特表 2023-522106 操作されたキャプシドを有するアデノ随伴ウイルス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-26

(54)【発明の名称】操作されたキャプシドを有するアデノ随伴ウイルス

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/35 20060101AFI20230519BHJP

   C07K 14/015 20060101ALI20230519BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230519BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230519BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230519BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230519BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20230519BHJP

【ＦＩ】

C12N15/35

C07K14/015 ZNA

C12N7/01

C12N5/10

A61K35/76

A61K48/00

A61P9/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022563387

(86)(22)【出願日】2021-04-19

(85)【翻訳文提出日】2022-11-28

(86)【国際出願番号】 US2021027979

(87)【国際公開番号】W WO2021216456

(87)【国際公開日】2021-10-28

(31)【優先権主張番号】63/012,703

(32)【優先日】2020-04-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521087782

【氏名又は名称】テナヤ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】リード， クリストファー エー．

(72)【発明者】

【氏名】チェン， ゼ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA37

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA37

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045EA20

4H045EA34

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、操作されたキャプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。特に本開示は、心臓細胞における形質導入効率の増加、細胞型選択性の増加、及び／又は他の望ましい特性を達成する、操作されたＡＡＶ９キャプシド、ＡＡＶ５／９キメラキャプシド、又は組み合わせキャプシドを有するＡＡＶ９ビリオンを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

親配列のＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位、及びＶＲ－ＶＩＩＩ部位のうちの１つ以上でバリアントポリペプチド配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、前記親配列が、配列番号４６３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む、キャプシドタンパク質。

【請求項2】

前記バリアントポリペプチド配列が、心臓栄養性（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｃ）バリアントポリペプチド配列である、請求項１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項3】

前記キャプシドタンパク質が、前記親配列の前記ＶＲ－ＩＶ部位にバリアントポリペプチドを含む、請求項１又は２に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項4】

前記ＶＲ－ＩＶ部位の前記バリアントポリペプチドが、配列：
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－を有し、
式中、
ａ）Ｘ_１は、Ｇ、Ｓ又はＶであり、
ｂ）Ｘ_２は、Ｙ、Ｑ又はＩであり、
ｃ）Ｘ_３は、Ｈ、Ｗ、Ｖ又はＩであり、
ｄ）Ｘ_４は、Ｋ又はＮであり、
ｅ）Ｘ_５は、Ｓ、Ｇ又はＩであり、
ｆ）Ｘ_６は、Ｇ又はＲであり、
ｇ）Ｘ_７は、Ａ、Ｐ又はＶであり、
ｈ）Ｘ_８は、Ａ又はＲであり、
ｉ）Ｘ_９は、Ｑ又はＤである（配列番号４７７）、請求項３に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項5】

前記ＶＲ－ＩＶ部位の前記バリアントポリペプチドが、配列番号６～１０４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項6】

前記ＶＲ－ＩＶ部位の前記バリアントポリペプチドが、ＧＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６）、ＶＩＩＫＳＧＡＡＱ（配列番号７）、ＧＹＨＫＩＧＡＡＱ（配列番号８）、ＳＱＶＮＧＲＰＲＤ（配列番号３３）及びＧＹＨＫＳＧＶＡＱ（配列番号９）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項7】

前記ＶＲ－ＩＶ部位の前記バリアントポリペプチドが、前記アミノ酸配列ＧＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６）、又はＧＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６）に対して最大で１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換を含む配列を含む、請求項３に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項8】

前記キャプシドタンパク質が、前記親配列の前記ＶＲ－Ｖ部位にバリアントポリペプチドを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項9】

前記ＶＲ－Ｖ部位の前記バリアントポリペプチドが、配列：
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－を有し、
式中、
ａ）Ｘ_１は、Ｓ、Ｌ、Ｈ、Ｎ、又はＡであり、
ｂ）Ｘ_２は、Ｔ、Ｍ、Ｋ、Ｇ、又はＮであり、
ｃ）Ｘ_３は、Ｓ、Ｔ、Ｍ又はＩであり、
ｄ）Ｘ_４は、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、又はＮであり、
ｅ）Ｘ_５は、Ｆ、Ｓ、Ｐ又はＬであり、
ｆ）Ｘ_６は、Ｉ、Ｖ、又はＴである（配列番号４７４）、請求項８に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項10】

前記ＶＲ－Ｖ部位の前記バリアントポリペプチドが、配列番号１０５～２０３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項11】

前記ＶＲ－Ｖ部位の前記バリアントポリペプチドが、ＬＮＳＭＬＩ（配列番号１０５）、ＮＧＭＳＦＴ（配列番号１０６）、ＨＫＴＦＳＩ（配列番号１０７）、及びＳＭＳＮＦＶ（配列番号１０８）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項12】

前記ＶＲ－Ｖ部位の前記バリアントポリペプチドが、前記アミノ酸配列ＬＮＳＭＬＩ（配列番号１０５）、又はＬＮＳＭＬＩ（配列番号１０５）に対して最大で１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換を含む配列を含む、請求項８に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項13】

前記キャプシドタンパク質が、前記親配列のＶＲ－ＶＩＩ部位にバリアントポリペプチドを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項14】

前記ＶＲ－ＶＩＩ部位の前記バリアントポリペプチドが、配列：
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－を有し、
式中、
ａ）Ｘ_１は、Ｖ、Ｌ、Ｑ、Ｃ、又はＲであり、
ｂ）Ｘ_２は、Ｓ、Ｈ、Ｇ、Ｃ、又はＤであり、
ｃ）Ｘ_３は、Ｙ、Ｓ、Ｌ、Ｇ、又はＮであり、
ｄ）Ｘ_４は、Ｓ、Ｌ、Ｈ、Ｑ、又はＮであり、
ｅ）Ｘ_５は、Ｖ、Ｉ、又はＲである（配列番号４７５）、請求項１３に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項15】

前記ＶＲ－ＶＩＩ部位の前記バリアントポリペプチドが、配列番号２０４～３０２から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項16】

前記ＶＲ－ＶＩＩ部位の前記バリアントポリペプチドが、ＲＧＮＱＶ（配列番号２０４）、ＶＳＬＮＲ（配列番号２０５）、ＣＤＹＳＶ（配列番号２０６）、及びＱＨＧＨＩ（配列番号２０７）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項17】

前記ＶＲ－ＶＩＩ部位の前記バリアントポリペプチドが、前記アミノ酸配列ＲＧＮＱＶ（配列番号２０４）、又はＲＧＮＱＶ（配列番号２０４）に対して最大で１、２、若しくは３つのアミノ酸置換を含む配列を含む、請求項１３に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項18】

前記キャプシドタンパク質が、前記親配列の前記ＶＲ－ＶＩＩ部位にバリアントポリペプチドを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項19】

前記ＶＲ－ＶＩＩＩ部位の前記バリアントポリペプチドが、配列：
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－を有し、
式中、
ａ）Ｘ_１は、Ｓ、Ｎ、又はＡであり、
ｂ）Ｘ_２は、Ｖ、Ｍ、Ｎ、又はＡであり、
ｃ）Ｘ_３は、Ｙ、Ｖ、Ｓ、又はＧであり、
ｄ）Ｘ_４は、Ｙ、Ｔ、Ｍ、Ｇ、又はＮである（配列番号４７６）、請求項１８に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項20】

前記ＶＲ－ＶＩＩＩ部位の前記バリアントポリペプチドが、配列番号３０３～４０１から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項21】

前記ＶＲ－ＶＩＩＩ部位の前記バリアントポリペプチドが、ＡＮＹＧ（配列番号３０５）、ＮＶＳＹ（配列番号３０３）、ＳＭＶＮ（配列番号３０４）、及びＮＶＧＴ（配列番号３０６）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項22】

前記ＶＲ－ＶＩＩＩ部位の前記バリアントポリペプチドが、前記アミノ酸配列ＡＮＹＧ（配列番号３０５）、又はＡＮＹＧ（配列番号３０５）に対して最大で１つ若しくは２つのアミノ酸置換を含む配列を含む、請求項１８に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項23】

前記ＶＲ－ＶＩＩＩ部位の前記バリアントポリペプチドが、前記アミノ酸配列ＮＶＳＹ（配列番号３０３）、又はＮＶＳＹ（配列番号３０３）に対して最大で１つ若しくは２つのアミノ酸置換を含む配列を含む、請求項１８に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項24】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４０２～４１０から選択される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項25】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４０２と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項26】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４０３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項27】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４０４と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項28】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４０６と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項29】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４０９と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項30】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４８３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項31】

前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ５／ＡＡＶ９キメラキャプシドタンパク質である、請求項１～２３のいずれか一項に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項32】

前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質からの少なくとも１つのセグメントを含む、請求項３１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項33】

前記キャプシドタンパク質が、
ａ）配列番号４１１又は配列番号４１２と少なくとも９５％同一の配列を含む第１のセグメント、
ｂ）配列番号４１３又は配列番号４１４と少なくとも９５％同一の配列を含む第２のセグメント、
ｃ）配列番号４１５又は配列番号４１６と少なくとも９５％同一の配列を含む第３のセグメント、
ｄ）配列番号４１７又は配列番号４１８と少なくとも９５％同一の配列を含む第４のセグメント、
ｅ）配列番号４１９又は配列番号４２０と少なくとも９５％同一の配列を含む第５のセグメント、を含み、
ここで、少なくとも１つのセグメントがＡＡＶ５キャプシドタンパク質由来であり、少なくとも１つのセグメントがＡＡＶ９キャプシドタンパク質由来である、請求項３１又は３２に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項34】

前記キメラキャプシドタンパク質が、配列番号４４５～４６２から選択される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項35】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４５７と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項36】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４５９と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項37】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４４５と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項38】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４４６と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項39】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４４７と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項40】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４４８と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項41】

配列番号４６３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシドタンパク質。

【請求項42】

バリアントポリペプチド配列が、心臓栄養性バリアントポリペプチド配列である、請求項４１に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項43】

前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質からの少なくとも１つのセグメントを含む、請求項４１又は４２に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項44】

前記キャプシドタンパク質が、
ｆ）配列番号４１１又は配列番号４１２と９５％同一の配列を含む第１のセグメント、
ｇ）配列番号４１３又は配列番号４１４と９５％同一の配列を含む第２のセグメント、
ｈ）配列番号４１５又は配列番号４１６と９５％同一の配列を含む第３のセグメント、
ｉ）配列番号４１７又は配列番号４１８と９５％同一の配列を含む第４のセグメント、
ｊ）配列番号４１９又は配列番号４２０と９５％同一の配列を含む第５のセグメント、を含み、
ここで、少なくとも１つのセグメントが、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質由来であり、少なくとも１つのセグメントが、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質由来である、請求項４１～４３のいずれか一項に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項45】

前記キメラキャプシドタンパク質が、配列番号４２１～４４４から選択される配列と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項46】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４３４と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項47】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４３８と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項48】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４４１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載のキャプシドタンパク質。

【請求項49】

ａ）請求項１～４８のいずれか一項に記載のキャプシドタンパク質、及び
ｂ）１つ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。

【請求項50】

前記ｒＡＡＶビリオンが、前記親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、心臓細胞における形質導入効率の増加を示す、請求項４９に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項51】

前記ｒＡＡＶビリオンが、前記親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）細胞において増加した形質導入効率を示す、請求項４９又は５０に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項52】

前記ｒＡＡＶビリオンが、前記親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、ヒト心臓線維芽細胞（ｈＣＦ）細胞において増加した形質導入効率を示す、請求項４９～５１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項53】

前記ヒト心臓線維芽細胞が、前記心臓の左心室に位置する、請求項５２に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項54】

前記ｒＡＡＶビリオンが、１００，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において少なくとも２倍増加した形質導入効率を示す、請求項５１に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項55】

前記ｒＡＡＶビリオンが、７５，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において少なくとも２倍増加した形質導入効率を示す、請求項５１に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項56】

前記ｒＡＡＶビリオンが、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、少なくとも２倍増加した心臓形質導入効率を示し、前記マウスが、２．５Ｅ＋１１ｖｇ／マウスのビリオン投薬量で注射される、請求項４９～５５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項57】

前記ｒＡＡＶビリオンが、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、少なくとも１．５倍増加した心臓形質導入効率を示し、前記マウスが、２Ｅ＋１１ｖｇ／マウスのビリオン投薬量で注射される、請求項４９～５５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項58】

前記ｒＡＡＶビリオンが、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、少なくとも２倍増加した心臓形質導入効率を示し、前記マウスが、１Ｅ＋１１ｖｇ／マウスのビリオン投薬量を注射される、請求項４９～５５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項59】

前記ｒＡＡＶビリオンが、前記親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、肝細胞における減少した形質導入効率を示す、請求項４９～５８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項60】

前記ｒＡＡＶビリオンが、前記親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、改善されたＮＡｂ回避を示す、請求項４９～５９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項61】

前記ｒＡＡＶビリオンが、肝細胞よりも心臓細胞に対する前記ｒＡＡＶビリオンの増加した選択性を示す、請求項４９～６０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項62】

前記ｒＡＡＶビリオンが、肝細胞よりもｉＰＳ－ＣＭ細胞に対する前記ｒＡＡＶビリオンの増加した選択性を示す、請求項４９～６１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項63】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４０４と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む、請求項４９～６２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項64】

前記キャプシドタンパク質が、配列番号４８３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む、請求項４９～６２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項65】

請求項４９～６４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。

【請求項66】

請求項１～６４のいずれか一項に記載のキャプシドタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項67】

心臓細胞を形質導入する方法であって、前記心臓細胞を、請求項４９～６４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオンと接触させることを含み、前記ｒＡＡＶビリオンが前記心臓細胞を形質導入する、方法。

【請求項68】

前記心臓細胞が、心筋細胞である、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、前記細胞において増加した形質導入効率を示す、請求項６７又は６８に記載の方法。

【請求項70】

前記ｒＡＡＶビリオンが、７５，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、前記細胞において少なくとも２倍増加した形質導入効率を示す、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

１つ以上の遺伝子産物を心臓細胞に送達する方法であって、前記心臓細胞を、請求項４９～６４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオンと接触させることを含む、方法。

【請求項72】

前記心臓細胞が、心筋細胞である、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

心臓病態の治療を必要とする対象における心臓病態を治療する方法であって、治療有効量の請求項４９～６４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン又は請求項６１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶビリオンが心臓組織を形質導入する、方法。

【請求項74】

前記１つ以上の遺伝子産物が、ＭＹＢＰＣ３、ＤＷＯＲＦ、ＫＣＮＨ２、ＴＲＰＭ４、ＤＳＧ２、ＰＫＰ２、及び／又はＡＴＰ２Ａ２を含む、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記１つ以上の遺伝子産物が、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＥＰＧ５、ＥＶＣ、ＥＶＣ２、ＦＢＮ１、ＮＦ１、ＳＣＮ５Ａ、ＳＯＳ１、ＮＰＲ１、ＥＲＢＢ４、ＶＩＰ、ＭＹＨ７、及び／又はＣａｓ９を含む、請求項７３に記載の方法。

【請求項76】

前記１つ以上の遺伝子産物が、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ｍｉＲ－１３３、及び／又はＭＥＳＰ１を含む、請求項７３に記載の方法。

【請求項77】

請求項６７に記載の医薬組成物及び使用説明書を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月２０日に出願された米国仮出願番号第６３／０１２，７０３号に対する優先権の利益を主張するものであり、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、一般に、アデノ随伴ウイルスベクターによる遺伝子療法に関する。特に本開示は、操作されたキャプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルスビリオンに関する。

【0003】

配列表への言及
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に出願されており、．ｔｘｔ形式の電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルには、２０２１年４月１３日に作成された約４７９キロバイトのサイズの「ＴＥＮＡ＿０１９＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の配列表が含まれている。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子療法及びその他の生物医学応用に有望である。特に、ＡＡＶは、インビトロ及びインビボの両方で、様々な組織及び細胞に遺伝子産物を送達するために使用することができる。ＡＡＶのキャプシドタンパク質は、主にＡＡＶベクターの免疫原性及び指向性を決定する。

【0005】

心臓組織については、全身送達後に心臓を形質導入する能力があるため、ＡＡＶサブタイプ９（ＡＡＶ９）が好ましいＡＡＶベクターである。ＡＡＶ９は心臓への適度な遺伝子導入を達成できるが、ベクターの大半は肝臓に輸送される。更に、心臓における遺伝子導入の治療レベルを達成するためには、比較的高用量の全身投与が必要であり、全身炎症、ひいては毒性につながる可能性がある。

【0006】

心臓指向性の改善、及び任意選択的には肝臓よりも心臓組織の選択性の改善を達成する、操作されたキャプシドタンパク質を有するアデノ随伴ウイルスの開発に対するニーズがある。本開示は、心臓組織及び／又は細胞型を、野生型ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンよりもより効率的及び／又はより選択的に形質導入することができるｒＡＡＶビリオンを形成する、ＡＡＶ９キャプシド及び／又はキメラＡＡＶ５／ＡＡＶ９キャプシドのバリアントを提供するものであり、これは安全で有効な心臓遺伝子療法に使用することができる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

一態様では、本開示は、親配列のＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位、及びＶＲ－ＶＩＩＩ部位のうちの１つ以上でバリアントポリペプチド配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシドタンパク質を提供し、親配列は、配列番号４６３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチド配列は、心臓栄養性（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｃ）バリアントポリペプチド配列である。

【0008】

いくつかの実施形態では、本開示のキャプシドタンパク質は、親配列のＶＲ－ＩＶ部位にバリアントポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位のバリアントポリペプチドは、配列：
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－を有し、
式中、Ｘ_１は、Ｇ、Ｓ又はＶであり、Ｘ_２は、Ｙ、Ｑ又はＩであり、Ｘ_３は、Ｈ、Ｗ、Ｖ又はＩであり、Ｘ_４は、Ｋ又はＮであり、Ｘ_５は、Ｓ、Ｇ又はＩであり、Ｘ_６は、Ｇ又はＲであり、Ｘ_７は、Ａ、Ｐ又はＶであり、Ｘ_８は、Ａ又はＲであり、Ｘ_９は、Ｑ又はＤである（配列番号４７７）。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位のバリアントポリペプチドは、配列番号６～１０４から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位のバリアントポリペプチドは、ＧＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６）、ＶＩＩＫＳＧＡＡＱ（配列番号７）、ＧＹＨＫＩＧＡＡＱ（配列番号８）、ＳＱＶＮＧＲＰＲＤ（配列番号３３）及びＧＹＨＫＳＧＶＡＱ（配列番号９）から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位のバリアントポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６）、又はＧＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６）に対して最大で１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換を含む配列を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、本開示のキャプシドタンパク質は、親配列のＶＲ－Ｖ部位にバリアントポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－Ｖ部位のバリアントポリペプチドは、配列：
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－を有し、
式中、Ｘ_１は、Ｓ、Ｌ、Ｈ、Ｎ、又はＡであり、Ｘ_２は、Ｔ、Ｍ、Ｋ、Ｇ、又はＮであり、Ｘ_３は、Ｓ、Ｔ、Ｍ又はＩであり、Ｘ_４は、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、又はＮであり、Ｘ_５は、Ｆ、Ｓ、Ｐ、又はＬであり、Ｘ_６は、Ｉ、Ｖ、又はＴである（配列番号４７４）。いくつかの実施形態では、ＶＲ－Ｖ部位のバリアントポリペプチドは、配列番号１０５～２０３から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－Ｖ部位のバリアントポリペプチドは、ＬＮＳＭＬＩ（配列番号１０５）、ＮＧＭＳＦＴ（配列番号１０６）、ＨＫＴＦＳＩ（配列番号１０７）、及びＳＭＳＮＦＶ（配列番号１０８）から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－Ｖ部位のバリアントポリペプチドは、アミノ酸配列ＬＮＳＭＬＩ（配列番号１０５）、又はＬＮＳＭＬＩ（配列番号１０５）に対して最大で１、２、３、若しくは４つのアミノ酸置換を含む配列を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、本開示のキャプシドタンパク質は、親配列のＶＲ－ＶＩＩ部位にバリアントポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩ部位のバリアントポリペプチドは、配列：
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－を有し、
式中、Ｘ_１は、Ｖ、Ｌ、Ｑ、Ｃ、又はＲであり、Ｘ_２は、Ｓ、Ｈ、Ｇ、Ｃ、又はＤであり、Ｘ_３は、Ｙ、Ｓ、Ｌ、Ｇ、又はＮであり、Ｘ_４は、Ｓ、Ｌ、Ｈ、Ｑ、又はＮであり、Ｘ_５は、Ｖ、Ｉ、又はＲである（配列番号４７５）。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩ部位のバリアントポリペプチドは、配列番号２０４～３０２から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩ部位のバリアントポリペプチドは、ＲＧＮＱＶ（配列番号２０４）、ＶＳＬＮＲ（配列番号２０５）、ＣＤＹＳＶ（配列番号２０６）、及びＱＨＧＨＩ（配列番号２０７）から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩ部位のバリアントポリペプチドは、アミノ酸配列ＲＧＮＱＶ（配列番号２０４）、又はＲＧＮＱＶ（配列番号２０４）に対して最大で１、２、若しくは３つのアミノ酸置換を含む配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、本開示のキャプシドタンパク質は、親配列のＶＲ－ＶＩＩ部位にバリアントポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位のバリアントポリペプチドは、配列：
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－を有し、
式中、Ｘ_１は、Ｓ、Ｎ、又はＡであり、Ｘ_２は、Ｖ、Ｍ、Ｎ、又はＡであり、Ｘ_３は、Ｙ、Ｖ、Ｓ、又はＧであり、Ｘ_４は、Ｙ、Ｔ、Ｍ、Ｇ、又はＮである（配列番号４７６）。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位のバリアントポリペプチドは、配列番号３０３～４０１から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位のバリアントポリペプチドは、ＡＮＹＧ（配列番号３０５）、ＮＶＳＹ（配列番号３０３）、ＳＭＶＮ（配列番号３０４）、及びＮＶＧＴ（配列番号３０６）から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位のバリアントポリペプチドは、アミノ酸配列ＡＮＹＧ（配列番号３０５）、又はＡＮＹＧ（配列番号３０５）に対して最大で１つ又は２つのアミノ酸置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位のバリアントポリペプチドは、アミノ酸配列ＮＶＳＹ（配列番号３０３）、又はＮＶＳＹ（配列番号３０３）に対して最大で１つ又は２つのアミノ酸置換を含む配列を含む。

【0012】

一態様では、本開示は、親配列のＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位、及びＶＲ－ＶＩＩＩ部位のうちの１つ以上でバリアントポリペプチド配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシドタンパク質を提供し、親配列は、配列番号４６３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４０２～４１０から選択される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４０２と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４０３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４０４と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４０６と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４０９と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、４８２と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、４８３に対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、４８４に対し、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、４８５に対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５／ＡＡＶ９キメラキャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質からの少なくとも１つのセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質が、ａ）配列番号４１１又は配列番号４１２と９５％同一の配列を含む第１のセグメント、ｂ）配列番号４１３又は配列番号４１４と９５％同一の配列を含む第２のセグメント、ｃ）配列番号４１５又は配列番号４１６と９５％同一の配列を含む第３のセグメント、ｄ）配列番号４１７又は配列番号４１８と９５％同一の配列を含む第４のセグメント、ｅ）配列番号４１９又は配列番号４２０と９５％同一の配列を含む第５のセグメント、を含み、ここで、少なくとも１つのセグメントがＡＡＶ５キャプシドタンパク質由来であり、少なくとも１つのセグメントがＡＡＶ９キャプシドタンパク質由来である。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質は、配列番号４４５～４６２から選択される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４５７と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４５９と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４４５と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４４６と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４４７と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４４８と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0014】

一態様では、本開示は、配列番号４６３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシドタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチド配列は、心臓栄養性バリアントポリペプチド配列である。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質からの少なくとも１つのセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、
ａ）配列番号４１１又は配列番号４１２と少なくとも９５％同一の配列を含む第１のセグメント、
ｂ）配列番号４１３又は配列番号４１４と少なくとも９５％同一の配列を含む第２のセグメント、
ｃ）配列番号４１５又は配列番号４１６と少なくとも９５％同一の配列を含む第３のセグメント、
ｄ）配列番号４１７又は配列番号４１８と少なくとも９５％同一の配列を含む第４のセグメント、
ｅ）配列番号４１９又は配列番号４２０と９５％同一の配列を含む第５のセグメント、を含み、
ここで、少なくとも１つのセグメントが、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質由来であり、少なくとも１つのセグメントは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質由来である。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質は、配列番号４２１～４４４から選択される配列と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４３４と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４３８と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４４１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0015】

一態様では、本開示は、本開示のキャプシドタンパク質及び１つ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、配列番号４０４と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、配列番号４８３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、心臓細胞において増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、心臓細胞は、心臓の左心室に位置する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）細胞において増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、ヒト心臓線維芽細胞（ｈＣＦ）細胞において増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１００，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において少なくとも２倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、７５，０００の多重性感染（ＭＯＩ）において、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において少なくとも２倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、少なくとも２倍増加した心臓形質導入効率を示し、マウスは、２．５Ｅ＋１１ｖｇ／マウスのビリオン用量を注射される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、少なくとも１．５倍増加した心臓形質導入効率を示し、マウスは、ビリオン用量の２Ｅ＋１１ｖｇ／マウスを注射される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、少なくとも２倍増加した心臓形質導入効率を示し、マウスは、１Ｅ＋１１ｖｇ／マウスのビリオン用量を注射される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、肝細胞における減少した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、改善されたＮＡｂ回避を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、肝細胞よりも心臓細胞に対するｒＡＡＶビリオンの増加した選択性を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、肝細胞よりもｉＰＳ－ＣＭ細胞に対するｒＡＡＶビリオンの増加した選択性を示す。

【0016】

一態様では、本開示は、本開示のｒＡＡＶビリオン及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。

【0017】

一態様では、本開示は、本開示のキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４０４と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、キャプシドタンパク質をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４８３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、キャプシドタンパク質をコードする配列を含む。

【0018】

一態様では、本開示は、心臓細胞を本開示のｒＡＡＶビリオンと接触させることを含む、心臓細胞を形質導入する方法を提供し、ｒＡＡＶビリオンが心臓細胞を形質導入する。いくつかの実施形態では、心臓細胞は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、細胞において増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、７５，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質配列を含むＡＡＶビリオン（ｖｉｒｏｎ）と比較して、細胞において少なくとも２倍増加した形質導入効率を示す。

【0019】

一態様では、本開示は、１つ以上の遺伝子産物を心臓細胞に送達する方法であって、心臓細胞を本開示のｒＡＡＶビリオンと接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、心臓細胞は心筋細胞である。

【0020】

一態様では、本開示は、心臓病態の治療を必要とする対象において心臓病態を治療する方法であって、治療有効量の本開示のｒＡＡＶビリオン又は本開示の医薬組成物を対象に投与することを含み、ｒＡＡＶビリオンが心臓組織を形質導入する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１つ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子産物は、ＭＹＢＰＣ３、ＤＷＯＲＦ、ＫＣＮＨ２，ＴＲＰＭ４、ＤＳＧ２、ＰＫＰ２、及び／又はＡＴＰ２Ａ２を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子産物は、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＥＰＧ５、ＥＶＣ、ＥＶＣ２、ＦＢＮ１、ＮＦ１、ＳＣＮ５Ａ、ＳＯＳ１、ＮＰＲ１、ＥＲＢＢ４、ＶＩＰ、ＭＹＨ７、及び／又はＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子産物は、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ｍｉＲ－１３３、及び／又はＭＥＳＰ１を含む。

【0021】

一態様では、本開示は、本開示の医薬組成物及び使用説明書を含むキットを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】選択されたＡＡＶ９可変領域（ＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－Ｖ、ＶＲ－ＶＩＩ、及びＶＲ－ＶＩＩＩ部位）中のアミノ酸を強調するＡＡＶ９キャプシドを示す。

【図2】指向性進化法選択戦略及びバリアント特性評価の概略図を示す。ライブラリの生成後、各ライブラリはｈｉＰＳＣ－ＣＭで１ラウンド、マウスモデルで２ラウンド選択を受けた。各ライブラリからの上位バリアントを、ウイルスの全身送達後のインビトロ形質導入（ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）及びインビボ形質導入（心臓及び肝臓）の評価を通して特徴付けした。上位バリアントを、ヒトＮＡｂ阻害を回避する能力についてスクリーニングした。

【図3A】３ラウンドのライブラリスクリーニング後のＶＲ改変ライブラリのグラフ表現を示す。親ウイルスライブラリで３ラウンドの選択後におけるＶＲ－ＩＶ（図３Ａ）、ＶＲ－Ｖ（図３Ｂ）、ＶＲ－ＶＩＩ（図３Ｃ）及びＶＲ－ＶＩＩＩ（図３Ｄ）のライブラリ複雑度のグラフ表現を示し、画像中の各読み取りデータは、画像の中の１ピクセルと相関する。タンパク質配列は、配列の疎水性に基づいて固有の色を与えられ、同じ配列の読み取りデータは一緒にクラスターを形成する。

【図3B】同上。

【図3C】同上。

【図3D】同上。

【図4A】指向性進化法の後にＶＲ－ＩＶ（図４Ａ）、ＶＲ－Ｖ（図４Ｂ）、ＶＲ－ＶＩＩ（図４Ｃ）及びＶＲ－ＶＩＩＩ（図４Ｄ）部位で同定されたタンパク質モチーフを示す。

【図4B】同上。

【図4C】同上。

【図4D】同上。

【図5】ＡＡＶ ＶＲ－ＩＶ改変バリアントがＡＡＶ９と比較して優れたｈｉＰＳＣ－ＣＭ形質導入を示すことを示す。ヒトＩＰＳＣ由来の心筋細胞に、遍在的に発現するＧＦＰレポーターをパッケージングする、ＡＡＶ９又は様々な進化したキャプシドバリアントを１００，０００のＭＯＩで感染させた。感染の３日後、フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現を定量した。ＣＲ９－０１（１２９倍）、ＣＲ９－０７（１６倍）、及びＣＲ９－１３（９倍）は、ＡＡＶ９と比較して有意に改善された形質導入を示したが、一方ＣＲ９－１０、ＣＲ９－１３、及びＣＲ９－１４は形質導入のわずかな増加を示した。図の下半分は、ＡＡＶ９及び形質導入の劇的な増加を示すＣＲ９－０１の代表的な画像を示す。

【図6A】新規のＡＡＶバリアントのインビボでの特性評価を示す。ＡＡＶ９：ＣＡＧ－ＧＦＰ又は新規キャプシドにパッケージングされたＣＡＧ－ＧＦＰを、２．５×１０１１ｖｇ／マウス（群当たりｎ＝２～３マウス）でＣ５７ＢＬ／６Ｊに後眼窩注射した。図６Ａは、ＣＲ９－０７、ＣＲ９－１０、ＣＲ９－１３、及びＣＲ９－１４が、ＥＬＩＳＡにより決定されるとき、ＡＡＶ９よりも有意に高い心臓形質導入を示したことを示す（ｐ＜０．０５、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。図６Ｂは、上位形質導入バリアントの心臓の代表的な断面を示す。図６Ｃは、ＣＲ９－１０及びＣＲ９－１４が、ＡＡＶ９と比較して、肝臓指向性が有意に減少したことを示すことを示す（ｐ＜０．０３、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。図６Ｄは、上位バリアントの肝臓の代表的なＩＨＣ画像を示す。

【図6B】同上。

【図6C】同上。

【図6D】同上。

【図7A】プールされたヒトＩｇＧに対するＮＡｂ阻害に対する新規のＡＡＶバリアントの感受性を示す。図７Ａは、０～６００μｇ／ｍＬの範囲のプールされたヒトＩｇＧ（約２０００人の患者）の様々な用量での中和抗体の回避を評価するための実験計画の図解である。図７Ｂは、３００μｇ／ｍＬを超えるＩｇＧ濃度でのＣＲ９－０７及びＣＲ９－１３の中和の減少を示す用量反応曲線を示す。図７Ｃは、ＣＲ９－０７及びＣＲ９－１３が、ＡＡＶ９と比較して中和を有意に減少させたことを示す（ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）

【図7B】同上。

【図7C】同上。

【図8】ＤＮＡシャッフリングによるＡＡＶ５／９キメラライブラリ生成の視覚的描写を示す。ＡＡＶ９は、ＡＡＶ５との相同性を改善するためにコドン改変され、両方のＣａｐ遺伝子は、ＤＮａｓｅＩ消化によって断片化され、２つのＣａｐ遺伝子間の部分的な相同性に基づいてＰＣＲを介して再構築された。

【図9】１ラウンドのインビボスクリーニング後に、ＡＡＶ５／９キメラライブラリのライブラリの複雑度が有意に減少したことを示す。個々のＡＡＶキメラの配列をグラフで示した。

【図10A】上位ＡＡＶ５／９キメラのインビトロ特性評価を示す。図１０Ａは、７５，０００のＭＯＩでのｈｉＰＳＣ－ＣＭの形質導入効率を示す。ＺＣ４４は、ＡＡＶ９と比較して、改善されたｈｉＰＳＣ－ＣＭ形質導入を示す。図１０Ｂは、１ｍｇ／ｍＬのプールされたヒトＩｇＧでの上位ＡＡＶ５／９キメラのＮＡｂ回避の評価を示す。ＺＣ４４は、ＡＡＶ９と比較して、増強されたＮＡｂの回避を示す。

【図10B】同上。

【図11】キメラＡＡＶバリアントのインビボでの特性評価を示す。ＡＡＶ９：ＣＡＧ－ＧＦＰ又はキメラキャプシドにパッケージングされたＣＡＧ－ＧＦＰを、２×１０１１ｖｇ／マウス（群当たりｎ＝３マウス）でＣ５７ＢＬ／６Ｊに後眼窩注射した。注射の１４日後、心臓（図１１Ａ）及び肝臓（図１１Ｂ）を採取し、トランスフェクション効率及び特異性を評価するためにＧＦＰ発現を評価した。ＺＣ４０及びＺＣ４７は、野生型ＡＡＶ９と比較して、改善された心臓特異性を示した。

【図12】上位のＡＡＶ５／９キメラ及びＡＡＶ９ ＶＲ改変バリアントを組み合わせることによって、組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｙ）ＡＡＶバリアントを生成する様子を示す。

【図13】ＶＲ改変及び組み合わせＡＡＶキャプシドバリアントの製造可能性の評価を示す。ＡＡＶキャプシドバリアントの製造可能性を評価するために、中程度のベクター生産を実施した。ＣＲ９－０７，ＣＲ９－１０、及びＴＮ４０－１４は、ＡＡＶ９と比較して、製造可能性を改善した。

【図14】組み合わせＡＡＶバリアントが、ｈｉＰＳＣ－ＣＭ形質導入を有意に改善していることを示す。ヒトＩＰＳＣ由来心筋細胞に、遍在的に発現するＧＦＰレポーターをパッケージングする、ＡＡＶ９又は様々な組み合わせキャプシドバリアントを１００，０００のＭＯＩで感染させた。感染の５日後、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５細胞イメージングリーダーを使用して、ＧＦＰ発現を定量した。ＴＮ４４－０７及びＴＮ４７－０７は、ＡＡＶ９と比較して、ｈｉＰＳＣ－ＣＭの形質導入を有意に改善した（＞１５倍）。

【図15A】新規のＡＡＶバリアントのインビボ特性評価の結果を示す。ＡＡＶ９：ＣＡＧ－ＧＦＰ又は新規キャプシドにパッケージングされたＣＡＧ－ＧＦＰを、１×１０１１ｖｇ／マウス（群当たりｎ＝４マウス）でＣ５７ＢＬ／６Ｊタイプを作製するにおいて後眼窩注射した。注射１４日後、心臓及び肝臓を採取し、ＧＦＰの発現を評価した。図１５Ａは、心臓における各キャプシドバリアントの形質導入効率を示す。図１５Ｂは、肝臓における各キャプシドバリアントの形質導入効率を示す。図１５Ｃは、心臓における形質導入効率／肝臓における形質導入効率の比を示す。ＴＮ４４－０７及びＴＮ４７－１０は、ＡＡＶ９と比較して強化された心臓形質導入を示し、一方ＴＮ４７－１４は肝臓から脱標的化され、ＡＡＶ９よりも有意に高い心臓対肝臓形質導入比を有した。

【図15B】同上。

【図15C】同上。

【図16】上位組み合わせキャプシドバリアントのヒトＮＡｂ回避の評価を示す。全ての組み合わせＡＡＶキャプシドバリアントは、プールされたヒトＩｇＧ中の中和抗体からの回避の改善を示し、同時にＴＮ４４－０７が最もステルスなキャプシドでありＡＡＶ９と比較してＮＡｂ中和の非常に有意な減少を有する（ｐ＝０．０００２、ｔ検定、ウェルチ補正）。

【図17A】標準的なＡＡＶ９キャプシドに対して基準にされたカニクイザルの左心室における、異なる操作されたキャプシドを有するｒＡＡＶビリオンの相対的形質導入を示す。２つのキャプシドバリアントＴＮ３及びＴＮ６は、左心室の形質導入において有意な改善を示した。

【図17B】肝臓におけるキャプシドバリアントの形質導入プロファイルを示す。キャプシドバリアントの大部分は、ＡＡＶ９と比較して減少した肝臓指向性を示す。

【図17C】ＡＡＶ９キャプシドに対して正規化された、相対的な心臓対肝臓の形質導入比を示す。ＴＮ３は、ＡＡＶ９と比較して、心臓対肝臓の特異性が５倍増加したことが明らかとなった。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。特に、本開示は、操作されたキャプシドタンパク質（キメラキャプシドタンパク質を含む）、それらを同定する方法、及びそれらを使用する方法を提供する。本明細書に開示される新しいキャプシドタンパク質を同定する方法は、キメラキャプシドタンパク質を含む、ＡＡＶの任意の血清型に対して広範な適用可能性を有する。更に、これらは、本方法又は他の方法からの変異を有するキャプシドタンパク質を繰り返し改善するために適用できる。一般に、本開示の方法は、ｃａｐ遺伝子ポリヌクレオチドの形態のＡＡＶキャプシドの無作為化又は半無作為化ライブラリの調製、このようなキャプシドを含むＡＡＶビリオンの調製（ｃａｐ遺伝子ライブラリをＡＡＶゲノムに組み込むか又はパッケージング系統にトランスフェクトされたプラスミド上などでトランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）提供するかのいずれかによって）、ＡＡＶビリオンのポジティブ又はネガティブ選択、及びシーケンシングのためのｃａｐ遺伝子回収に関する。いくつかの実施形態では、回収及びシーケンシングは、ナノポアシーケンシングを含む。他のハイスループット又は次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法を使用してもよい。

【0024】

いくつかの実施形態では、本開示は、
ａ）本明細書に記載のキャプシドタンパク質及び
ｂ）１つ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸、を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。

【0025】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオンは、本明細書に開示されるＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオンは、本明細書に開示されるキメラＡＡＶ５／ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオンは、本明細書に開示される組み合わせキャプシドタンパク質を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、以下に示すように、配列番号１と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む。ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、並びにＶＲ部位（ＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－Ｖ、ＶＲ－ＶＩＩ、及びＶＲ－ＶＩＩＩ）のＮ末端残基は、以下の完全長ＶＰ１（配列番号１）の配列に示されている。

【化1】

（配列番号１）

【0027】

ＶＲ部位におけるバリアントポリペプチド配列を有するキャプシドタンパク質
一態様では、本開示は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を提供し、キャプシドタンパク質は、親配列の１つ以上の部位で親配列に関するバリアントポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、親配列の１つ以上の部位はＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位、及びＶＲ－ＶＩＩＩ部位からなる群から選択される。上記の配列番号１で標識されているように、ＶＲ－ＩＶ部位は、親配列の残基４５２と４６０の間にあり（「ＮＧＳＧＱＮＱＱＴ」、配列番号２）、ＶＲ－Ｖ部位は、親配列の残基４９７と５０２の間にあり（「ＮＮＳＥＦＡ」、配列番号３）、ＶＲ－ＶＩＩ部位は、親配列の残基５４９と５５３の間にあり（「ＧＲＤＮＶ」配列番号４）、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位は、親配列の残基５８６と５８９の間にある（「ＳＡＱＡ」配列番号５）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、ＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位、及び／又はＶＲ－ＶＩＩＩ部位を除いて配列番号１と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、親配列のＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位、及びＶＲ－ＶＩＩＩ部位のうちの１つ以上でバリアントポリペプチド配列を含み、親配列は、配列番号４６３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む。（配列番号４６３では、「Ｘ」と標識されたアミノ酸残基は、配列同一性の計算から除外される。）

【0028】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、合理的に設計され、変異誘発によって導入され、又は１つ以上の部位でランダムコドン使用頻度を有する配列のライブラリを生成することによって無作為化される、いずれかのバリアントポリペプチド配列を含む。本開示のキャプシドタンパク質は、実施例に示されるがこれに限定されない、指向性進化法によって富化され、その後にシーケンシングが行われる同定された任意のバリアントポリペプチド配列を含む。任意の特定の置換部位に限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位、及びＶＲ－ＶＩＩＩ部位からなる群から選択される１つ以上の部位は、本明細書に記載されるアミノ酸置換を有する。

【0029】

いくつかの実施形態では、本開示のキャプシドタンパク質は、ＶＲ－ＩＶ部位にバリアントポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位全体（「ＮＧＳＧＱＮＱＱＴ」、配列番号２）が、式：
－（Ｘ）_ｎ－のペプチドで置換され、
式中、ｎは、７～１１であり、Ｘは、２０個の標準アミノ酸（配列番号４７８）のうちのいずれかを表す。

【0030】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－である。

【0031】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－であり、
式中、Ｘ_１はＧ、Ｓ若しくはＶであり、Ｘ_２はＹ、Ｑ若しくはＩであり、Ｘ_３はＨ、Ｗ、Ｖ、若しくはＩであり、Ｘ_４はＫ若しくはＮであり、Ｘ_５はＳ、Ｇ若しくはＩであり、Ｘ_６はＧ若しくはＲであり、Ｘ_７はＡ、Ｐ若しくはＶであり、Ｘ_８はＡ若しくはＲであり、及び／又はＸ_９はＱ若しくはＤである（配列番号４７７）。

【0032】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＧＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６）、ＶＩＩＫＳＧＡＡＱ（配列番号７）、ＧＹＨＫＩＧＡＡＱ（配列番号８）、ＧＹＨＫＳＧＶＡＱ（配列番号９）、ＶＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号１０）、ＧＹＨＫＩＳＡＡＱ（配列番号１１）、ＴＴＶＰＳＳＳＲＹ（配列番号１２）、ＶＩＩＲＶＶＲＬＳ（配列番号１３）、ＴＶＬＧＱＮＱＱＴ（配列番号１４）、ＩＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号１５）、ＴＶＬＤＫＮＱＱＴ（配列番号１６）、ＹＳＧＴＤＶＲＹＫ（配列番号１７）、ＶＴＡＳＧＫＥＨＲ（配列番号１８）、ＧＹＲＫＳＧＡＡＱ（配列番号１９）、ＮＲＴＶＳＮＧＳＥ（配列番号２０）、ＴＶＬＤＲＩＮＫＴ（配列番号２１）、ＴＧＶＧＨＬＴＳＡ（配列番号２２）、ＧＹＨＫＧＧＡＡＱ（配列番号２３）、ＶＩＡＫＳＧＡＡＱ（配列番号２４）、ＧＹＨＫＳＧＡＡＨ（配列番号２５）、ＦＩＩＫＳＧＡＡＱ（配列番号２６）、ＧＹＨＫＶＶＲＬＳ（配列番号２７）、ＧＡＴＲＳＡＶＥＳ（配列番号２８）、ＴＶＳＧＱＮＱＱＴ（配列番号２９）、ＬＳＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号３０）、ＳＳＳＧＱＮＱＱＴ（配列番号３１）、ＳＧＳＧＱＮＱＱＴ（配列番号３２）、ＳＱＶＮＧＲＰＲＤ（配列番号３３）、ＧＹＨＫＥＷＣＧＳ（配列番号３４）、ＶＶＳＳＫＳＬＮＳ（配列番号３５）、ＧＹＨＫＳＧＡＡＰ（配列番号３６）、ＤＡＳＳＲＥＫＶＲ（配列番号３７）、ＳＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号３８）、ＴＡＮＧＳＱＫＹＬ（配列番号３９）、ＶＩＩＲＶＧＡＡＱ（配列番号４０）、ＳＳＴＮＫＩＳＴＡ（配列番号４１）、ＴＶＬＤＲＩＱＱＴ（配列番号４２）、ＧＹＨＫＳＧＡＶＱ（配列番号４３）、ＴＶＬＤＱＮＱＱＴ（配列番号４４）、ＶＮＭＳＳＰＩＫＴ（配列番号４５）、ＡＡＹＮＳＮＳＡＦ（配列番号４６）、ＧＹＨＫＳＧＡＡＲ（配列番号４７）、ＶＩＩＲＶＶＲＬＱ（配列番号４８）、ＲＦＷＴＱＮＱＱＴ（配列番号４９）、ＳＳＰＲＡＳＳＡＬ（配列番号５０）、ＩＩＩＲＶＶＲＬＳ（配列番号５１）、ＫＳＳＮＬＴＡＭＰ（配列番号５２）、ＮＬＮＳＤＲＨＳＡ（配列番号５３）、ＬＳＬＫＳＧＡＡＱ（配列番号５４）、ＴＶＬＤＲＮＱＱＴ（配列番号５５）、ＧＳＥＲＶＳＮＳＧ（配列番号５６）、ＶＩＡＫＩＧＡＡＱ（配列番号５７）、ＶＹＨＫＩＧＡＡＱ（配列番号５８）、ＬＳＹＫＳＧＡＡＱ（配列番号５９）、ＳＴＶＳＱＰＶＲＴ（配列番号６０）、ＧＨＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６１）、ＹＡＧＩＤＰＲＹＨ（配列番号６２）、ＤＲＳＲＫＳＭＣＤ（配列番号６３）、ＶＩＩＲＳＧＡＡＱ（配列番号６４）、ＧＹＨＫＳＧＧＳＡ（配列番号６５）、ＶＩＩＫＩＧＡＡＱ（配列番号６６）、ＧＹＨＫＶＶＱＬＳ（配列番号６７）、ＶＩＩＫＬＶＡＡＱ（配列番号６８）、ＫＶＳＳＨＳＶＣＤ（配列番号６９）、ＧＹＨＫＲＶＲＬＳ（配列番号７０）、ＧＹＨＫＳＳＡＡＱ（配列番号７１）、ＧＹＲＫＩＧＡＡＱ（配列番号７２）、ＧＹＨＫＳＧＡＡＣ（配列番号７３）、ＧＹＲＱＳＧＡＡＱ（配列番号７４）、ＶＩＩＫＬＩＡＡＱ（配列番号７５）、ＶＩＩＲＶＶＲＡＱ（配列番号７６）、ＧＹＨＫＳＧＡＡＷ（配列番号７７）、ＧＹＨＫＳＧＡＶＳ（配列番号７８）、ＧＹＨＫＥＷＣＳＳ（配列番号７９）、ＳＳＳＳＮＲＬＡＤ（配列番号８０）、ＳＮＮＳＳＳＡＫＦ（配列番号８１）、ＶＫＬＳＳＴＳＳＳ（配列番号８２）、ＧＹＨＫＥＷＣＡＱ（配列番号８３）、ＡＧＳＧＱＮＱＱＴ（配列番号８４）、ＮＰＨＧＴＡＴＹＬ（配列番号８５）、ＮＧＳＧＱＮＱＨＴ（配列番号８６）、ＧＹＨＫＶＧＡＡＱ（配列番号８７）、ＶＩＩＲＶＶＲＬＫ（配列番号８８）、ＮＳＩＰＳＴＳＫＷ（配列番号８９）、ＶＩＩＲＶＶＱＬＱ（配列番号９０）、ＳＱＶＮＧＲＰＱＤ（配列番号９１）、ＮＧＳＧＱＤＱＱＴ（配列番号９２）、ＧＬＮＳＳＤＲＲＬ（配列番号９３）、ＩＹＨＫＩＧＡＡＱ（配列番号９４）、ＹＨＫＳＧＡＡＱＬ（配列番号９５）、ＹＳＧＴＤＶＱＹＫ（配列番号９６）、ＬＧＳＧＱＮＱＱＴ（配列番号９７）、ＰＶＳＳＧＡＤＲＲ（配列番号９８）、ＥＨＳＴＫＬＮＡＣ（配列番号９９）、ＮＧＳＤＲＩＮＫＲ（配列番号１００）、ＶＩＩＫＧＧＡＡＱ（配列番号１０１）、ＧＹＨＲＶＶＲＬＳ（配列番号１０２）、ＶＩＩＲＶＶＲＬＬ（配列番号１０３）、及びＶＩＬＫＳＧＡＡＱ（配列番号１０４）から選択される配列を含むか又はそれからなる。

【0033】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、配列番号６～１０４のうちの１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同一のペプチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0034】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＧＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６）と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同一の配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＧＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６）に対して最大で１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＧＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６）に対して最大で１つ、２つ、３つ、又は４つの保存的アミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＧＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６）である。

【0035】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＳＱＶＮＧＲＰＲＤ（配列番号３３）と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同一の配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＳＱＶＮＧＲＰＲＤ（配列番号３３）に対して最大で１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＳＱＶＮＧＲＰＲＤ（配列番号３３）に対して最大で１つ、２つ、３つ、又は４つの保存的アミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＩＶ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＳＱＶＮＧＲＰＲＤ（配列番号３３）である。

【0036】

いくつかの実施形態では、本開示のキャプシドタンパク質は、ＶＲ－Ｖ部位にバリアントポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－Ｖ部位全体（「ＮＮＳＥＦＡ」、配列番号３）が、式：
－（Ｘ）_ｎ－のペプチドで置換され、
式中、ｎは、４～８であり、Ｘは、２０個の標準アミノ酸（配列番号４７９）のうちのいずれかを表す。

【0037】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－Ｖ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－である

【0038】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－Ｖ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－である
式中、Ｘ_１は、Ｓ、Ｌ、Ｈ、Ｎ、又はＡであり、Ｘ_２は、Ｔ、Ｍ、Ｋ、Ｇ、又はＮであり、Ｘ_３は、Ｓ、Ｔ、Ｍ又はＩであり、Ｘ_４は、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、又はＮであり、Ｘ_５は、Ｆ、Ｓ、Ｐ又はＬであり、Ｘ_６は、Ｉ、Ｖ、又はＴである（配列番号４７４）。

【0039】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－Ｖ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＬＮＳＭＬＩ（配列番号１０５）、ＮＧＭＳＦＴ（配列番号１０６）、ＨＫＴＦＳＩ（配列番号１０７）、ＳＭＳＮＦＶ（配列番号１０８）、ＡＴＩＰＰＩ（配列番号１０９）、ＳＳＴＨＦＤ（配列番号１１０）、ＮＮＱＦＳＹ（配列番号１１１）、ＮＭＧＨＹＳ（配列番号１１２）、ＳＫＱＭＦＱ（配列番号１１３）、ＷＰＳＡＧＶ（配列番号１１４）、ＮＧＧＹＱＣ（配列番号１１５）、ＳＴＳＰＩＶ（配列番号１１６）、ＳＱＳＧＬＷ（配列番号１１７）、ＶＮＳＱＦＳ（配列番号１１８）、ＳＧＩＥＦＲ（配列番号１１９）、ＳＡＳＫＦＴ（配列番号１２０）、ＱＬＮＷＴＳ（配列番号１２１）、ＳＭＧＦＰＶ（配列番号１２２）、ＳＳＦＭＧＬ（配列番号１２３）、ＧＳＮＦＨＶ（配列番号１２４）、ＤＭＴＬＹＡ（配列番号１２５）、ＭＧＣＬＦＴ（配列番号１２６）、ＡＬＡＦＮＳ（配列番号１２７）、ＳＫＦＬＦＡ（配列番号１２８）、ＱＤＡＧＬＬ（配列番号１２９）、ＱＤＡＳＬＬ（配列番号１３０）、ＲＤＤＭＦＳ（配列番号１３１）、ＬＳＲＣＦＱ（配列番号１３２）、ＬＳＲＤＦＱ（配列番号１３３）、ＱＧＬＴＰＶ（配列番号１３４）、ＱＷＤＶＦＴ（配列番号１３５）、ＰＲＶＳＦＡ（配列番号１３６）、ＱＳＹＹＮＰ（配列番号１３７）、ＲＡＳＨＬＧ（配列番号１３８）、ＩＩＬＦＶＰ（配列番号１３９）、ＩＩＳＦＳＹ（配列番号１４０）、ＬＤＳＭＬＩ（配列番号１４１）、ＮＩＧＨＹＳ（配列番号１４２）、ＮＲＭＳＦＴ（配列番号１４３）、ＮＧＭＳＦＡ（配列番号１４４）、ＩＩＬＬＬＰ（配列番号１４５）、ＲＭＲＳＬＬ（配列番号１４６）、ＲＲＲＣＲＦ（配列番号１４７）、ＰＫＱＭＦＱ（配列番号１４８）、ＬＭＳＮＦＶ（配列番号１４９）、ＧＡＳＨＬＧ（配列番号１５０）、ＣＡＳＩＳＷ（配列番号１５１）、ＳＭＴＴＦＲ（配列番号１５２）、ＡＡＩＰＰＩ（配列番号１５３）、ＰＧＣＥＳＬ（配列番号１５４）、ＳＭＧＦＡＣ（配列番号１５５）、ＦＬＰＳＬＭ（配列番号１５６）、ＮＧＩＳＦＴ（配列番号１５７）、ＥＳＳＲＷＡ（配列番号１５８）、ＱＬＹＦＶＰ（配列番号１５９）、ＳＳＮＦＨＶ（配列番号１６０）、ＬＥＦＭＬＩ（配列番号１６１）、ＱＦＤＳＦＤ（配列番号１６２）、ＳＰＶＦＡＣ（配列番号１６３）、ＶＲＬＩＦＤ（配列番号１６４）、ＮＧＭＳＦＩ（配列番号１６５）、ＬＬＦＰＰＩ（配列番号１６６）、ＧＡＧＶＴＧ（配列番号１６７）、ＱＷＭＳＦＴ（配列番号１６８）、ＳＩＧＦＰＶ（配列番号１６９）、ＲＭＱＳＬＬ（配列番号１７０）、ＴＳＡＬＱＶ（配列番号１７１）、ＳＬＴＨＦＤ（配列番号１７２）、ＱＥＬＰＦＬ（配列番号１７３）、ＬＹＦＬＬＰ（配列番号１７４）、ＬＳＦＦＦＡ（配列番号１７５）、ＬＳＲＩＦＱ（配列番号１７６）、ＤＥＶＩＬＦ（配列番号１７７）、ＲＡＧＶＡＧ（配列番号１７８）、ＮＧＭＳＬＰ（配列番号１７９）、ＰＦＥＤＦＱ（配列番号１８０）、ＱＹＧＳＬＦ（配列番号１８１）、ＮＹＴＦＶＬ（配列番号１８２）、ＭＳＧＹＱＣ（配列番号１８３）、ＮＹＡＦＶＰ（配列番号１８４）、ＲＡＧＶＴＧ（配列番号１８５）、ＷＮＳＭＬＩ（配列番号１８６）、ＩＲＲＦＳＩ（配列番号１８７）、ＮＧＭＳＦＹ（配列番号１８８）、ＩＩＱＦＳＹ（配列番号１８９）、ＮＧＣＬＦＴ（配列番号１９０）、ＲＤＡＳＬＬ（配列番号１９１）、ＡＤＳＭＬＩ（配列番号１９２）、ＶＤＳＱＦＳ（配列番号１９３）、ＳＩＧＮＦＶ（配列番号１９４）、ＮＧＭＳＬＬ（配列番号１９５）、ＮＹＴＦＶＰ（配列番号１９６）、ＩＲＲＬＶＦ（配列番号１９７）、ＰＭＳＮＦＶ（配列番号１９８）、ＬＷＶＦＰＶ（配列番号１９９）、ＶＲＬＨＦＤ（配列番号２００）、ＳＭＳＮＬＦ（配列番号２０１）、ＳＴＳＬＩＶ（配列番号２０２）、及びＨＫＴＦＧＩ（配列番号２０３）から選択される配列を含むか又はそれからなる。

【0040】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－Ｖ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、配列番号１０５～２０３のうちの１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同一のペプチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0041】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－Ｖ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＬＮＳＭＬＩ（配列番号１０５）と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同一の配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－Ｖ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＬＮＳＭＬＩ（配列番号１０５）に対して最大で１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－Ｖ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＬＮＳＭＬＩ（配列番号１０５）に対して最大で１つ、２つ、３つ、又は４つの保存的アミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－Ｖ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＬＮＳＭＬＩ（配列番号１０５）である。

【0042】

いくつかの実施形態では、本開示のキャプシドタンパク質は、ＶＲ－ＶＩＩ部位にバリアントポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩ部位全体（「ＧＲＤＮＶ」、配列番号４）が、以下の式：
－（Ｘ）_ｎ－のペプチドで置換され、
式中、ｎは、３～７であり、Ｘは、２０個の標準アミノ酸（配列番号４８０）のうちのいずれかを表す。

【0043】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－である

【0044】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－である
式中、Ｘ_１は、Ｖ、Ｌ、Ｑ、Ｃ、又はＲであり、Ｘ_２は、Ｓ、Ｈ、Ｇ、Ｃ、又はＤであり、Ｘ_３は、Ｙ、Ｓ、Ｌ、Ｇ、又はＮであり、Ｘ_４は、Ｓ、Ｌ、Ｈ、Ｑ、又はＮであり、Ｘ_５は、Ｖ、Ｉ、又はＲである（配列番号４７５）。

【0045】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩ部位におけるバリアントポピペプチド配列は、ＲＧＮＱＶ（配列番号２０４）、ＶＳＬＮＲ（配列番号２０５）、ＣＤＹＳＶ（配列番号２０６）、ＱＨＧＨＩ（配列番号２０７）、ＬＣＳＬＶ（配列番号２０８）、ＰＴＩＹＶ（配列番号２０９）、ＤＶＩＨＩ（配列番号２１０）、ＡＥＦＹＡ（配列番号２１１）、ＮＳＶＶＣ（配列番号２１２）、ＶＲＳＮＣ（配列番号２１３）、ＬＡＮＮＩ（配列番号２１４）、ＮＬＱＦＭ（配列番号２１５）、ＥＦＲＤＬ（配列番号２１６）、ＤＦＧＳＬ（配列番号２１７）、ＶＴＮＹＣ（配列番号２１８）、ＷＮＴＮＡ（配列番号２１９）、ＴＥＳＴＣ（配列番号２２０）、ＳＧＡＡＶ（配列番号２２１）、ＧＧＣＤＩ（配列番号２２２）、ＳＧＳＶＶ（配列番号２２３）、ＳＳＮＡＣ（配列番号２２４）、ＹＮＴＴＶ（配列番号２２５）、ＳＫＣＬＡ（配列番号２２６）、ＳＡＹＴＶ（配列番号２２７）、ＶＲＤＴＶ（配列番号２２８）、ＷＲＳＭＶ（配列番号２２９）、ＡＹＨＧＶ（配列番号２３０）、ＧＭＮＴＩ（配列番号２３１）、ＡＥＴＳＬ（配列番号２３２）、ＴＬＶＹＶ（配列番号２３３）、ＮＨＤＷＩ（配列番号２３４）、ＴＶＧＩＶ（配列番号２３５）、ＳＬＰＴＶ（配列番号２３６）、ＴＧＩＬＣ（配列番号２３７）、ＴＤＴＹＩ（配列番号２３８）、ＬＰＶＴＹ（配列番号２３９）、ＧＤＶＹＩ（配列番号２４０）、ＬＹＧＴＶ（配列番号２４１）、ＧＣＥＦＩ（配列番号２４２）、ＳＡＧＬＬ（配列番号２４３）、ＩＫＳＮＩ（配列番号２４４）、ＶＴＴＳＬ（配列番号２４５）、ＡＶＴＳＶ（配列番号２４６）、ＲＤＩＨＩ（配列番号２４７）、ＳＡＩＳＬ（配列番号２４８）、ＶＡＳＴＣ（配列番号２４９）、ＩＫＧＬＬ（配列番号２５０）、ＧＳＹＨＴ（配列番号２５１）、ＲＩＧＦＶ（配列番号２５２）、ＮＤＩＹＩ（配列番号２５３）、ＡＶＳＣＶ（配列番号２５４）、ＱＨＮＬＬ（配列番号２５５）、ＶＳＳＣＶ（配列番号２５６）、ＬＮＬＤＶ（配列番号２５７）、ＬＧＡＴＩ（配列番号２５８）、ＰＶＬＣＶ（配列番号２５９）、ＳＡＲＨＩ（配列番号２６０）、ＲＡＴＬＩ（配列番号２６１）、ＰＹＮＨＡ（配列番号２６２）、ＩＧＤＳＩ（配列番号２６３）、ＳＰＭＬＣ（配列番号２６４）、ＹＤＳＴＬ（配列番号２６５）、ＡＬＫＨＶ（配列番号２６６）、ＡＤＬＬＴ（配列番号２６７）、ＮＮＧＨＬ（配列番号２６８）、ＩＮＳＥＶ（配列番号２６９）、ＳＮＫＴＴ（配列番号２７０）、ＧＳＴＧＬ（配列番号２７１）、ＤＳＤＭＩ（配列番号２７２）、ＴＳＮＦＩ（配列番号２７３）、ＲＮＦＴＴ（配列番号２７４）、ＳＨＫＹＳ（配列番号２７５）、ＶＳＤＩＶ（配列番号２７６）、ＲＶＶＱＡ（配列番号２７７）、ＡＡＣＡＶ（配列番号２７８）、ＲＧＲＱＩ（配列番号２７９）、ＡＶＡＮＩ（配列番号２８０）、ＡＧＹＤＬ（配列番号２８１）、ＬＳＥＡＡ（配列番号２８２）、ＭＳＮＹＬ（配列番号２８３）、ＮＦＳＤＮ（配列番号２８４）、ＳＣＣＤＶ（配列番号２８５）、ＬＡＳＳＶ（配列番号２８６）、ＰＤＨＡＶ（配列番号２８７）、ＫＦＤＩＩ（配列番号２８８）、ＮＳＳＳＡ（配列番号２８９）、ＨＴＭＨＶ（配列番号２９０）、ＴＬＳＹＣ（配列番号２９１）、ＡＤＴＨＲ（配列番号２９２）、ＳＭＹＳＶ（配列番号２９３）、ＳＶＮＬＶ（配列番号２９４）、ＭＳＧＨＬ（配列番号２９５）、ＫＩＳＤＴ（配列番号２９６）、ＴＧＬＬＡ（配列番号２９７）、ＡＷＴＴＳ（配列番号２９８）、ＧＧＡＬＩ（配列番号２９９）、ＳＣＩＥＶ（配列番号３００）、ＰＰＶＩＣ（配列番号３０１）、及びＧＴＹＮＬ（配列番号３０２）から選択される配列を含むか又はそれからなる。

【0046】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、配列番号２０４－３０２のうちの１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同一のペプチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0047】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＲＧＮＱＶ（配列番号２０４）と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同一の配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＲＧＮＱＶ（配列番号２０４）に対して最大で１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＲＧＮＱＶ（配列番号２０４）に対して最大で１つ、２つ、３つ、又は４つの保存的アミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＲＧＮＱＶ（配列番号２０４）である。

【0048】

いくつかの実施形態では、本開示のキャプシドタンパク質は、ＶＲ－ＶＩＩ部位にバリアントポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位全体（「ＳＡＱＡ」、配列番号５）は、式：
－（Ｘ）_ｎ－のペプチドで置換され、
式中、ｎは、２～６であり、Ｘは、２０個の標準アミノ酸（配列番号４８１）のうちのいずれかを表す。

【0049】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－である

【0050】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、
－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－である
式中、Ｘ_１は、Ｓ、Ｎ、又はＡであり、Ｘ_２は、Ｖ、Ｍ、Ｎ、又はＡであり、Ｘ_３は、Ｙ、Ｖ、Ｓ、又はＧであり、Ｘ_４は、Ｙ、Ｔ、Ｍ、Ｇ、又はＮ（配列番号４７６）である。

【0051】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＮＶＳＹ（配列番号３０３）、ＳＭＶＮ（配列番号３０４）、ＡＮＹＧ（配列番号３０５）、ＮＶＧＴ（配列番号３０６）、ＳＡＹＭ（配列番号３０７）、ＥＫＶＴ（配列番号３０８）、ＴＴＰＧ（配列番号３０９）、ＧＶＹＳ（配列番号３１０）、ＳＹＶＧ（配列番号３１１）、ＬＱＹＮ（配列番号３１２）、ＤＰＡＫ（配列番号３１３）、ＴＨＦＳ（配列番号３１４）、ＩＧＧＶ（配列番号３１５）、ＳＳＷＮ（配列番号３１６）、ＳＶＹＶ（配列番号３１７）、ＴＬＮＧ（配列番号３１８）、ＮＴＳＮ（配列番号３１９）、ＶＱＹＡ（配列番号３２０）、ＤＱＹＲ（配列番号３２１）、ＭＰＶＳ（配列番号３２２）、ＳＡＱＡ（配列番号３２３）、ＭＴＶＡ（配列番号３２４）、ＴＶＭＧ（配列番号３２５）、ＦＳＳＩ（配列番号３２６）、ＳＬＲＬ（配列番号３２７）、ＳＡＭＧ（配列番号３２８）、ＹＩＫＬ（配列番号３２９）、ＬＭＴＭ（配列番号３３０）、ＱＶＨＬ（配列番号３３１）、ＹＮＳＶ（配列番号３３２）、ＣＶＩＳ（配列番号３３３）、ＲＬＤＧ（配列番号３３４）、ＡＩＭＶ（配列番号３３５）、ＧＴＴＧ（配列番号３３６）、ＡＳＹＴ（配列番号３３７）、ＬＨＶＧ（配列番号３３８）、ＬＱＦＡ（配列番号３３９）、ＶＲＧＤ（配列番号３４０）、ＮＶＭＩ（配列番号３４１）、ＳＬＹＧ（配列番号３４２）、ＧＴＶＧ（配列番号３４３）、ＦＮＳＶ（配列番号３４４）、ＴＲＬＧ（配列番号３４５）、ＬＫＶＬ（配列番号３４６）、ＳＩＲＶ（配列番号３４７）、ＫＩＱＧ（配列番号３４８）、ＱＩＬＧ（配列番号３４９）、ＱＲＤＡ（配列番号３５０）、ＥＡＶＲ（配列番号３５１）、ＡＩＴＶ（配列番号３５２）、ＫＥＳＩ（配列番号３５３）、ＬＭＶＮ（配列番号３５４）、ＩＮＬＳ（配列番号３５５）、ＧＱＶＳ（配列番号３５６）、ＴＳＬＬ（配列番号３５７）、ＳＳＴＬ（配列番号３５８）、ＹＥＫＦ（配列番号３５９）、ＤＧＫＬ（配列番号３６０）、ＱＶＹＳ（配列番号３６１）、ＱＫＥＧ（配列番号３６２）、ＡＲＤＭ（配列番号３６３）、ＤＮＦＲ（配列番号３６４）、ＳＨＧＬ（配列番号３６５）、ＶＳＶＮ（配列番号３６６）、ＧＬＫＤ（配列番号３６７）、ＱＰＶＦ（配列番号３６８）、ＶＹＳＭ（配列番号３６９）、ＶＭＡＱ（配列番号３７０）、ＦＶＧＭ（配列番号３７１）、ＷＳＴＰ（配列番号３７２）、ＳＹＰＶ（配列番号３７３）、ＴＴＹＳ（配列番号３７４）、ＴＶＴＴ（配列番号３７５）、ＫＤＫＴ（配列番号３７６）、ＹＲＥＬ（配列番号３７７）、ＬＳＨＦ（配列番号３７８）、ＳＰＧＴ（配列番号３７９）、ＬＭＧＴ（配列番号３８０）、ＡＡＳＬ（配列番号３８１）、ＦＳＮＮ（配列番号３８２）、ＱＡＲＬ（配列番号３８３）、ＹＨＩＡ（配列番号３８４）、ＡＲＱＤ（配列番号３８５）、ＶＡＹＴ（配列番号３８６）、ＴＰＳＹ（配列番号３８７）、ＭＩＬＨ（配列番号３８８）、ＬＧＮＶ（配列番号３８９）、ＴＳＩＳ（配列番号３９０）、ＴＭＶＹ（配列番号３９１）、ＬＶＶＧ（配列番号３９２）、ＳＰＬＹ（配列番号３９３）、ＹＫＳＥ（配列番号３９４）、ＦＴＲＬ（配列番号３９５）、ＶＳＹＮ（配列番号３９６）、ＥＲＴＰ（配列番号３９７）、ＦＲＳＥ（配列番号３９８）、ＮＹＴＥ（配列番号３９９）、ＱＴＩＮ（配列番号４００）、及びＤＶＨＲ（配列番号４０１）から選択される配列を含むか又はそれからなる。

【0052】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、配列番号３０３～４０１のうちの１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同一のペプチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0053】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＡＮＹＧ（配列番号３０５）と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同一の配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＡＮＹＧ（配列番号３０５）に対して最大で１つ、２つ、又は３つのアミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＡＮＹＧ（配列番号３０５）に対して最大で１つ、２つ、又は３つの保存的アミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＡＮＹＧ（配列番号３０５）である。

【0054】

いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＮＶＳＹ（配列番号３０３）と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同一の配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＮＶＳＹ（配列番号３０３）に対して最大で１つ、２つ、又は３つのアミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位におけるバリアントポリペプチドの配列は、ＮＶＳＹ（配列番号３０３）に対して最大で１つ、２つ、又は３つの保存的アミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＶＲ－ＶＩＩＩ部位におけるバリアントポリペプチド配列は、ＮＶＳＹ（配列番号３０３）である。

【0055】

いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号４０２～４１０及び４６４～４６８のうちの１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一のポリペプチド配列、又はその機能的断片を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【表1】

【0056】

キメラＡＡＶ５／ＡＡＶ９キャプシド
本開示はまた、配列番号４６３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）キャプシドタンパク質を提供する。（配列番号４６３では、「Ｘ」と標識されたアミノ酸残基は、配列同一性の計算から除外される。）いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５／ＡＡＶ９キメラキャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ５／ＡＡＶ９キメラキャプシドタンパク質配列は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質配列（配列番号１）と、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％を超えて同一である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ５／ＡＡＶ９キメラキャプシドタンパク質配列のＣ末端５００残基は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質配列（配列番号１）のＣ末端５００残基と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質配列（配列番号１）のＱ６８８にあたる位置の残基は、キメラキャプシドタンパク質中のリジン（Ｋ）である。

【0057】

いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質に由来する少なくとも１、２、３、４、５又はそれ以上のポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質に由来する少なくとも１、２、３、４、５又はそれ以上のポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドセグメントは、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質に由来し、少なくとも１つのポリペプチドセグメントは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質に由来する。

【0058】

いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質のＮ末端の最初の２５０残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質のＮ末端の最初の２２５残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質のＮ末端の最初の２００残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質のＮ末端の最初の１５０残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質のＮ末端の最初の１００残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質のＮ末端の最初の５０残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントの各々は、対応するＡＡＶ５キャプシド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列同一性を有する。

【0059】

いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質の５０～２５０残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質の５０～２００残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質の５０～１５０残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質の１００～２５０残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質の１００～２００残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質の１５０～２５０残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントの各々は、対応するＡＡＶ５キャプシド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列同一性を有する。

【0060】

いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質のＣ末端の最後の１００残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質のＣ末端の最後の５０残基は、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントの各々は、対応するＡＡＶ５キャプシド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質は、上述のように、キメラキャプシドタンパク質のＮ末端又はその近くに１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントと、本段落に記載されるように、キメラキャプシドタンパク質のＣ末端又はその近くに１つ以上のＡＡＶ５キャプシド由来ポリペプチドセグメントと、を含む。

【0061】

いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端への順序で、配列番号４１１と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列、又は配列番号４１２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列を有する第１のポリペプチドセグメント；配列番号４１３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列、又は配列番号４１４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列を有する第２のポリペプチドセグメント；配列番号４１５と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列、又は配列番号４１６と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列を有する第３のポリペプチドセグメント；配列番号４１７と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列、又は配列番号４１８と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列を有する第４のポリペプチドセグメント；及び配列番号４１９と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列、又は配列番号４２０と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列を有する第５のポリペプチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドセグメントは、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質に由来し、少なくとも１つのポリペプチドセグメントは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質に由来する。
ＡＡＶ９由来ポリペプチドセグメント１：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰＱＰＫＡＮＱＱＨＱＤＮＡＲＧＬＶＬＰＧＹ（配列番号４１１）
ＡＡＶ５由来ポリペプチドセグメント１の配列：
ＭＳＦＶＤＨＰＰＤＷＬＥＥＶＧＥＧＬＲＥＦＬＧＬＥＡＧＰＰＫＰＫＰＮＱＱＨＱＤＱＡＲＧＬＶＬＰＧＹ（配列番号４１２）
ＡＡＶ９由来ポリペプチドセグメント２の配列：
ＫＹＬＧＰＧＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫ（配列番号４１３）
ＡＡＶ５由来ポリペプチドセグメント２の配列：
ＮＹＬＧＰＧＮＧＬＤＲＧＥＰＶＮＲＡＤＥＶＡＲＥＨＤＩＳＹＮＥＱＬＥ（配列番号４１４）
ＡＡＶ９由来ポリペプチドセグメント３の配列：
ＡＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＬＬＥＰ（配列番号４１５）
ＡＡＶ５由来ポリペプチドセグメント３の配列：
ＡＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＫＬＡＤＤＴＳＦＧＧＮＬＧＫＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰ（配列番号４１６）
ＡＡＶ９由来ポリペプチドセグメント４の配列：
ＬＧＬＶＥＥＡＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＡＧＩＧＫＳＧＡＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＴＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＬＴＭＡＳＧＧＧＡＰＶＡ（配列番号４１７）
ＡＡＶ５由来ポリペプチドセグメント４の配列：
ＦＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＴＧＫＲＩＤＤＨＦＰＫＲＫＫＡＲＴＥＥＤＳＫＰＳＴＳＳＤＡＥＡＧＰＳＧＳＱＱＬＱＩＰＡＱＰＡＳＳＬＧＡＤＴＭＳＡＧＧＧＧＰＬＧ（配列番号４１８）
ＡＡＶ９由来ポリペプチドセグメント５の配列：
ＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＱＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮＡＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＤＮＮＧＶＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＤＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＥＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＤＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＥＦＥＮＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＫＴＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴＬＫＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲＮＹＩＰＧＰＳＹＲＱＱＲＶＳＴＴＶＴＱＮＮＮＳＥＦＡＷＰＧＡＳＳＷＡＬＮＧＲＮＳＬＭＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧＳＬＩＦＧＫＱＧＴｇｒｄｎｖＤＡＤＫＶＭＩＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＳＹＧＱＶＡＴＮＨＱＳＡＱＡＱＡＱＴＧＷＶＱＮＱＧＩＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＭＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＡＦＮＫＤＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＮＮＶＥＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号４１９）
Ｑ６８８Ｋ変異を有するＡＡＶ９由来ポリペプチドセグメント５の配列：
ＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＱＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮＡＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＤＮＮＧＶＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＤＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＥＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＤＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＥＦＥＮＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＫＴＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴＬＫＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲＮＹＩＰＧＰＳＹＲＱＱＲＶＳＴＴＶＴＱＮＮＮＳＥＦＡＷＰＧＡＳＳＷＡＬＮＧＲＮＳＬＭＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧＳＬＩＦＧＫＱＧＴｇｒｄｎｖＤＡＤＫＶＭＩＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＳＹＧＱＶＡＴＮＨＱＳＡＱＡＱＡＱＴＧＷＶＱＮＱＧＩＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＭＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＡＦＮＫＤＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＫＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＮＮＶＥＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号４２０）

【0062】

いくつかの実施形態では、キメラキャプシドタンパク質は、配列番号４２１～４４４のうちの１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一のポリペプチド配列、又はその機能的断片を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【表2】

【0063】

組み合わせキャプシドタンパク質
一態様では、本開示は、組み合わせキャプシドタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「組み合わせキャプシドタンパク質」は、本開示に記載のＡＡＶ５／ＡＡＶ９キメラキャプシドタンパク質を指し、これは１つ以上の部位でキメラ親配列に関してアミノ酸変異を更に含む。いくつかの実施形態では、キメラ親配列の１つ以上の部位は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位、及びＶＲ－ＶＩＩＩ部位にあたる部位から選択される。

【0064】

本開示の組み合わせキャプシドタンパク質は、限定されるものではないが、本実施例に示されるように同定された任意のバリアントポリペプチド配列を含む。任意の特定の例に限定されないが、いくつかの実施形態では、組み合わせキャプシドタンパク質は、キメラＡＡＶ５／ＡＡＶ９キャプシドタンパク質骨格を含み、本明細書に記載されるＡＡＶ９キャプシドタンパク質のＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位、及びＶＲ－ＶＩＩＩ部位にあたる部位からなる群から選択される１つ以上の部位にバリアントポリペプチド配列を更に含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、組み合わせキャプシドタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端への順序で、配列番号４１１と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列、又は配列番号４１２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列を有する第１のポリペプチドセグメント；配列番号４１３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列、又は配列番号４１４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列を有する第２のポリペプチドセグメント；配列番号４１５と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列、又は配列番号４１６と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列を有する第３のポリペプチドセグメント；配列番号４１７と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列、又は配列番号４１８と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列を有する第４のポリペプチドセグメント；及び配列番号４１９と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列、又は配列番号４２０と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一の配列を有する第５のポリペプチドセグメントを含む（ここで、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位及びＶＲ－ＶＩＩＩ部位にあたる領域は、第５のポリペプチドセグメントの配列同一性計算において除外される）。いくつかの実施形態では、組み合わせキャプシドタンパク質は、ＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位、及び親配列のＶＲ－ＶＩＩＩ部位のうちの１つ以上でバリアントポリペプチド配列を含み、親配列は、配列番号４６３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む。（配列番号４６３では、「Ｘ」と標識されたアミノ酸残基は、配列同一性の計算から除外される。）

【0066】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドセグメントは、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質に由来し、少なくとも１つのポリペプチドセグメントは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質に由来する。

【0067】

いくつかの実施形態では、組み合わせキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のＶＲ－ＩＶ部位、ＶＲ－Ｖ部位、ＶＲ－ＶＩＩ部位、及びＶＲ－ＶＩＩＩ部位にあたる部位から選択される１つ以上の部位にバリアントポリペプチド配列を更に含む。

【0068】

いくつかの実施形態では、組み合わせキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のＶＲ－ＩＶ部位にあたる部位にバリアントポリペプチド配列を有し、これは、ＧＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６）と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同一の配列を含むか、それから本質的なるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のＶＲ－ＩＶ部位にあたる部位におけるバリアントポリペプチドの配列は、ＧＹＨＫＳＧＡＡＱ（配列番号６）に対して最大で１つ、２つ、３つ、又は４つの保存的アミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的なるか、又はそれからなる。

【0069】

いくつかの実施形態では、組み合わせキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のＶＲ－Ｖ部位にあたる部位にバリアントポリペプチド配列を有し、これは、ＬＮＳＭＬＩ（配列番号１０５）と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同一の配列を含むか、それから本質的なるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のＶＲ－Ｖ部位にあたる部位におけるバリアントポリペプチドの配列は、ＬＮＳＭＬＩ（配列番号１０５）に対して最大で１つ、２つ、３つ、又は４つの保存的アミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的なるか、又はそれからなる。

【0070】

いくつかの実施形態では、組み合わせキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のＶＲ－ＶＩＩＩ部位にあたる部位にバリアントポリペプチド配列を有し、これは、ＡＮＹＧ（配列番号３０５）又はＮＶＳＹ（配列番号３０３）と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同一の配列を含むか、それから本質的なるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のＶＲ－ＶＩＩＩ部位にあたる部位におけるバリアントポリペプチドの配列は、ＡＮＹＧ（配列番号３０５）又はＮＶＳＹ（配列番号３０３）に対して最大で１つ、２つ、３つ、又は４つの保存的アミノ酸置換からなる配列を含むか、それから本質的なるか、又はそれからなる。

【0071】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質配列（配列番号１）のＱ６８８にあたる位置の残基は、組み合わせキャプシドタンパク質中のリジン（Ｋ）である。

【0072】

いくつかの実施形態では、組み合わせキャプシドタンパク質は、配列番号４４５～４６２のうちの１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは１００％同一のポリペプチド配列、又はその機能的断片を含むか、それから本質的なるか、又はそれからなる。

【表3】

【0073】

追加の変異
例えば、形質導入効率又は組織選択性を更に改善するために、追加のアミノ酸置換が組み込まれてもよい。例示的な非限定的な置換としては、限定されるものではないが、ＡＡＶ５又はＡＡＶ９ベースのキャプシドのいずれかにおける、ＡＡＶ５の配列に対するＳ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ又はＴ５８２Ａが挙げられる。

【0074】

いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５又はＡＡＶ９ベースのキャプシドのいずれかにおいて、ＡＡＶ５の配列に対してＳ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、Ｔ５８２Ａ、Ｋ２５１Ｒ、Ｙ７０９Ｆ、Ｙ６９３Ｆ、又はＳ４８５Ａから選択される変異を含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５又はＡＡＶ９ベースのキャプシドのいずれかにおいて、ＡＡＶ５の配列に対してＫ２５１Ｒ、Ｙ７０９Ｆ、Ｙ６９３Ｆ、Ｓ４８５Ａから選択される変異を含む。

【0075】

形質導入効率、指向性、及びＮＡｂ回避
形質導入効率は、当該技術分野で公知の方法又は実施例に記載される方法を使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、操作されたキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、心臓細胞における増加した形質導入効率を示す。

【0076】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、ヒト心臓線維芽細胞（ｈＣＦ）細胞において増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ヒト心臓線維芽細胞は、心臓の左心室に位置する。

【0077】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１００，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｈＣＦ細胞において、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、又は１５倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１００，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｈＣＦ細胞において、約２～約１６倍、約２～約１４倍、約２～約１２倍、約２～約１０倍、約２～約８倍、約２～約６倍、約２～約４倍、又は約２～約３倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１００，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｈＣＦ細胞において、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、又は１５倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１００，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｈＣＦ細胞において、約２０％～３０％、約３０％～４０％、約４０％～５０％、約５０％～８０％、約８０％～１００％、約１００％～１２５％、約１２５％～１５０％、約１５０％～１７５％、又は約１７５％～２００％増加した形質導入効率を示す。

【0078】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｈＣＦ細胞において、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、又は１５倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｈＣＦ細胞において、約２～約１６倍、約２～約１４倍、約２～約１２倍、約２～約１０倍、約２～約８倍、約２～約６倍、約２～約４倍、又は約２～約３倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｈＣＦ細胞において、約２０％～３０％、約３０％～４０％、約４０％～５０％、約５０％～８０％、約８０％～１００％、約１００％～１２５％、約１２５％～１５０％、約１５０％～１７５％、又は約１７５％～２００％増加した形質導入効率を示す。

【0079】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）細胞において増加した形質導入効率を示す。

【0080】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１００，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、又は１５倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１００，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において、約２～約１６倍、約２～約１４倍、約２～約１２倍、約２～約１０倍、約２～約８倍、約２～約６倍、約２～約４倍、又は約２～約３倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１００，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において、約２０％～３０％、約３０％～４０％、約４０％～５０％、約５０％～８０％、約８０％～１００％、約１００％～１２５％、約１２５％～１５０％、約１５０％～１７５％、又は約１７５％～２００％増加した形質導入効率を示す。

【0081】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、７５，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、又は１５倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、７５，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において、約２～約１６倍、約２～約１４倍、約２～約１２倍、約２～約１０倍、約２～約８倍、約２～約６倍、約２～約４倍、又は約２～約３倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、７５，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において、約２０％～３０％、約３０％～４０％、約４０％～５０％、約５０％～８０％、約８０％～１００％、約１００％～１２５％、約１２５％～１５０％、約１５０％～１７５％、又は約１７５％～２００％増加した形質導入効率を示す。

【0082】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、又は１５倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において、約２～約１６倍、約２～約１４倍、約２～約１２倍、約２～約１０倍、約２～約８倍、約２～約６倍、約２～約４倍、又は約２～約３倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、１，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において、約２０％～３０％、約３０％～４０％、約４０％～５０％、約５０％～８０％、約８０％～１００％、約１００％～１２５％、約１２５％～１５０％、約１５０％～１７５％、又は約１７５％～２００％増加した形質導入効率を示す。

【0083】

いくつかの実施形態では、本開示の操作されたキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、心臓において増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、心臓における形質導入効率は、ＡＡＶ９：ＣＡＧ－ＧＦＰ又は本開示の操作されたキャプシドタンパク質によって封入されたＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに注射することによってモニターされる。いくつかの実施形態では、注射用量は、２．５Ｅ＋１１ｖｇ／マウスである。いくつかの実施形態では、注射用量は、２Ｅ＋１１ｖｇ／マウスである。いくつかの実施形態では、注射用量は、１Ｅ＋１１ｖｇ／マウスである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、心臓において少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、又は１５倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、心臓において約２～約１６倍、約２～約１４倍、約２～約１２倍、約２～約１０倍、約２～約８倍、約２～約６倍、約２～約４倍、又は約２～約３倍増加した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、心臓において約２０％～３０％、約３０％～４０％、約４０％～５０％、約５０％～８０％、約８０％～１００％、約１００％～１２５％、約１２５％～１５０％、約１５０％～１７５％、又は約１７５％～２００％増加した形質導入効率を示す。

【0084】

いくつかの実施形態では、本開示の操作されたキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、肝細胞における減少した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、肝臓形質導入効率は、ＡＡＶ９：ＣＡＧ－ＧＦＰ又は本開示の操作されたキャプシドタンパク質によって封入されたＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに注射することによってモニターされる。いくつかの実施形態では、注射用量は、２．５Ｅ＋１１ｖｇ／マウスである。いくつかの実施形態では、注射用量は、２Ｅ＋１１ｖｇ／マウスである。いくつかの実施形態では、注射用量は、１Ｅ＋１１ｖｇ／マウスである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、肝臓において、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、又は１５倍減少した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、肝臓において約２～約１６倍、約２～約１４倍、約２～約１２倍、約２～約１０倍、約２～約８倍、約２～約６倍、約２～約４倍、又は約２～約３倍減少した形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、肝臓において約２０％～３０％、約３０％～４０％、約４０％～５０％、約５０％～８０％、又は約８０％～１００％減少した形質導入効率を示す。

【0085】

１つの細胞／組織／臓器型の他方に対する形質導入効率の比が、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して本開示の操作されたキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンについて増加する場合、細胞型及び／又は組織／臓器型に対する選択性は増加する。いくつかの実施形態では、操作されたキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、肝臓細胞よりもｉＰＳ－ＣＭ細胞に対する選択性の増加を示す。いくつかの実施形態では、操作されたキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、インビボで注射された場合、肝臓よりも心臓に対する選択性の増加を示す。いくつかの実施形態では、操作されたキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、インビボで注射された場合、肝臓よりも心臓の左心室に対する選択性の増加を示す。

【0086】

いくつかの実施形態では、操作されたキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、又は１５倍増加した、肝臓細胞よりもｉＰＳ－ＣＭ細胞及び／又は肝臓よりも心臓の選択性を示す。いくつかの実施形態では、操作されたキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、約２～約１６倍、約２～約１４倍、約２～約１２倍、約２～約１０倍、約２～約８倍、約２～約６倍、約２～約４倍、又は約２～約３倍増加した、肝臓細胞よりもｉＰＳ－ＣＭ細胞及び／又は肝臓よりも心臓の選択性を示す。いくつかの実施形態では、操作されたキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、約２０％～３０％、約３０％～４０％、約４０％～５０％、約５０％～８０％、約８０％～１００％、約１００％～１２５％、約１２５％～１５０％、約１５０％～１７５％、又は約１７５％～２００％増加した、肝臓細胞よりもｉＰＳ－ＣＭ細胞及び／又は肝臓よりも心臓の選択性を示す。

【0087】

いくつかの実施形態では、本開示の操作されたキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して、ヒトＮＡｂ（中和抗体）を回避する改善された能力を示す。いくつかの実施形態では、ヒトＮＡｂを回避する能力は、ＮＡｂ阻害アッセイを介して測定される。ＮＡｂ阻害アッセイの非限定的な例は、本開示の実施例のセクションに記載される。いくつかの実施形態では、ＮＡｂ阻害アッセイは、所定のＭＯＩで標的細胞を処置する前に、プールされたヒトＮＡｂ（例えば、ＩｇＧ）とともにＡＡＶビリオンをインキュベートすることによって行われ、プールされたヒトＮＡｂとともにインキュベートされていないＡＡＶビリオンと比較して形質導入効率の減少を測定する。ＮＡｂ阻害が少ないことは、ヒトＮＡｂを回避するＡＡＶビリオンの改善された能力を示す。いくつかの実施形態では、操作されたキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、又は１５倍のヒトＮＡｂを回避する改善された能力を示す。いくつかの実施形態では、操作されたキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、約２～約１６倍、約２～約１４倍、約２～約１２倍、約２～約１０倍、約２～約８倍、約２～約６倍、約２～約４倍、又は約２～約３倍のヒトＮＡｂを回避する改善された能力を示す。いくつかの実施形態では、操作されたキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、約２０％～３０％、約３０％～４０％、約４０％～５０％、約５０％～８０％、約８０％～１００％、約１００％～１２５％、約１２５％～１５０％、約１５０％～１７５％、又は約１７５％～２００％のヒトＮＡｂを回避する改善された能力を示す。

【0088】

キャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、野生型ｃａｐ遺伝子の天然コドン、又は同じタンパク質をコードするように選択される代替コドンのいずれかを含む配列を含み得る。挿入のコドン使用頻度を変化させることができる。適切なヌクレオチド配列を選択し、本開示の任意のキャプシドタンパク質をコードするための代替的ヌクレオチド配列を導き出することは、当業者の範囲内である。タンパク質配列の逆翻訳は、宿主生物のコドン使用頻度表、すなわちヒトの真核生物コドン使用頻度を使用して実施することができる。

【0089】

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４０２～４１０及び４６４～４６８のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一の配列を含むＡＡＶ９由来キャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0090】

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４２１～４４４のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一の配列を含むＡＡＶ５／ＡＡＶ９キメラキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0091】

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４４５～４６２のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一の配列を含む組み合わせキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0092】

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４０２～４１０、４２１～４６２、４６４～４６８から選択される改変キャプシドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一の配列を含むＡＡＶ９、ＡＡＶ５／ＡＡＶ９キメラ、又は組み合わせキャプシドタンパク質を提供し、ここで、指定されたパーセントの同一性レベルでのアミノ酸置換、任意選択的に保存的置換が許容される。

【0093】

遺伝子産物
いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンは、ＭＹＢＰＣ３、ＫＣＮＨ２、ＴＲＰＭ４、ＤＳＧ２、ＡＴＰ２Ａ２、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＥＰＧ５、ＥＶＣ、ＥＶＣ２、ＦＢＮ１、ＮＦ１、ＳＣＮ５Ａ、ＳＯＳ１、ＮＰＲ１、ＥＲＢＢ４、ＶＩＰ、ＭＹＨ７又は、その変異体、バリアント、若しくは断片から選択される１つ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンは、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５から選択される１つ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンは、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＯＣＴ４、ＢＡＦ６０Ｃ、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ２、ＩＲＸ４、ＩＳＬＬ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＮＫＸ２．５、ＳＲＦ、ＴＢＸ２０、ＺＦＰＭ２、並びにＭＩＲ－１３３から選択される１つ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンは、ＭＹＢＰＣ３、ＤＷＯＲＦ、ＫＣＮＨ２、ＴＲＰＭ４、ＤＳＧ２、ＰＫＰ２、及びＡＴＰ２Ａ２から選択される１つ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンは、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、ＥＰＧ５、ＥＶＣ、ＥＶＣ２、ＦＢＮ１、ＮＦ１、ＳＣＮ５Ａ、ＳＯＳ１、ＮＰＲ１、ＥＲＢＢ４、ＶＩＰ、ＭＹＨ７、及びＣａｓ９から選択される１つ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンは、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ｍｉＲ－１３３、及びＭＥＳＰ１から選択される１つ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。

【0098】

定義
文脈が別段の示唆をしない限り、本発明の特徴は、任意の組み合わせで使用することができる。記載された任意の特徴又は特徴の組み合わせを除外又は省略することができる。別個の実施形態に記載される本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態で組み合わせて提供されてもよい。単一の実施形態に記載される本発明の特徴は、別個に又は任意の適切な部分的な組み合わせで提供されてもよい。実施形態の全ての組み合わせは、各々及び全ての組み合わせが個別に開示されているかのように、本明細書に開示されている。実施形態及び要素の全ての部分的な組み合わせは、あたかも全てのこうした部分的な組み合わせが個別に開示されているかのように、本明細書に開示される。

【0099】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。詳細な説明は、読者の便宜のためにのみセクションに分割され、任意のセクションに見られる開示は、別のセクションの開示と組み合わせることができる。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料も、本発明の実施又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び材料をこれから説明する。本明細書で言及される全ての刊行物は、その刊行物が引用されることに関連して方法及び／又は材料を開示及び記述するために、参照により組み込まれる。刊行物への言及は、その刊行物が先行技術であることを認めるものではない。

【0100】

単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数形の指示対象を含む。例えば、「組換えＡＡＶビリオン」への言及は、複数のこのようなビリオンを含み、また「その心臓細胞」への言及は、１つ以上の心臓細胞を含む。

【0101】

接続詞「及び／又は」は、「及び」と「又は」との両方を意味し、「及び／又は」によって接続された列挙は、列挙された項目の１つ以上の全ての可能な組み合わせを包含する。

【0102】

用語「ベクター」は、細胞に送達されるポリヌクレオチド又はタンパク質を含む巨大分子又は分子の複合体を指す。

【0103】

「ＡＡＶ」はアデノ随伴ウイルスの略語である。この用語は、サブタイプが示されている場合を除き、ＡＡＶの全てのサブタイプ、並びに天然型と組換え型の両方を網羅している。略語「ｒＡＡＶ」は、組換えアデノ随伴ウイルスを指す。「ＡＡＶ」は、ＡＡＶ又は任意のサブタイプを含む。「ＡＡＶ５」は、ＡＡＶサブタイプ５を指す。「ＡＡＶ９」は、ＡＡＶサブタイプ９を意味する。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、並びに天然の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びキャプシドサブユニットの配列は、文献又はＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースに見出すことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿＿００２０７７（ＡＡＶ１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ１）、ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ３）、ＮＣ＿００１８２９（ＡＡＶ４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ５）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ８）、ＮＣ＿００６２６１（ＡＡＶ８）、及びＡＹ５３０５７９（ＡＡＶ９）を参照されたい。ＡＡＶを記載する刊行物には、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９、Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３９、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．２２１：２０８、Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４、Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５－３８３；国際特許 公開番号ＷＯ２０１８／２２２５０３Ａ１、ＷＯ２０１２／１４５６０１Ａ２、ＷＯ２０００／０２８０６１Ａ２、ＷＯ１９９９／６１６０１Ａ２、及びＷＯ１９９８／１１２４４Ａ２；米国特許 出願 第１５／７８２，９８０号及び第１５／４３３，３２２号、並びに米国特許第 第１０，０３６，０１６号、第９，７９０，４７２号、第９，７３７，６１８号、第９，４３４，９２８号、第９，２３３，１３１号、第８，９０６，６７５号、第７，７９０，４４９号、第７，９０６，１１１号、第７，７１８，４２４号、第７，２５９，１５１号、第７，１９８，９５１号、第７，１０５，３４５号、第６，９６２，８１５号、第６，９８４，５１７号、及び第６，１５６，３０３号が挙げられる。

【0104】

当技術分野で使用される「ＡＡＶベクター」又は「ｒＡＡＶベクター」は、文脈に応じて、ｒＡＡＶビリオンにパッケージングされたＤＮＡ又はｒＡＡＶビリオン自体のいずれかを指す。本明細書で使用される場合、文脈から別段のことが明らかでない限り、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶビリオンにパッケージングされることができるポリヌクレオチド配列を含む核酸（典型的にはプラスミド）であるが、キャプシド又はｒＡＡＶビリオンの他のタンパク質を有するものを指す。一般的には、ｒＡＡＶベクターは、異種ポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド）と、異種ポリヌクレオチド配列に隣接する１つ又は２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）とを含む。２つのＩＴＲのうち１つのみがｒＡＡＶにパッケージングされてもよく、その上で、得られたｒＡＡＶビリオンの感染力が維持され得る。Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１８：８０を参照されたい。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）又は自己相補性（ｓｃＡＡＶ）のいずれかを生成するように設計されてもよい。ＭｃＣａｒｔｙ Ｄ．（２００８）Ｍｏ．Ｔｈｅｒ．１６：１６４８－１６５６；ＷＯ２００１／１１０３４、ＷＯ２００１／９２５５１、ＷＯ２０１０／１２９０２１を参照されたい。

【0105】

「ｒＡＡＶビリオン」は、少なくとも１つのウイルスキャプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１）及びキャプシドタンパク質を含むキャプシド形成されたｒＡＡＶベクター（又はその断片）を含む細胞外ウイルス粒子を指す。

【0106】

簡潔で明確にするために、本開示は、「キャプシドタンパク質」又は「複数のキャプシドタンパク質」を指す。当業者であれば、そのような言及がＶＰ１、ＶＰ２、若しくはＶＰ３、又はＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の組み合わせを指すことを理解する。野生型ＡＡＶ及びほとんどの組換え発現系と同様に、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３は、同じオープンリーディングフレームから発現されるため、ＶＰ３をコードする配列の操作により、必然的にＶＰ１及びＶＰ２のＣ末端ドメインの配列が変更される。また、異なるオープンリーディングフレームからキャプシドタンパク質を発現させてもよく、その場合、得られたｒＡＡＶビリオンのキャプシドは、野生型及び操作されたキャプシドタンパク質の混合物、及び異なる操作されたキャプシドタンパク質の混合物を含有し得る。

【0107】

本明細書で使用される場合、「末端逆位反復配列」又は「ＩＴＲ」という用語は、その対称性を理由にそのように命名されたＡＡＶウイルスシスエレメントを指す。これらのエレメントは、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に不可欠である理論に拘束されるものではないが、ＩＴＲ機能に必要不可欠な最小限のエレメントは、Ｒｅｐ結合部位及び末端分離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）に、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列を加えたものであると考えられる。本開示は、ＡＡＶゲノムを生成する代替的な手段が存在してもよく、又は本開示のキャプシドタンパク質と適合性があるように積極的に開発され得ることを企図する。

【0108】

「ヘルパーウイルス機能」は、ＡＡＶ複製及びパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにおいてコードされる機能を指す。

【0109】

「パッケージング」は、ｒＡＡＶベクターのキャプシド形成を含むｒＡＡＶビリオンのアセンブリをもたらす一連の細胞内事象を指す。ＡＡＶ「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製タンパク質及びキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐは、本明細書ではＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。パッケージングには、ヘルパーウイルス自体、又は組換え系ではより一般的には、ヘルパーフリー系によって供給されるヘルパーウイルス機能（すなわち、１つ以上のヘルパープラスミド）のいずれかを必要とする。

【0110】

ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」とは、哺乳動物細胞によってＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）を複製し、パッケージングさせるウイルスを意味する。ヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアなどのポックスウイルスであってもよい。

【0111】

「感染性」ビリオン又はウイルス粒子は、コンピテントにアセンブルされたウイルスキャプシドを含み、ビリオンが指向性である細胞内にポリヌクレオチド構成要素を送達することができるものである。この用語は、必ずしもウイルスの複製能力を意味するものではない。

【0112】

「感染性」とは、ビリオンが細胞を変化させる（ｉｎｆｌｅｃｔ）能力の測定を指す。感染性は、感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比として表すことができる。感染性は、特定の細胞型に関して一般的に決定される。これはインビボ又はインビトロの両方で測定することができる。感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比を決定する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｇｒａｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：Ｓ３３７（ＴＣＩＤ_５０感染力価アッセイを記載）；及びＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３を参照されたい。

【0113】

用語「親キャプシド」又は「親配列」は、粒子キャプシド又は配列が由来する参照配列を指す。別段の指定がない限り、親配列は、操作されたキャプシドタンパク質と同じ血清型の野生型キャプシドタンパク質の配列を指す。

【0114】

「複製コンピテント」ウイルス（例えば、複製コンピテントＡＡＶ）は、感染性であり、感染した細胞で複製することができる（すなわち、ヘルパーウイルス又はヘルパーウイルス機能の存在下で）ウイルスを指す。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンは、ｒｅｐ遺伝子、又はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の両方を欠くゲノムを含み、したがって複製インコンピテントである。

【0115】

本開示の実践は、別段の示唆がない限り、当業者の範囲内である、組織培養、免疫学、分子生物学、細胞生物学、及び組換えＤＮＡの従来的な技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｄｓ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＣＲ １：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｅｄｓ．（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，５^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇａｉｔ ｅｄ．（１９８４） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、米国特許第 ４，６８３，１９５号、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｄ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｏｈａｉｌ（２００４）Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、及びＳｅｌｌ（２０１３）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋを参照されたい。

【0116】

用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか、又はそれらの類似体の任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、直鎖核酸及び環状核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、及びプライマーが挙げられる。別段の指定又は要求が無い限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載の本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態、及び二本鎖形態を構成することが既知であるか、又は予測される２つの相補的な一本鎖形態それぞれの両方を包含する。

【0117】

用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これには、遺伝子コードされた及び遺伝子コードされないアミノ酸、化学的又は生化学的に改変又は誘導体化されたアミノ酸、及び改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれ得る。用語はまた、改変されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、又は標識構成要素とのコンジュゲーションを包含する。

【0118】

用語「ペプチド」は、短いポリペプチド、例えば、約４～３０アミノ酸残基を有するペプチドを指す。

【0119】

用語「単離された」は、ビリオン、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質が、通常、自然界で会合している細胞及びその他の構成要素から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型若しくは遺伝子型の組織又は細胞から分離された細胞である。

【0120】

本明細書で使用される場合、「配列同一性」又は「同一性」は、目的の配列と参照配列との間で同一のアミノ酸の数のパーセンテージを指す。一般に、同一性は、目的の配列を参照配列に整列させることと、整列させた配列間で同一のアミノ酸の数を決定することと、その数を参照配列におけるアミノ酸の総数で割ることと、その結果に１００を掛けてパーセンテージ得ることとによって決定される。配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手できるＢＬＡＳＴなどの様々なコンピュータープログラムを使用して整列させることができる。アライメントための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６）；ａｎｄ Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３－１８７（１９９７）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４に記載されている。当業者は、配列の長さ、相違、及び参照配列に関する挿入又は欠失の存在又は非存在を含む様々な要因に応じて、適切なアライメント方法を選択することができる。

【0121】

「組換え」はポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限又はライゲーションステップ、及び自然界に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の様々な組み合わせの産物であるか、又はポリヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドからアセンブルされることを意味する。「組換え」タンパク質は、組換えポリペプチドから産生されたタンパク質である。組換えビリオンは、組換えポリヌクレオチド及び／又は組換えタンパク質、例えば、組換えキャプシドタンパク質を含むビリオンである。

【0122】

「遺伝子」は、転写及び翻訳された後、特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。「遺伝子産物」は、特定の遺伝子の発現から生じる分子である。遺伝子産物には、ポリペプチド、タンパク質、アプタマー、干渉ＲＮＡ、又はｍＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）は、システムを作製するために必要な１つの遺伝子産物として、又はいくつかの遺伝子産物（例えば、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ）として記載され得る。

【0123】

「ショートヘアピンＲＮＡ」、又はｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを発現させるために使用されるポリヌクレオチド構築物である。

【0124】

「制御エレメント」又は「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、又は分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度、又は特異性に影響を与えることができ、本質的に増強し得る又は阻害し得る。制御エレメントは、プロモーター及び／又はエンハンサーなどの転写調節配列を含む。

【0125】

「プロモーター」は、ある特定の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼを結合することが可能で、プロモーターから通常下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始することが可能なＤＮＡ配列である。本明細書で使用される場合、用語「組織特異的プロモーター」は、心臓組織などの特定の臓器又は組織の細胞で操作可能なプロモーターを指す。

【0126】

「作動可能に（Ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結された」又は「動作可能に（Ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された」は、エレメントが予想される様式で作動できる関係にある遺伝子エレメントの並置を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写を開始するのを助ける場合、プロモーターはコード領域に作動可能に連結される。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在する残基が存在してもよい。

【0127】

「発現ベクター」は、標的細胞における遺伝子産物の発現に影響を与えるために使用される目的の遺伝子産物をコードするコード配列を含むベクターである。発現ベクターは、遺伝子産物の発現を促進するためにコード配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む。

【0128】

用語「発現カセット」は、標的細胞における遺伝子産物の発現に影響を与えるために使用される目的の遺伝子産物をコードするコード配列を含む異種ポリヌクレオチドを指す。別段の指定がない限り、ＡＡＶベクターの発現カセットは、ＩＴＲ間（かつそれを含まない）のポリヌクレオチドを含む。

【0129】

本明細書において使用される場合、用語「遺伝子送達」又は「遺伝子導入」は、外来性核酸配列、例えばＤＮＡを宿主細胞に確実に挿入するための方法又はシステムを指す。こうした方法は、組み込まれていない移入ＤＮＡの一過性発現、移入されたレプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外複製及び発現、又は移入された遺伝物質の宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みをもたらし得る。

【0130】

「異種」とは、それが比較される実体の残りの遺伝子型とは、遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって、異なる種に由来するプラスミド又はベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。その天然コード配列から除去され、それが天然に連結が見出されていないコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然に存在するＡＡＶに通常含まれていない核酸を含むｒＡＡＶである。

【0131】

用語「遺伝子変更」及び「遺伝子改変」（及びその文法的バリアント）は、本明細書において互換的に使用され、遺伝子エレメント（例えば、ポリヌクレオチド）が有糸分裂又は減数分裂以外によって細胞に導入されるプロセスを指す。エレメントは、細胞に対して異種であってもよく、又は細胞に既に存在するエレメントの追加のコピー又は改良されたバージョンであってもよい。遺伝子変更は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、又はポリヌクレオチド－リポソーム複合体との接触などの当技術分野で公知の任意のプロセスを介して、組換えプラスミド又は他のポリヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクトすることによって、影響され得る。遺伝子変更はまた、例えば、形質導入又はベクターによる感染によっても影響を受け得る。

【0132】

細胞は、インビトロでの細胞の長期培養中にその機能を実施するために配列が利用可能な場合、ポリヌクレオチド配列で「安定的」に変更、形質導入、遺伝子改変、又は形質転換されていると言われる。一般的に、そのような細胞は、変更された細胞の子孫によっても遺伝可能である遺伝子変更が導入されるという点で、「遺伝的に」変更される（遺伝子改変される）。

【0133】

用語「トランスフェクション」は、本明細書で使用される場合、細胞による外因性核酸分子の取り込みを指す。外因性核酸が細胞膜内に導入されている場合、細胞は「トランスフェクト」されている。いくつかのトランスフェクション技術は、当技術分野で一般的に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。このような技術を使用して、１つ以上の外因性核酸分子を適切な宿主細胞に導入することができる。

【0134】

用語「形質導入」は、本明細書で使用される場合、野生型ビリオンによる「感染」とは対照的に、組換えビリオンによる細胞への外因性核酸の移入を指す。組換えビリオンに関して感染が使用される場合、用語「形質導入」及び「感染性」は同義であり、したがって「感染力」及び「形質導入効率」は同等であり、類似の方法を使用して決定することができる。

【0135】

別段の指定がない限り、全ての医学用語は、例えば、全ての目的に関して、参照によりその全体が組み込まれるＨａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５ｅｄ．、特に心臓又は心血管疾患、障害、状態、及び機能障害に関する章におけるように、医療従事者が使用する用語の通常の意味が与えられている。

【0136】

「治療」、「治療すること」、及び「治療する」は、疾患、障害、若しくは状態及び／又はその症状の有害な、又は任意の他の望ましくない作用を低減又は寛解させるために、薬剤を用いて疾患、障害、又は状態に対して作用すると定義される。

【0137】

本発明の組成物に関連して使用される場合の「投与」、「投与すること」などは、直接投与（医療従事者による対象への投与、又は対象による自己投与による）及び／又は間接投与（組成物を患者に処方する）の両方を指す。典型的には、有効量は投与されるが、その量は、当業者によって決定され得る。任意の投与方法を使用してもよい。対象への投与は、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、血管内、又は心筋内送達によって達成され得る。

【0138】

本明細書で使用される場合、組成物の量に関する用語「有効量」などは、所望の生理学的転帰（例えば、細胞の再プログラミング又は疾患の治療）を誘導するのに十分な量を指す。有効量は、１つ以上の投与、適用、又は投薬量で投与することができる。こうした送達は、個々の投薬量単位が使用される期間、組成物の生物学的利用能、投与経路などを含む、多くの変数に依存する。しかしながら、任意の特定の対象に対する組成物の特定の量（例えば、ｒＡＡＶビリオン）は、使用される特定の薬剤の活性、対象の年齢、体重、全般的健康、性別、及び食事、投与時間、排泄速度、組成物の組み合わせ、治療される特定の疾患の重症度、及び投与形態を含む様々な要因に依存することが理解される。

【0139】

用語「個体」、「対象」、及び「患者」は、本明細書では互換的に使用され、限定されないが、ヒト及びヒト以外の霊長類（例えば、サル）、哺乳動物の競技用動物（例えば、ウマ）、哺乳動物家畜（例えば、ヒツジ、ヤギなど）、哺乳動物ペット（例えば、イヌ、ネコなど）、及び齧歯類（例えばマウス、ラットなど）を含む哺乳動物を指す。

【0140】

用語「心臓病態」又は「心機能障害」は互換的に使用され、心臓のポンプ機能におけるなんらかの欠陥を指す。これには、例えば、収縮性の欠陥、弛緩能力の欠陥（拡張機能障害とも呼ばれる）心臓弁の異常又は不適切な機能、心筋の疾患（心筋症と呼ばれることもある）、心筋への不十分な血液供給を特徴とする狭心症、心筋虚血、及び／又は梗塞などの疾患、アミロイドーシス及びヘモクロマトーシスなどの浸潤性疾患、全般性又は局所性肥大（例えば、ある種の心筋症又は全身性高血圧症で発生する可能性がある）並びに心室間の異常な伝達も挙げられる。

【0141】

本明細書で使用される場合、用語「心筋症」は、心筋に直接影響を与える任意の疾患又は機能障害を指す。疾患又は障害の病因は、例えば、炎症性、代謝性、毒性、浸潤性、線維形成性、血液学的、遺伝的、又は起源不明であり得る。２つの基本形態は、（１）原因不明の心筋疾患からなる１次型、及び（２）既知の原因の心筋疾患、又は他の臓器系に関与する疾患と関連付けられた２次型と認識される。「特定の心筋症」は、ある特定の全身性又は心臓障害に関連する心疾患を指し、例としては、高血圧性及び代謝性心筋症が挙げられる。心筋症には、左心室及び／又は右心室の収縮期ポンプ機能が損なわれ、進行性の心臓肥大につながる障害である拡張型心筋症（ＤＣＭ）、高血圧又は大動脈狭窄症などの明白な原因のない左心室肥大を特徴とする肥大型心筋症、並びに異常な拡張機能及び心室の充填を妨げる過度に剛直な心室壁を特徴とする拘束型心筋症が含まれる。心筋症にはまた、左心室緻密化障害、不整脈源性右室心筋症、及び不整脈源性右心室異形成症が含まれる。

【0142】

「心不全」は、心臓機能の異常により、代謝組織の要件に見合う速度で血液を送り出すことができないことの原因となり、かつ／又は心臓が、異常に高い拡張期容積に限って送り出すことができる病態を指す。心不全には、収縮期及び拡張期不全が含まれる。心不全患者は、低い心拍出量の患者（典型的には虚血性心疾患、高血圧、拡張型心筋症及び／又は弁膜症若しくは心膜症が続発する）、及び高い心拍出量（典型的には甲状腺機能亢進症、貧血、妊娠、動静脈瘻、脚気、及びパジェット病による）の患者に分類される。心不全には、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）、駆出率が保たれた心不全（ＨＦｐＥＦ）が含まれる。

【0143】

語句「薬学的に許容可能な」は、本明細書で用いられる場合、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題又は合併症のない、妥当な利益／リスク比に見合った、ヒト及び動物の組織と接触しての使用に適した、化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。

【0144】

「精製された」という用語は、本明細書で使用される場合、材料が取得される天然材料を含む、無関係な材料、すなわち不純物の存在を低減又は排除する条件下で単離された材料を指す。例えば、精製されたｒＡＡＶベクターＤＮＡは、組織培養成分、汚染物などを含む、細胞又は培養成分を実質的に含まないことが好ましい。

【0145】

損傷を受けた心臓組織に関連して本明細書で使用される場合、用語「再生する」、「再生」などは、その通常の意味を与えられ、また例えば、虚血、梗塞、再灌流、又は他の疾患により損傷を受けている心臓又は心臓組織において、新しい心臓組織を成長及び／又は発達させるプロセスも指す。いくつかの実施形態では、心臓組織再生は、心筋細胞の生成を含む。

【0146】

用語「治療遺伝子」は、本明細書で使用される場合、発現された場合、それが存在する細胞若しくは組織、又は遺伝子が発現される哺乳動物に有益な効果を付与する遺伝子を指す。有益な効果の例としては、状態若しくは疾患の徴候若しくは症状の改善、状態若しくは疾患の予防若しくは抑制、又は所望の特徴の付与が挙げられる。治療遺伝子には、細胞又は哺乳動物の遺伝子欠損を部分的又は完全に補正する遺伝子が含まれる。

【0147】

本明細書で使用される場合、用語「機能的心筋細胞」は、電気シグナルを送受信することができる分化した心筋細胞を指す。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、活動電位及び／又はＣａ^２＋トランジェントなどの電気生理学的特性を呈する場合、機能的心筋細胞であると言われる。

【0148】

本明細書で使用される場合、「分化した非心臓細胞」は、成体生物の全ての細胞型に分化することができず（すなわち、多能性細胞ではない）、かつ心臓系統以外の細胞系統（例えば、ニューロン系統又は結合組織系統）の細胞を指すことができる。分化細胞としては、以下に限定されないが、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞、少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）細胞、単能性細胞、前駆細胞、及び最終分化細胞が挙げられる。特定の実施形態では、分化能の低い細胞は、分化能が高い細胞に関して、「分化した」とみなされる。

【0149】

「体細胞」は、生物の体を形成する細胞である。体細胞には、生物の臓器、皮膚、血液、骨、及び結合組織を構成する細胞が含まれるが、生殖細胞には含まれない。

【0150】

本明細書で使用される場合、用語「全能性」は、生物の全ての細胞系統を形成する細胞の能力を意味する。例えば、哺乳動物では、接合体及び第１卵割段階割球のみが全能性である。

【0151】

本明細書で使用される場合、用語「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」は、体又は体細胞の全ての系統を形成する細胞の能力を意味する。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉である、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉のそれぞれから細胞を形成することができる多能性幹細胞の一種である。多能性細胞は、Ｎａｎｏｇ及びＲｅｘ１などのマーカーのそれらの発現によって認識され得る。

【0152】

本明細書で使用される場合、用語「複能性」は、１つの系統の複数の細胞型を形成する成体幹細胞の能力を指す。例えば、造血幹細胞は、血液細胞系統、例えば、リンパ細胞及び骨髄細胞の全ての細胞を形成することができる。

【0153】

本明細書で使用される場合、用語「少能性」は、成体幹細胞が少数の異なる細胞型にのみ分化する能力を指す。例えば、リンパ系幹細胞又は骨髄系幹細胞は、それぞれリンパ系統又は骨髄系統のいずれかの細胞を形成することができる。

【0154】

本明細書で使用される場合、用語「単能性」は、単一細胞型を形成する細胞の能力を意味する。例えば、精原幹細胞は、精子細胞のみを形成することができる。

【0155】

本明細書で使用される場合、用語「再プログラミング」又は「分化転換」は、多能性幹細胞特徴を呈する細胞に細胞を脱分化させる中間プロセスなしに、異なるタイプの細胞（例えば、線維芽細胞）からの、ある特定の系統の細胞（例えば、心臓細胞）の生成を指す。

【0156】

本明細書で使用される場合、用語「心臓細胞」は、心臓収縮又は血液供給などの心臓機能を提供するか、又はそうでなければ心臓の構造を維持するのに役立つ、心臓内に存在する任意の細胞を指す。本明細書で使用される場合、心臓細胞は、心臓の心外膜、心筋、又は心内膜に存在する細胞を包含する。心臓細胞はまた、例えば、心臓の筋細胞又は心筋細胞、及び冠動脈又は静脈の細胞などの心臓血管系の細胞を含む。心臓細胞の他の非限定的な例としては、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞又は前駆細胞、心臓伝導細胞、及び心筋、血管、及び心臓細胞支持構造を構成する心臓ペースメーカー細胞が挙げられる。心臓細胞は、例えば、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を含む幹細胞に由来し得る。

【0157】

本明細書で使用される場合、「心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）」又は「複数の心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）」という用語は、骨格筋細胞とは対照的に、哺乳動物の心臓に天然に存在するサルコメア含有横紋筋細胞を指す。心筋細胞は、例えば、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、心臓α－アクチニンなどの特殊な分子の発現によって特徴付けられる。本明細書で使用される場合、用語「心筋細胞」は、任意の心筋細胞亜集団又は心筋細胞サブタイプ、例えば、心房、心室及びペースメーカー心筋細胞を含む、総称である。

【0158】

用語「心筋細胞様細胞」は、心筋細胞と特徴を共有するが、全ての特徴を共有しなくてもよい細胞を意味することが意図される。例えば、心筋細胞様細胞は、ある特定の心臓遺伝子の発現において心筋細胞とは異なる場合がある。

【0159】

用語「培養」又は「細胞培養」は、人工の、インビトロ環境での細胞の維持を意味する。「細胞培養系」は、本明細書で使用される場合、細胞集団が単層として又は懸濁液中で成長し得る培養条件を指す。「培養培地」は、本明細書で使用される場合、細胞の培養、成長、又は増殖のための栄養溶液を指す。培養培地は、機能的特性、例えば、限定するものではないが、特定の状態での細胞を維持する能力（例えば、多能性状態、静止状態など）、細胞を成熟させる能力、時には特定の系統（例えば、心筋細胞）の細胞への前駆細胞の分化を促進する能力などによって特徴付けすることができる。

【0160】

本明細書で使用される場合、用語「発現」又は「発現する」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又はその後転写されたｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含み得る。遺伝子の発現レベルは、細胞又は組織試料中のｍＲＮＡ又はタンパク質の量を測定することによって決定され得る。

【0161】

用語「誘導心筋細胞」又は略語「ｉＣＭ」は、心筋細胞（及び／又は心筋細胞様細胞）に形質変換された非心筋細胞（及びその子孫）を指す。本開示の方法は、例えば、他の技術を強化するために、誘導心筋細胞を生成するために、現在公知であるか、又は後で発見される任意の方法と併せて使用することができる。

【0162】

本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞由来心筋細胞」という用語は、心筋細胞様細胞に分化されたヒト人工多能性幹細胞を指す。調製されたｉＰＳ－ＣＭ細胞のための例示的な方法は、Ｋａｒａｋｉｋｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊｕｎ １９；１１７（１）：８０－８８によって提供される。

【0163】

本明細書で使用される場合、「ヒト心臓線維芽細胞」及び「マウス心臓線維芽細胞」という用語はそれぞれ、ヒト又はマウスの成人心臓の心室から単離され、エクスビボで培養物に維持される初代細胞を指す。

【0164】

本明細書で使用される場合、「非心筋細胞」という用語は、本明細書で定義及び使用される「心筋細胞」の基準を満たしていない細胞調製物中の任意の細胞又は細胞集団を指す。非心筋細胞の非限定的な例としては、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心筋前駆細胞、及び幹細胞が挙げられる。

【0165】

本明細書で使用される場合、「再プログラミング」は、分化転換、脱分化などを含む。

【0166】

本明細書で使用される場合、用語「再プログラミング効率」は、試料中の細胞の総数と比較して、心筋細胞にうまく再プログラムされる、試料中の細胞の数を指す。

【0167】

本明細書で使用される場合、用語「再プログラミング因子」は、１つの細胞型から別の細胞型への細胞の再プログラミングを支援するために、細胞における発現のために導入される因子を含む。例えば、再プログラミング因子は、他の転写因子及び／又は小分子と組み合わせて、心臓線維芽細胞を誘導心筋細胞に再プログラミングすることが可能な転写因子を含み得る。文脈から別途明らかでない限り、リプログラミング因子は、ＡＡＶ送達ポリヌクレオチドによってコードされ得るポリペプチドを指す。再プログラミング因子はまた、小分子を含んでもよい。

【0168】

用語「幹細胞」は、自己再生能力を有し、及び分化した子孫を生成する能力を有する細胞を指す。用語「多能性幹細胞」は、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）全ての細胞を生じさせることができるが、完全な生物を生じさせる能力を有しない幹細胞を指す。

【0169】

本明細書で使用される場合、ポリペプチド又は核酸配列に関して、「その同等物」という用語は、参照ポリペプチド又は核酸配列とは異なるが、必須の特性（例えば、生物活性）を保持するポリペプチド又は核酸を指す。ポリヌクレオチドの典型的なバリアントは、別の参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。バリアントのヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更させてもよく、又は変更させなくてもよい。ヌクレオチド変化は、参照配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、欠失、付加、融合及び切断をもたらし得る。一般的に、参照ポリペプチド及びバリアントの配列が全体的に極めて類似し、多くの領域において同一であるように、差異は限定的である。

【0170】

本明細書で使用される場合、用語「前駆細胞」は、特定のタイプの細胞に分化するか、又は特定のタイプの組織を形成することを約束する細胞を指す。幹細胞のような前駆細胞は、更に１つ以上の種類の細胞に分化することができるが、幹細胞よりも成熟しており、それによってより限定された／制限された分化能力を有する。

【0171】

用語「遺伝子改変」は、新規核酸（すなわち、細胞に対し外因性の核酸）の導入後に細胞に誘導される永久的又は一過性の遺伝子変化を指す。遺伝子変化は、心臓細胞のゲノム内に新規核酸を組み込むことによって、又は染色体外エレメントとして新しい核酸の一過性又は安定的な維持によって達成され得る。細胞が真核細胞である場合、細胞のゲノム内に核酸を導入することによって、永続的な遺伝子変化を達成することができる。遺伝子改変の適切な方法には、ウイルス感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどが挙げられる。

【0172】

用語「幹細胞」は、自己再生能力を有し、及び分化した子孫を生成する能力を有する細胞を指す。用語「多能性幹細胞」は、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）全ての細胞を生じさせることができるが、完全な生物を生じさせる能力を有しない幹細胞を指す。いくつかの実施形態では、心筋細胞表現型を誘導するための組成物は、再プログラミングを誘導するための細胞集団に使用することができる。他の実施形態では、組成物は、心筋細胞表現型を誘導する。

【0173】

「人工多能性幹細胞」という用語は、その通常の意味を与えられ、また多能性のうちの少なくとも１つの特徴を示すように再プログラムされた、分化した哺乳動物体細胞（例えば、皮膚などの成体体細胞）も指すものとする。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１－８７２、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０８（１９）：７８３８－７８４３、Ｓｅｌｌ（２０１３）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋを参照されたい。

【0174】

用語「形質導入効率」は、少なくとも１つのＡＡＶゲノムで形質導入された細胞のパーセンテージを指す。例えば、１ｘ１０^６個の細胞がウイルスに曝露され、０．５ｘ１０^６個の細胞がＡＡＶゲノムの少なくとも１コピーを含有すると判定された場合、形質導入効率は５０％である。形質導入効率を決定する例示的な方法は、フローサイトメトリーである。例えば、ＡＡＶゲノムが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチドを含む場合、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージは、形質導入効率の尺度である。

【0175】

用語「選択性」は、１つの細胞型の、別の細胞型、又は他の全ての細胞型に対する形質導入効率の比率を指す。

【0176】

用語「感染力」は、ＡＡＶビリオンが、細胞、特にインビボ細胞に感染する能力を指す。したがって、感染力は、少なくとも生体内分布及び中和抗体の回避の関数である。

【0177】

別段の記載がない限り、本明細書全体を通して使用される略語は、以下の意味を有する。ＡＡＶ、アデノ随伴ウイルス、ｒＡＡＶ、組換えアデノ随伴ウイルス；ＡＨＣＦ、成人ヒト心臓線維芽細胞、ＡＰＣＦ、成体ブタ心臓線維芽細胞、ａ－ＭＨＣ－ＧＦＰ；アルファ－ミオシン重鎖緑色蛍光タンパク質；ＣＦ、心臓線維芽細胞；ｃｍ、センチメートル；ＣＯ、心拍出量ＥＦ、駆出率；ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞選別；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＧＭＴ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５；ＧＭＴｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、ＴＧＦ－βｉ、ＷＮＴｉ；ＧＯ、遺伝子オントロジー；ｈＣＦ、ヒト心臓線維芽細胞；ｉＣＭ、誘導心筋細胞；ｋｇ、キリグラム（ｋｉｌｌｉｇｒａｍ）；μｇ、マイクログラム；μｌ、マイクロリットル；ｍｇ、ミリグラム；ｍｌ、ミリリットル；ＭＩ、心筋梗塞；ｍｓｅｃ、ミリ秒；ｍｉｎ、分；ＭｙＡＭＴ、ミオカルジン、Ａｓｃｌ１、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５；ＭｙＡ、ミオカルジン及びＡｓｃｌ１；ＭｙＭＴ、ミオカルジン、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５；ＭｙＭＴｃ、ミオカルジン、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、ＴＧＦ－Ｂｉ、ＷＮＴｉ；ＭＲＩ、磁気共鳴画像法；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水；ＰＢＳＴ、リン酸緩衝食塩水、ｔｒｉｔｏｎ；ＰＦＡ、パラホルムアルデヒド；ｑＰＣＲ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応；ｑＲＴ－ＰＣＲ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＮＡ、リボ核酸；ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＲＮＡシーケンシング；ＲＴ－ＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応；ｓｅｃ、秒；ＳＶ、一回拍出量；ＴＧＦ－β、トランスフォーミング成長因子ベータ；ＴＧＦ－βｉ、トランスフォーミング成長因子ベータ阻害剤；ＷＮＴ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ－Ｉｎｔ；ＷＮＴｉ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ－Ｉｎｔ阻害剤、ＹＦＰ、黄色蛍光タンパク質；４Ｆ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、ＴＢＸ５、及びミオカルジン；４Ｆｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、ＴＢＸ５、及びミオカルジン＋ＴＧＦ－βｉ及びＷＮＴｉ；７Ｆ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５、Ｅｓｓｒｇ、ミオカルジン、Ｚｆｐｍ２、及びＭｅｓｐ１；７Ｆｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５、Ｅｓｓｒｇ、ミオカルジン、Ｚｆｐｍ２、及びＭｅｓｐ１＋ＴＧＦ－β及びＷＮＴｉを含む。

【0178】

用語「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖の物理的特性を置換されている残基と共有するアミノ酸残基の置換を指す。保存的置換には、極性残基の極性、非極性残基の非極性、疎水性残基の疎水性、小さい残基の小ささ、及び大きい残基の大きさが含まれる。保存的置換は、以下の群内の置換を更に含む：｛Ｓ、Ｔ｝、｛Ａ、Ｇ｝、｛Ｆ、Ｙ｝、｛Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｅ｝、｛Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ｝、｛Ｃ、Ｕ、Ｇ、Ｐ、Ａ｝、及び｛Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗ｝。

【0179】

組成物
遺伝子療法に有用な特性を有するキャプシドバリアントを同定する努力には、米国特許 第９，２３３，１３１号に記載されるＡＡＶ２及びＡＡＶ５ ｃａｐ遺伝子のＤＮＡのシャッフリング、並びに国際特許 出願 番号ＷＯ２０１２／１４５６０１Ａ２及びＷＯ２０１８／２２２５０３Ａ１に記載される指向性進化法が含まれる。これらの文書の開示は、全ての目的に関して、特にＡＡＶビリオンを作製及び使用する方法、並びにその中に開示されているポリヌクレオチド配列及び遺伝子産物、並びに心臓疾患又は障害の治療に有用な転写因子の組み合わせに関して、本明細書に組み込まれる。

【0180】

ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子によってコードされ、これは右オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とも呼ばれる（左ＯＲＦ、ｒｅｐと対照的に）。代表的なＡＡＶキャプシドの構造は、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１０４０５－１０４０（ＡＡＶ２）、Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１５５６－１１５７０（ＡＡＶ４）、Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１２２６０－１２２７１（ＡＡＶ８）及びＧｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７：１１１８７－１１１９９（ＡＡＶ５）を含む様々な刊行物に記載されている。

【0181】

ＡＡＶキャプシドは、Ｔ＝１の正二十面体対称性で配置された、予測される比１：１：１０の３つのウイルスタンパク質（ＶＰ）、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の６０コピー（合計）を含有する。３つのＶＰは、同じｍＲＮＡから翻訳され、ＶＰ１は、そのＣ末端領域にＶＰ２配列全体に加えて、固有のＮ末端ドメインを含有する。ＶＰ２は、そのＣ末端でＶＰ３に加えて、余分なＮ末端配列を含有する。ほとんどの結晶構造では、全てのキャプシドタンパク質（約５３０アミノ酸）に共通するＣ末端ポリペプチド配列のみが観察される。ＶＰ１のＮ末端固有の領域、ＶＰ１－ＶＰ２重複領域、及びＶＰ３の最初の１４～１６個のＮ末端残基が、主に障害を受けると考えられる。クライオ電子顕微鏡及び画像再構成データは、インタクトＡＡＶキャプシドでは、ＶＰ１及びＶＰ２タンパク質のＮ末端領域がキャプシド内に位置し、受容体及び抗体結合にはアクセスできないことを示唆している。したがって、受容体の付着及び形質導入表現型は、一般的に、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の共通のＣ末端ドメイン内のアミノ酸配列によって決定される

【0182】

いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸の挿入、置換、又は欠失は、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＧＨループ、又はループＩＶ、例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＧＨループ、又はループＩＶ、の溶媒アクセス可能部分にある。ＡＡＶキャプシドのＧＨループ／ループＩＶについては、例えば、ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：８０９、Ｐａｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７、及びＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１９５５を参照されたい。いくつかの実施形態では、「親」ＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ５キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、「親」ＡＡＶキャプシドタンパク質は、キメラキャプシドタンパク質である。様々なＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で公知である。例えば、ＡＡＶ１についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４９５４２、ＡＡＶ４についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４４９２７、ＡＡＶ５についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ１３７５６、ＡＡＶ６についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ９５４５０、ＡＡＶ７についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０７７１７８、ＡＡＶ８についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０７７１８０、ＡＡＶ９についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ９９２６４、及びＡＡＶ１０についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＴ４６３３７を参照されたい。例えば、予測される祖先ＡＡＶキャプシドについては、Ｓａｎｔｉａｇｏ－Ｏｒｔｉｚ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：９３４を参照されたい。

【0183】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製欠損型パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは約４．７ｋｂの長さであり、２つの１４５ヌクレオチド末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６に提供される。ＡＡＶの生活環及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。シュードタイプｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ ０１／８３６９２に開示されている。キャプシド変異を有するｒＡＡＶなど、他の種類のｒＡＡＶバリアントもまた企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。例示的なＡＡＶベクターは、ＵＳ７，１０５，３４５、ＵＳ１５／７８２，９８０、ＵＳ７，２５９，１５１、ＵＳ６，９６２，８１５、 ＵＳ７，７１８，４２４、ＵＳ６，９８４，５１７、ＵＳ７，７１８，４２４、ＵＳ６，１５６，３０３、ＵＳ８，５２４，４４６、ＵＳ７，７９０，４４９、ＵＳ７，９０６，１１１、ＵＳ９，７３７，６１８、米国出願１５／４３３，３２２、ＵＳ７，１９８，９５１に提供され、これらの各々が全ての目的に関してその全体が参照により組み込まれる。

【0184】

本開示のｒＡＡＶビリオンは、１つ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。遺伝子産物は、ポリペプチド若しくはＲＮＡ、又はその両方であってもよい。遺伝子産物がポリペプチドである場合、ヌクレオチド配列は、任意選択的に１つ以上のイントロンとともに遺伝子産物ポリペプチドに翻訳されるメッセンジャーＲＮＡをコードする。ヌクレオチド配列は、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の遺伝子産物をコードしてもよい（ただし、その数は、ｒＡＡＶビリオンのパッケージング能力、典型的には約５．２ｋｂ、によって制限される）。遺伝子産物は、１つのプロモーター（単一の転写単位に対して）又は２つ以上のプロモーターに作動可能に連結されてもよい。複数の遺伝子産物はまた、配列内リボソーム進入シグナル（ＩＲＥＳ）又は自己切断ペプチド（例えば、２Ａペプチド）を使用して産生されてもよい。

【0185】

いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド遺伝子産物は、心筋線維芽細胞の再プログラミングを誘導して、誘導心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）を生成するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド遺伝子産物は、心臓細胞の機能を強化するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド遺伝子産物は、心臓細胞において欠失又は欠損している機能を提供するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド遺伝子産物は、ゲノム編集エンドヌクレアーゼである。

【0186】

いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、異種ポリペプチドに融合された融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、細胞内局在性を提供するアミノ酸配列に融合されたゲノム編集ヌクレアーゼを含み、すなわち、融合パートナーは、細胞内局在性配列である（例えば、核を標的化するための１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、２つ以上のＮＬＳ、３つ以上のＮＬＳなど）。

【0187】

一般に、ウイルスベクターは、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ構築物を、「産生細胞」又は「パッケージング細胞」株に導入することによって産生される。パッケージング細胞株には、任意の容易にトランスフェクト可能な細胞株が含まれるが、これらに限定されない。パッケージング細胞株は、ＨＥＫ２９１、２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ、ＨｅＬａ又はＳｆ９細胞株に基づくことができる。パッケージング細胞株の例としては以下が挙げられるが、これに限定されない。Ｓｆ９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１７１１（商標））。ｒＡＡＶビリオンを生成するための例示的パッキング細胞株及び方法は、国際特許 公開 番号ＷＯ２０１７／０７５６２７、ＷＯ２０１５／０３１６８６、ＷＯ２０１３／０６３３７９、ＷＯ２０１１／０２０７１０、ＷＯ２００９／１０４９６４、ＷＯ２００８／０２４９９８、ＷＯ２００３／０４２３６１、及びＷＯ１９９５／０１３３９２、米国特許 番号ＵＳ９４４１２０６Ｂ２、ＵＳ８６７９８３７、及びＵＳ７０９１０２９Ｂ２に提供される。

【0188】

いくつかの実施形態では、遺伝子産物は機能的心臓タンパク質である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、非機能的心臓タンパク質を機能的心臓タンパク質に交換又は修復する、ゲノム編集エンドヌクレアーゼ（任意選択的に、ガイドＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ、及び／又は修復テンプレートを含む）である。機能的心臓タンパク質としては、これらに限定されないが、心筋トロポニンＴ；心臓サルコメアタンパク質；β－ミオシン重鎖；心室ミオシン必須軽鎖１（ｍｙｏｓｉｎ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ １）；心室ミオシン調節軽鎖２（ｍｙｏｓｉｎ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ２）；心臓ａ－アクチン；ａ－トロポミオシン；心筋トロポニンＩ；心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ；４．５ＬＩＭタンパク質１（ｆｏｕｒ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ＬＩＭ ｐｒｏｔｅｉｎ １）；チチン；５’－ＡＭＰ－活性化プロテインキナーゼサブユニットガンマ－２；トロポニンＩ ３型、ミオシン軽鎖２、アクチンアルファ心筋１；心臓ＬＩＭタンパク質；カベオリン３（ＣＡＶ３）；ガラクトシダーゼアルファ（ＧＬＡ）；リソソーム膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグリシン（ＭＴＴＧ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡイソロイシン（ＭＴＴＩ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡリジン（ＭＴＴＫ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグルタミン（ＭＴＴＱ）；ミオシン軽鎖３（ＭＹＬ３）、トロポニンＣ（ＴＮＮＣ１）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）；筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）；ストロマ由来因子１（ＳＤＦ－１）、アデニル酸シクラーゼ－６（ＡＣ６）、ベータ－ＡＲＫｃｔ（β－アドレナリン受容体キナーゼＣ末端）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子；低酸素誘導性成長因子、チモシンベータ４（ＴＭＳＢ４Ｘ）；一酸化窒素シンターゼ－３（ＮＯＳ３）；ウノカルチン（ｕｎｏｃａｒｔｉｎ）３（ＵＣＮ３）；メルシン（ｍｅｌｕｓｉｎ）；アポリポタンパク質（ａｐｏｐｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅ（ＡｐｏＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、及びＳ１００Ａ１（低分子カルシウム結合タンパク質；例えば、Ｒｉｔｔｅｒｈｏｆｆ ａｎｄ Ｍｏｓｔ（２０１２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９：６１３、Ｋｒａｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４７：４４５を参照されたい。）が挙げられる。

【0189】

いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、その発現が、遺伝的障害の原因となる遺伝子の欠損を補う遺伝子産物である。本開示は、例えば限定されないが、括弧内に示される障害に使用するために、又は各々によって引き起こされる他の障害のために、以下のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶビリオンを提供する：ＴＡＺ（バース症候群）、ＦＸＮ（フリードライヒ運動失調）、ＣＡＳＱ２（ＣＰＶＴ）、ＦＢＮ１（マルファン）、ＲＡＦ１及びＳＯＳ１ｓ（ヌーナン）、ＳＣＮ５Ａ（ブルガダ）、ＫＣＮＱ１及びＫＣＮＨ２ｓ（ＱＴ延長症候群）、ＤＭＰＫ（筋強直性ジストロフィー１型）、ＬＭＮＡ（肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型）、ＪＵＰ（ナクソス）、ＴＧＦＢＲ２（ロイス－ディーツ）、ＥＭＤ（Ｘ－連鎖ＥＤＭＤ）、並びにＥＬＮ（ＳＶ大動脈弁狭窄）。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）；ＢＡＧファミリー分子シャペロン調節因子３（ＢＡＧ３）；ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）；トロポミオシン１（ＴＰＭ１）；ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）；５’－ＡＭＰ－活性化プロテインキナーゼサブユニットガンマ－２（ＰＲＫＡＧ２）；トロポニンＩ ３型（ＴＮＮＩ３）；チチン（ＴＴＮ）；ミオシン、軽鎖２（ＭＹＬ２）；アクチン、アルファ心筋１（ＡＣＴＣ１）；カリウム電位依存性チャネル、ＫＱＴ様サブファミリー、メンバー１（ＫＣＮＱ１）；プラコフィリン２（ＰＫＰ２）；筋細胞エンハンサー因子２ｃ（ＭＥＦ２Ｃ）；及び心臓ＬＩＭタンパク質（ＣＳＲＰ３）のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0190】

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子産物は、ポリペプチド再プログラミング因子である。再プログラミング因子は、１つの細胞型を別の細胞型に変換する手段として望ましい。非心筋細胞は、当業者に利用可能な任意の方法を使用して、インビトロ又はインビボで心筋細胞に分化させることができる。例えば、Ｉｅｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ １４２：３７５－３８６、Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ６３５７７、Ａｄｄｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．６０：９７－１０６、Ｊａｙａｗａｒｄｅｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１１０：１４６５－１４７３、Ｎａｍ Ｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１０：５５８８－５５９３、Ｗａｄａ Ｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１０：１２６６７－１２６７２、及びＦｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １：２３５－２４７に記載される方法を参照されたい。

【0191】

心臓の状況では、再プログラミング因子は、直接、又は中間細胞型のいずれかを介して、心臓線維芽細胞を心臓筋細胞に変換することが可能であり得る。特に、直接再プログラミングが可能であるか、又はまず線維芽細胞を多能性若しくは全能性幹細胞に変換することによって再プログラミングが可能である。このような多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞と呼ばれる。その後心臓筋細胞（ＣＭ）細胞に変換されるｉＰＳ細胞は、ｉＰＳ－ＣＭ細胞と呼ばれる。この例では、インビトロで心臓線維芽細胞から誘導されたｉＰＳ－ＣＭをインビボで使用して、目的のキャプシドタンパク質を選択する。本開示はまた、本開示のキャプシドタンパク質を使用して、インビトロで、順にｉＰＳ－ＣＭ細胞を生成することも想定しているが、特にインビボで、治療的遺伝子療法レジメンの一部として使用することを想定している。誘導心筋細胞様（ｉＣＭ）細胞は、心筋細胞へ直接再プログラミングされた細胞を指す。

【0192】

誘導心筋細胞は、１つ以上の心筋細胞特異的マーカーを発現し、心筋細胞特異的マーカーには、限定されないが、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＣ、トロポミオシン、カベオリン－３、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖－２ａ、ミオシン軽鎖－２ｖ、リアノジン受容体、サルコメアａ－アクチン、Ｎｋｘ２．５、コネキシン４３及び心房性ナトリウム利尿因子が挙げられる。誘導心筋細胞はまた、サルコメア構造を呈することができる。誘導心筋細胞では、心筋細胞特異的遺伝子ＡＣＴＣ１（心臓ａ－アクチン）、ＡＣＴＮ２（アクチンａ２）、ＭＹＨ６（ア－ミオシン重鎖）、ＲＹＲ２（リアノジン受容体２）、ＭＹＬ２（ミオシン調節軽鎖２、心室アイソフォーム）、ＭＹＬ７（ミオシン調節軽鎖、心房アイソフォーム）、ＴＮＮＴ２（トロポニンＴ ２型、心臓）、及びＮＰＰＡ（ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ型）、ＰＬＮ（ホスホランバン）の発言の増加を示す。ｉＣＭが由来する線維芽細胞と比較して、誘導心筋細胞では、Ｃｏｌｌａ２（コラーゲンｌａ２）などの線維芽細胞マーカーの発現が下方制御される。

【0193】

ポリペプチド再プログラミング因子を伴う再プログラミング方法（場合により、ｒＡＡＶとともに供給される低分子再プログラミング因子によって補充される）には、ＵＳ２０１８／０１１２２８２Ａ１、ＷＯ２０１８／００５５４６、ＷＯ２０１７／１７３１３７、ＵＳ２０１６／０１８６１４１、ＵＳ２０１６／０２５１６２４、ＵＳ２０１４／０３０１９９１、及びＵＳ２０１３／０２１６５０３Ａ１に記載される方法が含まれ、特に開示される再プログラミング方法及び因子について、その全体が組み込まれる。

【0194】

いくつかの実施形態では、心臓細胞は、目的の１つ以上のポリヌクレオチド又はタンパク質の発現を調節する１つ以上の再プログラミング因子、例えば、Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅホモログ１（ＡＳＣＬ１）、ミオカルジン（ＭＹＯＣＤ）、筋細胞特異的エンハンサー因子２Ｃ（ＭＥＦ２Ｃ）、及び／又はＴ－ボックス転写因子５（ＴＢＸ５）を使用して、誘導心筋細胞様（ｉＣＭ）細胞に再プログラミングされる。いくつかの実施形態では、１つ以上の再プログラミング因子は、目的の１つ以上のポリヌクレオチド又はタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡポリヌクレオチド）として提供される。いくつかの実施形態では、１つ以上の再プログラミング因子は、タンパク質として提供される。

【0195】

いくつかの実施形態では、再プログラミング因子は、マイクロＲＮＡ又はマイクロＲＮＡアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、又は目的の１つ以上のポリヌクレオチド若しくはタンパク質の発現を増加させることができる低分子である。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチド又はタンパク質の発現は、マイクロＲＮＡ又はマイクロＲＮＡアンタゴニストの発現によって増加する。例えば、Ｏｃｔポリペプチドの内因性発現は、マイクロＲＮＡ－３０２（ｍｉＲ－３０２）の導入によって、又はｍｉＲ－３０２の発現の増加によって増加させることができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３１（２）：２５９－６８（２０１３）を参照されたい。したがって、ｍｉＲＮＡ－３０２は、内因性Ｏｃｔポリペプチド発現の誘導因子であり得る。ｍｉＲＮＡ－３０２は単独で、又はＯｃｔポリペプチドをコードする核酸とともに導入することができる。いくつかの実施形態では、好適な核酸遺伝子産物はマイクロＲＮＡである。適切なｍｉｃｒＲＮＡとしては、例えば、ｍｉｒ－１、ｍｉｒ－１３３、ｍｉｒ－２０８、ｍｉｒ－１４３、ｍｉｒ－１４５、及びｍｉｒ－４９９が挙げられる。

【0196】

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、低分子再プログラミング因子の投与の前、最中、又は後に、本開示のｒＡＡＶビリオンを投与することを含む。いくつかの実施形態では、低分子再プログラミング因子は、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ－１９３１８９、デキサメタゾン、ＬＹ３６４９４７、Ｄ４４７６、ミリセチン、ＩＷＲ１、ＸＡＶ９３９、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、Ｓ－ニトロソ－ＴＶ－アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）、Ｈｈ－Ａｇｌ．５、アルプロスタジル、クロマカリム、ＭＮＩＴＭＴ、Ａ７６９６６２、レチノイン酸ｐ－ヒドキシアニリド、デカメトニウムジブロミド、ニフェジピン、ピロキシカム、バシトラシン、アズトレオナム、ハルマロール塩酸塩、アミド－Ｃ２（Ａ７）、Ｐｈ－Ｃ１２（ＣＩＯ）、ｍＣＦ３－Ｃ－７（Ｊ５）、Ｇ８５６－７２７２（Ａ４７３）、５４７５７０７、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される低分子である。

【0197】

いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５から選択される対象の１つ以上の目的のタンパク質の発現を調節する再プログラミング因子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＯＣＴ４、ＢＡＦ６０Ｃ、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ２、ＩＲＸ４、ＩＳＬＬ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＮＫＸ２．５、ＳＲＦ、ＴＢＸ２０、ＺＦＰＭ２、並びにｍｉＲ－１３３から選択される１つ以上の再プログラミング因子を含む。

【0198】

いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５（すなわち、ＧＭＴ）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５（すなわち、ＭｙＭＴ）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５（すなわち、ＭｙＡＭＴ）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＭＹＯＣＤ及びＡＳＣＬ１（すなわち、ＭｙＡ）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、及びＭＹＯＣＤ（すなわち、４Ｆ）を含む。他の実施形態では、遺伝子産物は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＥＳＳＲＧ、ＭＹＯＣＤ、ＺＦＰＭ２、及びＭＥＳＰ１（すなわち、７Ｆ）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＡＳＣＬ１、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＭＹＯＣＤ、ＥＳＲＲＧ、及びＭＥＳＰＬのうちの１つ以上を含む。

【0199】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、インビトロ又はインビボで心臓筋細胞を生成する。心筋細胞（Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）又は心臓筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅ）は、心筋を構成する筋細胞である。各々の心筋細胞は、筋細胞の収縮単位であるサルコメアの長鎖である筋原線維を含有する。心筋細胞は、骨格筋細胞のものと類似した横紋（ｓｔｒｉａｔｉｏｎ）を示すが、多核骨格細胞とは異なり、それらは１つの核のみを含有する。心筋細胞はミトコンドリア密度が高く、ＡＴＰを迅速に産生できるため、疲労に対する強い耐性がある。成熟心筋細胞は、以下の心筋マーカーのうちの１つ以上を発現することができる：α－アクチニン、ＭＬＣ２ｖ、ＭＹ２０、ｃＭＨＣ、ＮＫＸ２－５、ＧＡＴＡ４、ｃＴＮＴ、ｃＴＮＩ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＬＣ２ａ、又はそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態では、成熟心筋細胞は、ＮＫＸ２－５、ＭＥＦ２Ｃ、又はそれらの組み合わせを発現する。いくつかの実施形態では、心筋前駆細胞は、ＧＡＴＡ４、ＩＳＬ１、又はそれらの組み合わせなどの初期心筋前駆体マーカーを発現する。

【0200】

いくつかの実施形態では、遺伝子産物はポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、以下に記載されるように、遺伝子産物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合することができるガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、例えば、心臓細胞におけるｍＲＮＡ及び／又はポリペプチド遺伝子産物のレベルを低減させることができる阻害性核酸である。例えば、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド遺伝子産物は、心疾患又は障害を引き起こす対立遺伝子によってコードされる転写物を選択的に不活化することができる干渉ＲＮＡである。一例として、対立遺伝子は、肥大型心筋症を引き起こす変異を含むミオシン重鎖７、心筋、ベータ（ＭＹＨ７）対立遺伝子である。他の例には、例えば、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）又は左心室緻密化障害（ＬＶＮＣ）を引き起こす対立遺伝子によってコードされる転写物を選択的に不活化する干渉ＲＮＡが挙げられ、ここで、対立遺伝子は、ＭＹＬ３（ミオシン軽鎖３、アルカリ、心室、骨格遅筋（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｓｌｏｗ））、ＭＹＨ７、ＴＮＮＩ３（トロポニンＩ ３型（心臓））、ＴＮＮＴ２（トロポニンＴ ２型（心臓））、ＴＰＭｌ（トロポミオシン１（アルファ））又はＨＣＭを引き起こす、ＤＣＭを引き起こす若しくはＬＶＮＣを引き起こす変異を含むＡＣＴＣｌ対立遺伝子である。例えば、心臓疾患を引き起こす変異の例に関しては、例えば米国特許 公開 第２０１６／０２３７４３０号を参照されたい。

【0201】

いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドをコードするＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、干渉ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、アプタマーである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、治療ポリペプチド、例えば、臨床的利益を提供するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、標的核酸の改変を提供するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ｉ）標的核酸の改変を提供するＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）標的核酸中の標的配列に結合する第１のセグメント、及びＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントを含むガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ｉ）標的核酸の改変を提供するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、ｉｉ）標的核酸中の第１の標的配列に結合する第１のセグメント、及びＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントを含む第１のガイドＲＮＡ、及びｉｉｉ）標的核酸中の第２の標的配列に結合する第１のセグメント、及びガイドＲＮＡに結合する第２のセグメントを含む第１のガイドＲＮＡである。

【0202】

本開示のｒＡＡＶビリオン中の異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに動作可能に連結され得る。例えば、本開示のｒＡＡＶビリオン中の異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、調節可能プロモーター、又は心臓細胞特異的プロモーターに動作可能に連結され得る。好適な構成的プロモーターとしては、ヒト伸長因子１αサブユニット（ＥＦｌα）プロモーター、β－アクチンプロモーター、α－アクチンプロモーター、β－グルクロニダーゼプロモーター、ＣＡＧプロモーター、スーパーコアプロモーター、及びユビキチンプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオン中の異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、心臓特異的転写調節エレメント（ＴＲＥ）に動作可能に連結され、ここで、心臓特異的ＴＲＥは、プロモーター及びエンハンサーを含む。適切な心臓特異的ＴＲＥには、限定されないが、以下の遺伝子に由来するＴＲＥ：ミオシン軽鎖－２（ＭＬＣ－２）、ａ－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）、デスミン、ＡＥ３、心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）、及び心臓アクチンが挙げられる。Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０－５６６、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５２：４９２－５０５、Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：５８４－５９１、Ｐａｒｍａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１８７０－１８８５、Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２：６０８－６１７、及びＳａｒｔｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４０４７－４０５１。同様にＰａｃａｋ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｇｅｎｅｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｔｈｅｒ．６：１３も参照されたい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ａ－ＭＨＣプロモーター、ＭＬＣ－２プロモーター、又はｃＴｎＴプロモーターである。

【0203】

遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、プロモーター及び／又はエンハンサーに動作可能に連結され、遺伝子産物の発現を促進する。利用される宿主／ベクターシステムに応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、いくつもの適切な転写及び翻訳制御エレメントうちのいずれかを、ｒＡＡＶビリオンにおいて使用してもよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４）。

【0204】

別個のプロモーター及び／又はエンハンサーを、ポリヌクレオチドの各々に使用することができる。いくつかの実施形態では、同じプロモーター及び／又はエンハンスが、単一のオープンリーディングフレーム内の二つ以上のポリヌクレオチドに使用される。遺伝子エレメントのこの配置を用いるベクターは、「ポリシストロニック」と呼ばれる。ポリシストロニックベクターの例示的な例は、２Ａ領域によって連結された二つ以上のポリヌクレオチドを含む単一のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたエンハンサー及びプロモーターを含み、それによってオープンリーディングフレームの発現は、複数のポリペプチドを同時翻訳で生成される。２Ａ領域は、コドンスキッピングを介して複数のポリペプチド配列の生成を媒介すると考えられているが、本開示は、翻訳後切断を利用して、同じポリヌクレオチドから２つ以上の目的のタンパク質を生成するポリシストロニックベクターにも関連する。例示的２Ａ配列、ベクター、及び関連する方法は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００４／０２６５９５５Ａ１に提供される。

【0205】

適切な真核性プロモーター（真核細胞で機能するプロモーター）の非限定的な例としては、ＣＭＶ、ＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、早期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長末端反復（ＬＴＲ）、及びマウスメタロチオネイン－Ｉが挙げられる。いくつかの実施形態では、心臓特異的発現を供与することができるプロモーターが使用される。好適な心臓特異的プロモーターの非限定的な例としては、デスミン（Ｄｅｓ）、アルファ－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、及び心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）が挙げられる。好適なニューロン特異的プロモーターの非限定的な例としては、シナプシンＩ（ＳＹＮ）、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ、テブリンアルファＩ、ニューロン特異的エノラーゼ、及び血小板由来成長因子ベータ鎖プロモーター、並びにサイトメガロウイルスエンハンサー（Ｅ）をそれらのニューロン特異的プロモーターに融合させることによるハイブリッドプロモーターが挙げられる。

【0206】

再プログラミング因子の発現を駆動するための適切なプロモーターの例としては、限定されるものではないが、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）エレメント；構成的プロモーター、例えばＣＭＶ、ＨＳＶ１－ＴＫ、ＳＶ４０、ＥＦ－ｌａ、β－アクチン、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）；誘導性プロモーター、例えば、Ｔｅｔ－オペレーターエレメントを含むものなど、心臓特異的プロモーター、デスミン（ＤＥＳ）、アルファ－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）及び心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）；神経特異的プロモーター、例えばネスチン、神経核（ＮｅｕＮ）、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、ベータＩＩＩチューブリン、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、オリゴデンドロサイト系統（Ｏｌｉｇｌ／２）、及びグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；並びに膵臓特異的プロモーター、例えばＰａｘ４、Ｎｋｘ２。２、Ｎｇｎ３、インスリン、グルカゴン、及びソマトスタチンが挙げられる。

【0207】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞型特異的転写調節エレメント（ＴＲＥ）に動作可能に連結され、ＴＲＥはプロモーター及びエンハンサーを含む。適切なＴＲＥには、限定されないが、以下の遺伝子に由来するＴＲＥ：ミオシン軽鎖－２、ａ－ミオシン重鎖、ＡＥ３、心筋トロポニンＣ、及び心臓アクチンが含まれる。Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０－５６６、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５２：４９２－５０５、Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：５８４－５９１、Ｐａｒｍａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１８７０－１８８５、Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２：６０８－６１７、及びＳａｒｔｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：４０４７－４０５１。

【0208】

プロモーターは、遺伝子又は核酸セグメントと自然に会合するものであってもよい。同様に、ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）については、プロモーターは、マイクロＲＮＡ遺伝子（例えば、ｍｉＲＮＡ－３０２遺伝子）と自然に会合するプロモーターであってもよい。こうした自然に会合するプロモーターは、「自然プロモーター」と称することができ、コードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得することができる。同様に、エンハンサーは、核酸配列と自然に会合するものであってもよい。しかしながら、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置することができる。

【0209】

あるいは、特定の利点は、コード核酸セグメントを、その自然環境において通常核酸と会合しないプロモーターを指す、組換え又は異種プロモーターの制御下に配置することによって得られる。組換えエンハンサー又は異種エンハンサーはまた、その自然環境において核酸配列と通常会合しないエンハンサーも指す。こうしたプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、並びに任意の他の原核細胞、ウイルス細胞、又は真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及びプロモーター又はエンハンサーであって、「天然型」ではない、すなわち、異なる転写制御領域の異なるエレメント、及び／又は発現を変化させる変異を含有するプロモーター又はエンハンサーを含み得る。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、本明細書に開示される組成物に関して、ＰＣＲ（商標）を含む組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を使用して、配列を産生してもよい（各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたい）。

【0210】

使用されるプロモーターは、構成的、誘導性、発生特異的、組織特異的であり得、及び／又は核酸セグメントの高レベルの発現を方向付ける適切な条件下で有用であり得る。例えば、プロモーターは、構成的プロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルスの最初期プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＨＳＶ１－ＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、ＰＧＫプロモーター、又はそれらの組み合わせであってもよい。使用できる真核性プロモーターの例としては、以下に限定されないが、構成的プロモーター、例えばＣＭＶ、ＳＶ４０及びＲＳＶプロモーターなどのウイルスプロモーター、並びに調製可能プロモーター例えば、ｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーター、及びＣＲＥにより調節される合成プロモーターなどの誘導性又は抑制性プロモーターが挙げられる。特定の実施形態では、細胞型特異的プロモーターは、特定の細胞型における再プログラミング因子の発現を駆動するために使用される。本明細書に記載される方法に有用な好適な細胞型特異的プロモーターの例としては、限定されるものではないが、Ｈｅ ｅｔ ａｌ（２００６）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：９４９－９５９に記載される合成マクロファージ特異的プロモーター、顆粒球及びマクロファージ特異的リゾザイムＭプロモーター（例えば、 Ｆａｕｓｔ ｅｔ ａｌ（２０００），Ｂｌｏｏｄ ９６（２）：７１９－７２６を参照されたい）、及び骨髄特異的ＣＤ１１ｂプロモーター（例えば、Ｄｚｉｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ（１９９５），Ｂｌｏｏｄ ８５（２）：３１９－３２９を参照されたい）が挙げられる。採用され得るプロモーターの他の例には、ヒトＥＦ１α伸長因子プロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＣＡＧニワトリアルブミンプロモーター、本明細書に記載されるウイルスベクターのうちのいずれかと関連付けられたウイルスプロモーター、又は本明細書に記載されるプロモーターのうちのいずれかと相同なプロモーター（例えば、別の種からの）が挙げられる。使用され得る原核プロモーターの例としては、限定されるものではないが、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ５、ｔａｃ、ｂｌａ、ｔｒｐ、ｇａｌ、ｌａｃ、又はマルトースプロモーターが挙げられる。

【0211】

いくつかの実施形態では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを使用して、マルチ遺伝子又はポリシストロニックのメッセージを作成できる。ＩＲＥＳエレメントは、５’－メチル化Ｃａｐ依存的翻訳のリボソームスキャンニングモデルを迂回して、内部部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４（６１８０）：３２０－３２５（１９８８））。ピコルナウイルス科の２つのメンバー（ポリオ及び脳心筋炎）からのＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４（６１８０）：３２０－３２５（１９８８））、並びに哺乳動物メッセージからのＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋ＆Ｓａｍｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０－９４（１９９１））が記載されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。ＩＲＥＳによって各々が隔てられた、複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写し、ポリシストロニックメッセージを作成することができる。ＩＲＥＳエレメントにより、各々のオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームからアクセス可能である。複数の遺伝子を、単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現して、単一のメッセージを転写することができる（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９２５，５６５号及び第５，９３５，８１９号を参照されたい）。

【0212】

いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ポリアデニル化配列に動作可能に連結される。適切なポリアデニル化配列には、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル（ｂＧＨｐｏｌｙＡ）及び短いポリＡシグナルが含まれる。任意選択的に、本開示のｒＡＡＶベクターは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、いわゆる自己切断ペプチド、例えばＰ２Ａペプチドを含む配列によって結合される。

【0213】

いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的エンドヌクレアーゼを含み、例えば、エンドヌクレアーゼは、心疾患又は障害に関連する対立遺伝子をノックアウトする。例えば、優性対立遺伝子が、野生型の場合、心臓構造タンパク質である遺伝子の欠損コピーをコードし、かつ／又は正常な心臓機能を提供する場合、部位特異的エンドヌクレアーゼを欠損対立遺伝子に標的化し、欠損対立遺伝子をノックアウトすることができる。いくつかの実施形態では、部位特異的エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。

【0214】

欠損対立遺伝子をノックアウトすることに加えて、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、欠損対立遺伝子によってコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするドナーＤＮＡとの相同組換えを刺激することもできる。例えば、主題のｒＡＡＶビリオンを使用して、欠損対立遺伝子、欠損対立遺伝子（又はその断片）の機能的コピーをノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼの両方を送達し、その結果、欠損対立遺伝子を修復し、それによって機能的心臓タンパク質の（例えば、機能的トロポニンなど）産生を提供することができる。いくつかの実施形態では、主題のｒＡＡＶビリオンは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする異種ヌクレオチド配列と、欠損対立遺伝子の機能的コピーをコードする異種ヌクレオチド配列を含み、機能的コピーは、機能的心臓タンパク質をコードする。機能的な心臓タンパク質には、例えば、トロポニン、塩素イオンチャネルなどが挙げられる。

【0215】

使用に適した部位特異的エンドヌクレアーゼとしては、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられるが、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼは、非天然型であり、特定の遺伝子を標的とするように改変されている。こうした部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の位置を切断するように操作することができ、非相同末端結合はその後、いくつかのヌクレオチドを挿入又は欠失させながら切断を修復することができる。そのような部位特異的エンドヌクレアーゼ（「ＩＮＤＥＬ」とも称される）は、次いでタンパク質をフレームから外し、遺伝子を効果的にノックアウトする。例えば、米国特許 公開 第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。適切な部位特異的エンドヌクレアーゼには、操作されたメガヌクレアーゼ再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。適切なエンドヌクレアーゼは、Ｉ－Ｔｅｖｌヌクレアーゼを含む。適切なメガヌクレアーゼには、Ｉ－Ｓｃｅｌが含まれる（例えば、Ｂｅｌｌａｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２：１０３７を参照されたい）、及びＩ－Ｃｒｅｌ（例えば、Ｈｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：４６８を参照されたい）。使用に適した部位特異的エンドヌクレアーゼには、ＣＲＩＳＰＲｉシステム及びＣａｓ９に基づくＳＡＭシステムが含まれる。

【0216】

いくつかの実施形態では、遺伝子産物はＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ガイドＲＮＡ、例えば、シングルガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、１）ガイドＲＮＡ、及び２）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。ガイドＲＮＡは、ａ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合するタンパク質結合領域、及びｂ）標的核酸に結合する領域を含み得る。ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、本明細書では「ゲノム編集ヌクレアーゼ」とも呼ばれる。

【0217】

適切なゲノム編集ヌクレアーゼの例としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＩＩ型、Ｖ型、又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）である。適切なゲノム編集ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＩＩ型、Ｖ型、又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆｌタンパク質、Ｃ２ｃｌタンパク質、又はＣ２ｃ３タンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、クラス２ ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質、また「Ｃａｓｌ３ａ」タンパク質とも呼ばれる）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＣａｓＸタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＣａｓＹタンパク質を含む。

【0218】

使用方法
いくつかの実施形態では、本開示は、標的細胞におけるｒＡＡＶビリオンの増加した形質導入効率をもたらすＡＡＶキャプシドタンパク質を同定する方法を提供する。方法は、そのｒＡＡＶゲノムが、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするｃａｐポリヌクレオチドのライブラリを含む、ｒＡＡＶビリオンの集団を提供することと、任意選択的に、非標的細胞への望ましくないｒＡＡＶビリオンを付着させるのに十分な時間、集団を非標的細胞と接触させることと、ｒＡＡＶビリオンによってｃａｐポリヌクレオチドを標的細胞に形質導入することを可能にするのに十分な時間、集団を標的細胞と接触させることと、標的細胞からのｃａｐポリヌクレオチドをシーケンシングし、それによって、標的細胞における増加した形質導入効率をもたらすＡＡＶキャプシドタンパク質を同定することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、非標的細胞へのｒＡＡＶビリオンの付着を可能にするのに十分な時間、非標的細胞に集団を接触させることによって、ｒＡＡＶビリオンの集団を枯渇させることを更に含む。このような同定方法の非限定的な例を実施例に提供する。

【0219】

本開示は、ｒＡＡＶビリオンを使用して、インビトロで心筋細胞及び／又は心筋細胞様細胞を生成するための方法を提供する。選択された開始細胞を、ｒＡＡＶで形質導入し、任意選択的に、開始細胞を系統及び／又は分化境界を越えて変換して心臓前駆細胞及び／又は心筋細胞を形成するのに十分な時間及び条件下で、低分子再プログラミング因子（形質導入の前、間、又は後）に曝露する。いくつかの実施形態では、開始細胞は、線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、開始細胞は、分化表現型を示す１つ以上のマーカーを発現する。開始細胞の心臓前駆細胞及び心筋細胞への変換にかかる時間は、様々である。例えば、心臓又は心筋細胞マーカーが発現するまで、目的の１つ以上のポリヌクレオチド又はタンパク質を用いた処理後に開始細胞をインキュベートすることができる。このような心臓又は心筋細胞細胞マーカーは、以下のマーカーのうちのいずれかを含み得る：α－ＧＡＴＡ４、ＴＮＮＴ２、ＭＹＨ６、ＲＹＲ２、ＮＫＸ２－５、ＭＥＦ２Ｃ、ＡＮＰ、アクチニン、ＭＬＣ２ｖ、ＭＹ２０、ｃＭＨＣ、ＩＳＬ１、ｃＴＮＴ、ｃＴＮＩ、及びＭＬＣ２ａ、又はそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態では、誘導された心筋細胞細胞は、１つ以上のニューロン細胞マーカーに対して陰性である。このようなニューロン細胞マーカーは、以下のマーカーのうちのいずれかを含み得る：ＤＣＸ、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、及びＥＮＯ２。

【0220】

心臓前駆体マーカーが開始細胞によって発現されるまで、インキュベーションを進行させることができる。こうした心臓前駆体マーカーには、ＧＡＴＡ４、ＴＮＮＴ２、ＭＹＨ６、ＲＹＲ２、又はそれらの組み合わせが含まれる。ＧＡＴＡ４、ＴＮＮＴ２、ＭＹＨ６、ＲＹＲ２、又はそれらの組み合わせなどの心臓前駆体マーカーは、本明細書に記載の組成物中で細胞のインキュベーションを開始後約８日までに、又は約９日までに、又は約１０日までに、又は約１１日までに、又は約１２日までに、又は約１４日までに、又は約１５日までに、又は約１６日までに、又は約１７日までに、又は約１８日までに、又は約１９日までに、又は約２０日までに発現することができる。細胞の更なるインキュベーションを、ＮＫＸ２－５、ＭＥＦ２Ｃ又はそれらの組み合わせなどの後期心臓前駆体マーカーの発現が生ずるまで実施することができる。

【0221】

再プログラミング効率は、心筋細胞マーカーの関数として測定され得る。このような多能性マーカーには、限定されないが、心筋細胞マーカータンパク質及びｍＲＮＡの発現、心筋細胞形態並びに電気生理学的表現型が含まれる。心筋細胞マーカーの非限定的な例としては、ａ－サルコグリカン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、コネキシン３７、コネキシン４０、クリプト（ｃｒｙｐｔｏ）、デスミン、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨ６、ミオシン重鎖、ＮＫＸ２．５、ＴＢＸ５、及びトロポニンＴが挙げられる。

【0222】

心筋細胞に特異的な様々なマーカーの発現は、従来の生化学的又は免疫化学的方法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ、免疫組織化学的アッセイなど）によって検出され得る。あるいは、心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現を評価することができる。細胞における心筋細胞特異的マーカーコード核酸の発現は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）又はハイブリダイゼーション分析、任意のマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡを増幅、検出及び分析するためにこれまでに一般的に使用されている分子生物学的方法によって確認することができる。心筋細胞に特異的なマーカーをコードする核酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースを通して入手可能である。したがって、プライマー又はプローブとしての使用に必要なマーカー特異的配列は、容易に決定される。

【0223】

心筋細胞は、なんらかの心臓特異的な電気生理学的特性を示す。１つの電気的特性は、活動電位であり、これは、各心臓細胞の内部と外部との間の電位の差が、一貫した軌跡に従って上昇及び下降する、短時間の事象である。心筋細胞の別の電気生理学的特徴は、Ｃａ^２＋トランジェントと呼ばれる、細胞質遊離Ｃａ^２＋濃度の周期的変動であり、これは、心筋細胞の収縮及び弛緩の調節に使用される。これらの特徴を検出及び評価して、細胞集団が心筋細胞に再プログラミングされたかどうかを評価することができる。

【0224】

本開示は、遺伝子産物を心臓細胞、例えば、心臓線維芽細胞に送達する方法を提供する。方法は、一般に、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）をｒＡＡＶビリオンで感染させることを含み、ここで、ｒＡＡＶビリオンに存在する異種核酸によってコードされる遺伝子産物が、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）で産生される。心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）への遺伝子産物の送達は、心疾患又は障害の治療を提供することができる。心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）への遺伝子産物の送達は、心臓線維芽細胞から誘導心筋細胞様（ｉＣＭ）細胞の生成を提供することができる。心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）への遺伝子産物の送達は、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）のゲノムの編集を提供することができる。

【0225】

いくつかの実施形態では、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）に感染又は形質導入することは、インビトロで実施される。いくつかの実施形態では、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）に感染又は形質導入することは、インビトロで行われ、感染／形質導入された心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）は、それを必要とする個体に導入され（例えば、輸注される、又は植え込まれる）、例えば、それを必要とする個体の心臓組織に直接導入される。インビトロ形質導入については、細胞に送達される有効量のｒＡＡＶビリオンは、ｒＡＡＶビリオンの約１０^５～約１０^１３個である。他の有効な投薬量は、用量反応曲線を確立する日常的な試験を通して、当業者によって容易に確立され得る。

【0226】

いくつかの実施形態では、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）に感染させることは、インビボで実施される。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、それを必要とする個体の心臓組織に直接投与される。「有効量」は、実験及び／又は臨床試験を通して決定できる比較的広い範囲に入る。例えば、インビボ注射、すなわち心臓組織に直接注射する場合、治療有効用量は、約１０^６～１０^１５個程度の本開示のｒＡＡＶビリオン、例えば、約１０^５～約１０^１２個程度のｒＡＡＶビリオンである。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、心外膜を通しての心筋内注射を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、冠動脈を通しての血管送達を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、上大静脈を通しての全身送達を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、末梢静脈を通しての全身送達を介して投与される。

【0227】

例えば、本開示のｒＡＡＶビリオンの、約１０^４～約１０^５、約１０^５～約１０^６、約１０^６～約１０^７、約１０^６～約１０^７、約１０^７～約１０^８、約１０^８～約１０^９、約１０^９～約１０^１０ _、約１０^１０～約１０^１１ _、約１０^１１まで、約１０^１１～約１０^１２、約１０^１２～約１０^１３、約１０^１３～約１０^１４、約１０^１４～約１０^１５ゲノムコピー、又は１０^１５ゲノムコピーより多くが個体に投与され、例えば、心臓組織に直接投与されるか、又は別の経路を介して投与される。個体に投与されるｒＡＡＶビリオンの数は、個体の体重１キログラム（ｋｇ）当たりのウイルスゲノム（ｖｇ）で表記することができる。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０^２ｖｇ／ｋｇ～１０^４ｖｇ／ｋｇ、約１０^４ｖｇ／ｋｇ～約１０^６ｖｇ／ｋｇ、約１０^６ｖｇ／ｋｇ～約１０^８ｖｇ／ｋｇ、約１０^８ｖｇ／ｋｇ～約１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約１０^１０ｖｇ／ｋｇ～約１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１０^１６ｖｇ／ｋｇ、約１０^１６ｖｇ／ｋｇ～約１０^１８ｖｇ／ｋｇであるか、又は１０^１８ｖｇ／ｋｇより多い。

【0228】

いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、心外膜を通しての心筋内注射を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、冠動脈を通しての血管送達を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、上大静脈を通しての全身送達を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、末梢静脈を通しての全身送達を介して投与される。

【0229】

いくつかの実施形態では、所望のレベルの遺伝子発現を達成するために、２回以上の投与（例えば、２回、３回、４回、又はそれより多くの投与）を用いてもよい。いくつかの実施形態では、２回以上の投与は、様々な間隔で、例えば、毎日、毎週、月２回、毎月、３か月毎、６か月毎、毎年などの間隔で投与される。いくつかの実施形態では、複数回投与は、１か月～２か月、２か月～４か月、４か月～８か月、８か月～１２か月、１年～２年、２年～５年、又は５年を超える期間にわたって投与される。

【0230】

本開示は、心臓線維芽細胞を再プログラミングして誘導心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）を生成する方法を提供する。本方法は、一般に、本開示のｒＡＡＶビリオンで心臓線維芽細胞を感染させることを含み、ｒＡＡＶビリオンは、１つ以上の再プログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。

【0231】

心筋細胞に特異的な様々なマーカーの発現は、従来の生化学的又は免疫化学的方法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ、免疫組織化学的アッセイなど）によって検出される。あるいは、心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現を評価することができる。細胞における心筋細胞特異的マーカーコード核酸の発現は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）又はハイブリダイゼーション分析、任意のマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡを増幅、検出及び分析するためにこれまでに一般的に使用されている分子生物学的方法によって確認することができる。心筋細胞に特異的なマーカーをコードする核酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースを通して利用可能であり、したがってプライマー又はプローブとしての使用に必要なマーカー特異的配列は容易に決定される。

【0232】

誘導心筋細胞はまた、自発収縮を呈することができる。誘発心筋細胞が自発収縮を呈するかどうかは、標準的な電気生理学的方法（例えば、パッチクランプ）を使用して決定することができる。

【0233】

いくつかの実施形態では、誘発心筋細胞は、自発的なＣａ^２＋周期変動を呈することができる。Ｃａ^２＋周期変動は、標準的な方法を使用して、例えば、様々なカルシウム感受性色素のいずれかを使用して検出することができ、細胞内Ｃａ^２＋イオン検出色素としては、限定されるものではないが、ｆｕｒａ－２、ｂｉｓ－ｆｕｒａ ２、ｉｎｄｏ－１、Ｑｕｉｎ－２、Ｑｕｉｎ－２ ＡＭ、ベンゾチアザ－１、ベンゾチアザ－２、ｉｎｄｏ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－ＦＦ、ＢＴＣ、Ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２、Ｍａｇ－Ｆｕｒａ－５、Ｍａｇ－Ｉｎｄｏ－１、ｆｌｕｏ－３、ｒｈｏｄ－２、ｒｈｏｄ－３、ｆｕｒａ－４Ｆ、ｆｕｒａ－５Ｆ、ｆｕｒａ－６Ｆ、ｆｌｕｏ－４、ｆｌｕｏ－５Ｆ、ｆｌｕｏ－５Ｎ、オレゴングリーン４８８ ＢＡＰＴＡ、カルシウムグリーン、カルセイン、Ｆｕｒａ－Ｃ１８、カルシウムグリーン－Ｃ１８、カルシウムオレンジ、カルシウムクリムゾン、カルシウムグリーン－５Ｎ、マグネシウムグリーン、オレゴングリーン４８８ ＢＡＰＴＡ－１、オレゴングリーン４８８ ＢＡＰＴＡ－２、Ｘ－ｒｈｏｄ－１、Ｆｕｒａ Ｒｅｄ、Ｒｈｏｄ－５Ｆ、Ｒｈｏｄ－５Ｎ、Ｘ－Ｒｈｏｄ－５Ｎ、Ｍａｇ－Ｒｈｏｄ－２、Ｍａｇ－Ｘ－ Ｒｈｏｄ－１、Ｆｌｕｏ－５Ｎ、Ｆｌｕｏ－５Ｆ、Ｆｌｕｏ－４ＦＦ、Ｍａｇ－Ｆｌｕｏ－４、エクオリン、デキストランコンジュゲート又はこれらの色素のうちのいずれかの他の誘導体、及びその他（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅのカタログ又はインターネットサイトを参照されたく、同様にＮｕｃｃｉｔｅｌｌｉ，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ４０：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｌａｍｂｅｒｔ，ｅｄ．，Ｃａｌｃｉｕｍ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １１４），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）、Ｗ．Ｔ．Ｍａｓｏｎ，ｅｄ．，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），２００５，Ｄ．Ｇ．Ｌａｍｂｅｒ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）が挙げられる。

【0234】

いくつかの実施形態では、ｉＣＭはインビトロで生成され、ｉＣＭは個体に導入され、例えば、ｉＣＭは、それを必要とする個体の心臓組織に植え込まれる。本開示の方法は、インビトロで心臓線維芽細胞の集団に感染させて、ｉＣＭの集団を生成することを含むことができ、ｉＣＭの集団は、それを必要とする個体の心臓組織に植え込まれる。

【0235】

いくつかの実施形態では、ｉＣＭはインビボで生成される。例えば、いくつかの実施形態では、一つ以上の再プログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む本開示のｒＡＡＶビリオンが、個体に投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、それを必要とする個体の心臓組織に直接投与される。いくつかの実施形態では、１つ以上の再プログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む本開示のｒＡＡＶビリオンの約１０^６～約１０^５、約１０^５～約１０^９、約１０^９～約１０^１０、約１０^１０～約１０^１１、約１０^１１～約１０^１２、約１０^１２～約１０^１３、約１０^１３～約１０^１４、約１０^１４～約１０^１５ゲノムコピー、又は１０^１５ゲノムコピーより多くが個体に投与され、例えば、個体の心臓組織に直接投与されるか、又は別の投与経路を介して投与される。個体に投与されるｒＡＡＶビリオンの数は、個体の体重１キログラム（ｋｇ）当たりのウイルスゲノム（ｖｇ）で表記することができる。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０^２ｖｇ／ｋｇ～１０^４ｖｇ／ｋｇ、約１０^４ｖｇ／ｋｇ～約１０^６ｖｇ／ｋｇ、約１０^６ｖｇ／ｋｇ～約１０^８ｖｇ／ｋｇ、約１０^８ｖｇ／ｋｇ～約１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約１０^１０ｖｇ／ｋｇ～約１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１０^１６ｖｇ／ｋｇであるか、又は１０^１６ｖｇ／ｋｇより多い。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、心外膜を通しての心筋内注射を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、冠動脈を通しての血管送達を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、上大静脈を通しての全身送達を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、末梢静脈を通しての全身送達を介して投与される。

【0236】

本開示は、心臓細胞のゲノムを改変する（「編集する」）方法を提供する。本開示は、心臓線維芽細胞のゲノムを改変する（「編集する」）方法を提供する。本開示は、心筋細胞のゲノムを改変（「編集する」）する方法を提供する。方法は一般的に、本開示のｒＡＡＶビリオンで心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞又は心筋細胞）を感染させることを含み、ｒＡＡＶビリオンは、ゲノム編集エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本開示のｒＡＡＶビリオンで心臓線維芽細胞又は心筋細胞を感染させることを含み、ｒＡＡＶビリオンは、ＲＮＡガイドゲノム編集エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本開示のｒＡＡＶビリオンで心臓線維芽細胞又は心筋細胞を感染させることを含み、ｒＡＡＶビリオンは、ｉ）ＲＮＡガイドゲノム編集エンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）１つ以上のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本開示のｒＡＡＶビリオンで心臓線維芽細胞又は心筋細胞を感染させることを含み、ｒＡＡＶビリオンは、ｉ）ＲＮＡガイドゲノム編集エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）ガイドＲＮＡ、及びｉｉｉ）ドナー鋳型ＤＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。好適なＲＮＡガイドゲノム編集エンドヌクレアーゼは上記のとおりである。

【0237】

いくつかの実施形態では、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞、心筋細胞）を感染させることは、インビトロで実施される。いくつかの実施形態では、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞、心筋細胞）に感染させることはインビトロで行われ、感染した心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）は、それを必要とする個体に導入され（例えば、植え込まれる）、例えば、それを必要とする個体の心臓組織に直接導入される。インビトロでの形質導入については、細胞に送達される有効量のｒＡＡＶビリオンは、ｒＡＡＶビリオンの約１０^ｓ～約１０^１３個程度である。他の有効な投薬量は、用量反応曲線を確立する日常的な試験を通して、当業者によって容易に確立され得る。

【0238】

いくつかの実施形態では、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞、心筋細胞）に感染させることは、インビボで実施される。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、それを必要とする個体の心臓組織に直接投与される。「有効量」は、実験及び／又は臨床試験を通して決定できる比較的広い範囲に入る。例えば、インビボ注射、すなわち心臓組織に直接注射する場合、治療有効用量は、約１０^６～１０^１５個程度の本開示のｒＡＡＶビリオン、例えば１０^１１～約１０^１２個程度のｒＡＡＶビリオンである。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、心外膜を通しての心筋内注射を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、冠動脈を通しての血管送達を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、上大静脈を通しての全身送達を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、末梢静脈を通しての全身送達を介して投与される。

【0239】

例えば、本開示のｒＡＡＶビリオンの、約１０^６～約１０^７、約１０^７～約１０^８、約１０^８～約１０^９、約１０^９～約１０^１０、約１０^１０～約１０^１１、約ｌ０^１１～約１０^１２、約１０^１２～約１０^１３、約１０^１３～約１０^１４、約１０^１４～約１０^１５ゲノムコピー、又は１０^１５ゲノムコピーより多くが個体に投与され、例えば、個体の心臓組織に直接投与される。個体に投与されるｒＡＡＶビリオンの数は、個体の体重１キログラム（ｋｇ）当たりのウイルスゲノム（ｖｇ）で表記することができる。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０^２ｖｇ／ｋｇ～１０^４ｖｇ／ｋｇ、約１０^４ｖｇ／ｋｇ～約１０^６ｖｇ／ｋｇ、約１０^６ｖｇ／ｋｇ～約１０^８ｖｇ／ｋｇ、約１０^８ｖｇ／ｋｇ～約１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約１０^１０ｖｇ／ｋｇ～約１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１０^１６ｖｇ／ｋｇ、約１０^１６ｖｇ／ｋｇ～約１０^１８ｖｇ／ｋｇであるか、又は１０^１８ｖｇ／ｋｇより多い。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、心外膜を通しての心筋内注射を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、冠動脈を通しての血管送達を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、上大静脈を通しての全身送達を介して投与される。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、末梢静脈を通しての全身送達を介して投与される。

【0240】

いくつかの実施形態では、ゲノム編集は、相同組換え修復（ＨＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＤＲは、心臓線維芽細胞又は心筋細胞における内因性標的核酸の欠損を修正し、欠損は、心臓線維芽細胞若しくは心筋細胞、又は心臓線維芽細胞若しくは心筋細胞の成分の構造及び／又は機能の欠損に関連するか、又はそれをもたらす。

【0241】

いくつかの実施形態では、ゲノム編集は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪは、心臓線維芽細胞又は心筋細胞の内因性標的核酸における欠損を除去し、欠損は、心臓線維芽細胞若しくは心筋細胞、又は心臓線維芽細胞若しくは心筋細胞の成分の構造及び／又は機能の欠損に関連するか、又はそれをもたらす。

【0242】

心臓細胞のゲノムを編集するための本開示の方法を使用して、心疾患又は障害を生じさせる様々な遺伝的欠損のうちのいずれかを修正することができる。目的の変異には、以下の遺伝子のうちの１つ以上における変異が含まれる：心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）；ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）；トロポミオシン１（ＴＰＭ１）；ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）；５’－ＡＭＰ－活性化プロテインキナーゼサブユニットガンマ－２（ＰＲＫＡＧ２）；トロポニンＩ ３型（ＴＮＮＩ３）；チチン（ＴＴＮ）；ミオシン、軽鎖２（ＭＹＬ２）；アクチン、アルファ心筋１（ＡＣＴＣ１）；カリウム電位依存性チャネル、ＫＱＴ様サブファミリー、メンバー１（ＫＣＮＱ１）；プラコフィリン２（ＰＫＰ２）；筋細胞エンハンサー因子２ｃ（ＭＥＦ２Ｃ）；及び心臓ＬＩＭタンパク質（ＣＳＲＰ３）。目的の特異的変異としては、限定されるものではないが、ＭＹＨ７ Ｒ６６３Ｈ変異、ＴＮＮＴ２ Ｒ１７３Ｗ、ＰＫＰ２ ２０１３ｄｅｌＣ変異、ＰＫＰ２ Ｑ６１７Ｘ変異、及びＫＣＮＱ１ Ｇ２６９Ｓミスセンス変異が挙げられる。目的の変異には、以下の遺伝子のうちの１つ以上における変異が含まれる：ＭＹＨ６、ＡＣＴＮ２、ＳＥＲＣＡ２、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＭＹＯＣＤ、ＮＫＸ２－５、ＮＯＴＣＨ１、ＭＥＦ２Ｃ、ＨＡＮＤ２、及びＨＡＮＤ１。いくつかの実施形態では、目的の変異は、以下の遺伝子における変異が含まれる：ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、及びＭＹＯＣＤ。本開示の方法を用いて治療できる心臓疾患及び障害には、冠動脈心疾患、心筋症、心内膜炎、先天性心血管異常、及びうっ血性心不全が含まれる。本開示の化合物で治療され得る心疾患又は心障害には、限定されるものではないが、肥大型心筋症、心臓弁膜症、心筋梗塞、うっ血性心不全、ＱＴ延長症候群、心房性不整脈、心室性不整脈、拡張型心不全、収縮型心不全、心臓弁疾患、心臓弁石灰化、左心室心筋緻密化障害、心室中隔欠損症、及び虚血が挙げられる。

【0243】

治療方法
本開示は、治療を必要とする対象において心臓病態を治療する方法であって、治療有効量のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ｒＡＡＶビリオンは心臓組織を形質導入する、方法を提供する。

【0244】

本開示の組成物及び方法を使用した治療を必要とする対象としては、以下に限定されないが、先天性心臓欠陥を有する個体、変性性筋疾患に罹患している個体、虚血性心臓組織をもたらす状態を罹患している個体（例えば、冠動脈疾患を有する個体）などが挙げられる。いくつかの例では、方法は、変性性筋疾患又は状態（例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、又は結果として生じる虚血性心筋症を伴う冠動脈疾患）を治療するために有用である。いくつかの例では、対象となる方法は、心臓又は心血管の疾患又は障害を有する個体を治療するために有用であり、例えば心臓血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管障害（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠動脈弁疾患（ｖａｌｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ）、拡張動脈疾患（ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉｌａｔｅｄ）、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧（高血圧症）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、又は静脈血栓塞栓症である。

【0245】

本開示の組成物、細胞、及び方法を使用した治療に好適な対象は、虚血性心臓組織をもたらす状態を含むがこれに限定されない心臓状態を有する（例えば冠動脈疾患を有する個体）個体（例えば、哺乳動物対象、例えばヒト、非ヒト霊長類、家畜哺乳動物、マウス、ラットなどの実験的非ヒト哺乳動物対象）が含まれる。

【0246】

いくつかの実施例では、治療に好適な対象は、心臓又は心血管疾患又は状態、例えば、心臓血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管事故（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠動脈弁疾患、拡張動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧（高血圧症）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、又は静脈血栓塞栓症に罹患している。いくつかの例では、本発明の方法による治療に好適な個体は、変性性筋疾患又は状態、例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、又は虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患を有する個体を含む。

【0247】

例えば、心臓病態は、うっ血性心不全、心筋梗塞、心臓虚血、心筋炎、及び不整脈からなる群から選択することができる。いくつかの実施形態では、対象は、糖尿病である。いくつかの実施形態では、対象は、非糖尿病である。いくつかの実施形態では、対象は、糖尿病性心筋症に罹患している。

【0248】

治療のために、本開示のｒＡＡＶビリオン及び／又はそれらの医薬組成物は、局所的に又は全身的に投与することができる。ｒＡＡＶビリオンは、注射、カテーテル、植え込み可能なデバイスなどによって導入され得る。ｒＡＡＶビリオンは、細胞に悪影響を及ぼさない任意の生理学的に許容可能な賦形剤又は担体中で投与することができる。例えば、本開示のｒＡＡＶビリオン及び／又はそれらの医薬組成物は、静脈内又は心臓内経路（例えば、心外膜内又は心筋内）を通して投与することができる。本開示のｒＡＡＶビリオン及び／又はそれらの医薬組成物を対象に、特にヒト対象を投与する方法は、医薬組成物（例えば、ｒＡＡＶビリオンを含む組成物）の注射又は注入を含む。注射には、筋肉への直接注射が含まれ得、注入には血管内注入が含まれ得る。ｒＡＡＶビリオン又は医薬組成物は、対象への注射による導入を容易にする送達デバイスに挿入することができる。こうした送達デバイスは、レシピエント対象の体内に細胞及び流体を注入するための管、例えばカテーテルを含む。管は更に、それを通して本発明の細胞は、所望の位置で対象に導入され得る、針、例えば、注射器を含んでもよい。

【0249】

いくつかの実施形態（ｅｍｂｄｏｉｍｅｎｔｓ）では、ｒＡＡＶビリオンは、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は心臓内注射によって、若しくは心臓内カテーテル挿入によって投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、直接心筋内注射又は経血管投与によって投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、直接心筋内注射、順行性冠動脈内注射、逆行性注射、経心内膜注射、又は再循環送達を伴う分子心臓手術（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｒｄｉａｃ ｓｕｒｇｅｒｙ ｗｉｔｈ ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（ＭＣＡＲＤ）によって投与される。

【0250】

ｒＡＡＶビリオンは、このような送達デバイス、例えば、シリンジに、様々な形態で挿入することができる。ｒＡＡＶビリオンは、医薬組成物の形態で供給され得る。そのような組成物は、ヒトでの投与のために十分に滅菌された条件下で調製された等張性賦形剤を含み得る。医薬製剤における一般原則については、Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ｂｙ Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ＆Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６、及びＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ＆Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００を参照されたい。賦形剤及び組成物の任意の付随成分の選択は、用いられる経路及び／又はデバイスによる投与を最適化するように適合され得る。

【0251】

組換えＡＡＶは、局所的に又は全身的に投与されてもよい。組換えＡＡＶは、本開示の適切なキャプシドタンパク質を選択することによって、特定の細胞型を標的とするように操作され得る。様々な治療投与レジメン及びＡＡＶビリオン組成物の用量の適合性を決定するために、ｒＡＡＶビリオンをまず適切な動物モデルで試験することができる。あるレベルで、組換えＡＡＶは、インビボで標的細胞を感染させるそれらの能力について評価される。組換えＡＡＶは、標的組織に移行するかどうか、宿主において免疫反応を誘発するかどうかを確認するため、又は投与されるｒＡＡＶビリオンの適切な数若しくは投薬量を決定するために評価することもできる。治療される疾患に応じて、組換え型ＡＡＶが免疫反応を生成することが望ましい場合、又は望ましくない場合がある。一般に、ビリオンの反復投与が必要な場合、ビリオンが免疫原性でない場合は有利である。試験目的のために、ｒＡＡＶビリオン組成物は、免疫不全動物（ヌードマウス、又は化学的に又は放射線照射によって免疫不全となった動物など）に投与することができる。標的組織又は細胞を、感染期間後に採取し、組織又は細胞が感染したかどうか、及び標的組織又は細胞に所望の表現型（例えば、誘導心筋細胞）が誘導されたかどうかを決定するために評価され得る。

【0252】

組換えＡＡＶビリオンは、心臓への直接注射又は心臓カテーテル挿入を含むがこれに限定されない様々な経路によって投与することができる。あるいは、ｒＡＡＶビリオンは、静脈内注入などにより全身的に投与することができる。直接注射を用いる場合、開心手術又は低侵襲手術のいずれかで実施されうる。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、注射又は注入によって心膜腔に送達される。注射又は注入された組換えウイルスは、様々な方法によって追跡することができる。例えば、検出可能な標識（緑色蛍光タンパク質、又はベータガラクトシダーゼなど）で標識された又はそれを発現する組換えＡＡＶを容易に検出することができる。組換えＡＡＶは、標的細胞に、表面発現タンパク質又は蛍光タンパク質などのマーカータンパク質を発現させるように操作されてもよい。あるいは、組換えＡＡＶによる標的細胞の感染は、試験に利用される動物により発現されない細胞マーカー（例えば、実験動物に細胞を注射する場合のヒト特異的抗原）のそれらの発現によって検出され得る。標的細胞の存在及び表現型は、蛍光顕微鏡法（例えば、緑色蛍光タンパク質、又はベータガラクトシダーゼ）、免疫組織化学法（例えば、ヒト抗原に対する抗体を使用する）、ＥＬＩＳＡ法（ヒト抗原に対する抗体を使用する）、又は心臓表現型を示すＲＮＡに特異的である増幅を引き起こすプライマー及びハイブリダイゼーション条件を使用するＲＴ－ＰＣＲ分析によって評価することができる。

【0253】

医薬組成物
一態様では、本開示は、本開示のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、及び緩衝剤のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、又は緩衝剤は、ヒトでの使用に適している。こうした賦形剤、担体、希釈剤、及び緩衝剤は、過度の毒性なしに投与することができる任意の医薬品を含む。薬学的に許容可能な賦形剤には、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノールなどの液体が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能な塩は、その中に、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸の塩、及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩が含まれ得る。更に、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、このようなビヒクルに存在してもよい。多種多様な薬学的に許容可能な賦形剤が当該技術分野で既知であり、本明細書で詳細に論じる必要はない。薬学的に許容可能な賦形剤は、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，７^ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，３^ｒｄ ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃを含む多様な刊行物において詳細に記載されている。

【0254】

組成物を調製するために、ｒＡＡＶビリオンを作製し、必要に応じて又は所望により精製する。ｒＡＡＶは、薬学的に許容可能な担体と混合されてもよく、又はその中に懸濁されてもよい。これらのｒＡＡＶは、適切な濃度に調整されてもよく、任意選択的に他の薬剤と組み合わせてもよい。単位用量に含まれるｒＡＡＶビリオン及び／又は他の薬剤の濃縮は、大きく変化し得る。用量及び投与数は、当業者によって最適化され得る。例えば、約１０^２～１０^１０のベクターゲノム（ｖｇ）を投与してもよい。いくつかの実施形態では、用量は、少なくとも約１０^２ｖｇ、約１０^３ｖｇ、約１０^４ｖｇ、約１０^５ｖｇ、約１０^６ｖｇ、約１０^７ｖｇ、約１０^８ｖｇ、約１０^９ｖｇ、約^１０ｖｇ、又はそれより多くのベクターゲノムである。化合物の１日用量も同様に変化し得る。こうした１日用量は、例えば、少なくとも約１０^２ｖｇ／日、約１０^３ｖｇ／日、約１０^４ｖｇ／日、約１０^５ｖｇ／日、約１０^６ｖｇ／日、約１０^７ｖｇ／日、約１０^８ｖｇ／日、約１０^９ｖｇ／日、約１０^１０ｖｇ／日、又はより多いベクターゲノム／日の範囲であり得る。

【0255】

特定の実施形態では、治療方法は、１つ以上の抗炎症剤、例えば、抗炎症ステロイド又は非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の投与によって強化される。

【0256】

本発明で使用するための抗炎症性ステロイドには、コルチコステロイド、特にグルココルチコイド活性を有するもの、例えば、デキサメタゾン及びプレドニゾンが含まれる。本発明で使用する非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、一般に、炎症及び疼痛を引き起こすプロスタグランジン、シクロオキシゲナーゼ－１（ＣＯＸ－１）及び／又はシクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）の産生を遮断することによって作用する。従来のＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ－１及びＣＯＸ－２の両方を遮断することによって機能する。ＣＯＸ－２選択阻害剤は、ＣＯＸ－２酵素のみを遮断する。特定の実施形態では、ＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ－２選択阻害剤、例えば、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標^））、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ）、及びバルデコキシブ（Ｂ ｅｘｔｒａ）である。特定の実施形態では、抗炎症性は、ＮＳＡＩＤプロスタグランジン阻害剤、例えば、ピロキシカムである。

【0257】

治療に使用するｒＡＡＶビリオンの量は、選択された特定の担体だけでなく、投与経路、治療される状態の性質、及び患者の年齢及び状態によっても変化する。最終的に、担当の医療提供者が、適切な用量を決定し得る。医薬組成物は、細胞を含む、又は含まない投与のために単一の単位剤形中の各化合物の適切な比で製剤化され得る。細胞又はベクターは、別個に提供され、化合物組成物の液体溶液と混合されてもよく、又は別個に投与されてもよい。

【0258】

組換えＡＡＶは、非経口投与（例えば、注射、例えば、ボーラス注射又は持続注入）のために製剤化されてもよく、アンプル、プレフィルドシリンジ、小容量注入容器、又は保存剤を添加した複数回投与容器で単位剤形中に存在してもよい。医薬組成物は、油性ビヒクル又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又はエマルションの形態を取ることができ、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの配合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含有し得る。適切な担体には、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、及び当技術分野で一般的に使用される他の材料が含まれる。

【0259】

組成物はまた、心疾患、状態、及び損傷の治療に有用な薬剤などの他の成分を含有してもよく、それらは例えば抗凝固剤（例えば、ダルテパリン（ｆｒａｇｍｉｎ）、ダナパロイド（ｏｒｇａｒａｎ）、エノキサパリン（ｌｏｖｅｎｏｘ）、ヘパリン、チンザパリン（ｉｎｎｏｈｅｐ）、及び／又はワーファリン（クマジン）、抗血小板剤（例えば、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、又はジピリダモール）、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（例えば、ベナゼプリル（Ｌｏｔｅｎｓｉｎ）、カプトプリル（Ｃａｐｏｔｅｎ）、エナラプリル（Ｖａｓｏｔｅｃ）、ホシノプリル（Ｍｏｎｏｐｒｉｌ）、リシノプリル（Ｐｒｉｎｉｖｉｌ、Ｚｅｓｔｒｉｌ）、モエキシプリル（Ｕｎｉｖａｓｃ）、ペリンドプリル（Ａｃｅｏｎ）、キナプリル（Ａｃｃｕｐｒｉｌ）、ラミプリル（Ａｌｔａｃｅ）、及び／又はトランドラプリル（Ｍａｖｉｋ）、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬（例えば、カンデサルタン（Ａｔａｃａｎｄ）、エプロサルタン（Ｔｅｖｅｔｅｎ）、イルベサルタン（Ａｖａｐｒｏ）、ロサルタン（Ｃｏｚａａｒ）、テルミサルタン（Ｍｉｃａｒｄｉｓ）、及び／又はバルサンタン（Ｄｉｏｖａｎ））、ベータ遮断薬（例えば、アセブトロール（Ｓｅｃｔｒａｌ）、アテノロール（Ｔｅｎｏｒｍｉｎ）、ベタキソロール（Ｋｅｒｌｏｎｅ）、ビソプロロール／ヒドロクロロチアジド（Ｚｉａｃ）、ビソプロロール（Ｚｅｂｅｔａ）、カルテオロール（Ｃａｒｔｒｏｌ）、メトプロロール（Ｌｏｐｒｅｓｓｏｒ、Ｔｏｐｒｏｌ ＸＬ）、ナドロール（Ｃｏｒｇａｒｄ）、プロプラノロール（Ｉｎｄｅｒａｌ）、ソタロール（Ｂｅｔａｐａｃｅ）、及び／又はチモロール（Ｂｌｏｃａｄｒｅｎ））、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、アムロジピン（Ｎｏｒｖａｓｃ、Ｌｏｔｒｅｌ）、ベプリジル（Ｖａｓｃｏｒ）、ジルチアゼム（Ｃａｒｄｉｚｅｍ、Ｔｉａｚａｃ）、フェロジピン（Ｐｌｅｎｄｉｌ）、ニフェジピン（Ａｄａｌａｔ、Ｐｒｏｃａｒｄｉａ）、ニモジピン（Ｎｉｍｏｔｏｐ）、ニソロジピン（Ｓｕｌａｒ）、ベラパミル（Ｃａｌａｎ、Ｉｓｏｐｔｉｎ、Ｖｅｒｅｌａｎ）、利尿薬（例えば、アミロライド（Ｍｉｄａｍｏｒ）、ブメタニド（Ｂｕｍｅｘ）、クロロチアジド（Ｄｉｕｒｉｌ）、クロルタリドン（Ｈｙｇｒｏｔｏｎ）、フロセミド（Ｌａｓｉｘ）、ヒドロクロロチアジド（Ｅｓｉｄｒｉｘ、Ｈｙｄｒｏｄｉｕｒｉｌ）、インダパミド（Ｌｏｚｏｌ）及び／又はスピロノラクトン（Ａｌｄａｃｔｏｎｅ）、血管拡張剤（例えば、二硝酸イソソルビド（Ｉｓｏｒｄｉｌ）、ネシリチド（Ｎａｔｒｅｃｏｒ）、ヒドララジン（Ａｐｒｅｓｏｌｉｎｅ）、硝酸塩及び／又はミノキシジル）、スタチン、ニコチン酸、ゲムフィブロジル、クロフィブラート、ジゴキシン、ジギトキシン、ラノキシン、又はそれらの任意の組み合わせである。

【0260】

追加的な薬剤は、抗菌剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、生物学的応答調節剤、成長因子、免疫モジュレーター、モノクローナル抗体、及び／又は保存剤なども含まれ得る。本発明の組成物はまた、他の療法形態とともに使用されてもよい。

【0261】

本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオンは、疾患又は障害を治療するために対象に投与することができる。このような組成物は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与目的が外傷に対する応答であるか、又はより持続的な治療目的であるか、及び熟練の医師に知られている他の要因に応じて、連続的又は断続的な様式で、単回投与で、複数回投与であり得る。本発明の化合物及び組成物の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよく、又は一連の間隔を空けて投与されてもよい。局所投与及び全身投与の両方が企図される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンの局所送達が達成される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンの局所送達を使用して、心臓内の細胞集団を生成する。いくつかの実施形態では、そのような局在化された集団は、心臓に対する「ペースメーカー細胞」として動作する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、洞房（ＳＡ）結節、房室（ＡＶ）結節、ヒス束、及び／又はプルキンエ線維のうちの１つ以上を生成、再生、修復、置換、及び／又は若返らせる（ｒｅｊｕｎｅｖａｔｅ）ために使用される。

【0262】

張性を制御するために、水性医薬組成物は、ナトリウム塩などの生理学的塩を含み得る。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは１～２０ｍｇ／ｍｌで存在し得る。存在する可能性のある他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム脱水物（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、及び塩化カルシウムが挙げられる。

【0263】

組成物は、１つ以上の緩衝剤を含んでもよい。典型的な緩衝液としては、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ホウ酸塩緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、又はクエン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は、典型的には、５～２０ｍＭの範囲の濃度で含まれる。組成物のｐＨは、一般的に、５～８、より典型的には、６～８、例えば、６．５～７．５、又は７．０～７．８である。

【0264】

組成物は、無菌であることが好ましい。組成物は、グルテンフリーであることが好ましい。組成物は、好ましくは非発熱性である。

【0265】

いくつかの実施形態では、細胞を含む組成物は、凍結保護剤を含んでもよい。凍結保護剤の非限定的な例としては、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、及びグリセロール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、スクロース、トレハロース、デキストロース、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0266】

ｒＡＡＶビリオンを有する組成物中に、以下の化合物の１種以上も存在し得る：ＷＮＴアゴニスト、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－ベータシグナル伝達阻害剤、エピジェネティック改変剤、ＬＳＤ１阻害剤、アデニルシクラーゼアゴニスト、又はそれらの任意の組み合わせ。

【0267】

キット
本明細書に記載される組成物（例えば、ｒＡＡＶビリオン）のうちのいずれかを含む、様々なキットが本明細書に記載される。キットは、一緒に混合されるか、又は個別に包装され、乾燥形態又は水和形態のいずれかで、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを含み得る。本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオン及び／又はその他の薬剤は、別個のバイアル、ボトル又は他の容器に別々に包装され得る。あるいは、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオン及び／又は薬剤のうちのいずれかは、単一の組成物として、又は一緒に又は別々に使用され得る二つ以上の組成物として一緒に包装されてもよい。本明細書に記載の化合物及び／又は薬剤は、分化境界を越えて選択された細胞を変換して、心臓前駆細胞及び／又は心筋細胞を形成することを促進するため、適切な比及び／又は量で包装することができる。

【0268】

キットには、これらの組成物、化合物及び／又は薬剤を投与するための説明書を含めることができる。こうした説明書は、本出願全体を通して記載される情報を提供し得る。ｒＡＡＶビリオン又は医薬組成物は、送達デバイスの形態のキットのうちのいずれか内に提供され得る。あるいは、送達デバイスは、キットに別個に含めることができ、説明書は、対象への投与前に送達デバイスを組み立てる方法を記載することができる。

【0269】

キットのいずれも、シリンジ、カテーテル、メス、試料又は細胞収集のための滅菌容器、希釈剤、薬学的に許容可能な担体なども含み得る。キットは、本出願の前のセクション又は他の部分の組成物に関して本明細書に記述される補足因子又は薬物のうちのいずれかなどの他の因子を提供することができる。

【0270】

以下の非限定的な実施例は、本発明の開発に関与する実験作業のいくつかを説明する。

【実施例】

【0271】

実施例１：可変領域改変ＡＡＶ９キャプシドの同定
ライブラリの生成とＡＡＶの選択
ＡＡＶ９キャプシドの可変領域（ＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－Ｖ、ＶＲ－ＶＩＩ、及びＶＲ－ＶＩＩＩ部位）を図１に示す。図２に示すようにＡＡＶ９キャプシドの各部位内の残基をランダムに変更して、形質導入効率及び／又は心臓組織に対する選択性が改善されたＡＡＶバリアントを同定することにより、ライブラリスクリーニング戦略を採用して、非常に多様なライブラリを生成した。簡潔に述べると、各可変領域に対して、全てのＶＲ改変ライブラリの組み合わせからなるライブラリとともに、個々のライブラリが生成された。これらのライブラリは独立して、３回の指向性進化法に供された。ヒト栄養性バリアントを選択するために、第１回進化ラウンドをｈｉＰＳＣ－ＣＭで実施した。指向性進化の残りの２ラウンドは、αＭＨＣ－Ｃｒｅマウスのライブラリの全身送達を通じて行われ、全身送達後に心臓の内皮バリアを通して経細胞輸送（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｅ）し、心筋細胞に形質導入できる心臓栄養性バリアントを選択した。３ラウンドの指向性進化法の後、図３Ａ～３Ｄ及び４Ａ～４Ｄに示すように、各ライブラリは様々なレベルの収束を示した。

【0272】

インビトロ及びインビボにおける増加した形質導入効率の確認
各ライブラリの上位バリアントは、最初にインビトロでヒトｉＰＳＣ－ＣＭを形質導入するそれらの能力について評価した。細胞を、１００，０００のＭＯＩで、ＧＦＰレポーターを遍在的に発現する各バリアントパッケージングで感染させた。ＶＲ－ＩＶ改変ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９と比較して有意に強化されたｈｉＰＳＣ－ＣＭ形質導入を示し、ＣＲ９－０１は形質導入効率の１２９倍の増加を示した（図５）。その後、バリアントを、全身送達後に心臓に形質導入するそれらの能力についてインビボで評価した。この目的のために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、２．５Ｅ＋１１ ｖｇ／マウスで、ＡＡＶ９：ＣＡＧ－ＧＦＰ又は新規のキャプシドバリアントによって封入されたＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかを注射した。注射の７日後、動物を屠殺し、ＥＬＩＳＡによるＧＦＰ発現解析のために心臓及び肝臓を回収した。各ライブラリのバリアントは、ＡＡＶ９ と比較して心臓への形質導入の増加を示した（図６Ａ－６Ｂ）。心臓への形質導入が増加したほとんどのバリアントは、改善された心臓特異性を有するキャプシドの同定につながる、肝指向性の減少も示した（図６Ｃ～６Ｄ）。最後に、上位の性能を発揮するＡＡＶキャプシドバリアントを、ヒトＮＡｂを回避するそれらの能力について評価した。バリアントパッケージングＣＡＧ－ＧＦＰを、プールされたヒトＩｇＧの増加濃度で３０分間インキュベートし、その後、１００，０００のＭＯＩでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を処理した。感染後４８時間で、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより評価した（図７Ａ）。ＣＲ９－０７及びＣＲ９－１３の２つのバリアントは、未改変ＡＡＶ９と比較して、改善されたＮＡｂ回避を呈示した（図７Ｂ～７Ｃ）。

【0273】

実施例２：ＡＡＶ５／９キメラキャプシドの同定
キャプシドシャフリングを使用して、改善された心筋細胞指向性を有するＡＡＶ５／９キメラタンパク質バリアントを同定した。図８に示すように、ＡＡＶ５／９キメラライブラリを、ＡＡＶ５及びＡＡＶ９の好ましい特性（肝指向性の減少、低ＮＡｂ感受性、経細胞輸送性及び／又は心臓形質導入性）を有するキメラを同定するために生成した。インビボ選択の１ラウンドの後、ライブラリの複雑度が劇的に低減し、親ライブラリの全身送達後に心臓に形質導入できるバリアントが１００個未満となった（図９）。乗換え事象の大部分は、キャプシドのＶＰ１領域内で発生し、大部分のバリアントはＡＡＶ９が有意を占めるＶＰ３領域を有していた。次に、ｈｉＰＳＣ－ＣＭをＡＡＶ９：ＣＡＧ－ＧＦＰ又はキメラＡＡＶ５／９キャプシドによって封入されたＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかにより、７５，０００のＭＯＩで感染させた。感染７２時間後、細胞を採取し、フローサイトメトリーを使用して各キャプシドの形質導入効率を評価した（図１０Ａ）。ＺＣ４４は、ＡＡＶ９と比較して、ｈｉＰＳＣ－ＣＭ細胞における形質導入効率の改善を示した。

【0274】

ＡＡＶ５／９キメラキャプシドを、ヒトＮＡｂを回避するそれらの能力について評価した。ここで、ＣＡＧ－ＧＦＰをパッケージングしているバリアントを１ｍｇ／ｍＬのプールされたヒトＩｇＧと３０分間インキュベートした後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１００，０００のＭＯＩで処理した。感染４８後、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現を評価した。増加した形質導入効率に加えて、ＺＣ４４はＡＡＶ９と比較してＮＡｂに対する感受性の減少を示した（図１０Ｂ）。

【0275】

上位のキメラバリアントを、全身送達後に心臓及び肝臓を形質導入するそれらの能力についてインビボで評価した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、２Ｅ＋１１ｖｇ／マウスでＡＡＶ９：ＣＡＧ－ＧＦＰ又は新規のキャプシドバリアントにより封入されたＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかを注射した。注射の１４日後、動物を屠殺し、ＥＬＩＳＡによるＧＦＰ発現解析のために心臓及び肝臓を回収した。ＺＣ４７は、ＡＡＶ９と比較して心臓への増加した形質導入を示した；ＺＣ４０、ＺＣ４４、及びＺＣ４９は、親ＡＡＶ９と同等の、心臓組織をインビボで形質導入する能力を保持していた（図１１Ａ）。Ｚ４０、Ｚ４１、Ｚ４６、及びＺ４７はそれぞれ、全身送達後の肝臓形質導入の顕著な低下によって証明されるように、肝臓の脱標的化を示した（図１１Ｂ）。

【0276】

実施例３：組み合わせキャプシドの同定
可変領域改変キャプシド及びキメラキャプシド内の改変を組み合わせて、追加の組み合わせキャプシドバリアントを生成した。ＡＡＶ５由来のＶＰ１配列と改変可変領域を含有する合計１８の組み合わせバリアントを生成した（図１２）。ＡＡＶキャプシドバリアントの製造可能性を評価するために、中程度のベクター産生を行った（図１３）。次いで、ｈｉＰＳＣ－ＣＭにおける組み合わせバリアントの形質導入効率を次のように評価した：細胞をＡＡＶ９：ＣＡＧ－ＧＦＰ又は組み合わせＡＡＶキャプシドパッケージングＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかにより７５，０００のＭＯＩで感染させた。感染の５日後に細胞を採取し、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５細胞イメージングリーダーを使用して各キャプシドの形質導入効率を評価した。ＴＮ４４－０７及びＴＮ４７－０７は、ＡＡＶ９よりも優れた形質導入を示した（＞１５倍）（図１４）。

【0277】

組み合わせバリアントを、全身送達後に心臓を形質導入するそれらの能力についてインビボで評価した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１Ｅ＋１１ ｖｇ／マウスで、ＡＡＶ９：ＣＡＧ－ＧＦＰ又は同じ導入遺伝子カセットをパッケージングする組み合わせキャプシドバリアントのいずれかを注射した。注射の１４日後、動物を屠殺し、ＥＬＩＳＡによるＧＦＰ発現解析のために、心臓及び肝臓を回収した。ＴＮ４４－０７及びＴＮ４７－１０は、ＡＡＶ９と比較して心臓形質導入の改善を示した；ＴＮ４７－１４は、ＡＡＶ９と同様のレベルで心臓に形質導入された（図１５Ａ）。注目すべきことに、ＴＮ４７－１４は、肝臓におけるＧＦＰ発現の顕著な減少によって証明されるように、肝臓に対するのほとんど全ての指向性を失っていた（図１５Ｂ）。ＴＮ４７－１０及びＴＮ４７－１４の両方とも、全身送達後、ＡＡＶ９と比較して、心臓の肝臓に対する形質導入の比が改善されている（図１５Ｃ）。選択された組み合わせキャプシドバリアントは、ヒトＮＡｂ回避についても評価された。ＡＡＶ９又はＣＡＧ－ＧＦＰをパッケージングしたキャプシドバリアントを、約２５００人の患者由来のプールしたヒトＩｇＧの非存在下又は存在下（６００ｕｇ／ｍＬ）で、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ウイルスを１００，０００のＭＯＩでＨＥＫ２９３Ｔ細胞とインキュベートした。翌日、培地を補充し、細胞を更に２４時間インキュベートして、十分にＧＦＰ発現させた。フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現を定量化し、形質導入をＩｇＧなし対照に対し正規化した。これら全ての組み合わせＡＡＶキャプシドバリアント（ＴＮ４４－０７、ＴＮ４７－０７、ＴＮ４７－１０、ＴＮ４７－１３及びＴＮ４７－１４）は、プールされたヒトＩｇＧ中の中和（ｎｅｔｕｒａｌｉｚｉｎｇ）抗体からの回避の改善を示した。その中で、ＴＮ４４－０７組み合わせキャプシドを含有するビリオンは、最もステルスであり、ＡＡＶ９と比較してＮＡｂ中和の有意な減少（ｐ＝０．０００２、ｔ検定、ウェルチ補正）を有していた（図１６）。

【0278】

実施例４：非ヒト霊長類における試験
操作されたキャプシドのパネルによって媒介される組換えＡＡＶの形質導入は、オスのカニクイザルマカク（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で１×１０^１２ｖｇ／ｋｇの用量で各キャプシドパッケージングＣＡＧ－ＧＦＰを静脈内送達した後、評価した（ｎ＝３／群）。投与後３０日目に、動物を安楽死させ、特定の形質導入の分析のために臓器を採取した。

【0279】

新規操作されたキャプシドバリアントの臓器特異的形質導入プロファイルをハイスループット様式で評価するために、ＲＮＡバーコードシーケンシングを使用したアプローチが採用された。各キャプシド（２つの親及び１２つの新規バリアント）には、遍在的に発現するＧＦＰカセット（ＣＡＧ－ＧＦＰ）の３’－ＵＴＲに配置された固有のバーコードが割り当られた。選択された各バーコードは、タンパク質発現／ＲＮＡ安定性に影響を及ぼさないことが実験的に決定された。バーコードをキャプシドに連結するために、ｒＡＡＶをキャプシドごとに個別に製造し、全てのｒＡＡＶ調製物を同じ濃度で一緒にプールした。オスのカニクイザル（生後２～５歳）に、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇのプールしたウイルスライブラリ（ｎ＝３）、又はＨＢＳＳで処置した偽物（ｓｈａｍ）（ｎ＝１）のいずれかを投与した。注射日から３０日後、動物を屠殺し、ＲＮＡ分析のために組織を回収した。各バーコードの相対存在量は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５５０及びカスタムのｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用したＧＦＰバーコード転写物の次世代シーケンシングにより決定された。各組織のバーコードの相対的な発現をＡＡＶ９について正規化した。結果を図１７に示す。

【0280】

操作されたキャプシドを含有するｒＡＡＶの形質導入を、動物の左心室及び肝臓で評価した。ＴＮ３及びＴＮ６操作されたキャプシドは、ＡＡＶ９と比較して、左心室で最も高い形質導入を示した（図１７Ａ）。ＴＮ６操作されたキャプシドはＡＡＶ９に匹敵する肝臓への形質導入を示したが、ＴＮ３は、ＡＡＶ９と比較して肝臓への形質導入が大幅に少なかった（図１７Ｂ）。各操作されたキャプシドの左心室（ＬＶ）対肝臓の形質導入比を図１７Ｃに示す。ＴＮ３操作されたキャプシドは、最も好ましい形質導入プロファイルを示す。それは肝臓での低形質導入を維持しながら、高ＬＶ形質導入を有する。肝臓におけるオフターゲット形質導入によるｒＡＡＶ誘発性毒性は、臨床応用では課題となり得、ＴＮ３操作されたキャプシドによって示される形質導入プロファイルはこの制限を克服し得る。様々な組織における操作されたキャプシドのパネルによって媒介されるｒＡＡＶ形質導入を分析することによって、広範囲な形質導入プロファイルが生成された（図１７Ｄ）。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【配列表】

2023522106000001.app

【国際調査報告】