特表 2023-522108 広域反応性コロナウイルスワクチンのエンジニアリング並びに関連する設計及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-26

(54)【発明の名称】広域反応性コロナウイルスワクチンのエンジニアリング並びに関連する設計及び使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/86 20060101AFI20230519BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20230519BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20230519BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230519BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20230519BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20230519BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20230519BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230519BHJP

【ＦＩ】

C12N15/86 Z ZNA

C12N15/50

C12N15/861 Z

C12N7/01

C12N15/10 200Z

A61K39/215

A61K35/761

A61P31/14

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022563395

(86)(22)【出願日】2021-04-20

(85)【翻訳文提出日】2022-12-16

(86)【国際出願番号】 US2021028187

(87)【国際公開番号】W WO2021216569

(87)【国際公開日】2021-10-28

(31)【優先権主張番号】63/012,360

(32)【優先日】2020-04-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522382691

【氏名又は名称】グレフェックス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】シュテルツ， ウーベ ディー．

(72)【発明者】

【氏名】プレストン， ダニエル エフ．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA45

4C085AA03

4C085BA71

4C085CC08

4C085DD62

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB33

(57)【要約】

β－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンは、β－ＣｏＶのＳタンパク質をコードするβ－ＣｏＶ ＤＮＡ配列を含む少なくとも１つのウイルスベクターを含む。β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列は、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列であり得る。ワクチンは、アデノウイルスに基づくパッケージングプラスミドをさらに含み得る。ウイルスベクター及びパッケージングプラスミドは、パッケージング細胞に含まれ、カプシドにカプシド形成され得る。少なくとも１つのβ－ＣｏＶの群からの感染に対して哺乳動物の対象にワクチン接種する方法は、広範なβ－ＣｏＶの群を、それらのＳタンパク質をコードするβ－ＣｏＶ ＲＮＡ配列における類似性に基づいたホモロジー群に分類することと、ホモロジー群の他のすべてのメンバーに対して６０％を超える配列同一性を有する各ホモロジー群について少なくとも１つのコンセンサス配列を同定することと、少なくとも１つのホモロジー群からのコンセンサス配列の少なくとも一部を含むウイルスベクターを調製することと、を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

β－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンであって、
β－ＣｏＶのＳタンパク質をコードするβ－ＣｏＶ ＤＮＡ配列を含む少なくとも１つのウイルスベクターを含む、ワクチン。

【請求項2】

ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項１に記載のワクチン。

【請求項3】

ベクターが、すべての内因性遺伝子を含まない完全欠失アデノウイルスベクターである、請求項２に記載のワクチン。

【請求項4】

β－ＣｏＶＤＮＡ配列が、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列である、請求項１～３のいずれかに記載のワクチン。

【請求項5】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列が、Ｓタンパク質をコードする配列全体である、請求項４に記載のワクチン。

【請求項6】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列が、Ｓタンパク質をコードする部分配列である、請求項４に記載のワクチン。

【請求項7】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列が、受容体結合ドメインが除去されたＳタンパク質をコードする部分配列である、請求項４に記載のワクチン。

【請求項8】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列が、受容体結合ドメイン配列がペプチドリンカーをコードするＤＮＡによって置き換えられている、Ｓタンパク質をコードする部分配列である、請求項４に記載のワクチン。

【請求項9】

Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６及びＡｄ３５の血清型並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるアデノウイルスに基づくパッケージングプラスミドをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項10】

少なくとも１つのウイルスベクターが、パッケージング細胞に含まれる、請求項１～９のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項11】

パッケージング細胞が、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６及びＡｄ３５の血清型並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるカプシドにカプシド形成される、請求項１０に記載のワクチン。

【請求項12】

β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列が、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列であり、ウイルスベクターが、ＳＡＲＳｒウイルス由来の少なくとも第２のβ－ＣｏＶ ＤＮＡ配列を含み、第２のβ－ＣｏＶ ＤＮＡ配列が、ＳＡＲＳｒウイルスのＳタンパク質をコードする、請求項１～１１のいずれかに記載のワクチン。

【請求項13】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶのＳタンパク質をコードするＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列を含む少なくとも１つのウイルスベクターと、
Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６及びＡｄ３６の血清型並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるアデノウイルスに基づく少なくとも１つのパッキングプラスミドと、
を含む、ＳＡＲＳ－２感染を予防するためのワクチンであって、
少なくとも１つのウイルスベクター及び少なくとも１つのパッキングプラスミドが、パッケージング細胞に含有され、
パッケージング細胞が、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６及びＡｄ３５の血清型並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるカプシドにカプシド形成される、ワクチン。

【請求項14】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列が、ＳＡＲＳ－２ウイルスの部分Ｓタンパク質をコードする、請求項１３に記載のワクチン。

【請求項15】

β－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンであって、
β－ＣｏＶのＳタンパク質をコードする少なくとも１つのβ－ＣｏＶ ＲＮＡ配列を含む、ワクチン。

【請求項16】

ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項１８に記載のワクチン。

【請求項17】

β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列が、ＳＡＲＳ－２β－ＲＮＡ配列である、請求項１５～１６のいずれかに記載のワクチン。

【請求項18】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列が、Ｓタンパク質をコードする配列全体である、請求項１５～１７のいずれかに記載のワクチン。

【請求項19】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列が、Ｓタンパク質をコードする部分配列である、請求項１５～１６のいずれかに記載のワクチン。

【請求項20】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列が、受容体結合ドメインが除去されているＳタンパク質をコードする部分配列である、請求項１９に記載のワクチン。

【請求項21】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列が、受容体結合ドメイン配列がペプチドリンカーをコードするＲＮＡによって置き換えられている、Ｓタンパク質をコードする部分配列である、請求項１９に記載のワクチン。

【請求項22】

β－ＣｏＶ ＲＮＡの遺伝子情報を送達する発現ベクターをさらに含む、請求項１５～２１のいずれかに記載のワクチン。

【請求項23】

発現ベクターが、エンジニアリングされたウイルスベクターである、請求項１８のいずれかに記載のワクチン。

【請求項24】

β－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンであって、
β－ＣｏＶのＳタンパク質をコードする少なくとも１つのβ－ＣｏＶタンパク質配列を含む、ワクチン。

【請求項25】

β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列が、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶタンパク質配列である、請求項２４のいずれかに記載のワクチン。

【請求項26】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶタンパク質配列が、Ｓタンパク質をコードする配列全体である、請求項２４～２５のいずれかに記載のワクチン。

【請求項27】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶタンパク質配列が、Ｓタンパク質をコードする部分配列である、請求項２４～２５のいずれかに記載のワクチン。

【請求項28】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶタンパク質配列が、受容体結合ドメインが除去されている部分Ｓタンパク質配列である、請求項２７に記載のワクチン。

【請求項29】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶタンパク質配列が、部分Ｓタンパク質配列であり、受容体結合ドメイン配列がペプチドリンカーによって置き換えられている、請求項２７に記載のワクチン。

【請求項30】

少なくとも１つのβ－ＣｏＶの群からの感染に対して哺乳動物の対象にワクチン接種する方法であって、
広範なβ－ＣｏＶの群を、それらのＳタンパク質をコードするβ－ＣｏＶ ＲＮＡ配列における類似性に基づいたホモロジー群に分類することと、
ホモロジー群の他のすべてのメンバーに対して６０％を超える配列同一性を有する各ホモロジー群について少なくとも１つのコンセンサス配列を同定することと、
少なくとも１つのホモロジー群からのコンセンサス配列の少なくとも一部を含むウイルスベクターを調製することと、
を含む、方法。

【請求項31】

コンセンサス配列が、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質配列及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

ウイルスベクターの調製が、２つ以上のホモロジー群からのコンセンサス配列の少なくとも一部を含むことを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

ワクチンを哺乳動物の対象に注射することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項34】

少なくとも１つのβ－ＣｏＶの群からの感染に対して哺乳動物の対象にワクチン接種する方法であって、
広範なβ－ＣｏＶの群を、それらのＳタンパク質をコードするβ－ＣｏＶのＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質配列における類似性に基づいたホモロジー群に分類することと、
ホモロジー群の他のすべてのメンバーに対して６０％を超える配列同一性を有する各ホモロジー群についてβ－ＣｏＶタンパク質配列の少なくとも一部を同定することと、
少なくとも１つのホモロジー群からのβ－ＣｏＶタンパク質配列の少なくとも一部を含むＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質ワクチンを調製することと、
を含む、方法。

【請求項35】

ワクチンを哺乳動物の対象に注射することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月２０日に出願された仮出願第６３／０１２，３６０号の優先権を主張するものであり、仮出願ではない。本出願は、その全内容が本明細書に参照により援用される。

【0002】

本開示は、コロナウイルスのワクチン、より詳細にはβ－コロナウイルスからの感染から哺乳動物を防御するためのワクチンを開発するためのワクチンプラットフォームに関する。別の実施形態では、本開示は、同定された群の遺伝子配列を使用して、コロナウイルスのワクチンを開発するための方法に関する。

【0003】

配列表の提出
２０２１年４月２０日に作成され、サイズが５４である、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ」という名称のテキストファイルＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇの電子提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

コロナウイルス（ＣｏＶ）は、アルファ－、ベータ－、ガンマ－及びデルタ－コロナウイルスの４つの属に分類される。β－ＣｏＶは、哺乳動物、一般にはコウモリ及びげっ歯類に感染することができるエンベロープ型のプラス鎖ＲＮＡウイルスであるが、多くのβ－ＣｏＶは同様にヒトに感染することが知られている。ヒト及び動物におけるＣｏＶによる感染は、一般に、短期間の軽度から中等度の上気道疾患を引き起こす。例外は、重症でしばしば致死的な症候を特徴とする重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－１）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、及び武漢を起源とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＡＲＳ－２）（ＣＯＶＩＤ－１９とも呼ばれる）である。ＳＡＲＳ－２感染の最初の症例は２０１９年１２月に見られた。２０２０年４月１６日現在、米国だけで、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によって報告された推定６３２，０００例の症例及び推定３１，０００例の死亡があり、４．９％の致死率をもたらした。ＳＡＲＳ－２はヒトに対して感染性が高い。世界保健機関（ＷＨＯ）は、２０２０年１月３０日に、世界規模のＳＡＲＳ－２パンデミックを国際的な医療緊急事態と宣言した。

【0005】

ＳＡＲＳ－２のための具体的な治療は得られていないが、調査中である。疾患のさらなる伝播を防ぐための最良の手法は、特定のワクチンの開発である。ＳＡＲＳ－２に対する集団免疫は、活性型ＳＡＲＳ－２ウイルスによる自然感染ではなく、良性ワクチンによる免疫でより良好に達成される。回復中の患者に見られる低レベルの免疫応答についての１つの説明は、ＳＡＲＳ－２による消耗性免疫抑制の機能であり得る。しかしながら、ウイルスの不活性型を使用する伝統的なワクチンを用いた動物研究は、不活性化ウイルスワクチンが疾患の抗体依存性増強（ＡＤＥ）の誘導を特に受けやすい可能性があることを示唆している。これらのワクチン接種の場合、Ｔｈ２型疾患増強は抗ヌクレオカプシド（ＮＰ）応答によって引き起こされ得る。ワクチンのレシピエントにおいてＡＤＥを刺激しないＳＡＲＳ－２ワクチンを開発することが望ましい。

【0006】

対人距離の確保は、ＳＡＲＳ－２の活動的な伝播を首尾よく抑制しているが、社会の再開は、短期間での感染の急増、並びに起こり得る季節的発生につながると予想される。いくつかの地域では、変異型のＳＡＲＳ－２ウイルスによる感染の急増が既に見られている。ＳＡＲＳ関連β－ＣｏＶ（ＳＡＲＳｒ）の全体的な変異率は、世代あたり０．１変異と低く計算されている。最近の変異の出現にもかかわらず、ＳＡＲＳ－２ウイルスは同様に安定しているようである。任意のＳＡＲＳ－２ワクチンが、短期の変異体に対する防御も提供することが望ましい。

【0007】

関連するＳＡＲＳ－及びＭＥＲＳ－ＣｏＶを用いた多数の動物及び臨床試験は、より一般的な－ＣｏＶ感染に対して有効なワクチンを産生することができることを示唆している。ＳＡＲＳ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）は、動物宿主からヒトに飛び移った第３の致死性β－ＣｏＶである。１，８００個のＳＡＲＳｒが動物で既に同定されており、その一部は最終的にヒトに感染する可能性があることを考慮すると、将来のパンデミックを回避するために群に特異的なＳＡＲＳｒワクチンも作成することが望ましい。

【0008】

ワクチンにおける、アデノウイルスに基づくウイルスベクターを含むウイルスベクターの使用は公知である。そのような「ａｄベクター」は、他のワクチン系と比較して、より高くより持続的な免疫原性を繰り返し実証する。ワクチン接種プログラムにおいてａｄベクターを使用することに関する１つの問題は、標的ウイルスとは対照的に、アデノウイルス自体に対して引き起こされる強い免疫応答である。これらの強い抗アデノウイルス応答を回避するために、すべての内因性アデノウイルス遺伝子を完全に欠失させた（ｆｄ）ａｄベクターを開発した。ｆｄアデノウイルスゲノムのパッキング情報は、最初は第２のウイルスコンストラクト－ハイブリッドバキュロウイルス－アデノウイルス又はヘルパーウイルスと共に送達された。残念なことに、これは、ａｄベクター又はヘルパーウイルスの複製要素の混入をもたらした。既存のａｄベクターワクチンに関するこれらの問題を回避するａｄベクターワクチン系を開発することが望ましい。

【発明の概要】

【0009】

一実施形態では、本開示は、β－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンを提供する。本開示の実施形態によれば、β－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンは、β－ＣｏＶのＳタンパク質をコードするβ－ＣｏＶ ＤＮＡ配列を含む少なくとも１つのウイルスベクターを含む。

【0010】

一実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターは、すべての内因性遺伝子を含まない完全欠失アデノウイルスベクターである。さらに別の実施形態では、β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列は、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列である。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列は、Ｓタンパク質をコードする全配列である。なおさらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列は、Ｓタンパク質をコードする部分配列である。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列は、受容体結合ドメインが除去されたＳタンパク質をコードする部分配列である。さらに別の実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列は、受容体結合ドメイン配列がペプチドリンカーをコードするＤＮＡによって置き換えられている、Ｓタンパク質をコードする部分配列である。

【0011】

一実施形態では、ワクチンは、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６及びＡｄ３５の血清型並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるアデノウイルスに基づくパッケージングプラスミドをさらに含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つのウイルスベクターは、パッケージング細胞に含まれる。さらに別の実施形態では、パッケージング細胞は、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６及びＡｄ３５の血清型並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるカプシドにカプシド形成される。

【0012】

一実施形態では、β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列は、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列であり、ウイルスベクターは、ＳＡＲＳｒウイルス由来の少なくとも第２のβ－ＣｏＶ ＤＮＡ配列を含み、第２のβ－ＣｏＶ ＤＮＡ配列は、ＳＡＲＳｒウイルスのＳタンパク質をコードする。

【0013】

一実施形態では、本開示は、ＳＡＲＳ－２感染を予防するためのワクチンを提供する。本開示の実施形態によれば、ＳＡＲＳ－２感染を予防するためのワクチンは、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶのＳタンパク質をコードするＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列を含む少なくとも１つのウイルスベクターと、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６及びＡｄ３６の血清型並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるアデノウイルスに基づく少なくとも１つのパッキングプラスミドと、を含み、少なくとも１つのウイルスベクター及び少なくとも１つのパッキングプラスミドは、パッケージング細胞に含有され、パッケージング細胞は、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６及びＡｄ３５の血清型並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるカプシドにカプシド形成される。

【0014】

一実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列は、ＳＡＲＳ－２ウイルスの部分Ｓタンパク質をコードする。

【0015】

一実施形態では、本開示は、β－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンを提供する。本開示の実施形態によれば、β－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンは、β－ＣｏＶのＳタンパク質をコードする少なくとも１つのβ－ＣｏＶ ＲＮＡ配列を含む。

【0016】

一実施形態では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。さらなる実施形態では、β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列は、ＳＡＲＳ－２β－ＲＮＡ配列である。なおさらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列は、Ｓタンパク質をコードする配列全体である。さらに別の実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列は、Ｓタンパク質をコードする部分配列である。さらに別の実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列は、受容体結合ドメインが除去されたＳタンパク質をコードする部分配列である。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列は、Ｓタンパク質をコードする部分配列であり、受容体結合ドメイン配列は、ペプチドリンカーをコードするＲＮＡで置き換えられている。

【0017】

一実施形態では、ワクチンは、β－ＣｏＶ ＲＮＡの遺伝子情報を送達する発現ベクターをさらに含む。別の実施形態では、発現ベクターはエンジニアリングされたウイルスベクターである。

【0018】

一実施形態では、本開示は、β－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンを提供する。本開示の実施形態によれば、β－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンは、β－ＣｏＶのＳタンパク質をコードするβ－ＣｏＶタンパク質配列を含む少なくとも１つのウイルスベクターを含む。

【0019】

一実施形態では、β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列は、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶタンパク質配列である。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶタンパク質配列は、Ｓタンパク質をコードする配列全体である。なおさらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶタンパク質配列は、Ｓタンパク質をコードする部分配列である。さらに別の実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶタンパク質配列は、受容体結合ドメインが除去された部分Ｓタンパク質配列である。さらに別の実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶタンパク質配列は、受容体結合ドメイン配列がペプチドリンカーによって置き換えられている部分Ｓタンパク質配列である。

【0020】

一実施形態では、本開示は、少なくとも１つのβ－ＣｏＶの群からの感染に対して哺乳動物の対象にワクチン接種する方法を提供する。本開示の実施形態によれば、少なくとも１つのβ－ＣｏＶの群からの感染に対して哺乳動物の対象にワクチン接種する方法であって、該方法は、広範なβ－ＣｏＶの群を、それらのＳタンパク質をコードするβ－ＣｏＶ ＲＮＡ配列における類似性に基づいたホモロジー群に分類することと、ホモロジー群の他のすべてのメンバーに対して６０％を超える配列同一性を有する各ホモロジー群について少なくとも１つのコンセンサス配列を同定することと、少なくとも１つのホモロジー群からのコンセンサス配列の少なくとも一部を含むウイルスベクターを調製することと、を含む。

【0021】

一実施形態では、コンセンサス配列は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質配列及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0022】

一実施形態では、ウイルスベクターを調製する工程は、２つ以上のホモロジー群からのコンセンサス配列の少なくとも一部を含むことを含む。

【0023】

一実施形態では、本方法は、ワクチンを哺乳動物の対象に注射することをさらに含む。

【0024】

一実施形態では、本開示は、少なくとも１つのβ－ＣｏＶの群からの感染に対して哺乳動物の対象にワクチン接種する方法を提供する。本開示の実施形態によれば、少なくとも１つのβ－ＣｏＶの群からの感染に対して哺乳動物の対象にワクチン接種する方法であって、該方法は、広範なβ－ＣｏＶの群を、それらのＳタンパク質をコードするβ－ＣｏＶのＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質配列における類似性に基づいたホモロジー群に分類することと、ホモロジー群の他のすべてのメンバーに対して６０％を超える配列同一性を有する各ホモロジー群についてβ－ＣｏＶタンパク質配列の少なくとも一部を同定することと、少なくとも１つのホモロジー群からのβ－ＣｏＶタンパク質配列の少なくとも一部を含むＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質ワクチンを調製することと、を含む。

【0025】

別の実施形態では、本方法は、ワクチンを哺乳動物の対象に注射することをさらに含む。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】最大の可変性の部分及び最大の免疫応答を誘発する部分と共に、本開示の実施形態による、Ｓタンパク質をコードするＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡセグメントの機能的部分を示す概略図である。

【図2】本開示の実施形態によるワクチンの要素を示す図である。

【図3】本開示のウイルスベクターを利用する鳥インフルエンザワクチンの活性を示す図である。具体的には、図３Ａは対象群の生存率を示し、図３Ｂは対象群の体重を示し、図３Ｃは血清抗体価を示し、図３Ｄは肺ウイルス力価を示す。

【図4】ＭＥＲＳ－ＣｏＶワクチンの活性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本開示の任意の実施形態を詳細に説明する前に、本開示は、その適用において、以下の説明に記載されるか又は図面に示される構成要素の構成及び配置の詳細に限定されないことを理解されたい。本開示は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施又は実行することができる。また、本明細書で使用される表現及び用語は、説明のためのものであり、限定するものと見なされるべきではないことが理解される。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「有する（ｈａｖｉｎｇ）」及びそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目及びその均等物並びに追加の項目を包含することを意味する。本明細書における「本質的に含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」及び「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及びその変形の使用は、その後に列挙される項目、並びに全体の特性、使用又は製造を本質的に変更しないようにそのような均等物及び追加の項目を提供する均等物及び追加の項目を網羅することを意味する。本明細書における「からなる」及びその変形の使用は、その後に列挙される項目及びそれらの項目のみを含むことを意味する。

【0028】

図面を参照すると、全体を通して、同様の番号は同様の要素を指す。第１、第２などの用語は、様々な要素、構成要素、領域、及び／又は部分を説明するために本明細書で使用され得るが、これらの要素、構成要素、領域、及び／又は部分は、これらの用語によって限定されるべきではないことが理解されよう。これらの用語は、１つの要素、構成要素、領域及び／又は部分を別の要素、構成要素、領域及び／又は部分と区別するためにのみ使用される。したがって、第１の要素、構成要素、領域又は部分は、本開示から逸脱することなく、第２の要素、構成要素、領域又は部分と呼ぶことができる。

【0029】

本開示における数値範囲は近似値であるため、別途指示がない限り、範囲外の値を含んでもよい。数値範囲は、任意のより低い値と任意のより高い値との間に少なくとも２つの単位の分離があるという条件で、（別途具体的に明記しない限り）１単位の増分で、より低い値及びより高い値からの、及びこれらを含むすべての値を含む。一例として、例えば重量による要素の量などの組成、物理的又は他の特性が１０～１００である場合、１０、１１、１２などのすべての個々の値、及び１０～４４、５５～７０、９７～１００などの部分範囲が明示的に列挙されることが意図される。明示的な値を含む範囲（例えば、１、又は２、又は３～５、又は６、又は７の範囲）の場合、任意の２つの明示的な値の間の任意の部分範囲が含まれる（例えば、上記の範囲１～７は部分範囲１～２、２～６、５～７、３～７、５～６などを含む）。１未満の値を含む範囲又は１より大きい分数を含む範囲（例えば、１．１、１．５など）については、１単位は、適切には０．０００１、０．００１、０．０１又は０．１であると考えられる。１０未満の一桁の数を含む範囲（例えば、１～５）では、１単位は通常０．１であると見なされる。これらは、具体的に意図されるものの例にすぎず、列挙された最低値と最高値との間の数値のすべての可能な組み合わせは、本開示において明示的に述べられると見なされるべきである。

【0030】

「真下（ｂｅｎｅａｔｈ）」、「下（ｂｅｌｏｗ）」、「下方（ｌｏｗｅｒ）」、「上（ａｂｏｖｅ）」、「上方（ｕｐｐｅｒ）」などの空間的用語は、本明細書では、図に示すように、１つの要素又は特徴と別の要素又は特徴との関係を説明するための説明を容易にするために使用され得る。空間的に相対的な用語は、使用又は例示における向きに応じて異なる向きを包含することを意図していることが理解されよう。例えば、図中の装置が反転する場合、他の要素又は特徴の「下」又は「真下」にあると記載された要素は、他の要素又は特徴の「上」に配向される。したがって、例示的な「下」という用語は、上下の両方の向きを包含することができる。装置は、他の方向に向けられ（９０°又は他の向きに回転され）てもよく、本明細書で使用される空間的に相対的な記述語はそれに応じて解釈される。

【0031】

本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、関連する列挙項目のうちの１つ以上のありとあらゆる組み合わせを含む。例えば、「Ａ及び／又はＢ」などの語句で使用される場合、「及び／又は」という語句は、ＡとＢの両方、Ａ又はＢ、Ａ（単独）、及びＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」などの語句で使用される「及び／又は」という用語は、以下の実施形態「Ａ、Ｂ、及びＣ、Ａ、Ｂ、又はＣ、Ａ又はＣ、Ａ又はＢ、Ｂ又はＣ、Ａ及びＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、及びＣ（単独）のそれぞれを包含することを意図している。

【0032】

一実施形態では、本開示は、対象、特に哺乳動物の対象、より具体的にはヒトの対象における少なくとも１つのβ－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンを調製する方法を提供する。

【0033】

β－ＣｏＶの同定
本開示の実施形態によれば、対象、特に哺乳動物の対象、より具体的にはヒトの対象における少なくとも１つのβ－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンを調製する方法は、動物宿主、特に哺乳動物宿主から少なくとも１つのβ－ＣｏＶを同定することを含む。特に一実施形態では、対象、特に哺乳動物の対象、より具体的にはヒトの対象における少なくとも１つのβ－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンを調製するための方法は、コウモリ、ラット、ヒト、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される哺乳動物宿主から少なくとも１つのβ－ＣｏＶを同定することを含む。一実施形態では、少なくとも１つのβ－ＣｏＶは、少なくとも１つのＳＡＲＳｒを含む。別の実施形態では、少なくとも１つのβ－ＣｏＶは、少なくとも１つのＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶを含む。

【0034】

ホモロジー群の同定
本開示の実施形態によれば、対象、特に哺乳動物の対象、より具体的にはヒトの対象における少なくとも１つのβ－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンを調製するための方法は、同定されたβ－ＣｏＶを、例えば動物宿主から同定されたβ－ＣｏＶを、遺伝子配列の類似性に基づいたホモロジー群に分類することと、ホモロジー群ごとに少なくとも１つのコンセンサス配列を調製することとを含む。ホモロジー群は、β－ＣｏＶ遺伝子配列の全体、β－ＣｏＶ遺伝子配列の複数の部分、又はβ－ＣｏＶ遺伝子配列の単一の部分の類似性に基づくことができる。遺伝子配列は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質配列、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。単一のβ－ＣｏＶが同定される場合、それは単一のホモロジー群の唯一のメンバーであることが理解されよう。

【0035】

特定の実施形態では、β－ＣｏＶは複数のＳＡＲＳｒを含み、複数のＳＡＲＳｒは、１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つのホモロジー群に分類される。一実施形態では、ホモロジー群は、スパイクタンパク質、ＳＡＲＳ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、エンベロープタンパク質、核タンパク質、及びそれらの組み合わせに関連する遺伝子配列の少なくとも一部、又は少なくとも２つ以上の部分、又は全部に基づく。

【0036】

さらなる実施形態では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶが同定され、少なくとも１つのホモロジー群に分類される。

【0037】

一実施形態では、各ホモロジー群内で、遺伝子配列は、ホモロジー群の他のすべてのメンバーに対して６０％以上、又は６５％以上、又は７０％以上、又は７５％以上、又は８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する。

【0038】

一実施形態では、各ホモロジー群内で、遺伝子配列は、ホモロジー群の他のすべてのメンバーに対して６０％以上、又は６５％以上、又は７０％以上、又は７５％以上、又は８０％以上、又は８５％以上～９０％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％、又は１００％未満の配列同一性を有する。

【0039】

一実施形態では、各ホモロジー群の遺伝子配列は、ホモロジー群で異なるタンパク質配列を定義する。一実施形態では、異なるタンパク質は、Ｓタンパク質、エンベロープタンパク質、核タンパク質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらなる実施形態では、異なるタンパク質はＳタンパク質である。

【0040】

特定の実施形態では、複数のＳＡＲＳｒが分析され、５つのホモロジー群に分類され、各ホモロジー群内で、遺伝子配列は６５％超～９９％の配列同一性を有する。

【0041】

ホモロジー群及びコンセンサス配列を同定するための例示的なプロセスがここで提供される。

【0042】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶは、約３０ｋｂのプラスセンス一本鎖ＲＮＡゲノム及び４つの構造タンパク質を有する。構造タンパク質の１つは、スパイク（Ｓ）ペプロマーである。これらのＳタンパク質は、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶの表面に見出され、細胞受容体結合を媒介し、したがってウイルスの宿主指向性を決定する。Ｓタンパク質をコードするＲＮＡのタンパク質部分は、図１に示すように、ＳＩ鎖１０とＳ２鎖２０とがフランカット部位２５で隔てられた状態で、ＳＩ鎖とＳ２鎖とに分けられる。ＲＢＤ ３０は、ＳＩ鎖１０に位置する。ＲＢＤの変異は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）へのウイルスの結合に影響を及ぼし、この結合の増強は、動物宿主からヒト宿主へのウイルスの飛び移りを促進することによることが発見された。膜融合部分４０は、Ｓ２鎖２０に位置する。図１には、ヘプタペプチドＨＲ１及びＨＲ２、Ｓタンパク質の膜貫通ＴＭ及び細胞質ドメインがさらに示されている。

【0043】

ＳＡＲＳ－１β－ＣｏＶなどの他のコロナウイルスとは対照的に、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶのＳタンパク質は、ウイルス構築中に酵素で切断されない。ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ Ｓタンパク質は、プロタンパク質転換酵素フリンによって予め活性化される。したがって、細胞侵入時の標的細胞プロテアーゼへの依存性は減少する。

【0044】

ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ Ｓタンパク質は、ＳＩ鎖１０とＳ２鎖２０とに分割される。Ｓ２鎖２０のコンフォメーション変化は、宿主細胞内でのウイルスの融合をもたらす。これは、ＲＢＤを含むＳタンパク質コードＲＮＡ配列と組み合わせて、Ｓタンパク質コードＲＮＡ配列を抗ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶワクチンレジメンで使用するための重要な候補にする。

【0045】

図１はまた、より大きな免疫応答を誘発するＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶのＳタンパク質部分を示す（６０）。示されるように、部分６０ｂはＲＢＤ ３０と重複し、かなりの部分であり、これはＲＢＤ ３０に関連する有意な免疫応答が存在することを意味する。部分６０ｄ及び６０ｅは、可変性の低い膜融合部分４０と重なり合っているが、より小さく、したがって、免疫応答をそれほど強く誘発しない。異なるβ－ＣｏＶ、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＭＥＲＳ－ＣｏＶに対する免疫応答を分析する際に、これらのコロナウイルスの活性を中和する能力を有する抗体が、Ｓタンパク質のより保存された領域、すなわち、Ｓ２ドメイン２０内のＳタンパク質ステム領域内にも結合し得ることが観察された。

【0046】

図１にさらに例示されるように、様々なＳＡＲＳｒからのＲＮＡのＳタンパク質コード配列をアラインメントすることにより、遺伝子全体にわたって有意な相違が示される（５０）。したがって、本発明のＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡに基づくワクチンは、他のＳＡＲＳｒによって引き起こされる感染から効率的に防御することができない可能性がある。しかし、複数のＳＡＲＳｒからのＲＮＡのＳタンパク質コード配列を分析すると、表１に示すように、ＳＡＲＳｒをホモロジー群に分類することができる。

【0047】

表１の情報を得るために、ＶｉＰＲ及びＮＣＢＩを使用して配列を見出した。全体的なアラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して行った。関連するアラインメント（＞９２％）を抽出してグループ分けを作成し、これをＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを用いてアラインメントし、ＢＬＡＳＴ多重配列アラインメントを用いて確認した。

【0048】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ群については、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を網羅するＧｅｎＢａｎｋ及びＶｉＰＲからの１１３０配列を分析した。いくつかの配列は、ギャップを担う可能性が高いランダムインサートを含んでいたが、少数の変異体はすべて抗体結合を維持していた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２群については、新しいクレード２０Ｈ、２０１及び２０Ｊ（南アフリカ、カリフォルニア及び英国の変異体にそれぞれ対応する）を含む３０００超の配列を分析した。ＷＩＶ－１は、コウモリでは顕著なＳＡＲＳｒであるが、ヒト細胞で複製することが示されている。ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶを生じさせたと考えられるＲａＴＧ１３株を含む５６のＷＩＶ－１株を分析した。１６株のみが完全ＣＤＳを有していた。ＮＣＢＩ保存タンパク質ドメインファミリーｃｄ２１４７７及びＣｎ３Ｄによって示されるように、構造は変異体間で安定に見えた。ＹＮＬＦ群では、コウモリ、センザンコウ及びラクダから得られた７１個の配列（３９は完全なＣＤＳである）。これらのＳＡＲＳｒ株は、ＷＩＶ１ファミリーよりもＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶとの類似性が低いが、特定の領域においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ群及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２群とのいくつかの強い類似性を有する。全体的なスパイクアラインメントは並みであるが、ＲＢＤアラインメントは強い類似性を示す。Ｂａｔ２０１３群では、高い類似性を有する１９個の試料を分析した。Ｂａｔ２０１３群は、他の群よりも高い分散を示すが、多くの株が同じ抗体に対して交差反応性を示している。

【0049】

コンセンサス配列
本開示の実施形態によれば、対象、特に哺乳動物の対象、より具体的にはヒトの対象における少なくとも１つのβ－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンを調製する方法は、各ホモロジー群について少なくとも１つのコンセンサス配列を同定することを含む。コンセンサス配列は、配列の各位置に統計的に最も高頻度の残基を含む群について開発されたＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質配列である。一実施形態では、ホモロジー群についてのコンセンサス配列は、対応するホモロジー群の各メンバーと少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の共有性を有する。

【0050】

特定の実施形態では、コンセンサス配列は、対応するホモロジー群の他のすべてのメンバーと６０％以上、又は６５％以上、又は７０％以上、又は７５％以上、又は８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するＤＮＡ配列である。

【0051】

特定の実施形態では、コンセンサス配列は、対応するホモロジー群の他のすべてのメンバーと６０％以上、又は６５％以上、又は７０％以上、又は７５％以上、又は８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するＲＮＡ配列である。

【0052】

特定の実施形態では、コンセンサス配列は、対応するホモロジー群の他のすべてのメンバーと６０％以上、又は６５％以上、又は７０％以上、又は７５％以上、又は８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するタンパク質配列である。

【0053】

一実施形態では、コンセンサス配列を編集して可変ドメインを除去する。例示的な可変ドメインは、図１の３２４～５３３の配列として示される。１つ以上の可変ドメインが欠失するような実施形態では、欠失配列は、欠失によって形成されたギャップを架橋するように設計されたより小さいリンカーペプチドによって置き換えられる。

【0054】

一実施形態では、各ホモロジー群のコンセンサス配列は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質配列、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、ホモロジー群のうちの少なくとも１つのコンセンサス配列はＲＮＡである。さらなる実施形態では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。

【0055】

一実施形態では、分析されるβ－ＣｏＶは、ＳＡＲＳｒである。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳｒは、少なくとも１つのホモロジー群に分類された少なくとも１つのＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶを含み、少なくとも１つのホモロジー群のコンセンサス配列は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はタンパク質配列である。単一のＳＡＲＳｒ、例えば単一のＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶが同定され、単一のＳＡＲＳｒがホモロジー群の唯一のメンバーである実施形態では、コンセンサス配列はＤＮＡ配列であり得、ＲＮＡ配列又はタンパク質配列は、ＳＡＲＳｒと１００％の共有性を有することが理解されよう。

【0056】

一実施形態では、コンセンサス配列は、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列であり、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列は、Ｓタンパク質コード配列の少なくとも一部である。さらなる実施形態では、コンセンサス配列は、Ｓタンパク質コード配列全体を含むＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡである。

【0057】

一実施形態では、コンセンサス配列は、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列であり、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列は、Ｓタンパク質コード配列の少なくとも一部である。

【0058】

一実施形態では、コンセンサス配列は、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶタンパク質配列であり、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶタンパク質配列は、Ｓタンパク質の少なくとも一部である。

【0059】

ウイルスベクター
本開示の実施形態によれば、対象、特に哺乳動物の対象、より具体的にはヒトの対象における少なくとも１つのβ－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンを調製する方法は、少なくとも１つのコンセンサス配列をウイルスベクターに挿入することを含む。一実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクター要素である。

【0060】

既存の及び誘導された干渉抗アデノウイルス免疫応答を最小限に抑えるために、すべての内因性遺伝子が、アデノウイルスベクター要素であるウイルスベクター要素から欠失している。すなわち、一実施形態では、ウイルスベクター要素は、完全欠失（ｆｄ）アデノウイルスベクターである。

【0061】

一実施形態では、アデノウイルスベクター７０、好ましくはｆｄアデノウイルスベクターは、図２に示すように、最大３３ｋｂの遺伝子コンストラクトを受け入れることができ、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）７２、７２及びパッケージングシグナル（Ｙ）７３を有する。欠失した内因性遺伝子は、サイズを補完するスタッファー７５で置き換えられる。示される実施形態では、これらのスタッファー７５は、ヒト遺伝子５－アミノイミダゾール－４－カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子（ＡＴＩＣ）の断片から調製される。さらなる実施形態では、限定されるものではないが、ヒトのヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼなどの他のスタッファー配列を使用することができる。

【0062】

図２に示す実施形態では、５つのコンセンサス配列８０ａ、８０ｂ、８０ｃ、８０ｄ、８０ｅは、ウイルスベクター又はアデノウイルスベクター又はｆｄアデノウイルスベクターによって受け入れられる。しかしながら、さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、より多い又はより少ないコンセンサス配列を含み得る。コンセンサス配列は、本明細書で提供される任意の実施形態又は実施形態の組み合わせに従う。

【0063】

例示のみを目的として、図２を参照すると、コンセンサス配列８０ａは、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶのみを含有するホモロジー群に由来するＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列である。ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列がウイルスベクターに含まれる唯一のコンセンサス配列である場合、得られたワクチンは、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶによる感染からの特異的防御を提供することを意図する。さらなる実施形態では、コンセンサス配列は、より広範なＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶの集合を含むホモロジー群に由来し得る。なおさらなる実施形態では、ウイルスベクターは、図２に示すように、異なるホモロジー群に由来する追加のコンセンサス配列を含み得る。そのような実施形態では、得られたワクチンは、異なるホモロジー群のウイルスに対してより広範な防御を提供し得る。

【0064】

別の実施形態では、ウイルスベクターは、ＤＮＡ導入遺伝子などの導入遺伝子を送達するように構成されたウイルスベクターであり得る。導入遺伝子を送達するように構成された例示的なウイルスベクターには、アデノウイルス関連ベクター及びワクシニアウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。

【0065】

パッケージングプラスミド
本開示の実施形態によれば、対象、特に哺乳動物の対象、より具体的にはヒトの対象における少なくとも１つのβ－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンを調製する方法は、少なくとも１つのパッケージングプラスミドを提供することを含む。

【0066】

図２をさらに参照すると、本開示で使用される例示的なプラスミド８２は、後期遺伝子及び初期遺伝子などの複数の遺伝子を含む。一実施形態では、プラスミド８２は、図２に示すように、複数の後期遺伝子、好ましくは後期領域１、２、３、４及び６を含む。さらなる実施形態では、本開示で使用されるプラスミド８２は、複数の初期遺伝子、好ましくは図２に示される初期領域２及び４を含む。

【0067】

一実施形態では、後期遺伝子及び初期遺伝子はトランスで提供される。

【0068】

図２に示されるように、プラスミド８２は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）及び右ＩＴＲをさらに含む。しかしながら、本開示で使用されるカプシドは、左ＩＴＲ、初期遺伝子Ｅｌ及びＥ３、そのパッキングシグナル、並びにそのタンパク質ＩＸ遺伝子を欠いている。

【0069】

特定の実施形態では、プラスミドは、（ｉ）後期領域１、２、３、４、５、（ｉｉ）初期領域２及び４、（ｉｉｉ）ＭＬＰ、及び（ｉｖ）右ＩＴＲから本質的になる。そのような実施形態では、プラスミドは、左ＩＴＦ、初期遺伝子Ｅｌ及びＥ３、パッキングシグナル、並びにタンパク質ＩＸ遺伝子を完全に欠いている。

【0070】

一実施形態では、プラスミド８２はアデノウイルスに基づく。さらなる実施形態では、プラスミド８２は、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６及びＡｄ３５血清型並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるアデノウイルスに基づいており、ヒト血清型Ａｄ２のアデノウイルスカプシドは、ｐＰａＣ２、ｐＰａＣ５を有するＡｄ５、ｐＰａＣ６を有するＡｄ６及びｐＰａＢ３５を有するＡｄ３５でコードされる。トランスフェクション

【0071】

本開示の実施形態によれば、対象、特に哺乳動物の対象、より具体的にはヒトの対象における少なくとも１つのβ－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンを調製するための方法は、パッケージング細胞にウイルスベクター及びパッキングプラスミドをトランスフェクションすることを含む。一実施形態では、パッケージング細胞は、１つ以上のウイルスベクター及び１つ以上のプラスミドを含み得る。好ましい実施形態では、パッケージング細胞は、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上のウイルスベクター及び１つのパッキングプラスミドを含む。

【0072】

さらに図２を参照すると、ウイルスベクター７０及びプラスミド８２は、コトランスフェクションにより真核生物宿主細胞又はパッケージング細胞８５に導入される。示される特定の実施形態では、ウイルスベクター７０及びプラスミド８２は、最適化され標準化された１週間コトランスフェクションプロトコールを使用してパッケージング細胞８５にコトランスフェクトされる。

【0073】

一実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、特にｆｄアデノウイルスベクターであり、パッケージング細胞は、ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）及びＰｅｒＣ．６細胞などであるがこれらに限定されない細胞株に由来する。ｆｄアデノウイルスベクターをパッケージングするのに必要なパッケージング細胞は、アデノウイルスベクターのＥｌ領域内にコードされた遺伝子を発現するようにエンジニアリングされなければならない。特定の実施形態では、パッケージング細胞は、アデノウイルスベクターのＥ１領域内にコードされる遺伝子を発現するようにエンジニアリングされたＨＥＫ２９３由来のＱ７パッケージング細胞である。

【0074】

ｆｄアデノウイルスベクターの産生は、エンジニアリングされたアデノウイルスゲノム、パッケージング発現プラスミド及び化学的トランスフェクション試薬の混合物によるパッケージング細胞の化学的トランスフェクションによって開始されることは注目に値する。

【0075】

カプシド
本開示の実施形態によれば、対象、特に哺乳動物の対象、より具体的にはヒトの対象における少なくとも１つのβ－ＣｏＶ感染を予防するためのワクチンを調製するための方法は、図２に示すように、ウイルスベクター７０及びプラスミド８２を含有するパッケージング細胞８５をカプシドにカプシド形成することを含む。

【0076】

ウイルスベクター７０及びプラスミド８２を含むパッケージング細胞８５は、ワクチン接種されている哺乳動物にはまれなアデノウイルスの血清型のカプシドで送達される。特定の実施形態では、ワクチン接種されている哺乳動物はヒトであり、ウイルスベクターは、ヒトにはまれなアデノウイルスの血清型のカプシドで送達される。一実施形態では、ウイルスベクターは、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６及びＡｄ３５の血清型のカプシド、並びにそれらの組み合わせで送達される。一実施形態では、ウイルスベクターはＡｄ６血清型のカプシドで送達される。

【0077】

ワクチンの組成
一実施形態では、本開示は、ワクチン、より具体的にはβ－ＣｏＶ、好ましくはＳＡＲＳｒからの感染を予防するためのワクチンの組成物を提供する。

【0078】

本開示の実施形態によれば、ワクチンは、少なくとも１つのウイルスベクターに担持された１つ以上のβ－ＣｏＶ、好ましくは１つ以上のＳＡＲＳｒに由来する１つ以上のコンセンサス配列を含む。コンセンサス配列は、本明細書に記載される任意の実施形態又は実施形態の組み合わせに従うことができる。ウイルスベクターは、上記の任意の実施形態又は実施形態の組み合わせに従うことができる。

【0079】

一実施形態では、１つ以上のコンセンサス配列は、β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質配列、又はそれらの組み合わせ、好ましくはＳＡＲＳｒ ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質配列、又はそれらの組み合わせである。

【0080】

本開示の実施形態によれば、１つ以上のコンセンサス配列は、少なくとも１つのＳＡＲＳｒ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列、又は好ましくは少なくとも１つのＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む。一実施形態では、ＳＡＲＳｒ ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、又はＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列は、Ｓタンパク質コード配列の少なくとも一部である。

【0081】

いくつかの実施形態では、１つ以上のコンセンサス配列の１つ以上は、部分的又は完全に除去された可変領域を有する。特定の実施形態では、１つ以上のコンセンサス配列は、少なくとも１つのＳＡＲＳｒ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列、好ましくは少なくとも１つのＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含み、これはＳタンパク質コード配列の少なくとも一部であり、Ｓタンパク質コード配列の可変領域の少なくとも一部が除去されている。

【0082】

一実施形態では、コンセンサス配列の発現はプロモーターによって駆動される。プロモーターは、コンセンサス配列、ワクチン接種動物、及びワクチンの特定の組成物に特異的であり得る。一実施形態では、プロモーターは、ヒトのサイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサー、ヒト成長遺伝子に由来するポリアデニル化部位、伸長因子１－アルファ、ホスホグリセレートキナーゼ、ユビキチンＣ、ベータアクチン遺伝子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。実施形態では、プロモーターの活性は、限定されないが、抗生物質などの化学物質によって影響され得る。テトラサイクリンは、プロモーターの活性に影響を及ぼす抗生物質の非限定的な例である。

【0083】

特定の実施形態では、ワクチンは、少なくともＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶからの感染を予防するように特に設計される。そのような実施形態では、１つ以上のコンセンサス配列は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む。好ましくは、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列は、Ｓタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列である。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列は、（部分的又は全体的に）Ｓタンパク質をコードする配列であるＲＮＡ配列である。

【0084】

コンセンサス配列がＳタンパク質を（部分的又は全体的に）コードするＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列である実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ配列は、ヒトコドンが最適化されており、特異的ＲＮＡの発現は、ヒトのサイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサー、続いてヒト成長遺伝子に由来するポリアデニル化部位によって駆動される。他の実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡの発現は、他のプロモーター、例えば限定されないが、伸長因子１－α、ホスホグリセレートキナーゼ、ユビキチンＣ、βアクチン遺伝子、及びそれらの組み合わせに由来するプロモーターによって駆動される。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡの発現は、その活性が、限定されないが、抗生物質テトラサイクリンなどの化学物質によって影響され得るプロモーターによって駆動される。

【0085】

さらなる実施形態では、ワクチンは、２つ以上のコンセンサス配列、１つ以上のウイルスベクターを含む。本開示の実施形態によれば、１つのコンセンサス配列は、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列であり、ワクチンは、ＳＡＲＳｒ ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質配列である少なくとも１つの追加のコンセンサス配列を含む。

【0086】

一実施形態では、少なくとも１つのウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、より好ましくはｆｄアデノウイルスベクターである。

【0087】

さらなる実施形態では、ワクチンは、全部又は一部がＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ配列、及び少なくとも１つの他のＳＡＲＳｒ ＲＮＡ（全部又は一部）配列を有するウイルスベクターを含むＳＡＲＳｒワクチンである。そのような実施形態では、ウイルスベクターは、同様に、ウイルスベクターに表されるＳＡＲＳｒ群のそれぞれについてのヒトコドン最適化Ｓタンパク質の発現カセットを担持する。ヒトコドン最適化Ｓタンパク質は、ＣＭＶ前初期プロモーター／エンハンサー、続いてヒト成長ホルモン由来のポリアデニル化部位によって駆動される。

【0088】

いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶ ＲＮＡ、及び存在する場合、さらなるＳＡＲＳｒ ＲＮＡは、Ｓタンパク質コード配列の可変領域を完全に又は部分的に除去した。

【0089】

本開示の実施形態によれば、ワクチンは、パッキングプラスミドをさらに含む。パッキングプラスミドは、本明細書に記載される任意の実施形態又は実施形態の組み合わせに従うことができる。

【0090】

一実施形態では、少なくとも１つのコンセンサス配列は、ＳＡＲＳｒ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列、特にＳタンパク質コード配列であるＳＡＲＳｒ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列であり、パッキングプラスミドは、左ＩＴＲ、初期遺伝子Ｅ１及びＥ３、そのパッキングシグナル、並びにそのタンパク質ＩＸ遺伝子を欠いている。特定の実施形態では、少なくとも１つのコンセンサス配列は、ＳＡＲＳｒ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列、特に、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６及びＡｄ３５の血清型及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアデノウイルスに基づくウイルスベクター及びパッキングプラスミドに含まれるＳタンパク質コード配列であるＳＡＲＳｒ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列であり、ヒト血清型Ａｄ２のアデノウイルスカプシドは、ｐＰａＣ２、ｐＰａＣ５を有するＡｄ５、ｐＰａＣ６を有するＡｄ６及びｐＰａＢ３５を有するＡｄ３５でコードされ、プラスミドは、左ＩＴＲ、初期遺伝子Ｅ１及びＥ３、そのパッキングシグナル、並びにそのタンパク質ＩＸ遺伝子を含まない。

【0091】

本開示の実施形態によれば、ワクチンは、コンセンサス含有ウイルスベクター及びプラスミドがコトランスフェクトされたパッケージング細胞を含む。パッケージングは、任意の実施形態又は組み合わせ又は本明細書に開示される実施形態に従う。

【0092】

一実施形態では、ウイルスベクター及びプラスミドを、ＨＥＫ－２９３由来のＱ７パッケージング細胞を使用する最適化され標準化された１週間コトランスフェクションプロトコールを使用して、パッケージング細胞にコトランスフェクトする。例示的な実施形態では、ウイルスベクターは、ＳＡＲＳｒ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列、特にＳタンパク質をコードする配列であるＳＡＲＳｒ ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む少なくとも１つのコンセンサス配列を含み、プラスミドは、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６及びＡｄ３５の血清型及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアデノウイルスに基づいており、ヒト血清型Ａｄ２のアデノウイルスカプシドは、ｐＰａＣ２、ｐＰａＣ５を有するＡｄ５、ｐＰａＣ６を有するＡｄ６及びｐＰａＢ３５を有するＡｄ３５でコードされ、ウイルスベクター及びプラスミドは、ＨＥＫ－２９３由来のＱ７パッケージング細胞を使用する最適化され標準化された１週間コトランスフェクションプロトコールを使用して、パッケージング細胞にコトランスフェクトされる。

【0093】

ワクチンは、（ウイルスベクター及びプラスミドと共に）パッケージング細胞がカプシド形成されているカプシドを含む。カプシドは、本明細書に開示される任意の実施形態又は実施形態の組み合わせによるものであり得る。

【0094】

一実施形態では、カプシドは、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６及びＡｄ３５の血清型、並びにそれらの組み合わせのものである。

【0095】

ワクチン接種方法
一実施形態では、本開示は、β－ＣｏＶの少なくとも１つの群からの感染に対して動物対象、好ましくは哺乳動物の対象、より好ましくはヒトの対象にワクチン接種する方法を提供する。

【0096】

本開示の実施形態によれば、本方法は、少なくとも１つのβ－ＣｏＶコンセンサス配列、好ましくは少なくとも１つのＳＡＲＳｒコンセンサス配列、より好ましくは少なくとも１つのＳＡＲＳ－２β－ＣｏＶコンセンサス配列を含む少なくとも１つのウイルスベクター及びプラスミドを含むワクチンを提供することを含み、少なくとも１つのウイルスベクター及びプラスミドはパッケージング細胞にトランスフェクトされ、パッケージング細胞はカプシドにカプシド形成される。

【0097】

一実施形態では、少なくとも１つのβ－ＣｏＶコンセンサス配列は、任意の実施形態又は組み合わせ又は本明細書に記載される実施形態に従う。一実施形態では、少なくとも１つのウイルスベクターは、本明細書に記載される任意の実施形態又は実施形態の組み合わせに従う。一実施形態では、プラスミドは、本明細書に記載される任意の実施形態又は実施形態の組み合わせに従う。一実施形態では、パッケージング細胞は、本明細書に記載される任意の実施形態又は実施形態の組み合わせに従う。一実施形態では、カプシドは、本明細書に記載される任意の実施形態又は実施形態の組み合わせに従う。

【0098】

本方法は、動物対象、好ましくは哺乳動物の対象、例えばヒトなどにウイルスベクターを注射することをさらに含む。一実施形態では、単一用量は、少なくとも１つのβ－ＣｏＶに対する防御を提供するのに十分なものであり、より具体的には、ワクチンに含まれるコンセンサス配列の少なくとも１つに対して６０％以上、又は６５％以上、又は７０％以上、又は７５％以上、又は８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する任意のβ－ＣｏＶに対する防御を提供する。

【0099】

他の実施形態では、防御を提供するために２回以上の用量が必要とされ得る。特に、２回、又は３回、又は４回の用量は、少なくとも１つのβ－ＣｏＶに対する防御、より具体的には、ワクチンに含まれるコンセンサス配列の少なくとも１つに対して、６０％以上、又は６５％以上、又は７０％以上、又は７５％以上、又は８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する任意のβ－ＣｏＶに対する防御を提供するのに十分なものである。

【実施例】

【0100】

実施例１
本開示の実施形態によるウイルスベクターの効率を示すために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、本開示の実施形態によるウイルスベクターを使用して様々な用量のＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）ワクチンを投与し、次いで、Ｈ５Ｎ１ウイルスに曝露した。特に、それぞれ１０匹のマウスの４つの群が存在した。第１の対照群（Ｃｌ）にプラセボをワクチン接種する。第２の対照群（Ｃ２）にはワクチン接種しない。第１の実験群（Ｅｌ）に、ベクター懸濁バッファー（ＰＢＳ、ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ、ＥＤＴＡ ０１．ｍＭ、スクロース５％）に懸濁した３×１０^８ゲノム当量のＧｒｅＦｌｕＶｉｅワクチン（Ｈ５Ｎ１ウイルスと少なくとも６０％の共有性を有するコンセンサス配列を含むウイルスベクターを含む）をワクチン接種する。第２の実験群（Ｅ２）に、ベクター懸濁バッファーに懸濁した３×１０^７ゲノム当量のＧｒｅＦｌｕＶｉｅワクチンをワクチン接種する。Ｃｌ、Ｅ１及びＥ２群は、同じ対照又はワクチン調製物で２４日目に追加免疫した。２６日目に、Ｃｌ、Ｅ１及びＥ２群に、Ｈ５Ｎ１の半数致死量（ＬＤ５０）を鼻腔内投与した。それらの群を観察し、それらの体重を毎日測定した。４８日目にマウスから採血し、Ｈ５Ｎ１ウイルスによるＭＤＣＫ試験細胞（ＭＤＣＫ ｔｅｓｔ ｓｅｌｌｓ）の感染を中和する抗体及びウマ赤血球の赤血球凝集を阻害する抗体の存在について試験した。

【0101】

図３に示すように、Ｃｌ群は生存率が非常に低く、すべてのマウスが感染後１５日前に死亡している。対照的に、Ｅ１及びＥ２の両群は有意に改善された生存率を示し、体重はＣ２群の傾向を模倣している。Ｅ１群及びＥ２群のうち、Ｅ１群は、より高いウイルス中和及びより低い肺ウイルス力価を示す。重要なことに、Ｅ１及びＥ２の両群は、免疫後に感染と戦う能力の有意な改善を示す。

【0102】

実施例２
５匹のマウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス）の対照群（Ｃ３）にプラセボをワクチン接種する。５匹のマウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス）の実験群（Ｅ３）に、ベクター懸濁バッファー（ＰＢＳ、ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ、ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ、スクロース５％）に懸濁した３×１０^７ゲノム当量のＧｒｅＭＥＲＳｆｌワクチン（ＥＭＸ／２０１２ ＭＥＲＳ－ＣｏＶと少なくとも６０％の共有性を有するコンセンサス配列を有するウイルスベクターを含む）をワクチン接種する。コンセンサス配列は、具体的には、ＭＥＲＳ－ＣｏＶの全長スパイクタンパク質である。Ｃ３群及びＥ３群は、同じ対照又はワクチン調製物で１７日目に追加免疫した。１９日目に、Ｃ３群及びＥ３群にＭＥＲＳのＬＤ ５０を鼻腔内感染させた。該群を２１日目に混合した。血清を、ＥＭＸ／２０１２ ＭＥＲＳ－ＣｏＶによる試験細胞の感染を中和する抗体の存在について試験した。

【0103】

図４に示すように、Ｅ３群はウイルス中和に有意な改善を示した。

【0104】

ウイルスベクター及び関連するワクチンの複数の実施形態が本明細書に詳細に記載されているが、それらのエンジニアリング及び変形が可能であり、それらのすべてが本発明の真の趣旨及び範囲内に入ることは明らかである。特に、本ウイルスベクター及びワクチンは、β－ＣｏＶ、より具体的にはＳＡＲＳ－２及びＳＡＲＳｒウイルスに関して詳細に記載されているが、ウイルスベクター及びワクチンは、例えば、ａ－ＣｏＶ、ｇ－ＣｏＶ、及びｄ－ＣｏＶなどの他のクラスのコロナウイルスに適用するために当業者の技術に従ってエンジニアリングできることが理解されよう。さらに、多数の修正及び変更が当業者には容易に思い浮かぶため、本発明を図示及び説明された正確な構成及び操作に限定することは望ましくなく、したがって、すべての適切な修正及び均等物を用いることができ、本開示の範囲内にある。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

2023522108000001.app

【国際調査報告】