(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-30
(54)【発明の名称】ＵＢＲボックスドメインリガンドとしての化合物
(51)【国際特許分類】
C07C 235/16 20060101AFI20230523BHJP
A61K 31/167 20060101ALI20230523BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230523BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230523BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20230523BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230523BHJP
【ＦＩ】
C07C235/16 Z CSP
A61K31/167
A61P21/00
A61P43/00 111
A61P43/00 105
A61P3/00
A61P27/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022563901
(86)(22)【出願日】2021-04-27
(85)【翻訳文提出日】2022-12-19
(86)【国際出願番号】 KR2021005335
(87)【国際公開番号】W WO2021221444
(87)【国際公開日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】63/015,945
(32)【優先日】2020-04-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522408290
【氏名又は名称】オートタック インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】クォン、ヨン テ
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヒュン テ
(72)【発明者】
【氏名】ナ、ジェオン ウン
(72)【発明者】
【氏名】セオ、ユ ジン
(72)【発明者】
【氏名】ジ、チャン フーン
(72)【発明者】
【氏名】チョイ、ハ リム
(72)【発明者】
【氏名】リー、ジ ウン
(72)【発明者】
【氏名】ヘオ、ア ジュン
【テーマコード（参考）】
4C206
4H006
【Ｆターム（参考）】
4C206AA01
4C206AA02
4C206AA03
4C206GA04
4C206GA31
4C206KA01
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZA33
4C206ZA94
4C206ZB21
4C206ZC01
4C206ZC21
4H006AA01
4H006AB20
(57)【要約】
本明細書は、ＵＢＲボックスドメインリガンドとしての化合物に関するものである。本明細書は、ＵＢＲボックスドメインに結合する低分子化合物を提供する。さらに、本明細書は、ＵＢＲボックスドメインに結合するリガンド化合物を含むＵＢＲボックスドメイン基質結合を阻害するための組成物、ＵＢＲ関連疾患を処置するための医薬組成物、およびその用途を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式１：［式１］
【化7】
またはその塩であって、
式中、Ａ１はＣＨ３またはＮＨ２である、化合物またはその塩。
【請求項2】
ＵＢＲボックスドメイン基質結合を阻害するための組成物であって、前記組成物が請求項１に記載の化合物またはその塩を含む、組成物。
【請求項3】
ＵＢＲ関連疾患を処置するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容され得る塩を含む、医薬組成物。
【請求項4】
前記ＵＢＲ関連疾患が、筋ジストロフィー（ベッカー型、先天性型、デュシェンヌ型、遠位型、エメリー－ドレイフス型、顔面肩甲上腕型、肢帯型、筋緊張型、眼咽頭型）によって引き起こされる筋肉低下、サルコペニアもしくは癌悪液質を含む筋肉低下もしくは分解によって媒介される筋肉消耗疾患、脂肪肉腫、嚢胞性線維症、ヨハンソン・ブリザード症候群、閉塞性尿路疾患（尿道閉塞続発）、自己免疫性膵炎を含む過剰なタンパク質分解によって引き起こされる疾患、またはアッシャー症候群を含むＵＢＲボックスおよびＵＢＲタンパク質に関連する既知の疾患を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年４月２７日に出願された米国仮出願番号６３／０１５，９４５の利益および優先権を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年４月２７日に出願された米国仮出願番号６３／０１５，９４５の利益および優先権を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本明細書で開示される内容は、ＵＢＲボックスドメインリガンドとしての化合物に関するものである。ＵＢＲボックスドメインは、Ｎ末端則経路のユビキチンタンパク質リガーゼＥ３成分ｎ－レコグニン（ＵＢＲ）タンパク質に共通して存在するドメインである。この場合、ＵＢＲボックスドメインは、基質が結合するドメインとして知られている。ＵＢＲボックスドメインは、基質のＮ末端残基と結合して基質にマルチユビキチン鎖を形成するために必須であり、このプロセスを通じて基質が分解されることが知られている。
【0003】
本明細書は、ＵＢＲボックスドメインに結合するリガンドとして機能する化合物に関するものである。
【背景技術】
【0004】
細胞は、タンパク質を分解することで、生体内タンパク質の量および機能を調節している。この場合、生体内タンパク質はＮ末端残基配列に依存して分解されることがあり、このような分解経路はＮ末端則経路として知られている。すなわち、Ｎ末端則経路は、特定のタンパク質のＮ末端を分解シグナルとして使用するタンパク質分解系である。Ｎ末端則経路は、以下のようなタンパク質分解プロセスを含むことができる。
【0005】
真核生物の場合、Ｎ－レコグニンがタンパク質のＮ末端の分解シグナルを認識し、当該Ｎ－レコグニンは分解されるタンパク質にユビキチンを結合させて、タンパク質を分解することができる。この場合、Ｎ末端の分解シグナルとしては、Ｎ末端に正の電荷を有する残基（タイプ１：例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジン）または大きな疎水性残基（タイプ２：フェニルアラニン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンおよびチロシン）を有するものを挙げることができる。本発明者らは、Ｎ－レコグニンＵＢＲ１、ＵＢＲ２、ＵＢＲ３およびＵＢＲ５を初めて発見またはクローニングし、Ｎ－レコグニンが基質認識ドメインとしてＵＢＲボックスドメインを有することを明らかにした（Ｔａｓａｋｉら、２００５）。この場合、Ｎ－レコグニンがＮ末端則リガンドと結合して生成されたユビキチン化基質は、プロテアソームに運ばれ、短いペプチドに分解される。このプロセスで、Ｎ－レコグニンがＮ末端則基質を標的とする際に必要となる水素結合のほとんどを、特定のＮ末端残基（Ｎｔ－Ａｒｇ、Ｎｔ－Ｈｉｓ、Ｎｔ－Ｌｙｓ、Ｎｔ－Ｔｒｐ、Ｎｔ－Ｐｈｅ、Ｎｔ－Ｔｙｒ、Ｎｔ－Ｌｅｕ、Ｎｔ－Ｌｅｕ）が提供するため、結合に必須の決定因子である（Ｓｒｉｒａｍ ａｎｄ Ｋｗｏｎ ，２０１０）。
【0006】
ＵＢＲはユビキチンタンパク質リガーゼＥ３成分ｎ－レコグニンの略称であり、ＵＢＲはタンパク質のＮ末端分解シグナルを認識するＮ－レコグニンである。哺乳類には、少なくとも７種類のＵＢＲ１～７が存在することが知られている。さらに、ＵＢＲが共通して有するＵＢＲボックスドメインは、約７０残基の大きさを有するジンクフィンガーモチーフであり、高度に保存された基質結合ドメインとして知られている［Ｋｗｏｎら、１９９８；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，１９９９；Ｋｗａｋら、２００４；Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，１９９６；Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，１９９７；Ｋｗｏｎら、２０１１；およびＺｅｎｋｅｒら、２０１４］。
【0007】
すなわち、ＵＢＲはタンパク質分解経路であるＮ末端則経路に関連するＮ－レコグニンであり、ＵＢＲのＵＢＲボックスドメインは基質結合ドメインである。特に、ＵＢＲ１～７のうち、ＵＢＲ１、ＵＢＲ２、ＵＢＲ３およびＵＢＲ５はユビキチンタンパク質リガーゼＥ３として作用することが知られており、ＲＩＮＧドメインまたはＨＥＣＴドメインを有している。ＵＢＲに結合したＮ末端則基質は、ユビキチンプロテアソーム経路で分解される。具体的には、ＵＢＲに含まれるＵＢＲボックスドメインが基質のＮ末端アミノ酸を認識し、ＲＩＮＧドメインまたはＨＥＣＴドメインを介して基質をユビキチン化し、それによってプロテアソーム経路を介して基質を分解する。例えば、ミスフォールドしたタンパク質が細胞内に長期間留まると、タンパク質が凝集してプロテアソームを阻害したり、他の細胞機能を低下させたりすることがあるため、ユビキチンプロテアソーム経路を介して分解される（Ｊｉ ａｎｄ Ｋｗｏｎ，２０１７）。
【0008】
すなわち、ＵＢＲボックスドメインは、Ｎ末端の分解シグナルを認識することにより、細胞内タンパク質分解経路において重要な役割を担っている。したがって、ＵＢＲボックスドメインに結合するリガンドは、細胞内タンパク質分解経路に影響を及ぼし得る。
【0009】
上記のとおり、本明細書は、細胞内タンパク質分解経路に関連するＵＢＲボックスドメインに結合するリガンドとしての化合物に関するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本明細書は、ＵＢＲボックスドメインに結合する低分子化合物を提供する。この場合、ＵＢＲボックスドメインは、ＵＢＲ１～７に含まれるＵＢＲボックスドメインを含む。低分子化合物は、ＵＢＲボックスドメインに結合するのに適したリガンドとして機能することができる。
【0011】
１つの実施形態において、本明細書は、ＵＢＲボックスドメインに結合するリガンド化合物を含む、ＵＢＲボックスドメイン基質結合を阻害するための組成物を提供する。
【0012】
具体的な一実施形態において、本明細書は、ＵＢＲ関連疾患を処置するための医薬組成物、およびその使用を提供し、当該組成物は、ＵＢＲボックスドメインに結合するリガンド化合物を含む。
【0013】
より具体的な実施形態において、本明細書は、筋ジストロフィー（ベッカー型、先天性型、デュシェンヌ型、遠位型、エメリー－ドレイフス型、顔面肩甲上腕型、肢帯型、筋緊張型、眼咽頭型）によって引き起こされる筋肉低下、サルコペニアもしくは癌悪液質を含む筋肉低下もしくは分解によって媒介される筋肉消耗疾患、脂肪肉腫、嚢胞性線維症、ヨハンソン・ブリザード症候群、閉塞性尿路疾患（尿道閉塞続発）、自己免疫性膵炎を含む過剰なタンパク質分解によって引き起こされる疾患、またはアッシャー症候群を含むＵＢＲボックスおよびＵＢＲタンパク質に関連する既知の疾患を含む疾患を処置するための医薬組成物、ならびにその使用を提供し、当該組成物はＵＢＲボックスドメインに結合するリガンド化合物を含む。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本明細書は、式１の構造を有する化合物またはその塩を提供する：
［式１］
式中、Ａ１は、ＣＨ３またはＮＨ２である。
［式１］
【化1】
【0015】
この場合、一例として、本明細書は、Ａ１がＣＨ３またはＮＨ２である本化合物またはその塩を含むＵＢＲボックスドメイン基質結合を阻害するための組成物を提供する。
【0016】
この場合、一例として、本明細書は、Ａ１がＣＨ３またはＮＨ２である本化合物またはその薬学的に許容され得る塩を含むＵＢＲ関連疾患を処置するための医薬組成物、および本化合物を用いることによってＵＢＲ関連疾患を処置する方法を提供する。
【0017】
この場合、一例として、ＵＢＲ関連疾患は、筋ジストロフィー（ベッカー型、先天性型、デュシェンヌ型、遠位型、エメリー－ドレイフス型、顔面肩甲上腕型、肢帯型、筋緊張型、眼咽頭型）によって引き起こされる筋肉低下、サルコペニアもしくは癌悪液質を含む筋肉低下もしくは分解によって媒介される筋肉消耗疾患、脂肪肉腫、嚢胞性線維症、ヨハンソン・ブリザード症候群、閉塞性尿路疾患（尿道閉塞続発）、自己免疫性膵炎を含む過剰なタンパク質分解によって引き起こされる疾患、またはアッシャー症候群から選択されてもよい。
【0018】
有利な効果本明細書に開示される発明は、ＵＢＲボックスドメインに関して高い結合強度を有するリガンド化合物を提供する。
【0019】
ＵＢＲボックスドメインリガンド化合物を介して、ＵＢＲボックスドメインの基質結合を抑制することができ、この特性を生かした様々な用途を提供することができる。例えば、ＵＢＲボックスドメインリガンド化合物により、ＵＢＲ関連疾患（例えば、サルコペニア等）を処置することができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】イムノブロット法を用いて、筋アクチンがＡｒｇ／Ｎ－デグロン経路の基質であるかどうかを確認した実験結果を示す図である。
【0021】
【図2】試験管内転写／翻訳法を用いて、化合物（化合物１、２）をＵＢＲ１に結合させることによって分解されるはずであるＲ－ｎｓｐ４の発現が抑制されるかどうかを確認した実験結果を示す図である。
【0022】
【図3】イムノブロット法を用いて、化合物（化合物１、２）が筋肉細胞においてＵＢＲタンパク質の基質であるアクチンの分解を抑制するかどうかを確認した実験結果を示す図である。
【0023】
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下、添付図面を参照しながら具体的な例示的実施形態および実施例を通じて本発明の内容をより詳細に説明する。添付図面には、本発明のいくつかの例示的な実施形態が含まれているが、すべての例示的な実施形態ではないことに留意されたい。本明細書によって開示された発明の内容は、様々に実施することができ、本明細書に記載された特定の例示的な実施形態に限定されるものではない。本明細書に開示される発明が属する技術分野における通常の技術を有する者であれば、本明細書に開示される発明の内容の多くの変更および他の例示的な実施形態を想到することができるであろう。したがって、本明細書に開示される発明の内容は、本明細書に記載された特定の例示的な実施形態に限定されるものではなく、その変更および他の例示的な実施形態も特許請求の範囲に含まれることを理解されたい。
【0025】
［用語の定義］
本明細書で使用される主な用語の定義を以下に示す。
本明細書で使用される主な用語の定義を以下に示す。
【0026】
ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３成分ｎ－レコグニン（ＵＢＲ）本明細書において使用されるＵＢＲという用語は、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３成分ｎ－レコグニンの略称を指す。ＵＢＲは、タンパク質のＮ末端残基を認識するＮ－レコグニンであり、哺乳類には少なくとも７種類のＵＢＲ１～７が存在することが知られている。ＵＢＲはＮ－レコグニンであり、生体内タンパク質分解経路であるＮ末端則経路に関連している。具体的には、ＵＢＲは、タンパク質のＮ末端分解シグナル（Ｎ－デグロン）を認識し、基質タンパク質がユビキチンプロテアソーム経路を介して分解されるプロセスに関与する。
【0027】
ＵＢＲボックスドメイン本明細書で使用されるＵＢＲボックスドメインという用語は、ＵＢＲタンパク質に存在するドメインであり、ジンクフィンガーモチーフである。ＵＢＲタンパク質は、ＵＢＲ１～７タンパク質を含む。ＵＢＲボックスドメインは、基質タンパク質が結合するドメインとして知られている。本明細書に開示されるＵＢＲボックスドメインリガンドとしての化合物は、ＵＢＲボックスドメインに結合することにより、ＵＢＲボックスドメインの基質結合を抑制することができる。さらに、本明細書に開示されるＵＢＲボックスドメインリガンドとしての化合物は、細胞内タンパク質分解経路に影響を及ぼし得る。
【0028】
ＲＩＮＧドメイン
本明細書で使用されるＲＩＮＧドメインという用語は、ＵＢＲ１、２および３タンパク質に存在することが知られている。ＲＩＮＧドメインはまた、ＲＩＮＧユビキチン化ドメインと置き換えられ得る。ＲＩＮＧドメインは、タンパク質に存在するドメインであり、ジンクフィンガーモチーフである。ＲＩＮＧドメインは、Ｅ２に存在するユビキチンが基質タンパク質に転移されるプロセスで重要な役割を果たすドメインであり、ＲＩＮＧドメインは、ユビキチンが基質タンパク質に転移されるプロセスを一段階で行わせる役割を果たす。
本明細書で使用されるＲＩＮＧドメインという用語は、ＵＢＲ１、２および３タンパク質に存在することが知られている。ＲＩＮＧドメインはまた、ＲＩＮＧユビキチン化ドメインと置き換えられ得る。ＲＩＮＧドメインは、タンパク質に存在するドメインであり、ジンクフィンガーモチーフである。ＲＩＮＧドメインは、Ｅ２に存在するユビキチンが基質タンパク質に転移されるプロセスで重要な役割を果たすドメインであり、ＲＩＮＧドメインは、ユビキチンが基質タンパク質に転移されるプロセスを一段階で行わせる役割を果たす。
【0029】
ＨＥＣＴドメイン
本明細書で使用されるＨＥＣＴドメインという用語は、ＵＢＲ５タンパク質に存在することが知られている。ＨＥＣＴドメインはまた、ＨＥＣＴユビキチン化ドメインと置き換えられることもできる。ＨＥＣＴドメインは、Ｅ２に存在するユビキチンが基質タンパク質に転移されるプロセスにおいて重要な役割を果たすドメインである。Ｅ２に存在するユビキチンはＨＥＣＴドメインに運ばれ、次に基質タンパク質に転移される。すなわち、ＨＥＣＴドメインは、ユビキチンが基質タンパク質に転移されるプロセスを二段階で行わせる役割を果たす。
本明細書で使用されるＨＥＣＴドメインという用語は、ＵＢＲ５タンパク質に存在することが知られている。ＨＥＣＴドメインはまた、ＨＥＣＴユビキチン化ドメインと置き換えられることもできる。ＨＥＣＴドメインは、Ｅ２に存在するユビキチンが基質タンパク質に転移されるプロセスにおいて重要な役割を果たすドメインである。Ｅ２に存在するユビキチンはＨＥＣＴドメインに運ばれ、次に基質タンパク質に転移される。すなわち、ＨＥＣＴドメインは、ユビキチンが基質タンパク質に転移されるプロセスを二段階で行わせる役割を果たす。
【0030】
ジンクフィンガーモチーフ
本明細書において使用される場合、ジンクフィンガーモチーフという用語は、タンパク質の構造を安定化させるために１つまたは複数の亜鉛イオンが存在するタンパク質構造モチーフを指す。本明細書のＵＢＲボックスドメインおよびＲＩＮＧドメインは、ジンクフィンガーモチーフである。
本明細書において使用される場合、ジンクフィンガーモチーフという用語は、タンパク質の構造を安定化させるために１つまたは複数の亜鉛イオンが存在するタンパク質構造モチーフを指す。本明細書のＵＢＲボックスドメインおよびＲＩＮＧドメインは、ジンクフィンガーモチーフである。
【0031】
リガンド本明細書において使用される場合、リガンドという用語は、タンパク質に特異的に結合する物質を指す。タンパク質には、酵素または受容体が含まれ、タンパク質が酵素である場合、リガンドは酵素に結合する基質等を指すことがあり、タンパク質が受容体である場合、リガンドは受容体に結合するホルモン等を指すことがある。
【0032】
本明細書で提供されるＵＢＲボックスドメインリガンドとしての化合物は、ＵＢＲボックスドメインに結合する化合物を意味する。一例として、本化合物は、ＵＢＲタンパク質中のＵＢＲボックスドメインに結合する化合物を指す。具体例として、本化合物は、ＵＢＲ１～７の１つまたは複数のタンパク質に存在するＵＢＲボックスドメインに結合する化合物を指す。しかしながら、本化合物はこれに限定されるものではない。
【0033】
本明細書で提供されるＵＢＲボックスドメインリガンドとしての化合物は、ＵＢＲボックスドメインの基質と競合的に作用することができる。すなわち、本化合物は、ＵＢＲボックスドメインの基質結合を抑制することができる。さらに、本化合物は、基質の結合を抑制することにより、基質の分解を抑制することができる。
【0034】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書で言及したすべての刊行物、特許および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【0035】
以下、本発明の具体的な内容を開示する。
【0036】
Ｉ．ＵＢＲボックスドメイン
１．概要
本明細書で提供されるＵＢＲボックスドメインリガンドとしての化合物は、ＵＢＲボックスドメインに結合する。ＵＢＲボックスドメインは、Ｎ末端残基配列またはＮ末端分解シグナルが結合するドメインとして知られている。このドメインは、タンパク質がＮ末端則経路によって分解されるプロセスに関連している。したがって、本化合物は、Ｎ末端則経路を介したタンパク質分解プロセスに影響を及ぼし得る。
１．概要
本明細書で提供されるＵＢＲボックスドメインリガンドとしての化合物は、ＵＢＲボックスドメインに結合する。ＵＢＲボックスドメインは、Ｎ末端残基配列またはＮ末端分解シグナルが結合するドメインとして知られている。このドメインは、タンパク質がＮ末端則経路によって分解されるプロセスに関連している。したがって、本化合物は、Ｎ末端則経路を介したタンパク質分解プロセスに影響を及ぼし得る。
【0037】
２．Ｎ末端則経路
細胞は、タンパク質分解を通じてタンパク質の量を調節している。この場合、タンパク質の分解シグナルであるデグロンを認識するプロセスによって、タンパク質の分解のプロセスが行われることが知られている。具体的には、タンパク質のＮ末端残基配列に依存してタンパク質分解が調節されており、Ｎ末端に存在するタンパク質分解シグナルを総称してＮ－デグロンと呼ぶ。Ｎ－デグロンとしては、Ｎ末端に正の電荷を有する残基（例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジン）または大きな疎水性残基（フェニルアラニン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンおよびチロシン）を有するものが挙げられる。上記のとおり、Ｎ末端則という用語は、タンパク質の半減期がタンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸残基によって決定されるという関連性に基づいて使用されてきた。
細胞は、タンパク質分解を通じてタンパク質の量を調節している。この場合、タンパク質の分解シグナルであるデグロンを認識するプロセスによって、タンパク質の分解のプロセスが行われることが知られている。具体的には、タンパク質のＮ末端残基配列に依存してタンパク質分解が調節されており、Ｎ末端に存在するタンパク質分解シグナルを総称してＮ－デグロンと呼ぶ。Ｎ－デグロンとしては、Ｎ末端に正の電荷を有する残基（例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジン）または大きな疎水性残基（フェニルアラニン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンおよびチロシン）を有するものが挙げられる。上記のとおり、Ｎ末端則という用語は、タンパク質の半減期がタンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸残基によって決定されるという関連性に基づいて使用されてきた。
【0038】
３．ＵＢＲボックスドメイン
Ｎ末端則経路では、Ｎ－デグロンはＮ－レコグニンによって認識され、Ｎ－レコグニンとしてユビキチンタンパク質リガーゼＥ３成分ｎ－レコグニン（ＵＢＲ）が発見された。ＵＢＲは、ＵＢＲボックスドメインによって、Ｎ末端残基配列またはＮ末端分解シグナルを認識することが知られている。すなわち、ＵＢＲは、ＵＢＲボックスドメインを介してタンパク質分解シグナルを認識し、タンパク質分解シグナルの認識を通じて、タンパク質の分解プロセスを行う。
Ｎ末端則経路では、Ｎ－デグロンはＮ－レコグニンによって認識され、Ｎ－レコグニンとしてユビキチンタンパク質リガーゼＥ３成分ｎ－レコグニン（ＵＢＲ）が発見された。ＵＢＲは、ＵＢＲボックスドメインによって、Ｎ末端残基配列またはＮ末端分解シグナルを認識することが知られている。すなわち、ＵＢＲは、ＵＢＲボックスドメインを介してタンパク質分解シグナルを認識し、タンパク質分解シグナルの認識を通じて、タンパク質の分解プロセスを行う。
【0039】
ＵＢＲによるタンパク質の分解プロセスは、以下の内容を含み得る。
ＵＢＲボックスドメインは、Ｎ末端分解シグナルを有する基質を認識し、ユビキチンが基質に結合し、ユビキチンが結合した基質がプロテアソームによって分解され得る。すなわち、Ｎ末端分解シグナルを有する基質が、ユビキチンプロテアソーム系（ＵＰＳ）によって分解され得る。
ＵＢＲボックスドメインは、Ｎ末端分解シグナルを有する基質を認識し、ユビキチンが基質に結合し、ユビキチンが結合した基質がプロテアソームによって分解され得る。すなわち、Ｎ末端分解シグナルを有する基質が、ユビキチンプロテアソーム系（ＵＰＳ）によって分解され得る。
【0040】
ＩＩ．ＵＢＲボックスドメインリガンド
１．概要
ＩＩ．ＵＢＲボックスドメインリガンド
１．概要
１）本明細書の化合物は、ＵＢＲボックスドメインの構造およびＮ末端経路基質への結合の特性を反映したものである。本明細書に開示されるＵＢＲボックスドメインリガンドとしての化合物は、ＵＢＲボックスドメインの構造およびＵＢＲボックスドメインとＮ末端経路基質との結合形態を考慮して設計されたものである。
１．概要
ＩＩ．ＵＢＲボックスドメインリガンド
１．概要
１）本明細書の化合物は、ＵＢＲボックスドメインの構造およびＮ末端経路基質への結合の特性を反映したものである。本明細書に開示されるＵＢＲボックスドメインリガンドとしての化合物は、ＵＢＲボックスドメインの構造およびＵＢＲボックスドメインとＮ末端経路基質との結合形態を考慮して設計されたものである。
【0041】
ＵＢＲボックスドメインに存在する様々なアミノ酸は、イオン相互作用、水素結合、疎水性相互作用等によってＮ末端経路基質中のアミノ酸と相互作用し、結合する。これらの結合様式を解析することにより、ＵＢＲボックスドメインと適切な結合様式を形成することができる低分子化合物が合成され、本明細書に提供される。さらに、式１による化合物を以下に提供する。
【0042】
２）本明細書の化合物は、ＵＢＲボックスドメインとの結合を向上させるコア構造を有する。
【0043】
１）式１
［式１］
【化2】
【0044】
上記式１中、Ａ１は、ＣＨ３またはＮＨ２である。
【0045】
この場合、本明細書に開示される式１の化合物は、その立体異性体または塩の形態で存在してもよく、そのような化合物の異性体または塩の形態も本明細書の範囲に含まれる。
【0046】
２）化合物の具体例
ｉ）化合物
一例として、本明細書に開示されるＵＢＲボックスドメインリガンドとしての化合物は、以下に記載されるものから選択することができる：
［化合物１］
［化合物２］
この場合、化合物として、その考え得る異性体の形態、またはその混合物の形態を考慮してもよい。例えば、エナンチオマーおよびジアステレオマーを含むすべての立体異性体、またはそれらの混合物（例えば、ラセミ混合物）を考慮してもよい。
ｉ）化合物
一例として、本明細書に開示されるＵＢＲボックスドメインリガンドとしての化合物は、以下に記載されるものから選択することができる：
［化合物１］
【化3】
【化4】
【0047】
ｉｉ）化合物の塩
本明細書に開示される化合物として、その塩の形態を考慮してもよい。この場合、塩には、薬学的に許容され得る塩が含まれる。本明細書に開示される塩としては、酸付加塩または塩基付加塩が挙げられる。塩を形成する例示的な酸としては、塩酸、硫酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸およびグルタル酸等が挙げられ、また、塩を形成する例示的な塩基としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、メチルアミンおよびトリメチルアミン等が挙げられる。しかしながら、酸および塩基はこれに限定されるものではなく、当業者であれば容易に選択することができる。
本明細書に開示される化合物として、その塩の形態を考慮してもよい。この場合、塩には、薬学的に許容され得る塩が含まれる。本明細書に開示される塩としては、酸付加塩または塩基付加塩が挙げられる。塩を形成する例示的な酸としては、塩酸、硫酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸およびグルタル酸等が挙げられ、また、塩を形成する例示的な塩基としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、メチルアミンおよびトリメチルアミン等が挙げられる。しかしながら、酸および塩基はこれに限定されるものではなく、当業者であれば容易に選択することができる。
【0048】
ＩＩＩ．化合物の使用
１．ＵＢＲボックスドメイン基質結合の阻害
ＵＢＲボックスドメイン基質結合を阻害するための組成物本明細書に開示される化合物は、ＵＢＲボックスドメイン基質結合を阻害するための組成物の調製に使用することができる。一例として、本明細書に開示される化合物を含む組成物は、ＵＢＲボックスドメインに結合することによって、ＵＢＲボックスドメイン基質結合を阻害するために使用することができる。別の例として、本化合物を含む組成物は、ＵＢＲボックスドメインに結合して分解される基質が分解されるのを防止する用途のために使用することができる。具体例として、本化合物を含む組成物は、ＵＢＲボックスドメインに結合している基質がユビキチン－プロテアソーム経路によって分解されるのを防止する用途のために使用することができる。
１．ＵＢＲボックスドメイン基質結合の阻害
ＵＢＲボックスドメイン基質結合を阻害するための組成物本明細書に開示される化合物は、ＵＢＲボックスドメイン基質結合を阻害するための組成物の調製に使用することができる。一例として、本明細書に開示される化合物を含む組成物は、ＵＢＲボックスドメインに結合することによって、ＵＢＲボックスドメイン基質結合を阻害するために使用することができる。別の例として、本化合物を含む組成物は、ＵＢＲボックスドメインに結合して分解される基質が分解されるのを防止する用途のために使用することができる。具体例として、本化合物を含む組成物は、ＵＢＲボックスドメインに結合している基質がユビキチン－プロテアソーム経路によって分解されるのを防止する用途のために使用することができる。
【0049】
具体例として、本明細書に開示される化合物を含む組成物は、ＵＢＲボックスドメインに結合するＮ末端残基を有する基質の結合を阻害する用途のために使用することができる。具体例として、本明細書に開示される化合物を含む組成物は、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、ロイシン（Ｌｅｕ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ）などのＮ末端残基を有する基質の結合を阻害する用途のために使用することができる。しかしながら、用途はこれに限定されるものではなく、当該該組成物は、当該技術分野においてＵＢＲボックスドメインの基質として知られている物質の結合を阻害する用途のために使用することができる。
【0050】
実施例を参照すると、本明細書に開示される化合物は、ＵＢＲに結合することによって基質の分解を阻害することが確認できる（図１、２および３を参照）。
【0051】
２．ＵＢＲ関連疾患の処置
本明細書の化合物またはその塩は、ＵＢＲボックスドメインに結合する性質を有する。すなわち、本明細書の化合物は、ＵＢＲボックスドメインに結合するリガンドとして機能する化合物である。したがって、これらの化合物は、体内でＵＢＲボックスドメインに結合することによって分解されるタンパク質の分解を阻害するために用いることができ、このようなメカニズムを使用してＵＢＲ関連疾患を処置することができる。
本明細書の化合物またはその塩は、ＵＢＲボックスドメインに結合する性質を有する。すなわち、本明細書の化合物は、ＵＢＲボックスドメインに結合するリガンドとして機能する化合物である。したがって、これらの化合物は、体内でＵＢＲボックスドメインに結合することによって分解されるタンパク質の分解を阻害するために用いることができ、このようなメカニズムを使用してＵＢＲ関連疾患を処置することができる。
【0052】
１）医薬組成物
本明細書に開示される化合物は、処置を必要とする対象を処置するための医薬組成物の調製に使用することができる。
本明細書に開示される化合物は、処置を必要とする対象を処置するための医薬組成物の調製に使用することができる。
【0053】
この場合、処置には、特定の病状の症候を緩和する効果、または疾患の進行を遅延させる効果を有することが含まれる。この場合、対象には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。この場合、医薬組成物は、前述の化合物とともに、薬学的に許容され得る担体、賦形剤および／または添加剤を含んでいてもよい。薬学的に許容され得る担体、賦形剤および添加剤としては、水、生理食塩水、グリコール、グリセロール、動植物油脂類、油、澱粉等が挙げられるが、これに限定されず、薬学的に許容され得る、当該技術分野で公知のすべての許容され得る担体、賦形剤および／または添加剤が含まれる。
【0054】
２）処置方法
本明細書は、本明細書に開示される化合物またはその薬学的に許容され得る塩を、投与を必要とする対象に投与する段階を含む、処置方法を提供する。この場合、化合物またはその薬学的に許容され得る塩の投与は、化合物またはその塩を投与しない対象者と比較して、特定の病状の症候を緩和する効果、または疾患の進行を遅延させる効果を有し得る。この場合、対象には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。
本明細書は、本明細書に開示される化合物またはその薬学的に許容され得る塩を、投与を必要とする対象に投与する段階を含む、処置方法を提供する。この場合、化合物またはその薬学的に許容され得る塩の投与は、化合物またはその塩を投与しない対象者と比較して、特定の病状の症候を緩和する効果、または疾患の進行を遅延させる効果を有し得る。この場合、対象には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。
【0055】
－ＵＢＲ関連疾患
一例として、本明細書は、本化合物またはその薬学的に許容され得る塩を、ＵＢＲ関連疾患を有する対象に投与する段階を含む処置方法を提供する。すなわち、本明細書に開示される化合物またはその薬学的に許容され得る塩は、ＵＢＲ関連疾患を処置するために使用することができる。具体例として、本化合物またはその薬学的に許容され得る塩は、ＵＢＲボックスドメインに結合することによって分解されるタンパク質の分解を阻害することにより、処置対象となる特定の疾患を処置するために使用することができる。
一例として、本明細書は、本化合物またはその薬学的に許容され得る塩を、ＵＢＲ関連疾患を有する対象に投与する段階を含む処置方法を提供する。すなわち、本明細書に開示される化合物またはその薬学的に許容され得る塩は、ＵＢＲ関連疾患を処置するために使用することができる。具体例として、本化合物またはその薬学的に許容され得る塩は、ＵＢＲボックスドメインに結合することによって分解されるタンパク質の分解を阻害することにより、処置対象となる特定の疾患を処置するために使用することができる。
【0056】
特定の疾患としては、筋ジストロフィー（ベッカー型、先天性型、デュシェンヌ型、遠位型、エメリー－ドレイフス型、顔面肩甲上腕型、肢帯型、筋緊張型、眼咽頭型）によって引き起こされる筋肉低下、サルコペニアもしくは癌悪液質を含む筋肉低下もしくは分解によって媒介される筋肉消耗疾患、脂肪肉腫、嚢胞性線維症、ヨハンソン・ブリザード症候群、閉塞性尿路疾患（尿道閉塞続発）、自己免疫性膵炎を含む過剰なタンパク質分解によって引き起こされる疾患、またはアッシャー症候群を含むＵＢＲボックスおよびＵＢＲタンパク質に関連する既知の疾患が挙げられる。一例として、本化合物またはその薬学的に許容され得る塩は、ＵＢＲによって媒介される筋肉低下を処置するために使用することができる。例えば、癌、敗血症および甲状腺機能亢進症などの病状に伴う筋肉量の早期減少は、筋肉内タンパク質の分解の増加と関連しており、これはユビキチンプロテアソーム系の活性化と関連することが知られている。この場合、特にＮ末端則経路の活性化によりユビキチン結合が増加し、その結果、筋肉低下が生じることが知られている［ＡＬＦＲＥＤ Ｌ．ＧＯＬＤＢＥＲＧら、１９９８，１９９９］。それに応じて、本明細書に開示される化合物またはその薬学的に許容され得る塩は、ＵＢＲボックスドメインに結合することにより筋肉低下経路の活性化を防止することにより、疾患を処置するために使用することができる。しかしながら、本発明はこれに限定されるものではなく、特定の疾患には、当該技術分野においてＵＢＲに関連する疾患として知られているすべての疾患が含まれる。
【0057】
Ｖ．実施例
実施例１．化合物の合成
［表１］
実施例１．化合物の合成
［表１］
【0058】
化合物のリスト
１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ４００ＭＨｚおよびＢｒｕｋｅｒ Ｆｏｕｒｉｅｒ ３００ＭＨｚで記録し、内部標準としてＴＭＳを用いた。ＬＣＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ＨＰＬＣおよび６１２０ＭＳＤの四重極質量分析計で測定した（カラム：Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ、５μｍ）ＥＳ（＋）または（－）イオン化モードで操作；Ｔ＝３０℃；流速＝１．５ｍＬ／ｍｉｎ；検出波長：２２０ｎｍ、２５４ｎｍ。
実験例１－１
化合物１（Ｎ－（５－アセチル－２－クロロフェニル）－５－メトキシペンタンアミド）の調製
段階１）Ｂ２の合成ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中のＢ１（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－オン、５．００ｇ、５０ｍｍｏｌ、１．０当量）とオルトギ酸トリメチル（１０．６ｇ、１００ｍｍｏｌ、２．０当量）との混合物に、濃Ｈ２ＳＯ４（３ｍＬ）を２５℃で滴加した。この混合物を６５℃で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で濃縮した。８Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、この混合物を８０℃で２時間撹拌した。１０℃に冷却後、反応混合物を４Ｎ ＨＣｌで酸性化し、ＥＡ（５０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮してＢ２（５－メトキシペンタン酸、４．０ｇ、収率６０％）を無色の油状物として得た。
【表1】
実験例１－１
化合物１（Ｎ－（５－アセチル－２－クロロフェニル）－５－メトキシペンタンアミド）の調製
【化5】
【0059】
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ３．４１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．３４ （ｓ，３Ｈ），２．３９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．６２－１．７４（ｍ，４Ｈ）。
【0060】
段階２）化合物１の合成ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＢ２（５－メトキシペンタン酸、０．２ｇ、１．５２ｍｍｏｌ、１．０当量）とＨＡＴＵ（０．６９ｇ、１．８２ｍｍｏｌ、１．２当量）との混合物を２５℃で３０分間撹拌した。次に、１－（３－アミノ－４－クロロフェニル）エタン－１－オン（０．２６ｇ、１．５２ｍｍｏｌ、１．０当量）およびトリエチルアミン（０．３１ｇ、０．３０ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。この混合物を５０℃で４８時間撹拌した。この混合物を水（５０ｍＬ） に注ぎ、ＥＡ（５０ ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮して粗生成物を得て、これをｐｒｅｐ－ＨＰＬＣで精製した。回収した画分を濃縮し、大部分のＣＨ３ＣＮを除去した。残留画分を凍結乾燥して、化合物１（Ｎ－（５－アセチル－２－クロロフェニル）－５－メトキシペンタンアミド、３８ｍｇ、収率８．８％）を白色の固形物として得た。
【0061】
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ９．０３（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｄｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．３５（ｓ，３Ｈ），２．６１（ｓ，３Ｈ），２．５２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．８５－１．８８（ｍ，２Ｈ），１．６９－１．７３（ｍ，２Ｈ）。
【0062】
ＬＣＭＳ；Ｍａｓｓ Ｃａｌｃｄ．：２８３．７；ＭＳ Ｆｏｕｎｄ：２８３．９。
【0063】
実験例１－２
化合物２（４－クロロ－３－（５－メトキシペンタンアミド）ベンズアミド）の調製
ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＢ２（５－メトキシペンタン酸、０．２ｇ、１．５２ｍｍｏｌ、１．０当量）とＨＡＴＵ（０．６９ｇ、１．８２ｍｍｏｌ、１．２当量）との混合物を２５℃で３０分間撹拌した。次に、３－アミノ－４－クロロベンズアミド（０．２６ｇ、１．５２ｍｍｏｌ、１．０当量）およびトリエチルアミン（０．３１ｇ、０．３０ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。この混合物を５０℃で４８時間撹拌した。この混合物を水（５０ｍＬ）に注ぎ、ＥＡ（５０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して粗生成物を得、これをｐｒｅｐ－ＨＰＬＣで精製した。回収した画分を濃縮し、大部分のＣＨ３ＣＮを除去した。残留画分を凍結乾燥して、化合物２（４－クロロ－３－（５－メトキシペンタンアミド）ベンズアミド、４８ｍｇ、収率１１．１％）を黄色の固形物として得た。
化合物２（４－クロロ－３－（５－メトキシペンタンアミド）ベンズアミド）の調製
【化6】
【0064】
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ８．８２（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．６４（ｄｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），５．９３－６．３８（ｍ，２Ｈ），３．４５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．８１－１．８８（ｍ，２Ｈ），１．６６－１．７３（ｍ，２Ｈ）。
【0065】
ＬＣＭＳ； Ｍａｓｓ Ｃａｌｃｄ．：２８４．７；ＭＳ Ｆｏｕｎｄ：２８４．９。
【0066】
実施例２．結合アッセイ実験
実施例２－１ イムノブロット法を用いた、筋アクチンがＡｒｇ／Ｎ－デグロン経路基質であるかどうかの確認
実施例２－１ イムノブロット法を用いた、筋アクチンがＡｒｇ／Ｎ－デグロン経路基質であるかどうかの確認
【0067】
ラット筋肉由来細胞であるＬ６細胞株を、１０％ＦＢＳおよび１％ストレプトマイシン／ペニシリンを含むＤＭＥＭ培地を用いて、５％二酸化炭素を維持したインキュベーター内で培養し、培養後の細胞を１２ウェルプレートに分注した。さらに、細胞をプレート表面に完全に付着させるように２４時間培養した。ＭＧ１３２がＵＢＲ１結合を増加させるかどうかを確認するために、ＭＧ１３２（１０ｕＭ）単独で２４時間処理した後、細胞を回収した。回収した細胞からタンパク質を抽出するため、各サンプルにライセート調製用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、２ｍＭ ＮａＦ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ｂ－グリセロリン酸、５ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ロイペプチン、アプロチニン）５０ｕＬを注入し、細胞を溶解させた。測定した総タンパク質濃度に基づきサンプル用緩衝液を各サンプルに加え、混合物を１００℃で５分間反応させた。完全に反応したサンプルから５ｕＬを採取し、アクリルアミドゲルの各ウェルに分注した後、イムノブロット法を行い、その実験結果を［図１］に示す。
【0068】
イムノブロット法では、３つまたはそれを超える独立した実験から代表的な実験を模式化した。
【0069】
図１を参照すると、ＭＧ１３２により、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＣ１およびＡＣＴＧ２のレベルが対照と比較して増加することが確認された。さらに、ＵＢＲタンパク質をノックダウンすると、ＡＣＴＡ１およびＡＣＴＧ２のレベルが増加することが確認された。すなわち、筋アクチンはＡｒｇ／Ｎ－デグロン経路の基質であることを確認できた。
【0070】
実施例２－２ 試験管内転写／翻訳法によるＲ－ｎｓＰ４分解阻害の確認ＴｎＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍキットを用いて、化合物のＲ－ｎｓＰ４発現を確認した。Ｔｒａｎｓｃｅｎｄ Ｂｉｏｔｉｎ－Ｌｙｓｙｌ－ｔＲＮＡ、メチオニン、ベスタチン、ＴｎＴｑｕｉｃｋ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘおよびＤＨＦＲ－Ｕｂ－Ｒ－ｎｓＰ４プラスミドを用いてプレミックスを作製した後、プレミックスに化合物（１ｕＭ）を混合した。各サンプルを３０℃で４０分間反応させた後、そこに５Ｘ ＳＤＳローディング色素を加えた。得られた混合物を９５℃で２分間反応させた後、５ｕＬを採取してアクリルアミドゲルの各ウェルに分注し、次にイムノブロット法を行い、その実験結果を［図２］に示す。試験管内転写／翻訳法では、３回またはそれを超える独立した実験から代表的な実験を模式化した。
【0071】
図２を参照すると、化合物１、２によって、対照と比較してＲ－ｎｓＰ４のレベルが増加することが確認できる。すなわち、本発明による化合物で処理した場合、ＵＢＲ１に結合することにより、Ｒ－ｎｓＰ４レベルが増加することが確認できた。
【0072】
実施例２－３ イムノブロット法による筋肉細胞のアクチン分解阻害の評価
筋肉細胞における化合物のアクチン分解を評価するため、ラット筋肉由来細胞であるＬ６細胞株を、１０％ＦＢＳおよび１％ストレプトマイシン／ペニシリンを含むＤＭＥＭ培地を用いて、５％二酸化炭素を維持したインキュベーター内で培養した。本化合物から選択される代表的な化合物による処理に応じたＵＢＲ１結合強度を測定するために、細胞を１２ウェルプレートに分注した。細胞をプレート表面に完全に付着させるようにさらに２４時間培養した。化合物（５ｕＭ）単独で２４時間処理した後に細胞を回収し、化合物がＵＢＲ１結合を増加させるかどうかを確認した。回収した細胞からタンパク質を抽出するため、各サンプルにライセート調製用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、２ｍＭ ＮａＦ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ｂ－グリセロリン酸、５ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ロイペプチン、アプロチニン）５０ｕＬを注入し、細胞を溶解させた。測定した総タンパク質濃度に基づきサンプル用緩衝液を各サンプルに加え、混合物を１００℃で５分間反応させた。完全に反応したサンプルから５ｕＬを採取し、アクリルアミドゲルの各ウェルに分注した後、イムノブロット法を行い、その実験結果を［図３］に示す。イムノブロット法では、３つまたはそれを超える独立した実験から代表的な実験を模式化した。
筋肉細胞における化合物のアクチン分解を評価するため、ラット筋肉由来細胞であるＬ６細胞株を、１０％ＦＢＳおよび１％ストレプトマイシン／ペニシリンを含むＤＭＥＭ培地を用いて、５％二酸化炭素を維持したインキュベーター内で培養した。本化合物から選択される代表的な化合物による処理に応じたＵＢＲ１結合強度を測定するために、細胞を１２ウェルプレートに分注した。細胞をプレート表面に完全に付着させるようにさらに２４時間培養した。化合物（５ｕＭ）単独で２４時間処理した後に細胞を回収し、化合物がＵＢＲ１結合を増加させるかどうかを確認した。回収した細胞からタンパク質を抽出するため、各サンプルにライセート調製用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、２ｍＭ ＮａＦ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ｂ－グリセロリン酸、５ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ロイペプチン、アプロチニン）５０ｕＬを注入し、細胞を溶解させた。測定した総タンパク質濃度に基づきサンプル用緩衝液を各サンプルに加え、混合物を１００℃で５分間反応させた。完全に反応したサンプルから５ｕＬを採取し、アクリルアミドゲルの各ウェルに分注した後、イムノブロット法を行い、その実験結果を［図３］に示す。イムノブロット法では、３つまたはそれを超える独立した実験から代表的な実験を模式化した。
【0073】
図３を参照すると、化合物１、化合物２により、ＡＣＴＡ１のレベルが対照と比較して増加することを確認できた。すなわち、本発明による化合物で処理した場合、ＵＢＲ１に結合することにより、筋肉内タンパク質ＡＣＴＡ１の分解が阻害されることが確認できた。
【0074】
実施例２－４ ＭＳＴを用いたＵＢＲ１と化合物との結合の有無の測定
１）ＵＢＲ１タンパク質の調製
ヒトＵＢＲ１（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ８ＩＷＶ７）のＵＢＲボックスに相当するＧｌｎ９７－Ｐｒｏ１６８部分を、改変した発現ベクターにクローニングし、次に大腸菌で発現させた。アフィニティークロマトグラフィーを用いた後、プロテアーゼでタグを除去し、次にＮ末端にＧｌｙ－Ｈｉｓ－Ｍｅｔを付加した。イオンクロマトグラフィーを行った後、最終的にＵＢＲ１のＵＢＲボックスタンパク質をゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭ β－メルカプトエタノールの緩衝液組成、およびｐＨ７．５で精製した。
１）ＵＢＲ１タンパク質の調製
ヒトＵＢＲ１（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ８ＩＷＶ７）のＵＢＲボックスに相当するＧｌｎ９７－Ｐｒｏ１６８部分を、改変した発現ベクターにクローニングし、次に大腸菌で発現させた。アフィニティークロマトグラフィーを用いた後、プロテアーゼでタグを除去し、次にＮ末端にＧｌｙ－Ｈｉｓ－Ｍｅｔを付加した。イオンクロマトグラフィーを行った後、最終的にＵＢＲ１のＵＢＲボックスタンパク質をゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭ β－メルカプトエタノールの緩衝液組成、およびｐＨ７．５で精製した。
【0075】
２）ＵＢＲ１ ＵＢＲボックスタンパク質のラベル化Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ ＲＥＤ－ＮＨＳ ２ｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（カタログ番号ＭＯ－Ｌ０１１）の色素は、第一級アミン（リジン残基）と共有結合を形成するＮＨＳエステル基を有する。この色素は、ＲＥＤ検出器を搭載したＭｏｎｏｌｉｔｈシリーズデバイス用に最適化されている。精製したＵＢＲ１ ＵＢＲボックスタンパク質を、このキットを用いて提示されたプロトコルに従ってラベル化した。
【0076】
３）ＭＳＴを用いたＵＢＲ１とリガンドとの結合の有無の測定
熱泳動とは、温度勾配によって粒子が移動する現象を指す。高温領域に存在する粒子は低温領域に存在する粒子よりも運動エネルギーが大きく、より大きなエネルギーを持つ周囲の粒子と衝突する頻度が高くなる。その結果、粒子は高温領域から低温領域へ移動する。
熱泳動とは、温度勾配によって粒子が移動する現象を指す。高温領域に存在する粒子は低温領域に存在する粒子よりも運動エネルギーが大きく、より大きなエネルギーを持つ周囲の粒子と衝突する頻度が高くなる。その結果、粒子は高温領域から低温領域へ移動する。
【0077】
タンパク質の熱泳動は、通常、タンパク質－リガンド複合体の熱泳動とは異なる。これは、リガンドが結合することで、そのサイズ、電荷および溶媒和エネルギーが変化するためである。さらに、ＭＳＴは、リガンド結合によりタンパク質のサイズおよび電荷が大きく変化しなくても、リガンド結合によって引き起こされるタンパク質分子の溶媒エントロピーの変化を検出することができる。したがって、ＭＳＴを用いてＵＢＲ１ ＵＢＲボックスタンパク質とリガンド化合物との結合を測定したところ、提示されたリガンドがＵＢＲ１ ＵＢＲボックスに結合することが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【手続補正書】
【提出日】2023-05-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式１：［式１］
【化7】
式中、Ａ１はＣＨ３またはＮＨ２である、化合物またはその塩。
【請求項2】
ＵＢＲボックスドメイン基質結合を阻害するための組成物であって、前記組成物が請求項１に記載の化合物またはその塩を含む、組成物。
【請求項3】
ＵＢＲ関連疾患を処置するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容され得る塩を含む、医薬組成物。
【請求項4】
前記ＵＢＲ関連疾患が、筋ジストロフィー（ベッカー型、先天性型、デュシェンヌ型、遠位型、エメリー－ドレイフス型、顔面肩甲上腕型、肢帯型、筋緊張型、眼咽頭型）によって引き起こされる筋肉低下、サルコペニアもしくは癌悪液質を含む筋肉低下もしくは分解によって媒介される筋肉消耗疾患、脂肪肉腫、嚢胞性線維症、ヨハンソン・ブリザード症候群、閉塞性尿路疾患（尿道閉塞続発）、自己免疫性膵炎を含む過剰なタンパク質分解によって引き起こされる疾患、またはアッシャー症候群を含むＵＢＲボックスおよびＵＢＲタンパク質に関連する既知の疾患を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】