特表 2023-522330 ＦＬＴ３陽性悪性腫瘍を処置するためのＦＬＴ３標的化キメラ抗原受容体改変細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-30

(54)【発明の名称】ＦＬＴ３陽性悪性腫瘍を処置するためのＦＬＴ３標的化キメラ抗原受容体改変細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230523BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230523BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230523BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230523BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230523BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20230523BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230523BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230523BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230523BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230523BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230523BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20230523BHJP

   C07K 16/40 20060101ALN20230523BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20230523BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/12

C12N15/867 Z

C12N5/10

C12N5/0783

A61P35/02

A61K31/7088

A61K35/17

A61K48/00

A61P35/00

C07K14/705

C07K16/40

C07K19/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022562727

(86)(22)【出願日】2021-04-16

(85)【翻訳文提出日】2022-12-13

(86)【国際出願番号】 US2021027821

(87)【国際公開番号】W WO2021212069

(87)【国際公開日】2021-10-21

(31)【優先権主張番号】63/011,819

(32)【優先日】2020-04-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】598004424

【氏名又は名称】シティ・オブ・ホープ

【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】カリジューリ， マイケル エー．

(72)【発明者】

【氏名】ユー， ジャンフア

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA01

4C084MA38

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB27

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA05

4C086MA38

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZB27

4C087AA01

4C087AA02

4C087CA12

4C087CA20

4C087MA01

4C087MA38

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）を特異的に認識し、それに結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子が形質導入された自己または同種細胞の集団を含む組成物、そのようなＣＡＲを発現する細胞を製剤化、調製する方法および抗がん剤としての使用方法が提供される。一部の場合では、ＣＡＲを、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後にＴ２Ａリボソームスキップ配列および短縮型ＥＧＦＲ（本明細書ではＥＧＦＲｔもしくはｔＥＧＦＲと称される）または短縮型ＣＤ１９（本明細書ではＣＤ１９ｔもしくはｔＣＤ１９と称される）が続くベクターを使用して産生させることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ７７７のポリヌクレオチドもしくはその等価物または配列番号１２のｎｔ５５～ｎｔ７７７のポリヌクレオチドを含む、抗ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）抗原結合性断片をコードする核酸分子。

【請求項2】

配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７のポリヌクレオチドもしくは配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７と少なくとも８５％同一であるその等価物を含む、または配列番号１２のｎｔ１～ｎｔ７７７のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項3】

配列番号１のポリヌクレオチドもしくは配列番号１と少なくとも８５％同一であるその等価物、または配列番号１２のポリヌクレオチドを含む、抗ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子。

【請求項4】

ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨ（配列番号１５）に示される軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）をコードするポリヌクレオチド、
ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号１６）に示される軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）をコードするポリヌクレオチド、
ＱＱＳＮＴＷＰＹＴ（配列番号１７）に示される軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）をコードするポリヌクレオチド、
ＳＹＷＭＨ（配列番号１８）に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）をコードするポリヌクレオチド、
ＥＩＤＰＳＤＳＹＫＤＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号１９）に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ２）をコードするポリヌクレオチド、
ＡＩＴＴＴＰＦＤＦ（配列番号２０）に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ３）をコードするポリヌクレオチド
を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項5】

【化45】

【化46】

の抗体重鎖可変領域および

【化47】

の抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項6】

シグナルペプチド、ペプチドスペーサー、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１または２に記載の核酸分子。

【請求項7】

ＣＤ２８共刺激ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３から６までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項8】

ＣＤ２８膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３から７までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項9】

シグナルペプチド、ペプチドスペーサー、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項10】

前記等価物が、配列番号２のアミノ酸（ａａ）１９～ａａ２５９のポリペプチドをコードする、請求項１から９までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項11】

前記核酸分子または前記等価物が、配列番号２のａａ１～ａａ２５９のポリペプチドをコードする、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項12】

前記核酸分子または前記等価物が、配列番号２のポリペプチドをコードする、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項13】

短縮型ＣＤ１９または短縮型ＥＧＦＲをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項14】

前記短縮型ＥＧＦＲが、配列番号１０のポリペプチドを含み、前記短縮型ＣＤ１９が、配列番号１３または１１のポリペプチドを含む、請求項１３に記載の核酸分子。

【請求項15】

配列番号２８のポリヌクレオチドまたは短縮型ＣＤ１９をコードするその等価物をさらに含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項16】

前記ＣＡＲをコードする前記ポリヌクレオチドと前記短縮型ＣＤ１９または前記短縮型ＥＧＦＲをコードする前記ポリヌクレオチドの間に位置するリボソームスキップ配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項17】

Ｔ２Ａスキップ配列、および前記短縮型ＥＧＦＲまたは前記短縮型ＣＤ１９をコードする配列をさらに含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項18】

Ｔ２Ａスキップ配列、および短縮型ＥＧＦＲをコードする配列をさらに含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項19】

Ｔ２Ａスキップ配列、および短縮型ＣＤ１９をコードする配列をさらに含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項20】

請求項１から１９までのいずれか一項に記載の核酸分子またはそれと相補的な核酸分子を含むベクターであって、ウイルスベクターまたは発現ベクターであり、必要に応じてレンチウイルスベクターである、またはレトロウイルスベクターである、ベクター。

【請求項21】

配列番号１のヌクレオチド配列またはその等価物の発現が、プロモーター、必要に応じてＥＦ－１アルファプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＭＭＬＶプロモーターの制御下にある、請求項２０に記載のベクター。

【請求項22】

請求項１から１９までのいずれかに記載の核酸分子または請求項２０もしくは２１に記載のベクターを含むヒトＴ細胞またはＮＫ細胞の集団。

【請求項23】

単離された細胞または前記ヒトＴ細胞もしくはＮＫ細胞の集団が、セントラルメモリーＴ細胞、ＮＫ細胞、ナイーブメモリーＴ細胞、汎Ｔ細胞またはＣＤ２５＋細胞およびＣＤ１４＋細胞が実質的に枯渇したＰＢＭＣを含む、請求項２２に記載のヒトＴ細胞またはＮＫ細胞の集団。

【請求項24】

少なくとも９０％が同じ少なくとも１種の細胞亜型の細胞で構成される、請求項２２または２３に記載の集団。

【請求項25】

請求項１から１９までのいずれか一項に記載の核酸分子または請求項２０もしくは２１に記載のベクターを含む単離された細胞。

【請求項26】

免疫細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、ガンマ－デルタＴ細胞、幹細胞、前駆細胞または前駆体細胞の群から選択される、請求項２５に記載の細胞。

【請求項27】

請求項２５または２６に記載の単離された細胞を含む細胞の集団。

【請求項28】

請求項２２から２４までもしくは２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２５もしくは２６のいずれかに記載の単離された細胞、および担体、ならびに必要に応じて安定剤、保存剤または凍結保存剤を含む組成物。

【請求項29】

急性骨髄性白血病に罹患しているヒト患者を処置する方法であって、請求項１から１９までのいずれかに記載の核酸分子を含む自己または同種ヒトＴ細胞またはＮＫ細胞の集団を投与するステップを含む、方法。

【請求項30】

処置を必要とする患者を処置する方法であって、請求項２２から２４までまたは２７のいずれか一項に記載の細胞集団を前記患者に投与するステップを含む、方法。

【請求項31】

前記患者が、脳がん、腎がん、乳がん、腺癌、神経がん、肺がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、黒色腫、カルチノイド、卵巣がん、子宮頸がん、膵がん、前立腺がん、子宮体がん、神経膠腫、神経がん、皮膚がん、頭頸部がん、胃がん、肝がん、精巣がん、甲状腺がん、リンパ腫、尿路上皮がんまたは骨髄異形成症候群の群から選択される疾患を有する、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記患者が、ＦＬＴ３を発現するがん細胞を有する、請求項２９から３１までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記患者が、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）に活性化突然変異を有する腫瘍細胞を有する、請求項２９から３２までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記患者が、ＦＬＴ３－ＩＴＤ突然変異を有する腫瘍細胞を有する、請求項２９から３３までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記キメラ抗原受容体を発現する細胞が局所的にまたは全身的に投与される、請求項２９から３４までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記キメラ抗原受容体を発現する細胞が単回投薬または反復投薬によって投与される、請求項２９から３５までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

ＣＡＲ Ｔ細胞またはＮＫ細胞を調製する方法であって、自己または同種ヒトＴ細胞またはＮＫ細胞の集団を用意するステップと、前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞に対して請求項１から１９までのいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターによる形質導入を行うステップとを含む、方法。

【請求項38】

ＣＡＲを発現する細胞を調製する方法であって、前記細胞に対して、請求項１７もしくは１８に記載のベクターまたは請求項１から１９までのいずれか一項に記載の核酸分子を用いた形質導入を行うステップを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、その内容全体が参照によって本出願に組み込まれる２０２０年４月１７日出願の米国仮出願第６３／０１１，８１９号の優先権を主張するものである。

【0002】

技術分野
本開示は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）発現細胞に結合するように工学的に操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、そのようなＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞、そのようなＣＡＲ Ｔ細胞またはＮＫ細胞を製剤化する方法、および抗がん剤としての使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）は、正常な造血幹細胞および前駆細胞に発現される膜貫通タンパク質である。ＦＬＴ３はまた、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＡＭＬ）において悪性芽球にも発現される。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

ＦＬＴ３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞により、ｉｎ ｖｉｖｏで固形がんおよび白血病などの血液がんの成長を抑制し、白血病を担持するマウスの生存を延長することができる（Chen et al., Leukemia 31: 1830, 2017）。したがって、患者におけるがんを効率的に処置するＦＬＴ３特異的ＣＡＲ治療が依然として必要とされている。

【0005】

本開示の概要
白血病芽球などのがん細胞の表面にＦＬＴ３発現を有する患者に関して、例えば、標準治療での予後が悪いことが示されたＡＭＬを有する高齢者に対して、ＦＬＴ３－ＣＡＲ Ｔ細胞またはＮＫ細胞を治療抵抗性疾患の処置または先行処置として検討することができる。

【0006】

ＦＬＴ３特異的ＣＡＲ（「ＦＬＴ３ ＣＡＲ」とも称される）をコードする核酸分子が本明細書に記載される。核酸分子は、以前に設計されたコード配列よりも高いＣＡＲ発現および大きな効果を可能にする、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲの改善されたコード配列（例えば、配列番号１）を含む。

【0007】

一態様では、ＦＬＴ３ ＣＡＲ核酸分子は、

【化1】

を含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0008】

配列番号１は、配列：

【化2】

【化3】

を有するポリペプチドをコードする。

【0009】

一態様では、ＣＡＲは、シグナル配列（例えば、MGWSSIILFLVATATGVH；配列番号３）；ＦＬＴ３標的化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）

【化4】

スペーサー（すなわち、ヒンジドメイン、LEPKSCDKTHTCPPCPDPKGT；配列番号５）；ＣＤ２８膜貫通ドメイン（FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV；配列番号６）、ＣＤ２８共刺激ドメイン（RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS；配列番号７）；およびＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン

【化5】

を含む、それを含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカー（例えば、GGGGSGGGGSGGGGS；または配列番号４のａａ１１９～ａａ１３３）によって連結した、重鎖可変領域：

【化6】

；または配列番号４のアミノ酸（ａａ）１～ａａ１１８）と軽鎖可変領域（

【化7】

；または配列番号４のａａ１３４～ａａ２４１）とを含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0010】

一部の場合では、ＣＡＲを、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後にＴ２Ａリボソームスキップ配列および短縮型ＥＧＦＲ（本明細書ではＥＧＦＲｔもしくはｔＥＧＦＲと称される）または短縮型ＣＤ１９（本明細書ではＣＤ１９ｔもしくはｔＣＤ１９と称される）が続くベクターを使用して産生させることができる。この配置では、ＥＧＦＲｔまたはＣＤ１９ｔを同時発現させることにより、遺伝子改変された細胞の正確な測定を可能にし、遺伝子改変された細胞の正の選択、ならびに治療用Ｔ細胞またはＮＫ細胞の養子移入後のｉｎ ｖｉｖｏにおける効率的な細胞追跡を可能にする、不活性な非免疫原性表面マーカーがもたらされる。増殖を効率的に制御してサイトカインストームおよびオフターゲットの毒性を回避することは、Ｔ細胞免疫療法を成功させるための重要なハードルである。レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなどのベクターに組み入れられるＥＧＦＲｔまたはＣＤ１９ｔは、処置に関連する毒性が生じた場合にＣＡＲ＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞を除去する自殺遺伝子として作用し得る。

【0011】

一態様では、抗ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子が本明細書で提供される。核酸分子は、ＦＬＴ３ ｓｃＦｖ抗原結合性断片をコードする配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ７７７のポリヌクレオチド配列またはその等価物を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、等価物は、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ７７７（ＦＬＴ３ ｓｃＦｖ抗原結合性断片をコードする）と少なくとも約７５％（これだけに限定されないが、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％または少なくとも約９９％を含む）同一であると同時に、最適化されたヌクレオチドの変化のうちの少なくとも１つを維持する。それに加えて、またはその代わりに、等価物は、ＦＬＴ３ ｓｃＦｖ抗原結合性断片をコードする配列番号１２のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ７７７のポリヌクレオチドまたはその等価物を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。さらなる実施形態では、等価物は、配列番号１４の（ｎｔ）５５～ｎｔ７７７を含むものでなく、それから本質的になるものでなく、それからなるものでもない。一部の実施形態では、核酸分子は、短縮型ＣＤ１９または短縮型ＥＧＦＲをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0012】

一部の実施形態では、核酸分子は、シグナルペプチドおよびＦＬＴ３ ｓｃＦｖ抗原結合性領域をコードする配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）１～ｎｔ７７７のポリヌクレオチド配列またはその等価物を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、等価物は、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）１～ｎｔ７７７と少なくとも約７５％（これだけに限定されないが、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％または少なくとも約９９％を含む）同一であると同時に、最適化されたヌクレオチドの変化を維持する。それに加えて、またはその代わりに、等価物は、配列番号１２のヌクレオチド（ｎｔ）１～ｎｔ７７７のポリヌクレオチドを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。さらなる実施形態では、等価物は、配列番号１４の（ｎｔ）１～ｎｔ７７７を含むものでなく、それから本質的になるものでなく、それからなるものでもない。

【0013】

一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号１のポリヌクレオチド配列またはその等価物を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、等価物は、配列番号１と少なくとも約７５％（これだけに限定されないが、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％または少なくとも約９９％を含む）同一であると同時に、最適化されたヌクレオチドの変化を維持する。それに加えて、またはその代わりに、等価物は、配列番号１２のポリヌクレオチドを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0014】

本明細書に開示されるＦＬＴ３ ＣＡＲをコードする核酸分子またはそれと相補的な核酸分子を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなるベクターも提供される。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、発現ベクターである。さらなる実施形態では、ベクターはレトロウイルスベクターである。なおさらなる実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。

【0015】

さらなる態様では、ＦＬＴ３ ＣＡＲをコードする本明細書に開示される核酸分子またはＦＬＴ３ ＣＡＲをコードする本明細書に開示されるベクターを含むヒトＴ細胞またはＮＫ細胞の集団が提供される。ＦＬＴ３ ＣＡＲをコードする本明細書に開示される核酸分子またはＦＬＴ３ ＣＡＲをコードする本明細書に開示されるベクターを含む単離された細胞またはその集団がさらに提供される。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、幹細胞、免疫細胞、ＮＫ細胞またはＴ細胞の前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または前駆体細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）の群から選択される。

【0016】

なおさらなる態様では、本明細書に開示されるＦＬＴ３ ＣＡＲを含有するもしくは発現する細胞の集団、または本明細書に開示されるＦＬＴ３ ＣＡＲを発現する単離された細胞、および担体、ならびに必要に応じて安定剤、保存剤または凍結保存剤を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる組成物が提供される。

【0017】

一態様では、急性骨髄性白血病などのがんに罹患しているヒト患者を処置する方法が提供される。方法は、本明細書に開示されるＦＬＴ３ ＣＡＲをコードする核酸分子を含む自己もしくは同種ヒトＴ細胞もしくはＮＫ細胞の集団、または本明細書に開示されるＦＬＴ３ ＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターを投与するステップを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。当業者は当技術分野で公知の臨床的および準臨床的パラメータ、例えば、他の公知の治療を用いた処置または治療の非存在下と比較した、腫瘍量の減少、転移の阻害、全生存の増強、毒性の低減、無増悪生存期間の延長、がんの緩徐化または停止、腫瘍マーカーまたは他の臨床症状の低減などを使用して、患者がいつ処置されたかを決定することができる。これらの方法を第２選択、第３選択、第４選択または第５選択治療として他の公知の抗腫瘍またはがん治療と組み合わせることもでき、第１選択治療として提供することもできる。

【0018】

別の態様では、それを必要とする患者を処置する方法が提供される。方法は、本明細書に開示されるＦＬＴ３ ＣＡＲ細胞集団を患者に投与するステップを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0019】

さらに別の態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞またはＮＫ細胞を調製する方法が提供される。方法は、自己または同種ヒトＴ細胞またはＮＫ細胞の集団を用意するステップと、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に対して本明細書に開示されるベクターまたは本明細書に開示される核酸分子を用いた形質導入を行うステップとを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0020】

ＦＬＴ３－ＣＡＲを発現する細胞を調製する方法がさらに提供される。方法は、細胞に対して本明細書に開示されるベクターまたは本明細書に開示される核酸分子を用いた形質導入を行うステップを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0021】

本明細書に開示される方法において使用するための組成物およびキットも提供される。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、ｐＨＩＶ－７をどのように構築したかの概略図を提示する。

【0023】

【図2】図２は、ｐＨＩＶ－７の図を提示する。

【0024】

【図3】図３は、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現するレトロウイルスベクターゲノムを作成するためのプラスミドの図を提示する。

【0025】

【図4】図４Ａ～４Ｄは、４種のＴ細胞群、すなわち、対照としての機能を果たす、ＧＦＰを発現するＴ細胞（図４Ａ）、同じく対照としての機能を果たす、ｔＣＤ１９を発現するＴ細胞（図４Ｂ）、最適化されていない核酸分子によってコードされるｔＣＤ１９およびＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞（図４Ｃ）、ならびに最適化された核酸分子によってコードされるｔＣＤ１９およびＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞（図４Ｄ）におけるＣＡＲ発現を評価したフローサイトメトリーの結果を提示する。

【0026】

【図5】図５Ａ～５Ｂは、２種の異なる標的がん細胞、すなわち、ＭＯＬＭ１３およびＵ９３７を使用し、２つの異なるエフェクターと標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）で試験した腫瘍溶解パーセンテージをプロットしたものである。図５Ａは、Ｅ：Ｔを１：５として試験した結果を示し、一方、図５Ｂは、Ｅ：Ｔを１：２５として試験した結果を示す。各標的細胞の型および各Ｅ：Ｔについて、Ｔ細胞の４つの群、すなわち、ＧＦＰを発現するＴ細胞（ＧＦＰ）、ｔＣＤ１９を発現するＴ細胞（ｔＣＤ１９）、最適化されていない核酸分子によってコードされるｔＣＤ１９およびＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞（最適化前）、ならびに最適化された核酸分子によってコードされるｔＣＤ１９およびＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞（最適化後）を試験し、腫瘍溶解パーセンテージを、同じ順序に従った４つのセット内の棒としてプロットした。

【0027】

【図6】図６Ａ～６Ｃは、それぞれドナー１～ドナー３から単離されたがん細胞とＴ細胞の共培養物の上清中のインターロイキン２（ＩＬ－２）の濃度を提示する。Ｔ細胞を、ＧＦＰ（ＧＦＰ対照）またはｔＣＤ１９（ｔＣＤ１９対照）または最適化されていない核酸分子によってコードされるｔＣＤ１９およびＦＬＴ３特異的ＣＡＲ（最適化前ＦＬＴ３／ＣＤ１９）または最適化された核酸分子によってコードされるｔＣＤ１９およびＦＬＴ３特異的ＣＡＲ（最適化後ＦＬＴ３／ＣＤ１９）を発現するように工学的に操作した。次いで、工学的に操作されたＴ細胞の各群を、別々に２種のがん細胞株と一緒にインキュベートした：ＭＯＬＭ１３細胞は、ＦＬＴ３を発現する（すなわち、ＦＬＴ３＋）腫瘍標的であり、一方、Ｕ９３７細胞はＦＬＴ３を発現せず、陰性対照としての機能を果たした。したがって、図６Ａ～６Ｃには各ドナーおよび各Ｔ細胞群についての２本の棒がプロットされている：左側は、ＭＯＬＭ１３との共培養中のＩＬ－２濃度を示し、一方、右側は、Ｕ９３７との共培養中のＩＬ－２濃度を示す。

【0028】

【図7】図７Ａ～７Ｃは、それぞれドナー１～ドナー３から単離されたがん細胞とＴ細胞の共培養物の上清中のインターフェロンガンマ（すなわち、ＩＦＮγまたはＩＦＮ－ガンマ）の濃度を提示する。Ｔ細胞を、ＧＦＰ（ＧＦＰ対照）またはｔＣＤ１９（ｔＣＤ１９対照）または最適化されていない核酸分子によってコードされるｔＣＤ１９およびＦＬＴ３特異的ＣＡＲ（最適化前ＦＬＴ３／ＣＤ１９）または最適化された核酸分子によってコードされるｔＣＤ１９およびＦＬＴ３特異的ＣＡＲ（最適化後ＦＬＴ３／ＣＤ１９）を発現するように工学的に操作した。次いで、工学的に操作されたＴ細胞の各群を、別々に２種のがん細胞株と一緒にインキュベートした：ＭＯＬＭ１３細胞は、ＦＬＴ３＋腫瘍標的であり、一方、Ｕ９３７細胞は、ＦＬＴ３を発現せず、陰性対照としての機能を果たした。したがって、図７Ａ～７Ｃには各ドナーおよび各Ｔ細胞群についての２本の棒がプロットされている：左側は、ＭＯＬＭ１３との共培養中のＩＦＮγ濃度を示し、一方、右側は、Ｕ９３７との共培養中のＩＦＮγ濃度を示す。

【0029】

【図8】図８は、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲ細胞により、ＡＭＬ増悪が用量依存的に緩徐化／停止することを示す。ＦＬＴ３（＋）ＡＭＬのＭＯＬＭ－１３モデルにおいてＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現するＮＫ細胞とＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞を比較した。全ての作業を、臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）由来の生存可能に凍結させた初代ヒトＣＡＲ ＮＫ細胞を用いて実施した。

【発明を実施するための形態】

【0030】

詳細な説明
定義
理解される通り、セクションまたはサブセクション見出しは、本明細書で使用される場合、単に組織化を目的としたものであり、記載されている主題を限定および／または分離するものとは解釈されない。

【0031】

別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、ここでは好ましい方法、デバイス、および材料を記載する。本明細書において引用された技術刊行物および特許公報は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における全てが、本開示が先行開示に基づいてそのような開示に先立つ権限がないことを容認するものと解釈されるべきではない。

【0032】

本開示の実施には、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内に入る組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の技法が使用される。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition；the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach；Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition；Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis；米国特許第４，６８３，１９５号；Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986))；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)；Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology；Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)）；Sohail (ed.) (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)を参照されたい。

【0033】

本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「１つの（ａ）細胞」という用語は、複数の細胞を、それらの混合物を含め、包含する。

【0034】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、化合物、組成物および方法が、列挙されている要素を含むが、他のものを排除しないことを意味するものとする。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、化合物、組成物および方法を定義するために使用される場合、組合せに対して本質的に重要なあらゆる要素以外のものが排除されることを意味するものとする。したがって、本明細書で定義されている要素から本質的になる組成物では、例えば、単離および精製方法ならびに薬学的に許容される担体、保存剤などに由来する微量の夾雑物は排除されない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、他の成分の微量要素を超えるものが排除されることを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態はこの技術の範囲内に入る。

【0035】

全ての数字表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、範囲を含め、概算であり、（＋）または（－）に１％、５％または１０％の増加で変動する。必ずしも明記されているとは限らないが、全ての数字表示に「約」という用語が先行することが理解されるべきである。本明細書に記載の試薬はただ単に例示的なものであり、その等価物が当技術分野で公知であることも、必ずしも明記されているとは限らないが、理解されるべきである。

【0036】

本明細書で使用される場合、高い、低い、増大、減少、低減またはこれらのあらゆる文法上の変形形態などの、本明細書で使用される比較用語は、参照からのある特定の変動を指し得る。一部の実施形態では、そのような変動は、参照よりも約１０％または約２０％または約３０％または約４０％または約５０％または約６０％または約７０％または約８０％または約９０％または約１倍または約２倍または約３倍または約４倍または約５倍または約６倍または約７倍または約８倍または約９倍または約１０倍または約２０倍または約３０倍または約４０倍または約５０倍または約６０倍または約７０倍または約８０倍または約９０倍または約１００倍またはそれよりも大きく高いことを指し得る。一部の実施形態では、そのような変動は、参照に対して約１％または約２％または約３％または約４％または約５％または約６％または約７％または約８％または約０％または約１０％または約２０％または約３０％または約４０％または約５０％または約６０％または約７０％または約７５％または約８０％または約８５％または約９０％または約９５％または約９６％または約９７％または約９８％または約９９％を指し得る。

【0037】

「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載されている状況が生じる場合もあり生じない場合もあることを意味し、したがって、記載には、その状況が生じる場合もその状況が生じない場合も含まれる。

【0038】

本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙されている項目のうちの１つまたは複数のありとあらゆる可能性のある組合せ、ならびに、選択肢（「または（ｏｒ）」）と解釈される場合には組合せの欠如を指し、包含する。

【0039】

「実質的に」または「本質的に」は、ほぼ完全にまたは完全に、例えば、いくらかの所与の数量の９５％またはそれよりも大きいことを意味する。一部の実施形態では、「実質的に」または「本質的に」は、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％を意味する。

【0040】

「許容される」、「効果的な」または「十分な」という用語は、本明細書に開示される任意の構成成分、範囲、投薬形態などの選択について記載するために使用される場合、前記構成成分、範囲、投薬形態などが、開示される目的に適するものであることが意図されている。

【0041】

当業者には理解される通り、ありとあらゆる目的に関して、本明細書に開示される範囲は全て、そのありとあらゆる可能性のある部分範囲および部分範囲の組合せも包含する。さらに、当業者には理解される通り、範囲は、個々のメンバーそれぞれを含む。

【0042】

本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである、生きている多細胞の脊椎動物生物体を指す。「哺乳動物」という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物のどちらも包含する。

【0043】

「対象」、「宿主」、「個体」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、動物、一般には哺乳動物を指す。任意の適切な哺乳動物を本明細書に記載の方法によって処置することができる。哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカクなど）、飼育動物（例えば、イヌおよびネコ）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）および実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）が挙げられる。一部の実施形態では、哺乳動物はヒトである。哺乳動物は、任意の年齢または任意の発生段階にあってよい（例えば、成体、若年、子、幼少または子宮内哺乳動物）。哺乳動物は雄であっても雌であってもよい。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は、疾患を有する、または疾患を有すると診断されている、または疾患を有する疑いがある。

【0044】

一部の実施形態では、構成成分の名称に関する「第１の」、「第２の」、「第３の」、「第４の」または同様の用語は、それらの名称に関するある特定の同一性を共有する１つよりも多くの構成成分を区別および識別するために使用される。例えば、「第１の投与」および「第２の投与」は、本明細書にわたって、２回の投与を区別するために使用される。

【0045】

「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、互換的に使用され、任意の長さの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかのポリマー形態のヌクレオチド、またはその類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、公知または未知の任意の機能を発揮し得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドなどの修飾されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前またはその後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断されていてよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識用構成成分とのコンジュゲーションによってなどで、さらに修飾され得る。この用語は、二本鎖分子および一本鎖分子のどちらも指す。別段の指定または必要がない限り、ポリヌクレオチドであるこの技術の任意の態様は、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが公知のまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれのどちらも包含する。したがって、この用語には、これだけに限定されないが、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プリンおよびピリミジン塩基を含むＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドもしくはポリマーまたは他の天然の、化学的にもしくは生化学的に修飾された、天然ではないもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれる。

【0046】

一部の実施形態では、参照核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの等価物は、参照によってコードされるものと同じ配列をコードする。一部の実施形態では、参照核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの等価物は、参照、相補的参照、逆参照、および／または逆相補（すなわち、相補的）参照と、必要に応じて高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。それに加えて、またはその代わりに、等価の核酸、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドは、参照核酸、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％もしくは少なくとも７５％もしくは少なくとも８０％の配列同一性あるいは少なくとも８５％の配列同一性あるいは少なくとも９０％の配列同一性あるいは少なくとも９２％の配列同一性あるいは少なくとも９５％の配列同一性あるいは少なくとも９７％の配列同一性あるいは少なくとも９８％の配列同一性を有するものである、あるいは、等価の核酸は、参照ポリヌクレオチドもしくはその相補物と高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。別の態様では、等価物は、参照核酸、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％もしくは少なくとも７５％もしくは少なくとも８０％の配列同一性あるいは少なくとも８５％の配列同一性あるいは少なくとも９０％の配列同一性あるいは少なくとも９２％の配列同一性あるいは少なくとも９５％の配列同一性あるいは少なくとも９７％の配列同一性あるいは少なくとも９８％の配列同一性を有する、あるいは、等価の核酸は、参照ポリヌクレオチドもしくはその相補物と高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。

【0047】

「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的様式で生じ得る。複合体は、２重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本またはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範囲にわたるプロセスにおけるステップ、例えば、ＰＣＲ反応またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断の開始などを構成し得る。

【0048】

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、インキュベーション温度、約２５℃～約３７℃；ハイブリダイゼーション緩衝剤濃度、約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約０％～約２５％；および洗浄溶液、約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣが挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、インキュベーション温度、約４０℃～約５０℃；緩衝剤濃度、約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約３０％～約５０％；および洗浄溶液、約５×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣが挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、インキュベーション温度、約５５℃～約６８℃；緩衝剤濃度、約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約５５％～約７５％；および洗浄溶液、約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、５分から２４時間までであり、１回、２回またはそれよりも多くの洗浄ステップを伴い、洗浄インキュベーション時間は約１分、２分、または１５分である。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝剤である。他の緩衝系を使用するＳＳＣの等価物を使用できることが理解される。

【0049】

一部の実施形態では、コーディング核酸分子を、例えば、ある特定のＧＣ含量を有するように最適化することができる。ＧＣ含量（またはグアニン－シトシン含量）は、核酸分子における、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）のいずれかである窒素塩基のパーセンテージである。この尺度は、ＤＮＡではアデニンおよびチミンならびにＲＮＡではアデニンおよびウラシルも含めた、含まれる４種の総塩基のうちのＧ塩基およびＣ塩基（すなわち、Ｇ残基およびＣ残基）の割合を示すものである。定量的に、各ＧＣ塩基対は３つの水素結合によって一緒に保持されているが、一方、ＡＴおよびＡＵ塩基対は、２つの水素結合によって一緒に保持されている。したがって、ＧＣ含量が低い核酸分子は、ＧＣ含量が高い核酸分子と比較して熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓ－ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が低い。二本鎖核酸の熱安定性（ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）に寄与する最も重要な因子が、実際に、隣接する塩基の塩基積み重ねに起因するものであることも実証されている。ＧＣ対には環外基の相対的な位置に起因してＡＴまたはＡＵ対よりも好都合な積み重ねエネルギーが存在する。

【0050】

「コドン」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質合成の間に特定のアミノ酸残基または終止シグナルに対応する３つの連続したヌクレオチドの配列を指す。一部の実施形態では、コドンは、下記の表に提示される標準の遺伝暗号である。

【表1】

【0051】

核酸分子のコドン頻度という用語は、ポリペプチドの発現の際に核酸分子によって使用されるコドンの再出現率を指す。一部の実施形態では、本明細書で使用されるコドン頻度は、完全な核酸分子の総コドン数に対するそのコドンの数のパーセンテージとして表される。他の実施形態では、本明細書で使用されるコドン頻度は、コドン１０００個当たりのそのコドンの平均数として表される。例えば、３００ヌクレオチド残基を有する核酸分子では１００個のコドンが使用され、そのうちの１０個がＧＣＣからなるコドンであり、アラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基をコードする。したがって、ＧＣＣコドン頻度は、１０％またはコドン１０００個当たり１００個と表すことができる。核酸のコドン頻度の算出に関しては、例えば、www.bioinformatics.org/sms2/codon_usageなど、いくつかのオンラインツールが利用可能である。

【0052】

「コードする」という用語は、核酸配列に適用される場合、そのネイティブな状態でまたは当業者に周知の方法によって操作された場合に、転写および／または翻訳されて、ポリペプチドおよび／またはその断片のｍＲＮＡを生じ得る場合にポリペプチドを「コードする」といえるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補物であり、それからコード配列を推定することができる。

【0053】

「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることが可能な少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。「発現する」という用語は、遺伝子産物の産生を指す。

【0054】

本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスまたは転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスまたは両方のプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングも含まれ得る。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって決定することができる。

【0055】

「形質導入する」または「形質導入」という用語は、ＣＡＲを発現する細胞の作製に適用される場合、それによって外来ヌクレオチド配列が細胞に導入されるプロセスを指す。一部の実施形態では、この形質導入はベクターを介して行われる。

【0056】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、これだけに限定されないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣなどを含めた、異なる宿主間での移行のために設計された核酸構築物を指す。一部の実施形態では、プラスミドベクターを市販のベクターから調製することができる。他の実施形態では、ウイルスベクターを、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶなどから、当技術分野で公知の技法に従って作製することができる。一実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。

【0057】

「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することが可能な、染色体ＤＮＡとは分離した染色体外ＤＮＡ分子である。多くの場合、プラスミドは環状かつ二本鎖である。プラスミドにより、微生物の集団内での遺伝子水平伝播の機構がもたらされ、また、一般には、所与の環境状態において選択上の利点がもたらされる。プラスミドは、競合的環境ニッチにおいて天然に存在する抗生物質に対する耐性をもたらす遺伝子を有し得る、あるいは、産生されるタンパク質が同様の状況下で毒素としての機能を果たし得る。そのような使用のための多くのプラスミドが市販されている。複製させる遺伝子を、細胞に特定の抗生物質に対する耐性をもたせる遺伝子およびその位置へのＤＮＡ断片の容易な挿入を可能にするいくつかの一般に使用される制限部位を含有する短い領域である多重クローニング部位（ＭＣＳまたはポリリンカー）を含有するプラスミドのコピーに挿入する。一部の実施形態では、１つまたは複数のプラスミドをウイルスベクターまたはウイルスゲノムの産生に使用する。一部の実施形態では、プラスミドをポリヌクレオチドの複製または増幅のために使用する。プラスミドの別の主要な使用は、大量のタンパク質の作出である。この場合、研究者は、目的の遺伝子を有するプラスミドを含有する細菌を成長させる。細菌が抗生物質耐性を付与するタンパク質を産生するのと同時に、挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように誘導することもできる。これは、遺伝子またはそれがコードするタンパク質を大量産生させるための安価かつ容易なやり方である。

【0058】

「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかにおいて宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む組換えによって産生されるウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが挙げられる。セムリキ森林ウイルスに基づくベクターおよびシンドビスウイルスに基づくベクターなどのアルファウイルスベクターも遺伝子治療および免疫療法における使用のために開発されている。Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5: 434-439およびYing, et al. (1999) Nat. Med. 5 (7): 823-827を参照されたい。

【0059】

遺伝子移入がレンチウイルスベクターによって媒介される実施形態では、ベクター構築物は、レンチウイルスゲノムまたはその一部、および治療用遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、「レンチウイルス媒介性遺伝子移入」または「レンチウイルス形質導入」は同じ意味を有し、遺伝子または核酸配列が、細胞に進入し、そのゲノムが宿主細胞のゲノム内に組み込まれるウイルスによって宿主細胞に安定に移入されるプロセスを指す。ウイルスは、その正常な感染機構によって宿主細胞に進入し得る、または、異なる宿主細胞の表面受容体またはリガンドに結合して細胞に進入するように改変することができる。レトロウイルスは、それらの遺伝情報をＲＮＡの形態で有するが、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡがＤＮＡ形態に逆転写され、それが感染細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＤＮＡ形態はプロウイルスと称される。本明細書で使用される場合、レンチウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス様進入機構によって外因性核酸を細胞に導入することが可能なウイルス粒子を指す。「レンチウイルスベクター」は、他のレトロウイルスベクターと比較して非分裂細胞への形質導入に関してある特定の利点を有する当技術分野で周知のレトロウイルスベクターの一つの型である。Trono D. (2002) Lentiviral vectors, New York: Spring-Verlag Berlin Heidelbergを参照されたい。

【0060】

本開示のレンチウイルスベクターは、オンコレトロウイルス（ＭＬＶを含有するレトロウイルスの亜群）、およびレンチウイルス（ＨＩＶを含有するレトロウイルスの亜群）に基づくまたはそれに由来する。例としては、ＡＳＬＶ、ＳＮＶおよびＲＳＶが挙げられ、これらは全て、レンチウイルスベクター粒子産生系のためにパッケージング構成成分およびベクター構成成分に分割されている。本開示によるレンチウイルスベクター粒子は、特定のレトロウイルスの遺伝学的にまたは他の点で（例えば、パッケージング細胞系の特異的選択により）変更されたバージョンに基づいてもよい。

【0061】

本開示によるベクター粒子が特定のウイルスに「基づく」または「由来する」とは、そのベクターが特定のウイルスに由来することを意味する。ベクター粒子のゲノムは、そのウイルス由来の構成成分を骨格として含む。一部の実施形態では、ウイルスはレトロウイルスである。ベクター粒子は、逆転写および組込み系を含めた、ＲＮＡゲノムに適合する必須のベクター構成成分を含有する。通常、これらには特定のレトロウイルスに由来するｇａｇおよびｐｏｌタンパク質が含まれる。したがって、ベクター粒子の大多数の構造的な構成要素は通常、そのレトロウイルスに由来するが、所望の有用な特性がもたらされるように遺伝子変更または他のやり方での変更がなされていてもよい。しかし、ある特定の構造的な構成要素、特にｅｎｖタンパク質は、異なるウイルスを起源とし得る。ベクター粒子産生系に異なるｅｎｖ遺伝子を使用して、特異性が異なるベクター粒子を得ることにより、ベクターの宿主域および感染または形質導入される細胞型を変更することができる。

【0062】

「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」という用語は、本明細書で使用される場合、この名称を伴う、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属に属するウイルスのクラスのメンバーを指す。このウイルスの多数の血清型が遺伝子送達に適することが公知である；公知の血清型は全て、種々の組織型由来の細胞に感染し得る。少なくとも１１種の連番が付されたＡＡＶ血清型が当技術分野で公知である。本明細書に開示される方法に有用である非限定的な例示的な血清型としては、１１種の血清型のいずれか、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはバリアントもしくは合成血清型、例えば、ＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂが挙げられる。ＡＡＶ粒子は、３種の主要なウイルスタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ ＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶ ｒｈ７４を指す。これらのベクターは市販されているか、または特許もしくは技術文献に記載されている。

【0063】

「調節配列」、「調節エレメント」「発現制御エレメント」または「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、転写および／または複製される標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結しており、標的ポリヌクレオチドの発現および／または複製を容易にするポリヌクレオチドが意図されている。

【0064】

調節ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用される場合、「作動可能に連結」という用語は、調節ポリヌクレオチドとそれが連結しているポリヌクレオチド配列との間の、特定のタンパク質が調節ポリヌクレオチドに結合すると連結しているポリヌクレオチドが転写されるような関連を指す。

【0065】

プロモーターは発現制御エレメントまたは調節配列の例である。「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、コード配列の発現を調節する任意の配列を指す。プロモーターは、調節された遺伝子転写のための制御点をもたらす、遺伝子または他のポリヌクレオチドに対して５’側または上流に位置し得る。プロモーターの例はポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩである。プロモーターは、例えば、構成的、誘導性、抑止可能または組織特異的であってよい。「プロモーター」は、そこで転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である、制御配列である。プロモーターは、そこで調節タンパク質および分子が結合し得る、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの遺伝子エレメントを含有し得る。プロモーターの非限定的な例としては、ＥＦ１アルファプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、およびＭＭＬＶプロモーターが挙げられる。

【0066】

ＥＦ１アルファ（本明細書ではＥＦ－１アルファとも称される）プロモーター配列は当技術分野で公知である（例えば、それぞれ２０１９年３月１３日に最終アクセスされたaddgene.org/11154/sequences/; ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J04617、およびZheng and Baum (2014) Int'l. J. Med. Sci. 11 (5): 404-408を参照されたい）。一部の実施形態では、ＥＦ１アルファプロモーターは、

【化8】

および必要に応じて、その等価物を含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0067】

サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列も当技術分野で公知である（例えば、２０１９年３月１３日に最終アクセスされたsnapgene.com/resources/plasmid-files/?set=basic_cloning_vectors&plasmid=CMV_promoter、およびZheng and Baum (2014)、上記を参照されたい）。一部の実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、

【化9】

を含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0068】

モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーター配列は当技術分野で公知である（例えば、Lorens et al. Virology. 2000 Jun 20;272 (1): 7-15を参照されたい）。一部の実施形態では、ＥＦ１アルファプロモーターは、配列番号２４を含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0069】

本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、本明細書で使用される場合、発現される核酸配列に対するその位置および向きとは無関係に、核酸配列の転写を強化、改善または改良する配列エレメントを示す。エンハンサーは、単一のプロモーターからの、または同時に１つよりも多くのプロモーターから転写を増強し得る。この転写を改善する機能性が保持されるまたは実質的に保持される（例えば、野生型活性、すなわち、全長配列の活性の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％）限りは、野生型エンハンサー配列の任意の短縮された、突然変異したまたは他のやり方で改変されたバリアントも上記の定義の範囲内に入る。

【0070】

「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、それらの最も広範な意味で互換的に使用され、２つまたはそれよりも多くのサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣体の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結したものであり得る。別の態様では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結したものであり得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸残基を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数には制限はない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤ光学異性体とＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含めた、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸のいずれかを指す。

【0071】

等価の／等価物および生物学的等価の／生物学的等価物という用語は、例えば、参照としてタンパク質またはポリペプチドに言及する場合に、互換的に使用される。一部の実施形態では、等価のタンパク質またはポリペプチドは、参照タンパク質またはポリペプチドに対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％または少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有するものである。一部の実施形態では、等価のタンパク質またはポリペプチドは、本明細書に開示されるポリペプチドまたはタンパク質に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％または少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、等価のタンパク質またはポリペプチドは、本明細書に記載の等価のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはタンパク質に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％または少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。それに加えてまたはその代わりに、ポリヌクレオチドの等価物は、参照または親ポリヌクレオチドと同じまたは同様の機能のタンパク質またはポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、等価物は機能的なタンパク質であり、必要に応じて、本明細書に記載されているまたは他のやり方で当業者が入手可能な１つまたは複数のアッセイによって同定することができる。別の態様では、等価物は、参照タンパク質またはポリペプチドと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％または少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。

【0072】

本明細書で使用される場合、参照配列内の同定された位置に「対応する」または「アラインメントされる」、目的の配列内のアミノ酸（ａａ）またはヌクレオチド（ｎｔ）残基の位置とは、その残基の位置が、目的の配列と参照配列の間の配列アラインメント内の同定された位置にアラインメントされることを指す。例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａおよびＢＬＡＳＴなど、そのような配列アラインメントを実施するための種々のプログラムが利用可能である。

【0073】

本明細書で使用される場合、「を特異的に認識し、それに結合する」という用語は、抗体（もしくはその抗原結合性断片またはそのような抗体もしくは抗原結合性断片を含む生物学的作用剤、例えば、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現する細胞など）とその標的抗原との間の、別の分子との結合親和性よりも実質的に高い結合親和性での接触を意味する。一部の実施形態では、抗体（もしくはその抗原結合性断片またはそのような抗体もしくは抗原結合性断片を含む生物学的作用剤、例えば、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現する細胞など）とその標的抗原の間の結合親和性は、少なくとも１０^－３Ｍであり、その中の任意の数値または任意の範囲、例えば、少なくとも約１０^－６Ｍまたは少なくとも約１０^－７Ｍ、および好ましくは１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍまたは１０^－１２Ｍなどが含まれる。

【0074】

本明細書で使用される場合、「ＦＬＴ３」および「ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３」という用語は、互換的に使用され、この名称、代替名称（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ、幹細胞チロシンキナーゼ、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ、ＦＬサイトカイン受容体、ＣＤ１３５抗原、ＥＣ ２．７．１０．１、ＣＤ１３５、ＦＬＫ－２、ＳＴＫ１、ＦＬＫ２、増殖因子受容体チロシンキナーゼＩＩＩ型、受容体型チロシン－プロテインキナーゼＦＬＴ３、胎児肝臓キナーゼ２、胎児肝臓キナーゼ－２、ＥＣ ２．７．１０、ＦＬＴ－３もしくはＳＴＫ－１）のいずれか、またはＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ３６８８８を伴う受容体型チロシン－プロテインキナーゼＦＬＴ３、ならびに、ＦＬＴ３およびその任意のバリアントもしくはアイソフォームと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＦＬＴ３に特異的に結合するモノクローナル抗体が、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよび他の商業的な供給源から市販されており、例えば、以下のウェブアドレスに列挙されている：biocompare.com/Search-Antibodies/?search=FLT3&said=0。抗原結合性断片を調製するための方法は当技術分野で公知である。抗原結合性ドメインは、任意の適当な種、例えば、ヒツジまたはヒトに由来するものであってよい。

【0075】

ＦＬＴ３の非限定的な例としては、

【化10】

からなるヒトＦＬＴ３アイソフォーム１および必要に応じてその等価物；ならびに

【化11】

【化12】

からなるヒトＦＬＴ３アイソフォーム２および必要に応じてその等価物が挙げられる。

【0076】

本明細書で使用される場合、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）における活性化突然変異は、ＦＬＴ３遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）突然変異などの、ＦＬＴ３キナーゼの活性化を導く突然変異ＦＬＴ３ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。ＦＬＴ３は、急性骨髄性白血病の症例の約３分の１において突然変異している。急性骨髄性白血病において最も頻度の高いＦＬＴ３突然変異は、膜近傍ドメインにおける遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）突然変異（２３％）およびチロシンキナーゼドメインにおける点突然変異（１０％）である。最も頻度の高いキナーゼドメイン突然変異は、アスパラギン酸がチロシンに変換される、８３８位のアスパラギン酸（８３５位のヒトアスパラギン酸残基と等価）のチロシンでの置換（ＦＬＴ３／Ｄ８３５Ｙ）である。これらの突然変異はどちらもＦＬＴ３を構成的に活性化するものであるにもかかわらず、ＩＴＤ突然変異を有する患者の予後の方が大いに不良である。また、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８４６，６３０号でより詳細を参照されたい。

【0077】

「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に結合することが可能な細胞外ドメイン、細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、および、少なくとも１つの細胞内ドメインを含む、融合タンパク質を指す。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、時には、「キメラ受容体」、「Ｔボディ（Ｔ－ｂｏｄｙ）」または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と称される。

【0078】

「抗原に結合することが可能な細胞外ドメイン」とは、例えば、抗体またはその抗原結合性断片など、ある特定の抗原に結合し得る任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。

【0079】

本明細書で使用される場合、「抗体」（本明細書では「免疫グロブリン」とも称される）という用語は、集合的には、例として、これだけに限定することなく、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、これらの組合せ、ならびに、任意の脊椎動物において、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギおよびマウスなどの哺乳動物において免疫応答の間に産生される同様の分子、ならびに非哺乳動物種において免疫応答の間に産生される同様の分子、例えばサメ免疫グロブリンなどを含めた、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子を指す。他に特に記載がなければ、「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリン、および、目的の分子（または目的の高度に類似した分子の群）に、他の分子への結合を実質的に排除して特異的に結合する「抗体断片」または「抗原結合性断片」（例えば、目的の分子に対して、生体試料中の他の分子に対する結合定数よりも少なくとも１０^３Ｍ^－１もしくはそれよりも大きい、少なくとも１０^４Ｍ^－１もしくはそれよりも大きい、または少なくとも１０^５Ｍ^－１もしくはそれよりも大きい結合定数を有する抗体および抗体断片）を包含する。「抗体」という用語は、キメラ抗体（例えば、マウスもしくはヒト化非霊長類抗体）などの遺伝子操作された形態またはヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体など）またはその両方も包含する。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.)；Owen et al., Kuby Immunology, 7^th Ed., W.H. Freeman & Co., 2013；Murphy, Janeway's Immunobiology, 8^th Ed., Garland Science, 2014；Male et al., Immunology (Roitt), 8^th Ed., Saunders, 2012；Parham, The Immune System, 4^th Ed., Garland Science, 2014も参照されたい。

【0080】

抗体構造に関して、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続した重（Ｈ）鎖と軽（Ｌ）鎖を有する。軽鎖にはラムダ（λ）およびカッパ（κ）の２つの型が存在する。重鎖には抗体分子の機能活性を決定する主要なクラス（またはアイソタイプ）が５つ存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する（領域は「ドメイン」としても公知である）。重鎖可変領域と軽鎖可変領域は組み合わさって抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される３つの超可変領域によって遮られた「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は定義されている（これにより参照により本明細書に組み込まれるKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照されたい）。Ｋａｂａｔデータベースは現在オンラインで維持されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成物である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域を合わせたものであり、主にβ－シートコンフォメーションをとり、ＣＤＲはループを形成してβシート構造と接続し、一部の場合ではその一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、ＣＤＲを鎖間の非共有結合性の相互作用によって正しい向きに位置付ける足場を形成するように作用する。

【0081】

ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合を主に担う。各鎖のＣＤＲは、一般には、Ｎ末端から開始して逐次的に番号が付され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称され、一般には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても識別される（重鎖領域はＣＤＲＨと呼ばれ、軽鎖領域はＣＤＲＬと呼ばれる）。したがって、ＣＤＲＨ３は、それが見いだされる抗体の重鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ３であり、一方、ＣＤＲＬ１は、それが見いだされる抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。例えば、ＦＬＴ３抗体は、ＦＬＴ３と関連性のある抗原に独特の特定のＶ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域配列を有し、したがって、特定のＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ））を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲは抗体ごとに変動するが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位のみが、抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と称される。

【0082】

本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体分子またはＴ細胞受容体などの、特定の液性免疫または細胞性免疫の産物が特異的に結合し得る化合物、組成物または物質を指す。抗原は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝産物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質、およびホルモンならびに複合炭水化物（例えば、多糖）、リン脂質、およびタンパク質などの巨大分子を含めた任意の型の分子であってよい。抗原の一般的なカテゴリーとしては、これだけに限定されないが、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物および他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片拒絶に関与する抗原、毒素、ならびに他の種々雑多な抗原が挙げられる。

【0083】

一部の実施形態では、抗体、その抗原結合性断片またはＣＡＲなどの結合性部分に対する抗原は、本明細書では、「抗原」、その後に結合性部分（例えば、ＦＬＴ３ ＣＡＲもしくはＦＬＴ３特異的ＣＡＲなど）、または抗原の前に「抗」および抗原の後に結合性部分（例えば、抗ＦＬＴ３抗体など）または、結合性部分、その後に「に対する（ｔｏ）」もしくは「を対象とする（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ）」、次いで抗原（例えば、ＦＬＴ３に対する抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ＦＬＴ３）など）という形式で提示され得る。

【0084】

本明細書で使用される場合、「抗原結合性ドメイン」という用語は、ＦＬＴ３などの抗原標的に特異的に結合し得る任意のタンパク質またはポリペプチドドメインを指す。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖまたはＦｖからなる群から選択することができる。

【0085】

単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）は、リンカーペプチド（一般にはおよそ５～２５アミノ酸の長さ）で接続された重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。ｓｃＦｖに関しては、重鎖および軽鎖の可変領域は、同じ抗体に由来するものであっても異なる抗体に由来するものであってもよい。一部の実施形態では、ＦＬＴ３ ｓｃＦｖは本明細書において配列番号４として開示される。追加的な適切なＦＬＴ３ ｓｃＦｖは、例えば、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，９６１，３１２号およびＷＯ２０２０／０１０２８４において見いだすことができる。

【0086】

一部の実施形態では、「リンカー配列」、「リンカーペプチド」および「リンカーポリペプチド」という用語は、互換的に使用され、１回から１０回あるいは約８回まであるいは約６回まであるいは約５回または４回あるいは３回あるいは２回繰り返され得る、１アミノ酸から１０アミノ酸まで、あるいは８アミノ酸あるいは６アミノ酸あるいは５アミノ酸を含む任意のアミノ酸配列に関する。例えば、リンカーは、３回繰り返されるペンタペプチドからなる１５個までのアミノ酸残基を含み得る。さらなる実施形態では、リンカー配列は、３コピーのＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号２７）を含む、（グリシン_４セリン）_３（配列番号４のａａ１１９～ａａ１３３）柔軟なポリペプチドリンカーである。他の実施形態では、「リンカー配列」、「リンカーペプチド」および「リンカーポリペプチド」という用語は、いくつか（例えば、約１～約５０個）のランダムなアミノ酸残基からなるペプチドを指す。

【0087】

一部の実施形態では、抗体の「等価の／等価物」または「生物学的等価の／生物学的等価物」という用語は、抗体の、ＥＬＩＳＡまたは他の適切な方法によって測定して、そのエピトープ／抗原タンパク質またはその断片に選択的に結合する能力を意味する。生物学的に等価の抗体としては、これだけに限定されないが、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、ペプチド、抗体断片、抗体バリアント、抗体誘導体および抗体模倣体が挙げられる。

【0088】

「膜貫通ドメイン」は、細胞膜にまたがり、細胞外ドメインとシグナル伝達ドメインを連結するように機能し得ることが公知の任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。膜貫通ドメインは、天然の供給源に由来するものであっても合成供給源に由来するものであってもよい。供給源が天然のものである場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来するものであってよい。本開示において特に使用される膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、およびＴＣＲに由来するものであり得る。あるいは、膜貫通ドメインは合成されたものであってもよく、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基が主に含まれる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に見いだされることが好ましい。必要に応じて、２アミノ酸から１０アミノ酸の間の長さであることが好ましい短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーにより、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質内シグナル伝達ドメインの連結が形成され得る。グリシン－セリンダブレットにより、特に適切なリンカーがもたらされる。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0089】

本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８膜貫通ドメイン」という用語は、この名称を伴う特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＣＤ２８膜貫通ドメイン配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿００６７１２８６２．２およびＸＭ＿００９４４４０５６．１を伴う断片配列により、ＣＤ２８膜貫通ドメインの配列の追加的な非限定的な例がもたらされる。列挙されている受託番号のそれぞれを伴う配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号６またはその等価物を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。さらなる実施形態では、配列番号６の等価物は、配列番号６と比較して１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１、または１２、または１３、または１４、または１５、またはそれよりも多くの突然変異を含み得るが、それでもなお、配列番号６と同様に、細胞膜にまたがり、細胞外ドメインとシグナル伝達ドメインを連結するように機能し得る。

【0090】

「細胞内ドメイン」、「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「細胞質ドメイン」は、細胞においてシグナルを伝えて生物学的プロセスの活性化または阻害を引き起こすドメインとして機能することが公知の任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが置かれた免疫細胞の従来のエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、免疫細胞を、その特定の機能を発揮するように方向付けるタンパク質の一部を指す。シグナル伝達ドメイン全体を使用することもでき、その短縮された部分がエフェクター機能シグナルの伝達のために十分である限りは、短縮された部分を使用することもできる。ＴＣＲおよび補助受容体ならびにその誘導体またはバリアントの細胞質配列が、ＣＡＲに使用するための細胞内シグナル伝達ドメインとして機能し得る。本開示において特に使用される細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲ、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものであり得る。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ（すなわち、ＣＤ３ゼータ）シグナル伝達ドメインを含み得る、あるいはそれから本質的になり得る、またはそれからさらになり得る。

【0091】

本明細書で使用される場合、「ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン」または「ＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、この名称を伴う特定のタンパク質断片、および、本明細書で示されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。一部の実施形態では、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、

【化13】

またはその等価物を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。さらなる実施形態では、配列番号８の等価物は、配列番号８と比較して１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１、または１２、または１３、または１４、または１５、またはそれよりも多くの突然変異を含み得るが、それでもなお、配列番号８と同様に、エフェクター機能シグナルを伝達し、免疫細胞を、特定の機能を発揮するように方向付けることが可能である。そのような伝達を評価する、例示される方法は、例えば、Bridgeman JS, et al. Clin Exp Immunol. 2014 Feb；175 (2): 258-67において見いだすことができる。

【0092】

ＴＣＲによって生成されたシグナルは単独ではＴ細胞の完全な活性化のために不十分であるので、二次または共刺激シグナルも必要になり得る。したがって、これだけに限定されないが、タンパク質ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ３、４Ｂ２、Ｂ７－Ｈ３、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球性活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドの細胞内ドメインを含めた、共刺激シグナル伝達分子（本明細書では共刺激ドメインまたは共刺激シグナル伝達ドメインまたは共刺激シグナル伝達領域とも称される）の細胞内領域もＣＡＲの細胞質ドメインに含めることができ、本明細書では、共刺激シグナル伝達ドメインと称される。ある特定の実施形態では、細胞内ドメインは、一次シグナル伝達ドメインに加えて、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る、あるいはそれから本質的になり得る、またはその上さらに含み得る。例えば、ＣＡＲは、シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）に加えて、１つ、２つまたはそれよりも多くの共刺激ドメインを含み得る。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域、４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域またはＯＸ４０共刺激領域から選択される１つまたは複数または２つまたはそれよりも多くの共刺激領域をさらに含む。

【0093】

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞活性化部分（例えば、細胞質内領域）は、ＣＤ８タンパク質、ＣＤ２８タンパク質、４－１ＢＢタンパク質、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ３－ゼータタンパク質からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質またはその断片を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる、Ｔ細胞またはＮＫ細胞シグナル伝達ドメインである。

【0094】

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞活性化部分（例えば、細胞質内領域）は、ＣＤ８タンパク質、ＣＤ２８タンパク質、４－１ＢＢタンパク質、およびＣＤ３ゼータタンパク質からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質またはその断片を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる、Ｔ細胞またはＮＫ細胞シグナル伝達ドメインである。

【0095】

本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域」または「ＣＤ２８共刺激ドメイン」という用語は、この名称を伴う特定のタンパク質断片、および、本明細書に示されるＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの配列の例は、米国特許第５，６８６，２８１号；Geiger, T.L. et al., Blood 98: 2364-2371 (2001) ；Hombach, A. et al., J Immunol 167: 6123-6131 (2001) ；Maher, J. et al. Nat Biotechnol 20: 70-75 (2002) ；Haynes, N.M. et al., J Immunol 169: 5780-5786 (2002) ；Haynes, N.M. et al., Blood 100: 3155-3163 (2002)に提示されている。一部の実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号７またはその等価物を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。さらなる実施形態では、配列番号７の等価物は、配列番号７と比較して１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１、または１２、または１３、または１４、または１５、またはそれよりも多くの突然変異を含み得るが、それでもなお、配列番号７と同様に、免疫細胞を刺激してその特定の機能を発揮させることが可能である。

【0096】

シグナルペプチド（時にはシグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、輸送ペプチド、リーダー配列またはリーダーペプチドと称される）は、分泌経路に向かうよう運命づけられた新たに合成されるタンパク質の大多数のＮ末端に存在する短いペプチド（通常１６～３０アミノ酸長）である。これらの合成されたタンパク質は、ある特定の細胞小器官（小胞体、ゴルジまたはエンドソーム）の内部に存在するように、細胞から分泌されるように、または大多数の細胞膜に挿入されるように方向づけられる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるシグナルペプチドにより、タンパク質が細胞膜に発現されるように方向付けられる。

【0097】

キメラ抗原受容体は、必要に応じて、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間のリンカーとしての機能を果たす「ヒンジドメイン」を含み得る。

【0098】

スペーサードメイン（本明細書ではスペーサーまたはヒンジまたはヒンジドメインとも称される）は、結合ユニットと膜貫通ドメインを分離する、ＣＡＲの細胞外の構造的領域である。これらのスペーサーにより、一般に、効率的なＣＡＲ発現および活性のための安定性が供給される。そのようなドメインは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭまたはそのバリアントなどの任意の免疫グロブリンのヒトＦｃドメイン、ＣＨ３ドメインまたはヒンジ領域の一部を含み得る、またはそれから本質的になり得る、またはその上さらにそれからなり得る。例えば、一部の実施形態は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、および／またはＮ２９７Ｑ突然変異（Ｋａｂａｔ番号付けに従って）を伴うまたは伴わないＩｇＧ４ヒンジを含み得る。追加的なスペーサーとしては、これだけに限定されないが、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２８ヒンジ領域が挙げられる。ヒンジドメインは、天然の供給源に由来するものであってもよく、合成供給源に由来するものであってもよい。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４などの表面抗原分類タンパク質に由来するものである。一実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインである。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭなどの免疫グロブリンに由来するものである。一実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ１ヒンジドメインである。さらなる実施形態では、ＩｇＧ１ヒンジドメインは、ＬＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＤＰＫＧＴ（配列番号５）またはその等価物を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、配列番号５の等価物は、配列番号５と比較して１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１、または１２、または１３、または１４、または１５、またはそれよりも多くの突然変異を含むが、それでもなお、配列番号５と同様に、効率的なＣＡＲ発現および活性のための安定性を実質的に維持することが可能である。

【0099】

細胞表面に発現されるタンパク質を、本明細書に開示されるＣＡＲを発現する細胞のマーカーとして、または本明細書に開示されるＣＡＲを発現する細胞の自殺スイッチをもたらすために使用することができる。そのようなタンパク質の細胞質内領域の一部または全部は、通常、タンパク質のネイティブな機能が低下するかまたはさらには消失するように、短縮される。したがって、そのようなタンパク質は、本明細書では、短縮型タンパク質マーカーと称される。一部の実施形態では、短縮型タンパク質マーカーは、ＣＡＲを発現する細胞の自殺スイッチとして使用される場合、対象において発現されないかまたは正常な細胞またはＣＡＲを発現する細胞に隣接する正常な細胞よりも実質的に低いレベルで発現される。したがって、ＣＡＲを発現する細胞を（例えば、短縮型タンパク質マーカーを特別に認識し、それに結合する中和抗体を投与することによって、または部分とコンジュゲートした毒素を投与し、それにより毒素を短縮型タンパク質マーカーに方向づけることによって）除去する際に、対象の正常な細胞は危険にさらされない。

【0100】

一部の実施形態では、本明細書における開示は、ある特定の短縮型タンパク質マーカー（例えば、短縮型ＣＤ１９または短縮型ＥＧＦＲ）が他のマーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など）と比較してより高い率で発現されることを示す。図４Ｂと図４Ａとを参照されたい。したがって、さらなる実施形態では、これらの短縮型タンパク質マーカーが、本明細書に開示されるＣＡＲを発現する細胞への使用に特に適する。

【0101】

そのような適切な短縮型タンパク質マーカーの１つは、短縮型ＣＤ１９である。本明細書で使用される場合、「ＣＤ１９」および「Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９」という用語は、互換的に使用され、ヒトにおいて遺伝子ＣＤ１９によってコードされる膜貫通タンパク質であることが公知のタンパク質を指す。ヒトでは、ＣＤ１９は、形質細胞以外の全てのＢ系列細胞において、および濾胞樹状細胞において発現される。このタンパク質または基礎をなす遺伝子の非限定的な例示的な配列は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ１６ＰＯ２８９４３、ＨＧＮＣ：１６３３、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：９３０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１７７４５５、ＯＭＩＭ：１０７２６５、およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１５３９１の下に見いだされ得る。例示的な短縮型ＣＤ１９は本明細書に提示され、

【化14】

を含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。別の例示的な短縮型ＣＤ１９は本明細書に提示され、

【化15】

を含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。あるいは、配列番号１３または１１の等価物、例えば、配列番号１３もしくは１１と比較して１、もしくは２、もしくは３、もしくは４、もしくは５、もしくは６、もしくは７、もしくは８、もしくは９、もしくは１０、もしくは１１、もしくは１２、もしくは１３、もしくは１４、もしくは１５、もしくはそれよりも多くの突然変異を含むもの、または配列番号１３もしくは１１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一のものを使用することができる。さらなる実施形態では、配列番号１３または１１の等価物は、それでもなお、ＣＤ１９を特異的に認識し、それに結合する抗体またはその抗原結合性断片などの部分が認識し、結合することが可能なものである。なおさらなる実施形態では、配列番号１３または１１の等価物では、野生型ＣＤ１９と同じようには、等価物を発現する細胞が機能を発揮するように方向付けられない。一部の実施形態では、配列番号１１をコードするポリヌクレオチドは、

【化16】

を含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0102】

別の適切な短縮型タンパク質マーカーは、短縮型ＥＧＦＲである。本明細書で使用される場合、「ＥＧＦＲ」および「上皮増殖因子受容体」という用語は、互換的に使用され、ヒトにおいて遺伝子ＥＧＦＲによってコードされる膜貫通タンパク質であることが公知のタンパク質を指す。このタンパク質または基礎をなす遺伝子の非限定的な例示的な配列は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ０７Ｐ０５５０１９、ＨＧＮＣ：３２３６、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１９５６、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１４６６４８、ＯＭＩＭ（登録商標）：１３１５５０、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ００５３３の下に見いだされ得る。例示的な短縮型ＥＧＦＲは本明細書に提示され、

【化17】

を含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。あるいは、配列番号１０の等価物、例えば、配列番号１０と比較して１、もしくは２、もしくは３、もしくは４、もしくは５、もしくは６、もしくは７、もしくは８、もしくは９、もしくは１０、もしくは１１、もしくは１２、もしくは１３、もしくは１４、もしくは１５、もしくはそれよりも多くの突然変異を含むもの、または配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一のものを使用することができる。さらなる実施形態では、配列番号１０の等価物は、それでもなお、ＥＧＦＲを特異的に認識し、それに結合する抗体またはその抗原結合性断片などの部分が認識し、結合することが可能なものである。なおさらなる実施形態では、配列番号１０の等価物では、野生型ＥＧＦＲと同じようには、等価物を発現する細胞が機能を発揮するように方向付けられない。

【0103】

本明細書で使用される場合、リボソームスキップ配列は、切断可能なペプチドまたは切断可能なリンカーとも称され、例えば、酵素、または細胞におけるタンパク質の翻訳の間にリボソームスキッピングを誘導し得るペプチド、またはその両方によって切断することができるペプチドを意味する。そのような切断可能なペプチドを含む１つの翻訳されたポリペプチドから２つの最終産物を生じさせることができ、したがって、１つのオープンリーディングフレームから１つよりも多くのポリペプチドを発現させることが可能になる。したがって、本明細書に開示される通り、リボソームスキップ配列を使用して、ＣＡＲおよび短縮型タンパク質マーカーを細胞に発現させることができる。あるいは、他の方法を使用して、例えば、ＣＡＲコード配列、短縮型タンパク質マーカーコード配列、それらの間に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む核酸分子によって、そのような同時発現を実現することができる。

【0104】

切断可能なペプチドの１つの例は、２Ａ自己切断性ペプチドなどの自己切断性ペプチドである。２Ａ自己切断性ペプチドは、１８～２２アミノ酸長ペプチドのひとつのクラスであり、細胞における組換えタンパク質の切断を誘導し得る。一部の実施形態では、２Ａ自己切断性ペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２ＡおよびＢｍＣＰＶ２Ａから選択される。例えば、２０１５年１１月５日に公開されたWang Y, et al. 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori. Sci Rep. 2015;5:16273.を参照されたい。

【0105】

本明細書で使用される場合、「Ｔ２Ａ」および「２Ａペプチド」という用語は互換的に使用され、任意の２Ａペプチドもしくはその断片、任意の２Ａ様ペプチドもしくはその断片、または、コンセンサスポリペプチドモチーフＤ－Ｖ／Ｉ－Ｅ－Ｘ－Ｎ－Ｐ－Ｇ－Ｐ（配列番号２９）（配列中、Ｘは、一般に自己切断性であると考えらえる任意のアミノ酸を指す）を含有する比較的短いペプチド配列（起源ウイルスに応じておよそ２０アミノ酸長）内に必要なアミノ酸を含む人工ペプチドを指す。

【0106】

「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」という用語は、本明細書で使用される場合、互換的に、リボソームの結合およびｍＲＮＡの翻訳を直接促進し、それにより、キャップ非依存的な翻訳の開始を可能にするポリヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）上のＲＮＡ配列を指す。それに加えて、またはその代わりに、ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳ ＲＮＡ配列に対して相補的または逆向きである、または相補的であり逆向きのポリヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはそれらのハイブリッドなど）も指す。ＩＲＥＳの非限定的な例は、Hellen CU and Sarnow P. Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules. Genes Dev. 2001 Jul 1;15(13):1593-612に見いだすことができる。

【0107】

「検出可能な標識」、「標識」、「検出可能なマーカー」または「マーカー」は、互換的に使用され、これだけに限定されないが、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含めたタンパク質を含む。検出可能な標識を本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体または組成物に付着させることもできる。

【0108】

本明細書で使用される場合、「標識」または検出可能な標識という用語は、「標識された」組成物を生成するために、検出されるべき組成物と直接的または間接的にコンジュゲートされる直接的または間接的に検出可能な化合物または組成物、例えば、Ｎ末端ヒスチジンタグ（Ｎ－Ｈｉｓ）、磁気的に活性な同位元素、例えば、^１１５Ｓｎ、^１１７Ｓｎおよび^１１９Ｓｎ、非放射性同位元素、例えば、^１３Ｃおよび^１５Ｎなど、ポリヌクレオチドまたはタンパク質、例えば、抗体などを意図している。この用語はまた、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの、挿入配列が発現されるとシグナルをもたらす、ポリヌクレオチドとコンジュゲートした配列も包含する。標識は、それ自体が検出可能な場合もあり（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、酵素標識の場合では、基質化合物または組成物の検出可能な化学的変質が触媒され得る。標識は、小規模検出に適するものであり得る、またはハイスループットスクリーニングにより適したものであり得る。したがって、適切な標識としては、これだけに限定されないが、磁気的に活性な同位元素、非放射性同位元素、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含めたタンパク質が挙げられる。標識を単に検出することもでき、数量化することもできる。単に検出される応答は、一般に、その存在がただ単に確認される応答を含み、一方、数量化される応答は、一般に、強度、極性化または他の特性などの数量化可能な（例えば、数値的に報告可能な）値を有する応答を含む。発光または蛍光アッセイでは、結合に実際に関与するアッセイの構成成分と結び付けた発光団またはフルオロフォアを使用して、または別の（例えば、レポーターもしくはインジケーター）構成成分と結び付けた発光団またはフルオロフォアを間接的に使用して、検出可能な応答を直接生じさせることができる。シグナルを生じる発光標識の例としては、これだけに限定されないが、生物発光および化学発光が挙げられる。検出可能な発光応答は、一般に、発光シグナルの変化または存在を含む。発光標識アッセイ構成成分のための適切な方法および発光団は当技術分野で公知であり、例えば、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed)に記載されている。発光プローブの例としては、これだけに限定されないが、エクオリンおよびルシフェラーゼが挙げられる。

【0109】

本明細書で使用される場合、「免疫コンジュゲート」という用語は、第２の作用剤、例えば、細胞傷害剤、検出可能な作用剤、放射性作用剤、標的化剤、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、半合成抗体または多重特異性抗体などと結び付いたまたは連結した抗体または抗体誘導体を含む。

【0110】

適切な蛍光標識の例としては、これだけに限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル－クマリン、ピレン、Ｍａｌａｃｉｔｅ ｇｒｅｅｎ、スチルベン、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、ＣＡＳＣＡＤＥ ＢＬＵＥ（商標）、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄが挙げられる。他の適切な光学的色素は、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)に記載されている。

【0111】

一部の実施形態では、蛍光標識を官能化して、細胞表面マーカーなどの細胞または組織内またはその表面に存在する細胞構成成分への共有結合による付着を容易にする。適切な官能基としては、これだけに限定されないが、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステル、およびスルホニルハロゲン化物が挙げられ、これらは全て、蛍光標識を第２の分子に付着させるために使用することができる。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、作用剤、マーカーまたは第２の標識剤のいずれかの付着部位に依存する。

【0112】

本明細書で使用される場合、精製用標識またはマーカーとは、例えば、エピトープタグ（これだけに限定されないが、Ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグを含む）、アフィニティータグ（これだけに限定されないが、グルタチオン－Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ－ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、カルモジュリン結合性タンパク質（ＣＢＰ）もしくはマルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）を含む）または蛍光タグなどの、標識とコンジュゲートした分子または構成成分の精製に使用することができる標識を指す。

【0113】

ポリペプチドまたはそのそれぞれの等価物は、カルボキシ末端において後ろに追加的な５０アミノ酸、あるいは約４０アミノ酸、あるいは約３０アミノ酸、あるいは約２０アミノ酸、あるいは約１０アミノ酸、あるいは約５アミノ酸、あるいは約４、または３、または２、または１アミノ酸を有し得る。

【0114】

本明細書において例示されている各ＣＡＲ構成成分のさらなる実施形態は、例示される構成成分と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有し、類似の生物学的機能を有する他のタンパク質を含む。

【0115】

明示的な列挙を伴わずに、また別段の意図がない限り、本開示がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関する場合、それらの等価物または生物学的に等価物が本開示の範囲内に入ることが意図されていることが暗示される。本明細書で使用される場合、「その生物学的等価物」という用語は、参照タンパク質、抗体、ポリペプチドまたは核酸について言及する場合、「その等価物」と同義であることが意図されており、最小の相同性を有する一方で、所望の構造または機能性を依然として維持するものが意図されている。本明細書で特に記載されていなければ、本明細書で言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質には、その等価物も包含されることが企図されている。例えば、等価物は、少なくとも約７０％の相同性または同一性、または少なくとも８０％の相同性または同一性、あるいは少なくとも約８５％あるいは少なくとも約９０％あるいは少なくとも約９５％あるいは９８％のパーセント相同性または同一性が意図されており、参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と実質的に等価の生物活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドについて言及する場合、その等価物は、参照ポリヌクレオチドまたはその相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。

【0116】

別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、アラインメントした場合に、２つの配列を比較して塩基（または残基）のパーセンテージが同じであることを意味する。アラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1に記載されているものを使用して決定することができる。デフォルトパラメータをアラインメントに使用することが好ましい。好ましいアラインメントプログラムはＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメータを使用する。特に、好ましいプログラムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰであり、以下のデフォルトパラメータを使用する：Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLASTにおいて見いだすことができる。別の好ましいアラインメントプログラムは、www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/において利用可能なＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａまたはwww.ebi.ac.uk/Tools/psa/において利用可能なペアワイズ配列アラインメントであり、デフォルトパラメータを使用する。

【0117】

本明細書で使用される場合、細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。さらなる実施形態では、細胞は免疫細胞である。

【0118】

「宿主細胞」は、特定の対象の細胞だけでなく、そのような細胞の後代または潜在的な後代も指す。次の世代では突然変異または環境の影響のいずれかに起因してある特定の改変が生じ得るので、そのような後代は、実際には、親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも、本明細書で使用されるこの用語の範囲に含まれる。

【0119】

「培養すること（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて、様々な種類の培地上または培地中で細胞または生物体を増殖させること（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）を指す。培養下で成長させた細胞の後裔は、親細胞と完全には同一でない（すなわち、形態学的に、遺伝学的にまたは表現型的に）可能性があることが理解される。

【0120】

「免疫細胞」には、例えば、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、例えば、顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球）、単球、およびリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＮＫＴ細胞））、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）など、ならびに骨髄系由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。一部の実施形態では、免疫細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する。さらなる実施形態では、ＨＳＣは骨髄で産生される。なおさらなる実施形態では、ＨＳＣは、臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）から単離される。他の実施形態では、ＨＳＣは、末梢血から単離される。一部の実施形態では、免疫細胞は、以下のうちの１つまたは複数に由来する：前駆細胞、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来細胞、胚性生殖細胞、胚性生殖細胞由来細胞、幹細胞、幹細胞由来細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）または不死化細胞。一部の実施形態では、ＨＳＣは、対象の臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、対象の末梢血または対象の骨髄に由来する。

【0121】

一部の実施形態では、免疫細胞は、セントラルメモリーＴ細胞、ＮＫ細胞、ネイティブなメモリーＴ細胞、汎Ｔ細胞、またはこれらの任意の組合せを指す。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ２５＋細胞およびＣＤ１４＋細胞が実質的に枯渇した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を指す。

【0122】

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」という用語は、胸腺において成熟するリンパ球の型を指す。Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫において重要な役割を果たし、細胞表面上にＴ細胞受容体が存在することにより、Ｂ細胞などの他のリンパ球と区別される。Ｔ細胞は、単離することもでき、商業的に入手可能な供給源から得ることもできる。「Ｔ細胞」は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびガンマ－デルタＴ細胞を含めた、ＣＤ３を発現する免疫細胞の全ての型を包含する。「細胞傷害性細胞」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球を包含し、これらの細胞は、細胞傷害性応答を媒介することが可能である。市販のＴ細胞株の非限定的な例としては、以下の株、ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９０１（商標））、ＢＣＬ２ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２８９９（商標））、Ｎｅｏ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２８９８（商標））、ＴＡＬＬ－１０４細胞傷害性ヒトＴ細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１１３８６）が挙げられる。さらなる例としては、これだけに限定されないが、成熟Ｔ細胞株、例えば、Ｄｅｇｌｉｓ、ＥＢＴ－８、ＨＰＢ－ＭＬｐ－Ｗ、ＨＵＴ ７８、ＨＵＴ １０２、Ｋａｒｐａｓ ３８４、Ｋｉ ２２５、Ｍｙ－Ｌａ、Ｓｅ－Ａｘ、ＳＫＷ－３、ＳＭＺ－１およびＴ３４など；ならびに未成熟Ｔ細胞株、例えば、ＡＬＬ－ＳＩＬ、Ｂｅ１３、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＣＭＬ－Ｔ１、ＤＮＤ－４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ－９、ＨＤ－Ｍａｒ、ＨＰＢ－ＡＬＬ、Ｈ－ＳＢ２、ＨＴ－１、ＪＫ－Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ ４５、ＫＥ－３７、ＫＯＰＴ－Ｋ１、Ｋ－Ｔ１、Ｌ－ＫＡＷ、Ｌｏｕｃｙ、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ－１、ＭＯＬＴ ３、ＭＯＬＴ－４、ＭＯＬＴ １３、ＭＯＬＴ－１６、ＭＴ－１、ＭＴ－ＡＬＬ、Ｐ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｐｅｅｒ、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ－２５５、ＰＦ－３８２、ＰＦＩ－２８５、ＲＰＭＩ－８４０２、ＳＴ－４、ＳＵＰ－Ｔ１～Ｔ１４、ＴＡＬＬ－１、ＴＡＬＬ－１０１、ＴＡＬＬ－１０３／２、ＴＡＬＬ－１０４、ＴＡＬＬ－１０５、ＴＡＬＬ－１０６、ＴＡＬＬ－１０７、ＴＡＬＬ－１９７、ＴＫ－６、ＴＬＢＲ－１、－２、－３、および－４、ＣＣＲＦ－ＨＳＢ－２（ＣＣＬ－１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６３）、ＲＳ４；１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１８７３）、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（ＡＴＣＣ ＣＲＭ－ＣＣＬ－１１９）；および皮膚Ｔ細胞リンパ腫株、例えば、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ ＣＲＭ－ＴＩＢ－１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１６２）が挙げられる。これだけに限定されないが、ＲＥＨ、ＮＡＬＬ－１、ＫＭ－３、Ｌ９２－２２１を含めたヌル白血病細胞株が別の商業的に入手可能な免疫細胞の供給源であり、他の白血病およびリンパ腫に由来する細胞株、例えば、Ｋ５６２赤白血病、ＴＨＰ－１単球性白血病、Ｕ９３７リンパ腫、ＨＥＬ赤白血病、ＨＬ６０白血病、ＨＭＣ－１白血病、ＫＧ－１白血病、Ｕ２６６骨髄腫も同様である。そのような市販の細胞株の非限定的な例示的な供給源としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＡＴＣＣ（www.atcc.org/）およびＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（www.dsmz.de/）が挙げられる。

【0123】

本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞」という用語は、ナチュラルキラー細胞としても公知であり、骨髄に由来し、自然免疫系において極めて重要な役割を果たすリンパ球の型を指す。ＮＫ細胞は、細胞表面の抗体および主要組織適合性遺伝子複合体の非存在下であっても、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞または他のストレスを受けている細胞に対する迅速な免疫応答をもたらす。ＮＫ細胞は、単離することもでき、商業的に入手可能な供給源から得ることもできる。商業的なＮＫ細胞株の非限定的な例としては、以下の株、ＮＫ－９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０７（商標））、ＮＫ－９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０８（商標））が挙げられる。さらなる例としては、これだけに限定されないが、ＮＫ株であるＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ－１、ＮＫＬ、ＮＫ－ＹＳ、ＮＯＩ－９０、およびＹＴが挙げられる。そのような市販の細胞株の非限定的な例示的な供給源としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＡＴＣＣ（www.atcc.org/）およびＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（www.dsmz.de/）が挙げられる。

【0124】

「幹細胞」という用語は、未分化の状態または部分的に分化した状態にあり、自己再生する能力または分化した後代を生成する能力またはその両方を有する細胞を指す。自己再生は、幹細胞の、増殖してそのような幹細胞をより多く生じさせると同時に、その発生の潜在性（すなわち、全能性、多能性、多分化能など）を維持する能力と定義される。「体性幹細胞」という用語は、本明細書では、胎児組織、若年組織、および成体組織を含めた非胚組織に由来する任意の幹細胞を指すために使用される。天然の体性幹細胞が、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋、および心筋を含めた多種多様な成体組織から単離されている。例示的な天然に存在する体性幹細胞としては、これだけに限定されないが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および神経または神経幹細胞（ＮＳＣ）が挙げられる。一部の実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。一部の実施形態では、幹細胞または前駆細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」は、初期胚組織（例えば、胚盤胞など）、胚組織または胎児組織を含めた、妊娠期間中の任意の時点、必ずしもではないが一般にはおよそ妊娠１０～１２週よりも前に取得され、受精後であるが妊娠期間終了前に形成される組織に由来する幹細胞を指す。胚性幹細胞は初期胚または胚盤胞に由来する多能性細胞である頻度が最も高い。胚性幹細胞は、これだけに限定されないが、ヒト組織を含めた適切な組織から直接得ることもでき、樹立された胚細胞株から得ることもできる。「胚様幹細胞」は、胚性幹細胞の特徴の全てではないが１つまたは複数を共有する細胞を指す。

【0125】

「分化」は、それによって、特殊化されていない細胞が心細胞、肝細胞、免疫細胞または筋肉細胞などの特殊化した細胞の特色を獲得するプロセスを記載する。「定方向分化」は、特定の細胞型への分化を誘導するための幹細胞培養条件の操作を指す。「脱分化した」により、細胞の系列内の拘束度がより低い位置に戻る細胞が定義される。本明細書で使用される場合、「分化するまたは分化した」という用語により、細胞の系列内で拘束度がより高い（「分化した」）位置をとる細胞が定義される。

【0126】

本明細書で使用される場合、「分化するまたは分化した」という用語により、細胞の系列内の拘束度がより高い（「分化した」）位置をとる細胞が定義される。「脱分化した」により、細胞の系列内の拘束度がより低い位置に戻る細胞が定義される。脱分化した細胞の例は人工多能性幹細胞である。

【0127】

本明細書で使用される場合、細胞の「系列」により、細胞の遺伝、すなわち、その先祖および後代が定義される。細胞の系列により、細胞が発生および分化の遺伝スキーム内に入れられる。

【0128】

「多系列幹細胞」または「多分化能幹細胞」は、それ自体および別個の発生系列由来の少なくとも２つのさらに分化した後代細胞を生じる幹細胞を指す。この系列は同じ胚葉（すなわち、中胚葉、外胚葉または内胚葉）または異なる胚葉に由来し得る。

【0129】

「前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）」または「前駆体細胞」または「前駆細胞」は、特定の細胞型に分化する能力を有する細胞を意味するものとする。前駆細胞は、幹細胞であり得る。前駆細胞はまた、幹細胞よりも特異的なものでもあり得る。前駆細胞は、単能性または多分化能性であり得る。成熟した幹細胞と比較して、前駆細胞は、細胞分化の後期にあり得る。前駆細胞の例としては、これだけに限定することなく、前駆神経細胞が挙げられる。

【0130】

本明細書で使用される場合、「多能性細胞」により、少なくとも２つの別個の（遺伝子型または表現型またはその両方について）さらに分化した後代細胞を生じさせることができる、分化度がより低い細胞が定義される。別の態様では、「多能性細胞」は、１種または複数種の幹細胞特異的な遺伝子の発現を誘導することによって歴史的に作製されている、非多能性細胞、一般には成熟した体細胞から人工的に誘導された幹細胞である人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を包含する。そのような幹細胞特異的な遺伝子としては、これだけに限定されないが、オクタマー転写因子のファミリー、すなわち、Ｏｃｔ－３／４；Ｓｏｘ遺伝子のファミリー、すなわち、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８；Ｋｌｆ遺伝子のファミリー、すなわち、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５；Ｍｙｃ遺伝子のファミリー、すなわち、ｃ－ｍｙｃおよびＬ－ｍｙｃ；Ｎａｎｏｇ遺伝子のファミリー、すなわち、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびＲＥＸ１；またはＬＩＮ２８が挙げられる。ｉＰＳＣの例は、Takahashi et al. (2007) Cell advance online publication 20 November 2007；Takahashi & Yamanaka (2006) Cell 126: 663-76；Okita et al. (2007) Nature 448: 260-262；Yu et al. (2007) Science advance online publication 20 November 2007；およびNakagawa et al. (2007) Nat. Biotechnol. Advance online publication 30 November 2007に記載されている。

【0131】

「人工多能性細胞」は、成熟した細胞から未成熟表現型に再プログラムされる胚様細胞を意図するものである。様々な方法が当技術分野で公知である。例えば、２０１４年２月５日に最後にアクセスしたsciencedaily.com/releases/2014/01/140129184445で入手可能な"A simple new way to induce pluripotency: Acid." Nature, 29 January 2014および米国特許出願公開第２０１０／００４１０５４号。ヒトｉＰＳＣも幹細胞マーカーを発現し、また、３つの胚葉全てに特徴的な細胞を生成することが可能である。

【0132】

「単為発生幹細胞」は、卵の単為発生活性化から生じる幹細胞を指す。単為発生幹細胞を創出する方法は当技術分野で公知である。例えば、Cibelli et al. (2002) Science 295 (5556) : 819およびVrana et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (Suppl. 1）11911-6を参照されたい。

【0133】

本明細書で使用される場合、「多能性遺伝子またはマーカー」という用語は、未成熟または未分化表現型との相関が示されている、発現される遺伝子またはタンパク質、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ－ＭｙｃおよびＬＩＮ－２８を意図するものである。そのようなものを同定する方法は当技術分野で公知であり、そのようなものを同定するためのシステムが、例えば、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されている（ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）Ｍａｐ Ｋｉｔ）。

【0134】

本明細書で使用される場合、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、これだけに限定されないが、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）、赤血球、および血小板を含めた全ての型の血液細胞を生じさせる幹細胞などの細胞である。造血幹細胞は、末梢血および骨髄に見いだすことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される免疫細胞はＨＳＣに由来する。

【0135】

「表現型」という用語は、測定可能であり、集団内の個体のサブセットにおいてのみ発現される個体の形質または特徴の説明を指す。本開示の一部の実施形態では、個体の表現型には、単一細胞、実質的に均一な細胞の集団、分化した細胞の集団、または細胞の集団で構成される組織の表現型が含まれる。

【0136】

一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞の集団は、実質的に均一である。本明細書で使用される場合、「実質的に均一」は、細胞の約５０％よりも多く、あるいは約６０％よりも多く、あるいは７０％よりも多く、あるいは７５％よりも多く、あるいは８０％よりも多く、あるいは８５％よりも多く、あるいは９０％よりも多く、あるいは９５％よりも多くが同じまたは同様の表現型のものである細胞の集団を説明する。表現型は、予め選択された細胞表面マーカーまたは他のマーカーによって決定することができる。

【0137】

「単離された」という用語は、本明細書で使用される場合、他の物質を実質的に含まない分子、生物製剤、細胞性物質、細胞または生体試料を指す。一態様では、「単離された」という用語は、それぞれ、天然の供給源中に存在する他のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官から分離されたＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸、またはタンパク質もしくはポリペプチド（例えば、抗体またはその誘導体）、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官を指す。「単離された」という用語は、組換えＤＮＡ技法によって作製された場合には細胞性物質、ウイルス性物質もしくは培養培地を実質的に含まない、または化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはペプチドも指す。さらに、「単離された核酸」は、断片としては天然に存在せず、天然の状態では見いだされない核酸断片を包含するものとする。「単離された」という用語はまた、本明細書では、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すためにも使用され、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドのどちらも包含するものとする。「単離された」という用語はまた、本明細書では、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すためにも使用され、培養された細胞または組織および工学的に操作された細胞または組織のどちらも包含するものとする。

【0138】

本明細書で使用される場合、「単離された細胞」という用語は、一般に、組織の他の細胞から実質的に分離された細胞を指す。

【0139】

細胞の集団とは、表現型または遺伝子型またはその両方が同一である（クローンの）または同一でない１つよりも多くの細胞の集合を意図するものである。集団は、本明細書に記載の通り、精製されたもの、高度に精製されたもの、実質的に均一のもの、または不均一のものであり得る。

【0140】

「実質的に均一」とは、細胞の約５０％よりも多く、あるいは約６０％よりも多く、あるいは７０％よりも多く、あるいは７５％よりも多く、あるいは８０％よりも多く、あるいは８５％よりも多く、あるいは９０％よりも多く、あるいは、９５％よりも多くが同じまたは同様の表現型のものである細胞の集団を説明する。表現型は、予め選択された細胞表面マーカーまたは他のマーカーによって決定することができる。

【0141】

本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、絶対的な純度を求めるものではなく、相対語として意図されている。したがって、例えば、精製された核酸、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、細胞または他の活性化合物は、タンパク質または他の夾雑物から全体的にまたは部分的に単離されたものである。一般に、本開示の範囲内で使用するための実質的に精製されたペプチド、タンパク質、生物学的複合体、細胞または他の活性化合物は、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、細胞または他の活性化合物を、医薬担体、賦形剤、緩衝剤、吸収促進剤、安定剤、保存剤、アジュバントまたは他の副成分と共に、治療的投与のための完全な医薬製剤として混和または製剤化する前の調製物中に存在する全ての高分子種の８０％よりも多くを構成する。より一般には、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体または他の活性化合物は、他の製剤成分と混和する前の精製された調製物中に存在する全ての高分子種の９０％よりも多く、多くの場合、９５％よりも多くになるように精製される。他の場合では、精製された調製物は、本質的に均一であり得、その場合、他の高分子種は従来の技法によって検出不可能である。

【0142】

一部の実施形態では、「工学的に操作された」または「組換え」という用語は、参照される種の天然に存在するタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、株、野生株または親宿主株において通常見いだされない少なくとも１つの改変を有することを指す。一部の実施形態では、「工学的に操作された」または「組換え」という用語は、人為的な介入によって合成されたものであることを指す。

【0143】

本明細書で使用される場合、「自己」という用語は、細胞に関しては、単離され、同じ対象（レシピエントまたは宿主）に注入し戻される細胞を指す。「同種」は、非自己細胞を指す。

【0144】

本明細書で使用される場合、「組成物」は、本明細書に開示される化合物などの活性作用剤および不活性または活性な担体を指す。担体は、これだけに限定することなく、ビーズもしくは樹脂などの固体、またはリン酸緩衝食塩水などの液体であり得る。

【0145】

「医薬組成物」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける診断または治療的使用に適した組成物を構成する、活性なポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体または細胞と、固体支持体などの不活性または活性な担体の組合せを包含するものとする。

【0146】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、標準の医薬担体、例えば、リン酸緩衝食塩水溶液、水、および、油／水または水／油エマルションなどのエマルション、および種々の型の湿潤剤などのいずれも包含する。組成物はまた、安定剤および保存剤も含み得る。担体、安定剤およびアジュバントの例に関しては、Martin (1975) Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)を参照されたい。

【0147】

「併用（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」投与または処置は、２種の作用剤を、それらの薬理学的効果が同時に現れるように投与することを指す。併用は、同時にまたは実質的に同時に投与することを求めるものではないが、併用にはそのような投与も含まれ得る。そのような追加的な作用剤、例えば、細胞減少療法は本明細書に記載されている。

【0148】

「細胞減少療法」は、本明細書で使用される場合、これだけに限定されないが、化学療法、寒冷療法、および放射線療法を包含する。細胞増殖を減少させるように作用する作用剤は当技術分野で公知であり、広く使用されている。がん細胞を、それらが分裂している時にのみ死滅させる化学療法薬は細胞周期特異的と称される。これらの薬物としては、トポイソメラーゼ阻害剤および代謝拮抗薬を含めたＳ期において作用する作用剤が挙げられる。

【0149】

トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素（トポイソメラーゼＩおよびＩＩ）の作用に干渉する薬物である。化学処置のプロセスの間、トポイソメラーゼ酵素は、複製に必要なＤＮＡの構造の操作を制御し、したがって、細胞周期特異的である。トポイソメラーゼＩ阻害剤の例としては、上に列挙されているカンプトテシン（camptothecan）類似体、イリノテカンおよびトポテカンが挙げられる。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の例としては、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシドが挙げられる。

【0150】

代謝拮抗薬は、通常、正常な代謝基質の類似体であり、多くの場合、染色体複製に関与するプロセスに干渉する。代謝拮抗薬は、周期の極めて特異的な期にある細胞を攻撃する。代謝拮抗薬としては、葉酸アンタゴニスト、例えば、メトトレキセート；ピリミジンアンタゴニスト、例えば、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン（foxuridine）、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン；プリンアンタゴニスト、例えば、６－メルカプトプリンおよび６－チオグアニン；アデノシンデアミナーゼ阻害剤、例えば、クラドリビン、フルダラビン、ネララビンおよびペントスタチン；などが挙げられる。

【0151】

植物アルカロイドは特定の型の植物に由来するものである。ビンカアルカロイドはニチニチソウ植物（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅａ）から作出される。タキサンは、タイヘイヨウイチイ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｙｅｗ）木（イチイ属）の樹皮から作出される。ビンカアルカロイドおよびタキサンは微小管阻害剤としても公知である。ポドフィロトキシンはポドフィルム植物に由来する。カンプトテシン類似体はアジア「カンレンボク（Ｈａｐｐｙ Ｔｒｅｅ）」（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）に由来する。ポドフィロトキシンおよびカンプトテシン類似体はトポイソメラーゼ阻害剤にも分類される。植物アルカロイドは一般に細胞周期特異的である。

【0152】

これらの作用剤の例としては、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビノレルビン；タキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル；ポドフィロトキシン、例えば、エトポシドおよびテニポシド（tenisopide）；ならびにカンプトテシン類似体、例えば、イリノテカンおよびトポテカンが挙げられる。

【0153】

寒冷療法としては、これだけに限定されないが、温度を低下させることを伴う治療、例えば、低体温療法が挙げられる。

【0154】

放射線療法としては、これだけに限定されないが、当技術分野で公知の、放射線、例えば、電離放射線、ＵＶ照射への曝露が挙げられる。例示的な線量としては、これだけに限定されないが、少なくとも約２Ｇｙから約１０Ｇｙ以下までの範囲の電離放射線の線量および／または少なくとも約５Ｊ／ｍ^２から約５０Ｊ／ｍ^２以下までの範囲、通常約１０Ｊ／ｍ^２の紫外線放射の線量が挙げられる。

【0155】

本明細書で使用される場合、併用される治療は、がん細胞におけるＦＬＴ３の発現を増大させる薬物であり得る。一部の実施形態では、薬物は、ＦＬＴ３阻害剤を含む。本明細書で使用される場合、「ＦＬＴ３阻害剤」という用語は、ＦＬＴ３に結合し、その活性を低下させる分子を指す。理論に束縛されずに、そのようなＦＬＴ３阻害剤により細胞における表面ＦＬＴ３発現を増大させることができると考えらえる。ＦＬＴ３阻害剤の非限定的な例としては、ギルテリチニブ（Ａｓｔｅｌｌａｓ、ＣＩＤ ４９８０３３１３）、キザルチニブ（quizaritinib）（Ａｍｂｉｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＩＤ ２４８８９３９２）、ミドスタウリン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＣＩＤ ９８２９５２３）、ソラフェニブ（Ｂａｙｅｒ ａｎｄ Ｏｎｘｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＣＩＤ ２１６２３９）、スニチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ、ＣＩＤ ５３２９１０２）、レスタウルチニブ（lestarutinib）（Ｃｅｐｈａｌｏｎ、ＣＩＤ １２６５６５）、ＦＦ－１０１０１（Ｆｕｉｊｆｉｌｍ）、ドビチニブ（ＮｏｖａｒｔｉｓまたはＯｎｃｏｌｏｇｙ Ｖｅｎｔｕｒｅ、ＣＩＤ ９８８６８０８）、および、これだけに限定されないが塩および水和物などのその等価物、例えば、ギルテリチニブフマル酸塩（ＣＩＤ ７６９７０８１９）、キザルチニブジヒドロクロリド（ＣＩＤ ２５１８４０３５）、ミドスタウリン水和物（ＣＩＤ ７１３１１８５４）、ソラフェニブトシル酸塩（ＣＩＤ ４０６５６３）、ソラフェニブ硫酸塩（ＣＩＤ ８６６７２５１９）、ソラフェニブ臭化水素酸塩（ＣＩＤ ４４５９９９７４）、ソラフェニブ塩酸塩（ＣＩＤ ４４５９９９７５）、スニチニブリンゴ酸塩（ＣＩＤ ６４５６０１５）、レスタウルチニブ水和物（ＣＩＤ ４５１１１９３４）、レスタウルチニブメタノレート（ＣＩＤ １３１７３８５０８）、ドビチニブ乳酸塩（ＣＩＤ ４４１５０６２１）、ドビチニブ二乳酸（ＣＩＤ ６６５５３１５０）が挙げられる。

【0156】

「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすために十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬で投与することができる。そのような送達は、個々の投薬量単位が使用される期間、治療剤の生物学的利用能、投与経路などを含めたいくつかの可変要素に依存する。しかし、任意の特定の対象に対する本明細書に開示される治療剤の特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、化合物の生物学的利用能、投与経路、動物の年齢およびその体重、全体的な健康、性別、動物の食餌、投与時間、排出速度、薬物の組合せ、ならびに処置される特定の障害の重症度ならびに投与の形態を含めた種々の因子に依存することが理解される。一般に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて効果的であることが見いだされた濃度と釣り合った血清中レベルを実現するために効果的である量の化合物を投与することが望まれる。これらの考慮事項、ならびに効果的な製剤および投与手順は当技術分野で周知であり、標準の教本に記載されている。

【0157】

薬物または作用剤の「治療有効量」は、薬理学的反応を得るために十分な量である、薬物または作用剤の量を指す；あるいは、特定の障害または疾患を有する患者に投与した場合に、意図された効果、例えば、患者におけるその特定の障害または疾患の１つまたは複数の顕在化の処置、軽減、好転、緩和または除去をもたらすために十分である薬物または作用剤の量である。治療効果は、必ずしも１回投薬の施行で生じず、一連の投薬の施行後にしか生じない場合がある。したがって、治療有効量は、１回または複数回の投与で投与され得る。

【0158】

本明細書で使用される場合、「接触させること（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」という用語は、２つまたはそれよりも多くの分子または他の実体間の直接的または間接的な結合または相互作用を意味する。直接的な相互作用の特定の例は、結合である。間接的な相互作用の特定の例は、一方の実体が中間分子に作用し、今度はそれが第２の参照実体に作用する場合である。接触させることは、本明細書で使用される場合、溶液中、固相中、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、細胞内およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるものを包含する。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて接触させることは、投与することまたは投与と称され得る。

【0159】

細胞またはベクターまたは他の作用剤およびそれを含有する組成物の「投与」または「送達」は、１回用量で、処置の過程全体を通して連続的にまたは断続的に実施することができる。最も有効な投与の手段および投薬量については、それらを決定する方法が当業者に公知であり、また、治療に使用される組成物、治療の目的、処置される標的細胞、および処置される対象によって変動する。治療にあたる医師または動物の場合では治療にあたる獣医師によって選択される用量レベルおよびパターンを用いて単回または複数回の投与を行うことができる。作用剤の適切な投薬形態（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）および投与方法は当技術分野で公知である。投与経路も決定することができ、最も効果的な投与経路については、それを決定する方法が当業者に公知であり、また、処置のために使用される組成物、処置の目的、処置される対象の健康状態または病期、および標的細胞または組織によって変動する。投与経路の非限定的な例としては、静脈内投与、頭蓋内投与、経口投与、腹腔内注入、経鼻投与、吸入、注射、および局部的適用が挙げられる。一部の実施形態では、投与は、腫瘍内投与または腫瘍微小環境への投与またはその両方である。一部の実施形態では、投与は、ある特定の期間、例えば、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約２４時間またはそれよりも長い期間にわたる注入（例えば、対象の末梢血への注入）である。

【0160】

投与という用語は、これだけに限定することなく、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、脳室内（ＩＣＶ）、くも膜下腔内、大槽内注射もしくは注入、皮下注射または埋め込み）、吸入噴霧、経鼻、膣内、直腸内、舌下、尿道内（例えば、尿道内坐薬）または局部的投与経路（例えば、ゲル、軟膏剤、クリーム剤、エアロゾルなど）による投与を包含するものとし、単独でまたはまとめて、各投与経路に適した従来の無毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、およびビヒクルを含有する適切な投薬量単位製剤への製剤化を行うことができる。本開示は、投与経路、製剤または投薬スケジュールに限定されない。

【0161】

「投与」は、１回用量で、処置の過程全体を通して連続的にまたは断続的に実施することができる。最も有効な投与の手段および投薬量については、それらを決定する方法が当業者に公知であり、また、治療に使用される組成物、治療の目的、処置される標的細胞、および処置される対象によって変動する。治療にあたる医師によって選択される用量レベルおよびパターンを用いて単回または複数回の投与を行うことができる。作用剤の適切な投薬形態および投与方法は当技術分野で公知である。投与経路も決定することができ、最も効果的な投与経路については、それを決定する方法が当業者に公知であり、また、処置のために使用される組成物、処置の目的、処置される対象の健康状態または病期、および標的細胞または組織によって変動する。一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞を１×１０^４～１×１０^１５個またはその間の範囲、例えば、１×１０^７～１×１０^１０個で対象に投与する。一部の実施形態では、投与することまたはその文法上の変形形態は、ある特定の間隔での１回よりも多くの投薬も指す。一部の実施形態では、間隔は、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、１０日間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年またはより長い間隔である。一部の実施形態では、１回用量を１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれよりも多く繰り返す。例えば、本明細書に開示される細胞を対象に週に１回、最大４週間にわたって投与することができる。組成物および治療を他の治療と組み合わせることができ、例えば、リンパ球枯渇化学療法の後に治療の注入（例えば、４回の週１回の注入）を行い、これを１サイクルと定義し、その後、部分奏効または完全奏効が認められるまで追加的なサイクルを行う、あるいは、造血幹細胞移植またはＣＡＲ Ｔ細胞療法などの別のモダリティへの「橋かけ」治療として利用する。

【0162】

本開示の作用剤は、治療のために任意の適切な投与経路によって投与することができる。最適な経路はレシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患によって変動することも理解されよう。

【0163】

本明細書で使用される場合、対象における疾患を「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または対象における疾患の「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、（１）疾患にかかりやすい素因を有するもしくは疾患の症状がまだ示されていない対象において症状もしくは疾患が発生するのを防止すること；（２）疾患を阻害するもしくはその発生を制止すること；または（３）疾患を好転させるもしくは疾患の退縮を引き起こす、または疾患の症状を好転させるもしくは疾患の症状の退縮を引き起こすことを指す。当技術分野において理解されている通り、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、臨床結果を含めた有益なまたは所望の結果を得るための手法である。本技術の目的に関しては、有益なまたは所望の結果には、これだけに限定されないが、検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらず、１つまたは複数の症状の軽減または好転、状態（疾患を含む）の程度の減弱、状態（疾患を含む）の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、状態（疾患を含む）、増悪の遅延または緩徐化、状態（疾患を含む）の好転または緩和、状態および寛解（部分的であるか完全であるかを問わず）のうちの１つまたは複数が含まれ得る。疾患ががんである場合、以下の臨床的エンドポイントが処置の非限定的な例である：腫瘍量の減少、腫瘍成長の緩徐化、より長い全生存、より長い腫瘍増悪までの時間、腫瘍の転移の阻害または転移の減少。一態様では、予防法は処置から除外される。

【0164】

一実施形態では、「疾患」または「障害」という用語は、本明細書で使用される場合、がんまたは腫瘍（これらは互換的に使用される）、そのような疾患を有すると診断された状態、そのような疾患を有する疑いがある状態、またはそのような疾患を有するリスクが高い状態を指す。疾患は、原発性、再発性、不応性または転移性がんであり得る。

【0165】

一部の実施形態では、疾患はがんである。さらなる実施形態では、がんは、白血病またはリンパ腫である。本明細書で使用される場合、「白血病」は、未成熟白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）の異常な増加を特徴とする血液または骨髄のがんである。なおさらなる実施形態では、疾患は、ＦＬＴ３を発現するがん細胞を有するものである。ある特定の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である。急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＡＭＬ）－急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）または急性骨髄芽球性白血病とも称される－の具体的な状態は、骨髄中に蓄積し、正常な血液細胞の産生に干渉する異常な骨髄細胞の急速な成長を特徴とする、骨髄性起源の血液細胞のがんである。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）－急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）または急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）とも称される－の具体的な状態は、正常な健康な血液細胞の欠乏をもたらす悪性未成熟白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）（リンパ芽球）の過剰産生および蓄積を特徴とする白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）のがんである。本明細書で使用される場合、「リンパ腫」は、血液細胞腫瘍、ならびにリンパ節腫大、発熱、大量発汗、意図されたものではない体重減少、そう痒、および常時の疲労感という症状の発生を特徴とする血液のがんである。一部の実施形態では、疾患は、固形腫瘍がんである。非限定的な例としては、組織の肉腫および癌腫、例えば、脳がん、腎がん、乳がん、腺癌、神経がん、肺がん、結腸直腸がんまたは神経膠芽腫（ＧＢＭ）が挙げられる。一部の実施形態では、疾患は、乳がん、黒色腫、カルチノイド、卵巣がん、子宮頸がん、膵がん、結腸直腸がん、前立腺がん、子宮体がん、腎がん、神経膠腫、神経がん、皮膚がん、頭頸部がん、胃がん、肝がん、精巣がん、肺がん、甲状腺がん、リンパ腫、尿路上皮がんまたはwww.proteinatlas.org/ENSG00000122025-FLT3/pathologyもしくはSung Hee Lim et al. Oncotarget. 2017 Jan 10;8 (2): 3237-3245において同定される任意の他のがんから選択される。一部の実施形態では、疾患は、骨髄異形成症候群である。したがって、本明細書において方法および他の開示に記載されるがんという用語は、疾患または骨髄異形成症候群という用語と置き換えることができることが当業者には理解されよう。

【0166】

「に罹患している」という用語は、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語と関連する場合、患者または個体が本明細書に開示される疾患を有すると診断されていることまたはその素因を有することを指す。この患者では特徴的な疾患病状がまだ発生していない。

【0167】

本明細書で使用される場合、「がん」は、対象において異常な制御されない複製を示す細胞が存在することを特徴とする病態であり、一部の態様では、この用語は、「腫瘍」という用語と互換的に使用され得る。「がんまたは腫瘍抗原」という用語は、がん細胞または腫瘍細胞または組織に関連し、その表面に発現されることが公知の抗原を指し、「がんまたは腫瘍を標的とする抗体」という用語は、そのような抗原を標的とする抗体を指す。

【0168】

「許容される」、「効果的な」または「十分な」という用語は、本明細書に開示される任意の構成成分、範囲、投薬形態などの選択について記載するために使用される場合、前記構成成分、範囲、投薬形態などが開示される目的に適するものであることを意図するものである。

【0169】

「第１選択」または「第２選択」または「第３選択」という句は、患者が受ける処置の順序を指す。第１選択治療レジメンは、最初に提供される処置であり、第２選択治療または第３選択治療は、それぞれ第１選択治療の後または第２選択治療の後に提供される。国立がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によると、第１選択治療は「疾患または状態に対する最初の処置」と定義される。がんを有する患者では、一次処置は、外科手術、化学療法、放射線療法またはこれらの治療の組合せであり得る。第１選択治療はまた、当業者には「一次治療および一次処置」と称される。２００８年５月１日に最終アクセスされたwww.cancer.govの国立がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ウェブサイトを参照されたい。一般には、患者は、患者が第１選択治療に対して前向きな臨床的または亜臨床的応答を示さないかまたは第１選択治療を中止したことが原因で、その後の化学療法レジメンを受ける。本明細書に記載の方法および処置は、第１選択治療、第２選択治療、第３選択治療、第４選択治療または第５選択治療として提供することができる。
本開示を実施するための様式

【0170】

本開示では、改善されたＦＬＴ３－ＣＡＲコード配列を有するＣＡＲの生成および抗腫瘍有効性が記載される。改善された配列は、本明細書では最適化された配列とも称され、より高い発現レベルのＣＡＲならびに短縮型タンパク質マーカーを細胞にもたらし、したがって、細胞への形質導入および形質導入された細胞の同定または単離における使用に特に適する。例えば、図４Ｃと図４Ｄとを参照されたい。さらなる実施形態では、最適化された配列が形質導入されたＣＡＲ発現細胞は、腫瘍細胞に対してより高い細胞傷害性を示す。例えば、図５Ａを参照されたい。

【0171】

一態様では、抗ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子が提供される。核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ７７７またはｎｔ１～ｎｔ７７７または全長のポリヌクレオチドまたはその等価物を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0172】

一態様では、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ７７７のポリヌクレオチドもしくはその等価物または配列番号１２のｎｔ５５～ｎｔ７７７のポリヌクレオチドを含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる、抗ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）抗原結合性断片をコードする核酸分子が提供される。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７のポリヌクレオチドもしくは配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７と少なくとも８５％同一であるその等価物を含む、もしくはそれから本質的になる、もしくはその上さらにそれからなる、または配列番号１２のｎｔ１～ｎｔ７７７のポリヌクレオチドを含む。

【0173】

一部の実施形態では、等価物は、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ７７７、またはｎｔ１～ｎｔ７７７、または全長と少なくとも約７５％（これだけに限定されないが、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む）同一である。ただし、一態様では、配列番号１の最適化されたヌクレオチドのうちの少なくとも１つが等価物において保持される。それに加えて、またはその代わりに、等価物は、

【化18】

【化19】

のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ７７７、またはｎｔ１～ｎｔ７７７、または全長のポリヌクレオチドを含み、ここで、小文字は、任意のヌクレオチドを示す（配列番号１２）。一部の実施形態では、小文字は、配列番号１内の対応する位置に位置するヌクレオチドを示す。一部の実施形態では、等価物は、

【化20】

のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ７７７、またはｎｔ１～ｎｔ７７７のポリヌクレオチドを含まない。

【0174】

一部の実施形態では、核酸分子またはその等価物は、ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨ（配列番号１５）に示される軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）をコードするポリヌクレオチド、ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号１６）に示される軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）をコードするポリヌクレオチド、ＱＱＳＮＴＷＰＹＴ（配列番号１７）に示される軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）をコードするポリヌクレオチド、ＳＹＷＭＨ（配列番号１８）に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）をコードするポリヌクレオチド、ＥＩＤＰＳＤＳＹＫＤＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号１９）に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ２）をコードするポリヌクレオチド、およびＡＩＴＴＴＰＦＤＦ（配列番号２０）に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ３）をコードするポリヌクレオチドを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0175】

一部の実施形態では、核酸分子またはその等価物は、

【化21】

の抗体重鎖可変領域および

【化22】

の抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0176】

一部の実施形態では、核酸分子または等価物は、ＦＬＴ３を特異的に認識し、それに結合する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、シグナル配列、スペーサー、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードする。一部の実施形態では、核酸分子または等価物は、シグナルペプチドをコードするポリペプチド、ＦＬＴ３抗原結合性断片をコードするポリペプチド、ヒンジドメインをコードするポリペプチド、膜貫通ドメインをコードするポリペプチド、共刺激シグナル伝達領域をコードするポリペプチド、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリペプチドを含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、核酸分子または等価物は、シグナルペプチドをコードするポリペプチド、ＦＬＴ３抗原結合性断片をコードするポリペプチド、ヒンジドメインをコードするポリペプチド、ＣＤ２８膜貫通ドメインをコードするポリペプチド、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域をコードするポリペプチド、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリペプチドを含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0177】

一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子または等価物は、配列番号２のアミノ酸（ａａ）１９～ａａ２５９のポリペプチドをコードする。さらなる実施形態では、本明細書に開示される核酸分子または等価物は、配列番号２のａａ１～ａａ２５９のポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、核酸分子または等価物は、配列番号２のポリペプチドをコードする。

【0178】

一部の実施形態では、核酸分子は、短縮型ＣＤ１９または短縮型ＥＧＦＲをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。さらなる実施形態では、短縮型ＥＧＦＲは、配列番号１０のポリペプチドを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。なおさらなる実施形態では、短縮型ＣＤ１９は、配列番号１３または１１のポリペプチドを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、短縮型ＣＤ１９をコードする配列番号２８に記載されるポリヌクレオチドまたはその等価物をさらに含む。

【0179】

一部の実施形態では、核酸分子は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと短縮型ＣＤ１９または短縮型ＥＧＦＲをコードするポリヌクレオチドの間に位置するリボソームスキップ配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、核酸分子は、Ｔ２Ａスキップ配列および短縮型ＥＧＦＲまたは短縮型ＣＤ１９をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、核酸分子は、Ｔ２Ａスキップ配列および短縮型ＥＧＦＲをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、核酸分子は、Ｔ２Ａスキップ配列および短縮型ＣＤ１９をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、核酸分子は、Ｔ２Ａスキップ配列および短縮型ＥＧＦＲをコードする配列をさらに含む。

【0180】

一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、配列番号１の等価物を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物は、約５５％～約６０％またはその間の任意のパーセンテージまたは範囲がＧ残基およびＣ残基からなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物は、約５８％がＧ残基およびＣ残基からなる。

【0181】

一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約７０％がＧＣＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のシステイン（Ｃｙｓ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約６０％がＴＧＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のアスパラギン酸（Ａｓｐ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約６０％がＧＡＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のグルタミン酸（Ｇｌｕ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約７５％がＧＡＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約６０％がＴＴＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のグリシン（Ｇｌｙ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約５５％がＧＧＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のグリシン（Ｇｌｙ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約２５％がＧＧＡからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のヒスチジン（Ｈｉｓ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約８０％がＣＡＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のイソロイシン（Ｉｌｅ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約６５％がＡＴＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のリシン（Ｌｙｓ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約７０％がＡＡＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のロイシン（Ｌｅｕ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約６５％がＣＴＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のメチオニン（Ｍｅｔ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約９０％がＡＴＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のアスパラギン（Ａｓｎ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約５５％がＡＡＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のプロリン（Ｐｒｏ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約４０％がＣＣＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のグルタミン（Ｇｌｎ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約９５％がＣＡＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のアルギニン（Ａｒｇ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約２５％がＡＧＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のＡｒｇアミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約２５％がＣＧＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のセリン（Ｓｅｒ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約４０％がＡＧＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のトレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約４５％がＡＣＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のＴｈｒアミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約４０％がＡＣＡからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のバリン（Ｖａｌ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約６５％がＧＴＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のトリプトファン（Ｔｒｐ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約９０％がＴＧＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のチロシン（Ｔｙｒ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約５０％がＴＡＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物内のＴｙｒアミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約４５％がＴＡＴからなる。

【0182】

一部の実施形態では、配列番号１の等価物は、約０％～約１％、必要に応じて約０．４３５％の頻度のＧＣＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．４３５％の頻度のＧＣＡからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．６５２％の頻度のＧＣＴからなるコドン、約３％またはそれよりも高い、必要に応じて約３．９１３％の頻度のＧＣＣからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０．６５２％の頻度のＴＧＴからなるコドン、約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．０８７％の頻度のＴＧＣからなるコドン；約０％～約２％、必要に応じて約１．７３９％の頻度のＧＡＴからなるコドン、約３％またはそれよりも高い、必要に応じて約３．４７８％の頻度のＧＡＣからなるコドン；約２％またはそれよりも高い、必要に応じて約２．８２６％の頻度のＧＡＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．８７０％の頻度のＧＡＡからなるコドン；約０％～約２％、必要に応じて約１．３０４％の頻度のＴＴＴからなるコドン、約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．９５７％の頻度のＴＴＣからなるコドン；約０％～約２％、必要に応じて約１．０８７％の頻度のＧＧＧからなるコドン、約０％～約３％、必要に応じて約２．８２６％の頻度のＧＧＡからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．６５２％の頻度のＧＧＴからなるコドン、約５％またはそれよりも高い、必要に応じて約５．６５２％の頻度のＧＧＣからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０．４３５％の頻度のＣＡＴからなるコドン、約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．９５７％の頻度のＣＡＣからなるコドン；約０％の頻度のＡＴＡからなるコドン、約０％～約２％、必要に応じて約１．０８７％の頻度のＡＴＴからなるコドン、約２％またはそれよりも高い、必要に応じて約２．１７４％の頻度のＡＴＣからなるコドン；約３％またはそれよりも高い、必要に応じて約３．９１３％の頻度のＡＡＧからなるコドン、約０％～約２％、必要に応じて約１．５２２％の頻度のＡＡＡからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０．４３５％の頻度のＴＴＧからなるコドン、約０％の頻度のＴＴＡからなるコドン、約５％またはそれよりも高い、必要に応じて約５．４３５％の頻度のＣＴＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．４３５％の頻度のＣＴＡからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．４３５％の頻度のＣＴＴからなるコドン、約０％～約２％、必要に応じて約１．０８７％の頻度のＣＴＣからなるコドン；約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．９５７％の頻度のＡＴＧからなるコドン；約０％～約２％、必要に応じて約１．０８７％の頻度のＡＡＴからなるコドン、約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．５２２％の頻度のＡＡＣからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０．６５２％の頻度のＣＣＧからなるコドン、約０％～約２％、必要に応じて約１．３０４％の頻度のＣＣＡからなるコドン、約０％～約２％、必要に応じて約１．３０４％の頻度のＣＣＴからなるコドン、約２％またはそれよりも高い、必要に応じて約２．６０９％の頻度のＣＣＣからなるコドン；約４％またはそれよりも高い、必要に応じて約４．７８３％の頻度のＣＡＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．２１７％の頻度のＣＡＡからなるコドン；約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．７３９％の頻度のＡＧＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．８７０％の頻度のＡＧＡからなるコドン、約０％～約２％、必要に応じて約１．３０４％の頻度のＣＧＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．４３５％の頻度のＣＧＡからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．２１７％の頻度のＣＧＴからなるコドン、約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．７３９％の頻度のＣＧＣからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０．８７０％の頻度のＡＧＴからなるコドン、約４％またはそれよりも高い、必要に応じて約４．３４８％の頻度のＡＧＣからなるコドン、約０％の頻度のＴＣＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．２１７％の頻度のＴＣＡからなるコドン、約０％～約３％、必要に応じて約２．８２６％の頻度のＴＣＴからなるコドン、約０％～約３％、必要に応じて約２．６０９％の頻度のＴＣＣからなるコドン；約０％の頻度のＡＣＧからなるコドン、約３％またはそれよりも高い、必要に応じて約３．０４３％の頻度のＡＣＡからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．６５２％の頻度のＡＣＴからなるコドン、約３％またはそれよりも高い、必要に応じて約３．２６１％の頻度のＡＣＣからなるコドン；約３％またはそれよりも高い、必要に応じて約３．４７８％の頻度のＧＴＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．２１７％の頻度のＧＴＡからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．４３５％の頻度のＧＴＴからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．８７０％の頻度のＧＴＣからなるコドン；約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．９５７％の頻度のＴＧＧからなるコドン；約２％またはそれよりも高い、必要に応じて約２．３９１％の頻度のＴＡＴからなるコドン、および約２％またはそれよりも高い、必要に応じて約２．６０９％の頻度のＴＡＣからなるコドンを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0183】

一部の実施形態では、配列番号１の等価物は、下記の表に開示されているコドン頻度またはコドン使用選好を含む。

【表2-1】

【表2-2】

【0184】

一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物は、約５５％～約６０％またはその間の任意のパーセンテージまたは範囲がＧ残基およびＣ残基からなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物は、約５８％がＧ残基およびＣ残基からなる。

【0185】

一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約８０％がＧＣＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のシステイン（Ｃｙｓ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約５０％がＴＧＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のシステイン（Ｃｙｓ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約５０％がＴＧＴからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のアスパラギン酸（Ａｓｐ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約６０％がＧＡＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のグルタミン酸（Ｇｌｕ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約７０％がＧＡＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約５５％がＴＴＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のグリシン（Ｇｌｙ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約６０％がＧＧＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のグリシン（Ｇｌｙ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約３０％がＧＧＡからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のヒスチジン（Ｈｉｓ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約８０％がＣＡＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のイソロイシン（Ｉｌｅ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約８０％がＡＴＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のリシン（Ｌｙｓ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約８０％がＡＡＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のロイシン（Ｌｅｕ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約９０％がＣＴＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のメチオニン（Ｍｅｔ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約９０％がＡＴＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のアスパラギン（Ａｓｎ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約５０％がＡＡＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のアスパラギン（Ａｓｎ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約５０％がＡＡＴからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のプロリン（Ｐｒｏ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約４０％がＣＣＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のグルタミン（Ｇｌｎ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約９０％がＣＡＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のアルギニン（Ａｒｇ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約５０％がＣＧＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のＡｒｇアミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約２０％がＡＧＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のセリン（Ｓｅｒ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約６０％がＡＧＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のトレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約４５％がＡＣＣからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のＴｈｒアミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約４５％がＡＣＡからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のバリン（Ｖａｌ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約７０％がＧＴＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のトリプトファン（Ｔｒｐ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約９０％がＴＧＧからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のチロシン（Ｔｙｒ）アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約６０％がＴＡＴからなる。一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物内のＴｙｒアミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも約３０％がＴＡＴからなる。

【0186】

一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物は、約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＧＣＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＧＣＡからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．７７２％の頻度のＧＣＴからなるコドン、約３％またはそれよりも高い、必要に応じて約３．８６１％の頻度のＧＣＣからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０．７７２％の頻度のＴＧＴまたはＴＧＣからなるコドン、約０．５％またはそれよりも高い、必要に応じて約０．７７２％の頻度のＴＧＴまたはＴＧＣからなるコドン；約０％～約２％、必要に応じて約１．５４４％の頻度のＧＡＴからなるコドン、約３％またはそれよりも高い、必要に応じて約３．０８９％の頻度のＧＡＣからなるコドン；約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．９３１％の頻度のＧＡＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．７７２％の頻度のＧＡＡからなるコドン；約０％～約２％、必要に応じて約１．５４４％の頻度のＴＴＴからなるコドン、約２％またはそれよりも高い、必要に応じて約２．３１７％の頻度のＴＴＣからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０．３８６％の頻度のＧＧＧからなるコドン、約０％～約４％、必要に応じて約３．８６１％の頻度のＧＧＡからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＧＧＴからなるコドン、約７％またはそれよりも高い、必要に応じて約７．７２２％の頻度のＧＧＣからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０．３８６％の頻度のＣＡＴからなるコドン、約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．９３１％の頻度のＣＡＣからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０％の頻度のＡＴＡからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．７７２％の頻度のＡＴＴからなるコドン、約３％またはそれよりも高い、必要に応じて約３．８６１％の頻度のＡＴＣからなるコドン；約３％またはそれよりも高い、必要に応じて約３．４７５％の頻度のＡＡＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．７７２％の頻度のＡＡＡからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＴＴＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＴＴＡからなるコドン、約７％またはそれよりも高い、必要に応じて約７．３３６％の頻度のＣＴＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＣＴＡからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＣＴＴからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＣＴＣからなるコドン；約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．１５８％の頻度のＡＴＧからなるコドン；約０％～約２％、必要に応じて約１．１５８％の頻度のＡＡＣまたはＡＡＴからなるコドン、約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．１５８％の頻度のＡＡＣまたはＡＡＴからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＣＣＧからなるコドン、約０％～約２％、必要に応じて約１．１５８％の頻度のＣＣＡからなるコドン、約０％～約２％、必要に応じて約１．１５８％の頻度のＣＣＴからなるコドン、約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．５４４％の頻度のＣＣＣからなるコドン；約５％またはそれよりも高い、必要に応じて約５．０１９％の頻度のＣＡＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．３８６％の頻度のＣＡＡからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０．７７２％の頻度のＡＧＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＡＧＡからなるコドン、約１％またはそれよりも高い、必要に応じて約１．５４４％の頻度のＣＧＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．３８６％の頻度のＣＧＡからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＣＧＴからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．３８６％の頻度のＣＧＣからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＡＧＴからなるコドン、約６％またはそれよりも高い、必要に応じて約６．１７８％の頻度のＡＧＣからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＴＣＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．３８６％の頻度のＴＣＡからなるコドン、約４％またはそれよりも高い、必要に応じて約４．６３３％の頻度のＴＣＴからなるコドン、約４％またはそれよりも高い、必要に応じて約４．２４７％の頻度のＴＣＣからなるコドン；約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＡＣＧからなるコドン、約４％またはそれよりも高い、必要に応じて約４．２４７％の頻度のＡＣＡからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．３８６％の頻度のＡＣＴからなるコドン、約４％またはそれよりも高い、必要に応じて約４．２４７％の頻度のＡＣＣからなるコドン；約３％またはそれよりも高い、必要に応じて約３．８６１％の頻度のＧＴＧからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．３８６％の頻度のＧＴＡからなるコドン、約０％～約１％、必要に応じて約０．０００％の頻度のＧＴＴからなるコドン、約０％～約２％、必要に応じて約１．１５８％の頻度のＧＴＣからなるコドン；約２％またはそれよりも高い、必要に応じて約２．７０３％の頻度のＴＧＧからなるコドン；約２％またはそれよりも高い、必要に応じて約２．７０３％の頻度のＴＡＴからなるコドン、および約０％～約２％、必要に応じて約１．５４４％の頻度のＴＡＣからなるコドンを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0187】

一部の実施形態では、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ７７７の等価物は、下記の表に開示されているコドン頻度またはコドン使用選好を含む。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【0188】

一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、配列番号１の等価物のｎｔ５５～ｎｔ７７７を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0189】

一部の実施形態では、配列番号１の等価物は、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～４０８を含む。一部の実施形態では、配列番号１の等価物は、配列番号１のｎｔ４５４～ｎｔ７７７を含む。一部の実施形態では、配列番号１の等価物は、配列番号１のｎｔ８４１～ｎｔ９２１を含む。一部の実施形態では、配列番号１の等価物は、配列番号１のｎｔ９２２～ｎｔ１０４４を含む。一部の実施形態では、配列番号１の等価物は、配列番号１のｎｔ１０４５～ｎｔ１３８０を含む。一部の実施形態では、配列番号１の等価物は、配列番号１のｎｔ５５～ｎｔ４０８および配列番号１のｎｔ４５４～ｎｔ７７７を含む。一部の実施形態では、配列番号１の等価物は、配列番号１のｎｔ５５～ｎｔ４０８、配列番号１のｎｔ４５４～ｎｔ７７７、配列番号１のｎｔ８４１～ｎｔ９２１、配列番号１のｎｔ９２２～ｎｔ１０４４、および配列番号１のｎｔ１０４５～ｎｔ１３８０を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号１を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、配列番号１の等価物は、配列番号１のアラインメントされたｎｔ残基で置換された少なくとも１つのｎｔ残基を含む配列番号１４のポリヌクレオチドを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。さらなる実施形態では、置換されたｎｔ残基は、元のｎｔ残基とは異なる。

【0190】

一態様では、ＣＡＲをコードする核酸分子が提供される。一部の実施形態では、核酸分子は、必要な調節配列、例えば、細胞における発現のためのプロモーター、またはエンハンサーをさらに含む。一部の実施形態では、核酸分子は、ＣＡＲの発現を方向づける第１の調節配列をさらに含む。さらなる実施形態では、調節配列は、以下：プロモーター、イントロン、エンハンサーまたはポリアデニル化シグナルのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１アルファプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ＭＭＬＶプロモーターである。さらなる実施形態では、核酸分子は、同じ第１の調節配列または第２の調節配列、例えばプロモーターエレメントなどによって調節され得る短縮型タンパク質マーカーをさらにコードする。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＥＦ１アルファプロモーターを含む。当業者には明らかである通り、プロモーター（複数可）は宿主発現系に対して選択され、宿主および発現ベクターならびに意図された使用によって変動する。一実施形態では、調節配列のいずれか一方または両方を細胞特異的または組織特異的なものにすることができる。

【0191】

本明細書に記載のＣＡＲは当技術分野で公知の任意の手段で作製することができるが、組換えＤＮＡ技法を使用して作製することが好ましい。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸を調製し、都合のよい当技術分野で公知の分子クローニングの標準の技法（ゲノムライブラリースクリーニング、オーバーラップＰＣＲ、プライマー補助ライゲーション、部位特異的突然変異誘発など）によって完全なコード配列にアセンブルすることができる。得られたコード領域を発現ベクターに挿入し、それを使用して適切な発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球、最も好ましくは自己Ｔリンパ球を形質転換することが好ましい。

【0192】

患者から単離された種々のＴ細胞サブセットに対して、ＣＡＲ発現のためのベクターを用いた形質導入を行うことができる。有用なＴ細胞サブセットの１つはセントラルメモリーＴ細胞である。セントラルメモリーＴ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、例えば、ＣＬＩＮＩＭＡＣＳ（登録商標）デバイスを使用して所望の受容体を発現する細胞を免疫磁気により選択することによりＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択することによって単離することができる。セントラルメモリーＴ細胞について富化した細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化し、例えば、ＣＡＲの発現を方向づけるレンチウイルスベクターならびにｉｎ ｖｉｖｏ検出、除去、および潜在的なｅｘ ｖｉｖｏ選択のための非免疫原性表面マーカーを用いて形質導入することができる。活性化／遺伝子改変されたＣＡＲ Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＩＬ－２／ＩＬ－１５を用いて増大させ、次いで、凍結保存することができる。ＣＡＲ Ｔ細胞の調製の追加的な方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３３９２に見いだすことができる。

【0193】

一部の実施形態では、ＦＬＴ３ ＣＤＲドメインアミノ酸配列のさらなる非限定的な例は、米国特許第１０，９６１，３１２号、ＷＯ２０２０／０１０２８４、米国特許出願第ＵＳ２０１８０３４６６０１号の表１～４、米国特許出願第ＵＳ２０１８００３７６５７号の表Ｖ、米国特許出願第ＵＳ２０１７００３７１４９号の表１０、米国特許出願第ＵＳ２０１６０２７２７１６号の表Ｖ、米国特許出願第ＵＳ２０１１００９１４７０号の表１～３および米国特許出願第ＵＳ２００９０２９７５２９号の表１～３に記載されている。ＦＬＴ３重鎖可変領域および軽鎖可変領域アミノ酸配列の非限定的な例は、米国特許第１０，９６１，３１２号、ＷＯ２０２０／０１０２８４、米国特許出願第ＵＳ２０１８０３４６６０１号の表１および３、米国特許出願第ＵＳ２０１８００３７６５７号の表Ｘ、米国特許出願第ＵＳ２０１７００３７１４９号の表１０および米国特許出願第ＵＳ２０１６０２７２７１６号の表ＶＩＩに記載されている。

【0194】

一態様では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる膜貫通ドメインをさらにコードする。別の態様では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域または４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域またはその両方を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる細胞内ドメインをさらにコードする。さらなる態様では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。

【0195】

一部の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲまたはその細胞質ドメインは、ＩＬ２Ｒβまたはその断片をさらに含む。さらなる実施形態では、ＩＬ２Ｒβの断片は、免疫細胞の活性化を容易にする、ＩＬ２ＲβのＪＡＫ－ＳＴＡＴ活性化ドメインを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0196】

一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、免疫調節性分子またはサイトカインをさらに発現し、必要に応じて分泌する。さらなる実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、免疫調節分子またはサイトカインの抑制因子を低発現レベルまたは低活性で含む。一実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、ＩＬ－１５を発現するが、サイトカイン誘導性Ｓｒｃ相同性２含有タンパク質（ＣＩＳ）は発現しない。例えば、Daher et al. Blood 2021 Feb 4; 137 (5): 624-636を参照されたい。
短縮型ＥＧＦＲおよび短縮型ＣＤ１９

【0197】

一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、ＣＡＲの発現または活性化、または発現と活性化の両方を制御するための切り換え機構も含み得る。例えば、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含み得る、またはそれからなり得る、またはそれから本質的になり得、ここで、細胞外ドメインは、標的細胞（例えば、がん細胞など）上にまたはそれによって発現される標的抗原以外の分子に特異的な標識、結合性ドメインまたはタグに結合する標的特異的結合性エレメントを含む。一部の実施形態では、そのような標識、結合性ドメインまたはタグは、標的細胞上にまたは標的細胞によって発現される標的抗原を認識し、それに結合する。そのような実施形態では、ＣＡＲの特異性は、標識、結合性ドメインまたはタグによって認識されるまたはそれに結合するＣＡＲ上の標的抗原結合性ドメインおよびドメインを含む、それからなる、またはそれから本質的になる第２の構築物によってもたらされる。例えば、ＷＯ２０１３／０４４２２５、ＷＯ２０１６／０００３０４、ＷＯ２０１５／０５７８３４、ＷＯ２０１５／０５７８５２、ＷＯ２０１６／０７００６１、ＵＳ９，２３３，１２５、ＵＳ２０１６／０１２９１０９を参照されたい。このように、ＣＡＲを発現するＴ細胞、ＮＫ細胞または他の細胞を対象に投与することができるが、当該細胞は、ＦＬＴ３特異的結合性ドメインなどの標識、結合性ドメインまたはタグを含む第２の組成物が投与されるまで、標的抗原（すなわち、ＦＬＴ３）に結合できない。

【0198】

本開示のＣＡＲはさらに、それらの機能を活性にするために多量体形成を必要とし得る（例えば、ＵＳ２０１５／０３６８３４２、ＵＳ２０１６／０１７５３５９、ＵＳ２０１５／０３６８３６０を参照されたい）、および／または、Ｔ細胞応答またはＮＫ細胞応答などの免疫細胞応答を引き出すために小分子薬物などの外因性シグナルを必要とし得る（ＵＳ２０１６／０１６６６１３、Yung et al., Science, 2015）。

【0199】

さらに、開示されるＣＡＲを発現する細胞は、処置後にＣＡＲを発現する細胞の細胞死を誘導するため（Buddee et al., PLoS One, 2013）、または標的抗原への結合後にＣＡＲの発現をダウンレギュレートするため（ＷＯ２０１６／０１１２１０）に、「自殺スイッチ」を含み得る。非限定的な例示的な自殺スイッチまたは自殺遺伝子はｉＣａｓｐである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲおよび／またはその細胞質ドメインは、自殺遺伝子産物をさらに含む。さらなる実施形態では、自殺遺伝子産物は、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシルエステラーゼ、シトクロムＰ４５０またはＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、短縮型ＥＧＦＲまたは誘導性カスパーゼ（「ｉＣａｓｐ」）のうちの１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、自殺遺伝子産物は、本明細書に開示される短縮型タンパク質マーカーである。

【0200】

ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後にリボソームスキップ配列（例えば、ＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号９）、および：

【化23】

と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一であるかまたは同一である配列を有する短縮型ＥＧＦＲが続き得る。一部の場合では、短縮型ＥＧＦＲは、配列番号１０と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸の変化（好ましくは保存的）を有する。

【0201】

あるいは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後にリボソームスキップ配列（例えば、ＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号９）、および：

【化24】

と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一であるかまたは同一である配列を有する短縮型ＣＤ１９が続き得る。
ベクター

【0202】

本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの任意の１つまたは複数を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなるベクターも提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、ポリヌクレオチドまたはＣＡＲの発現を駆動するための調節エレメントをさらに含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。さらなる実施形態では、調節エレメントは、以下のうちの１つまたは複数を含む：プロモーター、イントロン、エンハンサーまたはポリアデニル化シグナル。一部の実施形態では、ベクターは、検出可能なまたは精製用マーカーをさらに含む。

【0203】

一部の態様では、本明細書に開示される核酸分子またはそれと相補的な核酸分子を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなるベクターが提供される。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。それに加えて、またはその代わりに、ベクターは、発現ベクターである。一部の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターはレトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクター内で、配列番号１のヌクレオチド配列またはその等価物の発現は、プロモーター、必要に応じてＥＦ－１アルファプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＭＭＬＶプロモーターの制御下にある。

【0204】

一部の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクター（例えば、プラスミドなど）である。他の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり、その非限定的な例は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターの群から選択される。一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子を、ベクター、例えば、発現ベクター、例えば、レンチウイルスベクターもしくはレトロウイルスベクター（５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に）またはアデノウイルスベクターまたは遺伝子を発現させることができる任意の他のベクターに挿入することができる。

【0205】

一部の実施形態では、ベクターは、野生型ウイルスに由来するまたはそれに基づくものである。さらなる実施形態では、ベクターは、野生型レンチウイルスに由来するまたはそれに基づくものである。そのようなベクターの例としては、これだけに限定することなく、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が挙げられる。あるいは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などの他のレトロウイルスをベクター骨格の基礎として使用できることが意図されている。一部の実施形態では、本開示において使用するためのレトロウイルスベクターとしては、これだけに限定されないが、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｒｐ．によって製造されているＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ ｐＬｅｎｔｉ ｓｅｒｉｅｓ ｖｅｒｓｉｏｎｓ４，６，ａｎｄ ６．２「ＶｉｒａＰｏｗｅｒ」ｓｙｓｔｅｍ；Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって自作され使用されているｐＨＩＶ－７－ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって製造されている「Ｌｅｎｔｉ－Ｘ」レンチウイルスベクター、ｐＬＶＸ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈによって製造されているｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ；Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって製造されているｐＬｅｍｉＲ；およびＣｈａｒｉｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ＣＢＦ）、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙによって自作され使用されているｐＬＶが挙げられる。組換えレンチウイルスベクターは当技術分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９２４，１２３号；同第７，０５６，６９９号；同第７，４１９，８２９号および同第７，４４２，５５１号を参照されたい。本開示によるウイルスベクターは特定のウイルスの構成成分に限定される必要はないことが明らかになろう。ウイルスベクターは、２種またはそれよりも多くの異なるウイルスに由来する構成成分を含んでよく、また、合成の構成成分を含んでもよい。標的細胞特異性などの所望の特徴が得られるようにベクター構成成分を操作することができる。

【0206】

米国特許第６，９２４，１２３号には、ある特定のレトロウイルス配列により、標的細胞ゲノムへの組込みが容易になることが開示されている。この特許では、各レトロウイルスゲノムが、ビリオンタンパク質および酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖと称される遺伝子を含むことが教示されている。これらの遺伝子の両端には長い末端反復配列（ＬＴＲ）と称される領域が隣接している。ＬＴＲは、プロウイルスの組込み、および転写を担う。ＬＴＲはまた、エンハンサー－プロモーター配列としての機能も果たす。言い換えれば、ＬＴＲにより、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのカプシド形成はウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列によって起こる。ＬＴＲ自体は同一の配列であり、Ｕ３、ＲおよびＵ５と称される３つのエレメントに分けることができる。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に独特の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両端における反復配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に独特の配列に由来する。これらの３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルスの間で相当に変動し得る。ウイルスゲノムに関しては、ポリ（Ａ）付加（終結）の部位がＬＴＲの右側のＲとＵ５の境界にある。Ｕ３は、プロウイルスの転写制御エレメントの大多数を含有し、これらのエレメントには、細胞内転写活性化因子タンパク質および一部の場合ではウイルス転写活性化因子タンパク質に対して応答性のプロモーターおよび複数のエンハンサー配列を含む。

【0207】

構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ自体に関しては、ｇａｇは、ウイルスの内部の構造タンパク質をコードする。ｇａｇタンパク質は、タンパク質分解によりプロセシングされて、成熟タンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（カプシド）およびＮＣ（ヌクレオカプシド）になる。ｐｏｌ遺伝子は、ゲノムの複製を媒介する、ＤＮＡポリメラーゼを含有する逆転写酵素（ＲＴ）、関連するＲＮａｓｅ Ｈおよびインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする。

【0208】

ウイルスベクター粒子の産生のために、宿主細胞において、ベクターＲＮＡゲノムを、それをコードするＤＮＡ構築物から発現させる。ベクターゲノムによりコードされない粒子の構成成分は、宿主細胞において発現される追加的な核酸配列（通常ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子のいずれかまたはその両方を含む「パッケージング系」）によってトランスでもたらされる。ウイルスベクター粒子の産生のために必要な配列のセットを、宿主細胞に一過性トランスフェクションによって導入することもでき、宿主細胞のゲノムに組み込むこともでき、種々のやり方を合わせてもたらすこともできる。必要になる技法は当業者に公知である。

【0209】

一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子を細胞において発現させるためのベクター、すなわち、発現ベクターが提供される。一部の実施形態では、発現ベクターを作製するためのベクター、すなわち、作製用ベクターまたはパッケージングベクター、例えば、ウイルスベクターゲノムを複製するためのプラスミドが提供され、そのようなベクターゲノムは、ウイルスベクター内に適当にパッケージングされると、細胞に形質導入することができ、その結果、細胞における核酸分子の発現がもたらされる。２つの例示的な作製用ベクターが図２におよび図３に例示されている。

【0210】

単離された核酸をレトロウイルスパッケージング系に、パッケージングベクターおよび細胞株を使用してパッケージングすることができる。パッケージングベクターとしては、これだけに限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。パッケージングベクターは、遺伝子材料の細胞への送達を容易にするエレメントおよび配列を含有する。例えば、レトロウイルス構築物は、複製インコンピテントレトロウイルスベクターのパッケージングに必要な全てのビリオンタンパク質をトランスにコードする複製インコンピテントレトロウイルスゲノムに由来する少なくとも１つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含む、複製コンピテントヘルパーウイルスを生じさせることなく複製インコンピテントレトロウイルスベクターを高力価でパッケージングすることが可能なビリオンタンパク質を産生させるための、パッケージングベクターである。レトロウイルスＤＮＡ配列は、ウイルスのウイルス５’ＬＴＲのネイティブなエンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする領域を欠き、また、ヘルパーゲノムのパッケージングを担うｐｓｉ機能配列および３’ＬＴＲの両方を欠くが、外来ポリアデニル化部位、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化部位、ならびに、ウイルス産生が望まれる細胞型における効率的な転写を方向づける外来エンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする。レトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）などの白血病ウイルスである。外来エンハンサーおよびプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）最初期（ＩＥ）エンハンサーおよびプロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサーおよびプロモーター（Ｕ３領域）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域、またはネイティブなモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターと接合したＨＣＭＶ ＩＥエンハンサーであってよい。レトロウイルスパッケージングベクターは、プラスミドに基づく発現ベクターによってコードされる２つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列からなるものであってもよく、その場合、例えば、第１のヘルパー配列が狭宿主性ＭＭＬＶまたはＧＡＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有し、第２のヘルパー配列がｅｎｖタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する。宿主域を決定するＥｎｖ遺伝子は、異種栄養性、広宿主性、狭宿主性、ポリトロピック（ミンクフォーカス形成）または１０Ａ１マウス白血病ウイルスｅｎｖタンパク質またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ ｅｎｖタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスｅｎｖ（ｇｐ１６０）タンパク質、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｕｓ Ｖｉｒｕｓ）（ＶＳＶ）Ｇタンパク質、ヒトＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ）Ｉ型およびＩＩ型ｅｎｖ遺伝子産物をコードする遺伝子、上述のｅｎｖ遺伝子のうちの１つまたは複数の組合せに由来するキメラエンベロープ遺伝子または上述のｅｎｖ遺伝子産物の細胞質および膜貫通をコードするキメラエンベロープ遺伝子、ならびに所望の標的細胞上の特定の表面分子を対象とするモノクローナル抗体に由来するものであり得る。

【0211】

パッケージングプロセスにおいて、パッケージングベクターおよびレトロウイルスベクターを、ウイルスを産生させることが可能な哺乳動物細胞の第１の集団、例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞、例えば、２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）に一過性に同時トランスフェクトして、高力価の組換えレトロウイルスを含有する上清を生じさせる。本開示の別の方法では、次いで、この一過性にトランスフェクトされた第１の細胞の集団を哺乳動物標的細胞、例えば、ヒトリンパ球と共培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｅ）して、標的細胞に外来遺伝子を高効率で形質導入する。本開示のさらに別の方法では、上記の一過性にトランスフェクトされた第１の細胞の集団由来の上清を哺乳動物標的細胞、例えば、ヒトリンパ球または造血幹細胞と一緒にインキュベートして、標的細胞に外来遺伝子を高効率で形質導入する。

【0212】

別の態様では、パッケージングベクターを、ウイルスを産生させることが可能な哺乳動物細胞の第１の集団、例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞、例えば、２９３細胞において安定に発現させる。レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを、選択マーカーと同時トランスフェクション、またはシュードタイピングされたウイルスの感染のいずれかによって細胞に導入する。どちらの場合でもベクターは組み込まれる。あるいは、ベクターをエピソームとして維持されるプラスミドとして導入することもできる。高力価の組換えレトロウイルスを含有する上清を生じさせる。

【0213】

明らかである通り、ヒト患者に対して臨床的に使用する場合、マーカーまたは精製タグを構築物から省く。細胞に、本明細書に記載のウイルスベクターを使用して、あるいは"Nonviral RNA transfection to transiently modify T cell with chimeric antigen receptors for adoptive therapy"というタイトルのRiet et al. (2013) Meth. Mol. Biol. 969: 187-201に記載の技術を使用して形質導入することができる。

【0214】

外因性核酸を宿主細胞に導入するさらなる方法が公知であり、それらとして、これだけに限定されないが、ＲＮＡ電気穿孔、ナノテクノロジー、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙベクター、レトロウイルス、および／またはアデノウイルスのうちの１つまたは複数を使用した遺伝子送達が挙げられる。

【0215】

外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞内に組換えＤＮＡ配列が存在することを確認するために、種々のアッセイを実施することができる。そのようなアッセイとしては、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲなど；「生化学的」アッセイ、例えば、特定のペプチドの存在または非存在を、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）によって、または本開示の範囲内に入る作用剤を同定するための本明細書に記載のアッセイによって検出することなどが挙げられる。
細胞

【0216】

一部の態様では、本明細書に開示される核酸分子または本明細書に開示されるベクターを含むヒトＴ細胞またはＮＫ細胞の集団が提供される。一部の実施形態では、単離された細胞またはヒトＴ細胞またはＮＫ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞、ＮＫ細胞、ナイーブメモリーＴ細胞、汎Ｔ細胞またはＣＤ２５＋細胞およびＣＤ１４＋細胞が実質的に枯渇したＰＢＭＣを含む。

【0217】

さらなる態様では、本明細書に開示される核酸分子または本明細書に開示されるベクターを含む単離された細胞が提供される。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、幹細胞、前駆細胞または前駆体細胞の群から選択される。単離された細胞を含む細胞の集団も提供される。

【0218】

なおさらなる実施形態では、本明細書に開示される細胞集団、本明細書に開示される細胞、および担体、ならびに必要に応じて安定剤、保存剤または凍結保存剤を含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる組成物が提供される。

【0219】

一部の実施形態では、細胞集団は、実質的に均一である。さらなる実施形態では、集団は、少なくとも９０％（これだけに限定されないが、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む）の、同じ少なくとも１種の細胞亜型の細胞を含み、例えば、細胞の少なくとも９０％がＴ細胞またはＮＫ細胞である。

【0220】

本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示されるＣＡＲ、本明細書に開示される短縮型タンパク質マーカー、または本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちの任意の１つまたは複数を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる単離された細胞も本明細書で提供される。

【0221】

細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）であっても真核細胞であってもよい。真核細胞の非限定的な例としては、これだけに限定されないが、酵母細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、マウス細胞、ウマ細胞またはヒト細胞が挙げられる。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＡＲを発現する。さらなる実施形態では、単離された細胞は、短縮型タンパク質マーカーを発現する。一部の実施形態では、細胞は、検出可能なまたは精製用マーカーをさらに含む。

【0222】

一部の実施形態では、真核細胞、哺乳動物またはヒト細胞は、免疫細胞、必要に応じてＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、これらの任意のサブセットまたは任意の他の免疫細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージから必要に応じて選択される免疫細胞である。ある特定の実施形態では、単離された細胞は、Ｔ細胞、例えば、動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、ネコＴ細胞、イヌＴ細胞またはヒトＴ細胞である。ある特定の実施形態では、単離された細胞は、ＮＫ細胞、例えば、動物ＮＫ細胞、哺乳動物ＮＫ細胞、ネコＮＫ細胞、イヌＮＫ細胞またはヒトＮＫ細胞である。ある特定の実施形態では、単離された細胞は、ＮＫＴ細胞、例えば、動物ＮＫＴ細胞、哺乳動物ＮＫＴ細胞、ネコＮＫＴ細胞、イヌＮＫＴ細胞またはヒトＮＫＴ細胞である。ある特定の実施形態では、単離された細胞は、Ｂ細胞、例えば、動物Ｂ細胞、哺乳動物Ｂ細胞、ネコＢ細胞、イヌＢ細胞またはヒトＢ細胞である。各種について同じまたは同様の実施形態が樹状細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、これらの任意のサブセット、または記載されているＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＢ細胞、または任意の他の免疫細胞に適用されることが理解される。さらなる実施形態では、Ｔ細胞は、ガンマ－デルタＴ細胞である。一態様では、細胞は、遺伝子編集技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用して、ＣＤ５２発現が除去されるように改変されたＴ細胞である。

【0223】

一部の実施形態では、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または免疫細胞から選択される。さらなる実施形態では、免疫細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。

【0224】

細胞は、患者、ドナーまたは既製品として入手可能なものなどの細胞株に由来するものであってよい。細胞は、処置される対象に対して自己であっても同種であってもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞の増大および遺伝子改変の前に、細胞を、対象から得ることができる－例えば、自己治療を伴う実施形態において－または、市販の細胞株もしくは細胞培養物、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞から得ることができる。

【0225】

細胞は、末梢血、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含めた、対象内のいくつかの供給源から得ることができる。

【0226】

関連性のある細胞を単離する方法が当技術分野で周知であり、本出願に容易に適合させることができる；例示的な方法が下記の実施例に記載されている。本開示との関連で使用するための単離方法としては、これだけに限定されないが、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ；ＳＴＥＭｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＥＡＳＹＳＥＰ（商標）、ＲＯＢＯＳＥＰ（商標）、ＲＯＳＥＴＴＥＳＥＰ（商標）、ＳＥＰＭＡＴＥ（商標）；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＭＡＣＳ（商標）細胞分離キット、および他の市販の細胞分離および単離キットが挙げられる。そのようなキットに利用可能な、独特の細胞表面マーカーに特異的なビーズまたは他の結合性物質を使用することにより、免疫細胞の特定の亜集団を単離することができる。例えば、ＭＡＣＳ（商標）ＣＤ４＋ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓおよびＣＤ８＋ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することができる。公知の技法に従って単離することができる細胞の非限定的な代替の例としては、大半のＴ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、およびガンマデルタＴ細胞が挙げられる。

【0227】

あるいは、これだけに限定されないが、Ｔ細胞については以下の株、ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９０１（商標））、ＢＣＬ２ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２８９９（商標））、Ｎｅｏ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２８９８（商標））；Ｂ細胞については以下の株、ＡＨＨ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８１４６（商標））、ＢＣ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２３０（商標））、ＢＣ－２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２３１（商標））、ＢＣ－３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２７７（商標））、ＣＡ４６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６４８（商標））、ＤＧ－７５［Ｄ．Ｇ．－７５］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２６２５（商標））、ＤＳ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１１１０２（商標））、ＥＢ－３［ＥＢ３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－８５（商標））、Ｚ－１３８（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ－３００１）、ＤＢ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２２８９）、Ｔｏｌｅｄｏ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６３１）、Ｐｆｉｆｆｅｒ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６３２）、ＳＲ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２２６２）、ＪＭ－１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０４２１）、ＮＦＳ－５ Ｃ－１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６９３）；ＮＦＳ－７０ Ｃ１０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６９４）、ＮＦＳ－２５ Ｃ－３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６９５）、およびＳＵＰ－Ｂ１５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９２９）；ならびにＮＫ細胞については、以下の株、ＮＫ－９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０７（商標））、ＮＫ－９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０８（商標））を含む、市販の細胞培養物から細胞を得ることもできる。さらなる例としては、これだけに限定されないが、成熟Ｔ細胞株、例えば、Ｄｅｇｌｉｓ、ＥＢＴ－８、ＨＰＢ－ＭＬｐ－Ｗ、ＨＵＴ ７８、ＨＵＴ １０２、Ｋａｒｐａｓ ３８４、Ｋｉ ２２５、Ｍｙ－Ｌａ、Ｓｅ－Ａｘ、ＳＫＷ－３、ＳＭＺ－１およびＴ３４；未成熟Ｔ細胞株、例えば、ＡＬＬ－ＳＩＬ、Ｂｅ１３、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＣＭＬ－Ｔ１、ＤＮＤ－４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ－９、ＨＤ－Ｍａｒ、ＨＰＢ－ＡＬＬ、Ｈ－ＳＢ２、ＨＴ－１、ＪＫ－Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ ４５、ＫＥ－３７、ＫＯＰＴ－Ｋ１、Ｋ－Ｔ１、Ｌ－ＫＡＷ、Ｌｏｕｃｙ、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ－１、ＭＯＬＴ ３、ＭＯＬＴ－４、ＭＯＬＴ １３、ＭＯＬＴ－１６、ＭＴ－１、ＭＴ－ＡＬＬ、Ｐ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｐｅｅｒ、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ－２５５、ＰＦ－３８２、ＰＦＩ－２８５、ＲＰＭＩ－８４０２、ＳＴ－４、ＳＵＰ－Ｔ１～Ｔ１４、ＴＡＬＬ－１、ＴＡＬＬ－１０１、ＴＡＬＬ－１０３／２、ＴＡＬＬ－１０４、ＴＡＬＬ－１０５、ＴＡＬＬ－１０６、ＴＡＬＬ－１０７、ＴＡＬＬ－１９７、ＴＫ－６、ＴＬＢＲ－１、－２、－３、および－４、ＣＣＲＦ－ＨＳＢ－２（ＣＣＬ－１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６３）、ＲＳ４；１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１８７３）、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（ＡＴＣＣ ＣＲＭ－ＣＣＬ－１１９）；皮膚Ｔ細胞リンパ腫株、例えば、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ ＣＲＭ－ＴＩＢ－１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１６２）；未分化大細胞リンパ腫に由来するＢ細胞株、例えば、ＤＥＬ、ＤＬ－４０、ＦＥ－ＰＤ、ＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ ２９９、Ｋｉ－ＪＫ、Ｍａｃ－２Ａ Ｐｌｙ１、ＳＲ－７８６、ＳＵ－ＤＨＬ－１、－２、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、および－１６、ＤＯＨＨ－２、ＮＵ－ＤＨＬ－１、Ｕ－９３７、Ｇｒａｎｄａ ５１９、ＵＳＣ－ＤＨＬ－１、ＲＬ；ホジキンリンパ腫、例えば、ＤＥＶ、ＨＤ－７０、ＨＤＬＭ－２、ＨＤ－ＭｙＺ、ＨＫＢ－１、ＫＭ－Ｈ２、Ｌ ４２８、Ｌ ５４０、Ｌ１２３６、ＳＢＨ－１、ＳＵＰ－ＨＤ１、およびＳＵ／ＲＨ－ＨＤ－１；ならびにＮＫ株、例えば、ＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ－１、ＮＫＬ、ＮＫ－ＹＳ、ＮＯＩ－９０、およびＹＴなどが挙げられる。これだけに限定されないが、ＲＥＨ、ＮＡＬＬ－１、ＫＭ－３、Ｌ９２－２２１を含めたヌル白血病細胞株が別の商業的に入手可能な免疫細胞の供給源であり、他の白血病およびリンパ腫、例えば、Ｋ５６２赤白血病、ＴＨＰ－１単球性白血病、Ｕ９３７リンパ腫、ＨＥＬ赤白血病、ＨＬ６０白血病、ＨＭＣ－１白血病、ＫＧ－１白血病、Ｕ２６６骨髄腫に由来する細胞株も同様である。そのような市販の細胞株の非限定的な例示的な供給源としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＡＴＣＣ（atcc.org/）およびＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（dsmz.de/）が挙げられる。

【0228】

一部の実施形態では、開示されるＣＡＲを発現するＴ細胞を、内因性ＴＣＲの発現が低減するまたは排除されるようにさらに改変することができる。内因性ＴＣＲの低減または排除により、オフターゲットの効果を減少させ、Ｔ細胞の効果を増大させることができる。機能的なＴＣＲの発現を安定に欠くＴ細胞は、種々の手法を使用して作製することができる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体全体を複合体として内部移行し、分別し、分解し、半減期は静止Ｔ細胞では約１０時間であり、刺激されたＴ細胞では３時間である（von Essen, M. et al. 2004. J. Immunol. 173: 384-393）。ＴＣＲ複合体の適当な機能には、ＴＣＲ複合体を構成するタンパク質の適当な化学量論的比率が必要である。ＴＣＲ機能にはまた、２つの機能性の、ＩＴＡＭモチーフを有するＴＣＲゼータタンパク質も必要である。ＴＣＲがそのＭＨＣ－ペプチドリガンドと会合した際に活性化されるには、同じＴ細胞上のいくつかのＴＣＲが会合する必要があり、それらの全てが適当にシグナル伝達しなければならない。したがって、ＴＣＲ複合体が適当に結び付かない、または最適にシグナル伝達できないタンパク質で不安定化されると、Ｔ細胞は細胞応答の開始に十分には活性化されない。

【0229】

したがって、一部の実施形態では、ＴＣＲ発現を、初代Ｔ細胞における特定のＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β）および／またはＣＤ３鎖をコードする核酸を標的とする、ＲＮＡ干渉（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、ＣＲＩＳＰＲまたは他の方法を使用して排除することができる。これらのタンパク質のうちの１つまたは複数の発現を遮断することにより、Ｔ細胞はＴＣＲ複合体の重要な構成成分のうちの１つまたは複数をもはや産生せず、それにより、ＴＣＲ複合体が不安定化され、機能的なＴＣＲの細胞表面発現が妨げられる。ＲＮＡ干渉を使用した場合、一部のＴＣＲ複合体が細胞表面に再生利用される可能性があるにもかかわらず、ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）により、ＴＣＲタンパク質の新規産生が妨げられ、その結果、ＴＣＲ複合体全体の分解および除去がもたらされ、その結果、機能的なＴＣＲ発現が安定に欠損したＴ細胞の産生がもたらされる。

【0230】

初代Ｔ細胞における阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）の発現は、任意の従来の発現系、例えば、レンチウイルス発現系を使用して実現することができる。レンチウイルスは、静止初代Ｔ細胞を標的とすることには有用であるが、全てのＴ細胞がｓｈＲＮＡを発現するとは限らない。これらのＴ細胞の一部は、Ｔ細胞の機能活性を変更するためにＴＣＲ発現の十分な阻害を可能にするのに十分な量のＲＮＡを発現しない可能性がある。したがって、ウイルスによる形質導入後に中程度～高いＴＣＲ発現を保持するＴ細胞を、例えば、細胞選別または分離技法によって除去し、したがって、残りのＴ細胞を細胞表面ＴＣＲまたはＣＤ３が欠損したものにすることができ、それにより、機能的なＴＣＲまたはＣＤ３の発現が欠損した単離されたＴ細胞の集団を増大させることが可能になる。

【0231】

初代Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲの発現は、従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および標的ＴＣＲに特異的なガイドＲＮＡを使用して実現することができる。適切な発現系、例えば、レンチウイルスまたはアデノウイルス発現系が当技術分野で公知である。阻害性ＲＮＡの送達と同様に、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、静止初代Ｔ細胞または他の適切な免疫細胞をＣＡＲ細胞療法のために特異的に標的とすることができる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ編集が不首尾である限りでは、上に開示されている方法に従って上首尾になるよう細胞を選択することができる。例えば、上記の通り、ウイルスによる形質導入後に中程度～高いＴＣＲ発現を保持するＴ細胞を、例えば、細胞選別または分離技法によって除去し、したがって、残りのＴ細胞を細胞表面ＴＣＲまたはＣＤ３が欠損したものにすることができ、それにより、機能的なＴＣＲまたはＣＤ３の発現が欠損した単離されたＴ細胞の集団を増大させることが可能になる。ＣＲＩＳＰＲ編集構築物が、内因性ＴＣＲのノックアウトおよび本明細書に開示されるＣＡＲ構築物のノックインの両方に有用であり得ることがさらに理解される。したがって、これらの目的の一方または両方が実現されるようにＣＲＩＳＰＲ系を設計することができることが理解される。

【0232】

本明細書に開示される細胞を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上それからなる細胞集団も提供される。さらなる実施形態では、細胞集団は、実質的に均一である。一部の実施形態では、細胞集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または免疫細胞を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上それからなる。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球またはマクロファージからなる群から選択される。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＨＳＣまたはｉＰＳＣに由来するものである。一実施形態では、細胞は、遺伝子編集技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用してＣＤ５２発現が除去されるように改変されたＴ細胞である。

【0233】

一部の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞またはＮＫ細胞を調製する方法が提供される。方法は、自己または同種ヒトＴ細胞またはＮＫ細胞の集団を用意するステップと、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に対して本明細書に開示されるベクターまたは本明細書に開示される核酸分子による形質導入を行うステップとを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0234】

一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞を調製する方法が提供される。方法は、細胞に対して本明細書に開示されるベクターまたは本明細書に開示される核酸分子を用いた形質導入を行うステップを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0235】

一部の態様では、本開示は、ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、単離された細胞に対して本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれかを用いた形質導入を行うステップを含む、方法に関する。さらなる実施形態では、方法は、ＣＡＲを発現する細胞を選択し、単離するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞を作製する方法は、ＣＡＲを発現する細胞の集団を活性化および増大させるステップをさらに含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0236】

細胞を、望ましいＣＡＲを発現するように遺伝子改変する前であるかその後であるかにかかわらず、細胞を、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号およびLapateva et al. (2014) Crit Rev Oncog 19 (1-2): 121-32；Tam et al. (2003) Cytotherapy 5 (3): 259-72；Garcia-Marquez et al. (2014) Cytotherapy 16 (11): 1537-44などの参考文献に記載されているものなどの一般に公知の方法を使用して活性化および増大させることができる。ｅｘ ｖｉｖｏにおいて腫瘍と関連性のある抗原で刺激することにより、選択されたＣＡＲを発現する細胞亜集団を活性化および増大させることができる。あるいは、細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、腫瘍と関連性のある抗原との相互作用によって活性化することができる。

【0237】

ある特定の免疫細胞の場合では、細胞を活性化および増大させるために、追加的な細胞集団、可溶性リガンドおよび／またはサイトカインまたは刺激剤が必要になり得る。関連性のある試薬が当技術分野で周知であり、公知の免疫学的原理に従って選択される。例えば、可溶性ＣＤ－４０リガンドがある特定のＢ細胞集団の活性化および増大に役立ち得る；同様に、照射処理したフィーダー細胞をＮＫ細胞の活性化および増大のための手順に使用することができる。

【0238】

関連性のある細胞を活性化する方法が当技術分野で周知であり、本出願に容易に適合させることができる；例示的な方法は下記の実施例に記載されている。本開示との関連で使用するための単離方法としては、これだけに限定されないが、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ活性化および増大キット；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）活性化キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＭＡＣＳ（商標）活性化／増大キット、ならびに関連性のある細胞の活性化部分に特異的な他の市販の細胞キットが挙げられる。免疫細胞の特定の亜集団を、そのようなキットで入手可能なビーズまたは他の作用剤を使用することによって活性化または増大させることができる。例えば、α－ＣＤ３／α－ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用して、単離されたＴ細胞の集団を活性化および増大させることができる。
ＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現させるためのレンチウイルスベクター

【0239】

ＦＬＴ３特異的ＣＡＲを、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターを含めた種々のベクターのいずれかを使用してＴ細胞またはＮＫ細胞において発現させることができる。

【0240】

Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ（Ｄｕａｒｔｅ ＣＡ）にあるＴ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＴＣＴＲＬ）により開発されたｐＨＩＶ７ベクターは、ＣＡＲ発現のために有用なベクターである。このベクターでは、ＣＡＲの発現を駆動するためにヒトＥＦ１プロモーターを使用する。ｐＨＩＶ７の構築が図１に概略的に描かれている。簡単に述べると、ｇａｇ－ｐｏｌからの６５３ｂｐとそれに加えてＳＬ３－ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）を間に伴う５’および３’末端反復配列（ＬＴＲ）を含有するｐｖ６５３ＲＳＮを、以下の通りｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした：ステップ１において、５’ＬＴＲからｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）までの配列によりｐ５’ＨＩＶ－１ ５１を作出し、次いで、５’ＬＴＲを、ＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去し、まずＣＭＶエンハンサーにライゲーションし、次いでＳＶ４０複製開始点にライゲーションすることによって改変した（ｐ５’ＨＩＶ－２）。ステップ２において、３’ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングしてｐ３’ＨＩＶ－１を作出した後、３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーター内に４００ｂｐの欠失を作出してＨＩＶ Ｕ３内のシス調節エレメントを除去し、ｐ３’ＨＩＶ－２を形成した。ステップ３において、ｐ５’ＨＩＶ－３およびｐ３’ＨＩＶ－２から単離した断片をライゲーションしてｐＨＩＶ－３を作出した。ステップ４において、ｐ３’ＨＩＶ－２を、余分の上流ＨＩＶ配列を除去してｐ３’ＨＩＶ－３を生成し、ＷＰＲＥを含有する６００－ｂｐのＢａｍＨＩ－ＳａｌＩ断片をｐ３’ＨＩＶ－３に付加してｐ３’ＨＩＶ－４を作出することによってさらに改変した。ステップ５において、ｐＨＩＶ－３ ＲＲＥのサイズをＰＣＲによって縮小し、ｐＨＩＶ－３由来の５’断片（示していない）およびｐ３’ＨＩＶ－４にライゲーションして、ｐＨＩＶ－６を作出した。ステップ６において、ＨＩＶ－１ ｐＮＬ４－３由来のｃＰＰＴ ＤＮＡフラップ配列を含有する１９０ｂｐのＢｇｌＩＩ－ＢａｍＨＩ断片をｐＮＬ４－３から増幅し、ｐＨＩＶ６のＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列の間に置いて、ｐＨＩＶ－７を作出した。この親プラスミドｐＨＩＶ７－ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）を、４－プラスミド系を使用した親ベクターのパッケージングのために使用した。

【0241】

ウイルスゲノムのベクターへの効率的なパッケージングのためには、パッケージングシグナル、ｐｓｉ ψが必要である。ＲＲＥおよびＷＰＲＥによりＲＮＡ転写物の輸送および導入遺伝子の発現が増強される。フラップ配列とＷＰＲＥの組合せにより、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの形質導入効率が増強されることが実証されている。

【0242】

組換えによって複製コンピテントレンチウイルスが生じる確率を低減させるために、ヘルパー機能（ウイルスベクターの作製に必要である）を３つの別々のプラスミドに分割する：１）ｐＣｇｐは、ウイルスベクターのアセンブリに必要なｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードする；２）ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２は、ＲＲＥ配列に対して作用して効率的なパッケージングのためのウイルスゲノムの輸送を補助するＲｅｖタンパク質をコードする；および３）ｐＣＭＶ－Ｇは、ウイルスベクターの感染力に必要な水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌｏ－ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＳＶ）の糖タンパク質をコードする。

【0243】

ｐＨＩＶ７によりコードされるベクターゲノムとヘルパープラスミドの間には最小限のＤＮＡ配列相同性が存在する。相同性の領域には、ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列内に位置するおよそ６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域；３つ全てのヘルパープラスミド内のＣＭＶプロモーター配列；およびヘルパープラスミドｐＣｇｐ内のＲＲＥ配列が含まれる。これらの領域内の相同性に起因して複製コンピテント組換えウイルスが生じることは、多数の組換え事象が必要になるので、ほぼあり得ない。さらに、得られた組換えのいずれでも機能的なＬＴＲおよびレンチウイルスの複製のために必要なｔａｔ配列が欠如すると思われる。ＣＭＶプロモーターをＥＦ１α－ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦ１ｐ）で置き換えた。ＥＦ１ｐは５６３ｂｐを有するものであり、これを、ＣＭＶプロモーターを切除した後、ＮｒｕＩおよびＮｈｅＩを使用してｅｐＨＩＶ７に導入した。野生型ウイルスの病原性のために必要であり、また、標的細胞への増殖性感染のために必要なｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖ以外のレンチウイルスゲノムをこの系から除去した。さらに、ベクター構築物は、インタクトな３’ＬＴＲプロモーターを含有せず、したがって、標的化された細胞において得られる発現され逆転写されたＤＮＡプロウイルスゲノムは不活性ＬＴＲを有する。この設計の結果として、プロウイルスからＨＩＶ－Ｉ由来配列は転写されず、治療用配列のみがそれらのそれぞれのプロモーターから発現される。ＳＩＮベクターにおけるＬＴＲプロモーター活性の除去により、宿主遺伝子の意図的でない活性化の可能性が有意に低減することが予想される。
組成物

【0244】

担体および本明細書に開示されるポリヌクレオチドの任意の１つまたは複数、本明細書に開示されるポリペプチド、本明細書に開示されるベクターの任意の１つ、本明細書に開示される細胞の任意の１つまたは本明細書に開示される細胞集団を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる組成物が本明細書でさらに提供される。一部の実施形態では、担体は、薬学的に許容される担体である。

【0245】

簡単に述べると、本開示の医薬組成物は、これだけに限定されないが、本明細書に記載の特許請求される組成物の任意の１つを、１種または複数種の薬学的にまたは生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含む。そのような組成物は、緩衝剤、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなど；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシンなど；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本開示の組成物は、局所または全身投与、例えば、経口、静脈内、頭蓋内、局部的、経腸、および／または非経口投与用に製剤化することができる。ある特定の実施形態では、本開示の組成物を静脈内投与用に製剤化する。

【0246】

細胞または組成物の投与は、１回用量で、処置の過程全体を通して連続的にまたは断続的に実施することができ、所望の治療的利益を実現するための有効量が提供される。最も有効な投与の手段および投薬量については、それらを決定する方法が当業者に公知であり、また、治療に使用される組成物、治療の目的および処置される対象によって変動する。治療にあたる医師によって選択される用量レベルおよびパターンを用いて単回または複数回の投与を行うことができる。作用剤の適切な投薬形態および投与方法は当技術分野で公知である。さらなる実施形態では、本開示の細胞および組成物は、併用される治療に使用される作用剤をさらに含む。なおさらなる実施形態では、本開示の細胞および組成物を他の処置または治療と組み合わせて投与することができる。一態様では、対象由来の試料を単離し、ＦＬＴ３発現についてアッセイした後、開示される治療の投与を行う。したがって、一態様では、方法は、対象から単離された試料中のＦＬＴ３発現についてアッセイするステップをさらに含み、試料はがんまたは腫瘍細胞を含有する。

【0247】

細胞および細胞の集団を宿主および／または対象に、当技術分野で公知であり、例えばＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６４１９１に記載されている方法を使用して投与する。対象が非ヒト動物である場合、この本開示の細胞または組成物の投与は、治療のため、または、治療もしくは併用治療に関する実験およびスクリーニングアッセイのための所望の疾患、障害、もしくは状態の動物モデルを生成するために行うことができる。

【0248】

一部の態様では、本開示は、がんまたは腫瘍細胞と結合した本明細書に開示される単離された細胞の任意の１つを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上それからなる単離された複合体であって、がんまたは腫瘍細胞と、ＣＡＲを発現する単離された細胞が、ＣＡＲによって発現される抗原または腫瘍を標的とする抗体の抗原結合性ドメインによって結合している、複合体に関する。
使用方法

【0249】

一部の実施形態では、がん、例えば、急性骨髄性白血病などの、ＦＬＴ３が発現されるがんに罹患しているヒト患者を処置する方法が提供される。方法は、本明細書に開示される核酸分子を含む自己または同種ヒト細胞、例えば、免疫細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、幹細胞、前駆細胞、臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）細胞、造血幹細胞の集団を投与するステップを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。当該治療を他の治療と組み合わせることができ、第１選択、第２選択、第３選択、第４選択または第５選択治療として施行することができる。がんは、原発がんまたは転移性もしくは再発性がんであり得る。一態様では、患者は、処置を受ける前に、がん細胞におけるＦＬＴ３発現を増大させる作用剤を受けている。

【0250】

一部の実施形態では、それを必要とする患者を処置する方法が提供される。一態様では、患者は、ＦＬＴ３が発現されるがんまたは腫瘍に罹患している。方法は、本明細書に開示される細胞集団を患者に投与するステップを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。細胞、例えば、免疫細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、幹細胞、前駆細胞、臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）細胞、造血幹細胞は、処置を受ける患者に対して同種または自己であり得る。当該治療を他の治療と組み合わせることができ、第１選択、第２選択、第３選択、第４選択または第５選択治療として施行することができる。がんは、原発がんまたは転移性もしくは再発性がんであり得る。一態様では、患者は、処置を受ける前に、がん細胞におけるＦＬＴ３発現を増大させる作用剤を受けている。

【0251】

一部の実施形態では、患者は、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）に活性化突然変異を有する腫瘍細胞を有する。さらなる実施形態では、患者は、ＦＬＴ３－ＩＴＤ突然変異を有する腫瘍細胞を有する。

【0252】

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体を発現する細胞を局所的にまたは全身的に投与する。

【0253】

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体を発現する細胞を単回投薬または反復投薬によって投与する。一部の実施形態では、投与を少なくとも１回または少なくとも２回またはそれよりも多く繰り返す。

【0254】

一部の実施形態では、細胞集団は、ＮＫ細胞を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、患者に対して同種である。

【0255】

一部の実施形態では、方法は、本明細書に開示される第２の細胞集団を患者に投与するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、第２の細胞集団は、ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。細胞は、患者に対して自己または同種であり得る。なおさらなる実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は患者に対して自己である。

【0256】

一部の実施形態では、細胞集団は、Ｔ細胞を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。

【0257】

一部の実施形態では、方法は、がん細胞におけるＦＬＴ３の発現を増大させる薬物を投与するステップをさらに含む。

【0258】

一部の態様では、本開示は、ＦＬＴ３を発現するがん細胞またはがん細胞を構成する組織の成長を阻害する方法に関する。方法は、がん細胞または組織を、ＣＡＲおよび必要に応じて本明細書に開示される短縮型タンパク質マーカーを発現する細胞のいずれかと接触させるステップを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおけるものである。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるものであり、発現細胞は、処置を受ける対象に対して自己または同種である。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるものであり、発現細胞は処置を受ける対象に対して同種である。ｉｎ ｖｉｖｏにおける接触させるステップは、そのような処置を必要とする対象に発現細胞を投与することによるものであり得る。

【0259】

一部の態様では、本開示は、対象におけるＦＬＴ３を発現するがん細胞または組織の成長を阻害する方法であって、対象に、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞を有効量で、および必要に応じて併用される治療を投与するステップを含む、方法を提供する。

【0260】

一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法に関する。一部の実施形態では、対象は、ＦＬＴ３を発現するがん細胞を含む。方法は、対象に、例えば、ＣＡＲおよび必要に応じて本明細書に開示される短縮型タンパク質マーカーを発現する細胞を有効量で投与するステップを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、処置を受ける対象に対して自己または同種である。一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、処置を受ける対象に対して同種である。一部の実施形態では、方法は、対象に、併用される治療を施行することをさらに含む。

【0261】

一部の態様では、以下のうちの１つまたは複数のための方法が本明細書で提供される：それを必要とする対象において、がんもしくは腫瘍の成長を阻害すること、がんもしくは腫瘍の転移を阻害すること、またはがんもしくは腫瘍を処置すること。方法は、ＣＡＲおよび必要に応じて短縮型タンパク質マーカーを発現する細胞を対象に投与するステップを含む、またはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、必要とする対象に対して自己または同種である。一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、必要とする対象に対して同種である。

【0262】

一態様では、処置のために選択された対象におけるがんを処置するための方法が提供される。方法は、例えば、本明細書に開示される細胞または細胞集団を対象に有効量で投与するステップを含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上それからなる。一部の実施形態では、対象を、対象のがん細胞によってＦＬＴ３が発現される場合に選択する。一部の実施形態では、ＦＬＴ３発現は、対象のがんの生検材料などの試料を、ＦＬＴ３を特異的に認識し、それに結合する抗体または抗原結合性ドメインとｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで接触させ、試料と抗体または抗原結合性ドメインの間の結合を検出することによって決定される。さらなる実施形態では、抗原結合性ドメインは、検出可能なマーカーをさらに含む。一部の実施形態では、単離されたまたは工学的に操作された細胞は、必要とする対象に対して自己である。一部の実施形態では、単離されたまたは工学的に操作された細胞は、必要とする対象に対して同種である。

【0263】

一部の態様では、本明細書に開示される方法は、対象に、併用される治療を施行するステップをさらに含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。適当な処置レジメンは、治療にあたる医師または獣医師によって決定される。

【0264】

一部の実施形態では、ＦＬＴ３ ＣＡＲ細胞を、これらの非限定的な例示的な併用される治療のうちの任意の１つの前またはその後に、例えば、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の前に、または放射線療法もしくは化学療法の後に、投与することができる。ＦＬＴ３ ＣＡＲ細胞を造血幹細胞移植の前に使用する実施形態では、ＦＬＴ３ ＣＡＲ細胞を使用して、造血幹細胞の送達前に寛解を実現することができる；一般に、造血幹細胞移植は寛解後の方が上首尾である。さらなる非限定的な例としては、改変されていない免疫細胞、本明細書に開示されるものとは異なる抗原に対して特異的な１種または複数種の免疫調節性分子またはＣＡＲ細胞を発現するベクターを含む改変された免疫細胞などの、他の関連性のある細胞型が挙げられる。本開示のＣＡＲ細胞と同様に、一部の実施形態では、これらの細胞は自己または同種であり得る。

【0265】

一部の実施形態では、併用される治療は、細胞減少療法、またはがん細胞におけるＦＬＴ３の発現をアップレギュレートする治療の一方または両方から選択される。一部の実施形態では、細胞減少療法は、化学療法、寒冷療法、温熱療法、標的化療法、免疫療法または放射線療法のうちの１つまたは複数を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。さらなる実施形態では、併用される治療は、がん細胞またはがん細胞を含む組織の物理的除去を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。なおさらなる実施形態では、併用される治療を、本明細書に開示されるＦＬＴ３特異的ＣＡＲ治療の前に、それと同時に、またはその後に使用することができる。一部の実施形態では、がん細胞におけるＦＬＴ３発現をアップレギュレートする治療を、本明細書に開示されるＦＬＴ３特異的ＣＡＲ治療の前に、またはそれと同時に使用する。

【0266】

一部の実施形態では、免疫療法は、がん細胞に対する対象の免疫応答の増強、例えば、抗ＰＤ－１治療または抗ＰＤ－Ｌ１治療を指す。ＰＤ－１に対する市販の抗体の非限定的な例としては、ペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ピジリズマブ（Ｃｕｒｅ Ｔｅｃｈ）、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫ）、ＡＭＰ－５１４（ＧＳＫ）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、およびセミプリマブ（ＲｅｇｅｎｅｒｏｎおよびＳａｎｏｆｉ）が挙げられる。ＰＤ－Ｌ１に対する市販の抗体の非限定的な例としては、アテゾリズマブ（Ｒｏｃｈｅ Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、アベルマブ（Ｍｅｒｃｋ ＳｏｒｅｎｏおよびＰｆｉｚｅｒ）、デュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｕｉｂｂ）、およびＣＫ－３０１（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。

【0267】

一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を第１選択治療として使用する。他の実施形態では、本明細書に開示される方法を第２選択治療または第３選択治療として使用する。

【0268】

ある特定の実施形態では、患者または対象は、単離された細胞を有効量で受けた、すなわち投与された後、正常な造血を維持するまたは回復する。正常な造血は、これだけに限定されないが、血液または骨髄に影響を及ぼすがん、例えば、これだけに限定されないが急性骨髄性白血病または急性リンパ芽球性白血病などのリンパ腫または白血病などのある特定のがんに関しては極めて重要なエンドポイントである。処置後の「正常な造血」を決定する方法は当技術分野で公知であり、それらとして、これだけに限定されないが、ベースライン血液細胞計数と処置後の血液細胞計数を比較する「ピンプリック」血液検査および／または循環ＣＤ３４＋細胞についての同様の比較が挙げられる。さらなる非限定的な例示的な方法として、生着を検証する骨髄生検が挙げられる。正常な造血の維持または回復（正常な生着としても公知）の失敗には、これだけに限定されないが、貧血、蒼白、起立性低血圧症、および血小板回復の欠如に起因する出血および／もしくは挫傷などの症候性の指標に加えて、繰返しの輸血の必要および／もしくは抗生物質の必要、ならびに／または高い罹患率および死亡率が伴う。正常な造血および／または生着は、これだけに限定されないが、顆粒球計数＞１．０×１０^９／Ｌの持続、血小板計数＞５０×１０^９の持続、ヘモグロビンレベル約９もしくは１０ｇ／ｄＬの持続、および／または赤血球輸血の必要がないことなどの臨床的に許容される閾値によって定義することができる。一部の実施形態では、正常な造血は、Ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞の著しい枯渇がないことによって定義される。一部の実施形態では、十分に長期間にわたる造血または上首尾の長期間にわたる造血生着は、幹細胞移植のための骨髄破壊的調製後に対象に注入される造血用製品における十分な数のＬｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞と相関し得る。

【0269】

ＣＡＲを発現する細胞の総用量は、例えば、上に開示された因子に応じて変動し得る。一部の実施形態では、用量は、患者当たりまたは患者の体重１キログラム（ｋｇ）当たり、およそ１～１０^１０個の細胞、例えば、少なくとも１個、少なくとも１０^１個、少なくとも１０^２個、少なくとも１０^３個、少なくとも１０^４個、少なくとも１０^５個、少なくとも１０^６個、少なくとも１０^７個、最大で１０^８個、最大で１０^９個、最大で１０^１０個、１０^２個から１０^１０個の間、１０^３個から１０^９個の間、１０^４個から１０^８個の間であり得る。一部の実施形態では、用量を、桁に対する整数係数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９によってさらに限定することができ、それにより、以下の非限定的な例に従って列挙される用量範囲がもたらされる：患者当たりまたは患者の体重１ｋｇ当たり５×１０^４個から１×１０^８個の間。

【0270】

本開示の医薬組成物を処置または防止される疾患に適した様式で投与することができる。数量および投与の頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の型および重症度などの因子によって決定されるが、臨床試験によって適当な投薬量を決定することができる。一実施形態では、本開示の医薬組成物を直接注射によって直接投与する、または、例えば静脈内注射など、全身的に投与する。

【0271】

本開示の態様は、患者がＣＡＲ治療に応答する可能性が高いか応答する可能性が低いかを決定するための例示的な方法を提供する。方法は、患者から単離された腫瘍試料中の壊死の存在または非存在を決定するステップと、がんまたは腫瘍抗原を発現するがんまたは腫瘍細胞の量を定量化するステップとを含む、あるいはそれから本質的になる、またはさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、方法は、ＣＡＲ治療に応答する可能性が高いと決定された患者にＣＡＲ治療を有効量で施行するステップをさらに含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。ＣＡＲ治療は、患者に対して自己または同種であり得、患者は、がんに罹患している対象であり得、動物またはヒトであり得る。

【0272】

壊死に関する組織学的染色技法は当技術分野で周知である。例えば、ヘマトキシリン・エオシン染色は、「Ｈ＆Ｅ染色」とも称され、組織、特に腫瘍形成性またはがん性成長における壊死の存在を同定するための一般的な技法である。細胞質Ｈ＆Ｅ染色により、細胞質ＲＮＡの喪失に一部起因し得、細胞質タンパク質の変性に一部起因し得る好酸球増加の増大が示される。壊死組織染色では、多くの場合、細胞質は細胞質細胞小器官の酵素消化に起因して「虫食い状態」のように見える。ミエリン像、石灰化、および他の細胞中へのファゴサイトーシスの形跡も、組織学的染色によって検出することができる壊死組織の特質である。壊死組織はまた、核染色においても特定の特質を有し、多くの場合、細胞死の結果として核融解、核濃縮、および核崩壊が示される。そのような壊死特質の顕微鏡検査および手動または自動のいずれかでの定量化を使用することにより、ＣＡＲ治療の関連性を決定することができる。一般に、これだけに限定されないが、バイオマーカーに基づくまたはイメージングに基づく診断を含めた、腫瘍形成性もしくはがん性成長または壊死組織を検出する代替手段もまた、患者が特定の型のＣＡＲ治療に応答するかどうかの決定に同等に適し、したがって、使用することができる。明らかである通り、ＣＡＲ治療は、抗原結合性ドメインによって特定のがんまたは腫瘍が標的とされ、処置されるように、患者試料中のがんまたは腫瘍の遺伝子型および／または表現型に基づいて選択される。
キット

【0273】

本明細書に開示されるＣＡＲ、短縮型タンパク質マーカー、ポリヌクレオチド、細胞、細胞集団または組成物のうちの１つまたは複数、および必要に応じてその作出または使用に関する指示を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなるキットも本明細書で提供される。

【0274】

特定の一態様では、本開示は、これらの方法を実施するためのキット、ならびに細胞または組織またはその両方の採取；スクリーニング、形質導入などの実施；結果の解析、またはこれらの任意の組合せなどの本開示の方法の実施に関する指示を提供する。

【0275】

一態様では、キットは、本明細書に開示されるポリペプチド、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、前記核酸を含むベクター、本明細書に開示される細胞、例えば、単離された同種細胞、好ましくはＴ細胞またはＮＫ細胞など、本明細書に開示される細胞集団、本明細書に開示される組成物、本明細書に開示される単離された複合体、または必要に応じて患者由来の自己細胞の調達に関する指示のうちの任意の１つまたは複数を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。そのようなキットは、ＣＡＲの形質導入、選択、活性化または増大に適した培地および他の試薬も含み得る、あるいはそれから本質的になり得る、またはその上さらにそれを含み得る。

【0276】

一態様では、キットは、ＣＡＲを発現する細胞またはその集団を含む、あるいはそれから本質的になる、またはその上さらにそれからなる。一部の実施形態では、このキットの細胞には、それを必要とする対象への投与前に、活性化または増大またはその両方が必要になり得る。さらなる実施形態では、キットは、単離されたＣＡＲを発現する細胞の活性化もしくは増大または活性化および増大の両方のために、上記の開示に包含されるものなどの培地および試薬をさらに含み得る、またはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、細胞は、ＣＡＲ治療に使用されるものである。さらなる実施形態では、キットは、ＣＡＲ治療を必要とする患者への単離された細胞の投与に関する指示を含む。

【0277】

本開示のキットはまた、例えば、緩衝剤、保存剤またはタンパク質安定化剤も含み得る。キットは、検出可能な標識、例えば、酵素または基質を検出するために必要な構成成分をさらに含み得る。キットは、アッセイし、試験試料と比較することができる対照試料または一連の対照試料も含有し得る。キットの各構成成分を個々の容器内に封入することができ、種々の容器の全てを、キットを使用して実施されるアッセイの結果の解釈に関する指示と一緒に単一のパッケージに入れることができる。本開示のキットは、キット容器上またはその中に書面を含有し得る。書面には、キットに含有される試薬の使用方法が記載されている。

【0278】

適用できるように、これらの提案されたキット構成成分を当業者に使用される通例の様式でパッケージングすることができる。例えば、これらの提案されたキット構成成分を溶液中に入れてまたは液体分散としてなどで提供することができる。

【0279】

本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な説明および図面から、特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【実施例】

【0280】

本発明を以下の実施例においてさらに記載する。実施例は特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
ＦＬＴ３ ＣＡＲを発現させるためのベクター

【0281】

種々のベクターおよび発現系を使用して、Ｔ細胞に対してＦＬＴ３ ＣＡＲを発現するように形質導入を行うことができる。適切なベクターの１つが図２に示されている。ｐＨＩＶ７ベクター（Chung et al. Mol Ther. 2014 May; 22(5): 952-963. Epub 2014 Feb 28.）に基づくこのレンチウイルスベクターでは、ＦＬＴ３ ＣＡＲ発現がＥＦ－１アルファプロモーターによって駆動され、ＦＬＴ３ ＣＡＲが、マーカーとして使用することができる短縮型ＣＤ１９と同時発現される。

【0282】

ＦＬＴ３ ＣＡＲ発現の代替ベクターが図３に示されている。この場合、発現はＭＭＬＶプロモーターによって駆動され、ＦＬＴ３ ＣＡＲが、マーカーとして使用することができる短縮型ＣＤ１９と同時発現される。
（実施例２）
改善されたＦＬＴ３ ＣＡＲ発現

【0283】

ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を富化させたＰＢＭＣを、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化した。翌日、細胞に対して、改善されたコード配列（配列番号１）によってコードされるＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現するベクターまたは同じＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現するが、以前に使用されていたコード配列によってコードされる他の点では同一のベクターを用いて形質導入を行った。このベクターにはｐＨＩＶ７骨格を使用した。本明細書に記載の通り、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲをＣＤ１９ｔタグと同時発現させた。２種の対照を使用した：ＧＦＰを発現するベクターおよびＣＤ１９ｔタグを発現するベクター。全ての場合において、Ｔ細胞へのトランスフェクションを、ＭＯＩを１として行った。５日目にＦＬＴ３ ＣＡＲ－Ｔ発現および細胞傷害性についてのアッセイを実施した。

【0284】

図４Ａ～４Ｄにおいて見ることができる通り、Ｔ細胞に改善されたＦＬＴ３特異的ＣＡＲコード配列を用いて形質導入した場合に最も高いＣＡＲ発現が認められた。
（実施例３）
改善されたＦＬＴ３＋腫瘍細胞の死滅

【0285】

種々の構築物を用いて形質導入したＴ細胞の細胞傷害性の評価を、２４時間および７２時間の時点でＭＯＬＭ１３細胞をＦＬＴ３＋腫瘍標的として、およびＵ９３７細胞を陰性対照として使用して行った。Ｅ：Ｔ比は１：５および１：２５とした。結果が、健康なドナー３個体からのデータの平均として、％腫瘍溶解±ＳＥＭとして示されている。図５Ａ～５Ｂにおいて見ることができる通り、改善されたＦＬＴ３特異的ＣＡＲコード配列を用いて形質導入したＴ細胞の方が以前のＦＬＴ３特異的ＣＡＲコード配列を用いて形質導入したＴ細胞よりも効果的であった。
（実施例４）
改善されたサイトカイン発現

【0286】

腫瘍細胞を患者３個体から得、種々の構築物を用いて形質導入したＴ細胞と共培養した。培養上清中のＩＬ－２（図６Ａ～６Ｃ）およびＩＦＮ－γ（図７Ａ～７Ｃ）の発現を測定した。図４Ａ～４Ｄおよび図５Ａ～５Ｂにおいて見ることができる通り、患者間の変動性がいくらか認められたにもかかわらず、改善されたＦＬＴ３特異的ＣＡＲコード配列を用いて形質導入したＴ細胞は以前のＦＬＴ３特異的ＣＡＲコード配列を用いて形質導入したＴ細胞よりも優れていた。
（実施例５）
侵攻性ヒトＦＬＴ３（＋）ＡＭＬ（ＭＯＬＭ－１３）のマウスモデルにおけるＦＬＴ３ ＣＡＲ活性。

【0287】

０日目に、ルシフェラーゼを発現するＭＯＬＭ－１３細胞１×１０^５個を１１週齢の雄ＮＳＧマウスに注射した。ＭＯＬＭ－１３注射の１時間後、生存可能に凍結および解凍したＦＬＴ３ ＣＡＲ ＮＫ細胞（２０×１０^６個）および生存可能に凍結させたＦＬＴ３ ＣＡＲ Ｔ細胞（５×１０^６個）を０日目にＩＶ注射した。ＦＬＴ３ ＣＡＲ ＮＫ細胞を受けたマウスは２つの群に分けた：一方の群はＦＬＴ３ ＣＡＲ ＮＫ細胞の単回ＩＶ注射を週に１回受け、他方の群はＦＬＴ３ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の投薬を１週間に３日間連続して３回受けた（０日目、１日目、２日目、および７日目、８日目、９日目など）。最後の群は、ＦＬＴ３ ＣＡＲ Ｔ細胞の単回投薬を受けた（２１日目に再燃が見られた）。
実施形態

【0288】

実施形態１．配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子。

【0289】

実施形態２．実施形態１の核酸分子を含むウイルスベクターまたは発現ベクター。

【0290】

実施形態３．Ｔ２Ａスキップ配列および短縮型ＥＧＦＲまたは短縮型ＣＤ１９をコードする配列をさらに含む、実施形態１の核酸分子。

【0291】

実施形態４．Ｔ２Ａスキップ配列および短縮型ＥＧＦＲをコードする配列をさらに含む、実施形態１の核酸分子。

【0292】

実施形態５．Ｔ２Ａスキップ配列および短縮型ＣＤ１９をコードする配列をさらに含む、実施形態１の核酸分子。

【0293】

実施形態６．Ｔ２Ａスキップ配列および短縮型ＥＧＦＲをコードする配列をさらに含む、実施形態１の核酸分子。

【0294】

実施形態７．Ｔ２Ａスキップ配列および短縮型ＣＤ１９をコードする配列をさらに含む、実施形態１の核酸分子。

【0295】

実施形態８．レンチウイルスベクターである、実施形態２のベクター。

【0296】

実施形態９．レトロウイルスベクターである、実施形態２のベクター。

【0297】

実施形態１０．配列番号１のヌクレオチド配列の発現が、ＥＦ－１アルファプロモーターまたはＭＭＬＶプロモーターの制御下にある、実施形態２のベクター。

【0298】

実施形態１１．実施形態１の核酸分子を含むベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団。

【0299】

実施形態１２．セントラルメモリーＴ細胞、ＮＫ細胞、ナイーブメモリーＴ細胞、汎Ｔ細胞またはＣＤ２５＋細胞およびＣＤ１４＋細胞が実質的に枯渇したＰＢＭＣを含む、実施形態１１のヒトＴ細胞の集団。

【0300】

実施形態１３．急性骨髄性白血病に罹患している患者を処置する方法であって、実施形態１の核酸分子を含むベクターによって形質導入された自己または同種ヒトＴ細胞の集団を投与するステップを含む、方法。

【0301】

実施形態１４．患者が、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）に活性化突然変異を有する腫瘍細胞を有する、実施形態１３の方法。

【0302】

実施形態１５．患者が、ＦＬＴ３－ＩＴＤ突然変異を有する腫瘍細胞を有する、実施形態１３の方法。

【0303】

実施形態１６．実施形態キメラ抗原受容体を局所的にまたは全身的に投与する、実施形態１３の方法。

【0304】

実施形態１７．キメラ抗原受容体を単回投薬または反復投薬によって投与する、実施形態１３の方法。

【0305】

実施形態１８．ＣＡＲ Ｔ細胞を調製する方法であって、自己または同種ヒトＴ細胞の集団を用意するステップと、実施形態１の核酸分子を含むベクターによってＴ細胞に形質導入するステップとを含む、方法。
配列表

【0306】

配列番号１：最適化されたＣＡＲコード配列、

【化25】

【化26】

【0307】

配列番号２：ＦＬＴ３ ＣＡＲ、

【化27】

【0308】

配列番号３：シグナル配列、ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ

【0309】

配列番号４：ＦＬＴ３ ｓｃＦｖ。配列番号４のアミノ酸（ａａ）１～ａａ１１８は重鎖可変領域であり、配列番号４のａａ１３４～ａａ２４１は軽鎖可変領域であり、配列番号４のａａ１１９～ａａ１３３はペプチドリンカーである。

【化28】

【0310】

配列番号５：ＩｇＧ１ヒンジドメイン、ＬＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＤＰＫＧＴ

【0311】

配列番号６：ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ

【0312】

配列番号７：ＣＤ２８共刺激ドメイン、ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ

【0313】

配列番号８：ＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、

【化29】

【0314】

配列番号９：リボソームスキップ配列、ＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ

【0315】

配列番号１０：ｒＥＧＦＲ、

【化30】

【0316】

配列番号１１：ｔＣＤ１９、

【化31】

【0317】

配列番号１２：コンセンサス配列、小文字は、任意のヌクレオチドまたは配列番号１内の対応する位置に位置するヌクレオチドを示す、

【化32】

【化33】

【0318】

配列番号１３：ｔＣＤ１９、

【化34】

【0319】

配列番号１４：最適化前のｓｃＦｖコード配列

【化35】

【0320】

配列番号１５：ＣＤＲＬ１、ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨ

【0321】

配列番号１６：ＣＤＲＬ２、ＹＡＳＱＳＩＳ

【0322】

配列番号１７：ＣＤＲＬ３、ＱＱＳＮＴＷＰＹＴ

【0323】

配列番号１８：ＣＤＲＨ１、ＳＹＷＭＨ

【0324】

配列番号１９：ＣＤＲＨ２、ＥＩＤＰＳＤＳＹＫＤＹＮＱＫＦＫＤ

【0325】

配列番号２０：ＣＤＲＨ３、ＡＩＴＴＴＰＦＤＦ

【0326】

配列番号２１：ＦＬＴ３重鎖可変領域、

【化36】

【0327】

配列番号２２：ＦＬＴ３軽鎖可変領域、

【化37】

【0328】

配列番号２３：ＥＦ１アルファプロモーター

【化38】

【0329】

配列番号２４：ＭＭＬＶプロモーター、

【化39】

【0330】

配列番号２５：ＦＬＴ３アイソフォーム１、

【化40】

【化41】

【0331】

配列番号２６：ＦＬＴ３アイソフォーム２、

【化42】

【0332】

配列番号２７：ペプチドリンカー、ＧＧＧＧＳ

【0333】

配列番号２８：ｔＣＤ１９コード配列、

【化43】

【0334】

配列番号２９：２Ａペプチドコンセンサスモチーフ、
Ｄ－Ｖ／Ｉ－Ｅ－Ｘ－Ｎ－Ｐ－Ｇ－Ｐ、Ｘは任意のアミノ酸を指す

【0335】

配列番号３０：ＣＭＶプロモーター、

【化44】

等価物

【0336】

本発明をその詳細な説明と併せて記載したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであり、限定するものではないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変も以下の特許請求の範囲の範囲内に入る。全ての参考文献が、ありとあらゆる目的に関してそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0337】

特に定義されていなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、この技術が属する当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。

【0338】

本明細書において例示的に記載されている本技術は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の限定の非存在下で適切に実施することができる。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、限定されることなく、広く読み取られるべきである。さらに、本明細書で使用される用語および表現は、説明する用語として使用され、限定するものではなく、そのような用語および表現の使用において、示され、記載されている特徴の等価物またはその一部のいずれも排除するものではなく、種々の改変が特許請求された本技術の範囲内に入る可能性があることが理解される。

【0339】

したがって、本明細書で提供される材料、方法および実施例は、好ましい態様を代表するものであり、例示であり、本技術の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。

【0340】

本明細書では本技術を広範にかつ包括的に記載した。包括的な開示の範囲内に入る狭義の種および下位概念の分類のそれぞれも本技術の一部を形成する。これには、類概念から何らかの対象物を排除する条件または否定的な限定を伴う本技術の包括的な説明も、排除される材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、含まれる。

【0341】

さらに、本技術の特色または態様がマルクーシュ群の用語で記載されている場合、それにより、本技術がマルクーシュ群のあらゆる個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されることが当業者には理解されよう。

【0342】

本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それぞれが、個別に参照により組み込まれる場合と同じ程度に、その全体が参照により本明細書に明白に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めた本明細書に支配される。

【0343】

他の態様は、以下の特許請求の範囲内に記載されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】