特表 2023-521926 ＰＨＦ７のヒストン３ユビキチン化を標的にする精子クロマチン凝縮抑制剤スクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-25

(54)【発明の名称】ＰＨＦ７のヒストン３ユビキチン化を標的にする精子クロマチン凝縮抑制剤スクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/50 20060101AFI20230518BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230518BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20230518BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALN20230518BHJP

【ＦＩ】

G01N33/50 Z

C12N5/10 ZNA

G01N33/15 Z

C12Q1/02

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022563021

(86)(22)【出願日】2021-07-15

(85)【翻訳文提出日】2022-10-17

(86)【国際出願番号】 KR2021009074

(87)【国際公開番号】W WO2022025490

(87)【国際公開日】2022-02-03

(31)【優先権主張番号】10-2020-0092968

(32)【優先日】2020-07-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】513246872

【氏名又は名称】ソウル大学校産学協力団

【氏名又は名称原語表記】ＳＥＯＵＬ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｒ＆ＤＢ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(74)【代理人】

【識別番号】100170900

【弁理士】

【氏名又は名称】大西 渉

(72)【発明者】

【氏名】ベク ソンヒ

(72)【発明者】

【氏名】キム チャンロク

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045CB01

2G045DA36

2G045FB02

2G045FB03

4B063QA20

4B063QQ20

4B063QR80

4B063QS32

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA46

(57)【要約】

本願は、ＰＨＦ７のヒストン３ユビキチン化を標的にする精子クロマチン凝縮抑制剤スクリーニング方法を開示する。本願に係る方法によって究明された物質は、ヒストンＨ３Ｋ１４に対するＰＨＦ７ Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性が抑制できて、ＢＲＤＴの転写調節機能に影響を与えないながらも、ＢＲＤＴの安定化を妨げることによってこれの濃度を減少させて、ヒストン除去においてこれの機能を効果的に抑制することができる。このような機構によって究明された物質を利用したＰＨＦ７の特異的な抑制は、男性避妊薬として有用に使われることができる。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＨＦ７（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ７）及びＢＲＤＴ（Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ ｔｅｓｔｉｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）タンパク質を発現する真核細胞を提供する段階；
前記細胞をＰＨＦ７のヒストン３（Ｈ３）の１４番目リシン残基に対するユビキチン化活性を抑制すると期待される試験物質と接触する段階；
前記接触後、前記細胞で前記Ｈ３タンパク質のユビキチン化程度を測定する段階；及び
前記測定する段階で前記試験物質と接触した細胞で、接触されなかった細胞と比較して、前記Ｈ３のユビキチン化が減少された場合、前記試験物質を精子クロマチン凝縮に必要なヒストン－プロタミン交換抑制剤として選別する段階を含む、精子クロマチン凝縮抑制剤スクリーニング方法。

【請求項2】

前記細胞は、ＰＨＦ７を過発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１に記載の精子クロマチン凝縮抑制剤スクリーニング方法。

【請求項3】

前記細胞は、ヒトを除いた動物モデルとして提供されるものであり、
前記測定する段階で、前記動物モデルの精細胞でＢＲＤＴタンパク質のユビキチン化または前記ＢＲＤＴタンパク質の濃度を測定することを追加で含み、
前記ＢＲＤＴタンパク質ユビキチン化が、前記試験物質で処理されなかった細胞と比較して増加するか、または前記ＢＲＤＴタンパク質の濃度が前記試験物質で処理されなかった細胞と比較して、減少した場合、前記試験物質を精子核凝縮に必要なヒストン－クロマチン交換抑制剤として選別する段階を含む、請求項１に記載の精子クロマチン凝縮抑制剤スクリーニング方法。

【請求項4】

前記精子クロマチン凝縮抑制剤は、男性避妊剤として使われるものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の精子クロマチン凝縮抑制剤スクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、ＰＨＦ７のヒストン３ユビキチン化調節による精子核凝縮調節を究明した分子機構に基づいた薬物スクリーニング技術に関する分野である。

【背景技術】

【0002】

精子形成過程は、父系遺伝体の半分を有する精子を作る複雑な過程である。精原細胞から由来した二倍体精細胞（ｓｐｅｒｍａｔｉｄ）が４つの半数体精細胞に分裂する減数分裂以後、円形精細胞は、精子成熟過程を経て精子になるが、この際細胞質除去、核凝縮、先体形成、尾部成長などを伴う。

【0003】

体細胞のクロマチンは、ヒストンで構成されている反面、精子クロマチンは、主にアルギニンが豊富なプロタミンで構成されている。精子のさらに凝縮されたクロマチンは、ＤＮＡ損傷から遺伝体を保護して父系遺伝体が子孫によく伝達できるようにする。精子成熟過程の間、伸長型（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ）精細胞のヒストンは、クロマチンから除去されて、転移タンパク質（ＴＮＰ）に交換されて、最後にプロタミンに交換される（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９ａ） Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ １０，９６２．）。このようなヒストン－プロタミン交換に問題がある精子は、核凝縮の失敗で非正常的な形態と減少した運動性を示して、結果的に受精能力に問題を引き起こす（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１７，１４２９－１４３８）。

【0004】

ヒストン－プロタミン交換以前に伸長型精細胞で起きるヒストンＨ４過アセチル化は、ヒストン除去と精子成熟過程に必要な遺伝子の転写調節に役割をする（Ｇｏｕｄａｒｚｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。多くの研究を介して、Ｈ４過アセチル化に関与された多くの種類の調節タンパク質が明らかになった。ＰＩＷＩは、伸長型精細胞でＨ４過アセチル化に必要なＨ２Ａ、Ｈ２Ｂのユビキチン化を促進するＲＮＦ８の細胞内位置を調節するが、Ｈ４過アセチル化にＲＮＦ８が関わっているかについてはまだ論争中である（Ｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１７） Ｃｅｌｌ １６９，１０９０－１１０４．ｅ１０１３．；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｎａｔｕｒｅ ４６６，５０８－５１２．；Ｓｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２６，２７３７－２７４８．）。クロマチンリモデラーであるＣＨＤ５は、Ｈ４過アセチル化と転写調節による精子頭発生に役割をする。Ｈ４過アセチル化以後、ＢＲＤＴは、ＢＤ１ドメインを介して過アセチル化されたＨ４末端のＨ４Ｋ５／Ｋ８アセチル化を認知して、クロマチンリモデラーと共にヒストン除去と転写調節に関与する。ＢＤ１を介したアセチル化されたクロマチンの認知は、ブロモドメインとＤＮＡの相互作用によって強化される。さらに、精子プロテアゾームの単位体の中の一つであるＰＡ２００は、精子成熟過程の間ヒストンのアセチル化－媒介分解に必要である（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｃｅｌｌ １５３，１０１２－１０２４）。

【0005】

しかし、精子成熟過程の間、ヒストン除去に対する分子機構に対する研究は充分ではなく、これに対する究明及びこれを根拠とした男性生殖系薬物開発技術が必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本願は、精子形成過程でヒストンＨ３Ｋ１４に対するＰＨＦ７ Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性調節機構に基づいた精子核凝縮抑制剤スクリーニング方法を提供しようとする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

一様態で、本願は、ＰＨＦ７（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ７）及びＢＲＤＴ（Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ ｔｅｓｔｉｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）タンパク質を（過）発現する真核細胞を提供する段階；前記細胞をＰＨＦ７のヒストン３（Ｈ３）の１４番目リシン残基に対するユビキチン化活性を抑制すると期待される試験物質と接触する段階；前記接触後、前記細胞で前記Ｈ３タンパク質のユビキチン化程度を測定する段階；及び前記測定する段階で前記試験物質と接触した細胞で、接触されなかった細胞と比較して、前記Ｈ３のユビキチン化が増加した場合、前記試験物質を精子クロマチン凝縮に必要なヒストン－プロタミン交換抑制剤として選別する段階を含む、精子クロマチン凝縮抑制剤スクリーニング方法を提供する。

【0008】

一実現例で、本願に係る方法に使われる細胞としては、ＰＨＦ７を（過）発現する様々な細胞が使われることができる。一実現例で、前記細胞は、ＰＨＦ７が過発現したＨＥＫ（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｏｙｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ）２９３Ｔ細胞である。

【0009】

本願に係る方法の一実現例で、細胞は、ヒトを除いた動物モデルとして提供されるもので、前記測定する段階で、前記動物モデルの凝縮型精細胞（ｓｐｅｒｍａｔｉｄ）でＢＲＤＴタンパク質のユビキチン化または前記ＢＲＤＴタンパク質の濃度を測定するのを追加で含み、前記ＢＲＤＴタンパク質ユビキチン化が前記試験物質で処理されなかった細胞と比較して増加するか、または前記ＢＲＤＴタンパク質の濃度が前記試験物質で処理されなかった細胞と比較して減少した場合、前記試験物質を精子核凝縮に必要なヒストン－クロマチン交換抑制剤として選別する段階を含む。

【0010】

本願に係る方法によりスクリーニングされた精子核凝縮抑制剤の候補物質は、男性避妊薬として効果的に開発できる。

【発明の効果】

【0011】

本願で究明された機構に基づいたスクリーニング方法及びこれにより究明された物質は、ヒストンＨ３Ｋ１４に対するＰＨＦ７ Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を抑制することができて、ＢＲＤＴの転写調節機能に影響を与えないながらも、ＢＲＤＴの安定化を妨げることによって、これの濃度を減少させてヒストン除去においてこれの機能を効果的に抑制することができて、これは精子の発生を抑制することができて、このような機構を介して究明された物質を利用したＰＨＦ７の特異的な抑制は、男性避妊剤として効果的に使われることができる。

【0012】

特に従来にＢＲＤＴ、ＢＲＤ２、３及び４が属するＢＲＤファミリーの抑制剤であるチエノトリアゾロジアゼピンＪＱ１（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１２６８５２４－７０－４）は、マウスでＢＲＤＴを標的することで男性避妊薬として提示されたことがある。しかし、ＪＱ１は身体全般的に発現するＢＲＤ２、３、４を抑制して副作用の危険がある。ＢＲＤＴが精子形成過程初期から役割を果たす反面、本願でその機構に究明されたＰＨＦ７は、減数分裂後精細胞で優勢に発現して精子形成過程後期に作用するため、ＢＲＤＴを標的にする場合より副作用が少ないことがある。またＰＨＦ７のＥ３ユビキチンリガーゼ活性は、精子成熟過程に必要であるため、ＰＨＦ７は、男性不妊検査の診断マーカーとして使われることができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】Ｐｈｆ７^ｔＫＯ雄マウスは精子発生欠陥を示すという結果である。（Ａ）マウス精子発生過程の図式。（Ｂ）異なる年齢のマウスの精巣で相対的なＰｈｆ ｍＲＮＡレベル。（Ｃ）異なる年齢のマウスの精巣でＰＨＦ７タンパク質レベル。（Ｄ）８週齢対照群とＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの精巣細胞でＰＨＦ７タンパク質レベル。（Ｅ）野生型雌マウスと交配した対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯ雄マウスの受精能力。（Ｆ）ヘマトキシリン－ＰＡＳ染色を利用した対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの精巣組織分析。（Ｇ）ヘマトキシリン－エオシン染色を利用した対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの副睾丸組織分析。（Ｈ）対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの精子の位相差顕微鏡イメージ。（Ｉ）対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウス精子の運動性。（Ｊ）試験管受精アッセイ。対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウス精子の相対的受精能力。（Ｋ）対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウス精子の共焦点顕微鏡イメージ。（Ｌ）ヒストンＨ２Ａ、ＴＨ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４抗体を利用した対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウス精子の共焦点顕微鏡イメージ。（Ｍ）対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウス精子抽出液のヒストンとプロタミンタンパク質レベル。（Ｎ）対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウス精巣切片でＨ３、ＰＲＭ２抗体を利用した免疫染色。矢印は、Ｈ３とＰＲＭ２が共に発現する凝縮型精細胞を示す。（Ｏ）対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウス精細胞抽出液で行った免疫ブロット分析。

【図2】ＰＨＦ７はヒストンＨ３の１４番リシンに対するＥ３ユビキチンリガーゼであることを究明した結果である。（Ａ）対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウス精巣細胞抽出液で行った免疫ブロット分析。Ｈ３免疫ブロットの長時間露出データは、２５ｋＤａの下の移動したＨ３バンドを含む。（Ｂ）対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウス精巣細胞抽出液で行った免疫沈降分析。（Ｃ）Ｆｌａｇ－ＰＨＦ７とＨｉｓｍａｘ－ＵｂをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした後の免疫ブロット分析。（Ｄ）Ｅ．ｃｏｌｉで精製したＰＨＦ７と組換えヌクレオソームを利用したＥ２スクリーニングに対するｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイ。ヒストンユビキチン化の相対的レベルは、各免疫ブロットの下に表示。（Ｅ）異なる反応時間で進行したヌクレオソームのｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイ。Ｈ３ユビキチン化の相対的レベルは、Ｈ３免疫ブロットの下に表示。（Ｆ）Ｕｂの有無に応じだＧＳＴ－Ｈ３欠失突然変異を利用したｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイ。Ｈ３ユビキチン化比率は、ＧＳＴ免疫ブロットの下に表記。星印（＊）は、Ｈ３のポリユビキチン化を示す。（Ｇ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＨＡ－ＰＨＦ７とＨ３－Ｆｌａｇ ＫＲ突然変異をトランスフェクションした後進行したＨ３ユビキチン化残基に対するスクリーニング。（Ｈ）Ｈ３－Ｆｌａｇ ＷＴとＫ１４Ｒ突然変異を過発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で得たヒストン抽出物を利用したｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイ。

【図3】Ｐｈｆ７酵素活性がないＣ１６０Ａノックインマウスは、精子形成過程とＨ３ユビキチン化に欠陥を示すことを究明した結果である。（Ａ）ＰＨＦ７ ＷＴ、ΔＰＨＤ、ΔＲＩＮＧ突然変異の図式。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＦｌａｇ－ＰＨＦ７ ＷＴ、ΔＰＨＤ、ΔＲＩＮＧのＥ３ユビキチンリガーゼ活性比較。（Ｂ）と（Ｃ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＰＨＦ７のＰＨＤドメイン突然変異（Ｂ）とＲＩＮＧドメイン突然変異（Ｃ）のＥ３ユビキチンリガーゼ活性の欠陥。（Ｄ）ＧＳＴ－ＰＨＦ７のＲＩＮＧドメイン突然変異体を利用したｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイ。（Ｅ）Ｐｈｆ７ Ｃ１６０Ａ ＫＩマウスに対する図式。ＫＩ対立遺伝子は、ＢａｍＨ Ｉ（ＧＧＡＴＴＣ）とＡｆｅ Ｉ（ＡＧＣＧＣＴ）の制限部位を有する。（Ｆ）野生型雌マウスと交配した対照群及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}雄マウスの受精能力。（Ｇ）対照群及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}雄マウス精子の運動性。（Ｈ）ＩＶＦアッセイ。対照群及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}雄マウス精子の受精能力。（Ｉ）対照群及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}雄マウス精子の共焦点顕微鏡イメージ。（Ｊ）対照群及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}雄マウス精子でヒストンＨ２Ａ、ＴＨ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４を免疫染色した共焦点顕微鏡イメージ。（Ｋ）対照群及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}雄マウス精巣切片でＨ３抗体とＰＲＭ２抗体を利用した免疫染色の共焦点顕微鏡イメージ。矢印は、Ｈ３とＰＲＭ２が共に発現する凝縮型精細胞を示す。（Ｌ）対照群及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}雄マウス精細胞抽出液で行った免疫ブロット分析。（Ｍ）対照群及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}雄マウス精巣細胞抽出液で行った免疫ブロット分析。Ｈ３免疫ブロットの長時間露出データは、２５ｋＤａの下のＨ３ｕｂバンドを含む。

【図4】ＰＨＦ７のＥ３ユビキチンリガーゼ活性は、Ｈ４過アセチル化以後ヒストン除去に必要であることを究明した結果である。（Ａ及びＢ）単一細胞ＲＮＡシーケンシングから得た命名された細胞類型別に色で表記された二つの遺伝子型のマウスから得た精巣細胞に対するｔ－ＳＮＥ分析（Ａ）とすべての細胞における非常に多様な遺伝子の補正された発現レベル（Ｂ）。ヒートマップにあるすべての遺伝子と細胞は、Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ ｄｉｓｔａｎｃｅを利用して分類された。各細胞のメタデータは、ヒートマップ上に表記された（遺伝子型、Ｐｈｆ７^ｆ／ｆ、灰色；Ｐｈｆ７^ｔＫＯ、赤色とｔ－ＳＮＥ分析に使われた細胞類型）。（Ｃ）対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの精巣細胞でＴｎｐ１／２とＰｒｍ１／２の相対的ｍＲＮＡレベル。（Ｄ）対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの精細胞抽出物で行われたＴＮＰｓ及びＰＲＭｓに対する免疫ブロット分析。（Ｅ）対照群及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの精細胞抽出物で行われたＴＮＰｓ及びＰＲＭｓに対する免疫ブロット分析。（Ｆ）対照群及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの精細胞抽出物で行われたＨ４ａｃ及びＨ４に対する免疫ブロット分析。（Ｇ）対照群及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの精細胞抽出物で行われたＨ４ａｃ及びＨ４に対する免疫ブロット分析。（Ｈ）各遺伝子型のマウスの精巣切片でＨ４ａｃ抗体、ＰＲＭ２抗体を利用して行われた免疫染色に対する共焦点顕微鏡イメージ。（Ｉ）Ｈ４過アセチル化以後ヒストン除去でＰＨＦ７の機能に対する図式モデル。

【図5】ＰＨＦ７は、初期凝縮型精細胞でＢＲＤＴのレベルを維持するのに役割をすることを究明した結果である。（ＡとＢ）Ｐｈｆ７^ｆ／ｆ及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウス（Ａ）、Ｐｈｆ７^＋／ＣＡ及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウス（Ｂ）の精細胞でＢＲＤＴのタンパク質レベルと相対的ｍＲＮＡレベル。（ＣとＤ）Ｐｈｆ７^ｆ／ｆ及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウス（Ｃ）、Ｐｈｆ７^＋／ＣＡ及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウス（Ｄ）の精巣切片でＨ４ａｃ抗体とＢＲＤＴ抗体を利用した免疫染色の共焦点顕微鏡イメージ。ローマ数字は、洗浄管の精子形成過程段階を示す。（Ｅ）伸長型あるいは凝縮型精細胞の核でＨ４ａｃ及びＢＲＤＴが染色された比率に対する定量化。

【図6】ＰＨＦ７のＥ３ユビキチンリガーゼ活性は、ＢＲＤＴの安定性を調節することを究明した結果である。（Ａ）Ｐｈｆ７^{Ｆｌａｇ／＋}マウスの精巣切片でＢＲＤＴ抗体とＦｌａｇ抗体を利用した免疫染色の共焦点顕微鏡イメージ。ローマ数字は、洗浄管の精子形成過程段階を示す。矢印は、ＢＲＤＴとＦｌａｇ－ＰＨＦ７が共に発現する精細胞の核を示す。（Ｂ）ＢＥＴファミリーの保存されたＳＰＯＰデグロン（Ｄ）配列。（Ｃ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ－ＢＲＤＴ（１－５５５アミノ酸）野生型とΔＤ突然変異体をトランスフェクション後、ＭＧ１３２処理有無に応じた免疫ブロット分析。（Ｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ－ＢＲＤＴ、ＳＰＯＰ、ＰＨＦ７の野生型とＣ１６０Ａ突然変異体をトランスフェクション後行った免疫ブロット分析。（Ｅ）Ｐｈｆ７^ｆ／ｆ、Ｐｈｆ７^ｔＫＯ、Ｐｈｆ７^＋／ＣＡ、Ｐｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの精細胞でＳＰＯＰ、Ｃｕｌ３、ＢＲＤ４、ＰＴＥＮのタンパク質レベル。（Ｆ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ－ＢＲＤＴ、ＳＰＯＰ、ＰＨＦ７野生型とＣ１６０Ａ突然変異体をトランスフェクション及びＭＧ１３２処理後行ったユビキチン化アッセイ。（Ｇ）トランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＨＡあるいはＰＨＦ７抗体及びＦｌａｇ抗体で免疫染色した共焦点顕微鏡イメージ。（Ｈ）ＢＲＤＴ、ＳＰＯＰ－Ｃｕｌ３－Ｒｂｘ１、ＰＨＦ７を利用したｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイ。

【図7】ＰＨＦ７－媒介ヒストンユビキチン化は、ＢＲＤＴのユビキチン化を弱化させることを究明した結果である。（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で行ったＢＲＤＴとＰＨＦ７の免疫沈降実験。（Ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＧＳＴ－ＢＲＤＴとＨ３ｕｂあるいはＨ４ａｃを含んだビオチン化されたヌクレオソームとストレプトアビジンビーズを利用したｉｎ ｖｉｔｒｏプルダウンアッセイ。プルダウンされたＧＳＴ－ＢＲＤＴの相対的比率は、免疫ブロットの下に表記される。（Ｃ）ＢＲＤＴ、ＳＰＯＰ－Ｃｕｌ３－Ｒｂｘ１、修飾化されたヌクレオソームを利用したｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイ。（Ｄ）初期凝縮型精細胞（ステップ１２）でＰＨＦ７－媒介Ｈ３ｕｂを介したＢＲＤＴ安定性調節に対するモデル。

【図8】欠失マウスの作製結果を示す。（Ａ）ＰＨＦ７遺伝子をターゲットする方法に対する図式。Ｐｈｆ７エクソン４、５、６及び７対立遺伝子（灰色ボックス）とｌａｃＺ遺伝子（紫色ボックス）、ｌｏｘＰ（緑色矢印）、ＦＲＴ（青色ボックス）、ネオマイシン選択マーカー（薄緑色ボックス）、ジフテリア毒素遺伝子（ＤＴ、空色ボックス）を含んだターゲッティングベクター。（Ｂ）Ｐｈｆ７^ｆ／ｆ及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの精巣イメージと体重対比精巣の重さに対する比率。エラーバーは平均±ＳＤを示す。（ＣとＤ）Ｐｈｆ７^ｆ／ｆ及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの精巣切片でＨ３（緑色）、ＰＲＭ１（赤色、Ｃ）、ＴＮＰ２（赤色、Ｄ）、ＤＡＰＩ（青色）に対する免疫染色の共焦点顕微鏡イメージ。矢印は、ＰＲＭ１やＴＮＰ２がＨ３と共同発現を表す精細胞を示す。

【図9】Ｈ３Ｋ１４ｕｂに対するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果を示す。（Ａ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏで変形されたヒストンＨ３タンパク質を利用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。表記されたペプチド配列と変形に該当するＭＳ／ＭＳ分析スペクトル。（Ｂ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で命名されたペプチド配列に対するペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）の個数差。二回繰り返された実験でＰＨＦ７過発現と対照群サンプルが表記される。（Ｃ）Ｐｈｆ７^ｆ／ｆ及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの精巣の間でユビキチン化されたＨ２Ａ及びＨ２Ｂタンパク質に対するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。

【図10】Ｐｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの分析結果を示す。（Ａ）Ｐｈｆ７^＋／ＣＡ及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウス精巣切片のヘマトキシリン－ＰＡＳ染色。（Ｂ）Ｐｈｆ７^＋／ＣＡ及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの副睾丸切片のヘマトキシリン－エオシン染色。（Ｃ）Ｐｈｆ７^＋／ＣＡ及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウス精子の位相差顕微鏡イメージ。（ＤとＥ）Ｐｈｆ７^＋／ＣＡ及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの精巣切片でＨ３（緑色）、ＰＲＭ１（赤色、Ｄ）、ＴＮＰ２（赤色、Ｅ）、ＤＡＰＩ（青色）に対する免疫染色の共焦点顕微鏡イメージ。矢印は、ＰＲＭ１あるいはＴＮＰ２がＨ３と共同発現する精細胞を示す。

【図11】単一細胞ＲＮＡシーケンシングは、ＰＨＦ７－欠失マウスは野生型マウスと類似の転写体プロファイルを有することを示す。（Ａ）グラフ基盤クラスターで色塗りされたＵＭＡＰプロット。（Ｂ）ＵＭＡＰプロット上に分布したマウス細胞。赤点は、各プロットで各サンプルから由来した細胞を示す。（Ｃ）ＵＭＡＰプロット上のマーカー遺伝子の補正された発現レベル。（Ｄ）細胞内ＵＭＩ（Ｕｎｉｑｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）の総個数の分布。

【図12】Ｐｈｆ７が壊れたマウスの凝縮型精細胞には、Ｈ４アセチル化が非正常的に残っていることを示す。（Ａ）精子形成周期で精子成熟過程の図式。アラビア数字は、精子成熟過程のステップ（１－１６）を示す。円形精細胞（ステップ１－８）、伸長型精細胞（ステップ９－１１）、凝縮型精細胞（ステップ１２－１３）、凝縮後精細胞（ステップ１４－１６）。（ＢとＣ）Ｐｈｆ７^ｆ／ｆ、Ｐｈｆ７^ｔＫＯ（Ｂ）、Ｐｈｆ７^＋／ＣＡ及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}（Ｃ）マウスの精巣切片上でＨ４ａｃ（緑色）、ＰＮＡ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）に対する染色の共焦点顕微鏡イメージ。ローマ数字は、洗浄管内で精子形成ステップ（Ｉ－ＸＩＩ）を示す。

【図13】精巣切片でＰＲＭ１あるいはＴＮＰ２とＨ４ａｃの共同免疫染色結果で、図４と関連した結果である。（Ａ）Ｐｈｆ７^ｆ／ｆ、Ｐｈｆ７^ｔＫＯ、Ｐｈｆ７^＋／ＣＡ及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウス精巣切片上のＨ４ａｃ（赤色）、ＰＲＭ１（緑色）、ＤＡＰＩ（青色）に対する免疫染色の共焦点顕微鏡イメージ。（Ｂ）Ｐｈｆ７^ｆ／ｆ、Ｐｈｆ７^ｔＫＯ、Ｐｈｆ７^＋／ＣＡ及びＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウス精巣切片上のＨ４ａｃ（赤色）、ＴＮＰ２（緑色）、ＤＡＰＩ（青色）に対する免疫染色の共焦点顕微鏡イメージ。

【図14】Ｆｌａｇ－ＰＨＦ７ノックインマウスの作製を示す。（Ａ）Ｆｌａｇ－ＰＨＦ７ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ｍｉｃｅに対する図式。ＰＨＦ７エクソン２対立遺伝子（灰色ボックス）、３ｘＦｌａｇ（赤色）、３ｘＦｌａｇ（赤色）、スペーサー（橙色）、沈黙突然変異（空色）を含むノックイン（ｋｎｏｃｋ－ｉｎ）配列。（Ｂ）Ｐｈｆ７^＋／＋（野生型）及びＰｈｆ７^{Ｆｌａｇ／＋}マウスの精巣細胞抽出物でＦｌａｇ－ＰＨＦ７のタンパク質レベル。星印（＊）は、非特異的バンドを示す。（Ｃ）Ｐｈｆ７^{Ｆｌａｇ／＋}マウス精巣切片のＦｌａｇ（緑色）、ＰＮＡ（赤色）、ＤＡＰＩ（青色）に対する免疫染色の共焦点顕微鏡イメージ。ローマ数字は、洗浄管内で精子形成段階（Ｉ－ＸＩＩ）を示す。（Ｄ）Ｐｈｆ７^{Ｆｌａｇ／＋}マウス精巣切片のＦｌａｇ（緑色）、ＤＡＰＩ（青色）に対する免疫染色の共焦点顕微鏡イメージ。（Ｅ）Ｐｈｆ７^{Ｆｌａｇ／＋}マウス精巣切片のＦｌａｇ（緑色）、Ｈ４ａｃ（赤色）、ＤＡＰＩ（青色）に対する免疫染色の共焦点顕微鏡イメージ。ローマ数字は、洗浄管内で精子形成段階（Ｉ－ＸＩＩ）を示す。矢印は、Ｆｌａｇ－ＰＨＦ７とＨ４ａｃが共同発現する精細胞を示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本願は、ＰＨＦ７（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ７）が、精子成熟過程でヒストン除去因子であるＢＲＤＴ（Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ ｔｅｓｔｉｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）の安定性維持に重要であるとの発見に基づいたものである。精子形成過程は、体細胞分裂、減数分裂、及び精子成熟過程を含む精子を作る複雑な過程である。このうち精子成熟過程の間、減数分裂後精細胞（ｓｐｅｒｍａｔｉｄ）のクロマチンからヒストンが除去されてプロタミンに代替される。このような精子形成過程でヒストン－プロタミン交換は、精子核凝縮に重要であるにも関わらず、その研究が十分ではなく、これに対する調節機構に究明が必要である。

【0015】

本願では、具体的にＰＨＦ７タンパク質が減数分裂後精細胞でヒストンＨ３の１４番目リシン（Ｋ１４）残基に対するＥ３ユビキチンリガーゼとして作用して、このようなＰＨＦ７によるヒストンユビキチン化は、ヒストン除去因子であるＢＲＤＴのタンパク質量を増加させることで、ＰＨＦ７タンパク質がヒストン－プロタミン交換を調節するクロマチン凝縮の重要な後成遺伝学的因子との発見に基づいたものである。

【0016】

具体的に本願では、ＰＨＦ７欠失マウスとＥ３ユビキチンリガーゼ活性が壊れたＰｈｆ７ Ｃ１６０Ａ突然変異マウスを作製して、このマウスが初期凝縮型精細胞でヒストン除去因子ＢＲＤＴの調節異常でヒストン－プロタミン交換の欠乏と精子成熟過程に異常を示すことを明らかにした。また、マウスの精細胞でヒストン除去因子ＢＲＤＴのタンパク質量が減少して、免疫ブロット及び組織免疫染色を介して特定発生時期でＢＲＤＴの発現量の差を確認した。また、本願ではＰＨＦ７のＥ３ユビキチンリガーゼのヒストンユビキチン化に対する活性が、ＢＲＤＴのユビキチン化を抑制させることによって、ＢＲＤＴの安定化、即ち濃度増加に寄与することを究明した。

【0017】

そこで、ＰＨＦ７の欠陥または発現または活性の抑制は、１４番目リシン残基がユビキチン化されたヒストン３（Ｈ３Ｋ１４ｕｂ）の欠乏を誘導して、続いて初期凝縮型精細胞でＢＲＤＴタンパク質量を減少させて、ヒストンがプロタミンに代替されず、残っている非正常的な精子の発生を誘導させることができる。

【0018】

そこで一様態で、本願はＰＨＦ７を標的とする精子クロマチン凝縮に必要なヒストン－プロタミン交換抑制剤として選別する段階を含む、精子クロマチン凝縮抑制剤スクリーニング方法を提供する。

【0019】

体細胞のクロマチンは、ヒストンで構成されている反面、精子クロマチンは、主にアルギニンが豊富なプロタミンで構成されている。精子のさらに凝縮されたクロマチンは、ＤＮＡ損傷から遺伝体を保護して、父系遺伝体が子孫によく伝達できるようにする。精子成熟過程の間、伸長型（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ）精細胞のヒストンは、クロマチンから除去されて、転移タンパク質（ＴＮＰ）に交替されて、最後にプロタミンに交替される（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９ａ） Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ １０，９６２．）。このようなヒストン－プロタミン交換に問題がある精子は、核凝縮の失敗で非正常的な形態と減少した運動性を見せて、結果的に受精能力に問題を招く（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１７，１４２９－１４３８）。

【0020】

一実現例で、前記方法は、ＰＨＦ７及びＢＲＤＴを発現する真核細胞を提供する段階；前記細胞をＰＨＦ７のヒストン３（Ｈ３）の１４番目リシン残基に対するユビキチン化活性を抑制すると期待される試験物質と接触または処理する段階；前記試験物質で処理された細胞でＢＲＤＴタンパク質のユビキチン化程度を測定する段階；及び前記測定する段階において前記試験物質で処理された細胞で、処理されなかった細胞と比較して、前記ＢＲＤＴのユビキチン化が増加した場合、前記試験物質を男性避妊候補物質として選別する段階を含む。

【0021】

本願に係る標的であるＰＨＦ７は、ヒストンメチルリーダーとして知らされるＰＨＤドメインを有するＰＨＦファミリーの一員で、そのヒト及びマウスのタンパク質及び遺伝子配列は、ＮＣＢＩに次のように公知されている：ＰＨＦ７のヒトタンパク質配列：ＮＰ＿０５７５６７．３、遺伝子配列：ＮＣ＿０００００３．１２、マウスタンパク質配列：ＮＰ＿０８２２２５．１、遺伝子配列：ＮＣ＿００００８０．６。

【0022】

従来ＰＨＦ７遺伝子の瓦解は、精子生成に欠陥をもたらして、Ｈ２Ａユビキチン化を減少させるとの研究結果がある（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９ｂ）。しかし、減数分裂後精細胞でＰＨＦ７がＨ３Ｋ１４ｕｂのＥ３ユビキチンリガーゼとして作用して精子生成の間ヒストン除去のためにＢＲＤＴタンパク質の安定性を維持する結果は本願で初めて究明された。

【0023】

本願で究明されたＰＨＦ７ Ｅ３ユビキチンリガーゼの基質であるＨ３は、ヒストンタンパク質である。ヒト及びマウスのＨ３タンパク質及び遺伝子配列は、ＮＣＢＩに次のように公知されている：Ｈ３のヒトタンパク質配列：ＮＰ＿００３５２０．１、遺伝子配列：ＮＣ＿０００００６．１２、マウスタンパク質配列：ＮＰ＿０３８５７８．２、遺伝子配列：ＮＣ＿００００７９．６。前記アミノ酸残基の番号を付けるにあたり、通常タンパク質の最初のアミノ酸はＭｅｔであるため、本願でヒストンの残基番号はＭｅｔを除いてその次のアミノ酸を１番目にしたものである。

【0024】

一般的にヒストンタンパク質は、真核細胞でＤＮＡをパッキングして、ヌクレオソームという構造的ユニットを作る塩基性タンパク質である。ヒストンには、Ｈ１／Ｈ５、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４の５種類のファミリーがあり、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４は、ヌクレオソームのコアを構成して、Ｈ１／Ｈ５リンカーヒストンである。コアヒストンはダイマーで存在する。本願に係るＰＨＦ７ Ｅ３ユビキチンリガーゼは、Ｈ３の１４番目リシン残基をユビキチン化させる。ユビキチンは、７６個のアミノ酸からなるタンパク質で、ユビキチン化されたタンパク質のユビキチンは、タンパク質分解を促進したり他のタンパク質との相互作用を調節する形で自身や他のタンパク質の活性を調節する。

【0025】

ＢＲＤＴは、初期精母細胞で初めて発現して発生時期により様々な機能を有する。精子成熟過程初期から円形精細胞で転写が抑制され始めて、精子ではすべての転写が止まると知らされている。しかし、ＰＨＦ７との関連性は明らかにされていない。本願では、単一細胞ＲＮＡシーケンシングなどの実験によって、ＰＨＦ７欠失がＢＲＤＴ転写に影響を与えないことを究明しており、ＰＨＦ７によるＢＲＤＴ調節は、転写抑制以後段階に作用する、ＰＨＦ７がヒストン－プロタミン交換を調節するクロマチン凝縮の重要な後成遺伝学的因子として作用することを究明した。ＢＲＤＴの配列は、ＮＣＢＩに次のように公知されている：ヒトタンパク質配列：ＮＰ＿００１７１７．３、遺伝子配列：ＮＣ＿０００００１．１１、マウスタンパク質配列：ＮＰ＿４７３３９５．２、遺伝子配列：ＮＣ＿００００７１．６。

【0026】

本願に係る方法で候補物質を選別するため、試験物質で処理された細胞で前記ヒストンタンパク質のユビキチン化程度を測定する段階を含む。ヒストン３のユビキチン化を測定する方法は公知されていて、例えば本願実施例に記載されたのを参照することができる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ ８：１４７９９（２０１７））。前記測定する段階で、前記試験物質で処理された細胞で、処理されなかった細胞と比較して、前記ヒストン３のユビキチン化が増加した場合、前記試験物質を精子クロマチン凝縮に要求されるヒストン－プロタミン交換抑制剤として選別する。

【0027】

一実現例で本願に係る方法に使われる細胞は、ヒトまたはマウスを含む哺乳類由来の細胞でＰＨＦ７を過発現する真核細胞、例えばＰＨＦ７を過発現する確立された細胞株ＨＥＫ（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ）２９３Ｔである。前記確立された細胞株は市中で購入することができる。確立された細胞株で特定遺伝子を過発現する方法は公示されており、例えばヒトＰＨＦ７遺伝子をコートするプラスミドを目的する細胞株に伝達移入して使うことができる。しかし、細胞株はこれに制限されず、本願に係る目的を達成できる様々な細胞が使われることができる。

【0028】

他の実現例で、本願に係る方法に使われる細胞は、動物モデル、例えばマウスの一部である。本願に係る方法でマウスが使われる。

【0029】

本願に係る方法で測定する段階で試験物質と接触した細胞で、接触されなかった細胞と比較して、前記Ｈ３のユビキチン化が増加した場合、前記試験物質を精子クロマチン凝縮に必要なヒストン－プロタミン交換抑制剤として選別する段階を含む。

【0030】

一実現例で、本願に係る方法で細胞は、ヒトを除いた動物モデルとして提供されて、この場合、本願方法の測定する段階で、前記動物、例えばワイルドクイプマウスの精巣細胞でＢＲＤＴタンパク質のユビキチン化または前記ＢＲＤＴタンパク質の濃度を測定するのをヒストンユビキチン化の代わりにまたはこれに追加で含み、前記ＢＲＤＴタンパク質ユビキチン化が、前記試験物質で処理されなかった細胞と比較して増加したり、または前記ＢＲＤＴタンパク質の濃度が前記試験物質で処理されなかった細胞と比較して、減少した場合、前記試験物質を精子核凝縮に必要なヒストン－クロマチン交換抑制剤として選別する段階を含む。本願図７及び実施例６等に記載された通り、ＢＲＤＴのユビキチン化はこれの分解を促進して、その濃度を低くする。従って、本願に係る方法で試験物質によるユビキチン化の増加はＢＲＤＴタンパク質の濃度を減少させる。

【0031】

そこで、本願に係る方法でＰＨＦ７がヒストン３（Ｈ３）の１４番目リシン残基に対するユビキチン化活性を抑制することができる候補物質は、窮極的にＢＲＤＴのユビキチン化を増加させて、これはＢＲＤＴ濃度を減少につながり、結果的に精子形成過程でクロマチン凝縮の欠陥を誘導して、精子発生を抑制して男性避妊薬として効果的に使われることができる。

【0032】

本願に係る方法に使われる細胞は、このような細胞を含むオルガノイドまたはヒトを除いた動物モデルとして提供されることができる。このような動物モデルは、本願実施例または当業界に公知された方法を利用して製造されることができる。本願でオルガノイドとは、実際の臓器の微細構造を示す３次元環境のインビトロで生産されたミニ臓器である。これは自己回復及び分化能を有する細胞が３次元培養環境で作られる。オルガノイドを製造する方法は、公知（Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｍｂｉｓｏ）されたものを参考にすることができる。

【0033】

本願に係る方法に使われる試験物質は、本願で究明されたＰＨＦ７ユビキチンリガーゼのＨ３ユビキチン化によって精子成熟過程でのクロマチン凝縮を調節する後成的因子としての機能の調節、変化、特にＨ３ Ｋ１４のユビキチン化の抑制を持ってくると期待される物質、例えば低分子量化合物、高分子量化合物、化合物の混合物（例えば、天然抽出物または細胞または組織培養物）、または、バイオ医薬品（例えば、タンパク質、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、アプタマー、ＲＮＡｚｙｍｅ及びＤＮＡｚｙｍｅ）または糖及び脂質などを含むがこれに限定しない。

【0034】

本願に係る一実現例では、低分子化合物が試験物質として使われることができる。前記試験物質は、合成または天然化合物のライブラリーから得ることができて、このような化合物のライブラリーを得る方法は当業界に公知されている。合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（ＵＳＡ）、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＵＳＡ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（ＵＳＡ）及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から購入可能で、天然化合物のライブラリーは、Ｐａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）及びＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＵＳＡ）から購入可能である。試験物質は、当業界に公知された様々な組み合わせライブラリー方法によって得ることができて、例えば、生物学的ライブラリー、空間アドレッサブルパラレル固相または液相ライブラリー（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）、デコンボリューションが要求される合成ライブラリー方法、「１－ビーズ１－化合物」ライブラリー方法、そして親和性クロマトグラフィー選別を利用する合成ライブラリー方法によって得ることができる。分子ライブラリーの合成方法は、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，６９０９，１９９３；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，１１４２２，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６７８，１９９４；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１３０３，１９９３；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０５９，１９９４；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０６１；Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３，１９９４等に開示されている。例えば、薬物のスクリーニング目的のためには、化合物は低分子量の治療効果を有するものが使われることができる。例えば、重量が４００Ｄａ、６００Ｄａまたは８００Ｄａのような約１０００Ｄａ内外の化合物が使われることができる。目的により、このような化合物は、化合物ライブラリーの一部を構成することができ、ライブラリーを構成する化合物の数字も数十個から数百万個まで多様である。このような化合物ライブラリーは、ペプチド、ペプトイド及びその他環状または線状のオリゴマー性化合物、及び鋳型を基本とする低分子化合物、例えばベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ビアリール、カーボサイクル及びポリサイクル化合物（例えば、ナフタリン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイドなど）、カーボハイドレート及びアミノ酸誘導体、ジヒドロピリジン、ベンズヒドリル及びへテロサイクル（例えば、トリアジン、インドール、チアゾリジンなど）を含むものであってもよいが、これは単に例示でありこれに限定されない。

【0035】

また、例えばバイオロジックスがスクリーニングに使われることができる。バイオロジックスは、細胞またはバイオ分子を称するもので、バイオ分子とは、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質または生体内及び生体外で細胞システムなどを利用して産生された物質を称する。バイオ分子を単独でまたは他のバイオ分子または細胞と組み合わせで提供されることができる。バイオ分子は、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、抗体、または、その他血漿で発見されるタンパク質または生物学的有機物質を含むものである。

【0036】

一実現例で、本願に係る方法で候補物質を選別することができる増加または減少は、当業者なら本願に開示された結果及び当業者の常識を考慮して適切に選択することができ、例えばこれに制限しないが、試験物質と接触しなかった対照群と比較して試験物質の存在下で、約１０％以上減少、約２０％以上減少、約３０％以上減少、約４０％以上減少、約５０％以上減少、約６０％以上減少、約７０％以上減少、約８０％以上減少、約８０％以上減少、約１００％減少またはその間の範囲を含む試験物質を候補物質として選別することができるが、前記を超える範囲を除くのではない。

【0037】

以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし下記の実施例本発明をより簡単に理解するために提供されるだけであって本発明が下記の実施例に限定されるのではない。

【0038】

実施例
実験材料及び方法
ＰＨＦ７条件的ノックアウトマウスの作製：ＩＭＰＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｕｓｅ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）でＰＨＦ７の一番目の対立遺伝子欠失（ｔｍ１ａ）を有する３個の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を得てＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に微細注射した。ｌａｃＺ及びｎｅｏｍｙｃｉｎカセットを除去するために、異形接合Ｆ１をＦＬＰｅＲマウスと交配した。子孫マウスは、Ｓｔｒａ８－Ｃｒｅマウスと交配して精巣特異的ＰＨＦ７欠失マウスを得た。Ｐｈｆ７^ｆ／ｆ及びＰｈｆ７^ｔＫＯ雄マウスは８週齢以後に実験に使われた。遺伝子型プライマーは次のとおりである。
Ｆｏｒｗａｒｄ ５’－ＡＴＣＡＧＴＧＴＧＴＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＣＡＴＣ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ ５’－ＴＴＡＴＣＧＡＧＴＧＧＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＧＴＧ－３’．

【0039】

いずれの動物研究及び過程は、ソウル大学の実験動物資源管理院（ＩＡＣＵＣ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を受けた。

【0040】

Ｐｈｆ７ Ｃ１６０ＡノックインマウスとＦｌａｇ－ＰＨＦ７ノックインマウスの作製：Ｐｈｆ７ Ｃ１６０Ａ ＫＩマウスは、以前の方法でｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９をトランスフェクションしたＥＳ細胞から作製された。特に、遺伝体受精のために、ＥＧＲ－Ｇ０１［１２９Ｓ２×Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒ－Ｔｇ（ＣＡＧ／Ａｃｒ－Ｅｇｆｐ）ＥＳ細胞が利用された。ｓｇＲＮＡのターゲット配列は、５’－ＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＧＧＧＧＡＧＴＴ－３である。ＰＨＦ７の７番目エクソンに点突然変異（ＴＧＴ→ＧＣＴ，Ｃ１６０Ａ）を導入するために、ＨＤＲ授与プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクター）がデザインされた。Ｃ１６０Ａ対立遺伝子を有するキメラ子孫は、異形接合（Ｐｈｆ７^＋／ＣＡ）マウスを得るために野生型Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスと交配された。次に、Ｐｈｆ７^＋／ＣＡマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配された。Ｐｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスは、Ｐｈｆ７^＋／ＣＡマウス間の交配によって得た。Ｐｈｆ７^＋／ＣＡ、Ｐｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスは８週以後に実験に使われた。Ｃ１６０Ａ対立遺伝子に対する遺伝子型プライマーは次の通りである。
Ｆｏｒｗａｒｄ；５’－ＴＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＣＡＡＡＴＡＧＡＣ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ；５’－ＴＣＴＧＡＡＴＣＴＴＡＣＡＣＡＴＡＣＴＴＧＡＧＣＡ－３’．

【0041】

ＫＩ対立遺伝子は、ＡｆｅＩ制限部位を有し（図３Ｅ）、遺伝子型はＡｆｅＩ反応によって区分される。Ｆｌａｇ－ＰＨＦ７ ＫＩマウスは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９混合物とレファレンスＤＮＡを卵子に注射することによって作製された。ｇＲＮＡ配列は、５’－ＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＴＴＧ－３’である。Ｆｌａｇ－ＰＨＦ７対立遺伝子に対する遺伝子型プライマーは次の通りである。
Ｆｏｒｗａｒｄ ５’－ＧＧＧＴＧＧＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＧ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ ５’－ＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴ－３’．

【0042】

いずれの動物研究及び過程は、ソウル大学の実験動物資源管理院（ＩＡＣＵＣ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）と大阪大学微生物病研究所の動物実験委員会の承認を受けた。このＫＩマウスの冷凍精子（ＳＴＯＣＫ ＰＨＦ７＜ｅｍ２（Ｃ１６０Ａ）Ｏｓｂ＞Ｔｇ（ＣＡＧ／Ａｃｒ－ＥＧＦＰ）Ｃ３－Ｎ０１－ＦＪ００２Ｏｓｂ、ＲＢＲＣ＃１１０３２、ＣＡＲＤ＃２９３９；ａｎｄ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＰＨＦ７＜ｅｍ３（ＦＬＡＧ／ＰＨＦ７）Ｏｓｂ＞、ＲＢＲＣ＃１１０５６、ＣＡＲＤ＃２９６３）は、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｕｓ．ｂｒｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｅｎ／）及び熊本大学ＣＡＲＤ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｒｄ．ｍｅｄｉｃ．ｋｕｍａｍｏｔｏ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｃａｒｄ／ｅｎｇｌｉｓｈ／）で利用可能な予定である。ＳＴＯＣＫ ＰＨＦ７＜ｅｍ２（Ｃ１６０Ａ）Ｏｓｂ＞、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ ＰＨＦ７＜ｅｍ３（３ｘＦＬＡＧ／ＰＨＦ７）Ｏｓｂ＞は、伊川正人教授（大阪大学微生物病研究所）から収得した。

【0043】

細胞培養：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）は、５％ＣＯ_２を含む湿式培養器で１０％ＦＢＳと抗生剤を含むＤＭＥＭメディアで培養された。この研究に使われたすべての細胞は、マイコプラズマ汚染に対して定期的に検査を受けた。

【0044】

精子運動性：副睾丸で得た精子は、ＴＹＨ滴に広めた。１０分培養後、精子運動性は、ＣＡＳＡ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｐｅｒｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）システム（ＣＥＲＯＳ ＩＩ）によって分析された。

【0045】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精アッセイ：ＰＭＳＧ（Ｐｒｅｇｎａｎｔ ｍａｒｅ ｓｅｒｕｍ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）をＢ６Ｄ２Ｆ１雌マウスの腹腔に注射して、４８時間後、ｈＣＧ（ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）を注射した。ｈＣＧ注射後、１４時間目に卵子を各卵管のラッパ管から抽出してＴＹＨ滴で培養した。副睾丸精子は２時間の間ＴＹＨ滴で先行培養する。精子を卵子があるＴＹＨ滴に添加した。６時間後、卵子の周囲の卵球細胞をｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅで５分処理することによって除去して位相差顕微鏡で前核を観察した。

【0046】

組織学：精巣組織分析は、以前の方法で行われた。副睾丸は、１０％ホルマリンで４℃一夜中行われた。固定後、組織はエタノール濃度を５０％から１００％に上げながら脱水した。脱水された標本は、１００％キシレンを経てパラフィンワックスに入れた。ヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために、組織を７μｍ厚さに切ってパラフィンを除去して水分を補充した後、ヘマトキシリン３分、エオシン１分の間染色した。イメージはデジタル顕微鏡で得た。

【0047】

マウス精巣細胞の分離：マウス精巣組織は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２メディアでｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ａ、ＤＮａｓｅ Ｉ、トリプシンで分解した。トリプシンは、ＦＢＳでブロックした細胞は７０μｍ、４０μｍストレーナーで取り除いた。遠心分離後、赤血球はＲＢＣ溶解バッファーで除去した。細胞はＨＢＳＳで洗浄した。精細胞は、以前のプロトコルを変形して重力沈殿法であるＳＴＡ－ＰＵＴで分離した。コラムにＤＭＥＭ－Ｆ１２メディアの４％ＢＳＡを敷いて２％ＢＳＡをゆっくり積んだ後、０．５％ＢＳＡに溶かした精巣細胞をその上にローディングした。沈殿は常温で１５０分の間行われた。各分画は位相差顕微鏡で細胞形態を介して区分された。

【0048】

組織免疫染色：副睾丸で得た精子は、スライドの上で乾燥してＰＬＬが処理されたカパースリップ上の精細胞は、１Ｍ ＤＴＴが含まれたＰＢＳで３０分間培養して４％ＰＦＡが含まれたＰＢＳに１０分間常温で固定する。固定されたサンプルは、１０分間常温で０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれたＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で透過させる。染色のために、細胞は２時間の間常温で抗体と培養して、蛍光が標識された２次抗体と１時間の間培養する。精巣切片を利用した組織免疫染色は、ブロッキングからマウンティングまで同じ方法で行われた。サンプルは共焦点顕微鏡で観察した。同じホストから得た二つの抗体を利用した二重染色のために、精巣切片は、まずＢＲＤＴ抗体を４℃一夜中培養して次の順序の抗体を１時間の間常温で培養した。Ａｌｅｘａ ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄｏｎｋｅｙ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｈ４ａｃ抗体、Ａｌｅｘａ ５９４ Ｄｏｎｋｅｙ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）。マウンティングされたサンプルは共焦点顕微鏡で観察した。

【0049】

トランスフェクション及び細胞融解（ｌｙｓｉｓ）：トランスフェクションはＰＥＩを利用した。すべての細胞は冷たいＰＢＳで洗浄後集めてＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーに融解された。すべての抽出物は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析された。

【0050】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイ：組換えタンパク質ＰＨＦ７、ＵＢＥ１、ＧＳＴ－Ｈ３、ＧＳＴ－ＢＲＤＴ、ＳＰＯＰは、Ｅ．ｃｏｌｉストレーンＲｏｓｅｔｔａで精製した。組換えヌクレオソーム、ＧＳＴ－Ｈ３、ヒストン抽出物を利用したヒストンユビキチン化アッセイは、アッセイバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＡＴＰ、ａｎｄ ２ｍＭ ＤＴＴ）でユビキチン、ＵＢＥ１、ＵｂｃＨ５ｂ、ＵｂｃＨ５ｃ、ＰＨＦ７を利用して３０℃、１時間の間行われた。Ｆｌａｇ－Ｃｕｌ３とＨＡ－Ｒｂｘ１は、トランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＦｌａｇ－Ｍ２アガロースビーズと３ｘＦｌａｇペプチドを利用して精製された。ＧＳＴ－ＢＲＤＴ、Ｈｉｓ－ＳＰＯＰ、Ｆｌａｇ－Ｃｕｌ３、ＨＡ－Ｒｂｘ１、ＰＨＦ７を同じバッファーで３０℃、３０分間培養してユビキチン、ＵＢＥ１、ＵｂｃＨ５ａを添加して３０℃、１時間の間ＢＲＤＴユビキチン化アッセイを行った。ＰＨＦ７と組換えヌクレオソームでユビキチン化アッセイを進行後、変形されたヌクレオソームは、ＰＨＦ７、ユビキチン、ＵｂｃＨ５ｂ及び５ｃを除去するために、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ ５０Ｋ ｍｅｍｂｒａｎｅで取り除いた。変形されたヌクレオソームを利用したＢＲＤＴユビキチン化アッセイは同じ方法で行った。

【0051】

ｉｎ ｖｉｖｏユビキチン化アッセイ：精巣細胞は変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１％ ＳＤＳ、７０ｍＭ β－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）で溶解して９５℃で５分間沸かした。すべての抽出物は、脱変性バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、タンパク質分解酵素阻害剤）で希釈した後、Ｈ３抗体を用いて４℃で一夜中免疫沈降を行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ｈｉｓｍａｘ－ＵｂをトランスフェクションしてＭＧ１３２を６時間処理した後、同じ方法で細胞を破砕する。免疫沈降はＦｌａｇ抗体を用いて４℃で２時間行われた。

【0052】

免疫沈降：トランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＥＢＣ２００バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ－４０、タンパク質分解酵素阻害剤）で破砕して遠心分離をした。上澄み液をＦｌａｇ抗体と４℃で２時間の間培養した。その後、タンパク質Ａ／Ｇセファロースビーズを入れて４℃で１時間の間培養した。ビーズは、ＥＢＣ２００バッファーで洗浄と１０分間サンプルバッファーで沸かした。

【0053】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏビオチン－ストレプトアビジンプルダウンアッセイ：組換えタンパク質ＧＳＴ－ＢＲＤＴは、Ｅ．ｃｏｌｉストレーンＲｏｓｅｔｔａで精製した。組換えビオチン化ヌクレオソームは、ＰＨＦ７を利用したｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイに使われて、プルダウンバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５ｍＭ ＤＴＴ）でストレプトアビジンアガロースレジンと４℃で１時間の間培養した。プルダウンバッファーでビーズについたヌクレオソームを洗浄してＧＳＴ－ＢＲＤＴタンパク質と４℃で２時間の間培養した。ビーズは洗浄して１０分間沸かした。

【0054】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析：ゼルにあるペプチドサンプルプレップとｉｎ ｖｉｔｒｏ変形されたヒストンサンプルのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、以前の方法で行われた。ＰＨＦ７を過発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とＰｈｆ７^ｆ／ｆ及びＰｈｆ７^ｔＫＯマウス精巣細胞のペプチドサンプルプレップと免疫親和精製は、ＰＴＭＳＣａｎ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｒｅｍｎａｎｔ Ｍｏｔｉｆ（Ｋ－ε－ＧＧ）キットで行われた。ペプチドサンプルは、３μｍ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ ｐａｒｔｉｃｌｅｓを利用して、ｉｎ－ｈｏｕｓｅ ｐａｃｋｅｄ ｌｏｎｇ ｃａｐｉｌｌａｒｙコラム（１００ｃｍ×７５μｍ ｉ．ｄ．）とｔｒａｐコラム（３ｃｍ×１５０μｍ ｉ．ｄ）で分離した。３００ｎｌ／分の流速及び６０分間溶媒Ａ（０．１％ギ酸を有する水）乃至４０％の溶媒Ｂ（０．１％ギ酸を有するアセトニトリル）範囲の線形勾配をナノ液体ＵＰＬＣ（水）Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合して次の媒介変数を使って作動した。前駆体スキャン範囲のｍ／ｚ ３００－１８００、前駆体隔離ウィンドーの１．４Ｔｈ、高い水準の衝突エネルギー（ＮＣＥ）の３０％－エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、３０秒の動的排除期間、各々全体ＭＳまたはＭＳ／ＭＳスキャンに対してｍ／ｚ ２００で６０ｋまたは７．５ｋ解像度で得られたデータセットは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｐｒｏｔｅｏｍｅデータベースに基づいて１０ｐｐｍの前駆体イオン質量抵抗でＭＳ－ＧＦ＋アルゴリズムかＭａｘＱｕａｎｔソフトによって探索された。前記の発見率は、タンパク質とペプチド水準で１％に設定した。ペプチドスペクトルマッチのナンバーは、各々明らかになったペプチド配列に対して集計された。関心があるペプチド配列の強度は、ＭａｘＱｕａｎｔ探索結果から得られるかＱｕａｌ Ｂｒｏｗｓｅｒソフトを利用してＸＩＣ（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）レベルの手動注釈によって決定された。

【0055】

定量ＲＴ－ＰＣＲ：ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌを利用して抽出されて、逆転写は２．５ｍｇのＲＮＡをＭ－ＭＬＶ ｃＤＮＡ合成キットを利用して行われた。ｍＲＮＡ量は、ＳＹＢＲ ＴＯＰｒｅａｌ ｑＰＣＲ ２ｘ ＰｒｅＭｉｘとＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ３８４で測定した。ｍＲＮＡの定量は、ｄｄＣｔ方法で計算されて、すべての反応は３つの同一実験群で行われた。発現は１８Ｓ ｒＲＮＡとＨｐｒｔを利用して補正された。

【0056】

単一細胞ＲＮＡシーケンシング実験：単一細胞ＲＮＡシーケンシングライブラリーは、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｌｉｂｒａｒｙ ＆ Ｇｅｌ Ｂｅａｄ Ｋｉｔ ｖ２を利用して数千個の精巣細胞をｎａｎｏ ｌｉｔｅｒ規模の滴に分離することによって作られた。各滴には逆転写によってｃＤＮＡが作られた。結果的に、バーコードシーケンスとＵＭＩ（Ｕｎｉｑｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）が各ｃＤＮＡ分子に添加された。ｃＤＮＡはプーリングされてシーケンシングライブラリーは、マニュアルのとおりプレップされた。ライブラリーは、Ｎｅｘｔｓｅｑ ５５０ ｐｌａｔｆｏｒｍとＮｏｖａｓｅｑ ６０００ ｐｌａｔｆｏｒｍでシーケンシングされた。

【0057】

単一細胞ＲＮＡシーケンシングデータ分析：シーケンシングデータは、ｆａｓｔｑファイルを作るために、ｂｃｌ２ｆａｓｔｑを利用して多重化解除された。多重化解除後、リードはマウスレファレンス遺伝体に配列されて、特徴バーコードマトリックスはトリミングとなるｃｅｌｌｒａｎｇｅｒカウントを利用して作られて、デフォルトパラメーターを有するｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ ａｇｇｒで集計された。次の分析は、Ｓｅｕｒａｔプログラムを利用して行われた。特徴バーコードマトリックス生成後に、３個未満の細胞で発現する遺伝子と２００個以下の遺伝子発現を示す細胞を除去した。さらに、ミトコンドリア遺伝子発現の２０％以上を示す細胞と２，０００個以下の分子発現を示す細胞を除去した。データは、ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ法によって補正された。Ｈｉｇｈ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎデータを視覚化するために、‘ｍｅａｎ．ｖａｒ．ｐｌｏｔ’を有するＦｉｎｄＶａｒｉａｂｌｅＦｅａｔｕｒｅによって選ばれた非常に多様な遺伝子を介してＰＣＡ（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。細胞は、ＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒを利用して１０ＰＣと０．５ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒに区分されたクラスターに配分された。ＵＭＡＰを利用して１０ＰＣに基づく細胞を挿入して細胞クラスター情報を視覚化した。

【0058】

定量化及び統計分析：免疫ブロットの定量化はＩｍａｇｅ Ｊソフトで行われた。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトを利用してグループの差を見せるために、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ－検定とＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－検定で行われた。

【0059】

実施例１．Ｐｈｆ７^ｔＫＯ雄マウスを利用してＰＨＦ７精子形成過程に関与することを究明
精巣でＰＨＦ７の高い発現を根拠にＰＨＦ７が精子形成過程で機能を分析した。まず精子形成過程の間ＰＨＦ７がいつ発現するのか調べるために、本願では他の発生時期のマウスから精巣抽出液を分析した。週齢に応じて次の発生段階が観察される；７ｄｐｐに精原細胞、１４ｄｐｐに精母細胞、２１ｄｐｐに円形精細胞、２８ｄｐｐに伸長型精細胞、３０ｄｐｐに凝縮型精細胞、３５ｄｐｐに精子（図１Ａ）。２１ｄｐｐにＰｈｆ ｍＲＮＡレベルが増加して（図１Ｂ）、２８ｄｐｐにＰＨＦ７タンパク質レベルが増加するため（図１Ｃ）、ＰＨＦ７は円形と伸長型精細胞で発現することが分かった。

【0060】

精子形成過程で、ＰＨＦ７の役割を調べるために、本願では精巣特異的なＰＨＦ７ノックアウト（ＫＯ）マウス（以後Ｐｈｆ７^ｔＫＯ）を作製した（図８Ａ）。対照群（Ｐｈｆ７^ｆ／ｆ）マウスに比べてＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの精巣細胞でＰＨＦ７タンパク質発現が欠失されていることを見ることができる（図１Ｄ）。本願では、対照群マウスとＰｈｆ７^ｔＫＯマウスを野生型雌と交配して、Ｐｈｆ７^ｔＫＯ雄は対照群雄に比べて不妊であった（図１Ｅ）。対照群雄とＰｈｆ７^ｆ／ｆ雄の体重対比精巣重さに対する比率に大きい差はなかった（図８Ｂ）。さらに、本願ではヘマトキシリン－ＰＡＳ染色をした時、Ｐｈｆ７^ｔＫＯ雄の洗浄管で明確な欠陥が観察できなかった（図１Ｆ）。

【0061】

副睾丸でヘマトキシリン－エオシン染色による組織学的分析で対照群よりＰｈｆ７^ｔＫＯで精子数が少ないことを観察した（図１Ｇ、１Ｈ）。Ｐｈｆ７^ｔＫＯマウスの精子は対照群に比べて低い運動性を示した（図１Ｉ）。ＩＶＦ実験でＰｈｆ７^ｔＫＯ精子が対照群精子に比べて低い受精率を示した（図１Ｊ）。引き続き精子の形態を観察して、Ｐｈｆ７^ｔＫＯ精子の大部分が対照群に比べて丸くて大きい頭を有するのを見ることができた（図１Ｋ）。これは、Ｐｈｆ７^ｔＫＯ精子が対照群に比べて頭に少なく凝縮されたクロマチンを有することを示す。

【0062】

精子成熟過程の間、円形精細胞の核はヒストン－プロタミン交換を含むクロマチン凝縮によって凝縮が起きる。少なく凝縮された頭を有する精子は、クロマチンでヒストンとプロタミンの非正常的な比率によって現れる。従って、本願では精子でヒストンとプロタミンの量を測定した。対照群に比べてＰｈｆ７^ｔＫＯ精子でより多くの量のヒストンが検出された（図１Ｌ、１Ｍ）。さらに、Ｐｈｆ７^ｔＫＯ精子でより多くのＰＲＭ１と、より少ないＰＲＭ２が観察された（図１Ｍ）。次に、ヒストン－プロタミン交換が起きる精細胞を分析した。本来は、ヒストンが検出されない凝縮型精細胞でヒストンが残っているのか調べるために、精巣切片でヒストンＨ３とＰＲＭ１、ＰＲＭ２、ＴＮＰ２に共同免疫染色を行った。対照群マウスのｓｔａｇｅ ＶＩＩ－ＶＩＩＩ洗浄管には、ＰＲＭ１、ＰＲＭ２が発現する凝縮型精細胞でＨ３が検出されないが、Ｐｈｆ７^ｔＫＯマウスではＨ３とＰＲＭ１、ＰＲＭ２が共に発現する精細胞が観察された（図１Ｎ及び図８Ｃ）。対照群マウスのｓｔａｇｅ Ｉ洗浄管にある凝縮型精細胞は、Ｈ３は発現せずＴＮＰ２を発現する。しかし、Ｐｈｆ７^ｔＫＯマウスの一部凝縮型精細胞でＨ３とＴＮＰ２が共に発現した（図８Ｄ）。精細胞分画でヒストンのタンパク質レベルを分析した時、対照群マウスの精細胞は、発生が進行されるにつれヒストンレベルが減少したが、Ｐｈｆ７^ｔＫＯマウスではそうでなかった（図１Ｏ）。従って、対照群マウスの凝縮型精細胞ではヒストンが除去されるが、Ｐｈｆ７^ｔＫＯマウスの凝縮型精細胞にはヒストンが残っている。このデータは、Ｐｈｆ７^ｔＫＯ雄が精子成熟過程でヒストン－プロタミン交換に欠陥があって、精子数の減少と非正常的な形態によって不妊になったことを示す。

【0063】

実施例２．ＰＨＦ７はヒストンＨ３の１４番リシンに対するＥ３ユビキチンリガーゼとして作用することを究明
本願では、対照群マウスに比べてＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの精巣細胞で２５ｋＤａの下のＨ３バンドが減少したのを観察した（図２Ａ）。上に移動したバンドが、ユビキチン化されたＨ３であるか調べるために、精巣細胞抽出液でＨ３抗体で免疫沈降をした後、Ｕｂ抗体で探知した。同じ大きさで対照群精巣細胞抽出液では、ユビキチン化されたＨ３が検出されて、Ｐｈｆ７^ｔＫＯ精巣細胞ではユビキチン化されたＨ３の量が減少した（図２Ｂ）。

【0064】

前記Ｈ３ユビキチン化の結果を根拠に引き続きＰＨＦ７がＨ３のＥ３ユビキチンリガーゼとしての可能性を詳細に分析した。具体的に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＰＨＦ７とユビキチンを過発現してＰＨＦ７によるＨ３ユビキチン化を確認した。興味深いことに、ＰＨＦ７とＨｉｓｍａｘ－Ｕｂを入れた群で、２８ｋＤａのＨｉｓｍａｘ－Ｕｂ－Ｈ３と２２ｋＤａの内生的Ｈ３ｕｂを観察した（図２Ｃ）。ＰＨＦ７がＨ２Ａ Ｋ１１９ｕｂを誘導することが知らされているが、ＰＨＦ７がある時に、Ｈ２Ａ Ｋ１１９ｕｂが増加するのを観察した。Ｈ２ＢとＨ４は、ＰＨＦ７の過発現によってユビキチン化されなかった（図２Ｃ）。組換えヌクレオソームを利用してＨ３のｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを行った。これのために、Ｅ２ユビキチンコンジュゲート酵素をスクリーニングしてＵｂｃＨ５Ｂと５Ｃが、ＰＨＦ７がＨ３をユビキチン化する際のＥ２酵素であることを明らかにした（図２Ｄ）。同じ条件で、ＰＨＦ７はＨ２Ａ Ｋ１１９、Ｈ２Ｂ、Ｈ４をユビキチン化させたが、Ｈ２Ｂ Ｋ１２０ｕｂ抗体を使った際にＨ２Ｂ Ｋ１２０のユビキチン化は検出されなかった（図２Ｄ）。そして、ＰＨＦ７、Ｅ１、ＵｂｃＨ５Ｂ／Ｃ、Ｕｂの添加は時間依存的にＨ３ユビキチン化を増加させた（図２Ｅ）。次に、ＰＨＦ７を媒介したＨ３ユビキチン化の残基を確認した。Ｈ３の欠失突然変異を利用したｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化実験は、Ｈ３のＮ－末端内でユビキチン化が起きることを示している（図２Ｆ）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化実験で得たＨ３ｕｂに対するＬＣ－ＭＳ／ＭＳはＨ３のユビキチン化残基が、Ｋ１４であることを示している（図９Ａ）。尚、突然変異作製した時に、ただＨ３のＫ１４Ｒ突然変異だけＰＨＦ７によってユビキチン化されなかった（図２Ｇ）。Ｈ３のＫ１４残基はｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化実験でも証明された（図２Ｈ）。尚、ＰＨＦ７を過発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞抽出液でユビキチン化タンパク質に対するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって対照群に比べてＰＨＦ７の過発現が変形されたＨ３Ｋ１４ペプチドを増加させるのを確認した（図９Ｂ）。対照群とＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの精巣細胞を利用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳでＨ２Ａ、Ｈ２Ｂユビキチン化が３０％減少した（図９Ｃ）。しかし、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で精巣細胞のＨ３Ｋ１４ｕｂを検出することができなかった。これは、Ｈ３Ｋ１４ｕｂが少ない量で存在するか少ない比率の精細胞で存在したためと推定される。このデータは、ＰＨＦ７がＨ３の１４番リシンにＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有することを示す。

【0065】

ＰＨＦ７は、ＰＨＤドメインとＲＩＮＧドメインを有する。従来の研究は、ＰＨＦ７のＮ－末端ＰＨＤドメインがＨ３Ｋ４ｍｅ２に特異的に結合して、ＰＨＦ７のＲＩＮＧドメインがＥ３ユビキチンリガーゼ活性に作用することを示した。ＰＨＦ７のＰＨＤドメインとＲＩＮＧドメインがＨ３ユビキチン化に必要であるかを調べるために、各ドメインの欠失突然変異を作製して各ドメインの欠失はＨ３ユビキチン化を誘導できなかった（図３Ａ）。ＲＩＮＧドメインとＰＨＤドメインの保存されたアミノ酸残基を壊したＰＨＦ７突然変異は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を失った（図３Ｂ、３Ｃ）。ＰＨＦ７のＲＩＮＧドメイン突然変異は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもＨ３をユビキチン化することができなかった（図３Ｄ）。まとめると、ＰＨＦ７のＰＨＤドメインとＲＩＮＧドメインがＨ３ユビキチン化に必要で、各ドメインが壊れるとＰＨＦ７によるＨ３ユビキチン化を喪失した。

【0066】

実施例３．ＰＨＦ７の酵素活性がないＣ１６０Ａノックイン（ｋｎｏｃｋ－ｉｎ）マウスの作製及び分析
ＰＨＦ７のＥ３ユビキチンリガーゼ活性が精子形成過程に重要であるか調べるために、ＰＨＦ７の酵素活性が壊れたＲＩＮＧドメイン内にＣ１６０Ａ突然変異を有するＰＨＦ７ノックイン（ｋｎｏｃｋ－ｉｎ，ＫＩ）マウスを（ここからＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}）作製した（図３Ｅ）。対照群（Ｐｈｆ７^＋／ＣＡ）とＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}雄を野生型雌と交配させた時、Ｐｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}雄が対照群雄に比べて不妊であった（図３Ｆ）。対照群雄は、野生型雄と似た受精能力を示すため、Ｃ１６０Ａ突然変異は劣性であることが示された。Ｐｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの精巣が目立つ欠陥が見られないにも関わらず、Ｐｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの副睾丸で少ない数の精子が観察された（図１０Ａ及びＢ）。Ｐｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの精子は、対照群に比べて非正常的な形態、低い運動性、低い受精能力を示した（図３Ｇ、３Ｈ、図１０Ｃ）。Ｐｈｆ７^ｔＫＯマウスの精子と類似するように、Ｐｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの精子と精細胞は、精子成熟過程の間不完全なヒストン除去を示しているが（図３Ｊ～３Ｌ）、これはＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスがＰｈｆ７^ｔＫＯマウスと似たような表現型であることを示す。重要なことは、対照群に比べてＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの精巣細胞でＨ３ユビキチン化が減少した（図３Ｍ）。まとめると、このデータは、ＰＨＦ７のＥ３ユビキチンリガーゼ活性が精子成熟過程の間Ｈ３ユビキチン化に重要であることを示す。

【0067】

実施例４．ＰＨＦ７のＥ３ユビキチンリガーゼ活性はＨ４過アセチル化以後のヒストン除去に重要であることを究明
ショウジョウバエでＰＨＦ７は、生殖細胞で下位遺伝子の転写調節に役割をすることが知らされている。マウス精子形成過程で、ＰＨＦ７の欠失が遺伝体水準で転写体変化を誘導するのか調べるために、１０Ｘゲノミクス分析法を利用して対照群とＰｈｆ７^ｔＫＯマウスの精巣細胞で転写体を分析した。単一細胞ＲＮＡシーケンシング結果は、二つの生物学的繰り返し実験で再現性が高く、精原細胞から精細胞までの知らされた細胞群集のように良好に分類された（図４Ａ、図１１）。細胞群集は、精子形成に関与した細胞の構成が対照群とＰｈｆ７^ｔＫＯマウスとで類似していることを示す。しかし、驚くべきことに二つのマウスの間で各群集内の有意な遺伝子発現パターンの差を発見することができなかったが（図４Ｂ）、これはＰＨＦ７の欠陥がマウスの精子形成過程の間転写体に有意な変化を与えないことを示す。これを根拠に精子成熟過程の間クロマチン凝縮の変化を分析した。

【0068】

従って、ＴｎｐとＰｒｍの発現をまず分析した。単一細胞ＲＮＡシーケンシング結果を代弁するように、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、この遺伝子のｍＲＮＡレベルに大差ないことを示した（図４Ｃ）。しかし、精細胞抽出液を利用した免疫ブロット分析は、対照群に比べてＰｈｆ７^ｔＫＯとＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスとでＴＮＰ１／２、ＰＲＭ２のタンパク質レベルが減少しているのを示す（図４Ｄ、４Ｅ）。次に、伸長型精細胞でヒストン－プロタミン交換以前に起きる後成遺伝学的イベントであるＨ４過アセチル化を分析した。驚くべきことに、Ｐｈｆ７^ｔＫＯとＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの精細胞は、対照群に比べて非常に高いレベルのＨ４アセチル化を示した（図４Ｆ、４Ｇ）。ＰＨＦ７の欠陥が精巣でＨ４アセチル化をどのように増やしたのか調べるために、精巣切片で免疫染色実験をした。マウスで精子形成周期は１２段階からなり、１２段階以後、次の周期の１段階となる（図１２）。減数分裂以後、精子成熟過程は、１６ステップに分かれる。洗浄管基底にある精原細胞は、精子形成過程が進行しながら内側に移動するようになり１２、１－８段階洗浄管に（ステップ１２－１６）凝縮型精細胞が存在して、９－１１段階洗浄管には（ステップ９－１１）伸長型精細胞が存在する。対照群精巣でＨ４アセチル化は９段階洗浄管のステップ９伸長型精細胞で初めて現れて、１２段階洗浄管のステップ１２凝縮型精細胞で減少するが、Ｐｈｆ７^ｔＫＯとＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの精巣でＨ４アセチル化は正常的にはＨ４アセチル化が存在しない１－８段階洗浄管のステップ１３－１６凝縮型精細胞まで残っている（図１２Ｂ、Ｃ）。伸長型精細胞で発生するＨ４過アセチル化は、ヒストン除去を誘導して、これによって凝縮型精細胞ではＨ４アセチル化のレベルが減るようになる。より正確な検証のために、Ｈ４ａｃを凝縮型精細胞のマーカーであるＴＮＰ２（ステップ１１－１４精細胞、１１－２段階）、ＰＲＭ１（ステップ１１－１６精細胞、１１－８段階）、ＰＲＭ２（ステップ１４－１６精細胞、２－８段階）と共同免疫染色を進行した。対照群で精巣切片上のＨ４ａｃとＰＲＭ２は相反する発現を示しているが、Ｐｈｆ７^ｔＫＯとＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの精巣ではすべての洗浄管でＨ４ａｃが検出されてＰＲＭ２と共同染色された（図４Ｈ）。ＴＮＰ２とＰＲＭ１は、ステップ１１精細胞（１１段階）から発現するため、対照群ではただステップ１１－１２精細胞（１１－１２段階）だけにおいてＨ４ａｃと二つのタンパク質が共同染色になった。しかし、Ｐｈｆ７^ｔＫＯとＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスでは、すべての洗浄管にＨ４ａｃが発現するため、ＴＮＰ２とＰＲＭ１が発現するすべての精細胞でＨ４ａｃと共同染色になる（図１３Ａ、Ｂ）。Ｐｈｆ７^ｔＫＯとＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの凝縮型精細胞でヒストンが残っていることを観察したため、Ｐｈｆ７^ｔＫＯとＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの凝縮型精細胞でＨ４ａｃが残っていることである。

【0069】

ＰＨＦ７とＨ４ａｃとの間の関係を調べるために、Ｆｌａｇ－ＰＨＦ７ ＫＩマウスを作製した（ここからＰｈｆ７^Ｆｌａｇ）（図１４Ａ）。Ｐｈｆ７^{Ｆｌａｇ／＋}マウスの精巣細胞を利用した免疫ブロット分析でＦｌａｇ－ＰＨＦ７タンパク質の発現を確認した（図１４Ｂ）。Ｆｌａｇ抗体で組織免疫染色をした時、１１段階から２段階洗浄管で、ステップ１１－１２精細胞の核内でＦｌａｇ－ＰＨＦ７を検出した（図１４Ｃ、Ｄ）。Ｐｈｆ７^{Ｆｌａｇ／＋}マウスの精巣切片でＨ４ａｃとＦｌａｇを共同免疫染色するとＦｌａｇ－ＰＨＦ７はＨ４ａｃ誘導以後に発現してステップ１１－１２精細胞でＨ４ａｃのように発現する（図１４Ｅ）。ＰＨＦ７の発現タイミングは、ＰＨＦ７の欠陥がＨ４過アセチル化の誘導には影響を与えないことを示す。

【0070】

まとめると、Ｐｈｆ７^ｔＫＯとＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの凝縮型精細胞で非正常的に残っているＨ４アセチル化は、精子成熟過程の間ヒストン除去が不完全に起きたためであると見ることができる。このような結果は、Ｐｈｆ７^ｔＫＯとＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスでＨ４過アセチル化以後ヒストン除去に問題があることを示す（図４Ｉ）。

【0071】

実施例５．ＰＨＦ７の欠陥は初期凝縮型精細胞でＢＲＤＴの減少を誘発して不完全なヒストン除去につながることを究明
Ｐｈｆ７^ｔＫＯとＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスでＨ４過アセチル化以後ヒストン除去がなぜ壊れたのか分子機構を調べるために、まずＨ４アセチル化を認知するヒストン除去因子であるＢＲＤＴのレベルを測定した。驚くべきことに、Ｐｈｆ７^ｔＫＯとＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスの精細胞でＢＲＤＴのタンパク質レベルｍＲＮＡレベルは差がなく対照群に比べて低いことを示した（図５Ａ、５Ｂ）。Ｐｈｆ７^ｔＫＯとＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスでどの精子成熟時期にＢＲＤＴが減っているのか確認するために、ＢＲＤＴとＨ４ａｃに対して組織免疫染色を行った。ＢＲＤＴは、精母細胞からマウスでは伸長型精細胞、ヒトでは精子まで検出されると知らされているが、本研究者等は、ＢＲＤＴが対照群マウスでステップ１２精細胞まで発現して、その発現がステップ１３精細胞で減少することを確認した（図５Ｃ、５Ｄ）。Ｈ４ａｃは、ステップ１１精細胞とステップ１２精細胞の核でＢＲＤＴと共同染色されて、それらのレベルがステップ１３精細胞で減少した（図５Ｅ）。驚くべきことに、Ｐｈｆ７^ｔＫＯとＰｈｆ７^{ＣＡ／ＣＡ}マウスのステップ１２精細胞でＢＲＤＴのレベルが減少して、ステップ１２精細胞とステップ１３精細胞の核でＨ４ａｃがより多く残っているのを観察した（図５Ｃ－５Ｅ）。ヒストンは、後期伸長型精細胞から初期凝縮型精細胞までの時期に除去されて、Ｈ４ａｃはステップ１３精細胞で検出されない。このデータは、ステップ１２精細胞までのＨ４ａｃとＢＲＤＴの共同発現がヒストン除去に重要で、ＰＨＦ７のＥ３ユビキチンリガーゼ活性がステップ１２精細胞でＢＲＤＴレベルを維持するのに必要であることを示す。従って、ＰＨＦ７の欠陥がステップ１２精細胞でＢＲＤＴレベル維持に失敗して、これによって不完全なヒストン除去が起きたと推定した。

【0072】

実施例６．ＰＨＦ７のＥ３ユビキチンリガーゼ活性はＢＲＤＴ安定性に重要であることを究明
減数分裂後、精細胞でＰＨＦ７がＢＲＤＴとの関連性を分析するために、まずＰｈｆ７^{Ｆｌａｇ／＋}マウスの精細胞でＰＨＦ７とＢＲＤＴの共同発現を確認した。組織免疫染色結果は、ＰＨＦ７とＢＲＤＴがステップ１１－１２精細胞で共に発現するのを示す（図６Ａ）。ＢＲＤ２、３、４を含むＢＥＴファミリーは、ＢＤ１とＢＤ２との問にＳＰＯＰデグロンがあるが、Ｃｕｌ３－ＳＰＯＰ Ｅ３ユビキチンリガーゼによって安定性が調節される。重要なことに、本研究者等は同じファミリーの中の一つであるＢＲＤＴにＳＰＯＰデグロン配列があることを見出した（図６Ｂ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＢＲＤＴとＳＰＯＰを過発現後に進行した免疫ブロット結果は、ＳＰＯＰによるＢＲＤＴ分解がＭＧ１３２処理によって抑制されることを示す（図６Ｃ）。ＳＰＯＰデグロン配列がないＢＲＤＴ突然変異は、ＳＰＯＰによって影響されなかったが、これはＣｕｌ３－ＳＰＯＰがＢＲＤＴを分解させるＥ３ユビキチンリガーゼであることを示している。

【0073】

ＰＨＦ７がＢＲＤＴ安定性に影響を与えるのか調べるために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＢＲＤＴ、ＳＰＯＰ、ＰＨＦ７を過発現した。ＰＨＦ７ ＷＴは、ＳＰＯＰを媒介した分解を弱化させることによって、ＢＲＤＴタンパク質量を増やした反面、ＰＨＦ７ Ｃ１６０Ａはそうでなかった（図６Ｄ）。ＳＰＯＰの知らされた基質であるＢＲＤ４とＰＴＥＮは、ＰＨＦ７によって増加しなかったが、ＰＨＦ７がＳＰＯＰの活性に影響を与えなかったことを示す。ＳＰＯＰとＣｕｌ３は、精細胞で発現してＰＨＦ７突然変異精細胞でＢＲＤ４とＰＴＥＮも対照群と大きい差はなかった（図６Ｅ）。次に、ユビキチン化アッセイでＰＨＦ７ Ｃ１６０ＡでないＷＴだけがＢＲＤＴのユビキチン化を弱化させた（図６Ｆ）。細胞免疫染色分析は、ＢＲＤＴ、ＳＰＯＰ、ＰＨＦ７が核内で共に発現することを示した（図６Ｇ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイは、ＰＨＦ７自体がＳＰＯＰによって誘導されたＢＲＤＴのユビキチン化を弱化させることはなかった（図６Ｈ）。これは、ＰＨＦ７が直接的にＢＲＤＴのユビキチン化を調節しないことを示している。まとめると、このデータは、ＰＨＦ７のＥ３ユビキチンリガーゼ活性はＳＰＯＰによるＢＲＤＴの分解を弱化させることによって、ＢＲＤＴ安定性を維持するのに重要であることを示す。

【0074】

ＰＨＦ７がＢＲＤＴタンパク質安定性にどのように影響を与えるのか調べるために、まずＰＨＦ７とＢＲＤＴの結合を確認した。しかし、ＰＨＦ７はＢＲＤＴと直接的に付かず（図７Ａ）、それで、ＰＨＦ７を媒介したヒストンユビキチン化がＢＲＤＴの調節と関連があるか調べることにした。ＧＳＴ－ＢＲＤＴとヒストンユビキチン化やＨ４ａｃを有するヌクレオソームを利用したｉｎ ｖｉｔｒｏプルダウンアッセイは、ＰＨＦ７媒介ヒストンユビキチン化がＨ４ａｃを有するヌクレオソームとＢＲＤＴの結合を弱く増加させた（図７Ｂ）。それにもかかわらず、ＰＨＦ７媒介ヒストンユビキチン化とＨ４ａｃを有するヌクレオソームがＳＰＯＰによって誘導されたＢＲＤＴユビキチン化を抑制して、各々一つずつあるヌクレオソームはそうでなかった（図７Ｃ）。このデータは、ＰＨＦ７媒介ヒストンユビキチン化は、Ｈ４ａｃがある時にＢＲＤＴと相互作用して、ＢＲＤＴのユビキチン化を調節することを示している。伸長型精細胞でＨ４過アセチル化以後、ＢＲＤＴがＨ４ａｃを認知してＰＨＦ７媒介ヒストンユビキチン化は、初期凝縮型精細胞でＢＲＤＴの安定化に寄与して、ヒストン除去を促進することが推定される（図７Ｄ）。

【0075】

ショウジョウバエでＰＨＦ７は、初期生殖細胞で雄特異的な遺伝子発現を活性化させることによって、原細胞としての決定を調節すると知らされている。マウスで、従来の研究は、円形精細胞でＰＨＦ７媒介Ｈ２Ａｕｂに焦点が合わされて、以後伸長型精細胞でヒストン－プロタミン交換に必要な過程であるＲＮＦ８媒介Ｈ２Ａｕｂ及びＨ２Ｂｕｂが起きると推定した。

【0076】

本願では、Ｈ３Ｋ１４ｕｂがＰＨＦ７のさらに他の基質であり、精子成熟過程でヒストン－プロタミン交換に重要であることを明らかにした。伸長型精細胞でＨ４過アセチル化以後、ＰＨＦ７媒介ヒストンユビキチン化がこれと組み合わせてＢＲＤＴの安定化に寄与して、即ち、ＰＨＦ７が初期凝縮型精細胞でＢＲＤＴを維持する重要な役割をするようになる。ＰＨＦ７の欠陥は、Ｈ３Ｋ１４ｕｂの欠乏を誘導し、続いて初期凝縮型精細胞でＢＲＤＴタンパク質量を減少させて、ヒストンが残っている非正常的な精子の発生を誘導するようになる。本発明は、ヒストンユビキチン化によりクロマチン上の豊富なＢＲＤＴヒストン－プロタミン交換のためのヒストン除去を促進するのを提示する。

【0077】

以上で、本願の例示的な実施例について詳細に説明したが、本願の権利範囲は、これに限定されず次の請求の範囲で定義している本願の基本概念を利用した当業者の様々な変形及び改良形態も本願の権利範囲に属するものである。

【0078】

本発明で使われるすべての技術用語は、別に定義されない限り、本発明の関連分野で通常の当業者が一般的に理解するもののような意味で使われる。本明細書に参考文献と記載されるすべての刊行物の内容は、本発明に取り入れる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【国際調査報告】