(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-26
(54)【発明の名称】線維症のバイオマーカー
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20230519BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230519BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230519BHJP
A61K 45/00 20060101ALN20230519BHJP
A61P 43/00 20060101ALN20230519BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18
G01N33/53 D ZNA
C12N15/13
A61K45/00
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022562971
(86)(22)【出願日】2021-04-15
(85)【翻訳文提出日】2022-12-14
(86)【国際出願番号】 EP2021059759
(87)【国際公開番号】W WO2021209540
(87)【国際公開日】2021-10-21
(31)【優先権主張番号】2005564.6
(32)【優先日】2020-04-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2017987.5
(32)【優先日】2020-11-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522403778
【氏名又は名称】ノルディック バイオサイエンス エー／エス
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ペーアソン，マーティン
(72)【発明者】
【氏名】カースダル，モルテン，アッサー
(72)【発明者】
【氏名】リーミング，ダイアナ ジュリー
(72)【発明者】
【氏名】フィスカー，メッテ，ジュール
(72)【発明者】
【氏名】マノン－ジェンセン，ティナ
(72)【発明者】
【氏名】モルテンセン，ヨアヒム，ホーグ
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA17
4C084NA05
4C084ZC42
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、生体試料において架橋ＣＴＸ－ＩＩＩを検出するためのサンドイッチイムノアッセイ及びキット、並びにリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とする薬物の有効性を評価するためのその使用に関する。架橋ＣＴＸ－ＩＩＩは、肝線維症、慢性腸疾患、好酸球性食道炎及び癌を含む、線維症と関連付けられる疾患におけるバイオマーカーとして使用することができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１）を有するペプチドを特異的に認識し、結合するモノクローナル抗体。
【請求項2】
前記モノクローナル抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して作製されたモノクローナル抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項3】
前記抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＸ（配列番号２）を有し、その中のＸは任意のアミノ酸を表すペプチドを特異的に認識しないか、又はそれと結合しない、請求項１又は請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項4】
前記抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＤ（配列番号４）を有するペプチドを特異的に認識しないか、又はそれと結合しない、請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項5】
前記抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹ（配列番号５）を有するペプチドを特異的に認識しないか、又はそれと結合しない、請求項１～４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項6】
生体試料において架橋ＣＴ－ＩＩＩを検出するためのサンドイッチイムノアッセイであって、前記架橋ＣＴ－ＩＩＩが、鎖間架橋によって共に結合した少なくとも２つのＣＴ－ＩＩＩの鎖を含み、前記方法が、前記架橋ＣＴ－ＩＩＩを含む前記生体試料を、表面に結合した第１のモノクローナル抗体と接触させる工程であって、前記架橋ＣＴ－ＩＩＩに含まれるＣＴ－ＩＩＩの各鎖が、インタクトなＩＩＩ型コラーゲンのＣプロテアーゼ切断によって生成されるＣＴ－ＩＩＩのＣ末端ネオエピトープを含む工程；
第２のモノクローナル抗体を添加する工程；及び
前記第２のモノクローナル抗体の結合量を決定する工程
を含み、
前記第１のモノクローナル抗体と前記第２のモノクローナル抗体の両方が、ＣＴ－ＩＩＩの前記Ｃ末端ネオエピトープと特異的に反応し、前記ネオエピトープが、Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ－ＣＯＯＨ（配列番号１）に含まれている、サンドイッチイムノアッセイ。
【請求項7】
前記モノクローナル抗体が、請求項１～５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体である、請求項６に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項8】
前記サンドイッチイムノアッセイが、生体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量するために使用される、請求項６又は７に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項9】
前記生体試料が生物学的流体である、請求項６～８のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項10】
前記生物学的流体が、血清、血漿、尿、羊水、組織上清又は細胞上清である、請求項９に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項11】
前記サンドイッチイムノアッセイが、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、又は酵素結合免疫吸着アッセイである、請求項６～１０のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項12】
前記第２のモノクローナル抗体が標識されている、請求項６～１１のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項13】
前記第２のモノクローナル抗体が酵素結合抗体である、請求項１２に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項14】
前記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、請求項１３に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項15】
前記第２のモノクローナル抗体が、放射性標識されるか、又はフルオロフォアに連結している、請求項１４に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項16】
前記第２のモノクローナル抗体を認識するさらなる標識抗体を用いて、前記第２のモノクローナル抗体の結合量を決定する、請求項６～１０のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項17】
前記方法により決定した架橋ＣＴＩＩＩの量を、既知の疾患の重篤度の標準的な疾患試料と相関させて、疾患の重篤度を評価することをさらに含む、請求項８～１６のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項18】
前記生物学的流体試料中に存在するＰＲＯ－Ｃ３の量を定量すること、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＲＯ－Ｃ３）に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比を決定すること、
をさらに含む、請求項８～１６のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項19】
前記方法により決定されたＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＲＯ－Ｃ３）に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比を、既知の疾患の重篤度の標準的な疾患試料と相関させて、疾患の重篤度を評価することをさらに含む、請求項１８に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項20】
前記疾患が線維性疾患である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項21】
線維性疾患が肝疾患である、請求項２０に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項22】
前記肝疾患が非アルコール性脂肪性肝疾患又はＨＣＶ関連肝疾患である、請求項２１に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項23】
前記疾患が慢性腸疾患又は癌である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項24】
前記慢性腸疾患がクローン病又は潰瘍性大腸炎である、請求項２３に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項25】
前記癌が、乳癌、膀胱癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、卵巣癌、肝臓癌、前立腺癌、又は黒色腫である、請求項２３に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項26】
リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とするアンタゴニスト薬の有効性を評価する方法であって、請求項６～１６のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、少なくとも２つの生体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量することを含み、前記生体試料が、前記対象へのアンタゴニスト薬の投与期間中の最初の時点及び少なくとも１つのその後の時点で対象から得られ、前記アンタゴニスト薬の投与期間中の前記最初の時点から前記少なくとも１つのその後の時点までの間の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量の減少が、ＬＯＸを標的とする有効なアンタゴニスト薬を示す、方法。
【請求項27】
前記方法が、ＬＯＸＬ２を標的とするアンタゴニスト薬の有効性を評価する、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
サンドイッチアッセイで使用するためのキットであって：請求項１に記載の前記第１のモノクローナル抗体を結合している固体支持体；及び
請求項１に記載の前記第２のモノクローナル抗体
を含み、前記第２のモノクローナル抗体が標識を含む、キット。
【請求項29】
線維症を有する患者の線維症応答表現型を特定する方法であって、患者から得られた生物学的流体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量するために、請求項８６～１９のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイを使用すること、並びに前記架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とｉ）既知の線維性応答表現型と関連付けられる値及び／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させることを含む方法。
【請求項30】
生物学的流体試料中に存在するＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＲＯ－Ｃ３）の量を定量すること、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＲＯ－Ｃ３）に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比を決定すること、及び
ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＲＯ－Ｃ３）に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比と所定のカットオフ値を相関させること、
をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記カットオフ値が、少なくとも３．８ｎｇ／ｍＬの架橋ＣＴ－ＩＩＩであり、かつ／又はＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＲＯ－Ｃ３）に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比が少なくとも０．５である、請求項２９又は請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
好酸球性食道炎を有する患者を特定する方法であって、請求項８～１９のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者から得られた生物学的流体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量すること、並びに前記架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とｉ）既知の好酸球性食道炎患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させること、を含む方法。
【請求項33】
慢性腸疾患を有する患者を特定する方法であって、請求項８～１９のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者から得られた生物学的流体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量すること、並びに前記架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とｉ）既知の慢性腸疾患を有する患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させること、を含む方法。
【請求項34】
癌を有する患者を特定する方法であって、請求項８～１９のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者から得られた生物学的流体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量すること、並びに前記架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とｉ）既知の癌患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させること、を含む方法。
【請求項35】
線維性疾患を有する患者を特定する方法であって、請求項８～１９のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者から得られた生物学的流体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量すること、並びに前記架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とｉ）既知の線維性疾患患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させること、を含む方法。
【請求項36】
治療から恩恵を受ける患者を特定する方法であって、請求項８～１９のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者から得られた生物学的流体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量すること、並びに前記架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とｉ）既知の疾患患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させること、を含む方法。
【請求項37】
前記治療が、コラーゲン架橋を標的とする薬物の投与を含む、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の技術分野
本発明は、生体試料において架橋ＣＴＸ－ＩＩＩを検出するためのサンドイッチイムノアッセイ、及びリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とする薬物の有効性を評価するためのその使用に関する。本発明はまた、サンドイッチイムノアッセイを実施するためのキットに関する。
本発明は、生体試料において架橋ＣＴＸ－ＩＩＩを検出するためのサンドイッチイムノアッセイ、及びリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とする薬物の有効性を評価するためのその使用に関する。本発明はまた、サンドイッチイムノアッセイを実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
関連技術の説明
線維性疾患（表Ａに列挙したものを含む）、例えば、世界中で１年間に８００，０００人の死亡を伴う肝硬変は、罹患率及び死亡率の主要原因である。
線維性疾患（表Ａに列挙したものを含む）、例えば、世界中で１年間に８００，０００人の死亡を伴う肝硬変は、罹患率及び死亡率の主要原因である。
【0003】
表Ａ．異なる線維性疾患
【表1】
【0004】
「線維性疾患」は、主症状であるか又は二次症状であるかにかかわらず、線維症が生じる任意の疾患である。線維症は、持続感染、自己免疫反応、アレルギー反応、化学的損傷、放射線、及び組織損傷を含む様々な刺激によって誘発される慢性炎症反応の最終結果である。線維症は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の蓄積及び再編成によって特徴付けられる。明らかな病因及び臨床的な区別を有するにもかかわらず、ほとんどの慢性線維性障害は、成長因子、タンパク質分解酵素、血管新生因子、及び線維形成性サイトカインの産生を持続させる持続性刺激因子を共通して有し、これらは一緒になって、結合組織要素、特にコラーゲン及びプロテオグリカンの沈着を刺激し、正常な組織構造を徐々に除去し、破壊する。ヒトの健康に多大な影響を与えるにもかかわらず、現在、線維症のメカニズムを直接標的とする承認済み治療は存在しない。
【0005】
ＩＩＩ型コラーゲンの役割及び肝臓１、腸２、腎臓３、及び肺４の線維症におけるその関与は、ターンオーバーの変化を示した。線維芽細胞によって産生される主な線維状コラーゲンの１つであるので、ＩＩＩ型コラーゲンは、線維化促進架橋事象にも関与すると考えられる。ここで、架橋が過剰に形成されると、マトリックスの剛性６が増して、プロテアーゼが近づけないマトリックス５になる。その結果、線維化促進シグナル伝達カスケードを活性化する細胞：ＥＣＭ相互作用によって、（筋）線維芽細胞の活性化７、分化８、及び遊走９を介したＥＣＭ蓄積につながる。
【0006】
線維状コラーゲンの架橋：
コラーゲン原線維の成熟の最終工程の１つは、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、リシルオキシダーゼ様酵素（ＬＯＸＬ）、及びトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）１０などの酵素によって触媒される分子内架橋及び分子間架橋の形成である。これらの架橋の形成は、引張強度１１、弾性を含む機械的特性と機能的特性の両方をそれらのそれぞれの組織に提供し、いくつかの細胞機能に影響を与える１２～１４。様々な種類の酵素的及び非酵素的架橋が線維状コラーゲン（コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＩＸ、及びＸＩ型）内に存在する１０が、ＬＯＸ（Ｌ）及びＴＧによって触媒される酵素的架橋形成が興味深い。これは、生理学的架橋事象と病理学的架橋事象の両方に関与するためである１５、１６。ＬＯＸ（Ｌ）は、自発的な架橋形成につながる線維状コラーゲンテロペプチド内の特異的リジン又はヒドロキシリジンの酸化的脱アミノ化を触媒するが、ＴＧは、グルタミンとリジンとの間のイソペプチド結合の形成を触媒する。ＬＯＸ（Ｌ）由来の架橋の最終的な生化学的性質は、それらの組織発現に依存して異なるが、主要線維状コラーゲン内の架橋部位は保存されているようであり、これはコラーゲン特異的架橋よりもむしろ組織特異性を示す１０。
コラーゲン原線維の成熟の最終工程の１つは、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、リシルオキシダーゼ様酵素（ＬＯＸＬ）、及びトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）１０などの酵素によって触媒される分子内架橋及び分子間架橋の形成である。これらの架橋の形成は、引張強度１１、弾性を含む機械的特性と機能的特性の両方をそれらのそれぞれの組織に提供し、いくつかの細胞機能に影響を与える１２～１４。様々な種類の酵素的及び非酵素的架橋が線維状コラーゲン（コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＩＸ、及びＸＩ型）内に存在する１０が、ＬＯＸ（Ｌ）及びＴＧによって触媒される酵素的架橋形成が興味深い。これは、生理学的架橋事象と病理学的架橋事象の両方に関与するためである１５、１６。ＬＯＸ（Ｌ）は、自発的な架橋形成につながる線維状コラーゲンテロペプチド内の特異的リジン又はヒドロキシリジンの酸化的脱アミノ化を触媒するが、ＴＧは、グルタミンとリジンとの間のイソペプチド結合の形成を触媒する。ＬＯＸ（Ｌ）由来の架橋の最終的な生化学的性質は、それらの組織発現に依存して異なるが、主要線維状コラーゲン内の架橋部位は保存されているようであり、これはコラーゲン特異的架橋よりもむしろ組織特異性を示す１０。
【0007】
生理学的架橋の重要性は、動物モデル、及びある種の遺伝病においてそれらの不在が組織の強度及び弾性の低下を示すことが観察されるので明らかである。低下するか又は弱まった架橋の有害作用に加えて、過剰な形成及び生化学的変化はまた、組織の線維症と癌の両方において観察されるように、組織機能に有害となり得る。継続した組織傷害の状況では、創傷治癒カスケードの繰り返し活性化は、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンなどの線維性コラーゲン１７、並びにＬＯＸ（Ｌ）及びＴＧを含む線維化促進因子の上方制御並びに蓄積をもたらす。コラーゲン及びそれらの架橋酵素の過剰な蓄積は、堅い線維性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の形成を媒介する。
【0008】
線維症の解消の評価：
抗線維化療法の効果を決定するために、高感度で、信頼性があり、最適な低侵襲性の評価方法が必要である。現在の治療上の選択肢として、ニンテダニブ及びピルフェニドンは、特発性肺線維症１８、１９の患者において観察されたように進行を遅くするだけか、又は強皮症２０の研究の症例のように、皮膚線維症に顕著な効果を与えることができないため、線維症を完全に阻害し、逆転させる目標はまだ達成されていない。同様に、抗炎症薬の使用は線維症に影響を与えないことがあり、これは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者の腸線維症の場合によくみられる２１、２２。しかし、臓器線維症における線維性コラーゲン及びそれらの架橋の関与の知識並びに評価が高まるにつれ、新しい潜在的標的が明らかにされている。これらには、ＬＯＸＬ２／３２３及びＴＧ２２４の小分子阻害剤、並びにＲｈｏキナーゼ２５を標的とすることによって線維化促進細胞内シグナル伝達カスケードを阻害する阻害剤が含まれる。現在、肝線維症２６及び腎臓線維症２７におけるゴールデンスタンダードである組織生検、及び腸線維症２８及び肺線維症２９に使用される煩雑又は侵襲的な他の方法のいずれかと共に、新規血清学的バイオマーカーを適用することができる。架橋された線維性コラーゲンの断片を標的とする線維症の重要な部分を提供することは、線維症解消の正確な評価を潜在的に助けることができる。これは、それぞれコラーゲンＩ型及びＩＩ型の架橋の分解断片を測定するＣＴＸ－Ｉ３０及びＣＴＸ－ＩＩ３１バイオマーカーの適用により骨吸収及び軟骨破壊の臨床設定で部分的に示された。そのため、線維症解消のバイオマーカーとして架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の新規バイオマーカーを開発する必要がある。
抗線維化療法の効果を決定するために、高感度で、信頼性があり、最適な低侵襲性の評価方法が必要である。現在の治療上の選択肢として、ニンテダニブ及びピルフェニドンは、特発性肺線維症１８、１９の患者において観察されたように進行を遅くするだけか、又は強皮症２０の研究の症例のように、皮膚線維症に顕著な効果を与えることができないため、線維症を完全に阻害し、逆転させる目標はまだ達成されていない。同様に、抗炎症薬の使用は線維症に影響を与えないことがあり、これは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者の腸線維症の場合によくみられる２１、２２。しかし、臓器線維症における線維性コラーゲン及びそれらの架橋の関与の知識並びに評価が高まるにつれ、新しい潜在的標的が明らかにされている。これらには、ＬＯＸＬ２／３２３及びＴＧ２２４の小分子阻害剤、並びにＲｈｏキナーゼ２５を標的とすることによって線維化促進細胞内シグナル伝達カスケードを阻害する阻害剤が含まれる。現在、肝線維症２６及び腎臓線維症２７におけるゴールデンスタンダードである組織生検、及び腸線維症２８及び肺線維症２９に使用される煩雑又は侵襲的な他の方法のいずれかと共に、新規血清学的バイオマーカーを適用することができる。架橋された線維性コラーゲンの断片を標的とする線維症の重要な部分を提供することは、線維症解消の正確な評価を潜在的に助けることができる。これは、それぞれコラーゲンＩ型及びＩＩ型の架橋の分解断片を測定するＣＴＸ－Ｉ３０及びＣＴＸ－ＩＩ３１バイオマーカーの適用により骨吸収及び軟骨破壊の臨床設定で部分的に示された。そのため、線維症解消のバイオマーカーとして架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の新規バイオマーカーを開発する必要がある。
【0009】
好酸球性食道炎
好酸球性食道炎（ＥｏＥ）は、好酸球の顕著な流入及びＴｈ２細胞促進炎症を特徴とする食道の食物アレルゲン誘発性慢性炎症である。Ｔｈ２炎症経路の活性化は好酸球の動員をもたらし、次に、形質転換成長因子βなどの炎症促進及び線維化促進メディエータを分泌させる。時間と共に、線維化促進メディエータの持続的炎症及び分泌は、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化を開始し、線維形成をもたらす［４６～４８］。筋線維芽細胞は組織線維症における主細胞であり、コラーゲン並びにリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）及びＬＯＸ様酵素（ＬＯＸＬ）などの架橋酵素を顕著に分泌する。食道生検のマッソントリクローム染色による組織学的評価は、粘膜固有層の上皮下区画におけるコラーゲンの顕著な沈着を示す［４６、４９］。
好酸球性食道炎（ＥｏＥ）は、好酸球の顕著な流入及びＴｈ２細胞促進炎症を特徴とする食道の食物アレルゲン誘発性慢性炎症である。Ｔｈ２炎症経路の活性化は好酸球の動員をもたらし、次に、形質転換成長因子βなどの炎症促進及び線維化促進メディエータを分泌させる。時間と共に、線維化促進メディエータの持続的炎症及び分泌は、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化を開始し、線維形成をもたらす［４６～４８］。筋線維芽細胞は組織線維症における主細胞であり、コラーゲン並びにリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）及びＬＯＸ様酵素（ＬＯＸＬ）などの架橋酵素を顕著に分泌する。食道生検のマッソントリクローム染色による組織学的評価は、粘膜固有層の上皮下区画におけるコラーゲンの顕著な沈着を示す［４６、４９］。
【0010】
進行性の線維性狭窄（ｆｉｂｒｏｓｔｅｎｏｓｉｓ）が食道狭窄及び狭窄形成をもたらし得るので、一般的な臨床症状には、線維症が本質的な役割を担う嚥下障害及び食片圧入が含まれる。ＥｏＥの診断は、主に、嚥下障害を経験している患者における内視鏡評価及び食道生検に基づく［５０］。ＥｏＥの斑状性により、単一生検は５５％の感度で不十分である［５１］。したがって、合計６つの生検が得られると、感度が９９％まで高まる［５２］。内視鏡検査では臨床症状を視覚的に確認できるが、ＥｏＥ患者の最高１０％が内視鏡所見を示さないため、全ての患者に生検が必要である。食道生検は、上部内視鏡検査及び鎮静を必要とするので、血液ベースのバイオマーカーなどの別の方法が開発されている。いくつかの血清バイオマーカーが評価されている［５３、５４］が、血液ベースのバイオマーカーの使用は、ＥｏＥについては現在、臨床では一般に使用されていない。そのため、血液ベースのバイオマーカーなどの低侵襲性ツールに対する必要性が医療で存在する。同様に、ＥｏＥについては、炎症性腸疾患で得られたデータ［５５、５６］に、線維形成又は線維溶解のいずれかを反映するコラーゲン代謝産物を標的とする血液ベースのバイオマーカーを適用することができる。これらのバイオマーカーは、早期の介入を可能にする内視鏡検査によって観察できない無症候性線維症を有する患者の早期特定を助けることができる。さらに、代謝産物の分解は、上皮下炎症又は線維症の解消を反映し、治療効果を反映し得る。したがって、コラーゲンリモデリングの検証済み血液ベースバイオマーカーの導入は、組織生検の必要性を潜在的に制限する深部組織食道リモデリングを評価するための本質的なツールを提供することができる。
【0011】
さらなるツールには、線維性狭窄に関連付けられる圧力が高まる食道の物理的性質の情報を提供する高解像度マノメトリーが含まれる［５７］。さらに、サイトスポンジ（Ｃｙｔｏｓｐｏｎｇｅ）を用いたブラシ細胞診の結果は、内視鏡的所見と相関し、近位と遠位の食道好酸球増加症の両方に対して良好な感度及び特異性を示した［５８］。
【0012】
炎症性腸疾患
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の病理学的不均一性及び特にクローン病（ＣＤ）の亜型の病理は、いくつかの疾患分類システムの作成を必要としている。臨床医による患者の評価及び病理学的評価を含む臨床パラメータは、臨床的に不活性な又は活性のある疾患の決定をもたらした［６３、６４］。さらに、内視鏡検査に基づくモントリオール分類の使用は、非狭窄かつ非穿通（Ｂ１）、狭窄（Ｂ２）又は穿通（Ｂ３）などの内視鏡症状に基づく患者の層別化を可能にする疾患の視覚的及びより客観的な分類を提供する［６５］。狭窄及び瘻孔は、線維性狭窄、組織、特にコラーゲンの過剰な蓄積、又は貫通傷をもたらす重度の組織及びコラーゲンの分解のいずれかによって特徴づけられるＣＤの２つの重篤な合併症である。細胞外マトリックス中のコラーゲンは、腸組織でかなりの割合を占めており、健康な腸組織と炎症した腸組織の両方において重要な構造的な及びシグナル伝達の指示を有する［６６］。ＩＢＤにおける慢性炎症の結果として、間質マトリックス中の活性化筋線維芽細胞は、ＬＯＸ（Ｌ）及びＴＧ２などの架橋酵素と組み合わせて、Ｉ型、ＩＩＩ型及びＶ型コラーゲンなどの顕著な量の線維性コラーゲンを沈着させる。このプロセスは、最終的に、炎症とは無関係に線維化プロセスを広める広範なコラーゲン架橋により、マトリックス剛性を増強させる［６７］。さらに、筋線維芽細胞及び動員された炎症細胞は、コラーゲンのリモデリングを促進するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）などの大量のＥＣＭ分解プロテアーゼを産生する。線維性狭窄によって引き起こされる狭窄疾患は、コラーゲンの広範な沈着及び架橋の結果であるが、穿通疾患は、コラーゲンのタンパク質分解の優位性によって特徴付けられる。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の病理学的不均一性及び特にクローン病（ＣＤ）の亜型の病理は、いくつかの疾患分類システムの作成を必要としている。臨床医による患者の評価及び病理学的評価を含む臨床パラメータは、臨床的に不活性な又は活性のある疾患の決定をもたらした［６３、６４］。さらに、内視鏡検査に基づくモントリオール分類の使用は、非狭窄かつ非穿通（Ｂ１）、狭窄（Ｂ２）又は穿通（Ｂ３）などの内視鏡症状に基づく患者の層別化を可能にする疾患の視覚的及びより客観的な分類を提供する［６５］。狭窄及び瘻孔は、線維性狭窄、組織、特にコラーゲンの過剰な蓄積、又は貫通傷をもたらす重度の組織及びコラーゲンの分解のいずれかによって特徴づけられるＣＤの２つの重篤な合併症である。細胞外マトリックス中のコラーゲンは、腸組織でかなりの割合を占めており、健康な腸組織と炎症した腸組織の両方において重要な構造的な及びシグナル伝達の指示を有する［６６］。ＩＢＤにおける慢性炎症の結果として、間質マトリックス中の活性化筋線維芽細胞は、ＬＯＸ（Ｌ）及びＴＧ２などの架橋酵素と組み合わせて、Ｉ型、ＩＩＩ型及びＶ型コラーゲンなどの顕著な量の線維性コラーゲンを沈着させる。このプロセスは、最終的に、炎症とは無関係に線維化プロセスを広める広範なコラーゲン架橋により、マトリックス剛性を増強させる［６７］。さらに、筋線維芽細胞及び動員された炎症細胞は、コラーゲンのリモデリングを促進するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）などの大量のＥＣＭ分解プロテアーゼを産生する。線維性狭窄によって引き起こされる狭窄疾患は、コラーゲンの広範な沈着及び架橋の結果であるが、穿通疾患は、コラーゲンのタンパク質分解の優位性によって特徴付けられる。
【0013】
臨床パラメータ及び内視鏡検査は、ＩＢＤ分野における標準化された方法を表す。臨床パラメータを決定するためのアンケートは、組織の症状の客観的及び適切な特定を欠く。さらに、現在、ゴールドスタンダードの内視鏡検査は、患者に不快感を与え、小腸への到達が限られており、かつ検証済みの組織病理学的システムがなく［６８］、小腸の領域に到達することが制限されるため、ＣＤ患者に影響を及ぼす場合が多い。ＭＲＥなどのより最近の技術は、疾患の症状を評価するための非侵襲的かつ高精度のツールとなっているが、取り扱い費用が増加している［６９］。
【0014】
したがって、様々な疾患の症状を促進する根底の分子プロセスを評価することができる非侵襲性バイオマーカー、特に、腸の線維形成及び腸線維症の解消を反映するマーカーの開発が緊急に必要である。
【0015】
癌
何年もの熱心な研究にもかかわらず、癌は、世界中の死亡の第２の主要な原因のままである。癌患者の生存における重要な要素は、早期診断及び治療に対する応答を予測する能力である。
何年もの熱心な研究にもかかわらず、癌は、世界中の死亡の第２の主要な原因のままである。癌患者の生存における重要な要素は、早期診断及び治療に対する応答を予測する能力である。
【0016】
臓器線維症と同様に、癌は、ＥＣＭリモデリングの病理学的な程度によって特徴付けられる［７２］［７３］。ここで、癌及び間質細胞は、コラーゲンを含む周囲のＥＣＭ構成成分を分解するＭＭＰを大量に分泌する。ＥＣＭの分解に加えて、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）は、ＬＯＸ（Ｌ）及びＴＧ２による多くの酵素架橋に供される腫瘍間質内にコラーゲンを顕著に沈着させ、腫瘍の進行を増強する［７４］［７５］。このプロセスは、細胞のシグナル伝達、増殖、分化、遺伝子発現、遊走、浸潤、及び転移を調節する［７６］［７７］。このようにＣＡＦが先導して、線維性コラーゲンの整列及び酵素的架橋が、腫瘍細胞を浸潤させる道を開く。さらに、高度に架橋されたＥＣＭは、Ｔ細胞の遊走を妨げ、それによって宿主免疫系から腫瘍細胞を遮蔽すると考えられている［７８］。この遮蔽効果は、ある種の癌患者の免疫療法への応答が不十分である理由を説明し得る［７８］［７９］。
【0017】
線維性コラーゲン沈着並びに腫瘍の進行及び治療応答におけるその後の酵素的架橋の重要な役割を強調する証拠が見出されているので、ＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーを広範な癌の種類において調査した。ＣＴＸ－ＩＩＩの定量及びその後の患者の層別化は、腫瘍間質内の分子プロセスを評価し、免疫療法から潜在的に恩恵を受ける患者を特定するのを助ける可能性がある。
【0018】
ＷＯ２０１７８／３４１７２は、適切な試料中のＩＩＩ型コラーゲン（ＰＩＩＩＮＰ）の架橋されたＮ末端プロペプチドを線維症のマーカーとして測定することを説明している。この方法は、ＷＯ２０１４／１７０３１２に開示されたモノクローナル抗体を利用した。このマーカーは、形成プロセスにおいて単独で生成される。
【0019】
本出願者は、Ｃプロテイナーゼによって生成され、その後、追加の未知のプロテアーゼによって断片を放出する架橋ＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチドのネオエピトープを標的とし、線維性ＥＣＭの分解を正確に評価することができる高感度イムノアッセイを開発した。
【0020】
架橋ＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチドネオエピトープを標的とする高度に特異的なモノクローナル抗体を用いて、直接サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発した。このアッセイは、線維溶解の定量的評価として臨床設定で使用することができる。
【発明の概要】
【0021】
本発明は、架橋ＣＴ－ＩＩＩが鎖間架橋によって一緒に結合された少なくとも２つのＣＴ－ＩＩＩ鎖を含む架橋Ｃ末端テロペプチドＩＩＩコラーゲン（ＣＴ－ＩＩＩ）を生体試料中で検出するためのサンドイッチイムノアッセイを対象とする。本方法は、架橋ＣＴ－ＩＩＩに含まれるＣＴ－ＩＩＩの各鎖が、インタクトなＩＩＩ型プロコラーゲンのＮプロテアーゼ切断によって生成されたＣＴ－ＩＩＩのＣ末端ネオエピトープを有する架橋ＣＴ－ＩＩＩを含む生体試料を、表面に結合した第１のモノクローナル抗体と接触させること、及び第２のモノクローナル抗体を添加することを含む。両方のモノクローナル抗体は、ＣＴ－ＩＩＩのＣ末端ネオエピトープと特異的に反応し、前記ネオエピトープは、Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ－ＣＯＯＨ（配列番号１）に含まれる。本方法は、第２のモノクローナル抗体の結合量を決定することをさらに含む。
【0022】
本明細書で使用する用語「ＣＴ－ＩＩＩ」は、ＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチドを指す。
【0023】
本発明はまた、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とするアンタゴニスト薬の有効性を評価する方法を対象とする。本方法は、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、対象へのアンタゴニスト薬の投与期間中の最初の時点及び少なくとも１つのその後の時点で対象から得られる少なくとも２つの生体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量することを含む。アンタゴニスト薬の投与期間中の最初の時点から少なくとも１つのその後の時点までの間の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量の低下は、ＬＯＸを標的とする有効なアンタゴニスト薬を示す。
【0024】
本発明はさらに、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイに使用するためのキットに関する。該キットは、上記の第１のモノクローナル抗体を結合している固体支持体と、本明細書に記載の標識された第２のモノクローナル抗体を含む。
【0025】
本発明はまた、線維症を有する患者の線維症応答表現型を特定する方法であって、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者から得られた生物学的流体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量すること、並びに前記架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とｉ）既知の線維性応答表現型と関連付けられる値及び／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させることを含む方法を対象とする。本方法はさらに、生物学的流体試料中に存在するＮ末端ＩＩＩ型コラーゲンプロペプチド（ＰＲＯ－Ｃ３）の量を定量すること、ＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比を決定すること、及びＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の前記比と所定のカットオフ値を相関させることをさらに含み得る。
【発明の効果】
【0026】
発明の説明
したがって、第１の態様において、本発明は、Ｃ末端がアミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１）（本明細書では標的配列ともいう）を有する架橋ＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチドネオエピトープ（本明細書では標的ペプチドとも呼ばれる）を特異的に認識し、結合するモノクローナル抗体に関する。
したがって、第１の態様において、本発明は、Ｃ末端がアミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１）（本明細書では標的配列ともいう）を有する架橋ＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチドネオエピトープ（本明細書では標的ペプチドとも呼ばれる）を特異的に認識し、結合するモノクローナル抗体に関する。
【0027】
好ましくは、該モノクローナル抗体は、Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して作られたモノクローナル抗体である。抗体を作るために使用される合成ペプチドは、そのＮ末端で担体タンパク質に連結された合成ペプチドであり得る。例示的な担体タンパク質には、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などのタンパク質が含まれるが、これに限定されない。合成ペプチドは、ペプチドのＮ末端に１以上の追加のアミノ酸残基を含み得る担体タンパク質に任意の適切な結合を介して連結され得る。該モノクローナル抗体は、限定されないが、マウス又は他の哺乳動物を免疫すること、免疫された哺乳動物から脾臓細胞を分離し、ハイブリドーマ細胞と融合させること、及びその後、得られたハイブリドーマ細胞を培養してモノクローナル増殖を確実にすることなどの、当業者に公知の適切な技術を介して作製されている場合もある。
【0028】
好ましい実施形態では、該モノクローナル抗体は、Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＸ（配列番号２）を有し、その中のＸは任意のアミノ酸を表すペプチドを特異的に認識しないか、又はそれと結合しない。そのため、該モノクローナル抗体は、好ましくは、標的アミノ酸配列が１以上のアミノ酸によってＣ末端で伸長された標的ペプチドの伸長変異体を特異的に認識しないか、又はそれと結合しない。好ましくは、該モノクローナル抗体は、ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＤＺ－ＣＯＯＨ（配列番号３）であり、その中のＺは存在しないか、又はコラーゲンＩＩＩ型の配列の１以上のアミノ酸である前記Ｃ末端アミノ酸配列の伸長バージョンを実質的に認識しないか、又はそれと結合しない。好ましくは、前記モノクローナル抗体は、好ましくは、Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＤ（配列番号４）を有するペプチドを特異的に認識しないか、又はそれと結合しない。
【0029】
好ましい実施形態では、該モノクローナル抗体は、Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹ（配列番号５）を有するペプチドを特異的に認識しないか、又はそれと結合しない。そのため、該モノクローナル抗体は、好ましくは、標的アミノ酸配列が１以上のアミノ酸をＣ末端で切断された標的ペプチドの短縮変異体を特異的に認識しないか、又はそれと結合しない。
【0030】
好ましくは、該モノクローナル抗体又はその断片は、好ましくは、以下のもの：
ＣＤＲ－Ｌ１：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号６）
ＣＤＲ－Ｌ２：ＲＭＳＮＬＡＳ（配列番号７）
ＣＤＲ－Ｌ３：ＭＱＨＬＥＦＰＬＴ（配列番号８）
ＣＤＲ－Ｈ１：ＤＨＧＭＨ（配列番号９）
ＣＤＲ－Ｈ２：ＶＩＳＴＹＹＧＤＡＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１０）
ＣＤＲ－Ｈ３：ＳＭＧＧＮＹＶＧＴＧＦＡＹ（配列番号１１）
から選択される１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。
ＣＤＲ－Ｌ１：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号６）
ＣＤＲ－Ｌ２：ＲＭＳＮＬＡＳ（配列番号７）
ＣＤＲ－Ｌ３：ＭＱＨＬＥＦＰＬＴ（配列番号８）
ＣＤＲ－Ｈ１：ＤＨＧＭＨ（配列番号９）
ＣＤＲ－Ｈ２：ＶＩＳＴＹＹＧＤＡＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１０）
ＣＤＲ－Ｈ３：ＳＭＧＧＮＹＶＧＴＧＦＡＹ（配列番号１１）
から選択される１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。
【0031】
好ましくは、該抗体又はその断片は、上記のＣＤＲ配列のうちの少なくとも２、３、４、５又は６つを含む。
【0032】
好ましくは、該モノクローナル抗体又はその断片は、ＣＤＲ配列を含む軽鎖可変領域を有する。
ＣＤＲ－Ｌ１：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号６）
ＣＤＲ－Ｌ２：ＲＭＳＮＬＡＳ（配列番号７）及び
ＣＤＲ－Ｌ３：ＭＱＨＬＥＦＰＬＴ（配列番号８）
ＣＤＲ－Ｌ１：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号６）
ＣＤＲ－Ｌ２：ＲＭＳＮＬＡＳ（配列番号７）及び
ＣＤＲ－Ｌ３：ＭＱＨＬＥＦＰＬＴ（配列番号８）
【0033】
好ましくは、該モノクローナル抗体又はその断片は、ＣＤＲ間のフレームワーク配列を含む軽鎖を有し、前記フレームワーク配列は、以下の軽鎖配列中のＣＤＲ間のフレームワーク配列と実質的に同一又は実質的に類似している（その中のＣＤＲは太字で示され、下線が引かれており、フレームワーク配列はイタリックで示されている）。
RSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEFPLT（配列番号１２）
RSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEFPLT（配列番号１２）
【0034】
好ましくは、該モノクローナル抗体又はその断片は、ＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域を有する。
ＣＤＲ－Ｈ１：ＤＨＧＭＨ（配列番号９）
ＣＤＲ－Ｈ２：ＶＩＳＴＹＹＧＤＡＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１０）及び
ＣＤＲ－Ｈ３：ＳＭＧＧＮＹＶＧＴＧＦＡＹ（配列番号１１）
ＣＤＲ－Ｈ１：ＤＨＧＭＨ（配列番号９）
ＣＤＲ－Ｈ２：ＶＩＳＴＹＹＧＤＡＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１０）及び
ＣＤＲ－Ｈ３：ＳＭＧＧＮＹＶＧＴＧＦＡＹ（配列番号１１）
【0035】
好ましくは、該モノクローナル抗体又はその断片は、ＣＤＲ間のフレームワーク配列を含む重鎖を有し、前記フレームワーク配列は、以下の軽鎖配列中のＣＤＲ間のフレームワーク配列と実質的に同一又は実質的に類似している（その中のＣＤＲは太字で示され、下線で示されており、フレームワーク配列はイタリックで示されている）。
DHGMHWVKQSQAKSLEWIGVISTYYGDATYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARSMGGNYVGTGFAY（配列番号１３）
DHGMHWVKQSQAKSLEWIGVISTYYGDATYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARSMGGNYVGTGFAY（配列番号１３）
【0036】
本明細書で使用されるように、抗体のＣＤＲ間のフレームワークアミノ酸配列は、それらが少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは少なくとも９５％の類似性又は同一性を有する場合、別の抗体のＣＤＲ間のフレームワークアミノ酸配列と実質的に同一又は実質的に類似している。類似又は同一のアミノ酸は、近接していても、又はしていなくてもよい。
【0037】
フレームワーク配列は、１以上のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含み得る。アミノ酸置換は保存的であり得、それは、置換アミノ酸が元のアミノ酸と類似の化学的性質を有することを意味する。当業者は、どのアミノ酸が類似の化学的性質を共有するかを理解する。例えば、以下のアミノ酸のグループ：グループ１ Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；グループ２ Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；グループ３ Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；グループ４ Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ；グループ５ Ｐｈｅ Ｔｈｙ Ｔｒｐは、サイズ、電荷及び極性などの類似の化学的性質を共有する。
【0038】
ＣＬＵＳＴＡＬプログラムなどのプログラムを用いて、アミノ酸配列を比較することができる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、いずれかの配列に適切にスペースを挿入することにより最適なアライメントを見出す。最適なアライメントのためのアミノ酸同一性又は類似性（同一性プラスアミノ酸の種類の保存）を計算することが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似の配列の最長ストレッチを整列させ、値を適合度に割り当てる。そのため、いくつかの類似性領域が見出され、各々が異なるスコアを有する比較を得ることが可能である。両方の種類の分析が本発明において企図される。同一性又は類似性が、好ましくは、フレームワーク配列の全長にわたって計算される。
【0039】
ある好ましい実施形態では、該モノクローナル抗体又はその断片は、軽鎖可変領域配列：
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEFPLTFGAGTKLELK（配列番号１４）（ＣＤＲは太字で、下線を付した；フレームワーク配列はイタリック体である）
及び／又は重鎖可変領域配列：
QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGSGHTFTDHGMHWVKQSQAKSLEWIGVISTYYGDATYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARSMGGNYVGTGFAYWGQGTLVTVSA（配列番号１５）（ＣＤＲは太字で、下線を付した；フレームワーク配列はイタリック体である）
を含み得る。
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEFPLTFGAGTKLELK（配列番号１４）（ＣＤＲは太字で、下線を付した；フレームワーク配列はイタリック体である）
及び／又は重鎖可変領域配列：
QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGSGHTFTDHGMHWVKQSQAKSLEWIGVISTYYGDATYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARSMGGNYVGTGFAYWGQGTLVTVSA（配列番号１５）（ＣＤＲは太字で、下線を付した；フレームワーク配列はイタリック体である）
を含み得る。
【0040】
本発明は、生体試料においてＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴ－ＩＩＩ）の架橋Ｃ末端テロペプチドを検出するためのサンドイッチイムノアッセイであって、前記架橋ＣＴ－ＩＩＩは、鎖間架橋によって共に結合された少なくとも２つのＣＴ－ＩＩＩ鎖を含み、
前記方法が、前記架橋ＣＴ－ＩＩＩを含む前記生体試料を、表面に結合した第１のモノクローナル抗体と接触させること、その際、架橋ＣＴ－ＩＩＩに含まれるＣＴ－ＩＩＩの各鎖が、インタクトなＩＩＩ型コラーゲンのＣプロテイナーゼ切断によって生成されるＣＴ－ＩＩＩのＣ末端ネオエピトープを含み；
第２のモノクローナル抗体を添加すること；及び
前記第２のモノクローナル抗体の結合量を決定すること；
を含み、
前記第１のモノクローナル抗体と前記第２のモノクローナル抗体の両方が、ＣＴ－ＩＩＩの前記Ｃ末端ネオエピトープと特異的に反応し、前記ネオエピトープが、Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ－ＣＯＯＨ（配列番号１）に含まれる、サンドイッチイムノアッセイに関する。
前記方法が、前記架橋ＣＴ－ＩＩＩを含む前記生体試料を、表面に結合した第１のモノクローナル抗体と接触させること、その際、架橋ＣＴ－ＩＩＩに含まれるＣＴ－ＩＩＩの各鎖が、インタクトなＩＩＩ型コラーゲンのＣプロテイナーゼ切断によって生成されるＣＴ－ＩＩＩのＣ末端ネオエピトープを含み；
第２のモノクローナル抗体を添加すること；及び
前記第２のモノクローナル抗体の結合量を決定すること；
を含み、
前記第１のモノクローナル抗体と前記第２のモノクローナル抗体の両方が、ＣＴ－ＩＩＩの前記Ｃ末端ネオエピトープと特異的に反応し、前記ネオエピトープが、Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ－ＣＯＯＨ（配列番号１）に含まれる、サンドイッチイムノアッセイに関する。
【0041】
好ましくは、該モノクローナル抗体は、ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＤＺ－ＣＯＯＨ（配列番号３）であり、その中のＺは存在しないか、又はコラーゲンＩＩＩ型の配列の１以上のアミノ酸である前記Ｃ末端アミノ酸配列の伸長したバージョンを実質的に認識しないか、又はそれと結合しない。
【0042】
好ましくは、該モノクローナル抗体は、ＫＡＧＧＦＡＰＹＹ－ＣＯＯＨ（配列番号５）である前記Ｃ末端アミノ酸配列の切断バージョンを実質的に認識しないか、又はそれと結合しない。
【0043】
本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイは、捕捉抗体と検出抗体の両方として同じ抗体を使用するので、二本鎖ペプチド（すなわち、架橋されている）がアッセイによって認識され得る。
【0044】
好ましくは、サンドイッチイムノアッセイは、生物学的流体中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量するために使用され、前記生物学的流体は、限定されないが、血清、血漿、尿、羊水、組織上清又は細胞上清であり得る。
【0045】
サンドイッチイムノアッセイは、限定されないが、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、又は酵素結合免疫吸着アッセイであり得る。
【0046】
好ましい実施形態では、第２のモノクローナル抗体の結合量を決定するために、第２のモノクローナル抗体が標識され得る。
【0047】
好ましくは、第２のモノクローナル抗体は酵素結合抗体であり得る。酵素は、限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり得る。
【0048】
好ましくは、第２のモノクローナル抗体は放射性標識されるか、又はフルオロフォアに連結されてもよい。
【0049】
これらは本発明で使用される好ましい標識であるが、限定されないが、ＤＮＡレポーター又は電気化学発光タグなどの任意の適切な標識システムが使用され得ることが考えられる。
【0050】
あるいは、第２のモノクローナル抗体を認識するさらなる標識抗体を用いて、前記第２のモノクローナル抗体の結合量を決定してよい。さらなる標識抗体は、上記の標識を用いて標識され得る。
【0051】
本発明の好ましい実施形態では、サンドイッチイムノアッセイは、前記方法により決定された架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を、既知の疾患の重篤度の標準的な疾患試料と相関させて、疾患の重篤度を評価することをさらに含み得る。疾患は線維性疾患であり得る。そのような線維性疾患は、限定されないが、肝疾患、特に非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、又はＨＣＶ関連肝線維症などのウイルス性肝線維症であり得る。あるいは、疾患は慢性腸疾患であり得る。そのような慢性腸疾患は、限定されないが、クローン病又は潰瘍性大腸炎、好ましくはクローン病であり得る。あるいは、疾患は癌であり得る。そのような癌は、限定されないが、乳癌、膀胱癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、卵巣癌、肝臓癌、前立腺癌、又は黒色腫であり得る。好ましくは、癌は乳癌である。
【0052】
サンドイッチイムノアッセイを用いて、前記方法によって決定された架橋ＣＴ－ＩＩＩの量と、異なる時点で同じ患者から得られた第２の試料において決定された架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とを比較することによって、疾患の進行を監視することもできる。第２の試料は、試料が試験される前後数時間、数日、数週、又は数年に得ることができる。複数の試料を異なる時点で取得して、架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を決定し、結果を比較することができる。治療が成功したかどうかを識別するために、治療後の疾患の進行を監視するためにサンドイッチイムノアッセイを用いることができる。好ましくは、疾患は線維性疾患である。そのような線維性疾患は、限定されないが、肝疾患、特に非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、又はＨＣＶ関連肝線維症などのウイルス性肝線維症であり得る。あるいは、疾患は好酸球性食道炎であり得る。あるいは、疾患は慢性腸疾患であり得る。そのような慢性腸疾患は、限定されないが、クローン病又は潰瘍性大腸炎、好ましくはクローン病であり得る。あるいは、疾患は癌であり得る。そのような癌は、限定されないが、乳癌、膀胱癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、卵巣癌、肝臓癌、前立腺癌、又は黒色腫であり得る。好ましくは、癌は乳癌である。
【0053】
本明細書に記載のサンドイッチアッセイは、好ましくは、試料中に存在するＰＲＯ－Ｃ３の量を決定することによって、ＩＩＩ型コラーゲン形成の量を決定することをさらに含み得る。
【0054】
ＰＲＯ－Ｃ３と架橋ＣＴ－ＩＩＩ（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比を用いて、いくつかの疾患状態において顕著に上昇しているＩＩＩ型コラーゲンの正味の沈着を決定することができる。Ｐｒｏ－Ｃ３は、コラーゲン形成の間に生成され、コラーゲン形成の尺度であるが、ＣＴＸ－ＩＩＩは、分解中に生成され、分解の尺度である。したがって、ＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＣＴ－ＩＩＩ（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比を用いて、いくつかの疾患状態において顕著に上昇している正味の線維溶解を決定することができる。例えば、ＨＣＶ関連肝線維症患者の中のＩｓｈａｋスコア（線維症の重篤度の指標）がより低い患者は、Ｉｓｈａｋスコアがより高い患者と比較して、より高い正味の線維溶解度を有していた。さらに、クローン病及び潰瘍性大腸炎患者では、Ｂ１のモントリオール分類によって示されるあまり重篤ではない疾患、すなわち非狭窄かつ非穿通疾患の患者は、Ｂ２のモントリオール分類を有する患者と比較して、より高い正味の線維溶解度を有していた。さらに、乳癌患者では、ステージＩＩＩ（癌の重篤度の指標）の患者は、ステージＩＩの患者と比較して、より高い正味の線維溶解度を有していた。
【0055】
さらなる態様では、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイは、ＬＯＸを標的とするアンタゴニスト薬などのリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とする薬物の有効性を評価する方法において使用され得る。
【0056】
したがって、本発明はまた、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とするアンタゴニスト薬の有効性を評価する方法であって、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、少なくとも２つの生体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量することを含み、前記生体試料は、前記対象へのアンタゴニスト薬の投与期間中の最初の時点及び少なくとも１つのその後の時点で対象から得たものであり、アンタゴニスト薬の投与期間中の前記最初の時点から少なくとも１つのその後の時点までの間の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量の低下は、ＬＯＸを標的とする有効なアンタゴニスト薬を示す方法に関する。
【0057】
好ましくは、本方法は、アンタゴニスト薬の有効性を定量化する。
【0058】
好ましくは、本方法は、ＬＯＸＬ２を標的とするアンタゴニスト薬の有効性を評価する。
【0059】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイで使用するためのキットであって、上記の第１のモノクローナル抗体を結合している固体支持体；及び上記の標識された第２のモノクローナル抗体を含むキットに関する。
【0060】
別の態様では、本発明はまた、線維症を有する患者の線維症応答表現型を特定する方法であって、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者から得られた生物学的流体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量すること、並びに前記架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とｉ）既知の線維性応答表現型と関連付けられる値及び／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させることを含む方法に関する。本方法はさらに、生物学的流体試料中に存在するＰＲＯ－Ｃ３の量を定量すること、ＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比を決定すること、及びＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の前記比と所定のカットオフ値を相関させることをさらに含み得る。
【0061】
決定された架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を、所定のカットオフ値と比較することができる。所定のカットオフ値は、好ましくは少なくとも３．５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも３．８ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは少なくとも４．０ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは少なくとも４．２ｎｇ／ｍＬ、及び最も好ましくは少なくとも４．５ｎｇ／ｍＬである。この点に関して、様々な統計解析の併用により、モノクローナル抗体（上記）と少なくとも３．５ｎｇ／ｍＬ以上のＣ末端ＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーとの間の測定された結合量は、「自然退行性」表現型を有する患者を決定するものであり得ることが見出された。少なくとも３．５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも３．８ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは少なくとも４．０ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは少なくとも４．２ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも４．５ｎｇ／ｍＬの統計的カットオフ値を有することにより、本発明の方法を利用して、自然退行性表現型を有する患者を高レベルの信頼性で特定することが可能である。
【0062】
試料中の測定された架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）及びＩＩＩ型コラーゲン（ＰＲＯ－Ｃ３）の比を、所定のカットオフ値と比較することができる。所定のカットオフ値は、好ましくは少なくとも０．５、より好ましくは少なくとも０．６、さらにより好ましくは少なくとも０．７５、さらにより好ましくは少なくとも０．８、及び最も好ましくは少なくとも０．９である。この点に関して、様々な統計解析の併用により、少なくとも０．５以上の架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）及びＩＩＩ型コラーゲン（ＰＲＯ－Ｃ３）の比は、自然退行性表現型を有する患者を決定するものであり得ることが見出された。好ましくは少なくとも０．５、より好ましくは少なくとも０．６、さらにより好ましくは少なくとも０．７５、さらにより好ましくは少なくとも０．８、及び最も好ましくは少なくとも０．９の統計的カットオフ比の値を有することによって、本発明の方法を利用して、自然退行性表現型を有する患者を高いレベルの信頼性で特定することが可能である。
【0063】
別の態様では、本発明はまた、線維性疾患を有する患者を特定する方法であって、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者から得られた生物学的流体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量すること、並びに前記架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とｉ）既知の線維性疾患患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させることを含む方法に関する。本方法はさらに、生物学的流体試料中に存在するＰＲＯ－Ｃ３の量を定量すること、ＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比を決定すること、及びＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の前記比と、ｉ）既知の線維性疾患患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させること、をさらに含み得る。正常な健常対照と比較して高いレベルの架橋ＣＴ－ＩＩＩ又は有意に異なる比は、線維性疾患を示す。
【0064】
線維性疾患は、限定されないが、肝疾患、特に非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、又はＨＣＶ関連肝線維症などのウイルス性肝線維症から選択され得る。
【0065】
別の態様では、本発明はまた、好酸球性食道炎患者を特定する方法であって、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者から得られた生物学的流体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量すること、並びに前記架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とｉ）既知の好酸球性食道炎患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させることを含む方法に関する。本方法はさらに、生物学的流体試料中に存在するＰＲＯ－Ｃ３の量を定量すること、ＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比を決定すること、及びＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の前記比と、ｉ）既知の好酸球性食道炎患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させることをさらに含み得る。正常な健常対照と比較して高いレベルの架橋ＣＴ－ＩＩＩ又は有意に異なる比は、好酸球性食道炎を示す。
【0066】
別の態様では、本発明はまた、慢性腸疾患患者を特定する方法であって、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者から得られた生物学的流体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量すること、並びに前記架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とｉ）既知の慢性腸疾患患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させることを含む方法に関する。本方法はさらに、生物学的流体試料中に存在するＰＲＯ－Ｃ３の量を定量すること、ＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比を決定すること、及びＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の前記比とｉ）既知の慢性腸疾患患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させることをさらに含み得る。正常な健常対照と比較して高いレベルの架橋ＣＴ－ＩＩＩ又は有意に異なる比は、慢性腸疾患の存在を示す。
【0067】
慢性腸疾患は、限定されないが、クローン病、又は潰瘍性大腸炎などの過敏性腸疾患から選択され得る。好ましくは、慢性腸疾患は、クローン病又は潰瘍性大腸炎であり、より好ましくはクローン病である。
【0068】
別の態様では、本発明はまた、癌患者を特定する方法であって、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者から得られた生物学的流体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量すること、並びに前記架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とｉ）既知の癌患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させることを含む方法に関する。本方法はさらに、生物学的流体試料中に存在するＰＲＯ－Ｃ３の量を定量すること、ＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比を決定すること、及びＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の前記比とｉ）既知の癌患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させることをさらに含み得る。正常な健常対照と比較して高いレベルの架橋ＣＴ－ＩＩＩ又は有意に異なる比は、癌の存在を示す。
【0069】
癌は、限定されないが、乳癌、膀胱癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、卵巣癌、肝臓癌、前立腺癌、又は黒色腫から選択され得る。好ましくは、癌は乳癌である。
【0070】
別の態様では、本発明は、治療から恩恵を受ける患者を特定する方法であって、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者から得られた生物学的流体試料中の架橋ＣＴ－ＩＩＩの量を定量すること、並びに前記架橋ＣＴ－ＩＩＩの量とｉ）既知の疾患患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させることを含む方法を提供する。本方法はさらに、生物学的流体試料中に存在するＰＲＯ－Ｃ３の量を定量すること、ＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の比を決定すること、及びＰＲＯ－Ｃ３に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の前記比とｉ）既知の疾患患者及び／若しくは正常な健常対照と関連付けられる値並びに／又はｉｉ）所定のカットオフ値を相関させることをさらに含み得る。正常な健常対照と比較して高いレベルの架橋ＣＴ－ＩＩＩ又は有意に異なる比は、治療の必要性を示す。
【0071】
本方法は、治療を患者に施すことをさらに含み得る。
【0072】
治療は、好ましくは、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とするアンタゴニスト薬などのコラーゲン架橋を標的とする薬物の投与である。
【0073】
疾患は線維性疾患であり得る。そのような線維性疾患は、限定されないが、肝疾患、特に非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、又はＨＣＶ関連肝線維症などのウイルス性肝線維症であり得る。あるいは、疾患は好酸球性食道炎であり得る。あるいは、疾患は慢性腸疾患であり得る。そのような慢性腸疾患は、限定されないが、クローン病、又は潰瘍性大腸炎などの過敏性腸症候群であり得る。あるいは、疾患は癌であり得る。そのような癌は、限定されないが、乳癌、膀胱癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、卵巣癌、肝臓癌、前立腺癌、又は黒色腫であり得る。好ましくは、癌は乳癌である。
【0074】
本発明の方法に統計的カットオフ値を適用することは、単独の診断アッセイをもたらすので、特に有利である。すなわち、診断の結論に到達するために、健常個体及び／又は既知の疾患の重篤度を有する患者との直接的な比較の必要性を取り除く。これはまた、初期の予後を実証するために、内視鏡検査又は生検などのより侵襲的な手順の必要性を取り除く可能性があり、適切な治療計画の開始を促進する迅速かつ確定的なツールとして機能し得るので、（例えば、物理的検査及び／又は医療専門家との相談によって決定されるように）一般的に線維症を示す医学的徴候又は症状を既に有する患者を評価するためのアッセイを利用する場合に特に有利であり得る。好ましくは、所定のカットオフ値は、ヒト血液、血清又は血漿中で測定されるカットオフ値に対応する。
【0075】
定義
本明細書で使用する用語「ネオエピトープ」は、ポリペプチドの末端、すなわちポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端のＮ末端又はＣ末端ペプチド配列を指し、その一般的な方向における意味として解釈されるべきではない。
本明細書で使用する用語「ネオエピトープ」は、ポリペプチドの末端、すなわちポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端のＮ末端又はＣ末端ペプチド配列を指し、その一般的な方向における意味として解釈されるべきではない。
【0076】
本明細書で使用する用語のモノクローナル抗体ＮＢＨ－２４２は、ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴ－ＩＩＩ）のＣ末端テロペプチドに位置するＣ末端ネオエピトープに対して作られたネオエピトープ特異的抗体を指し、前記ネオエピトープはＣ末端配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ－ＣＯＯＨ（配列番号１）を含む。
【0077】
本明細書で使用する用語「ＰＲＯ－Ｃ３」は、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドを指す。
【0078】
本明細書で使用する用語「ＰＣＸ３」は、ＩＩＩ型コラーゲンの架橋されたＮ末端プロペプチドを指す。
【0079】
本明細書で使用する用語「ＰＲＯ－Ｃ３アッセイ」は、以前に記載された３２Ｎ末端プロペプチド中のネオエピトープを検出及び定量するための競合ＥＬＩＳＡを指す。
【0080】
本明細書で使用する用語「ＰＣＸ３アッセイ」は、ＷＯ２０１７／１３４１７２に以前に記載された架橋されたＮ末端プロペプチドを検出及び定量するための競合ＥＬＩＳＡを指す。
【0081】
本明細書で使用する用語「ＣＴ－ＩＩＩ」は、ＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチドを指す。
【0082】
本明細書で使用する用語「ＣＴＸ－ＩＩＩ」は、鎖間架橋によって共に結合された少なくとも２つのＣＴ－ＩＩＩの鎖を含むＩＩＩ型コラーゲンの架橋Ｃ末端テロペプチドを指す。
【0083】
本明細書で使用する用語「ＣＴＸ－ＩＩＩ」アッセイは、架橋ＩＩＩ型コラーゲン、すなわち架橋ＣＴ－ＩＩＩのＣ末端テロペプチドネオエピトープを検出及び定量するための本明細書に記載のサンドイッチアッセイを指す。
【0084】
本明細書で使用する用語「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、同義的に使用される。
【0085】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、全抗体と、全抗体の結合特異性を保持する抗体の断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、又は当業者に公知の他のそのような断片などの両方を指す。同じ結合特異性を保持する抗体は、同一の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔら４５に記載されているものなどの当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。
【0086】
抗体は、実施例に記載されているように、Ｂ細胞クローンから作製することができる。抗体のアイソタイプは、ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ又はＩｇＡアイソタイプ、又はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブクラスに特異的なＥＬＩＳＡによって決定することができる。アイソタイプを特定するために、他の適切な方法を使用することができる。
【0087】
作製される抗体のアミノ酸配列は、標準的な技術を用いて決定することができる。例えば、ＲＮＡを細胞から単離することができ、逆転写によりｃＤＮＡを作製するために使用することができる。次いで、ｃＤＮＡを、抗体の重鎖及び軽鎖を増幅するプライマーを用いてＰＣＲにかける。例えば、全てのＶＨ（可変重鎖）配列についてはリーダー配列に特異的なプライマーを、以前に決定されたアイソタイプの定常領域に位置する配列に結合するプライマーと共に使用することができる。軽鎖は、Ｖカッパ又はＶラムダリーダー配列にアニールするプライマーと共にカッパ又はラムダ鎖の３’末端に結合するプライマーを用いて増幅することができる。全長の重鎖及び軽鎖を作製し、配列決定することができる。
【0088】
本明細書で使用する用語「Ｃ末端」は、ポリペプチドの末端、すなわちポリペプチドのＣ末端を意味し、その一般的な方向における意味として解釈されるべきではない。同様に、用語「Ｎ末端」は、ポリペプチドの末端、すなわちポリペプチドのＮ末端を指し、その一般的な方向における意味として解釈されるべきではない。
【0089】
本明細書で使用する用語「競合イムノアッセイ」は、試料中に存在する標的ペプチド（もしあれば）が既知量の（例えば、固定基質に結合されているか、又は標識されている）ペプチドの標的と抗体への結合について競合するイムノアッセイを指し、これは当業者に公知の技術である。
【0090】
本明細書で使用する用語「ＥＬＩＳＡ」（酵素結合免疫吸着アッセイ）は、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどの酵素と連結した抗体を用いて、試料中に存在する標的ペプチド（もしあれば）を検出するイムノアッセイを指す。次いで、酵素の活性を、測定可能な生成物を作製する基質とのインキュベーションにより評価する。これにより、試料中の標的ペプチドの存在及び／又は量を検出及び／又は定量することができる。ＥＬＩＳＡは当業者に公知の技術である。
【0091】
本明細書で使用する用語「サンドイッチイムノアッセイ」は、試料中の抗原の検出のための少なくとも２つの抗体の使用を指し、当業者に公知の技術である。
【0092】
本明細書で使用する用語「結合量」は、モノクローナル抗体と標的ペプチドとの間の結合の定量を指し、前記定量は、生物学的流体試料中の標的ペプチドの測定値を検量線と比較することによって決定され、検量線は、標的ペプチドの既知の濃度の標準試料を用いて作成される。生物学的流体中のＣ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１）を有する標的ペプチドを測定する本明細書に開示される特異的アッセイにおいて、検量線は、Ｃ末端アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１）を有する（特に、アミノ酸配列ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１）からなり得る）既知濃度の較正ペプチドの標準試料を用いて作成される。生物学的流体試料において測定された値を検量線と比較して、試料中の標的ペプチドの実際の量を決定する。
【0093】
本明細書で使用する「カットオフ値」は、統計的カットオフ値以上の患者試料中のバイオマーカーの測定値が、肝線維症などの線維性疾患の存在又は尤度の少なくとも７０％の確率、好ましくは少なくとも８０％の確率、好ましくは少なくとも８５％の確率、より好ましくは少なくとも９０％の確率、及び最も好ましくは少なくとも９５％の確率に対応するという点で、患者における肝線維症などの線維性疾患の高い尤度を示すために統計的に決定される結合量又は線維溶解のレベルを意味する。「カットオフ値」はまた、自然退行表現型を有する患者の高い尤度を示すために統計的に決定される結合量又は線維溶解レベルを意味することができる。
【0094】
本明細書で使用する「線維症応答表現型」は、治療なしに線維症の重篤度がどのように変化するかを示す患者の表現型を指す。「自然退行性」表現型を有する患者は、プラセボでの処置の５２週後にＩｓｈａｋスコアが低下した患者である。プラセボでの処置の５２週後にＩｓｈａｋスコアの変化のない患者は「安定性」表現型を有しているが、プラセボでの処置の５２週後にＩｓｈａｋスコアが増加した患者は、「進行性」表現型を有する。「自然退行性」表現型を有する患者は、安定性又は進行性の表現型を有する患者と比較して、異なる治療計画、すなわち、より低い投与量又はより短い治療サイクルを必要とし得る。
【0095】
本明細書で使用する用語「正常な健常対象と関連付けられる値及び／又は既知の疾患の重篤度と関連付けられる値」は、健常であると考えられる、すなわち疾患の無い（例えば、肝疾患、特に非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、又はＨＣＶ関連肝線維症などのウイルス性肝線維症などの線維性疾患；クローン病又は潰瘍性大腸炎などの慢性腸疾患；乳癌、膀胱癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、卵巣癌、肝臓癌、前立腺癌、又は黒色腫などの癌の無い）対象について上記の方法によって決定される架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の標準化された量若しくはＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＲＯ－Ｃ３）に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の標準化された比、及び／又は既知の重篤度の疾患（例えば、肝疾患、特に非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、又はＨＣＶ関連肝線維症などのウイルス性肝線維症などの線維性疾患；クローン病又は潰瘍性大腸炎などの慢性腸疾患；乳癌、膀胱癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、卵巣癌、肝臓癌、前立腺癌、又は黒色腫などの癌）を有することが知られている対象について上記の方法により決定される架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の標準化された量若しくはＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＲＯ－Ｃ３）に対する架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）の標準化された比を意味する。
【0096】
本明細書で使用する「線維性疾患」は、肝疾患、特に、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、又はＨＣＶ関連肝線維症などのウイルス性肝線維症などを指す。
【0097】
本明細書で使用する「慢性腸疾患」は、限定されないが、クローン病又は潰瘍性大腸炎などの過敏性腸疾患から選択され得る。好ましくは、慢性腸疾患は、クローン病又は潰瘍性大腸炎、より好ましくはクローン病である。
【0098】
本明細書で使用する「癌」は、限定されないが、乳癌、膀胱癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、卵巣癌、肝臓癌、前立腺癌、又は黒色腫から選択され得る。好ましくは、癌は乳癌である。
【0099】
本発明を、以下の図面を参照して、以下の実施例で実証する。
【図面の簡単な説明】
【0100】
【図1】図１：ラット（上）、マウス（真ん中）、及びヒト（下）の配列間のＩＩＩ型コラーゲンα１鎖の配列アライメント。赤色ボックスは、ＣＴ－ＩＩＩ中のネオエピトープの標的配列をまとめたものである。ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇからの対応する種の配列及びＣＬＵＳＴＡＬＷ ２．１多重アライメントツールを用いてアライメントを作成した。
【図4】図４：健常ヒト血漿ＥＤＴＡドナー、並びにベースライン及び６ヶ月の経過観察の時点での肥満手術患者のＣＴＸ－ＩＩＩレベルを示す。ＬＬＭＲ以下のレベルをＬＬＭＲレベル（１．８ｎｇ／ｍＬ）と定義した。星印は、以下のものを示す：＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
【図5】図５：ベースライン及び６ヶ月の経過観察の時点でのＰＲＯ－Ｃ３（ＩＩＩ型コラーゲン形成）及びＣＴＸ－ＩＩＩ（架橋ＩＩＩ型コラーゲン分解）のバイオマーカーレベル間の比としてＩＩＩ型コラーゲンの正味の沈着を表す。星印は、以下のものを示す：＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
【図6】図６：ＨＣＶ関連肝線維症患者を、それらのＩｓｈａｋスコア（１～２、３、及び４～５）及びスクリーニング時点でのそれらのＣＴＸ－ＩＩＩレベルに従って層別化し、健常ドナーのＣＴＸ－ＩＩＩレベルに対してプロットした図を示す。データを中央値＋ＩＱＲとしてプロットし、有意性をｐ＜０．０００１＊＊＊＊として示した。
【図8】図８：自然発症の線維症表現型；退行性、安定性、又は進行性に従って層別化したプラセボグループ内の患者のスクリーニング時点でのＣＴＸ－ＩＩＩ（Ａ）レベル又は正味の線維溶解（Ｂ）レベルを示す。データを中央値＋ＩＱＲでプロットし、有意性をｐ＜０．０５＊、ｐ＜０．０１＊＊、及びｐ＜０．００１＊＊＊として示した。
【図9】図９：最低レベルから最高レベルの三分位値（第１、第２、及び第３の三分位値）に患者を分けることにより、スクリーニング時点でのＣＴＸ－ＩＩＩ（Ａ）レベル又は正味の線維溶解（Ｂ）レベルに基づく患者のＩｓｈａｋスコアのパーセンテージ変化を示す。データを平均＋ＳＥＭとしてプロットし、有意性をｐ＜０．０１＊＊、及びｐ＜０．００１＊＊＊として示した。
【図10】図１０：Ｙｏｕｄｅｎ指数によって計算したカットオフレベルを利用したスクリーニング時点のＣＴＸ－ＩＩＩ（Ａ）レベル又は正味の線維溶解（Ｂ）レベルに基づく患者のＩｓｈａｋスコアの平均パーセンテージ変化を示す。データを平均＋ＳＥＭとしてプロットし、有意性をｐ＜０．０１＊＊として示した。
【図11】図１１：Ｙｏｕｄｅｎ指数によって決定されたスクリーニング時点のＣＴＸ－ＩＩＩ又は正味の線維溶解のレベルに基づいて退行性線維症表現型を呈しているオッズ比を示す。オッズ比を９５％ＣＩでプロットし、有意性をｐ＜０．０１＊＊として示した。
【図13】図１３：健常ドナー、ＣＤ患者及びＵＣ患者のＣＴＸ－ＩＩＩレベルをプロットした。統計的差異を、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓの一元配置ＡＮＯＶＡによって計算し、有意性をｐ＜０．０００１＊＊＊＊として示した。
【図14】図１４：内視鏡検査によって決定した非狭窄かつ非穿通疾患（Ｂ１）又は狭窄疾患の症状（Ｂ２）のいずれかを有する患者のＣＴＸ－ＩＩＩの血漿レベル（Ａ）、正味の架橋線維溶解（ｌｏｇ（ＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＣ３Ｘ））（Ｂ）、及び正味の線維溶解（ｌｏｇ（ＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＲＯ－Ｃ３））。統計的差異をＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ（Ａ）及び対応のないｔ検定（Ｂ＋Ｃ）によって計算し、有意性をｐ＜０．０５＊、及びｐ＜０．０１＊＊として示した。
【発明を実施するための形態】
【0101】
実施例１
方法及び材料：
試薬
実験で使用した全ての試薬は、Ｍｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）及びＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）などの会社からの高品質の化学薬品であった。モノクローナル抗体の産生及びアッセイの開発及び検証のために使用した合成ペプチドは、１）免疫原性ペプチド：キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）－ＣＧＧ－ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ、２）コーティングペプチド：ビオチン－ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ、３）選択ペプチド：ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１）又はＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ×ＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１６）（Ｎ末端ジスルフィド架橋により連結した二量体）、４）伸長ペプチド：ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＤ（配列番号４）又はＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＤ×ＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＤ（配列番号１７）（Ｎ末端ジスルフィド架橋により連結した二量体）、５）切断ペプチド：ＫＡＧＧＦＡＰＹＹ（配列番号５）又はＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹ×ＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹ（配列番号１８）（Ｎ末端ジスルフィド架橋によって連結した二量体）、及び６）ラット二量体ペプチド：ＣＫＳＧＧＦＳＰＹＹＧ×ＣＫＳＧＧＦＳＰＹＹＧであった。二量体ペプチドは、アッセイの開発及び検証のためにのみ使用した。全ての合成ペプチドをＧｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡから購入した。
方法及び材料：
試薬
実験で使用した全ての試薬は、Ｍｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）及びＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）などの会社からの高品質の化学薬品であった。モノクローナル抗体の産生及びアッセイの開発及び検証のために使用した合成ペプチドは、１）免疫原性ペプチド：キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）－ＣＧＧ－ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ、２）コーティングペプチド：ビオチン－ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ、３）選択ペプチド：ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１）又はＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ×ＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１６）（Ｎ末端ジスルフィド架橋により連結した二量体）、４）伸長ペプチド：ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＤ（配列番号４）又はＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＤ×ＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＤ（配列番号１７）（Ｎ末端ジスルフィド架橋により連結した二量体）、５）切断ペプチド：ＫＡＧＧＦＡＰＹＹ（配列番号５）又はＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹ×ＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹ（配列番号１８）（Ｎ末端ジスルフィド架橋によって連結した二量体）、及び６）ラット二量体ペプチド：ＣＫＳＧＧＦＳＰＹＹＧ×ＣＫＳＧＧＦＳＰＹＹＧであった。二量体ペプチドは、アッセイの開発及び検証のためにのみ使用した。全ての合成ペプチドをＧｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡから購入した。
【0102】
モノクローナル抗体の産生及びクローンの特性評価
ＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチド中に位置する標的ネオエピトープ（１２１２’－ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ－‘１２２１）を、タンパク質ブラストを用いたその特有性並びにラット及びマウスとの配列相同性について分析した（図１）。
ＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチド中に位置する標的ネオエピトープ（１２１２’－ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ－‘１２２１）を、タンパク質ブラストを用いたその特有性並びにラット及びマウスとの配列相同性について分析した（図１）。
【0103】
モノクローナル抗体の作製を、４～６週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスにて行った。フロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、２００μＬの乳化抗原及び５０μｇの免疫原性ペプチド（ＫＬＨ－ＣＧＧ－ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ）をマウスの皮下に免疫した。安定した血清力価レベルに達するまで、マウスを２週間間隔で免疫した。最高血清力価を有するマウスを融合のために選択した。マウスを１ヶ月休ませ、１００μＬの０．９％ＮａＣｌ溶液中の５０μｇ免疫原性ペプチドを静脈内に免疫した。３日後、脾臓細胞を細胞融合のために単離した。簡単に説明すると、脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を生成し、次いで、セミミディアム法（ｓｅｍｉ－ｍｅｄｉｕｍ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて培養皿内でクローン化した。クローンを９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、限界希釈を用いてモノクローナル増殖を確実にした。上清を、４ｎｇ／ｍＬのコーティングペプチド（ビオチン－ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ）でコーティングしたストレプトアビジンプレコーティングプレート（Ｒｏｃｈｅ，Ｈｖｉｄｏｖｒｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ，カタログ番号１１９４０２７９）を用いた間接競合ＥＬＩＳＡにより、選択ペプチド（ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１））及び伸長ペプチド（ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＤ（配列番号４））に対する反応性についてスクリーニングした。全ての試薬を５０ｍＭ ＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で希釈した。２つの最良のモノクローンの最終阻害のための選択を、伸長ペプチド（ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧＤ（配列番号４））、切断ペプチド（ＫＡＧＧＦＡＰＹＹ（配列番号５））、又は免疫原性ペプチド（ＫＬＨ－ＣＧＧ－ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ）ではなく選択ペプチド（ＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１））に対する反応性を試験することで行った。最適なモノクローンを精製する前に、抗体を、サンドイッチＥＬＩＳＡキット、ＳＢＡ Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）を用いてアイソタイプ試験をした。最良の反応性を有するモノクローンを、製造業者の指示に従ってタンパク質Ｇカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて精製した。
【0104】
作製した抗体の配列を決定し、ＣＤＲを決定した。
【0105】
鎖の配列は以下の通りである（ＣＤＲは下線で太字；定常領域はイタリック）：
重鎖配列（マウスＩｇＧアイソタイプ）
QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGSGHTFTDHGMHWVKQSQAKSLEWIGVISTYYGDATYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARSMGGNYVGTGFAYWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK（配列番号１９）
ＣＤＲ－Ｈ１：ＤＨＧＭＨ（配列番号９）
ＣＤＲ－Ｈ２：ＶＩＳＴＹＹＧＤＡＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１０）
ＣＤＲ－Ｈ３：ＳＭＧＧＮＹＶＧＴＧＦＡＹ（配列番号１１）
軽鎖配列（マウスカッパアイソタイプ）
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEFPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE（配列番号２０）
ＣＤＲ－Ｌ１：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号６）
ＣＤＲ－Ｌ２：ＲＭＳＮＬＡＳ（配列番号７）
ＣＤＲ－Ｌ３：ＭＱＨＬＥＦＰＬＴ（配列番号８）
重鎖配列（マウスＩｇＧアイソタイプ）
QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGSGHTFTDHGMHWVKQSQAKSLEWIGVISTYYGDATYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARSMGGNYVGTGFAYWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK（配列番号１９）
ＣＤＲ－Ｈ１：ＤＨＧＭＨ（配列番号９）
ＣＤＲ－Ｈ２：ＶＩＳＴＹＹＧＤＡＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１０）
ＣＤＲ－Ｈ３：ＳＭＧＧＮＹＶＧＴＧＦＡＹ（配列番号１１）
軽鎖配列（マウスカッパアイソタイプ）
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEFPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE（配列番号２０）
ＣＤＲ－Ｌ１：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号６）
ＣＤＲ－Ｌ２：ＲＭＳＮＬＡＳ（配列番号７）
ＣＤＲ－Ｌ３：ＭＱＨＬＥＦＰＬＴ（配列番号８）
【0106】
アッセイの開発
モノクローナル抗体標識
１１０μＬのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．６を１ｍＬ（１ｍｇ／ｍＬ）の抗体に添加し、続いて１３．３μＬのビオチンアミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、カタログ番号Ｂ２６４３）を添加することにより、捕捉抗体として使用するモノクローナルＮＢＨ－２４２抗体をビオチンで標識した。溶液を２０℃で１時間、くるくると回転させながらインキュベートした。その後、１１０μＬの０．２Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．０をこの溶液に加え、前と同様にインキュベートした。この溶液をＺｅｂａ ７ｋ ＭＷＣＯ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号８９８８９）中で一晩透析し、４℃で１ｘＰＢＳに浸した。さらに、モノクローナル抗体の一部を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識し、検出抗体として使用した。ＨＲＰ標識を、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、カタログ番号１１８２９６９６００１から購入し、Ｒｏｃｈｅ社製ペルオキシダーゼ標識キットを用いて、製造業者のプロトコルに従って実施した。
モノクローナル抗体標識
１１０μＬのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．６を１ｍＬ（１ｍｇ／ｍＬ）の抗体に添加し、続いて１３．３μＬのビオチンアミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、カタログ番号Ｂ２６４３）を添加することにより、捕捉抗体として使用するモノクローナルＮＢＨ－２４２抗体をビオチンで標識した。溶液を２０℃で１時間、くるくると回転させながらインキュベートした。その後、１１０μＬの０．２Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．０をこの溶液に加え、前と同様にインキュベートした。この溶液をＺｅｂａ ７ｋ ＭＷＣＯ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号８９８８９）中で一晩透析し、４℃で１ｘＰＢＳに浸した。さらに、モノクローナル抗体の一部を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識し、検出抗体として使用した。ＨＲＰ標識を、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、カタログ番号１１８２９６９６００１から購入し、Ｒｏｃｈｅ社製ペルオキシダーゼ標識キットを用いて、製造業者のプロトコルに従って実施した。
【0107】
直接サンドイッチＥＬＩＳＡプロトコル
ストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ’ｓ，Ｈｖｉｄｏｖｒｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ、カタログ番号１１９４０２７９）でプレコーティングした９６ウェルプレートを、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で１＋１００希釈したＣＴＸ－ＩＩＩ断片を標的とする１００μＬのビオチン化抗体で、１分あたり３００回転（ｒｐｍ）で回転させながら室温で３０分間コーティングした。未結合のビオチン化捕捉抗体を廃棄し、標準化したＥＬＩＳＡプレート洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）装置、マイクロプレート洗浄器，ＥＬｘ４０５ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＷ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＵＳＡ）を用いて、ウェルを洗浄緩衝液（２５ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３６％ Ｂｒｏｎｉｄｏｘ Ｌ５、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した。全ての試料及び検出抗体をインキュベーション緩衝液（５０ｍＭ ＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ Ｌｉｑｕｉｄ ＩＩ、ｐＨ７．４）で希釈し、検出抗体を１＋１００で希釈した。２０μＬの試料物質及び対照を、ＣＴＸ－ＩＩＩ断片を標的とするＨＲＰ標識検出抗体１００μＬと４℃で２０時間、３００ｒｐｍで攪拌しながらインキュベートした。未結合の一次抗体及び試料を廃棄し、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した。その後、１００μＬの化学発光基質をウェルに加え、プレートを暗所で、３００ｒｐｍで回転させながら、２０℃で３分間インキュベートした。最後に、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍで発光を測定するように設定したＥＬＩＳＡリーダー（ＶｅｒｓａＭＡＸ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて発光を定量した。二量体選択ペプチド（ＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ×ＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１６）の２倍連続希釈から得られた結果を用いて、４－パラメトリック数学的適合モデルを用いて標準曲線をプロットした。未知の試料の測定値を、標準曲線で補間し、ＣＴＸ－ＩＩＩ断片の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を得た。
ストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ’ｓ，Ｈｖｉｄｏｖｒｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ、カタログ番号１１９４０２７９）でプレコーティングした９６ウェルプレートを、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で１＋１００希釈したＣＴＸ－ＩＩＩ断片を標的とする１００μＬのビオチン化抗体で、１分あたり３００回転（ｒｐｍ）で回転させながら室温で３０分間コーティングした。未結合のビオチン化捕捉抗体を廃棄し、標準化したＥＬＩＳＡプレート洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）装置、マイクロプレート洗浄器，ＥＬｘ４０５ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＷ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＵＳＡ）を用いて、ウェルを洗浄緩衝液（２５ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３６％ Ｂｒｏｎｉｄｏｘ Ｌ５、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した。全ての試料及び検出抗体をインキュベーション緩衝液（５０ｍＭ ＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ Ｌｉｑｕｉｄ ＩＩ、ｐＨ７．４）で希釈し、検出抗体を１＋１００で希釈した。２０μＬの試料物質及び対照を、ＣＴＸ－ＩＩＩ断片を標的とするＨＲＰ標識検出抗体１００μＬと４℃で２０時間、３００ｒｐｍで攪拌しながらインキュベートした。未結合の一次抗体及び試料を廃棄し、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した。その後、１００μＬの化学発光基質をウェルに加え、プレートを暗所で、３００ｒｐｍで回転させながら、２０℃で３分間インキュベートした。最後に、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍで発光を測定するように設定したＥＬＩＳＡリーダー（ＶｅｒｓａＭＡＸ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて発光を定量した。二量体選択ペプチド（ＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ×ＣＫＡＧＧＦＡＰＹＹＧ（配列番号１６）の２倍連続希釈から得られた結果を用いて、４－パラメトリック数学的適合モデルを用いて標準曲線をプロットした。未知の試料の測定値を、標準曲線で補間し、ＣＴＸ－ＩＩＩ断片の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を得た。
【0108】
技術的検証
検出の下限（ＬＬＯＤ）を、２１個のゼロ試料（すなわち、インキュベーション緩衝液）から決定し、平均＋３×標準偏差として計算し、検出の上限（ＵＬＯＤ）を二量体選択ペプチドの１０個の測定値から決定し、平均＋３×標準偏差として計算した。５つの品質管理（ＱＣ）試料の１０回の独立した実行（これらのうちの最低３つは健常なヒト血漿ＥＤＴＡ試料（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ，ＵＳＡ）であり、各実行が試料の二重決定からなる）により、アッセイ間及びアッセイ内の変動を決定した。アッセイ間及びアッセイ間の変動に対する受け入れ基準は、それぞれ１５％及び１０％であった。希釈していない試料を基準として用いて、有意な濃度の健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料の１：６倍希釈の回収率（１００％±２０％）を計算することによりアッセイの直線性を決定した。アッセイの特異性を、二量体選択ペプチドの１００％試料に対する二量体伸長ペプチド、二量体切断ペプチド、及び二量体ラットペプチドの測定値の回収率を計算することによって決定した。試料測定の精度を、有意な濃度の健常ヒト血漿ＥＤＴＡの２つの試料をスパイクすることによって決定し、その後、理論値と実際の測定値との間の回収率を計算することによって決定した。ビオチン、脂質及びヘモグロビンからの干渉は、既知の濃度の干渉物質で健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料をスパイクすることによって試験した。その後、対照試料と低い又は高い干渉試料との間の回収率を計算した。
検出の下限（ＬＬＯＤ）を、２１個のゼロ試料（すなわち、インキュベーション緩衝液）から決定し、平均＋３×標準偏差として計算し、検出の上限（ＵＬＯＤ）を二量体選択ペプチドの１０個の測定値から決定し、平均＋３×標準偏差として計算した。５つの品質管理（ＱＣ）試料の１０回の独立した実行（これらのうちの最低３つは健常なヒト血漿ＥＤＴＡ試料（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ，ＵＳＡ）であり、各実行が試料の二重決定からなる）により、アッセイ間及びアッセイ内の変動を決定した。アッセイ間及びアッセイ間の変動に対する受け入れ基準は、それぞれ１５％及び１０％であった。希釈していない試料を基準として用いて、有意な濃度の健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料の１：６倍希釈の回収率（１００％±２０％）を計算することによりアッセイの直線性を決定した。アッセイの特異性を、二量体選択ペプチドの１００％試料に対する二量体伸長ペプチド、二量体切断ペプチド、及び二量体ラットペプチドの測定値の回収率を計算することによって決定した。試料測定の精度を、有意な濃度の健常ヒト血漿ＥＤＴＡの２つの試料をスパイクすることによって決定し、その後、理論値と実際の測定値との間の回収率を計算することによって決定した。ビオチン、脂質及びヘモグロビンからの干渉は、既知の濃度の干渉物質で健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料をスパイクすることによって試験した。その後、対照試料と低い又は高い干渉試料との間の回収率を計算した。
【0109】
分析物及び試薬の安定性
ＣＴＸ－ＩＩＩ断片の安定性を、ストレスを与えていない試料からの３つの健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料の回収率を計算することによって決定した。これらの試料を、最高４サイクルの凍結融解を行うか、又は４℃若しくは２０℃のいずれかでの２、４、２４、又は４８時間のインキュベーションに供した。
ＣＴＸ－ＩＩＩ断片の安定性を、ストレスを与えていない試料からの３つの健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料の回収率を計算することによって決定した。これらの試料を、最高４サイクルの凍結融解を行うか、又は４℃若しくは２０℃のいずれかでの２、４、２４、又は４８時間のインキュベーションに供した。
【0110】
インビトロ切断アッセイ
臨床的コホート測定
バイオマーカーアッセイ
ＩＩＩ型コラーゲン形成の評価を、Ｎ末端プロペプチド中のネオエピトープを標的とするＰＲＯ－Ｃ３３２競合ＥＬＩＳＡを用いて行った。簡単に説明すると、ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレートを、タンパク質安定剤及び保存剤を含有するＰＢＳ緩衝コーティング溶液で１＋１００希釈したビオチン化コーターペプチド１００μＬと２０℃、３００ｒｐｍで、３０分間インキュベートした。インキュベーション後、コーティング溶液を捨て、標準化したＥＬＩＳＡプレート洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）装置、マイクロプレート洗浄器、ＥＬｘ４０５ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＷ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＵＳＡ）を用いて洗浄緩衝液（２５ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３６％ Ｂｒｏｎｉｄｏｘ Ｌ５、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）でウェルを５回洗浄した。２０μＬの試料物質を適切なウェルに添加し、続いて、インキュベーション緩衝液で１＋１００希釈したＨＲＰ標識抗体１００μＬを添加した。プレートを４℃、３００ｒｐｍで２０時間インキュベートし、その後、それらを先に記載したように洗浄した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ カタログ番号４３８ＯＨ，Ｔａａｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を１００μＬ／ウェルで比色試薬として用い、暗所で、３００ｒｐｍで攪拌しながら１５分インキュベートした。１００μＬの１％ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止し、ＥＬＩＳＡリーダー（ＶｅｒｓａＭＡＸ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を用い、基準として６５０ｎｍを用いて、光学濃度を４５０ｎｍで読み取った。分析した試料内のＰＲＯ－Ｃ３の濃度を、選択ペプチドの２倍連続希釈によって作成した４－パラメトリック対数標準曲線を用いた補間によって決定した。
臨床的コホート測定
バイオマーカーアッセイ
ＩＩＩ型コラーゲン形成の評価を、Ｎ末端プロペプチド中のネオエピトープを標的とするＰＲＯ－Ｃ３３２競合ＥＬＩＳＡを用いて行った。簡単に説明すると、ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレートを、タンパク質安定剤及び保存剤を含有するＰＢＳ緩衝コーティング溶液で１＋１００希釈したビオチン化コーターペプチド１００μＬと２０℃、３００ｒｐｍで、３０分間インキュベートした。インキュベーション後、コーティング溶液を捨て、標準化したＥＬＩＳＡプレート洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）装置、マイクロプレート洗浄器、ＥＬｘ４０５ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＷ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＵＳＡ）を用いて洗浄緩衝液（２５ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３６％ Ｂｒｏｎｉｄｏｘ Ｌ５、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）でウェルを５回洗浄した。２０μＬの試料物質を適切なウェルに添加し、続いて、インキュベーション緩衝液で１＋１００希釈したＨＲＰ標識抗体１００μＬを添加した。プレートを４℃、３００ｒｐｍで２０時間インキュベートし、その後、それらを先に記載したように洗浄した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ カタログ番号４３８ＯＨ，Ｔａａｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を１００μＬ／ウェルで比色試薬として用い、暗所で、３００ｒｐｍで攪拌しながら１５分インキュベートした。１００μＬの１％ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止し、ＥＬＩＳＡリーダー（ＶｅｒｓａＭＡＸ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を用い、基準として６５０ｎｍを用いて、光学濃度を４５０ｎｍで読み取った。分析した試料内のＰＲＯ－Ｃ３の濃度を、選択ペプチドの２倍連続希釈によって作成した４－パラメトリック対数標準曲線を用いた補間によって決定した。
【0111】
結果：
モノクローナル抗体の産生及び特徴付け
ＩＩＩ型コラーゲンのラット、マウス、及びヒト配列のアライメントは、２つのアミノ酸の違い（図１の「：」によって示す）を明らかにした。アイソタイプの特徴評価により、アッセイ開発に使用した抗体ＮＢＨ－２４２をＩｇＧ２ａ κ軽鎖であると決定した。最終阻害において、該モノクローナル抗体は、伸長ペプチド、切断ペプチド、又は免疫原性ペプチドに対していかなる反応性も示さず、これはシグナル阻害の欠如によって観察された。選択ペプチドに対する反応性の試験は、ペプチド濃度によるシグナル阻害の増加を実証し、そのため間接競合ＥＬＩＳＡにおいて抗体への結合が示された（図２）。
モノクローナル抗体の産生及び特徴付け
ＩＩＩ型コラーゲンのラット、マウス、及びヒト配列のアライメントは、２つのアミノ酸の違い（図１の「：」によって示す）を明らかにした。アイソタイプの特徴評価により、アッセイ開発に使用した抗体ＮＢＨ－２４２をＩｇＧ２ａ κ軽鎖であると決定した。最終阻害において、該モノクローナル抗体は、伸長ペプチド、切断ペプチド、又は免疫原性ペプチドに対していかなる反応性も示さず、これはシグナル阻害の欠如によって観察された。選択ペプチドに対する反応性の試験は、ペプチド濃度によるシグナル阻害の増加を実証し、そのため間接競合ＥＬＩＳＡにおいて抗体への結合が示された（図２）。
【0112】
技術的検証
サンドイッチＥＬＩＳＡの開発において、モノクローナルＮＢＨ－２４２抗体を捕捉抗体と検出抗体の両方として使用した。ヒトＣＴＸ－ＩＩＩ ＥＬＩＳＡの測定範囲を、ＬＬＯＤ及びＵＬＯＤを計算することによって決定し、０．９２～１５．９４ｎｇ／ｍＬの範囲を提供した。アッセイ間及びアッセイ内の変動を計算することによって決定したアッセイの技術的性能は、それぞれ１４．８％及び５．４％の変動で許容範囲内であった（表４）。アッセイの直線性を、健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料で試験し、１０８．９％の平均回収率をもたらし、そのため、許容範囲は１００％±２０％であった（表５）。試料をさらに希釈すると、濃度は測定範囲よりも低くなった。計算した回収率をプロットすることにより、二量体ペプチドに対する直接サンドイッチＥＬＩＳＡにおける抗体の特異性を試験した。ここで、抗体は、二量体伸長ペプチド、二量体切断ペプチド、又は二量体ラットペプチドのいずれにも反応性を示さなかったが、発光の増加（ｙ軸）によって示される二量体選択ペプチドの濃度の増加に対する反応性を示した（図３）。別の健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料で健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料をスパイクすると、１０２．２％の平均回収率が得られた（表６）。試験した干渉物質のいずれも、健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料中の試料の測定値に対する効果を実証せず、平均回収率は許容範囲内（１００％±２０％）であった（表７）。
サンドイッチＥＬＩＳＡの開発において、モノクローナルＮＢＨ－２４２抗体を捕捉抗体と検出抗体の両方として使用した。ヒトＣＴＸ－ＩＩＩ ＥＬＩＳＡの測定範囲を、ＬＬＯＤ及びＵＬＯＤを計算することによって決定し、０．９２～１５．９４ｎｇ／ｍＬの範囲を提供した。アッセイ間及びアッセイ内の変動を計算することによって決定したアッセイの技術的性能は、それぞれ１４．８％及び５．４％の変動で許容範囲内であった（表４）。アッセイの直線性を、健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料で試験し、１０８．９％の平均回収率をもたらし、そのため、許容範囲は１００％±２０％であった（表５）。試料をさらに希釈すると、濃度は測定範囲よりも低くなった。計算した回収率をプロットすることにより、二量体ペプチドに対する直接サンドイッチＥＬＩＳＡにおける抗体の特異性を試験した。ここで、抗体は、二量体伸長ペプチド、二量体切断ペプチド、又は二量体ラットペプチドのいずれにも反応性を示さなかったが、発光の増加（ｙ軸）によって示される二量体選択ペプチドの濃度の増加に対する反応性を示した（図３）。別の健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料で健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料をスパイクすると、１０２．２％の平均回収率が得られた（表６）。試験した干渉物質のいずれも、健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料中の試料の測定値に対する効果を実証せず、平均回収率は許容範囲内（１００％±２０％）であった（表７）。
【0113】
表４：５つのＱＣ試料（これらのうちの３つは健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料であり、最後の２つが二量体選択ペプチドであった）を用いることによるＣＴＸ－ＩＩＩアッセイについてのアッセイ間及びアッセイ内の変動。変動（％）を、各試料の１０の個々の二重決定の平均として計算する。
【表2】
【0114】
表５：４つの健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料（ＨＰ）の試料希釈回収率
【表3】
【0115】
表６：有意な濃度の健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料を互いにスパイクし、試料の測定される値と理論値との間でスパイク回収率（％）を計算した。
【表4】
【0116】
表７：３つの健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料中のヘモグロビン、ビオチン、及び脂質からの干渉。回収率（％）を、純粋な血漿ＥＤＴＡ試料に対する干渉物質の低濃度及び高濃度から計算する。
【表5】
【0117】
分析物及び試薬の安定性
健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料中の分析物の安定性は、凍結／融解の４サイクルまで安定であった（表８）。健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料の４℃でのインキュベーションについての平均回収率は９２．５％であり、全ての試料中で４８時間まで安定であった。２０℃において、平均回収率は１１４．７％であり、４つの試料のうちの３つは２４時間まで分析物の安定性を実証した（表９）。
健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料中の分析物の安定性は、凍結／融解の４サイクルまで安定であった（表８）。健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料の４℃でのインキュベーションについての平均回収率は９２．５％であり、全ての試料中で４８時間まで安定であった。２０℃において、平均回収率は１１４．７％であり、４つの試料のうちの３つは２４時間まで分析物の安定性を実証した（表９）。
【0118】
表８：
【表6】
【0119】
表９：
【表7】
【0120】
考察
Ｃプロテイナーゼ切断後のＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチド中のネオエピトープを標的とするモノクローナル抗体の産生に基づいて、ＩＩＩ型コラーゲンの架橋断片を検出するためにＮＢＨ－２４２モノクローナル抗体を利用することにより、新規ＣＴＸ－ＩＩＩサンドイッチＥＬＩＳＡを開発した。簡単に説明すると、このアッセイは、ヒトネオエピトープに対して高い特異性を実証し、ヒト血漿ＥＤＴＡ試料中の分析物を検出する能力を有した。さらに、このアッセイは、許容可能なアッセイ間及びアッセイ内の変動、直線性、及び正確な測定値を用いて技術的に安定であることが示された。
Ｃプロテイナーゼ切断後のＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチド中のネオエピトープを標的とするモノクローナル抗体の産生に基づいて、ＩＩＩ型コラーゲンの架橋断片を検出するためにＮＢＨ－２４２モノクローナル抗体を利用することにより、新規ＣＴＸ－ＩＩＩサンドイッチＥＬＩＳＡを開発した。簡単に説明すると、このアッセイは、ヒトネオエピトープに対して高い特異性を実証し、ヒト血漿ＥＤＴＡ試料中の分析物を検出する能力を有した。さらに、このアッセイは、許容可能なアッセイ間及びアッセイ内の変動、直線性、及び正確な測定値を用いて技術的に安定であることが示された。
【0121】
特性評価及び技術的検証
抗体の特性評価の間、該モノクローナル抗体反応性を、ネオエピトープ配列の変動に対する競合ＥＬＩＳＡで試験し、これは抗体の高い特異性を示したが、使用したペプチドは単量体であり、したがって、サンドイッチＥＬＩＳＡでの抗体使用を検証しなかった。そのため、抗体結合部位に対してＮ末端に位置するジスルフィド結合を介して架橋された前述の異なるペプチドバリエーションの２つの同一の配列を含む二量体ペプチドのセットを設計した。二量体ペプチドに対する反応性を試験すると、抗体は二量体ヒト選択ペプチドに対して高い特異性を誘発し、そのため、ヒトネオエピトープ配列に対するその高い特異性を再検証する一方で、架橋断片の検出においてその潜在的な有用性も実証した。
抗体の特性評価の間、該モノクローナル抗体反応性を、ネオエピトープ配列の変動に対する競合ＥＬＩＳＡで試験し、これは抗体の高い特異性を示したが、使用したペプチドは単量体であり、したがって、サンドイッチＥＬＩＳＡでの抗体使用を検証しなかった。そのため、抗体結合部位に対してＮ末端に位置するジスルフィド結合を介して架橋された前述の異なるペプチドバリエーションの２つの同一の配列を含む二量体ペプチドのセットを設計した。二量体ペプチドに対する反応性を試験すると、抗体は二量体ヒト選択ペプチドに対して高い特異性を誘発し、そのため、ヒトネオエピトープ配列に対するその高い特異性を再検証する一方で、架橋断片の検出においてその潜在的な有用性も実証した。
【0122】
特異性が高く、該抗体がラットの配列相同体を検出することができないために、このアッセイの開発及び検証はヒト試料物質に集中した。天然の反応性はヒト血漿ＥＤＴＡ試料で示されたが、測定した試料の値の大部分は、図３のＨＤレベルから観察できるように、測定範囲の下端にあった。測定範囲内の試料をアッセイの技術的検証のために選択し、その技術的安定性を明らかにした。健常ヒト血漿ＥＤＴＡ試料の希釈回収、及びアッセイの正確さを示すスパイク回収と同様に、アッセイ間及びアッセイ内の変動は許容範囲内であった。
【0123】
分析物及び試薬安定性
アッセイの開発及び臨床使用における重要な要因は、様々な凍結及び融解サイクル後の試料物質の正確な測定、及びより高い温度又はより低い温度でのインキュベーションを可能にする分析物の安定性である。これは、正確な試料の取り扱いが完全には知られていない臨床試料物質を測定するときに特に重要である。試料の注意深い取り扱いは常に優先的であるべきであるが、ＣＴＸ－ＩＩＩ分析物の安定性試験は、いかなる主な不安定性も示唆しなかった。
アッセイの開発及び臨床使用における重要な要因は、様々な凍結及び融解サイクル後の試料物質の正確な測定、及びより高い温度又はより低い温度でのインキュベーションを可能にする分析物の安定性である。これは、正確な試料の取り扱いが完全には知られていない臨床試料物質を測定するときに特に重要である。試料の注意深い取り扱いは常に優先的であるべきであるが、ＣＴＸ－ＩＩＩ分析物の安定性試験は、いかなる主な不安定性も示唆しなかった。
【0124】
以下の実施例では、ＣＴＸ－ＩＩＩのレベルを上記のアッセイを用いて測定した。ＷＯ２０１４／１７０３１２に記載の方法を用いて、ＰＲＯＣ３のレベルを測定し、ＷＯ２０１７／３４１７２に記載のアッセイを用いてＰＣ３Ｘのレベルを測定した。
【0125】
実施例２－肥満手術
肥満手術を受けた非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の５８人の患者から、ベースライン及び６ヶ月の経過観察の時点で採血した。患者の人口統計の概略図を表１０に提供し、これには、患者のＢＭＩ、非アルコール性脂肪性肝疾患活性スコア（ＮＡＳ）、脂肪肝グレード、炎症グレード、バルーニング、及びそれらの線維症ステージが含まれる。患者の人口統計をベースラインのみで取得し、４５～４８人の患者について人口統計のみが提供された。手術の手順の前に、術前の体重減少を促すために、患者にダイエットさせた。測定した試料は血漿ＥＤＴＡであり、ＣＴＸ－ＩＩＩ測定まで－８０℃で保存した。
肥満手術を受けた非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の５８人の患者から、ベースライン及び６ヶ月の経過観察の時点で採血した。患者の人口統計の概略図を表１０に提供し、これには、患者のＢＭＩ、非アルコール性脂肪性肝疾患活性スコア（ＮＡＳ）、脂肪肝グレード、炎症グレード、バルーニング、及びそれらの線維症ステージが含まれる。患者の人口統計をベースラインのみで取得し、４５～４８人の患者について人口統計のみが提供された。手術の手順の前に、術前の体重減少を促すために、患者にダイエットさせた。測定した試料は血漿ＥＤＴＡであり、ＣＴＸ－ＩＩＩ測定まで－８０℃で保存した。
【0126】
表１０：ベースラインにおける肥満手術患者の人口統計を表す。
【表8】
【0127】
統計解析
健常な血漿ＥＤＴＡ試料と肥満手術患者のコホートからの血漿ＥＤＴＡ試料との間のＣＴＸ－ＩＩＩレベルの比較を、誤発見率を補正する一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）を適用することによって行った。結果を中央値ＣＴＸ－ＩＩＩレベル＋四分位範囲（ＩＱＲ）として示す。全ての統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．８．２．０（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で行った。星印は以下のものを示す：＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１；ｎｓ＝有意でない差。
健常な血漿ＥＤＴＡ試料と肥満手術患者のコホートからの血漿ＥＤＴＡ試料との間のＣＴＸ－ＩＩＩレベルの比較を、誤発見率を補正する一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）を適用することによって行った。結果を中央値ＣＴＸ－ＩＩＩレベル＋四分位範囲（ＩＱＲ）として示す。全ての統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．８．２．０（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で行った。星印は以下のものを示す：＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１；ｎｓ＝有意でない差。
【0128】
結果
ＣＴＸ－ＩＩＩレベルはＮＡＦＬＤに関する
ＣＴＸ－ＩＩＩのレベルは、健常ヒト血漿ＥＤＴＡドナー（ＨＤ）のレベルと比較して、ベースライン（ｐ＜０．０００１）、及び６ヶ月の経過観察（ｐ＜０．００１）の時点で、肥満手術を受けたＮＡＦＬＤの患者において有意に高かった（図４）。さらに、ベースライン（ｐ＜０．０１）レベルは、６ヶ月の経過観察の時点でのレベルよりも有意に高かった（図）。
ＣＴＸ－ＩＩＩレベルはＮＡＦＬＤに関する
ＣＴＸ－ＩＩＩのレベルは、健常ヒト血漿ＥＤＴＡドナー（ＨＤ）のレベルと比較して、ベースライン（ｐ＜０．０００１）、及び６ヶ月の経過観察（ｐ＜０．００１）の時点で、肥満手術を受けたＮＡＦＬＤの患者において有意に高かった（図４）。さらに、ベースライン（ｐ＜０．０１）レベルは、６ヶ月の経過観察の時点でのレベルよりも有意に高かった（図）。
【0129】
ＩＩＩ型コラーゲンの沈着
ＩＩＩ型コラーゲンの正味の沈着を示すＰＲＯ－Ｃ３及びＣＴＸ－ＩＩＩの比は、ベースラインの時点での患者と比較して、６ヶ月の経過観察の時点での肥満手術患者において有意に上昇した（ｐ＜０．０００１）（図５）。
ＩＩＩ型コラーゲンの正味の沈着を示すＰＲＯ－Ｃ３及びＣＴＸ－ＩＩＩの比は、ベースラインの時点での患者と比較して、６ヶ月の経過観察の時点での肥満手術患者において有意に上昇した（ｐ＜０．０００１）（図５）。
【0130】
考察
ＣＴＸ－ＩＩＩアッセイの開発は、ベースラインレベルと６ヶ月の経過観察レベルとの間の差を含む、ＨＤ患者とＮＡＦＬＤ患者とを区別する能力を実証した。
ＣＴＸ－ＩＩＩアッセイの開発は、ベースラインレベルと６ヶ月の経過観察レベルとの間の差を含む、ＨＤ患者とＮＡＦＬＤ患者とを区別する能力を実証した。
【0131】
ＣＴＸ－ＩＩＩレベルはＮＡＦＬＤに関する
ＮＡＦＬＤは、集団の約１／４に影響を及ぼす主な慢性肝疾患の１つであり３３、主な原因の１つは、肝臓内に脂肪の蓄積をもたらす肥満である３４。次いで、この蓄積は、炎症カスケードの開始につながり、瘢痕組織を形成する可能性があり、最終的には肝線維症の状態につながり得る３４。ここで、ＩＩＩ型コラーゲン３５及びＥＣＭ関連架橋酵素ＬＯＸＬ２３６を含むＥＣＭ成分の過剰な蓄積が、さらなる疾患の進行に関与する。このように、肥満手術を受けたＮＡＦＬＤ患者の研究における新規ＣＴＸ－ＩＩＩマーカーの可能性及び生物学的関連性を評価した。ベースライン及び６ヶ月の経過観察の時点でＮＡＦＬＤ患者から得られた血漿ＥＤＴＡ試料中のＣＴＸ－ＩＩＩレベルを測定することにより、各時点での患者間の有意差が実証された。さらに、ＮＡＦＬＤ患者のＣＴＸ－ＩＩＩレベルをＨＤと比較すると、ＮＡＦＬＤと診断された患者は、全ての時点で有意により高いバイオマーカーレベルを示した。ＣＴＸ－ＩＩＩマーカーのこのレベルの増加は、肥満手術患者に生じる線維溶解のレベルが有意に増加したことを示唆している。ＣＴＸ－ＩＩＩと組み合わせて、ＩＩＩ型コラーゲン形成の肝線維症関連ＰＲＯ－Ｃ３バイオマーカーも測定した。２つのバイオマーカー測定の組み合わせは、ＩＩＩ型コラーゲンの正味の沈着の尺度を提供した。本明細書で、沈着は、ベースラインから６ヶ月の経過観察まで増加し、成熟架橋ＩＩＩ型コラーゲンの分解から組織内の新しいコラーゲンの形成への切り替えが示唆される。これらのデータから、既知の活性のある疾患を有する個体を区別し、ＣＴＸ－ＩＩＩのレベルを経時的に監視することにおいてＣＴＸ－ＩＩＩマーカーの可能性が示される。ＣＴＸ－ＩＩＩマーカーは、脂肪肝グレード、炎症グレード、バルーニング、ＢＭＩ、線維症ステージ、又はＮＡＳスコア（図示せず）を含む、それらの個々の疾患スコアに基づいて患者間で区別することができなかった。
ＮＡＦＬＤは、集団の約１／４に影響を及ぼす主な慢性肝疾患の１つであり３３、主な原因の１つは、肝臓内に脂肪の蓄積をもたらす肥満である３４。次いで、この蓄積は、炎症カスケードの開始につながり、瘢痕組織を形成する可能性があり、最終的には肝線維症の状態につながり得る３４。ここで、ＩＩＩ型コラーゲン３５及びＥＣＭ関連架橋酵素ＬＯＸＬ２３６を含むＥＣＭ成分の過剰な蓄積が、さらなる疾患の進行に関与する。このように、肥満手術を受けたＮＡＦＬＤ患者の研究における新規ＣＴＸ－ＩＩＩマーカーの可能性及び生物学的関連性を評価した。ベースライン及び６ヶ月の経過観察の時点でＮＡＦＬＤ患者から得られた血漿ＥＤＴＡ試料中のＣＴＸ－ＩＩＩレベルを測定することにより、各時点での患者間の有意差が実証された。さらに、ＮＡＦＬＤ患者のＣＴＸ－ＩＩＩレベルをＨＤと比較すると、ＮＡＦＬＤと診断された患者は、全ての時点で有意により高いバイオマーカーレベルを示した。ＣＴＸ－ＩＩＩマーカーのこのレベルの増加は、肥満手術患者に生じる線維溶解のレベルが有意に増加したことを示唆している。ＣＴＸ－ＩＩＩと組み合わせて、ＩＩＩ型コラーゲン形成の肝線維症関連ＰＲＯ－Ｃ３バイオマーカーも測定した。２つのバイオマーカー測定の組み合わせは、ＩＩＩ型コラーゲンの正味の沈着の尺度を提供した。本明細書で、沈着は、ベースラインから６ヶ月の経過観察まで増加し、成熟架橋ＩＩＩ型コラーゲンの分解から組織内の新しいコラーゲンの形成への切り替えが示唆される。これらのデータから、既知の活性のある疾患を有する個体を区別し、ＣＴＸ－ＩＩＩのレベルを経時的に監視することにおいてＣＴＸ－ＩＩＩマーカーの可能性が示される。ＣＴＸ－ＩＩＩマーカーは、脂肪肝グレード、炎症グレード、バルーニング、ＢＭＩ、線維症ステージ、又はＮＡＳスコア（図示せず）を含む、それらの個々の疾患スコアに基づいて患者間で区別することができなかった。
【0132】
実施例３ ＨＣＶ関連肝線維症
研究の説明
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連肝線維症と診断された合計１５８人の患者からスクリーニング及び５２週間後の時点で採血し、測定する試料物質は血漿ＥＤＴＡであった。表１１は患者集団の全体の概要を提供し、表１２はプラセボグループの４７人の患者を表す。
研究の説明
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連肝線維症と診断された合計１５８人の患者からスクリーニング及び５２週間後の時点で採血し、測定する試料物質は血漿ＥＤＴＡであった。表１１は患者集団の全体の概要を提供し、表１２はプラセボグループの４７人の患者を表す。
【0133】
表１１：ＨＣＶ関連肝線維症と診断されたスクリーニング時点での患者の人口統計の概要
【表9】
【0134】
表１２：スクリーニングの時点でのデータを示すプラセボグループ内の患者の人口統計の概要
【表10】
【0135】
統計解析
分析したグループの数（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ又はＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）に依存して、非パラメトリックｔ検定又は一元配置ＡＮＯＶＡを適用することによって、健常血漿ＥＤＴＡ試料とＨＣＶ関連肝線維症患者のコホートからの血漿ＥＤＴＡ試料との間のＣＴＸ－ＩＩＩレベルの比較を行った。データを誤発見率のために補正した。結果を、特に断らない限り、中央値ＣＴＸ－ＩＩＩ又は正味の線維溶解＋四分位範囲（ＩＱＲ）として示す。バイオマーカー三分位値レベルを、以下のように最低バイオマーカーレベルから初めて、最高バイオマーカーレベルまで：第１、第２、及び第３の三分位値として定義した。全ての統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．８．４．３（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＭｅｄＣａｌｃ ｖ．１９．３（ＭｅｄＣａｌｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｌｔｄ，８４００ Ｏｓｔｅｎｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）にて実施した。星印は、以下のものを示す：＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１；ｎｓ＝有意でない差。
分析したグループの数（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ又はＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）に依存して、非パラメトリックｔ検定又は一元配置ＡＮＯＶＡを適用することによって、健常血漿ＥＤＴＡ試料とＨＣＶ関連肝線維症患者のコホートからの血漿ＥＤＴＡ試料との間のＣＴＸ－ＩＩＩレベルの比較を行った。データを誤発見率のために補正した。結果を、特に断らない限り、中央値ＣＴＸ－ＩＩＩ又は正味の線維溶解＋四分位範囲（ＩＱＲ）として示す。バイオマーカー三分位値レベルを、以下のように最低バイオマーカーレベルから初めて、最高バイオマーカーレベルまで：第１、第２、及び第３の三分位値として定義した。全ての統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．８．４．３（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＭｅｄＣａｌｃ ｖ．１９．３（ＭｅｄＣａｌｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｌｔｄ，８４００ Ｏｓｔｅｎｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）にて実施した。星印は、以下のものを示す：＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１；ｎｓ＝有意でない差。
【0136】
結果
ＨＣＶ関連肝線維症を呈する患者を、スクリーニング時点でのそれらのＩｓｈａｋスコアに従って層別化し、それらのＣＴＸ－ＩＩＩレベルを健常ドナーのレベルと比較した。線維症の程度とは独立して、肝線維症を呈する患者は、健常ドナーと比較してスクリーニングの時点でＣＴＸ－ＩＩＩレベルが有意（ｐ＜０．０００１）に上昇していた（図６）。
ＨＣＶ関連肝線維症を呈する患者を、スクリーニング時点でのそれらのＩｓｈａｋスコアに従って層別化し、それらのＣＴＸ－ＩＩＩレベルを健常ドナーのレベルと比較した。線維症の程度とは独立して、肝線維症を呈する患者は、健常ドナーと比較してスクリーニングの時点でＣＴＸ－ＩＩＩレベルが有意（ｐ＜０．０００１）に上昇していた（図６）。
【0137】
スクリーニングの時点での正味の線維溶解度（ＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＲＯ－Ｃ３）を計算すると、Ｉｓｈａｋ分類を利用して様々な程度の線維症を呈する患者間に有意差を発見した（図７）。Ｉｓｈａｋスコアが１～２の患者は、スコアが４～５の患者と比較して、より高い正味の線維溶解度を誘発した（ｐ＜０．０５）。３のスコアを有する患者についても同様であり、スコアが４～５の患者と比較してレベルが有意に（ｐ＜０．０５）上昇した。
【0138】
合計４７人の患者をプラセボで５２週間処置し、その後、それらのＩｓｈａｋスコアを測定した。次いで、患者を、スクリーニングから５２週までの間のＩｓｈａｋスコアの変化に従って層別化し、退行性、安定性又は進行性の線維症表現型のいずれかを有するものとして定義した。各表現型のスクリーニングの時点でＣＴＸ－ＩＩＩレベルをプロットすると、進行性表現型と比較して自然退行性表現型を有する患者において、バイオマーカーレベルが有意に上昇したことが見出された（ｐ＜０．０１）。さらに、安定性線維症表現型を呈する患者は、進行性表現型と比較してスクリーニングの時点で有意により高いＣＴＸ－ＩＩＩレベルを示した（ｐ＜０．０５）（図８Ａ）。スクリーニングでの正味の線維溶解の計算は、退行性表現型を有する患者は進行性表現型と比較して有意により高いレベルの線維溶解（ｐ＜０．００１）を示すが、同様のことが安定性表現型と進行性表現型とを比較した場合に言える（ｐ＜０．０１）ため、患者の表現型間のより顕著な区別を可能とした（図８Ｂ）。
【0139】
スクリーニング時点のそれらのＣＴＸ－ＩＩＩレベル又は線維溶解のレベルのいずれかに基づいて、プラセボグループの患者を三分位値に分けると、低い初期ＣＴＸ－ＩＩＩレベル（第１の三分位値）の患者と比較して、スクリーニング時点で高レベルのＣＴＸ－ＩＩＩを有する患者（第３の三分位値）のＩｓｈａｋスコアに有意な減少が実証された（図９Ａ）。Ｉｓｈａｋスコアの観察は、正味の線維溶解に基づいて変化し、第３の三分位値中のレベルを有する患者は、第１の三分位値の患者と比較して有意な減少を示した（ｐ＜０．００１）。さらに、スクリーニング時点の第２の三分位値中の線維溶解のレベルを有する患者も、第１の三分位値と比較してそれらのＩｓｈａｋスコアの有意な減少を示した（ｐ＜０．０１）（図９Ｂ）。
【0140】
受信者操作特性（ＲＯＣ）及びその統計の要約に基づいて、Ｙｏｕｄｅｎ指数、退行性線維症表現型に最適なカットオフ値を、スクリーニング時点のＣＴＸ－ＩＩＩレベルと線維溶解レベルの両方について決定した（表１３）。スクリーニングの時点でのＣＴＸ－ＩＩＩ＞３．８ｎｇ／ｍＬのレベルは、カットオフ値より低いレベルを有する患者と比較して、Ｉｓｈａｋスコアを有意に低下させた（ｐ＜０．０１）（図１０Ａ）。正味の線維溶解についても同様であり、架橋ＩＩＩ型コラーゲン分解（ＣＴＸ－ＩＩＩ）及びＩＩＩ型コラーゲン形成（ＰＲＯ－Ｃ３）の比が０．５超の患者は、低レベルの線維溶解を呈する患者と比較して、Ｉｓｈａｋスコアの有意な低下を経験した（ｐ＜０．０１）（図１０Ｂ）。
【0141】
表１３：スクリーニングの時点でのＣＴＸ－ＩＩＩレベル又は正味の線維溶解度のいずれかの特異的なカットオフ値と、ＲＯＣ曲線からのそれらの関連する値とを用いた自然退行者の特定
【表11】
【0142】
Ｙｏｕｄｅｎ指数を計算することによって決定したカットオフレベルに基づいて患者を層別化し、その後、ロジスティック回帰から線維症の退行者であるオッズ比を計算する。これは、この値よりも低いレベルを呈する患者と比較して、スクリーニング時にＣＴＸ－ＩＩＩレベル≧３．８ｎｇ／ｍＬの患者に対して１９．４倍高い（ｐ＝０．００８８）線維症の自然退行者であるオッズ比をもたらした。患者の線維溶解レベルを観察すると、線維溶解率≧０．５で、オッズ比は２３．３（ｐ＝０．００５７）に増加した（図１１）。
【0143】
考察
ＨＣＶ線維症におけるＩＩＩ型コラーゲン：
線維症の進行中に、病原性細胞の活性化は、ＥＣＭ内のコラーゲン、特にＩ型、ＩＩＩ型及びＶ型の主要な線維性コラーゲンの過剰な形成をもたらす。ＬＯＸＬ及びＴＧなどのコラーゲン架橋酵素の増加と合わせて、線維性コラーゲンの沈着及びその後の架橋の増加は、組織硬化を増大させ、組織の破壊を引き起こし、臓器不全につながる可能性がある３７。ＨＣＶ関連肝線維症において、チェックされていないウイルス感染は、結果として生じる慢性炎症を伴う組織ホメオスタシスの喪失をもたらし、腫瘍増殖因子－β１（ＴＧＦ－β１）を含むいくつかの炎症性サイトカイン及び線維形成性サイトカインを発現させる。この線維形成性サイトカインのカスケードは、最終的に静止肝星細胞を活性化し、筋線維芽細胞に分化させる３８。筋線維芽細胞は、広範なコラーゲン架橋及びＥＣＭ収縮により媒介されるＥＣＭ産生及びマトリックス硬直の調節に関与する線維症の主なエフェクター細胞を構成する３９。ＨＣＶ関連肝線維症におけるＩＩＩ型コラーゲンの蓄積は、ＩＩＩ型コラーゲンのＮＨ２プロペプチドを標的とする高感度モノクローナル抗体を介したＩＩＩ型コラーゲンの形成を定量するバイオマーカーＰＲＯ－Ｃ３を用いて以前に示されている４０、４１。ＰＲＯ－Ｃ３と線維形成表現型との既知の関係を用いて、線維溶解と新規バイオマーカーＣＴＸ－ＩＩＩとの間の関係を調べた。ＮＡＦＬＤにおけるＣＴＸ－ＩＩＩレベルの調査結果と同様に、ＨＣＶ関連線維症に罹患している患者は、ＨＤと比較して高いレベルの架橋ＩＩＩ型コラーゲン分解を示した。さらに、最低の程度の線維症（Ｉｓｈａｋスコア１～２）を有する患者における線維溶解のレベルの増加が観察され、成熟架橋ＩＩＩ型コラーゲンの線維溶解の増加及びＩＩＩ型コラーゲン形成の減少が示唆された。これらのデータは、架橋した線維性ＥＣＭの上方制御されたタンパク質分解を示し、正味の線維溶解は、線維症の程度に基づいて患者間で区別することができる。
ＨＣＶ線維症におけるＩＩＩ型コラーゲン：
線維症の進行中に、病原性細胞の活性化は、ＥＣＭ内のコラーゲン、特にＩ型、ＩＩＩ型及びＶ型の主要な線維性コラーゲンの過剰な形成をもたらす。ＬＯＸＬ及びＴＧなどのコラーゲン架橋酵素の増加と合わせて、線維性コラーゲンの沈着及びその後の架橋の増加は、組織硬化を増大させ、組織の破壊を引き起こし、臓器不全につながる可能性がある３７。ＨＣＶ関連肝線維症において、チェックされていないウイルス感染は、結果として生じる慢性炎症を伴う組織ホメオスタシスの喪失をもたらし、腫瘍増殖因子－β１（ＴＧＦ－β１）を含むいくつかの炎症性サイトカイン及び線維形成性サイトカインを発現させる。この線維形成性サイトカインのカスケードは、最終的に静止肝星細胞を活性化し、筋線維芽細胞に分化させる３８。筋線維芽細胞は、広範なコラーゲン架橋及びＥＣＭ収縮により媒介されるＥＣＭ産生及びマトリックス硬直の調節に関与する線維症の主なエフェクター細胞を構成する３９。ＨＣＶ関連肝線維症におけるＩＩＩ型コラーゲンの蓄積は、ＩＩＩ型コラーゲンのＮＨ２プロペプチドを標的とする高感度モノクローナル抗体を介したＩＩＩ型コラーゲンの形成を定量するバイオマーカーＰＲＯ－Ｃ３を用いて以前に示されている４０、４１。ＰＲＯ－Ｃ３と線維形成表現型との既知の関係を用いて、線維溶解と新規バイオマーカーＣＴＸ－ＩＩＩとの間の関係を調べた。ＮＡＦＬＤにおけるＣＴＸ－ＩＩＩレベルの調査結果と同様に、ＨＣＶ関連線維症に罹患している患者は、ＨＤと比較して高いレベルの架橋ＩＩＩ型コラーゲン分解を示した。さらに、最低の程度の線維症（Ｉｓｈａｋスコア１～２）を有する患者における線維溶解のレベルの増加が観察され、成熟架橋ＩＩＩ型コラーゲンの線維溶解の増加及びＩＩＩ型コラーゲン形成の減少が示唆された。これらのデータは、架橋した線維性ＥＣＭの上方制御されたタンパク質分解を示し、正味の線維溶解は、線維症の程度に基づいて患者間で区別することができる。
【0144】
線維症の解消：
長い間、線維症は不可逆的であると考えられていたが、線維症の理解は近年変化し、現在は、線維症を線維形成及び線維溶解の動的プロセスとして認められている。ＬＯＸＬ２／３などの標的を含む新規抗線維症治療剤が開発されている４２ので、線維症解消の最終目標は到達範囲内である。しかし、臨床管理を最適化するために、したがって、患者を評価することができる高感度で特異的なツールが必要である。以前に自然進行性線維症表現型を有する患者を特定するＰＲＯ－Ｃ３バイオマーカーで実証されたように、ＥＣＭターンオーバーの血清学的バイオマーカーが、このための非侵襲性ツールを提供することができる４３、４４。５２週間後に、それらの線維症表現型が退行したか、安定のままか、又は進行したかどうかに応じて患者を分け、スクリーニングの時点での退行性表現型と進行性表現型との間でＣＴＸ－ＩＩＩレベルと正味の線維溶解レベルの両方に有意差が観察された。これらのデータから、初期の高レベルの架橋ＩＩＩ型コラーゲン分解、すなわち、線維溶解を有する患者は、より低い線維溶解度を有する患者と比較して線維性ＥＣＭの自然解消を経験するというバイオマーカーの予後診断の可能性が示唆される。
長い間、線維症は不可逆的であると考えられていたが、線維症の理解は近年変化し、現在は、線維症を線維形成及び線維溶解の動的プロセスとして認められている。ＬＯＸＬ２／３などの標的を含む新規抗線維症治療剤が開発されている４２ので、線維症解消の最終目標は到達範囲内である。しかし、臨床管理を最適化するために、したがって、患者を評価することができる高感度で特異的なツールが必要である。以前に自然進行性線維症表現型を有する患者を特定するＰＲＯ－Ｃ３バイオマーカーで実証されたように、ＥＣＭターンオーバーの血清学的バイオマーカーが、このための非侵襲性ツールを提供することができる４３、４４。５２週間後に、それらの線維症表現型が退行したか、安定のままか、又は進行したかどうかに応じて患者を分け、スクリーニングの時点での退行性表現型と進行性表現型との間でＣＴＸ－ＩＩＩレベルと正味の線維溶解レベルの両方に有意差が観察された。これらのデータから、初期の高レベルの架橋ＩＩＩ型コラーゲン分解、すなわち、線維溶解を有する患者は、より低い線維溶解度を有する患者と比較して線維性ＥＣＭの自然解消を経験するというバイオマーカーの予後診断の可能性が示唆される。
【0145】
退行者の特定、治療の結果
バイオマーカーのカットオフ値を計算することにより、この調査研究においてＣＴＸ－ＩＩＩレベルが３．８ｎｇ／ｍＬ以上であるか、又はスクリーニングの時点で線維溶解レベルが０．５以上である患者が、退行性表現型を呈する見込みが１９．４倍及び２３．３倍高いことが実証された。バイオマーカーカットオフレベルをスクリーニングの時点で用いて、自然退行者を特定することができる。線維性ＥＣＭの自然解消を呈する患者は、バイオマーカーによって決定されるように低い初期線維溶解を有する患者と比較してより低い治療用量を必要とし得る。その結果、これは、治験中の患者のより良好な層別化、費用の減少、患者の福祉の増加、及び治療開発の援助の可能性につながる。
バイオマーカーのカットオフ値を計算することにより、この調査研究においてＣＴＸ－ＩＩＩレベルが３．８ｎｇ／ｍＬ以上であるか、又はスクリーニングの時点で線維溶解レベルが０．５以上である患者が、退行性表現型を呈する見込みが１９．４倍及び２３．３倍高いことが実証された。バイオマーカーカットオフレベルをスクリーニングの時点で用いて、自然退行者を特定することができる。線維性ＥＣＭの自然解消を呈する患者は、バイオマーカーによって決定されるように低い初期線維溶解を有する患者と比較してより低い治療用量を必要とし得る。その結果、これは、治験中の患者のより良好な層別化、費用の減少、患者の福祉の増加、及び治療開発の援助の可能性につながる。
【0146】
実施例４ 好酸球性食道炎
方法：
患者の人口統計及び臨床評価
除去食で治療した２９人の成人ＥｏＥ患者を分析に含めた。嚥下障害及びＥＲＥＦ総スコアをベースライン時及び内視鏡検査による介入後に評価した。
方法：
患者の人口統計及び臨床評価
除去食で治療した２９人の成人ＥｏＥ患者を分析に含めた。嚥下障害及びＥＲＥＦ総スコアをベースライン時及び内視鏡検査による介入後に評価した。
【0147】
表１４ 健常ドナーを含む、ベースライン時及び介入後のＥｏＥ患者の基本的な患者の人口統計を示す。人口統計には、年齢、性別、嚥下障害の存在、及び好酸球性食道炎基準スコア（ＥＲＥＦＳ）の合計が含まれる。
【表12】
【0148】
統計解析
ベースライン時及び介入後の患者の人口統計と患者の臨床パラメータとの間の統計的分散を、２つのグループについてのフィッシャーの正確検定又は複数のグループについてのカイ二乗検定によって決定した。
ベースライン時及び介入後の患者の人口統計と患者の臨床パラメータとの間の統計的分散を、２つのグループについてのフィッシャーの正確検定又は複数のグループについてのカイ二乗検定によって決定した。
【0149】
両方の時点でのＥｏＥ患者の血清ＣＴＸ－ＩＩＩと健常ドナーとの間の統計的差異の計算を、ノンパラメトリックデータのためのＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓを適用する一元配置ＡＮＯＶＡによって行った。０．０５未満のｐ値を統計的に有意であると決定した。
【0150】
結果：
コホート説明：
ＥｏＥ患者及び健常ドナーの平均年齢に有意差があり（ｐ＝０．００３９）、健常ドナーは平均９歳年上である。ベースライン時及び除去食後のＥｏＥ患者のＥＲＥＦ総スコアの比較により、有意な低下（ｐ＜０．０００１）が観察された（表１４）。
コホート説明：
ＥｏＥ患者及び健常ドナーの平均年齢に有意差があり（ｐ＝０．００３９）、健常ドナーは平均９歳年上である。ベースライン時及び除去食後のＥｏＥ患者のＥＲＥＦ総スコアの比較により、有意な低下（ｐ＜０．０００１）が観察された（表１４）。
【0151】
ＥｏＥ患者と健常ドナーを区別するＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーの診断の可能性
血清ＣＴＸ－ＩＩＩレベルは、健常ドナーと比較して、ベースラインと除去食後（介入後）の両方で有意に上昇した（ｐ＜０．０００１）。ベースラインレベルと介入後レベルとの間に有意差は示されなかった（図１２）。
血清ＣＴＸ－ＩＩＩレベルは、健常ドナーと比較して、ベースラインと除去食後（介入後）の両方で有意に上昇した（ｐ＜０．０００１）。ベースラインレベルと介入後レベルとの間に有意差は示されなかった（図１２）。
【0152】
考察：
ベースライン時及び６週間の除去食後に採血した２９人のＥｏＥ患者及び健常ドナーの研究においてＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーを適用することによって、ＥｏＥ患者における血清ＣＴＸ－ＩＩＩの上昇が実証された。間質マトリックス中の位置で、ＥｏＥにおける線維症の間に、ＩＩＩ型コラーゲンの沈着が、活性化された筋線維芽細胞によって上皮下層に主に生じる［４６、４９］。コラーゲン成熟の最終工程では、大量の分泌された架橋酵素が、分子内架橋及び分子間架橋の広範な形成を媒介する。健常ドナー線維芽細胞の筋線維芽細胞分化を開始するＥｏＥ患者の高度に架橋された病理学的コラーゲンマトリックスの能力は、ＥｏＥ関連線維症の増加においてＥＣＭの重要性を明確に示す［５９］。食道線維症によって引き起こされる臨床症状は、上皮下線維症の実際の発症よりも後に起こり、１０年毎の病気の期間にリスクが２倍になる［６０］。そのため、線維性細胞外マトリックスリモデリングの早期の評価は、治療の早期開始に重要である［６１］。本明細書で、架橋ＩＩＩ型コラーゲンのプロテアーゼ分解代謝物の定量は、ＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーの診断可能性を実証した。ＥｏＥと診断された患者におけるＣＴＸ－ＩＩＩの血清レベルが有意に上昇し、バイオマーカーは、ＥｏＥにおける支持診断ツールを提供し、潜在的にＥｏＥの薬力学的マーカーとしても役立ち得る。線維性狭窄の発生又は線維症の解消を監視するための抗線維症治療薬又はマーカーは、現在、ＥｏＥに利用可能なものはないが、ＥｏＥの病因の特に重要な炎症促進性サイトカインを標的とする治療薬の研究が進行中である。現在の治療上の選択肢には、局所ステロイドの投与及び除去食が含まれる［６２］。これらの２つの療法は、食道好酸球増加症の低下を実証したが、まだ線維症の低下を実証していない。
ベースライン時及び６週間の除去食後に採血した２９人のＥｏＥ患者及び健常ドナーの研究においてＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーを適用することによって、ＥｏＥ患者における血清ＣＴＸ－ＩＩＩの上昇が実証された。間質マトリックス中の位置で、ＥｏＥにおける線維症の間に、ＩＩＩ型コラーゲンの沈着が、活性化された筋線維芽細胞によって上皮下層に主に生じる［４６、４９］。コラーゲン成熟の最終工程では、大量の分泌された架橋酵素が、分子内架橋及び分子間架橋の広範な形成を媒介する。健常ドナー線維芽細胞の筋線維芽細胞分化を開始するＥｏＥ患者の高度に架橋された病理学的コラーゲンマトリックスの能力は、ＥｏＥ関連線維症の増加においてＥＣＭの重要性を明確に示す［５９］。食道線維症によって引き起こされる臨床症状は、上皮下線維症の実際の発症よりも後に起こり、１０年毎の病気の期間にリスクが２倍になる［６０］。そのため、線維性細胞外マトリックスリモデリングの早期の評価は、治療の早期開始に重要である［６１］。本明細書で、架橋ＩＩＩ型コラーゲンのプロテアーゼ分解代謝物の定量は、ＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーの診断可能性を実証した。ＥｏＥと診断された患者におけるＣＴＸ－ＩＩＩの血清レベルが有意に上昇し、バイオマーカーは、ＥｏＥにおける支持診断ツールを提供し、潜在的にＥｏＥの薬力学的マーカーとしても役立ち得る。線維性狭窄の発生又は線維症の解消を監視するための抗線維症治療薬又はマーカーは、現在、ＥｏＥに利用可能なものはないが、ＥｏＥの病因の特に重要な炎症促進性サイトカインを標的とする治療薬の研究が進行中である。現在の治療上の選択肢には、局所ステロイドの投与及び除去食が含まれる［６２］。これらの２つの療法は、食道好酸球増加症の低下を実証したが、まだ線維症の低下を実証していない。
【0153】
結論：
現在の研究では、ＥｏＥ患者に６週間の除去食を与えると、血清ＣＴＸ－ＩＩＩレベルに有意な影響をもたらさなかった。短期間の食事介入によるＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーレベルの変化は観察されなかったが、ＥｏＥ患者においてプロテアーゼ分解され、架橋されたＩＩＩ型コラーゲンの有意に上昇したレベルは、ＥｏＥ関連線維症のＩＩＩ型コラーゲンリモデリングにおけるバイオマーカーの可能性を示す。
現在の研究では、ＥｏＥ患者に６週間の除去食を与えると、血清ＣＴＸ－ＩＩＩレベルに有意な影響をもたらさなかった。短期間の食事介入によるＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーレベルの変化は観察されなかったが、ＥｏＥ患者においてプロテアーゼ分解され、架橋されたＩＩＩ型コラーゲンの有意に上昇したレベルは、ＥｏＥ関連線維症のＩＩＩ型コラーゲンリモデリングにおけるバイオマーカーの可能性を示す。
【0154】
実施例５－炎症性腸疾患
方法：
患者の人口統計及び病理学的評価：
単純な内視鏡的ＣＤスコア（ＳＥＳ－ＣＤ）に従って、採血時に患者を内視鏡により評価し、スコア付けした。０～１のＳＥＳ－ＣＤスコアを有する患者を内視鏡により不活性であると決定するが、１を超えるスコアは内視鏡により活性があると決定した。さらに、ＳＥＳ－ＣＤスコアが利用できなかった場合、不活性又は活性のある疾患の決定は、臨床パラメータで決定される患者のハーベイ・ブラッドショウ指数（ＨＢＩ）スコアに基づいていた。０～４のＨＢＩスコアは、臨床的に不活性な疾患を有する患者を表すが、４を超えるスコアは、臨床的に活性のある疾患を有する患者と決定した。
方法：
患者の人口統計及び病理学的評価：
単純な内視鏡的ＣＤスコア（ＳＥＳ－ＣＤ）に従って、採血時に患者を内視鏡により評価し、スコア付けした。０～１のＳＥＳ－ＣＤスコアを有する患者を内視鏡により不活性であると決定するが、１を超えるスコアは内視鏡により活性があると決定した。さらに、ＳＥＳ－ＣＤスコアが利用できなかった場合、不活性又は活性のある疾患の決定は、臨床パラメータで決定される患者のハーベイ・ブラッドショウ指数（ＨＢＩ）スコアに基づいていた。０～４のＨＢＩスコアは、臨床的に不活性な疾患を有する患者を表すが、４を超えるスコアは、臨床的に活性のある疾患を有する患者と決定した。
【0155】
非狭窄かつ非穿通疾患（Ｂ１）又は狭窄疾患挙動（Ｂ２）のいずれかに分けた患者の疾患挙動についてモントリオール分類を利用することによってさらに患者を層別化した。疾患の発症年齢が１６歳以下の患者についてモントリオールＡ１グループの患者、及び／又は肛門周囲疾患挙動についてモントリオールＢ４分類を有する患者は、分析から除外した。
【0156】
表１５：内視鏡的又は臨床的な疾患の活性及び内視鏡的疾患挙動に応じた患者の人口統計及び層別化の概要
【表13】
【0157】
統計解析：
Ｂ１及びＢ２モントリオール分類における患者の人口統計と患者の病理学的パラメータとの間の統計的分散を、フィッシャーの正確検定によって決定した。
Ｂ１及びＢ２モントリオール分類における患者の人口統計と患者の病理学的パラメータとの間の統計的分散を、フィッシャーの正確検定によって決定した。
【0158】
健常ドナーと、ＣＤ又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）のいずれかと診断された患者との間の血漿ＣＴＸ－ＩＩＩ又は正味の線維溶解（ｌｏｇ（ＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＲＯ－Ｃ３））の評価を、比較グループの数に応じて、ｔ検定又は一元配置ＡＮＯＶＡを適用することによって行った。ノンパラメトリック一元配置ＡＮＯＶＡのためにＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ並びにノンパラメトリック及びパラメトリックデータのためにＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ又は対応のないｔ検定のいずれかによって統計的差異を計算した。０．０５未満のｐ値を統計的に有意であると決定した。
【0159】
結果：
患者の人口統計及び病理学的評価
Ｂ２の患者の数と比較して、Ｂ１グループにおいて統計的により多い数の患者が存在した（ｐ＝０．００８）。Ｂ１を有する患者の年齢は、Ｂ２分類を有する患者よりも有意に若かった（ｐ＝０．０１１８）。さらに、Ｂ１分類を有する患者は、Ｂ２を有する患者と比較して、肛門周囲にも症状を呈した有意により多い数の患者（Ｂ４）を有した（ｐ＝０．００２６）。残りの人口統計学的パラメータと病理学的パラメータとの間に有意差は示されなかった。
患者の人口統計及び病理学的評価
Ｂ２の患者の数と比較して、Ｂ１グループにおいて統計的により多い数の患者が存在した（ｐ＝０．００８）。Ｂ１を有する患者の年齢は、Ｂ２分類を有する患者よりも有意に若かった（ｐ＝０．０１１８）。さらに、Ｂ１分類を有する患者は、Ｂ２を有する患者と比較して、肛門周囲にも症状を呈した有意により多い数の患者（Ｂ４）を有した（ｐ＝０．００２６）。残りの人口統計学的パラメータと病理学的パラメータとの間に有意差は示されなかった。
【0160】
血漿ＣＴＸ－ＩＩＩは慢性腸炎症を有する患者において増加する
ＣＤ患者及びＵＣ患者は、健常ドナーと比較して有意により高いレベルの血漿ＣＴＸ－ＩＩＩを示した（ｐ＜０．０００１）。ＣＤとＵＣの患者の間には統計的な差異は見られなかった（図１３）。
ＣＤ患者及びＵＣ患者は、健常ドナーと比較して有意により高いレベルの血漿ＣＴＸ－ＩＩＩを示した（ｐ＜０．０００１）。ＣＤとＵＣの患者の間には統計的な差異は見られなかった（図１３）。
【0161】
血漿ＣＴＸ－ＩＩＩの定量による管腔疾患及び狭窄疾患の症状の区別
血漿ＣＴＸ－ＩＩＩは、不活性な疾患及び非狭窄かつ非穿通疾患（Ｂ１）挙動を呈するＣＤ患者において有意に上昇した。狭窄疾患（Ｂ２）症状を有する患者と比較して、レベルが上昇した（ｐ＜０．０１）（図１４Ａ）。さらに、正味の架橋線維溶解（ｌｏｇ（ＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＣ３Ｘ））又は正味の線維溶解（ｌｏｇ（ＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＲＯ－Ｃ３））を計算することにより、非狭窄かつ非穿通疾患（Ｂ１）患者は、狭窄疾患を有する患者（Ｂ２）と比較した場合に、より高いレベルの線維溶解が実証された（ｐ＜０．０５、及びｐ＜０．０１）（図１４Ｂ＋Ｃ）。
血漿ＣＴＸ－ＩＩＩは、不活性な疾患及び非狭窄かつ非穿通疾患（Ｂ１）挙動を呈するＣＤ患者において有意に上昇した。狭窄疾患（Ｂ２）症状を有する患者と比較して、レベルが上昇した（ｐ＜０．０１）（図１４Ａ）。さらに、正味の架橋線維溶解（ｌｏｇ（ＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＣ３Ｘ））又は正味の線維溶解（ｌｏｇ（ＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＲＯ－Ｃ３））を計算することにより、非狭窄かつ非穿通疾患（Ｂ１）患者は、狭窄疾患を有する患者（Ｂ２）と比較した場合に、より高いレベルの線維溶解が実証された（ｐ＜０．０５、及びｐ＜０．０１）（図１４Ｂ＋Ｃ）。
【0162】
考察：
この研究において、ＩＢＤ患者における線維溶解度を、架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）のプロテアーゼ分解代謝産物のレベルを定量化することによって、並びに正味の架橋線維溶解をＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＣ３Ｘ比によって、又は正味の線維溶解をＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＲＯ－Ｃ３比のいずれかによって調べた。この研究における主な知見は以下のとおりであった：１）ＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーレベルは健常ドナーと比較した場合に、ＩＢＤ患者において有意に上昇した（図１３）、かつ２）ＣＴＸ－ＩＩＩ又は架橋若しくは非架橋の正味の線維溶解（ｌｏｇ（ＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＣ３Ｘ又はＰＲＯ－Ｃ３））レベルの定量は、管腔疾患又は構造形成疾患（ｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）の挙動を呈する臨床寛解の患者を区別することができる（図１４）。
この研究において、ＩＢＤ患者における線維溶解度を、架橋ＩＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ－ＩＩＩ）のプロテアーゼ分解代謝産物のレベルを定量化することによって、並びに正味の架橋線維溶解をＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＣ３Ｘ比によって、又は正味の線維溶解をＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＲＯ－Ｃ３比のいずれかによって調べた。この研究における主な知見は以下のとおりであった：１）ＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーレベルは健常ドナーと比較した場合に、ＩＢＤ患者において有意に上昇した（図１３）、かつ２）ＣＴＸ－ＩＩＩ又は架橋若しくは非架橋の正味の線維溶解（ｌｏｇ（ＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＣ３Ｘ又はＰＲＯ－Ｃ３））レベルの定量は、管腔疾患又は構造形成疾患（ｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）の挙動を呈する臨床寛解の患者を区別することができる（図１４）。
【0163】
病理学的創傷治癒の活性化を維持するＩＢＤの特徴的な慢性炎症は、広範なＥＣＭリモデリングの重要な促進要因として認識される。ＣＤ患者における線維性コラーゲン発現は健常個体と比較して有意に上昇し［７０］、組織学的評価は粘膜下層から粘膜筋までの腸の異なる組織層において過剰な沈着を示した［６８］。さらに、炎症細胞と活性化線維芽細胞の両方が、増加した量のＭＭＰを産生し、その結果コラーゲン分解が増加し、重篤な場合には瘻の形成をもたらし得る。
【0164】
Ｈａａｆｔｅｎらによる以前の研究［７１］は、疾患挙動の内視鏡的評価に基づいてＣＤ患者を区別する際に、ＭＭＰ媒介分解及び形成を反映するＩＩＩ型コラーゲンバイオマーカーの使用を実証した。狭窄疾患を有する患者は、組織内のコラーゲンの過剰な沈着を反映するコラーゲン形成マーカーのレベルの増加と関連付けられるが、コラーゲン分解は、穿通疾患を有する患者において増加した［７１］。
【0165】
本明細書で、架橋ＩＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解代謝産物を定量し、非狭窄かつ非穿通疾患挙動（Ｂ１）を呈する不活性な疾患を有するＣＤ患者における全体的な正味の線維溶解を評価することによって線維溶解のレベルの増加が実証される。これらの患者は、狭窄疾患を有する患者（Ｂ２）と比較して、あまり重篤でない疾患症状を呈するとみなされ、不活性な疾患と組み合わされ得ることから、活発な炎症の程度が低いことも示唆される。ＣＤ患者の間質マトリックス中に沈着した線維性コラーゲンの分子内架橋及び分子間架橋の酵素的形成は、コラーゲンの成熟における最終工程を表す。そのため、架橋ＩＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解は、成熟コラーゲン原線維の線維溶解と関連付けられる。狭窄の形成を引き起こす大量のコラーゲン形成を呈し、広範なコラーゲン架橋と組み合わされる狭窄疾患を有する患者は、タンパク質分解を抑制することができる。これは、本研究で実証された線維溶解レベルの減少として観察される。したがって、ＩＩＩ型コラーゲン沈着が増加した非狭窄かつ非穿通疾患を有する患者は、潜在的により少ない程度に架橋しているにもかかわらず、病的ＩＩＩ型コラーゲン沈着の分解及びクリアランスが増大する。そのため、非狭窄かつ非穿通疾患と狭窄疾患との間のＩＩＩ型コラーゲンリモデリングの分子プロセスにおけるこれらの違いは、ＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカー、及び正味の線維溶解についてのＰＣ３Ｘ又はＰＲＯ－Ｃ３のいずれかとの比の利用により定量化することができる。
【0166】
腸線維症の内視鏡検査及び組織学的評価の限界により、真の線維溶解を反映するＣＴＸ－ＩＩＩなどのバイオマーカーを含めることは、臨床設定において有益であることが証明できる。低侵襲性バイオマーカーにより分子レベルでＩＩＩ型コラーゲンリモデリングを評価することにより、内視鏡検査及び組織学を支持するデータを提供することができる。これらのバイオマーカーは、亜臨床疾患挙動を特定し、かつ治療応答の亜臨床情報を提供することができる。ＣＤの線維性狭窄における治療が進むにつれて、ＣＴＸ－ＩＩＩなどのバイオマーカーを線維症解消の評価のために利用することができる。
【0167】
結論：
提示したデータは、ＩＩＩ型コラーゲンの架橋代謝産物をＩＢＤ患者の循環に放出するタンパク質分解活性の程度の増大を示す。これは、健常個体と比較してＣＤ患者とＵＣ患者の両方について実証された。さらに、ＣＤ患者を、内視鏡的及び／又は臨床的寛解（不活性）にあることに基づいて層別化し、その後、モントリオール分類の非狭窄かつ非穿通疾患（Ｂ１）又は狭窄疾患（Ｂ２）挙動に応じて層別化した。本明細書で、Ｂ１モントリオール分類の患者は、Ｂ２分類を有する患者と比較して最高の線維溶解度を示した。
提示したデータは、ＩＩＩ型コラーゲンの架橋代謝産物をＩＢＤ患者の循環に放出するタンパク質分解活性の程度の増大を示す。これは、健常個体と比較してＣＤ患者とＵＣ患者の両方について実証された。さらに、ＣＤ患者を、内視鏡的及び／又は臨床的寛解（不活性）にあることに基づいて層別化し、その後、モントリオール分類の非狭窄かつ非穿通疾患（Ｂ１）又は狭窄疾患（Ｂ２）挙動に応じて層別化した。本明細書で、Ｂ１モントリオール分類の患者は、Ｂ２分類を有する患者と比較して最高の線維溶解度を示した。
【0168】
実施例６－癌
方法：
アッセイ手順を上記のように行った。これらのアッセイにはＣＴＸ－ＩＩＩ及びＰＲＯ－Ｃ３が含まれる。
方法：
アッセイ手順を上記のように行った。これらのアッセイにはＣＴＸ－ＩＩＩ及びＰＲＯ－Ｃ３が含まれる。
【0169】
コホートには、膵臓、結腸直腸、腎臓、胃、卵巣、乳房、膀胱、肺、黒色腫、頭頸部及び前立腺の癌の患者各２０人を含めた。それには、３人の肝臓癌患者及び３３人の健常対照も含めた。全ての癌試料をＰｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から取得し、健常対照をＢｉｏＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）から取得した。
【0170】
表１６ コホートの人口統計
【表14】
【0171】
結果：
癌における架橋ＩＩＩ型コラーゲンのプロテアーゼ分解断片の血液レベル
健常個体及び癌と診断された患者における血清ＣＴＸ－ＩＩＩは、健常個体と比較した場合に、１２のうち７種類の癌において有意に上昇したレベルであることが明らかになった。バイオマーカーレベルは、膀胱癌（ｐ＜０．０１）、乳癌（ｐ＜０．０５）、ＣＲＣ（ｐ＜０．００１）、腎臓癌（ｐ＜０．０５）、肺癌（ｐ＜０．０５）、膵臓癌（ｐ＜０．０５）、及び胃癌（ｐ＜０．０５）において上昇していることが判明した。
癌における架橋ＩＩＩ型コラーゲンのプロテアーゼ分解断片の血液レベル
健常個体及び癌と診断された患者における血清ＣＴＸ－ＩＩＩは、健常個体と比較した場合に、１２のうち７種類の癌において有意に上昇したレベルであることが明らかになった。バイオマーカーレベルは、膀胱癌（ｐ＜０．０１）、乳癌（ｐ＜０．０５）、ＣＲＣ（ｐ＜０．００１）、腎臓癌（ｐ＜０．０５）、肺癌（ｐ＜０．０５）、膵臓癌（ｐ＜０．０５）、及び胃癌（ｐ＜０．０５）において上昇していることが判明した。
【0172】
Ｈ＆Ｎ癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、及び黒色腫を有する患者は、健常個体と比較して、有意に上昇したＣＴＸ－ＩＩＩのレベルを示さなかった（ｐ＞０．０５）。しかし、全ての１２種類の癌におけるＣＴＸ－ＩＩＩの中央値レベルは、健常個体と比較して上昇しており、肝臓癌は１１．９６の最も高い中央値レベルを示した（表１）。
【0173】
ステージＩＩＩ乳癌は増加した線維溶解と関連付けられる
癌のステージに従って乳癌を有する患者を層別化する場合、ステージＩＩを有する患者と比較して、ステージＩＩＩ乳癌を有する患者において有意に上昇したＣＴＸ－ＩＩＩのレベル（ｐ＜０．００１）が観察された。さらに、ＣＴＸ－ＩＩＩとＰＲＯ－Ｃ３の比を利用して正味の線維溶解度を計算することにより、ステージＩＩと比較して、ステージＩＩＩを有する患者において有意に高いレベル（ｐ＜０．０５）の正味の線維溶解が観察された（図１６）。
癌のステージに従って乳癌を有する患者を層別化する場合、ステージＩＩを有する患者と比較して、ステージＩＩＩ乳癌を有する患者において有意に上昇したＣＴＸ－ＩＩＩのレベル（ｐ＜０．００１）が観察された。さらに、ＣＴＸ－ＩＩＩとＰＲＯ－Ｃ３の比を利用して正味の線維溶解度を計算することにより、ステージＩＩと比較して、ステージＩＩＩを有する患者において有意に高いレベル（ｐ＜０．０５）の正味の線維溶解が観察された（図１６）。
【0174】
考察
架橋ＩＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解の程度を評価する際のＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーの可能性並びに様々な種類の癌における正味の線維溶解の調査は以下のようになった：（１）ＣＴＸ－ＩＩＩのレベルは、健常個体と比較して、１２のうち７種類の癌において有意に上昇しており、（２）ステージＩＩＩ乳癌を有する患者は、ステージＩＩの患者と比較してより高い血清ＣＴＸ－ＩＩＩ及び正味の線維溶解を呈した。
架橋ＩＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解の程度を評価する際のＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーの可能性並びに様々な種類の癌における正味の線維溶解の調査は以下のようになった：（１）ＣＴＸ－ＩＩＩのレベルは、健常個体と比較して、１２のうち７種類の癌において有意に上昇しており、（２）ステージＩＩＩ乳癌を有する患者は、ステージＩＩの患者と比較してより高い血清ＣＴＸ－ＩＩＩ及び正味の線維溶解を呈した。
【0175】
健常個体は、古いコラーゲンが分解され、置き換わり、組織ホメオスタシスを維持している平衡ＥＣＭリモデリングを経験するが、このプロセスは、腫瘍間質においてひどくゆがんでいる。腫瘍間質では、ＣＡＦなどの細胞は、主にＩ型コラーゲンであるが、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、及びＸＩ型コラーゲンの沈着並びに架橋を介してますます剛性のあるＥＣＭの形成を促進する。増加したマトリックス剛性の主要原因は、ＬＯＸＬ（Ｌ）及びＴＧ２の酵素作用により媒介される線維性コラーゲン内の分子内及び分子間の架橋量である［８０］。
【0176】
ＬＯＸ（Ｌ）媒介性架橋に関与することが示唆されるＬｙｓが、ＣＴＸ－ＩＩＩネオエピトープ内に埋め込まれている［８１］ことにより、ＩＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解後に放出される架橋断片を特異的に定量することができる。このように、ＭＭＰの放出の増加、ＩＩＩ型コラーゲンの沈着及び腫瘍間質を特徴付けるＬＯＸ（Ｌ）媒介性架橋は、ＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーのレベルの増加によって示される。
【0177】
この理論と一致して、本研究において、ＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーのレベルの増加が観察され、このバイオマーカーが健常個体と癌患者とを区別し、根底にあるＩＩＩ型コラーゲンの病理学的分解及び架橋を有する個体を特定することができる。しかし、調査した１２種類の癌のうち、Ｈ＆Ｎ癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、及び黒色腫は、健常個体よりも有意に高い線維溶解のレベルを示さなかった。本研究におけるレベルは健常個体のＣＴＸ－ＩＩＩレベルとは統計的に異なるわけではないが、癌患者の中央値ＣＴＸ－ＩＩＩでは増加が観察された。これは、これらの患者における架橋ＩＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解の程度の全体的な上昇を示す。統計的区別の欠如が、限られた試料サイズによって引き起こされる可能性があり、３人の患者のみからなる肝臓癌患者の観察で特に当てはまる。
【0178】
さらに、ＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーレベルと全体的な正味の線維溶解度（ＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＲＯ－Ｃ３）の両方が、乳癌の後期ステージで上昇していた。これらのデータは、癌患者の診断におけるＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーの使用を示し、それらの疾患の重篤度に応じて患者を層別化するためのバイオマーカーの潜在的能力を示す。線維溶解に関して、ステージＩＩＩとステージＩＶの乳癌患者との間に有意差が観察された。
【0179】
癌患者における病理コラーゲンのリモデリングの評価のための標的化架橋コラーゲン断片は、Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ Ｊｅｎｓｅｎらによる研究で最近示された。本明細書で、研究者らは、ＰＲＯ－Ｃ３バイオマーカーと共に、肝細胞癌の研究における血液ベースのバイオマーカーＰＣ３Ｘを調べた［８２］。ＰＲＯ－Ｃ３は、ＩＩＩ型コラーゲンの架橋及び非架橋Ｎ末端プロペプチドを定量化し、ＩＩＩ型コラーゲン形成を反映するが、ＰＣ３Ｘバイオマーカーは、架橋したＮ末端プロペプチドを特異的に標的とする。ＰＲＯ－Ｃ３と比較した肝細胞癌患者におけるＰＣ３Ｘレベルは、架橋ＩＩＩ型コラーゲンのレベルの増加を示し、腫瘍間質中のコラーゲン架橋の量の増加を支持する。
【0180】
近年、コラーゲンの酵素的架橋は、癌の治療分野において関心が得られている［８３］。上述したように、ＬＯＸ（Ｌ）及びＴＧ２などの酵素は、架橋の量の増加を促進するが、架橋の生化学的性質も決定的に重要である。特に、細胞内及び細胞外で発現するリシルヒドロキシラーゼ２の酵素的作用は、転移を促進し、生存を低下させることが示された。ＬＨ２は、コラーゲンα鎖内の特異的Ｌｙｓのヒドロキシル化を媒介し、Ｌｙｓヒドロキシル化に促進される架橋の程度がより高くなる。マトリックスの剛性を支配することによって、腫瘍の進行を増強する重要な機構的役割のために、ＬＯＸＬ２及びＬＨ２は、将来の治療選択の標的として特定された［８４］。
【0181】
そのため、架橋コラーゲンの代謝産物を特異的に標的とする血液ベースのバイオマーカーを利用することは、ＣＡＦ活性と架橋酵素の酵素活性を反映する定量的な測定を提供することができる。臨床設定において、バイオマーカーは、診断及び予後診断の目的のために潜在的に利用でき、線維溶解度に基づいて患者を分け、コラーゲン架橋を標的とする治療選択が有益である患者を特定することができる。
【0182】
結論：
線維溶解を反映する架橋ＩＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解断片は、１２種類の癌において放出され、定量化でき、健常個体と比較して全ての種類の癌において中央値レベルが上昇していることが実証された。癌患者では上昇しているが、７種類の癌においてのみＣＴＸ－ＩＩＩレベルが有意に上昇していることが判明した。さらに、架橋ＩＩＩ型コラーゲン線維溶解の定量化が、ステージＩＩ又はステージＩＩＩのいずれかにおける乳癌患者の区別を可能にし、上昇レベルは後期乳癌と関連付けられる。
線維溶解を反映する架橋ＩＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解断片は、１２種類の癌において放出され、定量化でき、健常個体と比較して全ての種類の癌において中央値レベルが上昇していることが実証された。癌患者では上昇しているが、７種類の癌においてのみＣＴＸ－ＩＩＩレベルが有意に上昇していることが判明した。さらに、架橋ＩＩＩ型コラーゲン線維溶解の定量化が、ステージＩＩ又はステージＩＩＩのいずれかにおける乳癌患者の区別を可能にし、上昇レベルは後期乳癌と関連付けられる。
【0183】
ＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカーは、タンパク質分解後に循環中に放出される架橋ＩＩＩ型コラーゲン断片の定量に使用することができ、それによって、癌患者の臨床設定で使用できると結論付けることができる。
【0184】
要約
ＩＩＩ型コラーゲンの架橋断片を測定することができる高度にネオエピトープ特異的ＥＬＩＳＡの開発及び検証が実証された。このアッセイは、ＨＤとＮＡＦＬＤ罹患肥満患者、ＨＤと肝線維症患者、ＨＤとＥｏＥ患者、ＨＤと慢性腸疾患の患者、及びＨＤと癌患者とを区別することができ、ＩＩＩ型コラーゲンの既知の蓄積及び架橋酵素のレベルの増加を伴う病状における疾患マーカーとしてのＣＴＸ－ＩＩＩマーカーの関連性を示した。
ＩＩＩ型コラーゲンの架橋断片を測定することができる高度にネオエピトープ特異的ＥＬＩＳＡの開発及び検証が実証された。このアッセイは、ＨＤとＮＡＦＬＤ罹患肥満患者、ＨＤと肝線維症患者、ＨＤとＥｏＥ患者、ＨＤと慢性腸疾患の患者、及びＨＤと癌患者とを区別することができ、ＩＩＩ型コラーゲンの既知の蓄積及び架橋酵素のレベルの増加を伴う病状における疾患マーカーとしてのＣＴＸ－ＩＩＩマーカーの関連性を示した。
【0185】
さらに、ＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカー及びＰＲＯ－Ｃ３バイオマーカーを用いた正味の線維溶解比（ＣＴＸ－ＩＩＩ／ＰＲＯ－Ｃ３）の計算は、それらの自然線維症表現型に従って患者を区別する能力によりＨＣＶ関連肝線維症におけるレベルの上昇を実証した。正味の線維溶解の計算はまた、慢性腸疾患、特にクローン病、及び乳癌などの癌におけるそれらの疾患の重篤度に従って患者を区別することができた。そのため、ＣＴＸ－ＩＩＩバイオマーカー及び関連する正味の線維溶解比は、ＨＣＶ関連肝線維症、慢性腸疾患又は癌を有する患者を特定することができるだけでなく、スクリーニング時点の応答を潜在的に予測する予後バイオマーカーとしても適用することができる。
【0186】
本明細書において、特に明示的に示さない限り、単語「又は」は、規定条件のいずれか又は両方が満たされた場合に真の値を返すオペレーターの意味で使用され、条件の１つだけが満たされることを必要とするオペレーターの「排他的又は」とは対照的である。単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「からなる」を意味するよりも、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で使用される。先に認められた全ての先行教示は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における公開されたいずれの先行文献の承認も、その教示が本明細書の日付のオーストラリア又はどこかの共通の一般常識であることを認める又は代表であると解釈されるべきではない。
【0187】
以下の参考文献が本明細書で引用される：
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【手続補正書】
【提出日】2023-01-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】