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▶ セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-26
(54)【発明の名称】ウイルス核タンパク質及びその製剤
(51)【国際特許分類】
C07K 14/005 20060101AFI20230519BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230519BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230519BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230519BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230519BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20230519BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20230519BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230519BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20230519BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230519BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230519BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230519BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230519BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20230519BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230519BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20230519BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20230519BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20230519BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20230519BHJP
A61K 39/295 20060101ALI20230519BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20230519BHJP
A61K 39/145 20060101ALI20230519BHJP
A61K 39/29 20060101ALI20230519BHJP
C12N 15/33 20060101ALI20230519BHJP
【ＦＩ】
C07K14/005 ZNA
A61P31/00
A61P35/00
A61P37/08
A61P31/12
A61P31/18
A61P31/16
A61P31/14
A61P31/20
A61K38/16
A61K47/64
A61K45/00
A61K31/7088
A61K9/12
A61P37/04
A61K47/32
A61K47/38
A61K39/12
A61K39/39
A61K39/295
A61K39/215
A61K39/145
A61K39/29
C12N15/33
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022563491
(86)(22)【出願日】2021-04-16
(85)【翻訳文提出日】2022-12-16
(86)【国際出願番号】 CU2021050002
(87)【国際公開番号】W WO2021213558
(87)【国際公開日】2021-10-28
(31)【優先権主張番号】2020-0028
(32)【優先日】2020-04-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】304012895
【氏名又は名称】セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アギラール ルビド、フリオ カエサル
(72)【発明者】
【氏名】アギラール サンティアゴ、ホルヘ オーガスティン
(72)【発明者】
【氏名】ヴァン － デ － クルンデルト、マールテン
(72)【発明者】
【氏名】ケーケレ、マルティン
(72)【発明者】
【氏名】シェイク モハンマド、ファズル アクバー
(72)【発明者】
【氏名】アル － マータブ、マムン
(72)【発明者】
【氏名】ギレン ニエト、ジェラルド エンリケ
(72)【発明者】
【氏名】ウディン、ヘラル
(72)【発明者】
【氏名】ティーレ、フランク
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA24
4C076AA95
4C076BB02
4C076BB13
4C076BB14
4C076BB25
4C076CC07
4C076CC31
4C076CC35
4C076CC41
4C076EE07G
4C076EE31G
4C076EE59
4C076FF17
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA01
4C084MA59
4C084MA66
4C084NA05
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB131
4C084ZB132
4C084ZB261
4C084ZB262
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4C084ZB331
4C084ZB332
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4C085AA03
4C085AA38
4C085BA51
4C085BA55
4C085BA71
4C085BA89
4C085BA92
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB09
4C086ZB13
4C086ZB26
4C086ZB31
4C086ZB33
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA54
4H045CA02
4H045DA50
4H045EA22
4H045EA28
4H045EA29
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
リボ核酸（ＲＮＡ）を含む核タンパク質、及びそのＲＮＡ含有量が２０％（質量／質量）超であるウイルス核タンパク質。このＲＮＡは、分解から保護するウイルス様構造内に含有される。さらに、この核タンパク質は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９としての先天性免疫受容体を活性化することが可能である。核タンパク質は、抗感染応答、抗腫瘍応答、または抗アレルギー性の応答を促進し、単独でまたは他の治療もしくは医薬と併用して使用されて、感染性またはアレルギー性のプロセスの予防または治療に好適な先天性免疫を刺激及び訓練する役割を果たす。本発明の核タンパク質は、ワクチンアジュバントまたは担体としても使用され、粘膜投与のためのキットの一部分でもあり得る製剤を製造するために好適である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リボ核酸（ＲＮＡ）及びウイルス起源のタンパク質を含む核タンパク質であって、前記ＲＮＡ含有量が２０％質量／質量超であり、前記ＲＮＡがウイルス様構造内で分解から保護され、この核タンパク質が、先天性免疫のための受容体ＴＬＲ３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９を同時に活性化する、前記核タンパク質。
【請求項2】
前記タンパク質が、好ましくはＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、パピローマウイルス、デング熱、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、及びコロナウイルスのカプシドから、組み換えデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）経路によって得られたウイルス起源のカプシドである、請求項１に記載の核タンパク質。
【請求項3】
前記ウイルス起源のカプシドが、配列番号１で特定されるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の核タンパク質。
【請求項4】
前記ＲＮＡが、２０％質量／質量超の前記ＲＮＡ含有量を維持する、外来性ＲＮＡ、ワクチン抗原として使用されるメッセンジャーＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、または別のＲＮＡタイプ化合物であり得る、請求項１に記載の核タンパク質。
【請求項5】
抗感染応答、抗腫瘍応答、または抗アレルギー応答を促進する医薬の製造のための、請求項１～４のいずれか１項に記載の核タンパク質の使用。
【請求項6】
前記医薬が抗ウイルスタイプの抗感染応答を促進する、請求項５に記載の使用。
【請求項7】
前記抗ウイルスタイプの応答が、急性ウイルス感染、再発性ウイルス感染、または慢性ウイルス感染の治療において使用される、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
前記ウイルス感染が、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマウイルス、デング熱ウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びコロナウイルスによって生じる、請求項７に記載の使用。
【請求項9】
前記コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ２と呼ばれるウイルスである、請求項８に記載の使用。
【請求項10】
前記医薬が、腫瘍疾患の患者の先天性免疫の活性化によって抗腫瘍応答を促進する、請求項６に記載の使用。
【請求項11】
前記医薬が、粘膜経路、非経口経路、及び／または腫瘍内経路によって、単剤療法として、または併用療法の一部分として投与される、請求項１０に記載の使用。
【請求項12】
感染性またはアレルギー性のプロセスの予防または治療における先天性免疫の活性化及び訓練のための医薬の製造のための、請求項１～４のいずれか１項に記載の核タンパク質の使用。
【請求項13】
前記医薬が、急性及び再発性の呼吸器ウイルス感染の予防または治療において使用される、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
前記医薬が、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルスによって生成された感染の予防または治療において使用される、請求項１３に記載の使用。
【請求項15】
前記コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ２と呼ばれるウイルスである、請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
前記医薬が、胃腸ウイルス感染、泌尿生殖器ウイルス感染、及び全身性ウイルス感染の予防または治療において使用される、請求項１２に記載の使用。
【請求項17】
前記医薬が、デング熱ウイルス、ジカウイルス、黄熱ウイルス、及び媒介生物によって伝達される他のウイルス感染によって生成された感染の予防または治療において使用される、請求項１６に記載の使用。
【請求項18】
インビボ及びインビトロの腫瘍の治療の間に、腫瘍細胞における及び腫瘍免疫環境における修飾を誘導するための医薬の製造のための、請求項１～４のいずれか１項に記載の核タンパク質の使用。
【請求項19】
請求項１～４のいずれか１項に記載の核タンパク質の使用であって、前記核タンパク質が同じ治療の過程で他の医薬と同時にまたは逐次的に投与される場合の、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、または感染性疾患の治療のための医薬の製造のための、前記使用。
【請求項20】
予防的及び治療的なワクチン接種戦略において使用されるワクチン抗原のアジュバントまたは担体の製造のための、請求項１～４のいずれか１項に記載の核タンパク質の使用。
【請求項21】
請求項１～４のいずれか１項に記載の核タンパク質及び薬学的に許容される希釈物質または賦形剤を含む、医薬製剤。
【請求項22】
ウイルス起源の少なくとも１つのタンパク質を追加で含み、このタンパク質が同じかまたは別のウイルスからであり得る、請求項２１に記載の製剤。
【請求項23】
ウイルス起源の前記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルスの表面上の抗原である、請求項２２に記載の製剤。
【請求項24】
粘膜投与のための粘膜接着物質（好ましくはカルボキシビニルポリマー及びセルロース誘導体の群からの）を追加で含む、請求項２１に記載の製剤。
【請求項25】
前記核タンパク質中に存在する前記タンパク質が、ペプチドまたはウイルス起源の他の抗原へコンジュゲートされる、請求項２１に記載の製剤。
【請求項26】
先天性免疫受容体アゴニストを追加で含む、請求項２１に記載の製剤。
【請求項27】
前記先天性免疫アゴニストが、ＴＬＲのアゴニスト、ＣｐＧ領域リッチの配列、ＲＩＧ－Ｉのアゴニスト効果の有る化合物（ｃ－ジＡＭＰ）、ＭＤ５－Ａ、または他の病原体関連分子パターン検出系のアゴニストである、請求項２６に記載の製剤。
【請求項28】
合成起源の核酸の複合体及び／またはヌクレオチド化合物（メッセンジャーＲＮＡ、ＤＮＡワクチン、ミニ遺伝子、または前記核タンパク質と会合するヌクレオチド性質の他の構造等）を追加で含む、請求項２１に記載の製剤。
【請求項29】
固形腫瘍の免疫療法において使用される化合物を追加で含む、請求項２１に記載の製剤。
【請求項30】
前記固形腫瘍の免疫療法において使用される化合物が、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）である、請求項２９に記載の製剤。
【請求項31】
鼻腔内、舌下、腫瘍内、静脈内、及び／または動脈化学塞栓によって投与可能な、請求項２１に記載の製剤。
【請求項32】
前記動脈化学塞栓が、固形腫瘍の患者へ、好ましくは肝腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、頭頸部腫瘍、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳房の腫瘍、胃腫瘍、及び膵臓腫瘍の患者へ適用される、請求項３１に記載の製剤。
【請求項33】
請求項２１～２７のいずれか１項に記載の製剤、粘膜投与のためにデザインされた粘膜付着性化合物、及びスプレータイプのデバイスを含む、粘膜投与のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬の分野に関し、具体的には先天性免疫系の免疫修飾剤及び活性化物質の分野、ならびに感染性アレルギー性疾患及びがんの予防及び治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
先天性免疫系は生物体のための最初の防衛線である。先天性免疫は、感染への物理学的及び化学的なバリア、ならびに微生物の広域スペクトラムパターンの認識に寄与する一群の細胞タイプを含む。抗ウイルス防御における初期ステージのうちの１つは、例えば先天性免疫系の細胞（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び樹状細胞等）の刺激を包含する。免疫応答を特徴づける基本原理は、適応免疫系のＴ細胞応答の誘導のための必須の前提条件としての先天性免疫系の関与である（Ｉｗａｓａｋｉ Ａ ａｎｄ Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５；１６：３４３－５３）。
【0003】
適応免疫（それは先天性免疫応答に続くものである）は、微生物抗原の特異的認識を介して侵入する病原体を排除し、免疫記憶を確立する。しかしながら、Ｔ細胞の抗原特異的機能は、先天性免疫系の細胞無しでは発生し得ない（Ｒｏｔｈｌｉｎ ＣＶ ａｎｄ Ｇｈｏｓｈ Ｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．２０２０ Ａｐｒ；８（１）．Ｐｉｉ：ｅ０００６９５）。
【0004】
感染性疾患の分野において、対象が先天性免疫応答を生成する能力は、対象間で変動し得る。これらの差異は、感染が任意のもしくは少なくとも実質的な症状無しに解消するかどうか、または対象が感染及びその無数の随伴症状を経験するかどうかを決定し得る。
【0005】
先天性免疫系と関連する複数の受容体は公知であり、その刺激が、抗ウイルス効果の有るサイトカイン応答のパターンを生成する。気道と関連する大部分の細胞において発現される、トール様受容体（ＴＬＲ）（特にＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８）；ならびにＲＩＧ－Ｉ及びＭＤＡ－５は、リボ核酸（ＲＮＡ）ウイルス（コロナウイルス、インフルエンザウイルス、及び呼吸器合胞体ウイルス等）を検出する。この検出は、サイトカイン及びインターフェロンの生成を導く事象のカスケードを生じる。感染の発生及び確立における先天性免疫の関連性、ならびにその発達は、気道に影響するウイルス（コロナウイルスが挙げられる）の複数の理解しにくいメカニズムの知識から確認される（Ｋｉｋｋｅｒｔ Ｍ．Ｊ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎ（２０２０）；１２：４－２０）。
【0006】
コロナウイルス（及び他のＲＮＡウイルス）は、先天性免疫系のこれらの受容体による当該ウイルスの検出に影響する複数の回避的な戦略を発達させ、これは、高齢者及び免疫系の弱体化した人々において強化される態様である。これらの群において、致死性はより高いレベルであり、免疫系の（特に先天性免疫系の）弱化の現象が観察される。高齢者の症例において、このことは、とりわけこれらの受容体によってウイルスを検出する能力の低減によって説明され、疾患のより高い罹患率／死亡率及びワクチンへの低い応答について説明する（Ｍｅｔｃａｌｆ ｅｔ ａｌ．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ（２０１５）１４：４２１－４３２）。
【0007】
様々な薬剤（カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、ウイルス及びそれらの構成要素、ならびにＴＬＲ及びサイトカインのアゴニスト等）は、「先天性免疫トレーニング」に関与する。この概念は、再発性細菌性の呼吸器及び尿生殖器の疾患の治療においても使用される（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｒａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０２０）；９：２９３６）。
【0008】
従来のワクチンが、再発性感染を引き起こす病原体（ヒトにおいて最もよくみられる感染である呼吸器及び尿路の感染症の原因であるもの等）について利用できない特定の条件において、先天性免疫の訓練に基づくワクチンの開発が、従来のワクチンを超える利点を示し得ると現在考えられている（Ｍｉｚｇｅｒｄ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｍｅｄ（２００６）；３：ｅ７６）。
【0009】
先天性免疫の刺激は、デング熱ウイルス感染の状況のウイルス感染の治療において成功裡に試験された。デング熱ウイルスによるｉｎ ｖｉｖｏ感染後のＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８の同時の活性化が、炎症経路及び体液性経路によって、抗ウイルスメカニズムを増加させ、ウイルス血症の減少及び感染したサルの臨床的改善をもたらすことが、感染させたアカゲザルモデルにおいて実証された（Ｓａｒｉｏｌ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２０１１）：６（４）：ｅ１９３２３）。これらの結果は、黄熱ウイルス及びベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスに感染した霊長動物のモデルを使用する研究における以前の知見を支持する（Ｓｔｅｐｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｆ Ｄｉｓ（１９７７）Ｖｏｌ １３６（１）：１２２－１２６；Ｓｔｅｐｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｆ Ｄｉｓ（１９７９）Ｖｏｌ １３９（３）：２６７－２７２）。
【0010】
ＴＬＲアゴニストとしては、リポタンパク質（ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、及びＴＬＲ６によって認識される）、二本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ３によって認識される）、リポポリサッカライド（ＴＬＲ４によって認識される）、フラジェリン（ＴＬＲ５によって認識される）、一本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ７及びＴＬＲ８によって認識される）、及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ、ＴＬＲ９によって認識される）が挙げられる（Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１０，１１：３７３－３８４）。ＴＬＲアゴニストは、腫瘍微小環境における先天性免疫応答を活性化し、それが腫瘍に対する適応免疫応答を刺激し得るために使用され得る。これらは、がん免疫療法においてますます使用されている。腫瘍微小環境（一般的に免疫抑制性）は、ＴＬＲアゴニストの適用を介して修飾されて、抗腫瘍免疫を回復させ得る（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ＆ Ｃｅｌｌ ２０１４，５：８９９－９１１）。
【0011】
ＴＬＲが病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を保持する粒子と相互作用し、二次メッセンジャーが活性化された場合に、ＴＬＲシグナリングが開始される。すべてのＴＬＲ（ＴＬＲ３を除いて）は、アダプタータンパク質ＭＹＤ８８と相互作用する。ＴＬＲ３アゴニストは、ＴＲＩＦ（ＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質誘導インターフェロン－β）依存性経路を誘発する。
【0012】
ＢＣＧは、主としてＴＬＲ２及びＴＬＲ４を刺激する生弱毒化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ調製物である。膀胱癌細胞におけるＴＬＲの刺激は、ＮＦ－κＢの核移行、ならびにＩＬ－１β、ＩＬ－６、及びＩＬ－８の産生を誘発する（Ａｙａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｕｒｏｌ ２０１１ １８５（５）：１９１５－ｔｗｅｎｔｙ－ｏｎｅ）。ＢＣＧ治療は、尿路上皮癌細胞において、ＭＨＣクラスII分子及び共刺激分子（ＣＤ８６及びＩＣＡＭ－１が挙げられる）の発現をそれぞれもたらす（Ｂｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２００４，９１：６０７－６１２）。ＢＣＧによる尿路上皮細胞癌腫の刺激は、細胞死を誘導し、分裂増殖及び運動性を低減した。より最近では、Ｙｕ及びその共同研究者らは、ＢＣＧがＴＬＲ７の活性化を直接介して尿路上皮癌における細胞アポトーシスを誘導する能力を主張した。ＢＣＧは、ＴＬＲ７の活性化及び関連するアポトーシス経路を介して尿路上皮癌細胞の細胞死を直接導くことができ（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．Ｋａｏｈｓｉｕｎｇ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２０１５，３１（８）：３９１－３９７）、ＢＣＧのＴＬＲマルチアゴニスト特性を証明する。
【0013】
ＢＣＧは、現在、筋層非浸潤性膀胱癌の再発及び進行を予防する、利用可能な治療である。この治療は、膀胱癌の免疫療法のためにＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）によって承認されたが、それは次善のものであり、より有効な免疫療法アプローチが必要である。
【0014】
インビトロ及びインビボの研究は、応答しない患者に代替オプションを見出すために現在遂行されている。膀胱癌の治療のためのＴＬＲアゴニストについての研究から有望な結果を示された（Ｏｈａｄｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１９，２６：ｅ１２８１８）。最近、ＴＬＲの発現の減少は、膀胱腫瘍において（特に筋層非浸潤性膀胱癌において）見出された。
【0015】
ＴＬＲは、病原体及び危険シグナル条件に応答して免疫系を活性化することだけでなく、抗腫瘍応答においても重要な役割を果たす。ヒト尿路上皮細胞は機能的ＴＬＲを発現し、ＴＬＲ２及びＴＬＲ３のアゴニストに応答する。筋層非浸潤性膀胱癌の治療においてＢＣＧを補完するポリ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３アゴニスト）の能力は知られており、したがってＢＣＧのこの非存在を補完する（Ａｙａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２０１６，６５（２）：２２３－３４）。ポリ（Ｉ：Ｃ）／ＢＣＧの組み合わせは、マウスモデルにおける腫瘍増殖の低減においてはるかにより有効であった。この結果は、マルチアゴニスト化合物におけるこの効果に集中することが、治療物質を進歩させ得ることを示唆する。現在のところ、このタイプの効果は、それが非常に稀であるので、または複数のＴＬＲと、主にＭＹＤ８８タンパク質に依存する経路及び依存しない経路においてそのシグナル伝達物質タンパク質が見出されるものとの同時活性化を誘導する能力を有する化合物は恐らくないので、アゴニストの組み合わせを介して調査される。
【0016】
ＴＬＲ３の発現は、肝細胞癌（ＨＣＣ）の分野における有益なマーカーであることが示されている。腫瘍ＴＬＲ３の発現の減少は、ＨＣＣ患者の腫瘍細胞分裂増殖、血管形成のアップレギュレーション及びアポトーシスの阻害、腫瘍進行、ならびに予後不良に関連することが見出された。複数の著者らは、ＴＬＲ３発現と、ＨＣＣの患者の全生存率または外科的切除後の無再発生存期間との関係性を実証した（Ｃｈｅｗ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｔ ２０１２，６１：４２７－４３８；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０１５，１５：２４５；Ｂｏｎｎｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０１９，Ｓ０１６８－８２７８（１９）：３０３５１－４）。Ｙｕａｎ及び共同研究者らによる関連の結果は、ＴＬＲ３活性化の効果に対する、ＨＣＣ細胞の分裂増殖の阻害、血管形成、及びアポトーシスの誘導に起因していた。これらのタンパク質の発現はＨＣＣの患者の全生存率と関連しており、分析は各々のアダプタータンパク質によって別々に遂行されて、がんの発生におけるＴＬＲ３役割の関連性を確認するものである。
【0017】
ＨＣＣの患者におけるＴＬＲ３のダウンレギュレーションは、予後不良と、及びＴＬＲ３が誘発したアポトーシスへの耐性と関連する。これは、免疫応答には関係なく、ＨＣＣ細胞のアポトーシスを防止し、腫瘍進行を促進する、当該細胞のための逃避メカニズムである。ＴＬＲ３は、ＴＬＲリガンドの使用に基づく治療法に好適な標的と判断される（Ｂｏｎｎｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０１９，Ｓ０１６８－８２７８（１９）：３０３５１－４）。
【0018】
その一方で、ＨＢｃＡｇ核タンパク質が宿主Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて異なる短縮の程度で産生される場合の、かかる核タンパク質中に含有されるＲＮＡの免疫修飾特性が、最近記載されている（Ｓｏｍｉｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３，８（９）：ｅ７５９３８）。当該技術分野における非常に関連する研究は、ＨＥＫ２９３Ｔレポーター細胞でのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のカプシドの核タンパク質の研究である。この研究はＴＬＲ３発現の刺激を除外したが、強いＴＬＲ２刺激を確認し（Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５，１７５（１０）：６２５３；著者の回答６２５３－５）、これは他の研究者によって以前に報告されている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９，１８２（１１）：６６７０－６６８１）。
【0019】
ＴＬＲアゴニストは、免疫系へのサプレッサー細胞の機能を阻害する（Ｆｒｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１７，１４：７１７－７３４）。制御性Ｔ細胞は、腫瘍関連免疫抑制に寄与する恒常性の維持において必須の役割を果たし、腫瘍中の制御性Ｔ細胞の存在から予後不良が予測される（Ｂｏｕｒｑｕｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｓ ２０１９，２：１０４１９２中で概説される）。この効果は、ＩＬ６の分泌を介して樹状細胞によって媒介される。ＴＬＲの活性化は、制御性Ｔ細胞の機能に影響するだけでなく、腫瘍へのそれらの動員も阻害する。
【0020】
したがって、がん、アレルギー、及び感染性疾患における適用のために、先天性免疫の受容体上でマルチアゴニスト効果を発揮する新しい実体を得ることは、依然として関心がもたれる。
【発明の概要】
【0021】
本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）及びウイルス起原のタンパク質を含有する核タンパク質であって、ＲＮＡ含有量が２０％質量／質量超であり、ＲＮＡがウイルス様構造内で分解から保護され、この核タンパク質が、先天性免疫受容体ＴＬＲ３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９を同時に活性化する、前記核タンパク質の提供によって、前述の問題を解決する。
【0022】
本発明の核タンパク質は、先天性免疫の様々な受容体上でマルチアゴニスト効果を生成すること、ＭＹＤ８８アダプタータンパク質（ＴＬＲ２、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９の受容体）、ならびにＴＲＩＦ及びＩＲＦ３（ＴＬＲ３受容体）を介してシグナル伝達を同時に活性化することが可能である。この知見の関連性は、両方の経路を同時に活性化するＴＬＲリガンドの組み合わせが、先天性免疫の活性化及びもたらされるＴ応答の質に対する相乗効果を有することを示す以前の報告から認識され得る（Ｂａｇｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７，１７８：１１６４－１１７１；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ．２００８；１０５（４２）：１６２６０－１６２６５；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１０；１２０（２）：６０７－６１６）。
【0023】
本発明の一実施形態において、核タンパク質中で、タンパク質は、組み換えＤＮＡ技術によって得られたウイルス起原のカプシド、好ましくはＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、デング熱ウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びコロナウイルスのカプシドである。２０％超のＲＮＡ対タンパク質の比が、産生プロセスの一部分として当該タンパク質に付随するように、これらのタンパク質は修飾され得る。
【0024】
好ましい実施形態において、核タンパク質中に存在するタンパク質は、初期配列から修飾されており、１８５アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。ウイルス起原のこのカプシドのアミノ酸配列は、配列番号１として配列表中で同定される。
【0025】
ＲＮＡ含有量が核タンパク質中で２０％質量／質量超で維持される限り、ＲＮＡは、外来性ＲＮＡ、ワクチン抗原として使用されるメッセンジャーＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、または別のＲＮＡ様化合物であり得る。
【0026】
別の態様において、本発明は、ＲＮＡ及びウイルス起原のタンパク質を含む核タンパク質であって、ＲＮＡ含有量が２０％質量／質量超であり、ＲＮＡがウイルス様構造内で分解から保護される、前記核タンパク質を、抗感染、抗腫瘍、または抗アレルギーの応答を促進する医薬の製造のために使用することを示す。これは、ＭＹＤ８８の依存性経路及び非依存性経路の同時刺激の結果として、抗原提示能力、共刺激分子の増加、炎症促進性メディエーター、及びプロアポトーシス経路の増強を介して起こって、これらのプロセスの制御、予防、及び回復に好都合な先天性免疫応答の増加を容易にする。
【0027】
特定の実施形態において、本発明の核タンパク質により製造された医薬は、抗ウイルスタイプの抗感染応答を促進する。これはインターフェロンの刺激に起因し、治療的及び予防的な状況に、特に血液及び／または粘膜におけるウイルスの持続されたレベルにより起こる慢性疾患、そして急性感染及び再発性感染、実際はＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマウイルス、デング熱ウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びコロナウイルスによって引き起こされるがこれらに限定されないウイルス感染の症例の治療において、適用される。好ましい実施形態において、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２と呼ばれるウイルスである。
【0028】
別の特定の実施形態において、本発明の核タンパク質により製造された医薬は、腫瘍疾患の患者の先天性免疫の活性化によって、抗腫瘍応答を促進する。本発明の核タンパク質の目的は、単剤療法で、または確立している治療法への補完物として、粘膜投与もしくは非経口投与を介して、及び／またはその腫瘍内投与を介して、腫瘍疾患の患者の先天性免疫を活性化することである。
【0029】
別の態様において、感染性またはアレルギー性のプロセスの予防または治療における先天性免疫の活性化及び訓練のための医薬の製造のための本発明の核タンパク質の使用が開示される。本発明の一実施形態において、医薬は、急性及び再発性の呼吸器ウイルス感染の予防または治療において使用されるが、その理由は、当該医薬が悪化を予防するか、または臨床症状の消失を容易にし、より迅速な回復相を可能にするからである。特定の実施形態において、医薬は、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びライノウイルスによって生じた感染の予防または治療において使用される。好ましい実施形態において、本発明の核タンパク質により予防または治療されるコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２と呼ばれるウイルスである。
【0030】
本発明の別の実施形態において、医薬は、胃腸ウイルス感染、泌尿生殖器ウイルス感染、及び全身性ウイルス感染の予防または治療において使用される。特に、本発明の核タンパク質により得られる医薬は、デング熱ウイルス、ジカウイルス、黄熱ウイルスによって引き起こされる感染、及びベクターによって伝達される他のウイルス感染の予防または治療において使用される。
【0031】
先天性免疫系の複数の受容体の同時刺激の特性に起因して、本発明の核タンパク質は、インビボ及びインビトロの腫瘍の治療の間に、腫瘍細胞における及び腫瘍免疫環境における修飾を誘導するための医薬の製造においても有用である。
【0032】
組成物が同じ治療の過程で他の医薬と同時にまたは逐次的に投与される場合の、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、または感染性疾患の治療のための医薬の製造のための前述の核タンパク質の使用も、本発明の目的である。
【0033】
別の態様において、本発明は、予防的または治療的なワクチン接種戦略において使用されるワクチン抗原のアジュバントまたは担体の製造のための核タンパク質の使用を企図する。ワクチン学の分野において、本発明の核タンパク質の目的物は、その性質によって、ワクチンの状況において先天性免疫を活性化及び／または訓練し得る。
【0034】
本発明は、
１）ＲＮＡ及びウイルス起原のタンパク質から構成される核タンパク質であって、ＲＮＡ含有量が２０％質量／質量超であり、これがウイルス様構造中で分解から保護される、前記核タンパク質、及び
２）薬学的に許容される希釈物質または賦形剤
を含む医薬製剤も示す。本発明の一実施形態において、医薬製剤は、ウイルス起原の少なくとも１つのタンパク質を追加で含み、かかるタンパク質は同じかまたは別のウイルスからであり得る。好ましい実施形態において、医薬製剤の一部分であるウイルス起原のタンパク質は、ＨＢＶ表面抗原である。
１）ＲＮＡ及びウイルス起原のタンパク質から構成される核タンパク質であって、ＲＮＡ含有量が２０％質量／質量超であり、これがウイルス様構造中で分解から保護される、前記核タンパク質、及び
２）薬学的に許容される希釈物質または賦形剤
を含む医薬製剤も示す。本発明の一実施形態において、医薬製剤は、ウイルス起原の少なくとも１つのタンパク質を追加で含み、かかるタンパク質は同じかまたは別のウイルスからであり得る。好ましい実施形態において、医薬製剤の一部分であるウイルス起原のタンパク質は、ＨＢＶ表面抗原である。
【0035】
本発明の別の実施形態において、製剤は、粘膜投与のための粘膜接着物質（好ましくはカルボキシビニルポリマー及びセルロース誘導体の群からの）を追加で含む。製剤において、核タンパク質中に存在するタンパク質がペプチドまたはウイルス起原の他の抗原へコンジュゲートされることも可能である。
【0036】
別の実施形態において、製剤は、先天性免疫受容体アゴニストをさらに含む。特定の実施形態において、先天性免疫のアゴニストは、ＴＬＲのアゴニスト、ＣｐＧ領域リッチの配列、ＲＩＧ－Ｉのアゴニスト効果の有る化合物（ｃ－ジ－ＡＭＰ）、ＭＤ５－Ａ、または病原体と関連する分子パターンの他の検出系のアゴニストである。
【0037】
別の実施形態において、本発明の核タンパク質を含む製剤は、合成起原の核酸の複合体及び／またはヌクレオチド化合物（メッセンジャーＲＮＡ、ＤＮＡワクチン、ミニ遺伝子、または核タンパク質と会合するヌクレオチド性質の他の構造等）を追加で含む。
【0038】
別の態様において、本発明の核タンパク質を含む製剤は、固形腫瘍の免疫療法において使用される化合物を追加で含む。本発明の一実施形態において、固形腫瘍免疫療法において使用される化合物は、ＢＣＧである。ＢＣＧとの併用の事例において、共投与は確立されている一方で、ソラフェニブとの併用治療において、核タンパク質による治療法は、ソラフェニブによる２～８週間の治療後に確立される。
【0039】
本発明において、核タンパク質を含む製剤は、非経口、鼻腔内、腫瘍内、舌下、静脈内で、及び／または動脈化学塞栓によって投与され得る。後者の事例において、この経路は、固形腫瘍の患者において、好ましくは肝腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、頭頸部腫瘍、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳房の腫瘍、胃腫瘍、及び膵臓腫瘍の患者において使用される。
【0040】
本発明は、核タンパク質製剤、粘膜付着性化合物、及び粘膜経路によるこの製品の投与のためにデザインされた噴霧デバイスを含む、粘膜投与のためのキットをさらに開示する。かかるキットにおいて、核タンパク質製剤を含む第１のバイアル、粘膜接着物質を含有している第２のバイアル、ならびにあるレベルの粘膜接着及び粘度の有る製品の鼻腔内経路及び舌下粘膜経路を介する生物分散を保証する噴霧デバイスがある。
【0041】
好ましい実施形態において、本発明の核タンパク質は、先天性免疫受容体（ＴＬＲ等）の刺激または調節によってＨＣＣ及び他の固形腫瘍を治療するために使用される。腫瘍の中への本発明の核タンパク質の投与は、腫瘍内注射もしくは静脈注射によって、または動脈化学塞栓によって、腫瘍細胞を攻撃するようにデザインされたワクチンと同時にまたは連続的に実行され得る。核タンパク質は腫瘍細胞及びプロフェッショナル抗原提示細胞によって取り上げられ、腫瘍細胞及びプロフェッショナル抗原提示細胞におけるＭＨＣ分子中でのヌクレオカプシドのタンパク質構成要素に由来するペプチドの提示を導く。したがって、核タンパク質は、核タンパク質のタンパク質構成要素への適応免疫応答を誘導するようにデザインされた治療ワクチンと同時にまたは連続的に適用され得る。本発明の核タンパク質中のＲＮＡのレベルの増加は、ＴＬＲ３下のシグナリング経路を活性化し、以前に記載されたＨＢＶのカプシド由来核タンパク質調製物（この効果を示すことができない）に比較して、この特性は固有である（Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５，１７５（１０）：６２５３；著者の応答６２５３－５）。
【0042】
同様に、本発明の核タンパク質及び本出願によってカバーされる他のものにおける核酸対タンパク質の比は、ＴＬＲ７遺伝子の発現及び対応するシグナリング経路（ＭＹＤ８８）を刺激する。核タンパク質の免疫刺激特性それ自体を活用することに加えて、本発明は、治療ワクチンの同時のまたは逐次的な投与と併用した核タンパク質の腫瘍内の適用を特にカバーする。この治療ワクチンは、腫瘍抗原またはヌクレオカプシドの誘導体について特異的なＴ細胞の活性化を誘導するために、鼻腔内の皮下または非経口のヌクレオカプシドの適用からなり得るがこれらに限定されない。
【0043】
腫瘍細胞そして腫瘍微小環境における抗原提示細胞のインサイチューの刺激は、炎症促進性サイトカインの分泌を誘導する。これらのサイトカインはエフェクター細胞（すなわち細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）を活性化し、したがってそれらの抗腫瘍活性を促進する。同時に、ＩＬ６を含むこれらのサイトカインは、Ｔｒｅｇｓ細胞及び骨髄性系統を由来するサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の免疫抑制機能を負に調節する。
【0044】
ＨＬＡクラスＩ及びＩＩの発現の増加は、共刺激シグナリング分子と一緒に、腫瘍特異的ペプチドについて特異的であり且つ核タンパク質のタンパク質構成要素に由来する適応免疫細胞による腫瘍細胞の認識を促進する。当該適応免疫細胞は核タンパク質によるワクチン接種によって誘導され、腫瘍特異的抗原を認識するＴ細胞の誘導を刺激する。抗原特異的適応免疫細胞の復帰は、局所的なケモカイン分泌によって刺激される。肝細胞は、粘膜にもユニークなインテグリンを発現する。したがって、粘膜（すなわち鼻腔内）を介する免疫は、肝臓中のワクチン誘導性Ｔ細胞の局在化を促進し、それは、腫瘍内経路によって投与される同じ抗原を含む専用ワクチンの鼻腔内適用を介して、ＨＣＣの標的化に役立つ。
【0045】
本発明は、ＨＣＣに関連しないがんの治療のための核タンパク質の適用をカバーする。複数のＴＬＲは、多くの腫瘍実質細胞によって発現されることが報告されている。ＴＬＲ２及びＴＬＲ３の刺激は、直接的な抗腫瘍効果を惹起する一方で、ＴＬＲ４刺激は腫瘍増殖を改善し、したがって好都合ではないことが以前に示された（Ｋａｃｚａｎｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ２０１３，９３（６）：８４７－６３によって概説される）。複数のＴＬＲアゴニストとしてのＢＣＧに比較して、本発明の核タンパク質によるインキュベーション後に示されるＴＬＲ３及びＴＬＲ２の最も強力な刺激は、好都合である。ＢＣＧはその製剤中に含有されるＬＰＳに起因してＴＬＲ４を刺激するが、本発明の核タンパク質は最小量のＬＰＳを含有し、したがってＴＬＲ４シグナリングに対して最小効果を有する。しかしながら、本発明の実施形態は、ＢＣＧの効果を補完するＴＬＲ３の誘導の増加を増進するための、ＢＣＧと組み合わせた核タンパク質の使用をカバーする。
【図面の簡単な説明】
【0046】
【図1】最適化したＨＢＶカプシド核タンパク質の異なる濃度により２４時間及び４８時間インキュベーションしたＨｅｐａＲＧ細胞における、ＴＬＲ遺伝子発現の刺激。遺伝子Ａ）ＴＬＲ２；Ｂ）ＴＬＲ３；Ｃ）ＴＬＲ７；Ｄ）ＴＬＲ８；Ｅ）ＴＬＲ９の発現の刺激。すべての比較は非刺激対照を参照し、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差（＊）；ｐ＜０．０１は非常に有意な差（＊＊）；Ｐ＜０．００１は高度に有意な差（＊＊＊）と判断された。
【図2】最適化したＨＢＶカプシド核タンパク質の異なる濃度により２４時間及び４８時間インキュベーションしたＨｅｐａＲＧ細胞における、ＴＬＲシグナル伝達因子またはアダプタータンパク質の遺伝子発現の刺激。遺伝子Ａ）ＭＹＤ８８；Ｂ）ＮＦｋｂ；Ｃ）ＴＲＩＦ；Ｄ）ＩＲＦ３の発現の刺激。すべての比較は非刺激対照を参照し、ｐ＜０．０５、統計的に有意な差（＊）；ｐ＜０．０１、非常に有意な差（＊＊）；Ｐ＜０．００１、高度に有意な差（＊＊＊）である。
【図3】Ａ）ＨＢＶカプシドからのＮＰ－Ｏの異なる濃度により２４時間及び４８時間インキュベーションしたＨｅｐａＲＧ細胞における、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子発現の刺激。Ｂ）ＧｕｓＢ発現のパーセンテージを参照した、ＨＬＡ Ａ遺伝子の発現。ＨＬＡ－Ａ遺伝子発現の基底レベルは通常は高いＧｕｓＢ発現レベルに類似していた。すべての比較は非刺激対照を参照し、ｐ＜０．０５、統計的に有意な差（＊）；ｐ＜０．０１、非常に有意な差（＊＊）；Ｐ＜０．００１、高度に有意な差（＊＊＊）である。
【図4】ＨＢＶカプシドからのＮＰ－Ｏの異なる濃度により２４時間及び４８時間インキュベーションしたＨｅｐａＲＧ細胞における、ＭＨＣクラスII遺伝子発現の刺激。Ａ）２つのインキュベーション時間におけるＨＬＡ ＤＲＢ１遺伝子発現の刺激。Ｂ）ＤＲＢ１のＧｕｓＢ発現のパーセンテージであり、ＤＲＢ１遺伝子の発現の誘導レベルは、通常は高いＧｕｓＢ発現の４０％近くに到達する。Ｃ）ＮＰ－Ｏによる４８時間のインキュベーション後の、３つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（ＤＰＢ１、ＤＱＢ１、及びＤＲＢ１）の刺激。すべての比較は非刺激対照を参照し、ｐ＜０．０５、統計的に有意な差（＊）；ｐ＜０．０１、非常に有意な差（＊＊）；Ｐ＜０．００１、高度に有意な差（＊＊＊）である。
【図5】ＨＢＶカプシドからのＮＰ－Ｏの異なる濃度により２４時間及び４８時間インキュベーションしたＨｅｐａＲＧ細胞における、Ｂａｘ及びｂｃｌ－２遺伝子の遺伝子発現の刺激。グラフＡ及びＢ中で、ＢＡＸ及びＢＣＬ２の遺伝子発現の刺激はそれぞれ、アポトーシスに関連する遺伝子として示される。グラフＣは、ＨｅｐａＲＧ細胞におけるＮＰ－Ｏのアポトーシス効果を遺伝子発現のレベルで特徴づけるために、その関連性に起因して研究されたＢＡＸ対ＢＣＬ２の関係性を示す。すべての比較は非刺激対照を参照し、ｐ＜０．０５、統計的に有意な差（＊）；ｐ＜０．０１、非常に有意な差（＊＊）；Ｐ＜０．００１、高度に有意な差（＊＊＊）である。
【図6】ＨＢＶカプシドからのＮＰ－Ｏの異なる濃度により２４時間及び４８時間インキュベーションしたＨｅｐａＲＧ細胞における、ＩＬ６遺伝子の遺伝子発現の刺激。グラフＡ中で、ＩＬ６遺伝子発現の刺激が示され、グラフＢは、参照遺伝子としてＧｕｓＢ遺伝子を使用する、発現の相対レベルを示す。すべての非刺激対照細胞は、研究された条件下で検出不可能なレベルの遺伝子発現を生じた。０．１％の値を任意に定義して、遺伝子発現の刺激を分析した。すべての比較は非刺激対照を参照し、ｐ＜０．０５、統計的に有意な差（＊）；ｐ＜０．０１、非常に有意な差（＊＊）；Ｐ＜０．００１、高度に有意な差（＊＊＊）である。
【図7】ＨＢＶカプシドからのＮＰ－Ｏの異なる濃度により２４時間及び４８時間インキュベーションしたＨｅｐａＲＧ細胞における、Ａ）ＩＦＮα遺伝子及びＢ）ＩＦＮβ遺伝子の遺伝子発現の刺激。刺激は非常に穏やかなものであったが、培養約１０時間後にこの効果がこの細胞株において検証される場合でさえ、特異的条件下で統計的有意差に達した。すべての比較は非刺激対照を参照し、ｐ＜０．０５、統計的に有意な差（＊）；ｐ＜０．０１、非常に有意な差（＊＊）；Ｐ＜０．００１、高度に有意な差（＊＊＊）である。
【図8】ＨｅｐａＲＧ細胞株における関心のある遺伝子の発現についてのＨＢＶカプシドのＮＰ－Ｏ誘導刺激に対するウイルス感染（ＨＢＶによる）の効果。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＮＰ－Ｏの増加用量（１０μｇ／ｍｌまで）により４８時間インキュベーションした。２つのＴＬＲ遺伝子をＭＹＤ８８依存性刺激因子及び非依存性刺激因子（それぞれＴＬＲ２及びＴＬＲ３）として選択し、抗原提示（ＤＲＢ１）及びサイトカイン機能（ＩＬ６）に関連する２つの追加の遺伝子を選択した。すべての比較は非刺激対照を参照し、ｐ＜０．０５、統計的に有意な差（＊）；ｐ＜０．０１、非常に有意な差（＊＊）；Ｐ＜０．００１、高度に有意な差（＊＊＊）である。
【図9】ＨＢＶカプシドのＮＰ－Ｏ（１０μｇ／ｍＬ）、ポリ－ＩＣ、及びエンテカビルによりインキュベーションしたＨｅｐａＲＧ細胞における、遺伝子Ａ）ＴＬＲ２；Ｂ）ＴＬＲ３；Ｃ）ＩＬ６；Ｄ）ＨＬＡクラスＩＩ（ＤＲＢ１）の遺伝子発現の刺激。すべての比較は非刺激対照を参照し、ｐ＜０．０５、統計的に有意な差（＊）；ｐ＜０．０１、非常に有意な差（＊＊）；Ｐ＜０．００１、高度に有意な差（＊＊＊）である。
【図10】ＨＢＶ複製に対する先天性免疫刺激の効果。最適化したＨＢＶカプシド核タンパク質を使用する、インビトロの刺激によって有意に誘導された先天性免疫応答メカニズムの活性化は、感染したＨｅｐａＲＧ細胞培養物上清中のＨＢＶの濃度を低減した。この効果は、エンテカビルについて見出されたもののレベルであった。
【図11】ＨＢＶカプシドのＮＰ－Ｏを含有している製剤により治療された患者におけるＴＬＲ３、７、及び８受容体（ＲＮＡウイルス受容体）の遺伝子発現（ＥＧ）に対する促進作用の有る患者の頻度。Ａ）ＴＬＲ３、７、及び８のＧＡを刺激する患者の頻度。Ｂ）ＴＬＲ３、７、及び８のＧＡの強力な刺激の有る患者。治療スキーム：３回の鼻腔内投与、毎週の頻度（０、７、及び１４日目）及び舌下を経由する１４回の投与。統計比較：
【実施例】
【0047】
実施例１。最適化した核タンパク質（ＮＰ－Ｏ）の核酸組成物の特徴評価。
核酸シーケンシングをｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑシーケンシング技術を使用して実行した。ウイルス様粒子としてその分子的安定性及び物理的構造を最大化するように最適化したタンパク質のバッチＡ～Ｄを選択した。追加で、ＲＮＡ様核酸を会合する能力の低い他の核タンパク質を研究に入れた。タンパク質単位あたり減少した量のＲＮＡの短縮バリアントの群、そしてバッチＡ～Ｄにおいて得られたものよりも低いレベルでのＲＮＡ／タンパク質比を含有する４つの核タンパク質バリアントを、研究へ追加した。
核酸シーケンシングをｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑシーケンシング技術を使用して実行した。ウイルス様粒子としてその分子的安定性及び物理的構造を最大化するように最適化したタンパク質のバッチＡ～Ｄを選択した。追加で、ＲＮＡ様核酸を会合する能力の低い他の核タンパク質を研究に入れた。タンパク質単位あたり減少した量のＲＮＡの短縮バリアントの群、そしてバッチＡ～Ｄにおいて得られたものよりも低いレベルでのＲＮＡ／タンパク質比を含有する４つの核タンパク質バリアントを、研究へ追加した。
【0048】
全ＲＮＡサンプルを超音波により断片化した（４℃で３０秒の２回のパルス）。第１ストランド相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）合成を、Ｎ６のランダム化プライマーによりプライミングした。次いでｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑシーケンシングアダプターをｃＤＮＡの５’末端及び３’末端へライゲーションした。最終的にこれを、試験用読み取り酵素を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ｃＤＮＡプールをＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００システムでシーケンスし、読み取り長は１００ｂｐであった。
【0049】
最適化した核タンパク質において見出されたＲＮＡ／タンパク質比は（表１）、研究された他の核タンパク質（バリアントＥ～Ｊ、表２）と比較して、そして、従来技術の水準において報告された他のバリアント（Ｒｉｅｄｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２，１６８（１０）：４９５１－４９５９）に対して、タンパク質単位あたりのＲＮＡ含有量で比較的高かった。バッチＡ～Ｄのタンパク質安定化プロセスにより、タンパク質の質量あたりの高レベルのＲＮＡ（＞２０％のＲＮＡ／タンパク質、質量：質量）の取り込みが可能になった（表１）。
【0050】
従来技術の水準の他の核タンパク質及び短縮バリアントと比較して、高レベルのＲＮＡを取り入れるかまたは会合するという予想外の特性から、この新しい化合物（タンパク質単位あたりのＲＮＡの高い比があると判断される修飾または最適化した新しい核タンパク質（ＮＰ－Ｏ））についての生物学的特性の探索への扉が開かれる。１８５アミノ酸の非短縮バリアントが、ウイルス様構造としての安定性についての探索において、１００マイクログラムのタンパク質あたり２０マイクログラム（２０％質量／質量）を越えるＲＮＡレベルを取り入れるという、能力の増加を呈したので、この知見は完全に偶然であった。このタイプの非短縮核タンパク質を用いて取り組んだ他の著者らは、およそ１％のものを報告し、それを微量レベルであると判断し、たとえそうであっても、関連態様は免疫学的視点から検証された（Ｒｉｅｄｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２，１６８（１０）：４９５１－４９５９）。
【0051】
核タンパク質の全ＲＮＡ中のｍＲＮＡの比率に関連する免疫学的性質は、以前に記載されていた（欧州特許出願公開第３４３７６５４（Ａ１）号；特許出願ＰＣＴ／ＣＵ２０１７／０５０００１号）。しかしながら、本事例において、より高いＲＮＡ－タンパク質比（それは他の核タンパク質において現在見出されたレベルを越える）があるので、定量的要素によって以前に記載されたタンパク質とは異なる。得られた結果は、報告されたものと矛盾しない。
【表1】
【表2】
【0052】
実施例２。バッチＡ－Ｊからの修飾／最適化した核タンパク質（ＮＰ－Ｏ）へ対応するタンパク質のアミノ酸配列の決定。
ＭＡＬＤＩ－ＭＳ測定をＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。５ｐＭｏｌを含有するペプチド溶液を、０．１％のＴＦＡ（ｖ：ｖ）を含有する５０％のアセトニトリル／水中の７．５ｍｇ／ｍＬのＣＨＣＡ（α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）からなるマトリックス溶液と混合した。この混合物を、平面のステンレス鋼表面を提供するプレート上での空気暴露によって乾燥し、全質量試験は、４００～４０００のＴｈのｍ／ｚ範囲についてポジティブモードで捕捉した。ＦＴ質量分析器（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）を使用する質量の解像力は、６０’０００であった。１０のレーザーショットを各々の分析において使用し、各々は１４μＪのレーザーエネルギーであった。質量スペクトルをＸｃａｌｉｂｕｒ（商標）ｖ３．０．６３ソフトウェアを使用して処理した。
ＭＡＬＤＩ－ＭＳ測定をＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。５ｐＭｏｌを含有するペプチド溶液を、０．１％のＴＦＡ（ｖ：ｖ）を含有する５０％のアセトニトリル／水中の７．５ｍｇ／ｍＬのＣＨＣＡ（α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）からなるマトリックス溶液と混合した。この混合物を、平面のステンレス鋼表面を提供するプレート上での空気暴露によって乾燥し、全質量試験は、４００～４０００のＴｈのｍ／ｚ範囲についてポジティブモードで捕捉した。ＦＴ質量分析器（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）を使用する質量の解像力は、６０’０００であった。１０のレーザーショットを各々の分析において使用し、各々は１４μＪのレーザーエネルギーであった。質量スペクトルをＸｃａｌｉｂｕｒ（商標）ｖ３．０．６３ソフトウェアを使用して処理した。
【0053】
低エネルギースペクトルを、エレクトロスプレーイオン源（Ｚｓｐｒａｙ Ｎａｎｏｆｌｏｗ）へカップリングしたＷａｔｅｒｓ（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）ＱＴＯＦ－２質量分析計を使用して捕捉した。飛行時間型（ＴｏＦ）質量分析器を、広範な質量範囲（ｍ／ｚ ２００～２０００）にわたって、参照としてセシウム塩及びナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ））の混合物により較正した。ＥＳＩ－ＭＳスペクトルを、ｍ／ｚ ２００～２０００の範囲で得た。質量スペクトルの捕捉及び処理のプログラムは、ＭａｓｓＬｙｎｘ ４．１（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＵＫ，Ｌｔｄ．）であった。１５～４８ｅＶの衝突エネルギーを適用して、分析されるペプチドの構造解明のための十分な情報を含有する断片化を誘導することによって、ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳスペクトルを得た。
【0054】
表３は、ＮＰ－Ｏ（バッチＡ～Ｄ）の配列、そしてＲＮＡ／タンパク質比（質量／質量）の減少を示す各々の短縮バリアントについて２つのバッチの配列を示す。
【表3】
【0055】
実施例３。異なるウイルスからの修飾／最適化した核タンパク質（ＮＰ－Ｏ）及び異なるＲＮＡ／タンパク質比を使用する、ＴＬＲ、及び先天性免疫と関連する他の遺伝子の刺激。
異なる核タンパク質により実行された遺伝子発現の刺激研究から、ＲＮＡ／タンパク質比（ＲＮＡ／タンパク質の質量：質量比）とＴＬＲタイプの先天性免疫受容体を活性化する能力との間の直接的な関係性が示された。
異なる核タンパク質により実行された遺伝子発現の刺激研究から、ＲＮＡ／タンパク質比（ＲＮＡ／タンパク質の質量：質量比）とＴＬＲタイプの先天性免疫受容体を活性化する能力との間の直接的な関係性が示された。
【0056】
試験された核タンパク質の中でＮＰ－Ｏの４つの異なるバッチがある（バッチＡ～Ｄ、実施例１において記載され、それは２０％超（２１～２６％）のＲＮＡ／タンパク質比を有する）。０．５～１５％のＲＮＡ／タンパク質の核タンパク質（Ｅ～Ｊバリアント）及び異なる研究室によって供与された異なるウイルス起源の他のＮＰバリアント（Ｋ～Ｎバリアント）は、減少したレベルのＲＮＡ／タンパク質であり、最適化／修飾したそれらのバリアントは、タンパク質に対して２０％超のパーセンテージのＲＮＡを含有する。
【0057】
表４中で示された結果によれば、２０％よりも低いＲＮＡ／タンパク質比を有する試験したＮＰのどれも、最適化したＮＰにおいて誘導されたレベルのＴＬＲ３受容体の促進作用を示さなかった。有意な効果は、抗原提示（ＤＲＢ１）、共刺激分子Ｂ７．１／Ｂ７．２（ＣＤ８０／ＣＤ８６）、及び１型インターフェロンに関連する他のタンパク質の、ＴＬＲ３シグナル伝達因子タンパク質（ＴＲＩＦ／ＩＲＦ３）における遺伝子発現に対しても観察されなかった。核タンパク質のＲＮＡレベルが２０％未満のＲＮＡ／タンパク質に低減した場合に、ＩＬ６遺伝子発現は有意に低減した（表４）。ＴＬＲ２遺伝子発現は、ＲＮＡ／タンパク質比の低減によって有意に影響を受けず、ＲＮＡ組成に関連しない経路によるこの受容体の活性化と矛盾しない。結果は、この核タンパク質に関する従来技術の水準において報告された知見、特に２０％未満のＲＮＡ／タンパク質比の核タンパク質におけるＴＬＲ３受容体の活性化がないとするものと矛盾しない。しかしながら、ＴＬＲ３受容体及びＴＲＩＦ依存性経路（＋ＩＲＦ３）の両方は、この受容体によって検出される刺激の伝達因子から刺激された。
【表4】
【0058】
すべての比較は非刺激対照を参照し、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差（＊）；ｐ＜０．０１は非常に有意な差（＊＊）；Ｐ＜０．００１は高度に有意な差（＊＊＊）と判断された。平均値及び統計比較結果を括弧中に示す。
【0059】
実施例４。ＨＢＶカプシドに基づくＮＰ－Ｏを使用する、ＴＬＲ受容体、それらの伝達因子タンパク質、ならびに抗原提示、アポトーシス、サイトカイン、及び１型インターフェロンと関連する他の遺伝子の刺激。
先天性免疫受容体の遺伝子発現に対するバッチＡ～Ｄからの最適化した核タンパク質の効果及びそれらの後続する効果の研究を、分化したＨｅｐａＲＧ細胞において遂行した。先天性免疫受容体の活性化物質としてのＮＰ－Ｏの品質を知るために、抗ウイルス効果、抗発がん効果、及び抗アレルギー効果に関連する遺伝子の群を研究した。関心のある他の遺伝子が、先天性免疫の受容体と一緒にインビトロで刺激されるかどうかを調べるために、異なる濃度でＮＰ－Ｏを使用する分化したＨｅｐａＲＧ株の肝細胞のインビトロの刺激を試験した。
先天性免疫受容体の遺伝子発現に対するバッチＡ～Ｄからの最適化した核タンパク質の効果及びそれらの後続する効果の研究を、分化したＨｅｐａＲＧ細胞において遂行した。先天性免疫受容体の活性化物質としてのＮＰ－Ｏの品質を知るために、抗ウイルス効果、抗発がん効果、及び抗アレルギー効果に関連する遺伝子の群を研究した。関心のある他の遺伝子が、先天性免疫の受容体と一緒にインビトロで刺激されるかどうかを調べるために、異なる濃度でＮＰ－Ｏを使用する分化したＨｅｐａＲＧ株の肝細胞のインビトロの刺激を試験した。
【0060】
ＥＪバッチからの最適化していないタンパク質を使用する本発明者の研究室の以前の試験は、ＴＬＲ３受容体、またはＴＲＩＦ及びＩＲＦ３を介するシグナリング経路の刺激を示さず、結果は、２０％未満のＲＮＡ／タンパク質比のＨＢＶカプシドの核タンパク質を使用した他の当業者の結果（Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５，１７５（１０）：６２５３；著者の回答６２５３－５）と一致した。
【0061】
本研究は、核タンパク質をバッチＡ～Ｄのこれらの研究のために区別なく使用して、ＨｅｐａＲＧ細胞がＮＰ－Ｏ核タンパク質の異なる濃度によりパルス処理された場合の、これらの細胞の遺伝子発現のインビトロの刺激に対するＮＰ－Ｏの効果を特徴づけることを目的とした。異なる濃度の核タンパク質を使用し（最大の１５μｇ／ｍＬのタンパク質）、２つの異なるインキュベーション時間（２４時間及び４８時間）を評価した。特に、本発明者らは、先天性免疫系の検出機構、特にＴＬＲ、核へのシグナルの伝達を確かにするそれらのアダプタータンパク質の活性化、アポトーシスに関連する細胞抗原性を増加させる遺伝子の活性化、炎症促進性効果、Ｔｈ１／Ｔｈ２、及び免疫「訓練」の誘導効果のマーカーサイトカインの発現、そしてこの細胞株を感染することができるウイルス（ＨＢＶ）のウイルス負荷を抑制する抗ウイルス能力のこの効果の具体的な実現を、妥当に明らかにすることを考慮する。特に、ウイルス複製を抑制し、同時に細胞抗原性に対する効果に関連するマーカーの群（サイトカインの産生）を活性化する、先天性免疫系のこのタイプの刺激の能力、そしてＭＹＤ８８に依存する遺伝子及び細胞の核へのそれらのシグナル伝達経路におけるアダプタータンパク質ＭＹＤ８８に依存しない遺伝子の活性化が、１週間を超えて先立って確立された刺激効果が感染プロセスの間に維持されるかどうか決定する。この事例において、感染性病原体は関連しないが、むしろ見出された抗ウイルス効果を担うのが先天性免疫応答の活性化であることを示すことを可能にするモデルである。
【0062】
抗原及び製剤
本発明の核タンパク質目的物は、本発明の例２において説明されたアミノ酸配列（バッチＡ～Ｄ）を含み、それは合計で１８５のアミノ酸を有し、２８～３２ナノメートルのサイズの類似するウイルス様タンパク質態様としてバクテリアＥ．ｃｏｌｉ中で自己集合する。その化学的性質の視点から、それは、タンパク質の質量／質量の単位あたり２０％を超えるＲＮＡ及びタンパク質の質量／質量の単位あたり２％未満のＤＮＡの割合の存在を特徴とする。
本発明の核タンパク質目的物は、本発明の例２において説明されたアミノ酸配列（バッチＡ～Ｄ）を含み、それは合計で１８５のアミノ酸を有し、２８～３２ナノメートルのサイズの類似するウイルス様タンパク質態様としてバクテリアＥ．ｃｏｌｉ中で自己集合する。その化学的性質の視点から、それは、タンパク質の質量／質量の単位あたり２０％を超えるＲＮＡ及びタンパク質の質量／質量の単位あたり２％未満のＤＮＡの割合の存在を特徴とする。
【0063】
ＨｅｐａＲＧ細胞株及びヒト初代肝細胞
研究室において一般的に使用される不死化肝細胞株のどれもＨＢＶ感染を支援しないので、ＨｅｐａＲＧ細胞株を選択した。これは、感染していないＨｅｐａＲＧ細胞、及びまたウイルスが感染した当該細胞（特に本発明者らはモデルとしてＨＢＶを使用する）における遺伝子発現の刺激の研究を可能にする。初代ヒト肝細胞は、長い間ＨＢＶの完全な複製周期の研究のための唯一の系であった。しかしながら、この限定は、ＨｅｐａＲＧと呼ばれるヒト肝細胞癌細胞株が見出された後に解消された。この培養された細胞株は、ＤＭＳＯ処理後に肝細胞及び胆汁細胞（ｂｉｌｅ ｃｅｌｌ）に類似する顆粒細胞へと分化する能力を有する肝臓前駆細胞（ＨＰＣ）として振る舞う（Ｇｒｉｐｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２，９９（２４）：１５６５５－１５６６０）。タウロコール酸ナトリウム共輸送体ポリペプチド（ＮＴＣＰ）（分化後にのみＨｅｐａＲＧ細胞中で発現される輸送体のうちの１つ）は、ＨＢＶについて特異的な受容体である（Ｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１４，１４６（４）：１０７０－１０８３）。
研究室において一般的に使用される不死化肝細胞株のどれもＨＢＶ感染を支援しないので、ＨｅｐａＲＧ細胞株を選択した。これは、感染していないＨｅｐａＲＧ細胞、及びまたウイルスが感染した当該細胞（特に本発明者らはモデルとしてＨＢＶを使用する）における遺伝子発現の刺激の研究を可能にする。初代ヒト肝細胞は、長い間ＨＢＶの完全な複製周期の研究のための唯一の系であった。しかしながら、この限定は、ＨｅｐａＲＧと呼ばれるヒト肝細胞癌細胞株が見出された後に解消された。この培養された細胞株は、ＤＭＳＯ処理後に肝細胞及び胆汁細胞（ｂｉｌｅ ｃｅｌｌ）に類似する顆粒細胞へと分化する能力を有する肝臓前駆細胞（ＨＰＣ）として振る舞う（Ｇｒｉｐｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２，９９（２４）：１５６５５－１５６６０）。タウロコール酸ナトリウム共輸送体ポリペプチド（ＮＴＣＰ）（分化後にのみＨｅｐａＲＧ細胞中で発現される輸送体のうちの１つ）は、ＨＢＶについて特異的な受容体である（Ｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１４，１４６（４）：１０７０－１０８３）。
【0064】
培養における細胞株の分化
細胞分化プロセスを、ルーチンの分化プロセスのために、以前に報告されたもの（Ｇｒｉｐｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２，９９（２４）：１５６５５－１５６６０）から適合させ、２ステップの手順を使用した。細胞を最初に増殖培地中で２週間維持した。次いで当該細胞を分化培地中でさらに２週間維持し、それは同じＷｉｌｌｉａｍ Ｅ培養培地であるが、１０％のＦＣＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５μｇ／ｍＬのインスリン、及びビヒクルとして２％のＤＭＳＯによる５×１０－５Ｍのヘミコハク酸ヒドロコルチゾンを補足したものであった。培地を２日または３日毎に更新した。
細胞分化プロセスを、ルーチンの分化プロセスのために、以前に報告されたもの（Ｇｒｉｐｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２，９９（２４）：１５６５５－１５６６０）から適合させ、２ステップの手順を使用した。細胞を最初に増殖培地中で２週間維持した。次いで当該細胞を分化培地中でさらに２週間維持し、それは同じＷｉｌｌｉａｍ Ｅ培養培地であるが、１０％のＦＣＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５μｇ／ｍＬのインスリン、及びビヒクルとして２％のＤＭＳＯによる５×１０－５Ｍのヘミコハク酸ヒドロコルチゾンを補足したものであった。培地を２日または３日毎に更新した。
【0065】
最適化した核タンパク質を使用するＨｅｐａＲＧ細胞の刺激
抗原によるインキュベーションを、核タンパク質化合物から構成されるＨＢｃＡｇタンパク質の０；１．２５；２．５；５；１０、及び１５μｇ／ｍＬの濃度で、核タンパク質を添加することによって実行した。３つの異なる実験複製を使用した。２つのインキュベーション時間（２４時間及び４８時間）を試験した。すべての事例において、非刺激細胞を陰性対照として使用した。
抗原によるインキュベーションを、核タンパク質化合物から構成されるＨＢｃＡｇタンパク質の０；１．２５；２．５；５；１０、及び１５μｇ／ｍＬの濃度で、核タンパク質を添加することによって実行した。３つの異なる実験複製を使用した。２つのインキュベーション時間（２４時間及び４８時間）を試験した。すべての事例において、非刺激細胞を陰性対照として使用した。
【0066】
ＨＢＶにより感染させたＨｅｐａＲＧ細胞の刺激
分化したＨｅｐａＲＧ細胞を、精製したＨＢＶ（５００ゲノム／細胞当量）により上で記載されるように感染させた。ＨｅｐａＲＧ細胞を、４％のＰＥＧ ８０００（Ｓｉｇｍａ）を補足した培養培地中のＨＢＶにより、３７℃で一晩でインキュベーションした。インキュベーションの終わりで、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、１．８％のＤＭＳＯ及び５×１０－５Ｍのヘミコハク酸ヒドロコルチゾンの存在下において維持した。感染を１週間発達させ、その後に、細胞を核タンパク質またはエンテカビルにより２４時間または４８時間処理した。
分化したＨｅｐａＲＧ細胞を、精製したＨＢＶ（５００ゲノム／細胞当量）により上で記載されるように感染させた。ＨｅｐａＲＧ細胞を、４％のＰＥＧ ８０００（Ｓｉｇｍａ）を補足した培養培地中のＨＢＶにより、３７℃で一晩でインキュベーションした。インキュベーションの終わりで、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、１．８％のＤＭＳＯ及び５×１０－５Ｍのヘミコハク酸ヒドロコルチゾンの存在下において維持した。感染を１週間発達させ、その後に、細胞を核タンパク質またはエンテカビルにより２４時間または４８時間処理した。
【0067】
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
ｑＰＣＲ反応は、商業的なＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ反応混合物（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１５μＬの最終体積へ適合させた。このキットは、偽陽性を回避するためにＨｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含有する。１反応あたり、以下の試薬の量：７．５μＬのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ混合物（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔから、Ｑｉａｇｅｎ）、１μＬの２つのオリゴヌクレオチド（１０ ｐＭｏｌ／μＬ）の各々、及び０．５ｍＬの水を採用し、組み合わせた。
ｑＰＣＲ反応は、商業的なＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ反応混合物（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１５μＬの最終体積へ適合させた。このキットは、偽陽性を回避するためにＨｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含有する。１反応あたり、以下の試薬の量：７．５μＬのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ混合物（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔから、Ｑｉａｇｅｎ）、１μＬの２つのオリゴヌクレオチド（１０ ｐＭｏｌ／μＬ）の各々、及び０．５ｍＬの水を採用し、組み合わせた。
【0068】
これらの要素を備えた反応混合物を、ｑＰＣＲにおいて評価されるサンプルの数に基づいて調製した。最終的にこの混合物から、１０μＬを、次いで事前に希釈した５μＬのｃＤＮＡ（１：１０、１：４０、及び１：５００）を、各々のＰＣＲチューブ（０．２ｍｌの容量）に採取した。陰性対照の事例において、５μｌの水を代りに添加して、１５μＬの全反応体積を作り上げた。
【0069】
特異的なプライマーを、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＩＧＢ、Ｈａｖａｎａ、Ｃｕｂａ）で合成し、１０ ｐＭｏｌ／μＬで使用した。その配列は文献から得られたか、または代替的にプライマーはいくつかの具体的な事例においてデザインされた。
【0070】
サーマルサイクリングを、Ｒｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ ３０００ ＰＣＲでリアルタイムで（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、オーストラリア）遂行した。ＰＣＲを、ポリメラーゼ活性化のために９５℃で１５分間インキュベーション後に開始し、続いて、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間の４０サイクルであった。
【0071】
統計
結果の精度を改善するために、すべての関心のある遺伝子のｑＰＣＲ定量を、ＧｕｓＢプライマーにより同時に増幅した非処理細胞の群からのｃＤＮＡサンプルの連続希釈物（典型的には１／４０、１／８０、１／１６０、１／３２０）によって作製した標準曲線に比較した。すべてのサンプルを同じ標準曲線に対して定量し、結果を相対的単位で表現した。遺伝子発現の刺激の結果を、３つの重複の平均として提示し、陰性対照についての平均値を１として、及び各々の処理群についての平均値を陰性対照の平均値を超えて何倍であるかとして判断する。
結果の精度を改善するために、すべての関心のある遺伝子のｑＰＣＲ定量を、ＧｕｓＢプライマーにより同時に増幅した非処理細胞の群からのｃＤＮＡサンプルの連続希釈物（典型的には１／４０、１／８０、１／１６０、１／３２０）によって作製した標準曲線に比較した。すべてのサンプルを同じ標準曲線に対して定量し、結果を相対的単位で表現した。遺伝子発現の刺激の結果を、３つの重複の平均として提示し、陰性対照についての平均値を１として、及び各々の処理群についての平均値を陰性対照の平均値を超えて何倍であるかとして判断する。
【0072】
統計的比較を、各々の処理群の３つの重複の平均とそれらの３つの対応する陰性対照（時間の一致する非処理細胞）との間で行った。等分散性結果が以前のＦ検定から与えられたと判断して、両側スチューデントのｔ検定を適用した。有意性レベルは、ｐ≦０．０５で確立された。ｐ＜０．０１の値は、非常に有意な統計的な差と判断された、ｐ＜０．００１の事例において高度に有意な統計的な差と判断された。データ分析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ及びＰｒｉｓｍ（バージョン５．０）により遂行した。
【0073】
トール様受容体（ＴＬＲ）遺伝子発現の核タンパク質刺激
ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、及びＴＬＲ７の遺伝子発現の刺激に対する最適化したヌクレオカプシドの用量を増加させる効果は、他のＴＬＲに比較して最も強力な効果をもたらした（図１）。刺激は、ＴＬＲ９の事例において弱かった。２４時間の刺激後のＴＬＲ８の事例において、高レベルの刺激は検出され、それは４８時間のインキュベーション後に見出さなかった。ＴＬＲ２／ＴＬＲ３遺伝子発現の強力で正の刺激は、複数の実験セットにおいて確認された。それらのうちの３つが、最適化した核タンパク質のみを使用し、それらの製剤は同じ方法である。
ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、及びＴＬＲ７の遺伝子発現の刺激に対する最適化したヌクレオカプシドの用量を増加させる効果は、他のＴＬＲに比較して最も強力な効果をもたらした（図１）。刺激は、ＴＬＲ９の事例において弱かった。２４時間の刺激後のＴＬＲ８の事例において、高レベルの刺激は検出され、それは４８時間のインキュベーション後に見出さなかった。ＴＬＲ２／ＴＬＲ３遺伝子発現の強力で正の刺激は、複数の実験セットにおいて確認された。それらのうちの３つが、最適化した核タンパク質のみを使用し、それらの製剤は同じ方法である。
【0074】
要約すると、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、及びＴＬＲ７の刺激は、２つの異なる時間（２４時間及び４８時間）で、及びＨＢＶに非感染細胞及び感染細胞の培養において確認された（図１）。インビトロの刺激における核タンパク質の異なる濃度の研究から、これらの特異的な遺伝子の遺伝子発現における有意且つ用量依存的な増加が示された。
【0075】
ＴＬＲ受容体のアダプタータンパク質の遺伝子発現の刺激。
ＴＬＲ遺伝子発現の刺激を、そのアダプタータンパク質（ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ、ＩＲＦ３、及びＮＦ－ｋＢ）のいくつかの遺伝子刺激の評価によっても研究した。刺激は、インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）の事例において２４時間後に最も強力であり骨髄分化一次応答遺伝子８８（ＭＹＤ８８）の強度が続いた。活性化Ｂ細胞のκ－軽鎖のエンハンサーの核内因子（ＮＦ－ｋＢ）の刺激は、４８時間のインキュベーション後に、より大きかった（図２）。研究した４つの遺伝子について、遺伝子発現の刺激は、２４時間で、及びＴＲＩＦを除いて、陽性であり（陰性対照との有意差が有る）、４８時間でもそうであった。
ＴＬＲ遺伝子発現の刺激を、そのアダプタータンパク質（ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ、ＩＲＦ３、及びＮＦ－ｋＢ）のいくつかの遺伝子刺激の評価によっても研究した。刺激は、インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）の事例において２４時間後に最も強力であり骨髄分化一次応答遺伝子８８（ＭＹＤ８８）の強度が続いた。活性化Ｂ細胞のκ－軽鎖のエンハンサーの核内因子（ＮＦ－ｋＢ）の刺激は、４８時間のインキュベーション後に、より大きかった（図２）。研究した４つの遺伝子について、遺伝子発現の刺激は、２４時間で、及びＴＲＩＦを除いて、陽性であり（陰性対照との有意差が有る）、４８時間でもそうであった。
【0076】
主要組織適合系（ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ）の分子の遺伝子発現の刺激。
最適化した核タンパク質によるＨｅｐａＲＧ細胞の刺激は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ）の遺伝子の遺伝子発現の強力な増加を示した。ＨＬＡクラスＩ遺伝子の事例において、ＨＬＡ－Ａは、ＨｅｐａＲＧ細胞のハプロタイプの以前の特徴評価に基づいて選択された。汎ハプロタイプオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、ＰＣＲの結果として、構成的ＧｕｓＢ遺伝子の遺伝子発現の基底レベルに比較して、ＨＬＡ－Ａ発現の基底レベルは、類似するかまたはより高かったが、発現レベルにおける強力な増加が証明された（図３）。同様に、３つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（ＤＲＢ１、ＤＰＢ１、及びＤＱＢ１）も研究し、遺伝子発現の刺激が示された（図３Ａ～Ｃ）。ＭＨＣクラスＩＩの刺激は、すべての３つの対立遺伝子において検証された。これらの遺伝子は、非常に低いベースラインレベルで発現していた。しかしながら、研究された異なる条件下でのＮＰ－Ｏによる刺激は、構成的に発現されるＧｕｓＢ対照遺伝子に近いレベルまで遺伝子発現のレベルを増加させた（図４５Ｂ）。
最適化した核タンパク質によるＨｅｐａＲＧ細胞の刺激は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ）の遺伝子の遺伝子発現の強力な増加を示した。ＨＬＡクラスＩ遺伝子の事例において、ＨＬＡ－Ａは、ＨｅｐａＲＧ細胞のハプロタイプの以前の特徴評価に基づいて選択された。汎ハプロタイプオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、ＰＣＲの結果として、構成的ＧｕｓＢ遺伝子の遺伝子発現の基底レベルに比較して、ＨＬＡ－Ａ発現の基底レベルは、類似するかまたはより高かったが、発現レベルにおける強力な増加が証明された（図３）。同様に、３つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（ＤＲＢ１、ＤＰＢ１、及びＤＱＢ１）も研究し、遺伝子発現の刺激が示された（図３Ａ～Ｃ）。ＭＨＣクラスＩＩの刺激は、すべての３つの対立遺伝子において検証された。これらの遺伝子は、非常に低いベースラインレベルで発現していた。しかしながら、研究された異なる条件下でのＮＰ－Ｏによる刺激は、構成的に発現されるＧｕｓＢ対照遺伝子に近いレベルまで遺伝子発現のレベルを増加させた（図４５Ｂ）。
【0077】
アポトーシスに関連するタンパク質の遺伝子発現の刺激
ＮＰ－ＯによるＨｅｐａＲＧ細胞の刺激は、ＢＡＸ遺伝子の発現の増加を実証し（図５Ａ）、比較的わずかな初期の増加後に、ＢＣＬ－２遺伝子の発現は、ＮＰ－Ｏによる刺激の４８時間後におよそ３０％抑制された（図５Ｂ）。経時的に、これらの２つの遺伝子の挙動は、アポトーシス促進の意味で、ＢＡＸ／ＢＣＬ－２遺伝子発現比の増加（図５Ｃ）をもたらした。
ＮＰ－ＯによるＨｅｐａＲＧ細胞の刺激は、ＢＡＸ遺伝子の発現の増加を実証し（図５Ａ）、比較的わずかな初期の増加後に、ＢＣＬ－２遺伝子の発現は、ＮＰ－Ｏによる刺激の４８時間後におよそ３０％抑制された（図５Ｂ）。経時的に、これらの２つの遺伝子の挙動は、アポトーシス促進の意味で、ＢＡＸ／ＢＣＬ－２遺伝子発現比の増加（図５Ｃ）をもたらした。
【0078】
サイトカイン及びインターフェロンの遺伝子発現の刺激
ＮＰ－ＯによるＨｅｐａＲＧ細胞の刺激は、ＩＬ６遺伝子の発現の増加をもたらした（図６Ａ）。ＩＬ６遺伝子刺激のピーク値は、対照ＧｕｓＢ遺伝子の遺伝子発現と比べておよそ７％であったが（図６Ｂ）、遺伝子発現がベースラインで強く抑制されたという点で注目すべきであった。すべての非刺激対照細胞は、研究された条件下で検出不可能なレベルの遺伝子発現を生じた。０．１％の値を任意に定義して、遺伝子発現の刺激を分析した。
ＮＰ－ＯによるＨｅｐａＲＧ細胞の刺激は、ＩＬ６遺伝子の発現の増加をもたらした（図６Ａ）。ＩＬ６遺伝子刺激のピーク値は、対照ＧｕｓＢ遺伝子の遺伝子発現と比べておよそ７％であったが（図６Ｂ）、遺伝子発現がベースラインで強く抑制されたという点で注目すべきであった。すべての非刺激対照細胞は、研究された条件下で検出不可能なレベルの遺伝子発現を生じた。０．１％の値を任意に定義して、遺伝子発現の刺激を分析した。
【0079】
ＮＰ－ＯによるＨｅｐａＲＧ細胞の刺激は、特異的な条件下でＩＦＮ∝及びＩＦＮβの遺伝子発現の増加（図７Ａ及びＢ）をもたらした。効果は主に非刺激細胞の陰性対照の１．５～２倍であったが、いくつかの事例において、効果は、研究された条件において統計的に有意であった。このタイプの細胞株において、インターフェロンの遺伝子発現に対する効果が１０時間のインキュベーションの近くで確認されることは、注目すべきことである。
【0080】
ウイルス感染条件下でのＮＰ－ＯによるＨｅｐａＲＧ細胞の刺激
ＮＰ－Ｏ誘導性の遺伝子刺激に対するウイルス感染（この事例においてＨＢＶ感染をモデルとして使用した）の効果を評価するために、ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＮＰ－Ｏの増加用量（１０μｇ／ｍｌまで）により４８時間インキュベーションした。２つのＴＬＲ遺伝子を、ＭＹＤ８８の非依存性及び依存性刺激因子として選択し（それぞれＴＬＲ２及びＴＬＲ３）、２つの追加の遺伝子を、刺激環境におけるＨＢｃＡｇ刺激へ最も良好な応答し、提示（ＨＬＡクラスＩＩ）及びＩＬ６サイトカイン刺激に関して影響を受けないものから選択した。４つの遺伝子は、遺伝子発現の刺激を示した（図８）。
ＮＰ－Ｏ誘導性の遺伝子刺激に対するウイルス感染（この事例においてＨＢＶ感染をモデルとして使用した）の効果を評価するために、ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＮＰ－Ｏの増加用量（１０μｇ／ｍｌまで）により４８時間インキュベーションした。２つのＴＬＲ遺伝子を、ＭＹＤ８８の非依存性及び依存性刺激因子として選択し（それぞれＴＬＲ２及びＴＬＲ３）、２つの追加の遺伝子を、刺激環境におけるＨＢｃＡｇ刺激へ最も良好な応答し、提示（ＨＬＡクラスＩＩ）及びＩＬ６サイトカイン刺激に関して影響を受けないものから選択した。４つの遺伝子は、遺伝子発現の刺激を示した（図８）。
【0081】
先天性免疫応答の活性化に関連する抗ウイルス効果
ＨＢＶ感染の状況において最適化した核タンパク質による処理によって誘導された先天性免疫応答の抗ウイルス効果を研究するために、ＨｅｐａＲＧ細胞をＨＢＶにより感染させ、７日目に、培養培地の１ｍＬあたり１０マイクログラムの用量で最適化した核タンパク質により刺激した。対照群として、ポリ（Ｐｏｌｉ）ＩＣ（それはＴＬＲ３のアゴニストとしての先天性免疫応答の刺激化合物である）を使用し、追加で、抗ウイルス効果の陽性対照として、エンテカビル（ＨＢＶによる慢性感染症の治療の分野における抗ウイルスであると認識された）を使用した。図９中で観察されるように、ＨＢＶ感染は、両方の経路（ＭＹＤ８８依存性及び非依存性）からのＴＬＲ、サイトカインＩＬ６及びＨＬＡクラスＩＩ（ＤＲＢ１）の遺伝子刺激を妨げなかった。
ＨＢＶ感染の状況において最適化した核タンパク質による処理によって誘導された先天性免疫応答の抗ウイルス効果を研究するために、ＨｅｐａＲＧ細胞をＨＢＶにより感染させ、７日目に、培養培地の１ｍＬあたり１０マイクログラムの用量で最適化した核タンパク質により刺激した。対照群として、ポリ（Ｐｏｌｉ）ＩＣ（それはＴＬＲ３のアゴニストとしての先天性免疫応答の刺激化合物である）を使用し、追加で、抗ウイルス効果の陽性対照として、エンテカビル（ＨＢＶによる慢性感染症の治療の分野における抗ウイルスであると認識された）を使用した。図９中で観察されるように、ＨＢＶ感染は、両方の経路（ＭＹＤ８８依存性及び非依存性）からのＴＬＲ、サイトカインＩＬ６及びＨＬＡクラスＩＩ（ＤＲＢ１）の遺伝子刺激を妨げなかった。
【0082】
結果から、ウイルスに類似する物理学的外観を備えた核タンパク質によって保護されて環境へ投与される場合に、ＴＬＲ３アゴニスト遺伝子発現の刺激効果の優越性が実証される。透過を増進する物質の存在無しのパルス処理された培地条件におけるポリ（Ｐｏｌｉ）ＩＣの事例における刺激効果は、限定される。これとは反対に、ウイルス様粒子性質は、最適化した核タンパク質の透過及び複数のアゴニストの存在を容易にし、同じ構造で、両方の経路（ＭＹＤ８８依存性及び非依存性）による刺激を容易にし、それは単純なＴＬＲ３アゴニストよりもはるかに大きな刺激を生成し、非処理細胞に対して有意な影響を有する規模で、抗原提示、サイトカイン分泌、及び図１０中で示されるように抗ウイルス効果も増加させ、エンテカビル（慢性Ｂ型肝炎の治療のためにより低い用量で使用されたものである、認められた評判の良い抗ウイルス薬）によって生成されたものと統計的な有意差は無かった。培養において適応免疫系の他の構成要素がないので、ＨＢＶ複製の変化が、先天性免疫受容体の活性化、及び本発明において記載される誘発プロセスの結果としてのみで起こる。
【0083】
実施例５。インビトロ及びインビボでの他の病原体に対する抗ウイルス効果。
ＮＰ－Ｏの抗ウイルス活性の第２の分析において、培養した細胞株における他のウイルスの複製に対する先天性免疫の活性化の効果を評価した。追加で、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、及びデング熱ウイルスの似ていない血清型の３つの異なる株により感染させた多様な細胞株のインビトロの培養へ添加した場合に、ＮＰ－Ｏにより刺激されたＨｅｐａＲＧ細胞の培養上清を査定し、処理した細胞はウイルスカウントの有意な低減を示すが、非処理細胞において効果を観察することができなかった。非処理のものに比較した、処理した細胞におけるウイルスカウント間の差は、ウイルスの各々のウイルス負荷の少なくとも１対数であった。これらの結果、及び以前に明らかにされたものは、コロナウイルス、ならびに急性感染、慢性感染、及び再発性感染を引き起こす他のウイルスによるウイルス感染の設定における抗ウイルス剤としてのＮＰ－Ｏの役割と矛盾しない。
ＮＰ－Ｏの抗ウイルス活性の第２の分析において、培養した細胞株における他のウイルスの複製に対する先天性免疫の活性化の効果を評価した。追加で、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、及びデング熱ウイルスの似ていない血清型の３つの異なる株により感染させた多様な細胞株のインビトロの培養へ添加した場合に、ＮＰ－Ｏにより刺激されたＨｅｐａＲＧ細胞の培養上清を査定し、処理した細胞はウイルスカウントの有意な低減を示すが、非処理細胞において効果を観察することができなかった。非処理のものに比較した、処理した細胞におけるウイルスカウント間の差は、ウイルスの各々のウイルス負荷の少なくとも１対数であった。これらの結果、及び以前に明らかにされたものは、コロナウイルス、ならびに急性感染、慢性感染、及び再発性感染を引き起こす他のウイルスによるウイルス感染の設定における抗ウイルス剤としてのＮＰ－Ｏの役割と矛盾しない。
【0084】
蚊によって伝達されるウイルス性疾患（特異的にデング熱、ジカ熱、及びチクングニア熱）の患者へのＮＰ－Ｏを含む製剤の投与は、ＮＰ－Ｏを含む製剤により治療されない患者に対して、ＮＰ－Ｏにより治療された群において、患者のパーセンテージを有意に低下させること、疾患の臨床症状を低減させること、及びより重大な増悪のステージへの進むものの比率を減少させることを可能にした。異なるＮＰ－Ｏバリアントの使用から、２０％のＲＮＡ／タンパク質のＮＰ－Ｏを生成するのに使用されたウイルスカプシドのタイプにかかわらず、類似する結果を誘導することが可能であることが示された。１群あたり１００名の患者による有効性研究において、疾患増悪の有る患者は、ＮＰ－Ｏ製剤を受けなかった患者のみの事例において見出された。一致した手法において、先天性免疫の活性化のマーカーの増加が実証された。
【0085】
実施例６。併用治療の状況における核タンパク質ＮＰ－Ｏ。
治療の併用は、本発明の化合物目的物による治療の臨床実施における最も頻繁に使用される代替物の１つと見なすことができる。物理化学的な技法を使用して、バッチＡ～ＤのＮＰに、静電相互作用を介して粒子構造に会合する能力を有する１群の化合物を補足した。１つ設定において、本発明のＮＰを、ワクチンｍＲＮＡ及び干渉ＲＮＡを補足した他のＮＰと同時に使用した。これらの化合物を、ウイルス剤（ＨＢＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２コロナウイルス、インフルエンザウイルス、及びデング熱ウイルス等）により感染させた培養中の細胞の処理において、インビボ及びインビトロで区別なく使用した。
治療の併用は、本発明の化合物目的物による治療の臨床実施における最も頻繁に使用される代替物の１つと見なすことができる。物理化学的な技法を使用して、バッチＡ～ＤのＮＰに、静電相互作用を介して粒子構造に会合する能力を有する１群の化合物を補足した。１つ設定において、本発明のＮＰを、ワクチンｍＲＮＡ及び干渉ＲＮＡを補足した他のＮＰと同時に使用した。これらの化合物を、ウイルス剤（ＨＢＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２コロナウイルス、インフルエンザウイルス、及びデング熱ウイルス等）により感染させた培養中の細胞の処理において、インビボ及びインビトロで区別なく使用した。
【0086】
このタイプの化合物の会合は、２０％を超えるＲＮＡ／タンパク質比の治療／ワクチン調製物の最終比を維持した。ウイルス培養へのこのタイプの化合物の投与は、各々の事例において１対数を超えてウイルスカウントを低減した。組み合わせが２０％質量／質量超のＲＮＡ／タンパク質レベルを有しないＮＰにより作製された場合に、この効果は観察されなかった。
【0087】
組み合わせてまたは会合して使用される他の化合物は、ＮＰとヌクレオチドまたはヌクレオシド性質の化合物（ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体、ポリＩＣ、化合物ｃ－ジＡＭＰ、核酸ポリマーＮＡＰ、刺激オリゴヌクレオチドＣｐＧ、及びヌクレオシドヌクレオチド性質の他の化合物等）の群中のものである。
【0088】
使用したＮＰ－Ｏ製剤は、粘膜組織細胞ならびに血液及び肝細胞の両方において、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、及びＴＬＲ２受容体を増加させ、ＭＹＤ８８依存性及び非依存性経路を活性化する能力を実証した。
【0089】
すべての事例において、ＴＬＲ受容体の増加は証明され、この活性化は、先天性免疫のこの刺激によって媒介される、デング熱、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＰＶによる感染の設定における抗ウイルス効果に付随した。効果は、インビトロの条件、そしてインビボの条件の両方で見出された。
【0090】
実施例７。呼吸器感染疾患の状況における核タンパク質ＮＰ－Ｏ。
動物及びボランティアにおけるＮＰ－Ｏの投与は、先天性免疫受容体（ウイルス病原体に関連する分子パターンの検出に関連するもの（ＴＬＲ３、７、及び８）を含む）の局所性及び全身性の増加を証明した。
動物及びボランティアにおけるＮＰ－Ｏの投与は、先天性免疫受容体（ウイルス病原体に関連する分子パターンの検出に関連するもの（ＴＬＲ３、７、及び８）を含む）の局所性及び全身性の増加を証明した。
【0091】
具体的には、ＨＢＶ表面抗原を含有するプロテオリポソームと組み合わせた製剤におけるＨＢＶカプシドからのＮＰ－Ｏの適用は、これらの受容体に対して局所性（扁桃腺上皮細胞において）及び全身性両方のレベルの刺激効果を生成し、血液中の単球の提示及び活性化の能力を増加させた。
【0092】
ＮＰ－Ｏの使用の実践的な適用を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２コロナウイルスによる感染の状況において、このウイルスについて疑われる患者及び陽性の患者の両方において実行した。このタイプの治療を、加速スキーム（陽性の患者または疑われる患者）及び先天性免疫系の「訓練」スキームにおいて実行した。
【0093】
ＮＰ－Ｏを含有する製剤を、加速スケジュールで１４日間投与した。この研究から、溶液中で、または他の抗原と組み合わせて、１０～５００マイクログラムのＮＰ－Ｏの用量を使用する、ＣｏＶ及び他のＲＮＡウイルスについて疑われる患者及び陽性の患者の先天性防御の活性化が実証された。いくつかの製剤において、鼻腔内経路及び舌下経路を介する分散物による投与、そして滴瓶またはかかる手順のために特異的な滴瓶を使用する液滴での投与のために、デバイスを使用した。
【0094】
ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８受容体の活性化効果を、鼻腔内投与（週１回の接種、３回）、及び舌下（１日１回の投与、１４日間）の臨床試験において同時に評価した。ＴＬＲ３／７及び８の遺伝子発現（ＧＥ）における有意な増加は、産物の投与を開始して４日目から検出され始めた（図１１）。
【0095】
産物の適用の結果として、ＣｏＶ感染及び他の同時の感染と関連する臨床症状の悪化は、同様に検出されなかった。治療された患者は、存在する原因となる感染から独立して、その後の満足な回復を有していた。ＮＰ－Ｏ製剤により治療された患者の大部分において、コロナウイルスの検出に関与するＲＮＡ受容体として一緒に分析される、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８受容体の刺激パターンを観察することができた（図１１）。これらの結果は、前臨床研究と矛盾しなかった。
【0096】
第２の治療スキームにおいて、６０歳を超えるボランティアの群を、Ｈａｖａｎａ市の老人ホームから動員した。ボランティアは、単一構成要素として、または先天性免疫系を活性化する複数の構成要素の製剤において、１０～１００マイクログラムの投薬量のＮＰ－Ｏを受けた。産物の投与は、３日毎または週１回で１～１２か月の期間の間１日１回の頻度で鼻腔内及び／または舌下の接種スキームであった。先天性免疫系のこの「訓練」プロセスは、ＮＰ－Ｏを含む製剤を受けたボランティアにおいて、この産物により治療されなかった群に対して、より少ない数の呼吸器疾患を可能にすることが見出された。同様に、感染した人々の臨床症状は有意に低減された。これらの抗原への応答は、ＴＮＦα及びＩＬ６の分泌の増加を特徴とする「訓練された」免疫のマーカーパターンの末梢血液単核細胞において反映され、これらのサイトカインはＮＰ－Ｏにより治療された対象の血清において有意に低減されたが、この効果は血清においてではなく、末梢血リンパ球の刺激のみと関連する。この手法において、産物及びその製剤は、加齢関連免疫不全を持った人々における先天性免疫系の免疫学的訓練に使用された。
【0097】
第３の治療スキームにおいて、ＨＢＶ及びＨＣＶのカプシドからのＮＰ－Ｏを、ペプチドをＮＰ－Ｏへコンジュゲーションするために使用し、補足の特定のバリアントにおいて、遺伝子工学技術によってこれらのタンパク質の配列の中へ挿入した。もたらされたウイルス様粒子を保護及び安定化するために、干渉ＲＮＡ及びメッセンジャーＲＮＡの配列を使用した。インビトロ及びインビボの結果から、これらのタンパク質エレメント及びワクチンＲＮＡを補足したこれらのＮＰ－Ｏは、依然として２０％を超えるＲＮＡ／タンパク質を有し、強力な適応応答及び保護応答を同時に誘導したことが実証された。
【0098】
実施例８。固形腫瘍に関連する腫瘍疾患におけるＮＰ－Ｏ核タンパク質の使用。
画像確認により肝臓癌と診断された患者をＮＰ－Ｏにより治療して、ＨＣＣに対する免疫療法効果を研究した。患者はＮＰ－Ｏの製剤を静脈内に受けた、及び／または腫瘍へ直接適用される動脈化学塞栓手順（ＴＡＣＥ）が付随した。別の治療選択肢において、腫瘍内及び腫瘍周囲の投与を、ＴＡＣＥ手順が遂行されなかった患者において評価した。この産物は、鼻腔内経路によって投与されるワクチンと併用して投与され、ワクチン抗原の中にＮＰＯ抗原を含有する。鼻腔内投与との局所的な腫瘍内または腫瘍周囲の投与の併用は、腫瘍のＭＤＳＣの量の著しい減少、そして再循環パターンの血液を通して肝臓腫瘍に到達するリンパ球の数の増加が反映された免疫応答を生成した。この結果として併用治療から、肝実質中に存在する腫瘍塊のサイズ及び数の有意な減少を観察され、それは、このタイプの免疫療法レジメンにおけるＮＰ－Ｏにより治療されなかった患者の群に比較して、治療された患者のより長い生存と関連した。ＨＢＶ及びＨＣＶによる感染に由来する肝臓腫瘍の症例において、ＨＢＶ及びＨＣＶのＮＰ－Ｏを、類似する抗腫瘍効果に互換的に使用した。これらのＮＰ－Ｏの製剤を、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎のウイルスの他の表面タンパク質と併用して使用した。
画像確認により肝臓癌と診断された患者をＮＰ－Ｏにより治療して、ＨＣＣに対する免疫療法効果を研究した。患者はＮＰ－Ｏの製剤を静脈内に受けた、及び／または腫瘍へ直接適用される動脈化学塞栓手順（ＴＡＣＥ）が付随した。別の治療選択肢において、腫瘍内及び腫瘍周囲の投与を、ＴＡＣＥ手順が遂行されなかった患者において評価した。この産物は、鼻腔内経路によって投与されるワクチンと併用して投与され、ワクチン抗原の中にＮＰＯ抗原を含有する。鼻腔内投与との局所的な腫瘍内または腫瘍周囲の投与の併用は、腫瘍のＭＤＳＣの量の著しい減少、そして再循環パターンの血液を通して肝臓腫瘍に到達するリンパ球の数の増加が反映された免疫応答を生成した。この結果として併用治療から、肝実質中に存在する腫瘍塊のサイズ及び数の有意な減少を観察され、それは、このタイプの免疫療法レジメンにおけるＮＰ－Ｏにより治療されなかった患者の群に比較して、治療された患者のより長い生存と関連した。ＨＢＶ及びＨＣＶによる感染に由来する肝臓腫瘍の症例において、ＨＢＶ及びＨＣＶのＮＰ－Ｏを、類似する抗腫瘍効果に互換的に使用した。これらのＮＰ－Ｏの製剤を、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎のウイルスの他の表面タンパク質と併用して使用した。
【0099】
ＮＰ－Ｏを含有するワクチンと併用した投与は、ＮＰ－Ｏの髄腔内／またはＴＡＣＥ投与によって誘導されるときのみ相加効果を生成した。患者の生存に対する効果は、他の従来療法（ＮＰ－Ｏと併用した療法無しのＴＡＣＥによって投与されるソラフェニブまたは産物等）よりも優れていた。
【0100】
それぞれＢＣＧ及びソラフェニブと併用した投与の事例として、固形腫瘍の併用療法において、同時に投与される他の化合物と共にまたは連続的に、ＮＰ－Ｏを投与した。この手法において、抗腫瘍効果は、好都合且つ合理的な手法で、併用治療の投与から最適化される。ＢＣＧとの併用は、ＴＬＲ３アゴニストを提供するＮＰ－Ｏとの併用療法による、この確立している治療（この治療法のために追加の利益を示し、問題になっている治療のパーセント有効性における増加を伴う抗腫瘍療法の影響が反映される態様）の補足を容易にした。
【0101】
非固形腫瘍に対する効果は、細胞の抗原性が増加し、抗原を提示するより大きな能力（共刺激シグナルの増加によって促進される効果）を有するようにＮＰ－Ｏを使用する、ＮＰ－Ｏの静脈内投与、ならびに樹状細胞及び腫瘍細胞のエクスビボまたはインビトロの治療から検証される。
【0102】
実施例９。感染性疾患、腫瘍学疾患、及びアレルギー性疾患のための予防的及び治療的なワクチン接種におけるＮＰ－Ｏ核タンパク質の使用。
舌下経路による反復投与は、ＮＰ－Ｏを含む製剤を受けたアレルギー患者の臨床プロファイルを変化させることができたことを検証することは可能であった。３か月の治療後に、抗ヒスタミン物質を服用することが必要な個体の数の減少を、ダニへのアレルギーの有る患者の間で観察することができた。同じ手法において、アレルギーエピソードが、免疫訓練プロセスにおいて舌下を介して治療した患者で低減し、平行して呼吸器疾患の症状及び頻度が低減したことを検証することは可能であった。この手法において、ＮＰ－Ｏは、アレルゲン単独の部分であり得るか、またはアレルゲンとの組み合わせであり得ることを示した。
舌下経路による反復投与は、ＮＰ－Ｏを含む製剤を受けたアレルギー患者の臨床プロファイルを変化させることができたことを検証することは可能であった。３か月の治療後に、抗ヒスタミン物質を服用することが必要な個体の数の減少を、ダニへのアレルギーの有る患者の間で観察することができた。同じ手法において、アレルギーエピソードが、免疫訓練プロセスにおいて舌下を介して治療した患者で低減し、平行して呼吸器疾患の症状及び頻度が低減したことを検証することは可能であった。この手法において、ＮＰ－Ｏは、アレルゲン単独の部分であり得るか、またはアレルゲンとの組み合わせであり得ることを示した。
【0103】
同様に、ペプチド及び可溶性タンパク質が、ＮＰ－Ｏへのコンジュゲートで投与された場合に、またはこの投与が溶液中で実行された場合に、ＮＰ－Ｏが、ウイルス性及び非ウイルス性の病原体からのペプチド及びタンパク質サブユニットへの免疫応答を刺激する能力を、免疫応答の増加の検出によって検証した。この手法において、「担体」効果は、ＮＰ－Ｏへンジュゲートしたペプチド抗原の免疫原性を増加させることを可能にすることが検証された。ＮＰ－Ｏの検出に関与する先天性免疫系の多数の受容体は、それらがＴｈ１抗ウイルス応答の量及びパターンを越える免疫応答、及び抗原に向けた多機能のＴ細胞の誘導を、ＮＰ－Ｏの非存在下においてこれらのペプチド抗原、ポリペプチド、及び可溶性タンパク質の投与によって生成された応答に対して有意な差で、抗原に提供することを可能にする。
【0104】
ＮＰ－Ｏを含有するワクチン製剤は、使用した抗原及びＮＰ－Ｏの使用に依存して、粘膜経路（好ましくは鼻腔内及び舌下）、ならびに皮下、筋肉内、及び場合によっては腫瘍内経路によって、投与される。ＮＰ－Ｏを含む製剤は、粘膜接着物質（カルボキシビニルポリマー、そしてセルロースに基づくかまたはそれに由来する他のものが制限されずに挙げられる）、及び一般にワクチン治療またはＮＰ－Ｏの治療的効果の標的粘膜においてより高い生物学的利用能を可能にするものの使用により、粘膜経路によって投与され得る。
【0105】
実施例１０。エピデミック及びパンデミックの条件下での先天性免疫系の活性化のために最適化した異なる核タンパク質の使用。
Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＣｏＶ、及びデング熱ウイルスのカプシド抗原に基づく核タンパク質配列を最適化し、２０％を超えるＲＮＡ／タンパク質比の増加を達成した。実施形態において、ＲＮＡ比率が非修飾の最適化した核タンパク質のＲＮＡ比率に関して２０％を越えた場合の、先天性免疫の刺激効果が検証された。見出された効果の中には、核タンパク質が呼吸器感染症の状況において先天性免疫応答を刺激する能力があり、アポトーシスプロセスの活性化及び腫瘍細胞のより高い抗原性と関連する抗腫瘍応答は、インビボ及びインビトロのモデルにおいて得られ、及び特異的な抗ウイルスサイトカインの産生経路の独自の刺激によって媒介される抗ウイルス効果の存在は、これらの核タンパク質により治療された動物においてウイルス感染を低減し、臨床症状を改善することを実証する。これらの治療の利益は、泌尿生殖系における再発性感染プロセスの低減においても鼻腔内経路及び舌下経路を介して観察された。これらの効果は、ＮＰ－Ｏにより治療された高齢者対象のより長い生存、そして呼吸器感染、胃腸感染、及び泌尿生殖器感染の再発からの必要な抗生物質による治療の有意な低減によって検証された。
Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＣｏＶ、及びデング熱ウイルスのカプシド抗原に基づく核タンパク質配列を最適化し、２０％を超えるＲＮＡ／タンパク質比の増加を達成した。実施形態において、ＲＮＡ比率が非修飾の最適化した核タンパク質のＲＮＡ比率に関して２０％を越えた場合の、先天性免疫の刺激効果が検証された。見出された効果の中には、核タンパク質が呼吸器感染症の状況において先天性免疫応答を刺激する能力があり、アポトーシスプロセスの活性化及び腫瘍細胞のより高い抗原性と関連する抗腫瘍応答は、インビボ及びインビトロのモデルにおいて得られ、及び特異的な抗ウイルスサイトカインの産生経路の独自の刺激によって媒介される抗ウイルス効果の存在は、これらの核タンパク質により治療された動物においてウイルス感染を低減し、臨床症状を改善することを実証する。これらの治療の利益は、泌尿生殖系における再発性感染プロセスの低減においても鼻腔内経路及び舌下経路を介して観察された。これらの効果は、ＮＰ－Ｏにより治療された高齢者対象のより長い生存、そして呼吸器感染、胃腸感染、及び泌尿生殖器感染の再発からの必要な抗生物質による治療の有意な低減によって検証された。
【0106】
概して、最適化した核タンパク質は、腫瘍モデル、アレルギーモデル、及び感染モデルにおいて使用され、２０％未満のＲＮＡ／タンパク質比の核タンパク質に比較して、それらの機能的有効性に関する明らかな優越性をもたらす。先天性免疫応答の刺激は、呼吸系ウイルス（コロナウイルス科のものが挙げられる）、肝臓指向性がある他のものの複製を阻害することができ、概して、それは先天性免疫系のマーカーの活性化と関連した。
【配列表フリーテキスト】
【0107】
配列番号１：＜２２３＞人工配列の記載：最適化したＢ型肝炎ウイルスヌクレオカプシドタンパク質配列
配列番号２：＜２２３＞人工配列の記載：最適化したＢ型肝炎ウイルスヌクレオカプシドタンパク質配列、短縮バリアント
配列番号３：＜２２３＞人工配列の記載：最適化したＢ型肝炎ウイルスヌクレオカプシドタンパク質配列、短縮バリアント
配列番号４：＜２２３＞人工配列の記載：最適化したＢ型肝炎ウイルスヌクレオカプシドタンパク質配列、短縮バリアント
配列番号２：＜２２３＞人工配列の記載：最適化したＢ型肝炎ウイルスヌクレオカプシドタンパク質配列、短縮バリアント
配列番号３：＜２２３＞人工配列の記載：最適化したＢ型肝炎ウイルスヌクレオカプシドタンパク質配列、短縮バリアント
配列番号４：＜２２３＞人工配列の記載：最適化したＢ型肝炎ウイルスヌクレオカプシドタンパク質配列、短縮バリアント
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】