特表2023-522558染色体外ＤＮＡの電気泳動抽出および富化のためのシステム、デバイス、および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-31
(54)【発明の名称】染色体外ＤＮＡの電気泳動抽出および富化のためのシステム、デバイス、および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20230524BHJP
C12M 1/26 20060101ALI20230524BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALN20230524BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20230524BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 112Z
C12M1/26
C12Q1/6806 Z ZNA
C12Q1/6869 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022551643
(86)(22)【出願日】2021-04-23
(85)【翻訳文提出日】2022-08-26
(86)【国際出願番号】 US2021028922
(87)【国際公開番号】W WO2021217052
(87)【国際公開日】2021-10-28
(31)【優先権主張番号】63/015,288
(32)【優先日】2020-04-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511087383
【氏名又は名称】セージ サイエンス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ボルズ， ティー． クリスチャン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA09
4B029BB20
4B029FA03
4B063QA13
4B063QQ03
4B063QQ05
4B063QQ42
4B063QS16
4B063QS25
(57)【要約】
本開示の実施形態は、染色体外ＤＮＡ抽出のための、ならびに、いくつかの実施形態では、そこからのＤＮＡの単離、ならびに／あるいは、いくつかの実施形態ではｅｃＤＮＡを含む抽出および／または単離されたＤＮＡの分析のための、方法、システム、およびデバイスを提示している。比較的ごく近接して配置された液体試料を保持するための、かつ本開示の１つまたは方法を可能にするまたは実行するように構成された、少なくとも２つのウェル／キャビティ／区画を含むアガロースゲルカセットおよび／またはシステムもまた提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
染色体外ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）の抽出および単離方法であって、ＤＮＡ電気泳動用に構成されたアガロースゲルカラムを提供することであって、前記ゲルカラムが、少なくとも２つの区画を含むように、または少なくとも２つの区画に含まれるように構成されていること；
複数の細胞を含む細胞懸濁物を含む試料を、前記少なくとも２つの区画のうちの、第１の正に帯電した電極に対して近位に配置された第１の区画内に置くことであって、前記正に帯電した電極は、電気泳動中に負に帯電した界面活性剤およびＤＮＡを誘引するよう構成されていること；
少なくとも１つの負に帯電した界面活性剤を含む溶解試薬を、前記少なくとも２つの区画の第２の区画内に置くことであって、前記第２の区画は、第２の負に帯電した電極に対して近位に配置されていること；
前記第１の電極および前記第２の電極を介して第１の電気泳動場を印加し、その結果、前記負に帯電した界面活性剤が前記細胞懸濁物を含む前記第１の区画に移動し、その中に入り、またはその中を通り、その結果、前記第１の区画内の細胞が液体混合による粘性せん断なしに実質的に溶解されるようにすること；
第２の電気泳動場を印加するか、または前記第１の電気泳動場を継続して、所望のｅｃＤＮＡのサイズ選択に適した条件下で電気泳動を行うようにし、その結果、前記ｅｃＤＮＡがより大きな染色体ＤＮＡ分子から分離されて前記ゲルカラムを移動すること；および
前記ゲルカラムから前記サイズ選択されたｅｃＤＮＡを単離すること
を含む方法。
【請求項2】
電気泳動により、３Ｍｂよりも大きなサイズの前記ＤＮＡが前記アガロースゲルに固定化されることになる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
電気泳動により、３Ｍｂよりも大きな前記ＤＮＡが前記第１の区画の壁に固定化されることになる、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
電気泳動により、３Ｍｂ未満のサイズを有するＤＮＡが前記ゲルカラムを移動することになる、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
３Ｍｂ未満のサイズを有する前記ＤＮＡが電気溶出により単離される、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
電気溶出により、３Ｍｂ未満のサイズのサイズ画分の前記ＤＮＡが、溶出カセットのうちの１またはそれより多くの溶出モジュールに溶出されることになる、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
３Ｍｂ未満の前記ＤＮＡがｅｃＤＮＡを含む、請求項４～６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
電気泳動が完了するまでの期間が、前記ｅｃＤＮＡのサイズに対応する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
電気泳動が２～９時間の間行われる、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
前記単離されたｅｃＤＮＡの少なくとも１つの特性を分析することをさらに含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
前記単離されたｅｃＤＮＡの少なくとも１つの特性を分析することをさらに含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項12】
さらに、前記ｅｃＤＮＡを富化することを含む、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
前記複数の細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、およびヒト細胞のいずれかを含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
前記複数の細胞が、細胞壁を除去するために酵素処理された真菌細胞を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
前記複数の細胞が、植物細胞を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項16】
前記複数の細胞が、そうでなければアニオン性界面活性剤による細胞溶解を妨げる細胞壁を除去するために酵素処理された植物細胞を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項17】
前記複数の細胞が細菌細胞を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
前記複数の細胞が、そうでなければアニオン性界面活性剤による細胞溶解を妨げる細胞壁を除去するために酵素処理された細菌細胞を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項19】
前記細胞懸濁物中の前記細胞が均一に分散している、請求項１～１８のいずれかに記載の方法。
【請求項20】
前記少なくとも２つの区画が互いに近接して配置されている、請求項１～１９のいずれかに記載の方法。
【請求項21】
ゲルカラムからサイズ選択されたｅｃＤＮＡを単離することが、電気溶出を経由する、請求項１～２０のいずれかに記載の方法。
【請求項22】
前記第２の電気泳動場または前記第１の電気泳動場の継続が、所望のｅｃＤＮＡのサイズ選択に適した条件下で電気泳動を行うように適用され、その結果、前記ｅｃＤＮＡがより大きな染色体ＤＮＡ分子から分離される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記ゲルカラムから前記サイズ選択されたｅｃＤＮＡを単離することが、電気溶出を介する、請求項１～２２のいずれかに記載の方法。
【請求項24】
前記少なくとも１つの特性が、サイズ、トポロジー、および配列内容からなる群から選択される、請求項１０～２３のいずれかに記載の方法。
【請求項25】
前記ｅｃＤＮＡのＤＮＡ配列を決定することをさらに含む、請求項１～２４のいずれかに記載の方法。
【請求項26】
前記ｅｃＤＮＡを画像化することをさらに含む、請求項１～２５のいずれかに記載の方法。
【請求項27】
画像化が、光学的、電子顕微鏡的、原子間力顕微鏡法のうちの少なくとも１つを介する、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
本明細書に開示される、前記方法の実施形態のいずれか１つもしくはそれより多く、および／またはその１つもしくはそれより多くのステップに従う方法。
【請求項29】
本明細書に開示される方法の１つまたはそれより多くを実行するように構成されたシステムおよびデバイスのうちの少なくとも１つ。
【請求項30】
比較的ごく近接して配置された液体試料を保持するための、かつ本開示の１つまたは方法を可能にするまたは実行するように構成された、少なくとも２つのウェル／キャビティ／区画を含むアガロースゲルカセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２０年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０１５，２８８号の利益および優先権を主張し、その開示全体は、参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２０年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０１５，２８８号の利益および優先権を主張し、その開示全体は、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
背景
多くの原核生物および真核生物において、細胞およびその小器官の遺伝的構成を構成するＤＮＡは、サイズおよびトポロジーにおいて劇的に異なることがある。哺乳動物では、核染色体ＤＮＡは線状であり、サイズは数十から数百メガベース（Ｍｂｓ）の範囲である。染色体ＤＮＡに加えて、各哺乳動物細胞は、一般に、１細胞あたり数千コピーの環状１６キロベース（ｋｂ）ＤＮＡをミトコンドリア内に持つ（Ｖｅｔｒｉら、１９９０）。
多くの原核生物および真核生物において、細胞およびその小器官の遺伝的構成を構成するＤＮＡは、サイズおよびトポロジーにおいて劇的に異なることがある。哺乳動物では、核染色体ＤＮＡは線状であり、サイズは数十から数百メガベース（Ｍｂｓ）の範囲である。染色体ＤＮＡに加えて、各哺乳動物細胞は、一般に、１細胞あたり数千コピーの環状１６キロベース（ｋｂ）ＤＮＡをミトコンドリア内に持つ（Ｖｅｔｒｉら、１９９０）。
【0003】
最近の研究により、真核細胞はまた、核ＤＮＡに由来する染色体外ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）サークルも含んでいることが示されている。正常細胞では、これらのＤＮＡは小さく、一般に２０ｋｂ未満のサイズであり、頻繁に反復染色体配列に関連している（Ｍｏｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．、２０１８）。しかし、がん細胞では、増幅されたがん遺伝子や薬剤耐性遺伝子を持つ、１０数ｋｂの大きさから数Ｍｂの範囲の大きさの、より大きな環状ｅｃＤＮＡもまた見られる（Ｖｅｒｈａａｋ， ｅｔ ａｌ．のレビュー、２０１９年）。
【0004】
同様に、細菌細胞では、平均サイズが約４Ｍｂの大きな環状染色体が頻繁に存在し（細菌の染色体サイズは、１００～２００（ｌｏｗ ｈｕｎｄｒｅｄ）ｋｂから１０代前半のＭｂの範囲である）、細菌はまた、一般にプラスミドと呼ばれるより小さな環状ｅｃＤＮＡを持つ（Ｆｒａｎｃｉａら、，２００４、Ｓｈｅｒｒａｔｔ，１９７４）。これらのプラスミドは、典型的には、１ｋｂから１００～２００ｋｂの大きさの範囲である。病原性細菌では、このようなプラスミドは、ビルレンス（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）、宿主範囲、および薬剤耐性に影響を与える遺伝子を頻繁に持つ（Ｐｉｌｌａ ａｎｄ Ｔａｎｇ，２０１８； Ｒｏｚｗａｎｄｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ，２０１８）。
【0005】
細菌および哺乳動物細胞において、染色体外ＤＮＡは通常、全細胞ＤＮＡの一部を構成している。現在、染色体外ＤＮＡのほとんどの分子的特徴づけは、全ゲノム配列データとｄｅ ｎｏｖｏ配列アセンブリアルゴリズムを用いてバイオインフォマティックに実施されている。高カバレッジの全ゲノム配列データを用いると、ｅｃＤＮＡ配列を単一の環状コンティグにアセンブルすることが可能な場合が多い。しかし、ｅｃＤＮＡが染色体ＤＮＡ配列と密接に関連している場合、そしてそれらが顕著なレベルの転位を有する場合、ｅｃＤＮＡのアセンブリは困難となる（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
ｅｃＤＮＡはヒトの疾患において重要な役割を担っているため、それを解析するための新しく費用対効果の高い方法を開発することが重要である。
ｅｃＤＮＡはヒトの疾患において重要な役割を担っているため、それを解析するための新しく費用対効果の高い方法を開発することが重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Veltri KL, Espiritu M, Singh G. Distinct genomic copy number in mitochondria of different mammalian organs. J Cell Physiol. 1990 Apr;143(1):160-4. doi: 10.1002/jcp.1041430122. PMID: 2318903.
【非特許文献2】Moller HD, Mohiyuddin M, Prada-Luengo I, Sailani MR, Halling JF, Plomgaard P, Maretty L, Hansen AJ, Snyder MP, Pilegaard H, Lam HYK, Regenberg B. Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue. Nat Commun. 2018 Mar 14;9(1):1069. doi: 10.1038/s41467-018-03369-8. PMID: 29540679; PMCID: PMC5852086.
【非特許文献3】Verhaak RGW, Bafna V, Mischel PS. Extrachromosomal oncogene amplification in tumour pathogenesis and evolution. Nat Rev Cancer. 2019;19(5):283-288. doi:10.1038/s41568-019-0128-6.
【非特許文献4】Francia MV, Varsaki A, Garcillan-Barcia MP, Latorre A, Drainas C, de la Cruz F. A classification scheme for mobilization regions of bacterial plasmids. FEMS Microbiol Rev. 2004 Feb;28(1):79-100. doi: 10.1016/j.femsre.2003.09.001. PMID: 14975531.
【非特許文献5】Sherratt DJ. Bacterial plasmids. Cell. 1974 Nov;3(3):189-95. doi: 10.1016/0092-8674(74)90130-5. PMID: 4373170
【非特許文献6】Pilla G, Tang CM. Going around in circles: virulence plasmids in enteric pathogens. Nat Rev Microbiol. 2018 Aug;16(8):484-495. doi: 10.1038/s41579-018-0031-2. PMID: 29855597.
【非特許文献7】Rozwandowicz M, Brouwer MSM, Fischer J, Wagenaar JA, Gonzalez-Zorn B, Guerra B, Mevius DJ, Hordijk J. Plasmids carrying antimicrobial resistance genes in Enterobacteriaceae. J Antimicrob Chemother. 2018 May 1;73(5):1121-1137. doi: 10.1093/jac/dkx488. PMID: 29370371.
【非特許文献8】Wu S, Turner KM, Nguyen N, Raviram R, Erb M, Santini J, Luebeck J, Rajkumar U, Diao Y, Li B, Zhang W, Jameson N, Corces MR, Granja JM, Chen X, Coruh C, Abnousi A, Houston J, Ye Z, Hu R, Yu M, Kim H, Law JA, Verhaak RGW, Hu M, Furnari FB, Chang HY, Ren B, Bafna V, Mischel PS. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature. 2019 Nov;575(7784):699-703. doi: 10.1038/s41586-019-1763-5. Epub 2019 Nov 20. PMID: 31748743; PMCID: PMC7094777.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
概要
本開示の実施形態は、染色体外ＤＮＡ抽出のための、ならびにいくつかの実施形態では、そこからのＤＮＡの単離、ならびに／あるいは、抽出および／もしくは単離されたＤＮＡの分析のための、方法、システム、およびデバイスを提示する。
本開示の実施形態は、染色体外ＤＮＡ抽出のための、ならびにいくつかの実施形態では、そこからのＤＮＡの単離、ならびに／あるいは、抽出および／もしくは単離されたＤＮＡの分析のための、方法、システム、およびデバイスを提示する。
【0008】
したがって、いくつかの実施形態では、染色体外ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）の抽出および分離方法が提供され、これは、ＤＮＡ電気泳動用に構成されたアガロースゲルカラムを提供することであって、ゲルカラムが、（本開示を通してキャビティまたはウェルとも言われ得る）少なくとも２つの区画を含むように、または少なくとも２つの区画に含まれるように構成されていること、複数の細胞を含む細胞懸濁物を含む試料を、少なくとも２つの区画のうちの、第１の正に帯電した電極に対して近位に配置された第１の区画内に置くことであって、正に帯電した電極は、電気泳動中に負に帯電した界面活性剤およびＤＮＡを誘引するよう構成されていること、少なくとも１つの負に帯電した界面活性剤を含む溶解試薬を、少なくとも２つの区画の第２の区画内に置くことであって、第２の区画は、第２の負に帯電した電極に対して近位に配置されていること、第１の電極および第２の電極を介して第１の電気泳動場を印加し、その結果、負に帯電した界面活性剤が細胞懸濁物を含む第１の区画に移動し、その中に入り、またはその中を通り、その結果、第１の区画内の細胞が液体混合による粘性せん断なしに実質的に溶解されるようにすること、第２の電気泳動場を印加するか、または第１の電気泳動場を継続して、所望のｅｃＤＮＡのサイズ選択に適した条件下で電気泳動を行うようにし、その結果、ｅｃＤＮＡがより大きな染色体ＤＮＡ分子から分離されてゲルカラムを移動すること、およびゲルカラムからサイズ選択されたｅｃＤＮＡを単離することを含む。
【0009】
そのような実施形態は、以下の特徴、機能、構造、ステップ、プロセス、目的、利点、および明確化のうちの１つおよび／または別のもの（およびいくつかの実施形態では、そのうちの複数のもの、およびいくつかの実施形態では、そのうちの大多数のもの、そしてなお他の実施形態では、実質的に全てもしくは全て）を含むことができ、本開示のさらに別の実施形態をもたらす：
－電気泳動により、３Ｍｂよりも大きなサイズのＤＮＡがアガロースゲルに固定化されることになる；
－電気泳動により、３Ｍｂよりも大きなＤＮＡが第１の区画の壁に固定化されることになる；
－電気泳動により、３Ｍｂ未満のサイズを有するＤＮＡがゲルカラムを移動することになる；
－３Ｍｂ未満のサイズを有するＤＮＡが電気溶出により単離される；
－電気溶出により、３Ｍｂ未満のサイズのサイズ画分のＤＮＡが、溶出カセットのうちの１またはそれより多くの溶出モジュールに溶出されることになる；
－３Ｍｂ未満のＤＮＡがｅｃＤＮＡを含む；
－電気泳動が完了するまでの期間が、ｅｃＤＮＡのサイズに対応する；
－電気泳動が２～９時間の間行われる；
－ｅｃＤＮＡを分析する；
－単離されたｅｃＤＮＡの少なくとも１つの特性を分析する、ここで、少なくとも１つの特性は、サイズ、トポロジー、および配列内容からなる群から選択され得る；
－ｅｃＤＮＡを富化する；
－複数の細胞が、動物細胞を含む；
－複数の細胞が、哺乳動物細胞を含む；
－複数の細胞が、ヒト細胞を含む；
－複数の細胞が、真菌細胞を含む；
－複数の細胞が、細胞壁を除去するために酵素処理された真菌細胞を含む；
－複数の細胞が、植物細胞を含む；
－複数の細胞が、そうでなければアニオン性界面活性剤による細胞溶解を妨げる細胞壁を除去するために酵素処理された植物細胞を含む；
－複数の細胞が細菌細胞を含む；
－複数の細胞が、そうでなければアニオン性界面活性剤による細胞溶解を妨げる細胞壁を除去するために酵素処理された細菌細胞を含む；
－細胞懸濁物中の細胞が均一に分散している；
－少なくとも２つの区画が互いに近接して配置されている（arranged proximate）；
－ゲルカラムからサイズ選択されたｅｃＤＮＡを単離することが、電気溶出を経由する；
－第２の電気泳動場および／または第１の電気泳動場の継続が、所望のｅｃＤＮＡのサイズ選択に適した条件下で電気泳動を行うように適用され、その結果、ｅｃＤＮＡがより大きな染色体ＤＮＡ分子から分離される；
－ゲルカラムからサイズ選択されたｅｃＤＮＡを単離することが、電気溶出を介する；
－ｅｃＤＮＡのＤＮＡ配列を決定する；ならびに
－ｅｃＤＮＡを画像化する、ここで、画像化が、光学的、電子顕微鏡的、原子間力顕微鏡法のうちの少なくとも１つを介し得る。
－電気泳動により、３Ｍｂよりも大きなサイズのＤＮＡがアガロースゲルに固定化されることになる；
－電気泳動により、３Ｍｂよりも大きなＤＮＡが第１の区画の壁に固定化されることになる；
－電気泳動により、３Ｍｂ未満のサイズを有するＤＮＡがゲルカラムを移動することになる；
－３Ｍｂ未満のサイズを有するＤＮＡが電気溶出により単離される；
－電気溶出により、３Ｍｂ未満のサイズのサイズ画分のＤＮＡが、溶出カセットのうちの１またはそれより多くの溶出モジュールに溶出されることになる；
－３Ｍｂ未満のＤＮＡがｅｃＤＮＡを含む；
－電気泳動が完了するまでの期間が、ｅｃＤＮＡのサイズに対応する；
－電気泳動が２～９時間の間行われる；
－ｅｃＤＮＡを分析する；
－単離されたｅｃＤＮＡの少なくとも１つの特性を分析する、ここで、少なくとも１つの特性は、サイズ、トポロジー、および配列内容からなる群から選択され得る；
－ｅｃＤＮＡを富化する；
－複数の細胞が、動物細胞を含む；
－複数の細胞が、哺乳動物細胞を含む；
－複数の細胞が、ヒト細胞を含む；
－複数の細胞が、真菌細胞を含む；
－複数の細胞が、細胞壁を除去するために酵素処理された真菌細胞を含む；
－複数の細胞が、植物細胞を含む；
－複数の細胞が、そうでなければアニオン性界面活性剤による細胞溶解を妨げる細胞壁を除去するために酵素処理された植物細胞を含む；
－複数の細胞が細菌細胞を含む；
－複数の細胞が、そうでなければアニオン性界面活性剤による細胞溶解を妨げる細胞壁を除去するために酵素処理された細菌細胞を含む；
－細胞懸濁物中の細胞が均一に分散している；
－少なくとも２つの区画が互いに近接して配置されている（arranged proximate）；
－ゲルカラムからサイズ選択されたｅｃＤＮＡを単離することが、電気溶出を経由する；
－第２の電気泳動場および／または第１の電気泳動場の継続が、所望のｅｃＤＮＡのサイズ選択に適した条件下で電気泳動を行うように適用され、その結果、ｅｃＤＮＡがより大きな染色体ＤＮＡ分子から分離される；
－ゲルカラムからサイズ選択されたｅｃＤＮＡを単離することが、電気溶出を介する；
－ｅｃＤＮＡのＤＮＡ配列を決定する；ならびに
－ｅｃＤＮＡを画像化する、ここで、画像化が、光学的、電子顕微鏡的、原子間力顕微鏡法のうちの少なくとも１つを介し得る。
【0010】
比較的ごく近接して配置された液体試料を保持するための、かつ本開示の１つまたは方法を可能にするまたは実行するように構成された、少なくとも２つのウェル／キャビティ／区画を含むアガロースゲルカセットおよび／またはシステム。
【0011】
本開示のこれらおよび他の実施形態、利点、および目的は、添付図、以下に提供する簡単な説明および以下に続く詳細な説明を参照することにより、さらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
詳細な説明
本開示の実施形態は、例えばＤＮＡ配列決定、および例えば光学マッピング、電子顕微鏡、および原子間力顕微鏡によるイメージングによる下流の分子分析のために染色体ＤＮＡからｅｃＤＮＡを分離しつつ、ｅｃＤＮＡを抽出する（およびいくつかの実施形態では、単離／抽出されたｅｃＤＮＡを富化する）方法、システム、およびデバイスに向けられている。
本開示の実施形態は、例えばＤＮＡ配列決定、および例えば光学マッピング、電子顕微鏡、および原子間力顕微鏡によるイメージングによる下流の分子分析のために染色体ＤＮＡからｅｃＤＮＡを分離しつつ、ｅｃＤＮＡを抽出する（およびいくつかの実施形態では、単離／抽出されたｅｃＤＮＡを富化する）方法、システム、およびデバイスに向けられている。
【0021】
いくつかの実施形態では、本開示の方法が実行され得る（またはそれを用いて実行される）システムおよび／またはデバイスとしては、特に、一般的な形態の、例えばＵＳ１０１３１９０１Ｂ２の図１１～１３、および図１５ならびに関連特許および出願（全てその全体が参考として本明細書に援用される）に示されるゲル電気泳動装置および消耗品を含む。いくつかの実施形態において、および図１ａ～ｂに示されるように、消耗品は、比較的ごく近接して（好ましくは１～５ｍｍ離して、より好ましくは１～３ｍｍ離して）配置された液体試料を保持するための、２つのウェル／キャビティ／区画（このような用語は本開示において交換可能に用いられる）を有するアガロースゲルカセットである。ゲルは、ＤＮＡ電気泳動に適したバッファー中に形成される。ゲルは、アガロース濃度（１００ｍｌあたりの重量％グラム）が好ましくは０．３％～３％、より好ましくは０．７５％～１．５％である。
【0022】
したがって、図１ａにおいて、これは、（いくつかの実施形態による）カセットの展開図であり、上部（１）、底部（２）、および溶出モジュールアセンブリ（３）を含む。カセット上部および底部は、接着するかまたは他の方法で一緒に貼り付けることができる。溶出モジュールの左面は、ＤＮＡ透過性フィルター材料に結合することができ、右面は、ＤＮＡ不透過性限外ろ過膜に結合することができる。カセット上部と下部をアセンブルした後、溶出モジュールをカセット上部のスロット（１３）に接着またはその他の方法で貼り付けることができる。カセットに挿入した後、溶出モジュールの左側面はゲルカラムの右側境界を形成するように構成されている。
【0023】
各カセットは、カセットの中央領域に位置する溶出電極チャネル（９）および（１０）の間のカセット上部（２）の内側から沿って延びる壁によって左右に分離された、２つの独立した試料処理ゾーンを含むことができる（図では見えない）。カセット上部には、負分離電極用ポート（１１）、および正分離電極用ポート（１２）が含まれる。分離電極は、負に帯電した分子をゲルカラムの軸に沿って移動させる電気泳動場を提供するように構成される。また、負溶出電極用ポート（９）と正溶出電極用ポート（１０）も示されており、左から右へゲルからバッファーを満たした溶出モジュールに負に帯電した分子を電気溶出するために使用することができる。試料ウェル用ポート（８）と試薬ウェル用ポート（７）も表示されている。
【0024】
図１ｂは、カセット上部を取り外してカセット内のゲルカラム（４）の位置を示す図である。いくつかの実施形態では、そして示されるように、ゲルは、その境界がカセット上部の下側の壁によって規定されるので、いくつかの側面で支持されていないように見える。試料ウェル（６）および試薬ウェル（５）の位置が示されている。図２ａはアセンブルされたカセットの上面図、図２ｂは上面カバーを取り外したアセンブルされたカセットの上面図である。すべてのラベルは図１ａおよび図１ｂと同じである。
【0025】
いくつかの実施形態において、好適な試料は、ドデシル硫酸ナトリウムなどの陰イオン（負に帯電した）界面活性剤によって溶解されることができる均一な細胞懸濁物であり得る。細胞壁を有しない真核細胞は、好適な細胞の例である。細菌、真菌、および植物細胞は、本開示による抽出方法で使用する前に、細胞がその細胞壁を分解する適切な酵素で処理される場合、試料として使用することができる。
【0026】
いくつかの実施形態による方法の概略図を、その方法を実行するためのカセット（３００）／溶出モジュール（３０５）のブロック表現と共に図３に示す（例えば、図１ａ～２ｂを参照）。図３の「Ｉ」の識別番号は、図３の「ＩＩ」および「ＩＩＩ」にも適用されることに注意されたい。したがって、均一に分散された細胞懸濁物を含む試料は、正に帯電した電極（３０６）（すなわち、電気泳動中に負に帯電した界面活性剤およびＤＮＡが移動する空洞）に対して近位のウェル（３０２）に入れられる。少なくとも１つの負に帯電した界面活性剤を含む溶解試薬は、負に帯電した電極（３０４）に対して近位のウェル（３０３）に入れられる。次に電場が電極を介して印加され、負に帯電した界面活性剤がウェル（３０３）の外から細胞懸濁物を含む試料ウェル（３０２）内に／試料ウェル（３０２）を通過して移動し、試料ウェル内の細胞は液体混合による粘性せん断なしに穏やかに溶解されるようにする。小さな細胞成分およびヌクレアーゼは、変性され、界面活性剤によって被覆され、正電極（３０６）に向かって運ばれる。したがって、いくつかの実施形態では、長さが概ね３～４００万塩基対（Ｍｂ）より大きい細胞ＤＮＡは、試料ウェル壁（「ＩＩ」の「ＨＭＷ ＤＮＡ」、すなわち図３の中央部分を参照）内に移動されるが、すぐにウェル壁の／近くのゲルに絡まり、そこに固定化される。しかし、ｅｃＤＮＡを含むより小さなＤＮＡ分子（＜概ね３～４Ｍｂ）は、試料ウェル壁に固定化されず、ゲルカラム（３０１）の下方へと移動する（例えば、「ＩＩ」の「ｅｃＤＮＡ」を参照）。より小さいｅｃＤＮＡは、適切なゲル電気泳動条件を使用してゲル内でサイズ分離され、ゲルカラムに隣接して配置される、バッファーを充填した溶出モジュール（図３の「ＩＩＩ」を参照）へゲルから電気溶出され得る（例えば、ＵＳ１０１３１９０１ Ｂ２において引用されたものに基づく装置を使用して；かかる装置はＳａｇｅＨＬＳシステム、Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；ｈｔｔｐｓ：／／ｓａｇｅｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓａｇｅｈｌｓ／として商業的に入手可能である）。
【0027】
溶出後、標準的なマニュアルまたは自動化液体処理方法を使用して、溶出モジュールからｅｃＤＮＡ生成物を回収することができる。ＤＮＡが５０ｋｂを超えるサイズである場合、生成物のせん断破壊を避けるように、ワイドボアピペットチップおよび遅いピペッティング速度が提案される。この電気泳動ｅｃＤＮＡ精製方法（いくつかの実施形態による）は、特に前のセクションで議論した非電気泳動方法と比較して、単純かつ高速である（いくつかの実施形態では、ｅｃＤＮＡのサイズに依存して、２～９時間の合計電気泳動時間である）。
【0028】
いくつかの実施形態による、溶解試薬のための例示的な界面活性剤は、約０．１％～約１０％（ｗ／ｖ）の間の濃度のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびＮ－ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（サルコシル）を含む。１つの好ましい溶解試薬は、２％～５％の間の濃度のＳＤＳである。
【0029】
回収後、富化されたｅｃＤＮＡ生成物は、定量的ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、光学イメージング、電子顕微鏡（ＥＭ）、および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を含む異なる方法によって分析することができる。定量的ＰＣＲは、ｅｃＤＮＡ上に担持された特定の既知の配列要素のコピー数および溶出位置を同定するのに有用である。また、電気泳動条件の所定のセット下での溶出位置から、ｑＰＣＲによって同定されたｅｃＤＮＡのサイズについてのある程度の推定を提供する。光学イメージング、ＥＭ、およびＡＦＭは、ｅｃＤＮＡのサイズおよびトポロジーについてより直接的な測定を提供することができる（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｂｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｍｉｋｈｅｉｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。さらに、光学イメージングおよびＡＦＭ法は、特定のＤＮＡ配列要素の長距離マップも提供でき、これはｅｃＤＮＡ配列決定データの確認および修正に有用な足場を提供し得る（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１７； Ｍｉｋｈｅｉｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。
【0030】
富化されたｅｃＤＮＡ産物は、ショートリードＩｌｌｕｍｉｎａペアエンドシーケンス、ＰａｃＢｉｏまたはＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅシーケンシングなどのロングリード法、またはリンクリードシーケンス（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’ ＴＥＬＬ－ｓｅｑ， Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， ２０１９）などの組み合わせアプローチを含むすべての標準配列決定法で配列決定することができる。
【0031】
いくつかの実施形態による、本方法によって産生された富化されたｅｃＤＮＡは、抽出中にゲルから完全に除去することが困難であってｅｃＤＮＡと共溶出する低量のＳＤＳによって汚染されることがある。小さなｅｃＤＮＡ（概ね２０ｋｂ未満）は、ＳＤＳを除去するために固相可逆的固定化法（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５）を使用して精製することができる。より長いｅｃＤＮＡはＳＰＲＩ法で壊れる可能性があり、そのような場合、少量のｅｃＤＮＡの効率的な沈殿を確保するために、必要に応じて不活性キャリアポリマー（グリコーゲンまたは線状ポリアクリルアミド）を用いてエタノール沈殿によりＤＮＡを濃縮して、ＳＤＳを除去することが好ましいものであり得る（Ｆｒｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
【実施例】
【0032】
実施例では、ＳａｇｅＨＬＳカセットのゲルとリザーバーバッファーで０．５×強度で使用される電気泳動バッファーＫに対する参照がなされている。１× Ｋバッファーは、１０２ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、５７ｍＭ Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノプロパンスルホン酸、［（２－ヒドロキシ－１，１－ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］－１－プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、０．１６ｍＭ ＥＤＴＡ酸、ｐＨ８．７である。
【0033】
実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ（ＡＴＣＣ ９６３７）由来のプラスミドの抽出および精製。
【0034】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗは、２つのプラスミド、ｐＲＫ１（１０２，５３６ｂｐ）およびｐＲＫ２（５，３６０ｂｐ）を保有している（Ａｒｃｈｅｒら、２０１１年）。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗの新鮮な一晩培養液をＬＢブロスで３７℃に振盪しながら調製した。細胞を、洗浄バッファー（１０ｍＭ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ，２０％ スクロース ｗｔ／ｖ）で再懸濁と遠心分離（１２，０００ｘｇ，２分）により２回洗浄し、スフェロプラストバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５，５ ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２０％ スクロース）に再懸濁した。次に、細胞をＲｅａｄｙ－Ｌｙｓｅリゾチーム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ／Ｌｕｃｉｇｅｎ）で、５６００ユニット／ｍｌの最終反応濃度で、室温で３０分間消化した。
【0035】
スフェロプラスト懸濁物の全ＤＮＡ濃度を、迅速なＳＤＳ溶解手順によって決定した。二重のアリコートを以下のように処理した。１０マイクロリットルの試料を、２００マイクロリットルのＱ溶解バッファー（０．５× Ｋバッファー、１％ＳＤＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ）と直ちに激しく混合した。得られたライセートを６００マイクロリットルのＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８， １ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈し、少なくとも３０秒間激しくボルテックスした。この最終の５μｌアリコートを、Ｑｕｂｉｔ ＨＳ試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ含量をアッセイした。
【0036】
ｅｃＤＮＡ抽出を行うために、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗスフェロプラストを洗浄バッファーで希釈して、７０マイクロリットル当たり２．５マイクログラムの最終ＤＮＡ濃度とした。希釈したスフェロプラスト調製物の７０μｌアリコートを０．７５％アガロースＳａｇｅＨＬＳカセットの試料ウェルへロードした。ＨＬＳ溶解バッファー（１ｘ Ｋバッファー，２％ グリセロール（ｗｔ／ｖ），３％ ＳＤＳ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ）の２００マイクロリットルのアリコートを試薬ウェルにロードし、ウェルポートをテープで密封し、直ちに抽出電気泳動を開始した。
【0037】
２つのプラスミド間のサイズに大きな差があるため、２つの異なる抽出電気泳動条件を使用した。より小さい５．３ｋｂプラスミドを富化するために設計された手順では、抽出電気泳動を５０Ｖで３０分間行った後、電気泳動を５０Ｖで４５分間横方向に行った。１０２ｋｂのより大きなプラスミドについては、抽出電気泳動をパルス電界プログラムを用いて５５Ｖで８時間行い、その後５０Ｖで１．５時間横方向に電気泳動を行った。パルス電界プログラムは、２４回のパルス電界サイクルにわたってパルス期間を直線的にインクリメントさせた順方向および逆方向期間を使用した。初期値は順方向３秒、逆方向１秒で、その後のＦ－Ｒサイクルごとに順方向パルスは２．５５秒、逆方向パルスは０．８５秒増加させた。２４回のＦ－Ｒサイクルの間インクリメントを続け、その後パルス時間を初期状態（Ｆ３秒、Ｒ１秒）に戻し、インクリメントサイクルを再開した。
【0038】
電気泳動の完了後、溶出産物をプラスミドについてＳＹＢＲグリーンｑＰＣＲによりアッセイした。溶出産物中の染色体ＤＮＡをアッセイするために、ｒｅｃＡ遺伝子のｑＰＣＲアッセイも行った。溶出産物中の微量のＳＤＳによるＰＣＲ阻害を抑制するために、ＳＤＳと結合する非イオン性界面活性剤ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（ｂＣＤ）を０．１％（ｗｔ／ｖ）で反応物に含めた。ｑＰＣＲ反応物（２０マイクロリットル）にはＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，Ｔｈｅｒｍｏ ＡＢＩ）、０．５マイクロモルの各プライマー、０．１％ ｂＣＤ、および２マイクロリットルの溶出産物のＤＮＡを含めた。ｑＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３装置（Ｔｈｅｒｍｏ ＡＢＩ）で、標準的なＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ条件（９５℃で１０分間の初期保持、その後９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクル）を用いて実施した。使用したプライマーは以下の通り。
ｐＲＫ１：
ｔｒｂＡ－１Ｆ ＴＣＴＴＴＣＣＡＧＧＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
ｔｒｂＡ－１Ｒ ＧＴＣＧＡＡＣＡＧＣＡＴＡＣＴＣＴＣＡＴ
ｐＲＫ２：
ｍｏｂＡ－１Ｆ ＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＧＡＡＴ
ｍｏｂＡ－１Ｒ ＧＡＴＴＴＴＣＧＴＣＴＣＧＴＴＴＧＡＧＧ
ｒｅｃＡ：
ｒｅｃＡ－１Ｆ ＴＡＴＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＧＧＣＧＡＡＣ
ｒｅｃＡ－１Ｒ ＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＣＴＴＣ
ｐＲＫ１：
ｔｒｂＡ－１Ｆ ＴＣＴＴＴＣＣＡＧＧＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
ｔｒｂＡ－１Ｒ ＧＴＣＧＡＡＣＡＧＣＡＴＡＣＴＣＴＣＡＴ
ｐＲＫ２：
ｍｏｂＡ－１Ｆ ＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＧＡＡＴ
ｍｏｂＡ－１Ｒ ＧＡＴＴＴＴＣＧＴＣＴＣＧＴＴＴＧＡＧＧ
ｒｅｃＡ：
ｒｅｃＡ－１Ｆ ＴＡＴＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＧＧＣＧＡＡＣ
ｒｅｃＡ－１Ｒ ＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＣＴＴＣ
【0039】
ｑＰＣＲの結果を図４ａおよび図４ｂに示す。図４ａは、より大きなｐＲＫ１プラスミド（１０２ｋｂ）が、使用したパルス電界条件下でＳａｇｅＨＬＳカセットの溶出画分５中に溶出したことを示す。図４ｂに示すように、より小さいプラスミドは、非常に短い３０分の抽出電気泳動時間を用いて溶出画分２に見出された。いずれの抽出物においても、プラスミドを含む画分に染色体ＤＮＡはほとんど見られず（ｐＲＫ１／ｒｅｃＡコピー比は１６、ｐＲＫ２／ｒｅｃＡコピー比は５０）、プラスミドＤＮＡの富化が確認された。
【0040】
実施例２：ヒト白血球（ＷＢＣ）からのミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の抽出と富化
【0041】
ヒト白血球（ＷＢＣ）を、赤血球溶解バッファー（１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）での３回の遠心洗浄によってＡＣＤ全血試料から分離し、懸濁バッファー（８％スクロース ｗｔ／ｖ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５％Ｆｉｃｏｌｌ４００ ｗｔ／ｖ、０．２５×Ｋバッファー）中に再懸濁した。ＷＢＣを、上記実施例１に記載の迅速なＳＤＳ溶解手順と、その後のＱｕｂｉｔ ＨＳキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたＤＮＡ定量を用いて、ゲノムＤＮＡ含量から定量した。ｍｔＤＮＡ抽出のために、試料ウェルに、７０ｕｌの懸濁バッファー中の１２０万個のＷＢＣをロードした。ＨＬＳのワークフローには、５０Ｖの電気泳動で１．２５時間の抽出およびサイズ選択と、その後の、ＨＬＳカセットの溶出モジュールにｍｔＤＮＡを採取するための５０Ｖで１．５時間の電気溶出を含めた。ｍｔＤＮＡ産物の溶出位置を、ｑＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ ＡＢＩ Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｈｓ０２５９８７４－ｇ１ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ＭＴ－ＮＤ２，ＡＢＩ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３装置）により決定した。図３に示すように、ｍｔＤＮＡは画分３および４に溶出された。染色体ＤＮＡはどの画分にもほとんど溶出されず、ｑＰＣＲによる見かけ上のｍｔＤＮＡの富化度は＞１０００倍であった。
【0042】
実施例３：本発明の方法で抽出したｅｃＤＮＡの配列決定。
【0043】
ヒトＷＢＣの２つのアリコートから、ｍｔＤＮＡを、上記の実施例２に記載したように抽出した。ｑＰＣＲを、ｍｔＤＮＡを含む溶出画分を見つけるために実施した。一方のレーンからの溶出産物を、Ｍｉｎｉｏｎ上でのＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅシーケンシングに使用した。もう一方のレーンからの溶出産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑでのペアエンドシーケンシングに使用した。
【0044】
両方のライブラリーについて、ＨＬＳの溶出画分４のＤＮＡは、概ね０．７ナノグラムの全ＤＮＡを含んでいた（約８０ｕｌ総量）。このＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮した。
【0045】
ＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリーをＮｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘキットで生成し、Ｍｉｓｅｑ ２Ｘ１５０ ｂｐペアエンドプロトコルを使用して配列決定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリードデータを、ＢＷＡ－ＭＥＭ（ｖｓ．０．７．１７－ｒ１１８８、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｌｈ３／ｂｗａ）によりｈｇ３８参照ゲノム（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ａｌｌ／ＧＣＡ／０００／００１／４０５／ＧＣＡ＿０００００１４０５．１５＿ＧＲＣｈ３８／ｓｅｑｓ＿ｆｏｒ＿ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＿ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ．ｕｃｓｃ＿ｉｄｓ／ＧＣＡ＿０００００１４０５．１５＿ＧＲＣｈ３８＿ｎｏ＿ａｌｔ＿ａｎａｌｙｓｉｓ＿ｓｅｔ．ｆｎａ．ｇｚを参照のこと）にアラインし、Ｓａｍｔｏｏｌｓ（ｖｓ．１．９、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓａｍｔｏｏｌｓ／ｓａｍｔｏｏｌｓ）によりソートおよびデュプリケートした。ｍｔＤＮＡのカバレッジはＩＧＶ（Ｌｉｎｕｘ（登録商標）ｖｓ．２．６．２，ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｉｇｖ／）を用いて視覚的に評価した。
【0046】
Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｍｉｎｉｏｎシーケンシングを、Ｍｉｎｉｏｎ Ｒ９．４．１フローセルを用いたＲａｐｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙキット（ＲＡＤ００４）を使用して実施した。Ｍｉｎｉｏｎライブラリー構築のために、５０ｎｇのＨＭＷ Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡをｍｔＤＮＡ富化ＨＬＳ溶出産物に加え、ライブラリー構築中のキャリアとした。Ｏｘｆｏｒｄ ＮａｎｏｐｏｒｅのＭｉｎｉｏｎデータを、ｇｕｐｐｙソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ）を用いて高精度モードでベースコールポストランし、得られたｆａｓｔｑデータファイルをｍｉｎｉｍａｐ２（ｖｓ．２．１７＿ｘ６４－ｌｉｎｕｘ，ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｌｈ３／ｍｉｎｉｍａｐ２）を用いてｈｇ３８参照にアラインし、Ｓａｍｔｏｏｌｓでソートした。ＮａｎｏＰｌｏｔ（ｖｓ．１．２４．０，ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｗｄｅｃｏｓｔｅｒ／ＮａｎｏＰｌｏｔ）を用いてリードの長さ分布を解析し、ＩＧＶを用いてカバレッジを視覚的に評価した。
【0047】
Ｍｉｎｉｏｎシーケンスのカバレッジは概ね６０倍（図５）、Ｍｉｓｅｑランのカバレッジは概ね１２，０００倍（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ～１２，０００－ｆｏｌｄ；図４ｂ）であった。Ｍｉｎｉｏｎのカバレッジは、非増幅ロングリードライブラリーから予想されるように、ｍｔＤＮＡゲノム全体にわたって著しく均一であった。トランスポザーゼにより生成されたＲａｐｉｄライブラリーは１５，９４０ｂｐのＮ５０リード長を有し、リードの概ね５０％が、ほぼ完全な長さの約１６，５００のリードであったことから、無傷のｍｔＤＮＡサークルにトランスポザーゼが１つ挿入された結果であることが明らかであった。ベースコーリングは、Ｍｉｎｉｏｎランの方がＭｉｓｅｑよりも著しくノイズが多かった。Ｍｉｓｅｑデータで同定されたＳＮＰのほとんどがＭｉｎｉｏｎデータでも確認できたのに対し、Ｍｉｎｉｏｎデータは潜在的なＳＮＰを著しく多く有し、複数のベースコールを有する部位をより多く有した。例えば、図６および図７を参照。
【0048】
開示に関するその他の留意点
本明細書において様々な発明的実施形態が記載および図示されてきたが、当業者であれば、本明細書において開示される機能性を実行するため、ならびに／または本明細書において記載される結果および／もしくは１つまたはそれより多くの利点を得るための様々な他の手段、機能性、ステップ、および／または構造（ソフトウェアコードを含む）を容易に想定し、かかる変形および／または改変の各々は、本明細書に記載される発明的実施形態の範囲内にあると考えられる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載された全てのパラメータ、および構成が例示的であることを意図しており、実際のパラメータ、および構成が、本発明の教示が用いられる特定の用途（単数または複数）に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載された特定の発明的実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または日常的な実験以上のものを使用せずに確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は例示としてのみ提示され、本開示およびその均等物によって支持される任意の請求項の範囲内で、発明的実施形態は、具体的に記載され請求されるものとは異なる方法で実施され得ることを理解されたい。本開示の発明的実施形態は、本明細書に記載された任意のおよび個々の特徴、構造、システム、装置、デバイス、ステップ、コード、機能性、および方法も対象とする。さらに、２つまたはそれより多くのそのような特徴、構造、システム、装置、デバイス、ステップ、コード、機能性、および方法の任意の組み合わせは、特徴、構造、システム、装置、デバイス、ステップ、コード、機能性、および方法の任意のそのような組み合わせが相互に矛盾しない場合、本開示の発明範囲に含まれる。さらなる実施形態は、１つまたはそれより多くの特徴、構造、ステップ、および／または機能性を具体的に欠くことによって、先行技術よりも特許性が高い場合がある（すなわち、そのような実施形態を対象とした請求項は、そのような請求項を先行技術と区別するために１つまたはそれより多くの否定的制限を含む場合がある）。
本明細書において様々な発明的実施形態が記載および図示されてきたが、当業者であれば、本明細書において開示される機能性を実行するため、ならびに／または本明細書において記載される結果および／もしくは１つまたはそれより多くの利点を得るための様々な他の手段、機能性、ステップ、および／または構造（ソフトウェアコードを含む）を容易に想定し、かかる変形および／または改変の各々は、本明細書に記載される発明的実施形態の範囲内にあると考えられる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載された全てのパラメータ、および構成が例示的であることを意図しており、実際のパラメータ、および構成が、本発明の教示が用いられる特定の用途（単数または複数）に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載された特定の発明的実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または日常的な実験以上のものを使用せずに確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は例示としてのみ提示され、本開示およびその均等物によって支持される任意の請求項の範囲内で、発明的実施形態は、具体的に記載され請求されるものとは異なる方法で実施され得ることを理解されたい。本開示の発明的実施形態は、本明細書に記載された任意のおよび個々の特徴、構造、システム、装置、デバイス、ステップ、コード、機能性、および方法も対象とする。さらに、２つまたはそれより多くのそのような特徴、構造、システム、装置、デバイス、ステップ、コード、機能性、および方法の任意の組み合わせは、特徴、構造、システム、装置、デバイス、ステップ、コード、機能性、および方法の任意のそのような組み合わせが相互に矛盾しない場合、本開示の発明範囲に含まれる。さらなる実施形態は、１つまたはそれより多くの特徴、構造、ステップ、および／または機能性を具体的に欠くことによって、先行技術よりも特許性が高い場合がある（すなわち、そのような実施形態を対象とした請求項は、そのような請求項を先行技術と区別するために１つまたはそれより多くの否定的制限を含む場合がある）。
【0049】
本開示の上述した実施形態は、多数の方法のいずれかで実施され得る。例えば、いくつかの実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを使用して（例えば、開示されたプロセスの１つまたはそれより多くのステップを実行するための機器の制御において）実装され得る（例えば、前述のように）。実施形態の任意の態様が少なくとも部分的にソフトウェアで実装される場合、ソフトウェアコードは、単一のコンピュータに設けられているか、複数のコンピュータに分散されているかどうかにかかわらず、任意の適切なプロセッサまたはプロセッサの集合体、サーバなどで実行され得る。
【0050】
本願のどこかに提示された、特許、特許出願、論文、ウェブページ、書籍などを含むがこれらに限定されない出版物または他の文書への任意のおよびすべての参照は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書で定義され使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義、および／または定義された用語の通常の意味を支配すると理解されるべきである。
【0051】
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確に反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【0052】
用語「できる（ｃａｎ）」および「し得る（ｍａｙ）」は、本開示において交換可能に使用され、言及された要素、構成要素、構造、機能、機能性、目的、利点、動作、ステップ、プロセス、装置、システム、デバイス、結果、または明確化が、言及されたそれぞれの実施形態（単数または複数）に従って、用語が使用（または言及）される文において示される命題を使用、含む、または生成する、またはその他の方法で表わす能力を有することを示す。
【0053】
本明細書および特許請求の範囲で使用される語句「および／または」は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には接続的に存在し、他の場合には非接続的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および／または」で列挙された複数の要素は、同じ方法で、すなわち、そのように結合された要素の「１つまたはそれより多く」と解釈されるべきである。他の要素は、「および／または」節によって具体的に特定された要素以外に、具体的に特定された要素に関連するか否かに関わらず、必要に応じて存在することができる。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのオープンエンドの言語と組み合わせて使用される場合、ある実施形態では、Ａのみ（必要に応じてＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ｂのみ（必要に応じてＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（必要に応じてその他の要素含む）；等を指すことができる。
【0054】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は、包括的であること、すなわち、多数の要素または要素のリストのうち少なくとも１つを含むが、１つより多くを含むこと、および、必要に応じて、追加のリストにない項目を含むことと解釈されるものとする。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」のような明確に反対を示す用語、または特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」は、多数の要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを意味することになる。一般に、本明細書で使用される用語「または」は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、「のうちの正確に１つ」などの排他的用語に先行された場合にのみ排他的選択肢（すなわち「どちらか一方だが両方ではない」）を示すものとして解釈するものとする。特許請求の範囲において使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
【0055】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つまたはそれより多くの要素のリストに言及する「少なくとも１つ」という語句は、要素のリスト内の任意の１つまたはそれより多くの要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙された各々および全ての要素の少なくとも１つを含むとは限らず、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外しないものとする。この定義はまた、語句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、具体的に特定された要素に関連するか否かにかかわらず、必要に応じて存在することができることを許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または、同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つのＡ、必要に応じて複数のＡを含み、Ｂが存在しないこと（および、必要に応じてＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、少なくとも１つのＢ、必要に応じて１つより多くのＢを含み、Ａが存在しないこと（および必要に応じてＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、少なくとも１つのＡ、必要に応じて１つより多くののＡ、および少なくとも１つのＢ、必要に応じて１つより多くのＢを含むこと（および必要に応じて他の要素を含む）；などを指す。
【0056】
特許請求の範囲および上記の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」等のすべての移行句は、オープンエンド、すなわち、含むが限定されないという意味に理解されるものとする。移行句である「からなる」および「から本質的になる」のみは、米国特許庁特許審査手続要覧第２１１１．０３条に規定されるように、それぞれクローズドまたはセミクローズドの移行句でなければならない。
【0057】
参考文献
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【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】