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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-29
(54)【発明の名称】化学物質相互作用効果の判定
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/18 20060101AFI20230522BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230522BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/18
C12M1/34 B
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022556623
(86)(22)【出願日】2021-03-19
(85)【翻訳文提出日】2022-09-30
(86)【国際出願番号】 SE2021050243
(87)【国際公開番号】W WO2021188037
(87)【国際公開日】2021-09-23
(31)【優先権主張番号】2050304-1
(32)【優先日】2020-03-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522369566
【氏名又は名称】カヴァロパウロス，ニコラオス
(71)【出願人】
【識別番号】522369577
【氏名又は名称】レーミルト，ローデリッヒ
(71)【出願人】
【識別番号】522369588
【氏名又は名称】タン，ポ－チェン
(71)【出願人】
【識別番号】522369599
【氏名又は名称】クルーガー，ヨハン
(71)【出願人】
【識別番号】522369603
【氏名又は名称】アンダーソン，ダン
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】カヴァロパウロス，ニコラオス
(72)【発明者】
【氏名】レーミルト，ローデリッヒ
(72)【発明者】
【氏名】タン，ポ－チェン
(72)【発明者】
【氏名】クルーガー，ヨハン
(72)【発明者】
【氏名】アンダーソン，ダン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA01
4B029AA07
4B029AA08
4B029BB02
4B029BB06
4B029FA01
4B063QA06
4B063QQ06
4B063QQ07
4B063QR68
4B063QS24
4B063QS39
4B063QX01
(57)【要約】
細胞培養基質（５０）上で細胞集団（５５）を培養するのであるが、その際に、培養容器（１０）内の所定位置にある化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質が基質（５０）中を拡散することによって、組み合わせ領域（４１、４３、４５）内の基質（５０）において少なくとも部分的には重複する濃度勾配が形成され、化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の外側の境界部周辺で基質（５０）において実質的に重複のない濃度勾配が形成される。化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の外側の境界部周辺において細胞集団（５５）の増殖を実質的に欠如している各阻害帯（６０、６２、６４）の阻害端点（６１、６３、６５）、および組み合わせ領域（４１、４３、４５）内において細胞集団（５５）の増殖を含む各増殖帯（７０、７２、７４）の増殖端点（７１、７３、７５）が判定され、細胞集団（５５）に対する化学物質間の相互作用効果の評価に利用される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞集団に対する化学物質相互作用効果を判定する方法であって、該方法が：互いに相対的な所定位置にあるＮ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）を含む培養容器（１０）に、細胞培養基質（５０）を添加する工程（Ｓ１）であって、
ここでＮ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）が化学物質を含み、Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）が、組み合わせ領域（４１、４３、４５）を取り囲み、Ｎが３以上の整数である、
工程（Ｓ１）；
細胞培養基質（５０）上および／または細胞培養基質（５０）内に細胞集団（５５）を配置し、細胞培養基質（５０）上および／または細胞培養基質（５０）内で該細胞集団（５５）を所定の時間、培養する工程（Ｓ２）であって、
その間、Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の化学物質が細胞培養基質（５０）中を拡散して、組み合わせ領域（４１、４３、４５）内の細胞培養基質（５０）において少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を形成し、またＮ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の外側の境界部周辺で細胞培養基質（５０）において実質的に重複のない化学物質濃度勾配を形成する、
工程（Ｓ２）；
Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）について、細胞集団（５５）の増殖を実質的に欠如している阻害帯（６０、６２、６４）の阻害端点（６１、６３、６５）を判定する工程（Ｓ３）であって、
阻害端点（６１、６３、６５）が化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の外側の境界部周辺部に位置する、
工程（Ｓ３）；
少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）について、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質の少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を有する組み合わせ領域（４１、４３、４５）内において、細胞集団（５５）の増殖を含む増殖帯（７０、７２、７４）の増殖端点（７１、７３、７５）を判定する工程（Ｓ４）；
および
少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質間の化学物質相互作用効果を、阻害端点（６１、６３、６５）および増殖端点（７１、７３、７５）に基づいて判定する工程（Ｓ５）；
を含む、方法。
【請求項2】
請求項１の方法であって、ここで細胞培養基質（５０）を添加する工程（Ｓ１）が、培養容器（１０）に細胞培養基質ゲルを添加し、該細胞培養基質ゲルを固化させて細胞培養基質（５０）とする、添加する工程（Ｓ１）を含む、方法。
【請求項3】
請求項１または２の方法であって、該方法が：少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）について、阻害端点（６１、６３、６５）に基づき、化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質の、細胞集団（５５）に関する最小阻害剤濃度（ＭＩＣ）を決定する工程（Ｓ１０）；
および
少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）について、増殖端点（７１、７３、７５）に基づき、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質の混合物中の、化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質のＭＩＣを決定する工程（Ｓ１１）、
をさらに含む方法であって、
ここで該化学物質相互作用効果を判定する工程（Ｓ５）が、ＭＩＣに基づいて、部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ）を決定する工程（Ｓ５）を含む、
方法。
【請求項4】
請求項３の方法であって、ここでＭＩＣを決定する工程（Ｓ１０）が、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）について、化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質の、細胞培養基質（５０）に関する拡散係数、および阻害端点（６１、６３、６５）に基づき、化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質のＭＩＣを決定することを含む工程（Ｓ１０）であり；
および
該混合物におけるＭＩＣを決定する工程（Ｓ１１）が、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）について、該拡散係数および増殖端点（７１、７３、７５）に基づき、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質の混合物中の、化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質のＭＩＣを決定することを含む工程（Ｓ１１）である、
方法。
【請求項5】
請求項４の方法であって、該方法が：該化学物質を、それぞれの異なる濃度で含むＮ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）を含む培養容器（１０）に、該細胞培養基質ゲルを添加し、該細胞培養基質ゲルを固化させて細胞培養基質（５０）とすること；
細胞培養基質（５０）上および／または細胞培養基質（５０）内に被検細胞集団（５５）を配置し、Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）中の化学物質を細胞培養基質（５０）中に拡散させながら、細胞培養基質（５０）上および／または細胞培養基質（５０）内で被検細胞集団（５５）を所定の時間培養することであって、
ここで被検細胞集団（５５）について該化学物質のＭＩＣが既知である、
培養させること；
Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の少なくとも１つの化学物質リザーバー（３１、３３、３５）について、被検細胞集団（５５）の増殖が実質的に欠如している阻害帯（６０、６２、６４）の阻害端点（６１、６３、６５）を判定することであって、
阻害端点（６１、６３、６５）が化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の外側の境界部周辺位置する、
判定すること；
および
阻害端点（６１、６３、６５）および該化学物質の、被検細胞集団（５５）に関するＭＩＣに基づいて、細胞培養基質（５０）に関する、該化学物質の拡散係数を決定すること、
によって該化学物質の拡散係数を決定することをさらに含む、方法。
【請求項6】
請求項１～５のいずれかに記載の方法であって、ゲルと混合した化学物質をＮ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に添加し、該ゲルを固化させて化学物質含有プラグとする工程（Ｓ２０）をさらに含む、方法。
【請求項7】
請求項１～５のいずれかに記載の方法であって、ここでＮ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）が、凍結乾燥形態または乾燥形態の化学物質を含み；
および
該方法が、該化学物質を溶解または分散させたゲルをＮ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に添加し、該ゲルを固化させて化学物質含有プラグとする工程（Ｓ２１）をさらに含む、方法。
【請求項8】
請求項１～７のいずれかに記載の方法であって、ここで、Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）が、円の外周に沿って互いに相対的な所定位置に配置され；
および
阻害端点（６１、６３、６５）が、該円の中心（１５）および化学物質リザーバー（３１、３３、３５）を通る軸（８０）に沿って配置され、化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の外側の境界部に対して周辺を通る軸（８０）上の点に位置する、
方法。
【請求項9】
請求項１～８のいずれかに記載の方法であって、ここでＮが３である、方法。
【請求項10】
請求項８および９の方法であって、ここで各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）が、該円の外周に整列化した円周壁（２４）の間で、弦壁（２１、２３、２５）によって取り囲まれ；
および
３つの弦壁（２１、２３、２５）が、三角形（４０）、好ましくは正三角形（４０）を取り囲む、
方法。
【請求項11】
培養容器挿入部（２０）であって：中央にＮ角形の開口部（４０）、好ましくは中央に正Ｎ角形開口部（４０）を有する円形底プレート（２２）；
円形底プレート（２２）の外周に取り付けられた円形の壁（２４）；
および
円形の壁（２４）および円形底プレート（２２）に取り付けられ、中央のＮ角形の開口部（４０）を取り囲むＮ個の弦壁（２１、２３、２５）であって、ここで円形底プレート（２２）、円形の壁（２４）および各弦壁（２１、２３、２５）が、化学物質リザーバー（３１、３３、３５）を規定し、Ｎが３以上の整数である、
Ｎ個の弦壁（２１、２３、２５）、
を含む、培養容器挿入部（２０）。
【請求項12】
請求項１１の培養容器挿入部であって、ここで円形底プレート（２２）が、少なくとも１つの化学物質リザーバー（３１、３３、３５）内に存在する少なくとも１種類の識別子（３２、３４、３６）を含む、培養容器挿入部。
【請求項13】
培養容器（１０）であって：底部ディスク（１２）；
底部ディスク（１２）に取り付けられた円周壁（１４）；
および
底部ディスク（１２）に配置された円形底プレート（２２）および円周壁（１４）から離れて位置する円形の壁（２４）を有する培養容器（１０）内に位置する、請求項１１または１２の培養容器挿入部（２０）、
を含む、培養容器（１０）。
【請求項14】
培養容器（１１０）であって：底部ディスク（１１２）；
底部ディスク（１１２）に取り付けられた円周壁（１１４）；
底部ディスク（１１２）に取り付けられた円形の壁（１２４）であって、円周壁（１１４）によって取り囲まれるが、円周壁（１１４）から離れて位置する円形の壁（１２４）；
および
円形の壁（１２４）および底部ディスク（１１２）に取り付けられ、底部ディスク（１１２）のＮ角形部分（４０）、好ましくは正Ｎ角形部分（４０）を取り囲むＮ個の弦壁（１２１、１２３、１２５）であって、
ここで底部ディスク（１１２）、円形の壁（１２４）および各弦壁（１２１、１２３、１２５）が化学物質リザーバー（１３１、１３３、１３５）を規定し、Ｎが３以上の整数である、Ｎ個の弦壁（１２１、１２３、１２５）、
を含む、培養容器（１１０）。
【請求項15】
請求項１４の培養容器であって、ここで底部ディスク（１１２）が、少なくとも１つの化学物質リザーバー（１３１、１３３、１３５）に存在する少なくとも１種類の識別子を含む、培養容器。
【請求項16】
請求項１１または１２の培養容器挿入部あるいは請求項１４または１５の培養容器であって、ここでＮが３である、培養容器挿入部あるいは培養容器。
【請求項17】
請求項１１、１２、または１６のいずれかの培養容器挿入部あるいは請求項１４、１５、または１６のいずれかの培養容器であって、ここで各化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）が、ゲルと化学物質を固化させた混合物で作成された化学物質含有プラグを含み、各化学物質含有プラグがそれぞれ、他の化学物質含有プラグ中の化学物質とは異なる化学物質を含む、培養容器挿入部あるいは培養容器。
【請求項18】
請求項１１、１２、または１６のいずれかの培養容器挿入部あるいは請求項１４、１５、または１６のいずれかの培養容器であって、ここで各化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）が、凍結乾燥形態または乾燥形態の化学物質を含む、培養容器挿入部あるいは培養容器。
【請求項19】
細胞集団（５５）に対する化学物質相互作用効果を判定するキットであって、該キットが：請求項１３～１８のいずれかに記載の培養容器（１０；１１０）；
請求項１３～１８のいずれかに記載の培養容器（１０；１１０）に添加し、固化させて細胞培養基質（５０）とすることを意図する多量の細胞培養基質ゲルであって、
ここでＮ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）の各化学物質リザーバーが各化学物質を含み、Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）が組み合わせ領域（４１、４３、４５）を取り囲む、
細胞培養基質ゲル；
細胞培養基質（５０）上および／または細胞培養基質（５０）内に細胞集団（５５）を配置して所定の時間経過後に、細胞培養基質（５０）の少なくとも１枚の写真を撮影する指示であって、
ここでＮ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）内の化学物質が細胞培養基質（５０）中を拡散し、組み合わせ領域（４１、４３、４５）内の細胞培養基質（５０）において少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を形成し、Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の外側の境界部周辺で細胞培養基質（５０）において実質的に重複のない化学物質濃度勾配が形成する、
写真を撮影する説明書；
Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）について、該少なくとも１枚の写真から、細胞集団（５５）の増殖を実質的に欠如している阻害帯（６０、６２、６４）の阻害端点（６１、６３、６５）を判定する説明書であって、
阻害端点（６１、６３、６５）が化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）の周辺部に位置する、
判定する説明書、
および
Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）の隣接する２つの化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）の各組み合わせについて、該少なくとも１枚の写真から、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）に含まれる化学物質の少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を有する組み合わせ領域（４１、４３、４５）内において、細胞集団（５５）の増殖を含む増殖帯（７０、７２、７４）の増殖端点（７１、７３、７５）を判定する説明書；
Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）に含まれる化学物質の、細胞培養基質（５０）についての拡散係数を規定する情報；
および
隣接する２つの化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）の各組み合わせに関して、隣接する２つの化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）について判定された阻害端点（６１、６３、６５）、隣接する２つの化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）について判定された増殖端点（７１、７３、７５）、および拡散係数を規定する情報に基づき、隣接する２つの化学物質リザーバー（３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５）に含まれる化学物質間の化学物質相互作用効果を判定する説明書、
を含む、キット。
【請求項20】
請求項１９のキットであって：Ｎ種類の化学物質；
および
該Ｎ種類の化学物質と混合し、固化させてＮ個の化学物質リザーバー中の各化学物質含有プラグとすることを意図するゲル、
をさらに含む、キット。
【請求項21】
指示を含むコンピュータープログラム（２４０）であって、該指示が少なくとも１つのプロセッサー（２１０）によって実行される場合に、該指示が：細胞培養基質（５０）上および／または細胞培養基質（５０）内に細胞集団（５５）を配置してから所定の時間経過した後の培養容器（１０）内の細胞培養基質（５０）について撮影された少なくとも１枚の写真を表す画像データを提供すること、ここで培養容器（１０）が、互いに相対的な所定位置にあるＮ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）を含み、Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）が化学物質を含み、Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）が組み合わせ領域（４１、４３、４５）を取り囲み、Ｎが３以上の整数であり、Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）中の化学物質が細胞培養基質（５０）中を拡散し、組み合わせ領域（４１、４３、４５）内の細胞培養基質において少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を形成し、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５）の外側の境界部周辺で細胞培養基質（５０）において実質的に重複のない化学物質濃度勾配が形成される、
画像データを提供すること；
Ｎ個の化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）について、該画像データに基づき、細胞集団（５５）の増殖が実質的に欠如している阻害帯（６０、６２、６４）の阻害端点（６１、６３、６５）を判定することであって、
阻害端点（６１、６３、６５）が化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の外側の境界部周辺に位置する、
判定すること；
少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）について、該画像データに基づき、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質の少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を有する組み合わせ領域（４１、４３、４５）内における細胞集団（５５）の増殖を含む増殖帯（７０、７２、７４）の増殖端点（７１、７３、７５）を判定すること；
および
阻害端点（６１、６３、６５）および増殖端点（７１、７３、７５）に基づいて、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質間の化学物質相互作用効果を判定すること、
を少なくとも１つのプロセッサー（２１０）に指示する、
コンピュータープログラム（２４０）。
【請求項22】
請求項２１のコンピュータープログラムであって、ここで該指示が少なくとも１つのプロセッサー（２１０）によって実行される場合に、該指示が：該画像データに基づき、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）について、化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質の、細胞集団（５５）に関する最小阻害剤濃度（ＭＩＣ）を、阻害端点（６１、６３、６５）に基づいて決定すること；
該画像データに基づき、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）について、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質の混合物の、化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質のＭＩＣを、増殖端点（７１、７３、７５）に基づいて決定すること；
および
該ＭＩＣに基づいて部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ）を決定すること、
を少なくとも１つのプロセッサー（２１０）に指示する、
コンピュータープログラム。
【請求項23】
請求項２２のコンピュータープログラムであって、ここで該指示が少なくとも１つのプロセッサー（２１０）によって実行される場合に、該指示が：該画像データに基づき、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）について、化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質の、細胞培養基質（５５）に関する拡散係数および阻害端点（６１、６３、６５）に基づき、化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質のＭＩＣを決定すること；
および
該画像データに基づき、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）の各化学物質リザーバー（３１、３３、３５）について、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質の混合物中の、化学物質リザーバー（３１、３３、３５）に含まれる化学物質のＭＩＣを、該拡散係数および増殖端点（７１、７３、７５）に基づいて決定すること、
を少なくとも１つのプロセッサー（２１０）に指示する、
コンピュータープログラム。
【請求項24】
請求項２１～２３のいずれかに記載されるコンピュータープログラムであって、ここで該指示が少なくとも１つのプロセッサー（２１０）によって実行される場合に、該指示が：細胞培養基質（５０）の表面（５１）上に細胞集団（５５）を配置してから所定の時間経過後に、培養容器（１０）内の細胞培養基質（５０）の表面（５５）について少なくとも１枚の写真を撮影するようにカメラ（２６０）を制御すること、
を少なくとも１つのプロセッサー（２１０）に指示する、
コンピュータープログラム。
【請求項25】
請求項２１～２４のいずれかに記載されるコンピュータープログラムを含むコンピューター可読性保存媒体（２５０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は一般に、化学物質混合物の細胞集団に対する化学物質相互作用効果を判定することに関するものである。
【背景技術】
【0002】
２種類以上の生体活性化合物が共存する場合には、常に化合物相互作用効果が存在し得る。化合物の混合物における併用効果が、化合物がおのおの単独で発揮する独立作用（相加性）に予想される効果よりも高い効果（正の相乗性）あるいは低い効果（負の相乗性、拮抗作用）である場合には、それら化合物には相互作用が存在する。したがって、特定の生物学的活性を最大化する目的で、正の相乗性を有する複数の化合物を物理的に組み合わせることができる。逆に、負の相乗性を有する他の複数の化合物については、混合物として用いたときに起こる活性阻害を回避する目的で、物理的に個別に作用させることが望ましい場合もある。
【0003】
併用効果および相乗性の最適化は、生体臨床医学の分野では特に重要である。２種類以上の薬剤の併用治療は、癌、および感染性疾患、例えば、細菌、ウイルスまたは真菌による感染性疾患の治療にますます利用されるようになってい。併用療法は治療の有効性を高め、かつ耐性進化を低減するため、単剤療法に比べて好ましい。併用療法の効力は、薬剤の生理的相互作用に関係しており、好ましい正の相乗性（協同的）作用あるいはまた拮抗性作用を発揮し得る。
【0004】
抗生物質に対する耐性が広がりつつあるため、抗生物質の相乗的組み合わせが治療の第１選択肢としてますます用いられるようになっている。抗生物質併用療法は、耐性を有する細菌感染症およびヘテロ耐性細菌を含む合併細菌感染症に対する有効治療を可能にし、それによって死亡率を低減し患者の回復を促進することが示されている。しかし、生物種間および臨床単離株間において薬剤相互作用が異なることもあり［１］、したがって慎重な診断法が治療成功にとって重要であることを、最近のデータは示している。
【0005】
相乗性を定量するには、複数の化合物についてそれぞれ個別の効果と組み合わせ効果とを測定することが必要となる。相乗効果は、典型的には狭い濃度範囲、すなわちＳ字状用量応答曲線の急勾配領域において良好に定量し得るものであるが、そのような曲線は生体試料に応じて数桁のずれが生じ得るため、困難がつきまとうのである。抗生物質相乗性の定量的尺度は、いわゆる部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ）である。２種類の抗生物質ＡおよびＢについてのＦＩＣｉの定義は、ｃＡ／ＭＩＣＡ＋ｃＢ／ＭＩＣＢであるが、ここでＭＩＣＡ／ＢはＡのみのとき、あるいはＢのみのときの最小阻害濃度であり、ｃＡ／ＢはＭＩＣを与えるＡ＋Ｂの混合物における抗生物質ＡまたはＢの濃度を表している。最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、試料における増殖を防ぐ化合物の最小濃度である。
【0006】
相乗性定量の標準的方法は２次元ブロス微量希釈法であるが、これは２種類の化合物の複数の不連続的濃度を通常９×９または８×１２濃度の正方格子（グリッド）、すなわちチェッカーボード状に組み合わせたものである。濃度グリッドが形成されれば、細胞試料を添加してその所定のインキュベーション時間の経過中または経過後に生物学的応答を測定する。３種類以上の薬剤間相乗性の定量に関して、簡易チェッカーボードアッセイが開発されている［２］。
【0007】
相乗性定量に関する別法として、ペトリ皿による半固体寒天表面培養法が開発されている。抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）は、抗生物質またはその他の化合物を染み込ませたペーパーディスクを用いて実施される日常的な試験である。細胞試料を播種した寒天表面上にペーパーディスクを載せる。化合物がディスクから周囲の寒天に拡散することによって濃度勾配の形成が起こり、細胞試料は特徴的阻害帯を除いてＭＩＣのところまで生育することができる。異なる薬剤を含む複数のディスクを近接して配置すると、相乗効果によって阻害帯の形状に歪みが生ずることがある。このように、ＡＳＴディスクの配置を利用して相乗性の定量的検出がこれまでに成されている［３］。類似の方法では紙またはプラスチックの短冊を用いるが、この短冊には化合物濃度勾配を有したコーティングが施され、化合物は所定の様式で寒天中を拡散する［４、５］。阻害帯の拡大は正の相乗性（協同作用）を示すものであり、他方、縮小は拮抗作用を示す。一般に、これらの方法は相乗効果の定性的情報のみを提供するものであって、ＦＩＣｉ値などの定量的情報を与えるものではない。
【0008】
相乗性は短冊の交差構成を用いて定量することができ、２つの短冊を９０°の角度に配置するが、その試験短冊はＭＩＣ点のところで互いに交差する［６］。抗生物質試験短冊交差構成の欠点は、複数工程を必要とすることである。試験短冊がＭＩＣ点の部位で互いに交差する必要があるため、細胞試料のＭＩＣはそれ以前のアッセイで既知となっていなくてはならない。第３の方法は閉鎖寒天拡散区画の利用である［７］；これは播種した寒天表面を、拡散によって均一濃度になる小領域に区分する。この拡散区画によって、寒天プレートにおける不連続濃度および化合物混合物のチェッカーボード様試験が可能になる。
【0009】
したがって、相乗性の定量と最適化に関する迅速簡便な方法であって、臨床検査薬について利用可能であり、また広範な生体活性化合物に応用可能な方法が依然として必要とされるのである。
【発明の概要】
【0010】
本発明の一般的な目標は、化学物質混合物の細胞集団に対する化学物質相互作用効果を判定することである。
【0011】
この目標およびその他の目標は、本明細書中に開示するような実施態様によって達成される。
【0012】
本発明は独立形式請求項によって規定される。本発明のさらなる実施態様は、従属形式請求項によって規定される。
【0013】
本発明の一局面は、細胞集団に対する化学物質相互作用効果を判定する方法に関するものである。該方法は、互いに相対的な所定位置のＮ個の化学物質リザーバーを含む培養容器に細胞培養基質を添加することを含む。Ｎ個の化学物質リザーバーの各化学物質リザーバーはそれぞれ１種類の化学物質を含み、Ｎ個の化学物質リザーバーは組み合わせ領域をとり囲むが、ここでＮは３以上の整数である。該方法はまた、細胞培養基質上および／または基質内に細胞集団を配置すること、および細胞培養基質上および／または基質内の細胞集団を所定の時間培養することを含み、培養中に、Ｎ個の化学物質リザーバー内の化学物質が細胞培養基質中を拡散し、細胞培養基質の組み合わせ領域において少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を形成し、Ｎ個の化学物質リザーバーの外側の境界部周辺の細胞培養基質において実質的に重複のない化学物質濃度勾配を形成する。該方法は、Ｎ個の化学物質リザーバーのうちの少なくとも２つの隣接化学物質リザーバーの各化学物質リザーバーに関して、細胞集団の増殖を実質的に欠如している阻害帯の阻害端点を判定することをさらに含む。阻害端点は、化学物質リザーバーの外側の境界部の周辺部に位置する。該方法は、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバーに関して、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバーに容れられている、または含まれている化学物質の少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を有する組み合わせ領域内において、細胞集団の増殖を含む増殖帯の増殖端点を判定することをさらに含む。該方法はまた、阻害端点および増殖端点に基づいて、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバーに含まれる化学物質間の化学物質相互作用効果を判定することを含む。
【0014】
本発明の別の一局面は、培養容器挿入部に関するものであって、該培養容器挿入部は中央にＮ角形の開口部を有する円形底プレートおよび該円形底プレートの外周に取り付けられた円形の壁を含む。該培養容器挿入部はまた、円形の壁および円形底プレートに取り付けられたＮ個の弦壁であって、中央のＮ角形の開口部を取り囲むＮ個の弦壁を含む。該円形底プレート、該円形の壁および各弦壁が化学物質リザーバーを規定し、ここでＮは３以上の整数である。
【0015】
本発明の関連する一局面においては、培養容器を規定するが、該培養容器は、底部ディスク、その底部ディスクに取り付けられた円周壁、および本発明にしたがう培養容器挿入部を含むものであり、ここで該培養容器挿入部は、底部ディスク上に配置される円形底プレートおよび円周壁から離れて位置する円形の壁を有する培養容器内に配置される。
【0016】
本発明のさらなる局面は、底部ディスク、該底部ディスクに取り付けられた円周壁、および該底部ディスクに取り付けられ、かつ該円周壁によって取り囲まれ該円周壁から離れた位置にある円形の壁を含む培養容器に関するものである。該培養容器はまた、円形の壁および底部ディスクに取り付けられたＮ個の弦壁であって、底部ディスクのＮ角形部分を取り囲む弦壁を含む。該底部ディスク、該円形の壁および各弦壁は化学物質リザーバーを規定し、ここでＮは３以上の整数である。
【0017】
本発明のさらに別の一局面は、細胞集団に対する化学物質相互作用効果を判定するキットに関するものである。該キットは、上記のような培養容器およびその培養容器に添加し固化させて細胞培養基質とすることを意図する多量の細胞培養基質ゲルを含む。Ｎ個の化学物質リザーバーの各化学物質リザーバーは各化学物質を含み、Ｎ個の化学物質リザーバーが組み合わせ領域を取り囲む。該キットはまた、細胞培養基質上および／または基質内の細胞集団を配置してから所定の時間経過後に、細胞培養基質について少なくとも１枚の写真を撮影する指示を含む。Ｎ個の化学物質リザーバー内の化学物質は細胞培養基質中を拡散するので、組み合わせ領域内の細胞培養基質において少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を形成し、Ｎ個の化学物質リザーバーの外側の境界部周辺の細胞培養基質において実質的に重複のない化学物質濃度勾配を形成する。該キットは、該少なくとも１枚の写真から、Ｎ個の化学物質リザーバーの各化学物質リザーバーについて、細胞集団の増殖を実質的に欠如している阻害帯の阻害端点を判定する指示をさらに含む。阻害端点は、化学物質リザーバーの周辺部に位置する。該キットはまた、該少なくとも１枚の写真から、Ｎ個の化学物質リザーバーの隣接する２つの化学物質リザーバーの各組み合わせに関して、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー内の化学物質の少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を有する組み合わせ領域内において、細胞集団の増殖を含む増殖帯の増殖端点を判定する指示を含む。該キットは、Ｎ個の化学物質リザーバーに含まれる化学物質の細胞培養基質における拡散係数を規定する情報をさらに含む。該キットはまた、隣接する２つの化学物質リザーバーについて判定された阻害端点、隣接する２つの化学物質リザーバーについて判定された増殖端点、および拡散係数を規定する情報に基づいて、隣接する２つの化学物質リザーバーの各組み合わせについて、隣接する２つの化学物質リザーバーに含まれる化学物質間の化学物質相互作用効果を評価するための指示を含む。
【0018】
本発明のさらなる局面は、少なくとも１つのプロセッサーによって実行される場合に、細胞培養基質上および／または細胞培養基質内に細胞集団を配置して所定時間経過後に撮影された培養容器内の細胞培養基質の少なくとも１枚の写真を表す画像データを、該少なくとも１つのプロセッサーが提供する指示を含むコンピュータープログラムに関する。培養容器は、互いに相対的な所定位置のＮ個の化学物質リザーバーを含む。Ｎ個の化学物質リザーバーの各化学物質リザーバーは１種類の化学物質を含む。Ｎ個の化学物質リザーバーは組み合わせ領域をとり囲み、Ｎは３以上の整数である。Ｎ個の化学物質リザーバー内の化学物質は細胞培養基質中を拡散し、組み合わせ領域内の細胞培養基質に少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を形成し、Ｎ個の化学物質リザーバーの外側の境界部周辺の細胞培養基質には実質的に重複のない化学物質濃度勾配を形成する。該少なくとも１つのプロセッサーはまた、画像データに基づき、Ｎ個の化学物質リザーバーのうちの少なくとも２つの隣接化学物質リザーバーの各化学物質リザーバーに関して、細胞集団の増殖を実質的に欠如している阻害帯の阻害端点を判定する。阻害端点は、化学物質リザーバーの外側の境界部周辺に位置する。該少なくとも１つのプロセッサーはさらに、画像データに基づき、該少なくとも２つの隣接化学物質リザーバーについて、該少なくとも２つの隣接化学物質リザーバーに含まれる化学物質の少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を有する組み合わせ領域内において、細胞集団の増殖を含む増殖帯の増殖端点を判定する。該少なくとも１つのプロセッサーはさらに、阻害端点および増殖端点に基づき、該少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー中に含まれる化学物質間の化学物質相互作用効果を判定する。
【0019】
本発明の関連する一局面では、上記のようなコンピュータープログラムを含むコンピューター可読性保存媒体を規定する。
【0020】
本発明は、化学物質の組み合わせについての相互作用効果（相乗効果または拮抗作用など）を、単一実験および単一培養容器で定量することを可能にする。本発明は、そのような化学物質相互作用に関する定性的情報を提供するのみならず、該化学物質相互作用の定量をも可能にする。
【0021】
実施態様ならびにさらなる目的およびそれらの利点については、添付図面と共に以下の説明を参照することによって、最も明確な理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】一実施態様の培養容器挿入部を模式的に示す。底面図（上部の図）、側面図（中央部の図）および上面図（下部の図）である。
【図2】細胞培養基質（中央部の図）を添加し、細胞培養（下部の図）後の培養容器挿入部（上部の図）を含む培養容器を模式的に示す。
【図3】一実施態様にしたがう培養容器を模式的に示す。
【図4】別の一実施態様にしたがう培養容器挿入部を模式的に示す。
【図5】さらなる一実施態様にしたがう培養容器挿入部を模式的に示す。
【図6】さらに別の一実施態様にしたがう培養容器挿入部を模式的に示す。
【図7】一実施態様にしたがう培養容器挿入部を模式的に示す。
【図8】別の一実施態様にしたがう培養容器挿入部を模式的に示す。
【図9】培養容器挿入部を有する培養容器について撮影された写真であり、該培養容器挿入部は、化学物質リザーバー周辺部に配置される細胞培養基質の阻害帯を示している。
【図10】培養容器挿入部を有する培養容器について撮影された写真であり、該培養容器挿入部は、その中心部において組み合わせ領域の細胞培養基質に増殖帯を示している。
【図11】本発明にしたがって判定される、３種類の化学物質Ａ、ＢおよびＣについての部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ）を表す図である。
【図12】一実施態様にしたがって、細胞集団に対する化学物質相互作用効果を判定する方法を示すフローチャートである。
【図16】一実施態様にしたがうコンピューターを模式的に示す。
【図17】大腸菌参照株Ｋ１２－ＭＧ１６５５についての自己相互作用の実験を示す。８種類の抗生物質ＡＭＰ、ＣＩＰ、ＣＴＸ、ＧＥＮ、ＦＯＦ、ＮＩＴ、ＭＥＣ、ＴＭＰの自己相互作用すべてについてのＦＩＣｉ。バーは、３重化生物試料における平均ＦＩＣｉ値および標準偏差（ＳＤ）を表す。相互作用はいずれも事実上、相加的であり、１試料ウイルコクソンの符号付き検定ではＦＩＣｉ＝１につき統計的有意差を示すものは全く検出されなかった。
【図18A】ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイの技術的検証を示す。（１８Ａ）参照株である大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌における薬剤相互作用の定量。部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ、平均±標準偏差、試料の多重化：ｎ＝１０）によって表される相乗性。（１８Ｂ）アッセイ精度の分析。反復可能性は同日に実施したアッセイの相対的標準誤差によって表される；破線は標準誤差の中央値を表し、点線は上位および下位の四分位数を表す；ｎ＝６の組み合わせ。再現性は、ＦＩＣｉにおける相対的な日間差異によって表される；破線は相対的差の中央値を表し、点線は上位および下位の四分位数を表す；ｎ＝６の組み合わせ。（１８Ｃ）生物学的および技術的な再現性を定量するための、異なる日および同日の両方の多重化試料を含むプールデータ（多重化：ｎ＝１０）に関する変動係数。抗生物質相互作用によって結果を群分けし、さらに３種類の株間で細かく分ける。（１８Ｄ）Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎの方法によるＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の比較、およびチェッカーボードアッセイ（平均値、ｎ＝１８、株と抗生物質の対の組み合わせ）。方法のＦＩＣｉにおける絶対差を、それらの平均値に対してプロットする。点の小さな変動は、２種類の方法間で偏りがほとんどないことを示唆している。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図18B】ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイの技術的検証を示す。（１８Ａ）参照株である大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌における薬剤相互作用の定量。部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ、平均±標準偏差、試料の多重化：ｎ＝１０）によって表される相乗性。（１８Ｂ）アッセイ精度の分析。反復可能性は同日に実施したアッセイの相対的標準誤差によって表される；破線は標準誤差の中央値を表し、点線は上位および下位の四分位数を表す；ｎ＝６の組み合わせ。再現性は、ＦＩＣｉにおける相対的な日間差異によって表される；破線は相対的差の中央値を表し、点線は上位および下位の四分位数を表す；ｎ＝６の組み合わせ。（１８Ｃ）生物学的および技術的な再現性を定量するための、異なる日および同日の両方の多重化試料を含むプールデータ（多重化：ｎ＝１０）に関する変動係数。抗生物質相互作用によって結果を群分けし、さらに３種類の株間で細かく分ける。（１８Ｄ）Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎの方法によるＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の比較、およびチェッカーボードアッセイ（平均値、ｎ＝１８、株と抗生物質の対の組み合わせ）。方法のＦＩＣｉにおける絶対差を、それらの平均値に対してプロットする。点の小さな変動は、２種類の方法間で偏りがほとんどないことを示唆している。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図18C】ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイの技術的検証を示す。（１８Ａ）参照株である大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌における薬剤相互作用の定量。部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ、平均±標準偏差、試料の多重化：ｎ＝１０）によって表される相乗性。（１８Ｂ）アッセイ精度の分析。反復可能性は同日に実施したアッセイの相対的標準誤差によって表される；破線は標準誤差の中央値を表し、点線は上位および下位の四分位数を表す；ｎ＝６の組み合わせ。再現性は、ＦＩＣｉにおける相対的な日間差異によって表される；破線は相対的差の中央値を表し、点線は上位および下位の四分位数を表す；ｎ＝６の組み合わせ。（１８Ｃ）生物学的および技術的な再現性を定量するための、異なる日および同日の両方の多重化試料を含むプールデータ（多重化：ｎ＝１０）に関する変動係数。抗生物質相互作用によって結果を群分けし、さらに３種類の株間で細かく分ける。（１８Ｄ）Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎの方法によるＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の比較、およびチェッカーボードアッセイ（平均値、ｎ＝１８、株と抗生物質の対の組み合わせ）。方法のＦＩＣｉにおける絶対差を、それらの平均値に対してプロットする。点の小さな変動は、２種類の方法間で偏りがほとんどないことを示唆している。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図18D】ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイの技術的検証を示す。（１８Ａ）参照株である大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌における薬剤相互作用の定量。部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ、平均±標準偏差、試料の多重化：ｎ＝１０）によって表される相乗性。（１８Ｂ）アッセイ精度の分析。反復可能性は同日に実施したアッセイの相対的標準誤差によって表される；破線は標準誤差の中央値を表し、点線は上位および下位の四分位数を表す；ｎ＝６の組み合わせ。再現性は、ＦＩＣｉにおける相対的な日間差異によって表される；破線は相対的差の中央値を表し、点線は上位および下位の四分位数を表す；ｎ＝６の組み合わせ。（１８Ｃ）生物学的および技術的な再現性を定量するための、異なる日および同日の両方の多重化試料を含むプールデータ（多重化：ｎ＝１０）に関する変動係数。抗生物質相互作用によって結果を群分けし、さらに３種類の株間で細かく分ける。（１８Ｄ）Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎの方法によるＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の比較、およびチェッカーボードアッセイ（平均値、ｎ＝１８、株と抗生物質の対の組み合わせ）。方法のＦＩＣｉにおける絶対差を、それらの平均値に対してプロットする。点の小さな変動は、２種類の方法間で偏りがほとんどないことを示唆している。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図19】大腸菌参照株Ｋ１２－ＭＧ１６５５に関するＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）ＵＴＩ抗生物質相互作用を示す。バーは、３重化生物試料の平均ＦＩＣｉ値および標準偏差（ＳＤ）を表す。点線はＦＩＣｉ＝１を示す。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図20A】大腸菌ＵＴＩ臨床的単離株の相互作用スクリーニングを示す。ＦＩＣｉ（平均±標準偏差）で表した抗生物質相互作用。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図20B】大腸菌ＵＴＩ臨床的単離株の相互作用スクリーニングを示す。ＦＩＣｉ（平均±標準偏差）で表した抗生物質相互作用。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図20C】大腸菌ＵＴＩ臨床的単離株の相互作用スクリーニングを示す。ＦＩＣｉ（平均±標準偏差）で表した抗生物質相互作用。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図20D】大腸菌ＵＴＩ臨床的単離株の相互作用スクリーニングを示す。ＦＩＣｉ（平均±標準偏差）で表した抗生物質相互作用。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図20E】大腸菌ＵＴＩ臨床的単離株の相互作用スクリーニングを示す。ＦＩＣｉ（平均±標準偏差）で表した抗生物質相互作用。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図20F】大腸菌ＵＴＩ臨床的単離株の相互作用スクリーニングを示す。ＦＩＣｉ（平均±標準偏差）で表した抗生物質相互作用。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図20G】大腸菌ＵＴＩ臨床的単離株の相互作用スクリーニングを示す。ＦＩＣｉ（平均±標準偏差）で表した抗生物質相互作用。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図20H】大腸菌ＵＴＩ臨床的単離株の相互作用スクリーニングを示す。ＦＩＣｉ（平均±標準偏差）で表した抗生物質相互作用。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図20I】大腸菌ＵＴＩ臨床的単離株の相互作用スクリーニングを示す。ＦＩＣｉ（平均±標準偏差）で表した抗生物質相互作用。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図20J】大腸菌ＵＴＩ臨床的単離株の相互作用スクリーニングを示す。ＦＩＣｉ（平均±標準偏差）で表した抗生物質相互作用。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図20K】大腸菌ＵＴＩ臨床的単離株の相互作用スクリーニングを示す。ＦＩＣｉ（平均±標準偏差）で表した抗生物質相互作用。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図20L】大腸菌ＵＴＩ臨床的単離株の相互作用スクリーニングを示す。ＦＩＣｉ（平均±標準偏差）で表した抗生物質相互作用。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図20M】大腸菌ＵＴＩ臨床的単離株の相互作用スクリーニングを示す。ＦＩＣｉ（平均±標準偏差）で表した抗生物質相互作用。ＦＩＣｉ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図21】抗生物質以外の生体活性化合物の分析におけるＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の利用を示す。
【図22】異なる蛍光蛋白質を発現する混合細菌試料の分析におけるＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の利用を示す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明は一般に、細胞集団に対する化学物質混合物の化学物質相互作用効果の判定に関するものである。
【0024】
本発明は、細胞集団に対する化学物質の組み合わせの相互作用効果を調べるため、および判定するために利用することができる。本発明は、化学物質の組み合わせが細胞集団に対して相互作用効果を有することを確認する、および相互作用効果の程度を定量するために用いることができ、すなわち、定性的情報および定量的情報の両方を提供する。化学物質の組み合わせが相乗作用、阻害作用または拮抗作用を発揮するか否か、あるいは細胞集団に対してただ単に独立した作用または相加的効果を与えるだけであるのか否かについて評価する目的、およびそのような相乗的または阻害性／拮抗的効果を定量する目的においても、本発明を利用することが可能であることを、上記は意味している。
【0025】
本明細書中の「化学物質」は、細胞集団に対して効果を発揮し得る任意の分子、化合物、組成物またはその他の化学物質であって、該細胞集団に関するそのような化学物質と別のもう一つの化学物質の相互作用効果を判定する、分子、化合物、組成物またはその他の化学物質を意味する表現である。そのような化学物質の典型的な例としては、薬剤または治療薬剤（薬剤候補を含む）が挙げられるが、それらのみに限定されるものではない；ここでは、細胞集団に対する異なる薬剤または治療薬剤の組み合わせの相互作用が対象となる。例えば、異なる薬剤または治療薬剤の組み合わせが細胞集団に対して単なる相加的効果を超える効果を発揮し得るか否か、すなわち、薬剤または治療薬剤の組み合わせが、該薬剤または治療薬剤の単独での作用から予想される効果よりも高い効果または大きな効果、すなわち、相乗効果を有しているのか否かを明らかにすることを対象とするものであってもよい。さらに、そのような組み合わせの薬剤または治療薬剤のうちの１つが、他の薬剤または治療薬剤が単独で細胞集団に対して発揮する作用または効果を阻害するか否かを明らかにすること、すなわち、なんらかの拮抗作用が存在するか否かを判定することを対象とするものであってもよい。
【0026】
薬剤または治療薬剤の組み合わせまたはカクテルを、治療に用いる複数の疾患が存在し、そのような治療としては、癌患者の化学療法における細胞増殖抑制性剤または化学療法剤、細菌感染における抗生物質または抗微生物剤、およびまた、そのようなウイルス感染または真菌感染における抗ウイルス剤または抗真菌薬の組み合わせが挙げられる。
【0027】
該化学物質は必ずしも薬剤または治療薬剤である必要はなく、例えば、毒性物質、汚染物質、イオンまたはその他の化学物質であってもよく、ここで細胞集団に対して該化学物質が相互作用効果を有するのか否かを判定することが対象となるのであってもよい。
【0028】
図１２は、一実施態様にしたがって、細胞集団に対する化学物質相互作用効果を判定する方法を示すフローチャートである。この方法については、図１、２、９および１０を参照しながら下で説明する。該方法は工程Ｓ１から開始するが、この工程はＮ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５を互いに相対的な所定位置に含む培養容器１０に、細胞培養基質５０を添加することを含む。Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５は化学物質を含み、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５が図１０に示すような組み合わせ領域４１、４３、４５を取り囲む。この実施態様にしたがえば、パラメーターＮは３以上の整数である。
【0029】
該方法はまた、工程Ｓ２において、細胞培養基質５０上および／または細胞培養基質５０内に細胞集団５５を配置し、細胞培養基質５０上および／または細胞培養基質５０内の細胞集団５５を所定の時間培養することを含むが、このときＮ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の化学物質が細胞培養基質５０中を拡散するので、組み合わせ領域４１、４３、４５内の細胞培養基質５０において少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を形成し、またＮ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部周辺では細胞培養基質５０に実質的に重複のない化学物質濃度勾配を形成する。
【0030】
該方法は、工程Ｓ３において、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５のうちの少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５について、細胞集団５５の増殖を実質的に欠如している阻害帯６０、６２、６４の阻害端点６１、６３、６５を判定することをさらに含む。この阻害端点６１、６３、６５は、化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部に対して相対的に辺縁部に位置する。
【0031】
該方法はまた、工程Ｓ４において、該少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５に関して、該少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質の少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を有する組み合わせ領域４１、４３、４５内において、細胞集団５５の増殖を含む増殖帯７０、７２、７４の増殖端点７１、７３、７５を判定することを含む。
【0032】
図１２の工程Ｓ３およびＳ４は、少なくとも部分的には同時または任意の順序で逐次的に実施することができる；すなわち、工程Ｓ４の前に工程Ｓ３、または工程Ｓ３の前に工程Ｓ４を実施することができる。
【0033】
該方法は、工程Ｓ５において、阻害端点６１、６３、６５および増殖端点７１、７３、７５に基づき、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質間の化学物質相互作用効果を判定することをさらに含む。
【0034】
図１２の方法に用いる培養容器１０は、細胞を培養する任意の容器またはデバイスであり得るが、そのようなものとしては、培養プレート、培養ディッシュ（ペトリ皿など）が挙げられるが、これらにのみに限定されるものではない。
【0035】
一実施態様においては、図１２の工程Ｓ１は、細胞培養基質ゲルを培養容器１０に添加すること、および細胞培養基質ゲルを固化させて細胞培養基質５０とすることを含む。したがって、この実施態様においては、細胞培養基質ゲルを培養容器１０に注ぎ、固化させて、細胞集団５５を、その上および／またはその中で培養し得る細胞培養基質５０とする。
【0036】
該細胞培養基質ゲルおよび細胞培養基質５０は、細胞のインビトロ培養に用いる任意のそのような基質ゲルおよび基質であり得る。そのような細胞培養基質５０の具体例としては、寒天、アガロース、アルギン酸、細菌セルロース、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、ヒドロゲル、ポリ－Ｌ－リジンおよびフィブロネクチンが挙げられるが、それらのみに限定されるものではない。
【0037】
工程Ｓ１において細胞培養基質ゲルを添加することの代替としては、多孔質性細胞培養基質５０などの細胞培養基質５０を培養容器１０に添加し、流し込み、または注ぎ込み、任意選択的に（多孔質）細胞培養基質５０を培養容器１０中で固化させることもできる。実際には、培養容器１０に流し込む、重合する、またはその他の任意の方法で成形させることのできる任意の細胞培養基質１０を、本発明にしたがって利用することが可能であろう。
【0038】
工程Ｓ２において、該細胞培養基質上および／または該細胞培養基質内に細胞集団５５を配置する。好ましい一実施態様においては、細胞集団５５を細胞培養基質５０の表面５１上に配置して、細胞培養基質５０の表面５１上で所定の時間培養する。その後、細胞集団５５は細胞培養基質５０の表面５１上で２次元の（２Ｄ）培養物を生成する。別の一実施態様においては、細胞集団５５を少なくとも部分的に細胞培養基質５０内に配置するのであってもよい。これは、細胞培養基質５０内、および任意選択的に少なくとも部分的には細胞培養基質５０の表面５１上で該細胞を３次元の（３Ｄ）培養物として増殖させるのであってもよいことを意味する。この実施態様においては、細胞集団５５を細胞培養基質ゲルと事前混合するのであってもよく、その場合には工程Ｓ１およびＳ２を、少なくとも部分的には同時に実施する。あるいは、細胞培養基質５０として固化させる前に、細胞集団５５を細胞培養基質ゲルに添加するのであってもよい。
【0039】
培養容器１０は、各化学物質を含むＮ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５を含む。化学物質リザーバー３１、３３、３５は、互いに相対的な所定位置に配置され、いわゆる組み合わせ領域４１、４３、４５を含む中心領域または窓４０を取り囲む。これらの化学物質リザーバー３１、３３、３５は、該化学物質を含むことが意図される任意のリザーバー、チャンバーまたはセルであり得る。化学物質リザーバー３１、３３、３５は、開放リザーバーであって、閉鎖リザーバーではない；すなわち、遮断部または天井部などは一切有していない。このことは、図２に示されるように、化学物質リザーバー３１、３３、３５が細胞培養基質５０に対して開かれており、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質が細胞培養基質５０中を拡散可能であり、それによって細胞培養基質５０に濃度勾配を形成し、細胞培養基質５０の化学物質リザーバー３１、３３、３５から離れた部分において該化学物質の濃度が次第に増加することを意味している。
【0040】
化学物質リザーバー３１、３３、３５からの該化学物質の拡散および化学物質リザーバー３１、３３、３５の互いに相対的な位置は、化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部に対して周辺部にある細胞培養基質５０の部分、すなわち、化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部または末端部と細胞培養基質５０の外縁部との間に位置する細胞培養基質５０の一部分のみが実質的に化学物質リザーバー３１、３３、３５から拡散する化学物質を含むことを意味している。例えば、図９に示される線８０に沿って、化学物質リザーバー３１の外側の境界部から細胞培養基質５０の外縁部に向かって拡散する場合に、化学物質リザーバー３１に含まれる化学物質の濃度勾配が存在し、化学物質リザーバー３１の外側の境界部が高濃度で、細胞培養基質５０の外縁部において化学物質が低濃度またはゼロ濃度となる。さらに、細胞培養基質５０のこの部分において、その他の化学物質リザーバー３３、３５からの化学物質の拡散は実質的に存在しない。したがって、細胞培養基質５０のこの部分では、そのような他の化学物質の濃度は実質的にゼロである。このことは、化学物質リザーバー３１、３３、３５に対して周辺部になる細胞培養基質５０の各部分においては、細胞培養基質５０にＮ種類の実質的に重複のない化学物質濃度勾配が存在することを意味している。
【0041】
化学物質リザーバー３１、３３、３５の化学物質は細胞培養基質５０の周辺部のみならず、中心窓の中心１５または組み合わせ領域４１、４３、４５を伴う部分４０に向かっても拡散する。この中心窓または細胞培養基質５０の部分４０において、該化学物質は組み合わせ領域４１、４３、４５に少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を形成する。このことは、所定の組み合わせ領域４１において、隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３の第１の組み合わせに含まれる化学物質の化学物質濃度勾配は、少なくとも部分的には重複を生じ、他方、別の組み合わせ領域４３においては、隣接する２つの化学物質リザーバー３３、３５の第２の組み合わせに含まれる化学物質の化学物質濃度は少なくとも部分的には重複を生ずることを意味する。このことは、各化学物質リザーバー３１、３３、３５がそれぞれ、それ以外の化学物質リザーバー３１、３３、３５中の化学物質とは異なる化学物質を含む場合には、各組み合わせ領域４１、４３、４５は少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配の固有の組み合わせを含むことを意味している。
【0042】
化学物質リザーバー３１、３３、３５の相互配置の結果として、細胞培養基質５０の中心窓または部分４０は少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を含み、他方、化学物質リザーバー３１、３３、３５よりも外側の細胞培養基質５０の周辺部は実質的に重複のない化学物質濃度勾配を含む。
【0043】
化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部に対して周辺の細胞培養基質５０の領域または部分は各阻害帯６０、６２、６４を含む。阻害帯６０、６２、６４において、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質の濃度は充分高く、細胞集団５５の増殖を防ぐ。化学物質リザーバー３１、３３、３５から細胞培養基質５０の外縁部、すなわち、いわゆる阻害端点６１、６３、６５へ向かって拡散が起こる場合に、この阻害帯６０、６２、６４の末端は、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質の最低濃度であって、細胞集団５５の増殖を防ぎ得る、あるいは阻害し得る最低濃度を表している。
【0044】
細胞培養基質５０の中心窓または部分４０における各組み合わせ領域４１、４３、４５は、細胞集団５５の増殖を含む各増殖帯７０、７２、７４を含む。そのような各増殖帯７０、７２、７４は、該細胞集団が最早増殖していない組み合わせ領域４１、４３、４５内に端点を含む。細胞増殖と細胞増殖欠如との境界のこの端点は、いわゆる増殖端点７１、７３、７５を構成する。この端点において、隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる２種類の化学物質の濃度の組み合わせは、細胞集団５５の増殖を防ぐ、もしくは阻害するのに充分である。
【0045】
この場合に、２種類の化学物質／化学物質リザーバー３１、３３、３５について判定された阻害端点６１、６３、６５に基づき、および２種類の化学物質の化学物質濃度勾配が部分的に重複する組み合わせ領域４１、４３、４５について判定された増殖端点７１、７３、７５に基づき、２種類の化学物質間の化学物質相互作用効果を判定することができる。
【0046】
一実施態様において、該方法は、図１３に示すような２つの付加的工程を含む。図１２の工程Ｓ３の後に、工程Ｓ１０を実施するが、この工程Ｓ１０は、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５について、阻害端点６１、６３、６５に基づき、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質の細胞集団に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）を判定することを含む。図１２の工程Ｓ４の後に図１３の工程Ｓ１１を実施するが、この工程Ｓ１１は、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５について、増殖端点７１、７３、７５に基づき、該少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質の混合物中の化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質のＭＩＣを判定することを含む。
【0047】
次いで、該方法図１２の工程Ｓ５に続く。この実施態様においては、工程Ｓ５は、ＭＩＣに基づいて部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ）を決定することを含む。
【0048】
特定の一実施態様において、工程Ｓ５は、ｃＡ／ＭＩＣＡ＋ｃＢ／ＭＩＣＢに基づいて、あるいは好ましくはｃＡ／ＭＩＣＡ＋ｃＢ／ＭＩＣＢに等しいものとしてＦＩＣｉを決定することを含む。ＭＩＣＡは、化学物質リザーバー３１に含まれる化学物質Ａについて工程Ｓ１０で決定されるＭＩＣを表すものであり、他方、ＭＩＣＢは、隣接化学物質リザーバー３３に含まれる化学物質Ｂについて工程Ｓ１０で決定されるＭＩＣを表す。したがって、これらのＭＩＣ値は各阻害端点６１、６３に基づいて決定される。これに対応して、ｃＡは、工程Ｓ１１において増殖端点７１に基づいて決定されるような化学物質ＡおよびＢのＭＩＣを与える混合物中の化学物質ＡのＭＩＣを表し、他方、ｃＢは、工程Ｓ１１において増殖端点７１に基づいて決定されるような化学物質ＡおよびＢのＭＩＣを与える混合物中の化学物質ＢのＭＩＣを表す。
【0049】
したがって、本発明は、細胞容器１０中の２種類の化学物質の組み合わせについて、単一実験でＦＩＣｉを決定することができる；その理由は、本発明が混合物中の化学物質のＭＩＣのみならず、化学物質の組み合わせについてのＦＩＣｉの決定に必要となる化学物質の個別のＭＩＣについても提供するからである。
【0050】
図１１は、図１０に示す培養容器で試験した３種類の化学物質Ａ、ＢおよびＣについてのＦＩＣｉ値を示す図である。ＦＩＣｉ値が１よりも小さい場合には、相乗効果の存在を表している。そのような相乗効果は、被検化学物質ＡおよびＢの組み合わせについて観察されるものである。ＦＩＣｉ値がおおよそ１に等しい場合には、化学物質ＢおよびＣの組み合わせが示すような相加効果を表している。一般に、ＦＩＣｉ値が１よりも大きい場合には、拮抗作用を表す。本例においては、化学物質ＡおよびＣの組み合わせが拮抗作用を発揮する。臨床的に意義のある相乗効果のレベルは通常０．５よりも小さいＦＩＣｉ値と定義される（ここでは化学物質ＡとＢとの間に見られるような効果）；また、臨床的に意義のある拮抗作用のレベルは通常４よりも大きいＦＩＣｉ値と定義される（ここでは化学物質ＡとＣとの間に見られるような効果）。
【0051】
一実施態様においては、図１３の工程Ｓ１０は、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５について、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質が細胞培養基質５０中を拡散するときの拡散係数および阻害端点６１、６３、６５に基づき、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質のＭＩＣを決定することを含む。この実施態様においては、工程Ｓ１１は、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５について、該拡散係数および増殖端点７１、７３、７５に基づき、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質の混合物中の、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質のＭＩＣを決定することを含む。
【0052】
細胞培養基質５０に関する化学物質の拡散係数を用いて、細胞培養基質５０における距離を該化学物質の濃度に変換することができる。化学物質の化学物質濃度勾配が拡散のフィック則にしたがうと仮定すれば、有限要素モデル（ＦＥＭ）を用いて、移流束も正味の体積源も存在しない場合の対流拡散方程式を解くことにより、該化学物質の濃度（Ｃ）の算出が可能である。該モデルでは、所定の点における化学物質濃度を算出するために、拡散係数（ｄ）、拡散時間（ｔ）および化学物質リザーバー３１、３３、３５における所定の点と細胞培養基質５０における所定の点との間の距離（Ｘ）、すなわち、ある関数ｆ（ ）のＣ＝ｆ（ｄ、ｔ、Ｘ）、を用いる。阻害端点６１、６３、６５または増殖端点７１、７３、７５に対する距離を測定する場合に、参照点として用いる化学物質リザーバー３１、３３、３５の所定の点は、化学物質リザーバー３１、３３、３５の中央または中心、または化学物質リザーバー３１、３３、３５の境界部など、化学物質リザーバー３１、３３、３５における、またはそれらに対するいかなる参照点であってもよい。
【0053】
化学物質の拡散係数は、典型的には用いる特定の細胞培養基質５０に依存する。このことは、所定の化学物質は、第１の細胞培養基質を用いる場合には第１の拡散係数を有し、第２の異なる細胞培養基質を用いる場合には第２の異なる拡散係数を有するものであってもよいことを意味している。
【0054】
ある細胞培養基質についての化学物質の拡散係数は、拡散較正によって決定し得る。そのような拡散較正は、化学物質をそれぞれ異なる濃度で含むＮ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５を含んでいる培養容器１０に、細胞培養基質５０を添加することを含む。例えば、細胞培養基質ゲルを培養容器１０に添加し固化させて細胞培養基質５０とすることができる。拡散較正はまた、細胞培養基質５０上および／または細胞培養基質５０内に被検細胞集団５５を配置し、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の化学物質を細胞培養基質５０中に拡散させながら、細胞培養基質５０上および／または細胞培養基質５０内で被検細胞集団５５を所定の時間培養することを含む。これらの工程は、基本的には図１２の工程Ｓ１およびＳ２に対応するが、各化学物質リザーバー３１、３３、３５が同一の化学物質を、好ましくは異なる濃度で含んでいるという違いを有する。拡散較正において化学物質を異なる濃度で用いることは、特定の化学物質が細胞培養基質５０内を急速に拡散するような場合であっても、読み取り可能な結果が存在するであろうことを意味している。拡散較正に用いる被検細胞集団５５については、化学物質についてのＭＩＣが既知である。
【0055】
拡散較正はまた、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の少なくとも１つの化学物質リザーバー３１、３３、３５について、被検細胞集団５５の増殖を実質的に欠如している阻害帯６０、６２、６４の阻害端点６１、６３、６５を判定することを含む。阻害端点６１、６３、６５は、化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部の周辺部に位置する。この工程は、基本的には図１２の工程Ｓ３に対応する。
【0056】
拡散較正は、被検細胞集団５５についての阻害端点６１、６３、６５および化学物質のＭＩＣに基づいて、化学物質の細胞培養基質５０についての拡散係数を決定することをさらに含む。
【0057】
したがって、阻害帯端部６０、６２、６３の阻害端点６１、６３、６５は、被検細胞集団５５についての化学物質のＭＩＣに対応する、すなわち、実質的にそのＭＩＣに等しい化学物質濃度を有する。Ｃが既知ＭＩＣに等しく、またＸが阻害端点６１、６３、６５と化学物質リザーバー３１、３３、３５における所定の点との間の距離に等しいものとして、上記の方程式、Ｃ＝ｆ（ｄ、Ｘ）を用いることにより、拡散係数（ｄ）を算出することができる。
【0058】
拡散較正に用いる被検細胞集団５５は、該化学物質についてのＭＩＣが既知であって、細胞培養基質５０上および／または細胞培養基質５０内で培養可能ないかなる細胞集団であってもよい。
【0059】
拡散較正は、化学物質相互作用効果を判定する方法を実施する前に、別個のプロセスとして実施することができる。あるいは、拡散較正を実施し、次いで、後に化学物質相互作用効果を判定する方法を実施する際に用いる目的で、その情報を保存する。したがって、該方法に用いる拡散係数を表またはリストから取り出すことが可能であり、例えば、上記の拡散較正を用いて予め拡散係数を決定しておくのであってもよい。
【0060】
細胞集団５５は、細胞培養基質５０上および／または細胞培養基質５０内で所定の時間培養する。この培養時間は、細胞が細胞培養基質５０上および／または細胞培養基質５０内で増殖し、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質が細胞培養基質５０に拡散して化学物質濃度勾配を形成することが可能であるように選択される。
【0061】
該培養時間は長すぎてはいけない。その理由は、そのような場合に、最終的に化学物質が細胞培養基質５０に拡散して基本的に細胞培養基質５０における化学物質の濃度が均一になり、化学物質濃度勾配が最早存在しなくなるからである。また、該培養時間は短すぎてもいけない。その理由は、細胞培養基質５０において化学物質濃度勾配が形成される時間を経過しておらず、また細胞培養基質５０上および／または細胞培養基質５０内で細胞集団５５が増殖するのに充分な時間が経過していないからである。
【0062】
該所定の時間は、一実施態様においては、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質の拡散係数に基づいて、および好ましくは細胞集団５５の細胞分裂時間に基づいて選択される。典型的な一実施態様においては、該所定の時間は、６時間～３６時間内の時間、好ましくは８時間～３２時間内の時間、およびより好ましくは１０時間～３０時間内の時間から選択される。現在の好ましい時間は、１２時間～２４時間である。したがって、典型的な一実施態様においては、細胞培養基質５０上および／または細胞培養基質５０内で細胞集団５５を一晩培養する。
【0063】
一実施態様においては、該方法は、図１４に示すような付加的工程Ｓ２０を含む。この工程Ｓ２０は、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５に、ゲルと混合した化学物質を添加し、そのゲルを固化させて化学物質含有プラグとすることを含む。
【0064】
この実施態様では、したがって、図１２の工程Ｓ１において細胞培養基質または細胞培養基質ゲルを加える前に、各化学物質リザーバー３１、３３、３５が化学物質含有プラグを含む。化学物質を混合したゲルは、工程Ｓ１で添加した細胞培養基質ゲルであってもよく、あるいは化学物質含有プラグとして固化させることのできる別のゲルであってもよい。しかし、そのような化学物質含有プラグに含まれる化学物質は、培養容器１０に形成される細胞培養基質５０内を化学物質含有プラグから拡散可能でなければならない。
【0065】
図１５は、化学物質リザーバー３１、３３、３５に化学物質を提供する別の一実施態様を示している。この実施態様においては、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５は、凍結乾燥または乾燥形態の化学物質を含む。そのような場合には、工程Ｓ２１において、ゲルをＮ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５に添加する。次いで、該化学物質をゲルに溶解または分散させ、ゲルを化学物質含有プラグとして固化させる。
【0066】
工程Ｓ２１は、図１２の工程Ｓ１とは別にまたは工程Ｓ１と共に実施することができる。前者の場合には、まずゲルを化学物質リザーバー３１、３３、３５に添加して、化学物質含有プラグとして固化させる。そのような場合には、該ゲルは工程Ｓ１で添加した細胞培養基質ゲルであってもよく、あるいは化学物質含有プラグとして固化させる別のゲルであってもよい。後者の場合には、該化学物質含有プラグは化学物質リザーバー３１、３３、３５に存在する細胞培養基質５０の一部である。化学物質リザーバー３１、３３、３５を凍結乾燥化学物質または乾燥化学物質と共に用いる場合には、まず、工程Ｓ２１において、化学物質リザーバー３１、３３、３５に化学物質含有プラグを形成させることが一般的に好ましく、次いで別の工程として、工程Ｓ１において細胞培養基質または細胞培養基質ゲルを添加してゲル中で該化学物質を良好に溶解または分散させ、少なくとも実質的に均一な所定の化学物質濃度を有する化学物質含有プラグを得る。
【0067】
一実施態様においては、図１２の工程Ｓ１は、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５を覆うように所定容積の細胞培養基質ゲルを培養容器１０に添加し、細胞培養基質ゲルを細胞培養基質５０として固化させることを含む。したがって、化学物質リザーバー３１、３３、３５が覆われた細胞培養基質５０の形成に充分な容量の細胞培養基質ゲルを培養容器１０に添加しなくてはならない。
【0068】
具体例を示せば、標準的な９０ｍｍペトリ皿に対して所定容積である２５ｍＬを用いることができる。別の培養容器１０については、所定容積は好ましくは、培養容器挿入部２０を覆うように算出される。特定の一例においては、培養容器挿入部２０を、好ましくは少なくとも２ｍｍの高さであって、かつ好ましくは１０ｍｍ未満の高さまで覆う必要がある。
【0069】
所定容積の細胞培養基質ゲルを用いることは、細胞培養基質５０の表面５１上に細胞集団を配置し、細胞培養基質５０の表面５１上で細胞集団５５を培養する場合には、特に有益である。そのような場合には、該化学物質は細胞培養基質５０中を拡散し、細胞培養基質５０の表面５１に沿って組み合わせ領域４１、４３、４５内で少なくとも部分的には重複する化学物質濃度を形成し、化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部の周辺で細胞培養基質５０の表面５１に沿って実質的に重複のない化学物質濃度勾配を形成する。
【0070】
該細胞培養基質ゲルのこの所定容積は、好ましくは上記の拡散較正においても用いられる。
【0071】
該細胞培養基質ゲルの所定容積は、培養容器１０の容積に少なくとも部分的には依存する。
【0072】
一実施態様においては、図１２の工程Ｓ３は、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５について、阻害帯６０、６２、６４の阻害端点６１、６３、６５を判定することを含む。工程Ｓ４は、この実施態様においては、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５の各組み合わせについて、隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質の少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を有する組み合わせ領域４１、４３、４５内で、増殖帯７０、７２、７４の増殖端点７１、７３、７５を判定することを含む。この実施態様においては、工程Ｓ５は、隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５の各組み合わせに関して、隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５について判定された阻害端点６１、６３、６５および隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５について判定された増殖端点７１、７３、７５に基づいて、隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質間の化学物質相互作用効果を判定することを含む。
【0073】
したがって、この実施態様においては、Ｎ個の阻害端点６１、６３、６５およびＮ個の増殖端点７１、７３、７５を判定し、隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５とそこに含まれる化学物質との各対に関して、化学物質相互作用効果を判定する。例えば、化学物質Ａ、ＢおよびＣを含む３種類の化学物質リザーバー３１、３３、３５が含まれている図１、２、９および１０に示すような培養容器１０を用いて、化学物質ＡとＢの間、化学物質ＡとＣの間、および化学物質ＢとＣの間の化学物質相互作用効果を判定することができる。
【0074】
一実施態様においては、図１に示すような円の外周に沿って互いに相対的な所定位置にＮ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５を配置する。そのような一実施態様においては、阻害端点６１、６３、６５は、円の中心１５および化学物質リザーバー３１、３３、３５を通る軸８０に沿い、化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部に対して周辺部の軸８０上の１点に位置する。
【0075】
したがって、そのような一実施態様においては、阻害端点６１、６３、６５は、円の中心１５に対して放射状、かつ化学物質リザーバー３１、３３、３５を通る半径の線上に位置する。
【0076】
図２、９および１０に示すような培養容器１０は、培養容器挿入部２０内に３種類の化学物質リザーバー３１、３３、３５を含むので、すなわち、パラメーターＮが３である。しかし、この実施態様は、図４～６および８に示すような３種類超の化学物質リザーバー３１、３３、３５、３７、３９を利用することを含むが、それのみに限定されるものではない。培養容器１０が３種類超の化学物質リザーバー３１、３３、３５、３７、３９を含む場合には、一般的に非隣接化学物質リザーバーの濃度勾配は、典型的には培養容器挿入部２０の中央部で重複し、そのため化学物質相互作用効果を判定するための計算がより複雑になる。
【0077】
したがって、好ましい一実施態様においては、パラメーターＮは３であり、それによって化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質のあらゆる組み合わせの化学物質相互作用効果を単一実験で試験することが可能になる。
【0078】
一実施態様においては、各化学物質リザーバー３１、３３、３５は、円の外周に整列する円周壁２４の間において、図１に示すような弦壁２１、２３、２５によって取り囲まれる。そのような一実施態様においては、３つの弦壁２１、２３、２５が三角形４０を取り囲む。したがって、そのような一実施態様においては、該中心窓または中心部は三角形４０の形状の内部にある。
【0079】
好ましい一実施態様においては、各化学物質リザーバー３１、３３、３５の容積は同一であり、そのため各弦壁２１、２３、２５は同一の長さを有する。そのような一実施態様においては、３つの弦壁２１、２３、２５で取り囲まれる三角形４０は正三角形４０である。しかし、この実施態様はそれのみに限定されるものではない。例えば、３つの弦壁２１、２３、２５で取り囲まれる三角形４０が二等辺三角形４０のこともあり得る。そのような一実施態様においては、化学物質リザーバー３１、３３の２つが、同一容積を有し、それらの弦壁２１、２３が同一の長さであり、他方、残りの化学物質リザーバー３５の容積は異なり、その弦壁２５の長さが異なるのであってもよい。そのような場合には、化学物質濃度勾配の解像度は、異なる化学物質および化学物質リザーバー３１、３３、３５に応じて異なるものとなる。
【0080】
細胞培養基質５０内および／または細胞培養基質５０上で培養する細胞集団５５は、任意の単一種類の細胞集団または複数種類の細胞の混合物であり得る。該細胞の具体的な例としては、例えば、細菌性細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、ヒト細胞を含む動物細胞（不死化細胞株、原発性癌細胞および試料に由来する培養物）を挙げることができるが、それらのみに限定されるものではない。細胞はまた、ファージ感染した細菌およびウイルス感染した真核細胞のこともあり得る。例えば、細胞集団５５は、生体試料（患者から取得される試料など）から得られることもあり得る。さらに、生体試料としては、体液試料（血液試料、血漿試料、血清試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、または尿試料など）、または身体組織試料（生検試料）、または体液または組織試料から単離および任意選択的に精製される細胞のこともあり得る。
【0081】
本発明は、単離または精製した細胞試料について利用され得るのみならず、実際のところ組み合わせ細胞試料（すなわち、実施例５に示すような２種類以上の異なる細胞種または細胞株を含む試料）中の１種類以上の細胞について化学物質相互作用効果を判定する目的で、利用するのであってもよい。このことは、本発明にしたがって細胞を分析する前に行うべき、細胞または株の精製工程の必要性が減ることを意味している。好ましい一実施態様においては、細胞混合物中の異なる細胞または株は、好ましくは細胞培養基質上および／または細胞培養基質内で判別可能であり、特に視覚的識別が可能である。例えば、個々の細胞の形状（桿菌性対一般的な円形の形状を有する球菌性細胞など）によって、混合物中の細胞または株のうちの１種類以上が蛍光蛋白質を発現する場合には蛍光測定または顕微鏡法によって、あるいは混合物中の細胞または株のうちの１種類以上が色素または比色標識を発現する場合には比色測定または顕微鏡法によって、などで、個々の細胞または株を同定および分離することができる。
【0082】
本発明の方法の典型的応用は、細菌集団に対する抗微生物剤（抗生物質など）の組み合わせについてのＦＩＣｉ値決定に関連するものである。細菌集団は、例えば、細菌感染症に罹患している対象の血液培養物またはその他の体液あるいは組織試料に由来するものであってもよい。その場合には、該細菌集団の増殖阻害に有効であり、細菌感染症と戦うための、該対象に投与し得る抗微生物剤の好適な組み合わせを見つけ出す目的で、該方法を利用することができる。
【0083】
そのような特定の一実施態様において、図１、２、９および１０に示すような細胞容器１０を用いる場合には、図１２の工程Ｓ１は、互いに相対的な所定位置に３種類の化学物質リザーバー３１、３３、３５を含む培養容器１０に、該細胞培養基質ゲルを添加し、該細胞培養基質ゲルを固化させて細胞培養基質５０とすることを含む。この特定の一実施態様においては、３種類の化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５は、抗微生物剤を含む。工程Ｓ２は、細菌集団５５を細胞培養基質５０上および／または細胞培養基質５０内、好ましくは細胞培養基質５０の表面５１上に配置し、細胞培養基質５０上および／または細胞培養基質５０内、好ましくは細胞培養基質５０の表面５１上で、所定の時間、好ましくは１２時間～２４時間の時間内から選択される時間、細菌集団５５を培養することを含む。このとき３種類の化学物質リザーバー３１、３３、３５の抗微生物剤が細胞培養基質５０中を拡散するので、組み合わせ領域４１、４３、４５内の細胞培養基質５０において少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を形成し、また３種類の化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部周辺では細胞培養基質５０に実質的に重複のない化学物質濃度勾配を形成する。工程Ｓ３は、各化学物質リザーバー３１、３３、３５について、細菌集団５５の増殖を実質的に欠如している阻害帯６０、６２、６４の阻害端点６１、６３、６５を判定することを含む。この実施態様においては、阻害帯６０、６２、６４の端点６１、６３、６５は、円の中心１５および化学物質リザーバー３１、３３、３５を通る軸８０に沿い、化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部周辺に位置する軸８０上の１点に位置する。工程Ｓ４は、隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５の各組み合わせについて、隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる抗微生物剤の少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を有する組み合わせ領域４１、４３、４５において、細菌集団５５の増殖を含む増殖帯７０、７２、７４の増殖端点７１、７３、７５を判定することを含む。
【0084】
この特定の一実施態様においては、該方法は、図１３に示すような工程Ｓ１０およびＳ１１をさらに含む。そのような場合においては、工程Ｓ１０は、各化学物質リザーバー３１、３３、３５について、阻害端点６１、６３、６５および化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる抗細菌剤の、細胞培養基質５０に関する拡散係数に基づき、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる該抗細菌剤の細菌集団５５に関するＭＩＣを決定することを含む。工程Ｓ１１は、隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５について、増殖端点７１、７３、７５および該拡散係数に基づき、隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質の混合物中において、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる抗微生物剤のＭＩＣを決定することを含む。
【0085】
該方法は、次いで工程Ｓ５において、該ＭＩＣに基づきＦＩＣｉを決定することを含む。
【0086】
本発明はまた、細胞集団に対する化学物質相互作用効果を判定する方法に用いることのできる培養容器挿入部２０に関するものである。一実施態様においては、培養容器挿入部２０は、中央にＮ角形の開口部４０、好ましくは、中央に正Ｎ角形開口部４０を有する円形底プレート２２を含む。一実施態様においては、培養容器挿入部２０は、円形底プレート２２の外周に取り付けられた円形の壁２４を含む。細胞培養基質２０はまた、この実施態様において、円形の壁２４および円形底プレート２２に取り付けられ、中央のＮ角形の開口部４０を取り囲むＮ個の弦壁２１、２３、２５を含む。円形底プレート２２、円形の壁２４および各弦壁２１、２３、２５は、化学物質リザーバー３１、３３、３５を規定し、Ｎは３以上の整数である。
【0087】
一実施態様においては、円形底プレート２２は、少なくとも１つの化学物質リザーバー３１、３３、３５内に存在する少なくとも１種類の識別子３２、３４、３６を含む。図１は、そのような識別子３２、３４、３６を示すものである。少なくとも１つの化学物質リザーバー３１、３３、３５が、そのような１つの識別子３２、３４、３６を含むのであれば一般的には充分であり、その理由は、残りの化学物質リザーバー３１、３３、３５は、この化学物質リザーバー３１、３３、３５に相対的な所定位置に識別され得るということである。しかし、好ましい一実施態様においては、各化学物質リザーバー３１、３３、３５は、図１に示されるような各識別子３２、３４、３６を含む。識別子３２、３４、３６は、下部プレート２２に付けられるいかなる識別子（文字、数またはその他の目印など）であってもよい。
【0088】
細胞培養挿入部２０は各種材料によって作成し得るが、そのような材料としては、ポリマー、プラスチック、金属合金を含む金属、ガラスおよびセラミックが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。該材料は、化学物質リザーバー３１、３３、３５に入れる化学物質に対して不活性でなければならない、すなわち、該化学物質と反応してはならない。該材料はまた、好ましくは滅菌可能なものである必要があり、そのような滅菌は、オートクレーブ滅菌、化学的滅菌および／または放射線滅菌などによるものである。
【0089】
細胞培養挿入部２０は使い捨てであってもよく、その場合には使用後に廃棄される。あるいは、細胞培養挿入部２０は再使用可能であってもよく、その場合には複数回の実験において清掃および滅菌後に使用される。
【0090】
プラスチックの具体的例としては、従来から用いられている細胞培養用プラスチックが挙げられ、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエチレンテレフタル酸（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ナイロンポリアミド（ＰＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリフェニレンスルファイド（ＰＰＳ）およびそれらの共重合体が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。
【0091】
金属の具体的例としては、チタン、アルミニウム、銅、亜鉛およびマンガンならびにその合金およびスチールが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。
【0092】
セラミックの具体的例としては、炭素およびシリコンを基礎とする結晶および非結晶性セラミックが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。
【0093】
細胞培養挿入部２０は様々な製造加工法により製造することができ、そのような加工法としては、３Ｄプリンティング、成形加工、機械加工、鋳造加工および刻彫加工が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。
【0094】
一実施態様においては、細胞培養挿入部２０は、光学的に透明な材料または少なくとも光学的に半透明の材料から作成する。
【0095】
本発明はまた、図２に例示するような底部ディスク１２、および底部ディスク１２に取り付けられた円周壁４を含む培養容器１０に関するものである。培養容器１０はまた、培養容器１０内に配置される本発明の培養容器挿入部２０を含むが、培養容器１０は底部ディスク１２の上に配置される円形底プレート２２および円周壁１４から離れて位置する円形の壁２４を有している。
【0096】
この実施態様においては、培養容器挿入部２０は培養容器１０から分離しており、図２に示すように培養容器１０内に置くように設計されている。この実施態様においては、培養容器１０は培養容器挿入部２０を設置する細胞培養プレートまたはディッシュ（ペトリ皿など）などのいかなる培養容器１０であってもよい。その場合には、培養容器１０は、図２に示すような単一の培養容器挿入部２０または複数の培養容器挿入部２０を含んでいてもよく、すなわち、培養容器１０のサイズ（直径）に対する培養容器挿入部２０のサイズ（直径）に応じて、少なくとも２つの培養容器挿入部２０を培養容器１０内に配置することができる。
【0097】
該少なくとも１つの培養容器挿入部２０は、円形底プレート２２と共に培養容器１０の底部ディスク１２上、好ましくは、底部ディスク１２の中心位置に配置される。特に、培養容器挿入部２０の円形の壁２４と培養容器１０の円周壁１４との間にある程度の空間または距離が存在するように、培養容器挿入部２０を培養容器１０内に配置すべきである。これによって、化学物質が円周壁１４に向かって周辺部に拡散する余裕が与えられるので、化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部周辺に実質的に重複のない化学物質濃度勾配が形成される。
【0098】
上記の実施態様においては、培養容器挿入部２０は培養容器１０から分離している。図３は、培養容器１１０および単一要素としての挿入部を含む別の一実施態様を示している。そのような一実施態様においては、培養容器１１０は、底部ディスク１１２および底部ディスク１１２に取り付けられた円周壁１１４を含む。培養容器１１０はまた、底部ディスク１１２に取り付けられた円形の壁１２４であって、円周壁１１４によって取り囲まれ、円周壁１１４から離れた距離に位置する円形の壁１２４を含む。培養容器１１０は、円形の壁１２４および底部ディスク１１２に取り付けられたＮ個の弦壁１２１、１２３、１２５であって、底部ディスク１１２のＮ角形部分４０、好ましくは正Ｎ角形部分４０を取り囲むＮ個の弦壁１２１、１２３、１２５をさらに含む。この実施態様においては、底部ディスク１１２、円形の壁１２４および各弦壁１２１、１２３、１２５が、化学物質リザーバー１３１、１３３、１３５を規定し、Ｎは３以上の整数である。
【0099】
一実施態様においては、底部ディスク１１２は、少なくとも１つの化学物質リザーバー１３１、１３３、１３５の内部に存在する、少なくとも１種類の識別子を含む。
【0100】
上記で説明されるように、パラメーターＮは好ましくは３であるが、４、５、６、またはそれ以上の数など、より大きいものであってもよい。
【0101】
図２に示すような培養容器１０または図３に示すような培養容器１１０は、培養容器挿入部２０について本明細書中で前述したような材料（ポリマー、プラスチック、金属合金を含む金属、ガラスおよびセラミックなど）から作成することができる。
【0102】
一実施態様においては、培養容器挿入部２０または培養容器１１０内の各化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５は、ゲルおよび化学物質の混合物を固化させることによって作成された化学物質含有プラグを含む。そのような一実施態様においては、各化学物質含有プラグはそれぞれ、好ましくは他の化学物質含有プラグ中の化学物質とは異なる化学物質を含む。
【0103】
別の一実施態様においては、培養容器挿入部２０または培養容器１１０内の各化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５は、凍結乾燥形態または乾燥形態の化学物質を含む。そのような一実施態様においては、凍結乾燥または乾燥させた各化学物質のそれぞれは、好ましくは凍結乾燥または乾燥させた残りの化学物質とは互いに異なる。
【0104】
これらの実施態様においては、凍結乾燥形態または乾燥形態または化学物質含有プラグ形態のいずれかの化学物質を、培養容器挿入部２０または培養容器１１０に予め載せておく。
【0105】
図４～８は、該実施態様の別の培養容器挿入部２０を示している。これらの培養容器挿入部２０は、図１に示すような培養容器挿入部２０の代わりに、化学物質相互作用効果を判定する方法において培養容器１０と共に用いることができる。あるいは、図３の培養容器１１０は、図３に示すような化学物質リザーバー１３１、１３３、１３５の代わりに、図４～９のいずれかのように配置され、規定される化学物質リザーバー３１、３３、３５、３７、３９を備えていてもよい。
【0106】
図４は、培養容器挿入部２０の外側の境界部を規定する四角形、好ましくは正方形の壁２４を含む培養容器挿入部２０を示している。培養容器挿入部２０はまた、正方形の壁２４に内接する円形の壁２６を含む；すなわち、円形の壁２６の直径が好ましくは正方形の壁２４の辺長に等しい。培養容器挿入部２０の円形の壁２６、正方形の壁２４、および下部プレート２２が、４つの化学物質リザーバー３１、３３、３５、３７を規定する。円形の壁２６は中央の円形開口部または窓４０を取り囲む。
【0107】
図５は、培養容器挿入部２０の外側の境界部を規定する円形の壁２４を含む培養容器挿入部２０の別の一実施態様を示す。培養容器挿入部２０はまた、円形の壁２４で取り囲まれる正方形の壁２６を含む；すなわち、正方形の壁２６の対角線は、好ましくは円形の壁２４の直径に等しい。培養容器挿入部２０の正方形の壁２６、円形の壁２４、および下部プレート２２が、４つの化学物質リザーバー３１、３３、３５、３７を規定する。正方形の壁２６は中央の正方形開口部または窓４０を取り囲む。
【0108】
図６は、培養容器挿入部２０の外側の境界部を規定する円形の壁２４を含む培養容器挿入部２０のさらなる一実施態様を示す。培養容器挿入部２０はまた、円形の壁２４によって取り囲まれる五角形の壁２６を含む。培養容器挿入部２０の五角形の壁２６、円形の壁２４、および下部プレート２２が、５つの化学物質リザーバー３１、３３、３５、３７、３９を規定する。五角形の壁２６は中央の五角形の開口部または窓４０を取り囲む。
【0109】
図１、５および６に示すような実施態様は、円形の壁２４および円形の壁２４で取り囲まれるＮ角形の壁２６を有するものとみなすこともできる。図１において、Ｎは３、すなわち、三角形であり；図５において、Ｎは４、すなわち、正方形であり；および図６において、Ｎは５、すなわち、五角形である。この概念は、５よりも大きいＮの値に関してもさらに拡張することができる。
【0110】
図７は、培養容器挿入部２０の外側の境界部を規定する三角形の壁２４を含む培養容器挿入部２０の一実施態様を示す。培養容器挿入部２０はまた、三角形の領域を３種類の化学物質リザーバー３１、３３、３５に区分する３つの壁２１、２３、２５、および中心窓または開口部４０を含む。好ましい一実施態様においては、これら３つの壁２１、２３、２５は長さが同一であり、各壁２１、２３、２５は好ましくは三角形の壁２４の辺の１つに平行である。培養容器挿入部２０の３つの壁２１、２３、２５、三角形の壁２４、および下部プレート２２が、３種類の化学物質リザーバー３１、３３、３５を規定する。
【0111】
図８は、培養容器挿入部２０の外側の境界部を規定する外側の四角形、好ましくは正方形の壁２４を含む培養容器挿入部２０のさらなる一実施態様を示す。培養容器挿入部２０はまた、外側の正方形の壁２４で取り囲まれる内部の四角形、好ましくは正方形の壁２６を含む；すなわち、内部の正方形の壁２６の対角線は、好ましくは外側の正方形の壁２４の辺長に等しい。培養容器挿入部２０の内部の正方形の壁２６、外側の正方形の壁２４、および下部プレート２２が、４つの化学物質リザーバー３１、３３、３５、３７を規定する。内部の正方形の壁２６は、中央の正方形開口部または窓４０を取り囲む。
【0112】
本発明の他の一局面は、細胞集団５５に対する化学物質相互作用効果を判定するキットに関する。該キットは、実施態様のいずれかにしたがう培養容器１０；１１０を含む。該キットはまた、培養容器１０；１１０に添加して細胞培養基質５０として固化させることを意図する多量の細胞培養基質ゲルを含む。Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５の各化学物質リザーバーは各化学物質を含み、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５は組み合わせ領域４１、４３、４５を取り囲む。該キットはまた、細胞培養基質５０中および／または細胞培養基質５０上、好ましくは表面５１上に細胞集団５５を配置して所定時間経過後に、細胞培養基質５０、好ましくは細胞培養基質５０の表面５１の少なくとも１枚の写真を撮影することの指示を含む。Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の化学物質は細胞培養基質５０中を拡散するので、組み合わせ領域４１、４３、４５内の細胞培養基質５０において少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を形成し、またＮ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部周辺では細胞培養基質５０に実質的に重複のない化学物質濃度勾配を形成する。
【0113】
該キットは、該少なくとも１枚の写真から、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５について、細胞集団５５の増殖を実質的に欠如している阻害帯６０、６２、６４の阻害端点６１、６３、６５を判定することの指示をさらに含む。阻害端点６１、６３、６５は、化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５に対して周辺部に配置される。該キットはまた、該少なくとも１枚の写真から、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５の隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５の各組み合わせについて、該少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５に含まれる化学物質の、少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を有する組み合わせ領域４１、４３、４５内における、細胞集団５５の増殖を含む増殖帯７０、７２、７４の増殖端点７１、７３、７５を判定することの指示を含む。
【0114】
該キットは、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５に含まれる化学物質の、細胞培養基質５０に関する拡散係数を規定する情報を含む。該キットはまた、隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５の各組み合わせについて、隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５について判定された阻害端点６１、６３、６５、隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５について判定された増殖端点７１、７３、７５、および拡散係数を規定する情報に基づき、隣接する２つの化学物質リザーバー３１、３３、３５；１３１、１３３、１３５に含まれる化学物質間の化学物質相互作用効果を判定することの指示を含む。
【0115】
特定の一実施態様においては、該キットは、阻害端点６１、６３、６５、増殖端点７１、７３、７５および本明細書中で上述した拡散係数を規定する情報によって決定されたＭＩＣ値に基づき、ＦＩＣｉ値を決定することの指示を含む。
【0116】
一実施態様においては、該キットはまた、Ｎ種類の化学物質を含み、かつそのＮ種類の化学物質に混合してＮ個の化学物質リザーバー中の各化学物質含有プラグとして固化させるゲルを含む。
【0117】
図１６は、本発明の実施態様の化学物質相互作用効果を判定する目的で使用することのできるプロセッサー２１０およびメモリー２２０を含むコンピューター２００の模式的ブロック図である。そのような一実施態様においては、化学物質相互作用効果の判定を、コンピュータープログラム２４０によって実行し得るが、このコンピュータープログラム２４０は、コンピューター２００の１つ以上のプロセッサー２１０を含む処理回路による実行のためのメモリー２２０に記憶させる。プロセッサー２１０およびメモリー２２０は、ソフトウェアの正常な実行が可能となるように相互連結される。入力／出力（Ｉ／Ｏ）ユニット２３０は、好ましくはカメラ２６０からの画像データを受信可能となるように、プロセッサー２１０および／またはメモリー２２０に連結される。
【0118】
用語「プロセッサー」は、一般的な意味における、特定の処理、判定または計算タスクを実行するプログラムコードまたはコンピュータープログラムの命令の実行が可能な回路、システムまたはデバイスであると解釈すべきである。したがって、１つ以上のプロセッサー２１０を含む該処理回路は、コンピュータープログラム２４０を実行する場合に、本明細書中に記載のような明確に規定された処理タスクを実行することが意図される。
【0119】
プロセッサー２１０は、専ら上記の工程、機能、処置および／またはブロックのみを実行しなければならないという訳ではなく、他のタスクをも実行するものであってもよい。
【0120】
特定の一実施態様においては、コンピュータープログラム２４０は、少なくとも１つのプロセッサー２１０によって実行される場合に、細胞培養基質５０上、および／または細胞培養基質５０内、好ましくは胞培養基質５０の表面５１上に細胞集団５５を配置して所定の時間経過した後に、培養容器１０内の細胞培養基質５０の表面５１を撮影した少なくとも１枚の写真を表す画像データを、少なくとも１つのプロセッサー２１０に提供させる指示を含む。培養容器１０は、互いに相対的な所定位置にＮ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５を含む。Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５は化学物質を含み、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５は組み合わせ領域４１、４３、４５を取り囲む。Ｎは３以上の整数である。Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の化学物質は細胞培養基質５０中を拡散するので、組み合わせ領域４１、４３、４５内の細胞培養基質に少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を形成し、またＮ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部周辺で細胞培養基質５０に実質的に重複のない化学物質濃度勾配を形成する。また、該画像データに基づいて、Ｎ個の化学物質リザーバー３１、３３、３５のうちの少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５に関し、細胞集団５５の増殖を実質的に欠如している阻害帯６０、６２、６４の阻害端点６１、６３、６５を、該少なくとも１つのプロセッサー２１０に判定させる。阻害端点６１、６３、６５は、化学物質リザーバー３１、３３、３５の外側の境界部の周辺部に位置する。さらに、該画像データに基づき、該少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５に関し、該少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質の少なくとも部分的には重複する化学物質濃度勾配を有する組み合わせ領域４１、４３、４５内において、細胞集団５５の増殖を含む増殖帯７０、７２、７４の増殖端点７１、７３、７５を、該少なくとも１つのプロセッサー２１０に判定させる。阻害端点６１、６３、６５および増殖端点７１、７３、７５に基づき、該少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質間の化学物質相互作用効果を、該少なくとも１つのプロセッサー２１０にさらに判定させる。
【0121】
一実施態様においては、該指示が少なくとも１つのプロセッサー２１０による実行の場合には、該指示は少なくとも１つのプロセッサー２１０に、細胞集団５５に関して、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質のＭＩＣを、阻害端点６１、６３、６５に基づいて決定させるが、これは画像データに基づき少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５について決定が成されるものである。この実施態様においては、少なくとも１つのプロセッサー２１０にさらに、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質の混合物中の化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質のＭＩＣを、増殖端点７１、７３、７５に基づいて決定させるが、これは画像データに基づき少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５について決定が成されるものである。該ＭＩＣに基づいて、該少なくとも１つのプロセッサーにさらにＦＩＣｉを決定させる。
【0122】
一実施態様においては、該指示が少なくとも１つのプロセッサー２１０による実行の場合には、該指示は、細胞培養基質５５および阻害端点６１、６３、６５に関して化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質の拡散係数に基づいて、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質のＭＩＣを、少なくとも１つのプロセッサー２１０に決定させるが、これは画像データに基づき少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５について決定が成されるものである。この実施態様においては、該少なくとも１つのプロセッサー２１０に、該拡散係数および増殖端点７１、７３、７５に基づいて、少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質の混合物中の、化学物質リザーバー３１、３３、３５に含まれる化学物質のＭＩＣを決定させるが、これは画像データに基づき少なくとも２つの隣接化学物質リザーバー３１、３３、３５の各化学物質リザーバー３１、３３、３５について決定が成されるものである。
【0123】
一実施態様においては、該指示が少なくとも１つのプロセッサー２１０による実行の場合には、該指示は、培養容器１０中の細胞培養基質５０の表面５５を被写体とした少なくとも１枚の写真を、細胞培養基質５０の表面５１上に細胞集団５５を配置してから所定の時間経過後に撮影するためにカメラ２６０を、少なくとも１つのプロセッサー２１０に制御させる。
【0124】
該提案技術はまた、コンピュータープログラム２４０を含むコンピューター可読性保存媒体２５０を提供する。一例を挙げれば、ソフトウェアまたはコンピュータープログラム２４０は、コンピューター可読性媒体 ２５０、特に非揮発性媒体上に保持または保存されるコンピュータープログラム製品として具現化されるのであってもよい。コンピューター可読性媒体２５０は、１種類以上の可読性または取り外し不可メモリーデバイスを含むのであってもよく、読込専用メモリー（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）メモリー、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）保存デバイス、フラッシュメモリー、磁気テープ、またはその他の任意の従来型メモリーデバイスが挙げられるが、これらにのみに限定されるものではない。したがって、該コンピューターのプロセッサー２１０による実行のために、コンピュータープログラム２４０をコンピューターの作動メモリー２２０に読み込むのであってもよい。
【0125】
実施例
実施例１：ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）
本実施例においては、抗生物質相乗性を試験するための、安定かつ高度定量的なアッセイについて説明する。 本明細書中では該アッセイをＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）とよぶが、これは拡散を基盤とするアッセイであって、単一寒天プレート内の（本実施例においては）３種類の抗生物質のあらゆる組み合わせ対の相互作用に関する定量的情報を提供するアッセイである。ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）はチェッカーボード法と同様に良好に実施されるが、そのユニークな設計と機能により、方法としての複雑度は大きく低減されて、複雑度はディスク拡散試験法と同程度となることが、技術的検証試験によって示されている。チェッカーボードアッセイと同様に、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）でも部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ）が得られるのであるが、より大規模迅速で、かつ多重化も容易である。このアッセイは、試料の感受性に関する予備的な情報なしに利用することができる。ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）が有する抗生物質相互作用スクリーニングについての潜在的な可能性は、併用療法の新規分野、すなわち尿路感染（ＵＴＩ）の治療に本アッセイを応用することによって示されたのである。保存的および可変的な抗生物質相互作用が同定され、これは精密化併用療法のオーダーメード医療への高度な潜在力を示唆するものであった。
実施例１：ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）
本実施例においては、抗生物質相乗性を試験するための、安定かつ高度定量的なアッセイについて説明する。 本明細書中では該アッセイをＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）とよぶが、これは拡散を基盤とするアッセイであって、単一寒天プレート内の（本実施例においては）３種類の抗生物質のあらゆる組み合わせ対の相互作用に関する定量的情報を提供するアッセイである。ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）はチェッカーボード法と同様に良好に実施されるが、そのユニークな設計と機能により、方法としての複雑度は大きく低減されて、複雑度はディスク拡散試験法と同程度となることが、技術的検証試験によって示されている。チェッカーボードアッセイと同様に、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）でも部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ）が得られるのであるが、より大規模迅速で、かつ多重化も容易である。このアッセイは、試料の感受性に関する予備的な情報なしに利用することができる。ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）が有する抗生物質相互作用スクリーニングについての潜在的な可能性は、併用療法の新規分野、すなわち尿路感染（ＵＴＩ）の治療に本アッセイを応用することによって示されたのである。保存的および可変的な抗生物質相互作用が同定され、これは精密化併用療法のオーダーメード医療への高度な潜在力を示唆するものであった。
【0126】
材料と方法
作成と設計
培養容器挿入部をコンピューター支援設計ソフトウェア（Ａｕｔｏｄｅｓｋ Ｆｕｓｉｏｎ ３６０）により設計し、オートクレーブ可能樹脂または歯科用樹脂用の専売処方剤を用いて３Ｄプリンティング（Ｆｏｒｍｌａｂｓ、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＡ； ＳＬＡ ３Ｄ ｐｒｉｎｔｅｒ）により作成した。３Ｄプリンティングは、ウプサラ大学（Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＵ－ＰＲＩＮＴ施設で行った。
作成と設計
培養容器挿入部をコンピューター支援設計ソフトウェア（Ａｕｔｏｄｅｓｋ Ｆｕｓｉｏｎ ３６０）により設計し、オートクレーブ可能樹脂または歯科用樹脂用の専売処方剤を用いて３Ｄプリンティング（Ｆｏｒｍｌａｂｓ、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＡ； ＳＬＡ ３Ｄ ｐｒｉｎｔｅｒ）により作成した。３Ｄプリンティングは、ウプサラ大学（Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＵ－ＰＲＩＮＴ施設で行った。
【0127】
株と培地
技術的検証のために、参照株として大腸菌Ｋ１２－ＭＧ１６５５（ＤＡ５４３８）、緑膿菌ＰＡ１４（ＤＡ６４１６０）、および黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３（ＤＡ６４４８５）を用いた。ＵＴＩ試験では、抗生物質のシプロフロキサシン（ＣＩＰ）、ホスホマイシン（ＦＯＦ）、メシリナム（ＭＥＣ）、ニトロフラントイン（ＮＩＴ）、トリメトプリム（ＴＭＰ）、アンピシリン（ＡＭＰ）、ゲンタマイシン（ＧＥＮ）、およびセフォタキシム（ＣＴＸ）に感受性である、由来の異なる６～２９５種類の範囲の臨床単離株をスクリーニングした。Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ寒天およびＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ；Ｒｅｆｓ．２７５７３０、２２５２５０）を用いて３７℃でインキュベーションすることにより細菌培養を行った。単一コロニーから１ｍｌで１９０ｒｐｍの旋回振盪を行い、一晩培養した培養物を調製した。ＵＴＩ単離物スクリーニングでは、寒天に２５ｍｇ／ｌのグルコース－６－リン酸を添加したが、その理由は、これがＦＯＦの作用に必要なものだからである。抗生物質のストックは、製造元の推奨にしたがって調製し、それぞれ単回利用とするために分注して－２０℃で保存した：ＡＭＰ １００ｍｇ／ｍｌまたは１８０ｍｇ／ｍｌ（水）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．Ａ９５１８－２５Ｇ）、ＣＩＰ ２５ｍｇ／ｍｌ（０．１Ｍ ＨＣｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．１７８５０－２５Ｇ－Ｆ）、ＣＴＸ ３ｍｇ／ｍｌまたは５０ｍｇ／ｍｌ（水）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｃ７０３９－１Ｇ）、ＧＥＮ ４５ｍｇ／ｍｌまたは５０ｍｇ／ｍｌ（水）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．４８７６０－５Ｇ－Ｆ）、ＦＯＦ ５０ｍｇ／ｍｌ（水）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．Ｐ５３９６－５Ｇ）、ＭＥＣ １０ｍｇ／ｍｌ（水）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．３３４４７－１００ＭＧ）、ＮＩＴ １０ｍｇ／ｍｌ（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｎ７８７８－１０Ｇ）、およびＴＭＰ １０ｍｇ／ｍｌ（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｔ－７８８３－５Ｇ）。
技術的検証のために、参照株として大腸菌Ｋ１２－ＭＧ１６５５（ＤＡ５４３８）、緑膿菌ＰＡ１４（ＤＡ６４１６０）、および黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３（ＤＡ６４４８５）を用いた。ＵＴＩ試験では、抗生物質のシプロフロキサシン（ＣＩＰ）、ホスホマイシン（ＦＯＦ）、メシリナム（ＭＥＣ）、ニトロフラントイン（ＮＩＴ）、トリメトプリム（ＴＭＰ）、アンピシリン（ＡＭＰ）、ゲンタマイシン（ＧＥＮ）、およびセフォタキシム（ＣＴＸ）に感受性である、由来の異なる６～２９５種類の範囲の臨床単離株をスクリーニングした。Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ寒天およびＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ；Ｒｅｆｓ．２７５７３０、２２５２５０）を用いて３７℃でインキュベーションすることにより細菌培養を行った。単一コロニーから１ｍｌで１９０ｒｐｍの旋回振盪を行い、一晩培養した培養物を調製した。ＵＴＩ単離物スクリーニングでは、寒天に２５ｍｇ／ｌのグルコース－６－リン酸を添加したが、その理由は、これがＦＯＦの作用に必要なものだからである。抗生物質のストックは、製造元の推奨にしたがって調製し、それぞれ単回利用とするために分注して－２０℃で保存した：ＡＭＰ １００ｍｇ／ｍｌまたは１８０ｍｇ／ｍｌ（水）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．Ａ９５１８－２５Ｇ）、ＣＩＰ ２５ｍｇ／ｍｌ（０．１Ｍ ＨＣｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．１７８５０－２５Ｇ－Ｆ）、ＣＴＸ ３ｍｇ／ｍｌまたは５０ｍｇ／ｍｌ（水）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｃ７０３９－１Ｇ）、ＧＥＮ ４５ｍｇ／ｍｌまたは５０ｍｇ／ｍｌ（水）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．４８７６０－５Ｇ－Ｆ）、ＦＯＦ ５０ｍｇ／ｍｌ（水）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．Ｐ５３９６－５Ｇ）、ＭＥＣ １０ｍｇ／ｍｌ（水）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．３３４４７－１００ＭＧ）、ＮＩＴ １０ｍｇ／ｍｌ（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｎ７８７８－１０Ｇ）、およびＴＭＰ １０ｍｇ／ｍｌ（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｔ－７８８３－５Ｇ）。
【0128】
ブロス微量希釈
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）を較正するために、ＥＵＣＡＳＴ指針に準拠する標準的ブロス微量希釈法を用いて、抗生物質のＭＩＣ値を個別的に決定した。抗生物質をＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎブロスで段階的２倍希釈し、その希釈物を９６穴マイクロタイタープレートに調製した。次いで、高密度の一晩培養物からおおよそ３×１０５細胞をこれらのプレートに接種して（１：１０００希釈、最終容積１８０μｌ）、振盪せずに３７℃で２４時間インキュベートした；その後、ウェルをピペッティングにより撹拌して、５４０ｎｍの光学密度により増殖度を測定した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ Ｔｙｐｅ ３５７）。非接種対照ウェルの増殖シグナルを与える最低濃度をＭＩＣとする。測定は２重化生物試料の重複物を用いて行い、それらの平均値をＭＩＣとした。ＦＯＦについてのＭＩＣ決定においては、ＦＯＦ媒介性阻害に必要である５０ｍｇ／ｌのグルコース－６－リン酸を培地に添加した。
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）を較正するために、ＥＵＣＡＳＴ指針に準拠する標準的ブロス微量希釈法を用いて、抗生物質のＭＩＣ値を個別的に決定した。抗生物質をＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎブロスで段階的２倍希釈し、その希釈物を９６穴マイクロタイタープレートに調製した。次いで、高密度の一晩培養物からおおよそ３×１０５細胞をこれらのプレートに接種して（１：１０００希釈、最終容積１８０μｌ）、振盪せずに３７℃で２４時間インキュベートした；その後、ウェルをピペッティングにより撹拌して、５４０ｎｍの光学密度により増殖度を測定した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ Ｔｙｐｅ ３５７）。非接種対照ウェルの増殖シグナルを与える最低濃度をＭＩＣとする。測定は２重化生物試料の重複物を用いて行い、それらの平均値をＭＩＣとした。ＦＯＦについてのＭＩＣ決定においては、ＦＯＦ媒介性阻害に必要である５０ｍｇ／ｌのグルコース－６－リン酸を培地に添加した。
【0129】
導入濃度
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイの技術的較正については、用いた株（表１）に対する抗生物質のＭＩＣに基づいて抗生物質濃度を決定した。ＵＴＩ単離物のスクリーニングでは、全株（図２０Ｃ～２０Ｊの単離物については表２、ならびに図２０Ａ～２０Ｃおよび２０Ｍの単離物については表３）について、２セットの抗生物質濃度を用いた。抗生物質についてＭＩＣが既知である場合には最も可読性の高い結果が得られるので、培養容器挿入部の濃度はＭＩＣに基づいて決定することが好ましい。ＦＯＦを用いた試験については、グルコース－６－リン酸を２５ｍｇ／ｌの濃度で最終寒天層に加えた。
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイの技術的較正については、用いた株（表１）に対する抗生物質のＭＩＣに基づいて抗生物質濃度を決定した。ＵＴＩ単離物のスクリーニングでは、全株（図２０Ｃ～２０Ｊの単離物については表２、ならびに図２０Ａ～２０Ｃおよび２０Ｍの単離物については表３）について、２セットの抗生物質濃度を用いた。抗生物質についてＭＩＣが既知である場合には最も可読性の高い結果が得られるので、培養容器挿入部の濃度はＭＩＣに基づいて決定することが好ましい。ＦＯＦを用いた試験については、グルコース－６－リン酸を２５ｍｇ／ｌの濃度で最終寒天層に加えた。
【0130】
【表1】
【0131】
【表2】
Ｓ＝感受性
【0132】
【表3】
【0133】
チェッカーボード実験
ＦＩＣｉ決定のための標準的なチェッカーボードアッセイ（８×８濃度）は、多重化生物試料の単一複製物において実施し、以前に報告されているように［６］、４×ＭＩＣ～１／４ＭＩＣの範囲の段階的２倍希釈物を用いた。接種サイズは５×１０５細胞（０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ）であり、１６時間の静置インキュベーション後に、５４０ｎｍの光学密度を読み取った（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ Ｔｙｐｅ ３５７）。Ｂｌｉｓｓモデル相乗性定量については、３重化生物試料で最大１×ＭＩＣまでの直線濃度を用いて、より解像度の高いチェッカーボード（９×９濃度）が得られた。周辺効果および勾配効果によるバイアスを回避するために、処理位置は完全無作為化した。相乗効果の度合いを、以前の報告［８］のような方法で算出した。増殖値は、バックグラウンド補正光学密度値を用いて未処理ウェルに対して相対的に表した。Ｂｌｉｓｓ独立モデル［９］にしたがう予想相対増殖Ｙ１＋２を、単一抗生物質処理で得られた相対増殖値Ｙ１およびＹ２の乗算によって算出した。ある組み合わせの相乗効果の程度ＳをＳ＝Ｙ１＋２－Ｙｏｂｓｅｒｖｅｄと定義した。Ｓ＝０は相加性であることを示しており、正の値は相乗作用であることを表し、また負の値は拮抗作用であることを表している。
ＦＩＣｉ決定のための標準的なチェッカーボードアッセイ（８×８濃度）は、多重化生物試料の単一複製物において実施し、以前に報告されているように［６］、４×ＭＩＣ～１／４ＭＩＣの範囲の段階的２倍希釈物を用いた。接種サイズは５×１０５細胞（０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ）であり、１６時間の静置インキュベーション後に、５４０ｎｍの光学密度を読み取った（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ Ｔｙｐｅ ３５７）。Ｂｌｉｓｓモデル相乗性定量については、３重化生物試料で最大１×ＭＩＣまでの直線濃度を用いて、より解像度の高いチェッカーボード（９×９濃度）が得られた。周辺効果および勾配効果によるバイアスを回避するために、処理位置は完全無作為化した。相乗効果の度合いを、以前の報告［８］のような方法で算出した。増殖値は、バックグラウンド補正光学密度値を用いて未処理ウェルに対して相対的に表した。Ｂｌｉｓｓ独立モデル［９］にしたがう予想相対増殖Ｙ１＋２を、単一抗生物質処理で得られた相対増殖値Ｙ１およびＹ２の乗算によって算出した。ある組み合わせの相乗効果の程度ＳをＳ＝Ｙ１＋２－Ｙｏｂｓｅｒｖｅｄと定義した。Ｓ＝０は相加性であることを示しており、正の値は相乗作用であることを表し、また負の値は拮抗作用であることを表している。
【0134】
物理的拡散モデルおよび画像解析
リザーバーからの試薬の拡散をモデル化するために有限要素モデル（ＦＥＭ）を利用した。拡散はフィックの拡散則にしたがうものと仮定し、移流束も正味の体積源も存在しない場合の対流拡散方程式を解くことにより、化学物質の濃度を算出した。ＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ（Ｃｏｍｓｏｌ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ＦＥＭ分析、抗生物質拡散のモデル化および較正ならびに抗生物質ランドスケープアセンブリを行った。Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）およびＣＯＭＳＯＬとＭａｔｌａｂの連携を利用して、このアルゴリズムのスクリプトを作成した。垂直に設置したＣＣＤデジタルカメラ（ラズベリーＰｉ ｖ２カメラモジュール）を用いて、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）プレートを撮影した。
リザーバーからの試薬の拡散をモデル化するために有限要素モデル（ＦＥＭ）を利用した。拡散はフィックの拡散則にしたがうものと仮定し、移流束も正味の体積源も存在しない場合の対流拡散方程式を解くことにより、化学物質の濃度を算出した。ＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ（Ｃｏｍｓｏｌ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ＦＥＭ分析、抗生物質拡散のモデル化および較正ならびに抗生物質ランドスケープアセンブリを行った。Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）およびＣＯＭＳＯＬとＭａｔｌａｂの連携を利用して、このアルゴリズムのスクリプトを作成した。垂直に設置したＣＣＤデジタルカメラ（ラズベリーＰｉ ｖ２カメラモジュール）を用いて、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）プレートを撮影した。
【0135】
統計的解析
統計的解析は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ ＰｒｉｓｍおよびをＭａｔｌａｂを用いて実施した。加法モデル（ＦＩＣｉ＝１）に対する測定ＦＩＣｉの統計的差異は、ウイルコクソンの符号付き検定を用いて評価した。ＵＴＩスクリーニングにおいては、臨床的に意義のある抗生物質相互作用のレベル（ＦＩＣｉ＜０．５、ＦＩＣｉ＞４）を示す相互作用を試験し、また臨床的相乗性または拮抗作用（表４および５）のいずれかを有することを示す単離株について、ＦＩＣ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定を実施した。
統計的解析は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ ＰｒｉｓｍおよびをＭａｔｌａｂを用いて実施した。加法モデル（ＦＩＣｉ＝１）に対する測定ＦＩＣｉの統計的差異は、ウイルコクソンの符号付き検定を用いて評価した。ＵＴＩスクリーニングにおいては、臨床的に意義のある抗生物質相互作用のレベル（ＦＩＣｉ＜０．５、ＦＩＣｉ＞４）を示す相互作用を試験し、また臨床的相乗性または拮抗作用（表４および５）のいずれかを有することを示す単離株について、ＦＩＣ＝１に対する１試料ウイルコクソンの符号付き検定を実施した。
【0136】
結果
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）のアッセイおよびシステム設計
以下の基準を満たすようにＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイを設計した：
（ｉ）抗生物質相互作用の定量的情報が得られること；
（ｉｉ）アッセイの複雑度の低減およびアッセイの準備および分析に要する作業時間の短縮；
（ｉｉｉ）多重化能が高いこと；
および
（ｉｖ）臨床微生物検査室の日常検査に組み込むことが容易であること。
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイは、単一寒天プレートで３種類の抗生物質の対に関する相乗性の定量的情報を提供する、拡散に基づくアッセイである。このアッセイは、任意の標準的細胞培養プレート（図２）に組み込むことが可能な培養容器挿入部（図１）から成る。同一細胞培養プレート上で複数の培養容器挿入部を用いることができる。培養容器挿入部は、抗生物質用の３つのリザーバー（図１においては、「Ａ」、「Ｂ」、および「Ｃ」と表示されている）および中央の三角形イメージング領域（図１）によって構成される。
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）のアッセイおよびシステム設計
以下の基準を満たすようにＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイを設計した：
（ｉ）抗生物質相互作用の定量的情報が得られること；
（ｉｉ）アッセイの複雑度の低減およびアッセイの準備および分析に要する作業時間の短縮；
（ｉｉｉ）多重化能が高いこと；
および
（ｉｖ）臨床微生物検査室の日常検査に組み込むことが容易であること。
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイは、単一寒天プレートで３種類の抗生物質の対に関する相乗性の定量的情報を提供する、拡散に基づくアッセイである。このアッセイは、任意の標準的細胞培養プレート（図２）に組み込むことが可能な培養容器挿入部（図１）から成る。同一細胞培養プレート上で複数の培養容器挿入部を用いることができる。培養容器挿入部は、抗生物質用の３つのリザーバー（図１においては、「Ａ」、「Ｂ」、および「Ｃ」と表示されている）および中央の三角形イメージング領域（図１）によって構成される。
【0137】
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）相乗性アッセイを実施するために、０．５ｍｌの抗生物質含有寒天をピペッティングによって化学物質リザーバー中に導入した。ほとんどの用途では、化学物質リザーバーには異なる抗生物質を導入した。寒天を固化させ、このアッセイを不活性状態とした。この時点で、培養容器挿入部に機能的消失のない状態で少なくとも１週間の冷蔵保存が可能であった。これによって、使用者の必要に応じて調製・保存される、異なる抗生物質を含む複数アッセイが可能になった；そのため、アッセイを遅延なく容易に実行することができる。
【0138】
特異的相乗性試験を実施するために、準備した培養容器挿入部を培養プレート内に配置し、培養寒天の最終層で、典型的には標準的９０ｍｍプレート（図２）については２５ｍｌで覆った。この工程でアッセイが活性化され、プレートが固化すれば使用の準備が完了となる（図２）。最終寒天層によって化学物質リザーバー内に抗生物質を懸濁することが可能となり、周囲の寒天領域および寒天表面への拡散が開始する。綿棒で塗りつけることにより、試料を固化プレートに塗布した。このアッセイは接種物密度が０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄとなるように設計されており、ディスク拡散試験ｖ８．０に関するＥＵＣＡＳＴ指針に合致する。接種後に、試料を増殖させる目的でプレートを一晩インキュベートした。この時点では、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）プレートは、標準的な寒天プレートと同一なものであった。このような性質のために、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイは、一晩の培養およびプレート上での細菌試料インキュベーションについての検査室管理システムがいかなるものであっても円滑に組み込むことが可能であった。増殖の経過中に、３種類の抗生物質の拡散によって生成した濃度ランドスケープにしたがって培養容器挿入部のまわりに阻害帯が形成された（図１０）。抗生物質相互作用を測定するために、プレートの撮影を行った。相乗性定量的評価のために厳選されたアルゴリズムで、結果を分析した。
【0139】
薬剤相互作用の定量的測定
定量的測定値は画像解析によって取得した。培養容器挿入部の特定配置および寒天表面に対する幾何学的位置関係によって、抗生物質の予め定めた制御性拡散が可能となった。有限要素法を用いて、各抗生物質について個別的にこの制御性拡散をモデル化した。このモデルによって抗生物質特異的拡散マップが得られた。拡散マップは、化学物質リザーバー中の抗生物質の初期濃度および抗生物質の拡散係数に関連するプレート表面の抗生物質濃度を表すものであった。
定量的測定値は画像解析によって取得した。培養容器挿入部の特定配置および寒天表面に対する幾何学的位置関係によって、抗生物質の予め定めた制御性拡散が可能となった。有限要素法を用いて、各抗生物質について個別的にこの制御性拡散をモデル化した。このモデルによって抗生物質特異的拡散マップが得られた。拡散マップは、化学物質リザーバー中の抗生物質の初期濃度および抗生物質の拡散係数に関連するプレート表面の抗生物質濃度を表すものであった。
【0140】
抗生物質はその構造および拡散マトリックスとの相互作用に応じて、その拡散特性が異なる。抗生物質の拡散係数は、較正工程における精密なアッセイ条件（寒天の種類、培養容積、インキュベーション時間）について決定することができる。較正のために、ＭＩＣが既知の参照株を標的抗生物質の３種類の濃度（１０×、２０×、４０×ＭＩＣ）で試験した。各潜在的抗生物質について、たった一度だけ較正を実施する必要がある。その後は、特定抗生物質を試験するときにはいつでも利用できるように拡散マップを保存しておいた。拡散係数に加えて、抗生物質リザーバーに使用する推奨初期濃度を上記のように１度実施した較正結果から算出した。この試験に用いた８種類の抗生物質についての推奨初期濃度であって、抗微生物感受性試験についてのＥＵＣＡＳＴ指針に準拠する初期濃度を表１～３に示す。
【0141】
仮想寒天表面を作成するために、分析アルゴリズムでは較正拡散マップを用いた。まず、アッセイの各化学物質リザーバーにどの抗生物質を配置するのかを、ユーザーが示す。この時点で、アルゴリズムは、アッセイに用いる抗生物質に対応した保存拡散マップを読み出す。これらのマップからアッセイ特異的抗生物質ランドスケープを構築した。次いで、培養容器挿入部の幾何学的アンカー点にしたがって、この抗生物質ランドスケープを写真にマップした。下に概説する部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ）の数式にしたがって、阻害帯および増殖帯の端部の点から抗生物質相互作用の度合いを定量した。
【0142】
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）寒天プレートの写真において、目的とする特定の領域を観察することができる（図９および１０）。培養容器挿入部の外側では、各抗生物質が単独で作用した。抗生物質は化学物質リザーバーから外側に向かって拡散するので、阻害帯の端点は化学物質リザーバーに向かい合う位置に存在するが、その化学物質リザーバーからは離れて位置し、抗生物質が単独で作用する場合には、該端点がその抗生物質の阻害濃度（ＩＣ）を表す。ＩＣ点（図９において点で示されている）は抗生物質ランドスケープに合致するので、３種類の抗生物質の対応する濃度を推定した（ＩＣＡ、ＩＣＢ、およびＩＣＣ）。
【0143】
イメージング領域の内側では、化学物質リザーバーから３種類の抗生物質が拡散するので、３つの角の部分で対毎に重複を生じる。イメージング領域のそれぞれの角の部分は、２種類の最も近接する抗生物質同士が一緒に作用するプレートの部分を構成する。したがって、角の部分に最も近いイメージング領域において増殖帯の端は、２種類の抗生物質の組み合わせが増殖に阻害的な部位に対応するのである（図１０において点で示されている）。同様に、３つのＩＣ点について、３種類の組み合わせ阻害点（ＣＰ）が抗生物質ランドスケープの点に合致するので、そこに存在する両方の抗生物質の濃度を推定した。両方のＩＣを個別に、および３種類の抗生物質全てについてのＣＰを推定し終えれば、分析アルゴリズムは全抗生物質対の部分阻害濃度指数（ＦＩＣｉ）の計算を開始する。抗生物質ＡとＢの間の相互作用については、ＦＩＣｉＡＢ＝ＣＡ／ＩＣＡ＋ＣＢ／ＩＣＢであるが、ここでＣＡおよびＣＢはそれぞれ対応する組み合わせ阻害点（ＣＰ）におけるＡおよびＢの濃度である。ＦＩＣｉＡＣおよびＦＩＣｉＢＣも同様に算出された。ＦＩＣｉ値が１であれば、それは相加性を意味する。ＦＩＣｉ＜１は相乗効果を表し、他方ＦＩＣｉ＞１は拮抗作用を表す。臨床的に意義のあるレベルの相乗効果および拮抗作用の閾値は、通常それぞれ＜０．５および＞２～４に設定される。写真における全てのＩＣおよびＣＰ点の判別は、自動もしくは用手的のいずれかによって行われる。次いで、この分析では３種類の抗生物質対全てについてＦＩＣｉデータが即座に得られた（図１１に示すように、図１０のプレートの分析から）。
【0144】
アッセイシステムの技術的検証
まず、対照として、自己相互作用実験を実施した。この実験では、３つの培養容器挿入部リザーバーを同一抗生物質で満たした。自己相互作用の対照実験では、本実施例において用いた全ての抗生物質（図１７）について、高い信頼性でＦＩＣｉが１に近いという結果が得られた。次に、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイによって得られる相乗性の定量が妥当なものであることを確かめるために、正確性と精度に関する試験を行った。２種類のグラム陰性参照株、大腸菌Ｋ１２－ＭＧ１６６５および緑膿菌ＰＡ１４、ならびにグラム陽性参照株である黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３における、４種類の抗生物質のパネルの全ての対の抗生物質相互作用を試験した。試験を行った抗生物質は、アンピシリン（ＡＭＰ）、セフォタキシム（ＣＴＸ）、シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、およびゲンタマイシン（ＧＥＮ）であるが、これらは３種類の異なる作用機序に渡り、また上記の細菌に起因する菌血症および敗血症の治療に通常用いられるものである。全６対の相互作用および全３種類の株（図１８Ａ）についてＦＩＣｉ指数を算出した。
まず、対照として、自己相互作用実験を実施した。この実験では、３つの培養容器挿入部リザーバーを同一抗生物質で満たした。自己相互作用の対照実験では、本実施例において用いた全ての抗生物質（図１７）について、高い信頼性でＦＩＣｉが１に近いという結果が得られた。次に、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイによって得られる相乗性の定量が妥当なものであることを確かめるために、正確性と精度に関する試験を行った。２種類のグラム陰性参照株、大腸菌Ｋ１２－ＭＧ１６６５および緑膿菌ＰＡ１４、ならびにグラム陽性参照株である黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３における、４種類の抗生物質のパネルの全ての対の抗生物質相互作用を試験した。試験を行った抗生物質は、アンピシリン（ＡＭＰ）、セフォタキシム（ＣＴＸ）、シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、およびゲンタマイシン（ＧＥＮ）であるが、これらは３種類の異なる作用機序に渡り、また上記の細菌に起因する菌血症および敗血症の治療に通常用いられるものである。全６対の相互作用および全３種類の株（図１８Ａ）についてＦＩＣｉ指数を算出した。
【0145】
アッセイ精度について完全な定量を行うために、上記の株を多重化した複数の複製物（ｎ＞１０）を、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイプロトコルを用いてスクリーニングした。反復可能性を定量化する目的で、多重化複製物の半分を同じ日に試験した（日内変動）。残りの半分は翌日に試験を行い、再現性の定量化とした（日毎の変動性）。結果を日間で比較するために、同一抗生物質組み合わせの日毎の相対的差異および次いで各株（図１８Ｂ）について６種類の組み合わせ全ての平均を定量することにした。平均の相対的差は、全ての株について１３％未満であり、上位の四分位数が４０％未満であった。このことは、アッセイが反復可能であり日毎の変動に依存するものではないことを示している。再現性を定量化する目的で、同一日の多重化試料を用い、抗生物質の全組み合わせについて、平均の相対的標準誤差を調べた。次いで、これらを各株について平均した。全相対的標準誤差は１２％未満であり、上位の四分位数は１５％未満であった。これは、多重化複製物間で技術的変動が非常に少ないことを示すものであった（図１８Ｂ）。最後に、全ての多重化複製物を総合して、反復可能性および再現性の両方を含む、精度の総合評価を行った。相互作用の平均値に比例する測定変動性を示す分析として、生物種の各組み合わせ対について変動係数を計算することにした（図１８Ｃ）。変動係数はすべて３７％未満であり、平均で１９．７％であった；このことは、再現可能かつ反復可能である充分な精度を有するものであることを示している。
【0146】
次に、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の精密さに関する定量を行った。その目的において、以前に報告［６］されているような、ブロス中の究極の標準的方法であるチェッカーボードアッセイを用いて、同様の抗生物質相互作用評価を行った。まず、該２種類の方法が系として異なる結果を生じるものであるか否かを試験しようと考えた。そこで、該２種類の方法（図１８Ｄ）で取得したＦＩＣｉデータのＢｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ分析を行うことにした。Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ比較では、チェッカーボード法とＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイとの間の偏りが０．０４９であった。このような低い偏り値は、ＦＩＣｉの差異に関する検出限界に近いものであった。したがって、該２種類の方法によって得られた結果間に統計的に有意な矛盾は全く存在しないことが結論付けられた。
【0147】
該２種類の方法が系として互換的であることが示されたので、一方の方法に対して他方の方法を選択する効果を、多変量線型回帰分析を用いて試験した。注目する抗生物質対が同一であれば、そのＦＩＣｉ測定値に対して強力かつ有意な効果が得られた（相関係数＝０．５５；Ｐ＜０．０１）。他方、方法の選択は、統計的には実験結果に相関しなかった（相関係数＝０．０７；Ｐ＝０．８３）。まとめると、抗生物質相互作用の検出に関してＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）はチェッカーボードアッセイと同等の精密さを有していることが結論付けられた。
【0148】
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）のチェッカーボードアッセイに対する違いは、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）が拡散に基づくものであるために連続的濃度範囲を用いるのに対して、チェッカーボードは典型的には離散的な２倍希釈の試験だということである。そこで、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の高い精度がより微細な濃度範囲の結果であるのか否かについて試験を行った。Ｂｌｉｓｓ独立加法モデルを用いた抗生物質相互作用の定量を行う高解像度直線濃度範囲のチェッカーボードが、株の組み合わせ１８対すべてについて得られた。再び、抗生物質相互作用について、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）による結果と高度に一致する結果が得られた。興味深いことに、ＭＩＣよりも低い用量の異なる相乗性プロファイル間では、相乗効果のプロファイルが用量依存性の変動を示すこともあったが、この場合には相互作用の分類が困難であった。そのような用量依存性の変動は、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）では検出されず、相互作用は所定の高阻害レベルに分類された。ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の精度は直線濃度範囲によってのみ決まるのではなく、所定の高阻害レベルにある相互作用の定量によっても決まるものであると結論付けられた。
【0149】
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイを用いた臨床的ＵＴＩ大腸菌単離物についての抗生物質相互作用パネル
大腸菌ＵＴＩ臨床的単離物および大腸菌Ｋ１２－ＭＧ１６５５参照株に対する抗生物質相乗性のスクリーニングに、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイを用いた。ＵＴＩの単剤療法または併用療法に通常用いられる５種類の抗生物質のパネルを選択した：すなわち、ニトロフラントイン（ＮＩＴ）、トリメトプリム（ＴＭＰ）、メシリナム（ＭＥＣ）、シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、およびホスホマイシン（ＦＯＦ）である。大腸菌株および大腸菌Ｋ１２－ＭＧ１６５５参照株（図１９）に対して抗生物質パネルの全対の相互作用を評価する目的で、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイを実施した。ほとんどの大腸菌株が該パネル（図２０Ａ～２０Ｍ）の全抗生物質に対して感受性とみなされた。臨床的に意義のあるレベルの正の相乗性を示すとみなされる、相互作用の絶対的ＦＩＣｉ限界値を、上記の推奨にしたがってＦＩＣｉ＜０．５に設定した。拮抗作用の保存的限界をＦＩＣｉ＞４に設定した。それらの間の値はすべて、相加性を示すものであるとみなした。
大腸菌ＵＴＩ臨床的単離物および大腸菌Ｋ１２－ＭＧ１６５５参照株に対する抗生物質相乗性のスクリーニングに、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイを用いた。ＵＴＩの単剤療法または併用療法に通常用いられる５種類の抗生物質のパネルを選択した：すなわち、ニトロフラントイン（ＮＩＴ）、トリメトプリム（ＴＭＰ）、メシリナム（ＭＥＣ）、シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、およびホスホマイシン（ＦＯＦ）である。大腸菌株および大腸菌Ｋ１２－ＭＧ１６５５参照株（図１９）に対して抗生物質パネルの全対の相互作用を評価する目的で、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイを実施した。ほとんどの大腸菌株が該パネル（図２０Ａ～２０Ｍ）の全抗生物質に対して感受性とみなされた。臨床的に意義のあるレベルの正の相乗性を示すとみなされる、相互作用の絶対的ＦＩＣｉ限界値を、上記の推奨にしたがってＦＩＣｉ＜０．５に設定した。拮抗作用の保存的限界をＦＩＣｉ＞４に設定した。それらの間の値はすべて、相加性を示すものであるとみなした。
【0150】
試験を行った全ての株を通じて相加的であったＮＩＴ－ＣＩＰ間（図２０Ｉ）、ＭＥＣ－ＣＩＰ間（図２０Ｄ）、ＴＭＰ－ＣＩＰ間（図２０Ｇ）、ＭＥＣ－ＦＯＦ間（図２０Ｅ）、ＴＭＰ－ＦＯＦ間（図２０Ｆ）、ＮＩＴ－ＦＯＦ間（図２０Ｈ）、ＧＥＮ－ＣＴＸ間（図２０Ｋ）、およびＧＥＮ－ＣＴＸ間（図２０Ｍ）の結果から分かるように、挙動が異なることを示す少数の株（表４および５を参照のこと）を除けば、実際的には、ほとんどの組み合わせが相加的であることが明らかになった。ＦＯＦ－ＣＩＰ（図２０Ｊ）は、単離株ＤＡ４４５６０に対しては境界線上ではあったが、統計的には有意な拮抗的相互作用を示した；しかしながら、その他の株についてはすべて相加的な挙動を示した。残りの組み合わせ、すなわちＴＭＰ－ＮＩＴ間（図２０Ｂ）、ＭＥＣ－ＴＭＰ間（図２０Ａ）、ＭＥＣ－ＮＩＴ間（図２０Ｃ）、およびＡＭＰ－ＧＥＮ間（図２０Ｋ）については、医学的により興味深い結果が得られた。ＴＭＰ－ＮＩＴ間（図２０Ｂ）およびＡＭＰ－ＣＴＸ間（図２０Ｌ）の組み合わせについては、ほとんどのＵＴＩ単離株において正の相乗効果を検出したが、相加的または拮抗的挙動を示す少数の単離株も存在し、このことはＵＴＩ単離株の多様な遺伝的変化を通じて保存されるこれら抗生物質の相乗性相互作用の性質を示唆している。他方、ＭＥＣ－ＮＩＴの組み合わせ（図２０Ｃ）は、試験した単離株のほとんどで検出される強力な拮抗的挙動を示した。ＭＥＣ－ＴＭＰの組み合わせ（図２０Ａ）は、試験した単離株すべてに対して正の相乗性作用、強い拮抗性作用および相加性作用の全てが入り交じった挙動を示したが、他方、ＡＭＰ－ＧＥＮの組み合わせ（図２０Ｋ）は、相加性および程度の異なる拮抗作用の入り交じった挙動を示した。これらのデータをまとめると、確認された相乗効果の値は１種類の生物種内ではケース・バイ・ケースなものであることが明確に示された。
【0151】
【表4】
Ｎ．Ａ．－非適用
Ｙ－あり
【0152】
【表5】
【0153】
考察
本試験では、抗生物質相互作用の効率的判定を可能にするＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイについて説明し特徴付けを行った。広範な技術的検証によって、高度に精密でありかつ高精度であることが示され、また既に確立されているチェッカーボード法と全体的に同等の性能を有していることが示された。次いで、臨床的ＵＴＩ単離株の大規模収集物に対してＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）を用いた抗生物質相乗性スクリーニングを実施した。一貫した相乗性、中性的な作用および拮抗的相互作用が見いだされ、それは株毎に大きく異なるものであった。
本試験では、抗生物質相互作用の効率的判定を可能にするＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイについて説明し特徴付けを行った。広範な技術的検証によって、高度に精密でありかつ高精度であることが示され、また既に確立されているチェッカーボード法と全体的に同等の性能を有していることが示された。次いで、臨床的ＵＴＩ単離株の大規模収集物に対してＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）を用いた抗生物質相乗性スクリーニングを実施した。一貫した相乗性、中性的な作用および拮抗的相互作用が見いだされ、それは株毎に大きく異なるものであった。
【0154】
簡潔さを重んじ臨床実施に見合うように、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）プロトコルの具体的な設計を行った。不活性状態では、抗生物質寒天プレートの通常の保存可能期間に準拠して、多量の冷蔵保存が可能である。これは、目的の抗生物質を含む培養容器挿入部を予め病院および研究室に納品しておき、必要が生じたときに迅速に実施することに適している。活性化工程が開始されれば、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）プレートの取り扱いは通常の寒天プレートの取り扱いと同一であり、したがって、大規模調製における寒天自動注入を含む寒天プレートの大量処理についての既存の臨床パイプラインに適合するものである。
【0155】
外来診療所および大学の研究室の両方で、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）を最も容易に利用できるように、異なる２種類のプロトコルを設計した。すなわち、耐性分断点に基づく臨床利用のためのプロトコル（表２および表３、図２０Ａ～２０ＭにおけるＵＴＩスクリーニングに利用するもの）、および高感度ＭＩＣに基づく研究応用のためのプロトコル（表１、図１８Ａ～１８Ｄのように利用するもの）。ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）による分析は、完全自動化が可能であり、入力としてデジタル写真のみが必要となる。専用機械を必要としないので、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）は、リソースに乏しい環境においても好適である。
【0156】
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の重要な設計原理は、抗生物質相乗性を臨床的に意義のある高濃度で定量することにあった。相乗性を阻害帯の端部から評価するが、このことはＦＩＣｉを利用した組み合わせ空間のＭＩＣ－等効力線を意味するものである。増殖速度に基づく方法などの、その他の方法は、相乗性をより低い阻害レベルに評価する傾向にある。これらの実験では、相乗効果を中程度の阻害範囲で加法モデル（Ｂｌｉｓｓ独立またはＬｏｅｗｅ相加性）からの偏りによって評価する。特定の抗生物質組み合わせについての相互作用プロファイルは用量に依存し得るが、そのためチェッカーボードでは相乗性定量が複雑化することもあることが示されている。これら生物学的に興味深い例は、生理的効果の複雑さを示唆する。そのような変動に対しては、ＦＩＣｉによる相乗性測定は安定したものである（または全く影響をうけない）；その理由は、臨床的に意義のある高い阻害レベル（ＭＩＣ）の設定で実施されるからである。プレートによるＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイの、ブロス微量希釈法と比較したときの他の技術的な差異は、細胞形態に対する抗生物質の表現型効果とよばれるものである。多くの抗生物質はその作用機序の一部として、細胞形態に変化を引き起こす。例えば、βラクタム系抗生物質は、細胞死前に広範な細胞伸長を誘導する。そのような伸長は、光学密度による生細胞数の測定において過大評価を引き起こし得るので、例えば、ブロス法および寒天法によって得られるＭＩＣ値が一致しないこともある。
【0157】
技術的データセットにおいて得られた結果は文献の結果と一致している。ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）は、以前に報告されているＡＭＰ－ＧＥＮ間、ＴＭＰ－ＭＥＣ間、およびＴＭＰ－ＮＩＴ間の相乗性を反復した：すなわち、大腸菌Ｋ１２－ＭＧ１６５５における、ＭＥＣ－ＮＩＴ間の強い拮抗作用、およびβラクタム類とＣＩＰとの間の相加性である。しかし、ＧＥＮ－ＣＩＰ間の相加的組み合わせは、以前の報告では低阻害の増殖速度による方法を用いた分類で相乗性となっている。緑膿菌ＰＡ１４株および黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３における抗生物質相互作用は、以前にはほとんど特徴付けが成されておらず、限られた比較しかない。ＡＭＰ－ＣＩＰ間の相加性は、黄色ブドウ球菌について以前に報告があり、ＣＩＰのβラクタム類およびアミノグリコシドＧＥＮとの相互作用は緑膿菌では拮抗的であることが知られている。ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）は、これらの観察結果についても再現している。まとめると、本発明者らの測定が文献と良好な一致を示すことは、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の精密さと実用性を支持するものである。
【0158】
臨床的ＵＴＩ単離株の上記の相乗効果スクリーニングは再現性があるので、ＴＭＰ－ＭＥＣ間の相互作用のように、２種類の抗生物質を組み合わせることによって、ほとんどの株について一貫した拮抗作用を示すと考えられる場合が存在する。これらのように、おしなべて拮抗的挙動を示すような場合には、実験的にであっても、併用療法を設計する際には明確な指針が必要であることを示唆している。避けるべきそのような抗生物質の組み合わせを見つけ出すのであれば、大規模で体系的な相乗性スクリーニングが必要になる。抗生物質相乗性を定量する従来の方法では、そのような規模で系統的スクリーニングを実施することは、実現不可能である。しかしながら、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）は、新規の方法であって、より作業量が少なく、安価で、それでもなお定量化可能な結果を得ることのできる方法を提供する。相互作用試験に対する本発明者らの新規アプローチを用いることによって、そのような大規模相乗性スクリーニングが達成可能となるのである。
【0159】
ＴＭＰ－ＮＩＴ間、ＴＭＰ－ＭＥＣ間、ＭＥＣ－ＮＩＴ間、ＡＭＰ－ＧＥＮ間、ＡＭＰ－ＣＴＸ間、およびＧＥＮ－ＣＴＸ間の相互作用に関するスクリーニングによって、重要な結果が明らかになった；すなわち、同一の２種類の抗生物質が同一種に属する異なる単離株に対して一貫した相乗性プロファイルを示すとは限らない。抗生物質がある１株に対して相乗的であり得るが、別の１株に対しては相加的または拮抗的であるならば、相乗効果スクリーニングが微生物検査室の標準試験の一部となるべきである。そのような挙動はＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）のようなアッセイの必要性をさらに示すものである。定量的であるが、難しい、または時間がかかるという理由で実施されないということがないような、充分簡便なアッセイであって、標準的スクリーニングの一部とすべきものであれば、微生物検査室において全ての症例にそのようなアッセイが実施される。
【0160】
臨床応用性に加えて、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）は、生物学における基礎研究のツールとしても高い潜在的可能性を秘めている。現在のところ、ほとんどの抗生物質相互作用についてその機構の理解が欠如している。また、この研究分野においては、抗生物質相互作用または他の生体活性化合物と抗生物質との相互作用に関する進化論的な理解にはほど遠い。これら知識上のギャップについては、部分的には従来の相乗効果測定法の複雑性によって説明されるのかもしれない。ＵＴＩ単離株のスクリーニングにおいては、ほとんどの抗生物質相互作用が相加的であった。可変的相乗性プロファイルがＭＥＣ－ＴＭＰ間およびＡＭＰ－ＧＥＮ間で観察されたが、これは興味深い生物株毎の変動を示唆している。さらに、ＭＥＣ－ＮＩＴ間の高度に拮抗的な相互作用はこの薬剤相互作用の進化的保存を潜在的に示すものであるのかもしれないが、これは細胞性機能モジュール間の機能的拘束性を示唆する。この拮抗作用は潜在的には、成分薬剤に対する細胞薬剤応答およびストレス応答における重なり合いによって説明され得る。βラクタム類およびＮＩＴはいずれも、個別的にＤＮＡ修復に関する細胞ＳＯＳ応答を発現し、これは潜在的には協調的でより強い防御応答による拮抗作用を説明するものであることが示されている。しかしながら、これらの抗生物質はまた、他の応答システムも誘導する；すなわち、βラクタム類についてのＲｐｏＳ媒介性ストレス応答およびＮＩＴの場合の酸化ストレス応答である。したがって、この拮抗作用はあるいは、これらさらなる応答の潜在的多面作用によって説明することも可能であろう。全く別の説明としては、抗生物質取り込み機構の減退または解毒作用の増強が挙げられる。これらの仮説およびその他の仮説は、機能遺伝学的スクリーニングのためのＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）を実施することによって効率的に試験することができるであろう。
【0161】
実施例２：較正プロトコル
試験する各抗生物質について、好適な参照株を選択する。本実施例においては、較正はいずれも大腸菌株Ｋ１２－ＭＧ１６６５で実施した。較正プロトコルの各工程を下に示す：
（１）既知でない限り、参照株に対する抗生物質のＭＩＣを、ブロス微量希釈アッセイ（ＢＭＤ）を用いて決定する。
（２）ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイの準備は３重試料とする。ＭＨ寒天において、１０×ＭＩＣ、２０×ＭＩＣ、および４０×ＭＩＣの抗生物質濃度で、抗生物質を３種類の化学物質リザーバーに導入する。
（３）ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイのプロトコルにしたがって、寒天最終層を３つの培養容器挿入部の上に注ぎ、固化した後、プロトコルにしたがって参照株の（細胞）集団を接種する。
（４）２４時間後に、図９に示すような挿入部の外側に阻害帯が形成される。
試験する各抗生物質について、好適な参照株を選択する。本実施例においては、較正はいずれも大腸菌株Ｋ１２－ＭＧ１６６５で実施した。較正プロトコルの各工程を下に示す：
（１）既知でない限り、参照株に対する抗生物質のＭＩＣを、ブロス微量希釈アッセイ（ＢＭＤ）を用いて決定する。
（２）ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイの準備は３重試料とする。ＭＨ寒天において、１０×ＭＩＣ、２０×ＭＩＣ、および４０×ＭＩＣの抗生物質濃度で、抗生物質を３種類の化学物質リザーバーに導入する。
（３）ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイのプロトコルにしたがって、寒天最終層を３つの培養容器挿入部の上に注ぎ、固化した後、プロトコルにしたがって参照株の（細胞）集団を接種する。
（４）２４時間後に、図９に示すような挿入部の外側に阻害帯が形成される。
【0162】
培養容器挿入部の外側の該濃度帯の端部は、該株に対して用いる抗生物質のＭＩＣに対応する。３か所の阻害帯の全ての端部について予測される濃度がＢＭＤによって決定した実験値に一致するまで、ＦＥＭ濃度モデルの拡散係数を繰り返し調整する。拡散係数の調整が完了すれば、較正アッセイの残りの２つの多重化生体試料に対して、該モデルを試験する。ＭＩＣ予測における変動性が残りの両アッセイについて実験値の１０％未満であれば、較正は完了となる。拡散モデル較正の後に、その抗生物質を全実験アッセイに用いることが可能となる。推奨初期抗生物質濃度は、計算アーティファクトを回避するために５ｍｍ超の阻害帯を与える濃度として算出する。
【0163】
実施例３：ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイのプロトコル
（１）用いるパイプラインの外側：ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）培養容器挿入部を調製する。
（ａ）ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）培養容器挿入部を滅菌ペトリ皿に設置する；
（ｂ）導入抗生物質濃度については、表１（ＭＩＣに基づく高解像度測定）または表２または３（分断点に基づく測定）を参照する；
（ｃ）オートクレーブした液状ＭＨ寒天（温度５０～６５℃）中に抗生物質を導入濃度になるように希釈する；
（ｄ）ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）培養容器挿入部の既定の化学物質リザーバーに０．５ｍｌの抗生物質寒天を添加する；
（ｅ）ペトリ皿に蓋をして、寒天の設置可能な水平面で冷蔵する。４℃においては、装着した培養容器挿入部は少なくとも１週間は安定である。
（２）使用前：標的株の単一コロニーから、ＭＨブロスで一晩増殖させて高密度培養物とする。
（３）使用する時：ＭＨ寒天で覆うことによってＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）培養容器挿入部を活性化する。標準的な９０ｍｍペトリ皿であれば、２５ｍｌのＭＨ寒天を加える。
（４）少なくとも３時間室温で寒天セットを静置する。
（５）高密度細菌培養物を０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄに希釈する。
（６）ディスク拡散試験ｖ８．０に関するＥＵＣＡＳＴ指針にしたがい、ローン状増殖を得るために、滅菌綿棒を用いて細菌をプレート表面に接種する。
（７）プレートを２４時間インキュベートする。
（８）プレートの写真を撮影して、ＣＰおよびＩＣ点を同定する。
（９）分析アルゴリズムにデータを入力する。
（１）用いるパイプラインの外側：ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）培養容器挿入部を調製する。
（ａ）ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）培養容器挿入部を滅菌ペトリ皿に設置する；
（ｂ）導入抗生物質濃度については、表１（ＭＩＣに基づく高解像度測定）または表２または３（分断点に基づく測定）を参照する；
（ｃ）オートクレーブした液状ＭＨ寒天（温度５０～６５℃）中に抗生物質を導入濃度になるように希釈する；
（ｄ）ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）培養容器挿入部の既定の化学物質リザーバーに０．５ｍｌの抗生物質寒天を添加する；
（ｅ）ペトリ皿に蓋をして、寒天の設置可能な水平面で冷蔵する。４℃においては、装着した培養容器挿入部は少なくとも１週間は安定である。
（２）使用前：標的株の単一コロニーから、ＭＨブロスで一晩増殖させて高密度培養物とする。
（３）使用する時：ＭＨ寒天で覆うことによってＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）培養容器挿入部を活性化する。標準的な９０ｍｍペトリ皿であれば、２５ｍｌのＭＨ寒天を加える。
（４）少なくとも３時間室温で寒天セットを静置する。
（５）高密度細菌培養物を０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄに希釈する。
（６）ディスク拡散試験ｖ８．０に関するＥＵＣＡＳＴ指針にしたがい、ローン状増殖を得るために、滅菌綿棒を用いて細菌をプレート表面に接種する。
（７）プレートを２４時間インキュベートする。
（８）プレートの写真を撮影して、ＣＰおよびＩＣ点を同定する。
（９）分析アルゴリズムにデータを入力する。
【0164】
実施例４：ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の異なる生体活性化合物
本実施例においては、４種類の異なる細菌種に対して異なる生体活性化合物を用いて、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイの実用性を広げた。
本実施例においては、４種類の異なる細菌種に対して異なる生体活性化合物を用いて、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイの実用性を広げた。
【0165】
材料と方法
株と培地
大腸菌株Ｋ１２－ＭＧ１６５５（Ｅｃｏ）、緑膿菌ＰＡ１４（Ｐａｅ）、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３（Ｓａｕ）および海洋細菌であるＶｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ ＡＴＣＣ１４０４８（Ｖｎａ）を、４種類の生体活性化合物：すなわち、アスピリン（ＡＳＰ）、安息香酸（ＢＡ）、イブプロフェン（ＩＢＵ）、およびティーツリー油（ＴＴＯ）に対して用いた。細菌培養は、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ寒天上、およびＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ；Ｒｅｆｓ．２７５７３０、２２５２５０）で、３７℃一晩インキュベーションすることによって、実施した。単一コロニーから１ｍｌで１９０ｒｐｍの旋回振盪を行い、一晩培養した培養物を調製した。海洋細菌であるＶｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓについては、２０４ｍＭ ＮａＣｌ、４．２ｍＭ ＫＣｌ、および２３．１４ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むｖ２塩を培地に添加した［１０］。生体活性化合物のストックは、製造元の推奨にしたがって調製し、それぞれ単回利用とするために分注して－２０℃で保存した：アスピリン４００ｍｇ／ｍｌ（５０％ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．Ａ２０９３－１００Ｇ）、安息香酸４００ｍｇ／ｍｌ（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．２４２３８１－２５Ｇ）、およびイブプロフェン６６４ｍｇ／ｍｌ（水）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｉ１８９２－１００Ｇ）。ティーツリー油は１００％のものを製造元より購入し、使用するまで室温で保存した（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．Ｗ３９０２０８－ＳＡＭＰＬＥ－Ｋ）。
株と培地
大腸菌株Ｋ１２－ＭＧ１６５５（Ｅｃｏ）、緑膿菌ＰＡ１４（Ｐａｅ）、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３（Ｓａｕ）および海洋細菌であるＶｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ ＡＴＣＣ１４０４８（Ｖｎａ）を、４種類の生体活性化合物：すなわち、アスピリン（ＡＳＰ）、安息香酸（ＢＡ）、イブプロフェン（ＩＢＵ）、およびティーツリー油（ＴＴＯ）に対して用いた。細菌培養は、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ寒天上、およびＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ；Ｒｅｆｓ．２７５７３０、２２５２５０）で、３７℃一晩インキュベーションすることによって、実施した。単一コロニーから１ｍｌで１９０ｒｐｍの旋回振盪を行い、一晩培養した培養物を調製した。海洋細菌であるＶｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓについては、２０４ｍＭ ＮａＣｌ、４．２ｍＭ ＫＣｌ、および２３．１４ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むｖ２塩を培地に添加した［１０］。生体活性化合物のストックは、製造元の推奨にしたがって調製し、それぞれ単回利用とするために分注して－２０℃で保存した：アスピリン４００ｍｇ／ｍｌ（５０％ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．Ａ２０９３－１００Ｇ）、安息香酸４００ｍｇ／ｍｌ（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．２４２３８１－２５Ｇ）、およびイブプロフェン６６４ｍｇ／ｍｌ（水）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｉ１８９２－１００Ｇ）。ティーツリー油は１００％のものを製造元より購入し、使用するまで室温で保存した（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ．Ｗ３９０２０８－ＳＡＭＰＬＥ－Ｋ）。
【0166】
ブロス微量希釈法
生体活性化合物のＭＩＣ値は、ＥＵＣＡＳＴ指針に準拠して、標準的ブロス微量希釈法を用いて個別に決定した。Ｅｃｏ、ＰａｅおよびＳａｕ株用に、各生体活性化合物の段階的２倍希釈物を９６穴マイクロタイタープレート中のＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎブロスに調製した。次いで、高密度の一晩培養物からおおよそ３×１０５細胞をこれらのプレートに接種して（１：１０００希釈、最終容積１８０μｌ）、密閉し、振盪せずに３７℃で２４時間インキュベートした。非接種対照ウェルに可視的な増殖シグナルを与える最低濃度をＭＩＣとする。測定は３重化生物試料を用いて行い、それらの平均値をＭＩＣとした。Ｖｎａ株についてのＭＩＣの決定では、この細菌種の増殖に必要なｖ２塩を培地に添加した。
生体活性化合物のＭＩＣ値は、ＥＵＣＡＳＴ指針に準拠して、標準的ブロス微量希釈法を用いて個別に決定した。Ｅｃｏ、ＰａｅおよびＳａｕ株用に、各生体活性化合物の段階的２倍希釈物を９６穴マイクロタイタープレート中のＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎブロスに調製した。次いで、高密度の一晩培養物からおおよそ３×１０５細胞をこれらのプレートに接種して（１：１０００希釈、最終容積１８０μｌ）、密閉し、振盪せずに３７℃で２４時間インキュベートした。非接種対照ウェルに可視的な増殖シグナルを与える最低濃度をＭＩＣとする。測定は３重化生物試料を用いて行い、それらの平均値をＭＩＣとした。Ｖｎａ株についてのＭＩＣの決定では、この細菌種の増殖に必要なｖ２塩を培地に添加した。
【0167】
導入濃度
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイを用いて自己相互作用を判定するために、用いた４種類の株（表６）に対する生体活性化合物のＭＩＣに基づき導入濃度を決定した。
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイを用いて自己相互作用を判定するために、用いた４種類の株（表６）に対する生体活性化合物のＭＩＣに基づき導入濃度を決定した。
【0168】
【表6】
【0169】
結果と考察
本実施例によって、抗生物質（図２１）に加えて、生体活性化合物の評価にも、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）を利用し得ることが実証された。これらの化合物は、寒天増殖培地内を容易に拡散する。挿入部における化合物の濃度を増加することによって、阻害帯のサイズに差異を認め、図９～１０に関する上記の考察のように、定量することが可能である。
本実施例によって、抗生物質（図２１）に加えて、生体活性化合物の評価にも、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）を利用し得ることが実証された。これらの化合物は、寒天増殖培地内を容易に拡散する。挿入部における化合物の濃度を増加することによって、阻害帯のサイズに差異を認め、図９～１０に関する上記の考察のように、定量することが可能である。
【0170】
したがって、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）は、抗生物質間の薬剤相互作用の試験にのみ限定されるものではない。原理的には、任意の生体活性化合物の個々の活性および組み合わせ活性を、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）によって試験することができる。したがって、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）は、例えば、ヒトおよび動物細胞などの細胞に対する化学療法化合物の効果を試験する、およびまた環境微生物学の用途に利用するのであってもよい。用途の潜在的多様性は、異なる培地および異なる培養条件（異なる温度でＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）を実施することなど）で容易に実施することができるＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の柔軟性の高さによるものである。活性が光学的に追跡可能、例えば、蛍光、比色定量などで追跡可能な場合には、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）はまた、複数の誘導因子および抑制因子に依存する、生物学的活性の特徴付けに利用することもできるであろう。抗生物質耐性の広がりによって併用療法の有用性が増しているのだが、病原体の高度な多様性は、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイによって得られる結果に基づく治療検証および治療最適化が好ましくは必要である個別化医療の付加価値を示唆するものである。ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）は、（他の分析法によって）広範な耐性を示す単離株について、併用療法の可能性の判別を容易にするものであってもよい。
【0171】
実施例５：ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）の混合細菌試料
本実施例においては、単一の試験で混合細菌試料を扱いその２種類の成分細菌を異なる蛍光マーカーで区別して異なる２セットのＦＩＣｉを推定するようにＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイの実用性を広げた。
本実施例においては、単一の試験で混合細菌試料を扱いその２種類の成分細菌を異なる蛍光マーカーで区別して異なる２セットのＦＩＣｉを推定するようにＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイの実用性を広げた。
【0172】
材料と方法
株と培地
株ＭＰ０２６およびＴＢ１９１はいずれも大腸菌Ｋ１２－ＭＧ１６５５株の派生株である。ＭＰ０２６は遺伝子操作されており赤色蛍光蛋白質（ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子によってコードされる）を発現する。この株は抗生物質クロラムフェニコールに感受性である。株ＭＰ０２６は、Ｍａｒｏｓ Ｐｌｅｓｋａ博士（ロックフェラー大学、米国）に提供していただいた。ＴＢ１９１も遺伝子操作されており、シアン蛍光蛋白質（ｃｅｒｕｌｅａｎ遺伝子によってコードされる）を発現し抗生物質クロラムフェニコール（ｃａｔ遺伝子によってコードされる）に耐性である。ＴＢ１９１は、Ｔｏｂｉａｓ Ｂｅｒｇｍｉｌｌｅｒ博士（エクセター大学、イギリス）に提供していただいた。Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ寒天およびＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ；Ｒｅｆｓ．２７５７３０、２２５２５０）を用いて３７℃で一晩インキュベーションすることにより細菌培養を行った。単一コロニーから１ｍｌで１９０ｒｐｍの旋回振盪を行い、一晩培養した培養物を調製した。抗生物質のストックは、製造元の推奨にしたがって調製し、それぞれ単回利用とするために分注して－２０℃で保存した：ＮＩＴ １０ｍｇ／ｍｌ（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｎ７８７８－１０Ｇ）、およびＴＭＰ １０ｍｇ／ｍｌ（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｔ－７８８３－５Ｇ）；ＣＡＭ １２．５ｍｇ／ｍＬ（エタノール）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｃ０３７８－５Ｇ）。
株と培地
株ＭＰ０２６およびＴＢ１９１はいずれも大腸菌Ｋ１２－ＭＧ１６５５株の派生株である。ＭＰ０２６は遺伝子操作されており赤色蛍光蛋白質（ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子によってコードされる）を発現する。この株は抗生物質クロラムフェニコールに感受性である。株ＭＰ０２６は、Ｍａｒｏｓ Ｐｌｅｓｋａ博士（ロックフェラー大学、米国）に提供していただいた。ＴＢ１９１も遺伝子操作されており、シアン蛍光蛋白質（ｃｅｒｕｌｅａｎ遺伝子によってコードされる）を発現し抗生物質クロラムフェニコール（ｃａｔ遺伝子によってコードされる）に耐性である。ＴＢ１９１は、Ｔｏｂｉａｓ Ｂｅｒｇｍｉｌｌｅｒ博士（エクセター大学、イギリス）に提供していただいた。Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ寒天およびＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ；Ｒｅｆｓ．２７５７３０、２２５２５０）を用いて３７℃で一晩インキュベーションすることにより細菌培養を行った。単一コロニーから１ｍｌで１９０ｒｐｍの旋回振盪を行い、一晩培養した培養物を調製した。抗生物質のストックは、製造元の推奨にしたがって調製し、それぞれ単回利用とするために分注して－２０℃で保存した：ＮＩＴ １０ｍｇ／ｍｌ（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｎ７８７８－１０Ｇ）、およびＴＭＰ １０ｍｇ／ｍｌ（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｔ－７８８３－５Ｇ）；ＣＡＭ １２．５ｍｇ／ｍＬ（エタノール）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．Ｃ０３７８－５Ｇ）。
【0173】
混合試験
実施例１で説明されるようなＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイに使用する目的で、ＭＰ０２６およびＴＢ１９１株のそれぞれを一晩培養し希釈した培養物を接種材料として用いた。ＭＰ０２６とＴＢ１９１株を１：１の比で混合した混合物を一晩培養した培養物から調製した。一晩培養した培養物の総密度は２×１０８ｃｆｕ／ｍＬであった。次いで、実施例１で説明されるようなＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイに使用する目的で、この混合物を接種材料として用いた。用いた３種類の抗生物質（表７）に対するＭＰ０２６株のＭＩＣに基づいて、挿入部の抗生物質濃度を決定した。
実施例１で説明されるようなＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイに使用する目的で、ＭＰ０２６およびＴＢ１９１株のそれぞれを一晩培養し希釈した培養物を接種材料として用いた。ＭＰ０２６とＴＢ１９１株を１：１の比で混合した混合物を一晩培養した培養物から調製した。一晩培養した培養物の総密度は２×１０８ｃｆｕ／ｍＬであった。次いで、実施例１で説明されるようなＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイに使用する目的で、この混合物を接種材料として用いた。用いた３種類の抗生物質（表７）に対するＭＰ０２６株のＭＩＣに基づいて、挿入部の抗生物質濃度を決定した。
【0174】
【表7】
【0175】
結果と考察
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）が混合細菌試料に利用可能であることを実証した。混合物の成分細菌を蛍光（図２２）または比色によって区別し得る場合には、単一ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイにおいてそれら個々のＦＩＣｉ値を決定することができる。表８には、ＭＰ０２６およびＴＢ１９１についてのＦＩＣｉ値を示す。
ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）が混合細菌試料に利用可能であることを実証した。混合物の成分細菌を蛍光（図２２）または比色によって区別し得る場合には、単一ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイにおいてそれら個々のＦＩＣｉ値を決定することができる。表８には、ＭＰ０２６およびＴＢ１９１についてのＦＩＣｉ値を示す。
【0176】
【表8】
【0177】
ほとんどの細菌感染において病原体の高度な多様性が観察されるが、ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）は未精製混合試料でも利用可能である。株精製の工程を省略することによって、どの抗生物質の組み合わせを治療に用いると有効であるかを判定するための総アッセイ時間を短縮できる。ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）アッセイが、診断法として、および個別化医療を設計し検証する目的において高い価値を有するものであることが理解されるであろう。ＣｏｍｂｉＡＮＴ（登録商標）を、例えば、蛍光または比色によって区別することのできる試料に用いる場合には、同一試料中の異なる細菌について、複数のＦＩＣｉを取得することができる。
【0178】
上記の実施態様は、本発明のいくつかの具体例であると理解されたい。本発明の範囲から逸脱することなく実施態様に様々な変更、組み合わせ、変形を加え得ることは、当業者であれば理解するであろう。特に、異なる実施態様における異なる課題解決部は、技術的に可能な他の構成で組み合わせることもできる。
参考文献
［１］ Ｂｒｏｃｈａｄｏ， ｅｔ ａｌ． Ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１８； ５５９： ２５９－２６３
［２］ ＷＯ ２０１５／０２８９８３ Ａ１
［３］ Ｄｒｉｅｕｘ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ： ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｂｅｎｃｈ ｇｕｉｄｅ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ ２００８； １４ Ｓｕｐｐｌ １： ９０－１０３
［４］ ＵＳ ２０１２／０１４９０５５ Ａ１
［５］ ＵＳ ４，７７８，７５８ Ａ
［６］ Ｗｈｉｔｅ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｓｙｎｅｒｇｙ： ｔｉｍｅ－ｋｉｌｌ， ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ， ａｎｄ Ｅ ｔｅｓｔ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ １９９６； ４０： １９１４－１９１８
［７］ ＵＳ ４，３２４，８５９ Ａ
［８］ Ｒｕｓｓ ｅｔ ａｌ． Ａｄｄｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１８； ３： １３３９－１３４５
［９］ Ｂｌｉｓｓ． Ｔｈｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｉｓｏｎｓ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｊｏｉｎｔｌｙ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ． １９３９； ２６： ５８５－６１５．
［１０］ Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ， ｅｔ ａｌ． Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ ａｓ ａ ｆａｓｔ－ｇｒｏｗｉｎｇ ｈｏｓｔ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１６； １３： ８４９－８５１
参考文献
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［８］ Ｒｕｓｓ ｅｔ ａｌ． Ａｄｄｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１８； ３： １３３９－１３４５
［９］ Ｂｌｉｓｓ． Ｔｈｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｉｓｏｎｓ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｊｏｉｎｔｌｙ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ． １９３９； ２６： ５８５－６１５．
［１０］ Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ， ｅｔ ａｌ． Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ ａｓ ａ ｆａｓｔ－ｇｒｏｗｉｎｇ ｈｏｓｔ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１６； １３： ８４９－８５１
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図20D】
【図20E】
【図20F】
【図20G】
【図20H】
【図20I】
【図20J】
【図20K】
【図20L】
【図20M】
【図21】
【図22】
【国際調査報告】