特表 2023-521956 抗体薬物複合体の調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-26

(54)【発明の名称】抗体薬物複合体の調製方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/68 20170101AFI20230519BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230519BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALI20230519BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230519BHJP

   C07K 16/30 20060101ALN20230519BHJP

   C07K 7/00 20060101ALN20230519BHJP

【ＦＩ】

A61K47/68

A61P35/00 ZNA

A61K31/4745

A61K39/395 C

A61K39/395 L

C07K16/30

C07K7/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022557990

(86)(22)【出願日】2021-03-25

(85)【翻訳文提出日】2022-09-22

(86)【国際出願番号】 CN2021083014

(87)【国際公開番号】W WO2021190602

(87)【国際公開日】2021-09-30

(31)【優先権主張番号】202010219311.2

(32)【優先日】2020-03-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202110297397.5

(32)【優先日】2021-03-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516174219

【氏名又は名称】江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司

(71)【出願人】

【識別番号】516174208

【氏名又は名称】上海恒瑞医薬有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】ＮＯ． ２７９ ＷＥＮＪＩＮＧ ＲＯＡＤ， ＭＩＮＨＡＮＧ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＳＨＡＮＧＨＡＩ ２００２４５， ＣＨＩＮＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(72)【発明者】

【氏名】梁 志

(72)【発明者】

【氏名】林 文鋒

(72)【発明者】

【氏名】石 瑞君

(72)【発明者】

【氏名】劉 洵

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF68

4C085AA14

4C085AA26

4C085CC23

4C085DD51

4C086AA04

4C086CB22

4C086NA13

4C086ZB26

4H045AA11

4H045BA13

4H045BA14

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA10

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、合成と精製工程を含む、抗体薬物複合体の調製方法に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体薬物複合体の調製方法であって、前記抗体薬物複合体の構造は、一般式（Ｐｃ－Ｌ_ａ－Ｙ－Ｄ）、即ち、

【化1】

で示され、
そのうち、
Ｗは、Ｃ_１－８アルキル基、Ｃ_１－８アルキル－Ｃ_３－７シクロアルキル基又は１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、前記直鎖ヘテロアルキル基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、前記Ｃ_１－８アルキル基、Ｃ_３－７シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ_１－６アルキル基、クロロＣ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基、Ｃ_１－６アルコキシ基及びＣ_３－７シクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ^２は－ＮＲ^４（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｐ^１ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ^４（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｐ^１ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ_２）ｐ^１Ｃ（Ｏ）－及び化学結合から選ばれ、そのうち、ｐ^１は１～２０の整数であり、
Ｌ^３は、２～７個のアミノ酸残基からなるペプチド残基であり、そのうち、前記アミノ酸残基はフェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸及びアスパラギン酸から選ばれるアミノ酸から形成されるアミノ酸残基であり、且つ任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ_１－６アルキル基、クロロＣ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基、Ｃ_１－６アルコキシ基及びＣ_３－７シクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｒ^１は、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基又はＣ_３－７シクロアルキル基であり、
Ｒ^２は、水素原子、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基及びＣ_３－７シクロアルキル基から選ばれ、
或いは、Ｒ^１とＲ^２は、それらに連結された炭素原子と共にＣ_３－７シクロアルキル基を形成し、
Ｒ^５は水素原子、Ｃ_１－６アルキル基、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基及びヒドロキシＣ_１－６アルキル基から選ばれ、
Ｒ^６とＲ^７は、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、ハロゲン、Ｃ_１－６アルキル基、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基及びヒドロキシＣ_１－６アルキル基から選ばれ、
ｍは０又は１であり、
ｎは３～８で、ｎは小数又は整数であり、
Ｐｃは、抗体又はその抗原結合断片であり、
前記調製方法は、
約１℃～約３６℃の反応温度の条件下で、抗体又はその抗原結合断片と還元剤とを反応させるステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）の生成物と、下記の式（Ｌａ－Ｙ－Ｄ）、即ち、

【化2】

で示される化合物とを反応させるステップ（ｂ）と、を含み、
そのうち、Ｗ、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７及びｍは前記に定義された通りである、
抗体薬物複合体の調製方法。

【請求項2】

ステップ（ａ）における前記反応温度条件は約４℃～約３０℃で、好ましくは約２０℃～約３０℃であり、より好ましくは約２５℃である、請求項１に記載の抗体薬物複合体の調製方法。

【請求項3】

ステップ（ａ）における反応は、ｐＨが約４．５～約６．５の条件下で行われ、好ましくは、前記反応はｐＨが約５．０～約６．０の条件下で行われ、より好ましくは、前記反応はｐＨが約５．６の条件下で行われる、請求項１又は２に記載の抗体薬物複合体の調製方法。

【請求項4】

ステップ（ａ）における反応は緩衝剤において行われ、好ましくは、前記緩衝剤はヒスチジン塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤及び酢酸塩緩衝剤から選ばれ、より好ましくは、前記緩衝剤はＥＤＴＡを含むヒスチジン塩緩衝剤である、請求項１～３の何れか一項に記載の抗体薬物複合体の調製方法。

【請求項5】

ステップ（ａ）における前記還元剤は、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン又はその塩、１，４－ジチオトレイトール及びβ－メルカプトエタノールから選ばれ、好ましくはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩である、請求項１～４の何れか一項に記載の抗体薬物複合体の調製方法。

【請求項6】

前記調製方法は、ステップ（ｂ）の生成物をカチオンカラムクロマトグラフィー又は親和性カラムクロマトグラフィーにより精製するステップ（ｃ）を更に含み、好ましくは、前記ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）の生成物に対してカチオンカラムクロマトグラフィーを行うことを含み、前記カチオンクロマトグラフィーの充填材はＣａｐｔｏ Ｓ Ｉｍｐａｃｔ及びＰｏｒｏｓ ＸＳから選ばれ、好ましくはＣａｐｔｏ Ｓ Ｉｍｐａｃｔである、請求項１～５の何れか一項に記載の抗体薬物複合体の調製方法。

【請求項7】

前記抗体又はその抗原結合断片は、抗ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体、抗ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）抗体、抗ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ａ３３抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣｌ抗体、抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体及び抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体、又はその抗原結合断片から選ばれ、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片はＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ、Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ、Ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ、Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ、Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ、Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ、Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ、Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ、ｃＢＲ９６及びＧｌｅｍａｔｕｍａｍａｂ、又はその抗原結合断片から選ばれる、
請求項１～６の何れか一項に記載の抗体薬物複合体の調製方法。

【請求項8】

前記抗体薬物複合体は、下記の式、即ち、

【化3】

で示される構造を有し、
そのうち、ｎは４～８で、ｎは小数又は整数である、
請求項１～７の何れか一項に記載の抗体薬物複合体の調製方法。

【請求項9】

ｎは４～８の小数又は整数、好ましくは５～７の小数又は整数、より好ましくは５．３～６．１の小数又は整数である、請求項１～８の何れか一項に記載の抗体薬物複合体の調製方法。

【請求項10】

前記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下であり、
好ましくは、前記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下であり、及び抗体軽鎖グループにおいて、１つの薬物と結合する抗体軽鎖の割合が６５％以上である、
請求項１～９の何れか一項に記載の抗体薬物複合体の調製方法。

【請求項11】

抗体薬物複合体の調製方法であって、前記抗体薬物複合体は、下記の式、即ち、

【化4】

で示される構造を有し、
そのうち、ｎは４～８で、ｎは小数又は整数であり、
前記調製方法は、
反応温度が約４℃～約３０℃、及びｐＨが約５．０～約６．０である条件下で、ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＴＣＥＰとを反応させるステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）の生成物と、下記の式、即ち、

【化5】

で示される化合物とを反応させるステップ（ｂ）と、を含む、
抗体薬物複合体の調製方法。

【請求項12】

抗体薬物複合体の調製方法であって、前記抗体薬物複合体は、下記の式、即ち、

【化6】

で示される構造を有し、
そのうち、ｎは４～８で、ｎは小数又は整数であり、
前記調製方法は、
反応温度が約２５℃、及びｐＨが約５．６である条件下で、ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＴＣＥＰとを反応させ、前記反応がＥＤＴＡを含むヒスチジン－塩酸緩衝剤において行われるステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）の生成物と、下記の式、即ち、

【化7】

で示される化合物とを反応させるステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）の生成物をカチオンクロマトグラフィーカラムにより精製することを含むステップ（ｃ）と、を含む、
抗体薬物複合体の調製方法。

【請求項13】

抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、前記抗体薬物複合体の構造は一般式（Ｐｃ－Ｌ_ａ－Ｙ－Ｄ）、即ち、

【化8】

で示され、
そのうち、
Ｗは、Ｃ_１－８アルキル基、Ｃ_１－８アルキル－Ｃ_３－７シクロアルキル基又は１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、前記直鎖ヘテロアルキル基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、前記Ｃ_１－８アルキル基、Ｃ_３－７シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ_１－６アルキル基、クロロＣ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基、Ｃ_１－６アルコキシ基及びＣ_３－７シクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ^２は－ＮＲ^４（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｐ^１ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ^４（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｐ^１ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ_２）ｐ^１Ｃ（Ｏ）－及び化学結合から選ばれ、そのうち、ｐ^１は１～２０の整数であり、
Ｌ^３は、２～７個のアミノ酸残基からなるペプチド残基であり、そのうち、前記アミノ酸残基はフェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸及びアスパラギン酸から選ばれるアミノ酸から形成されるアミノ酸残基であり、且つ任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ_１－６アルキル基、クロロＣ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基、Ｃ_１－６アルコキシ基及びＣ_３－７シクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｒ^１は、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基又はＣ_３－７シクロアルキル基であり、
Ｒ^２は、水素原子、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基及びＣ_３－７シクロアルキル基から選ばれ、
或いは、Ｒ^１とＲ^２は、それらに連結された炭素原子と共にＣ_３－７シクロアルキル基を形成し、
Ｒ^５は水素原子、Ｃ_１－６アルキル基、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基及びヒドロキシＣ_１－６アルキル基から選ばれ、
Ｒ^６とＲ^７は、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、ハロゲン、Ｃ_１－６アルキル基、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基及びヒドロキシＣ_１－６アルキル基から選ばれ、
ｍは０又は１であり、
ｎは４～８で、ｎは小数又は整数であり、
Ｐｃは、抗体又はその抗原結合断片であり、
また、前記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下であり、
好ましくは、前記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下であり、及び抗体軽鎖グループにおいて、１つの薬物と結合する抗体軽鎖の割合が６５％以上である、
抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。

【請求項14】

抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、前記抗体薬物複合体は、請求項１～９の何れか一項に記載の抗体薬物複合体の調製方法により調製されて得られ、且つ、前記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下であり、
好ましくは、前記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下であり、及び抗体軽鎖グループにおいて、１つの薬物と結合する抗体軽鎖の割合が６５％以上である、
抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。

【請求項15】

抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、前記抗体薬物複合体は、下記の式、即ち、

【化9】

で示される構造を有し、
そのうち、ｎは４～８で、ｎは小数又は整数であり、
前記抗体薬物複合体は、請求項１１又は１２に記載の抗体薬物複合体の調製方法により調製されて得られ、且つ、前記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下であり、
好ましくは、前記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下であり、及び抗体軽鎖グループにおいて、１つの薬物と結合する抗体軽鎖の割合が６５％以上である、
抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、抗体薬物複合体の調製方法に関し、特に、抗体薬物複合体の調製方法の合成工程及び精製工程に関する。

【背景技術】

【0002】

ここでの記載は、必ずしも従来技術を構成するものではなく、本開示に関連する背景情報のみを提供する。

【0003】

化学療法は依然として、手術、放射線療法、及び標的治療法を含む最も重要な抗がん手段の一つである。有効性の高い細胞毒性薬剤の種類が多いが、腫瘍細胞と正常細胞との間に差異が小さく、毒性や副作用があるため、これらの抗腫瘍化合物の幅広い臨床適用が制限されている。しかし、抗腫瘍モノクローナル抗体は腫瘍細胞の表面抗原に特異性を有するため、抗体薬物は抗腫瘍治療法の最先端の医薬品となっているが、抗体を抗腫瘍薬として単独で使用する場合に、治療効果が不十分であることはよくある。

【0004】

抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、モノクローナル抗体又は抗体断片を、安定した化学リンカー化合物により生物活性を有する細胞毒性薬剤に連結し、抗体の正常細胞と腫瘍細胞の表面抗原への結合の特異性及び細胞毒性薬剤の高い有効性を活用していると共に、前者の治療効果が比較的低い、及び後者の毒性や副作用が大きすぎるといった欠陥を回避している。これはつまり、従来の化学療法薬と比べ、抗体薬物複合体が腫瘍細胞と正確に結合すると共に、正常細胞への影響を低減することができることを意味する（Ｍｕｌｌａｒｄ Ａ， （２０１３） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， １２：３２９-３３２；ＤｉＪｏｓｅｐｈ ＪＦ， Ａｒｍｅｌｌｉｎｏ ＤＣ， （２００４） Ｂｌｏｏｄ， １０３：１８０７－１８１４）。

【0005】

２０００年に、最初の抗体薬物複合体であるＭｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ワイス製薬株式会社）は、急性骨髄性白血病の治療に用いられるように、アメリカＦＤＡにより発売が承認された（Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ （２０００） ２５（７）：６８６；ＵＳ４９７０１９８；ＵＳ ５０７９２３３；ＵＳ ５５８５０８９；ＵＳ ５６０６０４０；ＵＳ ５６９３７６２；ＵＳ ５７３９１１６；ＵＳ ５７６７２８５；ＵＳ ５７７３００１）。

【0006】

２０１１年８月に、Ａｄｃｅｔｒｉｓ^(R)（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ、Ｓｅａｇｅｎ社）は、ホジキンリンパ腫及び再発性未分化大細胞リンパ腫の治療に用いられるように、アメリカＦＤＡの迅速審査で承認された（Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２００３） ２１（７）：７７８－７８４；ＷＯ２００４０１０９５７；ＷＯ２００５００１０３８；ＵＳ７０９０８４３；ＵＳ７６５９２４１；ＷＯ２００８０２５０２０）。Ａｄｃｅｔｒｉｓ^(R)は、新規のＡＤＣ薬剤であり、薬剤をリンパ腫細胞での標的ＣＤ３０に直接作用させた後にエンドサイトーシスを発生させることで、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することができる。

【0007】

Ｍｙｌｏｔａｒｇ及びＡｄｃｅｔｒｉｓは何れも、血液系腫瘍に対して標的治療を行うものであり、血液系腫瘍は固形腫瘍と比べて、組織の構造がより簡単である。２０１３年２月、Ｋａｄｃｙｌａ（ａｄｏ－ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ、Ｔ－ＤＭ１）は、ＨＥＲ２陽性であると共にトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、商品名：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）及びタキソールに対して薬剤耐性がある進行性又は転移性乳がん患者（ＷＯ２００５０３７９９２、ＵＳ８０８８３８７）の治療に用いられるように、アメリカＦＤＡにより承認された。Ｋａｄｃｙｌａは、アメリカＦＤＡにより承認された、固形腫瘍を治療する最初のＡＤＣ薬剤である。

【0008】

抗体薬物複合体に用いられる細胞毒性を有する小分子は、幾つかの種類があるが、そのうちの一つは、トポイソメラーゼＩを阻害することにより抗腫瘍作用を有するカンプトセシン誘導体である。カンプトセシン誘導体であるエキサテカン（化学名：（１Ｓ，９Ｓ）－１－アミノ－９－エチル－５－フルオロ－２，３－ジヒドロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３，４：６，７］イミダゾ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）－ジオン）を抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に適用することを報告した文献には、ＷＯ２０１４０５７６８７、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６）２２（２０）：５０９７－５１０８、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ（２０１６） １０７：１０３９－１０４６がある。しかし、治療効果がより良いＡＤＣ薬剤のさらなる開発は依然として必要である。

【発明の概要】

【0009】

本開示は、抗体薬物複合体の調製方法を提供し、上記抗体薬物複合体の構造は一般式（Ｐｃ－Ｌ_ａ－Ｙ－Ｄ）、即ち、

【化1】

で示され、
そのうち、
Ｗは、Ｃ_１－８アルキル基、Ｃ_１－８アルキル－Ｃ_３－７シクロアルキル基又は１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、上記直鎖ヘテロアルキル基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、上記Ｃ_１－８アルキル基、Ｃ_３－７シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ_１－６アルキル基、クロロＣ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基、Ｃ_１－６アルコキシ基及びＣ_３－７シクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ^２は－ＮＲ^４（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｐ^１ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ^４（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｐ^１ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ_２）ｐ^１Ｃ（Ｏ）－及び化学結合から選ばれ、そのうち、ｐ^１は１～２０の整数であり、
Ｌ^３は、２～７個のアミノ酸残基からなるペプチド残基であり、そのうち、上記アミノ酸残基はフェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、リジン（Ｋ）、シトルリン、セリン（Ｓ）、グルタミン酸（Ｑ）及びアスパラギン酸（Ｄ）から選ばれるアミノ酸から形成されるアミノ酸残基であり、且つ任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ_１－６アルキル基、クロロＣ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基、Ｃ_１－６アルコキシ基及びＣ_３－７シクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｒ^１は、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基又はＣ_３－７シクロアルキル基であり、
Ｒ^２は、水素原子、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基及びＣ_３－７シクロアルキル基から選ばれ、
或いは、Ｒ^１とＲ^２は、それらに連結された炭素原子と共にＣ_３－７シクロアルキル基を形成し、
Ｒ^５は水素原子、Ｃ_１－６アルキル基、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基及びヒドロキシＣ_１－６アルキル基から選ばれ、
Ｒ^６とＲ^７は、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、ハロゲン、Ｃ_１－６アルキル基、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基及びヒドロキシＣ_１－６アルキル基から選ばれ、
ｍは０又は１であり、
ｎは３～８で、ｎは小数又は整数であり、
Ｐｃは、抗体又はその抗原結合断片であり、
上記調製方法は、
約１℃～約３６℃の反応温度の条件下で、抗体又はその抗原結合断片と還元剤とを反応させるステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）の生成物と、下記の式（Ｌａ－Ｙ－Ｄ）、即ち、

【化2】

で示される化合物とを反応させるステップ（ｂ）と、を含み、
そのうち、Ｗ、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７及びｍは上記に定義された通りである。

【0010】

別の態様において、本開示は、抗体薬物複合体の調製方法を提供し、上記抗体薬物複合体は、下記の式、即ち、

【化3】

で示される構造を有し、
そのうち、ｎは４～８で、ｎは小数又は整数であり、
上記調製方法は、
約１℃～約３６℃の反応温度の条件下で、抗体又はその抗原結合断片と還元剤とを反応させるステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）の生成物と、下記の式、即ち、

【化4】

で示される化合物とを反応させるステップ（ｂ）と、を含む。

【0011】

選択的な実施形態において、ステップ（ａ）における上記反応温度条件は約４℃～約３０℃、好ましくは約２０℃～約３０℃、より好ましくは２５℃であり、非限定的な実施例は、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃を含む。幾つかの実施形態において、上記反応温度条件は１３℃～２８℃又は１３℃～２５℃である。

【0012】

選択的な実施形態において、ステップ（ａ）における反応はｐＨが約４．５～約６．５の条件下で行われ、好ましくは、上記反応はｐＨが約５．０～約６．０の条件下で行われ、より好ましくは、上記反応はｐＨが約５．６の条件下で行われる。非限定的な実施例において、反応は、ｐＨが約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、又は約６．０で行われる。

【0013】

選択的な実施形態において、ステップ（ａ）における反応は緩衝剤において行われ、非限定的な実施例において、上記緩衝剤はヒスチジン塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤及び酢酸塩緩衝剤から選ばれる。

【0014】

選択的な実施形態において、ステップ（ａ）における反応は緩衝剤において行われ、非限定的な実施例において、上記緩衝剤はヒスチジン－塩酸緩衝剤である。

【0015】

選択的な実施形態において、上記緩衝剤は、ＥＤＴＡを含むヒスチジン塩緩衝剤及びＥＤＴＡを含むヒスチジン－塩酸緩衝剤から選ばれる。例えば、上記ヒスチジン塩緩衝剤の濃度は１ ｍＭ～１００ ｍＭ、１０ ｍＭ～５０ ｍＭ、２０ ｍＭ、３０ ｍＭ又は４０ ｍＭであり、ＥＤＴＡの濃度は１ ｍＭ～１０ ｍＭ、２ ｍＭ～５ ｍＭ、２．５ ｍＭ、３ ｍＭ又は４ ｍＭである。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤は、１０ ｍＭ～５０ ｍＭのヒスチジン塩緩衝剤及び１ ｍＭ～１０ ｍＭのＥＤＴＡを含む。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤は、２０ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝剤及び２．５ ｍＭのＥＤＴＡを含む。ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸を指す。

【0016】

選択的な実施形態において、ステップ（ａ）における上記還元剤は、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）又はその塩、１，４－ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びβ－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）などの好適な還元剤から選ばれ、好ましくはＴＣＥＰ又はその塩、より好ましくはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩である。

【0017】

選択的な実施形態において、ステップ（ａ）における還元剤と抗体又はその抗原結合断片（Ｐｃ）とのモル比は、２～１０：１、２．６～７：１、２．９～３．７：１、３．２～３．４：１又は３．３：１である。

【0018】

選択的な実施形態において、ステップ（ｂ）は有機溶剤において行われ、好ましい有機溶剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、アセトニトリル又はその混合物を含む。非限定的な実施例において、ステップ（ｂ）は、式（Ｌａ－Ｙ－Ｄ）で示される化合物をＤＭＳＯに溶解し、ステップ（ａ）の生成物を式（Ｌａ－Ｙ－Ｄ）で示される化合物のＤＭＳＯ溶液と混合することを含む。

【0019】

選択的な実施形態において、上記調製方法は、ステップ（ｂ）の生成物を精製することを含むステップ（ｃ）を更に含む。上記精製は、カチオンカラムクロマトグラフィー又は親和性カラムクロマトグラフィーにより精製することができ、上記カチオンクロマトグラフィーの充填材は、Ｃａｐｔｏ Ｓ Ｉｍｐａｃｔ及びＰｏｒｏｓ ＸＳから選ばれ、好ましくはＣａｐｔｏ Ｓ Ｉｍｐａｃｔである。幾つかの実施形態において、上記Ｃａｐｔｏ Ｓ Ｉｍｐａｃｔは、Ｃａｐｔｏ^ＴＭ Ｓ Ｉｍｐａｃｔである。幾つかの実施形態において、上記Ｐｏｒｏｓ ＸＳは、Ｐｏｒｏｓ^ＴＭ ＸＳである。

【0020】

選択的な実施形態において、薬物負荷量（ｎ）の範囲としては、それぞれの抗体又はその抗原結合断片（Ｐｃ）が３～８個、４～８個、５～７個、好ましくは５．３～６．１個、より好ましくは５．７個の細胞毒性薬剤と結合してもよい。ｎは小数又は整数である。幾つかの実施形態において、ｎは５．３、５．４、５．５、５．６又は５．７である。

【0021】

選択的な実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であり、好ましくは、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が６％以下である。非限定的な実施例において、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合は４％以下、３％以下、２％以下又は１％以下で、薬物と結合しない抗体重鎖の割合は６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下又は１％以下である。又は、抗体軽鎖グループにおいて、１つの薬物と結合する抗体軽鎖の割合は６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が１％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が４％以下である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下であり、及び抗体軽鎖グループにおいて、１つの薬物と結合する抗体軽鎖の割合が６５％以上である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が１％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が４％以下であり、及び抗体軽鎖グループにおいて、１つの薬物と結合する抗体軽鎖の割合が７０％以上である。幾つかの実施形態において、上記抗体重鎖の割合及び／又は抗体軽鎖の割合は、逆相クロマトグラフィーにより測定される。

【0022】

選択的な実施形態において、上記調製方法は、大量調製に適用される。上記調製方法のトラスツズマブの投与量は１００ ｍｇ以上、好ましくは１ ｇ以上、より好ましくは１０ ｇ以上、最も好ましくは１００ ｇ以上である。

【0023】

選択的な実施形態において、上記抗体薬物複合体は、一般式（Ｐｃ－Ｌ_ｂ－Ｙ－Ｄ）、即ち、

【化5】

で示される構造を有し、
そのうち、
ｓ^１は、２～８の整数であり、
Ｐｃ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、ｍ及びｎは上記に定義された通りであり、
上記調製方法は、
約１℃～約３６℃の反応温度の条件下で、抗体又はその抗原結合断片と還元剤とを反応させるステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）の生成物と、下記の式（Ｌ_ｂ－Ｙ－Ｄ）、即ち、

【化6】

で示される化合物とを反応させるステップ（ｂ）と、を含み、
そのうち、ｓ^１、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７及びｍは上記に定義された通りである。

【0024】

選択的な実施形態において、上記抗体薬物複合体は、下記の構造、即ち、

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

を有し、
そのうち、Ｐｃとｎは、一般式（Ｐｃ－Ｌａ－Ｙ－Ｄ）に定義された通りである。

【0025】

選択的な実施形態において、上記Ｐｃは、抗体又はその抗原結合断片であり、上記抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体から選ばれる。幾つかの実施形態において、上記抗体はモノクローナル抗体である。

【0026】

選択的な実施形態において、上記抗体又はその抗原結合断片は、抗ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体、抗ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）抗体、抗ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ａ３３抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣｌ抗体、抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体及び抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体、又はその抗原結合断片から選ばれ、
好ましくは、上記抗体又はその抗原結合断片は、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ、Ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ、Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ、ブレントキシマブ（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ、Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ、ｃＢＲ９６及びＧｌｅｍａｔｕｍａｍａｂ、又はその抗原結合断片から選ばれる。

【0027】

選択的な実施形態において、上記抗体複合体は、下記の式、即ち、

【化7】

で示される構造を有し、
そのうち、ｎは４～８で、ｎは小数又は整数である。

【0028】

別の態様において、本開示は、抗体薬物複合体の調製方法を提供し、上記抗体薬物複合体は、下記の式、即ち、

【化8】

で示される化合物とを反応させるステップ（ｂ）と、
そのうち、ｎは４～８で、ｎは小数又は整数であり、
上記調製方法は、
反応温度が約４℃～約３０℃、及びｐＨが約４．５～約６．５である条件下で、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とＴＣＥＰとを反応させるステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）の生成物と、下記の式、即ち、

【化9】

で示される化合物とを反応させるステップ（ｂ）と、を含む。

【0029】

選択的な実施形態において、上記抗体薬物複合体は、下記の式、即ち、

【化10】

で示される構造を有し、
そのうち、ｎは４～８で、ｎは小数又は整数であり、
上記調製方法は、
反応温度が約２５℃、及びｐＨが約５．６である条件下で、ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＴＣＥＰとを反応させ、上記反応がＥＤＴＡを含むヒスチジン－塩酸緩衝剤において行われるステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）の生成物と、下記の式、即ち、

【化11】

で示される化合物とを反応させるステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）の生成物をカチオンクロマトグラフィーカラム又は親和性クロマトグラフィーカラムにより精製することを含むステップ（ｃ）と、を含む。幾つかの実施形態において、上記ＥＤＴＡを含むヒスチジン－塩酸緩衝剤は、２０ ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝剤及び２．５ ｍＭのＥＤＴＡを含む。

【0030】

本開示は、抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩を更に提供し、上記抗体薬物複合体の構造は、一般式（Ｐｃ－Ｌ_ａ－Ｙ－Ｄ）、即ち、

【化12】

で示され、
そのうち、
Ｗは、Ｃ_１－８アルキル基、Ｃ_１－８アルキル－Ｃ_３－７シクロアルキル基又は１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、上記直鎖ヘテロアルキル基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、上記Ｃ_１－８アルキル基、Ｃ_３－７シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ_１－６アルキル基、クロロＣ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基、Ｃ_１－６アルコキシ基及びＣ_３－７シクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ^２は－ＮＲ^４（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｐ^１ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ^４（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｐ^１ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ_２）ｐ^１Ｃ（Ｏ）－及び化学結合から選ばれ、そのうち、ｐ^１は１～２０の整数であり、
Ｌ^３は、２～７個のアミノ酸残基からなるペプチド残基であり、そのうち、上記アミノ酸残基はフェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、リジン（Ｋ）、シトルリン、セリン（Ｓ）、グルタミン酸（Ｑ）及びアスパラギン酸（Ｄ）から選ばれるアミノ酸から形成されるアミノ酸残基であり、且つ任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ_１－６アルキル基、クロロＣ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基、Ｃ_１－６アルコキシ基及びＣ_３－７シクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｒ^１は、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基又はＣ_３－７シクロアルキル基であり、
Ｒ^２は、水素原子、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基及びＣ_３－７シクロアルキル基から選ばれ、
或いは、Ｒ^１とＲ^２は、それらに連結された炭素原子と共にＣ_３－７シクロアルキル基を形成し、
Ｒ^５は水素原子、Ｃ_１－６アルキル基、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基及びヒドロキシＣ_１－６アルキル基から選ばれ、
Ｒ^６とＲ^７は、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、ハロゲン、Ｃ_１－６アルキル基、ハロゲン化Ｃ_１－６アルキル基、重水素化Ｃ_１－６アルキル基及びヒドロキシＣ_１－６アルキル基から選ばれ、
ｍは０又は１であり、
ｎは４～８で、ｎは小数又は整数であり、
Ｐｃは、抗体又はその抗原結合断片であり、
上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であり、好ましくは、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が６％以下である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が１％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が４％以下である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下であり、及び抗体軽鎖グループにおいて、１つの薬物と結合する抗体軽鎖の割合が６５％以上である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が１％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が４％以下であり、及び抗体軽鎖グループにおいて、１つの薬物と結合する抗体軽鎖の割合が７０％以上である。

【0031】

本開示は、抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩を更に提供し、上記抗体薬物複合体は、上記の抗体薬物複合体の調製方法により調製されて得られ、且つ、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であり、好ましくは、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が６％以下である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が１％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が４％以下である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下であり、及び抗体軽鎖グループにおいて、１つの薬物と結合する抗体軽鎖の割合が６５％以上である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が１％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が４％以下であり、及び抗体軽鎖グループにおいて、１つの薬物と結合する抗体軽鎖の割合が７０％以上である。

【0032】

本開示は、抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩を更に提供し、上記抗体薬物複合体は、下記の式、即ち、

【化13】

で示される構造を有し、
そのうち、ｎは４～８で、ｎは小数又は整数であり、
上記抗体薬物複合体は、上記の抗体薬物複合体の調製方法により調製されて得られ、且つ、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であり、好ましくは、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が６％以下である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が１％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が４％以下である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が４％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が５％以下であり、及び抗体軽鎖グループにおいて、１つの薬物と結合する抗体軽鎖の割合が６５％以上である。幾つかの実施形態において、上記抗体薬物複合体の薬物負荷量分布は、抗体重鎖グループにおいて、４つの薬物と結合する抗体重鎖の割合が１％以下であると共に、薬物と結合しない抗体重鎖の割合が４％以下であり、及び抗体軽鎖グループにおいて、１つの薬物と結合する抗体軽鎖の割合が７０％以上である。
発明の詳細

【0033】

本開示は、大量生産により有利な調製方法を提供する。具体的に、上記調製方法で得られる製品は、薬物負荷量分布がより狭く、遊離毒素の含有量がより低く、収率がより高い。
用語

【0034】

本開示が更に容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本明細書で別途明示的に定義されていない限り、本明細書に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に通常理解されている意味を持っている。

【0035】

本開示は、出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１０７８７３における全ての内容を本願に取り込んでいる。

【0036】

「抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）」は、抗体又は抗体断片を、安定した化学リンカー化合物により生物活性を有する細胞毒素又は殺細胞活性を有する小分子薬物に連結し、抗体による腫瘍細胞への特異性又は高発現抗原細胞との結合の特異性及び細胞毒素の高い有効性を活用し、正常細胞への毒性や副作用を回避する。従来の化学療法薬と比べ、抗体薬物複合体は、腫瘍細胞と正確に結合すると共に、正常細胞への影響を低減することができる。

【0037】

「緩衝剤」は、その酸－塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に耐える緩衝剤を指す。ｐＨを適当な範囲に制御する緩衝剤の例は、酢酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、ヒスチジン塩、シュウ酸塩、乳酸塩、リン酸塩、枸櫞酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グリシルグリシン及び他の有機酸緩衝剤を含む。

【0038】

「ヒスチジン塩緩衝剤」は、ヒスチジンイオンを含む緩衝剤である。ヒスチジン塩緩衝剤の実例は、ヒスチジン－塩酸、ヒスチジン－酢酸、ヒスチジン－リン酸、ヒスチジン－硫酸などの緩衝剤を含み、好ましくはヒスチジン－塩酸緩衝剤であり、ヒスチジン－酢酸緩衝剤は、ヒスチジンと酢酸により調製されたもので、ヒスチジン塩酸緩衝剤は、ヒスチジンと塩酸又はヒスチジンとヒスチジンの塩酸塩により調製されたものである。

【0039】

「リン酸塩緩衝剤」は、リン酸イオンを含む緩衝剤である。リン酸塩緩衝剤の実例は、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム－枸櫞酸などを含む。好ましいリン酸塩緩衝剤は、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムである。

【0040】

「酢酸塩緩衝剤」は、酢酸イオンを含む緩衝剤である。酢酸塩緩衝剤の実例は、酢酸－酢酸ナトリウム、酢酸－ヒスチジン塩、酢酸－酢酸カリウム、酢酸－酢酸カルシウム、酢酸－酢酸マグネシウムなどを含む。好ましい酢酸塩緩衝剤は、酢酸－酢酸ナトリウムである。

【0041】

本明細書に使用される「約」、「ほぼ」という用語は、数値が当業者により測定された具体値の許容可能な誤差範囲にあることを意味し、上記数値部分が如何に計測又は測定するか（即ち、計測システムの限度）に依存する。例えば、この分野の各回の実行において「約」は、１以内又は１を超えた標準偏差を意味してもよい。又は、「約」又は「基本的に含む」は、多くとも２０％の範囲を意味してもよい。更に、特に生物学的システム又は過程について、当該用語は、多くとも１桁又は数値の多くとも５倍を意味してもよい。特に説明しない限り、具体値が本願及び請求項に現れる場合、「約」又は「基本的に含む」の意味は、当該具体値の許容可能な誤差範囲内にあると仮定すべきである。

【0042】

本開示に用いられるアミノ酸の３文字コードと１文字コードは、Ｊ． ｂｉｏｌ． ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）に記載された通りである。

【0043】

本開示に記載される「抗体」は免疫グロブリンを指し、完全抗体は２本の同じ重鎖と２本の同じ軽鎖が鎖間ジスルフィド結合により連結されてなるテトラペプチド鎖構造である。免疫グロブリンは、重鎖定常領域のアミノ酸組成と配列順序が異なるので、その抗原性も異なる。これにより、免疫グロブリンは、５種類に分けることができ、又は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥという免疫グロブリンのアイソタイプと呼ばれ、その対応する重鎖はそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同一種類のＩｇは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成及び重鎖ジスルフィド結合の数と位置の差によって、更に異なるサブクラスに分けることができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けられてもよい。軽鎖は、定常領域によって、κ鎖又はλ鎖に分けられる。５種類のＩｇのそれぞれは、κ鎖又はλ鎖を有してもよい。本開示に記載される抗体は、標的細胞における細胞表面抗原に対する特異性抗体が好ましく、非限定的な実施例としては、抗ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体、抗ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）抗体、抗ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ａ３３抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣｌ抗体、抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体又は抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体のうちの１つ又は複数であり、好ましくはトラスツズマブ（トラスツズマブ、商品名：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ペルツズマブ（ペルツズマブで、２Ｃ４とも呼ばれ、商品名：Ｐｅｒｊｅｔａ）、ニモツズマブ（ニモツズマブ、商品名：泰欣生）、Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ、Ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ、Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ、ブレントキシマブ、ゲムツズマブ、Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ、Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ、ｃＢＲ９６及びＧｌｅｍａｔｕｍａｍａｂである。

【0044】

抗体重鎖及び軽鎖は、Ｎ末端に近い約１１０個のアミノ酸の配列の変化が大きくて、可変領域（Ｆｖ領域）となり、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列が比較的に安定的で、定常領域となる。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と、４つの配列が比較的に保存的な骨格領域（ＦＲ）とを含む。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。それぞれの軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、３つのＣＤＲ領域と、４つのＦＲ領域とからなり、アミノ基末端からカルボキシ基末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列されている。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３であり、重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３である。本開示に記載される抗体又は抗原結合断片のＬＣＶＲ領域及びＨＣＶＲ領域のＣＤＲアミノ基酸残基は、数量と位置において既知のＫａｂａｔ番号付け規則（ＬＣＤＲ１－３、ＨＣＤＲ１－３）に合致する。

【0045】

本開示において、本開示に記載される抗体軽鎖は、軽鎖定常領域を更に含んでもよく、上記軽鎖定常領域はヒト又はマウスのκ、λ鎖又はその変異体を含む。

【0046】

本開示において、本開示に記載される抗体重鎖は、重鎖定常領域を更に含んでもよく、上記重鎖定常領域はヒト又はマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はその変異体を含む。

【0047】

本開示の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を含み、好ましくはヒト化抗体である。

【0048】

「マウス抗体」という用語は、本開示において、この分野の知識と技術によってマウスを用いて調製した抗体である。調製時に特定の抗原を試験対象に注射した後、所望の配列又は機能特性を有する抗体を発現したハイブリドーマを分離する。

【0049】

「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合してなる抗体であり、マウス抗体により誘発される免疫応答反応を低減することができる。キメラ抗体を作成するには、まず、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作成し、そしてマウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングし、更に、必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングし、マウス可変領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子とをキメラ遺伝子になるように連結した後、ヒトベクターに挿入し、最後に真核細胞系又は原核細胞系においてキメラ抗体分子を発現する。

【0050】

「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域フレームワーク、即ち、異なる種類のヒト生殖細胞系の抗体フレームワーク配列に移植して発生された抗体を指す。キメラ抗体が大量のマウスタンパク質成分をもつことにより誘導された強い異種反応性を克服することができる。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む共通ＤＮＡデータベース又は開示された参考文献から取得することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベースにおいて、及びＫａｂａｔ、Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．、１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎにおいて見出すことができる。免疫原性の低下に伴う活性の低下を回避するために、上記ヒト抗体可変領域フレームワーク配列に対して最も少ない逆変異又は復帰変異を行うことにより、活性を保つことができる。本開示のヒト化抗体は、更にファージで提示される、ＣＤＲに対して親和性成熟を行ったヒト化抗体も含む。

【0051】

「裸の抗体」という用語は、異種モジュール（例えば、細胞毒性モジュール）又は放射性マーカーと抱合していない抗体を指す。

【0052】

本開示に記載される「抗体の抗原結合断片」は、抗原結合活性を有するＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、及び抗原と結合するＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片を指してもよい。Ｆｖ断片は、抗体重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むが、定常領域がなく、全ての抗原結合部位の最小抗体断片を有する。一般的に、Ｆｖ抗体は、ＶＨとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを更に含み、抗原の結合に必要な構造を形成することができる。異なるリンカーにより２つの抗体可変領域を単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）又は単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）と呼ばれる１本のポリペプチド鎖になるように連結してもよい。

【0053】

本開示の「抗原結合部位」という用語は、抗原における連続又は不連続の、本開示の抗体又は抗原結合断片で認識される３次元空間部位を指す。

【0054】

本開示に記載される「ＡＤＣＣ」、即ち、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は、Ｆｃ受容体を発現した細胞が抗体のＦｃ部分を認識することで抗体で被覆された標的細胞を直接殺傷することを指す。ＩｇＧにおけるＦｃ部分に対する修飾により、抗体のＡＤＣＣエフェクター機能を低減又は解消することができる。上記修飾は、抗体の重鎖定常領域において、ＩｇＧ１のＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２／４キメラ、ＩｇＧ４のＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異から選ばれる変異を行うことを指す。

【0055】

本開示に記載される変異序列における「変異」は、「復帰変異」、「保存的修飾」又は「保存的置換又は置換」を含むが、これらに限定されない。本開示に記載される「保存的修飾」又は「保存的置換又は置換」は、類似の特徴（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性／親水性、主鎖の立体配座や剛性など）を有する他のアミノ酸でタンパク質中のアミノ酸を置換することで、タンパク質の生物学的活性を変えずに頻繁に変化可能にすることを意味する。当業者は、一般的に、ポリペプチドの非必須領域中の単一のアミノ酸置換が基本的に生物学的活性を変えないと分かっている（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、ｐ２２４、（４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照）。また、構造又は機能が類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。

【0056】

本開示に記載される「変異配列」は、本開示のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列に対して適当な置換、挿入や欠失などの変異修飾を行った場合に、得られた本開示のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列と異なる百分率の配列同一性程度を有するヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列を指す。本開示に記載される配列同一性は、少なくとも８５％、９０％又は９５％であってもよく、好ましくは少なくとも９５％である。非限定的な実施例は、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％を含む。２つの配列同士の配列比較及び同一性の百分率測定は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのホームページから取得可能なＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのデフォルト設定により行うことができる。

【0057】

「リンカーユニット」又は「連結断片」又は「連結ユニット」という用語は、一端が抗体又はその抗原結合断片に連結され、他端が薬物に連結された化学構造断片又は結合を指し、他のリンカーに連結された後、抗体又は薬物に連結されてもよい。

【0058】

リンカーは、伸長体、スペーサー及びアミノ酸ユニットを含み、例えば、ＵＳ２００５－０２３８６４９Ａ１に記載された方法のようなこの分野での既知の方法により合成することができる。リンカーは、細胞で薬物を放出しやすくする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチダーゼ感受性）リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７－１３１（１９９２）、米国特許Ｎｏ．５，２０８，０２０）を使用してもよい。

【0059】

本開示の工学的な抗体又は抗原結合断片は、通常の方法により調製・精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、クローンニングしてＧＳ発現ベクターに組換えることができる。組換えた免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定してトランスフェクションすることができる。更に好ましい従来技術の一つとして、哺乳動物発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存的なＮ末端部位において、抗体のグリコシル化を引き起こすことになる。陽性クローンは、バイオリアクターの無血清培地において培養を拡大することで、抗体を産生する。抗体を分泌した培養液は、通常の技術により精製することができる。例えば、調整された緩衝液を含むＡ又はＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムで精製を行う。非特異的に結合した成分を洗い流す。更に、ｐＨ勾配法により結合した抗体を溶離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで抗体断片を検出し、収集する。抗体は、通常の方法によりろ過濃縮することができる。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに例えば、－７０℃で冷凍し、又は凍結乾燥しなければならない。

【0060】

「アルキル基」という用語は１～２０個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖基である飽和脂肪族炭化水素基を指し、好ましくは１～１２個の炭素原子を含むアルキル基、より好ましくは１～１０個の炭素原子を含むアルキル基、最も好ましくは１～６個の炭素原子を含むアルキル基である。その非限定的な実例は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、１－エチル－２－メチルプロピル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、１，１－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、２－エチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、４－メチルペンチル基、２，３－ジメチルブチル基、ｎ－ヘプチル基、２－メチルヘキシル基、３－メチルヘキシル基、４－メチルヘキシル基、５－メチルヘキシル基、２，３－ジメチルペンチル基、２，４－ジメチルペンチル基、２，２－ジメチルペンチル基、３，３－ジメチルペンチル基、２－エチルペンチル基、３－エチルペンチル基、ｎ－オクチル基、２，３－ジメチルヘキシル基、２，４－ジメチルヘキシル基、２，５－ジメチルヘキシル基、２，２－ジメチルヘキシル基、３，３－ジメチルヘキシル基、４，４－ジメチルヘキシル基、２－エチルヘキシル基、３－エチルヘキシル基、４－エチルヘキシル基、２－メチル－２－エチルペンチル基、２－メチル－３－エチルペンチル基、ｎ－ノニル基、２－メチル－２－エチルヘキシル基、２－メチル－３－エチルヘキシル基、２，２－ジエチルペンチル基、ｎ－デシル基、３，３－ジエチルヘキシル基、２，２－ジエチルヘキシル基、及びその種々の分岐鎖異性体などを含む。より好ましくは、１～６個の炭素原子を含む低級アルキル基であり、その非限定的な実施例は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、１－エチル－２－メチルプロピル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、１，１－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、２－エチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、４－メチルペンチル基、２，３－ジメチルブチル基などを含む。アルキル基は、置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は任意の利用可能な連結部位で置換されてもよく、上記置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基及びオキソ基から選ばれる１つ又は複数の基であることが好ましい。

【0061】

「ヘテロアルキル基」という用語は、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１つ又は複数のヘテロ原子を含むアルキル基であり、そのうち、アルキル基は、上記に定義された通りである。

【0062】

「アルキレン基」という用語は、親アルカンの同じ炭素原子又は２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去して誘導した２つの残基を有する飽和の直鎖又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、１～２０個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖基であり、好ましくは１～１２個の炭素原子を含み、より好ましくは１～６個の炭素原子を含むアルキレン基である。アルキレン基の非限定的な実例は、メチレン（－ＣＨ_２－）、１，１－エチリデン（－ＣＨ（ＣＨ_３）－）、１，２－エチリデン（－ＣＨ_２ＣＨ_２）－、１，１－プロピリデン（－ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）－）、１，２－プロピリデン（－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）－）、１，３－プロピリデン（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－）、１，４－ブチリデン（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－）及び１，５－ブチリデン（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－）などを含むが、これらに限定されない。アルキレン基は、置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は任意の利用可能な連結部位で置換されてもよく、上記置換基は、独立的に、任意選択的にアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基及びオキソ基から選ばれる１つ又は複数の基で置換されることが好ましい。

【0063】

「アルコキシ基」という用語は、－Ｏ－（アルキル基）及び－Ｏ－（非置換のシクロアルキル基）であり、そのうち、アルキル基又はシクロアルキル基の定義は上記の通りである。アルコキシ基の非限定的な実例は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基を含む。アルコキシ基は、任意選択的に置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基から選ばれる１つ又は複数の基であることが好ましい。

【0064】

「シクロアルキル基」という用語は、飽和又は部分的に不飽和の単環式又は多環式の環状炭化水素置換基を指し、シクロアルキル環は３～２０個の炭素原子を含み、好ましくは３～１２個の炭素原子を含み、より好ましくは３～１０個の炭素原子を含み、最も好ましくは３～７個の炭素原子を含む。単環式シクロアルキル基の非限定的な実例は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロペンテニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキサジエニル基、シクロヘプチル基、シクロヘプタトリエニル基、シクロオクチル基などを含み、多環式シクロアルキル基は、スピロ環、縮合環及び架橋環のシクロアルキル基を含む。

【0065】

「ヘテロシクリル基」という用語は、３～２０個の環原子を含む飽和又は部分的に不飽和の単環式又は多環式環状炭化水素置換基を指し、そのうち、１つ又は複数の環原子は、窒素、酸素又はＳ（Ｏ）_ｍ（そのうち、ｍは０～２の整数である）から選ばれるヘテロ原子であるが、－Ｏ－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ－又は－Ｓ－Ｓ－の環部分を含まず、残りの環原子は炭素である。好ましくは３～１２個の環原子を含み、そのうち、１～４個はヘテロ原子であり、より好ましいシクロアルキル基環は３～１０個の環原子を含む。単環式ヘテロシクリル基の非限定的な実例は、ピロリジニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、ホモピペラジニル基などを含む。多環式ヘテロシクリル基は、スピロ環、縮合環及び架橋環のヘテロシクリル基を含む。

【0066】

「スピロヘテロシクリル基」という用語は、５～２０員の単環同士が１つの原子（スピロ原子と称する）を共有する多環式ヘテロシクリル基を指し、そのうち、１つ又は複数の環原子は窒素、酸素又はＳ（Ｏ）_ｍ（そのうち、ｍは０～２の整数である）から選ばれるヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素である。それは、１つ又は複数の二重結合を含んでもよいが、完全に共役したπ電子系を有する環がない。好ましくは６～１４員であり、より好ましくは７～１０員である。スピロヘテロシクリル基は、環同士が共有するスピロ原子の数によって、モノスピロヘテロシクリル基、ビススピロヘテロシクリル基又はポリスピロヘテロシクリル基に分けられ、好ましくはモノスピロヘテロシクリル基及びビススピロヘテロシクリル基である。より好ましくは４員／４員、４員／５員、４員／６員、５員／５員又は５員／６員のモノスピロヘテロシクリル基である。スピロヘテロシクリル基の非限定的な実例は、

【化14】

を含む。

【0067】

「縮合ヘテロシクリル基」という用語は、５～２０員で、系内の各環が系内の他の環と、隣接する１対の原子を共有する多環式ヘテロシクリル基であり、１つ又は複数の環は、１つ又は複数の二重結合を含んでもよいが、完全に共役したπ電子系を有する環は１つもなく、そのうち、１つ又は複数の環原子は、窒素、酸素、又はＳ（Ｏ）_ｍ（そのうち、ｍは、０～２の整数である）から選ばれるヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素である。好ましくは６～１４員であり、より好ましくは７～１０員である。構成する環の数によって、二環式、三環式、四環式又は多環式の縮合ヘテロシクリル基に分けることができ、好ましくは二環式又は三環式であり、より好ましくは５員／５員又は５員／６員の二環式縮合ヘテロシクリル基である。縮合ヘテロシクリル基の非限定的な実例は、

【化15】

を含む。

【0068】

「架橋ヘテロシクリル基」という用語は、５～１４員で、任意の２つの環が２つの直接的に連結されていない原子を共有する多環式ヘテロシクリル基であり、１つ又は複数の二重結合を含んでもよいが、完全に共役したπ電子系を有する環は１つもなく、そのうち、１つ又は複数の環原子は窒素、酸素又はＳ（Ｏ）_ｍ（そのうち、ｍは０～２の整数である）から選ばれるヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素である。好ましくは６～１４員であり、より好ましくは７～１０員である。構成する環の数によって、二環式、三環式、四環式又は多環式の架橋ヘテロシクリル基に分けることができ、好ましくは、二環式、三環式又は四環式であり、より好ましくは、二環式又は三環式である。架橋ヘテロシクリル基の非限定的な実例は、

【化16】

を含む。

【0069】

上記ヘテロシクリル環は、アリール基、ヘテロアリール基又はシクロアルキル基環に縮合してもよく、そのうち、親構造に連結された環はヘテロシクリル基であり、その非限定的な実例は、

【化17】

などを含む。

【0070】

ヘテロシクリル基は、任意選択的に置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基及びオキソ基から選ばれる１つ又は複数の基であることが好ましい。

【0071】

「アリール基」という用語は、共役したπ電子系を有する６～１４員の全炭素単環式又は縮合多環式（即ち、隣接する炭素原子対を共有する環）基を指し、好ましくは６～１０員であり、例えば、フェニル基とナフチル基であり、好ましくはフェニル基である。上記アリール環は、ヘテロアリール基、ヘテロシクリル基又はシクロアルキル基環に縮合してもよく、そのうち、親構造に連結された環はアリール環であり、その非限定的な実例は、

【化18】

を含む。

【0072】

アリール基は、置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基及びヘテロシクロアルキルチオ基から選ばれる１つ又は複数の基であることが好ましい。

【0073】

「ヘテロアリール基」という用語は、１～４個のヘテロ原子、５～１４個の環原子を含むヘテロ芳香族系を指し、そのうち、ヘテロ原子は酸素、硫黄及び窒素から選ばれる。ヘテロアリール基は、５～１０員であることが好ましく、５員又は６員であることがより好ましく、例えば、フラニル基、チエニル基、ピリジル基、ピロリル基、Ｎ－アルキルピロリル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、イミダゾリル基、テトラゾリル基などである。上記ヘテロアリール環は、アリール基、ヘテロシクリル基又はシクロアルキル基環に縮合してもよく、そのうち、親構造に連結された環はへテロアリール基環であり、その非限定的な実例は、

【化19】

を含む。

【0074】

ヘテロアリール基は、任意選択的に置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基及びヘテロシクロアルキルチオ基から選ばれる１つ又は複数の基であることが好ましい。

【0075】

「アミノ保護基」という用語は、分子の他の部位が反応する時に、アミノ基が変化されないように、除去され易い基でアミノ基を保護するものである。非限定的な実施例は、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、アセチル基、ベンジル基、アリル基及びｐ－メトキシベンジル基などを含む。これらの基は、任意選択的にハロゲン、アルコキシ基又はニトロ基から選ばれる１～３個の置換基で置換可能である。上記アミノ保護基は、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基が好ましい。

【0076】

「シクロアルキルアルキル基」という用語は、１つ又は複数のシクロアルキル基で置換され、好ましくは１つのシクロアルキル基で置換されたアルキル基を指し、そのうち、アルキル基は上記に定義された通りであり、そのうち、シクロアルキル基は、上記に定義された通りである。

【0077】

「ハロアルキル基」という用語は、１つ又は複数のハロゲンで置換されたアルキル基を指し、そのうち、アルキル基は上記に定義された通りである。

【0078】

「重水素化アルキル基」という用語は、１つ又は複数の重水素原子で置換されたアルキル基を指し、そのうち、アルキル基は上記に定義された通りである。

【0079】

「ヒドロキシ基」という用語は－ＯＨ基を指す。

【0080】

「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を指す。

【0081】

「アミノ基」という用語は、－ＮＨ_２を指す。

【0082】

「ニトロ基」という用語は、－ＮＯ_２を指す。

【0083】

「シアノ基」という用語は、－ＣＮを指す。

【0084】

「任意選択的」又は「任意選択的に」は、その後に記載されるイベントや環境が発生されてもよいが、必ずしもその必要がないことを意味し、この説明は、当該イベントや環境が発生され、又は発生されない場合を含む。例えば、「任意選択的に１～３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在してもよいが、必ずしもその必要がないことを意味する。

【0085】

「置換される」とは、基の中の１つ又は複数の水素原子、好ましくは５個以下、より好ましくは１～３個の水素原子が互いに独立的に対応する数の置換基で置換されることを意味する。無論、置換基は化学的に可能な部位にしか位置せず、当業者はそれほど努力せずに（実験又は理論により）可能又は不可能な置換を決定することができる。例えば、遊離水素を有するアミノ基又はヒドロキシ基は、不飽和（例えば、オレフィン）結合を有する炭素原子に結合する場合、不安定である可能性がある。

【0086】

「薬物担持量」又は「薬物負荷量」（ＤＡＲ）という用語は、ＡＤＣにおけるそれぞれの抗体又はその抗原結合断片に負荷された細胞毒性薬剤の平均数量を指し、整数又は小数である薬物量と抗体量の比率として示されてもよい。本開示の実施形態において、薬物担持量はｎで示され、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の平均値であってもよい。ＵＶ／可視分光法、質量分析、ＥＬＩＳＡ試験及びＨＰＬＣのような通常の方法で、カップリング反応後の各ＡＤＣ分子の薬物平均数量を同定することができる。

【0087】

「薬物負荷量分布」という用語は、抗体薬物複合体グループにおける、異なる数量の薬物と連結する抗体の分布状況、例えば、グループにおける０、２、４、６及び８個の薬物と連結する抗体の分布状況を指す。分解生成物が生成される可能性があるので、１、３、５及び７のＤＡＲが混合物に含まれる可能性もあると注意すべきである。本開示において、抗体薬物負荷量分布は、異なる数量の薬物と結合する抗体重鎖で表すことができ、例えば、Ｈ_０は薬物と結合しない重鎖、Ｈ_１は１つの薬物と結合する重鎖、Ｈ_２は２つの薬物と結合する重鎖、Ｈ_３は３つの薬物と結合する重鎖、Ｈ_４は４つの薬物と結合する重鎖を示す。例えば、Ｈ_３の割合が４％であることは、抗体薬物複合体の重鎖グループにおいて、３つの薬物と結合する重鎖の割合が４％であることを表す。それに応じて、本開示中の抗体薬物負荷量分布は、異なる数量の薬物と結合する抗体軽鎖で表すこともでき、Ｌ_０は薬物と結合しない抗体軽鎖、Ｌ_１は１つの薬物と結合する抗体軽鎖を示す。

【0088】

「与える」、「投与」及び「処理」は動物、ヒト、実験の被験者、細胞、組織、器官や生物流体に適用される場合に、外因性薬剤、治療剤、診断薬又は組成物と、動物、ヒト、被験者、細胞、組織、器官や生物流体との接触を意味する。「与える」、「投与」及び「処理」は例えば、治療、薬物動態、診断、研究と実験方法を意味してもよい。細胞の処理は、試薬と細胞との接触、及び試薬と流体との接触を含み、そのうち、上記流体は細胞と接触する。「与える」、「投与」及び「処理」は、また、試薬、診断、結合組成物により、又は別種の細胞を通じて、体外及びインビトロで例えば細胞を処理することを意味する。「処理」はヒト、獣医学又は研究対象に適用される場合に、治療的処理、予防又は予防的措置、研究と診断的応用を意味する。

【0089】

「治療」は、例えば、本開示の何れか１つの結合化合物の組成物を含む経口又は外用治療剤を患者に与えることを意味し、上記患者は１種又は複数種の疾患症状を有するが、既知の上記治療剤は、これらの症状に対して治療効果を有する。通常、治療を受ける患者又はグループには、１種又は複数種の疾患症状を効果的に緩和する量で治療剤を与えることにより、これらの症状の解消を誘導したり、これらの症状を臨床的に測定可能な任意の程度まで進行しないように抑制したりする。任意の具体的な疾患症状を効果的に緩和する治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者の疾患状態、年齢と体重、及び薬剤の患者で必要な治療効果を発生させる能力などの複数の要因によって、変化することができる。医者や他のプロのヘルスケアプロバイダによる当該症状の重症度又は進行状況への評価によく用いられる任意の臨床的検出方法により、疾患症状が低減されたか否かを評価することができる。本開示の実施形態（例えば、治療方法又は製品）は、各目標疾患症状の緩和において無効である可能性があるが、この分野で既知の任意の統計学的検定方法、例えばＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定、カイ二乗検定、Ｍａｎｎ及びＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定とＷｉｌｃｏｘｏｎ検定により、統計学的に有意な数の患者において目標疾患症状を低減可能であることが確認された。

【0090】

「有効量」は、医学的疾患の症状又は病症の改善又は予防に十分な量を含む。有効量は、更に、診断の許容又は促進に十分な量を意味する。特定の患者又は獣医被験者に用いられる有効量は、例えば、治療すべき病症、患者の全体的な健康状況、投与の方法経路と用量及び副作用の重症度などの要因によって変化することができる。有効量は、顕著な副作用又は毒性作用を回避する最大用量又は投与計画であってもよい。

【0091】

「置換」は、抗体タンパク質を溶解する溶剤系の置換を指し、例えば、抗体タンパク質が安定した製剤に存在するように、製剤を安定化する緩衝系で物理的な操作方式により抗体タンパク質を含む高塩又は高浸透圧溶剤系を置換する。上記物理的な操作方式は、限外ろ過、透析又は遠心分離後の再溶解を含むが、これらに限定されない。

【図面の簡単な説明】

【0092】

【図1A】本開示のＡＤＣ－１９の血漿安定性実験の結果である。

【図1B】本開示のＡＤＣ－１８の血漿安定性実験の結果である。

【図1C】本開示のＡＤＣ－２０の血漿安定性実験の結果である。

【図2】ＪＩＭＴ－１担腫瘍マウスに対する本開示のＡＤＣ－２１、ＡＤＣ－２４の薬効の評価である。

【図3】ヒト乳がん細胞ＳＫ－ＢＲ－３移植腫瘍ヌードマウスに対する本開示のＡＤＣの治療効果の評価である。

【図4】本開示のＡＤＣ－２５の血漿安定性実験の結果である。

【図5】ヒト脳星状膠芽腫Ｕ８７ＭＧヌードマウス移植腫瘍に対する本開示のＡＤＣの治療効果である。

【図6】ヒト咽頭がん胸水転移細胞Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２ヌードマウス移植腫瘍に対する本開示のＡＤＣの治療効果である。

【図7】ヒト膠芽腫Ｕ８７ＭＧヌードマウス移植腫瘍に対する本開示のＡＤＣの治療効果である。

【発明を実施するための形態】

【0093】

以下、実施例を合わせて本発明を更に説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。

【0094】

本開示の実施例における具体的な条件が明示されていない実験方法は、通常、一般的な条件、又は原料や商品のメーカーに勧められた条件に従う。具体的な供給源が明示されていない試薬は、市販の一般的な試薬である。

【0095】

一、抗体薬物複合体の調製とその特性及び生物学的試験
化合物の構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）又は質量分析（ＭＳ）によって決定された。ＮＭＲの測定には、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ－４００核磁気装置が利用され、測定溶剤が重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６）、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ_３）、重水素化メタノール（ＣＤ_３ＯＤ）であり、内部標準がテトラメチルシラン（ＴＭＳ）であり、化学シフトが１０^－６（ｐｐｍ）単位で示された。

【0096】

ＭＳの測定には、ＦＩＮＮＩＧＡＮ ＬＣＱＡｄ（ＥＳＩ）質量分析計（メーカー：Ｔｈｅｒｍｏ、型番：Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ ａｄｖａｎｔａｇｅ ＭＡＸ）が利用された。

【0097】

ＵＰＬＣの測定には、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＳＱＤ液体クロマトグラフ質量分析計が利用された。

【0098】

ＨＰＬＣの測定には、アジレント１２００ＤＡＤ高速液体クロマトグラフ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ １５０×４．６ ｍｍカラム）及びＷａｔｅｒｓ ２６９５－２９９６高速液体クロマトグラフ（Ｇｉｍｉｎｉ Ｃ１８ １５０×４．６ ｍｍカラム）が利用された。

【0099】

ＵＶ－ＨＰＬＣの測定には、Ｔｈｅｒｍｏ ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００紫外線分光光度計が利用された。

【0100】

増殖阻害率及びＩＣ_５０値の測定には、ＰＨＥＲＡ ｓｔａｒＦＳマイクロプレートリーダー（独ＢＭＧ社）が利用された。

【0101】

薄層クロマトグラフィー用シリカゲルプレートとしては、煙台黄海ＨＳＧＦ２５４又は青島ＧＦ２５４シリカゲルプレートが使用され、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に使用されるシリカゲルプレートの仕様は０．１５ ｍｍ～０．２ ｍｍであり、薄層クロマトグラフィーによる製品の分離精製用のシリカゲルプレートの仕様は、０．４ ｍｍ～０．５ ｍｍである。

【0102】

カラムクロマトグラフィーは、一般的に、煙台黄海２００～３００メッシュのシリカゲルをベクターとして利用した。

【0103】

本開示に係る既知の出発原料は、この分野での既知の方法を採用し、又はそれに従って合成してもよく、或いはＡＢＣＲ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｎｉｃｓ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、韶遠化学科技（Ａｃｃｅｌａ ＣｈｅｍＢｉｏ Ｉｎｃ）、達瑞化学品などの会社から購入してもよい。

【0104】

実施例において、特に断りのない限り、反応は、何れもアルゴン雰囲気又は窒素雰囲気において行われた。

【0105】

アルゴン雰囲気又は窒素雰囲気は、反応フラスコに容量が約１ Ｌのアルゴン又は窒素バルーンが接続されていることを指す。

【0106】

水素雰囲気は、反応フラスコに容量が約１ Ｌの水素バルーンが接続されていることを指す。

【0107】

加圧水素化反応は、Ｐａｒｒ ３９１６ＥＫＸ型水素化装置及び清藍ＱＬ－５００型水素発生器又はＨＣ２－ＳＳ型水素化装置が使用される。

【0108】

水素化反応は、通常、真空引きして水素を充填するような操作を３回繰り返す。

【0109】

マイクロ波反応は、ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ－Ｓ ９０８８６０型マイクロ波反応器が使用される。

【0110】

実施例において、特に断りのない限り、反応中の溶液は、水溶液を指す。

【0111】

実施例において、特に断りのない限り、反応の温度は、室温である。

【0112】

室温は最適な反応温度であり、温度範囲が２０℃～３０℃である。

【0113】

実施例におけるｐＨ＝６．５のＰＢＳ緩衝液の調製：８．５ ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、８．５６ ｇのＫ_２ＨＰＯ_４．３Ｈ_２Ｏ、５．８５ ｇのＮａＣｌ、１．５ ｇのＥＤＴＡを取ってフラスコに入れ、２ Ｌに定容し、超音波でそれを完全に溶解させ、振り混ぜた後に得た。

【0114】

化合物の精製に利用されたカラムクロマトグラフィーの溶離剤の系及び薄層クロマトグラフィーの展開溶媒の系は、Ａ：ジクロロメタンとイソプロピルアルコール系、Ｂ：ジクロロメタンとメタノール系、及びＣ：石油エーテルと酢酸エチル系を含み、溶剤の体積比は、化合物の極性によって調整してもよく、少量のトリエチルアミンと酸性又は塩基性試薬などを加えて調整してもよい。

【0115】

本開示の化合物の一部は、Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳによって特徴付けられた。Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳは、アジレント６５３０精密質量数四重極－飛行時間型質量分析計及びアジレント１２９０－Ｉｎｆｉｎｉｔｙ超高速液体クロマトグラフ（アジレントＰｏｒｏｓｈｅｌｌ ３００ＳＢ－Ｃ８ ５ μｍ、２．１×７５ ｍｍカラム）が利用された。

【0116】

実施例１－１
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－ヒドロキシシクロプロパン－１－カルボキサミド １

【化20】

【0117】

エキサテカンメシル酸塩１ｂ（２．０ ｍｇ、３．７６ μｍｏｌ、特許出願「ＥＰ０７３７６８６Ａ１」に開示された方法で調製された）に１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で０～５℃に冷却し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に１－ヒドロキシシクロプロピルギ酸１ａ（１．４ ｍｇ、３．７ μｍｏｌ、「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２５（１２）， １２６９－７２， １９８４」に開示された公知の方法で調製された）及び４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（３．８ ｍｇ、１３．７ μｍｏｌ）を順に加え、添加完了後、０～５℃で２時撹拌しながら反応させた。反応液に水５ ｍＬを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（８ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（５ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１（１．６ ｍｇ、収率：８２．１％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５２０．２ ［Ｍ＋１］
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ７．９０－７．８４ （ｍ， １Ｈ）， ７．８０－７．６８（ｍ， １Ｈ）， ５．８０－５．７０ （ｍ， １Ｈ）， ５．６２－５．５４（ｍ， ２Ｈ）， ５．４４－５．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２８－５．１０（ｍ， ２Ｈ）， ３．４０－３．１５ （ｍ， ３Ｈ）， ２．４４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２３（ｔ， １Ｈ）， ２．０６－１．７５ （ｍ， ２Ｈ）， １．６８－１．５６ （ｍ， １Ｈ）， １．２２－１．１８ （ｍ， ２Ｈ）， １．０４－０．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８９ （ｔ， ３Ｈ）。

【0118】

実施例１－２
（Ｓ）－２－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシアセトアミド ２－Ａ
（Ｒ）－２－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシアセトアミド ２－Ｂ

【化21】

【0119】

１ｂ（４ ｍｇ、７．５３ μｍｏｌ）に２ ｍＬのエタノール及び０．４ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に冷却し、０．３ ｍＬのＮ－メチルモルホリンを滴下し、清澄になるまで反応液を撹拌した。反応液に、２－シクロプロピル－２－ヒドロキシ酢酸２ａ（２．３ ｍｇ、１９．８ μｍｏｌ、特許出願「ＷＯ２０１３１０６７１７」に開示された方法で調製された）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（３ ｍｇ、２２．４ μｍｏｌ）及び１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（４．３ ｍｇ、２２．４ μｍｏｌ）を順に加え、添加完了後、０～５℃で１時間撹拌しながら反応させた。氷水浴を撤去し、３０℃に加熱して２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた粗製品である化合物２を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物（２－Ａ：１．５ ｍｇ、２－Ｂ：１．５ ｍｇ）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５３４．０ ［Ｍ＋１］。

【0120】

単一配置の化合物２－Ｂ（比較的短い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．０６分間であり、純度：８８％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．３７ （ｄ， １Ｈ）， ７．７６ （ｄ， １Ｈ）， ７．３０ （ｓ， １Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．５８－５．５６ （ｍ， １Ｈ）， ５．４８ （ｄ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３２－５．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６０ （ｔ， １Ｈ）， ３．１９－３．１３ （ｍ， １Ｈ）， ２．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２０－２．１４ （ｍ， １Ｈ）， １．９８ （ｑ， ２Ｈ）， １．８７－１．８３ （ｍ， １Ｈ）， １．５０－１．４０ （ｍ， １Ｈ）， １．３４－１．２８ （ｍ， １Ｈ）， ０．８６ （ｔ， ３Ｈ）， ０．５０－０．３９ （ｍ， ４Ｈ）。

【0121】

単一配置の化合物２－Ａ（比較的長い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１０分間、純度：８６％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．３５ （ｄ， １Ｈ）， ７．７８ （ｄ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ６．５２ （ｓ， １Ｈ）， ５．５８－５．５３ （ｍ， １Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３７ （ｄ， １Ｈ）， ５．３２ （ｔ， １Ｈ）， ３．６２ （ｔ， １Ｈ）， ３．２０－３．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２５－２．１６ （ｍ， １Ｈ）， １．９８ （ｑ， ２Ｈ）， １．８７－１．８２ （ｍ， １Ｈ）， １．５０－１．４０ （ｍ， １Ｈ）， １．２１－１．１４ （ｍ， １Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ３Ｈ）， ０．４７－０．３５ （ｍ， ４Ｈ）。

【0122】

実施例１－３
（Ｓ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－３，３，３－トリフルオロ－２－ヒドロキシプロパンアミド ３－Ａ
（Ｒ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－３，３，３－トリフルオロ－２－ヒドロキシプロパンアミド ３－Ｂ

【化22】

【化23】

【0123】

１ｂ（５．０ ｍｇ、９．４１ μｍｏｌ）に２ ｍＬのエタノール及び０．４ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で０～５℃に冷却し、０．３ ｍＬのＮ－メチルモルホリンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に３，３，３－トリフルオロ－２－ヒドロキシプロピオン酸３ａ（４．１ ｍｇ、２８．４ μｍｏｌ、供給元：Ａｌｆａ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．８ ｍｇ、２８．１ μｍｏｌ）及び１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（５．４ ｍｇ、２８．２ μｍｏｌ）を順に加え、添加完了後、０～５℃で１０分間撹拌しながら反応させた。氷水浴を撤去し、３０℃に加熱して８時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた粗製品である化合物３を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物（１．５ ｍｇ、１．５ ｍｇ）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５６１．９ ［Ｍ＋１］。

【0124】

単一配置の化合物（比較的短い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１１分間、純度：８８％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．９４ （ｄ， １Ｈ）， ７．８０ （ｄ， １Ｈ）， ７．３２ （ｓ， １Ｈ）， ７．２０ （ｄ， １Ｈ）， ６．５３ （ｓ， １Ｈ）， ５．６１－５．５５ （ｍ， １Ｈ）， ５．４５－５．２３ （ｍ， ３Ｈ）， ５．１５－５．０６ （ｍ， １Ｈ）， ４．６６－４．５７ （ｍ， １Ｈ）， ３．１８－３．１２ （ｍ， １Ｈ）， ２．４０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２６－２．２０ （ｍ， １Ｈ）， ２．１６－２．０８ （ｍ， １Ｈ）， ２．０２－１．９４ （ｍ， １Ｈ）， １．８９－１．８２ （ｍ， １Ｈ）， １．５０－１．４０ （ｍ， １Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ３Ｈ）。

【0125】

単一配置の化合物（比較的長い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１９分間、純度：９０％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．９７ （ｄ， １Ｈ）， ７．８０ （ｄ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．１６ （ｄ， １Ｈ）， ６．５３ （ｓ， １Ｈ）， ５．６３－５．５５ （ｍ， １Ｈ）， ５．４５－５．２０ （ｍ， ３Ｈ）， ５．１６－５．０７ （ｍ， １Ｈ）， ４．６６－４．５７ （ｍ， １Ｈ）， ３．１８－３．１２ （ｍ， １Ｈ）， ２．４０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２２－２．１４ （ｍ， １Ｈ）， ２．０４－１．９５ （ｍ， ２Ｈ）， １．８９－１．８２ （ｍ， １Ｈ）， １．５０－１．４０ （ｍ， １Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ３Ｈ）。

【0126】

実施例１－４
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－ヒドロキシシクロペンタン－１－カルボキサミド ４

【化24】

【0127】

１ｂ（３．０ ｍｇ、５．６４ μｍｏｌ）に１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で０～５℃に冷却し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に１－ヒドロキシ－シクロペンタンギ酸４ａ（２．２ ｍｇ、１６．９ μｍｏｌ、特許出願「ＷＯ２０１３１０６７１７」に開示された方法で調製された）及び４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（４．７ ｍｇ、１６．９ μｍｏｌ）を順に加え、添加完了後、０～５℃で１時間撹拌しながら反応させた。反応液に水５ ｍＬを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（５ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物４（２．５ ｍｇ、収率：８０．９％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５４８．０ ［Ｍ＋１］。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ７．７３－７．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．７５－５．６２ （ｍ， １Ｈ）， ５．４６－５．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２６－５．１０ （ｍ， １Ｈ）， ３．３０－３．１０ （ｍ， １Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２８－２．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０８－１．８４ （ｍ， ８Ｈ）， １．６９－１．５８ （ｍ， ２Ｈ）， １．０４－１．００ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８９ （ｔ， ３Ｈ）。

【0128】

実施例１－５
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－（ヒドロキシメチル）シクロプロパン－１－カルボキサミド ５

【化25】

【0129】

１ｂ（２．０ ｍｇ、３．７６ μｍｏｌ）に１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で０～５℃に冷却し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に１－（ヒドロキシメチル）－シクロペンタンギ酸５ａ（０．８７ ｍｇ、７．５ μｍｏｌ、特許出願「ＷＯ２０１３９６７７１」に開示された方法で調製された）及び４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（２ ｍｇ、７．２４ μｍｏｌ）を順に加え、添加完了後、０～５℃で２時間撹拌しながら反応させた。反応液に水５ ｍＬを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（８ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（５ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物５（１．０ ｍｇ、収率：５０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５３３．９ ［Ｍ＋１］。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ８．０７ （ｓ， １Ｈ）， ７．２３－７．１８ （ｍ， ２Ｈ）， ６．７１－６．６４ （ｍ， １Ｈ）， ６．５５－６．５１ （ｍ， １Ｈ）， ５．３６－５．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６７－４．６１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５３－３．４８ （ｍ， １Ｈ）， ３．３０－３．２２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１８－３．１３ （ｍ， １Ｈ）， ２．７１－２．６１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３５－２．２８ （ｍ， １Ｈ）， ２．０４－１．９１ （ｍ， ４Ｈ）， １．５３－１．４０ （ｍ， ３Ｈ）， ０．９１－０．７５ （ｍ， ４Ｈ）。

【0130】

実施例１－６
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－（ヒドロキシメチル）シクロブタン－１－カルボキサミド ６

【化26】

【0131】

１ｂ（３．０ ｍｇ、５．６４ μｍｏｌ）に１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で０～５℃に冷却し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に１－（ヒドロキシメチル）シクロブタン－１－ギ酸６ａ（２．２ ｍｇ、１６．９ μｍｏｌ、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ２０１４， ｖｏｌ．１３６， ＃２２， ｐ．８１３８－８１４２」という文献に開示された方法で調製された）及び４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（４．７ ｍｇ、１６．９ μｍｏｌ）を順に加え、添加完了後、０～５℃で１時間撹拌しながら反応させた。反応液に水５ ｍＬを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（５ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物６（２．１ ｍｇ、収率：６７．９％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５４８．０ ［Ｍ＋１］。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ７．８５－７．６２ （ｍ， １Ｈ）， ６．８８ （ｂｒ，１Ｈ）， ５．８７－５．４８ （ｍ，２Ｈ）， ５．４７－５．３３ （ｍ，１Ｈ）， ５．３１－５．０６ （ｍ，１Ｈ）， ４．２５－３．９１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２５ （ｂｒ， １Ｈ）， ２．６０－２．３２ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２３ （ｔ， １Ｈ）， ２．１５－１．９５ （ｍ， ３Ｈ）， １．７０－１．５６ （ｍ， ２Ｈ）， １．４１－１．１７ （ｍ， ９Ｈ）， １．０３ （ｓ， １Ｈ）， ０．９５－０．８０ （ｍ， ２Ｈ）。

【0132】

実施例１－７
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－ヒドロキシシクロブタン－１－カルボキサミド ７

【化27】

【0133】

１ｂ（３．０ ｍｇ、５．６４ μｍｏｌ）に２ ｍＬのエタノール及び０．４ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で０～５℃に冷却し、０．３ ｍＬのＮ－メチルモルホリンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に１－ヒドロキシシクロブタンギ酸７ａ（２．０ ｍｇ、１７．２２ μｍｏｌ、供給元：薬石）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（２．３ ｍｇ、１７．０ μｍｏｌ）及び１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（３．２ ｍｇ、１６．７ μｍｏｌ）を順に加え、添加完了後、０～５℃で１０分間撹拌しながら反応させた。氷水浴を撤去し、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物７（２．５ ｍｇ、収率：８３．１％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５３４．０ ［Ｍ＋１］。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．２８ （ｄ， １Ｈ）， ７．７５ （ｄ， １Ｈ）， ７．２９ （ｓ， １Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ６．１２ （ｓ， １Ｈ）， ５．５９－５．５１ （ｍ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２０－５．０１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２７－３．１７ （ｍ， １Ｈ）， ３．１５－３．０５ （ｍ， １Ｈ）， ２．７１－２．６３ （ｍ， １Ｈ）， ２．３７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１２－２．０５ （ｍ， １Ｈ）， ２．０３－１．９４ （ｍ， ２Ｈ）， １．９２－１．７８ （ｍ， ４Ｈ）， １．５０－１．４２ （ｍ， １Ｈ）， ０．９０－０．８３ （ｍ， ４Ｈ）。

【0134】

実施例１－８
１－（（（Ｓ）－７－ベンジル－２０－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２，５，８，１１，１４－ペンタアザイコシル）オキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロプロパン－１－カルボキサミド ８

【化28】

【0135】

ステップ１
１－（（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセチルアミノ）メトキシ）シクロプロパン－１－カルボン酸ベンジル ８ｃ

【0136】

１－ヒドロキシシクロプロパン－１－カルボン酸ベンジル８ａ（１０４ ｍｇ、０．５４ ｍｍｏｌ、特許出願「ＵＳ２００５／２０６４５」に開示された方法で調製された）及び（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセチルアミノ）メチル酢酸エステル８ｂ（１００ ｍｇ、０．２７ ｍｍｏｌ、特許出願「ＣＮ１０５８２９３４６Ａ」に開示された方法で調製された）を反応フラスコに加え、５ ｍＬのテトラヒドロフランを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（６１ ｍｇ、０．５４ ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴を撤去し、室温まで昇温して１０分間撹拌し、氷水２０ ｍＬを加え、酢酸エチル（５ ｍＬ×２）及びクロロホルム（５ ｍＬ×５）で抽出し、有機相を合わせて濃縮した。得られた残留物を３ ｍＬの１，４－ジオキサンに溶解し、水０．６ ｍＬを加え、炭酸水素ナトリウム（２７ ｍｇ、０．３２ ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸－９－フルオレニルメチル（７０ ｍｇ、０．２７ ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。水２０ ｍＬを加え、酢酸エチル（８ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（２０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物８ｃ（１００ ｍｇ、収率：７３．６％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５０１．０ ［Ｍ＋１］。

【0137】

ステップ２
１－（（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセチルアミノ）メトキシ）シクロプロパン－１－カルボン酸 ８ｄ

【0138】

８ｃ（５０ ｍｇ、０．１０ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランと酢酸エチル（Ｖ：Ｖ＝２：１）の混合溶媒３ ｍＬに溶解し、パラジウム炭素（２５ ｍｇ、含有量１０％）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で１時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキをテトラヒドロフランですすぎ、ろ液を濃縮して、表題生成物８ｄ（４１ ｍｇ、収率：１００％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ４１１．０ ［Ｍ＋１］。

【0139】

ステップ３
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（（１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノカルボニル）シクロプロポキシ）メチル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート ８ｅ

【0140】

１ｂ（７ ｍｇ、０．０１３ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、８ｄ（７ ｍｇ、０．０１７ ｍｍｏｌ）の０．５ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（７ ｍｇ、０．０２６ ｍｍｏｌ）を加え、氷浴で３５分間撹拌しながら反応させた。１０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（５ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物８ｅ（８．５ ｍｇ、収率：７８．０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８２８．０ ［Ｍ＋１］。

【0141】

ステップ４
１－（（２－アミノアセチルアミノ）メトキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロプロパン－１－カルボキサミド ８ｆ

【0142】

８ｅ（４ ｍｇ、４．８４ μｍｏｌ）を０．２ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０．１ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、２ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返し、３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて叩解し、上層のｎ－ヘキサンを注ぎ出すことを３回繰り返し、減圧濃縮して、粗製品である表題生成物８ｆ（２．９ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ６０６．０ ［Ｍ＋１］。

【0143】

ステップ５
１－（（（Ｓ）－７－ベンジル－２０－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２，５，８，１１，１４－ペンタアザイコシル）オキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロプロパン－１－カルボキサミド ８

【0144】

粗製品８ｆ（２．９ ｍｇ、４．８４ μｍｏｌ）を０．５ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、（Ｓ）－２－（－２－（－２－（６－（－２，５－ジオキソ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミノ）アセトアミノ）アセトアミノ）－３－フェニルプロピオン酸８ｇ（２．７ ｍｇ、５．８０ μｍｏｌ、特許出願「ＥＰ２９０７８２４」に開示された方法で調製された）の０．３ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（２．７ ｍｇ、９．６７ μｍｏｌ）を加え、氷浴で３０分間撹拌しながら反応させ、氷浴を撤去し、室温まで昇温して１５分間撹拌した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物８（２ ｍｇ、収率３９．０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １０６０．０ ［Ｍ＋１］。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ９．０１ （ｄ， １Ｈ）， ８．７７ （ｔ， １Ｈ）， ８．２１ （ｔ， １Ｈ）， ８．０８－７．９２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．７３ （ｄ， １Ｈ）， ７．２８ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４－７．０７ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９８ （ｓ， １Ｈ）， ６．５０ （ｓ， １Ｈ）， ５．６１ （ｑ， １Ｈ）， ５．４０ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３２ （ｔ， １Ｈ）， ５．１２ （ｑ， ２Ｈ）， ４．６２ （ｔ， １Ｈ）， ４．５２ （ｔ， １Ｈ）， ４．４０－４．３２ （ｍ， １Ｈ）， ３．７３－３．４７ （ｍ， ８Ｈ）， ３．１６－３．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８９ （ｄｄ， １Ｈ）， ２．６９－２．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３７－２．２３ （ｍ， ４Ｈ）， ２．１２－１．９３ （ｍ， ４Ｈ）， １．９０－１．７４ （ｍ， ２Ｈ）， １．５２－１．３８ （ｍ， ４Ｈ）， １．３３－１．１１ （ｍ， ５Ｈ）， ０．９１－０．８１ （ｍ， ４Ｈ）。

【0145】

実施例１－９
Ｎ－（（２Ｒ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド ９－Ａ
Ｎ－（（２Ｓ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド ９－Ｂ

【化29】

【化30】

【0146】

ステップ１
２－シクロプロピル－２－ヒドロキシ酢酸ベンジル ９ａ

【0147】

２ａ（１．３ ｇ、１１．２ ｍｍｏｌ、特許出願「ＷＯ２０１３／１０６７１７」に開示された方法で調製された）を５０ ｍＬのアセトニトリルに溶解し、炭酸カリウム（６．１８ ｇ、４４．８ ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（１．３３ ｍＬ、１１．２ ｍｍｏｌ）及びテトラブチルヨウ化アンモニウム（４１３ ｍｇ、１．１ ｍｍｏｌ）を順に加えた。反応液を室温で４８時間撹拌し、珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチル（１０ ｍＬ）ですすぎ、ろ液を合わせ、減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物９ａ（２ ｇ、収率８６．９％）を得た。

【0148】

ステップ２
１０－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸ベンジル ９ｂ

【0149】

９ａ（１２０．９ ｍｇ、０．５８６ ｍｍｏｌ）及び８ｂ（１８０ ｍｇ、０．４８９ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、４ ｍＬのテトラヒドロフランを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（１０９ ｍｇ、０．９８ ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴を撤去し、室温まで昇温し、４０分間撹拌し、１０ ｍＬの氷水を加え、酢酸エチル（２０ ｍＬ×２）及びクロロホルム（１０ ｍＬ×５）で抽出し、有機相を合わせて濃縮した。得られた残留物を４ ｍＬのジオキサンに溶解し、水２ ｍＬを加え、炭酸水素ナトリウム（４９．２ ｍｇ、０．５８６ ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸－９－フルオレニルメチル（１２６ ｍｇ、０．４９ ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。水２０ ｍＬを加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（２０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物９ｂ（４８ ｍｇ、収率：１９％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５１５．０ ［Ｍ＋１］。

【0150】

ステップ３
１０－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸 ９ｃ

【0151】

９ｂ（２０ ｍｇ、０．０３８ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランと酢酸エチル（Ｖ：Ｖ＝２：１）の混合溶媒４．５ ｍＬに溶解し、パラジウム炭素（１２ ｍｇ、含有量１０％、乾式）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で１時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチルですすぎ、ろ液を濃縮して、粗製品である表題生成物９ｃ（１３ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応を行った。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ４２４．９ ［Ｍ＋１］。

【0152】

ステップ４
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（（１－シクロプロピル－２－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート ９ｄ

【0153】

１ｂ（１０ ｍｇ、１８．８ μｍｏｌ）を反応フラスコに入れ、１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、粗製品９ｃ（１３ ｍｇ、３０．６ μｍｏｌ）を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１６．９ ｍｇ、６１．２ μｍｏｌ）を加え、氷浴で４０分間撹拌しながら反応させた。１０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物９ｄ（１９ ｍｇ、収率：７３．６％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８４２．１［Ｍ＋１］。

【0154】

ステップ５
２－（（２－アミノアセチルアミノ）メトキシ）－２－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アセトアミド ９ｅ

【0155】

９ｄ（１９ ｍｇ、２２．６ μｍｏｌ）を２ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、１ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、１ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返した。残留物に３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて叩解し、放置後に上清液を注ぎ出し、固体を保留した。固体残留物を減圧濃縮し、オイルポンプにより乾燥させて粗製品である表題生成物９ｅ（１７ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ６３８．０［Ｍ＋１８］。

【0156】

ステップ６
Ｎ－（（２Ｒ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド ９－Ａ
Ｎ－（（２Ｓ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド ９－Ｂ

【0157】

粗製品９ｅ（１３．９ ｍｇ、２２．４ μｍｏｌ）を０．６ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、８ｇ（２１．２ ｍｇ、４４．８ μｍｏｌ）の０．３ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１８．５ ｍｇ、６７．３ μｍｏｌ）を加え、氷浴で１０分間撹拌しながら反応させ、氷浴を撤去し、室温まで昇温し、１時間撹拌して反応させて化合物９を生成した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物（９－Ａ：２．４ ｍｇ、９－Ｂ：１．７ ｍｇ）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １０７４．４ ［Ｍ＋１］。

【0158】

単一配置の化合物９－Ａ（比較的短い保持時間）：
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１４分間、純度：８５％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．６０ （ｔ， １Ｈ）， ８．５１－８．４９ （ｄ， １Ｈ）， ８．３２－８．２４ （ｍ， １Ｈ）， ８．１３－８．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ８．０２－７．９６ （ｍ， １Ｈ）， ７．８２－７．７５ （ｍ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２６－７．１５ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９９ （ｓ， １Ｈ）， ６．５５－６．４８ （ｍ， １Ｈ）， ５．６５－５．５４ （ｍ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３５－５．１５ （ｍ， ３Ｈ）， ４．７４－４．６２ （ｍ， １Ｈ）， ４．５４－４．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７６－３．６４ （ｍ，４Ｈ）， ３．６２－３．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２０－３．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０４－２．９４ （ｍ， １Ｈ）， ２．８０－２．６２ （ｍ， １Ｈ）， ２．４５－２．３０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２５－２．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１５－２．０４ （ｍ， ２Ｈ）， １．９３－１．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５２－１．３９ （ｍ， ３Ｈ）， １．３４－１．１２ （ｍ， ５Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ３Ｈ）， ０．６４－０．３８ （ｍ， ４Ｈ）。

【0159】

単一配置の化合物９－Ｂ（比較的長い保持時間）：
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１６分間、純度：８９％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．６８－８．６０ （ｍ， １Ｈ）， ８．５８－８．５０ （ｍ， １Ｈ）， ８．３２－８．２４ （ｍ， １Ｈ）， ８．１３－８．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ８．０２－７．９４ （ｍ， １Ｈ）， ７．８２－７．７５ （ｍ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２６－７．１３ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９９ （ｓ， １Ｈ）， ６．５５－６．４８ （ｍ， １Ｈ）， ５．６０－５．５０ （ｍ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３５－５．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．７８－４．６８ （ｍ， １Ｈ）， ４．６０－４．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７６－３．５８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．５８－３．４８ （ｍ， １Ｈ）， ３．２０－３．１０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０８－２．９７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８０－２．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４５－２．３０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２５－２．１３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１３－２．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０３－１．９４ （ｍ， ２Ｈ）， １．９１－１．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５２－１．３９ （ｍ， ３Ｈ）， １．３４－１．１２ （ｍ， ４Ｈ）， ０．９１－０．７９ （ｍ， ３Ｈ）， ０．５３－０．３４ （ｍ， ４Ｈ）。

【0160】

実施例１－１０
Ｎ－（（２Ｓ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノカルボニル）－１，１，１－トリフルオロ－６，９，１２，１５－テトラオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド １０－Ａ
Ｎ－（（２Ｒ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノカルボニル）－１，１，１－トリフルオロ－６，９，１２，１５－テトラオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド １０－Ｂ

【化31】

【化32】

【0161】

ステップ１
３，３，３－トリフルオロ－２－ヒドロキシプロピオン酸ベンジル １０ａ

【0162】

３ａ（１．８０ ｇ、１２．５ ｍｍｏｌ）を１００ ｍＬのアセトニトリルに溶解し、炭酸カリウム（５．１７ ｇ、３７．５ ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（４．４８ ｍＬ、３７．５ ｍｍｏｌ）及びテトラブチルヨウ化アンモニウム（２３１ ｍｇ、０．６３ ｍｍｏｌ）を順に加えた。反応液を６０℃まで加熱して５時間撹拌した。反応液を室温に冷却し、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物１０ａ（９８０ ｍｇ、収率：３３．５％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ７．４３－７．３６ （ｍ， ５Ｈ）， ５．３４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．５３ （ｓ， １Ｈ）， ３．４４ （ｓ， １Ｈ）。

【0163】

ステップ２
１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－１０－（トリフルオロメチル）－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸ベンジル １０ｂ

【0164】

８ｂ（６３ ｍｇ、０．１７ ｍｍｏｌ）及び１０ａ（８０ ｍｇ、０．３４ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、３ ｍＬのテトラヒドロフランを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（３８ ｍｇ、０．３４ ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴を撤去し、室温まで昇温し、２０分間撹拌し、１０ ｍＬの氷水を加え、酢酸エチル（２０ ｍＬ×２）及びクロロホルム（１０ ｍＬ×５）で抽出し、有機相を合わせて濃縮し、得られた残留物を２ ｍＬのジオキサンに溶解し、０．４ ｍＬの水を加え、炭酸水素ナトリウム（１９ ｍｇ、０．２３ ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸－９－フルオレニルメチル（４９ ｍｇ、０．１９ ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。水２０ ｍＬを加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（２０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物１０ｂ（５１ ｍｇ、収率：５５．３％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５５９．９ ［Ｍ＋１８］。

【0165】

ステップ３
１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－１０－（トリフルオロメチル）－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸 １０ｃ

【0166】

１０ｂ（１５ ｍｇ、０．２８ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランと酢酸エチル（Ｖ：Ｖ＝２：１）の混合溶媒３ ｍＬに溶解し、パラジウム炭素（１５ ｍｇ、含有量１０％）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で１時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキをテトラヒドロフランですすぎ、ろ液を濃縮して、粗製品である表題生成物１０ｃ（１３ ｍｇ）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ４５２．９ ［Ｍ＋１］。

【0167】

ステップ４
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（（（３－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，１，１－トリフルオロ－３－オキソプロパン－２－イル）オキシ）メチル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート １０ｄ

【0168】

１ｂ（１０ ｍｇ、１８．８ μｍｏｌ）を反応フラスコに加え、１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、１０ｃ（１３ ｍｇ、２８．７ μｍｏｌ）の０．５ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１１ ｍｇ、３９．７ μｍｏｌ）を加え、氷浴で３０分間撹拌しながら反応させた。１０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせ、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１０ｄ（１６ ｍｇ、収率：９７．８％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８７０．０［Ｍ＋１］。

【0169】

ステップ５
２－（（２－アミノアセチルアミノ）メトキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－３，３，３－トリフルオロプロパンアミド １０ｅ

【0170】

１０ｄ（１６ ｍｇ、１８．４ μｍｏｌ）を０．６ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０．３ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、２ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返した。残留物に３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて叩解し、放置後に上清液を注ぎ出し、固体を保留することを３回繰り返した。固体残留物を減圧濃縮し、オイルポンプにより乾燥させて粗製品である表題生成物１０ｅ（１２ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ６４７．９ ［Ｍ＋１］。

【0171】

ステップ６
Ｎ－（（２Ｓ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノカルボニル）－１，１，１－トリフルオロ－６，９，１２，１５－テトラオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド １０－Ａ
Ｎ－（（２Ｒ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノカルボニル）－１，１，１－トリフルオロ－６，９，１２，１５－テトラオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド １０－Ｂ

【0172】

粗製品１０ｅ（１２ ｍｇ、１８．５ μｍｏｌ）を１．０ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、８ｇ（１４ ｍｇ、２９．６ μｍｏｌ）の０．３ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１５ ｍｇ、５４．２ μｍｏｌ）を加え、氷浴で３０分間撹拌しながら反応させ、氷浴を撤去し、室温まで昇温し、１時間撹拌して反応させて化合物１０を生成した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、対応する成分を収集し、減圧濃縮し、表題生成物（２．７ ｍｇ、２．６ ｍｇ）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １１０２．０ ［Ｍ＋１］。

【0173】

単一配置の化合物（比較的短い保持時間）：
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１８分間、純度：９１％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．９７ （ｄ， １Ｈ）， ８．８５－８．７６ （ｍ， １Ｈ）， ８．３７－８．２７ （ｍ， １Ｈ）， ８．１２－８．０２ （ｍ， １Ｈ）， ８．０２－７．９５ （ｍ， １Ｈ）， ７．８０ （ｄ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２６－７．１０ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９９ （ｓ， １Ｈ）， ６．６６ （ｂｒ， １Ｈ）， ６．５２ （ｓ， １Ｈ）， ５．６５－５．５４ （ｍ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， １Ｈ）， ５．３７－５．２５ （ｍ， ３Ｈ）， ５．２３－５．１３ （ｍ， １Ｈ）， ４．８１－４．６８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．５１－４．４１ （ｍ， １Ｈ）， ３．７８－３．４５ （ｍ， ６Ｈ）， ３．２１－３．１３ （ｍ， １Ｈ）， ３．０２－２．９３ （ｍ， １Ｈ）， ２．７７－２．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４５－２．２９ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２４－２．０５ （ｍ， ３Ｈ）， ２．０４－１．９３ （ｍ， ５Ｈ）， １．９０－１．７５ （ｍ， ２Ｈ）， １．５２－１．３８ （ｍ， ４Ｈ）， ０．９０－０．７８ （ｍ， ５Ｈ）。

【0174】

単一配置の化合物（比較的長い保持時間）：
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．２３分間、純度：９０％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ９．０５ （ｄ， １Ｈ）， ８．９７－８．８８ （ｍ， １Ｈ）， ８．３５－８．２７ （ｍ， １Ｈ）， ８．１１－８．０３ （ｍ， １Ｈ）， ８．０２－７．９５ （ｍ， １Ｈ）， ７．８０ （ｄ， １Ｈ）， ７．３４ （ｓ， １Ｈ）， ７．２９－７．１３ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９９ （ｓ， １Ｈ）， ６．６６ （ｂｒ， １Ｈ）， ６．５４ （ｓ， １Ｈ）， ５．６４－５．５５ （ｍ， １Ｈ）， ５．４３ （ｓ， １Ｈ）， ５．３６－５．２０ （ｍ， ３Ｈ）， ４．９２－４．８５ （ｍ， １Ｈ）， ４．８２－４．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ４．５２－４．４２ （ｍ， １Ｈ）， ３．７７－３．４８ （ｍ， ６Ｈ）， ３．２１－３．１４ （ｍ， １Ｈ）， ３．０３－２．９５ （ｍ， １Ｈ）， ２．７９－２．６５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４７－２．２８ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２５－２．０５ （ｍ， ３Ｈ）， ２．０５－１．９４ （ｍ， ５Ｈ）， １．９１－１．７６ （ｍ， ２Ｈ）， １．５２－１．３７ （ｍ， ４Ｈ）， ０．９２－０．７７ （ｍ， ５Ｈ）。

【0175】

実施例１－１１
１－（（（Ｓ）－７－ベンジル－２０－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２，５，８，１１，１４－ペンタアザイコシル）オキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロブタン－１－カルボキサミド １１

【化33】

【化34】

【0176】

ステップ１
１－（（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセチルアミノ）メトキシ）シクロブタン－１－カルボン酸ベンジル １１ｂ

【0177】

１－ヒドロキシシクロブタン－カルボン酸ベンジル１１ａ（１６７ ｍｇ、０．８１ ｍｍｏｌ、文献「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１３， ｖｏｌ． ５６， ＃ １３， ｐ． ５５４１－５５５２」に開示された方法で調製された）及び８ｂ（１５０ ｍｇ、０．４１ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、５ ｍＬのテトラヒドロフランを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃まで降温し、カリウカルボニルムｔｅｒｔ－ブトキシド（９２ ｍｇ、０．８２ ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を撤去し、室温まで昇温して１０分間撹拌し、２０ ｍＬの氷水を加え、酢酸エチル（５ ｍＬ×２）及びクロロホルム（５ ｍＬ×５）で抽出し、有機相を合わせて濃縮し、得られた残留物を３ ｍＬのジオキサンに溶解し、０．６ ｍＬの水を加え、炭酸水素ナトリウム（４１ ｍｇ、０．４８ ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸－９－フルオレニルメチル（１０５ ｍｇ、０．４１ ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。水２０ ｍＬを加え、酢酸エチル（８ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（２０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物１１ｂ（３７ ｍｇ、収率：１７．６％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５１４．６ ［Ｍ＋１］。

【0178】

ステップ２
１－（（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセチルアミノ）メトキシ）シクロブタン－１－カルボン酸 １１ｃ

【0179】

１１ｂ（３７ ｍｇ、７１．９ μｍｏｌ）をテトラヒドロフランと酢酸エチル（Ｖ：Ｖ＝２：１）の混合溶媒３ ｍＬに溶解し、パラジウム炭素（１５ ｍｇ、含有量１０％）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で２時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキをテトラヒドロフランですすぎ、ろ液を濃縮して、表題生成物１１ｃ（３５ ｍｇ、収率：８２％）を得て、そのまま次のステップに進んだ。

【0180】

ステップ３
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（（１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノカルボニル）シクロプロポキシ）メチル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート １１ｄ

【0181】

１ｂ（１０ ｍｇ、０．０１８ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、１１ｃ（１３ ｍｇ、０．０３１ ｍｍｏｌ）の０．５ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（２５ ｍｇ、０．０９１ ｍｍｏｌ）を加え、氷浴で４０分間撹拌しながら反応させた。８ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（５ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（８ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ａで精製し、表題生成物１１ｄ（１９ ｍｇ、収率：７３．９％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８４２．３ ［Ｍ＋１］。

【0182】

ステップ４
１－（（２－アミノアセチルアミノ）メトキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロブタン－１－カルボキサミド １１ｅ

【0183】

１１ｄ（１９ ｍｇ、２２．６ μｍｏｌ）を２ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、１ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で１．５時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、１ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返し、４ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて叩解し、上層のｎ－ヘキサンを注ぎ出すことを３回繰り返し、減圧濃縮して、粗製品である表題生成物１１ｅ（１５ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。

【0184】

ステップ５
１－（（（Ｓ）－７－ベンジル－２０－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２，５，８，１１，１４－ペンタアザイコシル）オキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロブタン－１－カルボキサミド １１

【0185】

粗製品１１ｅ（２ ｍｇ、３．２２ μｍｏｌ）を０．５ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、８ｇ（１．５ ｍｇ、３．１７ μｍｏｌ）の０．３ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（２．７ ｍｇ、９．６７ μｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応液をオイルポンプで回転乾燥させ、ＤＭＦを除去し、残留物をＤＣＭで溶解した後に薄層クロマトグラフィー法により２回直接精製し（展開溶媒の極性：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０／１）、表題生成物１１（１ ｍｇ、収率：２８．８％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １０７３．６ ［Ｍ＋１］。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ８．７０－８．６０ （ｍ， １Ｈ）， ８．２８－８．１９ （ｍ， １Ｈ）， ８．１３－７．９１ （ｍ， ３Ｈ）， ７．７９－７．７１ （ｄ， １Ｈ）， ７．２９ （ｓ， １Ｈ）， ７．２５－７．０９ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９８ （ｓ， １Ｈ）， ６．７１－６．６２ （ｍ， １Ｈ）， ６．５５－６．４７ （ｍ， １Ｈ）， ５．６４－５．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ５．４０ （ｓ， １Ｈ）， ５．３５－５．２７ （ｔ， ２Ｈ）， ５．１７－５．１０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６０－４．５１ （ｍ， １Ｈ）， ４．５１－４．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９３－３．７８ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７１－３．５９ （ｍ， ３Ｈ）， ３．０１－２．８８ （ｍ， ３Ｈ）， ２．７０－２．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４４－２．３０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２８－２．１４ （ｍ， ３Ｈ）， ２．１１－１．９２ （ｍ， ６Ｈ）， １．９０－１．７６ （ｍ， ３Ｈ）， １．５１－１．３９ （ｍ， ４Ｈ）， ０．９２－０．７５ （ｍ， ６Ｈ）。

【0186】

実施例１－１２
（Ｓ）－３－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシプロパンアミド １２－Ａ
（Ｒ）－３－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシプロパンアミド １２－Ｂ

【化35】

【化36】

【0187】

ステップ１
３－シクロプロピル－２－ヒドロキシプロピオン酸 １２ｂ

【0188】

１２ａ（０．５ ｇ、３．８７ ｍｍｏｌ、供給元：Ａｄａｍａｓ）を水と酢酸（Ｖ：Ｖ＝４：１）の混合溶剤３５ ｍＬに溶解し、氷水浴で０～５℃に降温し、亜硝酸ナトリウム（０．５３ ｇ、７．７４ ｍｍｏｌ）の２ Ｍ水溶液を滴下し、室温まで昇温して３時間撹拌しながら反応させた。反応液に固体塩化ナトリウムを加えて水相を飽和させ、酢酸エチル（８ ｍＬ×８）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮して、表題生成物１２ｂ（０．４５ ｇ、収率：８９．３％）を得た。

【0189】

ステップ２
（Ｓ）－３－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシプロパンアミド １２－Ａ
（Ｒ）－３－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシプロパンアミド １２－Ｂ

【0190】

１ｂ（４５ ｍｇ、０．０８５ ｍｍｏｌ）に１．５ ｍＬのエタノール及び１．５ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、０．１ ｍＬのＮ－メチルモルホリンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に１２ｂ（９０ ｍｇ、０．６９１ ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（３４ ｍｇ、０．２５１ ｍｍｏｌ）及び１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（４９ ｍｇ、０．２５６ ｍｍｏｌ）を順に加え、添加完了後、室温で３時間撹拌しながら反応させた。反応液を減圧濃縮し、得られた粗製品である化合物１２を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：Ｓｈａｒｐｓｉｌ－Ｔ Ｃ１８ ５ μｍ ２１．２＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、表題生成物（７ ｍｇ、１５ ｍｇ）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５４７．９ ［Ｍ＋１］。

【0191】

単一配置の化合物（比較的短い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．３４５分間、純度：７２％（カラム：ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｈａｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８ １．８ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．４２ （ｄ， １Ｈ）， ７．７８ （ｄ， １Ｈ）， ７．３０ （ｓ， １Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．６０－５．５０ （ｍ， ２Ｈ）， ５．４２ （ｓ， １Ｈ）， ５．１９ （ｑ， ２Ｈ）， ４．０２－４．００ （ｍ， １Ｈ）， ３．２１－３．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２１－２．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０５－１．９５ （ｍ， １Ｈ）， １．９２－１．６８ （ｍ， ４Ｈ）， １．５３－１．４１ （ｍ， １Ｈ），０．８７ （ｔ， ３Ｈ）， ０．４８－０．３４ （ｍ， ２Ｈ） ， ０．１４－０．０１ （ｍ， ２Ｈ）。

【0192】

単一配置の化合物（比較的長い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．３９９分間、純度：８８％（カラム：ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｈａｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８ １．８ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．３６ （ｄ， １Ｈ）， ７．７７ （ｄ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．５８－５．５１ （ｍ， １Ｈ）， ５．４８ （ｄ， １Ｈ）， ５．４２ （ｓ， １Ｈ），５．２０ （ｑ， ２Ｈ）， ４．０９－４．０２ （ｍ， １Ｈ）， ３．２２－３．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２７－２．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０５－１．９５ （ｍ， １Ｈ）， １．９３－１．８１ （ｍ， ２Ｈ）， １．６５－１．４３ （ｍ， ２Ｈ）， １．３２－１．２１ （ｍ， １Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ３Ｈ）， ０．４８－０．３３ （ｍ， ２Ｈ） ， ０．１４－０．０１ （ｍ， ２Ｈ）。

【0193】

実施例１－１３（参照例）
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシアセトアミド

【化37】

表題化合物１３は、特許「ＥＰ２９０７８２４Ａ１における明細書のページ１４７のＥｘａｍｐｌｅ ７６」に開示された方法で調製されて得られた。

【0194】

実施例１－１４
Ｎ－（（２Ｒ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－（シクロプロピルメチル）－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド １４－Ａ
Ｎ－（（２Ｓ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－（シクロプロピルメチル）－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド １４－Ｂ

【化38】

【化39】

【0195】

ステップ１
３－シクロプロピル－２－ヒドロキシプロピオン酸ベンジル １４ａ

【0196】

１２ｂ（２００ ｍｇ、１．５４ ｍｍｏｌ）を２０ ｍＬのアセトニトリルに溶解し、炭酸カリウム（１．０６ ｇ、７．６８ ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（０．１６ ｍＬ、１．３４ ｍｍｏｌ）及びテトラブチルヨウ化アンモニウム（２８ ｍｇ、０．０７ ｍｍｏｌ）を順に加えた。反応液を室温で４８時間撹拌し、珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチル（１０ ｍＬ）ですすぎ、ろ液を合わせて減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物１４ａ（１４０ ｍｇ、収率：４１．３％）を得た。

【0197】

ステップ２
１０－（シクロプロピルメチル）－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸ベンジル １４ｂ

【0198】

１４ａ（９４ ｍｇ、０．４２７ ｍｍｏｌ）及び８ｂ（１３０ ｍｇ、０．３５３ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、１０ ｍＬのテトラヒドロフランを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（７９ ｍｇ、０．７０４ ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴を撤去し、室温まで昇温し、１０分間撹拌し、氷水２０ ｍＬを加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×４）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（２０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物１４ｂ（５０ ｍｇ、収率：２６．８％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５２９．２ ［Ｍ＋１］。

【0199】

ステップ３
１０－（シクロプロピルメチル）－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸 １４ｃ

【0200】

１４ｂ（２７ ｍｇ、０．０５１ ｍｍｏｌ）を酢酸エチル３ ｍＬに溶解し、パラジウム炭素（７ ｍｇ、含有量１０％、乾式）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で１時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチルですすぎ、ろ液を濃縮して、粗製品である表題生成物１４ｃ（２３ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応を行った。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ４３９．１ ［Ｍ＋１］。

【0201】

ステップ４
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（（（３－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）オキシ）メチル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート １４ｄ

【0202】

１ｂ（２２ ｍｇ、４２．３８ μｍｏｌ）を反応フラスコに入れ、３ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、トリエチルアミン（４．３ ｍｇ，４２．４９ μｍｏｌ）を滴下し、粗製品１４ｃ（２３ ｍｇ、５１．１ μｍｏｌ）を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１７．６ ｍｇ、６３．６ μｍｏｌ）を加え、氷浴で４０分間撹拌しながら反応させた。１５ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（８ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１５ ｍＬ）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１４ｄ（２９ ｍｇ、収率：７９．９％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８５６．１［Ｍ＋１］。

【0203】

ステップ５
２－（（２－アミノアセチルアミノ）メトキシ）－３－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）プロパンアミド １４ｅ

【0204】

１４ｄ（２９ ｍｇ、３３．９ μｍｏｌ）を０．８ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０．４ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で１．５時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、１ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返した。残留物に３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて叩解し、放置後に上清液を注ぎ出すことを３回繰り返した。残留物を減圧濃縮し、オイルポンプにより乾燥させて粗製品である表題生成物１４ｅ（２２ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ６３４．１［Ｍ＋１］。

【0205】

ステップ６
Ｎ－（（２Ｒ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－（シクロプロピルメチル）－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド １４－Ａ
Ｎ－（（２Ｓ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－（シクロプロピルメチル）－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド １４－Ｂ

【0206】

粗製品１４ｅ（２２ ｍｇ、３３．９ μｍｏｌ）を２．５ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、８ｇ（２４ ｍｇ、５０．８ μｍｏｌ）、及び４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１４ ｍｇ、５０．６ μｍｏｌ）を加え、氷浴を撤去し、室温まで昇温し、１時間撹拌して反応させて化合物１４を生成した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、表題生成物（２ ｍｇ、２ ｍｇ）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １０８８．４ ［Ｍ＋１］。

【0207】

単一配置の化合物（比較的短い保持時間）：
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１８分間、純度：８８％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。

【0208】

単一配置の化合物（比較的長い保持時間）：
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．２３分間、純度：９６％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。

【0209】

実施例１－１５
１－（（Ｓ）－９－ベンジル－２２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－５，８，１１，１４，１７－ペンタオキソ－２－オキサ－４，７，１０，１３，１６－ペンタアザドコサン）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロプロパン－１－カルボキサミド１５

【化40】

【0210】

ステップ１
１－（１０－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－５，８－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザデシル）シクロプロパン－１－カルボン酸ベンジル １５ｂ

【0211】

８ｂ（５００ ｍｇ、１．３５ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに入れ、６ ｍＬのテトラヒドロフランを加え、１－ヒドロキシメチルシクロプロパン－１－ギ酸ベンジル１５ａ（２３３ ｍｇ、１．１３ ｍｍｏｌ、特許出願「ＥＰ２８６２８５６Ａ１の明細書のページ２６２のＥｘａｍｐｌｅ ２２－２」に開示された方法で調製された）をフラスコに入れ、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、水素化ナトリウム（５４ ｍｇ、１．３５ ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を撤去し、室温まで昇温して４０分間撹拌し、零度まで降温して２０ ｍＬの氷水を加え、酢酸エチル（５ ｍＬ×２）及びクロロホルム（５ ｍＬ×５）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（２０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１５ｂ（１５ ｍｇ、収率：２．５％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５１５．２ ［Ｍ＋１］。

【0212】

ステップ２
１－（１０－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－５，８－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザデシル）シクロプロパン－１－カルボン酸１５ｃ

【0213】

１５ｂ（１５ ｍｇ、０．０２９ ｍｍｏｌ）を２ ｍＬの酢酸エチルに溶解し、パラジウム炭素（３ ｍｇ、含有量１０％、乾式）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で４．５時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチルですすぎ、ろ液を濃縮して、表題生成物１５ｃ（１１ ｍｇ、収率：８９％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ４２５．２ ［Ｍ＋１］。

【0214】

ステップ３
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（（１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノカルボニル）シクロプロピル）メトキシ）メチル）アミノ）２－オキソエチル）カルバメート １５ｄ

【0215】

１ｂ（１０ ｍｇ、０．０２１ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに入れ、１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、１５ｃ（１１ ｍｇ、０．０２６ ｍｍｏｌ）を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１０．７ ｍｇ、０．０３９ ｍｍｏｌ）を加え、添加完了後、室温で６０分間撹拌しながら反応させた。１０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（５ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１５ｄ（１９ ｍｇ、収率：８７．０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８４２．２ ［Ｍ＋１］。

【0216】

ステップ４
１－（（２－アミノアセチルアミノ）メトキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロプロパン－１－カルボキサミド １５ｅ

【0217】

１５ｄ（１９ ｍｇ、２２．５６ μｍｏｌ）を２ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、１ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で１．５時間撹拌した。反応液を０℃で減圧濃縮し、１ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返し、３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて叩解し、上層のｎ－ヘキサンを注ぎ出すことを３回繰り返し、減圧濃縮して、粗製品である表題生成物１５ｅ（１３．９ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ６２０．１ ［Ｍ＋１］。

【0218】

ステップ５
１－（（Ｓ）－９－ベンジル－２２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－５，８，１１，１４，１７－ペンタオキソ－２－オキサ－４，７，１０，１３，１６－ペンタアザドコサン）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロプロパン－１－カルボキサミド １５

【0219】

粗製品１５ｅ（１３．９ ｍｇ、２２．４ μｍｏｌ）を１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、８ｇ（１５．８ ｍｇ、３３．４ μｍｏｌ）を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（９．３ ｍｇ、３３．６ μｍｏｌ）を加え、室温まで昇温し、６０時間撹拌しながら反応させた。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物１５（２．５ ｍｇ、収率１０．３％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １０７４．２ ［Ｍ＋１］。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．５１－８．３７ （ｍ， １Ｈ）， ８．２２ （ｔ， １Ｈ）， ８．１４－８．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ８．０１１－７．９４ （ｍ， １Ｈ）， ７．８２－７．７３ （ｍ， １Ｈ）， ７．２９ （ｓ， １Ｈ）， ７．２６－７．１０ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９８ （ｓ， １Ｈ）， ６．５３－６．４７ （ｍ， １Ｈ）， ５．６２－５．５０ （ｍ， １Ｈ）， ５．４５－５．３６ （ｍ， １Ｈ）， ５．３５－５．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ５．１３－５．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６１－４．５０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４２－４．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７６－３．６１ （ｍ， ３Ｈ）， ３．６０－３．４５ （ｍ， ３Ｈ）， ３．２７－３．２３ （ｍ， １Ｈ）， ３．２０－２．８１ （ｍ，７Ｈ）， ２．７５－２．６１ （ｍ， ３Ｈ）， ２４１－２．２８ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２３－２．１３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１１－２．０１ （ｍ， １Ｈ）， ２．０３－１．９４ （ｍ， １Ｈ）， １．９０ （ｓ， １Ｈ）， １．８７－１．７４ （ｍ， ２Ｈ）， １．５３－１．３６ （ｍ， ３Ｈ）， １．２９－１．０８ （ｍ， ４Ｈ）， ０．９０－０．６８ （ｍ， ４Ｈ）。

【0220】

実施例１－１６
１－（（Ｓ）－９－ベンジル－２２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－５，８，１１，１４，１７－ペンタオキソ－２－オキサ－４，７，１０，１３，１６－ペンタアザドコサン）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロブタン－１－カルボキサミド １６

【化41】

【化42】

【0221】

ステップ１
１－（ヒドロキシメチル）シクロブタン－１－カルボン酸 １６ｂ

【0222】

エチル１－（ヒドロキシメチル）シクロブタンカルボキシレート１６ａ（２５０ ｍｇ、１．５８ ｍｍｏｌ、供給元：Ａｌｆａ）をメタノール（２ ｍＬ）及び水（１ ｍＬ）に溶解し、水酸化ナトリウム（１２６ ｍｇ、３．１５ ｍｍｏｌ）を加え、４０℃に昇温し、３時間撹拌しながら反応させた。常温まで冷却し、減圧濃縮して有機溶剤を除去し、エーテル（１０ ｍＬ）で逆抽出し、水相を収集した。水相を６ Ｎの塩酸水溶液でｐＨ３～４に調整し、減圧濃縮して固体を得た。３ ｍＬのトルエンを加え、減圧濃縮して回転乾燥することを３回繰り返した。オイルポンプで乾燥させ、粗製品である表題生成物１６ｂ（２０６ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ，ＮＥＧ）：１２９．２ ［Ｍ－１］。

【0223】

ステップ２
１－（ヒドロキシメチル）シクロブタン－１－カルボン酸ベンジル １６ｃ

【0224】

粗製品１６ｂ（２０６ ｍｇ、１．５８ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１５ ｍＬ）に溶解し、無水炭酸カリウム（１．０９ ｇ、７．９０ ｍｍｏｌ）及びテトラブチルヨウ化アンモニウム（２９ ｍｇ、７８．５１ μｍｏｌ）を加え、臭化ベンジル（２１６ ｍｇ、１．２６ ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物１６ｃ（１１２ ｍｇ、収率：３２．１％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ２２１．１ ［Ｍ＋１］。

【0225】

ステップ３
１－（１０－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－５，８－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザデシル）シクロブタン－１－カルボン酸ベンジル １６ｄ

【0226】

１６ｃ（７７ ｍｇ、０．３５ ｍｍｏｌ）及び８ｂ（１００ ｍｇ、０．２７ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに入れ、３ ｍＬのテトラヒドロフランを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（６１ ｍｇ、０．５４ ｍｍｏｌ）を加え、氷浴で１０分間撹拌した。２０ ｍＬの氷水を加え、酢酸エチル（５ ｍＬ）及びクロロホルム（５ ｍＬ×５）で抽出し、有機相を合わせて濃縮した。得られた残留物を３ ｍＬの１，４－ジオキサンに溶解し、水０．５ ｍＬを加え、炭酸水素ナトリウム（２７ ｍｇ、０．３２ ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸－９－フルオレニルメチル（７１ ｍｇ、０．２７ ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。水２０ ｍＬを加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（２０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物１６ｄ（２４ ｍｇ、収率：１６．７％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５５１．３ ［Ｍ＋２３］。

【0227】

ステップ４
１－（１０－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－５，８－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザデシル）シクロブタン－１－カルボン酸ベンジル １６ｅ

【0228】

１６ｄ（１２ ｍｇ、２２．７ μｍｏｌ）をテトラヒドロフランと酢酸エチル（Ｖ：Ｖ＝２：１）の混合溶媒１．５ ｍＬに溶解し、パラジウム炭素（５ ｍｇ、含有量１０％）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で２時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチルですすぎ、ろ液を減圧濃縮して、粗製品である表題生成物１６ｅ（１０ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。

【0229】

ステップ５
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（（（１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノカルボニル）シクロブチル）メトキシ）メチル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート １６ｆ

【0230】

１ｂ（７．５ ｍｇ、０．０１４ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに入れ、１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、粗製品１６ｅ（１０ ｍｇ）の０．５ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（６ ｍｇ、０．０２６ ｍｍｏｌ）を加え、氷浴で３０分間撹拌しながら反応させた。１０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１６ｆ（１０．６ ｍｇ、収率：８７．８％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８５６．２ ［Ｍ＋１］。

【0231】

ステップ６
１－（（（２－アミノアセチルアミノ）メトキシ）メチル）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロブタン－１－カルボキサミド １６ｇ

【0232】

１６ｆ（１０．６ ｍｇ、１２．４ μｍｏｌ）を０．６ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０．３ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、２ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返し、３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて叩解し、上層のｎ－ヘキサンを注ぎ出すことを３回繰り返した。減圧濃縮して粗製品である表題生成物１６ｇ（８ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ６３４．１ ［Ｍ＋１］。

【0233】

ステップ７
１－（（Ｓ）－９－ベンジル－２２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－５，８，１１，１４，１７－ペンタオキソ－２－オキサ－４，７，１０，１３，１６－ペンタアザドコサン）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロブタン－１－カルボキサミド １６

【0234】

粗製品１６ｇ（８ ｍｇ）を１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、８ｇ（８．８ ｍｇ、１８．６ μｍｏｌ）を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（５．２ ｍｇ、１８．８ μｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌しながら反応させた。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、表題生成物１６（１．０ ｍｇ、収率：７．２％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １０８８．０ ［Ｍ＋１］。

【0235】

実施例１－１７
（１ｒ，４ｒ）－Ｎ－（（Ｓ）－７－ベンジル－１－（１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノカルボニル）シクロプロピルオキシ）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８，４１－ノナオキサ－２，５，８，１１，１４－ペンタアザトリテトラコンタン－４３－イル）－４－（（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）メチル）シクロヘキサン－１－カルボキサミド １７

【化43】

【化44】

【0236】

ステップ１
１－フェニル－２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９－デカオキサヘントリアコンタン－３１－酸ｔｅｒｔ－ブチル １７ｂ

【0237】

１－フェニル－２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６－ノナオキサオクタコサン－２８－オール１７ａ（０．３４ ｇ、０．６７ ｍｍｏｌ、供給元：畢得）を１０ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、酸化銀（０．２４ ｇ、１．０１ ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．１６ ｇ、０．８１ ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（０．０７ ｇ、０．４０ ｍｍｏｌ）を順に加え、室温で３時間撹拌しながら反応させた。ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１７ｂ（０．４２ ｇ、収率：１００％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ６３６．３ ［Ｍ＋１８］。

【0238】

ステップ２
２９－ヒドロキシ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサモンタン－１－酸ｔｅｒｔ－ブチル １７ｃ

【0239】

１７ｂ（４１７ ｍｇ、０．６７ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１５ ｍＬに溶解し、パラジウム炭素（１１０ ｍｇ、含有量１０％、乾式）を加え、水素ガスで３回置換し、６０℃まで昇温して３時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキをテトラヒドロフランですすぎ、ろ液を濃縮して、粗製品である表題生成物１７ｃ（３５７ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応を行った。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５４６．２ ［Ｍ＋１８］。

【0240】

ステップ３
２９－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサモンタン－１－酸ｔｅｒｔ－ブチル１７ｄ

【0241】

１７ｃ（３５７ ｍｇ、０．６７５ ｍｍｏｌ）を１０ ｍＬのトルエンに溶解し、ジフェニルリン酸アジド（２７９ ｍｇ、１．０１４ ｍｍｏｌ）及び１，８－ジアザビシクロウンデカ－７－エン（２０６ ｍｇ、１．３５３ ｍｍｏｌ）を加え、アルゴンガスで３回置換し、室温で２時間撹拌しながら反応させ、そして１０５℃まで昇温して１９時間反応させた。反応液を室温に冷却し、濃縮し、２０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×４）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（２０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、粗製品である表題生成物１７ｄ（４１２ ｍｇ）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５７１．３ ［Ｍ＋１８］。

【0242】

ステップ４
２９－アミノ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサモンタン－１－酸ｔｅｒｔ－ブチル １７ｅ

【0243】

１７ｄ（２３０ ｍｇ、０．４１５ ｍｍｏｌ）を８ ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、パラジウム炭素（５８ ｍｇ、含有量１０％、乾式）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で２時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキをテトラヒドロフランですすぎ、ろ液を濃縮して、粗製品である表題生成物１７ｅ（２２０ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応を行った。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５２８．２ ［Ｍ＋１］。

【0244】

ステップ５
１－（（１ｒ，４ｒ）－４－（（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）メチル）シクロヘキシル）－１－オキソ－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９－ノナオキサ－２－アザヘントリアコンタン－３１－酸ｔｅｒｔ－ブチル １７ｆ

【0245】

（１ｒ，４ｒ）－４－（（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）メチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（９８．５ ｍｇ、０．４１５ ｍｍｏｌ）を１０ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、２－（７－ベンゾトリアゾールオキシド）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（１９０ ｍｇ、０．５００ ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１６２ ｍｇ、１．２５３ ｍｍｏｌ）を加え、アルゴンガスで３回置換し、粗製品１７ｅ（２２０ ｍｇ、０．４１７ ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌しながら反応させた。１５ ｍＬの水を加え、ジクロロメタン（８ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１５ ｍＬ）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１７ｆ（１２２ ｍｇ、収率：３９．２％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ７４７．２［Ｍ＋１］。

【0246】

ステップ６
１－（（１ｒ，４ｒ）－４－（（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）メチル）シクロヘキシル）－１－オキソ－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９－ノナオキサ－２－アザ－３１－酸 １７ｇ

【0247】

１７ｆ（１２２ ｍｇ、０．１６３ μｍｏｌ）を０．８ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０．４ ｍＬのトリフルオロ酢酸を加え、室温で１時間撹拌しながら反応させた。１５ ｍＬのジクロロメタンを加えて希釈し、減圧濃縮し、１０ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返し、更に１０ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮し、ｐＨが７に近くなるまでｎ－ヘキサン：エーテル＝５：１の混合溶剤１０ ｍＬで３回叩解し、濃縮し、オイルポンプで乾燥し、表題生成物１７ｇ（９８ ｍｇ、収率：８６．８％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ６９１．２［Ｍ＋１］。

【0248】

ステップ７
２，４－ジメトキシベンジル－１－（（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセチルアミノ）メトキシ）シクロプロピル－１－カルボン酸エステル １７ｈ

【0249】

８ｄ（１６４ ｍｇ、０．４０ ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ ｍＬ）に溶解し、２，４－ジメトキシベンジルアルコール（８１ ｍｇ、０．４８ ｍｍｏｌ）、１－エチル－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジヒドロクライド（１１５ ｍｇ、０．６０ ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（５ ｍｇ、０．０４１ ｍｍｏｌ）を順に加え、添加完了後、室温で１時間撹拌しながら反応させた。２０ ｍＬの水を加え、振とうした後に分層させ、水相をジクロロメタン（８ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（２０ ｍＬ）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物１７ｈ（１２４ ｍｇ、収率：５５．４％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５８３．１［Ｍ＋２３］。

【0250】

ステップ８
２，４－ジメトキシベンジル（Ｓ）－１－（（１１－ベンジル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２－オキサ－４，７，１０，１３，１６－ペンタアザヘプタデカン－１７－イル）オキシ）シクロプロピル－１－カルボン酸エステル １７ｊ

【0251】

１７ｈ（３９ ｍｇ、６９．６ μｍｏｌ）を０．６ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０．３ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で１時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、２ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返し、３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて叩解し、上層のｎ－ヘキサンを注ぎ出すことを３回繰り返し、減圧濃縮した。得られた粗製品を２ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）グリシル－Ｌ－フェニルアラニン１７ｉ（３５ ｍｇ、６９．８ μｍｏｌ、特許出願「ＣＮ１０８８５３５１４Ａの明細書のページ１３の実施例７～１２」に開示された方法で調製された）を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（２３ ｍｇ、８３．１ μｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。１０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１７ｊ（４８ ｍｇ、収率：８３．９％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８２２．０［Ｍ＋１］。

【0252】

ステップ９
（Ｓ）－１－（（１１－ベンジル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２－オキサ－４，７，１０，１３，１６－ペンタアザヘプタデカン－１７－イル）オキシ）シクロプロパン－１－カルボン酸 １７ｋ

【0253】

１７ｊ（４８ ｍｇ、５８．４ μｍｏｌ）を１．４ ｍＬの３％（ｖ／ｖ）のジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液に溶解し、氷水浴で０～５℃に降温し、トリエチルシラン（２１ ｍｇ、１８０．６ μｍｏｌ）を加え、氷浴で３時間撹拌しながら反応させた。氷浴下で減圧濃縮して有機溶剤の半分を除去し、５ ｍＬのエーテルを加え、自然に室温まで昇温して叩解し、白い固体を析出し、ろ過し、ろ過ケーキを収集し、オイルポンプで乾燥し、表題生成物１７ｋ（３３ ｍｇ、収率：８４．１％）を得た。

【0254】

ステップ１０
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｓ）－７－ベンジル－１－（１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノカルボニル）シクロプロピルオキシ）－３，６，９，１２－テトラオキソ－２，５，８，１１－テトラアザトリデカン－１３－イル）カルバメート １７ｌ

【0255】

１ｂ（２０ ｍｇ、４２．４ μｍｏｌ）を反応フラスコに入れ、１ ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）のメタノールのジクロロメタン溶液を加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に冷却し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、１ｂが溶解されるまで撹拌した。１７ｋ（３３ ｍｇ、４９．１ μｍｏｌ）を１ ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）のメタノールのジクロロメタン溶液に溶解し、そして上記反応液に滴下し、更に４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１７．６ ｍｇ、６３．６ μｍｏｌ）を加えた。室温まで昇温して、１時間撹拌しながら反応させた。１０ ｍＬのジクロロメタン及び５ ｍＬの水を加え、５分間撹拌し、放置して分層させ、有機相を収集し、水相をジクロロメタン（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１７ｌ（３７ ｍｇ、収率：８０．２％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １０９０．１［Ｍ＋１］。

【0256】

ステップ１１
（１ｒ，４ｒ）－Ｎ－（（Ｓ）－７－ベンジル－１－（１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノカルボニル）シクロプロピルオキシ）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８，４１－ノナオキサ－２，５，８，１１，１４－ペンタアザトリテトラコンタン－４３－イル）－４－（（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）メチル）シクロヘキサン－１－カルボキサミド １７

【0257】

１７ｌ（１５．５ ｍｇ、１４．２３ μｍｏｌ）を０．６ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０．３ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で１．５時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、２ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返し、３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて叩解し、上層のｎ－ヘキサンを注ぎ出すことを３回繰り返した。減圧濃縮し、そしてオイルポンプで乾燥した。得られた粗製品を１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、１７ｇ（１１ ｍｇ、１５．９２ μｍｏｌ）を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（６．０ ｍｇ、２１．６８ μｍｏｌ）を加え、アルゴンガスで３回置換し、室温で３０分間撹拌しながら反応させた。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物１７（６ ｍｇ、収率２７．４％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １５５６．４ ［Ｍ＋１８］。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．９８ （ｄ， １Ｈ）， ８．７６ （ｓ， １Ｈ）， ８．２０ （ｂｒ， １Ｈ）， ８．１２－７．９５ （ｍ， ３Ｈ）， ７．９３－７．７６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．７５－７．６６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １Ｈ）， ７．２０－７．０５ （ｍ， ６Ｈ）， ６．９７ （ｓ， １Ｈ）， ６．６４ （ｂｒ， １Ｈ）， ６．５５ （ｄ， １Ｈ）， ６．４７ （ｓ， １Ｈ）， ５．６１－５．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．３７ （ｓ， １Ｈ）， ５．３３－５．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ５．１８ （ｓ， １Ｈ）， ５．１３ （ｓ， １Ｈ）， ５．０５ （ｓ， １Ｈ）， ５．００ （ｓ， １Ｈ）， ４．６５－４．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．５３－４．４５ （ｍ， １Ｈ）， ４．３８－４．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８４ （ｓ， ２Ｈ）， ３．６７ （ｄ， ３Ｈ）， ３．６０－３．４０ （ｍ， ３３Ｈ）， ３．１８ （ｄ， １Ｈ）， ３．１５－３．０８ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．００－１．９２ （ｍ， ３Ｈ）， １．８５ （ｓ， ２Ｈ）， １．８２－１．７３ （ｍ， ２Ｈ）， １．６８－１．５２ （ｍ， ４Ｈ）， １．２９－１．１５ （ｍ， ３Ｈ）， ０．８６－０．７６ （ｍ， ５Ｈ）。

【0258】

実施例１－１８
（１ｒ，４ｒ）－Ｎ－（（２Ｒ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５，１８－ヘキサオキソ－３，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８，４１，４４－デカオキサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタアザテトラヘキサデカン－４６－イル）－４－（（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）メチル）シクロヘキサン－１－カルボキサミド １８

【化45】

【化46】

【0259】

ステップ１
（Ｒ）－２－シクロプロピル－２－ヒドロキシ酢酸ベンジル １８ａ
（Ｓ）－２－シクロプロピル－２－ヒドロキシ酢酸ベンジル １８ｂ

【0260】

２ａ（７．４ ｇ、６３．７ ｍｍｏｌ）を２００ ｍＬのアセトニトリルに溶解し、炭酸カリウム（３５ ｇ、２５３．６ ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（９．３ ｇ、５４．４ ｍｍｏｌ）及びテトラブチルヨウ化アンモニウム（５００ ｍｇ、１．３６ ｍｍｏｌ）を順に加えた。反応液を室温で１６時間撹拌し、珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチル（１０ ｍＬ）ですすぎ、ろ液を合わせて減圧濃縮し、得られた残留物４．１ ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、更にキラル分割して精製し、表題生成物１８ａ（１．１ ｇ）及び１８ｂ（１．２ ｇ）を得た。

【0261】

ステップ２
（Ｒ）－１０－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸ベンジル １８ｃ

【0262】

８ｂ（３．１ ｇ、８．４１ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５５ ｍＬ）に溶解し、１８ａ（２．０ ｇ、９．７０ ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴で０～５℃に冷却し、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（１．８９ ｇ、１６．８４ ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴で１０分間撹拌した。酢酸エチル（３０ ｍＬ）及び水（２０ ｍＬ）を加え、放置して分層させ、水相をクロロホルム（３０ ｍＬ×５）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を減圧濃縮し、得られた残留物を１，４－ジオキサン（３２ ｍＬ）及び水（８ ｍＬ）に溶解し、炭酸ナトリウム（１．７８ ｇ、１６．７９ ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸－９－フルオレニルメチル（２．１８ ｇ、８．４２ ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液に水（３０ ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（３０ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物をカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物１８ｃ（１．３ ｇ、収率：３０．０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５１５．２［Ｍ＋１］。

【0263】

ステップ３
（Ｒ）－１０－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸 １８ｄ

【0264】

１８ｃ（１．２９ ｇ、２．５１ ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１５ ｍＬ）に溶解し、パラジウム炭（２６０ ｍｇ、含有量１０％、乾式）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で５時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチル（２０ ｍＬ）及びメタノール（２０ ｍＬ）ですすぎ、ろ液を濃縮し、粗製品である表題生成物１８ｄ（９８０ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応を行った。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ４２５．１ ［Ｍ＋１］。

【0265】

ステップ４
２，４－ジメトキシベンジル（Ｒ）－１０－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－エステル １８ｅ

【0266】

粗製品１８ｄ（９８０ ｍｇ、２．３１ ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ ｍＬ）に溶解し、２，４－ジメトキシベンジルアルコール（７７７ ｍｇ、４．６２ ｍｍｏｌ）、１－エチル－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジヒドロクライド（６６４ ｍｇ、３．４６ ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（２８ ｍｇ、０．２３ ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。減圧濃縮して有機溶剤を除去し、２０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（５０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（３０ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物をカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物１８ｅ（８１０ ｍｇ、収率：６１．１％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５７５．０［Ｍ＋１］。

【0267】

ステップ５
２，４－ジメトキシベンジル（Ｒ）－２－（（２－アミノアセチルアミノ）メトキシ）－２－シクロプロピル酢酸エステル １８ｆ

【0268】

１８ｅ（３３ ｍｇ、５７．４ μｍｏｌ）を０．６ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０．３ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で１時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、２ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返し、３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて叩解し、上層のｎ－ヘキサンを注ぎ出すことを３回繰り返し、減圧濃縮して、粗製品である表題生成物１８ｆ（２１ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。

【0269】

ステップ６
２，４－ジメトキシベンジル（１１Ｓ，１９Ｒ）－１１－ベンジル－１９－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２，１８－ジオキサ－４，７，１０，１３，１６－ペンタアザエイコサン－２０－酸エステル １８ｇ

【0270】

粗製品１８ｆ（２１ ｍｇ、５７．４ μｍｏｌ）を３ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、１７ｉ（２９ ｍｇ、５７．８ μｍｏｌ）を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１９ ｍｇ、６８．７ μｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。１０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１８ｇ（３７ ｍｇ、収率：７７．１％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８５３．０［Ｍ＋１８］。

【0271】

ステップ７
（１１Ｓ，１９Ｒ）－１１－ベンジル－１９－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２，１８－ジオキサ－４，７，１０，１３，１６－ペンタアザエイコサン－２０－酸 １８ｈ

【0272】

１８ｇ（３７ ｍｇ、４４．３ μｍｏｌ）を１．４ ｍＬの３％（ｖ／ｖ）のジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液に溶解し、氷水浴で０～５℃に降温し、トリエチルシラン（１５．４ ｍｇ、１３２．４ μｍｏｌ）を加え、氷浴で３時間撹拌しながら反応させた。氷浴下で減圧濃縮して有機溶剤の半分を除去し、５ ｍＬのエーテルを加え、自然に室温まで昇温して叩解し、白い固体を析出し、ろ過し、ろ過ケーキを収集し、オイルポンプで乾燥し、表題生成物１８ｈ（２４ ｍｇ、収率：７９．１％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ７０８．２［Ｍ＋２３］。

【0273】

ステップ８
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（２Ｒ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）カルバメート １８ｉ

【0274】

１ｂ（３０ ｍｇ、６３．６ μｍｏｌ）を反応フラスコに入れ、１ ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）のメタノールのジクロロメタン溶液を加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、１ｂが溶解されるまで撹拌した。１８ｈ（６５ ｍｇ、９４．８ μｍｏｌ）を１ ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）のメタノールのジクロロメタン溶液に溶解し、そして上記反応液に滴下し、更に４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（２７ ｍｇ、９７．６ μｍｏｌ）を加えた。室温まで昇温して、１時間撹拌しながら反応させた。１０ ｍＬのジクロロメタン及び５ ｍＬの水を加え、５分間撹拌し、放置して分層させ、有機相を収集し、水相をジクロロメタン（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１８ｉ（２５ ｍｇ、収率：３５．６％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １１０４．４［Ｍ＋１］。

【0275】

ステップ９
（Ｓ）－２－（２－（２－アミノアセチルアミノ）アセチルアミノ）－Ｎ－（２－（（（（Ｒ）－１－シクロプロピル－２－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）アミノ）－２－オキソエトキシ）－３－フェニルプロパンアミド １８ｊ

【0276】

１８ｉ（１２ ｍｇ、１０．９ μｍｏｌ）を０．６ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０．３ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で１．５時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、２ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返し、３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて叩解し、上層のｎ－ヘキサンを注ぎ出すことを３回繰り返し、減圧濃縮して、粗製品である表題生成物１８ｊ（１０ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８８１．０ ［Ｍ＋１］。

【0277】

ステップ１０
（１ｒ，４ｒ）－Ｎ－（（２Ｒ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５，１８－ヘキサオキソ－３，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８，４１，４４－デカオキサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタアザテトラヘキサデカン－４６－イル）－４－（（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）メチル）シクロヘキサン－１－カルボキサミド １８

【0278】

粗製品１８ｊ（１０ ｍｇ）を１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、１７ｇ（８．５ ｍｇ、１２．３ μｍｏｌ）を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（４．６ ｍｇ、１６．６ μｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応液をろ過し、高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９×２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物１８（９．５ ｍｇ、収率：５６．２％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １５７０．２ ［Ｍ＋１８］。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．７７ （ｄ， １Ｈ）， ８．５９－８．５５ （ｍ， １Ｈ）， ８．４２ （ｄ， １Ｈ）， ８．３７－８．２８ （ｍ， １Ｈ）， ８．２５－８．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．９６－７．８６ （ｍ， １Ｈ）， ７．８６－７．７０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３２－７．２８ （ｍ， １Ｈ）， ７．２５－７．１４ （ｍ， ３Ｈ）， ６．６７ （ｍ， １Ｈ）， ５．９６ （ｓ， １Ｈ）， ５．８０－５．７２ （ｍ， １Ｈ）， ５．６２－５．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．４３－５．３０ （ｍ， ３Ｈ）， ５．２８－５．１７ （ｍ， ２Ｈ）， ５．１２－５．０８ （ｍ， １Ｈ）， ４．７２－４．３５ （ｍ， ８Ｈ）， ３．９５－３．７０ （ｍ， １３Ｈ）， ３．３５－３．２２ （ｍ， １４Ｈ）， ２．４２－２．３２ （ｍ， ３Ｈ）， ２．０５－１．９８ （ｍ， ４Ｈ）， １．８８－１．８２ （ｍ， １２Ｈ）， １．４７－１．３９ （ｍ， ３Ｈ）， １．３２－１．１８ （ｍ， １１Ｈ）， ０．９０－０．８０ （ｍ， ４Ｈ）， ０．５２－０．３７ （ｍ， ３Ｈ）， ０．３２－０．１８ （ｍ， ２Ｈ）。

【0279】

実施例１－１９
（１ｒ，４ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５，１８－ヘキサオキソ－３，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８，４１，４４－デカオキサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタアザテトラヘキサデカン－４６－イル）－４－（（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）メチル）シクロヘキサン－１－カルボキサミド １９

【化47】

【0280】

ステップ１
（Ｓ）－１０－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸ベンジル １９ａ

【0281】

１８ｂ（２５２ ｍｇ、１．２２ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに入れ、４ ｍＬのジクロロメタンを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、リチウムｔｅｒｔ－ブトキシド（９８ ｍｇ、１．２２ ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴で１５分間撹拌しながら反応させ、清澄になると、８ｂ（３００ ｍｇ、８１４．３ μｍｏｌ）を加え、氷水浴で２．５時間撹拌した。水（１０ ｍＬ）を入れて、分液し、水相をジクロロメタン（８ ｍＬ×２）で抽出し、有機相を合わせた後に水（１０ ｍＬ×１）で洗浄し、飽和食塩水（１０ ｍＬ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過濃縮して粗製品を得た。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物１９ａ（２８２ ｍｇ、収率：６７．２％）を得た。

【0282】

ステップ２
（Ｓ）－１０－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸 １９ｂ

【0283】

１９ａ（２８０ ｍｇ、０．５５４ ｍｍｏｌ）を８ ｍＬの酢酸エチルに溶解し、パラジウム炭素（８４ ｍｇ、含有量１０％、乾式）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で３時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチルですすぎ、ろ液を濃縮して、粗製品である表題生成物１９ｂ（２３０ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応を行った。

【0284】

ステップ３
２，４－ジメトキシベンジル（Ｓ）－１０－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸エステル １９ｃ

【0285】

粗製品１９ｂ（２３０ ｍｇ、５４１．８ μｍｏｌ）を７ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、２，４－ジメトキシベンジルアルコール（１３６．７ ｍｇ、８１２．７ μｍｏｌ）、１－エチル－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジヒドロクライド（１５５ ｍｇ、８０８．５ μｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（６．６ ｍｇ、５３．５ μｍｏｌ）を順に加え、室温で１６時間撹拌した。反応液を１０ ｍＬのジクロロメタンで希釈した後、水（１０ ｍＬ×１）で洗浄し、飽和食塩水（１０ ｍＬ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過濃縮して粗製品を得た。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１９ｃ（１５９ ｍｇ、収率：５１．０％）を得た。

【0286】

ステップ４
２，４－ジメトキシベンジル（Ｓ）－２－（（２－アミノアセチルアミノ）メトキシ）－２－シクロプロピル酢酸エステル １９ｄ

【0287】

１９ｃ（６０ ｍｇ、１０４．４ μｍｏｌ）を１ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０．５ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で１時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、２ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返し、３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて叩解し、上層のｎ－ヘキサンを注ぎ出すことを３回繰り返し、減圧濃縮して、粗製品である表題生成物１９ｄ（２１ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。

【0288】

ステップ５
２，４－ジメトキシベンジル（１１Ｓ，１９Ｓ）－１１－ベンジル－１９－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２，１８－ジオキサ－４，７，１０，１３，１６－ペンタアザエイコサン－２０－酸エステル１９ｅ

【0289】

粗製品１９ｄ（３６ ｍｇ、１０２．２ μｍｏｌ）を４ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、１７ｉ（５２ ｍｇ、１０３．６ μｍｏｌ）を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（３４．６ ｍｇ、１２５．０ μｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。１０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１９ｅ（７０ ｍｇ、収率：８０．２％）を得た。

【0290】

ステップ６
（１１Ｓ，１９Ｓ）－１１－ベンジル－１９－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２，１８－ジオキサ－４，７，１０，１３，１６－ペンタアザエイコサン－２０－酸 １９ｆ

【0291】

１９ｅ（７０ ｍｇ、８３．７ μｍｏｌ）を２．５ ｍＬの３％（ｖ／ｖ）のジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液に溶解し、氷水浴で０～５℃に降温し、トリエチルシラン（２９ ｍｇ、２４９．４ μｍｏｌ）を加え、氷浴で３時間撹拌しながら反応させた。氷浴で減圧濃縮して有機溶剤の半分を除去し、５ ｍＬのエーテルを加え、自然に室温まで昇温して叩解し、白い固体を析出し、ろ過し、ろ過ケーキを収集し、オイルポンプで乾燥し、表題生成物１９ｆ（５７ ｍｇ、収率：９９．２％）を得た。

【0292】

ステップ７
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（２Ｓ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）カルバメート １９ｇ

【0293】

１ｂ（３０ ｍｇ、６３．６ μｍｏｌ）を反応フラスコに入れ、１ ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）のメタノールのジクロロメタン溶液を加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、１ｂが溶解されるまで撹拌した。１９ｆ（５７ ｍｇ、８３．１ μｍｏｌ）を１ ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）のメタノールのジクロロメタン溶液に溶解し、そして上記反応液に滴下し、更に４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（２６ ｍｇ、９３．９ μｍｏｌ）を加えた。室温まで昇温して、１時間撹拌しながら反応させた。１０ ｍＬのジクロロメタン及び５ ｍＬの水を加え、５分間撹拌し、放置して分層させ、有機相を収集し、水相をジクロロメタン（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１９ｇ（５６ ｍｇ、収率：７９．８％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １１０３．１［Ｍ＋１］。

【0294】

ステップ８
（Ｓ）－２－（２－（２－アミノアセチルアミノ）アセチルアミノ）－Ｎ－（２－（（（（Ｓ）－１－シクロプロピル－２－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）アミノ）－２－オキソエチル）－３－フェニルプロパンアミド １９ｈ

【0295】

１９ｇ（４．６ ｍｇ、４．１６ μｍｏｌ）を１．５ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０．７５ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で１．６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、２ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返し、３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えて叩解し、上層のｎ－ヘキサンを注ぎ出すことを３回繰り返し、減圧濃縮して、粗製品である表題生成物１９ｈ（４．０ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。

【0296】

ステップ９
（１ｒ，４ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５，１８－ヘキサオキソ－３，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８，４１，４４－デカオキサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタアザテトラヘキサデカン－４６－イル）－４－（（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）メチル）シクロヘキサン－１－カルボキサミド １９

【0297】

粗製品１９ｈ（４．０ ｍｇ）を１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、１７ｇ（２．９ ｍｇ、４．２ μｍｏｌ）を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１．５ ｍｇ、５．４ μｍｏｌ）を加え、室温で４０分間撹拌した。反応液をろ過し、高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９×２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ_４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物１９（２．１ ｍｇ、収率：３２．４％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６）： δ ８．７１－８．６２ （ｍ， １Ｈ）， ８．５９－８．５１ （ｍ， １Ｈ）， ８．３４－８．２６ （ｍ， １Ｈ）， ８．１４－８．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．９５－７．８６ （ｍ， １Ｈ）， ７．８３－７．６９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３５－７．３１ （ｍ， １Ｈ）， ７．２９－７．１１ （ｍ， ３Ｈ）， ７．０１ （ｓ， １Ｈ）， ６．７２－６．５０ （ｍ， ３Ｈ）， ５．５９－５．５０ （ｍ， ２Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３８－５．１８ （ｍ， ３Ｈ）， ４．７９－４．６９ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６１－４．４２ （ｍ， ３Ｈ）， ３．９１ （ｓ， ２Ｈ）， ３．７９－３．６５ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６３－３．４４ （ｍ， １３Ｈ）， ３．４１－３．３０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２６－３．０９ （ｍ， ５Ｈ）， ３．０８－２．８４ （ｍ， ４Ｈ）， ２．８１－２．６４ （ｍ， ３Ｈ）， ２．４２－２．２８ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２４－２．１２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０５－１．９３ （ｍ， ４Ｈ）， １．８９－１．７７ （ｍ， ２Ｈ）， １．７２－１．５６ （ｍ， ３Ｈ）， １．５３－１．３８ （ｍ， ３Ｈ）， １．３４－１．１０ （ｍ， １１Ｈ）， ０．９４－０．７８ （ｍ， ５Ｈ）， ０．５２－０．３５ （ｍ， ３Ｈ）。

【0298】

実施例１－２０（参照例）

【化48】

表題化合物２０は、特許「ＣＮ１０４７５５４９４Ａ」における明細書のページ１６３の実施例５８」に提供された方法により合成された。

【0299】

次の抗体は、抗体の通常の方法により調製され、例えば、ベクターを構築した後、ＨＥＫ２９３細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔ． Ｎｏ． １１６２５０１９）などの真核細胞をトランスフェクションし、発現して精製した後に得られてもよい。

【0300】

以下は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの配列である。
軽鎖

【化49】

重鎖

【化50】

【0301】

以下は、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂの配列である。
軽鎖

【化51】

重鎖

【化52】

【0302】

以下は、Ｂ７Ｈ３抗体１Ｆ９ＤＳの配列である。
軽鎖

【化53】

重鎖

【化54】

【0303】

実施例１－２１ ＡＤＣ－１

【化55】

【0304】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、２．５ ｍＬ、９．９６ ｍｇ／ｍＬ、０．１６８ μｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンの水溶液（１０ ｍＭ、０．０８２ ｍＬ、０．８２ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止め、反応液を水浴で２５℃に降温し、５．０ ｍｇ／ｍＬに希釈し、２．０ ｍＬの溶液を取り出して引き続き反応させた。

【0305】

化合物１０－比較的短い保持時間化合物（２．１ ｍｇ、２．０２ μｍｏｌ）を０．１０ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記２．０ ｍＬの溶液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－１の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－１のＰＢＳ緩衝液（５．０ ｍｇ／ｍＬ、１．１ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0306】

ＵＶ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝５．０９。

【0307】

実施例１－２２ ＡＤＣ－２

【化56】

【0308】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、２．５ ｍＬ、９．９６ ｍｇ／ｍＬ、０．１６８ μｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンの水溶液（１０ ｍＭ、０．０８２ ｍＬ、０．８２ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止め、反応液を水浴で２５℃に降温し、５．０ ｍｇ／ｍＬに希釈し、２．０ ｍＬの溶液を取り出して引き続き反応させた。

【0309】

化合物１０－比較的長い保持時間化合物（２．１ ｍｇ、２．０２ μｍｏｌ）を０．１０ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記２．０ ｍＬの溶液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－１の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２のＰＢＳ緩衝液（４．９５ ｍｇ／ｍＬ、１．１ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0310】

ＵＶ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝７．３９。

【0311】

実施例１－２３ ＡＤＣ－３

【化57】

【0312】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、２．５ ｍＬ、９．９６ ｍｇ／ｍＬ、０．１６８ μｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンの水溶液（１０ ｍＭ、０．０８２ ｍＬ、０．８２ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止め、反応液を水浴で２５℃に降温し、５．０ ｍｇ／ｍＬに希釈し、２．０ ｍＬの溶液を取り出して引き続き反応させた。

【0313】

化合物８（２．１ ｍｇ、２．０２ μｍｏｌ）を０．１０ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記２．０ ｍＬの溶液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－３の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－３のＰＢＳ緩衝液（５．２４ ｍｇ／ｍＬ、１．１ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0314】

ＵＶ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝７．３６。

【0315】

実施例１－２４ ＡＤＣ－４

【化58】

【0316】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、３．７４ ｍＬ、１３．３８ ｍｇ／ｍＬ、０．３３８ μｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンの水溶液（１０ ｍＭ、０．１７３ ｍＬ、１．７３ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止め、反応液を水浴で２５℃に降温し、６．７ ｍｇ／ｍＬに希釈し、１．３ ｍＬの溶液を取り出して引き続き反応させた。

【0317】

化合物９－比較的短い保持時間化合物９－Ａ（１．０ ｍｇ、０．９３ μｍｏｌ）を０．１０ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記１．３ ｍＬの溶液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－４のＰＢＳ緩衝液（１．７２ ｍｇ／ｍＬ、２．３６ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0318】

ＵＶ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝７．３９。

【0319】

実施例１－２５ ＡＤＣ－５

【化59】

【0320】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、３．０ ｍＬ、６．７０ ｍｇ／ｍＬ、０．１３６ μｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンの水溶液（１０ ｍＭ、０．０６７ ｍＬ、０．６７ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止め、反応液を水浴で２５℃に降温し、０．６１４ ｍＬの溶液を取り出して引き続き反応させた。

【0321】

化合物９－比較的短い保持時間化合物９－Ａ（０．５ ｍｇ、０．４２ μｍｏｌ）を０．０３１ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記０．６１４ ｍＬの溶液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－５のＰＢＳ緩衝液（３．０８ ｍｇ／ｍＬ、０．８２ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0322】

ＵＶ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝３．１６。

【0323】

実施例１－２６ ＡＤＣ－６

【化60】

【0324】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、３．７４ ｍＬ、１３．３８ ｍｇ／ｍＬ、０．３３８ μｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンの水溶液（１０ ｍＭ、０．１７３ ｍＬ、１．７３ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止め、反応液を水浴で２５℃に降温し、６．７ ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．７５ ｍＬの溶液を取り出して引き続き反応させた。

【0325】

化合物９－比較的長い保持時間化合物９－Ｂ（０．６８ ｍｇ、０．６３ μｍｏｌ）を０．１０ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記０．７５ ｍＬの溶液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－４Ｂの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－６のＰＢＳ緩衝液（１．７８ ｍｇ／ｍＬ、１．７８ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0326】

ＵＶ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝３．９４。

【0327】

実施例１－２７ ＡＤＣ－７

【化61】

【0328】

３７℃の条件下で、抗体ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、５．０ ｍＬ、１０ ｍｇ／ｍＬ、０．３３８ μｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンの水溶液（１０ ｍＭ、０．１７３ ｍＬ、１．７３ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止め、反応液を水浴で２５℃に降温し、５．０ ｍｇ／ｍＬに希釈し、１．０ ｍＬの溶液を取り出して引き続き反応させた。

【0329】

化合物８（０．６５ ｍｇ、０．６ μｍｏｌ）を０．１ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記１．０ ｍＬの溶液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－７の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－７のＰＢＳ緩衝液（１．４２ ｍｇ／ｍＬ、２．１５ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0330】

ＵＶ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝６．９１。

【0331】

実施例１－２８ ＡＤＣ－８

【化62】

【0332】

３７℃の条件下で、抗体ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、５．０ ｍＬ、１０ ｍｇ／ｍＬ、０．３３８ μｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンの水溶液（１０ ｍＭ、０．１７３ ｍＬ、１．７３ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止め、反応液を水浴で２５℃に降温し、５．０ ｍｇ／ｍＬに希釈し、１．６ ｍＬの溶液を取り出して引き続き反応させた。

【0333】

化合物１０－比較的短い保持時間化合物（１．０４ ｍｇ、１．０ μｍｏｌ）を０．１ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記１．６ ｍＬの溶液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－８の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－８のＰＢＳ緩衝液（２．１４ ｍｇ／ｍＬ、２．３１ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0334】

ＵＶ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝６．５８。

【0335】

実施例１－２９ ＡＤＣ－９

【化63】

【0336】

３７℃の条件下で、抗体ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、５．０ ｍＬ、１０ ｍｇ／ｍＬ、０．３３８ μｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンの水溶液（１０ ｍＭ、０．１７３ ｍＬ、１．７３ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止め、反応液を水浴で２５℃に降温し、５．０ ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．８ ｍＬの溶液を取り出して引き続き反応させた。

【0337】

化合物９－比較的短い保持時間化合物９－Ａ（０．５５ ｍｇ、０．５ μｍｏｌ）を０．１ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記０．８ ｍＬの溶液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－９Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－９のＰＢＳ緩衝液（２．２７ ｍｇ／ｍＬ、１．１１ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0338】

ＵＶ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝３．１６。

【0339】

実施例１－３０ ＡＤＣ－１０

【化64】

【0340】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．５７４ ｍＬ、３８．７８ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、１９．７６ μＬ、１９７．６ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0341】

化合物１４－比較的短い保持時間化合物（０．６４ ｍｇ、５８８ ｎｍｏｌ）を４０ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－１０の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－１０のＰＢＳ緩衝液（５．４８ ｍｇ／ｍＬ、１．０３ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0342】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．２５。

【0343】

実施例１－３１ ＡＤＣ－１１

【化65】

【0344】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．６４６ ｍＬ、４３．６４ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、２２．２４ μＬ、２２２．４ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0345】

化合物１４－比較的長い保持時間化合物（０．７２ ｍｇ、６６２ ｎｍｏｌ）を４０ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－１０の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－１１のＰＢＳ緩衝液（２．１３ ｍｇ／ｍＬ、１．８７ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0346】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝７．０３。

【0347】

実施例１－３２ ＡＤＣ－１２

【化66】

【0348】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．７２６ ｍＬ、４９．０５ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、２５．０ μＬ、２５０．０ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0349】

化合物１５（０．８１ ｍｇ、７５４ ｎｍｏｌ）を４０ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－１２の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－１２のＰＢＳ緩衝液（３．３４ ｍｇ／ｍＬ、１．４５ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0350】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．９３。

【0351】

実施例１－３３ ＡＤＣ－１３

【化67】

【0352】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．２８７ ｍＬ、１９．３９ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、９．８８ μＬ、９８．８ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0353】

化合物１６（０．３２ ｍｇ、２９４ ｎｍｏｌ）を２０ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－１３の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－１３のＰＢＳ緩衝液（２．３７ ｍｇ／ｍＬ、０．８８ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0354】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．５３。

【0355】

実施例１－３４ ＡＤＣ－１４

【化68】

【0356】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．５９２ ｍＬ、４０．０ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、２０．３８ μＬ、２０３．８ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0357】

化合物１７（０．９２ ｍｇ、５９８ ｎｍｏｌ）を４０ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－１４の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－１４のＰＢＳ緩衝液（０．３０ ｍｇ／ｍＬ、１２．０ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0358】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝７．６１。

【0359】

実施例１－３５ ＡＤＣ－１５

【化69】

【0360】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．５９２ ｍＬ、４０．０ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、２０．３８ μＬ、２０３．８ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0361】

化合物１８（０．９３ ｍｇ、５９９ ｎｍｏｌ）を４０ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－１５の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－１５のＰＢＳ緩衝液（０．３２ ｍｇ／ｍＬ、１１．８ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0362】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝７．８９。

【0363】

実施例１－３６ ＡＤＣ－１６

【化70】

【0364】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．５３ ｍＬ、３５．８ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、１８．２５ μＬ、１８２．５ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0365】

化合物１９（０．８３ ｍｇ、５３４ ｎｍｏｌ）を３５ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－１６の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－１６のＰＢＳ緩衝液（０．３２ ｍｇ／ｍＬ、１２．０ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0366】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝７．４３。

【0367】

実施例１－３７ ＡＤＣ－１７

【化71】

【0368】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、２．０ ｍＬ、１３５．１２ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、４３．２ μＬ、４３２ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0369】

化合物９－比較的短い保持時間化合物９－Ａ（２．２２ ｍｇ、２０６７ ｎｍｏｌ）を１７５ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－１７のＰＢＳ緩衝液（１．３２ ｍｇ／ｍＬ、１２．０ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0370】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝５．４２。

【0371】

実施例１－３８ ＡＤＣ－１８（参照例）

【化72】

【0372】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１．５ ｍＬ、１０１．３ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、５１．７ μＬ、５１７ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0373】

化合物２０（２．０ ｍｇ、１９３４ ｎｍｏｌ）を１００ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－１８の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－１８のＰＢＳ緩衝液（０．７９ ｍｇ／ｍＬ、１３．０ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0374】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝７．２３。

【0375】

実施例１－３９ ＡＤＣ－１９

【化73】

【0376】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１．３６ ｍＬ、９１．９ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、４６．９ μＬ、４６９ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0377】

化合物９－比較的短い保持時間化合物９－Ａ（２．０ ｍｇ、１８６２ ｎｍｏｌ）を１００ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－１９のＰＢＳ緩衝液（０．７３ ｍｇ／ｍＬ、１３．０ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0378】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．２６。

【0379】

実施例１－４０ ＡＤＣ－２０

【化74】

【0380】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１．５ ｍＬ、１０１．３ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、５１．７ μＬ、５１７ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0381】

化合物１０－比較的長い保持時間化合物（２．０ ｍｇ、１８１５ ｎｍｏｌ）を１００ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－１の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２０のＰＢＳ緩衝液（０．７３ ｍｇ／ｍＬ、１３．０ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0382】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝７．４３。

【0383】

実施例１－４１ ＡＤＣ－２１（参照例）

【化75】

【0384】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１．８６ ｍＬ、１２５．４ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、６３．９ μＬ、６３９ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0385】

化合物２０（２．０７ ｍｇ、２００１ ｎｍｏｌ）を１５０ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－１８の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２１のＰＢＳ緩衝液（２．９１ ｍｇ／ｍＬ、４．４４ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0386】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝７．２３。

【0387】

実施例１－４２ ＡＤＣ－２２

【化76】

【0388】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１．８８ ｍＬ、１２７．２ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、６４．９ μＬ、６４９ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0389】

化合物９－比較的短い保持時間化合物９－Ａ（２．１ ｍｇ、１９５５ ｎｍｏｌ）を１５０ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２２のＰＢＳ緩衝液（３．５６ ｍｇ／ｍＬ、３．９８ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0390】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．７９。

【0391】

実施例１－４３ ＡＤＣ－２３（参照例）

【化77】

【0392】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、３４５ ｍＬ、２３．３１ μｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、１１．８９ ｍＬ、１１８．９ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３．５時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0393】

化合物２０（３６２ ｍｇ、３５０ μｍｏｌ）を７．１２ ｍＬのＭｅＣＮ及び３．５６ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を限外ろ過膜バッグに通して２％（ｖ／ｖ）のＭｅＣＮ及び１％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含むＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液）、コハク酸緩衝水溶液（ｐＨ＝５．３の０．０１ Ｍのコハク酸緩衝水溶液）で順に脱塩精製した後に、スクロースを６０ ｍｇ／ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ ２０を０．２ ｍｇ／ｍＬまで加え、フラスコに入れて凍結乾燥した後、ＦＡＤＣ－１８の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２３の凍結乾燥粉末試料を得て、４℃で貯蔵した。

【0394】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝７．０５。

【0395】

実施例１－４４ ＡＤＣ－２４

【化78】

【0396】

３７℃の条件下で、抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、３３２ ｍＬ、２２．４３ μｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、１１．４４ ｍＬ、１１４．４ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３．５時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0397】

化合物９－比較的短い保持時間化合物９－Ａ（２４１ ｍｇ、２２４ μｍｏｌ）を１３．７６ ｍＬのＭｅＣＮ及び６．８８ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を限外ろ過膜バッグに通して４％（ｖ／ｖ）のＭｅＣＮ及び２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含むＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液）、コハク酸緩衝水溶液（ｐＨ＝５．３の０．０１ Ｍのコハク酸緩衝水溶液）で順に脱塩精製した後に、スクロースを６０ ｍｇ／ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ ２０を０．２ ｍｇ／ｍＬまで加え、フラスコに入れて凍結乾燥した後、ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２４の凍結乾燥粉末試料を得て、４℃で貯蔵した。

【0398】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝７．０７。

【0399】

実施例１－４５ ＡＤＣ－２５

【化79】

【0400】

３７℃の条件で、抗体Ｂ７Ｈ３抗体１Ｆ９ＤＳのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、２．１４ ｍＬ、１４４．６０ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、７３．７ μＬ、７４０ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう器に置き、３７℃で３時間振とう反応させて、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0401】

化合物９－比較的短い保持時間化合物９－Ａ（３．０ ｍｇ、２７９３ ｎｍｏｌ）を１５０ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－２５の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２５のＰＢＳ緩衝液（１．２８ ｍｇ／ｍＬ、１３．０ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0402】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．８７。

【0403】

実施例１－４６ ＡＤＣ－２６（参照例）

【化80】

【0404】

３７℃の条件で、抗体Ｂ７Ｈ３抗体１Ｆ９ＤＳのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．８９ ｍＬ、６０．１４ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、３０．１ μＬ、３００ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう器に置き、３７℃で３時間振とう反応させて、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0405】

化合物２０（１．０ ｍｇ、９６７ ｎｍｏｌ）を１００ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－２６の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２６のＰＢＳ緩衝液（１．６１ ｍｇ／ｍＬ、４．０ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0406】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．１５。

【0407】

実施例１－４７ ＡＤＣ－２７

【化81】

【0408】

３７℃の条件で、抗体Ｂ７Ｈ３抗体１Ｆ９ＤＳのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．８９ ｍＬ、６０．１４ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、３０．１ μＬ、３００ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう器に置き、３７℃で３時間振とう反応させて、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0409】

化合物９－比較的短い保持時間化合物９－Ａ（１．０２ ｍｇ、９５０ ｎｍｏｌ）を１００ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－２５の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２７のＰＢＳ緩衝液（１．９４ ｍｇ／ｍＬ、３．５ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0410】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．１１。

【0411】

実施例１－４８ ＡＤＣ－２８（参照例）

【化82】

【0412】

３７℃の条件で、抗体Ｂ７Ｈ３抗体１Ｆ９ＤＳのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、２．３６ ｍＬ、１５９．４７ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、８１．３ μＬ、８１０ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう器に置き、３７℃で３時間振とう反応させて、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0413】

化合物２０（３．０ ｍｇ、２９０１ ｎｍｏｌ）を１５０ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－２６の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２８のＰＢＳ緩衝液（１．２９ ｍｇ／ｍＬ、１３．０ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0414】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝７．４６。

【0415】

実施例１－４９ ＡＤＣ－２９

【化83】

【0416】

３７℃の条件で、抗体Ｂ７Ｈ３抗体１Ｆ９ＤＳのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．８０ ｍＬ、５０．０６ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、２８．６ μＬ、２９０ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう器に置き、３７℃で３時間振とう反応させて、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0417】

化合物９－比較的短い保持時間化合物９－Ａ（１．２９ ｍｇ、１２０１ ｎｍｏｌ）を１００ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－２５の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２９のＰＢＳ緩衝液（２．６３ ｍｇ／ｍＬ、２．４ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0418】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝７．２４。

【0419】

実施例１－５０ ＡＤＣ－３０（参照例）

【化84】

【0420】

３７℃の条件で、抗体Ｂ７Ｈ３抗体１Ｆ９ＤＳのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．８６ ｍＬ、５８．４ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、２９．１ μＬ、２９０ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう器に置き、３７℃で３時間振とう反応させて、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0421】

化合物２０（１．０ ｍｇ、９６７ ｎｍｏｌ）を１００ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－２６の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－３０のＰＢＳ緩衝液（１．６１ ｍｇ／ｍＬ、４．０ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0422】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．１５。

【0423】

実施例１－５１ ＡＤＣ－３１

【化85】

【0424】

３７℃の条件で、抗体Ｂ７Ｈ３抗体１Ｆ９ＤＳのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．８９ ｍＬ、６０．１４ ｎｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、３０．１ μＬ、３００ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう器に置き、３７℃で３時間振とう反応させて、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0425】

化合物８（１．０ ｍｇ、９４３ ｎｍｏｌ）を１００ μＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、ＦＡＤＣ－３１の一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－３１のＰＢＳ緩衝液（１．４７ ｍｇ／ｍＬ、４．５ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。

【0426】

ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．３３。

【0427】

ＡＤＣ原液の薬物負荷量の分析
実験の目的及び原理
ＡＤＣ原液は抗体架橋剤類薬物の１つであり、その疾患を治療するメカニズムとしては、抗体の標的指向性により毒素分子を細胞に送達し、更に細胞を殺す。薬物の負荷量は、薬効に決定的な役割を果たしている。紫外線法によりＡＤＣ原液の薬物負荷量を測定した。

【0428】

実験の方法
コハク酸ナトリウム緩衝液が入ったキュベットを、参照吸収セル及び試料測定吸収セルにそれぞれ置き、溶媒ブランクを差し引いた後、供試品溶液が入ったキュベットを試料測定吸収セルに置き、２８０ ｎｍ及び３７０ ｎｍでの吸光度を測定した。

【0429】

結果の算出：紫外線分光光度法（使用機器：Ｔｈｅｒｍｏ ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００紫外線分光光度計）によりＡＤＣ原液負荷量を測定し、その原理は、ある波長下でのＡＤＣ原液の全吸光値が細胞毒性薬とモノクローナル抗体の当該波長での吸光値の和に等しいことであり、即ち、
（ １ ） Ａ_{２８０ｎｍ}＝ε_{ｍａｂ－２８０}ｂＣ_ｍａｂ＋ε_{Ｄｒｕｇ－２８０}ｂＣ_Ｄｒｕｇ
ε_{Ｄｒｕｇ－２８０}：薬物の２８０ ｎｍでの平均モル吸光係数が５１００であり、
Ｃ_Ｄｒｕｇ：薬物の濃度、
ε_{ｍａｂ－２８０}：トラスツズマブ原液又はペルツズマブ原液の２８０ ｎｍでの平均モル吸光係数が２１４６００であり、
Ｃ_ｍａｂ：トラスツズマブ原液又はペルツズマブ原液の濃度、
ｂ：光路長は１ ｃｍである。

【0430】

同様に、試料の３７０ ｎｍでの全吸光値方程式を得ることができ、即ち、
（ ２ ） Ａ_{３７０ｎｍ}＝ε_{ｍａｂ－３７０}ｂＣ_ｍａｂ＋ε_{Ｄｒｕｇ－３７０}ｂＣ_Ｄｒｕｇ
ε_{Ｄｒｕｇ－３７０}：薬物の３７０ ｎｍでの平均モル吸光係数が１９０００であり、
Ｃ_Ｄｒｕｇ：薬物の濃度、
ε_{ｍａｂ－３７０}：トラスツズマブ原液又はペルツズマブ原液の３７０ ｎｍでの吸光係数が０であり、
Ｃ_ｍａｂ：トラスツズマブ原液の濃度、
ｂ：光路長は１ ｃｍである。

【0431】

（１）と（２）という２つの方程式により、モノクローナル抗体及び薬物の２つの検出波長での吸光係数と濃度データと合わせて、薬物の負荷量を算出することができる。
薬物負荷量＝Ｃ_Ｄｒｕｇ／Ｃ_ｍａｂ。

【0432】

生物学的評価
試験例１－１：本開示の化合物による腫瘍細胞へのインビトロ増殖阻害試験

【0433】

一、試験の目的
本実験は、本開示の薬物化合物による、Ｕ８７ＭＧ細胞（中国科学院細胞バンク、Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ＴＣＨｕ１３８）及びＳＫ－ＢＲ－３腫瘍細胞（ヒト乳がん細胞、ＡＴＣＣ、製品番号ＨＴＢ－３０）へのインビトロ増殖阻害活性を検出することを目的とする。異なる濃度の化合物によりインビトロで細胞を処理し、６日間培養した後、ＣＴＧ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^(R) Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、製品番号：Ｇ７５７３）試薬を用いて細胞の増殖を検出し、ＩＣ５０値に基づいて当該化合物のインビトロ活性を評価した。

【0434】

二、実験の方法
以下、Ｕ８７ＭＧ細胞へのインビトロ増殖阻害試験の方法を例として、本開示における本開示の化合物の腫瘍細胞へのインビトロ増殖阻害活性試験を行う方法を例示的に説明する。この方法は、同様に、他の腫瘍細胞へのインビトロ増殖阻害活性試験に適用されるが、これらに限定されない。
１、細胞の培養：Ｕ８７ＭＧ及びＳＫ－ＢＲ－３細胞をそれぞれ１０％のＦＢＳのＥＭＥＭ培地（ＧＥ、製品番号ＳＨ３００２４．０１）及び１０％のＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ、製品番号１６６００－１０８）で培養した。
２、細胞の用意：対数増殖期のＵ８７ＭＧ及びＳＫ－ＢＲ－３細胞を取り、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液、上海源培生物科技株式会社）で１回洗浄した後、２～３ ｍＬのトリプシン（０．２５％のＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（１ｘ）、Ｇｉｂｉｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を加えて２～３分間消化し、細胞が完全に消化された後、１０～１５ ｍＬの細胞培養液を加え、消化された細胞を溶離し、１０００ ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てから、１０～２０ ｍＬの細胞培養液を加えて細胞を再懸濁し、単細胞懸濁液に調製した。
３、細胞のプレートへの播種：Ｕ８７ＭＧ及びＳＫ－ＢＲ－３の単細胞懸濁液を均一に混合し、細胞培養液で生細胞密度をそれぞれ２．７５×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ及び８．２５×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、密度が調整された細胞懸濁液を均一に混合し、１８０ μＬ／ウェルで９６ウェルの細胞培養プレートに入れた。９６ウェルプレートの外周ウェルには、２００ μＬの培地のみを加えた。培養プレートをインキュベーターで２４時間（３７℃、５％のＣＯ_２）培養した。
４、化合物の用意：ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、上海泰坦科技股▲ふん▼有限公司）で化合物を溶解し、初期濃度が１０ ｍＭの原液に調製した。
小分子化合物の初期濃度は５００ ｎＭであり、薬物の調製方法は下記の通りである。
９６ウェルのＵ底配合プレートの第１列に、異なる試験すべき試料３０ μＬをそれぞれ加え、試料濃度を１００ μｍとし、第２～１１列の各ウェルに２０ μＬのＤＭＳＯを加えた。第１列の試料１０ μＬを取って第２列の２０ μＬのＤＭＳＯに加え、均一に混合し、１０ μＬを取って第３列に加え、このように、第１０列まで類推した。配合プレートにおける薬物を、ウェル毎に５ μＬ取って９５ μＬのＥＭＥＭ培地に加え、均一に混合して使用に備えた。
ＡＤＣの初期濃度は１０ ｎＭ又は５００ ｎＭであり、薬物の調製方法は下記の通りである。
９６ウェルプレートの第１列に、異なる試験すべき試料１００ μＬをそれぞれ加え、試料濃度を１００ ｎＭ又は５ μｍとし、第２～１１列の各ウェルに１００ μＬのＰＢＳを加えた。第１列の試料５０ μＬを取って第２列の１００ μＬのＰＢＳに加え、均一に混合し、５０ μＬを取って第３列に加え、このように、第１０列まで類推して３倍希釈した。
５、試料添加操作：１つの試料当たり２つの二重ウェルであるように、培養プレートに異なる濃度に配合された測定すべき試料２０ μＬを加えた。培養プレートをインキュベーターで６日間（３７℃、５％のＣＯ_２）インキュベートした。
６、発色操作：９６ウェルの細胞培養プレートを取り出し、各ウェルにＣＴＧ溶液９０ μＬを加え、室温で１０分間インキュベートした。
７、プレートの読み取り操作：９６ウェルの細胞培養プレートを取り出し、マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳ）に置き、マイクロプレートリーダーにより化学発光を測定した。

【0435】

三、データの分析
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５によりデータを処理して分析した。実験結果は下記の表１を参照する。

【0436】

【表2】

【0437】

結論：本開示における小分子断片は、ＳＫ－ＢＲ－３細胞とＵ８７細胞に対して顕著な増殖阻害活性を有し、キラル中心は、化合物の阻害活性に一定の影響がある。

【0438】

試験例１－２：本開示の抗体薬物複合体によるＨＥＲ２標的の腫瘍細胞へのインビトロ増殖阻害試験

【0439】

本実験は、ＨＥＲ２を標的とする本開示の抗体薬物複合体の、ＳＫ－ＢＲ－３（ヒト乳がん細胞、ＡＴＣＣ、製品番号ＨＴＢ－３０）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ヒト乳がん細胞、ＡＴＣＣ、製品番号ＨＴＢ－１３２）へのインビトロ増殖阻害活性を検出することを目的とする。異なる濃度の化合物によりインビトロで細胞を処理し、６日間培養した後、ＣＴＧ試薬を用いて細胞の増殖を検出し、ＩＣ_５０値に基づいて当該化合物のインビトロ活性を評価した。

【0440】

試験例１の試験方法によって、試験細胞をＳＫ－ＢＲ－３及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８とし、細胞培養液をそれぞれ１０％のＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ、製品番号１６６００－１０８）、１０％のＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地（ＧＥ、製品番号ＳＨ３００２４．０１）、及び１０％のＦＢＳを含むＬ－１５培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、製品番号１１４１５－１１４）とした。細胞培養液で３株の細胞をそれぞれ、生細胞密度が８．３３×１０^３個の細胞／ｍＬ、８．３３×１０^３個の細胞／ｍＬ及び１．３９×１０^４個の細胞／ｍＬになるように調整し、密度が調整された細胞懸濁液を均一に混合し、１８０ μＬ／ウェルで９６ウェルの細胞培養プレートに入れた。関連化合物を試験し、得られた結果を下記の表２に示している。

【0441】

【表3】

【0442】

結論：ＨＥＲ２を標的とする本開示の抗体薬物複合体は、ＨＥＲ２陽性細胞ＳＫ－ＢＲ－３に対して明らかな増殖阻害活性を有すると共に、ＨＥＲ２陰性細胞ＭＤＡ－ＭＢ－４６８への増殖阻害活性が弱く、良好な選択性を有する。

【0443】

試験例１－３：Ｈｅｒ２－ＡＤＣの血漿安定性実験

【0444】

ＡＤＣ－１９試料、ＡＤＣ－１８試料、ＡＤＣ－２０試料、ヒト血漿、サル血漿（上海美迪西生物医薬股▲ふん▼有限公司）、及び１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ） ＰＢＳ溶液（上海生工）をそれぞれ０．２２ μｍのフィルターでろ過して除菌した。ＡＤＣ－１９、ＡＤＣ－１８、ＡＤＣ－２０をそれぞれ２００ μｇ／ｍＬの最終濃度で上記滅菌血漿又は１％のＢＳＡ ＰＢＳ溶液に加え、３７℃の細胞インキュベーターに置いてインキュベーションし、インキュベーション当日を０日目と記し、その後、それぞれ７日目、１４日目及び２１日目に試料を取り出し、遊離毒素の検出を行った。

【0445】

２５ μＬの試料を取って９６ウェルプレートに入れ、５０ μＬの内部標準作動液（１００ ｎｇ／ｍＬのカンプトセシンアセトニトリル溶液）及び１５０ μＬのアセトニトリルを加え、ボルテックスで５分間混合し、１０分間（４０００ ｒｐｍ）遠心分離し、５ μＬをＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（米国アプライドバイオシステムズ社）で分析した。

【0446】

その結果、図１Ａに示されるように、ＡＤＣ－１９はヒトとサル血漿、及び１％のＢＳＡ ＰＢＳ溶液の何れにおいても非常に安定しており、遊離毒素の放出率が最大２．１％を超えず、且つ１４日目で安定する傾向が示された。

【0447】

ＡＤＣ－１８は、ヒト及びサル血漿において安定性が低く、遊離毒素の放出率が最大それぞれ１４．５％及び８．１０％であった。図１Ｂに示されるように、１％のＢＳＡ ＰＢＳ溶液においては比較的安定した。

【0448】

ＡＤＣ－２０は、ヒト血漿、サル血漿、及び１％のＢＳＡ ＰＢＳ溶液の何れにおいても安定性が低く、遊離毒素の放出率が最大それぞれ２１．７％、２９．７％及び２１．７％であった。、また、図１Ｃに示されるように、１％のＢＳＡ ＰＢＳ溶液においては常に分解状態であった。

【0449】

試験例１－４：ＪＩＭＴ－１担腫瘍マウスへの薬効の評価

【0450】

１、試験の目的
ｎｕｎｕヌードマウスを試験動物として、Ｈｅｒ２－ＡＤＣ抗体Ｔ－ＤＭ１、ＡＤＣ－２１、ＡＤＣ－２４が腹腔内に注射投与された後のヒト乳がん細胞トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）薬剤耐性株（ハーセプチン）ＪＩＭＴ－１移植腫瘍ヌードマウスに対する治療効果を評価した。

【0451】

２、被験薬及び材料
２－１、被験薬
Ｔ－ＤＭ１（ＵＳ２００５０１６９９３３を参照して調製した）
ＡＤＣ－２１：３ ｍｇ／ｋｇ
ＡＤＣ－２１：１０ ｍｇ／ｋｇ
ＡＤＣ－２４：３ ｍｇ／ｋｇ
ＡＤＣ－２４：１０ ｍｇ／ｋｇ
ブランク対照（Ｂｌａｎｋ）：ＰＢＳ
２－２、調製方法：何れもＰＢＳで希釈して調製した。
２－３、試験動物
北京維通利華から購入されたｎｕｎｕヌードマウス。

【0452】

３、試験の方法
マウスの右側肋骨部の皮下にＪＩＭＴ－１細胞（南京科佰）（５×１０^６／匹、５０％のマトリゲル付き）を接種し、腫瘍を８日間成長させ、２０３．０９±１１．９４ ｍｍ^３になった後に８匹／群で合計６群になるように動物をランダムに群分けした（ｄ１）。
腹腔内注射投与により、合計２回投与した。腫瘍の体積と体重を週２回計測し、データを記録した。
データの統計は、Ｅｘｃｅｌ ２００３統計ソフトウェアにより、平均値をａｖｇで算出し、ＳＤ値をＳＴＤＥＶで算出し、ＳＥＭ値をＳＴＤＥＶ／ＳＱＲＴで算出し、群間差異Ｐ値をＴＴＥＳＴで算出した。
腫瘍体積（Ｖ）の計算式：Ｖ＝１／２×Ｌ_長×Ｌ_短 ^２
相対体積（ＲＴＶ）＝Ｖ_Ｔ／Ｖ_０
腫瘍阻害率（％）＝（Ｃ_ＲＴＶーＴ_ＲＴＶ）／Ｃ_ＲＴＶ（％）
そのうち、Ｖ_０、Ｖ_Ｔは、それぞれ実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積である。Ｃ_ＲＴＶ、Ｔ_ＲＴＶはそれぞれ、実験終了時のブランク対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ、ＰＢＳ）及び実験群の相対腫瘍体積である。

【0453】

４、試験の結果
実験の結果は図２に示されるように、腹腔内に２回注射投与し、３４日目まで観察した時に実験を終了した。Ｔ－ＤＭ１（１０ ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍に対して阻害作用がなく、ＡＤＣ－２１は、３ ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率が４６．２２％（Ｐ＜０．０１）、１０ ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率が５６．７７％（Ｐ＜０．００１）であり、ＡＤＣ－２４は、３ ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率が６２．７７％（Ｐ＜０．００１）、１０ ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率が７６．３２％（Ｐ＜０．００１）であった。同等の用量である場合、ＡＤＣ－２４の腫瘍阻害効果は、明らかにＡＤＣ－２１より良かった。

【0454】

試験例１－５：ＳＫ－ＢＲ－３担腫瘍マウスへの薬効の評価

【0455】

１、試験の目的
ｎｕｎｕヌードマウスを試験動物として、Ｈｅｒ２－ＡＤＣ抗体ＡＤＣ－２１、ＡＤＣ－２２が腹腔内に注射投与された後のヒト乳がん細胞ＳＫ－ＢＲ－３移植腫瘍ヌードマウスに対する治療効果を評価した。

【0456】

２、被験薬及び材料
２－１、被験薬
ＡＤＣ－２１：１ ｍｇ／ｋｇ
ＡＤＣ－２１：６ ｍｇ／ｋｇ
ＡＤＣ－２２：１ ｍｇ／ｋｇ
ＡＤＣ－２２：６ ｍｇ／ｋｇ
ブランク対照（Ｂｌａｎｋ）：ＰＢＳ。
２－２、調製方法：何れもＰＢＳで希釈して調製した。
２－３、試験動物
北京維通利華から購入されたｎｕｎｕヌードマウス。

【0457】

３、試験の方法
マウスの右側肋骨部の皮下にＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＡＴＣＣ）（５×１０^６／匹、５０％のマトリゲル付き）を接種し、腫瘍を２０日間成長させ、１５３．３４±１１．７３ ｍｍ^３になった後に８匹／群で合計５群になるように動物をランダムに群分けした（ｄ０）。
腹腔内注射により１回投与した。腫瘍の体積と体重を週２回計測し、データを記録した。
データの統計は、Ｅｘｃｅｌ ２００３統計ソフトウェアにより、平均値をａｖｇで算出し、ＳＤ値をＳＴＤＥＶで算出し、ＳＥＭ値をＳＴＤＥＶ／ＳＱＲＴで算出し、群間差異Ｐ値をＴＴＥＳＴで算出した。
腫瘍体積（Ｖ）の計算式：Ｖ＝１／２×Ｌ_長×Ｌ_短 ^２
相対体積（ＲＴＶ）＝Ｖ_Ｔ／Ｖ_０
腫瘍阻害率（％）＝（Ｃ_ＲＴＶーＴ_ＲＴＶ）／Ｃ_ＲＴＶ（％）
そのうち、Ｖ_０、Ｖ_Ｔは、それぞれ実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積である。Ｃ_ＲＴＶ、Ｔ_ＲＴＶはそれぞれ、実験終了時のブランク対照及び実験群の相対腫瘍体積である。

【0458】

４、試験の結果
実験の結果は図３に示されるように、腹腔内に１回注射投与し、２８日目まで観察した時に実験を終了したところ、ＡＤＣ－２１は、１ ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率が１５．０１％、６ ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率が７７．４％であり、ブランク対照と比べて大きな有意差がある（Ｐ＜０．００１）。ＡＤＣ－２２は、１ ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率が１９．８２％、６ ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率が９８．３８％（Ｐ＜０．００１）であった。用量が同じく６ ｍｇ／ｋｇである場合、ＡＤＣ－２２の腫瘍阻害効果も、明らかにＡＤＣ－２１より良かった。

【0459】

試験例１－６：血漿安定性

【0460】

試料ＡＤＣ－２５を１００ μｇ／ｍＬの最終濃度で、それぞれヒト血漿、サル血漿、及び１％のＢＳＡ ＰＢＳ溶液と均一に混合した後、ろ過して除菌した後に３７℃の水浴に置いてインキュベートし、インキュベーション当日を０日目と記し、その後、それぞれ７日目、１４日目及び２１日目に試料を取り出し、遊離毒素の検出を行った。

【0461】

異なる時点での試料を取り出した後に室温に放置し、ボルテックスで均一に混合し、２５ μＬの試料を取って９６ウェルプレートに入れ、５０ μＬの内部標準作動液（１００ ｎｇ／ｍＬのカンプトセシンアセトニトリル溶液）及び１５０ μＬのアセトニトリルを加え、ボルテックスで５分間混合し、１０分間（４０００ ｒｐｍ）遠心分離し、上清液５ μＬを取ってＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。

【0462】

その結果、図４に示されるように、ＡＤＣ－２５はヒトとサル血漿、及び１％のＢＳＡ ＰＢＳ溶液の何れにおいても非常に安定しており、遊離毒素の放出率が最大２％を超えず、且つ１４日目で安定する傾向があった。

【0463】

試験例１－７：ヒト脳星状膠芽腫Ｕ８７ＭＧヌードマウス移植腫瘍に対するＡＤＣの治療効果の評価

【0464】

１、試験の目的
本実験は、ＢＡＬＢ／ｃＡ－ｎｕｄｅヌードマウスを試験動物として、ヒト脳星状膠芽腫Ｕ８７ＭＧヌードマウス移植腫瘍に対する本開示のＡＤＣ化合物の治療効果を評価した。

【0465】

２、被験薬及び材料
２－１、被験薬
ＡＤＣ－２７ （３ ｍｇ／ｋｇ）
ＡＤＣ－２６ （３ ｍｇ／ｋｇ）
ブランク対照（Ｂｌａｎｋ）：ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液。
２－２、調製方法：ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液。
２－３、試験動物
ＢＡＬＢ／ｃＡ－ｎｕｄｅヌードマウス：上海杰思捷実験動物有限責任公司から購入された。

【0466】

３、試験の方法
６～７週齢で雌の実験用ＢＡＬＢ／ｃＡ－ｎｕｄｅヌードマウスに、ヒト脳星状膠芽腫Ｕ８７ＭＧ細胞（ヒト脳星状膠芽腫、中国科学院細胞バンク、Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ＴＣＨｕ１３８）を皮下接種した。細胞接種後の１０日目に、動物を１群あたり８匹でランダムに群分けし（Ｄ０）、腹腔内に週１回注射投与し始め、合計３回投与し、１週ごとに腫瘍体積及び体重を２～３回測定し、データを記録した。腫瘍体積（Ｖ）の計算式は、次の通りである。
Ｖ＝１／２×ａ×ｂ^２
そのうち、ａ、ｂはそれぞれ長さ、幅を示す。
相対体積（ＲＴＶ）＝Ｖ_Ｔ／Ｖ_０
腫瘍阻害率（％）＝（Ｃ_ＲＴＶーＴ_ＲＴＶ）／Ｃ_ＲＴＶ（％）
そのうち、Ｖ_０、Ｖ_Ｔは、それぞれ実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積である。Ｃ_ＲＴＶ、Ｔ_ＲＴＶはそれぞれ、実験終了時の対照群（ブランク）及び実験群の相対腫瘍体積である。

【0467】

４、試験の結果
週１回腹腔内注射（ｉ．ｐ．）投与し、合計３回投与し、２２日目まで観察した時に、ＡＤＣ－２７による３ ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率は６３．３％（Ｐ＜０．０００１）、ＡＤＣ－２６による３ ｍｇ／ｋｇの阻害率は４９．１％に達した。ＡＤＣ－２７は、ＡＤＣ－２６よりも強い抗腫瘍効果が示された。
投与中に、各群の動物の体重は正常であり、ＡＤＣに明らかな毒性や副作用がないことが示された。検出の結果は、表３及び図５に示される通りであった。検出された抗体は、担腫瘍ヌードマウスにおけるＵ８７ＭＧ移植腫瘍の成長を効果的に阻害することができると共に、用量依存性が示された。

【0468】

【表4】

【0469】

試験例１－８：ヒト咽頭がん胸水転移細胞Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２ヌードマウス移植腫瘍に対するＡＤＣの治療効果の評価

【0470】

１、試験の目的
本実験は、ＢＡＬＢ／ｃＡ－ｎｕｄｅヌードマウスを試験動物として、ヒト咽頭がん胸水転移細胞Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２ヌードマウス移植腫瘍に対する本開示のＡＤＣ化合物の治療効果を評価した。

【0471】

２、被験薬及び材料
２－１、被験薬
ＡＤＣ－２９ （３ｍｇ／ｋｇ）
ＡＤＣ－２８ （３ｍｇ／ｋｇ）
陰性対照ＡＤＣ（３ ｍｇ／ｋｇ）：非Ｂ７Ｈ３標的抗体と化合物２０を複合して形成した抗体薬物複合体。
２－２、調製方法：何れもＰＢＳで希釈して調製した。
２－３、試験動物
ＢＡＬＢ／ｃＡ－ｎｕｄｅヌードマウス：常州▲か▼文斯実験動物有限責任公司から購入された。

【0472】

３、試験の方法
６～７週齢で雌の実験用ＢＡＬＢ／ｃＡ－ｎｕｄｅヌードマウスに、ヒト咽頭がん胸水転移細胞Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔａｌｏｇ ＃ＡＴＣＣ^(R) ＣＣＬ－１３８^TM）を皮下接種した。細胞接種後の１０日目に、動物を１群あたり８匹でランダムに群分けし（Ｄ０）、腹腔内に週１回注射投与し始め、合計３回投与し、１週ごとに腫瘍体積及び体重を２～３回測定し、データを記録した。腫瘍体積（Ｖ）の計算式は、次の通りである。
Ｖ＝１／２×ａ×ｂ^２
そのうち、ａ、ｂはそれぞれ長さ、幅を示す。
相対体積（ＲＴＶ）＝Ｖ_Ｔ／Ｖ_０
腫瘍阻害率（％）＝（Ｃ_ＲＴＶーＴ_ＲＴＶ）／Ｃ_ＲＴＶ（％）
そのうち、Ｖ_０、Ｖ_Ｔは、それぞれ実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積である。Ｃ_ＲＴＶ、Ｔ_ＲＴＶはそれぞれ、実験終了時の対照群（陰性対照）及び実験群の相対腫瘍体積である。

【0473】

４、試験の結果
週１回腹腔内注射投与し、合計３回投与し、２８日目まで観察した時に、被験ＡＤＣの腫瘍阻害率はそれぞれ、ＡＤＣ－２９による３ ｍｇ／ｋｇ（３ ｍｐｋ）の腫瘍阻害率が７２．２７％（Ｐ＜０．００１）、ＡＤＣ－２８による３ ｍｇ／ｋｇ（３ ｍｐｋ）の腫瘍阻害率は５６．２％（Ｐ＜０．００１）に達した。ＡＤＣ－２９は、何れもＡＤＣ－２８よりも強い抗腫瘍効果が示された。
投与中に、各群の動物の体重は正常であり、ＡＤＣに明らかな毒性や副作用がないことが示された。検出の結果は、表４及び図６に示される通りであった。検出された抗体は、担腫瘍ヌードマウスにおけるＤｅｔｒｏｉｔ ５６２移植腫瘍の成長を効果的に阻害することができると共に、用量依存性が示された。

【0474】

【表5】

【0475】

試験例１－９：Ｕ８７－ＭＧ担腫瘍マウスへの薬効の評価

【0476】

１、試験の目的
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを試験動物として、そのヒト神経膠腫細胞Ｕ８７ＭＧ移植腫瘍模型においてＢ７Ｈ３－抗体薬物複合体を腹腔内注射した後の治療効果を評価した。

【0477】

２、被験薬及び材料
２－１、被験薬
ＡＤＣ－３０ １ ｍｇ／ｋｇ
ＡＤＣ－３０ ３ ｍｇ／ｋｇ
ＡＤＣ－３１ １ ｍｇ／ｋｇ
ＡＤＣ－３１ ３ ｍｇ／ｋｇ
ブランク対照（Ｂｌａｎｋ）：ＰＢＳ
２－２、調製方法：何れもＰＢＳで希釈して調製した。
２－３、試験動物
ＢＡＬＢ／ｃＡ－ｎｕｄｅヌードマウス：上海斯莱克実験動物有限責任公司から購入された。

【0478】

３、試験の方法
マウスの右側肋骨部の皮下にＵ８７ＭＧ細胞（ヒト脳星状膠芽腫、中国科学院細胞バンク、Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ＴＣＨｕ１３８）（２．５×１０^６／匹）を接種し、腫瘍を１４日間成長させ、１６７．４９ ｍｍ^３になった後に８匹／群で合計５群になるように動物をランダムに群分けした（ｄ１）。
週１回腹腔内注射投与により、合計３回投与した。腫瘍の体積と体重を週２回計測し、データを記録した。
データの統計は、Ｅｘｃｅｌ ２００３統計ソフトウェアにより、平均値をａｖｇで算出し、ＳＤ値をＳＴＤＥＶで算出し、ＳＥＭ値をＳＴＤＥＶ／ＳＱＲＴで算出し、群間差異Ｐ値をＴＴＥＳＴで算出した。
腫瘍体積（Ｖ）の計算式：Ｖ＝１／２×Ｌ_長×Ｌ_短 ^２
相対体積（ＲＴＶ）＝Ｖ_Ｔ／Ｖ_０
腫瘍阻害率（％）＝（Ｃ_ＲＴＶーＴ_ＲＴＶ）／Ｃ_ＲＴＶ（％）
そのうち、Ｖ_０、Ｖ_Ｔは、それぞれ実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積である。Ｃ_ＲＴＶ、Ｔ_ＲＴＶはそれぞれ、実験終了時のブランク対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）及び実験群の相対腫瘍体積である。

【0479】

４、試験の結果
実験の結果は図７に示されるように、週１回腹腔内注射投与し、合計３回投与し、１８日目まで観察した時に、被験ＡＤＣの腫瘍阻害率はそれぞれ、ＡＤＣ－３０による１ ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率が０．３１％、ＡＤＣ－３０による３ ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率が４５．２３％（Ｐ＜０．０００１）、ＡＤＣ－３１による１ ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率が３９．２２％（Ｐ＜０．０１）、ＡＤＣ－３１による３ ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率が８０．２４％（Ｐ＜０．０００１）に達した。同等の用量である場合、ＡＤＣ－３１の腫瘍阻害効果は、明らかにＡＤＣ－３０より良かった。

【0480】

二、調製プロセスの最適化
次の実施例の例示的な生成物は、下記の式で示される構造を有する。

【化86】

【0481】

実施例２－１
０℃の条件下で、２．５ ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝液（ｐＨ５．６）において、６１．７１ ｍｇのトラスツズマブを含む抗体原液（０．０００４２５１ ｍｍｏｌ、トラスツズマブを２０ ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝液で抗体最終濃度１５ ｍｇ／ｍＬに希釈した）と０．７３１１ ｍｇのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、０．００２５５０ ｍｍｏｌ）を恒温水浴で３時間撹拌しながら反応させ、中間体Ｉ溶液を生成した。

【0482】

化合物９の比較的短い保持時間化合物９－Ａ（３．１９６ ｍｇ、０．００２９７５ ｍｍｏｌ）を０．２０６２ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を生成した。上記中間体Ｉ溶液に０．２０５２ ｍＬのＤＭＳＯを予め添加し、更にＤＭＳＯが予め添加された中間体Ｉ溶液に上記化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を加え、水浴で２５℃で１時間撹拌しながら反応させ、過剰のシステインを加えて反応をクエンチした。ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２－１を得た。

【0483】

逆相クロマトグラフィー－質量分析法により平均値を算出した：ｎ＝５．４５。

【0484】

実施例２－２
１３℃の条件下で、２．５ ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝液（ｐＨ５．６）において、６１．７１ ｍｇのトラスツズマブを含む抗体原液（０．０００４２５１ ｍｍｏｌ、トラスツズマブを２０ ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝液で抗体最終濃度１５ ｍｇ／ｍＬに希釈した）と０．５１１８ ｍｇのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、０．００１７８５ ｍｍｏｌ）を恒温水浴で３時間撹拌しながら反応させ、中間体Ｉ溶液を生成した。

【0485】

化合物９の比較的短い保持時間化合物９－Ａ（３．１９６ ｍｇ、０．００２９７５ ｍｍｏｌ）を０．２０６２ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を生成した。上記中間体Ｉ溶液に０．２０５２ ｍＬのＤＭＳＯを予め添加し、更にＤＭＳＯが予め添加された中間体Ｉ溶液に上記化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を加え、水浴で２５℃で１時間撹拌しながら反応させ、過剰のシステインを加えて反応をクエンチした。ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２－２を得た。

【0486】

逆相クロマトグラフィー－質量分析法により平均値を算出した：ｎ＝５．４９。

【0487】

実施例２－３
２５℃の条件下で、２．５ ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝液（ｐＨ５．６）において、６１．７１ ｍｇのトラスツズマブを含む抗体原液（０．０００４２５１ ｍｍｏｌ、トラスツズマブを２０ ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝液で抗体最終濃度１５ ｍｇ／ｍＬに希釈した）と０．４０２１ ｍｇのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、０．００１４０３ ｍｍｏｌ）を恒温水浴で３時間撹拌しながら反応させ、中間体Ｉ溶液を生成した。

【0488】

化合物９の比較的短い保持時間化合物９－Ａ（３．１９６ ｍｇ、０．００２９７５ ｍｍｏｌ）を０．２０６２ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を生成した。上記中間体Ｉ溶液に０．２０５２ ｍＬのＤＭＳＯを予め添加し、更にＤＭＳＯが予め添加された中間体Ｉ溶液に上記化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を加え、水浴で２５℃で１時間撹拌しながら反応させ、過剰のシステインを加えて反応をクエンチした。ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２－３を得た。

【0489】

逆相クロマトグラフィー－質量分析法により平均値を算出した：ｎ＝５．３９。

【0490】

実施例２－４
２８℃の条件下で、２．５ ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝液（ｐＨ５．６）において、６１．７１ ｍｇのトラスツズマブを含む抗体原液（０．０００４２５１ ｍｍｏｌ、トラスツズマブを２０ ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝液で抗体最終濃度１５ ｍｇ／ｍＬに希釈した）と０．３８９９ ｍｇのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、０．００１３６０ ｍｍｏｌ）を恒温水浴で３時間撹拌しながら反応させ、中間体Ｉ溶液を生成した。

【0491】

化合物９の比較的短い保持時間化合物９－Ａ（３．１９６ ｍｇ、０．００２９７５ ｍｍｏｌ）を０．２０６２ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を生成した。上記中間体Ｉ溶液に０．２０５２ ｍＬのＤＭＳＯを予め添加し、更にＤＭＳＯが予め添加された中間体Ｉ溶液に上記化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を加え、水浴で２５℃で１時間撹拌しながら反応させ、過剰のシステインを加えて反応をクエンチした。ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２－４を得た。

【0492】

逆相クロマトグラフィー－質量分析法により平均値を算出した：ｎ＝５．４４。

【0493】

実施例２－５
３７℃の条件下で、２．５ ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝液（ｐＨ５．６）において、６１．７１ ｍｇのトラスツズマブを含む抗体原液（０．０００４２５１ ｍｍｏｌ、トラスツズマブを２０ ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝液で抗体最終濃度１５ ｍｇ／ｍＬに希釈した）と０．３７７８ ｍｇのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、０．００１３１８ ｍｍｏｌ）を恒温水浴で３時間撹拌しながら反応させ、中間体Ｉ溶液を生成した。

【0494】

化合物９の比較的短い保持時間化合物９－Ａ（３．１９６ ｍｇ、０．００２９７５ ｍｍｏｌ）を０．２０６２ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を生成した。上記中間体Ｉ溶液に０．２０５２ ｍＬのＤＭＳＯを予め添加し、更にＤＭＳＯが予め添加された中間体Ｉ溶液に上記化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を加え、水浴で２５℃で１時間撹拌しながら反応させ、過剰のシステインを加えて反応をクエンチした。ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２－５を得た。

【0495】

逆相クロマトグラフィー－質量分析法により平均値を算出した：ｎ＝５．４６。

【0496】

実施例２－６
１３℃の条件下で、２．５ ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ ｍＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．５）において、５５．０２ ｍｇのトラスツズマブを含む抗体原液（０．０００３７９０ ｍｍｏｌ、トラスツズマブを５０ ｍＭのＰＢＳ緩衝液で抗体最終濃度１５ ｍｇ／ｍＬに希釈した）と０．４５６３ ｍｇのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、０．００１５９２ ｍｍｏｌ）を恒温水浴で３時間撹拌しながら反応させ、中間体Ｉ溶液を生成した。

【0497】

化合物９の比較的短い保持時間化合物９－Ａ（２．８５０ ｍｇ、０．００２６５３ ｍｍｏｌ）を０．１８３９ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を生成した。上記中間体Ｉ溶液に０．１８２９ ｍＬのＤＭＳＯを予め添加し、更にＤＭＳＯが予め添加された中間体Ｉ溶液に上記化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を加え、水浴で２５℃で１時間撹拌しながら反応させ、過剰のシステインを加えて反応をクエンチした。ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２－６を得た。

【0498】

逆相クロマトグラフィー－質量分析法により平均値を算出した：ｎ＝５．３９。

【0499】

実施例２－７
２５℃の条件下で、２．５ ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ ｍＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．５）において、５５．０２ ｍｇのトラスツズマブを含む抗体原液（０．０００３７９０ ｍｍｏｌ、トラスツズマブを５０ ｍＭのＰＢＳ緩衝液で抗体最終濃度１５ ｍｇ／ｍＬに希釈した）と０．３４７７ ｍｇのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、０．００１２１３ ｍｍｏｌ）を恒温水浴で３時間撹拌しながら反応させ、中間体Ｉ溶液を生成した。

【0500】

化合物９の比較的短い保持時間化合物９－Ａ（２．８５０ ｍｇ、０．００２６５３ ｍｍｏｌ）を０．１８３９ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を生成した。上記中間体Ｉ溶液に０．１８２９ ｍＬのＤＭＳＯを予め添加し、更にＤＭＳＯが予め添加された中間体Ｉ溶液に上記化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を加え、水浴で２５℃で１時間撹拌しながら反応させ、過剰のシステインを加えて反応をクエンチした。ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２－７を得た。

【0501】

逆相クロマトグラフィー－質量分析法により平均値を算出した：ｎ＝５．５０。

【0502】

実施例２－８
３７℃の条件下で、２．５ ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ ｍＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．５）において、５５．０２ ｍｇのトラスツズマブを含む抗体原液（０．０００３７９０ ｍｍｏｌ、トラスツズマブを５０ ｍＭのＰＢＳ緩衝液で抗体最終濃度１５ ｍｇ／ｍＬに希釈した）と０．３２５９ ｍｇのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、０．００１１３７ ｍｍｏｌ）を恒温水浴で３時間撹拌しながら反応させ、中間体Ｉ溶液を生成した。

【0503】

化合物９の比較的短い保持時間化合物９－Ａ（２．８５０ ｍｇ、０．００２６５３ ｍｍｏｌ）を０．１８３９ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を生成した。上記中間体Ｉ溶液に０．１８２９ ｍＬのＤＭＳＯを予め添加し、更にＤＭＳＯが予め添加された中間体Ｉ溶液に上記化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を加え、水浴で２５℃で１時間撹拌しながら反応させ、過剰のシステインを加えて反応をクエンチした。ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－２－８を得た。

【0504】

逆相クロマトグラフィー－質量分析法により平均値を算出した：ｎ＝５．４７。

【0505】

実施例２－９
２５℃の条件下で、２．５ ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝液（ｐＨ５．６）において、１２７．４ ｇのトラスツズマブを含む抗体原液（０．８８ ｍｍｏｌ、トラスツズマブを２０ ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝液で抗体最終濃度１５ ｍｇ／ｍＬに希釈した）と０．８３ ｇのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、２．９０ ｍｍｏｌ）を恒温水浴で３時間撹拌しながら反応させ、中間体Ｉ溶液を生成した。

【0506】

化合物９の比較的短い保持時間化合物９－Ａ（６．６ ｇ、６．１４ ｍｍｏｌ）を０．４３ ＬのＤＭＳＯに溶解し、化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を生成した。上記中間体Ｉ溶液に０．４３ ＬのＤＭＳＯを予め添加し、更にＤＭＳＯが予め添加された中間体Ｉ溶液に上記化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を加え、水浴で２５℃で１時間撹拌しながら反応させ、反応を止めた。

【0507】

上記反応液をＣａｐｔｏ Ｓ Ｉｍｐａｃｔ（ＧＥ）カチオンクロマトグラフィーカラムにより精製し、９つのカラム体積以上の１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含む０．０５ Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．５）と６つのカラム体積の０．０５ Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．５）でそれぞれ洗浄し、更に０．０５ Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５、０．３９ Ｍの塩化ナトリウム含有）で溶離し、反応液における遊離毒素と残留溶媒を除去した。２５℃で、カチオン溶離液を７倍体積等体積限外ろ過（３０ ｋｄの限外ろ過膜パッケージ）で０．０１ Ｍのコハク酸緩衝液（ｐＨ５．０）に置換し、ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－Ａ１を得た。上記方法により４ロットの試料を調製した。

【0508】

逆相クロマトグラフィー－質量分析法により測定して上記４ロットの試料の薬物担持量が何れも５．７であった。４ロットの収率はそれぞれ１００．８％、、９８．９％、、９７．４％及び９９．０％であった。

【0509】

実施例２－１０
３７℃の条件下で、トラスツズマブのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１６４ ｍＬ、１１．０８ μｍｏｌ）に、配合されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、３．５５ ｍＬ、３５．５ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３．５時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。

【0510】

化合物９の比較的短い保持時間化合物９－Ａ（１８５ ｍｇ、１７２ μｍｏｌ）を３．８８ ｍＬのアセトニトリル及び１．９４ ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を限外ろ過膜バッグに通して２％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル及び１％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含むＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液）、コハク酸緩衝水溶液（ｐＨ＝５．３の０．０１ Ｍのコハク酸緩衝水溶液）で順に脱塩精製し、小分子を除去し、ＦＡＤＣ－４Ａの一般式の例示的な生成物ＡＤＣ－Ｂ１４の試料を得て、４℃で貯蔵した。

【0511】

逆相クロマトグラフィー－質量分析法により平均値を算出した：ｎ＝５．３。

【0512】

試験例２－１ 薬物負荷量分布試験
１． ＲＰ－ＤＡＲ測定方法
１．１． 次の測定条件下でＲＰ－ＤＡＲ分析を行った：
ＵＰＬＣシステム：Ｗａｔｅｒｓ Ｈ－Ｃｌａｓｓ超高速液体クロマトグラフＵＰＬＣシステム
検出器：ＴＵＶ検出器（測定波長：２８０ ｎｍ）
カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４（２．１ ｍｍ×１５０ ｍｍ、１．７ μｍ）
カラム温度：８０℃
流速：０．３ ｍＬ／ｍｉｎ
試料室の温度：２０℃
作動時間：２５ ｍｉｎ
移動相Ａ：０．１％のジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）水溶液
移動相Ｂ：０．１％のＤＦＡアセトニトリル溶液
勾配プログラム：２７．０％Ｂ～４４．０％Ｂ（０．００ ｍｉｎ～１２．００ ｍｉｎ）、４４．０％Ｂ～１００％Ｂ（１２．００ ｍｉｎ～１３．００ ｍｉｎ）、１００％Ｂ～１００％Ｂ（１３．００ ｍｉｎ～２０．００ ｍｉｎ）、１００％Ｂ～２７．０％Ｂ（２０．００ ｍｉｎ～２０．０４ ｍｉｎ）、２７．０％Ｂ～２７．０％Ｂ（２０．０４ ｍｉｎ～２５ ｍｉｎ）
注入試料量：１．０ μＬ
１．２． データの分析
薬物と結合しない抗体の軽鎖（Ｌ_０）及び重鎖（Ｈ_０）に比較すると、薬物と結合する軽鎖（１つ薬物と結合する軽鎖：Ｌ_１）及び薬物と結合する重鎖（１つ薬物と結合する重鎖：Ｈ_１、２つの薬物と結合する重鎖：Ｈ_２、３つの薬物と結合する重鎖：Ｈ_３、４つの薬物と結合する重鎖：Ｈ_４）の場合は、疎水性が薬物と結合する数に比例して増加すると共に、保持時間が長くなる。従って、Ｌ_０、Ｌ_１、Ｈ_０、Ｈ_１、Ｈ_２、Ｈ_３及びＨ_４の順に溶離した。
薬物リンカーがＵＶを吸収するので、次の式に従って、軽鎖、重鎖と薬物リンカーのモル吸光係数を利用し、結合する薬物の数によって、得られたピーク面積を補正した。計算式は、次の通りである。
軽鎖（εＬＣ－２８０）／（εＬＣ－２８０＋連結薬物数×ε薬物－２８０）
重鎖（εＨＣ－２８０）／（εＨＣ－２８０＋連結薬物数×ε薬物－２８０）
備考：εＬＣ－２８０：軽鎖の２８０ ｎｍでのモル吸光係数、
εＨＣ－２８：重鎖の２８０ ｎｍでのモル吸光係数、
ε薬物－２８０：毒素の２８０ ｎｍでのモル吸光係数。

【0513】

【表6】

【0514】

２．測定結果

【表7】

【0515】

結果から示されるように、同じ緩衝系、異なる還元反応温度で調製された試料は、還元反応温度の低減につれて、試料の薬物負荷量分布の均一さが明らかに高くなり、同じ還元反応温度、異なる緩衝系で調製された試料は、ヒスチジン－塩酸緩衝系を使用した試料の薬物負荷量分布がより均一であった。

【0516】

試験例２－２：遊離毒素試験
１．遊離毒素の測定方法
１．１． 次の測定条件下でＨＰＬＣ分析を行った：
ＨＰＬＣシステム：Ｗａｔｅｒｓ Ｈ－Ｃｌａｓｓ超高速液体クロマトグラフＵＰＬＣシステム
検出器：ＴＵＶ検出器（測定波長：３７０ ｎｍ）
カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｅｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８（１３０ Å、２．１ ｍｍ×１５０ ｍｍ、１．７ μｍ）
カラム温度：４０℃
流速：０．３ ｍＬ／ｍｉｎ
試料室の温度：１０℃
移動相Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液
移動相Ｂ：０．１％のＴＦＡアセトニトリル溶液
勾配プログラム：２５．０％Ｂ～２５．０％Ｂ（０．００ ｍｉｎ～１．００ ｍｉｎ）、２５．０％Ｂ～５５．０％Ｂ（１．００ ｍｉｎ～１７．００ ｍｉｎ）、５５．０％Ｂ～２５．０％Ｂ（１７．００ ｍｉｎ～１７．１０ ｍｉｎ）、２５．０％Ｂ～２５．０％Ｂ（１７．１０ ｍｉｎ～２０．００ ｍｉｎ）
注入試料量：５．０ μＬ
１．２． データの分析
毒素のＬＯＤ限度の計算式は、次の通りである。
毒素限度（ｐｐｍ）＝０．１×４×１０００／Ｃ
注記：
ａ）０．１は毒素ＬＯＤ溶液濃度（μｇ／ｍＬ）、４は試料の前処理時の希釈倍数、１０００は単位換算係数、Ｃは測定試料のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）である。
ｂ）供試品中の遊離毒素のピーク面積はＬＯＤ溶液のピーク面積よりも小さいと、限度より小さい、又は未検出であると判定される。

【0517】

２．測定結果
ＡＤＣ－Ａ１（ロット１～４）及びＡＤＣ－Ｂ１４について遊離毒素を検出した結果（表７参照）、カチオンカラムクロマトグラフィーの使用は、大量調製に適用されるだけでなく、遊離毒素も顕著に低減されることが示された。

【0518】

【表8】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

2023521956000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-05-09

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0001】

本願は、２０２０年３月２５日に提出された中国特許出願（出願番号ＣＮ ２０２０１０２１９３１１．２）及び２０２１年３月１９日に提出された中国特許出願（出願番号ＣＮ ２０２１１０２９７３９７．５）の優先権を主張する。
本開示は、抗体薬物複合体の調製方法に関し、特に、抗体薬物複合体の調製方法の合成工程及び精製工程に関する。

【国際調査報告】