特表 2023-522038 修飾ＣＣＲポリペプチド及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-26

(54)【発明の名称】修飾ＣＣＲポリペプチド及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230519BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230519BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20230519BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20230519BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230519BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230519BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230519BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20230519BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20230519BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALI20230519BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230519BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230519BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230519BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230519BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230519BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K19/00 ZNA

C07K14/705

C07K16/30

C12N15/13

C12N15/867 Z

C12N5/10

C12N5/0789

C12N5/0783

C12N5/0786

A61K47/68

A61P35/00

A61P35/02

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K35/17

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022562711

(86)(22)【出願日】2021-04-16

(85)【翻訳文提出日】2022-10-14

(86)【国際出願番号】 US2021027648

(87)【国際公開番号】W WO2021211948

(87)【国際公開日】2021-10-21

(31)【優先権主張番号】63/011,494

(32)【優先日】2020-04-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521438515

【氏名又は名称】２セブンティ バイオ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】エバンス， ジョン ダブリュー．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA13

4C085BB11

4C085EE01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB65

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、改善されたキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）、融合タンパク質、遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞、及び疾患を治療するためのこれらの組成物の使用を提供する。本開示は、概して、部分的には、改善されたＣＣＲポリペプチド、融合タンパク質、及びそれを使用する方法に関する。特に、本発明は、ＣＡＲ及び修飾ＣＣＲポリペプチドを含む融合ポリペプチド、並びにがんの少なくとも１つの症状の治療、予防、又は改善におけるそれらの使用を提供する。より具体的には、ＣＣＲは、修飾ヒンジ領域を含み、ＣＡＲ／ＣＣＲ融合ポリペプチドは、低減された抗原非依存性シグナル伝達、例えば、ＣＡＲ抗原の不在下のシグナル伝達を示す。
【選択図】図１Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

融合ポリペプチドであって、
ａ）第１のヒンジ領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、
ｂ）ポリペプチド切断シグナルと、
ｃ）キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）であって、非修飾ヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減するように修飾された第２のヒンジ領域を含む、ＣＣＲと、を含む、融合ポリペプチド。

【請求項2】

融合ポリペプチドであって、
ａ）第１のヒンジ領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、
ｂ）ポリペプチド切断シグナルと、
ｃ）別のアミノ酸で置換された１つ以上のシステインを含む第２のヒンジ領域を含むキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）と、を含む、融合ポリペプチド。

【請求項3】

前記第２のヒンジ領域内の前記１つ以上のシステイン置換が、非修飾の第２のヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。

【請求項4】

前記第２のヒンジ領域内の前記１つ以上のシステイン置換が、非修飾の第２のヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲ／ＣＣＲの会合を低減する、請求項２又は３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項5】

前記第１のヒンジ領域が修飾されており、任意選択で、前記修飾が、１つ以上のアミノ酸置換又は欠失を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項6】

修飾された前記第１のヒンジ領域が、異なるアミノ酸で置換された１つ以上のシステインを含む、請求項５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項7】

前記修飾された第１のヒンジ領域が、非修飾の第１のヒンジ領域を含むＣＡＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減する、請求項６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項8】

前記修飾された第１のヒンジ領域が、非修飾の第１のヒンジ領域を含むＣＡＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲ／ＣＣＲの会合を低減する、請求項６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項9】

前記第１及び／又は第２のヒンジ領域内の前記１つ以上のシステイン残基が、セリン又はアラニンで置換されている、請求項２～８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項10】

前記第１及び第２のヒンジ領域が、同じタンパク質に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項11】

前記第１及び第２のヒンジ領域が、異なるタンパク質に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項12】

前記第２のヒンジ領域が、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ７ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ、ＰＤ－１ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３／ヒンジ／Ｍ１、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２からなる群から選択される、ヒンジ領域、又はその機能的断片を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項13】

前記第１のヒンジ領域が、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ７ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ、ＰＤ－１ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３／ヒンジ／Ｍ１、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２からなる群から選択される、ヒンジ領域、又はその機能的断片を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項14】

前記第２のヒンジ領域が、ＣＤ８αヒンジ領域、又はその機能的断片である、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項15】

前記第１のヒンジ領域が、ＣＤ８αヒンジ領域、又はその機能的断片である、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項16】

前記第１及び第２のヒンジ領域が、ＣＤ８αヒンジ領域又はその機能的断片である、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項17】

前記ＣＤ８αヒンジ領域が、配列番号２の２７位にアミノ酸置換を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項18】

前記ＣＤ８αヒンジ領域が、配列番号２の４４位にアミノ酸置換を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項19】

前記ＣＤ８αヒンジ領域が、配列番号２の２７及び４４位にアミノ酸置換を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項20】

前記第１及び／又は第２のヒンジ領域が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項21】

前記第１及び／又は第２のヒンジ領域が、配列番号３に示される配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項22】

前記第１及び／又は第２のヒンジ領域が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項23】

前記第１及び／又は第２のヒンジ領域が、配列番号４に示される配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項24】

前記第１及び／又は第２のヒンジ領域が、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項25】

前記第１及び／又は第２のヒンジ領域が、配列番号５に示される配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項26】

前記第１及び／又は第２のヒンジ領域が、配列番号７に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＣＤ４ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項27】

前記第１及び／又は第２のヒンジ領域が、配列番号８に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項28】

前記第１又は第２のヒンジ領域が、配列番号９に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＣＤ７ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項29】

前記第１又は第２のヒンジ領域が、配列番号１０に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＣＤ１５２ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項30】

前記第１又は第２のヒンジ領域が、配列番号１１に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＰＤ－１ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項31】

前記第１又は第２のヒンジ領域が、配列番号１２に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ１ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項32】

前記第１又は第２のヒンジ領域が、配列番号１３に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ２ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項33】

前記第１又は第２のヒンジ領域が、配列番号１４に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ３ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項34】

前記第１又は第２のヒンジ領域が、配列番号１５に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ４ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項35】

前記第１又は第２のヒンジ領域が、配列番号１６に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項36】

前記第１又は第２のヒンジ領域が、配列番号１７に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ１ヒンジ－ＣＨ３－ヒンジ－Ｍ１ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項37】

前記第１又は第２のヒンジ領域が、配列番号１８に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項38】

前記第１又は第２のヒンジ領域が、配列番号１９に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項39】

前記第１又は第２のヒンジ領域が、配列番号２０に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＰＤ－１ヒンジ領域、又はその機能的断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項40】

ａ）前記ＣＡＲが、第１の抗体又はその抗原特異的結合断片を更に含み、
ｂ）前記ＣＣＲが、第２の抗体又はその抗原特異的結合断片を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項41】

前記第１及び／若しくは第２の抗体又はその抗原特異的結合断片が、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、二重特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）、三重特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ＶＨＨ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、並びにラクダ科抗体（ＶＨＨ）又はその断片からなる群から選択される、請求項４０に記載の融合ポリペプチド。

【請求項42】

前記第１及び／若しくは第２の抗体又はその抗原特異的結合断片が、ｓｃＦｖ又はＶＨＨである、請求項４１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項43】

前記第１及び第２の抗体又は抗原特異的結合断片が、同じ標的抗原と結合する、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項44】

前記第１及び第２の抗体又は抗原特異的結合断片が、同じ標的抗原上の異なるエピトープと結合する、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項45】

前記第１及び第２の抗体又は抗原特異的結合断片が、異なる標的抗原と結合する、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項46】

前記第１の抗体又は抗原特異的結合断片が、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５（ｆｍｃ様チロシンキナーゼ３としても知られる；ＦＬＴ３）、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、クローディン－６（ＣＬＤＮ６）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＬＲＢ２）；黒色腫抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）によって認識される黒色腫抗原、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、並びにウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）からなる群から選択される、標的抗原と結合する、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項47】

前記第２の抗体又は抗原特異的結合断片が、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５（ｆｍｃ様チロシンキナーゼ３としても知られる；ＦＬＴ３）、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、クローディン－６（ＣＬＤＮ６）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＬＲＢ２）；黒色腫抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）によって認識される黒色腫抗原、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、並びにウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）からなる群から選択される、標的抗原と結合する、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項48】

ａ）前記第１の抗体又は抗原特異的結合断片が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｒｂＢ２を含むＥＧＦＲファミリー（ＨＥＲ２）、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、及びＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される標的抗原と結合し、
ｂ）前記第２の抗体又は抗原特異的結合断片が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｒｂＢ２を含むＥＧＦＲファミリー（ＨＥＲ２）、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、及びＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される標的抗原と結合する、請求項４０～４７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項49】

ａ）前記第１の抗体又は抗原特異的結合断片が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ３３、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＵＣ１６、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、及びＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される標的抗原と結合し、
ｂ）前記第２の抗体又は抗原特異的結合断片が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、及びＴＡＧ７２からなる群から選択される標的抗原と結合する、請求項４０～４８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項50】

ａ）前記第１の抗体又は抗原特異的結合断片が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）と結合し、
ｂ）前記第２の抗体又は抗原特異的結合断片が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、及びＴＡＧ７２からなる群から選択される標的抗原と結合する、請求項４０～４９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項51】

ａ）前記ＣＡＲが、第１の膜貫通ドメインを更に含み、
ｂ）前記ＣＣＲが、第２の膜貫通ドメインを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項52】

前記第１及び／又は第２の膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する、請求項５１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項53】

前記第１及び／又は第２の膜貫通ドメインが、ＣＤ８αに由来する、請求項５１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項54】

ａ）前記ＣＡＲが、第１の細胞内共刺激ドメインを更に含み、
ｂ）前記ＣＣＲが、第２の細胞内共刺激ドメインを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項55】

前記第１及び／又は第２の共刺激ドメインが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子に由来する、請求項５４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項56】

前記第１及び／又は第２の共刺激ドメインが、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）に由来する、請求項５４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項57】

前記第１及び／又は第２の共刺激ドメインが、ＣＤ２８に由来する、請求項５４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項58】

前記ＣＡＲが、一次シグナル伝達ドメインを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項59】

前記一次シグナル伝達ドメインが、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドに由来する、請求項５８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項60】

前記一次シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζに由来する、請求項５８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項61】

融合ポリペプチドであって、
ａ）第１の抗体又は抗原特異的結合断片、第１のヒンジ領域、第１の膜貫通ドメイン、第１の細胞内共刺激ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、
ｂ）ポリペプチド切断シグナルと、
ｃ）第２の抗体又は抗原特異的結合断片、第２のヒンジ領域、第２の膜貫通ドメイン、及び第２の細胞内共刺激ドメインを含むキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）と、を含み、
前記第２のヒンジ領域が、ｉ）非修飾の第２のヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減するか、又はｉｉ）非修飾の第２のヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲ／ＣＣＲの会合を低減する、１つ以上のシステイン置換又は欠失を含む、融合ポリペプチド。

【請求項62】

融合ポリペプチドであって、
ａ）ＢＣＭＡと結合する第１の抗体又は抗原特異的結合断片、ＣＤ８αに由来する第１のヒンジ領域、ＣＤ８αに由来する第１の膜貫通ドメイン、４－１ＢＢに由来する第１の細胞内共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲと、
ｂ）ポリペプチド切断シグナルと、
ｃ）ＥＧＦＲと結合する第２の抗体又は抗原特異的結合断片、ＣＤ８αに由来する第２のヒンジ領域、ＣＤ８αに由来する第２の膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８に由来する第２の細胞内共刺激ドメインを含むＣＣＲと、を含み、
前記第２のヒンジ領域が、ｉ）非修飾の第２のヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減するか、又はｉｉ）非修飾の第２のヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲ／ＣＣＲの会合を低減する、１つ以上のシステイン置換又は欠失を含む、融合ポリペプチド。

【請求項63】

前記修飾された第２のヒンジ領域が、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の融合ポリペプチド。

【請求項64】

ペプチド切断シグナルが、ウイルス自己切断ポリペプチドである、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項65】

前記ポリペプチド切断シグナルが、ウイルス自己切断２Ａポリペプチドである、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項66】

前記ポリペプチド切断シグナルが、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）ペプチド、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチド、ブタテッショウウイルス－１（ＰＴＶ－１）２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、及び脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択されるウイルス自己切断ポリペプチドである、先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項67】

先行請求項のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項68】

請求項６７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項69】

前記ベクターが、発現ベクターである、請求項６８に記載のベクター。

【請求項70】

前記ベクターが、エピソームベクターである、請求項６８又は６９に記載のベクター。

【請求項71】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項６８～７０のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項72】

前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項６８～７１のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項73】

前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項６８～７２のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項74】

請求項１～６６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを発現する、細胞。

【請求項75】

請求項７４に記載のポリヌクレオチド又は請求項５２～５７のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。

【請求項76】

前記細胞が、遺伝子操作された宿主細胞である、請求項７２又は７５に記載の細胞。

【請求項77】

前記細胞が、造血細胞である、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項78】

前記細胞が、造血幹細胞又は前駆細胞である、請求項７４～７７のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項79】

前記細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞又は前駆細胞である、請求項７４～７８のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項80】

前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項81】

前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項82】

前記細胞が、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、及び／又はＣＤ８^＋細胞である、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項83】

前記細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、又はヘルパーＴ細胞である、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項84】

前記Ｔ細胞が、αβ－Ｔ細胞である、請求項８１～８３のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項85】

前記Ｔ細胞が、γδ－Ｔ細胞である、請求項８１～８３のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項86】

前記宿主細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項87】

前記ナチュラルキラー細胞が、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項８６に記載の細胞。

【請求項88】

前記宿主細胞が、マクロファージである、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項89】

請求項７４～８８のいずれか一項に記載の細胞及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。

【請求項90】

がんを治療することを必要とする対象においてそれを治療する方法であって、治療有効量の請求項８９に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項91】

対象においてがんに関連する１つ以上の症状において改善する方法であって、前記がんに関連する少なくとも１つの症状を改善するのに十分な、治療有効量の請求項８９に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項92】

改善される前記１つ以上の症状が、脱力、疲労、息切れ、あざができやすい及び出血しやすい、頻発する感染、リンパ節の拡張、腹部膨張又は腹部疼痛、骨又は関節の疼痛、骨折、予期せぬ体重減少、食欲低下、寝汗、持続性の微熱、並びに排尿減少からなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記がんが、固形がんである、請求項９０～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記がんが、液性がんである、請求項９０～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記がんが、血液悪性腫瘍である、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記がんが、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項９４又は９５に記載の方法。

【請求項97】

前記非ホジキンリンパ腫が、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、又は辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）である、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記非ホジキンリンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

前記がんが、明白な多発性骨髄腫、くすぶっている多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫からなる群から選択されるＭＭである、請求項９４～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

請求項１～６６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを発現する細胞集団を生成する方法であって、請求項６７に記載のポリヌクレオチド、又は請求項６８～７３のいずれか一項に記載のベクターを前記細胞集団に導入することを含む、方法。

【請求項101】

前記細胞集団が、造血幹細胞又は前駆細胞を含む、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記細胞集団が、ＣＤ３４＋造血幹細胞又は前駆細胞を含む、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記細胞集団が、免疫エフェクター細胞を含む、請求項１００に記載の方法。

【請求項104】

前記細胞集団が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び／又はＮＫＴ細胞を含む、請求項１００に記載の方法。

【請求項105】

前記細胞集団が、Ｔ細胞を含む、請求項１００に記載の方法。

【請求項106】

ＣＡＲ及びＣＣＲの両方を発現する細胞におけるＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ共刺激を低減する方法であって、
ａ）各々がヒンジドメインを有するＣＡＲ及びＣＣＲポリペプチドを得ることであって、任意選択で、前記ＣＡＲ及びＣＣＲが、融合ポリペプチドとして発現される、得ることと、
ｂ）前記ＣＣＲヒンジドメイン内の１つ以上のシステイン残基を別の残基に置換し、それによって修飾ＣＣＲを産生することと、
ｃ）細胞において前記ＣＡＲ及び修飾ＣＣＲを発現することと、を含む、方法。

【請求項107】

非修飾ヒンジを含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減する方法であって、
ａ）各々がヒンジドメインを有するＣＡＲ及びＣＣＲポリペプチドを得ることであって、任意選択で、前記ＣＡＲ及びＣＣＲが、融合ポリペプチドとして発現される、得ることと、
ｂ）前記ＣＣＲヒンジドメイン内の１つ以上のシステイン残基を別の残基に置換し、それによって修飾ＣＣＲを産生することと、
ｃ）細胞において前記ＣＡＲ及び修飾ＣＣＲを発現することと、を含む、方法。

【請求項108】

非修飾ヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達の抗原媒介性刺激の前記ヒンジドメイン内の前記システイン残基置換である、請求項１０６又は１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記ＣＣＲの前記ヒンジドメイン内の前記システイン残基置換が、非修飾ヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下の前記ＣＡＲとの会合を低減する、請求項１０６又は１０７に記載の方法。

【請求項110】

前記ＣＣＲ及びＣＡＲの両方が、修飾ヒンジ領域を含む、請求項１０６～１０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項111】

前記修飾ＣＡＲヒンジ領域が、異なるアミノ酸で置換された１つ以上のシステインを含む、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記ＣＡＲヒンジ領域内で置換された前記１つ以上のシステインが、非修飾ヒンジ領域を含むＣＡＲと比較して、前記ＣＡＲの抗原非依存性シグナル伝達を低減する、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

前記ＣＡＲヒンジ領域内で置換された前記１つ以上のシステインが、非修飾ヒンジ領域を含むＣＡＲと比較して、前記ＣＣＲとの抗原依存性会合を低減する、請求項１１１に記載の方法。

【請求項114】

前記ＣＡＲ及びＣＣＲヒンジ領域が、同じタンパク質に由来する、請求項１０６～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

前記ＣＡＲ及びＣＣＲヒンジ領域が、異なるタンパク質に由来する、請求項１０６～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

前記ＣＣＲ及び／又はＣＡＲヒンジ領域内の前記１つ以上のシステイン残基が、セリン又はアラニンで置換されている、請求項１０６～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項117】

前記ＣＣＲ及び／又はＣＡＲヒンジ領域が、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ７ヒンジ、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）ヒンジ、ＰＤ－１ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３／ヒンジ／Ｍ１、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２からなる群から選択される、ヒンジ領域、又はその断片を含む、請求項１０６～１１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項118】

前記ＣＣＲ及び／又はＣＡＲヒンジ領域が、ＣＤ８αヒンジ領域、又はその断片である、請求項１０６～１１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項119】

前記ＣＣＲ及び／又はＣＡＲヒンジ領域が、ＣＤ８αヒンジ領域である、請求項１０６～１１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項120】

前記ＣＣＲ及び／又はＣＡＲの前記ＣＤ８αヒンジ領域が、配列番号２の２７位にアミノ酸置換を含む、請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

前記ＣＣＲ及び／又はＣＡＲの前記ＣＤ８αヒンジ領域が、配列番号２の４４位にアミノ酸置換を含む、請求項１１９に記載の方法。

【請求項122】

前記ＣＣＲ及び／又はＣＡＲの前記ＣＤ８αヒンジ領域が、配列番号２の２７及び４４位にアミノ酸置換を含む、請求項１１９に記載の方法。

【請求項123】

前記ＣＣＲ及び／又はＣＡＲの前記ＣＤ８αヒンジ領域が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１１９に記載の方法。

【請求項124】

前記ＣＣＲ及び／又はＣＡＲの前記ＣＤ８αヒンジ領域が、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１９に記載の方法。

【請求項125】

前記ＣＣＲ及び／又はＣＡＲの前記ＣＤ８αヒンジ領域が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１１９に記載の方法。

【請求項126】

前記ＣＣＲ及び／又はＣＡＲの前記ＣＤ８αヒンジ領域が、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１９に記載の方法。

【請求項127】

前記ＣＣＲ及び／又はＣＡＲの前記ＣＤ８αヒンジ領域が、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１１９に記載の方法。

【請求項128】

前記ＣＣＲ及び／又はＣＡＲの前記ＣＤ８αヒンジ領域が、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１９に記載の方法。

【請求項129】

前記ＣＡＲ及びＣＣＲが、請求項１～６６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドとして発現される、請求項１０６又は１０７に記載の方法。

【請求項130】

ステップ（ｃ）が、前記ＣＡＲ及び／又はＣＣＲをコードするポリヌクレオチド又はベクターを前記細胞に導入することを含む、請求項９２～１２９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年４月１７日に出願された米国仮出願第６３／０１１，４９４号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張する。

【0002】

配列表に関する記載
本出願に関する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＢＬＵＥ－１２７＿ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは２７ＫＢであり、２０２１年４月１４日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。

【背景技術】

【0003】

本開示は、疾患を治療するための改善された組成物及び方法に関する。より具体的には、本開示は、改善されたキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）、融合タンパク質、遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞、及び疾患を治療するためのこれらの組成物の使用に関する。

【0004】

関連分野に関する記載
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原認識及びＴ細胞活性化の両方を単一の受容体に組み合わせた受容体タンパク質である。ＣＡＲは、抗原特異的結合ドメイン、ヒンジ又はスペーサー配列、膜貫通ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン、並びにシグナル伝達ドメインなどのいくつかのタンパク質ドメインを有する複雑なタンパク質である。ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞は、標的抗原を発現する特定の細胞型（例えば、がん細胞）に再指向され得る。実際に、そのようなＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ１９抗原を発現するある特定の白血病及びリンパ腫のＴ細胞媒介殺傷の誘導に有用であることが証明されている。

【0005】

しかしながら、ＣＡＲ Ｔ技術に関する気勢にもかかわらず、効果的なＣＡＲの設計は、引き続き困難で時間のかかる試みであり（例えば、Ｇｕｅｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１９ Ｍａｒ １５；１２：１４５－１５６を参照されたい）、ＣＡＲ Ｔ細胞を使用する試みは限定的に成功している。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性を制限する大きな障害の１つは、「抗原陰性」がんの再発である。更に、ＣＡＲ Ｔ細胞の投与は、有害な副作用、例えば、サイトカインストーム及び／又は神経毒性を引き起こすことも知られている。更に、ＣＡＲで使用される所与の抗原結合ドメインの治療有効性は、予測不可能であり得る。抗原結合ドメインが強すぎる場合、ＣＡＲ Ｔ細胞は、「サイトカインストーム」とみなされる致命的な可能性がある免疫反応もたらす大量のサイトカイン放出を誘導し、抗原結合ドメインが弱すぎる場合、ＣＡＲ Ｔ細胞は、がん細胞を消す際に十分な治療有効性を示さない場合がある。腫瘍内の抗原発現の異形成性は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性にも影響を与える。
ＣＡＲ Ｔ細胞シグナル伝達を改善及び／又は増強するための成功した戦略は、まだ実現されておらず、ＣＡＲ Ｔ療法を様々ながんに対して進歩させるのに実質的な障害となっている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｇｕｅｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１９ Ｍａｒ １５；１２：１４５－１５６

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示は、概して、部分的には、改善されたＣＣＲポリペプチド、融合タンパク質、及びそれを使用する方法に関する。特に、本発明は、ＣＡＲ及び修飾ＣＣＲポリペプチドを含む融合ポリペプチド、並びにがんの少なくとも１つの症状の治療、予防、又は改善におけるそれらの使用を提供する。より具体的には、ＣＣＲは、修飾ヒンジ領域を含み、ＣＡＲ／ＣＣＲ融合ポリペプチドは、低減された抗原非依存性シグナル伝達、例えば、ＣＡＲ抗原の不在下のシグナル伝達を示す。

【0008】

様々な実施形態では、ａ）第１のヒンジ領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、ｂ）ポリペプチド切断シグナルと、ｃ）キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）であって、非修飾ヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減するように修飾された第２のヒンジ領域を含む、ＣＣＲと、を含む融合ポリペプチドが提供される。

【0009】

様々な実施形態では、ａ）第１のヒンジ領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、ｂ）ポリペプチド切断シグナルと、ｃ）別のアミノ酸で置換された１つ以上のシステインを含む第２のヒンジ領域を含むキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）と、を含む、融合ポリペプチドが提供される。

【0010】

特定の実施形態では、第２のヒンジ領域内の１つ以上のシステイン置換は、非修飾の第２のヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減する。

【0011】

特定の実施形態では、第２のヒンジ領域内の１つ以上のシステイン置換は、非修飾の第２のヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲ／ＣＣＲの会合を低減する。

【0012】

様々な実施形態では、第１のヒンジ領域は修飾されており、任意選択で、修飾は、１つ以上の置換又は欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾された第１のヒンジ領域は、異なるアミノ酸で置換された１つ以上のシステインを含む。いくつかの実施形態では、修飾された第１のヒンジ領域は、非修飾の第１のヒンジ領域を含むＣＡＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減する。いくつかの実施形態では、修飾された第１のヒンジ領域は、非修飾の第１のヒンジ領域を含むＣＡＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲ／ＣＣＲの会合を低減する。

【0013】

様々な実施形態では、第１及び／又は第２のヒンジ領域内の１つ以上のシステイン残基は、セリン又はアラニンで置換されている。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヒンジ領域は、同じタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヒンジ領域は、異なるタンパク質に由来する。

【0014】

様々な実施形態では、第１及び／又は第２のヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ７ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ、ＰＤ－１ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ－ＣＨ３－ヒンジ－Ｍ１、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３／ヒンジ／Ｍ１、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２からなる群から選択される、ヒンジ領域、又はその機能的断片を含む。特定の実施形態では、第１及び／又は第２のヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域、又はその機能的断片である。

【0015】

いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２の２７位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２の４４位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２の２７及び４４位にアミノ酸置換を含む。

【0016】

特定の実施形態では、第１及び／又は第２のヒンジ領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のヒンジ領域は、配列番号３に示される配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0017】

特定の実施形態では、第１及び／又は第２のヒンジ領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のヒンジ領域は、配列番号４に示される配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0018】

特定の実施形態では、第１及び／又は第２のヒンジ領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のヒンジ領域は、配列番号５に示される配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、配列番号７に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＣＤ４ヒンジ領域、又はその機能的断片。いくつかの実施形態では、配列番号８に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、又はその機能的断片。いくつかの実施形態では、配列番号９に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＣＤ７ヒンジ領域、又はその機能的断片。いくつかの実施形態では、配列番号１０に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＣＤ１５２ヒンジ領域、又はその機能的断片。いくつかの実施形態では、配列番号１１に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＰＤ－１ヒンジ領域、又はその機能的断片。いくつかの実施形態では、配列番号１２に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ１ヒンジ領域、又はその機能的断片。いくつかの実施形態では、配列番号１３に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ２ヒンジ領域、又はその機能的断片。いくつかの実施形態では、配列番号１４に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ３ヒンジ領域、又はその機能的断片。いくつかの実施形態では、配列番号１５に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ４ヒンジ領域、又はその機能的断片。いくつかの実施形態では、配列番号１６に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ヒンジ領域、又はその機能的断片。いくつかの実施形態では、配列番号１７に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ１ヒンジ－ＣＨ３－ヒンジ－Ｍ１ヒンジ領域、又はその機能的断片。いくつかの実施形態では、配列番号１８に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ヒンジ領域、又はその機能的断片。いくつかの実施形態では、配列番号１９に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２ヒンジ領域、又はその機能的断片。いくつかの実施形態では、配列番号２０に示される少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸同一性アミノ酸配列を含むＰＤ－１ヒンジ領域、又はその機能的断片。

【0020】

様々な実施形態では、ＣＡＲは、第１の抗体又はその抗原特異的結合断片を含み、ＣＣＲは、第２の抗体又はその抗原特異的結合断片を更に含む。いくつかの実施形態では、第１及び／若しくは第２の抗体又はその抗原特異的結合断片は、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、二重特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）、三重特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ＶＨＨ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、並びにラクダ科抗体（ＶＨＨ）又はその断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１及び／若しくは第２の抗体又はその抗原特異的結合断片は、ｓｃＦｖ又はＶＨＨである。

【0021】

いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体又は抗原特異的結合断片は、同じ標的抗原と結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体又は抗原特異的結合断片は、同じ標的抗原上の異なるエピトープと結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体又は抗原特異的結合断片は、異なる標的抗原と結合する。

【0022】

様々な実施形態では、第１及び／若しくは第２の抗体又は抗原特異的結合断片は、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５（ｆｍｃ様チロシンキナーゼ３としても知られる；ＦＬＴ３）、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、クローディン－６（ＣＬＤＮ６）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＬＲＢ２）、黒色腫抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）によって認識される黒色腫抗原、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、並びにウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）からなる群から選択される、標的抗原と結合する。

【0023】

様々な実施形態では、第１の抗体又は抗原特異的結合断片は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｒｂＢ２を含むＥＧＦＲファミリー（ＨＥＲ２）、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、及びＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される標的抗原と結合し、第２の抗体又は抗原特異的結合断片は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｒｂＢ２を含むＥＧＦＲファミリー（ＨＥＲ２）、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、及びＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される標的抗原と結合する。

【0024】

様々な実施形態では、第１の抗体又は抗原特異的結合断片は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ３３、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＵＣ１６、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、及びＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される標的抗原と結合し、第２の抗体又は抗原特異的結合断片は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、及びＴＡＧ７２からなる群から選択される標的抗原と結合する。

【0025】

様々な実施形態では、第１の抗体又は抗原特異的結合断片は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）と結合し、第２の抗体又は抗原特異的結合断片は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、及びＴＡＧ７２からなる群から選択される標的抗原と結合する。

【0026】

様々な実施形態では、ＣＡＲは、第１の膜貫通ドメインを更に含み、ＣＣＲは、第２の膜貫通ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。

【0027】

様々な実施形態では、ＣＡＲは、第１の細胞内共刺激ドメインを更に含み、ＣＣＲは、第２の細胞内共刺激ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の共刺激ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の共刺激ドメインは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）に由来する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の共刺激ドメインは、ＣＤ２８に由来する。

【0028】

様々な実施形態では、ＣＡＲは、一次シグナル伝達ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドに由来する。いくつかの実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。

【0029】

様々な実施形態では、ＣＡＲは、第１の抗体又は抗原特異的結合断片、第１のヒンジ領域、第１の膜貫通ドメイン、第１の細胞内共刺激ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメインを含み、ＣＣＲは、第２の抗体又は抗原特異的結合断片、第２のヒンジ領域、第２の膜貫通ドメイン、及び第２の細胞内共刺激ドメインを含む。

【0030】

特定の実施形態では、ａ）第１の抗体又は抗原特異的結合断片、第１のヒンジ領域、第１の膜貫通ドメイン、第１の細胞内共刺激ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、ｂ）ポリペプチド切断シグナルと、ｃ）第２の抗体又は抗原特異的結合断片、第２のヒンジ領域、第２の膜貫通ドメイン、及び第２の細胞内共刺激ドメインを含むキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）と、を含む融合ポリペプチドが提供されており、第２のヒンジ領域は、ｉ）非修飾の第２のヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減するか、又はｉｉ）非修飾の第２のヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲ／ＣＣＲの会合を低減する、１つ以上のシステイン置換又は欠失を含む。

【0031】

特定の実施形態では、ａ）ＢＣＭＡと結合する第１の抗体又は抗原特異的結合断片、ＣＤ８αに由来する第１のヒンジ領域、ＣＤ８αに由来する第１の膜貫通ドメイン、４－１ＢＢに由来する第１の細胞内共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲと、ｂ）ポリペプチド切断シグナルと、ｃ）ＥＧＦＲと結合する第２の抗体又は抗原特異的結合断片、ＣＤ８αに由来する第２のヒンジ領域、ＣＤ８αに由来する第２の膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８に由来する第２の細胞内共刺激ドメインを含むＣＣＲと、を含む融合ポリペプチドが提供されており、第２のヒンジ領域は、ｉ）非修飾の第２のヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減するか、又はｉｉ）非修飾の第２のヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲ／ＣＣＲの会合を低減する、１つ以上のシステイン置換又は欠失を含む。

【0032】

様々な実施形態では、修飾された第２のヒンジ領域は、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0033】

様々な実施形態では、ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス自己切断ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス自己切断２Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド切断シグナルは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）ペプチド、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチド、ブタテッショウウイルス－１（ＰＴＶ－１）２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、及び脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択されるウイルス自己切断ポリペプチドである。

【0034】

特定の実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれか１つの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。

【0035】

特定の実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドを発現する細胞が提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド又はベクターを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子操作された宿主細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞又は前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞又は前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及び／又はＣＤ８＋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、又はヘルパーＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、αβ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、γδ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、ナチュラルキラー細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マクロファージである。

【0036】

特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物が提供される。

【0037】

特定の実施形態では、がんを治療することを必要とする対象においてそれを治療する方法が提供される。様々な実施形態では、方法は、治療有効量の本明細書に記載される組成物を対象に投与することを含む。

【0038】

特定の実施形態では、対象においてがんに関連する１つ以上の症状において改善する方法が提供される。様々な実施形態では、方法は、がんに関連する少なくとも１つの症状を改善するのに十分な、治療有効量の本明細書に記載される組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、改善される１つ以上の症状は、脱力、疲労、息切れ、あざができやすい及び出血しやすい、頻発する感染、リンパ節の拡張、腹部膨張又は腹部疼痛、骨又は関節の疼痛、骨折、予期せぬ体重減少、食欲低下、寝汗、持続性の微熱、並びに排尿減少からなる群から選択される。

【0039】

様々な実施形態では、がんは、固形がんである。いくつかの実施形態では、がんは、液性がんである。いくつかの実施形態では、がんは、血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、がんは、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。いくつかの実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、又は辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）である。いくつかの実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。いくつかの実施形態では、がんは、明白な多発性骨髄腫、くすぶっている多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫からなる群から選択されるＭＭである。

【0040】

特定の実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドを発現する細胞集団を生成する方法が提供される。様々な実施形態では、方法は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド又はベクターを細胞集団に導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、造血幹細胞又は前駆細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＣＤ３４＋造血幹細胞又は前駆細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、免疫エフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び／又はＮＫＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、Ｔ細胞を含む。

【0041】

特定の実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲの両方を発現する細胞におけるＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ共刺激を低減する方法が提供される。様々な実施形態では、方法は、ａ）各々がヒンジドメインを有するＣＡＲ及びＣＣＲポリペプチドを得ることであって、任意選択で、ＣＡＲ及びＣＣＲが、融合ポリペプチドとして発現される、得ることと、ｂ）ＣＣＲヒンジドメイン内の１つ以上のシステイン残基を別の残基に置換し、それによって修飾ＣＣＲを産生することと、ｃ）細胞においてＣＡＲ及び修飾ＣＣＲを発現することと、を含む。

【0042】

特定の実施形態では、非修飾ヒンジを含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減する方法が提供される。様々な実施形態では、方法は、ａ）各々がヒンジドメインを有するＣＡＲ及びＣＣＲポリペプチドを得ることであって、任意選択で、ＣＡＲ及びＣＣＲが、融合ポリペプチドとして発現される、得ることと、ｂ）ＣＣＲヒンジドメイン内の１つ以上のシステイン残基を別の残基に置換し、それによって修飾ＣＣＲを産生することと、ｃ）細胞においてＣＡＲ及び修飾ＣＣＲを発現することと、を含む。

【0043】

様々な実施形態では、非修飾ヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達の抗原媒介性刺激のヒンジドメイン内のシステイン残基置換。いくつかの実施形態では、ＣＣＲのヒンジドメイン内のシステイン残基置換は、非修飾ヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲとの会合を低減する。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及びＣＡＲの両方は、修飾ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＣＡＲヒンジ領域は、異なるアミノ酸で置換された１つ以上のシステインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲヒンジ領域内で置換された１つ以上のシステインは、非修飾ヒンジ領域を含むＣＡＲと比較して、ＣＡＲの抗原非依存性シグナル伝達を低減する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲヒンジ領域内で置換された１つ以上のシステインは、非修飾ヒンジ領域を含むＣＡＲと比較して、ＣＣＲとの抗原依存性会合を低減する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲヒンジ領域は、同じタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲヒンジ領域は、異なるタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲヒンジ領域内の１つ以上のシステイン残基は、セリン又はアラニンで置換されている。

【0044】

様々な実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ７ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ（ＣＴＬＡ－４）、ＰＤ－１ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３／ヒンジ／Ｍ１、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２からなる群から選択される、ヒンジ領域、又はその機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域、又はその断片である。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域である。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲのＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２の２７位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲのＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２の４４位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲのＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２の２７及び４４位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲのＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲのＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号３に示される配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲのＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲのＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号４に示される配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲのＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲのＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号５に示される配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0045】

様々な実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲは、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれか１つとして発現される。様々な実施形態では、ステップ（ｃ）は、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲをコードするポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1A】ＥＧＦＲ＋ＨＴ－１０８０線維肉腫細胞の不在又は存在下の、抗ＥＧＦＲ ＣＣＲを有するか又は有しない抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現する非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）及びＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＦＮγレベルを示す。

【図1B】２０：１、１０：１、及び５：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、ＥＧＦＲ＋ＨＴ－１０８０線維肉腫細胞と共培養された抗ＥＧＦＲ ＣＣＲを有する及び有しない抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するＵＴＤ Ｔ細胞及びＣＡＲ Ｔ細胞によって誘導される細胞傷害性％を計算するためのインピーダンスデータを示す。

【図2】ビヒクル、ＵＴＤ Ｔ細胞、並びに抗ＥＧＦＲ ＣＣＲを有する及び有しない抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いた処置後の、免疫不全ＮＳＧマウスにおけるヒトＡ５４９腫瘍体積を示す。

【図3】ＣＣＲ活性化が、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲ媒介性シグナル伝達を誘導し得るいくつかの機序を表す漫画を示す。

【図4A】それらのヒンジ領域に変異を有する異なるＣＡＲ／ＣＣＲ構築物対を表す漫画と、ＢＣＭＡの外因性発現を伴う及び伴わない、ＥＧＦＲを発現する２つの異なるがん細胞株におけるＵＴＤ Ｔ細胞及び異なるＣＡＲ／ＣＣＲ対を発現するＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＦＮγレベルを示すグラフとを示す。

【図4A-1】それらのヒンジ領域に変異を有する異なるＣＡＲ／ＣＣＲ構築物対を表す漫画と、ＢＣＭＡの外因性発現を伴う及び伴わない、ＥＧＦＲを発現する２つの異なるがん細胞株におけるＵＴＤ Ｔ細胞及び異なるＣＡＲ／ＣＣＲ対を発現するＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＦＮγレベルを示すグラフとを示す。

【図4B】外因性ＢＣＭＡの発現を伴う及び伴わない、ＥＧＦＲを発現する２つの異なるがん細胞株におけるＵＴＤ Ｔ細胞及び異なるＣＡＲ／ＣＣＲ対を発現するＣＡＲ Ｔ細胞からのＴＮＦαレベルを示す。

【図4C】外因性ＢＣＭＡの発現を伴う及び伴わない、ＥＧＦＲを発現する２つの異なるがん細胞株におけるＵＴＤ Ｔ細胞及び異なるＣＡＲ／ＣＣＲ対を発現するＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＬ－２レベルを示す。

【図5A】例示的なＣＡＲ／ＣＣＲ構築物のドメインを示す。

【図5A-1】例示的なＣＡＲ／ＣＣＲ構築物のドメインを示す。

【図5B】Ｔ細胞上のＣＡＲ及びＣＣＲ構築物のＦＡＣＳ発現を示す。

【図6】ＥＧＦＲを発現するがＢＣＭＡではない２つのがん細胞株における、ヒンジＣからＳへの変異を有する又は有しない、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ及び抗ＥＧＦＲ ＣＣＲの様々な組み合わせを発現するＵＴＤ Ｔ細胞及びＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＦＮγレベルを示す。

【図7AB】ＢＣＭＡも発現するように修飾されたＡ５４９細胞（ＥＧＦＲ＋）及びＡ５４９細胞（ＥＧＦＲ＋）における、ヒンジＣからＳへの変異を有する又は有しない、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ及び抗ＥＧＦＲ ＣＣＲの様々な組み合わせを発現するＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＦＮγレベルを示す。ＢＣＭＡも発現するように修飾されたＡ５４９細胞（ＥＧＦＲ＋）及びＡ５４９細胞（ＥＧＦＲ＋）における、ヒンジＣからＳへの変異を有する又は有しない、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ及び抗ＥＧＦＲ ＣＣＲの様々な組み合わせを発現するＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＬ－２レベルを示す。

【図7CD】ＢＣＭＡも発現するように修飾されたＨＴ－１０８０細胞（ＥＧＦＲ＋）及びＨＴ－１０８０細胞（ＥＧＦＲ＋）における、ヒンジＣからＳへの変異を有する又は有しない、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ及び抗ＥＧＦＲ ＣＣＲの様々な組み合わせを発現するＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＦＮγレベルを示す。ＢＣＭＡも発現するように修飾されたＨＴ－１０８０細胞（ＥＧＦＲ＋）及びＨＴ－１０８０細胞（ＥＧＦＲ＋）における、ヒンジＣからＳへの変異を有する又は有しない、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ及び抗ＥＧＦＲ ＣＣＲの様々な組み合わせを発現するＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＬ－２レベルを示す。

【図8AB】ＥＧＦＲ＋ＨＴ－１０８０線維肉腫細胞における、ヒンジＣからＳへの変異を有する又は有しない、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ及び抗ＥＧＦＲ ＣＣＲの様々な組み合わせを発現するＵＴＤ Ｔ細胞及びＣＡＲ Ｔ細胞によって誘導される細胞傷害性％を計算するためのインピーダンスデータを示す。ＢＣＭＡも発現するように修飾されたＥＧＦＲ＋ＨＴ－１０８０線維肉腫細胞における、ヒンジＣからＳへの変異を有する又は有しない、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ及び抗ＥＧＦＲ ＣＣＲの様々な組み合わせを発現するＵＴＤ Ｔ細胞及びＣＡＲ Ｔ細胞によって誘導される細胞傷害性％を計算するためのインピーダンスデータを示す。

【図8CD】ＥＧＦＲ＋ＨＴ－１０８０線維肉腫細胞における、ヒンジＣからＳへの変異を有する又は有しない、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ及び抗ＥＧＦＲ ＣＣＲの様々な組み合わせを発現するＵＴＤ Ｔ細胞及びＣＡＲ Ｔ細胞によって誘導される細胞傷害性％を計算するためのインピーダンスデータを示す。ＢＣＭＡも発現するように修飾されたＥＧＦＲ＋ＨＴ－１０８０線維肉腫細胞における、ヒンジＣからＳへの変異を有する又は有しない、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ及び抗ＥＧＦＲ ＣＣＲの様々な組み合わせを発現するＵＴＤ Ｔ細胞及びＣＡＲ Ｔ細胞によって誘導される細胞傷害性％を計算するためのインピーダンスデータを示す。

【発明を実施するための形態】

【0047】

配列識別子の簡単な説明
配列番号１は、ヒトＣＤ８αタンパク質のアミノ酸配列を示す（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１７３２）。

【0048】

配列番号２は、例示的な野生型ＣＤ８αヒンジ領域のアミノ酸を示す。

【0049】

配列番号３は、（Ｃ２７Ｓ）の２７位にシステインからセリンへの変異を含む例示的なＣＤ８αヒンジのアミノ酸配列を示す。

【0050】

配列番号４は、４４位にシステインからセリンへの変異（Ｃ４４Ｓ）を含む例示的なＣＤ８αヒンジのアミノ酸配列を示す。

【0051】

配列番号５は、２７及び４４位にシステインからセリンへの変異（Ｃ２７Ｓ；Ｃ４４Ｓ）を含む例示的なＣＤ８αヒンジのアミノ酸配列を示す。

【0052】

配列番号６は、例示的なＣＤ８α膜貫通（ＴＭ）領域のアミノ酸配列を示す。

【0053】

配列番号７～２０は、更なる例示的なヒンジ領域のアミノ酸配列を示す。

【0054】

配列番号２１～３１は、様々なリンカーのアミノ酸配列を示す。

【0055】

配列番号３２～５６は、プロテアーゼ切断部位及び自己切断ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。

【0056】

前述の配列において、Ｘは、存在する場合、任意のアミノ酸又はアミノ酸の不在を指す。

【0057】

Ａ．概説
本開示は、修飾ＣＣＲポリペプチド、融合ポリペプチド、及び遺伝子修飾された細胞を提供し、ＣＣＲは、修飾ヒンジ領域を含む。特定の実施形態では、本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲを発現するように修飾された細胞は、非修飾ＣＣＲヒンジ領域を含むポリペプチド、融合ポリペプチド、又は細胞と比較して、ＣＡＲ標的抗原の不在下の低減された抗原非依存性シグナル伝達を示す。より具体的には、本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲを発現するように修飾された細胞は、ＣＣＲ抗原の存在下及びＣＡＲ抗原の不在下の低減されたシグナル伝達を示す。

【0058】

言い換えると、本明細書に記載される遺伝子修飾された細胞は、ＣＡＲ抗原及びＣＣＲ抗原の両方を発現する標的細胞に対して活性化される一方で、ＣＣＲ抗原のみを発現する細胞に対してほとんど又は全く活性化を示さない。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＣＣＲ抗原の存在下及びＣＡＲ抗原の不在下のシグナル伝達の減少は、ＣＣＲ及びＣＡＲヒンジ領域の間のジスルフィド結合を低減することによって達成されることが企図される。

【0059】

特定の実施形態では、ＣＣＲは、ＣＡＲシグナル伝達を増強する能力に有用である。更に、ＣＣＲは、ＣＡＲとは異なる抗原を標的とするように設計されてもよく、したがって、標的細胞特異性を増加させ、かつ／又は難治性標的細胞の発生を低減する可能性がある。重要なことに、二重抗原アプローチは、その最も純粋な形態で、ブール論理（ＡＮＤ、ＯＲ、ＮＯＴ）を利用して、細胞の特定サブセットを標的とし、他のサブセットを標的としない能力を提供し得る。細胞療法におけるこのアプローチの有用性は、がん特異的抗原を発見することの難しさによって強調される（例えば、Ｎｅｗｉｃｋ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．２０１７；６８：１３９－１５２を参照されたい）。実際に、多くの抗原は、他の細胞型及び／又は体内の他の場所に少なくともいくらかの発現を示す。したがって、この問題を克服するためのアプローチの１つは、ＣＡＲ及びＣＣＲ抗原特異性を区別することである。

【0060】

特定の実施形態では、療法は、ＣＡＲ及びＣＣＲ抗原の両方を発現する細胞のみを標的とするように設計される。更に、シグナル伝達／活性化のレベルを適切に調整することによって、抗原のうちの１つしか発現しない細胞の標的化は除外される。例えば、１）ＣＡＲ抗原、並びに２）ＣＡＲ抗原及びＣＣＲ抗原の両方を発現する細胞が標的化されるが、ＣＣＲ抗原のみを発現する細胞ではない。他の実施形態では、療法は、１）ＣＣＲ抗原、並びに２）ＣＣＲ抗原及びＣＡＲ抗原の両方を発現する細胞を標的とするように設計されるが、ＣＡＲ抗原のみを発現する細胞ではない。したがって、ＣＡＲ／ＣＣＲの組み合わせ及び／又は融合ポリペプチドの慎重な選択及び調整、並びにブール論理の使用により、特定の細胞型（例えば、がん細胞）の標的化を可能にしながら、オフターゲット効果、例えば、ＣＡＲ又はＣＣＲ抗原のみを発現する細胞の標的化を最小化する。

【0061】

興味深いことに、発明者らは驚くべきことに、いくつかのＣＡＲ／ＣＣＲの組み合わせ（例えば、融合ポリペプチド）が、ＣＣＲ抗原のみを発現する標的細胞に応答して、すなわち、ＣＡＲ抗原を発現しない標的細胞に対して、シグナル伝達を呈することを発見した（例えば、図１Ａ、１Ｂ、及び２を参照されたい）。上で議論されるように、これは、ＣＣＲがシグナル伝達ドメインを含まないため、理論上は単独ではシグナル伝達しないはずであるため、驚くべきことである。更に、ＣＣＲ抗原が他の細胞型（例えば、ＥＧＦＲ抗原）上で広く発現されているものである場合、ＣＣＲ抗原の存在下の活性化／シグナル伝達は、二重抗原アプローチの利益を著しく低減する。更に、そのようなシグナル伝達はまた、Ｔ細胞機能不全及び／又はオフターゲット細胞型の殺傷も誘導し得る。

【0062】

いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本明細書の発明者らは、ある特定のＣＣＲが、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲ媒介性Ｔ細胞シグナル伝達を誘導する、ＣＡＲとＣＣＲヒンジ領域との間のシステイン残基のジスルフィド結合を介して対応するＣＡＲと相互作用することができることを企図している。このＣＣＲ抗原依存性、ＣＡＲ抗原非依存性シグナル伝達は、Ｔ細胞の機能不全をもたらし、Ｔ細胞の有効性を低減する。本明細書に記載及び例示されるように、発明者らは驚くべきことに、ＣＡＲ抗原非依存性シグナル伝達の問題が部分的にはＣＣＲによって駆動され、そのようなシグナル伝達は、ＣＣＲヒンジ領域内の特定のシステイン残基を変異させることによって解決され得ることを発見した。特定の実施形態では、本明細書に企図される修飾ヒンジ領域を含むＣＡＲ及びＣＣＲを発現する免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲ及びＣＣＲ抗原の両方を発現する細胞に対して活性化され、一方で、ＣＣＲ抗原のみを発現する細胞に対する活性化を排除／低減する。

【0063】

したがって、本発明は、部分的に、ＣＡＲ及びＣＣＲポリペプチド、融合ポリペプチド、並びにＣＡＲ及びＣＣＲを発現する遺伝子修飾された細胞を提供し、ＣＣＲは、修飾ヒンジ領域を含む。特に、本明細書に記載されるポリペプチド、融合ポリペプチド、又は遺伝子修飾された細胞は、非修飾ＣＣＲヒンジ領域を含む融合ポリペプチド又は細胞と比較して、ＣＡＲ抗原の不在下の低減されたＴ細胞シグナル伝達を示す。より具体的には、本明細書に記載される改善されたポリペプチド、融合ポリペプチド、又は遺伝子修飾された細胞は、驚くべきことに、ＣＡＲ抗原非依存性シグナル伝達を低減し、一方で、両方の抗原の存在下のＴ細胞シグナル伝達を維持又は増加させる（例えば、図７Ａ～７Ｄを参照されたい）。

【0064】

様々な実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、ポリペプチド切断シグナルと、非修飾ヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ共刺激を低減するように修飾されたヒンジ領域を含むキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）と、を含む、融合ポリペプチドが提供される。

【0065】

様々な実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、ポリペプチド切断シグナルと、別のアミノ酸で置換された１つ以上のシステインを含むヒンジ領域を含むキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）と、を含む、融合ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、ＣＣＲヒンジ領域内の１つ以上のシステイン置換は、非修飾ヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減する。いくつかの実施形態では、ＣＣＲヒンジ領域内の１つ以上のシステイン置換は、非修飾ヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲ／ＣＣＲの会合を低減する。

【0066】

様々な実施形態では、ＣＣＲ及びＣＡＲは、修飾ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＣＡＲ及び／又はＣＣＲヒンジ領域は、異なるアミノ酸（例えば、セリン又はアラニン）で置換された１つ以上のシステインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲヒンジ領域内で置換された１つ以上のシステインは、非修飾ヒンジ領域を含むＣＡＲ及び／又はＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲヒンジ領域内の１つ以上のシステイン置換は、非修飾ヒンジ領域を含むＣＡＲ及び／又はＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲ／ＣＣＲの会合を低減する。

【0067】

様々な実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲヒンジ領域は、同じ又は異なるタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域（例えば、配列番号２）に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲのＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２（例えば、配列番号３）の２７位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲのＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２（例えば、配列番号４）の４４位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ及び／又はＣＡＲのＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２（例えば、配列番号５）の２７及び４４位にアミノ酸置換を含む。

【0068】

様々な実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ポリペプチド切断シグナル、及びキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）を含む融合ポリペプチドが提供され、ＣＡＲは、第１の抗体又はその抗原特異的結合断片、第１のヒンジ領域、第１の膜貫通ドメイン、及び第１の細胞内共刺激ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメインを含み、ＣＣＲは、第２の抗体又はその抗原特異的結合断片、第２のヒンジ領域、第２の膜貫通ドメイン、及び第２の細胞内共刺激ドメインを含み、ＣＣＲの第２のヒンジドメインは、異なるアミノ酸に置換された１つ以上のシステイン残基を含む。

【0069】

様々な実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドを発現する細胞が提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子操作された宿主細胞、造血細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、ＣＤ３４^＋細胞、免疫エフェクター細胞、Ｔ細胞、ＣＤ３^＋細胞、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、ヘルパーＴ細胞、αβ－Ｔ細胞、γδ－Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、又はマクロファージである。

【0070】

様々な実施形態では、本明細書に記載される細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に記載される組成物を対象に投与することを含む、がんを治療することを必要とする対象においてそれを治療する方法が提供される。

【0072】

様々な実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド又はベクターを細胞集団に導入することを含む、本明細書に記載される融合ポリペプチドを発現する細胞集団を生成する方法が提供される。

【0073】

様々な実施形態では、非修飾ヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ抗原媒介性刺激を低減する方法が提供され、方法は、各々がヒンジドメインを有するＣＡＲ及びＣＣＲポリペプチドを得ることであって、任意選択で、ＣＡＲ及びＣＣＲが、融合ポリペプチドとして発現される、得ることと、ＣＣＲヒンジドメイン内の１つ以上のシステイン残基を別の残基に置換し、それによって修飾ＣＣＲを産生することと、細胞においてＣＡＲ及び修飾ＣＣＲを発現することと、を含む。様々な実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲの両方を発現する細胞におけるＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ共刺激を低減する方法が提供され、方法は、ａ）各々がヒンジドメインを有するＣＡＲ及びＣＣＲポリペプチドを得ることであって、任意選択で、ＣＡＲ及びＣＣＲが、融合ポリペプチドとして発現される、得ることと、ｂ）ＣＣＲヒンジドメイン内の１つ以上のシステイン残基を別の残基に置換し、それによって修飾ＣＣＲを産生することと、ｃ）細胞においてＣＡＲ及び修飾ＣＣＲを発現することと、を含む。

【0074】

組換え（すなわち、操作された）ＤＮＡ、ペプチド及びオリゴヌクレオチド合成、免疫アッセイ、組織培養、形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）、酵素反応、精製、並びに関連する技術及び手順は、本明細書を通じて引用され、議論される、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学、及び免疫学における様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されるように一般的に行われてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００８年７月に更新）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ ＵＳＡ，１９８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ ２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊｕｌｉｅ Ｌｏｇａｎ，Ｋｉｒｓｔｉｎ Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｎｉｃｋ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００９，Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ，２００８ Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ，Ｅｄ．，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ ＣＣ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）、Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、並びにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの専門誌の研究論文を参照されたい。

【0075】

Ｂ．定義
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書で使用されるべきある特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ち得る。

【0076】

別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似した、又は均等の方法及び材料を、特定の実施形態の実施又は検証に使用することができるが、本明細書においては好ましい組成物、方法及び材料の実施形態を開示している。本開示の目的に対し、以下の用語を、以下に定義する。

【0077】

「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」といった冠詞は、本明細書において、冠詞の文法上の対象の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ、又は１以上）を指すために使用される。例示として、「要素」とは、１つの要素、又は１つ以上の要素を意味する。

【0078】

選択肢（例えば「又は」）の使用は、いずれか１つ、両方、又はその選択肢の任意の組み合わせを意味すると理解されたい。

【0079】

「及び／又は」という用語は、いずれか１つ、又はその選択肢の両方を意味すると理解されたい。

【0080】

本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さに対し、最大１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％変化する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さを指す。一実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さに関し、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、又は±１％の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さの範囲を指す。

【0081】

一実施形態では、例えば、１～５、約１～５、又は約１～約５といった範囲は、その範囲に包含される各数値を指す。例えば、１つの非限定的かつ単に例示的な実施形態では、範囲「１～５」は、表現１、２、３、４、５、又は１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、若しくは５．０、又は１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、若しくは５．０と同等である。

【0082】

本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上である数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さを指す。一実施形態では、「実質的に同一」とは、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さとおよそ同じである、例えば、生理学的効果などの効果を生じさせる数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さを指す。

【0083】

本明細書全体を通じて、文脈が別段要求しない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含むこと」は、規定される工程若しくは構成要素又は工程若しくは構成要素の群を含むことを暗示するが、任意の他の工程若しくは構成要素又は工程若しくは構成要素の群を除外することを暗示しないことは理解されるだろう。「～からなる」とは、語句「からなる」に続くもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。ゆえに、「～からなる」という文言は、列記される要素が必要又は義務であり、他の要素は存在し得ないことを示す。「本質的に～からなる」とは、当該文言の後に列記される任意の要素、及び列記される要素に関して本開示中に特定される活性若しくは作用に干渉しない、又は寄与しない他の要素に限定される任意の要素を含むことを意味する。ゆえに、「本質的に～からなる」という文言は、列記される要素が必須又は義務であり、しかし列記される要素の活性又は作用に実質的に影響を与える他の要素は存在しないことを示す。

【0084】

本明細書全体を通じて「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加的な実施形態」、若しくは「更なる実施形態」、又はそれらの組み合わせに対する参照は、当該実施形態と関連付けて記載される特定の性質、構造又は特徴が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。ゆえに本明細書全体の様々な箇所での前述の文言の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。更に、特定の性質、構造、又は特徴は、１つ以上の実施形態において任意の適切な様式で組み合わされ得る。更に、一実施形態でのある性質の肯定的な列挙は、特定の実施形態では当該性質の除外の根拠として機能することを理解されたい。

【0085】

追加の定義は、本開示全体を通じて記載されている。

【0086】

Ｃ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び修飾キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）
様々な実施形態では、免疫エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性を特定の抗原を発現するがん細胞に再指向し、かつ免疫エフェクター細胞療法の効果を相乗的に増加させるために、ＣＡＲ及びＣＣＲを発現するように修飾される。ＣＡＲは、所望の抗原に対する抗体ベースの特異性を、Ｔ細胞受容体の一次及び共刺激シグナル伝達構成要素と組み合わせた分子である。ＣＡＲとは異なり、ＣＣＲは、所望の抗原に対する抗体ベースの特異性をＴ細胞受容体共刺激ドメインと組み合わせた分子であるが、一次シグナル伝達ドメインを欠く分子である。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、異なる起源に由来する異なるタンパク質部分又はＤＮＡ部分から構成されるものを表す。

【0087】

特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、抗原結合ドメインを含むＣＡＲと、異なる抗原結合ドメインを含むＣＣＲとを発現する。ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメインを含み、ＣＣＲは、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内共刺激ドメインを含み、一次シグナル伝達ドメインを欠く。標的細胞の表面上の抗原とＣＣＲの抗原結合ドメインとの結合は、ＣＣＲのクラスター形成をもたらし、ＣＡＲ含有細胞に共刺激シグナルを送達する。ＣＣＲの主な特徴は、ＭＨＣ非依存的様式で免疫エフェクター細胞の特異性を更に再指向又は微調整し、かつＣＡＲの存在下、好ましくはＣＡＲ抗原の存在下の免疫エフェクター細胞応答を増強する能力である。

【0088】

様々な実施形態では、ＣＣＲは、抗原特異的結合ドメインを含む細胞外結合ドメインと、修飾ヒンジ領域と、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインと、を含むが、一次シグナル伝達ドメインではない。

【0089】

好ましい実施形態では、ＣＣＲヒンジ領域は、１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、１つ以上のセリン残基）で置換された１つ以上のシステイン残基を含む。

【0090】

ＣＡＲ及びＣＣＲ構成要素の例示的な例を以下に更に開示する。

【0091】

１．結合ドメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲは、標的細胞、例えば、がん細胞上に発現される特定の抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む細胞外結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、及び「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は、互換的に使用され、ＣＡＲ及びＣＣＲに、対象の標的抗原に特異的に結合する能力を提供する。結合ドメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。

【0092】

本明細書で使用される場合、「特異的結合親和性」又は「特異的に結合する」又は「特異的に結合した」又は「特異的結合」又は「特異的に標的とする」という用語は、バックグラウンド結合よりも高い結合親和性での抗体又はその抗原結合断片（又はそれを含むＣＡＲ及びＣＣＲ）の抗原への結合を説明する。結合ドメイン（又は結合ドメイン若しくは結合ドメインを含む融合タンパク質を含むＣＡＲ及びＣＣＲ）は、例えば、約１０^５Ｍ^－１以上の親和性又はＫａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する、特定の結合相互作用の平衡会合定数）で抗原に結合する、又は抗原と会合する場合、抗原に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態では、結合ドメイン（又は融合タンパク質）は、約１０^６Ｍ^－１、１０^７Ｍ^－１、１０^８Ｍ^－１、１０^９Ｍ^－１、１０^１０Ｍ^－１、１０^１１Ｍ^－１、１０^１２Ｍ^－１、又は１０^１３Ｍ^－１以上のＫａで標的に結合する。「高親和性」結合ドメイン（又はその一本鎖融合タンパク質）は、少なくとも１０^７Ｍ^－１、少なくとも１０^８Ｍ^－１、少なくとも１０^９Ｍ^－１、少なくとも１０^１０Ｍ^－１、少なくとも１０^１１Ｍ^－１、少なくとも１０^１２Ｍ^－１、少なくとも１０^１３Ｍ^－１、又はそれ以上のＫａを有するそれらの結合ドメインを指す。

【0093】

あるいは、親和性は、Ｍ単位（例えば、１０^－５Ｍ～１０^－１３Ｍ、又はそれ未満）での特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義されてもよい。本開示に従う結合ドメインポリペプチド並びにＣＡＲ及びＣＣＲタンパク質の親和性は、従来の技術を使用して、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によって、又は結合会合によって、又は標識されたリガンドを使用した変位アッセイを使用して、又はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能）などの表面プラズモン共鳴装置、又はＥＰＩＣシステム若しくはＥｎＳｐｉｒｅ（それぞれＣｏｒｎｉｎｇ及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能）などの光学バイオセンサーを使用して容易に決定することができる（また、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０、及び米国特許第５，２８３，１７３号、第５，４６８，６１４号、又は等価物を参照されたい）。

【0094】

一実施形態では、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合より約２倍高いか、バックグラウンド結合より約５倍高いか、バックグラウンド結合より約１０倍高いか、バックグラウンド結合より約２０倍高いか、バックグラウンド結合より約５０倍高いか、バックグラウンド結合より約１００倍高いか、又はバックグラウンド結合より約１０００倍高いか、又はそれ以上である。

【0095】

特定の実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲ細胞外結合ドメインは、抗体又はその抗原結合断片を含む。「抗体」は、免疫細胞によって認識されるものなどの、ペプチド、脂質、多糖類、又は抗原決定基を含む核酸などの抗原のエピトープを特異的に認識し、結合する軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を少なくとも含むポリペプチドである結合剤を指す。「単離された抗体又はその抗原結合断片」は、その自然環境の構成要素から識別され、分離及び／又は回収されたものである。

【0096】

「抗原（Ａｇ）」とは、動物へ注射される、又は動物に吸収される組成物（例えば、がん特異的タンパク質を含む組成物など）を含む、動物において抗体産生又はＴ細胞反応を刺激し得る化合物、組成物、又は物質を指す。抗原は、例えば、開示される抗原などの異種抗原により誘導される産物を含む、特異的な液性免疫又は細胞性免疫の産物と反応する。

【0097】

「エピトープ」又は「抗原性決定基」とは、結合物質が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置される連続アミノ酸又は非連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒への曝露で保持され、一方で三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒を用いた処理で失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間構造に少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個、約９個、又は約８～１０個のアミノ酸を含む。

【0098】

抗体は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ共役抗体（二重特異性抗体など）、及びその抗原結合断片を含む。また、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４－１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７を参照されたい。

【0099】

当業者によって理解されるであろうように、及び本明細書の他の箇所に記載されるように、完全抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。各重鎖は、可変領域、並びに第１、第２、及び第３の定常領域からなるが、一方で、各軽鎖は、可変領域及び定常領域からなる。哺乳類の重鎖は、α、δ、ε、γ、及びμに分類される。哺乳類の軽鎖は、λ又はκに分類される。α、δ、ε、γ、及びμ重鎖を含む免疫グロブリンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに分類される。完全抗体は、「Ｙ」形状を形成する。Ｙの幹は、一緒に結合された２つの重鎖の第２及び第３の定常領域（またＩｇＥ及びＩｇＭについては、第４の定常領域）から成り、ジスルフィド結合（鎖間）がヒンジに形成される。重鎖γ、α、及びδは、３つのタンデム（一直線）Ｉｇドメインからなる定常領域と、更なる柔軟性のためのヒンジ領域とを有し、重鎖μ及びεは、４つの免疫グロブリンドメインからなる定常領域を有する。第２及び第３の定常領域は、それぞれ「ＣＨ２ドメイン」及び「ＣＨ３ドメイン」と呼ばれる。Ｙの各アームは、単一の軽鎖の可変領域及び定常領域に結合された単一の重鎖の可変領域及び第１の定常領域を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。

【0100】

軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、３つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域を含み、これは「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれる。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｗｕ，ＴＴ ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１－５０，（１９７０）、Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．，ＰＮＡＳ，８４：２４４０－２４４３（１９８７）（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照されたい）による配列、又はＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（４）：９０１－９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７－８８３（１９８９））による構造によってなど、従来の方法によって定義又は識別することができる。

【0101】

軽鎖ＣＤＲを予測するための規則の例示的な例には、以下が挙げられる：ＣＤＲ－Ｌ１は、約残基２４で始まり、Ｃｙｓが先行し、約１０～１７残基であり、Ｔｒｐ（典型的には、Ｔｒｐ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎであるが、またＴｒｐ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ、Ｔｒｐ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ、Ｔｒｐ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ）が続く。ＣＤＲ－Ｌ２は、ＣＤＲ－Ｌ１の終了後に約１６残基で始まり、一般にＩｌｅ－Ｔｙｒであるが、またＶａｌ－Ｔｙｒ、Ｉｌｅ－Ｌｙｓ、Ｉｌｅ－Ｐｈｅが先行し、７残基であり、ＣＤＲ－Ｌ３は、ＣＤＲ－Ｌ２の終了後に約３３残基で始まり、Ｃｙｓが先行し、７～１１残基であり、Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－ＸＸＸ－Ｇｌｙ（ＸＸＸは任意のアミノ酸である）（配列番号５８）が続く。

【0102】

重鎖ＣＤＲを予測するための規則の例には、以下を含む：ＣＤＲ－Ｈ１は、約２６の残基で始まるが、Ｃｙｓ－ＸＸＸ－ＸＸＸ－ＸＸＸ（配列番号５９）が先行し、１０～１２の残基であり、Ｔｒｐ（典型的にはＴｒｐ－Ｖａｌであるが、またＴｒｐ－Ｉｌｅ、Ｔｒｐ－Ａｌａ）が続き、ＣＤＲ－Ｈ２は、ＣＤＲ－Ｈ１の終了後に約１５残基で始まり、一般にＬｅｕ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ（配列番号６０）、又はいくつかの変形が先行し、１６～１９残基であり、Ｌｙｓ／Ａｒｇ－Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａが続き、ＣＤＲ－Ｈ３は、ＣＤＲ－Ｈ２の終了後に約３３残基で始まり、Ｃｙｓ－ＸＸＸ－ＸＸＸ（典型的にはＣｙｓ－Ａｌａ－Ａｒｇ）が先行し、３～２５残基であり、Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－ＸＸＸ－Ｇｌｙ（配列番号６１）が続く。

【0103】

一実施形態では、軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ方法に従って決定される。

【0104】

一実施形態では、軽鎖ＣＤＲ並びに重鎖ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ方法に従って決定され、重鎖ＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔ方法とＣｌｏｔｈｉａ方法との間に含まれるＡｂＭ方法に従って決定され、例えば、Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ Ｎ＆Ｒｅｅｓ ＡＲ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２０００ Ｄｅｃ；１３（１２）：８１９－２４ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００４；２４８：５１－９１を参照されたい。ＣＤＲを予測するためのプログラムは、例えば、ＡｂＹｓｉｓ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）に公開されている。

【0105】

異なる軽鎖又は重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒトなどの種内で比較的保存される。抗体のフレームワーク領域は、構成軽鎖及び重鎖の結合フレームワーク領域であり、三次元空間においてＣＤＲを位置付け、整列させる役割を果たす。ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合を主に担う。各鎖のＣＤＲは、一般的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順次番号付けされ、また一般的に、特定のＣＤＲが位置する鎖によって識別される。したがって、抗体の重鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３と呼ばれ、一方で抗体の軽鎖の可変ドメイン内に位置するＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３と呼ばれる。異なる特異性を有する抗体（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）は、異なるＣＤＲを有する。抗体ごとに異なるのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。

【0106】

「ＶＬ」又は「ＶＬ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、又は本明細書に企図される他の抗体断片を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。「ＶＨ」又は「ＶＨ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、又は本明細書に企図される他の抗体断片を含む、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。

【0107】

「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、又は単一抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞の融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって、当業者に公知の方法によって産生される。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。

【0108】

「キメラ抗体」は、ヒトなどの１つの種に由来するフレームワーク残基、及びマウスなどの別の種に由来するＣＤＲ（一般に抗原結合を付与する）を有する。特定の好ましい実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、キメラ抗体又はその抗原結合断片である抗原特異的結合ドメインを含む。

【0109】

特定の実施形態では、抗体は、ヒト抗体（ヒトモノクローナル抗体など）又はヒトポリペプチドに特異的に結合するその断片である。ヒト抗体は、ヒト由来ファージ表示ライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を、上述の既知のヒト定常ドメイン配列と組み合わせることによって構築することができる。あるいは、ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製されてもよい。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）によって記載されている。更に、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照されたい。遺伝子シャッフリングを使用して、ヒト抗体を非ヒト、例えば、齧歯類の抗体から誘導することもできるが、ヒト抗体は、開始非ヒト抗体と類似の親和性及び特異性を有する。（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ ＷＯ９３／０６２１３を参照されたい）。ＣＤＲ移植による非ヒト抗体の従来のヒト化とは異なり、この技術は、非ヒト起源のＦＲ残基又はＣＤＲ残基を有しない完全ヒト抗体を提供する。

【0110】

一実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、「ヒト化」抗体を含む。ヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（例えば、マウス、ラット、又は合成）免疫グロブリンからの１つ以上のＣＤＲとを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、全てのＣＤＲは、ヒト化免疫グロブリン中のドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は存在する必要がないが、存在する場合、ヒト免疫グロブリン定常領域と、すなわち、少なくとも約８５～９０％、例えば、約９５％以上実質的に同一でなければならない。したがって、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、ＣＤＲである可能性を除いて、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化又は他のモノクローナル抗体は、追加の保存的アミノ酸置換を有することができ、これは抗原結合又は他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を与えない。ヒト化抗体は、遺伝子工学の手段によって構築され得る（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。

【0111】

抗体は、ラクダＩｇ、リャマＩｇ、アルパカＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、二重特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）、三重特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及びシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ラクダ科ＶＨＨ、ナノボディ）並びに抗原結合に関与する完全長抗体の部分などの抗原結合断片を含む。抗体はまた、ポリクローナル及びモノクローナル抗体並びにその抗原結合断片と、マウス抗体、ラクダ科抗体、及びヒト抗体、並びにその抗原結合断片と、及びキメラ抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、並びにヒト化抗体、並びにその抗原結合断片と、を含む。また、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４－１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７を参照されたい。

【0112】

「重鎖抗体」は、２つのＶＨドメインを含み、かつ軽鎖を含まない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：２５－３８（１９９９）、ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９４／２５５９１、米国特許第６，００５，０７９号）。「カメリド抗体」は、２つのＶＨドメインを含み、かつ軽鎖を含まない、ラクダ、アルパカ、又はリャマから単離された抗体を指す。「ヒト化ＶＨＨ」又は「ヒト化ラクダ様抗体」は、ヒトレシピエントにおける抗体の潜在的免疫原性を低減するためにヒト化を受けた非ヒトＶＨＨ又はラクダ様抗体を指す。

【0113】

「免疫グロブリン新規抗原受容体」の「ＩｇＮＡＲ」は、１つの可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメイン及び５つの定常新規抗原受容体（ＣＮＡＲ）ドメインのホモ二量体からなるサメ免疫レパートリーからの抗体のクラスを指す。ＩｇＮＡＲは、最も小さい既知の免疫グロブリンベースのタンパク質足場のいくつかを表し、非常に安定であり、効率的な結合特性を有する。固有の安定性は、（ｉ）マウス抗体にみられる従来の抗体ＶＨドメイン及びＶＬドメインと比較して、かなりの数の荷電及び親水性表面曝露残基を表す基礎となるＩｇ足場、並びに（ｉｉ）ループ間ジスルフィド架橋を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）ループにおける構造的特徴、及びループ内水素結合のパターンの安定化の両方に起因し得る。

【0114】

抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位と、その名称が容易に結晶化する能力を反映する残存する「Ｆｃ」断片とを有する、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、かつ依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片を生成する。

【0115】

「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施形態では、二本鎖Ｆｖ種は、緊密な非共有結合の会合における１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、軽鎖と重鎖が二本鎖Ｆｖ種と類似した「二量体」構造で会合できるように、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインを、可撓性ペプチドリンカーによって共有結合することができる。この構成では、各可変ドメインの３つの超可変領域（ＨＶＲ）が相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を画定する。まとめると、６つのＨＶＲは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低い親和性である。

【0116】

Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基を付加することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学結合も既知である。二重特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）は、２つのＦａｂ’断片を有し、各々が異なる抗原に結合する。三重特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）は、３つのＦａｂ’断片を有し、各々が異なる抗原に結合する。

【0117】

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、その断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインとペアになり、２つの抗原結合部位を作製することが強制される。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）により完全に記載されている。トリアボディ及びテトラボディについても、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）に記載されている。

【0118】

「シングルドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」又は「ナノボディ」は、抗体重鎖（ＶＨドメイン）の可変領域、又は抗体軽鎖（ＶＬドメイン）の可変領域からなる抗体断片を指す（Ｈｏｌｔ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（１１）：４８４－４９０）。

【0119】

「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中、及びいずれかの配向（例えば、ＶＬ－ＶＨ又はＶＨ－ＶＬ）中に存在する。概して、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、これによりｓｃＦｖは抗原結合のための所望の構造を形成することができる。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９－３１５を参照されたい。

【0120】

好ましい実施形態では、抗原特異的結合断片は、ｓｃＦｖ又はＶＨＨである。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、マウス、ヒト又はヒト化ｓｃＦｖである。一本鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローニングされてもよい。このようなハイブリドーマの産生は、ルーチンとなっている。可変領域重鎖（ＶＨ）及び可変領域軽鎖（ＶＬ）のクローニングに使用され得る技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８９；８６：３８３３－３８３７に記載されている。

【0121】

様々な実施形態では、ＣＡＲ（例えば、第１の結合ドメイン）及び／又はＣＣＲ（例えば、第２の結合ドメイン）の抗原特異的結合ドメインは、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５（ｆｍｃ様チロシンキナーゼ３としても知られる；ＦＬＴ３）、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、クローディン－６（ＣＬＤＮ６）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＬＲＢ２）；黒色腫抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）によって認識される黒色腫抗原、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、並びにウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）からなる群から選択される、標的抗原と結合する。

【0122】

特定の実施形態では、抗原特異的結合ドメインは、ｓｃＦｖ又はＶＨＨである。

【0123】

特定の実施形態では、抗原特異的結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡ又はＥＧＦＲポリペプチドと結合するｓｃＦｖである。

【0124】

２．リンカー
ある特定の実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、様々なドメイン間にリンカー残基を含み、例えば、分子の適切な間隔及び構造のために追加される。特定の実施形態では、リンカーは、可変領域を結合させる配列である。「可変領域を結合させる配列」は、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌを繋げるアミノ酸配列であり、２つの下位結合ドメインの相互作用と適合可能なスペーサー機能を提供し、得られたポリペプチドは、同じ軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的結合親和性を保持する。特定の実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のリンカーを含む。特定の実施形態では、リンカーの長さは、約１～約２５個のアミノ酸、約５～約２０個のアミノ酸、又は約１０～約２０個のアミノ酸、又はアミノ酸の任意の介在する長さである。いくつかの実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、又はそれ以上のアミノ酸長である。

【0125】

リンカーの例示的な例には、グリシンポリマー（Ｇ）_ｎと、ｎが少なくとも１、２、３、４、又は５の整数である、グリシン－セリンポリマー（Ｇ_１－５Ｓ_１－５）_ｎと、グリシン－アラニンポリマーと、アラニン－セリンポリマーと、及び当該技術分野で既知の他の可撓性リンカーと、が挙げられる。グリシン及びグリシン－セリンポリマーは比較的構造化されておらず、したがって、本明細書に記載されるＣＡＲ又はＣＣＲなどの融合タンパク質のドメイン間の中性テザーとして機能することができる。グリシンは、アラニンよりも非常に多くのｐｈｉ－ｐｓｉ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３－１４２（１９９２）を参照されたい）。当業者であれば、特定の実施形態におけるＣＡＲ又はＣＣＲの設計が、全て又は部分的に可撓性であるリンカーを含むことができ、それによりリンカーは、可撓性リンカー、並びに所望のＣＡＲ又はＣＣＲ構造を提供する、より可撓性の低い構造を付与する１つ以上の部分を含み得ることを認識するであろう。

【0126】

他の例示的なリンカーには、これらに限定されないが、以下のアミノ酸配列が含まれる：ＤＧＧＧＳ（配列番号２１）；ＴＧＥＫＰ（配列番号２２）（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ５５２５－５５３０（１９９７）を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号２３）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．１９９５、上記）；（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（式中、１、２、３、４、又は５（配列番号２４）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９３，１１５６－１１６０（１９９６．））；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号２５）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６－１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２６）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号２７）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号２８）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号２９）；ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）_２ＥＲＰ（配列番号３０）。あるいは、可塑性リンカーを、ＤＮＡ結合部位とペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９０：２２５６－２２６０（１９９３），ＰＮＡＳ ９１：１１０９９－１１１０３（１９９４））を使用して、又はファージディスプレイ法により合理的に設計することができる。一実施形態では、リンカーは、以下のアミノ酸配列を含む：ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号３１）（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１（４）：１６３７－１６４４（２００３））。

【0127】

３．スペーサードメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲの結合ドメインに続いて、１つ以上の「スペーサードメイン」が続き、これは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して、適切な細胞／細胞の接触、抗原結合、及び活性化を可能にする領域を指す（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２－４１９）。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。ある実施形態では、スペーサードメインは、これらに限定されないが、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２及びＣＨ３を含む免疫グロブリン部分である。スペーサードメインは、天然発生型免疫グロブリンヒンジ領域、又は改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでもよい。

【0128】

一実施形態では、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、又はＩｇＤのＣＨ２及びＣＨ３を含む。

【0129】

４．ヒンジドメイン
「ヒンジ」、「ヒンジドメイン」、及び「ヒンジ領域」という用語は、本明細書で互換的に使用され、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して位置付けて、適切な細胞／細胞の接触、抗原結合、及び活性化を可能にする役割を果たす可撓性ドメインを指す。ＣＡＲ及び／又はＣＣＲの結合ドメインには、概して、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間の１つ以上のヒンジドメインが続く。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然発生型免疫グロブリンヒンジ領域、又は改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、スペーサードメインを含む。

【0130】

本明細書で使用される場合、「改変ヒンジドメイン」、「修飾ヒンジドメイン」、及び「修飾ヒンジドメイン」という用語は、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％のアミノ酸の置換又は欠失）を有する天然発生型ヒンジド領域、（ｂ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％のアミノ酸の置換又は欠失）を有する少なくとも１０アミノ酸（例えば、少なくとも１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸）長である天然発生型ヒンジ領域の部分、又は（ｃ）コアヒンジ領域（４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５、又は少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５アミノ酸長であり得る）を含む天然発生型ヒンジ領域の部分を指す。

【0131】

好ましい実施形態では、修飾ヒンジ領域は、本明細書に記載され、かつ／又は当該技術分野で既知の好適なヒンジドメイン／領域に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヒンジ領域は、４個以下、３個以下、又は２個以下のアミノ酸置換及び／又は欠失を有する、本明細書に記載されるヒンジ配列を含む。

【0132】

ある特定の実施形態では、天然発生型ヒンジ領域中の１つ以上のシステイン残基は、１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、１つ以上のセリン残基）によって置換されてもよい。特定の実施形態では、改変ヒンジ領域は、別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）によるプロリン残基の置換を含む。

【0133】

本明細書で特定の実施形態に企図されるＣＡＲ及び／又はＣＣＲにおける使用に好適な例示的なヒンジドメインとしては、これらに限定されないが、例えば、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、及びＣＤ７を含む１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、それは、これらの分子からの野生型ヒンジ領域であってもよく、又は改変されてもよい。一実施形態では、ヒンジは、ＰＤ－１ヒンジ又はＣＤ１５２ヒンジである。別の実施形態では、ヒンジドメインは、天然発生型免疫グロビンヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ヒンジを含む。別の実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３／ヒンジ／Ｍ１、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、又はＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２を含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0135】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４ヒンジ領域は、配列番号７に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ヒンジ領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0137】

いくつかの実施形態では、ＣＤ７ヒンジ領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0138】

いくつかの実施形態では、ＣＤ１５２ヒンジ領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0139】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ヒンジ領域は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ヒンジ領域は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２ヒンジ領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0142】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ３ヒンジ領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0144】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ヒンジ領域は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0145】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ヒンジ－ＣＨ３－ヒンジ－Ｍ１ヒンジ領域は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0146】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ヒンジ領域は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0147】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２ヒンジ領域は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0148】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ヒンジ領域は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくは改変を含む。

【0149】

様々な実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドは、上に記載されるヒンジドメイン／領域のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む修飾された第１及び／又は第２のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾された第１及び／又は第２のヒンジ領域は、４個以下、３個以下、又は２個以下のアミノ酸置換及び／又は欠失を有する、上に記載されるヒンジ配列を含む。

【0150】

ある特定の実施形態では、ヒンジ領域／ドメイン中の１つ以上のシステイン残基は、１つ以上の他のアミノ酸残基によって置換されて、修飾ヒンジドメインを産生してもよい。いくつかの実施形態では、修飾ヒンジドメインは、セリン又はアラニンで置換された１つ以上のシステイン残基を含む。別の実施形態では、修飾ヒンジドメインは、セリンで置換された１つ以上のシステイン残基を含む。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、アラニンで置換された１つ以上のシステイン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲヒンジドメインは、修飾されている。いくつかの実施形態では、ＣＡＲヒンジドメインは、修飾されていない。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲヒンジドメインの両方が修飾されている。

【0151】

好ましい実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域／ドメインを含む。一実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号２に示されるアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、修飾ＣＤ８αヒンジドメインを含む。別の実施形態では、ＣＣＲは、修飾ＣＤ８αヒンジドメインを含み、ＣＡＲは、任意選択で、野生型ヒンジ配列を含む。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、１つ以上の他のアミノ酸残基で置換された１つ以上のシステイン残基を含む。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、セリン又はアラニンで置換された１つ以上のシステイン残基を含む。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、セリンで置換された１つ以上のシステイン残基を含む。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、アラニンで置換された１つ以上のシステイン残基を含む。

【0152】

一実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号２の２７位にシステインからセリンへの置換を含む。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号３に示される配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号３に示される配列に対して、少なくとも９０％、９３％、９５％、又は９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、４個以下、３個以下、又は２個以下のアミノ酸置換及び／又は欠失を含む。

【0153】

一実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号２の４４位にシステインからセリンへの置換を含む。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号４に示されるアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号４に示される配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号４に示される配列に対して、少なくとも９０％、９３％、９５％、又は９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、４個以下、３個以下、又は２個以下のアミノ酸置換及び／又は欠失を含む。

【0154】

一実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号２の２７及び４４位にシステインからセリンへの置換を含む。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号５に示されるアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号５に示される配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号５に示される配列に対して、少なくとも９０％、９３％、９５％、又は９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジドメインは、４個以下、３個以下、又は２個以下のアミノ酸置換及び／又は欠失を含む。

【0155】

５．膜貫通（ＴＭ）ドメイン
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分及び細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、かつＣＡＲ及び／又はＣＣＲを免疫エフェクター細胞の細胞膜に固定するＣＡＲ及び／又はＣＣＲの部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。ＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ又はベータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１に由来し得る（すなわち、Ｔ細胞受容体のアルファ又はベータ鎖の少なくとも膜貫通領域を含む）。特定の実施形態では、ＴＭドメインは合成であり、主にロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む。

【0156】

一実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２、ＣＤ２８、又はＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２、ＣＤ２８、又はＣＤ８αに由来するＴＭドメイン、及び場合によっては、ＴＭドメインをＣＡＲ又はＣＣＲの細胞内シグナル伝達ドメイン又は共刺激ドメインに連結させる、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸長の、短オリゴリンカー又はポリペプチドリンカーを含む。グリシン－セリンベースのリンカーは、特に好適なリンカーを提供する。

【0157】

例えば、１つの非限定的かつ単に例示的な実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号６に示されるＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。特定の実施形態では、ＣＤ８α膜貫通ドメインは、配列番号６に示される配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0158】

６．細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、ＣＡＲ結合標的細胞へのサイトカイン因子の放出、又は細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合で誘発される他の細胞応答を含む、ヒト抗原への効果的なＣＡＲ結合のメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に形質導入して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、及び細胞傷害活性を誘発することに関与するＣＡＲの一部を指す。

【0159】

「エフェクター機能」という用語は、免疫エフェクター細胞の専門的な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルプ又は活性であってもよい。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に専門化機能を行うよう指向するタンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメインの全体が採用され得るが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される程度まで、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを形質導入する限り、ドメイン全体の代わりに使用され得る。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。

【0160】

ＴＣＲによって生成されたシグナル単独ではＴ細胞の完全な活性化に不十分であり、二次的すなわち共刺激性のシグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの明確に異なるクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン、すなわち、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって抗原依存性一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメインと、抗原依存様式で作用して二次的すなわち共刺激性のシグナルを提供する共刺激シグナル伝達ドメインとによって媒介されると言うことができる。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」及び「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0161】

一次シグナル伝達ドメインは、刺激方法又は阻害方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激性に作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ）又はＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。

【0162】

特定の実施形態で有用なＩＴＡＭ含有一次シグナル伝達ドメインの例示的な例としては、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特に好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に連結され得る。

【0163】

特定の実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、ＣＡＲ及びＣＣＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性及び拡大を増強するための１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」又は「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原に結合するとＴリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要とされる第２のシグナルを提供する、抗原受容体又はＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。そのような共刺激性分子の例示的な例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＴＮＦＲ２、及びＺＡＰ７０が挙げられる。一実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、及びＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、並びにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。

【0164】

別の実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、ＣＤ２８及びＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメイン、並びにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。

【0165】

更に別の実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、ＣＤ２８及びＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメイン、並びにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。

【0166】

一実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、ＣＤ１３７及びＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメイン、並びにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。

【0167】

一実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、ＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。

【0168】

一実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、ＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。

【0169】

一実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。

【0170】

Ｄ．ＣＡＲ及びＣＣＲの例示的な実施形態
一実施形態では、ＣＡＲは、抗原と結合する抗体又はその抗原特異的結合断片と、ヒンジ領域と、膜貫通ドメインと、共刺激分子からの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、一次シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0171】

一実施形態では、ＣＡＲは、がん細胞に発現される抗原と結合する抗体又はその抗原特異的結合断片と、ヒンジ領域と、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ１、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子からの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２，ＣＤ７９ａ，ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来する一次シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0172】

一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ７ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ、ＰＤ１ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３／ヒンジ／Ｍ１、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２からなる群から選択されるヒンジドメインを含む。

【0173】

一実施形態では、ＣＡＲは、がんに発現される抗原と結合する抗体又はその抗原特異的結合断片と、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ７ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ、ＰＤ１ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３／ヒンジ／Ｍ１、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２からなる群から選択されるヒンジドメインと、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ１、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインと、ＴＭドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結させる、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸長の、短オリゴリンカー又はポリペプチドリンカーと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子からの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２，ＣＤ７９ａ，ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来する一次シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0174】

特定の実施形態では、ＣＡＲは、がんに発現される抗原と結合する抗体又はその抗原特異的結合断片と、ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメインと、約３～約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカー（例えば、テール－ＣＤ８リンカー）を含むＣＤ８α膜貫通ドメインと、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0175】

特定の実施形態では、ＣＡＲは、がんに発現される抗原と結合する抗体又はその抗原特異的結合断片と、ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメインと、約３～約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカー（例えば、テール－ＣＤ８リンカー）を含むＣＤ８α膜貫通ドメインと、ＣＤ１３４細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0176】

特定の実施形態では、ＣＡＲは、がんに発現される抗原と結合する抗体又はその抗原特異的結合断片と、ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメインと、約３～約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカー（例えば、テール－ＣＤ８リンカー）を含むＣＤ８α膜貫通ドメインと、ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0177】

様々な実施形態では、ＣＡＲ抗体又はその抗原特異的結合断片は、ｓｃＦｖ又はＶＨＨである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ抗体又はその抗原特異的結合断片は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ抗体又はその抗原特異的結合断片は、ＶＨＨである。

【0178】

本明細書に記載される実施形態のうちのいずれか１つでは、ＣＡＲヒンジ領域は、本明細書に記載されるように、低減された抗原非依存性Ｔ細胞シグナル伝達に修飾され得る。本明細書に記載される実施形態のうちのいずれか１つでは、ヒンジ領域は、非修飾ヒンジ領域を含むＣＡＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＣＲとの会合を低減するように修飾され得る。

【0179】

一実施形態では、修飾ＣＡＲヒンジ領域は、異なるアミノ酸で置換された１つ以上のシステインを含む。別の実施形態では、１つ以上のシステイン残基は、セリン又はアラニンで置換されている。好ましい実施形態では、修飾ヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域である。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２に由来する。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２の２７位にアミノ酸置換を含む（すなわち、配列番号３を参照されたい）。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２の４４位にアミノ酸置換を含む（すなわち、配列番号４を参照されたい）。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２の２７及び４４位にアミノ酸置換を含む（すなわち、配列番号５を参照されたい）。

【0180】

上述の実施形態のうちのいずれにおいても、ＣＡＲヒンジ領域内の１つ以上のシステイン置換は、非修飾ヒンジ領域を含むＣＡＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ共刺激を低減する。上記の実施形態のうちのいずれか１つでは、ＣＡＲヒンジ領域内の１つ以上のシステイン置換は、非修飾ヒンジ領域を含むＣＡＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＣＲとの会合を低減する。

【0181】

一実施形態では、ＣＣＲは、抗原と結合する抗体又はその抗原特異的結合断片と、ヒンジ領域と、膜貫通ドメインと、共刺激分子からの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0182】

一実施形態では、ＣＣＲは、がんに発現される抗原と結合する抗体又はその抗原特異的結合断片と、異なるアミノ酸で置換された１つ以上のシステインを含む修飾ヒンジ領域と、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ１、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子からの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0183】

一実施形態では、ＣＣＲは、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ７ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ、ＰＤ１ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３／ヒンジ／Ｍ１、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２からなる群から選択される修飾ヒンジ領域を含む。

【0184】

一実施形態では、ＣＣＲは、がんに発現される抗原と結合する抗体又はその抗原特異的結合断片と、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ７ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ、ＰＤ１ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３／ヒンジ／Ｍ１、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２からなる群から選択される修飾ヒンジ領域と、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ１、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインと、ＴＭドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結させる、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸長の、短オリゴリンカー又はポリペプチドリンカーと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＴＮＦＲ２、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子からの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0185】

特定の実施形態では、ＣＣＲは、がんに発現される抗原と結合するｓｃＦｖ又はＶＨＨと、本明細書に記載されるＣＤ８αポリペプチドを含む修飾ヒンジ領域と、約３～約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカー（例えば、テール－ＣＤ８リンカー）を含むＣＤ８α膜貫通ドメインと、ＣＤ１３７細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0186】

特定の実施形態では、ＣＣＲは、がんに発現される抗原と結合するｓｃＦｖ又はＶＨＨと、本明細書に記載されるＣＤ８αポリペプチドを含む修飾ヒンジ領域と、約３～約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカー（例えば、テール－ＣＤ８リンカー）を含むＣＤ８α膜貫通ドメインと、ＣＤ１３４細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0187】

特定の実施形態では、ＣＣＲは、がんに発現される抗原と結合するｓｃＦｖ又はＶＨＨと、本明細書に記載されるＣＤ８αポリペプチドを含む修飾ヒンジ領域と、約３～約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカー（例えば、テール－ＣＤ８リンカー）を含むＣＤ８α膜貫通ドメインと、ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0188】

様々な実施形態では、ＣＣＲ抗体又はその抗原特異的結合断片は、ｓｃＦｖ又はＶＨＨである。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ抗体又はその抗原特異的結合断片は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ抗体又はその抗原特異的結合断片は、ＶＨＨである。

【0189】

本明細書に記載される実施形態のうちのいずれか１つでは、ＣＣＲヒンジ領域は、本明細書に記載されるように、低減された抗原非依存性Ｔ細胞シグナル伝達に修飾され得る。本明細書に記載される実施形態のうちのいずれか１つでは、ＣＣＲヒンジ領域は、非修飾ヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲとの会合を低減するように修飾され得る。

【0190】

一実施形態では、修飾ＣＣＲヒンジ領域は、異なるアミノ酸で置換された１つ以上のシステインを含む。別の実施形態では、１つ以上のシステイン残基は、セリン又はアラニンで置換されている。好ましい実施形態では、修飾ヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域である。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２に由来する。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２の２７位にアミノ酸置換を含む（すなわち、配列番号３を参照されたい）。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２の４４位にアミノ酸置換を含む（すなわち、配列番号４を参照されたい）。別の実施形態では、修飾ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２の２７及び４４位にアミノ酸置換を含む（すなわち、配列番号５を参照されたい）。

【0191】

上述の実施形態のうちのいずれにおいても、ＣＣＲヒンジ領域内の１つ以上のシステイン置換は、非修飾ヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞シグナル伝達のＣＣＲ共刺激を低減する。上記の実施形態のうちのいずれか１つでは、ＣＣＲヒンジ領域内の１つ以上のシステイン置換は、非修飾ヒンジ領域を含むＣＣＲと比較して、ＣＡＲ抗原の不在下のＣＡＲとの会合を低減する。

【0192】

様々な実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、α_ｖβ_６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５（ｆｍｃ様チロシンキナーゼ３としても知られる；ＦＬＴ３）、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、クローディン－６（ＣＬＤＮ６）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＬＲＢ２）、黒色腫抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）によって認識される黒色腫抗原、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、並びにウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）からなる群から選択される、標的抗原と結合する。特定の実施形態では、抗原特異的結合ドメインは、ｓｃＦｖ又はＶＨＨである。特定の実施形態では、抗原特異的結合ドメインは、ｓｃＦｖである。特定の実施形態では、抗原特異的結合ドメインは、ＶＨＨである。特定の実施形態では、抗原特異的結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡ又はＥＧＦＲポリペプチドと結合するｓｃＦｖである。

【0193】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、α_ｖβ_６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５（ｆｍｃ様チロシンキナーゼ３としても知られる；ＦＬＴ３）、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、クローディン－６（ＣＬＤＮ６）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＬＲＢ２）、黒色腫抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）によって認識される黒色腫抗原、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、並びにウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）からなる群から選択される、標的抗原と結合する。

【0194】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｒｂＢ２を含むＥＧＦＲファミリー（ＨＥＲ２）、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、及びＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される標的抗原と結合する。

【0195】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡポリペプチドと結合する。

【0196】

様々な実施形態では、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、α_ｖβ_６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５（ｆｍｃ様チロシンキナーゼ３としても知られる；ＦＬＴ３）、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、クローディン－６（ＣＬＤＮ６）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＬＲＢ２）、黒色腫抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）によって認識される黒色腫抗原、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、並びにウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）からなる群から選択される、標的抗原と結合する。様々な実施形態では、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｒｂＢ２を含むＥＧＦＲファミリー（ＨＥＲ２）、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、及びＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される、標的抗原と結合する。

【0197】

様々な実施形態では、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチド、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド、ＴＡＧ７２ポリペプチド、又はＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0198】

様々な実施形態では、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドと結合する。様々な実施形態では、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドと結合する。様々な実施形態では、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合する。様々な実施形態では、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0199】

特定の実施形態では、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ｓｃＦｖ又はＶＨＨである。

【0200】

様々な実施形態では、ＣＡＲは、第１の抗体又はその抗原特異的結合断片を含み、ＣＣＲは、第２の抗体又はその抗原特異的結合断片を更に含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体又は抗原特異的結合断片は、同じ標的抗原と結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体又は抗原特異的結合断片は、同じ標的抗原上の異なるエピトープと結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体又は抗原特異的結合断片は、異なる標的抗原と結合する。

【0201】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｒｂＢ２を含むＥＧＦＲファミリー（ＨＥＲ２）、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、及びＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される標的抗原と結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｒｂＢ２を含むＥＧＦＲファミリー（ＨＥＲ２）、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、及びＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される標的抗原と結合する。

【0202】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥｒｂＢ２を含むＥＧＦＲファミリー（ＨＥＲ２）、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、及びＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される標的抗原と結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、及びＴＡＧ７２からなる群から選択される標的抗原と結合する。

【0203】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ３３、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＵＣ１６、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、及びＮＫＧ２Ｄリガンドからなる群から選択される標的抗原と結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、及びＴＡＧ７２からなる群から選択される標的抗原と結合する。

【0204】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ３３、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＵＣ１６、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、及びＮＫＧ２Ｄリガンドである標的抗原と結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２０、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、及びＴＡＧ７２からなる群から選択される標的抗原と結合する。

【0205】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドと結合する。

【0206】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドと結合する。

【0207】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0208】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合する。

【0209】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ３３ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドと結合する。

【0210】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ３３ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドと結合する。

【0211】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ３３ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0212】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ３３ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合する。

【0213】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ７９ａポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドと結合する。

【0214】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ７９ａポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドと結合する。

【0215】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ７９ａポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0216】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ７９ａポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合する。

【0217】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ７９ｂポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドと結合する。

【0218】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ７９ｂポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドと結合する。

【0219】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ７９ｂポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0220】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ７９ｂポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合する。

【0221】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＬＬ－１ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドと結合する。

【0222】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＬＬ－１ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドと結合する。

【0223】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＬＬ－１ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0224】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＬＬ－１ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合する。

【0225】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドと結合する。

【0226】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドと結合する。

【0227】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0228】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合する。

【0229】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＭＵＣ１６ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドと結合する。

【0230】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＭＵＣ１６ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドと結合する。

【0231】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＭＵＣ１６ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0232】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＭＵＣ１６ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合する。

【0233】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドと結合する。

【0234】

様々な実施形態では、抗原特異的結合ドメインは、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドと結合する。

【0235】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0236】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合する。

【0237】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＰＲＡＭＥポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドと結合する。

【0238】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＰＲＡＭＥポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドと結合する。

【0239】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＰＲＡＭＥポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0240】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＰＲＡＭＥポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合する。

【0241】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＲＯＲ１ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドと結合する。

【0242】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＲＯＲ１ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドと結合する。

【0243】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＲＯＲ１ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0244】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＲＯＲ１ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合する。

【0245】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドと結合する。

【0246】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドと結合する。

【0247】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0248】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＮＫＧ２Ｄリガンドポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲポリペプチドと結合する。

【0249】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＮＫＧ２Ｄリガンドポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドと結合する。

【0250】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＮＫＧ２Ｄリガンドポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドと結合する。

【0251】

様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＮＫＧ２Ｄリガンドポリペプチドと結合し、ＣＣＲの抗原特異的結合ドメインは、ヒトＴＡＧ７２ポリペプチドと結合する。

【0252】

特定の実施形態に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲの設計は、非修飾Ｔ細胞又は他のＣＡＲを発現するように修飾されたＴ細胞と比較して、ＣＡＲ及びＣＣＲを発現するＴ細胞における拡大、長期持続性、及び細胞傷害性特性の改善を可能にする。

【0253】

Ｅ．ポリペプチド
これらに限定されないが、ＣＡＲポリペプチド、ＣＣＲポリペプチド、融合ポリペプチド、及びその断片を含む、様々なポリペプチド、融合ポリペプチド、及びポリペプチドバリアントが本明細書に企図される。特定の実施形態では、本明細書に企図される例示的なポリペプチドには、修飾ヒンジ領域及び関連する融合ポリペプチドを含むＣＣＲが含まれる。特に、本明細書に記載されるポリペプチドは、非修飾ＣＣＲヒンジ領域を含むポリペプチド又は細胞と比較して、ＣＡＲ抗原の不在下の低減されたＴ細胞シグナル伝達を示す。より具体的には、本明細書に記載される改善されたポリペプチドは、驚くべきことに、ＣＣＲ媒介性ＣＡＲ抗原非依存性シグナル伝達を低減し、一方で、ＣＡＲ及びＣＣＲ抗原の両方の存在下のＴ細胞シグナル伝達を増加させる。

【0254】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、反対であることが明記されない限り、互換的に使用され、従来的な意味、すなわち、アミノ酸の配列としての意味に従う。ポリペプチドは特定の長さに限定されず、例えば、ポリペプチドは、完全長ポリペプチド又はポリペプチド断片を含んでもよく、ポリペプチドは、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などのポリペプチドの１つ以上の翻訳後修飾、並びに当該技術分野で既知の天然発生型及び非天然発生型の両方の他の修飾を含んでもよい。

【0255】

本明細書で使用される場合、「単離ポリペプチド」などは、細胞環境からの、及び細胞の他の構成要素との会合からの、ペプチド分子又はポリペプチド分子のインビトロでの合成、単離及び／又は精製を指し、すなわち、インビボでの物質と実質的に関連付けられていない。特定の実施形態では、単離ポリペプチドは、合成ポリペプチド、半合成ポリペプチド、若しくは組換え源から得られた、又は誘導されたポリペプチドである。

【0256】

ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つ以上の置換、欠失、付加、及び／又は挿入により、天然発生型ポリペプチドとは異なっている場合がある。そうしたバリアントは、天然発生型であってもよく、又は例えば、上述のポリペプチド配列のうちの１つ以上を修飾することにより合成的に生成されてもよい。例えば、特定の実施形態では、１つ以上の置換、欠失、付加、及び／又は挿入を結合ドメイン、ヒンジ、ＴＭドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン又は存在する場合、一次シグナル伝達ドメインに導入することにより、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲの結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書において予期される参照配列のいずれかに対して、少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、バリアントは、参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持している。特定の実施形態では、生物学的活性は、結合親和性である。特定の実施形態では、生物学的活性は、細胞溶解活性である。

【0257】

ポリペプチドは、「ポリペプチド断片」を含む。ポリペプチド断片は、単量体又は多量体であってもよく、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、及び／又は天然発生型若しくは組換えにより産生されたポリペプチドの内部欠失又は置換を有するポリペプチドを指す。生物学的に活性なポリペプチド断片の例示的な例には、抗体断片が挙げられる。本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な断片」又は「最小限の生物学的に活性な断片」という用語は、天然発生型ポリペプチド活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％を保持するポリペプチド断片を指す。好ましい実施形態では、生物学的活性は、エピトープに対する結合親和性である。ある特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５～約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０アミノ酸長である。特に有用なポリペプチド断片は、抗原結合ドメイン又は抗体の断片を含む機能性ドメインを含む。

【0258】

ポリペプチドはまた、ポリペプチド（例えば、ポリ－Ｈｉｓ）の合成、精製、若しくは同定の容易さのために、又は固体支持体へのポリペプチドの結合を増強するために、インフレームで融合されてもよく、又はリンカー若しくは他の配列に結合されてもよい。

【0259】

上述のように、特定の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、及び挿入を含む、様々な方法で改変されてもよい。そうした操作のための方法は、当該技術分野において一般的に既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中の変異により作製され得る。変異誘導及びヌクレオチド配列改変のための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８－４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７－３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、及びその中で引用されている参考文献を参照されたい。対象のタンパク質の生物学的活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出され得る。

【0260】

ある特定の実施形態では、ポリペプチドバリアントは、１つ以上の保存的置換を含む。「保存的置換」は、アミノ酸が、類似した性能を有する別のアミノ酸に置換される置換であり、ペプチド化学分野の当業者であれば、そうした置換によって、ポリペプチドの二次構造及び疎水親水的性質が実質的に変化しないと予測するであろう。特定の実施形態に企図されるポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造に修飾を行ってもよく、それでも所望の特徴を有するバリアントポリペプチド又は誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子が得られる。ポリペプチドのアミノ酸配列を変更し、同等な、又は改善されたバリアントポリペプチドを生成することが望ましい場合、当業者は、例えば、表１に従い、コードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変えることができる。

【表1】

【0261】

どのアミノ酸残基が、生物学的活性を無効化することなく置換、挿入、又は欠失され得るかを決定するガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒ、又はＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアなどの当該技術分野で周知のコンピュータプログラムを使用して見出すことができる。本明細書に開示されるタンパク質バリアント中のアミノ酸の変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、類似した荷電アミノ酸、又は非荷電アミノ酸の置換であることが好ましい。保存的アミノ酸変化には、その側鎖で関連付けられているアミノ酸ファミリーの１つの置換を含む。天然アミノ酸は一般的に以下の４つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、合わせて芳香族アミノ酸として分類される場合もある。ペプチド又はタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は当業者に既知であり、一般的に得られる分子の生物学的活性を変化させることなく行うことができる。当業者であれば、ポリペプチドの非必須領域中の単一アミノ酸置換は概して、生物学的活性を大きくは変化させないと認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。

【0262】

上述のように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなどの相対的類似性に基づいてもよい。

【0263】

ポリペプチドバリアントには更に、グリコシル化形態、他の分子との凝集コンジュゲート、及び無関係な化学部分（例えば、ペグ化分子）との共有結合コンジュゲートが含まれる。共有結合バリアントは、当該技術分野で既知であるように、アミノ酸鎖中、又はＮ末端残基若しくはＣ末端残基中に存在する基に機能性を連結することによって調製することができる。バリアントにはまた、対立遺伝子バリアント、種バリアント、及び変異タンパク質が含まれる。タンパク質の機能的活性に影響を与えない領域の切断又は欠失もバリアントである。

【0264】

特定の実施形態では、同じ細胞におけるＣＡＲ及びＣＣＲの発現が望まれる。ＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の別の箇所で議論されるように、ＩＲＥＳ配列によって分離され得る。

【0265】

好ましい実施形態では、融合ポリペプチドが本明細書に企図されている。

【0266】

特定の好ましい実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲは、ＣＡＲ及びＣＣＲを分離する１つ以上の自己切断ポリペプチド配列を含む融合ポリペプチドとして発現され得る。

【0267】

融合ポリペプチド及び融合タンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。融合ポリペプチドは、典型的には、Ｃ末端からＮ末端に連結されているが、それらは、Ｃ末端からＣ末端に、Ｎ末端からＮ末端に、又はＮ末端からＣ末端に連結されてもよい。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序又は指定された順序であってもよい。一実施形態では、融合タンパク質は、ＣＡＲ、ポリペプチド切断シグナル、及びＣＣＲを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＣＲ、ポリペプチド切断シグナル、及びＣＡＲを含む。

【0268】

一実施形態では、融合タンパク質は、ＣＡＲ、ポリペプチド切断シグナル、及びＣＣＲを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＣＲ、ポリペプチド切断シグナル、及びＣＡＲを含む。

【0269】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、がんに発現される抗原と結合するｓｃＦｖ、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲと、ポリペプチド切断シグナルと、抗原と結合するｓｃＦｖ、本明細書に記載される修飾ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び共刺激ドメインを含むＣＣＲと、を含む。例示的なドメイン／領域は、本明細書に記載されるものから選択されてもよい。

【0270】

好ましい実施形態では、融合タンパク質は、がんに発現される抗原と結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジ、膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲと、ポリペプチド切断シグナルと、抗原と結合するｓｃＦｖ、本明細書に記載される修飾ＣＤ８αヒンジ、膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８共刺激ドメインを含むＣＣＲと、を含む。

【0271】

ポリペプチド切断シグナルの例としては、例えば、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断リボザイム認識部位）、及び自己切断ウイルスオリゴペプチド（ｄｅＦｅｌｉｐｅ ａｎｄ Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６－２６を参照されたい）などのポリペプチド切断認識部位が挙げられる。

【0272】

好適なプロテアーゼ切断部位及び自己切断ペプチドは、当業者に既知である（例えば、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９－７２２、Ｓｃｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９－５９４を参照されたい）。タンパク質分解酵素切断部位の例としては、これらに限定されないが、ポティウイルスＮＩａタンパク質分解酵素（例えば、タバコエッチウイルスタンパク質分解酵素）、ポティウイルスＨＣタンパク質分解酵素、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）タンパク質分解酵素、ビオウイルスＮＩａタンパク質分解酵素、ビオウイルスＲＮＡ－２－コードタンパク質分解酵素、アフトウイルスＬタンパク質分解酵素、エンテロウイルス２Ａタンパク質分解酵素、ライノウイルス２Ａタンパク質分解酵素、ピコルナ３Ｃタンパク質分解酵素、コモウイルス２４Ｋタンパク質分解酵素、ネポウイルス２４Ｋタンパク質分解酵素、ＲＴＳＶ（ライスツングロ球状ウイルス）３Ｃ様タンパク質分解酵素、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様タンパク質分解酵素、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子及びエンテロキナーゼの切断部位が挙げられる。その高い切断ストリンジェンシーにより、ＴＥＶ（タバコエッチングウイルス）プロテアーゼ切断部位は、一実施形態では、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号３２）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号３３）及びＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号３４）（Ｘは、任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧ又はＱとＳの間で生じる）が好ましい。

【0273】

特定の実施形態では、ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス自己切断ペプチド又はリボソームスキッピング配列である。

【0274】

リボソームスキッピング配列の例示的な例には、これらに限定されないが、２Ａ若しくは２Ａ様部位、配列又はドメインが挙げられる（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。特定の実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド、又はカルジオウイルス２Ａペプチドである。

【0275】

一実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、ゾセアアシグナウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテスコウイルス－１（ＰＴＶ－１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、及び脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。

【0276】

２Ａ部位の例示的な例を表２に提供する。

【表2】

【0277】

好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるＣＡＲ、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチド、及び本明細書に記載されるＣＣＲを含む。

【0278】

Ｆ．ポリヌクレオチド
好ましい実施形態では、１つ以上のＣＡＲポリペプチド、ＣＣＲポリペプチド、又はＣＡＲ、２Ａペプチド、及びＣＣＲを含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってもよく、かつ組換え、合成、又は単離のいずれかであってもよい。ポリヌクレオチドには、これらに限定されないが、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、又は組換えＤＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、又は少なくとも１５０００以上のヌクレオチド長のヌクレオチドの多量体型を指し、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はいずれかタイプのヌクレオチドの修飾型、並びに全ての中間の長さのものを指す。本文脈において、「中間の長さ」とは、例えば、６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などの引用されている値の間の任意の長さを意味すると容易に理解されるであろう。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又はバリアントは、参照配列に対して、少なくとも若しくは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。

【0279】

本明細書で使用される場合、「単離ポリヌクレオチド」とは、天然発生状態で隣接する配列から精製されたポリヌクレオチドを指し、例えば、通常では断片と隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態では、「単離されたポリヌクレオチド」はまた、自然界には存在せず、人為的に作製された、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、又は他のポリヌクレオチドも指す。特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチド、半合成ポリヌクレオチド、又は組換え源から得られた若しくは誘導されたポリヌクレオチドである。

【0280】

様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ、１つ以上のヌクレオチド、及びポリ（Ａ）テールを含む。

【0281】

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されてもよい。本明細書で使用される場合、「コドン最適化」という用語は、ポリペプチドの発現、安定性、及び／又は活性を増加させるためにポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中のコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響を及ぼす因子には、これらに限定されないが、以下のうちの１つ以上が挙げられる：（ｉ）２つ以上の生物体又は遺伝子又は合成構築されたバイアステーブルの間のコドンバイアスの変動、（ｉｉ）生物体、遺伝子又は遺伝子セット内のコドンバイアスの程度の変動、（ｉｉｉ）コンテキストを含むコドンの体系的変動、（ｉｖ）その解読ｔＲＮＡに伴うコドンの変動、（ｖ）３つ組全体又は３つ組の１つの位置のいずれかのＧＣ％に伴うコドンの変動、（ｖｉ）例えば、天然配列などの参照配列に対する類似性における変動、（ｖｉｉ）コドン頻度のカットオフにおける変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造的性質、（ｉｘ）コドン置換セットの設計の基礎となるＤＮＡ配列の機能に関する予備知識、（ｘ）各アミノ酸に対するコドンセットの合成的変動、及び／又は（ｘｉ）誤った翻訳開始位置の分離された除去。

【0282】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と相当の配列同一性を呈するポリヌクレオチド、又は本明細書において規定されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、１つ以上のヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドに比べて、付加若しくは欠失若しくは異なるヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドを含む。この点に関し、当該技術分野において、参照ポリヌクレオチドに対し、変異、付加、欠失、及び置換を含むある特定の改変がなされ、改変されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能又は生物学的活性を保持し得ると十分に理解されている。

【0283】

ポリヌクレオチドバリアントは、生物学的に活性なポリペプチド断片又はバリアントをコードするポリヌクレオチド断片を含む。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド断片」という用語は、少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％の天然発生型ポリペプチド活性を保持するポリペプチドをコードする、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００以上のヌクレオチド長のポリヌクレオチド断片を指す。ポリヌクレオチド断片はアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、カルボキシ末端欠失、及び／若しくは内部欠失又は天然発生型若しくは組換え産生ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

【0284】

「配列同一性」、又は例えば「～に対して５０％同一の配列」を含む、という文章は、本明細書において使用される場合、比較ウィンドウ上で配列が、ヌクレオチドごとで同一である、又はアミノ酸ごとで同一である程度を指す。したがって、「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウ上の２つの最適アラインメント配列を比較すること、同一核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）又は同一アミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、及びＭｅｔ）が、両方の配列中に存在する位置の数を決定して、合致位置数を算出すること、合致位置数を、比較ウィンドウ中の総位置数（すなわちウィンドウサイズ）で割ること、及び結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を算出することにより計算されてもよい。本明細書に記載される参照配列のいずれかに対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド及びポリペプチドが含まれ、典型的には、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する。

【0285】

２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列関係を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、及び「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、長さが、少なくとも１２個の単量体単位であり、多くの場合、１５～１８個の単量体単位であり、多くの場合、少なくとも２５個の単量体単位である、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含む。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、及び（２）２つのポリヌクレオチド間で発散する配列を含んでもよく、２つの（又はそれ以上の）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」で比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、少なくとも６個の連続する位置、通常は、約５０～約１００、より一般的には約１００～約１５０の概念セグメントを指し、配列は、２つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続する位置の参照配列と比較される。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアラインメントのため、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して約２０％以下の付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。比較ウィンドウを整列するための配列の最適なアラインメントは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡにおけるアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化実行によって、又は選択された様々な方法のいずれかによって生成される検査及び最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたり最も高い相同性をもたらす）によって行われ得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９により開示されるプログラムのＢＬＡＳＴファミリーへの参照もなされ得る。配列解析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，１９９４－１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ１５のＵｎｉｔ １９．３に見出され得る。

【0286】

ポリヌクレオチドの配向を記載する用語には、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）及び３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の配向又は３’から５’の配向で注釈付けされ得る。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについて、５’から３’の鎖は、その配列が、プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるために、「センス」鎖、「プラス」鎖、又は「コード」鎖と指定される［ＤＮＡ中のチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡ中のウラシル（Ｕ）を除く］。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼによって転写された鎖である相補的な３’から５’鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、又は「非コード」鎖として指定される。本明細書で使用される場合、「逆配向」という用語は、３’から５’の方向に書かれた５’から３’の配列、又は５’から３’の方向に書かれた３’から５’の配列を指す。

【0287】

「相補的」及び「相補性」という用語は、塩基対形成規則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は、３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は、しばしば、５’末端が左に、３’末端が右にある、５’Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ ３’、逆相補体として記載される。その逆相補鎖と等しい配列は、パリンドローム配列であると言われる。相補性は、核酸塩基の一部のみが塩基対合規則に従って一致する、「部分的」であり得る。又は、核酸間には、「完全」又は「総合的な」相補性が存在し得る。

【0288】

更に、当業者であれば、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるポリペプチド又はそのバリアント断片をコードするヌクレオチド配列は多数存在することを認識するであろう。これらポリヌクレオチドのうちのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して、最小の相同性を担持する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差異によって変化するポリヌクレオチドが企図され、特定の実施形態では、例えば、ヒト及び／又は霊長類のコドン選択に最適化されたポリヌクレオチドが企図される。更に、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も使用され得る。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、及び／又は置換など、１つ以上の変異の結果として改変される内在性遺伝子である。

【0289】

本明細書で使用される場合、「核酸カセット」又は「発現カセット」という用語は、ＲＮＡを発現し、その後にポリペプチドを発現することができるベクター中の遺伝子配列を指す。一実施形態では、核酸カセットは、対象の遺伝子、例えば、対象のポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、核酸カセットは、１つ以上の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、及び例えば対象のポリヌクレオチドなどの対象の遺伝子を含む。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、ベクター内で位置的に、そして連続的に方向付けられる。それにより、カセット中の核酸はＲＮＡに転写されることができ、必要な場合にはタンパク質又はポリペプチドへと翻訳され、形質転換細胞での活動に必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内コンパートメントに標的化されることで生物活性に適したコンパートメントへと移行され、又は細胞外コンパートメントへと分泌されることができる。カセットは、ベクター内への即時の挿入に適合された３’末端及び５’末端を有することが好ましく、例えば、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有している。好ましい実施形態では、核酸カセットは、ＣＡＲ及び／又はＣＣＲをコードする。カセットは取り出され、単一ユニットとしてプラスミド又はウイルスベクター内に挿入されることができる。

【0290】

ポリヌクレオチドは、対象のポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「対象のポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチド、ポリペプチドバリアント、又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の目的のポリヌクレオチドを含んでもよい。ある特定の実施形態では、対象のポリヌクレオチドは、疾患又は傷害の治療又は予防において治療効果を提供するポリペプチドをコードする。対象のポリヌクレオチド、及びそれからコードされるポリペプチドは、野生型ポリペプチド、並びに機能的バリアント及び断片をコードする両方のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、対応する野生型参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、機能的バリアント又は断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％を有する。

【0291】

本明細書に企図されるポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書の他の箇所に開示されるか当該技術分野で既知である、プロモーター及び／又はエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、及び自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされてもよく、その結果、それらの全体的な長さが大幅に変動してもよい。したがって、ほぼ任意の長さのポリヌクレオチド断片が特定の実施形態で使用されてもよく、全長は、意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける調製及び使用の容易さによって制限されることが好ましい。

【0292】

ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知であり利用可能な様々な確立された技術のうちのいずれかを使用して調製され、操作され、かつ／又は発現されてもよい。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切なベクターに挿入されてもよい。

【0293】

ベクターの例示的な例としては、これらに限定されないが、プラスミド、自己複製配列、及び転位因子、例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｍｏｓ１、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ、Ｔｏｌ２、ｍｉｎｉ－Ｔｏｌ２、Ｔｃ３、ＭｕＡ、Ｈｉｍａｒ Ｉ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、及びその誘導体が挙げられる。

【0294】

ベクターの追加の例示的な例としては、限定するものではないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、例えば、ラムダファージ又はＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、及び動物ウイルスが挙げられる。

【0295】

ベクターとして有用なウイルスの例示的な例としては、限定するものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴型ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。

【0296】

発現ベクターの例示的な例には、これらに限定されないが、哺乳類細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳類細胞におけるレンチウイルス媒介性遺伝子導入及び発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、及びｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳類細胞でのポリペプチドの発現のために、そのような発現ベクター内にライゲーションされてもよい。

【0297】

特定の実施形態では、ベクターは、エピソームベクター、又は染色体外で維持されるベクターである。本明細書で使用される場合、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡ内に組み込むことなしに、及び宿主細胞の分裂により徐々に失われることなく複製することができるベクターを指し、当該ベクターは染色体外又はエピソームで複製することも意味する。

【0298】

発現ベクター中に存在する「制御エレメント」又は「制御配列」は、ベクターの非翻訳領域であり、複製起源、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ配列又はＫｏｚａｋ配列）、イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’の非翻訳領域が挙げられ、宿主の細胞タンパク質と相互作用して、転写と翻訳を実行する。こうしたエレメントは、その強度及び特異性において変化し得る。利用されるベクターシステム及び宿主に応じて、ユビキタスプロモーター及び誘導性プロモーターをはじめとする任意の数の好適な転写エレメント及び翻訳エレメントを使用してもよい。

【0299】

特定の実施形態では、ベクターは、これに限定されないが、発現ベクター及びウイルスベクターを含み、プロモーター及び／又はエンハンサーなどの外因性、内因性、又は異種制御配列を含む。「内因性」制御配列は、ゲノム中で所与の遺伝子と自然に連結される配列である。「外因性」制御配列は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指向されるように、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子と並立に配置されるものである。「異種」制御配列は、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。

【0300】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始及び転写する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞において作動されるプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴが豊富な領域を含み、かつ／又は転写の開始から７０～８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、式中、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る。

【0301】

「エンハンサー」という用語は、転写の増強を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指し、いくつかの場合では、別の制御配列に対する配向に関係なく機能することができる。エンハンサーは、プロモーター及び／又は他のエンハンサーエレメントと協働して、又は相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指す。

【0302】

「作動可能に連結した」という用語は、記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある並置を意味する。一実施形態では、用語は、核酸発現制御配列（プロモーター及び／又はエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、対象のポリヌクレオチドとの間の機能的結合を指し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指向する。

【0303】

本明細書で使用される場合、「構造的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結された配列の継続的な、又は連続的な転写を可能にするプロモーター、エンハンサー、又はプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、幅広い多様な細胞及び組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、若しくはプロモーター／エンハンサーであり得るか、又は制限された多様な細胞及び組織型それぞれにおける発現を可能にする、「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、若しくは「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、若しくはプロモーター／エンハンサーであり得る。

【0304】

特定の実施形態で使用するのに好適な例示的な遍在性発現制御配列としては、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期又は後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、及びＰ１１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核細胞翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータメンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（β－ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１４７７－１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、及び骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）Ｕ３プロモーター（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００３；７７（１７）：９４３９－９４５０）が挙げられる。

【0305】

一実施形態では、ベクターは、ＭＮＤＵ３プロモーターを含む。

【0306】

一実施形態では、ベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第１のイントロンを含むＥＦ１ａプロモーターを含む。

【0307】

一実施形態では、ベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第１のイントロンを欠くＥＦ１ａプロモーターを含む。

【0308】

本明細書で使用される場合、「条件付き発現」は、これらに限定されないが、誘導性発現、抑制可能な発現、特定の生理学的、生物学的、又は疾患状態などを有する細胞又は組織における発現を含む任意のタイプの条件付き発現を指し得る。この定義は、細胞型又は組織に特異的な発現を除外することは意図されない。ある特定の実施形態は、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす処理若しくは条件、又は対象のポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現の増加若しくは減少を引き起こす処理若しくは条件に供することによって発現が制御される、対象のポリヌクレオチドの条件発現を提供する。

【0309】

誘導性プロモーター／システムの例示的な例としては、これらに限定されないが、ステロイド誘導性プロモーター、例えばグルココルチコイド受容体又はエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター（対応するホルモンの処理で誘導可能）、メタロチオネインプロモーター（様々な重金属の処理で誘導可能）、ＭＸ－１プロモーター（インターフェロンで誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン制御性システム（Ｓｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クミン酸塩（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性制御システムなどが挙げられる。

【0310】

条件付き発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによっても達成され得る。ある特定の実施形態によれば、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えについて少なくとも１つの（典型的には２つの）部位を含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」又は「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、１つ以上の組換え部位（例えば、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、５０など）を含む組換え反応に関与する排他的又は組み込みタンパク質、酵素、補助因子又は関連タンパク質を含み、野生型タンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９－７０７（１９９３）を参照されたい）、又は変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列又はその断片を含む融合タンパク質）、断片及びそのバリアントであってもよい。特定の実施形態での使用に好適なリコンビナーゼの例示的な例には、これらに限定されないが、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、及びＰａｒＡが挙げられる。

【0311】

ベクターは、広範囲の部位特異的リコンビナーゼのいずれかに対して１つ以上の組換え部位を含んでもよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターの組み込みに必要とされる任意の部位に追加されることが理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「組換え配列」、「組換え部位」、又は「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識及び結合する特定の核酸配列を指す。

【0312】

例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの１つの組換え部位は、８塩基対コア配列に隣接する２つの１３塩基対逆位リピート（リコンビナーゼ結合部位として残る）を含む３４塩基対配列であるｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１－５２７（１９９４）の図１を参照されたい）。他の例示的なｌｏｘＰ部位としては、これらに限定されないが、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｂｅｔｈｋｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、及びｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）が挙げられる。

【0313】

ＦＬＰリコンビナーゼの好適な認識部位としては、これらに限定されないが、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９６）、Ｆ_１、Ｆ_２、Ｆ_３（Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ，１９９４）、Ｆ_４、Ｆ_５（Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９８８）が挙げられる。

【0314】

認識配列の他の例は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、及びａｔｔＲ配列であり、これはリコンビナーゼ酵素のλインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ－ｃ３１によって認識される。φＣ３１ ＳＳＲは、ヘテロタイプ部位のａｔｔＢ（３４ｂｐの長さ）とａｔｔＰ（３９ｂｐの長さ）との間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ａｔｔＢ及びａｔｔＰは、それぞれ細菌ゲノム及びファージゲノム上のファージインテグラーゼについての結合部位について名付けられ、両方とも、φＣ３１ホモ二量体によって結合される可能性のある不完全な逆方向反復を含む（Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。生成物部位、ａｔｔＬ及びａｔｔＲは、更にφＣ３１媒介性組換えに対して効果的に不活性（Ｂｅｌｔｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）であり、反応を不可逆的にする。挿入を触媒するために、ａｔｔＰ部位がゲノムａｔｔＢ部位に挿入するよりもａｔｔＢ担持ＤＮＡのほうが容易にゲノムａｔｔＰ部位に挿入されることが見出されている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｂｅｌｔｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。したがって、典型的な戦略は、相同組換えによって、ａｔｔＰ担持する「ドッキング部位」を定義された座位に位置付け、その後、挿入のためのａｔｔＢ担持ｉｎｃｏｍｉｎｇ配列と結合される。

【0315】

本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」又は「ＩＲＥＳ」とは、シストロン（タンパク質コード領域）の、ＡＴＧなどの開始コドンに内部リボソームが直接侵入することを促進し、キャップ非依存性の遺伝子翻訳を生じさせるエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７－８３）及びＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ １（１０）：９８５－１０００を参照されたい。特定の実施形態では、ベクターは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の対象のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、自己切断ポリペプチドをコードする１つ以上のＩＲＥＳ配列又はポリヌクレオチド配列によって分離され得る。一実施形態では、本明細書に企図されるポリヌクレオチドに使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳである。

【0316】

本明細書で使用される場合、「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、リボソーム小サブユニットへのｍＲＮＡの初期結合を大きく促進し、翻訳を増加させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号５７）であり、Ｒはプリン（Ａ又はＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３－９２、及びＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５－４８）。特定の実施形態では、ベクターは、所望のポリペプチド、例えば、ＣＡＲをコードするコンセンサスＫｏｚａｋ配列を有するポリヌクレオチドを含む。

【0317】

異種核酸転写物の効率的な終止とポリアデニル化を指向するエレメントは、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは、概して、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態では、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３′を含む。本明細書で使用される場合、「ポリＡ部位」又は「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって発生期のＲＮＡ転写物の終止及びポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリＡテールをコード配列の３’末端に付加することによってｍＲＮＡ安定性を促進することができ、したがって、翻訳効率の向上に寄与する。切断及びポリアデニル化は、ＲＮＡ中のポリ（Ａ）配列によって指向される。哺乳類プレｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断ポリアデニル化部位に隣接する２つの認識エレメントを有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡ六量体が、Ｕ残基又はＧＵ残基が豊富な、より可変性であるエレメントの上流２０～５０ヌクレオチドに存在する。初期転写物の切断はこれら２つのエレメントの間で発生し、５’切断産物に最大で２５０個のアデノシンが付加される。特定の実施形態では、コアポリ（Ａ）配列は、最良のポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０のポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ－グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、それらのバリアント、又は当該技術分野で既知の別の好適な異種又は内因性ポリＡ配列である。

【0318】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドを保有する細胞は、直接的な毒性及び／又は非制御増幅のリスクを低減するための誘導性自殺遺伝子をはじめとする自殺遺伝子を利用する。特定の態様では、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドを保有する宿主、又は細胞に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ－９又はカスパーゼ－８又はシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ－９は、二量体形成の特定の化学誘導物質（ＣＩＤ：ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を使用して活性化され得る。

【0319】

Ｇ．ベクター
ある特定の実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターによって細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）に導入される。特定の実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリシストロニックポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターによって細胞に導入される。特定の実施形態では、ＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及び抗ＣＣＲをコードする融合タンパク質をコードするポリシストロニックポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターによって細胞に導入される。

【0320】

「ベクター」という用語は、本明細書において、別の核酸分子を移送又は輸送することができる核酸分子を指すために使用される。移送された核酸は、一般的に、例えば、ベクター核酸分子に挿入される。ベクターは、細胞内で自己複製を指向する配列を含んでもよく、又は宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態では、非ウイルスベクターを使用して、本明細書で意図される１つ以上のポリヌクレオチドをＴ細胞に送達する。一実施形態では、ベクターは、ＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリシストロニックメッセージをコードするインビトロで合成又は合成的に調製されたｍＲＮＡである。

【0321】

一実施形態では、ベクターは、ＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質をコードするインビトロで合成又は合成的に調製されたｍＲＮＡである。

【0322】

非ウイルスベクターの例示的な例としては、これらに限定されないが、ｍＲＮＡ、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミド又はＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、及び細菌人工染色体が挙げられる。

【0323】

特定の実施形態に企図されるポリヌクレオチド又はベクターの非ウイルス性の送達の例示的な例としては、これらに限定されないが、エレクトロポレーション法、ソノポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、バイオリステック法、ウイロゾーム法、リポソーム法、免疫リポソーム法、ナノ粒子法、ポリカチオン又は脂質：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ法、人工ビリオン、ＤＥＡＥ－デキストラン介在移送、遺伝子銃、及びヒートショックが挙げられる。

【0324】

特定の実施形態に企図される特定の実施形態での使用に好適なポリヌクレオチド送達システムの例示的な例としては、これらに限定されないが、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．により提供されるシステムが挙げられる。リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体－認識リポフェクションに適したカチオン性脂質及び中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０－１８７、及びＢａｌａｚｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１－１２を参照されたい。抗体標的化送達、細菌誘導送達、非生物ナノセル系送達も特定の実施形態に企図される。

【0325】

様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、所望のポリペプチドを一過性に発現させるために細胞に導入されるｍＲＮＡである。本明細書で使用される場合、「一過性」とは、数時間、数日、又は数週間の期間にわたる非統合型導入遺伝子の発現を指し、発現期間は、細胞内のゲノムに組み込まれるか、又は安定的なプラスミドレプリコン内に含まれる場合、ポリヌクレオチドの発現期間よりも短い。

【0326】

特定の実施形態では、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、インビトロで転写されたｍＲＮＡである。本明細書で使用される場合、「インビトロで転写されたＲＮＡ」は、インビトロで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。概して、インビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから生成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡを生成するために使用されるテンプレートを含む。

【0327】

特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ若しくは修飾５’キャップ、及び／又はポリ（Ａ）配列を更に含み得る。本明細書で使用される場合、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７－メチルグアノシンキャップ、又はＲＮＡ ｍ^７Ｇキャップとも呼ばれる）は、転写開始の直後に真核性メッセンジャーＲＮＡの「前」又は５’末端に添加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第１の転写ヌクレオチドに連結され、リボソームによって認識され、ＲＮａｓｅから保護される末端基を含む。キャッピング部分は、翻訳の安定性又は効率など、ｍＲＮＡの機能を調節するように修飾され得る。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、約５０～約５０００個のアデニンのポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、約１００～約１０００塩基、約２００～約５００塩基、又は約３００～約４００塩基のポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、約６５塩基、約１００塩基、約２００塩基、約３００塩基、約４００塩基、約５００塩基、約６００塩基、約７００塩基、約８００塩基、約９００塩基、又は約１０００塩基以上のポリ（Ａ）配列を含む。ポリ（Ａ）配列は、局在化、安定性、又は翻訳の効率などのｍＲＮＡ機能を調節するために、化学的又は酵素的に修飾され得る。

【0328】

特定の実施形態に企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、個々の患者に投与することにより、典型的には以下に記載されるように全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は頭蓋内点滴）又は局所適用することによりインビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、動員（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）された末梢血、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検等）又はユニバーサルドナーの造血幹細胞などの細胞に生体外で送達されてもよく、その後、患者に細胞を再移植してもよい。

【0329】

一実施形態では、抗ＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与される。一実施形態では、ＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与される。あるいは、ネイキッドＤＮＡが投与されてもよい。投与は、これらに限定されないが、注射、注入、局所適用、及びエレクトロポレーションを含む、血液又は組織細胞との最終接触に分子を導入するために通常使用される任意の経路による。そのような核酸を投与する好適な方法は、利用可能でかつ当業者に周知であり、１つを超える経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、別の経路よりもより即時的かつより有効な反応を提供し得る場合が多い。

【0330】

本明細書に企図される特定の実施形態での使用に好適なウイルスベクター系の例示的な例には、これらに限定されないが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びワクシニアウイルスベクターが挙げられる。

【0331】

様々な実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリシストロニックメッセージをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又はＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質は、１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）で細胞を形質導入することによって、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に導入される。

【0332】

ＡＡＶは、小さな（約２６ｎｍ）複製欠損、主に、エピソーム非エンベロープで覆われたウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は典型的には、最小で導入遺伝子とその制御配列、並びに５’及び３’のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）から構成される。ＩＴＲ配列は約１４５ｂｐの長さである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶ１０から単離されたＩＴＲ及びカプシド配列を含む。

【0333】

いくつかの実施形態では、キメラｒＡＡＶが使用される。ＩＴＲ配列は、１つのＡＡＶ血清型から単離され、カプシド配列は別のＡＡＶ血清型から単離される。例えば、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列及びＡＡＶ６由来のカプシド配列を含むｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と呼ばれる。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶ１０のうちのいずれか１つに由来するカプシドタンパク質とを含み得る。好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列及びＡＡＶ６由来のカプシド配列を含む。好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列及びＡＡＶ２由来のカプシド配列を含む。

【0334】

いくつかの実施形態では、操作及び選択の方法をＡＡＶカプシドに適用して、それらが対象の細胞に形質導入される可能性を高めることができる。

【0335】

ｒＡＡＶベクターの構築、その産生、及び精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号、第９，１６９，４９２号、第９，０１２，２２４号、第８，８８９，６４１号、第８，８０９，０５８号、及び第８，７８４，７９９号に開示されており、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0336】

様々な実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリシストロニックメッセージをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又はＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質は、レトロウイルス、例えば、１つ以上のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスで細胞を形質導入することによって、免疫エフェクター細胞に導入される。

【0337】

本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖２本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態での使用に好適な例示的なレトロウイルスには、これらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、並びにレンチウイルスが含まれる。

【0338】

本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（又は属）を指す。例示的なレンチウイルスには、これらに限定されないが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２を含む）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、カプリン関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。一実施形態では、ＨＩＶを基にしたベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用配列エレメント）が好ましい。

【0339】

様々な実施形態では、本明細書に企図されるレンチウイルスベクターは、１つ以上のＬＴＲ、及び以下のアクセサリーエレメント：ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、輸出エレメント、ポリ（Ａ）配列のうちの１つ以上又は全てを含み、任意選択で、本明細書において別段に検討されるように、ＷＰＲＥ又はＨＰＲＥ、インシュレーター因子、選択マーカー、及び細胞自殺遺伝子を含み得る。

【0340】

特定の実施形態では、本明細書に企図されるレンチウイルスベクターは、組み込み的、又は非組み込み、又は組み込み欠損レンチウイルスであり得る。本明細書で使用される場合、「組み込み欠損レンチウイルス」又は「ＩＤＬＶ」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む能力を欠いているインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組み込み－インコンピテントウイルスベクターは、特許出願ＷＯ２００６／０１０８３４に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0341】

インテグラーゼ活性を低減するのに好適なＨＩＶ－１ ｐｏｌ遺伝子における例示的な変異には、これらに限定されないが、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、及びＫ２６４Ｈが挙げられる。

【0342】

一実施形態では、ＨＩＶ－１インテグラーゼ欠失ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｅ１５２Ｇ、若しくはＥ１５２Ａ変異、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、及びＥ１５２Ｇ変異、又はＤ６４Ｖ、Ｄ１１６Ａ、及びＥ１５２Ａ変異を含む。

【0343】

一実施形態では、ＨＩＶ－１インテグラーゼ欠失ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ変異を含む。

【0344】

「長末端反復（ＬＴＲ：ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指し、本来の配列ではＬＴＲはダイレクトリピートであり、Ｕ３、Ｒ及びＵ５領域を含む。

【0345】

本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」又は「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、配列が、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ－１又はＨＩＶ－２の中央ポリプリン区域及び中央終止配列（ｃＰＰＴ及びＣＴＳ）を含む核酸を指す。好適なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号及びＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴ及び／又はＣＴＳエレメント中の１つ以上の変異を有するＦＬＡＰエレメントを含む。更に別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴ又はＣＴＳエレメントのいずれかを含む。更に別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴ又はＣＴＳエレメントを含まない。

【0346】

本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」又は「パッケージング配列」という用語は、ウイルスＲＮＡをウイルスカプシド又は粒子に挿入するのに必要とされる、レトロウイルスゲノム内に位置するｐｓｉ［Ψ］配列を指す。例えば、Ｃｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１－２１０９を参照されたい。

【0347】

「輸出エレメント」という用語は、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ輸出エレメントの例としては、これらに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｒｅｖ反応性エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、及びＣｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ ５８：４２３を参照されたい）及びＢ型肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられる。

【0348】

特定の実施形態では、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、及び任意選択で、転写終止シグナルをベクターに組み込むことによって増加される。様々な転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）、及び同様のもの（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９：１７６６）は、タンパク質における異種核酸の発現を増加し得る。

【0349】

レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲの修飾の結果としていくつかの安全性の増強を含む。「自己不活化」（ＳＩＮ：ｓｅｌｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ベクターとは、複製欠損ベクターを指し、例えば、右（３’）ＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域はＵ３領域として知られているが、この領域が（例えば、欠失又は置換により）修飾されて、ウイルス複製の最初のラウンドを超えたウイルス転写が阻害される。追加的な安全性の増強は、５’ＬＴＲのＵ３領域を、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を誘導する異種プロモーターと置き換えることで提供される。使用され得る異種プロモーターの例には、例えば、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、早期又は後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最早期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられ得る。

【0350】

本明細書で使用される場合、「シュードタイプ」又は「シュードタイピング」という用語は、好ましい特性を有する別のウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で置換されているウイルスエンベロープタンパク質を有するウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧ－タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質を用いてシュードタイピングされ得、これにより、ＨＩＶがより広い範囲の細胞に感染することが可能になるが、これは、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）が、通常、ウイルスの標的をＣＤ４^＋提示細胞とするためである。

【0351】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、既知の方法により産生される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２－６７５０－９－１０、Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５－５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。

【0352】

本明細書に企図されるある特定の実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列のほとんど又は全てが、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ－１に由来する。しかしながら、レトロウイルス及び／若しくはレンチウイルス配列の多くの異なる源を使用することができるか、又はある特定のレンチウイルス配列の組み合わせられた多数の置換及び改変が、移入ベクターの本明細書に記載される機能を行う能力を損なうことなく適応され得ることが理解されるべきである。更に、様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野で既知である。Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、及び１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号、及び第５，９９４，１３６号を参照されたく、それらの多くが、本明細書に企図されるウイルスベクター又はトランスファープラスミドの産生に適合され得る。

【0353】

様々な実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリシストロニックメッセージをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又はＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質は、１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで細胞を形質導入することによって、免疫エフェクター細胞に導入される。

【0354】

アデノウイルスを基にしたベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そうしたベクターを用いることで、高力価及び高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に産生され得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、及び／又はＥ３遺伝子を置き換えるように操作され、その後、トランスで欠失した遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞において、複製欠損ベクターが増殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、及び筋肉に見出されるものなどの非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入し得る。従来のＡｄベクターは、高い運搬能力を有する。

【0355】

複製欠損である現行のアデノウイルスベクターの生成及び増殖は、Ａｄ５ ＤＮＡ断片によってヒト胎児腎臓細胞から形質転換されて、Ｅ１タンパク質を構造的に発現する２９３と呼ばれる固有のヘルパー細胞株を利用し得る（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムには不必要であるため（Ｊｏｎｅｓ＆Ｓｈｅｎｋ，１９７８）、現行のアデノウイルスベクターは、２９３細胞を利用して、Ｅ１、Ｄ３、又は両方のいずれかの領域に外来ＤＮＡを運搬する（Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核性遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｇｏｍｅｚ－Ｆｏｉｘ ｅｔ ａｌ．，１９９２）及びワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ＆Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２、Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）において使用されている。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与した研究には、気管点滴（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚ＆Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、及び脳内への定位接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３）が含まれる。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－９（１９９８））。

【0356】

様々な実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリシストロニックメッセージをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又はＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質は、単純ヘルペスウイルス、例えば、１つ以上のポリヌクレオチドを含むＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２で細胞を形質導入することによって、免疫エフェクター細胞に導入される。

【0357】

成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである直鎖２本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを含むエンベロープで覆われた二十面体カプシドからなる。一実施形態では、ＨＳＶを基にしたウイルスベクターは、１つ以上の必須又は非必須ＨＳＶ遺伝子において欠損している。一実施形態では、ＨＳＶを基にしたウイルスベクターは、複製欠損である。ほとんどの複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を防ぐために１つ以上の最早期、早期、又は後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含む。例えばＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される最早期遺伝子が欠損であり得る。ＨＳＶベクターの利点は、長期間のＤＮＡ発現をもたらし得る潜伏期に入る能力、及び最大２５ｋｂの外因性ＤＮＡを収容し得るその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶを基にしたベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、第５，８４６，７８２号、及び第５，８０４，４１３号、並びに国際特許出願第ＷＯ９１／０２７８８号、第ＷＯ９６／０４３９４号、第ＷＯ９８／１５６３７号、及び第ＷＯ９９／０６５８３号において記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0358】

Ｈ．遺伝子修飾された細胞
様々な実施形態では、がんの治療における使用のために、本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲを発現するように遺伝子修飾された細胞が提供される。本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」又は「遺伝子修飾された」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡの形態の追加的な遺伝物質を、細胞中の総遺伝物質に加えることを指す。「遺伝子修飾された細胞」、「修飾細胞」、及び「再指向された細胞」という用語は、相互交換可能に使用される。本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、遺伝子の発現を回復するか、修正するか、又は修飾する細胞において、又はＣＡＲ及びＣＣＲ、若しくはＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を発現させる目的で、余剰な遺伝物質を総遺伝物質にＤＮＡ又はＲＮＡの形態で導入することを指す。

【0359】

特定の実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲ、又は本明細書に企図されるＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質は、対象の標的抗原にそれらの特異性を再指向するように、免疫エフェクター細胞に導入及び発現される。「免疫エフェクター細胞」は、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性の細胞殺傷活性、サイトカイン分泌、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣの誘導など）を有する免疫系の任意の細胞である。本明細書に企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、これらに限定されないが、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、及びヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）を含む、Ｔリンパ球である。特定の実施形態では、細胞は、αβ Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、細胞は、γδ Ｔ細胞を含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。

【0360】

免疫エフェクター細胞は、自己又は非自己（ｎｏｎ－ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）（非自己（ｎｏｎ－ｓｅｌｆ）、例えば、同種、同系、又は異種）であってもよい。本明細書で使用される場合、「自己」とは、同じ対象に由来する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同種」とは、比較した細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同系」とは、比較した細胞と遺伝的に同一である、異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「異種」とは、比較した細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、細胞は自己である。

【0361】

特定の実施形態に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲと使用される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含む。「Ｔ細胞」又は「Ｔリンパ球」という用語は、当該技術分野において認識されており、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、又は活性化Ｔリンパ球を含むよう意図される。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）又はＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞、又はＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。特定の実施形態での使用に好適な他の例示的なＴ細胞の集団としては、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、Ｔメモリー幹細胞（ＴＳＣＭ）、中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、及びエフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）が挙げられる。

【0362】

当業者によって理解されるように、他の細胞も本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲを有する免疫エフェクター細胞として使用され得る。特に、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球及びマクロファージも含む。免疫エフェクター細胞は、エフェクター細胞の前駆体も含み、このような前駆細胞は、インビボ又はインビトロで免疫エフェクター細胞に分化するように誘導されてもよい。したがって、特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、例えば、臍帯血、骨髄又は動員末梢血に由来する細胞のＣＤ３４＋集団内に含まれる造血幹細胞（ＨＳＣ）などの免疫エフェクター細胞の前駆体を含み、それらは対象に投与されたときに成熟免疫エフェクター細胞へと分化し、又はインビトロで誘導されて成熟免疫エフェクター細胞へと分化してもよい。

【0363】

本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４」とは、細胞－細胞接着因子として作用することが多く、リンパ節へのＴ細胞の侵入に関与する細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋細胞集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を含み、ＨＳＣは患者に投与されたときに分化し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、及び単球／マクロファージ系統の細胞を含む全ての造血系に寄与する。

【0364】

本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲを発現する免疫エフェクター細胞を作製する方法が、特定の実施形態に提供される。一実施形態では、方法は、免疫エフェクター細胞がＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリシストロニックメッセージ、又は本明細書に企図されるＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を発現するように、個体から単離された免疫エフェクター細胞をトランスフェクト又は形質導入することを含む。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、インビトロでの更なる操作を伴わずに個体から単離され、及び遺伝子修飾される。次いで、そのような細胞を個体に直接再投与してもよい。更なる実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲ及びＣＣＲを発現するように遺伝子修飾される前に、まずインビトロで増殖するように活性化され、刺激される。この点に関して、免疫エフェクター細胞は、遺伝子修飾の前及び／又は後に培養されてもよい（すなわち、本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲを発現するように形質導入又はトランスフェクトされる）。

【0365】

特定の実施形態では、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞のインビトロでの操作又は遺伝子修飾の前に、細胞源が対象から得られる。特定の実施形態では、修飾された免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。

【0366】

特定の実施形態では、ＰＢＭＣは、本明細書に企図される方法を使用して、ＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリシストロニックメッセージ、又はＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を発現するように、直接遺伝子修飾されてもよい。ある特定の実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、Ｔリンパ球を更に単離し、ある特定の実施形態では、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球の両方を、遺伝子修飾及び／又は増殖の前又は後のいずれかに、ナイーブ、メモリー、及びエフェクターＴ細胞亜集団に保存することができる。

【0367】

Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、既知の方法を使用して単離後に遺伝子修飾され得るか、又は遺伝子修飾される前に、インビトロで免疫エフェクター細胞を活性化及び拡張（又は前駆細胞の場合に分化）させることができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書に企図されるキメラ抗原受容体で遺伝子修飾され（例えば、ＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリシストロニックメッセージをコードする核酸、又はＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を含むウイルスベクターで形質導入される）、その後、インビトロで活性化及び拡張される。様々な実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号、及び米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号に記載されるような方法を使用して、遺伝子修飾の前又は後に活性化及び拡張することができる。

【0368】

一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、本明細書に企図される核酸構築物で形質導入される。ある特定の実施形態では、形質導入されたＣＤ３４＋細胞は、概して、細胞が本来単離された対象である対象に投与後、インビボで成熟免疫エフェクター細胞に分化される。別の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、以前に記載される方法（Ａｓｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｉｍｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００４）に従って、以下のサイトカイン：Ｆｌｔ－３リガンド（ＦＬＴ３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球成長及び分化因子（ＴＰＯ）、ＩＬ－３及びＩＬ－６のうちの１つ以上への曝露前又はそれにより遺伝子修飾された後にインビトロで刺激されてもよい。

【0369】

特定の実施形態では、がんの治療のための修飾された免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲを含む。例えば、修飾された免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に記載されるＢ細胞悪性腫瘍と診断された患者（自己ドナー）から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋であり得るＴリンパ球の異種集団を形成する。

【0370】

ＰＢＭＣはまた、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞などの他の細胞傷害性リンパ球を含み得る。特定の実施形態に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲのコード配列を担持する発現ベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞集団に導入される。特定の実施形態では、発現ベクターを担持する形質導入に成功したＴ細胞は、フローサイトメトリーを使用して選別され、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離し、次いで更に増殖されて、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体、並びにＩＬ－２を使用した細胞活性化、又は、本明細書の別に記載される当該技術分野で既知の任意の他の方法に加えて、これらのＣＡＲ及びＣＣＲ発現Ｔ細胞の数を増加させることができる。標準的な手順は、ヒト対象における使用のための保存及び／又は調製のためのＴ細胞の凍結保存に使用される。一実施形態では、Ｔ細胞のインビトロ形質導入、培養、及び／又は増殖は、胎児仔ウシ血清及び胎児ウシ血清などの非ヒト動物由来産物の不在下で実施される。ＰＢＭＣの異種集団が遺伝子修飾されるため、結果として生じる形質導入細胞は、ＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリシストロニックメッセージ、又は本明細書に企図されるＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む修飾された細胞の異種集団である。

【0371】

更なる実施形態では、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の異なる発現ベクターの混合物を、免疫エフェクター細胞のドナー集団を遺伝子修飾する際に使用することができ、各ベクターは、本明細書に企図される異なるキメラ抗原受容体タンパク質をコードする。結果として生じる修飾された免疫エフェクター細胞は、修飾された細胞の混合集団を形成する。

【0372】

Ｉ．Ｔ細胞製造方法
様々な実施形態では、遺伝子修飾されたＴ細胞は、ＣＤ３ ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤、及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとの接触によって拡張される。

【0373】

特定の実施形態では、ＰＢＭＣ、又は単離Ｔ細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及び／又はＩＬ－１５などの適切なサイトカインを含む培養培地中で、可溶性抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又はビーズ若しくは他の表面上に結合された抗体などの刺激剤及び共刺激剤と接触する。

【0374】

特定の実施形態では、ＰＢＭＣ、又は単離Ｔ細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及び／若しくはＩＬ－１５などの適切なサイトカイン並びに／又はＰＩ３Ｋ阻害剤を含む培養培地中で、可溶性抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又はビーズ若しくは他の表面上に結合された抗体などの刺激剤及び共刺激剤と接触する。

【0375】

一実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、本明細書に企図されるＴ細胞製造方法においてＴ細胞の供給源として使用される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋であり得るＴリンパ球の異種の集団を形成し、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞などの他の単核細胞を含み得る。ＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリシストロニックメッセージをコードするポリヌクレオチド、又は特定の実施形態に企図されるＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を含む発現ベクターが、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞の集団に導入される。特定の実施形態では、発現ベクターを担持する形質導入に成功したＴ細胞は、フローサイトメトリーを使用して選別され、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離し、次いで更に増殖されて、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体、並びにＩＬ－２、ＩＬ－７、及び／又はＩＬ－１５を使用した細胞活性化に加えて、これらの修飾されたＴ細胞の数を増加させることができる。

【0376】

Ｔ細胞組成物の十分な治療用量を達成するために、しばしばＴ細胞に、１つ以上のラウンドの刺激、活性化、及び／又は拡張が行われる。Ｔ細胞は、一般的に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、及び第６，８６７，０４１号に記載されるように方法を使用して活性化及び拡張することができ、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0377】

好ましい実施形態では、本明細書に企図される方法によって製造されるＴ細胞は、改善された養子免疫療法組成物を提供する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本明細書に企図される特定の実施形態の方法によって製造されたＴ細胞組成物は、生存率の増加、分化の相対的非存在下での増殖、及びインビボでの持続性を含む、優れた特性を有すると考えられる。一実施形態では、Ｔ細胞を製造する方法は、細胞を、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤と接触させることを含む。

【0378】

特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞を刺激して活性化し、１つ以上の刺激シグナル及び任意選択でＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で増殖させることによって製造される。

【0379】

次いで、Ｔ細胞は、ポリシストロニックメッセージＣＡＲ及びＣＣＲ、又はＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を発現するように修飾され得る。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲ及びＣＣＲをコードするポリシストロニックメッセージ、又は本明細書に企図されるＣＡＲ、２Ａ自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を含むウイルスベクターでＴ細胞を形質導入することによって修飾される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、刺激及び活性化の前に修飾される。別の実施形態では、Ｔ細胞は、刺激及び活性化後に修飾される。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、刺激及び活性化の１２時間、２４時間、３６時間、又は４８時間以内に修飾される。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下又は不在下で活性化、刺激、及び／又は修飾される。

【0380】

Ｔ細胞を形質導入及び／又は編集した後、細胞を培養して増殖させる。Ｔ細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、又は７日間、少なくとも２週間、少なくとも１、２、３、４、５、又は６ヵ月以上、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回以上のラウンドの増殖で培養されてもよい。特定の実施形態では、Ｔ細胞を培養して増殖させる。

【0381】

様々な実施形態では、Ｔ細胞組成物は、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で製造される。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、製造プロセスの刺激、活性化、及び／又は拡張期うちのいずれか１つ、それらの任意の組み合わせ、又は全ての間に、Ｔ細胞を、ＰＩ３Ｋ経路の１つ以上の阻害剤と処置又は接触させることは、若いＴ細胞を優先的に増加させ、それによって優れた治療用Ｔ細胞組成物を産生することになる。

【0382】

本明細書で使用される場合、「ＰＩ３Ｋ阻害剤」という用語は、核酸、ペプチド、又はＰＩ３Ｋの少なくとも１つの活性に結合し、かつ阻害する小さな有機分子を指す。ＰＩ３Ｋタンパク質は、クラス１のＰＩ３Ｋ、クラス２のＰＩ３Ｋ、及びクラス３のＰＩ３Ｋの３つのクラスに分けることができる。クラス１のＰＩ３Ｋは、４つのｐ１１０触媒サブユニット（ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γ）のうちの１つと、２つの制御サブユニットファミリーのうちの１つとからなるヘテロ二量体として存在する。ＰＩ３Ｋ阻害剤は、好ましくはクラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤を標的とする。一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤の１つ以上のアイソフォームに対する選択性を示す（すなわち、ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γ又はｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γのうちの１つ以上に対する選択性）。別の実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はアイソフォーム選択性を示さず、「汎ＰＩ３Ｋ阻害剤」とみなされる。一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ触媒ドメインへのＡＴＰとの結合について競合する。

【0383】

ある特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、例えば、ＰＩ３Ｋ、並びにＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路中の追加のタンパク質を標的とすることができる。特定の実施形態では、ｍＴＯＲ及びＰＩ３Ｋの両方を標的とするＰＩ３Ｋ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤又はＰＩ３Ｋ阻害剤のいずれかと呼んでもよい。ＰＩ３Ｋのみを標的とするＰＩ３Ｋ阻害剤は、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤と呼んでもよい。一実施形態では、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤は、経路中のｍＴＯＲ及び／又は他のタンパク質に関して、阻害剤のＩＣ５０よりも少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、又はそれ以上低い、ＰＩ３Ｋに関して５０％の阻害濃度を示す薬剤を指すと理解され得る。

【0384】

特定の実施形態では、例示的なＰＩ３Ｋ阻害剤は、約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎｍ以下、更により好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ以下であるＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）でＰＩ３Ｋを阻害する。一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、約２ｎＭ～約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ～約５０ｎＭ、更により好ましくは約２ｎＭ～約１５ｎＭのＩＣ５０を用いてＰＩ３Ｋを阻害する。

【0385】

特定の実施形態に企図されるＴ細胞製造方法での使用に好適なＰＩ３Ｋ阻害剤の例には、これらに限定されないが、ＢＫＭ１２０（クラス１ ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ１４７（クラス１ ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、（汎ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、及びＰＸ－８６６（クラス１ ＰＩ３Ｋ阻害剤、ｐ１１０α、ｐ１１０β、及びｐ１１０γアイソフォーム、Ｏｎｃｏｔｈｙｒｅｏｎ）が含まれる。

【0386】

選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤のその他の例示的な例としては、これらに限定されないが、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ－２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ－１０１、ＺＳＴＫ４７４、及びＩＰＩ－１４５が挙げられる。

【0387】

汎ＰＩ３Ｋ阻害剤の更なる例示的な例としては、これらに限定されないが、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＳＫ１０５９６１５、ＴＧ１００７１３、及びＧＤＣ－０９４１が挙げられる。

【0388】

好ましい実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＺＳＴＫ４７４である。

【0389】

特定の実施形態では、操作されたＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の増殖を増加させる方法が提供される。そのような方法は、例えば、対象からＴ細胞源を採取すること、Ｔ細胞を刺激及び活性化すること、ＣＡＲ及びＣＣＲを発現するためのＴ細胞の修飾、並びに培地においてＴ細胞を拡張することを含み得、Ｔ細胞は、製造プロセスのより多くのステップのうちのいずれか１つにおいて１つ以上のＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で製造される。

【0390】

本明細書に企図される製造方法は、ヒト対象における使用のための保存及び／又は調製のための修飾されたＴ細胞の凍結保存を更に含んでもよい。一実施形態では、遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞を保存する方法は、細胞を解凍時に生存可能なままにするように、免疫エフェクター細胞を凍結保存することを含む。Ｔ細胞は、解凍時に細胞が生存し続けるように凍結保存される。必要に応じて、凍結保存され、形質転換した細胞を解凍し、増殖させ、より多くのそのような細胞に対して拡張させることができる。本明細書で使用される場合、「凍結保存」とは、（典型的には）７７Ｋ又は－１９６℃（液体窒素の沸点）など、ゼロ以下の温度に冷却することによって細胞を保存することを指す。凍結保存剤は、保存されている細胞を低温での凍結又は室温への加熱により損傷しないように、ゼロ以下の温度で使用されることが多い。凍結保存剤及び最適な冷却速度は、細胞損傷から保護することができる。使用され得る凍結保護剤としては、これらに限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ，Ｎａｔｕｒｅ，１９５９；１８３：１３９４－１３９５、Ａｓｈｗｏｏｄ－Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６１；１９０：１２０４－１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリジン（Ｒｉｎｆｒｅｔ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９６０；８５：５７６）、及びポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ ａｎｄ Ｒａｖｄｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６２；１９６：４８）が含まれる。好ましい冷却速度は、１℃～３℃／分である。少なくとも２時間後、Ｔ細胞は、－８０℃の温度に達し、長期低温貯蔵容器など、永久保存のために液体窒素（－１９６℃）に直接配置することができる。

【0391】

Ｊ．組成物及び製剤
特定の実施形態では、薬学的に許容される担体溶液の製剤は、当該技術分野で周知であり、例えば、腸内及び非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、脳室内、大脳内、頭蓋内、髄腔内、クモ膜下腔内、及び髄内の投与並びに製剤を含む様々な治療レジメンにおける、本明細書に記載される特定の組成物の使用に関する好適な投薬レジメン及び治療レジメンの開発も同様である。当業者であれば、本明細書に企図される特定の実施形態は、例えば、薬学分野で周知であり、かつ例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌｕｍｅ Ｉ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ．２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ Ｊｒ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；２０１２に記載される製剤などの他の製剤を含み得ることを理解するであろう。

【0392】

本明細書に企図される組成物は、本明細書に企図される１つ以上のＣＡＲポリペプチド、ＣＣＲポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞などを含み得る。組成物としては、これに限定されないが、薬学的組成物が挙げられる。好ましい実施形態では、組成物は、ＣＡＲ及びＣＣＲを発現するように修飾された１つ以上の細胞；ＣＡＲ、自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質；又はＣＡＲ、自己切断ポリペプチド、及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を含む。

【0393】

「薬学的組成物」とは、細胞又は動物への投与に対し、薬学的に許容される溶液又は生理学的に許容される溶液中で、単独で、又は１つ以上の他の治療モダリティと併用されて製剤化される組成物を指す。所望の場合には、組成物は、例えば、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、低分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬剤、抗体、又は他の様々な薬学的に活性な剤などの他の剤も同様に併用されて投与され得ることも理解されたい。事実上、組成物に含まれ得る他の構成要素に制限はないが、追加される剤は、意図される療法を送達する組成物の能力に有害な影響を与えないものとする。好ましい実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤、並びにＣＡＲ及びＣＣＲ、又はＣＡＲ及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を発現するように修飾された１つ以上の細胞を含む。

【0394】

本明細書において、「薬学的に許容される」という文言は、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織と接触して使用することに適し、合理的な利益／リスク比に見合った、それら化合物、物質、組成物及び／又は剤型を指すために採用される。

【0395】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤」は、限定するものではないが、ヒト又は家畜での使用に許容されるものとして米国食品医薬品局によって承認されている、アジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、染料／着色剤、香味剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、又は乳化剤を含む。例示的な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、ラクトース、グルコース、及びショ糖などの糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、並びにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガカンス；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター、ワックス、動物及び植物性脂肪、パラフィン、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウレートエチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；並びに薬学的製剤に用いられる任意の他の適合物質が挙げられる。

【0396】

特定の実施形態では、組成物は、本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲ発現免疫エフェクター細胞の量を含む。本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益又は所望の予防又は治療結果を達成するために、遺伝子修飾された治療用細胞、例えば、Ｔ細胞などの「有効な量」又は「有効量」を指す。

【0397】

「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために有効な遺伝子修飾された治療用細胞の量を指す。必ずではないが典型的には、予防的投与量は、疾患の早期ステージの前、又は早期ステージの対象において使用されるため、予防的有効量は、治療有効量よりも少ない。

【0398】

遺伝子修飾された治療用細胞の「治療有効量」は、個体の病態、年齢、性別、及び体重などの因子、並びに個体において所望の応答を引き出す幹細胞及び前駆細胞の能力に応じて変化し得る。治療有効量はまた、ウイルス又は形質導入された治療用細胞の任意の毒性又は有害な影響を、治療上有益な効果が上回るものである。「治療有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療する」のに有効な量を含む。治療的な量が示されている場合、投与される組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染又は転移の程度、及び状態における個々の差を考慮し、医師により決定され得る。

【0399】

一般的に、本明細書に記載されるＴ細胞を含む薬学的組成物は、１０２～１０１０細胞／体重ｋｇ、好ましくは１０５～１０６細胞／体重ｋｇの用量で、その範囲内の全ての整数値を含み、投与され得ると言える。細胞数は、組成物の意図される最終用途、組成物中に含まれる細胞のタイプに依存する。本明細書において提示される用途に関し、細胞は一般的に、リットル以下の量であり、５００ｍＬ以下、更には２５０ｍＬ又は１００ｍＬ以下であり得る。ゆえに所望される細胞の密度は、多くの場合、１０６細胞／ｍｌ超であり、一般的には、１０７細胞／ｍｌ超、一般的には１０８細胞／ｍｌ以上である。臨床的に関連する免疫細胞数は、複数回の点滴に分けられてもよく、累積的には１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１又は１０１２細胞以上となる。いくつかの態様では、具体的には注入される全細胞は特定の標的抗原へと再指向されるため、１０６／キログラム（患者当たり１０６～１０１１）の範囲の少ない数の細胞が投与される場合がある。組成物は、これらの範囲内の用量で複数回投与されてもよい。細胞は、療法を受けている患者にとって同種、同系、異種、又は自己であってもよい。望ましい場合、治療は、本明細書に記載されるようにマイトージェン（例えば、ＰＨＡ）又はリンホカイン、サイトカイン及び／若しくはケモカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１８、及びＴＮＦ－ベータ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与も含み、免疫反応の誘導を強化してもよい。

【0400】

一般的に、本明細書に記載されるように活性化及び拡張された細胞を含む組成物は、免疫不全状態の個体で生じる疾患の治療及び予防に活用されてもよい。特定の実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲを発現するように修飾された免疫エフェクター細胞、又は本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を含む組成物は、がんの治療に使用される。修飾された免疫エフェクター細胞は、単独で投与されてもよく、又は担体、希釈剤、賦形剤を併用した薬学的組成物として、及び／又は例えばＩＬ－２若しくは他のサイトカイン若しくは他の細胞集団などの他の構成要素を併用した薬学的組成物として投与されてもよい。特定の実施形態では、薬学的組成物は、遺伝子修飾されたＴ細胞の量を、１つ以上の薬学的若しくは生理学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と併用して含む。

【0401】

ＣＡＲ及びＣＣＲを発現するように修飾された免疫エフェクター細胞集団、又はＴ細胞などのＣＡＲ及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を含む薬学的組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸；抗酸化物質；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；防腐剤を含み得る。組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内又は動脈内）腹腔内又は筋肉内投与のために製剤化されることが好ましい。

【0402】

液体薬学的組成物は、溶液、懸濁液、又は他の類似の形態であるかどうかにかかわらず、以下：注射用水、生理食塩水、好ましくは生理食塩液、リンガー液、等張食塩水、溶媒又は懸濁媒として役立ち得る合成モノ又はジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化物質；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの等張性の調整のための薬剤、のうちの１つ以上を含み得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、又はガラス若しくはプラスチックで作製された複数回用量バイアルに封入され得る。注射用薬学的組成物は、滅菌であることが好ましい。

【0403】

一実施形態では、本明細書に企図されるＴ細胞組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地中で製剤化される。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清培地である。

【0404】

無血清培地は、血清含有培地を超える利点をいくつか有しており、単純でより明確な組成物、汚染物質量の低下、感染性実体の源となる可能性の排除、及びコスト低下が挙げられる。様々な実施形態では、無血清培地は、動物質を含まず、任意で無タンパク質であってもよい。任意選択で、培地はバイオ医薬品的に受容可能な組換えタンパク質を含み得る。「動物質を含まない」培地とは、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中で天然動物性タンパク質を置き換え、その栄養素は合成、植物又は微生物の源から得られる。「タンパク質を含まない」培地は、対照的に、実質的にタンパク質を含まないと規定される。

【0405】

特定の組成物において使用される無血清培地の例示としては限定されないが、ＱＢＳＦ－６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＸ－ＶＩＶＯ １０が挙げられる。

【0406】

好ましい一実施形態では、本明細書に企図される免疫エフェクター細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む溶液中で製剤化される。

【0407】

別の好ましい実施形態では、本明細書に企図される免疫エフェクター細胞を含む組成物は、凍結保存媒体を含む溶液中で製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地を使用して、融解後の高い細胞活性成績を維持してもよい。特定の組成物において使用される凍結保存培地の例示としては、これらに限定されないが、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、及びＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２が挙げられる。

【0408】

より好ましい実施形態では、本明細書に企図される免疫エフェクター細胞を含む組成物は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０に対してＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを５０：５０で含む溶液中で製剤化される。

【0409】

特定の実施形態では、組成物は、ＣＡＲ及びＣＣＲを発現するように修飾された有効量の免疫エフェクター細胞、又はＣＡＲ及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を、単独で又は１つ以上の治療剤と組み合わせて含む。したがって、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞組成物は、単独で、又は放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光力学的療法などの他の既知のがん治療と組み合わせて投与されてもよい。組成物は、抗生物質と併用して投与されてもよい。そのような治療剤は、例えば、特定のがんなどの本明細書に記載の特定の疾患状態に対する標準治療として当該技術分野において承認されている場合がある。企図される治療剤の例としては、特定の実施形態では、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法、治療用抗体、又は他の活性で補助的な剤が挙げられる。

【0410】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲを発現するように修飾された免疫エフェクター細胞、又はＣＡＲ及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と併せて投与され得る。

【0411】

様々な他の治療剤が、本明細書に記載される組成物と併せて使用されてもよい。一実施形態では、免疫エフェクター細胞、ＣＡＲ及びＣＣＲ、又はＣＡＲ及びＣＣＲをコードする融合タンパク質を含む組成物は、抗炎症剤とともに投与される。

【0412】

一実施形態では、免疫エフェクター細胞、ＣＡＲ及びＣＣＲ、又はそれらをコードする融合タンパク質を含む組成物は、治療用抗体とともに投与される。特定の実施形態に企図されるＣＡＲ修飾Ｔ細胞との併用に好適な治療用抗体の例示的な例としては、これらに限定されないが、アテゾリズマブ、アベルマブ、バビツキシマブ、ベバシズマブ（アバスチン）、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、コナツムマブ、クリゾチニブ、ダラツムマブ、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デュルバルマブ、エロツズマブ（ＨｕＬｕｃ６３）、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、イピリムマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、ミラツズマブ、モキセツモマブ、ニボルマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、ペムブロリズマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、テプロツムマブ、及びウブリツキシマブが挙げられる。

【0413】

Ｋ．治療方法
本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲを発現する遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞は、がんの予防、治療、及び改善に使用される、又はがんに関連する少なくとも１つの症状の予防、治療、又は改善に使用される養子免疫治療の改善された方法を提供する。

【0414】

様々な実施形態では、本明細書に企図される遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞は、対象においてがん細胞における細胞傷害性を増加させる、又は対象においてがん細胞の数の減少に使用される養子免疫治療の改善された方法を提供する。

【0415】

特定の実施形態では、一次免疫エフェクター細胞の特異性は、本明細書に企図されるＣＡＲ及び／又はＣＣＲで一次免疫エフェクター細胞を遺伝子修飾することによって、特定の抗原を発現する細胞、例えば、がん細胞に再指向される。様々な実施形態では、ウイルスベクターを使用して、ＣＡＲ及びＣＣＲをコードする特定のポリヌクレオチドを有する免疫エフェクター細胞を遺伝子修飾する。

【0416】

一実施形態では、Ｔ細胞が、がん細胞を発現する特定の抗原を標的とするＣＡＲ及び／又はＣＣＲを発現するように遺伝子修飾され、Ｔ細胞をそれを必要とするレシピエントに注入されるある種の細胞療法が提供される。注入された細胞は、レシピエントにおいて疾患を引き起こす細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、Ｔ細胞療法は、インビボで複製することができ、その結果、持続的ながん治療をもたらすことができる長期持続性をもたらす。

【0417】

一実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲを発現するＴ細胞は、強固なインビボＴ細胞増殖を経ることができ、長期間持続することができる。別の実施形態では、ＣＡＲ及びＣＣＲを発現するＴ細胞は、任意の追加の腫瘍形成又は増殖を阻害するために再活性化され得る特異的メモリーＴ細胞又は幹細胞メモリーＴ細胞へと進化する。

【0418】

特定の実施形態では、本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲを発現する免疫エフェクター細胞を含む組成物は、状態関連特定の抗原発現がん細胞又はがん幹細胞の治療に使用される。

【0419】

ＣＡＲ及びＣＣＲを発現する免疫エフェクター細胞を使用して、治療、予防、又は改善され得る状態の例示的な例が特定の実施形態に企図される。

【0420】

特定の実施形態では、本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲを発現するＴ細胞を含む組成物は、骨肉腫又はユーイング肉腫の治療に使用される。

【0421】

特定の実施形態では、本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲを発現するＴ細胞を含む組成物は、液性がん又は血液がんの治療に使用される。

【0422】

ある特定の実施形態では、液性がん又は血液がんは、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。

【0423】

ある特定の実施形態では、液性がん又は血液がんは、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、及び真性多血症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、明白な多発性骨髄腫、くすぶっている多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、及び髄外形質細胞腫からなる群から選択される。

【0424】

特定の実施形態では、液性がん又は血液がんは、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群から選択される。

【0425】

好ましい実施形態では、液性がん又は血液がんは、ＤＬＢＣＬである。

【0426】

好ましい実施形態では、液性がん又は血液がんは、再発性／難治性ＤＬＢＣＬである。

【0427】

特定の実施形態では、本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲを発現する治療有効量の免疫エフェクター細胞、又はそれを含む組成物を、それを必要とする患者に、単独で、又は１つ以上の治療剤と組み合わせて投与することを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、細胞は、がん細胞と関連する病態を発症するリスクがある患者の治療に使用される。したがって、特定の実施形態では、がんの少なくとも１つの症状を治療又は予防又は改善する方法は、本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲを発現する治療有効量の修飾されたＴ細胞をそれを必要とする対象に投与することを含む。

【0428】

本明細書で使用される場合、「個体」及び「対象」という用語は、しばしば相互交換可能に使用され、本明細書において他の場所で企図される遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、及び方法で治療され得る疾患、傷害又は病の症状を呈する任意の動物を指す。好ましい実施形態では、対象は、遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、及び本明細書の他の場所で企図される方法を用いて治療することができる、がんに関連する疾患、傷害、又は病態の症状を呈する任意の動物を含む。適切な対象（例えば、患者）としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ又はモルモット）、家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ、ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）、又はペット（例えば、ネコ又はイヌ）が挙げられる。非ヒト霊長類、好ましくはヒト患者も含まれる。典型的な対象としては、がん若しくはがんと診断された、又はそのリスクのある、又はがんを有するヒト患者が挙げられる。

【0429】

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、及び本明細書の他の場所で開示される方法を用いて治療され得る特定の疾患、傷害又は病態と診断された対象を指す。

【0430】

本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」には、疾患又は病態の症状若しくは病理に対する、あらゆる有益な作用又は望ましい作用を含み、治療される疾患又は状態の１つ以上の測定可能なマーカーの最小の低減さえも含み得る。治療には、任意で、疾患若しくは病態の減少、又は疾患若しくは病態の進行の遅延のいずれかが含まれてもよい。「治療」は必ずしも、疾患若しくは状態、又はその関連症状の完全な排除又は治癒を示すものではない。

【0431】

本明細書で使用される場合、「予防する」、及び例えば「予防される」、「予防すること」といった類似の文言は、疾患若しくは状態の予防、阻害、又は発生若しくは再発の可能性の低下を目的としたアプローチを示す。更に、疾患若しくは状態の発生又は再発の遅延、又は疾患若しくは状態の症状の発生又は再発の遅延も指す。本明細書において使用される場合、「予防」及びその類似文言も、疾患若しくは症状の発生又は再発の前の、疾患若しくは状態の強度、作用、症状、及び／又は負荷量の低下を含む。

【0432】

本明細書で使用される場合、「～の少なくとも１つの症状の改善」とは、対象が治療される疾患若しくは状態の１つ以上の症状の減少を指す。特定の実施形態では、治療される疾患又は状態は、がんであり、この場合において改善される１つ以上の症状としては限定されないが、脱力、疲労、息切れ、あざができやすい、及び出血しやすい、頻発する感染、リンパ節の拡張、腹部膨張又は腹部疼痛（膨張した腹部臓器が原因）、骨又は関節の疼痛、骨折、予期せぬ体重減少、食欲低下、寝汗、持続性の微熱、及び排尿減少（腎機能の障害が原因）が挙げられる。

【0433】

「増強する」、又は「促進する」、又は「増加する」、又は「拡張する」とは概して、本明細書に企図される組成物、例えば、ＣＡＲ及びＣＣＲを発現する遺伝子修飾されたＴ細胞が、ビヒクル又は対照の分子／組成物による反応と比較して、より大きな生理学的反応（すなわち、下流効果）をもたらす、誘発する、又は発生させる能力を指す。測定可能な生理学的反応としては特にＴ細胞の拡張、活性化、持続性、及び／又はがん細胞殺傷能力の増加が挙げられ、当該技術分野及び本明細書の記載の理解から明白である。「増加した」又は「強化された」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクル又は対照組成物によりもたらされる反応の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０又はそれ以上（例えば、５００倍、１０００倍）（その間及び１を超える全ての整数及び小数点を含む、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）である増加を含む場合がある。

【0434】

「減少する」、又は「下げる」、又は「低める」、又は「低減する」、又は「弱める」とは概して、本明細書に企図される組成物が、ビヒクル又は対照の分子／組成物による反応と比較して、小さな生理学的反応（すなわち下流効果）をもたらす、誘発する、又は発生させる能力を指す。「減少」又は「低減した」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物によりもたらされる反応、又は特定の細胞株での反応の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０又はそれ以上（例えば、５００倍、１０００倍）（その間及び１を超える全ての整数及び小数点を含む、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）である減少を含む場合がある。

【0435】

「維持する」、又は「保存する」、又は「維持」、又は「変化がない」、又は「実質的な変化がない」、又は「実質的な減少が無い」とは概して、本明細書に企図される組成物が、ビヒクル、対照の分子／組成物により生じた反応、又は特定の細胞株での反応と比較して、細胞において類似した、又は同等の生理学的反応（すなわち、下流効果）をもたらす、惹起させる、又は生じさせる能力を指す。同等の反応は、基準反応と実質的に違わない、又は測定可能な程度に違わない反応である。

【0436】

一実施形態では、がんを治療することを必要とする対象においてそれを治療する方法は、有効量、例えば、治療有効量の本明細書に企図される遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞を含む組成物を投与することを含む。投与の量並びに頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプ及び重大度といった因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定されてもよい。

【0437】

一実施形態では、対象に投与される組成物中の免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲ及びＣＣＲを発現するＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０^５細胞、少なくとも０．５×１０^５細胞、少なくとも１×１０^５細胞、少なくとも５×１０^５細胞、少なくとも１×１０^６細胞、少なくとも０．５×１０^７細胞、少なくとも１×１０^７細胞、少なくとも０．５×１０^８細胞、少なくとも１×１０^８細胞、少なくとも０．５×１０^９細胞、少なくとも１×１０^９細胞、少なくとも２×１０^９細胞、少なくとも３×１０^９細胞、少なくとも４×１０^９細胞、少なくとも５×１０^９細胞、又は少なくとも１×１０^１０細胞である。

【0438】

特定の実施形態では、約１×１０^７Ｔ細胞～約１×１０^９Ｔ細胞、約２×１０^７Ｔ細胞～約０．９×１０^９Ｔ細胞、約３×１０^７Ｔ細胞～約０．８×１０^９Ｔ細胞、約４×１０^７Ｔ細胞～約０．７×１０^９Ｔ細胞、約５×１０^７Ｔ細胞～約０．６×１０^９Ｔ細胞、又は約５×１０^７Ｔ細胞～約０．５×１０^９Ｔ細胞が対象に投与される。

【0439】

一実施形態では、対象に投与される組成物中の免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲ及びＣＣＲを発現するＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０^４細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０^４細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^４細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０^４細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０^７細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^７細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０^８細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^８細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０^８細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０^８細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０^８細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^９細胞／ｋｇ体重である。

【0440】

特定の実施形態では、約１×１０^６Ｔ細胞／ｋｇ体重～１×１０^８Ｔ細胞／ｋｇ体重、約２×１０^６Ｔ細胞／ｋｇ体重～０．９×１０^８Ｔ細胞／ｋｇ体重、３×１０^６Ｔ細胞／ｋｇ体重～約０．８×１０^８Ｔ細胞／ｋｇ体重、約４×１０^６Ｔ細胞／ｋｇ体重～約０．７×１０^８Ｔ細胞／ｋｇ体重、約５×１０^６Ｔ細胞／ｋｇ体重～約０．６×１０^８Ｔ細胞／ｋｇ体重、又は約５×１０^６Ｔ細胞／ｋｇ体重～約０．５×１０^８Ｔ細胞／ｋｇ体重が対象に投与される。

【0441】

当業者であれば、所望の治療効果を発揮させるために、本明細書に企図される組成物の複数回の投与が必要とされる場合があることを認識するであろう。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、１年、２年、５年、１０年、又はそれ以上の期間にわたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回以上投与されてもよい。

【0442】

ある特定の実施形態では、対象に活性化された免疫エフェクター細胞が投与され、次いで対象から採血して（又はアフェレーシス療法を実施し）、それに由来する免疫エフェクター細胞を活性化し、これら活性化及び拡張された免疫エフェクター細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週ごとに複数回実施されてもよい。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血から活性化されてもよい。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、又は４００ｃｃ以上の採血から活性化される。理論には拘束されないが、複数回の採血／複数回の再注入のプロトコルを使用することで、免疫エフェクター細胞のある群の選択に役立つ場合がある。

【0443】

本明細書に企図される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植、又は移植を含む、任意の都合の良い方法で実施され得る。好ましい実施形態では、組成物は非経口的に投与される。本明細書で使用される場合、「非経口投与」及び「非経口的に投与」という語句は、経腸投与及び局所投与以外の投与様式を指し、通常は注射によって、限定されるものではないが、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内の、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。一実施形態では、本明細書に企図される組成物は、腫瘍、リンパ節、又は感染部位への直接注射によって対象に投与される。

【0444】

一実施形態では、対象のＢ細胞関連状態に対する細胞性免疫反応を増加させる有効量の組成物がそれを必要とする対象に投与される。免疫応答は、感染細胞を殺傷することができる細胞傷害性Ｔ細胞、制御Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞応答によって媒介される細胞免疫応答を含んでもよい。主にＢ細胞を活性化することができるヘルパーＴ細胞によって媒介され、したがって抗体産生をもたらす液性免疫応答も誘発され得る。様々な技術を使用して、組成物によって誘導される免疫応答のタイプを分析することができ、当該技術分野、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．に十分に説明されている。

【0445】

一実施形態では、対象から免疫エフェクター細胞を除去することと、本明細書に企図されるＣＡＲ及びＣＣＲをコードする核酸を含むベクターで当該免疫エフェクター細胞を遺伝子修飾して、それによって、修飾された免疫エフェクター細胞の集団を産生することと、修飾された免疫エフェクター細胞の集団をその対象に投与することとを含む、がんと診断された対象を治療する方法が提供される。好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。

【0446】

ある特定の実施形態では、対象において標的細胞集団に対する免疫エフェクター細胞媒介性免疫調節因子応答を刺激する方法が提供され、方法は、ＣＡＲ及びＣＣＲをコードする核酸構築物を発現する免疫エフェクター細胞集団を対象に投与するステップを含む。

【0447】

特定の実施形態に企図される細胞組成物を投与する方法は、対象においてＣＡＲ及びＣＣＲを直接的に発現するか、又は対象に導入するときにＣＡＲ及びＣＣＲを発現する成熟免疫エフェクター細胞に分化する免疫エフェクター細胞の遺伝子修飾された前駆体を再導入するかのいずれかである、エクスビボで遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞の再導入をもたらすのに効果的である任意の方法を含む。１つの方法は、本明細書に企図される核酸構築物を用いてエクスビボで末梢血Ｔ細胞を形質導入することと、形質導入細胞を対象に戻すこととを含む。

【0448】

Ｌ．配列表

【表3-1】

【表3-2】

【0449】

本明細書に引用される全ての公表文献、特許出願及び登録特許が、個々の公表文献、特許出願又は登録特許のそれぞれが具体的に、及び個々に参照により組み込まれることが示されているように、参照により本明細書に組み込まれる。

【0450】

前述の実施形態は、明確性及び理解を目的として、図及び実施例により詳細に記載されているが、本明細書に企図される教示に照らし、特定の変化及び改変が、添付の請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなく実施され得ることが当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、説明の目的のみで提供され、限定の目的で提供されるものではない。当業者であれば、本質的に類似した結果をもたらすために変更又は修正され得る様々な非臨界パラメータを容易に認識するであろう。

【実施例】

【0451】

実施例１
ＣＣＲ抗原単独の存在下でのＴ細胞シグナル伝達の活性化
Ｔ細胞をレンチウイルス形質導入を使用して修飾し、ＣＡＲ分子又はＣＡＲ及びＣＣＲ（ＣＡＲ／ＣＣＲ）分子のいずれかをコードする構築物を送達した。ＣＡＲ構築物は、４－１ＢＢ及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメイン（ＢＢｚ）に融合した抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを発現した。ＣＡＲ＋ＣＣＲ構築物は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインＣＣＲに融合したＢＢｚ抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ及び抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを発現し、それはＣＣＲを形成した。ＣＡＲ＋ＣＣＲ構築物内のＣＡＲ及びＣＣＲ配列を、２Ａリボソームスキッピングエレメントを使用して分離した。

【0452】

次いで、修飾されたＴ細胞を、内因性ＢＣＭＡ発現を欠くＥＧＦＲ＋ＨＴ－１０８０腫瘍細胞株と共培養した。図１Ａでは、培養上清を２４時間後に収集し、ＩＦＮγ産生をＬｕｍｉｎｅｘアッセイにより評価した。図１Ａに示されるように、非修飾Ｔ細胞（ＵＴＤ）又は抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原曝露の不在下でＩＦＮγ分泌し損ねた。一方で、ＣＡＲ＋ＣＣＲ Ｔ細胞は、ＥＧＦＲにのみ曝露されているにもかかわらず、検出可能な量のＩＦＮγを産生した。

【0453】

同様に、図１Ｂでは、ＣＡＲ＋ＣＣＲ Ｔ細胞のみが、標準的な４時間のインビトロ殺傷／細胞傷害性アッセイ中に、用量依存的様式でＥＧＦＲ＋腫瘍標的を殺傷することができた。

【0454】

実施例２
ＣＣＲ依存性シグナル伝達は腫瘍体積を低減する
免疫不全ＮＳＧマウスに、内因性にＥＧＦＲを発現するがＢＣＭＡ発現を欠くヒトＡ５４９腫瘍細胞を皮下移植した。移植の約２０日後、マウスを非修飾Ｔ細胞（ＵＴＤ）、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞、又は抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋抗ＥＧＦＲ ＣＣＲ Ｔ細胞で処置し、腫瘍体積を評価した。図２に示されるように、非形質導入又は抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれも腫瘍増殖を制御することができず、最終的にはそれらのマウスは腫瘍形成に屈した。あるいは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋抗ＥＧＦＲ ＣＣＲ Ｔ細胞で処置されたマウスは、研究期間中、完全な腫瘍退縮を示した。

【0455】

いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、図３は、ＣＡＲ及びＣＣＲを与えられたＴ細胞が、ＣＡＲ抗原を欠いたまま、ＣＣＲ抗原を発現する腫瘍標的細胞にどのように反応することができるかを説明する、３つの例示的で非限定的なモデルを示す。ＣＣＲは、ＣＣＲ抗原と結合することができ、その後、ＣＡＲ分子とは無関係のシグナルを形質導入することができる（図３、左パネル）。ＣＤ３ｚによる抗原非依存性基底ＣＡＲシグナル伝達は、ＣＣＲ共刺激シグナルによって、標準的なインビトロ実験によって今や検出可能であり、かつインビボで腫瘍対照として現れるレベルにまで増強される（図３、左パネル）。ＣＡＲ分子とＣＣＲ分子との間の分子相互作用は、ＣＣＲ抗原を介したＣＣＲの結合がシグナル伝達を開始し、Ｔ細胞活性化を誘発するように存在する。

【0456】

実施例３
ＣＡＲ及びＣＣＲヒンジ変異は、ＣＡＲ Ｔ細胞シグナル伝達を調節する
実験は、ＣＡＲ及びＣＣＲのＣＤ８ａヒンジ領域中の４つのシステインのうちのいずれか１つ（ＣＡＲ中の２つ、及びＣＣＲ中の２つ）が、２つの異なるタンパク質間の分子相互作用に関与しているかどうかを試験するために設計した。ＣＡＲ又はＣＣＲのいずれかのＣＤ８ａヒンジの２８９及び３０６位（配列番号２の２７及び４４位に対応）におけるシステイン及びセリンの使用において変化した６つの異なるＣＡＲ＋ＣＣＲ構築物が生成され、Ｔ細胞に形質導入された。Ｃ１は、システインを４つの位置全てで利用する親ＣＡＲ＋ＣＣＲ構築物である。Ｃ２は、ＣＡＲ中に２つのセリン、及びＣＣＲ中に２つのシステインを含む。Ｃ３は、ＣＡＲ中に２つのシステイン、及びＣＣＲ中に２つのセリンを含む。Ｃ４は、ＣＡＲの配列番号２の２７位にセリン、及び配列番号２の４４位にシステイン、並びにＣＣＲの配列番号２の２７位にシステイン、及び配列番号２の４４位にセリンを含む。Ｃ５は、ＣＡＲの配列番号２の２７位にシステイン、及び配列番号２の４４位にセリン、並びにＣＣＲの配列番号２の２７位にセリン、及び配列番号２の４４位にシステインを含む。Ｃ６は、４つの位置全てでセリンを利用する。

【0457】

Ｔ細胞を、上に記載される６つの構築物並びに２つの対照：配列番号２の２７及び４４位でシステインをセリンで置き換える抗ＢＣＭＡ ＢＢｚ ＣＡＲ及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲのバリアントを用いて修飾した。次いで、各Ｔ細胞の状態を、ＥＧＦＲのみを発現する様々な腫瘍細胞（Ａ５４９及びＨＴ－１０８０）、又はＢＣＭＡ及びＥＧＦＲの両方を発現する腫瘍細胞（Ａ５４９．ＢＣＭＡ及びＨＴ－１０８０．ＢＣＭＡ）のいずれかで共培養した。ＩＦＮγ産生を２４時間後に評価した。図４Ａ～４Ｃに示されるように、対照抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞の存在下で培養されたときにのみサイトカインを産生した。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ中の配列番号２の２７及び４４位にセリンを導入することは、ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞で培養したときにＩＦＮγ産生の低減をもたらした。親ＣＡＲ＋ＣＣＲ構築物（Ｃ１）を発現するように操作されたＴ細胞は、ＢＣＭＡ及びＥＧＦＲ、又はＥＧＦＲのみのいずれかを発現する腫瘍細胞に応答した。これらの実験で使用された他のＣＡＲ＋ＣＣＲバリアントのいずれも、ＥＧＦＲのみを発現する腫瘍細胞に対する完全な反応性を保持することができなかった。興味深いことに、構築物Ｃ４は、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞に対する部分応答性を呈する唯一のバリアントであった。まとめると、これらのデータは、ＣＡＲ／ＣＣＲ分子相互作用を媒介することにおけるヒンジシステインの重要性を示す。

【0458】

実施例４
ＣＡＲ及びＣＣＲ融合ポリペプチドの設計及び発現。
図５Ａは、抗ＥＧＦＲ ＣＣＲ、２つのシステインからセリンへの変異を含む抗ＥＧＦＲ ＣＣＲ、及び対応するＣＡＲ＋ＣＣＲ構築物（それぞれＣ１及びＣ３）の構築に使用されるモジュラータンパク質ドメインを示す。Ｃ３は、配列番号２の２７及び４４位に対応するＣＤ８ａヒンジ内のシステインの代わりにセリンを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ及び抗ＥＧＦＲ ＣＣＲをコードする構築物である。Ｃ１は、ＣＡＲ及びＣＣＲ中に存在する４つのシステイン全てを有する親ＣＡＲ＋ＣＣＲ構築物である。

【0459】

これらの構築物の各々を、３つの異なるドナーからのＴ細胞に形質導入し、フローサイトメトリーを使用して、ＣＡＲ又はＣＣＲのいずれかを発現しないＵＴＤ対照と比較して、ＣＡＲ及びＣＣＲの両方の細胞表面発現を評価した。図５Ｂに示されるように、配列番号２の２７及び４４位におけるセリンの存在は、ＣＣＲのみの構築物の全体的な形質導入効率に影響を与えない。同様に、Ｃ１又はＣ３構築物で形質導入されたＴ細胞は、細胞表面上のＣＡＲ及びＣＣＲの両方の発現をもたらす。ＣＣＲの両位置にセリンが存在するにもかかわらず、形質導入効率への影響はない。

【0460】

実施例５
ＣＣＲヒンジ二重変異は、ＣＡＲ抗原の不在下のＴ細胞活性化を低減する
実施例４に記載される構築物で形質導入されたＴ細胞を、ＣＣＲ、ＥＧＦＲに対する抗原を発現するのみのＡ５４９又はＨＴ－１０８０腫瘍細胞で共培養し、２４時間後にＩＦＮγ産生について評価した。図６は、ＥＧＦＲを発現するが、ＢＣＭＡを欠く腫瘍細胞に対するＣＡＲ＋ＣＣＲ Ｔ細胞の応答性を示しており、これらのＴ細胞は、ＢＣＭＡ＋腫瘍だけでなく、ＥＧＦＲのみを発現する腫瘍も標的としたことを示唆している。ＣＣＲの配列番号２の２７及び４４位にセリンが導入されると、この反応性は、陰性対照と一致するレベルまで低減され、ＣＣＲヒンジ内のシステインが、ＥＧＦＲ単一陽性腫瘍細胞への反応性を媒介するのに重要であることを示す。

【0461】

これらの結果は、図７Ａ～７Ｄ及び８Ａ～８Ｄのデータによって更に裏付けられ、これは、ＢＣＭＡ及びＥＧＦＲを標的とするＣＡＲ＋ＣＣＲ Ｔ細胞が、システインの使用量にかかわらず、ＢＣＭＡ＋腫瘍細胞のサイトカイン放出及び殺傷を増加させたことを示す。しかしながら、ＣＣＲのヒンジドメイン内に天然システインを含む細胞のみが、ＥＧＦＲ単一陽性腫瘍細胞を除去することができるが、一方で、ＣＣＲのヒンジ内にシステインの代わりにセリンを含むＴ細胞は、ＢＣＭＡの不在下でそれらの腫瘍細胞を殺傷することができない（図８Ａ～８Ｄ）。

【0462】

概して、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定させるものと解釈されるべきではないが、かかる特許請求の範囲が権利を与える等価物の完全な範囲とともに全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されない。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4A-1】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5A-1】

【図5B】

【図6】

【図7AB】

【図7CD】

【図8AB】

【図8CD】

【配列表】

2023522038000001.app

【国際調査報告】