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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-26
(54)【発明の名称】ポリペプチド切断方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230519BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20230519BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230519BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230519BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230519BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230519BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K14/00 ZNA
C07K19/00
C12N15/63 Z
C12P21/02 C
C12N1/21
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022563388
(86)(22)【出願日】2021-04-20
(85)【翻訳文提出日】2022-11-28
(86)【国際出願番号】 US2021028249
(87)【国際公開番号】W WO2021216617
(87)【国際公開日】2021-10-28
(31)【優先権主張番号】63/012,789
(32)【優先日】2020-04-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522282793
【氏名又は名称】アブサイ コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ナスカ， テイラー
(72)【発明者】
【氏名】カーズ， ジョハン
(72)【発明者】
【氏名】ウェインストック， マシュー
(72)【発明者】
【氏名】スリンド， ミシェル
(72)【発明者】
【氏名】デルナー， エイミー
(72)【発明者】
【氏名】カンマラータ， マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ウォード， アビゲイル
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B064DA20
4B065AA26X
4B065AA26Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA11
4H045CA40
4H045EA20
4H045EA60
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
ポリペプチド内の一つ又は複数の特定の位置でのポリペプチドの切断のための方法及び構築物を提供する。本開示は、インテインポリペプチド及び、特定の残基でのポリペプチド及びタンパク質の切断のための、インテインポリペプチドを使用した方法を提供する。本明細書において提供するのは、インテインポリペプチド、インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現構築物、アッセイ方法、及び宿主細胞であり、それらを様々な実施形態において組み合わせることができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１のアミノ酸９３～１１２、配列番号４のアミノ酸８５～１０４、配列番号１２のアミノ酸１～２１、配列番号１５のアミノ酸１～２１、配列番号１２０のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２１のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２３のアミノ酸１０５～１２４、及び配列番号１２４のアミノ酸１０５～１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むインテインポリペプチド；又は、配列番号２のアミノ酸１００～１２９、配列番号１のアミノ酸８８～１１７、配列番号４のアミノ酸８０～１０９、配列番号１２のアミノ酸１～３０、配列番号１５のアミノ酸１～３０、配列番号１２０のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２１のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２２のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２３のアミノ酸１００～１２９、及び配列番号１２４のアミノ酸１００～１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むインテインポリペプチド。
【請求項2】
配列番号２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１のアミノ酸９３～１１２、配列番号４のアミノ酸８５～１０４、配列番号１２のアミノ酸１～２１、配列番号１５のアミノ酸１～２１、配列番号１２０のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２１のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２３のアミノ酸１０５～１２４、及び配列番号１２４のアミノ酸１０５～１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は、配列番号２のアミノ酸１００～１２９、配列番号１のアミノ酸８８～１１７、配列番号４のアミノ酸８０～１０９、配列番号１２のアミノ酸１～３０、配列番号１５のアミノ酸１～３０、配列番号１２０のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２１のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２２のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２３のアミノ酸１００～１２９、及び配列番号１２４のアミノ酸１００～１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のインテインポリペプチド。
【請求項3】
配列番号２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１のアミノ酸９３～１１２、配列番号４のアミノ酸８５～１０４、配列番号１２のアミノ酸１～２１、配列番号１５のアミノ酸１～２１、配列番号１２０のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２１のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２３のアミノ酸１０５～１２４、及び配列番号１２４のアミノ酸１０５～１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は、配列番号１のアミノ酸８８～１１７、配列番号２のアミノ酸１００～１２９、配列番号４のアミノ酸８０～１０９、配列番号１２のアミノ酸１～３０、配列番号１５のアミノ酸１～３０、配列番号１２０のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２１のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２２のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２３のアミノ酸１００～１２９、及び配列番号１２４のアミノ酸１００～１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のインテインポリペプチド。
【請求項4】
配列番号２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１のアミノ酸９３～１１２、配列番号４のアミノ酸８５～１０４、配列番号１２のアミノ酸１～２１、配列番号１５のアミノ酸１～２１、配列番号１２０のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２１のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２３のアミノ酸１０５～１２４、及び配列番号１２４のアミノ酸１０５～１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は、配列番号１のアミノ酸８８～１１７、配列番号２のアミノ酸１００～１２９、配列番号４のアミノ酸８０～１０９、配列番号１２のアミノ酸１～３０、配列番号１５のアミノ酸１～３０、配列番号１２０のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２１のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２２のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２３のアミノ酸１００～１２９、及び配列番号１２４のアミノ酸１００～１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のインテインポリペプチド。
【請求項5】
配列番号２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１のアミノ酸９３～１１２、配列番号４のアミノ酸８５～１０４、配列番号１２のアミノ酸１～２１、配列番号１５のアミノ酸１～２１、配列番号１２０のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２１のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２３のアミノ酸１０５～１２４、及び配列番号１２４のアミノ酸１０５～１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；又は、配列番号１のアミノ酸８８～１１７、配列番号２のアミノ酸１００～１２９、配列番号４のアミノ酸８０～１０９、配列番号１２のアミノ酸１～３０、配列番号１５のアミノ酸１～３０、配列番号１２０のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２１のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２２のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２３のアミノ酸１００～１２９、及び配列番号１２４のアミノ酸１００～１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のインテインポリペプチド。
【請求項6】
前記インテインアミノ酸配列がＮ末端システイン残基を欠く、請求項１～５のいずれか一項に記載のインテインポリペプチド。
【請求項7】
前記インテインポリペプチドが、実質的なエクステインライゲーション活性を欠く、請求項１～６のいずれか一項に記載のインテインポリペプチド。
【請求項8】
前記インテインポリペプチドがポリヒスチジンタグを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のインテインポリペプチド。
【請求項9】
前記ポリヒスチジンタグが６ｘＨｉｓタグを含む、請求項８に記載のインテインポリペプチド。
【請求項10】
前記インテインポリペプチドが、プロテアーゼにより切断可能な切断配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のインテインポリペプチド。
【請求項11】
配列番号１、２、４、１２、１５、及び１２０～１２４のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のインテインポリペプチド。
【請求項12】
請求項１～５のいずれか一項に記載のインテインポリペプチドのアミノ酸配列、及び標的ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、インテイン融合ポリペプチド。
【請求項13】
前記標的ポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸が、標的タンパク質の成熟形態のアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸である、請求項１２に記載のインテイン融合ポリペプチド。
【請求項14】
前記標的ポリペプチドが、一つ又は複数のジスルフィド結合を形成することができる、請求項１３に記載のインテイン融合ポリペプチド。
【請求項15】
前記標的ポリペプチドが、抗体重鎖、抗体軽鎖、及びそれらのフラグメントからなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１２に記載のインテイン融合ポリペプチド。
【請求項16】
前記インテイン融合ポリペプチドがシグナル配列を欠く、請求項１２に記載のインテイン融合ポリペプチド。
【請求項17】
前記インテインアミノ酸配列がＮ末端システイン残基を欠く、請求項１２に記載のインテイン融合ポリペプチド。
【請求項18】
前記インテイン融合ポリペプチドが、実質的なエクステインライゲーション活性を欠く、請求項１２に記載のインテイン融合ポリペプチド。
【請求項19】
前記インテイン融合ポリペプチドがポリヒスチジンタグを含む、請求項１２に記載のインテイン融合ポリペプチド。
【請求項20】
前記ポリヒスチジンタグが６ｘＨｉｓタグを含む、請求項１９に記載のインテイン融合ポリペプチド。
【請求項21】
前記インテイン融合ポリペプチドが、プロテアーゼにより切断可能な切断配列を含む、請求項１２に記載のインテイン融合ポリペプチド。
【請求項22】
請求項１～５のいずれか一項に記載のインテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項23】
インテインポリペプチドをコードする、及び配列番号２４～１１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項24】
二つ以上のインテインをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物であって、各々のインテインをコードするポリヌクレオチド配列が、すべての他のインテインをコードするポリヌクレオチド配列とは異なり、前記インテインをコードするポリヌクレオチド配列によりコードされるすべてのインテインポリペプチドが、同じアミノ酸配列を有する、又は前記インテインをコードするポリヌクレオチド配列によりコードされる前記インテインポリペプチドの少なくとも二つが、異なるアミノ酸配列を有する、発現構築物。
【請求項25】
前記二つ以上のインテインをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２４～１１９からなる群から選択される、請求項２４に記載の発現構築物。
【請求項26】
前記インテインをコードするポリヌクレオチド配列、及びそれらのインテインをコードするポリヌクレオチド配列によりコードされる前記インテインポリペプチドのアミノ酸配列が：（ａ）ポリヌクレオチド配列配列番号２６及び２７、ならびにアミノ酸配列配列番号２；
（ｂ）ポリヌクレオチド配列配列番号２４及び２５、ならびにアミノ酸配列配列番号１；
（ｃ）ポリヌクレオチド配列配列番号２８及び２９、ならびにアミノ酸配列配列番号３；
（ｄ）ポリヌクレオチド配列配列番号３０及び３１、ならびにアミノ酸配列配列番号４；
（ｅ）ポリヌクレオチド配列配列番号３２及び３３、ならびにアミノ酸配列配列番号５；
（ｆ）ポリヌクレオチド配列配列番号３４及び３５、ならびにアミノ酸配列配列番号６；
（ｇ）ポリヌクレオチド配列配列番号３６及び３７、ならびにアミノ酸配列配列番号７；
（ｈ）ポリヌクレオチド配列配列番号３８及び３９、ならびにアミノ酸配列配列番号８；
（ｉ）ポリヌクレオチド配列配列番号４０及び４１、ならびにアミノ酸配列配列番号９；
（ｊ）ポリヌクレオチド配列配列番号４３及び４４、ならびにアミノ酸配列配列番号１１；
（ｋ）ポリヌクレオチド配列配列番号４５及び４６、ならびにアミノ酸配列配列番号１２；
（ｌ）ポリヌクレオチド配列配列番号４８及び４９、ならびにアミノ酸配列配列番号１４；
（ｍ）ポリヌクレオチド配列配列番号５０及び５１、ならびにアミノ酸配列配列番号１５；
（ｎ）ポリヌクレオチド配列配列番号５３及び５４、ならびにアミノ酸配列配列番号１７；
（ｏ）ポリヌクレオチド配列配列番号５６及び５７、ならびにアミノ酸配列配列番号１９；
（ｐ）ポリヌクレオチド配列配列番号５９及び６０、ならびにアミノ酸配列配列番号２１；及び
（ｑ）ポリヌクレオチド配列配列番号２６、２７、６１～６６、及び７９～１１９の任意の二つ以上、ならびにアミノ酸配列配列番号２、からなる群から選択される、請求項２４に記載の発現構築物。
【請求項27】
前記発現構築物が発現ベクターである、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項28】
前記発現構築物が二重プロモーター発現ベクターである、請求項２７に記載の発現構築物。
【請求項29】
前記二重プロモーター発現ベクターがＬ－アラビノース誘導性プロモーター及びプロピオン酸誘導性プロモーターを含む、請求項２８に記載の発現構築物。
【請求項30】
標的ポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法が：前記インテインアミノ酸配列が、前記インテイン融合ポリペプチドから自己切除し、それにより、前記標的ポリペプチドを産生する、請求項１２に記載のインテイン融合ポリペプチドを含む組成物を生成すること；及び
前記組成物から前記標的ポリペプチドを回収することを含む、方法。
【請求項31】
前記組成物を生成することが、宿主細胞中で前記インテイン融合タンパク質を発現させることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記組成物を生成することが、前記宿主細胞を溶解することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記組成物が、前記宿主細胞を溶解することにより生成されるライセートである、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記宿主細胞が、チオレドキシンレダクターゼの機能レベルが低下している、ならびにグルタチオンレダクターゼ及びグルタチオンシンテターゼからなる群から選択されるタンパク質の機能レベルが低下している、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記宿主細胞が、ａｈｐＣ＊、ａｈｐＣΔ、Ｖ１６４Ｇ、Ｓ７１Ｆ、Ｅ１７３／Ｓ７１Ｆ、Ｅ１７１Ｔｅｒ、及びｄｕｐ１６２－１６９変異からなる群から選択されるＡｈｐＣをコードする遺伝子の改変形態を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記宿主細胞が、ＤｓｂＣの細胞質形態をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３４又は請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記宿主細胞が大腸菌Ｂ株５２１細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
請求項２４～２９のいずれか一項に記載の発現構築物を含む宿主細胞であって、前記宿主細胞が、チオレドキシンレダクターゼの機能レベルが低下している、ならびにグルタチオンレダクターゼ及びグルタチオンシンテターゼからなる群から選択されるタンパク質の機能レベルが低下している、宿主細胞。
【請求項41】
前記宿主細胞が、ａｈｐＣ＊、ａｈｐＣΔ、Ｖ１６４Ｇ、Ｓ７１Ｆ、Ｅ１７３／Ｓ７１Ｆ、Ｅ１７１Ｔｅｒ、及びｄｕｐ１６２－１６９変異からなる群から選択されるＡｈｐＣをコードする遺伝子の改変形態を有する、請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項42】
前記宿主細胞が、ＤｓｂＣの細胞質形態をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４０又は請求項４１に記載の宿主細胞。
【請求項43】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項44】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項45】
前記宿主細胞が大腸菌Ｂ株５２１細胞である、請求項４４に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２０年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／０１２，７８９号の利益を主張するものであり、当該仮特許出願は、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。
本願は、２０２０年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／０１２，７８９号の利益を主張するものであり、当該仮特許出願は、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。
【0002】
本発明は、分子生物学及びバイオテクノロジー製造の一般的な技術分野におけるものである。より具体的には、本発明は、特定の位置でのポリペプチド及びタンパク質の切断のためのバイオテクノロジー方法の技術分野にある。
【背景技術】
【0003】
生物学的材料、例えば治療用タンパク質、免疫原性化合物、又は工業用酵素及び生体材料などのバイオテクノロジー製造（又はバイオマニュファクチャリング）は、複雑な過程である。多くの生物学的材料は、中間体として、例えば、最終的な生物学的産物を形成するためにさらに処理される、製造及び／又は精製において有用なタグ又は他の配列を含むポリペプチドとして製造される。一つのバイオマニュファクチャリング上の課題は、原核宿主細胞の場合における改変「ｆＭｅｔ」（Ｎ－ホルミルメチオニン）であり得る、Ｎ末端メチオニン残基を含む、ポリペプチドのＮ末端からアミノ酸残基を除去して、そのタンパク質の成熟形態で見出される「天然」Ｎ末端アミノ酸残基を有するタンパク質を生成することである。Ｎ末端アミノ酸残基の除去のための方法を開発する必要性は、宿主細胞の細胞質中でタンパク質を産生するよう設計された発現系について特に緊急である。なぜなら、膜を横断する転座の間にそのようなタンパク質からのシグナルペプチドの切断はないためである。
【0004】
バイオマニュファクチャリングにおける別の課題は、それらの産生において使用される宿主細胞に毒性のあるポリペプチド及びタンパク質の産生である。特定の残基でポリペプチド及びタンパク質を切断することが可能であり、毒性タンパク質の産生において有用である、改善されたタンパク質発現方法が、明らかに必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、インテインポリペプチド及び、特定の残基でのポリペプチド及びタンパク質の切断のための、インテインポリペプチドを使用した方法を提供する。本明細書において提供するのは、インテインポリペプチド、インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現構築物、アッセイ方法、及び宿主細胞であり、それらを様々な実施形態において組み合わせることができる。
【0006】
一部の実施形態では、本明細書において提供するのは、配列番号２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１のアミノ酸９３～１１２、配列番号４のアミノ酸８５～１０４、配列番号１２のアミノ酸１～２１、及び配列番号１５のアミノ酸１～２１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性（例、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むインテインポリペプチドである。他の実施形態では、本明細書において提供するのは、配列番号２のアミノ酸１００～１２９、配列番号１のアミノ酸８８～１１７、配列番号４のアミノ酸８０～１０９、配列番号１２のアミノ酸１～３０、及び配列番号１５のアミノ酸１～３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性など）を有するアミノ酸配列を含むインテインポリペプチドである。一部の実施例では、このインテインポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１のアミノ酸９３～１１２、配列番号４のアミノ酸８５～１０４、配列番号１２のアミノ酸１～２１、及び配列番号１５のアミノ酸１～２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；又は、配列番号１のアミノ酸８８～１１７、配列番号２のアミノ酸１００～１２９、配列番号４のアミノ酸８０～１０９、配列番号１２のアミノ酸１～３０、及び配列番号１５のアミノ酸１～３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書において提供するのは、配列番号１２０～１２４のいずれか一つのアミノ酸１０５～１２４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性（例、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、又は配列番号１２０～１２４のいずれか一つのアミノ酸１００～１２９のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性など）を有するアミノ酸配列を含むインテインポリペプチドである。
【0007】
一部の実施例では、インテインポリペプチドは、Ｎ末端システイン残基を欠く、及び／又は実質的なエクステインライゲーション活性を欠く。追加の実施例では、インテインポリペプチドは、ポリヒスチジンタグ（例、６ｘＨｉｓタグ）を含み、及び／又はプロテアーゼにより切断可能な切断配列を含む。特に非限定的な例では、インテインポリペプチドは、配列番号１、２、４、１２、１５のいずれか一つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性（例、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。他の非限定的な例では、インテインポリペプチドは、配列番号１２０～１２４のいずれか一つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性（例、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。
【0008】
また、本明細書において提供するのは、開示するインテインポリペプチドのアミノ酸配列及び標的ポリペプチドのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、標的ポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸は、標的タンパク質の成熟形態のアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸である。他の実施形態では、標的ポリペプチドは、一つ又は複数のジスルフィド結合を形成することができる。一部の非限定的な実施例では、標的ポリペプチドは、抗体重鎖、抗体軽鎖、及びそれらのフラグメントからなる群から選択される。追加の実施例では、インテイン融合ポリペプチドはシグナル配列を欠く。他の実施例では、インテインアミノ酸配列は、Ｎ末端システイン残基を欠く、及び／又は実質的なエクステインライゲーション活性を欠く。追加の実施例では、インテイン融合ポリペプチドは、ポリヒスチジンタグ（例、６ｘＨｉｓタグ）を含み、及び／又はプロテアーゼにより切断可能な切断配列を含む。
【0009】
また、提供するのは、開示するインテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。特定の実施形態では、インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２４～１１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0010】
本明細書において開示するのは、二つ以上のインテインをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物であり、各インテインをコードするポリヌクレオチド配列は、すべての他のインテインをコードするポリヌクレオチド配列とは異なる。一部の実施形態では、インテインをコードするポリヌクレオチド配列によりコードされるすべてのインテインポリペプチドは、同じアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、インテインをコードするポリヌクレオチド配列によりコードされるインテインポリペプチドの少なくとも二つは、異なるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、二つ以上のインテインをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２４～１１９からなる群から選択される。
【0011】
一部の実施例では、このインテインをコードするポリヌクレオチド配列、及びそれらのインテインをコードするポリヌクレオチド配列によってコードされるインテインポリペプチドのアミノ酸配列は、以下からなる群から選択される：（ａ）ポリヌクレオチド配列配列番号２６及び２７、ならびにアミノ酸配列配列番号２；（ｂ）ポリヌクレオチド配列配列番号２４及び２５、ならびにアミノ酸配列配列番号１；（ｃ）ポリヌクレオチド配列配列番号２８及び２９、ならびにアミノ酸配列配列番号３；（ｄ）ポリヌクレオチド配列配列番号３０及び３１、ならびにアミノ酸配列配列番号４；（ｅ）ポリヌクレオチド配列配列番号３２及び３３、ならびにアミノ酸配列配列番号５；（ｆ）ポリヌクレオチド配列配列番号３４及び３５、ならびにアミノ酸配列配列番号６；（ｇ）ポリヌクレオチド配列配列番号３６及び３７、ならびにアミノ酸配列配列番号７；（ｈ）ポリヌクレオチド配列配列番号３８及び３９、ならびにアミノ酸配列配列番号８；（ｉ）ポリヌクレオチド配列配列番号４０及び４１、ならびにアミノ酸配列配列番号９；（ｊ）ポリヌクレオチド配列配列番号４３及び４４、ならびにアミノ酸配列配列番号１１；（ｋ）ポリヌクレオチド配列配列番号４５及び４６、ならびにアミノ酸配列配列番号１２；（ｌ）ポリヌクレオチド配列配列番号４８及び４９、ならびにアミノ酸配列配列番号１４；（ｍ）ポリヌクレオチド配列配列番号５０及び５１、ならびにアミノ酸配列配列番号１５；（ｎ）ポリヌクレオチド配列配列番号５３及び５４、ならびにアミノ酸配列配列番号１７；（ｏ）ポリヌクレオチド配列配列番号５６及び５７、ならびにアミノ酸配列配列番号１９；（ｐ）ポリヌクレオチド配列配列番号５９及び６０、ならびにアミノ酸配列配列番号２１；及び（ｑ）ポリヌクレオチド配列配列番号２６、２７、６１～６６、及び７９～１１９のいずれか二つ以上、ならびに配列番号２のアミノ酸配列。一部の実施例では、この発現構築物は発現ベクターである。追加の実施例では、この発現構築物は、二重プロモーター発現ベクター、例えば、Ｌ－アラビノース誘導性プロモーター及びプロピオン酸誘導性プロモーターを含む二重プロモーター発現ベクターである。
【0012】
標的ポリペプチドを産生するための方法も提供する。一部の実施形態では、この方法は、本明細書中に提供するインテイン融合ポリペプチドを含む組成物を生成することを含み、このインテインアミノ酸配列は、インテイン融合ポリペプチドから自己切除し、それにより、標的ポリペプチドを産生し、標的ポリペプチドをこの組成物から回収する。一部の実施形態では、組成物を生成することは、宿主細胞中でインテイン融合ポリペプチドを発現することを含む。この方法は、宿主細胞を溶解することをさらに含み得る。一部の実施例では、宿主細胞を溶解することによって、組成物を生成する。一部の実施形態では、宿主細胞は、チオレドキシンレダクターゼの機能の低下レベル、ならびにグルタチオンレダクターゼ及びグルタチオンシンテターゼからなる群から選択されるタンパク質の機能の低下レベルを有する。例えば、宿主細胞は、ａｈｐＣ＊、ａｈｐＣΔ、Ｖ１６４Ｇ、Ｓ７１Ｆ、Ｅ１７３／Ｓ７１Ｆ、Ｅ１７１Ｔｅｒ、及びｄｕｐ１６２－１６９変異からなる群から選択されるＡｈｐＣをコードする遺伝子の改変形態を有し、及び／又は宿主細胞は、ＤｓｂＣの細胞質形態をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌細胞（例えば、大腸菌Ｂ株５２１細胞）などである。
【0013】
また、提供するのは、開示する発現構築物を含む宿主細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、チオレドキシンレダクターゼの機能の低下レベル、ならびにグルタチオンレダクターゼ及びグルタチオンシンテターゼからなる群から選択されるタンパク質の機能の低下レベルを有する。一部の実施例では、宿主細胞は、ａｈｐＣ＊、ａｈｐＣΔ、Ｖ１６４Ｇ、Ｓ７１Ｆ、Ｅ１７３／Ｓ７１Ｆ、Ｅ１７１Ｔｅｒ、及びｄｕｐ１６２－１６９変異からなる群から選択されるＡｈｐＣをコードする遺伝子の改変形態を有し、及び／又は宿主細胞は、ＤｓｂＣの細胞質形態をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌細胞（例えば、大腸菌Ｂ株５２１細胞）などである。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】図１Ａ及び１Ｂは、大腸菌宿主細胞中で発現されたインテイン－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ構築物のウェスタンブロットを示す。ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ重鎖及び軽鎖は、それらのＮ末端で重鎖及び軽鎖の各々に付着された様々なインテインポリペプチド配列を伴って発現された；インテインの全てが、エクステインライゲーションを防止するためにＮ末端システイン残基を欠いた。使用するインテインの型を、各ブロット上に示している。ＤｎａＸ：シネコシスティスＤｎａＸ ６ｘＨｉｓ－タグ付きミニインテイン；ＤｎａＢ：シネコシスティスＤｎａＢ ６ｘＨｉｓ－タグ付きミニインテイン；Ｄ．ｔ．ＤｎａＢ：デスルホフンドラス・サーモサブテラネウス（Ｄｅｓｕｌｆｏｆｕｎｄｕｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ）ＤＳＭ １６０５７ ＤｎａＢインテイン；ｇｐ４１－１：プロクロロコッカス シアノファージＰ－ＳＳＭ２ ｇｐ４１－１ ６ｘＨｉｓ－タグ付きミニインテイン；及びＮ．ｐ．ＤｎａＢ：ノストック・パンクチホルム（Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）株ＡＴＣＣ ２９１３３／ＰＣＣ ７３１０２ ＤｎａＢミニインテイン。「Ｐ」は遠心分離によってペレット化された材料を示す一方で、「Ｓ」は可溶性のままであった材料を示す。各ウェルに対応するＴＲＡＳＴ－Ｆａｂタンパク質サンプルを、非還元条件下（図１Ａ）及び還元条件下（図１Ｂ）でポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。これらのゲルから作製されたウェスタンブロットでは、ヒトＩｇＧに結合する一次抗体を利用した。ＭＷ（ｋＤａ）：分子量（質量）マーカー。非切断及び切断タンパク質バンドの位置を、矢印及び記号で示している：パネルＡ（非還元）、上から：切断インテインを伴うＦａｂヘテロ二量体、両方のポリペプチドから切断されたインテインを伴うＦａｂヘテロ二量体、単量体の切断Ｆａｂポリペプチド；パネルＢ（還元）、上から：非切断インテインを伴う単量体Ｆａｂポリペプチド、単量体切断Ｆａｂポリペプチド。
【図2A】図２Ａ～２Ｃは、コントロールＭｅｔ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂと比較した、インテイン切断（しかし、他はインタクトな）インテイン－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂポリペプチドの構造の液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）による分析を示す一連のクロマトグラムである。ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂタンパク質及びｇｐ４１－１－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂタンパク質を、図１について記載するように、Ｎ末端インテイン配列で発現させた。タンパク質サンプルを、プロテインＬを用いた親和性クロマトグラフィーにより精製し、次にＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）で還元し、ギ酸で酸性化した。パネルＡは、溶出時間に対してプロットされた強度の任意の単位での吸光度を示し、パネルＢ及びＣは、溶出時間に対してプロットされた１秒当たりの計数（ＣＰＳ）であり；パネルＢ及びＣに対する説明文における単位ダルトン（「Ｄａ」）は、質量／電荷（ｍ／ｚ）を示す。図２Ａ：２１４ｎｍでのＵＶ光の吸光度は、１３分から１８分までの溶出を示し、軽鎖及び重鎖の両方の溶出を含む。ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂは、Ｍｅｔ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂコントロールに対する位置で同等のピークを示した。
【図2B】図２Ｂ：天然Ｎ末端を伴うＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ軽鎖の予測質量／電荷範囲でのタンパク質についての抽出されたイオンクロマトグラムピーク。Ｍｅｔ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂコントロールサンプルは、ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂサンプル及びｇｐ４１－１－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂサンプルと同じ強度スケールで見た場合に、検出可能な天然Ｎ末端軽鎖を含まないが、それら両方とも相当量の天然Ｎ末端軽鎖を産生した。
【図2C】図２Ｃ：天然のＮ末端を伴うＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ重鎖についての予測される質量／電荷範囲でのタンパク質についての抽出イオンクロマトグラムピーク。このパネル中に示すＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ重鎖の結果は、軽鎖についてパネルＢに示されるものと同等であるが、しかし、ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂサンプルは、ｇｐ４１－１－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂサンプルよりも高い量の天然Ｎ末端重鎖を呈した。
【図3A】図３Ａ及び３Ｂは、コントロールＭｅｔ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体と比較して、インテイン切断された（しかし、他はインタクトの）インテイン－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体の構造の液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）による分析を示す一連のクロマトグラムである。ＤｎａＸ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ、ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ、及びＤ．ｔ．ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂタンパク質を、図１について記載するようにＮ末端インテイン配列と発現させた。タンパク質サンプルを、プロテインＬを伴う親和性クロマトグラフィーにより精製し、次いでギ酸で酸性化し、非還元条件下でＬＣ－ＭＳにより分析した。図３Ａ及び３Ｂでの単位は、図２Ａ及び２Ｂと同じである。図３Ａ：２８０ｎｍでのＵＶ光の吸光度は、ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体の溶出を含む、１１分から２４分までの溶出を示す。サンプル、特にＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ及びＤ．ｔ．ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂサンプルは、Ｍｅｔ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂコントロールに同等の位置でピークを示した。
【発明を実施するための形態】
【0015】
ポリペプチド及びタンパク質の切断の問題は、本明細書中に記載する方法を提供することによって対処し、特に「天然の」又はそうでなければ望ましいＮ末端アミノ酸残基を有する、目的のポリペプチド及びタンパク質を産生する目的であり、これらは、本明細書では、「標的」ポリペプチド及びタンパク質として言及する。天然のＮ末端残基は、完全成熟タンパク質のＮ末端で見出されるアミノ酸であり、翻訳後修飾によりタンパク質に加えられる任意の残基は考慮しない。
【0016】
インテインポリペプチドは、インテインのアミノ酸配列、又はインテインアミノ酸配列の一つ又は複数のフラグメントを含み、インテインポリペプチドの例として、本明細書中に記載するミニインテイン及び分割インテインを含む。インテインポリペプチドは、エクステインポリペプチドから、又はエクステインポリペプチドから自己切除することが可能であり、また、エクステインポリペプチドを互いにライゲーションすることが可能である。インテイン融合ポリペプチドは、インテインのアミノ酸配列、又はインテインアミノ酸配列の一つ又は複数のフラグメントを含むインテインポリペプチドであり、また、標的ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。
【0017】
本明細書中で提供する方法は、切断されるインテイン融合ポリペプチド配列内に含まれるインテイン配列の使用、及び標的ポリペプチド又はタンパク質を生成するためのインテイン融合ポリペプチドからのインテイン配列の自己切除を含む。また、提供するのは、特定のインテインポリペプチド、及びそれらのインテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。
【0018】
インテイン及びそれらを使用して産生することができるタンパク質を、以下のセクションＩ～ＩＩに記載する。インテインを含むポリペプチド及びインテインを使用して産生されるタンパク質を産生及び精製する発現構築物、宿主細胞、及び方法を、以下のセクションＩＩＩ～Ｖに記載する。
Ｉ．インテイン及びインテイン含有発現構築物。
Ｉ．インテイン及びインテイン含有発現構築物。
【0019】
インテイン及びミニインテイン。インテインは、そのＮ末端側及びＣ末端側のそれぞれでインテイン配列に隣接するＮ－エクステイン及びＣ－エクステインからのそれ自体の切除を触媒することが可能なポリペプチドである。インテインは、全ての系統発生界にわたる生物において同定されており、これらの天然インテインについては、インテインの自己切除によって、典型的には、ペプチド結合を通じてＮ－エクステインとＣ－エクステインの連結がもたらされる。インテインの自己切除は、同じポリペプチド内のインテイン配列間、又はトランスで作用するインテインポリペプチド間の相互作用をもたらすことができる（以下の分割インテインの説明を参照のこと）。多くのインテインは、インテイン－切除反応について必要のない配列を含み、バイオマニュファクチャリングの目的のために、任意の外部配列が除去された「ミニ」インテインを使用することが好ましい（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｎｉ－ｉｎｔｅｉｎｓ ｓｕｐｐｏｒｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｎｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７ Ｏｃｔ １４；９４（２１）：１１４６６－１１４７１；Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８ Ｊａｎ ２０；９５（２）：７６２）。ミニインテインは、インタクトなインテインのＮ末端からの、及びＣ末端からのアミノ酸配列を含み、また、タグ、例えば６ｘＨｉｓポリヒスチジンタグなど、又はミニインテインの残りのＮ末端部分とＣ末端部分の間に配置された他の望ましい配列を含み得る。
【0020】
「非ライゲーション」インテイン。インテインのアミノ酸配列における改変は、エクステイン配列からの自己切除が可能であるが、しかし、Ｃ－エクステインへのＮ－エクステインの連結を触媒しないインテインバリアントを生成することが示されている（Ｍａｔｈｙｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｌｆ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｍｉｎｉ－ｉｎｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎｔｏ ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｎ－ ａｎｄ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ：ｆａｃｉｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｔｉｏｎ”，Ｇｅｎｅ １９９９ Ａｐｒ ２９；２３１（１－２）：１－１３）。具体的には、アラニン残基が、典型的には、インテイン配列のＮ末端に存在するシステイン残基に置換される場合、インテインは、エクステインのライゲーションを伴わずに、エクステインから切除することができる。Ｎ末端システイン残基を改変又は除去するインテインアミノ酸配列に対する他の変化は、また、エクステインライゲーションが可能ではないインテインをもたらすことができる。このような方法で改変されたインテイン、特にミニインテインを、本明細書中では非ライゲーションインテインとして言及する。インテインがエクステインを自己切除及び／又はライゲーションできる程度を、インテインの切除及びエクステインのライゲーションが生じ得る条件下でインテインポリペプチドを発現させ、次に、産生される異なるポリペプチド産物を定量化することにより、例えば、Ｍａｔｈｙｓ ｅｔ ａｌ．１９９９の図２において示されるようにゲル電気泳動によるポリペプチド産物の分離後に異なるタンパク質バンドを定量化することにより、又は定量的液体クロマトグラフィー方法により決定することができる。「非ライゲーション」インテインポリペプチドは、実質的なエクステインライゲーション活性を欠くインテインポリペプチドであって、同じ条件下で対応する「ライゲーション」インテインポリペプチドにより産生されるポリペプチドと比較して、ライゲーションされたエクステイン産物の２５％未満（及び好ましくはライゲーションされたエクステイン産物の１０％未満）を産生する。
【0021】
非ライゲーションインテインは、バイオテクノロジー方法により産生されるタンパク質の任意の所望のＮ末端を生成するために有用である。なぜなら、それらは、所望のＮ末端アミノ酸残基の直ぐ上流に配置されて、次に、他のアミノ酸を付着することなく自己切除により切断されることができるからである。バイオテクノロジー方法、特に治療用タンパク質により産生される多くのタンパク質について、所望のＮ末端残基は、タンパク質の天然型において見出される「天然」Ｎ末端アミノ酸であり得る。例えば、ポリペプチドの成功裏の発現が、ポリペプチドのＣ末端で追加の残基の存在を要求する場合、これらの改変された「非ライゲーション」型のインテインを使用して、所望のＣ末端残基を伴うタンパク質を産生することも可能である。これらの場合では、インテインアミノ酸配列は、所望のＣ末端残基の直ぐ後に続き、発現のために要求される任意の追加のアミノ酸配列を、ミニインテインの中心に加えることができる、又は発現された際にポリペプチドのＣ末端でインテイン配列に続いて含まれることができる。
【0022】
「分割」インテインは、インテインのＮ末端部分及びＣ末端部分が、トランスで作用して切除反応を、インテインのＮ末端部分が要求されるシステイン残基を有する場合にはライゲーション反応を達成することができる別々のポリペプチドとして発現されるインテインポリペプチドである。インテインのＣ末端部分を含むポリペプチドは、例えば、タグポリペプチド又は他の有用なアミノ酸配列をそのＮ末端領域中に含むこともできる。なぜなら、それらは、上に記載する所望のＮ末端残基を有する標的タンパク質を産生するために、インテインのＮ末端部分によるＣ末端インテインの切断に干渉しないはずであるからである。インテインのＮ末端部分及びＣ末端部分を分離することによって、標的タンパク質の、及びインテインのＣ末端部分（例えば）のアミノ酸配列を含むインテイン融合ポリペプチドがより短くなり、発現される分子当たりより少ない宿主細胞供給源が要求されるという点で、タンパク質のバイオテクノロジー産生の効率を増加させることができる。ポリペプチドの発現におけるインテインのＣ末端部分の使用に関するこれらの考慮事項は、上に記載するように、タンパク質上に所望のＣ末端残基を生成するために、インテインのＮ末端部分の使用にも適用される。
【0023】
分割インテインを使用することによって、除去（及び一部の場合ではライゲーション）反応が、インテインのＮ末端又はＣ末端部分を含むポリペプチドの発現から空間的及び／又は時間的に分離されることも可能になる。例えば、トランスで作用するインテインの部分は、宿主細胞の異なる領域又は区画において発現させることができ、それは、宿主細胞を通したインテイン融合ポリペプチドの発現及び移動（例えば転座など）後のインテインの他の部分を含むインテイン融合ポリペプチドと相互作用する、又はそれは、発現されたインテイン融合ポリペプチドのプロセシングにおいてエクスビボで使用されて、標的成熟タンパク質を産生することができる。特定の例として、６ｘＨｉｓポリヒスチジンタグを含む「非ライゲーション」インテインのＮ末端部分が発現及び精製されて、Ｎｉ２＋又はＣｄ２＋金属イオンを含む固体支持媒体に付着される。標的タンパク質のアミノ酸配列を含み、インテイン融合ポリペプチドのＮ末端にインテインのＣ末端部分を有するインテイン融合ポリペプチドは、インテインのＮ末端部分を含む媒体を通過し、インテイン融合ポリペプチドからのインテインのＣ末端部分の切断をもたらし、標的タンパク質を放出する。
【0024】
毒性ポリペプチドを産生するためのインテインの使用。インテインの「非ライゲーション」形態を使用することができる場合にはインテインポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に、あるいは切除及びライゲーションの両方が可能なインテインを使用することができる場合にはインテインポリペプチド配列内に追加のアミノ酸配列を含める能力によって、そうでなければ毒性であるポリペプチドの効率的な発現を可能にすることができる。宿主細胞に対して毒性のある活性を有する目的のポリペプチドは、アミノ酸残基が、例えば、インテイン自己切除反応により除去することができるまで、目的のポリペプチドの活性部位と相互作用し、ポリペプチドの活性及び同時にその毒性を排除又は低下させるアミノ酸配列の、インテイン中での包含により毒性を減らすことができる。
【0025】
インテインアミノ酸配列及びそれらをコードするＤＮＡ配列。いくつかの代表的なインテインポリペプチドのアミノ酸配列を、表１中に示すように、配列番号１～２１及び１２０～１２４として提示する。配列番号１～２１及び１２０～１２４のインテインポリペプチドの各々は、非ライゲーション型の改変インテインであり、Ｎ末端システイン残基を欠く。分割インテインは、表１中に示すように、インテイン及びミニインテインのＮ末端部分及びＣ末端部分に対応する。分割インテインは、場合により、追加のアミノ酸配列、例えば、ＤｎａＸインテインの、又はＤｎａＢインテインのＣ末端部分などを含むことができ、それらは、配列番号１２及び１５にそれぞれ提示されるように、各々が６ｘＨｉｓタグを含む。これらのインテインをコードするＤＮＡ配列も表１中に列挙し、さらに実施例１Ａ中に記載している。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0026】
インテインアミノ酸配列のバリアント。表１中に提示するアミノ酸配列のバリアントを有するインテインポリペプチドを、本明細書中に提供する方法において使用することができる。好ましくは、そのようなバリアントインテインポリペプチドは、活性、例えばエクステイン配列をライゲーションする能力及び／又はエクステイン配列から自己切除する能力などを有する。特定の実施形態では、インテインポリペプチドは、表１中に提示する配列の長さの少なくとも５０％（又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）にわたって、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、ここでアミノ酸配列同一性は、実施例３に従って決定される。特定のインテインポリペプチドは、表１中に提示する配列の少なくとも１０（又は少なくとも２０、又は少なくとも３０、又は少なくとも４０、又は少なくとも５０）の連続アミノ酸に対し、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性（又は少なくとも９０％の同一性、又は少なくとも９５％の同一性）を有し、ここでアミノ酸配列同一性は実施例３に従って決定される。本明細書中に提供する特定のインテインポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸９３～１１２、配列番号２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号４のアミノ酸８５～１０４、配列番号１２のアミノ酸１～２１、配列番号１５のアミノ酸１～２１、配列番号１２０のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２１のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２２のアミノ酸１０５～１２４、配列番号１２３のアミノ酸１０５～１２４、及び配列番号１２４のアミノ酸１０５～１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性（又は少なくとも８０％の同一性、又は少なくとも９０％の同一性を有し、又は少なくとも９５％の同一性）を有する；本開示のさらなるインテインポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸８８～１１７、配列番号２のアミノ酸１００～１２９、配列番号４のアミノ酸８０～１０９、配列番号１２のアミノ酸１～３０、配列番号１５のアミノ酸１～３０、配列番号１２０のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２１のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２２のアミノ酸１００～１２９、配列番号１２３のアミノ酸１００～１２９、及び配列番号１２４のアミノ酸１００～１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性（又は少なくとも７０％の同一性、又は少なくとも８０％の同一性を有し、又は少なくとも９０％の同一性、又は少なくとも９５％の同一性）を有し、ここでアミノ酸配列同一性は、実施例３に従って決定される。
【0027】
タグ及びインテインポリペプチドと使用することができる他のアミノ酸配列。
タグ 本明細書中に提供する方法において使用されるインテインポリペプチドは、そのようなインテインポリペプチドの精製及び／又は検出、ならびにそれらを含むインテイン融合ポリペプチドの精製及び／又は検出において助ける分子部分を含むように設計することができる。多くのそのような部分は当該技術分野において公知であり、一例として、インテインポリペプチドは、そのアミノ酸配列内、例えばミニインテインのＮ末端部分とＣ末端部分の間など、又はインテインポリペプチドのＮ又はＣ末端付近に、ポリヒスチジン「タグ」配列－一連の六つ以上のヒスチジン、好ましくは６～１０ のヒスチジン残基、最も好ましくは六つのヒスチジン（「６ｘＨｉｓ」）－を含むように設計することができる。ポリペプチド内のポリヒスチジン配列の存在によって、それが、コバルト又はニッケルベースの親和性媒体により結合され、他のポリペプチドから分離されることが可能になる。ポリヒスチジンタグ配列は、エクスペプチダーゼにより除去することができる。タグの別の例は、ＳｐｙＴａｇであり、それは、１２．３ｋＤａのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質により結合される１３個のアミノ酸のペプチドであり、共有結合的な分子間イソペプチド結合をもたらす。タグのさらなる型は、ビオチンリガーゼによるビオチン化のための標的であるＡｖｉＴａｇ（商標）ペプチド（Ａｖｉｄｉｔｙ、コロラド州オーロラ）である。追加のタグは、（１）ペスチウイルス、例えば古典的ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）とも呼ばれるブタコレラウイルス（アルフォート株）からの、ならびに境界病ウイルス（ＢＤＶ）及びウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）からのポリタンパク質の自己切断Ｎ末端部分（Ｎｐｒｏ）、ならびにそれらのフラグメント；及び／又は（２）小さなユビキチン関連修飾剤（ＳＵＭＯ）（例、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ５５８５３．１）を含む。任意のＮ末端タグは、それ自体を、ポリヒスチジンタグ、例えば６ｘＨｉｓなどでさらにタグ付けしてもよく、ニッケルカラム上でのタグ付きポリペプチドの初期精製を可能にし、タグ、例えばＮｐｒｏなどの自己切断、又はＳＵＭＯプロテアーゼによるＳＵＭＯ Ｎ末端タグの酵素的切断、及びカラムからの遊離ポリペプチドの溶出がそれぞれ続く。この方法の一実施形態では、ＳＵＭＯプロテアーゼポリペプチドはまた、６ｘＨｉｓタグを含む融合タンパク質であって、２工程の精製を可能にする：第１工程では、発現された６ｘＨｉｓ－ＳＵＭＯ－タグ付きポリペプチドが、ニッケルカラムへの結合、続くカラムから溶出により精製される。第２工程では、精製ポリペプチド上のＳＵＭＯタグが、６ｘＨｉｓ－タグ付きＳＵＭＯプロテアーゼにより切断され、ＳＵＭＯプロテアーゼ－ポリペプチド反応混合物が、第２ニッケルカラムを通して実行され、それは、ＳＵＭＯプロテアーゼを保持するが、しかし、今は非タグ付きであるポリペプチドが流れることを可能にする。
タグ 本明細書中に提供する方法において使用されるインテインポリペプチドは、そのようなインテインポリペプチドの精製及び／又は検出、ならびにそれらを含むインテイン融合ポリペプチドの精製及び／又は検出において助ける分子部分を含むように設計することができる。多くのそのような部分は当該技術分野において公知であり、一例として、インテインポリペプチドは、そのアミノ酸配列内、例えばミニインテインのＮ末端部分とＣ末端部分の間など、又はインテインポリペプチドのＮ又はＣ末端付近に、ポリヒスチジン「タグ」配列－一連の六つ以上のヒスチジン、好ましくは６～１０ のヒスチジン残基、最も好ましくは六つのヒスチジン（「６ｘＨｉｓ」）－を含むように設計することができる。ポリペプチド内のポリヒスチジン配列の存在によって、それが、コバルト又はニッケルベースの親和性媒体により結合され、他のポリペプチドから分離されることが可能になる。ポリヒスチジンタグ配列は、エクスペプチダーゼにより除去することができる。タグの別の例は、ＳｐｙＴａｇであり、それは、１２．３ｋＤａのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質により結合される１３個のアミノ酸のペプチドであり、共有結合的な分子間イソペプチド結合をもたらす。タグのさらなる型は、ビオチンリガーゼによるビオチン化のための標的であるＡｖｉＴａｇ（商標）ペプチド（Ａｖｉｄｉｔｙ、コロラド州オーロラ）である。追加のタグは、（１）ペスチウイルス、例えば古典的ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）とも呼ばれるブタコレラウイルス（アルフォート株）からの、ならびに境界病ウイルス（ＢＤＶ）及びウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）からのポリタンパク質の自己切断Ｎ末端部分（Ｎｐｒｏ）、ならびにそれらのフラグメント；及び／又は（２）小さなユビキチン関連修飾剤（ＳＵＭＯ）（例、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ５５８５３．１）を含む。任意のＮ末端タグは、それ自体を、ポリヒスチジンタグ、例えば６ｘＨｉｓなどでさらにタグ付けしてもよく、ニッケルカラム上でのタグ付きポリペプチドの初期精製を可能にし、タグ、例えばＮｐｒｏなどの自己切断、又はＳＵＭＯプロテアーゼによるＳＵＭＯ Ｎ末端タグの酵素的切断、及びカラムからの遊離ポリペプチドの溶出がそれぞれ続く。この方法の一実施形態では、ＳＵＭＯプロテアーゼポリペプチドはまた、６ｘＨｉｓタグを含む融合タンパク質であって、２工程の精製を可能にする：第１工程では、発現された６ｘＨｉｓ－ＳＵＭＯ－タグ付きポリペプチドが、ニッケルカラムへの結合、続くカラムから溶出により精製される。第２工程では、精製ポリペプチド上のＳＵＭＯタグが、６ｘＨｉｓ－タグ付きＳＵＭＯプロテアーゼにより切断され、ＳＵＭＯプロテアーゼ－ポリペプチド反応混合物が、第２ニッケルカラムを通して実行され、それは、ＳＵＭＯプロテアーゼを保持するが、しかし、今は非タグ付きであるポリペプチドが流れることを可能にする。
【0028】
リンカー 本明細書中で提供する方法において使用されるインテインポリペプチドは、リンカーを含むことができ、それは、二つの他のポリペプチドを接続するために使用されるポリペプチドである。アルファ－ヘリックスを形成するリンカーポリペプチドの例は、Ａｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｌｉｎｋｅｒ ｌｅｄ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｆ－ｂａｓｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２００９ Ｍａｒ；２６（３）：５２３－５２８；ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０９５－００８－９７６７－０；Ｅｐｕｂ ２００８ Ｎｏｖ １１において記載されている。
【0029】
追加の切断配列 切断配列は、化学試薬又は酵素により作用されて、切断配列を含むポリペプチドの切断をもたらすことができる別個のアミノ酸配列である。これらの配列の一つ又は複数を、タグ（例えば）と、インテインポリペプチド内又はその近傍の他のアミノ酸配列の間に導入して、タグ（又は他の型のアミノ酸配列）を切断することができる。エンテロキナーゼ切断配列（ＤＤＤＤＫＧ、配列番号１２及び１５のアミノ酸１１～１６）が、配列番号１２及び１５の６ｘＨｉｓ－タグ付き分割インテインポリペプチド配列中に含まれ、６ｘＨｉｓタグを切断することが可能になる。切断配列のさらなる例は、ＤＰを含むアミノ配列を含み、それは、Ｄ（Ａｓｐ）とＰ（Ｐｒｏ）の間の結合でのギ酸での処理により切断することができる。追加の例は、プロテアーゼ、例えばＴＥＶ（タバコエッチングウイルス）プロテアーゼ及びトロンビンなどにより切断可能なアミノ酸配列である。
【0030】
シグナルペプチド 本明細書中で提供する方法において利用されるインテイン融合ポリペプチドは、シグナルペプチドを有する、又はそれを欠くことができる。特定の実施形態では、インテイン融合ポリペプチドはシグナルペプチドを欠く。なぜなら、そのようなインテイン融合ポリペプチドが宿主細胞の細胞質中に保持されるのに有利であるためである。シグナルペプチド（シグナル配列、リーダー配列、又はリーダーペプチドとも呼ばれる）は、一つのアルファヘリックスを形成する傾向を有する、約５～２０アミノ酸長、しばしば約１０～１５アミノ酸長の疎水性アミノ酸の伸長により構造的に特徴付けられる。この疎水性伸長では、しばしば、正荷電アミノ酸（特にリジン）に富むより短い伸長が直前に先行する。成熟ポリペプチドから切断されるシグナルペプチドは、典型的には、シグナルペプチダーゼにより認識されて、切断されるアミノ酸の伸長で終わる。膜中へのポリペプチドの挿入を方向付けるシグナルペプチドは、シグナルアンカー配列とも呼ばれ、シグナルペプチダーゼにより切断されるアミノ酸配列を欠くことができ、その場合では、ポリペプチド中に保持される。シグナルペプチドは、しばしば、共翻訳的に、又は翻訳後のいずれかで、細胞質から外に、例えば、原核生物の細胞膜（又は大腸菌などのグラム陰性細菌の内膜）を通して、又は真核細胞の小胞体中へのポリペプチドの輸送を方向付ける能力により機能的に特徴付けることができる。シグナルペプチドが、大腸菌などの宿主細胞のペリプラズム空間中にポリペプチドを輸送することを可能にする程度は、例えば、細胞質中に保持されるタンパク質からペリプラズムタンパク質を分離することにより決定することができる（ＷＯ２０１４０２５６６３Ａ１の実施例１２を参照）。
【0031】
ＩＩ．本方法により産生されるポリペプチド及びタンパク質。
本明細書中に提供する方法は、切断されるインテイン融合ポリペプチド配列内に含まれるインテインアミノ酸配列の使用、及び標的ポリペプチド又はタンパク質を生成するための、インテイン融合ポリペプチドの残り部分からのインテインアミノ配列の自己切除を含む。本開示の方法を使用して産生することができる標的ポリペプチド及びタンパク質は、以下のいずれか、又は複数を含むことができる：アルファ－１－アンチトリプシン；２Ｃ４（ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体）；アクチビン；アドレスイン；アルカリホスファターゼ；抗ＣＤ１１ａ；抗ＣＤ１８；抗ＣＤ２０；抗凝固因子、例えばプロテインＣなど；抗ＨＥＲ－２抗体；抗ＩｇＥ；抗ＩｇＧ；抗ＶＥＧＦ；抗体及び抗体フラグメント；ＥｒｂＢ２ドメインに対する抗体、例えばＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン中の領域（例、ＥｒｂＢ２の残基２２前後から残基５８４前後までの領域中の任意の一つ又は複数の残基）に結合する２Ｃ４（ＷＯ ０１／００２４５ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ－１２６９７）など；Ａｐｏ２ リガンド（Ａｐｏ２Ｌ）；心房性ナトリウム利尿因子；ＢＤＮＦ；ベータラクタマーゼ；ボンベシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；ボツリヌス毒素；脳 ＩＧＦ－Ｉ；カルシトニン；カーディオトロフィン（心肥大因子）、例えばカーディオトロフィン－１（ＣＴ－１）など；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ１９ など；凝固因子、例えば第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、フォン・ヴィレブランズ因子など；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ；サイトカイン；崩壊加速因子；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳 ＩＧＦ－Ｉ）；ＤＮアーゼ；エンケファリナーゼ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；エリスロポエチン；線維芽細胞増殖因子、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦなど；卵胞刺激ホルモン；グルカゴン；ｇｐ１２０；グレリン；ヒト成長ホルモン又はウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；造血成長因子；ホーミング受容体；ＨＳＡ；ＩＧＦ－Ｉ；ＩＧＦ－ＩＩ；免疫毒素；インヒビン；インスリン鎖（インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖）又はプロインスリン；インスリン様成長因子結合タンパク質；インスリン様成長因子－Ｉ及び－ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）；インテグリン；インターフェロン、例えばインターフェロン－アルファ、－ベータ、－ガンマなど；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１からＩＬ－１０；レプチン；リポタンパク質；肺サーファクタント；黄体形成ホルモン；メトレレプチン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ミュラー管阻害物質；神経成長因子（ＮＧＦ）；神経栄養因子、例えば脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３、４、５、又は６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、又はＮＴ－６）など；骨誘導因子；副甲状腺ホルモン；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼあるいはヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）など；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；プロリラキシン；プロテインＡ又はＤ；ホルモン又は成長因子についての受容体；調節タンパク質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；レニン；リウマチ因子；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）など；スーパーオキシドジスムターゼ；表面膜タンパク質；Ｔ細胞受容体；ＴＧＦ－ベータ；トロンビン；トロンボポエチン；甲状腺刺激ホルモン；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ－１、ＴＧＦ－２、ＴＧＦ－３、ＴＧＦ－４、又はＴＧＦ－５を含むＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータなど；輸送タンパク質；腫瘍壊死因子－アルファ及び－ベータ；ウロキナーゼ；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部など；上のいずれかのフラグメント；ならびに上のタンパク質もしくはそのフラグメント又は機能ドメインの一つ又は複数に共有結合的に結合される上のいずれか又はそのフラグメント、例えば：抗体Ｆｃドメイン、抗体単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、酵素活性を伴うドメイン（例えばグリコシド加水分解酵素ドメイン又はキナーゼドメインなど）、ＥＶＨ１（Ｅｎａ／Ｖａｓｐホモログ、又はＷＨ１）ドメイン、ＰＡＳ（Ｐｅｒ－Ａｒｎｔ－Ｓｉｍ）ドメイン、ＰＤＺドメイン、ＰＯＵ（Ｐｉｔ－１、Ｏｃｔ、Ｕｎｃ－８６）ドメイン、ＳＰＲ（Ｓｐｒｅａｄ、Ｓｐｒｏｕｔｙ）ドメイン、ＶＷＦＣ（フォン・ヴィルブランド因子、Ｃ型又はＶＷＣ）ドメイン、又はジンクフィンガードメイン（例えば、リングフィンガードメイン）。
本明細書中に提供する方法は、切断されるインテイン融合ポリペプチド配列内に含まれるインテインアミノ酸配列の使用、及び標的ポリペプチド又はタンパク質を生成するための、インテイン融合ポリペプチドの残り部分からのインテインアミノ配列の自己切除を含む。本開示の方法を使用して産生することができる標的ポリペプチド及びタンパク質は、以下のいずれか、又は複数を含むことができる：アルファ－１－アンチトリプシン；２Ｃ４（ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体）；アクチビン；アドレスイン；アルカリホスファターゼ；抗ＣＤ１１ａ；抗ＣＤ１８；抗ＣＤ２０；抗凝固因子、例えばプロテインＣなど；抗ＨＥＲ－２抗体；抗ＩｇＥ；抗ＩｇＧ；抗ＶＥＧＦ；抗体及び抗体フラグメント；ＥｒｂＢ２ドメインに対する抗体、例えばＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン中の領域（例、ＥｒｂＢ２の残基２２前後から残基５８４前後までの領域中の任意の一つ又は複数の残基）に結合する２Ｃ４（ＷＯ ０１／００２４５ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ－１２６９７）など；Ａｐｏ２ リガンド（Ａｐｏ２Ｌ）；心房性ナトリウム利尿因子；ＢＤＮＦ；ベータラクタマーゼ；ボンベシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；ボツリヌス毒素；脳 ＩＧＦ－Ｉ；カルシトニン；カーディオトロフィン（心肥大因子）、例えばカーディオトロフィン－１（ＣＴ－１）など；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ１９ など；凝固因子、例えば第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、フォン・ヴィレブランズ因子など；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ；サイトカイン；崩壊加速因子；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳 ＩＧＦ－Ｉ）；ＤＮアーゼ；エンケファリナーゼ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；エリスロポエチン；線維芽細胞増殖因子、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦなど；卵胞刺激ホルモン；グルカゴン；ｇｐ１２０；グレリン；ヒト成長ホルモン又はウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；造血成長因子；ホーミング受容体；ＨＳＡ；ＩＧＦ－Ｉ；ＩＧＦ－ＩＩ；免疫毒素；インヒビン；インスリン鎖（インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖）又はプロインスリン；インスリン様成長因子結合タンパク質；インスリン様成長因子－Ｉ及び－ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）；インテグリン；インターフェロン、例えばインターフェロン－アルファ、－ベータ、－ガンマなど；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１からＩＬ－１０；レプチン；リポタンパク質；肺サーファクタント；黄体形成ホルモン；メトレレプチン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ミュラー管阻害物質；神経成長因子（ＮＧＦ）；神経栄養因子、例えば脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３、４、５、又は６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、又はＮＴ－６）など；骨誘導因子；副甲状腺ホルモン；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼあるいはヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）など；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；プロリラキシン；プロテインＡ又はＤ；ホルモン又は成長因子についての受容体；調節タンパク質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；レニン；リウマチ因子；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）など；スーパーオキシドジスムターゼ；表面膜タンパク質；Ｔ細胞受容体；ＴＧＦ－ベータ；トロンビン；トロンボポエチン；甲状腺刺激ホルモン；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ－１、ＴＧＦ－２、ＴＧＦ－３、ＴＧＦ－４、又はＴＧＦ－５を含むＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータなど；輸送タンパク質；腫瘍壊死因子－アルファ及び－ベータ；ウロキナーゼ；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部など；上のいずれかのフラグメント；ならびに上のタンパク質もしくはそのフラグメント又は機能ドメインの一つ又は複数に共有結合的に結合される上のいずれか又はそのフラグメント、例えば：抗体Ｆｃドメイン、抗体単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、酵素活性を伴うドメイン（例えばグリコシド加水分解酵素ドメイン又はキナーゼドメインなど）、ＥＶＨ１（Ｅｎａ／Ｖａｓｐホモログ、又はＷＨ１）ドメイン、ＰＡＳ（Ｐｅｒ－Ａｒｎｔ－Ｓｉｍ）ドメイン、ＰＤＺドメイン、ＰＯＵ（Ｐｉｔ－１、Ｏｃｔ、Ｕｎｃ－８６）ドメイン、ＳＰＲ（Ｓｐｒｅａｄ、Ｓｐｒｏｕｔｙ）ドメイン、ＶＷＦＣ（フォン・ヴィルブランド因子、Ｃ型又はＶＷＣ）ドメイン、又はジンクフィンガードメイン（例えば、リングフィンガードメイン）。
【0032】
ジスルフィド結合 本明細書中で提供する方法により産生される標的ポリペプチド及びタンパク質は、一部の例では、ジスルフィド結合を形成することができるポリペプチド及びタンパク質である。ジスルフィド結合は、例えば、ポリペプチド中に存在するシステイン残基のチオール基の間に形成される、Ｒ－Ｓ－Ｓ－Ｒ’として表される硫黄原子間の共有結合である。ポリペプチド又はタンパク質についてのジスルフィド結合の数は、機能的産物中に存在する場合、そのポリペプチド又はタンパク質により形成される分子内及び分子間ジスルフィド結合の総数である。例えば、ヒトＩｇＧ抗体軽鎖及び重鎖が同時発現される場合、抗体軽鎖は、典型的には、三つのジスルフィド結合（二つの分子内結合及び一つの分子間結合）を形成することができ、抗体重鎖は、典型的には、７つのジスルフィド結合（四つの分子内結合及び三つの分子間結合）を形成することができる。特定の実施形態では、本明細書中の方法により産生されるポリペプチド又はタンパク質は、少なくとも一つ及び２０未満のジスルフィド結合、又は少なくとも二つ及び１７未満のジスルフィド結合、又は少なくとも１７及び５０未満のジスルフィド結合、又は少なくとも三つ及び１０未満のジスルフィド結合、又は少なくとも三つ及び八つ未満のジスルフィド結合を形成することができる、あるいは一、二、三、四、五、六、七、八、及び九つのジスルフィド結合からなる群から選択される多数のジスルフィド結合を形成することができるポリペプチド又はタンパク質である。
【0033】
シャペロン 一部の実施形態では、インテイン融合ポリペプチドは、標的ポリペプチド又はタンパク質の産生に有益である、他の遺伝子産物、例えばシャペロンなどと同時発現される。シャペロンは、他の遺伝子産物のフォールディングもしくはアンフォールディング、及び／又はアセンブリ又は分解を支援する、しかし、構造がそれらの通常の生物学的機能（フォールディング及び／又はアセンブリの過程を完了している）を実施している際、結果として生じる単量体又は多量体遺伝子産物構造中では生じないタンパク質である。チャペロンは、発現構築物内の誘導性プロモーターもしくは構成的プロモーターから発現させることができる、又は宿主細胞染色体から発現させることができる；好ましくは、宿主細胞中のチャペロンタンパク質の発現は、適切に折り畳まれ、及び／又は標的タンパク質に組み立てられ、同時発現された標的ポリペプチドを産生するのに十分に高いレベルにある。大腸菌宿主細胞中に存在するシャペロンの例は、フォールディング因子ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ、ＤｓｂＣ／ＤｓｂＧ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、ＩｂｐＡ／ＩｂｐＢ、Ｓｋｐ、Ｔｉｇ（トリガー因子）、及びＦｋｐＡがあり、これらは細胞質タンパク質又はペリプラズムタンパク質のタンパク質凝集を防止するために使用されてきた。ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、及びＣｌｐＢは、タンパク質フォールディングを支援する際に相乗的に機能することができ、従って、組み合せにおけるこれらのシャペロンの発現は、タンパク質発現のために有益であることが示されている（Ｍａｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒａｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ” Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２０１１ Ｍａｙ １４；１０：３２）。原核生物宿主細胞中で真核生物タンパク質を発現させる場合、真核生物シャペロンタンパク質、例えば同じもしくは関連する真核生物種からの、又はフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）などが、特定の実施形態において、所望の遺伝子産物と同時発現される、又は誘導的に同時発現される。
【0034】
ＩＩＩ．発現構築物
発現構築物は、目的の一つ又は複数の遺伝子産物、例えばインテインアミノ酸配列及び標的ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含むインテイン融合ポリペプチドなどの発現のために設計されたポリヌクレオチドである。目的の特定の遺伝子産物は、それらが発現される宿主細胞のものとは異なる種から由来する「異種」遺伝子産物であり、及び／又は発現構築物内で利用されるプロモーターから自然に発現されない異種遺伝子産物であり、及び／又はそのような遺伝子産物の天然形態との違いを含むように設計された改変遺伝子産物である。異種及び／もしくは改変遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む、又は異なる種の生物から由来したポリヌクレオチドの組み合わせを含む、又は天然ポリヌクレオチドとは異なるように改変されているポリヌクレオチドを含む発現構築物は、天然分子ではない。発現構築物は、宿主細胞染色体中に組み込むことができ、又は宿主細胞染色体から独立して複製するポリヌクレオチド分子、例えばプラスミドもしくは人工染色体などとして宿主細胞内に維持することができる。発現構築物の例は、宿主細胞染色体中への一つ又は複数のポリヌクレオチド配列の挿入から得られるポリヌクレオチドであり、挿入されたポリヌクレオチド配列は、染色体コード配列の発現を変化させる。発現ベクターは、一つ又は複数の遺伝子産物の発現のために特に使用されるプラスミド発現構築物である。一つ又は複数の発現構築物は、宿主細胞染色体中に組み込む、又は染色体外ポリヌクレオチド、例えばプラスミドもしくは人工染色体などの上に維持することができる。特定の実施形態では、発現構築物は、二重プロモーター発現ベクター、例えばＵＳ２０１５３５３９４０Ａ１及びＷＯ２０１６２０５５７０Ａ１において記載されるものなどである。
発現構築物は、目的の一つ又は複数の遺伝子産物、例えばインテインアミノ酸配列及び標的ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含むインテイン融合ポリペプチドなどの発現のために設計されたポリヌクレオチドである。目的の特定の遺伝子産物は、それらが発現される宿主細胞のものとは異なる種から由来する「異種」遺伝子産物であり、及び／又は発現構築物内で利用されるプロモーターから自然に発現されない異種遺伝子産物であり、及び／又はそのような遺伝子産物の天然形態との違いを含むように設計された改変遺伝子産物である。異種及び／もしくは改変遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む、又は異なる種の生物から由来したポリヌクレオチドの組み合わせを含む、又は天然ポリヌクレオチドとは異なるように改変されているポリヌクレオチドを含む発現構築物は、天然分子ではない。発現構築物は、宿主細胞染色体中に組み込むことができ、又は宿主細胞染色体から独立して複製するポリヌクレオチド分子、例えばプラスミドもしくは人工染色体などとして宿主細胞内に維持することができる。発現構築物の例は、宿主細胞染色体中への一つ又は複数のポリヌクレオチド配列の挿入から得られるポリヌクレオチドであり、挿入されたポリヌクレオチド配列は、染色体コード配列の発現を変化させる。発現ベクターは、一つ又は複数の遺伝子産物の発現のために特に使用されるプラスミド発現構築物である。一つ又は複数の発現構築物は、宿主細胞染色体中に組み込む、又は染色体外ポリヌクレオチド、例えばプラスミドもしくは人工染色体などの上に維持することができる。特定の実施形態では、発現構築物は、二重プロモーター発現ベクター、例えばＵＳ２０１５３５３９４０Ａ１及びＷＯ２０１６２０５５７０Ａ１において記載されるものなどである。
【0035】
発現構築物は、特定のポリヌクレオチドエレメント、例えば複製の起点、選択マーカー、プロモーター、例えば構成的又は誘導性プロモーターなど（以下でさらに記載する）、リボソーム結合部位、及び複数のクローニング部位などを含み得る。これらのポリヌクレオチドエレメントの例は、当技術分野において周知であり、それらのさらなる記載は、以下の特許刊行物及び出願において見出すことができ、それらの全てが、参照により本明細書中に明示的に組み入れられる。ＵＳ９，６１７，３３５Ｂ２及びＷＯ２０１４／０２５６６３Ａ１、“Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ”、ＵＳ２０１５／３５３９４０Ａ１及びＷＯ２０１６／２０５５７０Ａ１、“Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ ａｎ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ”、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６７０６４、“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ”。
【0036】
誘導性プロモーター 以下にさらに記載するように、本明細書中に記載する発現システムの一部として発現構築物中に含むことができるいくつかの異なる誘導性プロモーターがある。好ましい誘導性プロモーターは、表２中に記載するものを含む。
【表2】
【0037】
〔注意］ Ｃｒａは、多くの異なるプロモーターのアクチベーター（インデューサーは要求されない）又はリプレッサー（抑制解除のために要求されるインデューサー）として作用する。一部のＣｒａ調節プロモーターについては、Ｃｒａの結合又は抑制解除に加えて、他の転写因子の結合（又はその抑制解除）が発現のために要求される。ここに列挙するプロモーターは、フルクトースの添加が、抑制性糖、例えばグルコースなどの非存在において、Ｃｒａ抑制解除及びプロモーターの発現をもたらすのに十分であるはずであるプロモーターである。
【0038】
特定の好ましい誘導性プロモーターは、ＷＯ２０１４／０２５６６３Ａ１の表１中に定義するように、少なくとも８０％のポリヌクレオチド配列同一性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性、及び最も好ましくは少なくとも９５％の同一性）を、プロモーターポリヌクレオチド配列の少なくとも３０（より好ましくは少なくとも４０、及び最も好ましくは少なくとも５０）の連続塩基と共有し、ここで、ポリヌクレオチド配列同一性の割合は、実施例３の方法を使用して決定される。好ましい誘導性プロモーターは、Ｄｅ Ｍｅｙ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｒａｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｎｅ ｔｕｎｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ，”ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０ Ｍａｒ ２４；１０：２６（ＷＯ２０１４／０２５６６３Ａ１の実施例８Ａ）の定量的ＰＣＲ法を使用して決定される、大腸菌Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５の対応する「野生型」誘導性プロモーターの少なくとも７５％（より好ましくは少なくとも１００％、最も好ましくは少なくとも１１０％）の強度を有する。発現構築物内で、誘導性プロモーターが、誘導的に発現される遺伝子産物についてのコード配列に対して５’（又は「その上流」）に配置され、誘導性プロモーターの存在が、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドのコード鎖に対して５’から３’方向に遺伝子産物コード配列の転写を方向付けることとなる。発現構築物内の誘導性プロモーターから発現される遺伝子産物は、これらの誘導性プロモーターから天然に発現される遺伝子産物ではなく、むしろ、それらは異種遺伝子産物であり、誘導性プロモーターから発現される異種遺伝子産物を含む発現構築物は、必然的に自然において見出されない人工構築物であるという結果を伴う。
【0039】
誘導性プロモーター 以下は、遺伝子産物の発現のための発現構築物において使用することができる誘導性プロモーター、ならびにそのような発現構築物を含む宿主細胞に作製することができる遺伝子改変の一部の記載である。これらの誘導性プロモーター及び関連遺伝子の例は、他に特定しない限り、大腸菌（大腸菌）株ＭＧ１６５５（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｄｅｐｏｓｉｔ ＡＴＣＣ ７００９２６）から由来するものであり、これは大腸菌Ｋ－１２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｄｏｉｃｅ ＡＴＣＣ １０７９８）の亜系である。 国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／５３５６２（ＷＯ２０１４／０２５６６３Ａ１）の表１は、誘導性プロモーター及び関連遺伝子のこれらの例についてのヌクレオチド配列の大腸菌ＭＧ１６５５におけるゲノム位置を列挙する；ＷＯ２０１４０２５６６３Ａ１公開は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。ヌクレオチド及び他の遺伝子配列は、ＷＯ２０１４／０２５６６３Ａ１の表１中のゲノム位置により参照され、参照により本明細書中に明示的に組み込まれる。本明細書中に記載する大腸菌プロモーター、遺伝子、及び株に関する追加情報は、ｅｃｏｌｉｗｉｋｉ．ｎｅｔのオンラインＥｃｏｌｉＷｉｋｉ リソースを含む、多くの公開リソースにおいて見出すことができる。
【0040】
アラビノースプロモーター （本明細書中で使用するように、「アラビノース」はＬ－アラビノースを意味する。）アラビノース利用に含まれるいくつかの大腸菌オペロンは、アラビノース―ａｒａＢＡＤ、ａｒａＣ、ａｒａＥ、及びａｒａＦＧＨ―により誘導可能であるが、しかし、典型的には、用語「アラビノースプロモーター」及び「ａｒａ プロモーター」は、ａｒａＢＡＤプロモーターを指定するために使用される。いくつかの追加の用語が、大腸菌ａｒａＢＡＤプロモーターを示すために使用されており、例えばＰａｒａ、ＰａｒａＢ、ＰａｒａＢＡＤ、及びＰＢＡＤなどである。「ａｒａプロモーター」又は上に与える代替的な用語のいずれかの本明細書中での使用は、大腸菌ａｒａＢＡＤプロモーターを意味する。別の用語であるａｒａＣ－ａｒａＢＡＤプロモーターの使用から分かるように、ａｒａＢＡＤプロモーターは双方向性プロモーターの一部とみなされ、一つの方向にａｒａＢＡＤオペロンの発現を制御するａｒａＢＡＤプロモーター、及び他の方向にａｒａＣコード配列の発現を制御する、ａｒａＢＡＤプロモーターからの反対鎖に近接して、及びその上にａｒａＣプロモーターを伴う。ＡｒａＣタンパク質は、ａｒａＢＡＤプロモーターのポジティブ及びネガティブの両方の転写調節因子である。アラビノースの非存在において、ＡｒａＣタンパク質はＰＢＡＤからの転写を抑制するが、しかし、アラビノースの存在において、ＡｒａＣタンパク質は、アラビノース結合時にその立体構造を変化させ、ＰＢＡＤからの転写を可能にするポジティブな調節因子となる。ａｒａＢＡＤオペロンは、Ｌ－アラビノースを、中間体Ｌ－リブロース及びＬ－リブロース－リン酸を通じて、Ｄ－キシルロース－５－リン酸に変換することにより代謝するタンパク質をコードする。アラビノース誘導性プロモーターからの発現の誘導を最大化する目的のために、Ｌ－リブロースへのＬ－アラビノースの変換を触媒するＡｒａＡの機能を除去又は低下させること、ならびに、場合により、ＡｒａＢ及びＡｒａＤの少なくとも一つの機能も除去又は低下させることが有用である。細胞中のアラビノースの有効濃度を減少させる宿主細胞の能力を除去又は低下させることによって、アラビノースを他の糖に変換する細胞の能力を除去又は低下させることにより、より多くのアラビノースをアラビノース誘導性プロモーターの誘導のために利用可能にすることが可能になる。宿主細胞中にアラビノースを移動させるトランスポーターをコードする遺伝子は、低親和性Ｌ－アラビノースプロトンシンポーターをコードするａｒａＥ、及びＡＢＣスーパーファミリー高親和性Ｌ－アラビノーストランスポーターのサブユニットをコードするａｒａＦＧＨ オペロンである。Ｌ－アラビノースを細胞中に輸送することができる他のタンパク質は、ＬａｃＹラクトースパーミアーゼの特定の変異体：それぞれ位置１７７でアラニンの代わりにシステイン又はバリンアミノ酸を有するＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）及びＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）タンパク質である（Ｍｏｒｇａｎ－Ｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ａｎｄ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｒａＢＡＤ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｌａｃｔｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｏｆ ｒｅｌａｘｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２ Ｍａｙ ２８；９９（１１）：７３７３－７３７７）。アラビノース誘導性プロモーターの均一な誘導を達成するために、アラビノースによる調節に非依存的な細胞中へのアラビノースの輸送を行うのが有用である。これは、ＡｒａＦＧＨトランスポータータンパク質の活性を除去又は低下させ、ａｒａＥの発現を、それが構成的プロモーターからのみ転写されるように変化させることにより達成することができる。ａｒａＥの構成的発現は、天然ａｒａＥ遺伝子の機能を除去又は低下させ、構成的プロモーターから発現されたＡｒａＥタンパク質についてのコード配列を含む発現構築物を細胞中に導入することにより達成することができる。あるいは、ＡｒａＦＧＨ機能を欠く細胞中では、宿主細胞の染色体ａｒａＥ遺伝子の発現を制御するプロモーターを、アラビノース誘導性プロモーターから構成性プロモーターに変化させることができる。類似の様式において、アラビノース誘導性プロモーターの均一な誘導のための追加の代替として、ＡｒａＥ機能を欠く宿主細胞は、構成的プロモーターから発現された細胞中に存在する任意の機能的ＡｒａＦＧＨコード配列を有することができる。別の代替として、天然ａｒａＥ及びａｒａＦＧＨプロモーターを、宿主染色体中の構成的プロモーターで置換することにより、構成的プロモーターからａｒａＥ遺伝子及びａｒａＦＧＨオペロンの両方を発現させることが可能である。また、ＡｒａＥ及びＡｒａＦＧＨアラビノーストランスポーターの両方の活性を除去又は低下させ、その状況において、このタンパク質がアラビノースを輸送することを可能にするＬａｃＹラクトースパーミアーゼ中の変異を使用することも可能である。ｌａｃＹ遺伝子の発現は、通常、アラビノースにより制御されないため、ＬａｃＹ変異体、例えばＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）又はＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）などの使用は、アラビノース誘導性プロモーターがアラビノースの存在により誘導される場合、「全か無か」の誘導現象に導かない。ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）タンパク質は、アラビノースを細胞中に輸送する際により効果的であるように見えるため、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用は、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用よりも好ましい。
【0041】
プロピオン酸プロモーター 「プロピオン酸プロモーター」又は「ｐｒｐプロモーター」は、大腸菌ｐｒｐＢＣＤＥオペロンのプロモーターであり、また、ＰｐｒｐＢと呼ばれる。ａｒａプロモーターと同様に、ｐｒｐプロモーターは双方向性プロモーターの一部であり、一つの方向でｐｒｐＢＣＤＥオペロンの発現を制御し、他の方向でｐｒｐＲコード配列の発現を制御するｐｒｐＲプロモーターを伴う。ＰｒｐＲタンパク質は、ｐｒｐプロモーターの転写調節因子であって、ＰｒｐＲタンパク質が２－メチルクエン酸塩（「２‐ＭＣ」）に結合する場合、ｐｒｐプロモーターからの転写を活性化する。プロピオン酸（また、プロパン酸と呼ばれる）は、プロピオン酸（又はプロパン酸）のイオンＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯ－ であり、このクラスの分子の特定の特性を共有する一般式Ｈ（ＣＨ２）ｎ ＣＯＯＨを有する「脂肪」酸のうちで最も小さく：水から塩分を出し、石鹸状のカリウム塩を有する場合に油性層を産生する。市販のプロピオン酸は、一般的に、プロピオン酸の一価カチオン塩、例えばプロピオン酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＨ２ ＣＯＯＮａ）などとして、又は二価カチオン塩、例えばプロピオン酸カルシウム（Ｃａ（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯ）２）などとして販売される。プロピオン酸は膜透過性であり、ＰｒｐＥ（プロピオニル－ＣｏＡシンテターゼ）によるプロピオニル－ＣｏＡへのプロピオン酸の変換、及び次に、ＰｒｐＣ（２－メチルシトレートシンターゼ）による２－ＭＣへのプロピオニル－ＣｏＡの変換により２－ＭＣに代謝される。ｐｒｐＢＣＤＥオペロンによりコードされる他のタンパク質、ＰｒｐＤ（２－メチルクエン酸デヒドラターゼ）及びＰｒｐＢ（２－メチルイソクエン酸リアーゼ）は、より小さな産物、例えばピルビン酸及びコハク酸塩などへの２－ＭＣのさらなる異化において含まれる。細胞成長培地に加えられたプロピオン酸によるプロピオン酸誘導性プロモーターの誘導を最大化するために、従って、プロピオン酸を２‐ＭＣに変換するために、ＰｒｐＣ及びＰｒｐＥ活性を伴うが、しかし、また、除去又は低下されたＰｒｐＤ活性、及び、場合により、除去又は低下されたＰｒｐＢ活性も有しており、２‐ＭＣが代謝されることが防止された宿主細胞を有することが望ましい。２‐ＭＣ生合成において含まれるタンパク質をコードする別のオペロンは、ｓｃｐＡ－ａｒｇＫ－ｓｃｐＢＣオペロンであり、また、ｓｂｍ－ｙｇｆＤＧＨオペロンと呼ばれる。これらの遺伝子は、プロピオニル－ＣｏＡへのコハク酸塩の変換のために要求されるタンパク質をコードし、それは次に、ＰｒｐＣにより２‐ＭＣに変換することができる。これらのタンパク質の機能の除去又は低下によって、２－ＭＣインデューサーの産生のための平行経路が除去され、このように、プロピオン酸誘導性プロモーターの発現のバックグラウンドレベルが低下し、外因的に供給されたプロピオン酸に対するプロピオン酸誘導性プロモーターの感受性が増加し得る。ｓｂｍ－ｙｇｆＤ－ｙｇｆＧ－ｙｇｆＨ－ｙｇｆＩの欠失が、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に導入され、ＪＳＢ株が作製され（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｋｅａｓｌｉｎｇ，“Ａ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｎｔｅｒｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ，”Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００５ Ｎｏｖ；７１（１１）：６８５６－６８６２）、外因的に供給されたインデューサーの非存在においてバックグラウンド発現を低下させる際に有用であったが、しかし、この欠失によって、ＪＳＢ株におけるｐｒｐプロモーターからの全体的な発現も低下した。しかし、欠失ｓｂｍ－ｙｇｆＤ－ｙｇｆＧ－ｙｇｆＨ－ｙｇｆＩはまた、明らかにｙｇｆＩに影響を及ぼし、それは機能未知の推定ＬｙｓＲファミリー転写レギュレーターをコードする。遺伝子ｓｂｍ－ｙｇｆＤＧＨは一つのオペロンとして転写され、ｙｇｆＩは反対の鎖から転写される。ｙｇｆＨ及びｙｇｆＩコード配列の３’末端は、少数の塩基対により重複し、そのため、ｓｂｍ－ｙｇｆＤＧＨオペロンの全てを取り除く欠失によって、明らかにｙｇｆＩコード機能も取り除かれた。ｓｂｍ－ｙｇｆＤＧＨ遺伝子産物のサブセット、例えばＹｇｆＧ（また、ＳｃｐＢ、メチルマロニル－ＣｏＡデカルボキシラーゼと呼ばれる）などの機能を除去又は低下させる、又は、ｓｂｍ－ｙｇｆＤＧＨ （又は ｓｃｐＡ－ａｒｇＫ－ｓｃｐＢＣ） オペロンの大部分を欠失させる一方で、ｙｇｆＨ （又は ｓｃｐＣ） 遺伝子の３’末端を十分に残して、ｙｇｆＩの発現に影響が及ぼされないようにすることは、誘導された発現の最大レベルを低下させることなく、プロピオン酸誘導性プロモーターからのバックグラウンド発現を十分に低下させるのに十分であり得る。
【0042】
ラムノースプロモーター （本明細書中で使用する、「ラムノース」はＬ－ラムノースを意味する。）「ラムノースプロモーター」又は「ｒｈａプロモーター」、又はＰｒｈａＳＲは、大腸菌ｒｈａＳＲオペロンのプロモーターである。ａｒａ及びｐｒｐプロモーターと同様に、ｒｈａプロモーターは、双方向性プロモーターの一部であり、一つの方向にｒｈａＳＲオペロンの発現を制御し、他の方向にｒｈａＢＡＤオペロンの発現を制御するｒｈａＢＡＤプロモーターを伴う。ｒｈａプロモーターは、しかし、発現を調節する際に含まれる二つの転写調節因子を有する：ＲｈａＲ及びＲｈａＳ．ＲｈａＲタンパク質は、ラムノースの存在においてｒｈａＳＲオペロンの発現を活性化させる一方で、ＲｈａＳタンパク質は、Ｌ－ラムノースの異化オペロン及び輸送オペロンであるｒｈａＢＡＤ及びｒｈａＴの発現をそれぞれ活性化させる（Ｗｉｃｋｓｔｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ＡｒａＣ／ＸｙｌＳ ｆａｍｉｌｙ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＲｈａＳ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｒｈａＳＲ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，”Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２０１０ Ｊａｎ；１９２（１）：２２５－２３２）。ＲｈａＳタンパク質はまた、ｒｈａＳＲオペロンの発現を活性化することができるが、実際には、ＲｈａＳは、ＲｈａＲと、発現をずっとより高いレベルに同時活性化する環状ＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）の能力に干渉することにより、この発現を負に自己調節する。ｒｈａＢＡＤオペロンは、Ｌ－ラムノースをＬ－ラムニュロースに変換するラムノース異化タンパク質ＲｈａＡ （Ｌ－ラムノースイソメラーゼ）；Ｌ－ラムヌロースをリン酸化してＬ－ラムヌロース－１－Ｐを形成するＲｈａＢ（ラムヌロキナーゼ）；ならびに、Ｌ－ラムヌロース－１－ＰをＬ－ラクトアルデヒド及びＤＨＡＰ（ジヒドロキシアセトンリン酸）に変換するＲｈａＤ （ラムヌロース－１－リン酸アルドラーゼ）をコードする。ランノース誘導性プロモーターからの発現の誘導のために利用可能な細胞中のランノースの量を最大化するために、ＲｈａＡ、又は、場合により、ＲｈａＡならびにＲｈａＢ及びＲｈａＤの少なくとも一つを排除又は低下させることにより、触媒により分解されるランノースの量を低下させることが望ましい。大腸菌細胞はまた、ｒｍｌＢＤＡＣＸ（又はｒｆｂＢＤＡＣＸ）オペロンによりコードされるタンパク質ＲｍｌＡ、ＲｍｌＢ、ＲｍｌＣ、及びＲｍｌＤ（また、それぞれＲｆｂＡ、ＲｆｂＢ、ＲｆｂＣ、及びＲｆｂＤと呼ばれる）の活性を通して、アルファ－Ｄ－グルコース－１－ＰからＬ－ラムノースを合成することができる。ラムノース誘導性プロモーターからのバックグラウンド発現を低下させ、外因性に供給されるラムノースによるラムノース誘導性プロモーターの誘導の感度を増強するために、ＲｍｌＡ、ＲｍｌＢ、ＲｍｌＣ、及びＲｍｌＤタンパク質の一つ又は複数の機能を排除又は低下させることが有用であり得る。Ｌ－ラムノースは、ＲｈａＴ、ラムノースパーミナーゼ又はＬ－ラムノース：プロトンシンポーターにより細胞中に輸送される。上記のように、ＲｈａＴの発現は、転写レギュレーターＲｈａＳにより活性化される。ＲｈａＴの発現を、ラムノースによる誘導（ＲｈａＳの発現を誘導する）から独立させるために、宿主細胞を、細胞中の全ての機能的ＲｈａＴコード配列が構成的プロモーターから発現されるように改変することができる。加えて、ＲｈａＳのコード配列は、欠失又は不活化させることができ、機能的ＲｈａＳは産生されなくなる。細胞中のＲｈａＳの機能を排除又は低下させることにより、ｒｈａＳＲプロモーターからの発現のレベルが、ＲｈａＳによる負の自己調節の欠如に起因して増加し、ランノース触媒オペロンｒｈａＢＡＤの発現のレベルが低下し、ｒｈａプロモーターから発現を誘導するランノースの能力がさらに増加する。
【0043】
キシロースプロモーター （本明細書中で使用するように、「キシロース」はＤ－キシロースを意味する。）キシロースプロモーター、又は「ｘｙｌプロモーター」、又はＰｘｙｌＡは、大腸菌ｘｙｌＡＢオペロンのためのプロモーターを意味する。キシロースプロモーター領域は、ｘｙｌＡＢオペロン及びｘｙｌＦＧＨＲオペロンの両方が、隣接するキシロース誘導性プロモーターから、大腸菌染色体上の反対方向に発現されるという点で、組織化において他の誘導性プロモーターと類似している（Ｓｏｎｇ ａｎｄ Ｐａｒｋ，“Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄ－ｘｙｌｏｓｅ ｏｐｅｒｏｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２：ＸｙｌＲ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，”Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９７ Ｎｏｖ；１７９（２２）：７０２５－７０３２）。ＰｘｙｌＡ及びＰｘｙｌＦプロモーターの両方の転写レギュレーターが、ＸｙｌＲであり、それは、キシロースの存在においてこれらのプロモーターの発現を活性化する。ｘｙｌＲ遺伝子は、ｘｙｌＦＧＨＲオペロンの一部として、又はｘｙｌＨ及びｘｙｌＲタンパク質コード配列の間に位置するキシロースにより誘導されない、それ自体の弱いプロモーターからのいずれかで発現される。Ｄ－キシロースは、ＸｙｌＡ（Ｄ－キシロースイソメラーゼ）により異化され、それはＤ－キシロースをＤ－キシロースに変換し、次にＸｙｌＢ（キシルロキナーゼ）によりリン酸化されてＤ－キシルロース－５－Ｐを形成する。キシロース誘導性プロモーターからの発現の誘導のために利用可能な細胞中でのキシロースの量を最大化するために、少なくともＸｙｌＡの、又は、場合により、ＸｙｌＡ及びＸｙｌＢの両方の機能を除去又は低下させることにより、触媒により分解されるキシロースの量を低下させることが望ましい。ｘｙｌＦＧＨＲオペロンは、ＡＢＣスーパーファミリー高親和性Ｄ－キシローストランスポーターのサブユニットであるＸｙｌＦ、ＸｙｌＧ、及びＸｙｌＨをコードする。大腸菌低親和性キシロース－プロトンシンポーターをコードするｘｙｌＥ遺伝子は、別々のオペロンを表し、その発現はまた、キシロースにより誘導可能である。キシロースによる誘導に非依存的なキシローストランスポーターの発現を作製するために、宿主細胞を改変することができ、全ての機能性キシローストランスポーターを構成的プロモーターから発現させる。例えば、ｘｙｌＦＧＨＲオペロンは、ｘｙｌＦＧＨコード配列が欠失されるように改変することができ、ＸｙｌＲは、キシロース誘導性ＰｘｙｌＦプロモーターから発現される唯一の活性タンパク質として残され、ｘｙｌＥコード配列は、その天然プロモーターではなく、構成的プロモーターから発現される。別の例として、ｘｙｌＲコード配列は、発現構築物中のＰｘｙｌＡ又はＰｘｙｌＦプロモーターから発現される一方で、ｘｙｌＦＧＨＲオペロンは欠失され、ｘｙｌＥは構成的に発現される、又は、代わりに、ｘｙｌＦＧＨオペロン（ｘｙｌＲコード配列を欠く。なぜなら、それが発現構築物中に存在するためである）が、構成的プロモーターから発現され、ｘｙｌＥコード配列は欠失又は改変されて、それが活性タンパク質を産生しないようになる。
【0044】
ラクトースプロモーター 用語「ラクトースプロモーター」は、ｌａｃＺＹＡオペロンについてのラクトース誘導性プロモーター、ｌａｃＺｐ１とも呼ばれているプロモーターを指す；このラクトースプロモーターは大腸菌Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５のゲノム配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０００９１３．２、１１－ＪＡＮ－２０１２）中の約３６５６０３～３６５５６８に位置付けられる（マイナス鎖、約３６５６０３～３６５５９８のＲＮＡポリメラーゼ結合（「－３５」）部位、３６５５７９～３６５５７３のプリブノーボックス（「－１０」）、及び ３６５５６７の転写開始部位を伴う）。一部の実施形態では、発現系は、ラクトース誘導性プロモーター、例えばｌａｃＺＹＡプロモーターなどを含み得る。他の実施形態では、発現系は、ラクトース誘導性プロモーターではない、一つ又は複数の誘導性プロモーターを含む。
【0045】
アルカリホスファターゼプロモーター 用語「アルカリホスファターゼプロモーター」及び「ｐｈｏＡプロモーター」は、ｐｈｏＡｐｓｉＦオペロンについてのプロモーター、ホスファターゼ飢餓条件下で誘導されるプロモーターを指す。ｐｈｏＡプロモーター領域は、大腸菌Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５のゲノム配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０００９１３．３、１６－ＤＥＣ－２０１４）中の約４０１６４７～４０１７４６に位置付けられる（プラス 鎖、４０１６９５～４０１７０１のプリブノウボックス（「－１０’」）を伴う）（Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｇｅｎｅ （ｐｈｏＡ） ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９８１ Ｎｏｖ １１；９（２１）：５６７１－５６７８）。ｐｈｏＡプロモーターについての転写アクチベーターは、ＰｈｏＢであり、センサータンパク質ＰｈｏＲとともに、大腸菌において二成分シグナル伝達系を形成する転写レギュレーターである。ＰｈｏＢ及びＰｈｏＲは、大腸菌Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５のゲノム配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０００９１３．３、１６－ＤＥＣ－２０１４）中の約４１７０５０～４１９３００に位置付けられるｐｈｏＢＲオペロンから転写される（プラス鎖、４１７，１４２～４１７，８３１のＰｈｏＢコード配列及び４１７，８８９～４１９，１８４のＰｈｏＲコード配列を伴う）。ｐｈｏＡプロモーターは、インデューサーの添加ではなく、物質－細胞内リン酸－の欠如により誘導されるという点で、上に記載する誘導性プロモーターとは異なる。このため、ｐｈｏＡプロモーターは一般的に、宿主細胞がリン酸について枯渇する段階、例えば発酵の後期段階で産生される遺伝子産物の転写を指示するために使用される。一部の実施形態では、発現系はｐｈｏＡプロモーターを含み得る。他の実施形態では、発現系は、ｐｈｏＡプロモーターではない一つ又は複数の誘導性プロモーターを含む。
【0046】
ＩＶ．宿主細胞
本明細書中に記載するように使用されるインテイン融合ポリペプチドの産生のために、宿主細胞は、そのようなポリペプチドを発現することが可能な任意の細胞、例えば単細胞生物、培養中で成長させた単離細胞、又は多細胞生物から由来する単離細胞などであり得る。そのようなポリペプチドの効率的な誘導性発現を可能にする宿主細胞の例を提供する。
本明細書中に記載するように使用されるインテイン融合ポリペプチドの産生のために、宿主細胞は、そのようなポリペプチドを発現することが可能な任意の細胞、例えば単細胞生物、培養中で成長させた単離細胞、又は多細胞生物から由来する単離細胞などであり得る。そのようなポリペプチドの効率的な誘導性発現を可能にする宿主細胞の例を提供する。
【0047】
特に適切な宿主細胞は、発酵培養中で高細胞密度での成長が可能であり、高度に制御された誘導性遺伝子発現を通じて宿主細胞の細胞質を酸化する際にインテイン融合ポリペプチドを産生することができる。これら品質を伴う宿主細胞は、以下の特徴の一部又は全てを組み合わせることにより産生される。（１）宿主細胞は、細胞質中の酸化ポリペプチドの発現もしくは機能を増加させることを通じて、及び／又は細胞質中の還元ポリペプチドの発現もしくは機能を減少させることにより、酸化細胞質を有するように遺伝子改変される。システインオキシダーゼＤｓｂＡ、ジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣ、又はＤｓｂタンパク質の組み合わせは、それらは全てが通常、ペリプラズム中に輸送されるが、それらの発現を増加させることは、ジスルフィド結合を要求する異種タンパク質の発現において利用されてきた（Ｍａｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒａｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２０１１ Ｍａｙ １４；１０：３２）。例えば２０のアミノ酸のＮ末端切断を有する、細胞質型ＤｓｂＣ（「ｃＤｓｂＣ」）などであるこれらＤｓｂタンパク質の細胞質形態を発現することも可能であり、これらはシグナルペプチドを欠き、従って、細胞質中に輸送されない。細胞質Ｄｓｂタンパク質、例えばｃＤｓｂＣなどは、宿主細胞の細胞質をより酸化させるのに有用であり、このように、細胞質中で産生される異種タンパク質におけるジスルフィド結合の形成にさらに役立つ。宿主細胞の細胞質はまた、チオレドキシン酵素系及びグルタレドキシン／グルタチオン酵素系を直接的に改変することにより、より酸化させることができる：グルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）又はグルタチオンシンテターゼ（ｇｓｈＢ）において欠損がある変異株が、チオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）と一緒に、細胞質酸化を与える。これらの株はリボヌクレオチドを低下させることができず、従って、外因性還元剤、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの非存在において成長することができない。ペルオキシレドキシンＡｈｐＣをコードする遺伝子 ａｈｐＣにおけるサプレッサー変異（ａｈｐＣ＊又はａｈｐＣΔ）は、それを、還元型グルタチオンを生成するジスルフィドレダクターゼに変換し、酵素リボヌクレオチドレダクターゼ上への電子のチャネリングを可能にし、ｇｏｒ及びｔｒｘＢにおいて欠損がある細胞、又はｇｓｈＢ及びｔｒｘＢにおいて欠損がある細胞が、ＤＴＴの非存在において成長することが可能になる。異なるクラスの変異型のＡｈｐＣが、ガンマ－グルタミルシステインシンテターゼ（ｇｓｈＡ）の活性において欠損しており、ｔｒｘＢにおいて欠損している株が、ＤＴＴの非存在において成長することを可能にさせることができる；これらは、ＡｈｐＣ Ｖ１６４Ｇ、ＡｈｐＣ Ｓ７１Ｆ、ＡｈｐＣ Ｅ１７３／Ｓ７１Ｆ、ＡｈｐＣ Ｅ１７１Ｔｅｒ、及びＡｈｐＣ ｄｕｐ１６２～１６９を含む（Ｆａｕｌｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｌｌｏｗｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００８ Ｍａｙ ６；１０５（１８）：６７３５－６７４０，Ｅｐｕｂ ２００８ Ｍａｙ ２）。（２）場合により、宿主細胞はまた、所望の遺伝子産物の産生において補助するシャペロン及び／又は補因子を発現するように、ならびに／あるいはポリペプチド遺伝子産物をグリコシル化するように、遺伝子改変することができる。（３）宿主細胞はまた、発現構築物からの遺伝子産物発現の特定の態様を改善するように設計された追加の遺伝子改変を含み得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、（Ａ）少なくとも一つの誘導性プロモーターのインデューサーについてのトランスポータータンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子の遺伝子機能の改変を有し、別の例として、トランスポータータンパク質をコードする遺伝子が、ａｒａＥ、ａｒａＦ、ａｒａＧ、ａｒａＨ、ｒｈａＴ、ｘｙｌＦ、ｘｙｌＧ、及びｘｙｌＨからなる群から選択され、もしくは特にａｒａＥであり、又はより具体的には、遺伝子機能の改変が、構成的プロモーターからのａｒａＥの発現であり、ならびに／あるいは（Ｂ）少なくとも一つの誘導性プロモーターのインデューサーを代謝するタンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子の遺伝子機能の低下レベルを有し、及び、さらなる例として、少なくとも一つの誘導性プロモーターのインデューサーを代謝するタンパク質をコードする遺伝子が、ａｒａＡ、ａｒａＢ、ａｒａＤ、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＤ、ｒｈａＡ、ｒｈａＢ、ｒｈａＤ、ｘｙｌＡ、及びｘｙｌＢからなる群から選択され、ならびに／あるいは（Ｃ）少なくとも一つの誘導性プロモーターのインデューサーの生合成において含まれるタンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子の遺伝子機能の低下レベルを有し、当該遺伝子は、さらなる実施形態では、ｓｃｐＡ／ｓｂｍ、ａｒｇＫ／ｙｇｆＤ、ｓｃｐＢ／ｙｇｆＧ、ｓｃｐＣ／ｙｇｆＨ、ｒｍｌＡ、ｒｍｌＢ、ｒｍｌＣ、及びｒｍｌＤからなる群から選択される。
【0048】
特定の実施形態では、宿主細胞は、微生物細胞、例えば酵母（サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）など）など、もしくは細菌細胞であるか、又はグラム陽性細菌もしくはグラム陰性細菌であるか、又は大腸菌であるか、又は大腸菌Ｂ株であるか、又は大腸菌Ｂ株５２１細胞であるか、又は大腸菌Ｂ株５２２細胞である。大腸菌５２１細胞及び大腸菌５２２細胞は、以下の遺伝子型を有する：
【0049】
大腸菌５２１：ΔａｒａＢＡＤ ｆｈｕＡ２ ［ｌｏｎ］ ｏｍｐＴ ａｈｐＣΔ ｇａｌ λａｔｔ：：ｐＮＥＢ３－ｒ１－ｃＤｓｂＣ （Ｓｐｅｃ，ｌａｃＩ） ΔｔｒｘＢ ｓｕｌＡ１１ Ｒ（ｍｃｒ－７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０－－ＴｅｔＳ）２ ［ｄｃｍ］ Ｒ（ｚｇｂ－２１０：：Ｔｎ１０－－ＴｅｔＳ） ΔａｒａＥｐ：：Ｊ２３１０４ ΔｓｃｐＡ－ａｒｇＫ－ｓｃｐＢＣ ｅｎｄＡ１ ｒｐｓＬ－Ａｒｇ４３ Δｇｏｒ Δ（ｍｃｒＣ－ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０
【0050】
大腸菌５２２：ΔａｒａＢＡＤ ｆｈｕＡ２ ｐｒｐＤ ［ｌｏｎ］ ｏｍｐＴ ａｈｐＣΔ ｇａｌ λａｔｔ：：ｐＮＥＢ３－ｒ１－ｃＤｓｂＣ （Ｓｐｅｃ，ｌａｃＩ） ΔｔｒｘＢ ｓｕｌＡ１１ Ｒ（ｍｃｒ－７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０－－ＴｅｔＳ）２ ［ｄｃｍ］ Ｒ（ｚｇｂ－２１０：：Ｔｎ１０－－ＴｅｔＳ） ΔａｒａＥｐ：：Ｊ２３１０４ ΔｓｃｐＡ－ａｒｇＫ－ｓｃｐＢＣ ｅｎｄＡ１ ｒｐｓＬ－Ａｒｇ４３ Δｇｏｒ Δ（ｍｃｒＣ－ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０。
【0051】
酸化細胞質を有する大腸菌宿主細胞を用いた増殖実験において、酸化細胞質を有する大腸菌Ｂ株は、対応する大腸菌Ｋ株よりもはるかに高い細胞密度まで増殖することができることが確認された。他の適切な株は、大腸菌Ｂ株ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮＥＢカタログ番号Ｃ３０２８Ｈ）及びＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮＥＢカタログ番号Ｃ３０２９Ｈ）、ならびに大腸菌Ｋ株ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７（ＮＥＢカタログ番号Ｃ３０２６Ｈ）を含む。
【0052】
原核生物宿主細胞 一部の実施形態では、宿主細胞は原核生物宿主細胞である。原核生物宿主細胞は、古細菌（例えばハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ））、グラム陽性細菌（例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ブチネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、及びストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ））、又はグラム陰性細菌、アルファプロテオバクテリア（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、及びシノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、ベータプロテオバクテリア（アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）を含み、及びガンマプロテオバクテリア（アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アゾトバクター・ビネランジー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びプチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））を含み得る。好ましい宿主細胞は、腸内細菌科ファミリーのガンマプロテオバクテリア、例えばエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、大腸菌類 （大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）を含む）、及び赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などを含む。
【0053】
真核生物宿主細胞 多くの追加の種類の宿主細胞を、開示する方法において使用することができ、真核細胞、例えば酵母（カンジダ・シェハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、他のクリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）としても公知であるサッカロマイセス パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、デッケラ／ブレタノマイセス（Ｄｅｋｋｅｒａ／Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、及びヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）など；他の真菌類（アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ））；昆虫細胞株（キイロショウジョウバエＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞及びスポドプテラ・フルギペルダＳｆ９細胞）；ならびに哺乳動物細胞株、不死化細胞株（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ，２９３、又はＨＥＫ－２９３）細胞、及びヒト肝細胞がん細胞（Ｈｅｐ Ｇ２））を含む、を含む。上記の宿主細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能である。
【0054】
Ｖ．宿主細胞の成長のための方法。
少容量の成長。インテイン融合ポリペプチドを産生するために使用される宿主細胞は、成長又は誘導条件をテストする目的のために、又は複数の異なる遺伝子産物の産生などのために、少容量で成長させることができる。実施される実験の性質によって、宿主細胞を成長させる容積、例えば１ｍＬから１リットルまで、又は５ｍＬから５００ｍＬの間、又は任意の便利な容積などが決定される。特定の実施形態では、宿主細胞が成長する容器は、成長培地を撹拌し、このように、宿主細胞に酸素を提供するために、繰り返し移動させる。宿主細胞は、適切な栄養素、及び抗生物質抵抗性を提供する発現構築物の、宿主細胞による保持について選択するために要求される任意の抗生物質を含む培地中で成長させる。細胞中に存在する誘導性発現構築物の発現を誘導するために使用される適した量のインデューサーを決定するために、実験を、小容積中で、例えばマルチウェルプレート中で成長させた宿主細胞を用いて有利に実施することができる。
少容量の成長。インテイン融合ポリペプチドを産生するために使用される宿主細胞は、成長又は誘導条件をテストする目的のために、又は複数の異なる遺伝子産物の産生などのために、少容量で成長させることができる。実施される実験の性質によって、宿主細胞を成長させる容積、例えば１ｍＬから１リットルまで、又は５ｍＬから５００ｍＬの間、又は任意の便利な容積などが決定される。特定の実施形態では、宿主細胞が成長する容器は、成長培地を撹拌し、このように、宿主細胞に酸素を提供するために、繰り返し移動させる。宿主細胞は、適切な栄養素、及び抗生物質抵抗性を提供する発現構築物の、宿主細胞による保持について選択するために要求される任意の抗生物質を含む培地中で成長させる。細胞中に存在する誘導性発現構築物の発現を誘導するために使用される適した量のインデューサーを決定するために、実験を、小容積中で、例えばマルチウェルプレート中で成長させた宿主細胞を用いて有利に実施することができる。
【0055】
発酵 組換えタンパク質の産生において含まれる発酵過程では、以下のカテゴリーの一つに該当する操作モードを使用する：（１）不連続（バッチ過程）操作、（２）連続操作、及び（３）半連続（流加）操作。バッチ過程は、特定の反応期間にわたり培養される、過程の開始時での微生物を用いた無菌培養培地（バッチ培地）の播種により特徴付けられる。培養の間に、細胞濃度、基質濃度（炭素源、栄養塩類、ビタミンなど）及び産物濃度が変化する。良好に混合することによって、反応混合物の組成又は温度において局所的な有意差がないことが確実になる。反応は非定常であり、細胞は、成長制限基質（一般的には炭素源）が消費されるまで成長する。
【0056】
連続操作は、新鮮な培養培地（供給培地）が発酵槽に連続的に加えられ、使用済み培地及び細胞が発酵槽から同じ速度で連続的に引き出される点で特徴付けられる。連続操作では、成長速度は培地添加の速度により決定され、成長収率は成長制限基質（例、炭素源）の濃度により決定される。全ての反応変数及び制御パラメータは、時間において一定のままであり、従って、経時的な一定状態が発酵槽中で確立され、一定の生産性及び出力が続く。
【0057】
半連続操作は、バッチ操作及び連続操作の組み合わせとみなすことができる。発酵がバッチ過程として開始され、成長限基質が消費された場合、グルコース及びミネラルを含む連続供給培地が特定の様式で加えられる（流加）。言い換えれば、この操作では、バッチ培地及び供給培地の両方を用いて、細胞成長及び所望のタンパク質の効率的な産生を達成する。細胞が培養期間の間に加えられる、又は取り出されることはなく、従って、発酵槽は微生物が関与する限りバッチで作動する。本開示は、上で言及するものを含む様々な過程において利用することができる一方で、特定の利用は、流加過程と併用される。
【0058】
上の過程の各々において、細胞成長及び産物蓄積を、代謝産物形成ならびに、一部の他の変数、例えば培地ｐＨ、光学密度、色、及び滴定酸度などの間の相関を利用することにより間接的にモニターすることができる。例えば、光学密度によって、不溶性細胞粒子の蓄積の指標が提供され、ディスプレイデバイスもしくはレコーダーに接続されたマイクロＯＤユニットを使用して操作中に、又はサンプリングによるオフラインでモニターすることができる。６００ナノメートルでの光学密度の読取値（ＯＤ６００）を、乾燥細胞重量を決定する手段として使用する。
【0059】
高細胞密度発酵は、一般的に、最低＞３０ｇの細胞乾燥重量／リットル（ＯＤ６００＞６０）の収量で得られ、特定の実施形態では、＞４０ｇの細胞乾燥重量／リットル（ＯＤ６００＞８０）の収量で得られるそれら過程として記載される。全ての高細胞密度発酵過程では、「流加」過程において発酵槽中に段階的に計量される、濃縮された栄養培地が用いられる。濃縮された栄養供給培地は、供給の間に発酵槽内容物の希釈を最小化するために、高細胞密度過程のために利用される。流加過程が利用されるが、操作者が炭素源の供給を制御することを可能にするためであり、これは重要で、なぜなら、細胞が高細胞密度を生成するのに十分高い炭素源の濃度に曝露された場合に、細胞が阻害性副産物、酢酸イオンの非常に多くを産生し、その成長が停止するからである（Ｍａｊｅｗｓｋｉ ａｎｄ Ｄｏｍａｃｈ，“Ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ－ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｖｉｅｗ ｏｆ ａｃｅｔａｔｅ ｏｖｅｒｆｌｏｗ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １９９０ Ｍａｒ ２５；３５（７）：７３２－７３８）。
【0060】
酢酸及びその脱プロトン化イオンである酢酸イオンは一緒に、バイオリアクター中での細菌成長及び組換えタンパク質産生の主な阻害副産物の一つを表す。ｐＨ７では、酢酸が酢酸の最もよく見られる形態である。任意の過剰な炭素エネルギー源が、炭素エネルギー源の量が細菌の処理能力を大きく超える場合に酢酸に変換され得る。研究によって、トリカルボン酸回路及び／又は電子伝達系の飽和が、酢酸蓄積の最も可能性の高い原因であることが示されている。成長培地の選択は、酢酸阻害のレベルに影響を及ぼし得る；定義された培地中で成長した細胞は、複合培地中で成長した細胞よりも酢酸により影響を及ぼされ得る。グリセロールでのグルコースの置換によって、また、産生される酢酸の量が大きく減少し得る。グリセロールは、細胞中へのその輸送速度がグルコースの速度よりもずっと遅いため、グルコースよりも少ない酢酸を産生すると考えられる。しかし、グリセロールはグルコースよりも高価であり、細菌をより遅く成長させ得る。低下した成長温度の使用によって、また、炭素源取り込みのスピード及び成長速度が減少し、このように、酢酸の産生を減少させることができる。細菌は、過剰な炭素エネルギー源の存在において、又は急速な成長の間だけでなく、嫌気性条件下でも酢酸を産生する。細菌、例えば大腸菌などが速く成長しすぎる場合、それらは、バイオリアクターシステムの酸素送達能力を超えることがあり、嫌気性成長条件に導き得る。これを防止するために、より遅い一定の成長速度を、栄養制限を通して維持してもよい。酢酸蓄積を低下させるための他の方法は、酢酸産生を防止するための遺伝子改変、酢酸利用遺伝子の添加、及び低下した酢酸を伴う株の選択を含む。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、そのグリオキシル酸シャント経路において酢酸を使用するその能力のため、より低いレベルの酢酸を産生することが示されている株の一つである。
【0061】
様々な大型の流加発酵槽を、組換えタンパク質の産生のために利用可能である。より大きな発酵槽は、少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００～１００，０００リットルの容量（作業容量）を有し、ヘッドスペースに十分なスペースを残している。これらの発酵槽は、酸素及び栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分配するために、撹拌器インペラ又は他の適切な手段を使用する。小規模発酵は、一般的に、体積容量において約１００リットル以下、一部の特定の実施形態では約１０リットル以下である、発酵槽中での発酵を指す。
【0062】
組換えタンパク質を産生するために使用される発酵過程のための標準的な反応条件は、一般的に、微生物宿主細胞、例えば大腸菌などについて、約５．０～８．０のｐＨ及び２０～５０℃の範囲の培養温度の維持を含む。一実施形態では、宿主系として大腸菌を利用するが、発酵は、約７．０の最適ｐＨ及び約３０℃の最適培養温度で実施する。
【0063】
これら発酵過程における標準的な栄養素培地成分は、一般的に、エネルギーの供給源、炭素、窒素、リン、マグネシウム、ならびに微量の鉄及びカルシウムを含む。また、培地は、成長因子（例えばビタミン及びアミノ酸など）、無機塩、及び産物形成に必須の任意の他の前駆体を含み得る。培地は、輸送可能な有機リン酸、例えばグリセロリン酸など、例えば、アルファ－グリセロリン酸及び／又はベータ－グリセロリン酸、より具体的な例として、グリセロール－２－リン酸及び／又はグリセロール－３－リン酸を含み得る。培養されている宿主細胞の成分組成を使用して、細胞成長をサポートするために要求される各々の成分の割合を算出することができる。成分濃度は、処理が低細胞密度又は高細胞密度のいずれの処理であるかに依存して変動する。例えば、低細胞密度バッチ発酵処理におけるグルコース濃度は、１～５ｇ／Ｌの範囲である一方で、高細胞密度バッチ処理では、４５ｇ／Ｌ～７５ｇ／Ｌの範囲のグルコース濃度が使用される。また、成長培地は、中程度の濃度（例えば、０．１～５ｍＭ、又は０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、もしくは２ｍＭの範囲で）の保護的なオスモライト、例えばベタイン、ジメチルスルホニオプロピオン酸、及び／又はコリンなどを含み得る。
【0064】
一つ又は複数のインデューサーを成長培地中に導入して、目的の遺伝子産物の発現を誘導することができる。誘導は、指数関数的な増殖期、例えば、指数関数的な成長期の終わりに向かっているが、しかし、培養が最大細胞密度に達する前などの間に、又は発酵の間のより早期もしくは後期の時点に開始することができる。栄養素、例えばリン酸などの枯渇により誘導可能な一つ又は複数のプロモーターから目的の遺伝子産物を発現する場合、誘導は、その栄養素が成長培地から十分に枯渇した場合に、外因性インデューサーの添加を伴うことなく、生じる。
【0065】
宿主細胞の指数関数的な増殖の間に、代謝速度は、酸素及び炭素／エネルギー源の利用可能性に正比例する；このように、利用可能な酸素もしくは炭素／エネルギー源のレベル又はその両方を低下させることによって、代謝速度が低下する。発酵槽の動作パラメータ、例えば撹拌速度もしくは背圧の操作、又はＯ２圧力を低下させることによって、利用可能な酸素レベルが調節されて、宿主細胞の代謝速度を低下させることができる。炭素／エネルギー源の濃度もしくは送達速度又はその両方を低下させることは、同様の効果を有する。さらに、発現系の性質に依存して、発現の誘導は、宿主細胞代謝速度における減少に導き得る。最後に、最大細胞密度に達した際、成長速度は劇的に停止又は低下する。宿主細胞の代謝速度における低下は、タンパク質のフォールディング及びアセンブリの過程を含む、目的の遺伝子産物のより制御された発現をもたらすことができる。宿主細胞代謝速度は、細胞成長速度であって、特異的成長速度又は瞬時成長速度のいずれかを測定することにより（光学密度（ＯＤ）、例えばＯＤ６００などを測定することにより、及び／又は、場合により、ＯＤをバイオマスに変換することにより）評価することができる。各々のアッセイ点でのおよそのバイオマス（細胞乾燥重量）を算出する：およそのバイオマス（ｇ）＝（ＯＤ６００÷２）×体積（Ｌ）。望ましい成長速度は、特定の実施形態では、０．０１～０．７の範囲中に、又は０．０５～０．３の範囲中にあり、又は０．１～０．２の範囲中にあり、又はおよそ０．１５（０．１５プラス又はマイナス１０％）であり、又は０．１５である。
【0066】
発酵装置 以下は、宿主細胞を成長させるために使用することができる装置の例である；発酵システムの多数の他の構成が市販されている。宿主細胞は、２Ｘ Ｒｕｓｈｔｏｎインペラ及びＢｉｏＦｌｏ／ＣｅｌｌｉＧｅｎ １１５発酵槽／バイオリアクタコントローラを備えた１Ｌ容器サイズの、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＢｉｏＦｌｏ／ＣｅｌｌｉＧｅｎ １１５水ジャケット式発酵槽（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ社、ニューヨーク州ホーポージ）中で成長させることができる；温度、ｐＨ、及び溶存酸素（ＤＯ）がモニターされる。また、四つの６０～２５０ｍｌのＤＡＳｂｏｘ発酵容器を含む、４倍で構成可能なＤＡＳＧＩＰシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ社、ニューヨーク州ホーポージ）中で宿主細胞を成長させることも可能であり、各々の容器には２Ｘ Ｒｕｓｈｔｏｎインペラ、ＤＡＳｂｏｘ排気コンデンサ、及びＤＡＳｂｏｘ供給・モニターモジュール（温度センサ、ｐＨ／酸化還元センサ、及び溶存酸素センサを含む）が含まれる。適切な発酵装置はまた、ＮＬＦ ２２ ３０Ｌ実験室発酵槽（Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州サマービル）を含み、ステンレス鋼容器中に３０－Ｌ容量及び２０－Ｌ最大作業容量、二つのＲｕｓｈｔｏｎインペラ、空気のみでのスパージ、ならびにｐＨ、ＤＯ、排気Ｏ２、排気ＣＯ２、温度、及び圧力を含むすべての関連パラメータの追跡及び制御を可能にするＢｉｏＳＣＡＤＡソフトウェアを実行する制御システムを伴う。
【0067】
インテイン融合ポリペプチド及び標的ポリペプチドの精製。６ｘＨｉｓタグを含むポリペプチドは、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製することができ、例えば、ニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）カラムの使用によって、他の分子が流れている間に目的の６ｘＨｉｓタグ付きポリペプチドを特異的に保持する。ＩＭＡＣでは、ヒスチジン残基と二価金属イオンの間での相互作用を利用し、最も一般的には、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、及びＺｎ２＋を含む他の金属イオンも、Ｈｉｓ残基についての親和性を有することが示されている。金属イオンは、典型的には、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）及びより一般的に使用されるニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を含む、様々な金属キレーターシステムを介してマトリクス上に固定化される。幅広いマトリックスが市販されており、例えばニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）、Ｎｉセファロース、及び銅－カルボキシルメチルアスパラギン酸（ＣＯ－ＣＭＡ）などである。カラムは、緩衝液、例えば５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３Ｍ 尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０などで平衡化することができる。６ｘＨＩｓタグ付きポリペプチドの結合後、低濃度のイミダゾール（０ｍＭ、又は１０～５０ｍＭ）を含む緩衝液、又は結合緩衝液のｐＨよりも高い、又は低いｐＨを伴う緩衝液を用いた洗浄工程を含めて、サンプル装填の間にカラムに弱く結合した非特異的タンパク質を除去することができる。例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１０の洗浄緩衝液を使用することができる。６ｘＨｉｓタグ付きポリペプチドは、少なくとも１００ｍＭのイミダゾール、又は２５０～５００ｍＭのイミダゾール、又は５００ｍＭのイミダゾールの濃度でイミダゾールを含む緩衝液を使用して、マトリックスから溶出することができる。また、緩衝液ｐＨを下げることにより、及び／又は溶出緩衝液中にキレート剤、例えばＥＤＴＡなどを（５０～２００ｍＭ、又は１００ｍＭの濃度で）含むことにより、目的のポリペプチドを溶出するが可能である。例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ１０の溶出緩衝液を使用することができる。ポリヒスチジンタグを含む遺伝子産物の精製方法が、Ｂｏｒｎｈｏｒｓｔ ａｎｄ Ｆａｌｋｅ，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２０００；３２６：２４５－２５４においてさらに記載されており、それは参照により本明細書中に組み込まれる。可溶性複合体からのＩＭＡＣによる６ｘＨｉｓタグ付きＣＰＢｐｒｏプロインスリンタンパク質の精製において、Ｎｉ－ＮＴＡ ＳｕｐｅｒＦｌｏｗ（ＱＩＡｇｅｎ、メリーランド州ジャーマンタウン）又はＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）のいずれかを使用して、この方法によって、９０％超の純度までのプロインスリン遺伝子産物の精製が可能になった。
【0068】
６ｘＨｉｓタグを欠くサンプルについて、又はそのようなタグの使用が必要ではない手順については、カチオン又はアニオン交換クロマトグラフィー、例えばＤＥＡＥ樹脂、及び／又は逆相もしくは高速液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ又はＨＰＬＣ）の使用などを用いて、目的のポリペプチドを他の汚染物質から、又は化学処理もしくは酵素処理の望ましくない産物からさらに分離することができる。
【実施例】
【0069】
実施例１
天然Ｎ末端を伴うＴＲＡＳＴ－Ｆａｂを産生するためのインテインポリペプチドの使用。
Ａ．宿主細胞中でのインテイン－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体の発現。
トラスツズマブは、商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）とも言及され、ＥＲＢＢ２とも呼ばれる、ＨＥＲ２抗原を認識する全長ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂは、トラスツズマブの抗原結合フラグメントである；ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ重鎖（「ＨＣ」）及びＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ軽鎖（「ＬＣ」）のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２２及び２３において提示する。ＴＲＡＳＴ Ｆａｂヘテロ二量体内で、重鎖及び軽鎖は、分子間ジスルフィド結合（鎖の各々の内での分子内ジスルフィド結合に加えて）により結合される。
天然Ｎ末端を伴うＴＲＡＳＴ－Ｆａｂを産生するためのインテインポリペプチドの使用。
Ａ．宿主細胞中でのインテイン－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体の発現。
トラスツズマブは、商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）とも言及され、ＥＲＢＢ２とも呼ばれる、ＨＥＲ２抗原を認識する全長ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂは、トラスツズマブの抗原結合フラグメントである；ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ重鎖（「ＨＣ」）及びＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ軽鎖（「ＬＣ」）のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２２及び２３において提示する。ＴＲＡＳＴ Ｆａｂヘテロ二量体内で、重鎖及び軽鎖は、分子間ジスルフィド結合（鎖の各々の内での分子内ジスルフィド結合に加えて）により結合される。
【0070】
発現構築物を作製し、それにおいて、ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ重鎖及びＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ軽鎖（それぞれ配列番号２２及び２３）をコードするＤＮＡ配列の各々が、それらの５’末端で、インテインをコードするＤＮＡ配列を有し、各々の種類の発現構築物についてのインテインアミノ酸配列が、表１中に記載する配列番号１～６の一つである。インテイン－ＴＲＡＳＴ－ＦａｂをコードするＤＮＡ配列を、インテイン－ＴＲＡＳＴ－ＬＣをコードする配列の上流に配置された、インテイン－ＴＲＡＳＴ－ＨＣをコードする配列とバイシストロン性の配置において、Ｌ－アラビノース誘導性プロモーター（ＰａｒａＢＡＤ又は「ａｒａプロモーター」）の下流の二重プロモーターベクター中にクローニングした。
【0071】
単一の発現ベクターから大腸菌中で発現させるために、各々がそのＮ末端にインテインを含む二つのポリペプチドがあったため、各々のインテインをコードする 二つの異なる ＤＮＡ 配列を調製したが－インテインコード配列＃１及びインテインコード配列＃２－、それらは大腸菌についての最適化されたコドン使用を有し、それらの間の組換え事象の可能性を低下させるのに十分なほど異なっていた。配列番号１～９を有するインテインの各々についての二つのインテインコード配列を表１中に列挙しており、配列番号２４～４１を有する。
【0072】
発現構築物をまた、ＤｎａＸ（ｓｐｌｉｔ＿Ｃ）－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ及びＤｎａＢ（ｓｐｌｉｔ＿Ｃ）－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂの発現のために、それぞれＤｎａＸ（ｓｐｌｉｔ＿Ｎ）又はＤｎａＢ（ｓｐｌｉｔ＿Ｎ）の存在において同様の方法で作製された。分割インテインの６ｘＨｉｓタグ付きＣ末端部分をコードするＤＮＡ配列（ＤｎａＸ（ｓｐｌｉｔ＿Ｃ）については配列番号１２及びＤｎａＢ（ｓｐｌｉｔ＿Ｃ）については配列番号１５）を、ａｒａプロモーターの下流のバイシストロン性の配置において、ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ ＨＣ及びＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ ＬＣをコードする配列の各々の上流に配置した。これらの構築物は、プロピオン酸誘導性ＰｐｒｐＢＣＤＥ又は「ｐｒｐプロモーター」も含む二重プロモーター発現構築物であり、ｐｒｐプロモーターを使用して、分割インテインのＮ末端部分（ＤｎａＸ（ｓｐｌｉｔ＿Ｎ）についての配列番号１０及びＤｎａＢ（ｓｐｌｉｔ＿Ｎ）についての配列番号１３）を発現させた。インタクトなインテインと同じ様式において、表１中に示すように、二つの異なるＤＮＡ配列を使用して、各々の発現構築物中に存在する分割インテインの二つのＣ末端部分をコードさせた。
【0073】
大腸菌５２１細胞を、インテイン－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体を発現する異なる発現ベクターで形質転換させ、各々が、表１中に記載する配列番号１～５のアミノ酸配列の一つを有するインテインを含む。発現ベクターを用いた形質転換に続いて、宿主細胞サンプルを、カナマイシンを含む固体培地上に播種し、カナマイシン耐性のための遺伝子を保有する発現ベクターを含む、成功した形質転換体について選択した。宿主細胞を培養し、インテイン－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂの発現をＬ－アラビノースで誘導した。
【0074】
ＤｎａＸ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ、ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ、Ｄ．ｔ．ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ、ｇｐ４１－１－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ、及びＮ．ｐ．ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂをそれぞれ発現する発現ベクターを伴う宿主細胞を、誘導後に採取して、ｐＨ ７．４で溶解させた。 ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂを発現する宿主細胞の二通りのサンプルを、ｐＨ６．４で、及びｐＨ８．０で溶解させた。全ての三つのｐＨ条件下での溶解によって、同等の結果がもたらされた。宿主細胞ライセートを遠心分離に供し、可溶性画分を各々のサンプルから収集し、各々のペレットを再懸濁した。可溶性画分（「Ｓ」）及び再懸濁ペレット（「Ｐ」）を、非還元条件下及び、また、還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲル中のタンパク質を次に、膜に移し、ヒトＩｇＧに結合する一次抗体と接触させ、二次抗体を使用して検出した。結果として得られたウェスタンブロットを図 １Ａ及び１Ｂ中に示す。異なるインテイン－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂサンプルの各々について、インテインが、ウェスタンブロット上で検出されたＴＲＡＳＴ－Ｆａｂポリペプチド種の大多数から切除されていることを見ることができる。
【0075】
大腸菌５２１細胞を、また、ＤｎａＸ（ｓｐｌｉｔ＿Ｃ）－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ／ＤｎａＸ（ｓｐｌｉｔ＿Ｎ）及びＤｎａＢ（ｓｐｌｉｔ＿Ｃ）－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ／ＤｎａＢ（ｓｐｌｉｔ＿Ｎ）をコードする発現構築物で形質転換させて；宿主細胞を、カナマイシンを含む培地中で成長させ、インテイン（ｓｐｌｉｔ＿Ｃ）－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂポリペプチドの発現をＬアラビノースで誘導させ、インテイン（ｓｐｌｉｔ＿Ｎ）の発現をプロピオン酸で誘導させた。誘導された宿主細胞を採取し、溶解し、ライセートをポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。インテイン（ｓｐｌｉｔ＿Ｃ）－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂポリペプチド及びインテイン（ｓｐｌｉｔ＿Ｎ）ポリペプチドの同時発現によって、ＴＲＡＳＴ－ＦａｂポリペプチドのＮ末端からのインテイン（ｓｐｌｉｔ＿Ｃ）が切断をもたらした。
【0076】
Ｂ．インテイン－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体のＬＣ－ＭＳ分析。
【0077】
ＤｎａＸ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ、ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ、Ｄ．ｔ．ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ、及びｇｐ４１－１－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂを発現する発現ベクターを含む大腸菌５２１宿主細胞を、２４ウェルプレート中で、バイシストロン性配置においてａｒａプロモーターの下流のコード配列からコントロールＭｅｔ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体を発現し、この構築物中のＭｅｔ－ＴＲＡＳＴ－ＬＣをコードする配列が、Ｍｅｔ－ＴＲＡＳＴ－ＨＣをコードする配列の上流に配置されている大腸菌５２１宿主細胞と共に培養した。 コントロールＭｅｔ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ及びインテイン－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂの発現を、５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシン及び様々な濃度、０．００１３ｍＭ、０．００６７ｍＭ、０．０３３３ｍＭ、０．１６６７ｍＭ、０．８３３３ｍＭ、及び４．１６６７ｍＭのＬ－アラビノースを含む成長培地中で誘導された。Ｍｅｔ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ及びインテイン－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂの発現を１６時間にわたり誘導させて、次に三つのサンプルを各々のウェルから収集した。
【0078】
Ｍｅｔ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂサンプル及びインテイン－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂサンプルを、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤、ベンゾナーゼ、及びリゾザイムを含む）中で溶解させ、次にプロテインＬ親和性捕捉により精製した。液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）分析を、２８～３８％溶媒Ｂ（アセトニトリル中の０．０８５％ ＴＦＡ）の勾配溶出により７０℃の一定温度でサンプルをＺＯＲＢＡＸ ＲＲＨＤ ３００Å ＳｔａｂｌｅＢｏｎｄジフェニルＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）に通すことにより実施した。カラムからの溶出を、２１４ｎｍ及び２８０ｎｍでのＵＶにより、及び５６００四重極飛行時間型（ＱＴＯＦ）質量分析計（ＳＣＩＥＸ、マサチューセッツ州フラミンガム）での６００～３０００ｍ／ｚからのＭＳ１スキャンにより検出した。天然Ｎ末端アミノ酸を有するＴＲＡＳＴ－Ｆａｂポリペプチドに関する質量／電荷（ｍ／ｚ）範囲を、データ取り込み後のイオン抽出のために選択し、インテイン－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂポリペプチドのインテイン介在性切断による天然Ｎ末端の生成を評価した。
【0079】
ＬＣ－ＭＳ分析の結果を図２及び３中に提供する。図２は、還元条件下で分析されたサンプルの結果を示し、パネル２Ｂ及び２Ｃは、それぞれ軽鎖及び重鎖の天然Ｎ末端に対応するピークの強度を示している。図２Ａ～２Ｃから見ることができるように、コントロールＭｅｔ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂは、天然Ｎ末端を伴う（即ち、Ｎ末端のＭｅｔ残基を伴わない）非常に少量の軽鎖又は重鎖を産生したが、しかし、ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ及びｇｐ４１－１－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂは、天然Ｎ末端を伴う有意な量のＴＲＡＳＴ－Ｆａｂポリペプチドを産生した。図３のパネルＢでは、非還元条件において分析され、天然Ｎ末端を伴うＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体の量を、Ｍｅｔ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂコントロール、ＤｎａＸ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ、ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ、及びＤ．ｔ．ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂの間で比較する。これらのクロマトグラフィーでは、天然Ｎ末端（ピーク強度約１００）を生成するためのＭｅｔ－ＴＲＡＳＴ－ＦａｂコントロールからのＭｅｔ残基の除去により産生されたピークを見ることが可能であるが、インテイン含有構築物の各々により産生された天然Ｎ末端ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂの量はずっと高かった（ピーク強度１０００～２０００）。
【0080】
実施例２
高性能インテイン－融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
表１中に列挙し、上の実施例１Ａにおいて記載するように、同じインテインアミノ酸配列をコードする二つの異なるポリヌクレオチドを、表１中に列挙するインテインポリペプチドの多くについて調製した。これらのインテインコード配列を、大腸菌中での改善された発現のためにコドン最適化させた。実験を、ＤｎａＢ－融合ポリペプチドのＤｎａＢ（配列番号２）アミノ酸配列部分をコードするポリヌクレオチドを同定するために実施したが、それは、大腸菌宿主細胞中での高レベルの目的の活性タンパク質の発現において有用であった。発現ベクターのライブラリーを構築して、それにおいて、目的のタンパク質の二つのポリペプチド鎖を、ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ ＨＣ及びＬＣについて実施例１Ａに記載するのと同じ様式でバイシストロン性配置において発現させた；各々のポリペプチド鎖を、融合ポリペプチドのＮ末端でＤｎａＢを伴うＤｎａＢ融合ポリペプチドとして発現させた。各々の融合ポリペプチドのＤｎａＢ部分は、配列番号２６及び２７に関して実施例１Ａに記載するように、異なるポリヌクレオチド配列によりコードされた。ライブラリー中の発現ベクターのサブセットは、配列番号２６及び２７のＤｎａＢコードポリヌクレオチド内のいくつかの位置で、それらの配列のヌクレオチド位置９と３０の間で変動して、各々のＤｎａＢコード配列の三番目から十番目のコドンにおいて多くの異なるサイレント変化を産生した。
高性能インテイン－融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
表１中に列挙し、上の実施例１Ａにおいて記載するように、同じインテインアミノ酸配列をコードする二つの異なるポリヌクレオチドを、表１中に列挙するインテインポリペプチドの多くについて調製した。これらのインテインコード配列を、大腸菌中での改善された発現のためにコドン最適化させた。実験を、ＤｎａＢ－融合ポリペプチドのＤｎａＢ（配列番号２）アミノ酸配列部分をコードするポリヌクレオチドを同定するために実施したが、それは、大腸菌宿主細胞中での高レベルの目的の活性タンパク質の発現において有用であった。発現ベクターのライブラリーを構築して、それにおいて、目的のタンパク質の二つのポリペプチド鎖を、ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ ＨＣ及びＬＣについて実施例１Ａに記載するのと同じ様式でバイシストロン性配置において発現させた；各々のポリペプチド鎖を、融合ポリペプチドのＮ末端でＤｎａＢを伴うＤｎａＢ融合ポリペプチドとして発現させた。各々の融合ポリペプチドのＤｎａＢ部分は、配列番号２６及び２７に関して実施例１Ａに記載するように、異なるポリヌクレオチド配列によりコードされた。ライブラリー中の発現ベクターのサブセットは、配列番号２６及び２７のＤｎａＢコードポリヌクレオチド内のいくつかの位置で、それらの配列のヌクレオチド位置９と３０の間で変動して、各々のＤｎａＢコード配列の三番目から十番目のコドンにおいて多くの異なるサイレント変化を産生した。
【0081】
ＤｎａＢ－融合ポリペプチドをコードする発現ベクターライブラリーを大腸菌宿主細胞中に形質転換し、宿主細胞を培養し、ＤｎａＢ－融合ポリペプチドの発現をＬ－アラビノースで誘導した。宿主細胞を、ＤｎａＢ－融合ポリペプチドから形成された、目的の活性タンパク質の発現レベルについて評価し、高発現宿主細胞の亜群を選択した。高発現宿主細胞の亜集団中に存在する発現ベクターを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により配列決定し、高発現宿主細胞の亜集団内に存在する異なるＤｎａＢコードポリヌクレオチドの相対比率を決定した。発現ベクター内の二つのＤｎａＢコード位置の各々で、最大の程度まで濃縮されたポリヌクレオチド配列は、宿主細胞の開始集団を高発現宿主細胞亜集団と比較した場合、配列番号２６及び２７のＤｎａＢコード配列であった。この結果は、配列番号２６及び２７のコドン最適化されたＤｎａＢコード配列が、選択された宿主細胞の高発現特性との最も高い平均レベルの相関を有したことを示す。各々のＤｎａＢコード配列の第三から第十のコドンにおけるサイレントコード配列の変化のいずれも、宿主細胞の集団にわたり高レベルの目的の活性タンパク質の発現を選択する場合、配列番号２６及び２７よりも大きな程度まで濃縮されたＤｎａＢコード配列をもたらさなかった。
【0082】
さらなる実験を、上に記載するように、各々のＤｎａＢコード配列の第三から第十のコドンにおけるサイレントコード配列変化を伴うＤｎａＢ融合ポリペプチドをコードする発現ベクターライブラリーを使用して実施した。この実験では、目的の活性タンパク質の高レベルの発現を証明する宿主細胞を選択し、宿主細胞の選択のさらなるラウンドを、産生された目的のタンパク質での特異的活性アッセイ、及び産生された目的の構造的に正確なタンパク質の量のアッセイ、例えば固相抽出質量分析法（ＳＰＥ－ＭＳ）アッセイなどを使用して実施した。これらの基準に基づいて、高性能宿主細胞を選択して、それらが含んでいる発現ベクターを配列決定した。配列番号２６及び２７を含む元の発現ベクターと比較した場合に目的の活性タンパク質の発現において改善を示す四つの追加のＤｎａＢコード配列をこのようにして同定した；四つのＤｎａＢコード配列は全て配列番号２７のバリエーションであり、配列番号６１～６４として提示する。
【0083】
実施例３
ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の類似性の決定。
ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性のパーセントは、二つの配列のアライメント中の記号の総数により割った、両方の整列された配列中で同一である整列された記号（例、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数として定義する。二つの配列間の類似性（同一性のパーセント）の程度を、ウェブサイトｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを通じて入手可能なＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌにおいて国立生物工学情報センター （ＮＣＢＩ）により実行された、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０） のグローバルアラインメント方法を使用して配列を整列させることにより決定してもよい。一つの実施形態では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアライメントパラメーターをデフォルト値（それぞれマッチ／ミスマッチスコア２及び－３、ならびに、それぞれ存在及び延長についてのギャップコスト５及び２）に設定する。当業者により使用される配列比較の他のプログラムをまた、配列を整列させるために使用してもよく、例えば、デフォルトパラメータ設定を使用して、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉウェブサイトでＮＣＢＩにより実行される、ベーシックローカルアライメント検索ツール又はＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，”Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９０ Ｏｃｔ ５；２１５（３）：４０３－４１０）などである。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは複数のオプションパラメータを有し、以下のように使用され得る二つのパラメータを含む：（Ａ）低い組成の複雑度を有するクエリー配列のセグメント、又は短い周期性の内部リピートからなるセグメントをマスクするためのフィルターの含有、これは、利用されていない、又はオフに設定されることが好ましい、及び（Ｂ）データベース配列に対する一致を報告するための統計的に有意な閾値、「Ｅｘｐｅｃｔ」又はＥスコアと呼ばれる（単に偶然に見出される一致の予想確率；一致に起因する統計的有意性がこのＥスコア閾値よりも大きい場合、一致は報告されない）。この「Ｅｘｐｅｃｔ」又はＥスコア値がデフォルト値（１０）から調整される場合、好ましい閾値は０．５である、又は増加する優先度の順序で、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、０．００００１、及び０．０００００１である。
ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の類似性の決定。
ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性のパーセントは、二つの配列のアライメント中の記号の総数により割った、両方の整列された配列中で同一である整列された記号（例、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数として定義する。二つの配列間の類似性（同一性のパーセント）の程度を、ウェブサイトｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを通じて入手可能なＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌにおいて国立生物工学情報センター （ＮＣＢＩ）により実行された、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０） のグローバルアラインメント方法を使用して配列を整列させることにより決定してもよい。一つの実施形態では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアライメントパラメーターをデフォルト値（それぞれマッチ／ミスマッチスコア２及び－３、ならびに、それぞれ存在及び延長についてのギャップコスト５及び２）に設定する。当業者により使用される配列比較の他のプログラムをまた、配列を整列させるために使用してもよく、例えば、デフォルトパラメータ設定を使用して、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉウェブサイトでＮＣＢＩにより実行される、ベーシックローカルアライメント検索ツール又はＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，”Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９０ Ｏｃｔ ５；２１５（３）：４０３－４１０）などである。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは複数のオプションパラメータを有し、以下のように使用され得る二つのパラメータを含む：（Ａ）低い組成の複雑度を有するクエリー配列のセグメント、又は短い周期性の内部リピートからなるセグメントをマスクするためのフィルターの含有、これは、利用されていない、又はオフに設定されることが好ましい、及び（Ｂ）データベース配列に対する一致を報告するための統計的に有意な閾値、「Ｅｘｐｅｃｔ」又はＥスコアと呼ばれる（単に偶然に見出される一致の予想確率；一致に起因する統計的有意性がこのＥスコア閾値よりも大きい場合、一致は報告されない）。この「Ｅｘｐｅｃｔ」又はＥスコア値がデフォルト値（１０）から調整される場合、好ましい閾値は０．５である、又は増加する優先度の順序で、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、０．００００１、及び０．０００００１である。
【0084】
本発明を実践する際、分子生物学、微生物学、及び組み換えＤＮＡ技術における多くの従来技術が、場合により使用される。そのような従来技術は、ベクター、宿主細胞、及び組み換え方法に関する。これら技術は周知であり、例えば、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｍｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００６年を通して補足）において説明されている。例えば、細胞の単離及び培養のための、ならびにその後の核酸又はタンパク質の単離のための他の有用な参考文献は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ （１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びそこで引用される文献；Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ （Ｅｄｓ．） （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－ Ｖｅｒｌａｇ （Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ａｎｄ Ａｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ （Ｅｄｓ．） Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ （１９９３） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．を含む。核酸を操作及び作製する際に有用な、核酸を作製する方法（例えば、インビトロ増幅、細胞からの精製、又は化学合成による）、核酸を操作する方法（例えば、部位特異的変異誘発、制限酵素での消化、ライゲーションなどによる）、ならびに様々なベクター、細胞株、などが、上記の参考文献において記載されている。また、本質的に任意のポリヌクレオチド（標識された、又はビオチン化されたポリヌクレオチドを含む）は、様々な商業的な供給源のいずれかから注文されたカスタム又は標準であってもよい。
【0085】
本発明は、本発明の実践のための特定の様式を含むことが見出された、又は提案された特定の実施形態に関して記載されている。本開示に照らして、多数の改変及び変更を、本発明の意図する範囲から逸脱することなく、例示する特定の実施形態において行うことができることが、当業者により理解されるであろう。任意の実施形態又は実施形態の特色は、互いに組み合わせることができ、そのような組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に包含される。
【0086】
引用する全ての参考文献が、特許刊行物を含め、それらの全体が参照により本明細書中に組み込まれる。ヌクレオチド及び他の遺伝子配列は、公開されたゲノム位置又は他の記載によって言及され、また、参照により本明細書中に明示的に組み込まれる。
【0087】
配列リスト
本明細書中又は添付の配列リスト中に列挙される任意の核酸配列及びアミノ酸配列を、米国特許規則連邦規則法典第３７巻（３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．）セクション１．８２２で定義されている、ヌクレオチド塩基及びアミノ酸についての標準的な略語を使用して示す。少なくとも一部の場合において、各々の核酸配列の一つの鎖のみを示しているが、しかし、相補鎖は、呈示する鎖への任意の参照により含まれるとして理解される。
本明細書中又は添付の配列リスト中に列挙される任意の核酸配列及びアミノ酸配列を、米国特許規則連邦規則法典第３７巻（３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．）セクション１．８２２で定義されている、ヌクレオチド塩基及びアミノ酸についての標準的な略語を使用して示す。少なくとも一部の場合において、各々の核酸配列の一つの鎖のみを示しているが、しかし、相補鎖は、呈示する鎖への任意の参照により含まれるとして理解される。
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【表3-6】
【表3-7】
【表3-8】
【表3-9】
【表3-10】
【表3-11】
【表3-12】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【配列表】
【国際調査報告】