(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-29
(54)【発明の名称】Ｎｅｃｔｉｎ－４に対する抗体及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230522BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230522BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230522BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230522BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230522BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230522BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230522BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230522BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20230522BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230522BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230522BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/63 Z
C07K16/28
A61K39/395 T
A61K39/395 Y
A61P35/04
A61P35/00
A61K47/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022563917
(86)(22)【出願日】2021-04-21
(85)【翻訳文提出日】2022-12-20
(86)【国際出願番号】 CN2021088661
(87)【国際公開番号】W WO2021213434
(87)【国際公開日】2021-10-28
(31)【優先権主張番号】202010320420.3
(32)【優先日】2020-04-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522261352
【氏名又は名称】▲邁▼威（上海）生物科技股▲フン▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100122471
【弁理士】
【氏名又は名称】籾井 孝文
(74)【代理人】
【識別番号】100193172
【弁理士】
【氏名又は名称】上川 智子
(72)【発明者】
【氏名】任 紅媛
(72)【発明者】
【氏名】朱 ▲ジェン▼
(72)【発明者】
【氏名】林 ▲鑑▼
(72)【発明者】
【氏名】王 ▲驪▼淳
(72)【発明者】
【氏名】徐 ▲曉▼紅
(72)【発明者】
【氏名】▲デン▼ 小芳
(72)【発明者】
【氏名】▲畢▼ 建▲軍▼
(72)【発明者】
【氏名】王 晋
(72)【発明者】
【氏名】▲呉▼ 建
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA86X
4B065AA87X
4B065AA87Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB19
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF70
4C085AA14
4C085AA26
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
ヒトＮｅｃｔｉｎ－４又はそのフラグメントに結合する抗体分子を提供する。この抗体は、ハイブリドーマスクリーニング及びヒト化技術によって得られ、癌の予防又は治療に使用され、臨床リード薬物分子として使用することができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）配列番号３５、配列番号３９及び配列番号４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＴＦＴＴＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＹＰＧＮＶＮ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＧＬＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号４７及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＹＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；（２）配列番号３６、配列番号４０及び配列番号４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＴＦＴＴＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＧＬＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号４７及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＹＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（３）配列番号３７、配列番号４１及び配列番号４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＴＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＧＬＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号４７及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＹＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（４）配列番号３８、配列番号４２及び配列番号４４に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＴＴＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＧＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＡＲＧＬＹＹＦＤ）；並びに配列番号４６、配列番号４８及び配列番号５０に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＳＮＤＶＡＷＹ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＬＬＩＹＹＡＳＮＲＹ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹ）；
（５）配列番号５１、配列番号５５及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＧＤＧＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６１、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（６）配列番号５２、配列番号５６及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹＧＶＳ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＶＩＷＧＤＧＫＩＹ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６１、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（７）配列番号５３、配列番号５７及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＤＹＧＶＳ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＶＩＷＧＤＧＫＩＹＹＮＳＶＬＫＳ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６１、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（８）配列番号５４、配列番号５８及び配列番号６０に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＩＤＹＧＶＳ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＬＧＶＩＷＧＤＧＫＩＹ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＡＫＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤ）；並びに配列番号６２、配列番号６４及び配列番号６６に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡＷＹ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＬＬＩＹＦＡＳＴＲＥ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦ）；
（９）配列番号５１、配列番号５５及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＧＤＧＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６７、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（１０）配列番号５１、配列番号６８及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＧＤＡＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６７、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（１１）配列番号５１、配列番号６９及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＧＧＧＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６７、配列番号６３、配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（１２）配列番号７０、配列番号７４及び配列番号７８に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＴＦＴＳＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＹＰＧＮＡＮ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＳＶＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号８０及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＮＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（１３）配列番号７１、配列番号７５及び配列番号７８に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＹＰＧＮＡＮＮＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＳＶＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号８０及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＮＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（１４）配列番号７２、配列番号７６及び配列番号７８に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＳＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＹＰＧＮＡＮＮＫＹＮＥＮＦＫＧ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＳＶＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号８０及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＮＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（１５）配列番号７３、配列番号７７及び配列番号７９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＴＳＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＧＷＩＹＰＧＮＡＮＮＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＡＲＳＶＹＹＦＤ）；並びに配列番号４６、配列番号８１及び配列番号５０に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＳＮＤＶＡＷＹ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＬＬＩＹＹＡＳＮＲＮ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹ）；
（１６）配列番号８２、配列番号８６及び配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＳＦＴＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＮＰＮＮＧＮ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＥＤＲＹＡＦＡＹ）；並びに配列番号９２、配列番号９４及び配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＴＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＬＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＨＴＷＥＩＰＹＴ）；
（１７）配列番号８３、配列番号８７及び配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＳＦＴＤＹＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＲＶＮＰＮＮＧＮＴＬ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＥＤＲＹＡＦＡＹ）；並びに配列番号９２、配列番号９４及び配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＴＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＬＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＨＴＷＥＩＰＹＴ）；
（１８）配列番号８４、配列番号８８及び配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＤＹＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＲＶＮＰＮＮＧＮＴＬＹＮＱＫＦＲＧ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＥＤＲＹＡＦＡＹ）；並びに配列番号９２、配列番号９４及び配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＴＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＬＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＨＴＷＥＩＰＹＴ）；並びに、
（１９）配列番号８５、配列番号８９及び配列番号９１に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＴＤＹＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＧＲＶＮＰＮＮＧＮＴＬ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＡＲＥＤＲＹＡＦＡ）；並びに配列番号９３、配列番号９５及び配列番号９７に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＳＴＳＳＹＴＹＭＨＷＹ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＬＬＩＫＹＡＳＮＬＥ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＨＴＷＥＩＰＹ）、
から選択される重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの組合せを含む、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体分子又はそのフラグメント。
【請求項2】
前記抗体分子又はそのフラグメントにおいて、前記重鎖可変領域が配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号８、配列番号１１若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列、若しくは示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は、前記重鎖可変領域が配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列、若しくは示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号１４、配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２５に示されるアミノ酸配列、若しくは示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は、
前記重鎖可変領域が配列番号２７、配列番号２９若しくは配列番号３０に示されるアミノ酸配列、若しくは示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号２８、配列番号３１若しくは配列番号３２に示されるアミノ酸配列、若しくは示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は、
前記重鎖可変領域が配列番号３３に示されるアミノ酸配列、若しくは示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号３４に示されるアミノ酸配列、若しくは示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体分子又はそのフラグメント。
【請求項3】
前記抗体分子又はそのフラグメントにおける前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、以下のようなアミノ酸配列の組合せから選択される、請求項１又は２に記載の抗体分子又はそのフラグメント：（１）配列番号７に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号８に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（２）配列番号９に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号９に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（４）配列番号１０に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（５）配列番号１０に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（６）配列番号１３に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（７）配列番号１６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（８）配列番号１６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（９）配列番号１６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１０）配列番号１９に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１１）配列番号２１に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１２）配列番号２７に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１３）配列番号２９に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１４）配列番号３０に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；又は、
（１５）配列番号３３に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項4】
ポリオウイルス受容体様分子４（Ｎｅｃｔｉｎ－４）、好ましくは哺乳動物Ｎｅｃｔｉｎ－４、より好ましくは霊長類Ｎｅｃｔｉｎ－４、更に好ましくはヒト又はカニクイザルＮｅｃｔｉｎ－４、特にヒトＮｅｃｔｉｎ－４に結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体分子又はそのフラグメント。
【請求項5】
前記抗体分子がマウス抗体、キメラ抗体、又は完全若しくは部分ヒト化抗体であり、前記フラグメントが前記抗体分子の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント）２（ｄｓＦｖ）２、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又は可変フラグメント（Ｆｖ）であり、好ましくは、前記抗体分子がモノクローナル抗体又は一本鎖抗体であり、
好ましくは、前記抗体分子又はそのフラグメントが定常領域、好ましくはマウス又はヒト重鎖定常領域（ＣＨ）及び／又は軽鎖定常領域（ＣＬ）を更に含み、好ましくは、前記抗体分子又はそのフラグメントが重鎖及び軽鎖を含み、
より好ましくは、前記抗体分子又はそのフラグメントがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ若しくはＩｇＥの重鎖定常領域、及び／又はカッパ型若しくはラムダ型の軽鎖定常領域を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体分子又はそのフラグメント。
【請求項6】
前記抗体分子がモノクローナル抗体、好ましくはヒト化モノクローナル抗体であり、好ましくは、前記モノクローナル抗体の前記重鎖定常領域がＩｇＧ１型のものであり、前記軽鎖定常領域がカッパ型のものである、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体分子又はそのフラグメント。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子又はそのフラグメントに含まれる重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項8】
請求項７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項9】
請求項７に記載の核酸分子及び／又は請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞、又は請求項７に記載の核酸分子及び／又は請求項８に記載のベクターで形質転換若しくはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項10】
請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子若しくはそのフラグメント、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター又は請求項９に記載の宿主細胞を含む組成物であって、好ましくは、該組成物が医薬組成物であり、任意に薬学的に許容可能な担体、アジュバント又は賦形剤を含む、組成物。
【請求項11】
疾患又は障害の検出又は診断のための作用物質の製造における請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子若しくはそのフラグメント、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞又は請求項１０に記載の組成物の使用。
【請求項12】
疾患又は障害を検出又は診断する方法であって、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子若しくはそのフラグメント、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞又は請求項１０に記載の組成物を被験体に由来する試料と接触させることを含み、前記被験体が哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである、方法。
【請求項13】
抗体薬物コンジュゲートの調製における請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子又はそのフラグメントの使用。
【請求項14】
請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子又はそのフラグメントを細胞毒性部分にコンジュゲートすることによって形成される抗体薬物コンジュゲートであって、好ましくは、前記細胞毒性部分がチューブリン阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡ結合剤であり、
より好ましくは、前記チューブリン阻害剤がメイタンシノイド、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ)、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルドラスタチン１０、ツブリシン及びその誘導体、クリプトフィシン及びその誘導体、並びにタルトブリンからなる群から選択され、
より好ましくは、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、ドキソルビシンの代謝産物であるＰＮＵ－１５９６８２及びその誘導体、並びにイリノテカン（ＣＰＴ－１１）の代謝産物であるＳＮ３８及びその誘導体からなる群から選択され、
より好ましくは、前記ＤＮＡ結合剤がＰＢＤ及びその誘導体、並びにデュオカルマイシン及びその誘導体からなる群から選択される、抗体薬物コンジュゲート。
【請求項15】
疾患又は障害の予防又は治療のための薬剤の製造における請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子若しくはそのフラグメント、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、請求項１０に記載の組成物又は請求項１４に記載の抗体薬物コンジュゲートの使用。
【請求項16】
疾患又は障害を予防又は治療する方法であって、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子若しくはそのフラグメント、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、請求項１０に記載の組成物又は請求項１４に記載の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする被験体に投与することを含み、前記被験体が哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである、方法。
【請求項17】
請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子又はそのフラグメント、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、請求項１０に記載の組成物又は請求項１４に記載の抗体薬物コンジュゲートを含むキットであって、好ましくは疾患又は障害の治療、検出又は診断に使用される、キット。
【請求項18】
前記疾患又は障害が、Ｎｅｃｔｉｎ－４が高度に発現している腫瘍又は癌であり、好ましくは、前記疾患又は障害が固形腫瘍であり、
好ましくは、前記疾患又は障害が膀胱癌、膵癌、乳癌（トリプルネガティブサブタイプ及び基底サブタイプを含む）、非小細胞肺癌、胃癌、食道癌、卵巣癌等、特に膀胱癌、乳癌、卵巣癌又は肺癌である、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の使用、方法又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年４月２１日に出願された中国特許出願第２０２０１０３２０４２０．３号の優先権を主張し、その特許出願の内容は引用することによりその全体が本明細書に包含される。
本出願は、２０２０年４月２１日に出願された中国特許出願第２０２０１０３２０４２０．３号の優先権を主張し、その特許出願の内容は引用することによりその全体が本明細書に包含される。
【0002】
本開示は、抗体医薬の分野に属し、特にヒトＮｅｃｔｉｎ－４に対する抗体及び薬剤の調製における抗体の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
Ｎｅｃｔｉｎ－４（ＰＶＲＬ４、ポリオウイルス受容体様分子４としても知られる）は、６６ｋＤの分子質量を有するＩ型膜貫通糖タンパク質であり、Ｉｇスーパーファミリータンパク質のネクチンファミリーに属する。Ｎｅｃｔｉｎ－４は、３つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン（ＶＣＣ）を有する細胞外領域を有し、カドヘリンとともに接着結合の形成及び維持において役割を果たす。
【0004】
Ｎｅｃｔｉｎ－４は、様々な腫瘍細胞の生成及び発生と密接に関連している。Ｎｅｃｔｉｎ－４は、多数の固形腫瘍、特に膀胱癌において発現することが見出されており、腫瘍関連抗原として、Ｎｅｃｔｉｎ－４は乳癌、卵巣癌及び肺癌において、それぞれ乳癌の５０％、卵巣癌の４９％及び肺癌の８６％に相当する組織発現の検出率を有し、これらの上皮性悪性腫瘍の発生、浸潤及び転移において重要な役割を果たす。したがって、Ｎｅｃｔｉｎ－４は、複数の固形腫瘍の診断及び治療のための重要な標的となっている。
【0005】
現在、Ｎｅｃｔｉｎ－４を対象とする主要な薬物は、抗Ｎｅｃｔｉｎ－４モノクローナル抗体と殺細胞剤モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）とをコンジュゲートすることによって形成される抗体薬物コンジュゲートであるエンホルツマブベドチンである。エンホルツマブベドチンは、主に膀胱癌、特に尿路上皮癌の治療に使用され、２０１８年３月にＦＤＡ画期的治療薬指定（Breakthrough Therapy Designation）を受けている。加えて、他の研究から、接着因子Ｎｅｃｔｉｎ－４が乳癌において効果的な予後因子として使用することができるだけでなく、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を有する患者に効果的な治療標的としても使用され得ることが示されている。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ研究から、抗Ｎｅｃｔｉｎ－４抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が限局性及び転移性ＴＮＢＣに対してより良好な治癒効果を有することが証明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本開示が解決しようとする技術的課題は、ハイブリドーマスクリーニング及びヒト化を通じて、Ｎｅｃｔｉｎ－４に特異的に結合する高親和性抗体を得ることであり、ヒト化工学によって完全ヒト抗体配列を得る必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記のような技術的課題に対して、本開示の目的は、Ｎｅｃｔｉｎ－４、特にヒトＮｅｃｔｉｎ－４に特異的に結合する抗体分子又はそのフラグメントを提供し、また、その用途を提供することである。本明細書に記載される抗体の「フラグメント」は、特に、抗体の様々な機能的フラグメント、例えばその抗原結合部分、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖフラグメントを包含する。
【0008】
本開示は、以下の技術的解決策を提供する。
【0009】
一態様では、本開示は、
（１）配列番号３５、配列番号３９及び配列番号４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＴＦＴＴＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＹＰＧＮＶＮ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＧＬＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号４７及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＹＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（２）配列番号３６、配列番号４０及び配列番号４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＴＦＴＴＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＧＬＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号４７及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＹＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（３）配列番号３７、配列番号４１及び配列番号４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＴＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＧＬＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号４７及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＹＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（４）配列番号３８、配列番号４２及び配列番号４４に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＴＴＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＧＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＡＲＧＬＹＹＦＤ）；並びに配列番号４６、配列番号４８及び配列番号５０に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＳＮＤＶＡＷＹ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＬＬＩＹＹＡＳＮＲＹ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹ）；
（５）配列番号５１、配列番号５５及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＧＤＧＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６１、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（６）配列番号５２、配列番号５６及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹＧＶＳ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＶＩＷＧＤＧＫＩＹ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６１、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（７）配列番号５３、配列番号５７及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＤＹＧＶＳ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＶＩＷＧＤＧＫＩＹＹＮＳＶＬＫＳ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６１、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（８）配列番号５４、配列番号５８及び配列番号６０に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＩＤＹＧＶＳ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＬＧＶＩＷＧＤＧＫＩＹ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＡＫＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤ）；並びに配列番号６２、配列番号６４及び配列番号６６に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡＷＹ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＬＬＩＹＦＡＳＴＲＥ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦ）；
（９）配列番号５１、配列番号５５及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＧＤＧＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６７、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（１０）配列番号５１、配列番号６８及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＧＤＡＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６７、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（１１）配列番号５１、配列番号６９及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＧＧＧＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６７、配列番号６３、配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（１２）配列番号７０、配列番号７４及び配列番号７８に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＴＦＴＳＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＹＰＧＮＡＮ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＳＶＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号８０及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＮＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（１３）配列番号７１、配列番号７５及び配列番号７８に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＹＰＧＮＡＮＮＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＳＶＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号８０及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＮＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（１４）配列番号７２、配列番号７６及び配列番号７８に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＳＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＹＰＧＮＡＮＮＫＹＮＥＮＦＫＧ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＳＶＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号８０及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＮＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（１５）配列番号７３、配列番号７７及び配列番号７９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＴＳＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＧＷＩＹＰＧＮＡＮＮＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＡＲＳＶＹＹＦＤ）；並びに配列番号４６、配列番号８１及び配列番号５０に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＳＮＤＶＡＷＹ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＬＬＩＹＹＡＳＮＲＮ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹ）；
（１６）配列番号８２、配列番号８６及び配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＳＦＴＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＮＰＮＮＧＮ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＥＤＲＹＡＦＡＹ）；並びに配列番号９２、配列番号９４及び配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＴＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＬＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＨＴＷＥＩＰＹＴ）；
（１７）配列番号８３、配列番号８７及び配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＳＦＴＤＹＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＲＶＮＰＮＮＧＮＴＬ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＥＤＲＹＡＦＡＹ）；並びに配列番号９２、配列番号９４及び配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＴＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＬＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＨＴＷＥＩＰＹＴ）；
（１８）配列番号８４、配列番号８８及び配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＤＹＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＲＶＮＰＮＮＧＮＴＬＹＮＱＫＦＲＧ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＥＤＲＹＡＦＡＹ）；並びに配列番号９２、配列番号９４及び配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＴＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＬＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＨＴＷＥＩＰＹＴ）；並びに、
（１９）配列番号８５、配列番号８９及び配列番号９１に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＴＤＹＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＧＲＶＮＰＮＮＧＮＴＬ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＡＲＥＤＲＹＡＦＡ）；並びに配列番号９３、配列番号９５及び配列番号９７に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＳＴＳＳＹＴＹＭＨＷＹ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＬＬＩＫＹＡＳＮＬＥ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＨＴＷＥＩＰＹ）、
から選択される重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの組合せを含む、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体分子又はそのフラグメントを提供する。
（１）配列番号３５、配列番号３９及び配列番号４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＴＦＴＴＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＹＰＧＮＶＮ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＧＬＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号４７及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＹＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（２）配列番号３６、配列番号４０及び配列番号４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＴＦＴＴＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＧＬＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号４７及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＹＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（３）配列番号３７、配列番号４１及び配列番号４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＴＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＧＬＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号４７及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＹＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（４）配列番号３８、配列番号４２及び配列番号４４に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＴＴＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＧＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＡＲＧＬＹＹＦＤ）；並びに配列番号４６、配列番号４８及び配列番号５０に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＳＮＤＶＡＷＹ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＬＬＩＹＹＡＳＮＲＹ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹ）；
（５）配列番号５１、配列番号５５及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＧＤＧＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６１、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（６）配列番号５２、配列番号５６及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹＧＶＳ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＶＩＷＧＤＧＫＩＹ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６１、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（７）配列番号５３、配列番号５７及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＤＹＧＶＳ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＶＩＷＧＤＧＫＩＹＹＮＳＶＬＫＳ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６１、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（８）配列番号５４、配列番号５８及び配列番号６０に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＩＤＹＧＶＳ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＬＧＶＩＷＧＤＧＫＩＹ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＡＫＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤ）；並びに配列番号６２、配列番号６４及び配列番号６６に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡＷＹ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＬＬＩＹＦＡＳＴＲＥ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦ）；
（９）配列番号５１、配列番号５５及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＧＤＧＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６７、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（１０）配列番号５１、配列番号６８及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＧＤＡＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６７、配列番号６３及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（１１）配列番号５１、配列番号６９及び配列番号５９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＦＳＬＩＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＧＧＧＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹ）；並びに配列番号６７、配列番号６３、配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＨＹＮＴＰＦＴ）；
（１２）配列番号７０、配列番号７４及び配列番号７８に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＴＦＴＳＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＹＰＧＮＡＮ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＳＶＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号８０及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＮＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（１３）配列番号７１、配列番号７５及び配列番号７８に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＹＰＧＮＡＮＮＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＳＶＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号８０及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＮＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（１４）配列番号７２、配列番号７６及び配列番号７８に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＳＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＹＰＧＮＡＮＮＫＹＮＥＮＦＫＧ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＳＶＹＹＦＤＹ）；並びに配列番号４５、配列番号８０及び配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＲＮＴ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ）；
（１５）配列番号７３、配列番号７７及び配列番号７９に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＴＳＹＹＩＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＧＷＩＹＰＧＮＡＮＮＫ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＡＲＳＶＹＹＦＤ）；並びに配列番号４６、配列番号８１及び配列番号５０に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＳＮＤＶＡＷＹ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＬＬＩＹＹＡＳＮＲＮ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＱＤＹＳＳＰＹ）；
（１６）配列番号８２、配列番号８６及び配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＳＦＴＤＹ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＮＰＮＮＧＮ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＥＤＲＹＡＦＡＹ）；並びに配列番号９２、配列番号９４及び配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＴＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＬＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＨＴＷＥＩＰＹＴ）；
（１７）配列番号８３、配列番号８７及び配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＧＹＳＦＴＤＹＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＲＶＮＰＮＮＧＮＴＬ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＥＤＲＹＡＦＡＹ）；並びに配列番号９２、配列番号９４及び配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＴＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＬＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＨＴＷＥＩＰＹＴ）；
（１８）配列番号８４、配列番号８８及び配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＤＹＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＲＶＮＰＮＮＧＮＴＬＹＮＱＫＦＲＧ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＥＤＲＹＡＦＡＹ）；並びに配列番号９２、配列番号９４及び配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＴＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＹＡＳＮＬＥＳ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＨＴＷＥＩＰＹＴ）；並びに、
（１９）配列番号８５、配列番号８９及び配列番号９１に示されるＣＤＲ－Ｈ１（ＴＤＹＹＭＨ）、ＣＤＲ－Ｈ２（ＷＩＧＲＶＮＰＮＮＧＮＴＬ）及びＣＤＲ－Ｈ３（ＡＲＥＤＲＹＡＦＡ）；並びに配列番号９３、配列番号９５及び配列番号９７に示されるＣＤＲ－Ｌ１（ＳＴＳＳＹＴＹＭＨＷＹ）、ＣＤＲ－Ｌ２（ＬＬＩＫＹＡＳＮＬＥ）及びＣＤＲ－Ｌ３（ＱＨＴＷＥＩＰＹ）、
から選択される重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの組合せを含む、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体分子又はそのフラグメントを提供する。
【0010】
本開示の抗体分子又はそのフラグメントにおける重鎖可変領域又は軽鎖可変領域は、当該技術分野で一般に知られる抗体における重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のドメイン構成に従って、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（ここで、ＦＲはフレームワーク領域である）としての配置で上記のドメイン構成要素を含む。
【0011】
好ましくは、本開示によって提供される抗体分子又はそのフラグメントにおいて、重鎖可変領域が配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号８、配列番号１１若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は、
重鎖可変領域が配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１４、配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２５に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は、
重鎖可変領域が配列番号２７、配列番号２９若しくは配列番号３０に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号２８、配列番号３１若しくは配列番号３２に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は、
重鎖可変領域が配列番号３３に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号３４に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
重鎖可変領域が配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１４、配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２５に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は、
重鎖可変領域が配列番号２７、配列番号２９若しくは配列番号３０に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号２８、配列番号３１若しくは配列番号３２に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は、
重鎖可変領域が配列番号３３に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号３４に示されるアミノ酸配列、若しくは示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0012】
本開示の特定の実施の形態によれば、抗体分子又はそのフラグメントにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、以下のようなアミノ酸配列の組合せから選択される：
（１）配列番号７に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号８に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（２）配列番号９に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号９に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（４）配列番号１０に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（５）配列番号１０に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（６）配列番号１３に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（７）配列番号１６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（８）配列番号１６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（９）配列番号１６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１０）配列番号１９に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１１）配列番号２１に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１２）配列番号２７に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１３）配列番号２９に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１４）配列番号３０に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；又は、
（１５）配列番号３３に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
（１）配列番号７に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号８に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（２）配列番号９に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号９に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（４）配列番号１０に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（５）配列番号１０に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（６）配列番号１３に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（７）配列番号１６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（８）配列番号１６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（９）配列番号１６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１０）配列番号１９に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１１）配列番号２１に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１２）配列番号２７に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１３）配列番号２９に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１４）配列番号３０に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；又は、
（１５）配列番号３３に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列；及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【0013】
本開示によって提供される重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の上記の特定のアミノ酸配列によると、それに含まれる重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、当業者によって慣習的に決定することができ、当該技術分野で既知の他の方法によって決定される、得られる重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲ、並びにそれらの組合せも本開示の範囲に含まれる。
【0014】
本開示によって提供される抗体分子又はそのフラグメントは、ポリオウイルス受容体様分子４（Ｎｅｃｔｉｎ－４）、好ましくは哺乳動物Ｎｅｃｔｉｎ－４、より好ましくは霊長類Ｎｅｃｔｉｎ－４、更に好ましくはヒト又はカニクイザルＮｅｃｔｉｎ－４、特にヒトＮｅｃｔｉｎ－４に結合する。
【0015】
好ましくは、抗体分子は、マウス抗体、キメラ抗体、又は完全若しくは部分ヒト化抗体であり、フラグメントはＮｅｃｔｉｎ－４に特異的に結合可能な抗体分子の任意のフラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント）２（ｄｓＦｖ）２、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又は可変フラグメント（Ｆｖ）である。
【0016】
好ましくは、抗体分子は、モノクローナル抗体又は一本鎖抗体である。
【0017】
好ましくは、抗体分子又はそのフラグメントは、ヒト又はマウス定常領域、好ましくはマウス又はヒト重鎖定常領域（ＣＨ）及び／又は軽鎖定常領域（ＣＬ）を更に含み、好ましくは、抗体分子又はそのフラグメントが重鎖及び軽鎖、例えば２つの重鎖及び軽鎖を含む。より好ましくは、抗体分子又はそのフラグメントは、ＩｇＧ型、ＩｇＡ型、ＩｇＭ型、ＩｇＤ型若しくはＩｇＥ型の重鎖定常領域、及び／又はカッパ型若しくはラムダ型の軽鎖定常領域を含む。
【0018】
本開示の特定の実施の形態によれば、本開示によって提供される抗体分子は、モノクローナル抗体、好ましくはヒト化モノクローナル抗体であり、好ましくは、モノクローナル抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１型のものであり、軽鎖定常領域は、カッパ型のものである。例えば、モノクローナル抗体の重鎖定常領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列又は示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、モノクローナル抗体の軽鎖定常領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列又は示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0019】
本開示の文脈において「少なくとも７５％の同一性」は、７５％～１００％の任意の同一性パーセント、例えば７５％、８０％、８５％、９０％、更には９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性である。
【0020】
別の態様では、本開示は、本開示による抗体分子又はそのフラグメントに含まれる重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【0021】
本開示による核酸分子は、ベクターにクローニングすることができ、次にこのベクターが宿主細胞をトランスフェクト又は形質転換する。したがって、更に別の態様では、本開示は、本開示による核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクター、人工染色体、ファージベクター等であり得る。
【0022】
本開示のベクター又は核酸分子は、宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトするために、又は抗体の保存若しくは発現等のために宿主細胞に入るために任意の方法で使用され得る。したがって、更なる態様では、本開示は、本開示による核酸分子及び／又はベクターを含む宿主細胞、又は本開示による核酸分子及び／又はベクターで形質転換若しくはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核生物又は真核生物細胞、例えば細菌若しくは昆虫、真菌、植物又は動物の細胞であり得る。
【0023】
本開示による抗体分子は、当該技術分野で知られている任意の従来の技術を用いて得ることができる。例えば、抗体分子の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、又は抗体分子の重鎖及び／又は軽鎖は、本開示によって提供される核酸分子から得ることができ、次いで、抗体分子は、それらを抗体分子の任意の他のドメインと共に集合させることによって得られるか、或いは、本開示によって提供される宿主細胞は、宿主細胞が抗体分子の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、又は抗体分子の重鎖及び／又は軽鎖を発現し、それらを抗体に集合させることを可能にする条件下で培養される。任意に、この方法は、産生された抗体分子を回収する工程を更に含み得る。
【0024】
本開示によって提供される抗体分子若しくはそのフラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞又は融合タンパク質は、組成物、より詳しくは、医薬製剤に含有されてもよく、実際に必要に応じて様々な目的に使用される。したがって、更なる態様では、本開示はまた、本開示による抗体分子若しくはそのフラグメント、核酸分子、ベクター及び／又は宿主細胞を含む組成物を提供する。組成物は、任意に薬学的に許容可能な担体、アジュバント又は賦形剤を含む医薬組成物であるのが好ましい。
【0025】
更に別の態様では、本開示はまた、疾患又は障害の検出又は診断のための作用物質の製造における抗体分子若しくはそのフラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞及び／又は組成物の使用を提供する。
【0026】
したがって、本開示は、疾患又は障害を検出又は診断する方法であって、抗体分子若しくはそのフラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞及び／又は組成物を被験体に由来する試料と接触させることを含む、方法を更に提供する。被験体は、哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである。
【0027】
更なる態様では、本開示はまた、抗体薬物コンジュゲートの調製における抗体分子又はそのフラグメントの使用を提供する。
【0028】
したがって、本開示は、本開示による抗体分子又はそのフラグメントを細胞毒性部分にコンジュゲートすることによって形成される抗体薬物コンジュゲートを提供する。
【0029】
好ましくは、細胞毒性部分は、チューブリン阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡ結合剤である。より好ましくは、チューブリン阻害剤は、メイタンシノイド、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ)、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルドラスタチン１０、ツブリシン及びその誘導体、クリプトフィシン及びその誘導体、並びにタルトブリンからなる群から選択される。好ましくは、トポイソメラーゼ阻害剤は、ドキソルビシンの代謝産物であるＰＮＵ－１５９６８２及びその誘導体、並びにイリノテカン（ＣＰＴ－１１）の代謝産物であるＳＮ３８及びその誘導体からなる群から選択される。好ましくは、ＤＮＡ結合剤は、ＰＢＤ及びその誘導体、並びにデュオカルマイシン及びその誘導体からなる群から選択される。
【0030】
更なる態様では、本開示はまた、疾患又は障害の予防又は治療のための薬剤の製造における抗体分子若しくはそのフラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、組成物及び／又は抗体薬物コンジュゲートの使用を提供する。
【0031】
別の態様では、本開示はまた、疾患又は障害を予防又は治療する方法であって、本開示による抗体分子若しくはそのフラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、組成物及び／又は抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法を提供する。被験体は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【0032】
したがって、更なる態様では、本開示は、本開示による抗体分子若しくはそのフラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、組成物及び／又は抗体薬物コンジュゲートを含むキットを提供する。キットは、疾患又は障害の治療、検出又は診断等の治療、検出又は診断を目的として使用することができる。
【0033】
本開示によって提供される様々な実施の形態によると、抗体分子若しくはそのフラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、組成物及び／又は抗体薬物コンジュゲートは、Ｎｅｃｔｉｎ－４の高発現に関連する疾患又は障害の予防、治療、検出又は診断に使用することができる。好ましくは、疾患又は障害は、Ｎｅｃｔｉｎ－４が高度に発現している腫瘍又は癌、特に固形腫瘍である。例えば、疾患又は障害は、膀胱癌、膵癌、乳癌（トリプルネガティブサブタイプ及び基底サブタイプを含む）、非小細胞肺癌、胃癌、食道癌、卵巣癌等、特に膀胱癌、乳癌、卵巣癌又は肺癌である。
【0034】
従来技術と比較して、本開示においては、Ｎｅｃｔｉｎ－４に特異的に結合する高親和性抗体がハイブリドーマスクリーニング及びヒト化によって得られ、完全ヒト抗体配列がヒト化工学によって得られる。さらに、提供される分子の物理化学的特性及び細胞学的活性に関する研究から、臨床的に有効なリード薬物分子の配列が得られることが確認される。
【0035】
本開示の実施形態を、添付の図面を参照して以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1A】フローサイトメトリーによる抗原発現細胞株の特定結果を示す図である。パネル１Ａ：ＨＴ－１３７６膀胱癌細胞
【図1B】フローサイトメトリーによる抗原発現細胞株の特定結果を示す図である。パネル１Ｂ：ＣＨＯ－ｈｕＮｅｃｔｉｎ４ Ｓ８細胞。
【図2A】ＦＡＣＳアッセイによるハイブリドーマ細胞培養上清の結合活性の検出結果を示す図である。パネル２Ａ：１回目のスクリーニング
【図2B】ＦＡＣＳアッセイによるハイブリドーマ細胞培養上清の結合活性の検出結果を示す図である。パネル２Ｂ：２回目のスクリーニング
【図2C】ＦＡＣＳアッセイによるハイブリドーマ細胞培養上清の結合活性の検出結果を示す図である。
【図3A】ＦＡＣＳアッセイによるＢＴ４７４細胞への抗体の結合の実験結果を示す図である。
【図3B】ＦＡＣＳアッセイによるＢＴ４７４細胞への抗体の結合の実験結果を示す図である。
【図3C】ＦＡＣＳアッセイによるＢＴ４７４細胞への抗体の結合の実験結果を示す図である。
【図3D】ＦＡＣＳアッセイによるＢＴ４７４細胞への抗体の結合の実験結果を示す図である。
【図4A】ＢＴ４７４細胞における抗体のエンドサイトーシス活性の実験結果を示す図である。
【図4B】ＢＴ４７４細胞における抗体のエンドサイトーシス活性の実験結果を示す図である。
【図4C】ＢＴ４７４細胞における抗体のエンドサイトーシス活性の実験結果を示す図である。
【図4D】ＢＴ４７４細胞における抗体のエンドサイトーシス活性の実験結果を示す図である。
【図5A】ＦＡＣＳアッセイによるｈｕＮｅｃｔｉｎ４、ｍｕＮｅｃｔｉｎ４及びｃｙｎｏＮｅｃｔｉｎ４を発現する細胞への抗体の結合の実験結果を示す図である。
【図5B】ＦＡＣＳアッセイによるｈｕＮｅｃｔｉｎ４、ｍｕＮｅｃｔｉｎ４及びｃｙｎｏＮｅｃｔｉｎ４を発現する細胞への抗体の結合の実験結果を示す図である。
【図5C】ＦＡＣＳアッセイによるｈｕＮｅｃｔｉｎ４、ｍｕＮｅｃｔｉｎ４及びｃｙｎｏＮｅｃｔｉｎ４を発現する細胞への抗体の結合の実験結果を示す図である。
【図6A】ネクチンファミリーのメンバーへの抗体の結合の実験結果を示す図である。パネル６Ａ：Ｎｅｃｔｉｎ－１
【図6B】ネクチンファミリーのメンバーへの抗体の結合の実験結果を示す図である。パネル６Ｂ：Ｎｅｃｔｉｎ－２
【図6C】ネクチンファミリーのメンバーへの抗体の結合の実験結果を示す図である。パネル６Ｃ：Ｎｅｃｔｉｎ－３
【図6D】ネクチンファミリーのメンバーへの抗体の結合の実験結果を示す図である。パネル６Ｄ：Ｎｅｃｔｉｎ－４
【図7A】カニクイザル血清中の抗体の安定性の実験結果を示す図である。パネル７Ａ：対照抗体エンホルツマブ
【図7B】カニクイザル血清中の抗体の安定性の実験結果を示す図である。パネル７Ｂ：４２Ｄ２０ ｈｚ１０。
【図8A】マウスにおける抗体のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態を示す図である。パネル８Ａ：対照抗体エンホルツマブ
【図8B】マウスにおける抗体のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態を示す図である。パネル８Ｂ：４２Ｄ２０ ｈｚ１０
【発明を実施するための形態】
【0037】
以下に本開示を、具体例を参照して説明する。これらの実施例は本開示の単なる例示に過ぎず、本開示の範囲を何ら限定するものではないことが当業者には理解されよう。
【0038】
以下の実施例における実験手順は、特に明示がない限り、全て慣用のものである。以下の実施例で用いた原材料及び試薬は、特に明示がない限り、いずれも市販品である。
【0039】
対照抗体エンホルツマブの重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１及び配列番号２に示される。
【0040】
本開示によって提供される抗体の配列は、別表Ｉ～ＩＶに示される。
【0041】
抗原、すなわち組み換えＮＥＣＴＩＮ４タンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿００２１７８．２、３２ａａ～３４９ａａ）は、配列番号３に示される。
【実施例】
【0042】
実施例１ 対照抗体の合成及び発現
エンホルツマブの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする完全合成遺伝子を、真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１のヒトκ軽鎖定常領域及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする遺伝子の上流にそれぞれクローニングし、エンホルツマブの軽鎖発現ベクター及び重鎖発現ベクターを得た。この２つのベクターを増殖のために大腸菌（Escherichia coli）に移植し、エンホルツマブの抗体軽鎖（配列番号２）遺伝子及び重鎖（配列番号１）遺伝子を有する大量のベクターを分離によって得た。ＨＥＫ２９３細胞に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と混合した２つのベクターを同時にトランスフェクトし、細胞トランスフェクションの５日後から６日後に培養上清を回収した。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて発現上清を精製することで抗体エンホルツマブを得た。
エンホルツマブの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする完全合成遺伝子を、真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１のヒトκ軽鎖定常領域及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする遺伝子の上流にそれぞれクローニングし、エンホルツマブの軽鎖発現ベクター及び重鎖発現ベクターを得た。この２つのベクターを増殖のために大腸菌（Escherichia coli）に移植し、エンホルツマブの抗体軽鎖（配列番号２）遺伝子及び重鎖（配列番号１）遺伝子を有する大量のベクターを分離によって得た。ＨＥＫ２９３細胞に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と混合した２つのベクターを同時にトランスフェクトし、細胞トランスフェクションの５日後から６日後に培養上清を回収した。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて発現上清を精製することで抗体エンホルツマブを得た。
【0043】
実施例２ 抗原Ｎｅｃｔｉｎ－４を発現する細胞株の調製
Ｎｅｃｔｉｎ－４遺伝子のリーディングフレームを、Ｎｅｃｔｉｎ－４ ｃＤＮＡを含むベクター（Sino Biological, Inc.、カタログ番号：ＨＧ１９７７１－ＵＴ）からＰＣＲによってクローニングし、酵素消化によってスクリーニング用のグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子を含む安定発現ベクターにクローニングした。懸濁培養したＣＨＯ－Ｋ１細胞をエレクトロトランスフェクトし（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ、Lonza）、トランスフェクトした細胞を、５０μＭ ＭＳＸ（Sigma、カタログ番号：Ｍ５３７９）を含むＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ（商標）培地（Gibco、カタログ番号：１２４９０－０２５）に移し、９６ウェル細胞培養プレートに接種した。３７℃、５％ＣＯ２で２週間～３週間置いた後、ＭＳＸ圧スクリーニングによるプレスクリーニングによって細胞を含む９ウェルを得て、細胞を２４ウェル細胞培養プレートにおいて増殖させ、最後に抗原の高発現を有するクローンＳ８をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析によって選択した。クローンのスケールアップ培養を行い、細胞を凍結保存した。
Ｎｅｃｔｉｎ－４遺伝子のリーディングフレームを、Ｎｅｃｔｉｎ－４ ｃＤＮＡを含むベクター（Sino Biological, Inc.、カタログ番号：ＨＧ１９７７１－ＵＴ）からＰＣＲによってクローニングし、酵素消化によってスクリーニング用のグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子を含む安定発現ベクターにクローニングした。懸濁培養したＣＨＯ－Ｋ１細胞をエレクトロトランスフェクトし（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ、Lonza）、トランスフェクトした細胞を、５０μＭ ＭＳＸ（Sigma、カタログ番号：Ｍ５３７９）を含むＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ（商標）培地（Gibco、カタログ番号：１２４９０－０２５）に移し、９６ウェル細胞培養プレートに接種した。３７℃、５％ＣＯ２で２週間～３週間置いた後、ＭＳＸ圧スクリーニングによるプレスクリーニングによって細胞を含む９ウェルを得て、細胞を２４ウェル細胞培養プレートにおいて増殖させ、最後に抗原の高発現を有するクローンＳ８をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析によって選択した。クローンのスケールアップ培養を行い、細胞を凍結保存した。
【0044】
高発現クローンＳ８をＣＨＯ－ｈｕＮｅｃｔｉｎ４ Ｓ８と命名した。Ｎｅｃｔｉｎ－４を内因性発現するＨＴ－１３７６膀胱癌細胞と比較した細胞の特定結果を図１に示す。
【0045】
実施例３ ハイブリドーマ細胞のスクリーニング及び特定
１． マウスの免疫化
１０匹の８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを２つの群に分け、改変ＣＨＯ－ｈｕＮｅｃｔｉｎ４ Ｓ８細胞株を免疫剤として用いる従来の免疫化手順及び組み換えヒトＮｅｃｔｉｎ４タンパク質（Novoprotein Scientific. Incから購入、カタログ番号：ＣＪ１９）を免疫剤として用いる急速免疫化手順によってそれぞれ免疫化した。
１． マウスの免疫化
１０匹の８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを２つの群に分け、改変ＣＨＯ－ｈｕＮｅｃｔｉｎ４ Ｓ８細胞株を免疫剤として用いる従来の免疫化手順及び組み換えヒトＮｅｃｔｉｎ４タンパク質（Novoprotein Scientific. Incから購入、カタログ番号：ＣＪ１９）を免疫剤として用いる急速免疫化手順によってそれぞれ免疫化した。
【0046】
免疫化前にマウスから採取した血液を陰性対照として使用した。２つの免疫剤を腹腔内注射し、２週間の間隔を空けて２回目及び３回目の免疫化を行った。３回目の免疫化の１週間後に血液を採取し、血清の力価を試験した。高力価のマウスを選択し、融合の３日前に最終ブーストを行った。
【0047】
２． 融合及びスクリーニング
ＳＰ２０骨髄腫細胞を回収し、或る特定の大きさまで増殖させた。融合の１日前に細胞に新鮮培地を供給し、融合に良好な細胞の成長状態を確実にした。融合当日に骨髄腫細胞を回収し、遠心分離し、基礎培地に懸濁し、計数して使用した。
ＳＰ２０骨髄腫細胞を回収し、或る特定の大きさまで増殖させた。融合の１日前に細胞に新鮮培地を供給し、融合に良好な細胞の成長状態を確実にした。融合当日に骨髄腫細胞を回収し、遠心分離し、基礎培地に懸濁し、計数して使用した。
【0048】
マウスの脾臓及びリンパ節をそれぞれ無菌的に摘出し、粉砕して細胞懸濁液を調製した後、細胞フィルターに通して濾過した。赤血球溶解を行い、得られた懸濁液をプールし、その中の細胞を計数した。Ｂ細胞及びＳＰ２０骨髄腫細胞を１：２の比率で混合し、混合した細胞を遠心分離し、電気融合バッファーで２回洗浄し、再懸濁して、約１×１０７個／ｍｌ～２×１０７個／ｍｌに調整された細胞密度を得た。細胞懸濁液を融合のために電気ショックカップに入れ、完全培養培地に添加し、３７℃、８％ＣＯ２のインキュベーターに３０分間～２４０分間入れて回復させた。その後、細胞をＨＡＴ培養培地に添加し、３８４ウェルプレートに入れて培養した。５日目に細胞にＨＡＴ培養培地を補充し、７日目にＨＡＴ培養培地をＨＴ培養培地に交換した。８日目～１０日目に、陽性ハイブリドーマのスクリーニングを以下のように行った。
【0049】
ハイブリドーマ細胞の培養上清を採取し、ＦＡＣＳアッセイによって分析し、細胞が細胞表面上にヒトＮｅｃｔｉｎ４抗原を安定発現したＣＨＯ－ｈｕＮｅｃｔｉｎ４ Ｓ８細胞に結合することができ、ブランクＣＨＯＫ１細胞に結合することができない陽性ウェルをスクリーニングした。スクリーニングされた陽性ウェル内の単一細胞を限界希釈によって得て、連続した２回のサブクローニング後に得られた細胞が１００％陽性であることが検出された時点でサブクローニング操作を終了した。得られたハイブリドーマ細胞クローンの各々が抗体を１つのみ分泌した。
【0050】
ＦＡＣＳアッセイによるハイブリドーマ細胞培養上清の結合活性の検出結果を図２及び表１～表３に示す。
【0051】
【表1】
【0052】
【表2】
【0053】
【表3】
【0054】
得られたマウスモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株のＩＤにちなんで命名した。
【0055】
実施例４ マウスモノクローナル抗体の可変領域配列の特定
抗ヒトＮｅｃｔｉｎ－４抗体を分泌するモノクローナルハイブリドーマ細胞を増殖培養に供し、キットに付属する説明書に記載の工程に従ってＲＮＡｆａｓｔ２００キット（Shanghai Flytech Biotechnology Co., Ltd.）を用いて細胞の全ＲＮＡを抽出し、得られたハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡを、５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴマスターミックス（Takara）を用いてｃＤＮＡに逆転写させ、抗体軽鎖可変領域ＩｇＶＬ（κ）及び重鎖可変領域ＶＨの配列を、縮重プライマー（Anke Krebber., 1997）及びＥｘｔａｑ ＰＣＲ試薬（Takara）を用いて増幅した。ＰＣＲ増幅産物を、ＰＣＲクリーンアップゲル抽出キット（Macherey-Nagel GmbH & Co.）を用いて精製し、キットに付属の説明書に従ってｐＣｌｏｎｅ００７シンプルベクターキット（Tsingke Biotechnology Co., Ltd.）を用いてＴ－ベクターに連結させ、コンピテント大腸菌細胞に形質転換した。モノクローナル抗体の可変領域配列は、株増幅及びプラスミド抽出後のＤＮＡシーケンシングにより得た。
抗ヒトＮｅｃｔｉｎ－４抗体を分泌するモノクローナルハイブリドーマ細胞を増殖培養に供し、キットに付属する説明書に記載の工程に従ってＲＮＡｆａｓｔ２００キット（Shanghai Flytech Biotechnology Co., Ltd.）を用いて細胞の全ＲＮＡを抽出し、得られたハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡを、５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴマスターミックス（Takara）を用いてｃＤＮＡに逆転写させ、抗体軽鎖可変領域ＩｇＶＬ（κ）及び重鎖可変領域ＶＨの配列を、縮重プライマー（Anke Krebber., 1997）及びＥｘｔａｑ ＰＣＲ試薬（Takara）を用いて増幅した。ＰＣＲ増幅産物を、ＰＣＲクリーンアップゲル抽出キット（Macherey-Nagel GmbH & Co.）を用いて精製し、キットに付属の説明書に従ってｐＣｌｏｎｅ００７シンプルベクターキット（Tsingke Biotechnology Co., Ltd.）を用いてＴ－ベクターに連結させ、コンピテント大腸菌細胞に形質転換した。モノクローナル抗体の可変領域配列は、株増幅及びプラスミド抽出後のＤＮＡシーケンシングにより得た。
【0056】
実施例５ キメラ抗体の調製
各マウス抗ヒトＮｅｃｔｉｎ－４モノクローナル抗体の重鎖可変領域配列と、公開されたヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１サブクラスの重鎖定常領域配列（配列番号４）とを共にスプライシングして、哺乳動物細胞発現ベクターへと構築し、また、各マウス抗ヒトＮｅｃｔｉｎ－４モノクローナル抗体の軽鎖可変領域配列と、公開されたヒトモノクローナル抗体カッパサブクラスの軽鎖定常領域配列（配列番号５）とを共にスプライシングして、哺乳動物細胞発現ベクターへと構築した。構築された抗ヒトＮｅｃｔｉｎ－４キメラ抗体の重鎖ベクターと軽鎖ベクターとをペアで混合し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてＨＥＫ２９３細胞にベクターをトランスフェクトした。約７日後に細胞上清を回収し、抗ヒトＮｅｃｔｉｎ－４キメラ抗体タンパク質をＭａｂＳｅｌｅｃｔによって得た。
各マウス抗ヒトＮｅｃｔｉｎ－４モノクローナル抗体の重鎖可変領域配列と、公開されたヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１サブクラスの重鎖定常領域配列（配列番号４）とを共にスプライシングして、哺乳動物細胞発現ベクターへと構築し、また、各マウス抗ヒトＮｅｃｔｉｎ－４モノクローナル抗体の軽鎖可変領域配列と、公開されたヒトモノクローナル抗体カッパサブクラスの軽鎖定常領域配列（配列番号５）とを共にスプライシングして、哺乳動物細胞発現ベクターへと構築した。構築された抗ヒトＮｅｃｔｉｎ－４キメラ抗体の重鎖ベクターと軽鎖ベクターとをペアで混合し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてＨＥＫ２９３細胞にベクターをトランスフェクトした。約７日後に細胞上清を回収し、抗ヒトＮｅｃｔｉｎ－４キメラ抗体タンパク質をＭａｂＳｅｌｅｃｔによって得た。
【0057】
得られたキメラ抗体を、フォーマット「マウス抗体略語－ｘｉＩｇＧ」に従って命名した。
【0058】
実施例６ マウス抗体のヒト化及びヒト化抗体の調製
抗体コードスキームの包括的な分析に基づいて、各マウス抗体の重鎖及び軽鎖の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列領域、並びに保存された三次元立体構造を支持するフレームワーク領域を決定した。続いて、主にＩＧＨＶ１ ｜ ＩＧＨＪ４＊０１等のマウス抗体に類似するヒト抗体の重鎖可変領域配列を、既知のヒト抗体配列について検索した後、配列中のフレームワーク領域配列を鋳型として選択し、マウス抗体の重鎖ＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域と合わせ、最終的にヒト化重鎖可変領域配列を生成した。同様にして、ヒト化軽鎖可変領域配列を生成した。
抗体コードスキームの包括的な分析に基づいて、各マウス抗体の重鎖及び軽鎖の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列領域、並びに保存された三次元立体構造を支持するフレームワーク領域を決定した。続いて、主にＩＧＨＶ１ ｜ ＩＧＨＪ４＊０１等のマウス抗体に類似するヒト抗体の重鎖可変領域配列を、既知のヒト抗体配列について検索した後、配列中のフレームワーク領域配列を鋳型として選択し、マウス抗体の重鎖ＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域と合わせ、最終的にヒト化重鎖可変領域配列を生成した。同様にして、ヒト化軽鎖可変領域配列を生成した。
【0059】
マウスＣＤＲをヒトフレームワーク領域に直接移植した抗体は、しばしば結合活性の劇的な低下を示すため、フレームワーク領域内の個々のアミノ酸をヒトからマウスに戻す変換を必要とする。どの位置を元のマウス残基に戻す必要があるかを決定するため、設計したヒト化抗体配列と元のマウス抗体配列とを比較して、アミノ酸の違いを確認し、それらの異なるアミノ酸が抗体構造を支持する、又は抗原に結合するために重要であるかを確認する必要がある。ヒト化設計によって得られた配列を、Ｎ（アスパラギン）グリコシル化部位、Ｎ－脱アミド化部位、Ｄ（アスパラギン酸）異性化部位等の潜在的な翻訳後修飾部位について確認する必要がある。
【0060】
ヒト化重鎖及び軽鎖可変領域を組み合わせ、キメラ抗体の調製のための実施例５に記載の手順を参照することによってヒト化抗体を得た。ヒト化抗体を、マウス抗体のＶＨ及びＶＬの改変ヒト化配列の番号（ＶＨ＿ｈｚ及びＶＬ＿ｈｚ）がそれぞれｍ及びｎであるフォーマット「マウス抗体略語－ｈｚｍｎ」に従って命名した。
【0061】
実施例７ 抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製
抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中にて２．０当量～２．６当量のＴＥＣＰで２時間還元し、ｖｃＭＭＡＥを含有するＤＭＡの溶液をＴＥＣＰ還元抗体の溶液に（ｖｃＭＭＡＥと抗体とのモル比６：１で）添加した。２℃～８℃で１時間撹拌した後、ＤＭＡ及び小分子残渣を限外濾過によって除去した。紫外分光光度計を用いてコンジュゲートの２４８ｎｍ～２８０ｎｍでの吸光度を測定し、コンジュゲートの濃度を算出した。得られたコンジュゲートを－８０℃で保存のために凍結管に小分けし（subpackaged）、コンジュゲートのＤＡＲ値（４．０±１）をＨＰＬＣ－ＨＩＣによって決定した。
抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中にて２．０当量～２．６当量のＴＥＣＰで２時間還元し、ｖｃＭＭＡＥを含有するＤＭＡの溶液をＴＥＣＰ還元抗体の溶液に（ｖｃＭＭＡＥと抗体とのモル比６：１で）添加した。２℃～８℃で１時間撹拌した後、ＤＭＡ及び小分子残渣を限外濾過によって除去した。紫外分光光度計を用いてコンジュゲートの２４８ｎｍ～２８０ｎｍでの吸光度を測定し、コンジュゲートの濃度を算出した。得られたコンジュゲートを－８０℃で保存のために凍結管に小分けし（subpackaged）、コンジュゲートのＤＡＲ値（４．０±１）をＨＰＬＣ－ＨＩＣによって決定した。
【0062】
ＡＤＣは、対応する抗体の名称に接尾語「Ｅ」を付けたものとして命名した。
【0063】
実施例８ ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞結合アッセイ
抗ヒトＮｅｃｔｉｎ－４対照抗体エンホルツマブ及び本開示の抗体又はＡＤＣを初期濃度１００ｎＭから勾配で２倍に希釈し、全部で１６濃度の各抗体又はＡＤＣの溶液を得た。異なる濃度の溶液を３８４ウェルプレートに１ウェル当たり１０μｌ添加した。
抗ヒトＮｅｃｔｉｎ－４対照抗体エンホルツマブ及び本開示の抗体又はＡＤＣを初期濃度１００ｎＭから勾配で２倍に希釈し、全部で１６濃度の各抗体又はＡＤＣの溶液を得た。異なる濃度の溶液を３８４ウェルプレートに１ウェル当たり１０μｌ添加した。
【0064】
細胞表面にＮｅｃｔｉｎ－４を発現しているＢＴ４７４細胞（乳癌細胞）を室温にて１００ｇで５分間遠心分離により回収した後、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を１回洗浄し、室温にて１００ｇで５分間遠心分離した。細胞を約２×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁し、抗体又はＡＤＣが添加された３８４ウェルプレートの各ウェルに１０μｌを加えた。４℃で１時間インキュベートした後、蛍光標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を加えた。４℃で１時間のインキュベーションを継続した後、細胞集団の平均蛍光読み取り値をフローサイトメーターで分析した。
【0065】
ＦＡＣＳアッセイによるＢＴ４７４細胞への本開示のマウス抗体分子の結合の実験結果を図３のパネル３Ａ並びに表４及び表５に示す。
【0066】
【表4】
【0067】
【表5】
【0068】
ＦＡＣＳアッセイによるＢＴ４７４細胞への本開示の改変ヒト化分子の結合の実験結果を図３のパネル３Ｂ及びパネル３Ｃ並びに表６及び表７に示す。
【0069】
【表6】
【0070】
【表7】
【0071】
ＦＡＣＳアッセイによるＢＴ４７４細胞への本開示のＡＤＣの結合の実験結果を図３のパネル３Ｄ及び表８に示す。
【0072】
【表8】
【0073】
実施例９ 抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞診断アッセイ
９．１ ＢＴ４７４細胞におけるエンドサイトーシスアッセイ
１． ＢＴ４７４細胞を１２００ｒｐｍで８分間遠心分離して回収し、ＤＰＢＳ（Gibco、カタログ番号：１４１９０－１３６）で２回洗浄した。
２． １ウェル当たり１Ｅ５の細胞を播種し、各抗体又はＡＤＣを初期濃度１０μｇ／ｍｌから勾配で２倍に希釈し、全部で７濃度の各抗体又はＡＤＣの溶液を得て、最後の１濃度は実際にブランクウェルとして使用した。抗体及びＡＤＣの溶液を細胞に添加し、得られた混合物を氷上で１時間インキュベートした。
３． 細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで８分間遠心分離した。次に、Ｌ－グルタミン及びＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ １６４０培地に細胞を再懸濁し、等量の３つの部分に分け、そのうち１つは３７℃で異なる時間インキュベートし、１つは常に氷上に維持してエンドサイトーシスなしの０時点対照として使用し、１つは抗体又はＡＤＣを添加せず、ＮＣ対照として使用した。
４． 細胞をクエン酸（ｐＨ２．７）で３．５分間洗浄し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ９．５）で中和し、ＰＢＳで２回洗浄し、適量の１％ＢＳＡ－ＰＢＳに再懸濁した後、ＩＱｐｌｕｓ機器で検出した。
５． ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析及び処理した。
９．１ ＢＴ４７４細胞におけるエンドサイトーシスアッセイ
１． ＢＴ４７４細胞を１２００ｒｐｍで８分間遠心分離して回収し、ＤＰＢＳ（Gibco、カタログ番号：１４１９０－１３６）で２回洗浄した。
２． １ウェル当たり１Ｅ５の細胞を播種し、各抗体又はＡＤＣを初期濃度１０μｇ／ｍｌから勾配で２倍に希釈し、全部で７濃度の各抗体又はＡＤＣの溶液を得て、最後の１濃度は実際にブランクウェルとして使用した。抗体及びＡＤＣの溶液を細胞に添加し、得られた混合物を氷上で１時間インキュベートした。
３． 細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで８分間遠心分離した。次に、Ｌ－グルタミン及びＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ １６４０培地に細胞を再懸濁し、等量の３つの部分に分け、そのうち１つは３７℃で異なる時間インキュベートし、１つは常に氷上に維持してエンドサイトーシスなしの０時点対照として使用し、１つは抗体又はＡＤＣを添加せず、ＮＣ対照として使用した。
４． 細胞をクエン酸（ｐＨ２．７）で３．５分間洗浄し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ９．５）で中和し、ＰＢＳで２回洗浄し、適量の１％ＢＳＡ－ＰＢＳに再懸濁した後、ＩＱｐｌｕｓ機器で検出した。
５． ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析及び処理した。
【0074】
ＢＴ４７４細胞における本開示のマウス抗体分子のエンドサイトーシス活性の実験結果を図４のパネル４Ａ及び表９に示す。
【0075】
【表9】
【0076】
ＢＴ４７４細胞における本開示の改変ヒト化分子のエンドサイトーシス活性の実験結果を図４のパネル４Ｂ及びパネル４Ｃ並びに表１０及び表１１に示す。
【0077】
【表10】
【0078】
【表11】
【0079】
ＢＴ４７４細胞における本開示のＡＤＣのエンドサイトーシス活性の実験結果を図４のパネル４Ｄ及び表１２に示す。
【0080】
【表12】
【0081】
９．２ ＢＴ４７４細胞における増殖阻害アッセイ
Ｎｅｃｔｉｎ４を発現する乳癌ＢＴ４７４細胞を培養し、トリプシン処理によって採取し、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。次いで、細胞を１ウェル当たり４０００細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。１％ＢＳＡを含有する培地に試験対象の抗体又はＡＤＣを溶解し、それぞれ初期濃度２００μｇ／ｍｌから勾配で３倍に希釈し、ゼロ濃度を含む全部で９濃度の各抗体又はＡＤＣの溶液を得た。抗体又はＡＤＣの希釈溶液を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μｌ添加した後、抗体又はＡＤＣの溶液を含む各ウェルに１００μｌの細胞培養物を添加し、混合し、３７℃、５％ＣＯ２で１２０時間インキュベートした。１％ＢＳＡを含有する培地を用いて５μＭ濃度のＣＣＫ－８を調製し、２０μｌのＣＣＫ－８溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した後、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。最後に、プレートを室温で１５分間置いた後、十分に混合した。検出波長として４５０ｎｍを用いてプレートを読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを用い、裸抗体又はＡＤＣの作用濃度（ｎｇ／ｍｌ）をＸ軸にプロットし、測定された吸光度値をＹ軸にプロットして４パラメータフィッティングを行い、裸抗体及びＡＤＣのＥＣ５０値を得た。
Ｎｅｃｔｉｎ４を発現する乳癌ＢＴ４７４細胞を培養し、トリプシン処理によって採取し、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。次いで、細胞を１ウェル当たり４０００細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。１％ＢＳＡを含有する培地に試験対象の抗体又はＡＤＣを溶解し、それぞれ初期濃度２００μｇ／ｍｌから勾配で３倍に希釈し、ゼロ濃度を含む全部で９濃度の各抗体又はＡＤＣの溶液を得た。抗体又はＡＤＣの希釈溶液を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μｌ添加した後、抗体又はＡＤＣの溶液を含む各ウェルに１００μｌの細胞培養物を添加し、混合し、３７℃、５％ＣＯ２で１２０時間インキュベートした。１％ＢＳＡを含有する培地を用いて５μＭ濃度のＣＣＫ－８を調製し、２０μｌのＣＣＫ－８溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した後、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。最後に、プレートを室温で１５分間置いた後、十分に混合した。検出波長として４５０ｎｍを用いてプレートを読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを用い、裸抗体又はＡＤＣの作用濃度（ｎｇ／ｍｌ）をＸ軸にプロットし、測定された吸光度値をＹ軸にプロットして４パラメータフィッティングを行い、裸抗体及びＡＤＣのＥＣ５０値を得た。
【0082】
結果を表１３、表１４及び表１５に示す。
【0083】
【表13】
【0084】
【表14】
【0085】
【表15】
【0086】
実施例１０ 抗原に対する抗体の交差結合活性の分析－Ｆａｃｓ
細胞：
ＣＨＯ－ｈｕＮｅｃｔｉｎ４ Ｓ８；
マウスＮｅｃｔｉｎ４（ＮＰ＿０８２１６９）を発現するＨＥＫ２９３細胞：ＨＥＫ－ｍｕＮｅｃｔｉｎ４；及び、
Ｃｙｎｏ Ｎｅｃｔｉｎ４（配列番号６）を発現するＨＥＫ２９３細胞：ＨＥＫ－ｃｙｎｏＮｅｃｔｉｎ４。
細胞：
ＣＨＯ－ｈｕＮｅｃｔｉｎ４ Ｓ８；
マウスＮｅｃｔｉｎ４（ＮＰ＿０８２１６９）を発現するＨＥＫ２９３細胞：ＨＥＫ－ｍｕＮｅｃｔｉｎ４；及び、
Ｃｙｎｏ Ｎｅｃｔｉｎ４（配列番号６）を発現するＨＥＫ２９３細胞：ＨＥＫ－ｃｙｎｏＮｅｃｔｉｎ４。
【0087】
本実験は、実施例８に記載される手順を参照して行った。結果を図５のパネル５Ａ、パネル５Ｂ及びパネル５Ｃ並びに表１６、表１７及び表１８に示す。
【0088】
【表16】
【0089】
【表17】
【0090】
【表18】
【0091】
実施例１１ 抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合親和性及び動態のアッセイ
抗体と抗原との間の相互作用は、GEのＢＩＡｃｏｒｅ機器Ｓ２００を用いて測定した。GE Healthcareのビオチン捕捉キットに提供される説明書を参照して、ＣＡＰセンサーチップ上の分析チャネル及び対照試料チャネルを最初に抗原、すなわちＨｉｓタグ付きヒトＮＥＣＴＩＮ４と結合させ、次いで、抗体を含む試料（それぞれ初期濃度２０ｎＭから３倍に希釈して、全部で８濃度の各抗体の溶液を得て、濃度０．７４１ｎＭを繰り返すように設定した）を分析チャネルと試料チャネルとの両方に流し、抗体－抗原結合時の光反応を測定した。各抗体の会合定数Ｋｏｎ及び解離定数Ｋｏｆｆ及び親和性定数ＫＤを、最終的に機器ソフトウェアフィッティング分析（１：１結合モード）により得た。
抗体と抗原との間の相互作用は、GEのＢＩＡｃｏｒｅ機器Ｓ２００を用いて測定した。GE Healthcareのビオチン捕捉キットに提供される説明書を参照して、ＣＡＰセンサーチップ上の分析チャネル及び対照試料チャネルを最初に抗原、すなわちＨｉｓタグ付きヒトＮＥＣＴＩＮ４と結合させ、次いで、抗体を含む試料（それぞれ初期濃度２０ｎＭから３倍に希釈して、全部で８濃度の各抗体の溶液を得て、濃度０．７４１ｎＭを繰り返すように設定した）を分析チャネルと試料チャネルとの両方に流し、抗体－抗原結合時の光反応を測定した。各抗体の会合定数Ｋｏｎ及び解離定数Ｋｏｆｆ及び親和性定数ＫＤを、最終的に機器ソフトウェアフィッティング分析（１：１結合モード）により得た。
【0092】
結果を表１９に示す。
【0093】
【表19】
【0094】
実施例１２ 同じファミリーに属する抗原タンパク質に対する抗体の交差結合活性の検証
抗原：
ヒトＮｅｃｔｉｎ－１（Ｃ－６Ｈｉｓ）、Novoproteinカタログ番号Ｃ４９２；
ヒトＮｅｃｔｉｎ－２（Ｃ－６Ｈｉｓ）、Novoproteinカタログ番号Ｃ４４０；
ヒトＮｅｃｔｉｎ－３（Ｃ－６Ｈｉｓ）、Novoproteinカタログ番号Ｃ６３０；
ヒトＮｅｃｔｉｎ－４（Ｃ－６Ｈｉｓ）、Novoproteinカタログ番号ＣＪ１９。
抗体（一次抗体）：本開示の抗体。
対照抗体：
ＣＤ１１１／Ｎｅｃｔｉｎ－１／ＰＶＲＬ１抗体、ウサギＦａｂ、８０２４４－ＲＰ０１－１００、Sino biologics；
抗Ｎｅｃｔｉｎ ２抗体（ａｂ２３３０８５）、ウサギ抗体、Abcam；
抗Ｎｅｃｔｉｎ ３抗体（ａｂ１３７９６１）、ウサギ抗体、Abcam。
二次抗体：
ヤギ抗ウサギＩｇＧ－Ｆｃ二次抗体（ＨＲＰ）カタログ番号ＳＳＡ００３、Jackson Immuno。
抗原：
ヒトＮｅｃｔｉｎ－１（Ｃ－６Ｈｉｓ）、Novoproteinカタログ番号Ｃ４９２；
ヒトＮｅｃｔｉｎ－２（Ｃ－６Ｈｉｓ）、Novoproteinカタログ番号Ｃ４４０；
ヒトＮｅｃｔｉｎ－３（Ｃ－６Ｈｉｓ）、Novoproteinカタログ番号Ｃ６３０；
ヒトＮｅｃｔｉｎ－４（Ｃ－６Ｈｉｓ）、Novoproteinカタログ番号ＣＪ１９。
抗体（一次抗体）：本開示の抗体。
対照抗体：
ＣＤ１１１／Ｎｅｃｔｉｎ－１／ＰＶＲＬ１抗体、ウサギＦａｂ、８０２４４－ＲＰ０１－１００、Sino biologics；
抗Ｎｅｃｔｉｎ ２抗体（ａｂ２３３０８５）、ウサギ抗体、Abcam；
抗Ｎｅｃｔｉｎ ３抗体（ａｂ１３７９６１）、ウサギ抗体、Abcam。
二次抗体：
ヤギ抗ウサギＩｇＧ－Ｆｃ二次抗体（ＨＲＰ）カタログ番号ＳＳＡ００３、Jackson Immuno。
【0095】
プレートを１μｇ／ｍｌの抗原でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次に、段階希釈した抗体をプレートに添加した。最後に、ＨＲＰ標識二次抗体を添加し、４５０ｎｍでの吸光度を検出した。結果を図６のパネル６Ａ、パネル６Ｂ、パネル６Ｃ及びパネル６Ｄに示す。
【0096】
この結果から、本開示の抗体が対照抗体と一致する特性を示し、全て抗原Ｎｅｃｔｉｎ－４を特異的に認識し、用量依存的な結合効果を示し、Ｎｅｃｔｉｎ－４と同じファミリーに属する他のタンパク質に対して交差結合活性を有しなかったことが分かる。
【0097】
実施例１３ カニクイザル血清における抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性研究
実験材料：試験対象の抗体、ＦＢＳ、抗体が結合する抗原、抗ｈｕＩｇＧ Ｆａｂモノクローナル抗体（Sigma、Ｉ５２６０－１ＭＬ）及びＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Jackson、コード：１０９－０３５－０９８）。
実験機器：３７℃のインキュベーター及びマイクロプレートリーダー。
実験材料：試験対象の抗体、ＦＢＳ、抗体が結合する抗原、抗ｈｕＩｇＧ Ｆａｂモノクローナル抗体（Sigma、Ｉ５２６０－１ＭＬ）及びＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Jackson、コード：１０９－０３５－０９８）。
実験機器：３７℃のインキュベーター及びマイクロプレートリーダー。
【0098】
実験手順：
試料の調製：
１）試験対象の抗体の溶液を２０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、減菌のために濾過し、２５０μｌ／チューブに小分けして使用した。
２）小分けした抗体溶液に同量のカニクイザル血清を添加し、最終濃度５０％の血清及び最終濃度１０μｇ／ｍｌの抗体を含有する試料を得た。
３）かかる試料を合計７つ調製し、シールフィルムで密閉し、３７℃に置き、プロセス全体を通して試料を滅菌状態に保った。
４）試料をそれぞれ０日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目及び２１日目に採取し、試験のために４℃に置き、２１日目に採取した試料は、少なくとも１日４℃に置いた。
試料の調製：
１）試験対象の抗体の溶液を２０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、減菌のために濾過し、２５０μｌ／チューブに小分けして使用した。
２）小分けした抗体溶液に同量のカニクイザル血清を添加し、最終濃度５０％の血清及び最終濃度１０μｇ／ｍｌの抗体を含有する試料を得た。
３）かかる試料を合計７つ調製し、シールフィルムで密閉し、３７℃に置き、プロセス全体を通して試料を滅菌状態に保った。
４）試料をそれぞれ０日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目及び２１日目に採取し、試験のために４℃に置き、２１日目に採取した試料は、少なくとも１日４℃に置いた。
【0099】
試験方法：
１）２つの９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中の０．２μｇ／ｍｌの抗原及びＰＢＳ中の抗ＩｇＧ Ｆａｂモノクローナル抗体で、それぞれ１ウェル当たり１００μｌにて４℃で一晩コーティングした。
２）以下の必要とされる試薬を調製した：
ブロッキングバッファー ５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ
抗体希釈バッファー ５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ＋５０％ＦＢＳ
ＥＬＩＳＡプレート洗浄バッファー ０．１％Ｔｗｅｅｎ＋ＰＢＳ
３）コーティングした２つのＥＬＩＳＡプレートを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄し、コーティングされていない抗原を洗い流した。
４）１ウェル当たり２００μｌのブロッキングバッファーを添加し、３７℃で１時間プレートをブロッキングした。
５）各試料中の試験対象の抗体を抗体希釈バッファーで２μｇ／ｍｌに希釈し、更に勾配で３倍に希釈し、全部で８濃度の各抗体の溶液を得た。
６）コーティングした２つのＥＬＩＳＡプレート内のブロッキングバッファーを捨て、希釈した抗体溶液をプレートに１ウェル当たり１００μｌ添加した後、３７℃で１時間インキュベートした。
７）プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
８）１：５０００に希釈した二次抗体を、洗浄したＥＬＩＳＡプレートに１ウェル当たり１００μｌ添加した後、ＲＴで４０分間インキュベートした。
９）プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
１０）ＴＭＢ基質を１ウェル当たり１００μｌ添加し、暗所で１０分間発色させた。
１１）５０μｌの２Ｍ ＨＣｌを添加して反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
１）２つの９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中の０．２μｇ／ｍｌの抗原及びＰＢＳ中の抗ＩｇＧ Ｆａｂモノクローナル抗体で、それぞれ１ウェル当たり１００μｌにて４℃で一晩コーティングした。
２）以下の必要とされる試薬を調製した：
ブロッキングバッファー ５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ
抗体希釈バッファー ５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ＋５０％ＦＢＳ
ＥＬＩＳＡプレート洗浄バッファー ０．１％Ｔｗｅｅｎ＋ＰＢＳ
３）コーティングした２つのＥＬＩＳＡプレートを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄し、コーティングされていない抗原を洗い流した。
４）１ウェル当たり２００μｌのブロッキングバッファーを添加し、３７℃で１時間プレートをブロッキングした。
５）各試料中の試験対象の抗体を抗体希釈バッファーで２μｇ／ｍｌに希釈し、更に勾配で３倍に希釈し、全部で８濃度の各抗体の溶液を得た。
６）コーティングした２つのＥＬＩＳＡプレート内のブロッキングバッファーを捨て、希釈した抗体溶液をプレートに１ウェル当たり１００μｌ添加した後、３７℃で１時間インキュベートした。
７）プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
８）１：５０００に希釈した二次抗体を、洗浄したＥＬＩＳＡプレートに１ウェル当たり１００μｌ添加した後、ＲＴで４０分間インキュベートした。
９）プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
１０）ＴＭＢ基質を１ウェル当たり１００μｌ添加し、暗所で１０分間発色させた。
１１）５０μｌの２Ｍ ＨＣｌを添加して反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【0100】
データ処理：
異なる時間にわたって置いた抗体の結合曲線の変化を観察し、抗体の結合活性の安定性を評価するために、ＥＬＩＳＡ値を用いて結合曲線をプロットした。結果を図７のパネル７Ａ及びパネル７Ｂに示す。
異なる時間にわたって置いた抗体の結合曲線の変化を観察し、抗体の結合活性の安定性を評価するために、ＥＬＩＳＡ値を用いて結合曲線をプロットした。結果を図７のパネル７Ａ及びパネル７Ｂに示す。
【0101】
結果から、本開示の抗体を３７℃で２１日間インキュベートした後に有効な抗体含量が変化せず、すなわち、抗体が３７℃で２１日間超にわたって安定に保管され得ることが証明される。
【0102】
実施例１４ マウスにおける抗体の薬物動態の分析
実験材料：試験対象の抗体、異なる時点でマウスから採取した血清、抗体が結合するヒトＮｅｃｔｉｎ－４抗原、抗ｈｕＩｇＧ Ｆａｂモノクローナル抗体（Sigma、Ｉ５２６０－１ＭＬ）及びＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Jackson、コード：１０９－０３５－０９８）。
実験材料：試験対象の抗体、異なる時点でマウスから採取した血清、抗体が結合するヒトＮｅｃｔｉｎ－４抗原、抗ｈｕＩｇＧ Ｆａｂモノクローナル抗体（Sigma、Ｉ５２６０－１ＭＬ）及びＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Jackson、コード：１０９－０３５－０９８）。
【0103】
実験手順：
血清の採取：
１）雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウスを３匹のマウスの群に分け、２００μｇの抗体をそれぞれ尾静脈から又は腹腔内に投与した。
２）実験設計に従って異なる時点で尾静脈から血液を採取し、採取した血液試料を室温で３０分以上置いた後、血清を４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって分離し、－２０℃で保管した。最後の血清試料が凍結保存中に蒸発し得ると仮定して、２０μｌを超える量の最後の血清試料を採取することが望ましい。
３）採取した最後の血清試料は、－２０℃で少なくとも２４時間凍結保存することが望ましい。
血清の採取：
１）雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウスを３匹のマウスの群に分け、２００μｇの抗体をそれぞれ尾静脈から又は腹腔内に投与した。
２）実験設計に従って異なる時点で尾静脈から血液を採取し、採取した血液試料を室温で３０分以上置いた後、血清を４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって分離し、－２０℃で保管した。最後の血清試料が凍結保存中に蒸発し得ると仮定して、２０μｌを超える量の最後の血清試料を採取することが望ましい。
３）採取した最後の血清試料は、－２０℃で少なくとも２４時間凍結保存することが望ましい。
【0104】
試験方法：
１）２つの９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中の０．２μｇ／ｍｌの抗原及びＰＢＳ中の抗ＩｇＧ Ｆａｂモノクローナル抗体で、それぞれ１ウェル当たり１００μｌにて４℃で一晩コーティングした。
２）以下の必要とされる試薬を調製した：
ブロッキングバッファー ５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ
抗体希釈バッファー ５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ＋５０％ブランクマウス血清
ＥＬＩＳＡプレート洗浄バッファー ０．１％Ｔｗｅｅｎ＋ＰＢＳ
３）コーティングした２つのＥＬＩＳＡプレートを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。
４）１ウェル当たり２００μｌのブロッキングバッファーを添加し、３７℃で１時間プレートをブロッキングした。
５）初めに、各血清試料をブロッキングバッファーで適切な濃度に希釈した後、抗体希釈バッファーで希釈して、適切な濃度範囲にわたって段階希釈物を得た。希釈倍率により血清試料の発色に関する最終測定値が標準の測定値の範囲に入ることが可能となるという条件で、濃度の達成に使用した特定の希釈倍率を予備試験における調整によって決定した。
６）抗体標準を抗体希釈バッファーで希釈した。標準の希釈方法は、標準を用いて線形曲線がフィッティングされ得るように（又は適切なソフトウェアが利用可能な場合にＳ字曲線がフィッティングされ得るように）予備試験における調整によっても決定した。
７）コーティングした２つのＥＬＩＳＡプレート内のブロッキングバッファーを捨て、希釈した抗体標準及び試験対象の血清試料をプレートに１ウェル当たり１００μｌ添加した後、３７℃で１時間インキュベートした。
８）プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
９）１：５０００に希釈した二次抗体を、洗浄したＥＬＩＳＡプレートに１ウェル当たり１００μｌ添加した後、３７℃で４０分間インキュベートした。
１０）プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
１１）ＴＭＢ基質を１ウェル当たり１００μｌ添加し、暗所で１０分間発色させた。
１２）５０μｌの２Ｍ ＨＣｌを添加して反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
１）２つの９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中の０．２μｇ／ｍｌの抗原及びＰＢＳ中の抗ＩｇＧ Ｆａｂモノクローナル抗体で、それぞれ１ウェル当たり１００μｌにて４℃で一晩コーティングした。
２）以下の必要とされる試薬を調製した：
ブロッキングバッファー ５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ
抗体希釈バッファー ５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ＋５０％ブランクマウス血清
ＥＬＩＳＡプレート洗浄バッファー ０．１％Ｔｗｅｅｎ＋ＰＢＳ
３）コーティングした２つのＥＬＩＳＡプレートを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。
４）１ウェル当たり２００μｌのブロッキングバッファーを添加し、３７℃で１時間プレートをブロッキングした。
５）初めに、各血清試料をブロッキングバッファーで適切な濃度に希釈した後、抗体希釈バッファーで希釈して、適切な濃度範囲にわたって段階希釈物を得た。希釈倍率により血清試料の発色に関する最終測定値が標準の測定値の範囲に入ることが可能となるという条件で、濃度の達成に使用した特定の希釈倍率を予備試験における調整によって決定した。
６）抗体標準を抗体希釈バッファーで希釈した。標準の希釈方法は、標準を用いて線形曲線がフィッティングされ得るように（又は適切なソフトウェアが利用可能な場合にＳ字曲線がフィッティングされ得るように）予備試験における調整によっても決定した。
７）コーティングした２つのＥＬＩＳＡプレート内のブロッキングバッファーを捨て、希釈した抗体標準及び試験対象の血清試料をプレートに１ウェル当たり１００μｌ添加した後、３７℃で１時間インキュベートした。
８）プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
９）１：５０００に希釈した二次抗体を、洗浄したＥＬＩＳＡプレートに１ウェル当たり１００μｌ添加した後、３７℃で４０分間インキュベートした。
１０）プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
１１）ＴＭＢ基質を１ウェル当たり１００μｌ添加し、暗所で１０分間発色させた。
１２）５０μｌの２Ｍ ＨＣｌを添加して反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【0105】
結果を図８のパネル８Ａ及びパネル８Ｂ並びに表２０に示す。
【0106】
【表20】
【0107】
本開示の実施形態に関する以上の説明は、本開示を限定することを意図するものではなく、当業者は、本開示の趣旨を逸脱しない範囲で本開示に種々の変更及び修正を加えることができ、これは添付の特許請求の範囲に含まれるべきである。
【0108】
【表21】
【0109】
【表22】
【0110】
【表23】
【0111】
【表24】
【0112】
【表25】
【0113】
【表26】
【0114】
【表27】
【0115】
【表28】
【0116】
【表29】
【0117】
【表30】
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【配列表】
【国際調査報告】