特表 2023-522054 保存および分析のための核酸試料を調製する方法、装置、およびキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-26

(54)【発明の名称】保存および分析のための核酸試料を調製する方法、装置、およびキット

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20230519BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20230519BHJP

   C12Q 1/70 20060101ALI20230519BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20230519BHJP

   C12M 1/26 20060101ALI20230519BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 100Z

C12Q1/6806 Z

C12Q1/70

C12Q1/6844 Z

C12M1/26

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022562976

(86)(22)【出願日】2021-04-15

(85)【翻訳文提出日】2022-12-14

(86)【国際出願番号】 EP2021059815

(87)【国際公開番号】W WO2021209564

(87)【国際公開日】2021-10-21

(31)【優先権主張番号】63/010,455

(32)【優先日】2020-04-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/042,552

(32)【優先日】2020-06-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/049,626

(32)【優先日】2020-07-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/052,269

(32)【優先日】2020-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/073,447

(32)【優先日】2020-09-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/124,048

(32)【優先日】2020-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/163,032

(32)【優先日】2021-03-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/164,520

(32)【優先日】2021-03-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522403789

【氏名又は名称】ヴォスビオ，インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】ピーター・ジョセフ・ホーンビー，デビッド

(72)【発明者】

【氏名】ティー．イェルデ，ダグラス

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029HA01

4B063QA18

4B063QQ07

4B063QQ10

4B063QQ52

4B063QR35

4B063QR76

4B063QR79

4B063QS25

(57)【要約】

ウイルス、細菌、酵母および他の細胞から、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む核酸を試料収集、放出および安定化する方法、装置およびキットが記載されている。放出および安定化された核酸は、試料をさらに調製することなくポイントオブケアで分析および定量化してもよく、または発送により検査研究室に輸送して直接分析してもよい。ＲＮＡであってもよい核酸は安全および安定したままであるため、政府郵便サービスを含む通常手段による発送が使用され得る。加えて、ＲＮＡ試料は安定したままであるため、分析は、試料を受け取った直後に、または数日間、数週間もしくは数か月間保存した後で実施され得る。保存は、室温もしくは周囲温度またはそれより低い温度であってもよい。試料を取得するために使用される試料収集器具は、ハイスループット並列処理機器を含む核酸検出および測定機器と連動させることできる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

分析前に生物試料を準備する方法であって、前記方法が：試料容器中で前記生物試料と水混和性有機溶媒を混ぜ合わせることを含み、
ここにおいて、前記水混和性有機溶媒は
（ｉ）前記生物試料内に存在するウイルスまたは細胞を溶かして、核酸を前記水混和性有機溶媒中の溶液中に放出させ、そして
（ｉｉ）前記生物試料中のＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ酵素を変性または失活させて、前記核酸の分解を低減し、それによって加工された生物試料を提供する、
前記方法。

【請求項2】

前記水混和性有機溶媒がアセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＤＭＦ、アセトン、ホルムアミドまたはＤＭＳＯ、またはこれらの組み合わせから構成される群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記水混和性有機溶媒がアセトニトリルである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記水混和性有機溶媒がアセトニトリルであり、前記核酸がウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記水混和性有機溶媒がＤＭＳＯである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

前記水混和性有機溶媒がＤＭＳＯであり、前記核酸がウイルスＲＮＡまたはウイルスＲＮＡである、請求項３に記載の方法。

【請求項7】

前記水混和性有機溶媒がアセトンである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項8】

前記生物試料が体液、血液、尿、便（糞）、臓器組織、脳脊髄液、鼻の物質（ｎａｓａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）、痰または唾液である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記生物試料が唾液中または鼻孔綿棒（ｎｏｓｔｒｉｌ ｓｗａｂ）上に存在する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記生物試料が、対象の呼気中に存在し、そして、試料容器内に息を吹き込むこと、または、当該対象の口の前に保持された表面上に息を吹きかけること、によって捕捉される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記生物試料が、前記試料容器に関連する吸着剤、媒体、または表面に捕捉される呼気液体粒子である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

呼吸による前記生物試料の捕捉が、呼吸のための入口と出口を有するチャンバーを含む装置を使用し、
前記チャンバーが、前記呼気粒子がその上に集まる表面、吸着剤または媒体を有し、
前記装置が、液体で擦り、拭き取り、滴下または濯ぐことによって表面、吸着剤または媒体から前記液体粒子を回収し、それによって前記生物試料を提供する手段、を有する、
請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

呼吸による前記生物試料の捕捉が装置を使用し、
前記装置が、前記呼気粒子がその上に集まる表面、吸着剤または媒体を口の前に置くこと、ならびに、液体で擦り、拭き取り、滴下または濯ぐことによって表面、吸着剤または媒体から前記液体粒子を回収し、それによって前記生物試料を提供する手段、を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

前記表面、吸着剤または媒体を冷却し、前記呼気粒子の凝縮を促進する、請求項１２または１３に記載の方法。

【請求項15】

前記核酸がＲＮＡである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記核酸がＤＮＡである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記生物試料の非核酸成分が、前記水混和性有機溶媒によって沈殿させられる、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記沈殿した非核酸成分が、細胞壁、エンベロープまたはカプシドデブリなどのタンパク質、酵素、脂質または炭水化物を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記水混和性有機溶媒中の前記核酸溶液を、前記生物試料の沈殿成分から分離するステップをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記生物試料がウイルス、細菌、酵母または組織細胞を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記生物試料がウイルスを含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記ウイルスが、（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による）ＣＯＶＩＤ－１９、（ＡＩＤＳ、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶによる）後天性免疫不全症候群、単純疱疹（ｃｏｌｄ ｓｏｒｅｓ）、水痘、麻疹、インフルエンザ、インフルエンザ、いくつかの種類の癌またはその他から構成される群より選択される、請求項２０または２１に記載の方法。
他の例は単純ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）、水痘・帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｅｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バール・ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、コロナウイルス、ロタウイルス、肝炎、尖圭コンジローマ（ヒトパピローマウイルス、またはＨＰＶ）、インフルエンザそしてＢＫウイルスを含む。

【請求項23】

前記生物試料と前記水混和性有機溶媒を混ぜ合わせることによって引き起こされる前記溶解が、加熱によって増大する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記生物試料がウイルスを含み、前記水混和性有機溶媒がウイルスを溶解し、ウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡを溶液中に放出する、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記生物試料が細胞を含み、前記水混和性有機溶媒が細胞壁を溶解し、前記核酸を溶液中に放出する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記水混和性溶媒の前記溶液が、約１５℃から約３０℃の間の周囲温度で少なくとも３日間保存可能であるように、前記核酸を安定化する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

保護緩衝液を前記試料に添加し、前記生物試料の安定化させることをさらに含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記試料がウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡであり、前記緩衝液がウイルス輸送媒体である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記加工された生物試料が保護緩衝液の添加を必要としない、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記試料容器に蓋がされている、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記試料容器がバイアル、チューブまたはコンテナであり、前記生物試料および前記水混和性有機溶媒を添加後に蓋により閉じられている、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記生物試料を保存することをさらに含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記水混和性有機溶媒がウイルスを殺すか無効化し、前記加工された生物試料を保存または輸送可能にすることができる、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

加工された生物試料中の標的核酸を検出するための方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法によって、加工された生物試料を提供し；
（ｂ）前記水混和性有機溶媒の存在下において、前記標的核酸を増幅するために前記加工された生物試料および核酸増幅試薬を混ぜ合わせ、増幅された試料を提供し；そして
（ｃ）前記増幅された試料を分析して、前記標的核酸の存在を検出する
ことを含む、前記方法。

【請求項35】

生物試料中の標的核酸を検出する方法であって、前記方法が、
（ａ）試料容器中で前記生物試料と水混和性有機溶媒を混ぜ合わせ、ここにおいて、前記水混和性有機溶媒は
（ｉ）前記生物試料内に存在するウイルスまたは細胞を溶かして、核酸を前記水混和性有機溶媒中の溶液中に放出させ、そして
（ｉｉ）前記生物試料中のＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ酵素を変性または失活させて、前記核酸の分解を低減し、それによって加工された生物試料を提供し；
（ｂ）前記水混和性有機溶媒の存在下において、前記標的核酸を増幅するために前記加工された生物試料および核酸増幅試薬を混ぜ合わせ、増幅された試料を提供し；そして
（ｃ）前記増幅された試料を分析して、前記標的核酸の存在を検出する
ことを含む、前記方法。

【請求項36】

前記水混和性有機溶媒および前記核酸増幅試薬を含む組成物と、前記生物試料とを混ぜ合わせることにより、前記水混和性有機溶媒と前記核酸増幅試薬を前記生物試料に同時に混ぜ合わせる、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記生物試料の沈殿した非核酸成分から前記水混和性有機溶媒の前記溶液を分離することをさらに含む、請求項３４または３５に記載の方法。

【請求項38】

前記沈殿した非核酸成分が濾過または遠心によって分離される、請求項３４から４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記標的核酸を増幅する前に前記加工された生物試料を水で希釈することをさらに含む、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記水混和性有機溶媒が、０．５％ｖ／ｖより高い濃度で存在するように、前記試料を希釈するステップを含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記加工された生物試料を水で希釈する前記ステップが、前記増幅試薬の添加の前記ステップと同時または順次に起こる、請求項３９または４０に記載の方法。

【請求項42】

前記増幅反応が検出酵素を用いて、前記標的核酸を増幅する、請求項３４から４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記検出酵素が、０．５％ｖ／ｖを超える溶媒濃度の前記水混和性有機溶媒の存在下、ＲＮＡをｃＤＮＡに転写する逆転写酵素である、請求項３４から４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記検出酵素が、０．５％ｖ／ｖを超える溶媒濃度の前記水混和性有機溶媒の存在下、前記核酸を増幅するポリメラーゼである、請求項３４から４３に記載の方法。

【請求項45】

前記増幅反応がＲＴ－ＰＣＲ、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＬＡＭＰまたはＥＸＰＡＲである、請求項３４から４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記標的核酸がＲＮＡであり、前記増幅反応がＲＴ－ＰＣＲであり、前記検出酵素が前記水混和性有機溶媒存在下においてＲＮＡをｃＤＮＡに転写する逆転写酵素ＲＮＡである、請求項３４から４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記標的核酸がＤＮＡであり、前記増幅反応がＰＣＲであり、前記検出酵素が前記水混和性有機溶媒の存在下において前記標的核酸を増幅するポリメラーゼである、請求項３４から４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記生物試料がウイルス、細菌、酵母または組織細胞を含む、請求項３４から４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記生物試料がウイルスを含み、その前記標的核酸がウイルス抗原である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記生物試料が体液、血液、尿、便（糞）、臓器組織、脳脊髄液、鼻の物質（ｎａｓａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）、痰または唾液である、請求項３４から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記ウイルスが、（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による）ＣＯＶＩＤ－１９、（ＡＩＤＳ、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶによる）後天性免疫不全症候群、単純疱疹（ｃｏｌｄ ｓｏｒｅｓ）、水痘、麻疹、インフルエンザ、インフルエンザ、いくつかの種類の癌およびその他から構成される群より選択される、
請求項５０に記載の方法。
他の例は単純ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）、水痘・帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｅｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バール・ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、コロナウイルス、ロタウイルス、肝炎、尖圭コンジローマ（ヒトパピローマウイルス、またはＨＰＶ）、インフルエンザそしてＢＫウイルスを含む。

【請求項52】

前記増幅された試料を分析する前記ステップが、前記核酸標的抗原に特異的な抗体または前記核酸標的抗原に特異的なプローブを用いて実施される、請求項３４か５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記抗体または前記プローブが結合後の検出のためにラベル化されている、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記増幅された核酸標的に特異的な前記抗体の前記結合を検出することが、酵素または蛍光分子でタグ付けされた二次抗体を用いて行われる、請求項５１または請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

前記核酸の少なくとも一部が、前記方法の間、可溶性のままである、請求項３４から５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記水混和性有機溶媒中の前記核酸の前記溶液を、前記加工された生物試料の沈殿成分から分離する前記最初のステップを含む、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記生物試料と前記水混和性有機溶媒を混ぜ合わせることによって引き起こされる溶解が、加熱により増大する、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

試料容器内に息を吹き込むことにより、対象の呼気中に存在する生物試料を捕捉し、調製し、そして保存する方法であって、
前記方法が、前記対象が試料容器内に息を吹き込み、前記生物試料を水混和性有機溶媒と混ぜ合わせることを含み、
ここにおいて、前記水混和性有機溶媒は、
（ｉ）前記生物試料内に存在するウイルスまたは細胞を溶かして、核酸を前記水混和性有機溶媒中の溶液中に放出させ、そして
（ｉｉ）前記生物試料中のＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ酵素を変性または失活させて、前記核酸の分解を低減し、それによって加工された生物試料を提供する、
前記方法。

【請求項59】

前記生物試料が、前記試料容器に関連する吸着剤、媒体、または表面上に捕捉される呼気液体粒子である、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記生物試料が、対象の呼気中に存在し、そして、試料容器内に息を吹き込むこと、または、当該対象の口の前に保持された表面上に息を吹きかけること、によって捕捉される、請求項５８または５９に記載の方法。

【請求項61】

前記生物試料が、吸着剤、媒体、または前記試料容器表面に捕捉される呼気液体粒子である、請求項５８から６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

呼吸による前記生物試料の捕捉が、呼吸のための入口と出口を有するチャンバーを含む装置を使用し、
前記チャンバーが、前記呼気粒子がその上に集まる表面、吸着剤または媒体を有し、
前記装置が、液体で擦り、拭き取り、滴下または濯ぐことによって表面、吸着剤または媒体から前記液体粒子を回収し、それによって前記生物試料を提供する手段、を有する、
請求項５８から６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記水混和性有機溶媒が、前記試料中の標的核酸を増幅するための核酸増幅試薬を保存および／または添加するための保護緩衝液または他の薬剤をさらに含む、請求項５８から６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

方法が、
空港では搭乗前の個人またはグループに対して、
学校では教室に入る前の個人またはグループに対して、
会社では会社に入る前の個人またはグループに対して、または
スポーツイベントや教会などの集団イベントでは前記イベントに入る前の個人またはグループに対して、
実施される方法である、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記生物試料を受けるための試料容器と、前記生物試料を混ぜ合わせるための水混和性有機溶媒を含む、請求項１から６４のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
ここにおいて、前記水混和性有機溶媒は
（ｉ）前記生物試料内に存在するウイルスまたは細胞を溶かして、核酸を前記水混和性有機溶媒中の溶液中に放出させ、そして
（ｉｉ）前記生物試料中のＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ酵素を変性または失活させて、前記核酸の分解を低減し、それによって加工された生物試料を提供する、
前記キット。

【請求項66】

前記生物試料を混合するための保護緩衝液、前記試料容器の蓋、水混和性有機溶媒の存在下で前記標的核酸を増幅するための核酸増幅試薬、前記標的核酸を検出するための試薬、および／または、採取もしくは加工された生物試料を検査のために研究室に送るための郵送用包装、１つ以上をさらに含む請求項６５に記載のキット。

【請求項67】

対象の呼気から生物試料を採取するための装置であって、
前記装置が、呼気のための入口および出口、採取チャンバー、並びに、前記チャンバーと連絡している水混和性有機溶媒を含有するカートリッジを含み、
前記対象が前記入口で呼吸することにより、吐き出された呼気粒子がチャンバーに集められ、カートリッジに通過し、ここで、前記生物試料が前記水混和性溶媒に集められるステップであって、
ここにおいて、前記水混和性有機溶媒は
（ｉ）前記生物試料内に存在するウイルスまたは細胞を溶かして、核酸を前記水混和性有機溶媒中の溶液中に放出させ、そして
（ｉｉ）前記生物試料中のＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ酵素を変性または失活させて、前記核酸の分解を低減し、それによって加工された生物試料を提供する、
前記装置。

【請求項68】

前記チャンバーが、前記カートリッジに移される前に呼吸粒子を集める表面、吸着剤または媒体を有する、請求項６７に記載の装置。

【請求項69】

前記装置が、液体で擦り、拭き取り、滴下または濯ぐことにより前記表面、吸着剤または媒体から、前記液体粒子を回収する手段を含み、それによって前記生物試料を提供する、
前記装置が、前記呼吸粒子がその上に集まる表面、吸着剤または媒体を口の前に置くこと、および液体で擦り、拭き取り、滴下または濯ぐことによって表面、吸着剤または媒体から前記液体粒子を回収し、それによって前記生物試料を提供する手段、を含む、
請求項６７または６８に記載の装置。

【請求項70】

前記入口が、前記対象の呼気をチャンバー内に導くための唇の窪みと関連している、請求項６７から６９のいずれか一項に記載の装置。

【請求項71】

装置が、呼気を前記装置内に導くための一方向逆止弁と、呼気時に閉じる外部逆止弁とを備える、請求項６７から７０のいずれか一項に記載の装置。

【請求項72】

前記表面、吸着剤または媒体が前記呼気粒子の凝縮を促進するために冷却される、請求項６９から７１のいずれか一項に記載の装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分析のための核酸を生物試料から調製する方法、装置およびキットであって、方法、装置およびキットは、核酸の安定化を可能にして保存を可能にし、特に、核酸試料は、ウイルスＲＮＡおよびウイルスＤＮＡを含み、分析は、ウイルス核酸抗原についてである、方法、装置およびキットに関する。

【背景技術】

【0002】

ウイルスは生細胞でのみ複製する。ウイルスは、感染した細胞を破壊もしくは損傷するか、身体の免疫系を損傷するか、または臓器を損傷する可能性のある炎症を引き起こすことにより、疾患を引き起こす。ウイルスは、（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による）ＣＯＶＩＤ－１９、（ＡＩＤＳ、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶによる）後天性免疫不全症候群、単純疱疹（ｃｏｌｄ ｓｏｒｅｓ）、水痘、麻疹、インフルエンザ、インフルエンザ、いくつかの種類の癌またはその他などの、多数の種類の疾患を引き起こす。他の例は、単純ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）、水痘・帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｅｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バール・ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、コロナウイルス、ロタウイルス、肝炎、尖圭コンジローマ（ヒトパピローマウイルス、またはＨＰＶ）、インフルエンザそしてＢＫウイルスを含む。

【0003】

ウイルスは構造が様々である。ウイルス粒子は、カプシドと呼ばれる保護タンパク質コート外被内の核酸で構成される。カプシドの形状は、ウイルスの種類により様々であり得る。カプシドは、ウイルス遺伝子によりコードされるタンパク質で作製されている。一部のウイルスは、脂質が付随または埋め込まれていてもよい外側タンパク質エンベロープを有する。外側エンベロープ層は、タンパク質スパイクまたは突起を含んでいてもよい。ほとんどのウイルスは、遺伝物質としてＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを有する。核酸は、一本鎖であってもよくまたは二本鎖であってもよい。最も単純なウイルスは、４つのタンパク質をコードするのに十分なＲＮＡまたはＤＮＡのみを含む。ＣＯＶＩＤ－１９は、２９個の外側タンパク質を有する。

【0004】

現在または過去のウイルスの検出は、ウイルス感染の産物を探すことにより実施され得る。抗体は、ウイルスまたは細菌などの外来性抗原による侵入に応答して、身体の免疫系により産生される。こうした抗原に対して生じた抗体の陽性検査結果は、最近に感染した個人またはある程度前に感染した個人にこの疾患が存在することを示す。典型的には、この検査には血液試料が必要とされ、血液試料は、有資格担当者により採取されなければならない。ウイルスを含む試料は、ヒト細胞または他の生体物質も含んでいる可能性がある。古典的なウイルス診断法では、ＲＮａｓｅ、他の酵素およびヒト細胞成分が除去され、ウイルス核酸は、核酸抽出カラムまたは磁気ビーズを使用して捕捉される。カラム／磁気ビーズにウイルス核酸に対する強力な選択性を付与するために、カオトロピック試薬または他の試薬などの化学試薬が試料混合物に添加される。

【0005】

一部の場合では、このウイルス核酸精製プロセスは、シリカ膜またはカオトロピックシリカ精製媒体方法論に基づく。一部の場合では、核酸精製は、イオン交換に基づく。生物試料中のウイルスの存在および量を測定するために、ＲＮＡまたは他の核酸が検出および定量化され得る。次いで、精製されたＲＮＡまたはＤＮＡは、増幅プロセスを使用して増幅および検出される。

【0006】

活性ウイルス感染の検査は、１つ以上のウイルス抗原を測定することにより実施され得る。ウイルス抗原と検査抗体との相互作用は、多くの場合、酵素（ＥＬＩＳＡの場合）または蛍光分子（色素またはトレーサー）のいずれかでタグ付けされた二次抗体を使用して増幅および検出される。こうしたウイルス抗原に結合する特殊タグ付き抗体は、試料、典型的には血液試料と混合される。タグ付き抗体が標的抗原を認識して結合する場合、個人はウイルスに感染している。ウイルス抗原検出検査は、血液試料、または感染している可能性がある組織の生検に対して行われるが、この場合も熟練担当者が検査を実施して結果を評価する必要がある。ウイルス抗原検査は、咽頭綿棒、唾液などから実施され得る。こうした場合、抗原は、もはやウイルスＲＮＡに付随していない可能性がある。したがって、抗原検査は、安価で迅速であるが、活性ウイルス感染の決定には結果の信頼性が低い。

【0007】

正確な結果を得るには、ウイルス核酸の直接検査が必要とされる。特定のウイルスの遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の存在、量、および特定のヌクレオチド配列を決定するために、直接ウイルス核酸検出試験が使用され得る。使用される検出技術は、核酸増幅技術（ＮＡＡＴ）であってもよい。この検査は、感染を引き起こす特定のウイルスを示すことができる。また、この検査は、検査の時点でウイルスが存在するか否かを示すことができる。したがって、この検査は、疾患の症状を顕在化させた患者に即時治療を処方するために有用であるかまたは必要でさえである。

【0008】

ウイルス検査には、血液、尿、便（糞）、臓器組織、脳脊髄液、鼻の物質、痰および唾液を含む、様々な種類の試料が使用される。試料収集の１つの方法では、検査は、鼻または喉の奥から綿棒で試料を採取し、その綿棒を滅菌チューブに慎重に挿入することから始まる。試料は分析まで保存される。次いで、試料は、ウイルスを分解して開口させてその核酸ゲノム（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を放出させる化学溶液と混合される。核酸は、媒体または磁気ビーズで充填されたカラムにより抽出され、回収される。その後、回収された核酸は、適切な試薬と混合され、ｑＰＣＲ機器、ＬＡＭＰ機器または類似の核酸検出機器に挿入される。機器は、ウイルス核酸を特異的に増幅してウイルスゲノムの選択配列の検出を可能にし、環境、宿主細胞特異的組織、操作者夾雑物または他のウイルスおよび微生物に由来する可能性のある他の核酸からの夾雑物を無視する。

【0009】

血液からおよび脳脊髄液からなどの一部の試料収集は、熟練担当者により実施されなければならないが、尿、糞、痰からの試料収集は、理論的には自宅で実施され得る。しかしながら、こうした試料収集法によりもたらされるウイルスは不安定であり、信頼性の高い正確な結果を得るには、熟練担当者が依然として必要である。加えて、分析がポイントオブケアで実施されない限り、試料収集して試料を別の場所にある機器へと輸送するには、特別なツールおよび手順が必要である。ウイルスは、こうした試料では依然として活性および伝染性であるため、ヒトに対する生ウイルスの暴露を防止するように取り扱われなければならない。

【0010】

ＣＯＶＩＤ－１９検査の指針は、２０２０年３月１９日に発表された暫定指針「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ （ＣＯＶＩＤ－１９）ｉｎ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｃａｓｅｓ」においてＷＨＯにより提供された。この文書には、検体の種類、採取材料および研究室で検査するまでの保存温度、および予想される発送時間に応じた推奨発送温度が列挙されている。この指針は、ウイルス検出用の検体は、採取後できるだけ早く研究室に到着すべきであると述べている。輸送中の標本の正しい取扱いは必須である。研究室に迅速に配送され得る検体は、２～８℃の冷蔵条件下で保存および発送され得る。研究室への検体の到着が遅れる可能性が高い場合、ウイルス輸送媒体の使用が強く推奨される。ウイルス輸送媒体（ＶＴＭ）は、一連の安定化成分と共に、抗真菌剤および抗生物質補完剤のみを含む。標本は、－２０℃または理想的には－７０℃に凍結され、さらなる遅延が予想される場合はドライアイスで発送してもよい。検体の凍結および解凍の繰返しを回避することが重要である。ＷＨＯ文書は、国境内側での検体の輸送は、該当する国内規制に従うべきであることをさらに指定している。ＣＯＶＩＤ－１９ウイルスを含む可能性のある試料の国際輸送は、国連モデル規則（ＵＮ Ｍｏｄｅｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）、および使用される輸送方式に応じて任意の他の該当する規則に準拠するべきである。より多くの情報が、感染性物質輸送の規制に関するＷＨＯ指針２０１９－２０２０およびＷＨＯ暫定指針に見出され得る。すべての試料採取は、最新の国際世界保健機関プロトコール、ならびに英国のイングランド公衆衛生局および米国の疾病対策センターを含む国内プロトコールに準拠しなければならない。こうした指針は、ＷＨＯ文書「Ｐａｃｋａｇｉｎｇ ａｎｄ ｓｈｉｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」にも記載されている。

【0011】

直接ウイルス核酸検出は、選択的であり、高感度であり、活発な感染の存在または非存在を示すが、試料収集および輸送、それに続く試料の分析は、堅牢でもロバストでもなく、慎重に制御された条件下で行われなければならない。さらに、ＲＮＡは本質的に不安定であり、分析は試料収集後に迅速に行われなければならない。特に、例えば、試料中に存在するリボヌクレアーゼ酵素（ＲＮａｓｅ）は、ＲＮＡを迅速に破壊することになる。試料は、試薬および抽出カラムまたは磁気ビーズの添加により研究室で抽出され、ＲＮａｓｅを含む他の夾雑物から核酸を精製および回収する。

【0012】

試料は壊れやすく、配送時間は、２、３日、またはそれよりも長くかかる可能性があるため、現行の試料収集法の場合、政府郵便サービスでは試料は容易に配送され得ない。現行技術下では、ＲＮＡを含むウイルスの遠隔試料収集を実施することは困難であり得る。試料収集は、試料収集および分析が少し遅延しただけで、いかなる状況下でも信頼性が低くなる可能性がある。例えば、グループ試料収集（特定の規定されたグループ内の個人の試料収集）は、グループ内で採取された最初の試料と最後の試料との間で時間が経過するため、信頼性の低い結果をもたらす可能性がある。加えて、ウイルス試料は、危険である可能性があり、制御された手順下で慎重に取り扱われなければならない。

【0013】

したがって、この分野では、診断検査の前に核酸試料を調製および安定化するための迅速で使い易い方法、特に試料中の核酸の分解を改善しつつ、試料の安全な保存および輸送を可能にする方法、ならびに／または検出するための試料の調製を簡素化する方法を提供することは依然として課題のままである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

概して、本発明は、ウイルス、細菌、酵母、組織細胞または他の細胞から核酸の試料収集、放出および保護を可能にする方法、装置およびキットを提供する。特に、本発明は、核酸を放出させ、核酸を保護するために、単独でまたは組み合わせて使用され得る一群の溶媒を提供する。放出および保護された核酸は、さらなる試料調製または精製を行うことなく直接的に分析され得る。本発明の装置および方法は、任意の核酸、特にＲＮＡに好適である。

【0015】

放出および安定化された核酸は、試料が採取されるポイントオブケアにて識別および定量化され得る。または、核酸試料は、分析が実施される検査研究室に郵送、発送、または輸送され得る。本発明の一部の態様では、本発明の装置および方法は、ウイルスＲＮＡに使用され得る。本発明の方法および装置は、室温および周囲温度で安定であるＲＮＡを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0016】

一部の態様では、試料中のＲＮＡは安定したままであるため、政府郵便サービスを含む通常手段による発送が使用され得る。加えて、ＲＮＡ試料は安定したままであるため、分析は、研究室で試料を受け取った後、随意に実施され得る。

【0017】

検出は、最初に抽出カラムまたは磁気ビーズを使用して核酸を捕捉する必要なく、試料に対して直接実施され得る。核酸の検出および定量化は、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＥＸＰＡＲ、または類似の核酸増幅および検出方法を含む、様々な技術により実施され得る。その代わりに、核酸は、例えば、単一分子配列決定を使用して、増幅することなく識別され得る。また、ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである逆転写酵素（ＲＴ）の使用による増幅で検出および操作され得る。ＲＴは、元のＲＮＡ鋳型に相補的であり、ｃＤＮＡと呼ばれるＤＮＡの鎖を重合する。次いで、このｃＤＮＡは、上記に概説されているＰＣＲ、ｑＰＣＲまたは等温法でさらに増幅してもよく、またはワンステップＲＴ－ｑＰＣＲもしくはＲＴ－ＬＡＭＰを使用して単一反応で検出してもよい。一部の方法では、検出は直接的であってもよい。他の方法では、検出は、質量分析、配列決定などを使用して実施され得る。検出技術は、ＮＡＡＴ、核酸増幅技術であってもよい。

【0018】

本発明の溶媒は、いくつかの異なる特性を有し、いくつかの異なる操作を実施する。第１に、溶媒は、試料と混ぜ合わせることができる水混和性有機溶媒である。第２に、溶媒は、脂質または細胞壁を可溶化または破壊して核酸を放出させる。第３に、溶媒は、タンパク質、特にＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを変性または無効化して、酵素による核酸の分解を防止する。第４に、本発明の溶媒は、カプシドまたはタンパク質を破壊し、破壊は、核酸を溶液中に放出させる。多くの場合、核酸は、ウイルス、細菌および他の細胞のタンパク質に付随する。本発明の溶媒は、タンパク質の変性または無効化という機能３を依然として実施しつつ、核酸の放出を促進する。第５に、溶媒は、核酸の増幅を妨げない。タンパク質を無効化または変性させる溶媒の性質を考慮すると、これは驚くべきことである。ＲＮＡの増幅は、増幅の最初のステップとしてｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を産生する酵素である逆転写酵素の作用に依存する。次に、ｃＤＮＡは、ＤＮＡ増幅プロセスにより増幅され得る。ＤＮＡ増幅は、熱サイクルまたはループ増幅のためのポリメラーゼに依存する。核酸を増幅するにはいくつかの種類のタンパク質が必要とされるため、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを無効化または変性させる溶媒の存在下で増幅が達成され得ることは驚くべきことである。最後に、第６には、増幅および検出のためには少なくとも一部分の核酸が可溶性であることが必要とされるため、本発明の溶媒は、核酸を沈殿させない。核酸はイオン性および親水性であり、水分子は構造を安定化させるため、エタノールおよびイソプロピルアルコールなどの一部の有機溶媒は、構造から水を排除し、核酸を沈殿させる。そのため、より一般には、有機溶媒沈殿は、核酸の沈殿、濃縮および精製の一般的な方法である。対照的に、本発明の溶媒は、有機および水混和性であるが、核酸を沈殿させない。本発明の一部の態様では、溶媒はアセトニトリルである。アセトニトリルを生物試料と混ぜ合わせて、増幅、検出および定量化のための核酸を調製、放出、および安定化することができる。本発明の一部の態様では、アセトニトリルは、ウイルスの脂質およびカプシドを破壊して、ＲＮＡを放出させる。溶媒は、ＲＮａｓｅを無効化して、試料の分解を防止する。試料は、任意選択で希釈され、次いでＲＴ－ＰＣＲ、ｑＰＣＲまたは他の増幅および検出方法に必要なすべての試薬を含むマスターミックスに添加される。任意選択で、本発明の溶媒は、マスターミックス中に存在する。細胞溶解および試料安定化のプロセスは、増幅チューブ内で実施され得る。アセトニトリルまたは本発明の別の溶媒は、ＲＮＡを放出させ、ＲＮａｓｅを無効化するのに十分な濃度で添加され得る。

【0019】

様々な溶媒が、本発明による使用のために好適である。ウイルスＲＮＡの放出および安定化に好適な水混和性溶媒は、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトンおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ならびに他の非プロトン性水混和性溶媒を含む。酢酸エチルなどの部分的に水混和性であるに過ぎない非プロトン性溶媒も、本発明に有効である。好ましくは、本発明の方法、装置およびキットは、アセトニトリル、アセトンおよびＤＭＳＯを使用するが、それは、こうした溶媒が本発明の状況において良好に機能するためである。アセトンおよびＤＭＳＯは毒性が低く、容易に発送され得る。本発明の一部の態様では、プロトン性溶媒が使用される。本発明の一部の態様では、溶媒は、溶解を増強するための界面活性剤、ならびに／または核酸溶解度を増強するためのイオン対形成試薬および／もしくはｐＨ調整緩衝剤を含んでいてもよい。

【0020】

本発明の方法、装置およびキットでは、十分な溶媒または試薬が、試料収集の時点でまたは試料収集後に添加され、周囲温度で長期間の核酸安定化を提供する。増幅の時点において、核酸を含む溶媒混合物は、増幅前に希釈してもよい。しかしながら、希釈は、感度を低減させる可能性があり、最小限の希釈のみが実施される。

【0021】

本発明の溶媒は、単一の溶媒であってもよく、または添加剤と共に水混和性有機溶媒を含む溶媒の混合物であってもよい。
したがって、第１の側面では、本発明は、分析前に生物試料を準備する方法であって、この方法が、
試料容器中で生物試料と水混和性有機溶媒を混ぜ合わせることを含み、ここにおいて、水混和性有機溶媒は、（ｉ）生物試料内に存在するウイルスまたは細胞を溶かして、核酸を水混和性有機溶媒中の溶液中に放出させ、そして、（ｉｉ）生物試料中のＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ酵素を変性または失活させて、核酸の分解を低減し、それによって加工された生物試料を提供する、方法を提供する。

【0022】

さらなる側面では、本発明は、加工された生物試料中の標的核酸を検出する方法であって、この方法が、
（ａ）本明細書に記載の方法によって、加工された生物試料を提供し；
（ｂ）水混和性有機溶媒の存在下において、標的核酸を増幅するために加工された生物試料および核酸増幅試薬と混ぜ合わせ、増幅された試料を提供し；そして
（ｃ）増幅された試料を分析して、標的核酸の存在を検出する
ことを含む方法を提供する。

【0023】

さらなる側面では、本発明は、生物試料中の標的核酸を検出する方法であって、この方法が、
（ａ）試料容器中で生物試料と水混和性有機溶媒を混ぜ合わせ、ここにおいて、水混和性有機溶媒は、（ｉ）生物試料内に存在するウイルスまたは細胞を溶かして、核酸を水混和性有機溶媒中の溶液中に放出させ、そして、（ｉｉ）生物試料中のＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ酵素を変性または失活させて、核酸の分解を低減し、それによって加工された生物試料を提供し；
（ｂ）水混和性有機溶媒の存在下において、標的核酸を増幅するために加工された生物試料および核酸増幅試薬を混ぜ合わせ、増幅された試料を提供し；そして
（ｃ）増幅された試料を分析して、標的核酸の存在を検出する
ことを含む方法を提供する。

【0024】

本発明のこの側面では、ステップ（ａ）および（ｂ）は、例えば、生物試料を、水混和性有機溶媒および増幅試薬を含む組成物と混ぜ合わせることにより、時を同じくして（つまり、同時に）生じてもよい。その代わりに、この方法は、増幅試薬が、混ぜ合わされた生物試料および増幅試薬に順次添加されるが、溶媒が、溶解されたウイルスまたは細胞を有し、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ酵素を変性させるように作用する前である状況も包含する。

【0025】

さらなる側面では、本発明は、試料容器に息を吹き込むことにより、対象の呼気中に存在する生物試料を捕捉し、調製し、そして保存する方法であって、この方法が、
対象に試料容器内に息を吹き込ませることにより試料容器内に生物試料を提供し；そして
生物試料を水混和性有機溶媒と混ぜ合わせる
ことを含み、
ここにおいて、水混和性有機溶媒は、（ｉ）生物試料内に存在するウイルスまたは細胞を溶かして、核酸を水混和性有機溶媒中の溶液中に放出させ、そして、（ｉｉ）生物試料中のＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ酵素を変性または失活させて、核酸の分解を低減し、それによって加工された生物試料を提供する、
方法を提供する。

【0026】

さらなる側面では、本発明は、生物試料を受けるための試料容器と、生物試料を混ぜ合わせるための水混和性有機溶媒を含む、上記クレームのいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、ここにおいて、水混和性有機溶媒は、（ｉ）生物試料内に存在するウイルスまたは細胞を溶かして、核酸を水混和性有機溶媒中の溶液中に放出させ、そして（ｉｉ）生物試料中のＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ酵素を変性または失活させて、核酸の分解を低減し、それによって加工された生物試料を提供する、キットを提供する。

【0027】

任意選択で、キットは、生物試料と混合するための緩衝液、試料容器の蓋、水混和性有機溶媒の存在下で標的核酸（例えば、ウイルス抗原）を増幅するための核酸増幅試薬、標的核酸を検出するための試薬および／またはキットが使用されることが意図される状況に応じて、採取もしくは加工された生物試料を検査のために研究室に送るための郵送用包装、１つ以上をさらに含む。

【0028】

さらなる側面では、本発明は、対象の呼気から生物試料を採取するための装置であって、この装置が、呼気のための入口および出口、採取チャンバー、ならびにチャンバーと連絡している水混和性有機溶媒を含有するカートリッジを含み、対象が入口で呼吸することにより、吐き出された呼気粒子がチャンバーに集められ、カートリッジに通過し、ここで、生物試料が水混和性溶媒に集められるステップであって、ここにおいて、水混和性有機溶媒は、（ｉ）生物試料内に存在するウイルスまたは細胞を溶かして、核酸を水混和性有機溶媒中の溶液中に放出させ、そして（ｉｉ）生物試料中のＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ酵素を変性または失活させて、核酸の分解を低減し、それによって加工された生物試料を提供する、装置を提供する。

【0029】

以下は、任意選択のステップを含む本発明の方法ステップの説明である。
１． 生物学的供給源から試料を取得する。酵母、細菌、組織細胞、他の細胞、ウイルスなどを含む試料を準備する。試料の生物学的供給源は、すべての臓器、腎臓、肝臓、肺、鼻孔、唾液、口、頬、糞、尿、血液、体液および排泄物を含む。試料は、ウイルスまたは細菌の粒子を含む呼気であってもよい。

【0030】

２． 試料を極性水混和性溶媒試薬と接触させて、ウイルス核酸を放出させる。試料および溶媒を混合する。ウイルスは、このステップ後は感染性ではなく、取扱いが安全である。任意選択で、溶媒は、核酸放出および核酸安定化を促進するための添加剤を含む。任意選択で、溶媒は、過酸化水素または他の酸化もしくは還元試薬を含む。任意選択で、溶媒は、タンパク質消化酵素を含む。任意選択で、まず添加剤を試料に添加し、続いて溶媒を添加する。

【0031】

３． 任意選択で、例えば、細胞またはウイルス粒子の溶解を向上させて核酸の放出を増強するために、試料溶媒混合物を加熱する。
４． 任意選択で、安定化された核酸試料を、分析のために使用され得るチューブ、バイアル、シリンジ、プレートまたは他の容器などの発送用容器に入れる。この時点で、本発明は、任意選択の試料保存を可能にする。

【0032】

５． 任意選択で、液体から固形物を濾過、遠心分離、または分離する。任意選択で、試料を保存する。
６． 試料を分析のための機器へと移す。任意選択で、試料を希釈する。任意選択で希釈する。

【0033】

７． 増幅試薬を添加する － 増幅試薬の添加の一部として希釈を実施してもよい。任意選択で、核酸の増幅前に、溶媒および添加剤を含む試薬混合物を加熱する。任意選択で、このステップにおいて、増幅試薬と共に本発明の溶媒を添加してもよい。

【0034】

８． 任意選択で、陽性対照および陰性対照を添加する。
９． 目的の核酸が試料中に存在する場合、目的の核酸を増幅および検出する。
プロセスのすべてのステップは、その後のステップと適合性である試薬およびプロセスを用いて実施されなければならない。例えば、添加される試薬または実施されるプロセスは、逆転写酵素、ポリメラーゼまたは他の増幅もしくは検出試薬がそれらの機能を実施することを妨げないことが好ましい。

【0035】

一部の態様では、試料採取は自宅で実施され得、試料は分析機器へと輸送され得る。一部の態様では、試料収集は、学校、空港、会社、または人々のグループが集まるかまたは一緒に旅行する他の場所で実施され得る。

【0036】

滅菌輸送容器が本発明に従って使用され得るが、必要というわけではない。細菌増殖を防止し、そうでなければ核酸を分解から保護するために、十分な本発明の溶媒が使用され得る。

【0037】

例えば、約２℃～約８℃の標準的冷蔵温度での冷蔵が使用され得るが、安定化された核酸は、室温または周囲温度、典型的には約１５℃～約３０℃でも保存され得る。
翌日到着発送が使用され得るが、より遅い発送方法が使用され得る。即時増幅および分析が実施され得、または増幅は後で実施され得る。増幅は、試料収集し本発明の溶媒を添加した、最大で１日後、１週間後、１か月後、２か月後、３か月後、６か月後、９か月後、１２か月後、または無期限後に実施され得る。

【0038】

試料収集プロセス中および関連装置の使用中、試料は安定である。ウイルスは感染性ではなく、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅは不活化されている。
本方法、装置およびキットは、手動試料収集をハイスループット並列試料処理と連動させるために使用され得る。試料は、一度に１つずつ増幅してもよく、または他の試料と並列して増幅してもよい。

【0039】

「および／または」は、本明細書で使用される場合、他方を伴うか伴わないかに関わらず、２つの指定された特徴または構成要素の各々の具体的な開示とみなされるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々が、あたかも各々が個々に本明細書に記載されているかの如く、具体的に開示されているとみなされる。

【0040】

状況が別様に指示しない限り、上記に示されている特徴の説明および定義は、本発明の任意の特定の側面または態様に限定されず、記載されているすべての側面および態様に等しく適用される。

【0041】

本明細書で言及された参考文献はすべて、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
本発明はこれより、添付の例および図面を参照して、限定ではなく例示により説明されることになる。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】図１は、混合用ビーズと共に、溶解および安定化用の溶媒を含むシリンジを示す図である。

【図2】図２は、溶解および安定化された試料を含むシリンジを示す図である。

【図3】図３は、呼気試料を直接溶解および安定化するための装置を図示する図である。

【図4】図４Ａは、呼気採取装置を含むシリンジを示す図である。図４Ｂは、試料採取後の図４Ａに示されるシリンジの図示である。

【図5】図５Ａは、呼気採取用の低背圧シリンジの図示である。図５Ｂは、５Ａの低背圧シリンジ内に溶媒を吐出するシリンジを示す図である。図５Ｃは、低背圧シリンジ内に位置決めされたシリンジプランジャーを図示する。

【図6】図６は、ウイルス、細菌および化学物質を採取するためのフィルターを含むマスクを示す図である。

【図7】図７は、図６に示されているマスクから回収されるフィルターの処理を図示する図である。図７Ａは、フィルターをシリンジに配置することを示す。図７Ｂは、溶媒を添加することを示し、図７Ｃは、溶媒を針からシリンジ内へと吸引することを示す。

【図8】図８は、フィルターがマスクから回収され、シリンジおよびフィルターホルダーを用いて処理されることを示す図である。

【図9】図９は、呼気に由来するウイルス粒子のための半マスク表面採取装置の図示である。

【発明を実施するための形態】

【0043】

定義
試料：検出するための核酸を含む生物試料。
加工された生物試料：ウイルスまたは細胞を溶解し、核酸の少なくとも一部を溶媒中の溶液中に放出させるために、本発明の水混和性有機溶媒で処理され、任意選択で次いで（ａ）保護緩衝液または保存のための他の試薬を添加することにより、および／または（ｂ）試料中の標的核酸を増幅するための核酸増幅試薬を添加することによりさらに処理された生物試料。

【0044】

増幅された試料：標的核酸が元の生物試料に存在する場合、増幅反応を起こして標的核酸を増幅させた、加工された生物試料。
検出酵素：核酸を転写または増幅して核酸を検出するために使用されるタンパク質酵素。

【0045】

溶媒：細胞またはウイルスから核酸を放出させ、核酸を安定化させる任意選択の添加剤を有する水混和性有機溶媒。本明細書で使用される場合、本発明の「溶媒」の使用に対する言及は、溶媒の組み合わせの使用を含む。一部の場合では、水混和性有機溶媒は、過酸化水素によりすべてまたは部分的に置換されていてもよい。

【0046】

Ｒｉｂｏｓｔａｙ：本発明の溶媒を有する調合物。
採取媒体：呼気から生物学的物質を採取する粒子または物質。
採取表面：呼気から生物学的物質を採取するように設計された表面。表面は、生物学的物質を検出するために試料収集され得る。

【0047】

沈殿物は、本明細書では、沈殿または他の方法から生じるあらゆる固形物であると定義される。

【0048】

発明の詳細な説明
本発明の概要
核酸増幅技法（ＮＡＡＴ）の現行の認証されている方法では、ウイルス試料を採取し、分析が実施される前にウイルスを可能な限り保護する。次いで、分析を実施する準備ができたら、ウイルス含有試料を、界面活性剤、塩基、カオトロープおよび他の試薬で処理して、核酸を放出させる。次いで、試料をカラムまたは磁気ビーズプロセスにより精製して、分析のための核酸を抽出および回収する。放出、精製および回収したら、ｑＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＥＸＰＡＲとも呼ばれるリアルタイムＰＣＲまたは他の増幅および検出酵素ならびに検出技術を使用して、核酸を直ちに増幅または検出する。増幅された核酸を検出し、定量化することができる。

【0049】

本発明は、核酸検出のために細胞を調製する方法、装置およびキットを提供する。細胞を含む生物試料を取得し、溶媒試薬を添加して細胞構造から核酸を放出させる。また、溶媒試薬は、試料中に存在する可能性のあるＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅを無効化または失活させる。試料収集時にまたはその後に、試料を本発明の溶媒で処理することができる。放出および安定化された核酸は、供給源の地点にて識別および定量化することができる。また、試料は、ウイルスの検出および定量化に必要な分析を実施するために、機器に持ち込んでもよく、または中央研究室に発送してもよい。このプロセスは、任意の細胞生物学的物質に使用され得る。試料からのＲＮＡおよび／またはＤＮＡは安定したままである。発送は、ウイルスを無効化または「死滅」させた状態で安全に達成され得、周囲温度で実施され得る。溶媒プロセスは、こうした物質からＤＮＡを放出させ、ＤＮａｓｅを無効化または変性させることにより、ＤＮＡを安定化するためにも使用され得る。

【0050】

本発明により使用される溶媒およびプロセスは、本発明で実施される４つのプロセス：１）細胞またはウイルスを溶解して、核酸を放出させること、２）本発明の溶媒によりＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅを無効化することにより核酸を保護すること、３）ＲＮＡの場合、本発明の溶媒の存在下で核酸逆転写（ＲＮＡの場合）すること、ならびに４）本発明の溶媒の存在下で増幅および検出を行うことを実施することができるようにそれらの間でバランスがとれている。したがって、本発明に使用される各々特定の溶媒は、次の課題を妨げることなく、各課題に対して最適化される。また、溶媒の使用に関する影響は、好適なｐＨおよび単純な塩を含む共溶媒分子を選択することにより、こうした基準を満たすように向上させることができる。

【0051】

基本手順は、溶媒を試料と混ぜ合わせること、混合すること、および分析または保存のいずれかを行うことを含む。保存は、短期間、つまりわずか数分間であってもよく、またはより長期間、１時間もしくは数時間もしくは数日間もしくは数週間でさえあってもよい。適正に保存すれば、保存試料内で溶媒が蒸発することはない。溶媒の上部空間は、蒸発を制御および最小限に抑えるために最小限に保たれ得る。本発明の一部の態様では、試料は、保存から直接分析される。一部の態様では、溶媒は、熱、ガスまたは高速蒸発（真空による）またはそれらの組み合わせを使用した蒸発により分析前に除去される。本発明の一部の態様では、分析前に溶媒を希釈するために水または緩衝液が試料に添加される。溶媒は、分析まで試料を保護する。しかしながら、核酸を増幅するには、溶媒を希釈してポリメラーゼまたは他の増幅試薬を再活性化する必要があり得る。溶媒または緩衝液の添加は、各試料がすべての試料に対して同じ方法で処理されるように、試料調製固定具（ｆｉｘｔｕｒｅ）または器具で行われることが好ましい。本発明の一部の態様では、安定化された試料は、保存前に濾過または遠心分離される。本発明の一部の態様では、試料は、分析前に濾過または遠心分離される。本発明の一部の態様では、試料は、検出混合物中の溶媒に添加される。

【0052】

自己管理されるかまたは訓練を受けていない担当者により実施される試料収集の場合、試料収集装置は、誰でも簡単に使用することができ、社会的に受け入れられるものである必要がある。本発明の一部の態様では、試料収集は、受動的プロセス、つまり受動流涎、排尿などである。本発明の他の態様では、試料収集は、能動的プロセス、つまり、拭き取ること、擦ることなどである。ウイルスは、すべての臓器、腎臓、肝臓、肺、鼻孔、口、頬、糞、尿、血液、呼気、唾液、体液および呼気を含む、身体の任意の部分から試料収集され得る。

【0053】

一部の態様では、試料は、呼吸により得られる。こうした態様では、呼気は、例えば、表面上にまたは装置内へと息を吹き込むこと、または呼気を表面上に堆積させるストローまたは装置内へと息を吐くことなど、任意の方法で採取され得る。その代わりに、呼気は、溶媒を通してバブリングしてもよい。呼吸試料は、単一の呼気から採取してもよく、または例えば装着可能な装置内への長期間の呼吸から採取されもよい。

【0054】

口または鼻から試料を採取するために、吸着剤パッドまたは吸着材が使用され得る。試料収集後、生物試料は、容器に堆積され得るかまたは絞り出され得る。容器は、本発明の溶媒を含んでいてもよい。その代わりに、容器は、本発明の溶媒を含む装置またはシリンジ内に取り込まれてもよい。その代わりに、試料は、ピペットまたはシリンジで取り出され、本発明の溶媒を含んでいてもよいバイアルに移してもよい。試料は、本発明の溶媒中に息を吹き込むかまたは呼気をバブリングすることにより採取してもよい。本発明の一部の態様では、呼気および液滴が一方向でのみ溶媒に添加されることを保証するために、（一方向）逆止弁が、マウスピースまたは吹込みストローに組み込まれていてもよい。この態様では、溶媒は、ストローから口へと逆流することはない。本発明の一部の態様では、呼気液滴が表面上に堆積され、呼気が採取され、溶媒で処理される。

【0055】

手動試料収集と自動試料調製との連携は、本プロセスの任意の時点で実施され得る。試料が取得された後、試料は、本発明の溶媒で試料を抽出および安定化するために、機器に配置してもよい。その代わりに、試料が安定化され得、次いで試料調製ステップが自動化され得る。

【0056】

本方法は、細菌、酵母、真菌などの試料のＲＮＡまたはＤＮＡを安定化して、核酸増幅および検出のための試料を調製するために使用され得る。例えば、細菌の場合、試料は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を放出させ、ＤＮａｓｅ（またはＲＮａｓｅ）を失活させることにより保護され得る。夾雑細菌は、溶媒により死滅され得る。他の物質は、溶媒により無効化され得る。他の生物試料は、本発明の溶媒中で安定化され得る。その代わりにまたはそれに加えて、本方法は、カラムまたは磁気ビーズを使用して事前に精製することなく、核酸の直接増幅を可能にする。しかしながら、本発明の溶媒は、カラムまたは磁気ビーズによる核酸の精製および回収の前に、ＲＮＡおよびＤＮＡを溶解、保護および安定化するためにも使用され得る。本発明に従って処理され得る核酸は、ＲＮＡ（例えば、複製または転写などの生物学的活性に対応する修飾に対応するため）またはＤＮＡ（例えば、メチル化、ヒドロキシメチル化、グルコシル化などを含む）の修飾形態を含む。

【0057】

ウイルス診断プロセス
ウイルスの診断上の課題の一部は、試料が、種々の他の細胞、酵素、および生物学的実体の存在下でウイルスを含む可能性があることである。外側層は、脂質およびタンパク質の壁、ならびに核酸を覆うタンパク質エンベロープで構成されている場合がある。酵母、他の真菌、細菌および類似実体を含む他の目的の試料も外側層を有する。

【0058】

本発明の方法で使用されるステップ
ステップ１． 試料を準備する。一部の態様では、試料はバイアル中に準備される。本発明の一部の態様では、その容積は、測定されており既知である。試料は、唾液であってもよくまたは鼻腔綿棒であってもよい。試料は、他の体液であってもよい。一部の態様では、試料は、器具に息を吹き込むことにより提供される。一部の態様では、試料は、表面、採取媒体またはフィルター上に息を吹き込むことにより提供される。

【0059】

ステップ２ 機能Ａ． 試料を水混和性有機溶媒と一緒にして混合する。本方法の技術では、有機溶媒は、細胞から核酸を放出させる。タンパク質含有エンベロープ（存在する場合）を、ＲＮＡまたはＤＮＡから除去する。

【0060】

試料を溶媒に添加してもよく、または溶媒を試料に添加して混合してもよい。一部の態様では、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ホルムアミドジメチルホルムアミド、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、メチルエチルケトン、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）または他の非プロトン性溶媒などの非プロトン性溶媒を使用して、ウイルス核酸を放出させる。本発明の一部の態様では、メタノール、エタノール、１－プロパノール、１－ブタノール、ブチルアルコールまたはイソプロピルアルコール、酢酸、ギ酸または他のプロトン性溶媒などのプロトン性溶媒を添加して、核酸の放出を支援することができる。添加される有機溶媒は、１つ以上の溶媒の混合物であってもよい。有機溶剤または溶媒は、水を含んでいてもよい。

【0061】

有機溶媒は、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ １５－Ｓ－９、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００または他の界面活性剤などの界面活性剤を含んでもよい。有機溶媒は、酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）などのイオン対試薬または他のイオン対形成試薬を含んでもよい。以下の溶媒は、本発明の方法で使用され得る：アセトアルデヒド、酢酸、アセトン、アセトニトリル、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、２－ブトキシエタノール、酪酸、ジエタノールアミン、ジエチレントリアミン、ジメチルホルムアミド、ジメトキシエタン、ジメチルスルホキシド、１，４－ジオキサン、エタノール、エチルアミン、エチレングリコール、ギ酸、フルフリルアルコール、グリセロール、メタノール、メチルジエタノールアミン、メチルイソシアニド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、１－プロパノール、１，３－プロパンジオール、１，５－ペンタンジオール、２－プロパノール、プロパン酸、プロピレングリコール、ピリジン、テトラヒドロフランおよびトリエチレングリコール。

【0062】

本発明の一部の態様では、溶媒を添加する前に、試料を、過酸化水素または他の過酸化物試薬で処理してもよい。また、過酸化物試薬は、溶媒と同時に添加してもよく、または溶媒の添加後に添加してもよい。過酸化物は、ウイルスまたは他の生物学的物質の溶解を支援することができる。試料中の過酸化物は、ＭｎＯ、Ｆｅ_２Ｏ_３、ＣｕＯ、ＨｆＯ_２、ＣｅＯ_２およびＧｄ_２Ｏ_３などの遷移金属塩、ならびにＺｒ、Ｔｉ、Ｙ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｃｅ、Ｇｄ、ＨｆおよびＵの酸化物と接触する任意のステップにおいて試料の加熱を促進することができる。

【0063】

唾液などの一部の試料では、このプロセスは、タンパク質および他の生物学的物質の少なくとも一部を沈殿させることになる。タンパク質は、変性する可能性があり、沈殿する可能性がある。本発明の一部の態様では、混合後の有機溶媒の濃度は、０．５％～５０％、１％～９５％、５％～７０％、または１０％～６０％の範囲である。溶媒濃度の制御は、溶媒および試料の相対容積を制御することにより達成することができる。溶媒を、バイアルまたは容器内に配置し、密閉することができる。次いで呼気または液体試料を、容器に添加することができる。この方法を使用する場合、溶媒濃度は、既知であるだろう。

【0064】

ステップ２ 機能Ｂ． このステップでは、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅが不活化または無効化される。これは、検出、分析、および定量化のための放出されたＲＮＡまたはＤＮＡの保護を補助する。

【0065】

ステップ２ 機能Ｃ． タンパク質および生物学的物質を、混ぜ合わされた試料および水混和性有機溶媒混合物中で沈殿させる。形成された固形物は、混ぜ合わされた混合物中の有機溶媒の濃度を増加させることにより増加させることができる。固形物を、混合することにより試料中に分散させてもよい。

【0066】

ステップ３． 任意選択で、試料中に存在する粒状物（つまり、沈殿した）画分を除去する。本発明の一部の態様では、粒状物は遠心分離により除去される。本発明の一部の態様では、粒状物は濾過により除去される。フィルターは、例えばシリンジに固定されていてもよく、清澄化された物質は、バイアルの中へと堆積させてもよい。本発明の一部の態様では、固定針を有するシリンジで、清澄化された試料をバイアルから吸い上げることができる。針は、液体を優先的に吸い上げて、固形物の多く、ほとんど、またはすべてをバイアル内に残すことができる。次いで、固形物画分を有しないシリンジ内容物を堆積させることができる。一部の態様では、プレートフィルターまたは遠心分離フィルターを使用して固形物を除去することができる。

【0067】

ステップ４． 任意選択で、水を添加して有機溶媒の濃度を低下させる。ポリメラーゼ酵素は、変性または沈殿のため有機溶媒により失活する可能性がある。溶媒によるポリメラーゼの失活を防止するために、増幅前に希釈を実施してもよい。しかしながら、本発明の方法では、一部の有機溶媒が残ることになる。

【0068】

ステップ５． 任意選択で水混和性溶媒を含む試料を加熱する。加熱は、溶媒および添加剤の反応速度の増加を補助することができる。

【0069】

ステップ６． 検出試薬を含む増幅試薬を、処理された試料に添加して混合する。増幅および定量化は、一例では、ｑＲＴ－ＰＣＲにより実施することができるが、任意のＲＮＡまたは核酸増幅および定量化法を使用することができる。ｑＰＣＲを使用してＤＮＡを増幅してもよい。他の核酸増幅機器を使用してもよい。本発明の一部の態様では、本発明の溶媒は、増幅試薬に含まれていてもよい。

【0070】

放出および安定化された試料である核酸を、増幅試薬に添加してもよく、または増幅試薬を、放出および安定化された試料である核酸に添加してもよい。いずれの場合も、試薬の濃度は既知であり、制御される。本発明の一部の態様では、増幅試薬を添加する前に、試料中の有機溶媒濃度は、＞１、１～２、２～３、３～４、４～５、５～１０、２０、３０、４０または５０分の１に低減される。有機溶媒の濃度の低減は、活性ポリメラーゼを保護することができるか、または増幅のためにポリメラーゼを再活性化することができる。

【0071】

一部の態様では、ステップ１～５の順序は様々であってもよい。本発明の一部の態様では、試料を、ステップ１、２、３、４、または５の後で無期限に保存し、次いで核酸の精製を行うことなく直接分析してもよい。本発明の一部の態様では、安定化された試料を、ステップ１、２、３、または４の後で、シリカもしくはイオン交換カラムまたは磁気ビーズプロセスにより精製して、核酸を回収してもよく、次いで試料を増幅または検出および分析してもよい。本発明の一部の態様では、試料を、シリカもしくはイオン交換カラムまたは磁気ビーズプロセスにより精製して、核酸を回収してもよい。その後、本発明の水混和性有機溶媒を、精製された核酸に添加して、核酸を無期限に安定化および保護することができる。核酸を安定化および保護した後で、試料を増幅または検出および分析してもよい。

【0072】

試料を任意選択で希釈し、ＲＴ－ＰＣＲまたは別の増幅および検出法のためのマスターミックスに添加する。その代わりにまたはそれに加えて、試薬を試料に添加して、試料を増幅に好適なものにすることができる。マスターミックスは、増幅および定量化に必要なすべての試薬を含んでいてもよく、さらなる側面では、本発明は、そのようなマスターミックス組成物を提供する。任意選択で、本発明の溶媒は、マスターミックス中に存在する。本発明の溶媒の濃度は、細胞の溶解に十分である必要がある。しかしながら、本発明の溶媒の濃度は、逆転写酵素、ポリメラーゼまたは混合物中に存在する可能性がある任意の他の必須酵素を阻害するほど高すぎないことが好ましい。また、溶媒は、試料中の標的核酸配列とプライマーなどの増幅試薬との間で必要とされるアニーリング操作を阻害してはならない。溶媒の溶解効果は、温度により増強させることができる。しかしながら、溶媒の有害効果も温度により増強される可能性がある。例として、増幅反応が実施される時点での本発明の溶媒の濃度は、例えば、細胞溶解またはウイルス溶解は可能であるが、増幅反応で使用される試薬が活性である下限として、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．５％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１５％、２０％または２５％（ｖ／ｖ）であってもよい。検出酵素およびプライマーアニーリングが妨げられない限り、濃度はより高くてもよい。

【0073】

試料の手動試料収集および並列処理
本発明の一部の態様では、試料は、バーコードまたは他のバイアル走査識別で識別され得る。識別は、試料の供給源および試料に関連する任意の他のパラメーターを記述することになる。機器には、バーコードまたは別の種類の読取機が取り付けられていてもよい。走査プロセスでは、試料が機器内に挿入されているスロットを光が照らすことになる。分析には、任意の多重並列処理機器が使用され得る。ハイスループット分析では、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６スロット付き機器が使用され得る。試料は並列処理され、陽性結果を報告するあらゆる試料は、供給源およびそのパラメーターを識別する情報と照合される。

【0074】

あらゆる陽性試料は、標的細胞に由来するウイルスまたは核酸の存在を確認するために、再検査され得る。このようにして、陰性の人だけが、飛行機への搭乗が許可され、入国が許可され、教室、運動場または会社オフィスもしくは製造工場などの任意の会場もしくは場所への入場が許可され得る。試料は直ちに安定化されるため、結果の完全性および忠実度は、他の方法によるものよりも高い。溶媒は完全に安定であり、無期限に保存され得るため、試料収集プロセスの完全性は、他の方法を使用して得られるものよりも高い。

【0075】

定量化
高品質データを得るには、試料に存在するＲＮＡが、試料収集プロセス中に、または分析および定量化までの任意の時点において分解されないことが必要である。分解は、必ずしも試料収集時間および分析時間に基づくわけではないが、ＲＮａｓｅもしくはＤＮａｓｅの含有量、ｐＨ、他の酵素または他の手段によるなど、試料ごとに異なる夾雑物により引き起こされる可能性がある。生物学的実体に由来する核酸の即時安定化ならびにＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅの無効化は、偽陰性結果に結び付く可能性のある分解または試料に関連する他の可変性を防止する。

【0076】

分析の検出限界は、試料内で検出され得る核酸分子の最小数である。特定数のウイルスが特定数の核酸分子と関連するため、これは、ウイルスの陽性存在が示される閾値を提供する。試料収集時に核酸の分解が防止される場合、閾値は非常により低く、信頼性が高い。また、信頼性の高い試料収集は、疾患または感染の進行に関する指標を提供する。定期的に試料収集を行い、時系列的にプロットすることは、ウイルスの量が増加しているのかまたは減少しているのかを示すことになる。加えて、試料分解が防止されるため、試料におけるウイルスの非存在は、信頼性の高い陰性結果を示すことになる。特に反復試料収集および分析により、対象が伝染性のままであるか否かを決定することが可能である。

【0077】

生物学的供給源からのウイルス試料の取得
核酸が安定化されるため、試料収集は、任意の場所で実施され得る。これは、医療担当者、研究室担当者によるポイントオブケアでの試料収集を含むか、またはその代わりに試料収集は自宅で実施してもよい。キットおよび器具または固定具を使用して誤謬なくプロセスに従うことができる限り、制限はない。したがって、本発明の方法、装置およびキットは、試料収集が熟練担当者によってのみ実施される、ウイルス検出のための既存方法を大幅に向上させるものである。

【0078】

例えば、通常手順を使用して咽および／または鼻から試料を採取するために、綿棒が使用され得る。または、ウイルスは、口腔綿棒、唾液または痰から得られ得る。一部の態様では、血液試料は、指を穿刺または突刺し、血液を毛細血管に採取し、血液を容器内に堆積させることにより取得され得る。

【0079】

尿、糞、痰および血液からの試料収集は、自宅で、または研究室／医療担当者により管理された設定で実施され得る。脳脊髄液からの試料収集は、熟練担当者により実施され、本発明の方法、装置およびキットを使用して処理され得る。

【0080】

一例では、ヒト呼気からエアロゾルを採取するために、ストロー型の器具が使用され得る。呼気だけが捕捉され得、液体が口内に逆流し得ないように、ストローには逆止弁が装備されていてもよい。呼気は、器具内において、本発明の溶媒を通してバブリングさせてもよい。

【0081】

一部の態様では、試料は、試料収集バイアルもしくはチューブまたは分析バイアルもしくはチューブに配置される。こうした態様では、試料収集または分析バイアルまたはチューブは、９ｍｍ以下、４．５ｍｍ以下、２．２５ｍｍ以下の外径を有してもよい。

【0082】

逆転写酵素およびポリメラーゼ酵素に対する本発明の溶媒の効果
本発明の溶媒は、タンパク質、脂質、および他の細胞性物質にとって有害であるが、核酸には有害ではない。有害特性の肯定的な効果は、溶媒が、酵素ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅを無効化または変性させ、したがって試料中の核酸の保護を補助することである。しかしながら、この特性は、核酸の増幅および検出に必須な２つの酵素にとっても有害である。逆転写酵素は、ＲＮＡをｃＤＮＡへと変換するために必要である。ほとんどの逆転写酵素の場合、許容されるアセトニトリルの最大濃度は０．５％（ｖ／ｖ）であることが発見された。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩは、１０％アセトニトリルに耐性であり、ＲＮＡからｃＤＮＡへの変換の劣化はほんのわずかであることが見出され、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩは、１５～２０％のアセトニトリルに耐性であることが見出された。より高い濃度は、逆転写酵素がＲＮＡをｃＤＮＡへと変換することを妨げた。本発明の他の有機溶媒は、同様の有害な挙動を示した。

【0083】

ポリメラーゼは、リアルタイムｑＰＣＲ、エンドポイント検出ｑＰＣＲ（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｑＰＣＲ）および他の方法でＤＮＡを増幅するために必要である。ＴａｑまたはＰｆｕポリメラーゼは、最大で１０～１５％アセトニトリルに耐性であることが見出された。ＬＡＭＰ用のＢｓｔポリメラーゼは、最大で１５～２０％アセトニトリルに耐性であることが見出された。本発明の他の有機溶媒は、同様の有害な挙動を示した。

【0084】

唾液、痰、喀痰、つば試料を処理するための方法、装置およびキット
唾液検査またはサリバオミクス（Ｓａｌｉｖａｏｍｉｃｓ）は、内分泌、免疫、炎症、感染、および他の状態のマーカーを識別するための唾液の研究室分析を含む診断技法である。唾液検査は、数多くの状態および疾患状況をスクリーニングまたは診断するために使用される。この種類の検査は、典型的には、滅菌チューブに少量の唾液を採取し、続いて検査機器で処理することを含む。唾液検査の支持者は、採取の容易さ、安全性、非侵襲性、手頃な価格、正確性、および静脈穿刺を回避する能力を、血液検査および他の種類の診断検査と比較した場合の主要な利点として挙げている。

【0085】

一部の検査方法は、吸着剤パッドを使用して唾液を採取すること、化学溶液を適用すること、および色の変化をモニターして陽性結果または陰性結果を示すことを含む。ＲＮＡの測定によるウイルス検出は、典型的には、液体を処理すること、および液体を測定装置および変換器に供することを必要とする。１つの方法は、吐唾または流涎により唾液を採取することである。

【0086】

別の方法は、受動流涎を採取することである。受動流涎（「混合」唾液とも呼ばれる）が使用され得る。受動流涎採取は、大容積試料採取を容易にする。複数の試料が容易に取得され得るため、唾液検査は、数時間、数日間、または数週間に及ぶ時間生物学的評価の実施に特に有用である。これは、ウイルス感染の進行を検査する場合、または個人が検出可能なウイルスをもはや有していないか否かを検査する場合に非常に重要である。

【0087】

受動流涎採取は、最大で１ｍＬまたは２ｍＬの全唾液を採取するために監督なしで使用され得る。特に安定化後に試料を保管することが所望の場合は、より大きな試料の取得が実施され得る。

【0088】

本発明の別の例では、カラム法または磁気ビーズ法からの唾液がバイアル内に堆積される。この方法の一態様では、容積は１ｍＬに調整される。０．５ｍＬの水混和性溶媒を含む２．５ｍＬシリンジを使用して、試料をシリンジ内に吸入する。シリンジは１．５ｍＬの液体を含むことになる。液体をバイアル内に入れ、吸入してシリンジ内に戻すことを繰り返して試料を混合する。ウイルスは溶解および安定化され、ＲＮＡ検出および定量化の準備が整う。

【0089】

本発明の別の態様では、１ｍＬ以上の涎／唾液が採取される。０．２ｍＬの非プロトン性溶媒を含むシリンジが準備される。シリンジの液体中にはガラスビーズが提供されている。ビーズは形状が不規則であってもよい。ビーズ材料は、プラスチック、ポリマー、金属、金属酸化物、またはガラス、またはシリンジ空洞を移動し溶媒を混合することになる任意のものであってもよい。０．２ｍＬのＤＭＳＯを含むシリンジを涎内に配置し、０．５ｍＬをシリンジ内に吸入する。シリンジは、規定量の涎／唾液がシリンジ内に吸入されるとプランジャーの動きが止まるように設計される。シリンジを数回反転させて、ビーズによる溶媒および試料の混合を可能にする。安定化された試料は、この時点で分析の準備が整うが、試料は安定しており、室温または周囲温度で無期限に維持され得る。

【0090】

個人またはグループの試料収集
試料収集は、個人または個人のグループに対して実施され得る。これは、１個人が活性ウイルスに感染していないことを保証する。グループ試料収集は、グループ内の各個人を試料収集することによりまたはプールされた試料を使用することにより達成され得る。グループ試料収集および分析は、飛行機、学校教室、集団イベントまたは会社敷地を含む任意の場所への立ち入りを許可する前に実施され得る。

【0091】

バーコード化シリンジなどのバーコード化または電子コード化試料収集装置は、個人または複数の個人の身元情報と照合されることになる。身元情報は、試料がロードされる際にまたは試料が処理される際に検出機器に入力されることになる。結果の報告は、試料および個人の身元と照合されることになる。こうした場合、試料収集および分析は、２時間以内、好ましくは１時間、３０分、１５分または５分以内に実施される。

【0092】

一部の場合では、個人は、感染の可能性はあるが、検出可能なウイルスをまだ産生していない可能性がある。検出可能なウイルスが産生されるまでには、ほんの数時間しかかからない場合がある。一部の態様では、個人は、着陸前の飛行中に再検査され得る。この場合、試料は、痰、喀痰または涎、鼻綿棒または口腔綿棒を含む任意の試料種類を使用して飛行中に取得され得る。バーコード化または識別符号化された試料収集装置は、個人と照合され得る。試料は、本発明の非プロトン性溶媒で安定化される。本発明の一部の態様では、プロトン性溶媒が使用される。結果は飛行中に決定され得、空港立ち入りまたは入国は、検査の結果により通知され得る。本発明の安定化装置、キットおよび方法は、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１日間、１週間、１か月間、６か月間、または無期限に安定である試料を提供する。ＲＮＡは、本発明の方法を用いて無期限に安定化され得るため、試料は、保管してもよく、後の日付で分析または再分析してもよい。試料が安定しているため、分析された試料および保管された試料を追跡および追尾するための方法が実現され得る。

【0093】

試料とウイルス核酸を放出させる試薬との接触
綿棒を、溶解および安定化用の溶液に入れ、激しく撹拌する。ジカウイルスおよびＣＯＶＩＤ－１９は、エンベロープウイルスである。ウイルス内から核酸を放出させるためには、ウイルスの外側エンベロープは破壊されなければならない。好ましい放出溶液は、本発明の溶媒である。しかしながら、溶解用溶液は、ウイルスからＲＮＡを放出させることが可能な塩基または界面活性剤または任意の緩衝液または溶媒であってもよい。本発明の溶媒は、試料へと直ちに添加され得る。患者は、綿棒試料が採取される前に、複数回以上咳をするように指示される場合がある。試料は、鼻孔、頬、口蓋および／または舌下を拭き取ることを含む様々な方法で取得され得る。

【0094】

ウイルス溶解試薬または溶液は、外部タンパク質を除去し、ウイルスの核酸を露出させる。ウイルス粒子が溶解されると、ＲＮＡが放出され、直ちにＲＮａｓｅ媒介姓分解を受け易くなる。これを防止するため、存在するＲＮａｓｅおよび存在するすべてのタンパク質は、非常に強力な変性溶媒で直ちに変性または失活され、それによって放出されたＲＮＡを安定化させる。不活化される酵素は、ＲＮａｓｅおよびリボザイムを含む。

【0095】

安定化溶液は、試料、バイアルまたは試薬に存在する可能性のあるＲＮａｓｅを失活または変性させる。本発明の一部の態様では、失活化剤は、溶解剤と同時に添加される。溶解剤および失活剤は、同じ試薬であってもよくまたは試薬の混合物であってもよい。本発明の一部の態様では、界面活性剤などの溶解のための試薬およびＲＮａｓｅを変性または失活させるための試薬は、水混和性有機溶媒である。本発明の一部の態様では、溶解溶液および安定化溶液は、水混和性有機溶媒を含む。本発明の一部の態様では、水混和性溶媒は、ウイルスＲＮＡ試料の溶解および安定化を両方とも行うことができる。

【0096】

溶媒は、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＤＭＦ、アセトンまたは他の非プロトン性溶媒を含む。要件は、溶媒が水混和性であり、ＲＮａｓｅタンパク質を失活または変性させるために十分な変性傾向または能力および濃度でなければならないことである。一部の態様では、濃度を５％有機溶媒（容積／容積）にするのに十分な溶媒が添加される。一部の態様では、最終濃度は、１～３％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％（ｖ／ｖ）またはそれよりも高濃度の有機溶媒である。本発明の一部の態様では、溶媒は、酢酸トリエチルアンモニウムなどのイオン対形成試薬または類似の試薬を含む。試薬は、ＲＮＡと対形成し、ＲＮＡの溶解度を向上させる非極性陽イオンを含んでいてもよい。溶媒は、脂質破壊性およびタンパク質破壊性であるが、核酸を可溶性およびインタクトに保つ。

【0097】

溶媒は、核酸増幅を阻害し、エラーが発生しやすいＰＣＲを助長する場合さえある。しかしながら、本発明の方法では、ＲＮａｓｅを無効化し、任意選択でウイルスからタンパク質皮殻を除去してＲＮＡまたはＤＮＡを露出させるのに十分な溶媒が使用される。一部の態様では、試料は、増幅前に、滅菌済ＲＮａｓｅ非含有水または緩衝液で希釈され得る。

【0098】

図１は、本発明の一態様における、溶解／安定化溶媒およびミキサーを含むシリンジを示す。プランジャー１０は、シリンジ筒２０に挿入されている。シリンジは、溶媒３０および試料ミキサー４０を含む。シリンジの端部は、ルアーテーパー部５０を有し、そこにルアー蓋６０を挿入してシリンジを密閉し、溶媒３０の蒸発を防止することができる。ミキサー４０は、円形であってもよくまたは任意の形状であってもよく、プラスチック、金属、金属酸化物またはガラスを含む任意の材料で作製されていてもよい。ミキサー４０は、ワイヤーまたはビーズもしくは複数のビーズで作製されていてもよい。ミキサー４０は、プランジャー１０が下方に押された際に溶媒３０がシリンジから出ていくことを阻止するような形状であってもよい。その代わりに、ミキサー４０は、気泡であってもよい。混合は、混合物の吸引および吐出により実施され得る。混合には、ボルテックスまたは振盪機も使用され得る。一部の態様では、混合は、綿棒もしくは唾液試料または他の生物試料と密接に接触して配置され得、その後密閉され得るチャンバーで行われる。

【0099】

図２では、考え得る目的のウイルスまたは他の物質を含む試料７５を、針７０からシリンジ内に吸入し、試料および溶媒を有するシリンジは、分析または保存され得る溶解および安定化された試料８０を生成するために、数回反転される。ミキサー４０は、シリンジ空洞を移動して、試料および溶媒を混合する。試料７５は注射器内に吸入され、シリンジ内部で混合されてもよく、または溶媒および試料を繰り返し吸引および吐出することにより混合されてもよい。他の態様では、本発明で使用される溶媒を試料へと吐出するために、シリンジが使用され得る。

【0100】

一部の態様では、混合は、本発明の試料および溶媒を含むシリンジの吸引および吐出の１回以上のサイクルで実施される。一部の態様では、本発明の試料および溶媒の混合物は、沈殿物および液体を形成する。

【0101】

ミキサーは、試料が水性ベースであり、溶媒が水混和性である限り、非プロトン性溶媒を含む任意の溶媒と共に使用され得る。本発明の一部の態様では、プロトン性溶媒が使用される。

【0102】

一部の場合では、本発明により使用されるシリンジの直径は、９ｍｍ以下である。これは、シリンジの上部にある唇部を含む。その代わりにまたはそれに加えて、一部の場合では、シリンジは、液体取扱器に取り付けられてもよい。本発明の一部の態様では、試料は、液体取扱機器のバイアル、チューブまたは反応器に配置される。本発明の一部の態様では、液体取扱器は、９６ウェル形式の最大９６個の試料に対応することができる。本発明の一部の態様では、シリンジの直径は４．５ｍｍ以下である。本発明の一部の態様では、液体取扱器は、最大３８４個の試料に対応することができる。本発明の一部の態様では、シリンジの直径は２．２５ｍｍ以下である。本発明の一部の態様では、液体取扱器は、最大１５３６個の試料に対応することができる。一部の場合では、特に、試料容器が手動で使用するものである場合、より大きな直径が使用され得る。

【0103】

本発明の化学は、呼気試料収集に使用するために特に好適である。この態様では、呼気および水混和性有機溶媒が混ぜ合わされる。溶媒は、試料中に存在するＲＮＡまたはＤＮＡを放出および抽出させ、また、試料中のＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ酵素を変性または失活させる。

【0104】

呼気試料の直接溶解および安定化のための装置が図３に示されている。呼気１００は、本発明の溶媒３０を含む装置に吹き込まれる。口部が、唇の窪み１１０の周りに形成されており、呼気１００を装置へと導く。吐き出された呼気１００は、肺区画および気道通路に保持されている内側層流体から形成される液滴を含む。こうした液滴は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、代謝物、および揮発性有機化合物など、数多くのバイオマーカーを含む。インフルエンザまたは別のウイルスに感染した患者の場合、液滴は、目的のウイルスを含む。正常な潮汐呼吸で排出される典型的な凝縮流体の量は、子供で７５～１５０マイクロリットル／分、成人で１００～２５０マイクロリットル／分である。

【0105】

吐き出された呼気の採取装置は、こうした液滴を捕捉し、それらを本発明の溶媒中の試料として提示する。採取装置は、自宅、職場、研究室、病院、または診療所にて、非監視下の患者により使用され得る。この非侵襲的な携帯型装置は、完全自立型および使い捨てである。対象が装置に通常通りに息を吹き込むと、呼気液滴がカートリッジに採取され得る。採取後、カートリッジは、分析のために別の場所に輸送され得る。カートリッジは、郵送を含む任意の方法により輸送され得る。これは、空港、診療所、病院、自宅、職場、学校、または他の合理的な環境を含む任意の場所での試料収集を可能にする。液滴は、本発明の溶媒内に混合されることになるプールとして採取してもよく、または溶媒内に直接採取してもよい。

【0106】

図３に図示されている装置は、呼気１００を装置内に導くが、呼気１００が装置から逆流することを許容しない一方向逆止弁１２０を内部に含む。本発明の一部の態様では、外部一方向逆止弁１３０は、空気が装置を通らずに個人内に吸入され得るよう位置決めされていてもよい。外部逆止弁１３０は、呼息時に閉じて、呼気液滴を採取装置内へと導く。呼気１００は、任意選択で吸着剤を含んでいてもよい溶媒３０に導かれる。溶媒障壁１４０は、溶媒３０が開口呼気通路に到達することを防止する。この装置は、一切の交差夾雑を排除するために使い捨てであってもよい。典型的な凝縮流体の量は、正常の潮汐呼吸努力で、子供の場合は７５～１５０マイクロリットル／分、成人の場合は１００～２５０マイクロリットル／分である。１～２分間の正常呼吸は、十分なウイルス試料をもたらすことができる。一部の態様では、呼吸は、２分間よりも長く継続され得る。

【0107】

図４Ａは、シリンジに基づく呼気採取装置の図示を示す。試料を採取するために、マウスピースが取り付けられたシリンジが使用される。個人からの呼気１００は、シリンジ筒２０に至る一方向逆止弁１５０を含むマウスピース１７０から吹き込まれる。個人は、５秒間、３０秒間、１分間、２分間またはそれよりも長く、マウスピース１７０に対して呼吸してもよい。一方向逆止弁１５０は、呼気、ウイルス粒子および他の有機物質がシリンジ筒２０に進入することを可能にするために使用される。一方向逆止弁１５０は、本発明の溶媒からの蒸気がシリンジから出て、マウスピース１７０から個人へと逆流することを可能にしない。溶媒を有する媒体１６０が、シリンジ筒２０に含まれる。溶媒を有する媒体１６０は、吸着紙材料、グラスウールまたは別の材料などの支持体を含む。ルアー蓋６０は、装置に対して息を吹き込む前に取り外される。ルアー蓋６０は、シリンジに蓋をするために使用され得、試料は、保存または発送され得る。試料が採取された後、マウスピース１７０は、シリンジ筒２０から取り外され、図４Ｂに示されているように、シリンジプランジャー１０がシリンジ内に挿入される。採取された試料は、溶媒を有する媒体１６０中に存在する。シリンジプランジャー１０は、種々の溶媒を操作して、調製された試料を溶出するために使用される。

【0108】

追加の溶媒、試薬、水または緩衝液は、シリンジ針７０により、溶解および安定化された試料内へと吸入され得る。
分析物を取り出すために、シリンジ針７０は、シリンジの端部に配置され、溶媒、水または緩衝液は、数回、シリンジに吸入され、排出される。シリンジプランジャー１０は、溶媒を有する媒体１６０から針７０を通してウイルス（または別の分析物）を排出するために押し下げられ得る。排出された溶媒混合物は取り出され、分析される。

【0109】

他の態様では、試料採取後に溶媒が添加され得る。
吸着剤パッド／媒体は、図４Ａでは溶媒内に位置決めされているが、シリンジ筒に沿って任意の場所に位置決めされていてもよい。

【0110】

本発明の一部の態様では、水蒸気が、本発明のシリンジまたは呼気装置に採取される。吸着剤パッド、媒体または表面は使用されないが、液滴が採取され、溶媒で処理される。
本発明の一部の態様では、呼気は、オリフィスを通って膨張してそれを冷却し、そのため呼気の液滴が凝縮して採取される。

【0111】

図５には、類似の低背圧シリンジ装置が示されている。図５Ａでは、装置に息を吐き出す際の抵抗を低減させるために、シリンジの底部が開口している。シリンジ筒２０には、媒体１８０が含まれている。シリンジの端部が除去されており、篩１９０が、シリンジ筒２０の面に配置されている。呼気１００はシリンジ内に導かれる。この場合、装置は、呼気蒸気試料または液体凝縮物を捕捉し、本発明の溶媒は後に添加される。

【0112】

図５Ｂでは、媒体１８０を含むシリンジ筒２０内に溶媒を吐出するために、溶媒を含むシリンジ２００が使用される。
図５Ｃでは、試料を処理するために、シリンジプランジャー１０がシリンジ筒２０に挿入される。図５Ｂに図示されている溶媒添加法の代替として、試料を溶解および安定化させるために、シリンジプランジャー１０を用いて溶媒が添加され得る。

【0113】

紙、クロマトグラフィー媒体またはグラスウールで構成されていてもよいカラム媒体または採取媒体は、ウイルス、細菌または他の有機および生物試料を含む空気液滴を採取する。採取媒体（紙、媒体、グラスウールなど）は、捕捉を容易にするために、強または弱イオン荷電体、親和性基、疎水性または親水性、吸着性または非吸着性、多孔性、非多孔性であってもよい。標的ウイルス、細菌などを含む液滴が捕捉されてもよく、有機分子が捕捉されてもよい。次いで、試料が採取された後、試料を溶解および安定化するために、本発明の溶媒が添加される。その代わりに、試料は、溶出に好適な溶媒を使用して直接溶出させてもよい。図５Ｃに示されている態様では、シリンジプランジャーを使用して、採取するための液体を吸入および吐出することにより、試料の溶出が支援され得る。

【0114】

一部の態様では、本発明の溶媒を用いた呼気試料収集法および器具は、コロナウイルス、ＣＯＶＩＤ－１９および他の疾患を含むウイルス疾患の試料収集のために使用され得る。一部の態様では、呼気試料収集法および器具は、ウイルス性肺炎、インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｆｌｕ）、他のインフルエンザ（ｏｔｈｅｒ ｆｌｕｓ）、細菌、胞子、化学物質および呼気から排出される任意の生物学的物質を試料収集するために使用され得る。一部の態様では、呼気試料収集法および器具は、呼気中に見出される小型有機分子を試料収集するために使用され得る。本発明のシリンジ呼気装置は、有機分子の採取のためには溶媒溶解を必要としないだろう。

【0115】

呼気からエアロゾルまたは凝縮物を採取する任意の装置が使用され得る。図６は、ウイルス採取のためのマスクの正面図および側面図を図示したものである。フィルター装置が取り付けられたマスク２３０が、ウイルス、細菌および化学物質を採取するために使用される。図６Ｂに示されているように、空気がマスク２３０から吸入され、呼気は、逆止弁２４０からフィルター２５０へと導かれる。マスクは長期間装着され得るため、この種類の装置は、高感度ウイルス検査のために使用され得る。低頻度で存在するウイルスが検出され得る。例えば、シフトの開始時にフィルターディスクが投入され、５分間使用され、次いでウイルスを検査するために取り外される。この種類のデバイスは、肺炎患者またはＣＯＶＩＤ－１９患者など、呼吸困難を有する患者に使用され得る。

【0116】

図７および８は、フィルターが、マスク２３０（図６に示されている）からどのようにして回収および処理されるかを示す。核酸がフィルター２５０から溶出され、処理される。図７Ａでは、フィルター２５０がマスクから取り外され、針７０が取り付けられたシリンジ筒２０内に投入される。シリンジプランジャー１０が取り外される。

【0117】

図７Ｂでは、フィルターは、検出のための試料を調製するために、溶媒添加シリンジ２６０を使用して溶媒２７０で処理される。
その代わりに、図７Ｃに示されているように、プランジャー１０は、フィルター２５０を処理するために、シリンジ筒２０内に挿入される。本発明の溶媒を針７０から吸引し、フィルター２５０から試料を回収するために、フィルター２５０を有するシリンジが使用される。

【0118】

または、別の態様では、フィルターは、容器内の本発明の液体に添加してもよく、試料は、フィルターから液体に移される。
図８では、マスクからフィルター２５０が回収され、シリンジおよびフィルターホルダーを用いて処理される。フィルターは、フィルターホルダー２７０に付加され、シリンジ２６０および針７０が取り付けられる。フィルターは、検出のための試料を調製するために本発明の溶媒で処理される。溶媒は、針７０からフィルター２５０を通してシリンジ２６０内に吸入され得る。また、一部の態様では、溶媒は、フィルター２５０および針７０を通して排出され得る。

【0119】

一部の態様では、本発明の溶媒は使用されず、生ウイルスまたは細菌が採取される。採取後、試料は、カラム精製もしくは磁気ビーズ精製またはプロテイナーゼＫによる消化など、従来の核酸試料調製法を使用して処理してもよい。核酸は、通常、ＲＮＡの場合は任意の逆転写酵素法および増幅法で、ＤＮＡの場合は他の増幅法で処理され得る。

【0120】

図９は、呼気から生物学的物質を採取するように設計された半マスク装置および表面を示す。図９Ａには正面図が示されており、図９Ｂには側面図が示されている。表面を有する採取表面２８０は、ウイルス粒子または他の生物学的物質を含む呼気を採取するために使用される。この例では、採取表面２８０は、この表面が口の真正面になるようにマスクに含まれている。呼吸および蒸気堆積は、理想的には、患者の正面に配置されている、例えばマスクまたはシールドの採取表面２８０上で実施される。マスクは、試料を取得するために必要な時間だけ装着され得る。子供または呼吸および呼息に問題がある人々には、この種類の採取が必要であり得る。呼気からの蒸気液滴が表面に堆積する。一部の態様では、採取表面は、呼気蒸気が堆積し得るプラットフォームまたは他の構造に存在してもよい。

【0121】

カラム、シリンジまたは表面は、呼気液滴の採取を増強するために、圧電素子または氷などの他の冷却方法で、例えばペルチェ素子を使用して冷却され得る。表面または装置は、使用前に冷蔵庫または類似の装置で冷却され得る。特に口により暖められると、蒸気凝縮物または呼気凝縮物を採取するには温度が高すぎる可能性がある。温度および露点によっては、液滴が、密着、付着または凝縮しない可能性がある。冷たい表面またはチューブは、採取を増強または可能にするだろう。

【0122】

採取チューブの例で説明されているように、表面は、多孔質または非多孔質の紙、プラスチック、ガラス、または金属であってもよい。表面は、採取を増強するための採取ウェルまたは他の構造を含んでいてもよい。表面は、親水性であってもよくまたは疎水性であってもよい。表面は、イオン交換基または任意の官能基もしくは化学基を含んでいてもよい。

【0123】

表面または媒体は、ポリスルホン、テフロン（登録商標）、ポリフッ素化材料もしくは類似の材料、セルロース、硝酸セルロース、金属、ポリカーボネート、紙、または紙材料であってもよい。液滴が蓄積し得る任意の材料が使用され得る。表面または媒体は、平滑表面、粗表面または多孔質表面を有してもよい。

【0124】

採取後、表面は、検出および分析のための所望の生物学的物質を採取するために、綿棒でまたは溶媒で濯ぐことにより試料収集される。濯ぎは、本発明の溶媒を使用して実施してもよい。凍結液体の除去を支援するために、加熱が使用され得る。

【0125】

採取後、試料は、カラム精製、磁気ビーズ精製またはプロテイナーゼＫによる消化を含む、従来の核酸試料調製法で処理してもよい。試料核酸は、通常は、ＲＮＡの場合は逆転写酵素法および増幅法、ならびにＤＮＡの場合は他の増幅法で処理される。

【0126】

採取後、試料は、生物学的物質を検出するために、本発明の溶媒で溶解および安定化される。一態様では、検出および分析のためのウイルスを試料収集および処理するために、綿棒が使用され得る。別の態様では、検出および分析のための細菌を試料収集および処理するために、綿棒が使用され得る。

【0127】

安定化された核酸試料を、発送用容器チューブ、バイアル、シリンジ、プレートまたは他の容器に入れる
試料を含むバイアルは、小包内に配置され、検査研究室に郵送され得る。発送は、通常の発送温度で達成され得る。ドライアイスまたは冷蔵は、許容されるが、必要ではない。加えて、放出されたウイルス核酸試料は安定したままであるため、分析は、研究室で試料を受け取って、室温で数日間、数週間または数か月間保存した後で、随意に実施され得る。安定した試料を維持することは、存在する可能性のあるあらゆるＲＮａｓｅを無効化または不活化することにより達成される。

【0128】

一部の実施形態では、試料は、問い合わせの時点で採取および分析してもよい。試料は発送されず、むしろ試料は、採取され、数分間または数時間などの短期間保存され、次いで分析される。これは、試料が採取され、プールされ、次いで一緒に分析される場合に有用である。しかしながら、この手順を成功させるには、採取された最初の試料が、採取された最後の試料と同程度に安定していなければならない。本発明の安定化装置および方法は、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１日間、１週間、１か月間、６か月間、または無期限に安定である試料を提供する。

【0129】

ウイルス、細菌または酵母は、本発明の溶媒を添加または混ぜ合わせた際に、無効化されるかまたは非感染性（および安定的）になる。これは、訓練を受けていない担当者による安全な取扱いを可能にする。試料収集器具および発送用封筒または梱包用封筒の外側は、追加の安全性のために、漂白剤、アルコール、または他の消毒剤で噴霧される場合がある。封筒表面は、消毒を容易にする表面で構成されていてもよい。こうした表面は、例えば、単層の銅または銀の薄層を含む。

【0130】

ウイルス核酸の増幅および分析
溶媒で安定化された試料は、研究室または機器がある場所で、緩衝液または脱イオン水で希釈され得る。内部標準、オリゴマープライマー、逆転写酵素、ポリメラーゼなどの検出酵素が添加され、ＲＴ、ＱＰＣＲまたはＬＡＭＰが実施される。一部の態様では、安定化された試料を含むバイアルは、９６ウェル形式のラックに配置され、機器に配置されるか、またはウイルスを検出するために機器内に直接配置され得る。ロボットに配置し、規定されたアリコートを取り出し、分析のために９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートまたは１５３６ウェルプレートに配置する。非プロトン性溶媒試料分析に関して説明された自動化は、他の試料にも使用され得る。本発明の一態様では、試料は、手動で採取され、次いで一度に１～９６個または１～３８４個または１～１５３６個が分析される。これは、９６ウェルまたは３８４ウェルまたは１５３６ウェル形式の機器に配置され得るシリンジまたはチューブに試料を手動で捕捉することにより達成される。手動で捕捉された試料は、ハイスループット形式に配置され、並列で自動化処理される。

【0131】

完全自動化および報告
検査者は、認定を受け、管理されなければならない場合がある。１つ以上の陰性結果は、ＣＯＶＩＤ－１９または他のウイルス感染の可能性を除外しない。検体の品質が不良であること、患者材料がほとんど含まれていないことを含む、いくつかの要因が、感染個人に陰性結果をもたらす可能性がある。しかしながら、本発明の方法では、試料の分解による偽陰性が生じることはない。

【0132】

一部の態様では、増幅ステップが適正に機能していることを確認するために、溶解の時点または分析の時点で陽性対照核酸が添加され得る。陽性対照プライマーは対照核酸に結合するが、ＣＯＶＩＤ－１９などの届出が必要な疾患の場合、国立疾病管理センターが、プライマー配列に関する詳細な指針を提供する：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｌａｂ／ｒｔ－ｐｃｒ－ｐａｎｅｌ－ｐｒｉｍｅｒ－ｐｒｏｂｅｓ．ｈｔｍｌ。

【0133】

陰性結果は、個人に存在する活性ウイルスの欠如を示す。しかしながら、陰性結果は、ウイルスをまったく有していないという結果、感染の最晩期での採取による結果、または感染の最初期での採取による結果であり得る。それにも関わらず、本発明の方法、キットおよび装置による検査が陰性である個人は、ウイルスを他の個人へと拡散させる可能性が低いかまたは可能性がより低いことを示す。

【0134】

一部の場合では、複数の試料が採取および分析され得る。例えば、疾患の進行が決定され得る。
ＣＯＶＩＤ－１９の症状または別のウイルス感染の症状を有する患者から陰性結果が得られた場合、特に上気道の検体のみが採取された場合は、可能であれば下気道に由来する検体を含む追加の検体が採取および検査されるべきである。各ＮＡＡＴの実行は、陽性および陰性外部対照ならびに内部対照を含むべきであり、研究室は、外部品質評価スキームに参加することが推奨される。

【0135】

キット、形式およびキットパッケージ
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットも提供する。一般に、そのようなキットは、生物試料を受け取るための試料容器、および生物学的試料を混ぜ合わせるための水混和性有機溶媒を含む。キットは、生物試料と混合するための緩衝液、試料容器の蓋、水混和性有機溶媒の存在下で標的核酸（例えば、ウイルス抗原）を増幅するための核酸増幅試薬、標的核酸（例えば、ウイルス抗原）を検出するための試薬および／または採取もしくは加工された生物試料を検査のために研究室に送付するための郵送用包装、１つ以上をさらに含んでいてもよい。

【0136】

キット内の有機溶媒は、様々な形式で提供され得る。溶媒は、シリンジ、ピペットチップ、スポイト、バイアル（例えば、ＰＣＲバイアルまたは検出バイアル）、または制御された量の溶媒が分散され得る任意の様式で含まれていてもよい。溶媒は、検出試薬、例えば、増幅反応および／または検出反応で使用される酵素および他の試薬と共に含まれていてもよい。溶媒は、既知少量を試料内に吐出するためのツールに取り付けられた大型ストック容器、または試料を保持するために使用されることになる容器に存在してもよい。溶媒は、試料と混ぜ合わせられ得るバイアル、シリンジまたは他の容器に事前ロードまたは事前充填されていてもよい。

【0137】

唾液試料または安定化が必要な他の試料の場合、必要とされる容積は、５０μＬ～５ｍＬの範囲であってもよい。例えば、試料は、一定の容積に設定され得、押出し吐出を使用することができる半自動サンプラーを用いてクエンチまたは安定化され得る。

【0138】

溶媒は、カプセルまたはピロー（ｐｉｌｌｏｗ）に含まれていてもよい。カプセルは、穿孔または別の機序で開口され得る。
自宅で使用するためのキットの場合、それらの設計は重要であり、以下の点の一部またはすべてを考慮すべきである。キットの溶媒は、数年間安定である必要がある。一般に、溶媒は、試料への添加後および分析まで安定である。自宅での試料収集の場合、本発明のキットは、好ましくは、誰でも簡単に操作できるものであり、本明細書に記載の方法により処理された試料容器は、処理研究室へと郵送されることが可能である。加えて、キットの処理は、比較的容易で安価であることが好ましく、例えば、処理による結果は、偽陽性および偽陰性の発生を最小限に抑える自動化様式である。また、キットは、合理的で実用的な保管寿命を有し、例えば、自宅用キットが、非常時まで自宅で保管され得ることを可能にし、キットが事前に購入され、キャビネットまたは戸棚で保存され得ることを可能にすることが好ましい。一般に、キットは、グループ分析にも使用され得る。

【実施例】

【0139】

診断は、本発明の技術の主要な応用である。しかしながら、診断以外にも、本技術は、任意の研究開発応用に使用され得る。例えば、突然変異を決定するために、試料が採取され、ＲＮＡ配列決定のために処理され得る。この場合、試料は、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、次いでイルミナおよびナノポアおよび他の技法により配列決定するために使用され得る。英国におけるＣＯＶＩＤ－１９の１つのバリアントは、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの２～４か月後に２３個の突然変異を有してした。突然変異の数は急速に多くなり、こうした突然変異を追跡することが望まれていた。

【0140】

実施例１
高リスク感染症に関連するウイルス粒子からの核酸の捕捉
生物試料がバイアル、チューブまたは容器に配置され、試料中に存在するＲＮＡを放出および抽出させるために非プロトン性溶媒が試料と混ぜ合わせられる、ウイルス試料を保存する方法が記載される。溶媒は、試料中に存在するあらゆるＲＮａｓｅを変性または不活化させる。

【0141】

このプロセスは、集団イベント、学校、会社、教会または人々のグループが限定された時間内に密接に接触して集まる任意の場所で使用され得る。この方法は、飛行機に搭乗する前、教室に入る前または職場に入る前の状況で有用である。例えば、飛行機の搭乗予定者は、空港またはゲートで試料が採取され、搭乗前に分析され得る。活性ウイルス感染を有する者は飛行機への搭乗が許可されないだろう。このようにして、すべての乗客および乗務員は、飛行中の安全が確保され得る。この方法の使用は、飛行目的地の入域地点を通過する際にも有用であり得る。

【0142】

この方法の成功は、試料が採取された時点において試料を直ちに安定化させる能力による。安定化は、試料を採取してから１分以内に、個人から試料を採取してから２、３、４、５、６、７、８、９分以内または１０分以内に実施され得る。迅速な安定化は、試料不安定性による偽陰性が生じないことを保証する。

【0143】

実施例２
ウイルス感染リスクの排除ならびに検出中のＲＮＡの捕捉および安定化の同時増強
過酸化水素加熱および除去。ＣＯＶＩＤ－１９が疑われる唾液（または綿棒、呼気など）試料を、等量のアセトニトリル（最終濃度５０％容積／容積）および１％過酸化水素（最終濃度０．５％容積／容積）と混合する。ウイルスは直ちに中和され、ウイルス粒子は、崩壊して、脂質、カプシドタンパク質およびゲノムＲＮＡを放出する。

【0144】

一部の例では、検出前に加熱ステップを行って、ＲＮＡ検出の感度および特異性を向上させる。一部の例では、検出前に過酸化水素を希釈する。一部の例では、検出前にアセトニトリルを希釈する。

【0145】

試料を加熱するためにおよび過酸化水素を排除するために、試料をＭｎＯ_２などの遷移金属触媒と混ぜ合わせる。ＭｎＯ_２は、過酸化水素（ＶＴＭに存在する可能性がある）を安全に分解し、高度に発熱性の反応で水および酸素を生成する。加熱は、ＲＮａｓｅをさらに不活化することができる。遷移金属酸化物または類似の触媒を使用することができる。例えば、ＭｎＯ_２またはＫＭｎＯ_４または任意の類似遷移金属塩を使用してもよい。金属酸化物は、膜または表面コーティングにより固定化してもよくまたは含浸／遮蔽してもよい。

【0146】

ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡは、この時点で、ＲＴ－ＰＣＲ、ＬＡＭＰまたは一部の他の増幅技法によるアッセイの準備が整う。試料は、この時点で、任意の下流アッセイ（ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＴ ＬＡＭＰ、ｑＰＣＲ、ＰＣＲなど）またはアッセイ検査で使用することができる。
過剰な過酸化水素を排除するための単純な遷移金属触媒の導入は、非常に発熱性であり、ＲＮＡ完全性を維持しつつ、ＲＮａｓｅの不活化を促進する。

【0147】

実施例３
溶解および酵母に由来するＲＮＡの安定化
ＹＰＤに播種した酵母コロニーに対してコロニーＰＣＲを実施した。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、菌株５１８（ｇｄｐ：：）のプレートを実験に使用した。Ａｍａｚｏｎから純粋培養物として入手可能なＢａｋｅｒ’Ｙｅａｓｔを含む他の菌株を使用した。

【0148】

寒天プレートから、酵母コロニーのいくつかの少量試料（針先サイズのコロニーのおよそ１０％）をｐ２００ピペットチップで摘取し、３０μＬの溶媒に再懸濁した。ｄｄＨ_２Ｏ、５０％ｖ／ｖアセトニトリル／１００ｍＭ ＴＥＡＡ、およびＤＩ Ｈ_２Ｏ中０．２％ドデシル硫酸ナトリウムを溶媒として使用して、酵母コロニーを再懸濁した。各溶媒再懸濁の複製を作製し、各複製の１つを９９℃で５分間加熱した。２５μＬ ＰＣＲ実験では、各懸濁物の１μＬを、ＤＮＡ鋳型として添加した。

【0149】

ＰＣＲ実験では、種々のプライマーを使用した。プライマーストックを、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ｇｅｎｏｍｉｃｓから購入し、５ｍＭに希釈し、０．４μＭの最終濃度を、２５μＬ ＰＣＲに使用した。加えて、２．５μＬの１０×Ｔａｑ Ｍｇ非含有反応緩衝液（ＮＥＢ）、１μＬの２５μＭ ＭｇＣｌ_２（ＮＥＢ）、２μＬの１．２５ｍＭ ｄＮＴＰミックス（ＮＥＢ）、および１μＬのポリメラーゼ（実験室で抽出した）をＰＣＲに添加し、次いでそれをｄｄＨ_２Ｏで２５μＬにした。

【0150】

標準的なＯｎｅＴａｑ ＰＣＲプロトコールを使用してＰＣＲを実施した。試料を、９５℃で３０秒間加熱してから、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および６８℃で６０秒間の４０サイクルを行った後、すべてのアンプリコンが十分に伸長することを確実にするために、６８℃で５分間加熱して終了した。次いで、１０μｌのＰＣＲアンプリコンを１％アガロースゲルにロードし、それを８５Ｖで４０分間泳動させた。バンドを、Ｇ：Ｂｏｘゲルイメージャーで視覚化した。

【0151】

このＰＣＲ実験の結果は、アセトニトリルが、酵母からＤＮＡを放出させたことを示す。２％～２０％の最終濃度のアセトニトリルは、特異的なＤＮＡ産物を増幅するＰＣＲの能力を妨げなかった。アセトニトリルを含むＰＣＲアンプリコンは、ｄｄＨ_２Ｏのみを含むものと同様のバンド強度を示した。

【0152】

実施例４
溶解およびウシ肝臓に由来するＲＮＡの安定化
地元の市場から肝臓を購入した。２グラム部分を、２ｍＬの５０／５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルと共に粉砕することにより混合した。上清を単離し、３倍に希釈した。実施例３と同様にＰＣＲを実施した。結果は、ＲＮＡが放出および増幅されたことを示した。

【0153】

実施例５
唾液、鼻孔綿棒（ｎｏｓｔｒｉｌ ｓｗａｂ）および他の生物試料中のウイルスの試料調製および直接検出の手順
アセトニトリル溶解および保護溶液：
１． アセトニトリル溶液を、ｐＨ５．６クエン酸ナトリウムを含むように調合する。

【0154】

２． クエン酸二ナトリウム（２５４．１ｇ／モル）から５０ｍＬの１Ｍクエン酸ナトリウムのクエン酸塩ストック溶液を調製する。１２．７ｇを、４０ｍＬフラスコ内の４０ｍＬ ＤＩ水に添加し、結晶を溶解させる。

【0155】

３． 氷酢酸を滴加して、ｐＨ５．６＋０．２を得る。クエン酸塩は、イオン化可能なカルボキシレートを３つ有する。初期溶液は、８を超えるｐＨを有することになる。酸を添加すると、ｐＨはまず急速に低下し、次いでｐＨ６．５付近ではよりゆっくりと低下することになる。

【0156】

４． ５０ｍＬメスフラスコへと定量的に移し、溶液を５０ｍＬの最終容量にする。
５． フィルター滅菌して、Ｆａｌｃｏｎチューブ（または類似の保存チューブ）に入れる。

【0157】

６． ５０ｍＬメスフラスコに、４０ｍＬのアセトニトリルを添加する。１ｍＬのｐＨ５．６クエン酸ナトリウム緩衝液を添加して混合する。アセトニトリルを所定容積まで添加して混合する。最終溶液は、２０ｍＭクエン酸ナトリウムを含む。

【0158】

手順：
１． 唾液試料または綿棒試料（例えば、２５μＬ）を、きれいな微量遠心分離チューブに移し、等量のアセトニトリル保護溶液を添加する。試料は、任意選択でウイルス移送媒体（ＶＴＭ）を含む。ボルテックス混合する。この抽出物は、可溶性ウイルスＲＮＡおよび細胞性物質を含むことになる。

【0159】

２． 任意選択で、サーマルサイクラーで４分間９０℃に加熱する。
３． 任意選択で、抽出物を卓上微量遠心分離機で２～５分間遠心分離して、あらゆる不溶性物質をペレット化する。

【0160】

４． ＲＴ－ＰＣＲマスターミックスを調製し、１０μＬをＰＣＲバイアルにピペットする。
５． 試料をＰＣＲバイアルにピペットする。沈殿物質の移動があってはならない。２０μＬ ＰＣＲバイアルの場合、６μＬの試料および４μＬのＤＩ水を添加する。これは、マスターミックスの量、アセトニトリル濃度および手順に応じて調整することができる。ボルテックス混合する。
６． 機器に配置し、ＲＴ－ＰＣＲで増幅および検出する。

【0161】

備考：
１． 唾液を、この手順で直接分析することができる。ＶＴＭで保護された唾液試料を、アセトニトリル／クエン酸塩溶液で溶解および保護し、次いで分析する。ＶＴＭは、アセトニトリル／クエン酸塩溶液よりも高い緩衝能力を有するかまたはアセトニトリル／クエン酸塩溶液と混合した際に試料のｐＨを上昇させることになる緩衝液を一切含むべきではない。

【0162】

２． ＤＩ水中の綿棒試料を、この手順で直接分析することができる。ＶＴＭで保護された唾液試料を、アセトニトリル／クエン酸塩溶液で溶解および保護し、次いで分析することができる。ＶＴＭは、アセトニトリル／クエン酸塩溶液よりも高い緩衝能力を有するかまたはアセトニトリル／クエン酸塩溶液と混合した際に試料のｐＨを上昇させることになる緩衝液を一切含むべきではない。

【0163】

実施例６
鼻咽頭綿棒試料および唾液試料を使用したＲｉｂｏｓｔａｙによるＣＯＶＩＤ－１９検査
Ｒｉｂｏｓｔａｙ調合物：（４０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．６、１％の過酸化水素（ｖ／ｖ））。Ｒｉｂｏｓｔａｙを使用してすべての試料を１：１希釈し、すべての最終濃度を２分の１に低減させた。試料が固体形態で提供される場合、２倍希釈のＲｉｂｏｓｔａｙを直接添加する。

【0164】

典型的なＲＴ－ＰＣＲ手順では：
１． ２５μＬのＲｉｂｏｓｔａｙを、２５μＬの液体臨床試料に添加する。
２． １５秒間ボルテックスし、次いで９０℃で４分間加熱する。

【0165】

３． 再度ボルテックスし、ＲＴ－ＰＣＲ用に５μＬを取り出す。
４． ５μＬ試料を、４５μＬヌクレアーゼ非含有水で希釈する。
５． ５μＬの希釈試料を、２０μＬ（最終容積）のＲＴ－ＰＣＲ反応に添加する。

【0166】

６． ＣＯＶＩＤ－１９キット説明書（Ｃｈａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、２５～４０サイクルで増幅を行う。
多くのＲＴ－ＰＣＲキットでは、Ｒｉｂｏｓｔａｙ成分の最終濃度が、最終アッセイにおいて０．５％アセトニトリル、０．５ｍＭクエン酸塩および０．０２５％過酸化物未満であることを保証することが重要である。本発明の溶媒に対する逆転写酵素の耐性を測定する実験を実施した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩおよびＮＥＢ ＭＭＬＶは、少なくとも１０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル濃度に耐性であることが見出された。

【0167】

実施例７
細胞からの全ＲＮＡの単離：酵母からＲＮＡを抽出するためのプロトコール
１．標準的な手順を使用して手作業で１分間粉砕することにより、凍結乾燥酵母細胞を機械的に破壊した。

【0168】

２． ５００ｍｇ（およそ）の粉砕物質をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。
３． １ｍＬのＲｉｂｏｓｔａｙを添加し、徹底的に混合した。
４． 混合物を遠心分離した（卓上で１５０００ｒｐｍ、５分間）
５． 上清を取り出し、１０～２０μＬを１％アガロースゲルでの電気泳動にかけた。

【0169】

６． 蛍光色素を使用したリボソームＲＮＡ種およびトランスファーＲＮＡ種の特徴的な外観により、ＲＮＡを識別した。臭化エチジウムまたは「Ｇｅｌ Ｇｒｅｅｎ」を、好適なトランスイルミネーターで使用した。

【0170】

完全な処理には、開始から終了まで１時間かかった。試料を直接分析したか、または室温で１０分間の標準的なエタノール沈殿により濃縮した。沈殿物を、１５０００で５分間の５分間卓上遠心分離により収集した。上清を破棄し、過剰なエタノールを除去した。試料を５００μＬのＲｉｂｏｓｔａｙに溶解した。

【0171】

実施例８
細菌エンベロープ二本鎖ＲＮＡバクテリオファージｐｈｉ６を使用した哺乳動物エンベロープウイルスからのＲＮＡ分離モデル
バクテリオファージｐｈｉ６は、植物病原体シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）を含むシュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ）に感染する宿主範囲が制限されたファージである。感染および溶解増殖を以下の通りに達成した：ＴＳＢプレートにＰ．シリンゲ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）を播種し（推奨事項は製造元による）、同じブロスで培養する。ブロス培養に接種する（ＳｔｅｒｉｌｉｎチューブまたはＦａｌｃｏｎチューブ中で２．５ｍＬまたは２５ｍＬの容積を使用する）。単一コロニーまたは５０～１００μＬのいずれかでの一晩ブロス増殖は３０℃を超えないこと（室温：約２４℃を使用）。

【0172】

ファージを添加する前に、穏やかに震盪しながら、しかしながら良好に通気して２～５時間インキュベートする（典型的には、培養１ｍＬ当たり２００個のファージ粒子）。
少なくとも８時間（または一晩）インキュベートする。結果は、著しい増殖を示した未感染培養と比較して、細菌増殖が微弱だった。これは、ウイルス感染が生産的／効果的であったことを示した。

【0173】

上清を回収し、細胞デブリを廃棄する。（遠心分離または０．２２μｍフィルター付きのシリンジを使用する）。
物質および試薬：
ＴＢＳ（１×）またはＴｒｉｓ緩衝生理食塩水：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、フィルター、または滅菌用オートクレーブ。

【0174】

ＰＥＧ／ＮａＣｌ（５×）ストック溶液：ＰＥＧ－８０００ ２０％、ＮａＣｌ ２．５Ｍ。１００ｇのＰＥＧ－８０００（２０％ｗ／ｖ）および７５ｇのＮａＣｌ（２．５Ｍ）を、室温で撹拌することにより４００ｍｌのｄｄＨ２Ｏに溶解し、５００ｍＬの最終容量にする。０．２μＭフィルターで滅菌する。

【0175】

手順：
１． ファージ粒子を含む１５００μＬの細菌培養を微量遠心分離チューブに移した。
２． １３，０００×ｇで２分間の微量遠心分離により細菌を分離した。

【0176】

３． １２００μＬの上清を、チップが細菌のペレットに触れないように気を付けながら、きれいな微量遠心分離チューブに移した。
４． ３００μＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ ５×を添加し、反転させることにより十分に混合した。ボルテックスしないこと。

【0177】

５． チューブを氷上で冷却した。数分後、チューブを取り出し、きれいなティッシュできれいに拭き、上清を間接照明にかざした。チューブを指で前後に揺らすことにより、多くの場合は、ＰＥＧ沈殿ビリオンが肉眼で見える。沈殿物が視認される場合、インキュベーションを５分間に短縮してもよく、それ以外の場合は、氷上で最大１時間インキュベーションを続けてもよい。

【0178】

６． １３，０００×ｇで３分間の微量遠心分離によりビリオンをペレット化した。
７． 手袋およびピペッターに付いているバクテリオファージが拡散しないように注意しながら、上清の大部分を大型チップで注意深く取り除き、適切な容器に廃棄した。溶液を、再び１３，０００×ｇで１分間微量遠心分離した。１００μＬチップですべての残留上清を除去し、チップを廃棄した。２回目の遠心分離は、１）チューブの底部にあるすべてのファージ粒子を採取し、２）細菌上清の完全な除去を達成するために不可欠である。

【0179】

８． ペレットを、１２０μＬのＴＢＳ（１×）（初期培養容積の１／１０）で激しくボルテックスすることにより再懸濁し、氷上でさらに１時間インキュベートした。ビリオンを再懸濁する前にペレットを数分間軟化させる方がより容易であることがある。大量のビリオンが沈殿する場合はインキュベーション時間を短縮してもよいが、清澄化ステップ中の粒子の喪失を防止するために、安全な３０分間インキュベーションステップが推奨される。

【0180】

９． 混合物を再び激しくボルテックスし、１３，０００×ｇで１分間微量遠心分離することによりファージ溶液を清澄化した。ファージ溶液を、きれいなマイクロチューブに移し、ビリオンを定量した。

【0181】

１０． 粒子を冷蔵保存した。
ファージからのＲＮＡ分離：ｐｈｉ６は、ＣＯＶＩＤ－１９を含むインフルエンザ様ウイルスを模倣する。これは、脂質二重層にタンパク質がスパイクとして挿入されているエンベロープファージである（これはＥＭ構造から判明している）。Ｒｉｂｏｓｔａｙは、ファージを不活化し、ＲＮＡを放出させるのに十分であることが示された。５０μＬのＲｉｂｏｓｔａｙを（過酸化物を有しない上記の調合物［２０％ＡＣＮ／１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５．６］）、等量のファージ粒子（力価不明）に添加した。これを、ピペットで２０秒間混合した。一連の試料容量をアガロースゲルに負荷した。結果：Ｒｉｂｏｓｔａｙは、エンベロープをはぎ取り、ＲＮＡを放出させ、ＲＮＡを安定化させた。放出されたＲＮＡは二本鎖であり、ＲＴ－ＰＣＲ／ＬＡＭＰ試験のための不純物のない鋳型として使用した。

【0182】

（最終濃度）１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．６）の添加は、抽出を増強し、ＲＮＡに良好な安定性を付与した。ＰＣＲの前にまたは試料処理の一部としてのいずれで使用される加熱ステップが存在することが多い。０．５％過酸化水素の添加は、抽出収量にほとんど効果を及ぼさなかったが、使用されることが多い加熱ステップである９０℃においてＲＮａｓｅ分解に対する保護を提供することができることが確立された。

【0183】

実施例９
ＣＯＶＩＤ－１９ウイルスのアセトニトリル不活化
一組の実験では、生ＣＯＶＩＤ－１９ウイルスをアセトニトリルと混合して、最終濃度を５０％ｖ／ｖにした。アセトニトリルを有する溶液および有しない溶液を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２播種ストックに添加してから、ＶＥＲＯ Ｅ６細胞と共にインキュベートした。インキュベーションは、３７℃で４８時間だった。感染に成功した細胞を、４８時間のインキュベーション後に、スパイクタンパク質染色を使用して測定した。結果は、アセトニトリルを用いない場合、感染率は９０％だったことを示した。アセトニトリルを用いると、感染率はゼロで、未感染細胞と同等だった。実験を４回繰り返し、同じ結果を得た。こうした結果は、ＣＯＶＩＤ－１９ウイルスまたは他のウイルスと本発明の水混和性溶媒との接触がウイルスの不活化をもたらし、本明細書に記載の方法による生物試料の安全な処理を可能にすることを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A-4B】

【図5A-5C】

【図6A-6B】

【図7A-7C】

【図8】

【図9A-9B】

【国際調査報告】