特表 2023-522622 ＴＤＰ－４３及びＦＵＳ凝集を抑制するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-31

(54)【発明の名称】ＴＤＰ－４３及びＦＵＳ凝集を抑制するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20230524BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230524BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230524BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20230524BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20230524BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20230524BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230524BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230524BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230524BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230524BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20230524BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20230524BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230524BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230524BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230524BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20230524BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20230524BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20230524BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20230524BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230524BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20230524BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20230524BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N15/85 Z

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

A61P25/00

A61P21/00

A61P25/28

A61P25/14

A61P43/00 105

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/761

A61K31/713

A61K31/7105

A61K9/127

A61K47/68

A61K47/54

A61K47/64

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022562431

(86)(22)【出願日】2021-04-16

(85)【翻訳文提出日】2022-12-12

(86)【国際出願番号】 CA2021050521

(87)【国際公開番号】W WO2021207854

(87)【国際公開日】2021-10-21

(31)【優先権主張番号】63/011,786

(32)【優先日】2020-04-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】300066874

【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】キャッシュマン，ニール アール．

(72)【発明者】

【氏名】プロトキン，スティーブン エス．

(72)【発明者】

【氏名】チャオ，ベイベイ

(72)【発明者】

【氏名】シュエ，チン－チュン

(72)【発明者】

【氏名】コーワン，キャサリン エム．

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA95

4C076BB11

4C076BB12

4C076BB25

4C076CC01

4C076CC26

4C076DD66

4C076DD70

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF11

4C084AA13

4C084MA24

4C084MA59

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZA022

4C084ZA151

4C084ZA152

4C084ZA161

4C084ZA162

4C084ZA221

4C084ZA222

4C084ZA941

4C084ZA942

4C084ZB211

4C084ZB212

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA05

4C086MA24

4C086MA59

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZA22

4C086ZA94

4C086ZB21

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA09

4C087CA12

4C087MA59

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA15

4C087ZA16

4C087ZA22

4C087ZA94

4C087ZB21

(57)【要約】

ヒトＲＡＣＫ１をノックダウンするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡなどのオリゴマー化合物及び組成物、並びにそれを必要とする対象において筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から任意に選択されるＴＤＰ－４３－ｏｐａｔｈｙ又はＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患を治療するため、又は細胞内のＴＤＰ－４３及び／又はＦＵＳ凝集を低下させるための方法であって、ＲＡＣＫ１を標的とする１以上のアンチセンス分子、任意に本明細書に開示される１以上のオリゴマー化合物を、それを必要とする対象に投与するか又は細胞内に導入することを含む方法が本明細書に開示される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１～１６、４９～５１及び２８９～４９９のうちのいずれか１つから選択される核酸標的配列の少なくとも一部に相補的な部分を含むオリゴマー化合物であって、好ましくは前記核酸標的配列が、配列番号２９２、２９７、２９８、２及び３のうちのいずれか１つから選択される、オリゴマー化合物。

【請求項2】

前記オリゴマー化合物が１４～４０ヌクレオチド長である、請求項１に記載のオリゴマー化合物。

【請求項3】

前記核酸標的配列が、配列番号２～６、８、１０～１６、４９～５１、２９２～２９４及び２９６～４８９のうちのいずれか１つから選択される、請求項１又は２に記載のオリゴマー化合物。

【請求項4】

前記核酸標的配列が、配列番号２～６、８、１０～１６、２９２～２９４及び２９６～２９８のうちのいずれか１つから選択される、請求項１又は２に記載のオリゴマー化合物。

【請求項5】

前記核酸標的配列が、配列番号２、３、２９２、２９７及び２９８のうちのいずれか１つから選択される、請求項１又は２に記載のオリゴマー化合物。

【請求項6】

前記部分が前記核酸標的配列と相補的であり、前記核酸標的配列が、配列番号２～６、８、１０～１６、４９～５１、２９２～２９４及び２９６～４８９のうちのいずれか１つから選択される配列であるか、又はそれを含む、請求項１又は２に記載のオリゴマー化合物。

【請求項7】

前記部分が前記核酸標的配列と相補的であり、前記核酸標的配列が、配列番号２～６、８、１０～１６、４９～５１、２９２～２９４及び２９６～２９８のうちのいずれか１つから選択される配列であるか、又はそれを含む、請求項１又は２に記載のオリゴマー化合物。

【請求項8】

前記部分が前記核酸標的配列と相補的であり、前記核酸標的配列が、配列番号２、３、２９２、２９７及び２９８のうちのいずれか１つであるか、又はそれを含む、請求項１又は２に記載のオリゴマー化合物。

【請求項9】

前記オリゴマー化合物がＲＮＡ、ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡの混合物を含むか、又はそれである、請求項１～８のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項10】

１以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項11】

複数の修飾ヌクレオチドを含み、任意に前記部分の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項９のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項12】

前記修飾が、前記リボース糖の２’位における化学修飾である、請求項１０又は１１に記載のオリゴマー化合物。

【請求項13】

前記化学修飾が、２’Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’Ｏ－ＭＯＥ）、２’フルオロ（２’Ｆ）及び２’－Ｏ，４’－Ｃメチレン架橋から選択される、請求項１２に記載のオリゴマー化合物。

【請求項14】

前記オリゴマー化合物が、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項15】

前記修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合又はホスホロアミダート結合である、請求項１４に記載のオリゴマー化合物。

【請求項16】

前記オリゴマー化合物が、複数のロック核酸モノマー（ＬＮＡＭ）を含む、請求項１０～１５のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項17】

前記オリゴマー化合物が、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項１～１６のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項18】

前記オリゴマー化合物が、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項１～１６のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項19】

前記オリゴマー化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ＲＡＣＫ１低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）構築物である、請求項１～１８のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項20】

前記部分が、配列番号１７～３２、５２～５４及び７８～２８８のいずれか一項に記載の配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項21】

前記部分が、配列番号１８～２２、２４、２６～３２、５２～５４及び７８～２８８のいずれか一項に記載の配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項22】

前記部分が、配列番号１８～２２、２４、２６～３２、５２～５４、８１～８３及び８５～８７のいずれか一項に記載の配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項23】

前記部分が、配列番号１８、１９、８１、８６及び８７のいずれか一項に記載の配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項24】

前記オリゴマー化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１９～２３のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項25】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ロック核酸（ＬＮＡ）、モルホリノオリゴヌクレオチド、ギャップマー又はミックスマー、任意にＬＮＡ／ＲＮＡミックスマーである、請求項２４に記載のオリゴマー化合物。

【請求項26】

前記部分が配列番号７８～２８８のいずれか一項に記載の配列を含む、請求項２５に記載のオリゴマー化合物。

【請求項27】

前記部分が、配列番号８１～８３及び８５～２８８のいずれか一項に記載の配列を含む、請求項２８に記載のオリゴマー化合物。

【請求項28】

前記部分が、配列番号８１、８６及び８７のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項３０に記載のオリゴマー化合物。

【請求項29】

前記部分が配列番号８１を含むか、又はそれである、請求項２８に記載のオリゴマー化合物。

【請求項30】

前記部分が配列番号８６を含むか、又はそれである、請求項２８に記載のオリゴマー化合物。

【請求項31】

前記部分が配列番号８７を含むか、又はそれである、請求項２８に記載のオリゴマー化合物。

【請求項32】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、複数のＲＮＡヌクレオチドが隣接する複数のＤＮＡヌクレオチドを含むギャップマーである、請求項２４～３１のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項33】

前記ギャップマーが、両側に５個のＲＮＡヌクレオチドが隣接する１０個のＤＮＡヌクレオチドを含む、請求項３２に記載のオリゴマー化合物。

【請求項34】

前記ＲＮＡヌクレオチドの１以上が２’Ｏ－ＭＯＥ修飾を含み、任意に前記ＲＮＡヌクレオチドの全てが２’Ｏ－ＭＯＥ修飾を含む、請求項３２に記載のオリゴマー化合物。

【請求項35】

前記部分が、１以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、任意に、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項２４～３４のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項36】

前記オリゴマー化合物が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり、前記部分がガイド鎖である、請求項１９～２３のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項37】

前記ガイド鎖が、配列番号１７～３２及び５２～５４のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項３６に記載のオリゴマー化合物。

【請求項38】

前記核酸標的配列が、ＲＡＣＫ１標的配列の２以上の追加の連続残基、任意に１９～３０個のＲＡＣＫ１標的配列残基又はその間の任意の数を含む、請求項３６又は３７に記載のオリゴマー化合物。

【請求項39】

前記ガイド鎖が２以上の追加の非標的残基を含む、請求項３６～３８のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項40】

前記ガイド鎖が、３’ＡＵオーバーハングを有する配列番号１８、３’ＡＣオーバーハングを有する配列番号１９又は３’ｇｕオーバーハングを有する配列番号１９の配列を含む、請求項３７に記載のオリゴマー化合物。

【請求項41】

前記オリゴマー化合物が二本鎖であり、３’ａｕオーバーハングを有する配列番号４０及び３’ＡＵオーバーハングを有する配列番号１８の配列を含む、請求項４０に記載のオリゴマー化合物。

【請求項42】

前記オリゴマー化合物が、二本鎖であり、３’ｇｕオーバーハングを有する配列番号３５及び３’ｇｕオーバーハングを有する配列番号１９の配列を含む、請求項４０に記載のオリゴマー化合物。

【請求項43】

前記ガイド鎖が２１～２５残基であり、任意に前記オリゴマー化合物が、前記ガイド鎖に相補的なパッセンジャー鎖を含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項44】

前記オリゴマー化合物がｓｈＲＮＡである、請求項１９～２３のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項45】

前記ｓｈＲＮＡが、５’～３’：ＧＡＡＣＵＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＵＵＡＵＣ（配列番号３４）（ループ）ＧＡＵＡＡＣＵＵＣＵＵＧＣＵＵＣＡＧＵＵＣ（配列番号１８）又は５’－３’：ＣＵＣＵＧＧＡＵＣＵＣＧＡＧＡＵＡＡＡ（配列番号３５）（ループ）ＵＵＵＡＵＣＵＣＧＡＧＡＵＣＣＡＧＡＧ（配列番号１９）を含む配列を含む、請求項４４に記載のオリゴマー化合物。

【請求項46】

１以上の細胞透過性部分をさらに含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項47】

前記１以上の細胞透過性部分が、糖、好ましくはＮ－アセチルガラクトサミン、脂質、好ましくはコレステロール、抗体又はその断片、好ましくはＦａｂ断片、アプタマー又はペプチドである、請求項４７に記載のオリゴマー化合物。

【請求項48】

前記オリゴマー化合物が、ベクター、例えば、プラスミド、又はレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターに含まれる、請求項１～４６のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。

【請求項49】

請求項１～４５のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物を含むベクター。

【請求項50】

前記ベクターが、プラスミド及びウイルスベクター、任意にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、又はγ－レトロウイルスベクターから選択される、請求項４９に記載のベクター。

【請求項51】

請求項１～４８のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物、又は請求項４９若しくは５０に記載のベクターを含み、任意に希釈剤を含む組成物。

【請求項52】

リポソーム、ナノ粒子又はナノソームなどの脂質粒子を含む、請求項５１に記載の組成物。

【請求項53】

複数のオリゴマー化合物、例えば、２、３、４又はそれ以上を含む、請求項５１又は５２に記載の組成物。

【請求項54】

ＲＡＣＫを標的とするための他のアンチセンス分子をさらに含む、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項55】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基球性包接体疾患（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から任意に選択されるＴＤＰ４３－ｏｐａｔｈｙ又はＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象のニューロン、アストロサイト細胞又はミクログリア細胞においてＲＡＣＫ１をノックダウンすることを含む方法。

【請求項56】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基球性包接体疾患（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から任意に選択されるＴＤＰ４３－ｏｐａｔｈｙ又はＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患を治療する方法であって、ＲＡＣＫ１を標的とする有効量の１以上のアンチセンス分子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。

【請求項57】

前記１以上のアンチセンス分子が、髄腔内、脳室内、鼻腔内、血管内又は実質内投与、好ましくは髄腔内投与によって投与される、請求項５５又は５６に記載の方法。

【請求項58】

ＴＤＰ－４３及び／若しくはＦＵＳ凝集を含む疾患細胞などの細胞におけるＴＤＰ－４３及び／若しくはＦＵＳ凝集を低下又は阻害する方法であって、前記細胞内のＲＡＣＫ１レベルを低下させるのに十分な量及び十分な時間、ＲＡＣＫ１を標的とする１以上のアンチセンス分子を前記細胞に投与するか、又は前記細胞内に導入することを含む方法。

【請求項59】

前記量及び／又は時間が、ＴＤＰ－４３凝集を低下させ、かつ／又は核内ＴＤＰ－４３を回復させるのに十分である、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記量及び／又は時間が、ＦＵＳ凝集を低下させ、かつ／又は核内ＦＵＳを回復させるのに十分である、請求項５８に記載の方法。

【請求項61】

前記１以上のアンチセンス分子が、請求項１～４８のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物のうちの１以上であるか又はそれを含み、任意に前記１以上の各々が請求項４９又は５０に記載のベクターに含まれる、請求項５５～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記１以上のアンチセンス分子が、表１に列挙される核酸標的配列を標的とする、請求項５５～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記１以上のアンチセンス分子が、請求項５１～５４に記載の前述の組成物を介して導入される、請求項５５～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記アンチセンス分子及び／又は組成物が、輸送試薬と共に、又は前記アンチセンス分子を発現する組換えプラスミド若しくはウイルスベクターとして、ネイキッド細胞内に投与又は導入される、請求項５５～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記輸送試薬が、リポソーム、ナノ粒子、又はナノソームなどの脂質粒子を含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項66】

前記中枢神経系の細胞、任意にニューロン、アストロサイト又はミクログリア細胞である、請求項５８～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記細胞が、ＴＤＰ－４３－ｏｐａｔｈｙ又はＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患を有する対象に存在する、請求項５８～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記ＴＤＰ４３－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）である、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記ＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患が、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）又は好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）である、請求項６７に記載の方法。

【請求項70】

それを必要とする対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）を治療するため、又はニューロン、アストロサイト若しくはミクログリア細胞などの細胞におけるＴＤＰ－４３及び／若しくはＦＵＳ凝集を低下又は阻害するための１以上のアンチセンス分子、任意に請求項１～４８のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物、請求項４９若しくは５０に記載のベクターの使用、及び／又は請求項５５～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から任意に選択されるＴＤＰ４３－ｏｐａｔｈｙ又はＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患の治療に使用するためのアンチセンス分子、請求項１～４８のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物、請求項４９～５０に記載のベクター又は請求項５１～５４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項72】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から任意に選択されるＴＤＰ４３－ｏｐａｔｈｙ又はＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患の治療薬の製造のためのアンチセンス分子、請求項１～４８のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物、請求項４９～５０に記載のベクター又は請求項５１～５４のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０２０年４月１７日出願の米国仮特許出願第６３／０１１,７８６号の優先権に基づいて米国特許法第１１９条の利益を主張する特許協力条約出願である。

【0002】

配列表の組み込み
２０２１年４月１６日に作成され、ＥＦＳ－ＷＥＢを介して提出される配列表「Ｐ６１０１２ＰＣ００配列表＿ＳＴ２５」（８９,５３２バイト）」のコンピュータ読み取り可能な形態が、参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は、ＲＡＣＫ１の遺伝子調節において使用するためのオリゴマーアンチセンス化合物、並びに疾患細胞におけるＴＤＰ－４３及びＦＵＳ凝集を低下させるための方法に関する。具体的には、本開示は、ＴＤＰ－４３－ｏｐａｔｈｙ及びＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患を治療するためのオリゴマーアンチセンス化合物並びにそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0004】

背景
ＲＡＣＫ１（活性化Ｃキナーゼ１の受容体）は、ＰＫＣ形質導入、ｍｉＲＮＡ調節、及び真核生物の小（４０Ｓ）リボソームサブユニット（１）への結合によるタンパク質翻訳を含む多くの正常な機能を有する高度に保存された足場タンパク質である。細胞ＲＡＣＫ１は、ＴＤＰ４３又はタウ病理を示す細胞において凝集することが報告されている（２，３）。

【0005】

ＲＡＣＫ１は、７枚羽根のβプロペラ構造をしているトリプトファン、アスパラギン酸リピート（ＷＤリピート）タンパク質である。ＲＡＣＫ１は、真核生物４０Ｓリボソームサブユニットのコアリボソームタンパク質であり、足場タンパク質は１００超のタンパク質と相互作用し、それによって細胞増殖、転写、タンパク質合成、及びニューロン機能に重要な様々なシグナル伝達経路を制御し；翻訳制御及びリボソーム品質管理に関与し；サイトゾル、小胞体（ＥＲ）、及び核内で発現する。ＲＡＣＫ１は、進化を通して高度に保存されている。ホモサピエンスＲＡＣＫ１のアミノ酸配列同一性は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に対しては１００％であり、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）に対しては１００％であり、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）に対しては７６％であり、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に対しては６４％であり、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対しては５３％である（４）。

【0006】

ＲＡＣＫ１が、ハンチントン病と関連付けられる遺伝子の野生型及び変異型のハンチンチン（ＨＴＴ）と相互作用することが報告されている（１０）。

【0007】

ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）は、ＡＬＳ及び前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）の病因に関与する周知のＲＮＡ／ＤＮＡ結合タンパク質である（５）。ＴＤＰ－４３は、主に核に局在し、ＲＮＡの発現とスプライシングに関与するが、細胞質にある場合、その機能は特異的ｍＲＮＡの輸送から翻訳まで様々である（６）。ＴＤＰ－４３の翻訳機構への結合は、ＲＡＣＫ１との相互作用によって媒介され、細胞質ＴＤＰ－４３の増加はグローバルタンパク質合成を抑制し、その作用は、野生型ＲＡＣＫ１の過剰発現によって救済される（２）。ＴＤＰ－４３は、翻訳全体のリプレッサーの代表であり、ＲＡＣＫ１を介したポリリボソームへの結合は、細胞質封入体の形成を促進し得る（２）。リボソーム結合欠損変異型（ＤＥ－ＲＡＣＫ１）タンパク質の存在下で、核局在シグナル欠損（ｄＮＬＳ）ＴＤＰ－４３タンパク質の凝集が低下し、翻訳機構との関連が少なくなり、ｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３によるグローバルな翻訳抑制が緩和される（２）。

【0008】

肉腫内で融合し／肉腫内で転座する（Ｆｕｓｅｄ ｉｎ Ｓａｒｃｏｍａ／Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ Ｓａｒｃｏｍａ（ＦＵＳ／ＴＬＳ）ＦＵＳは、主にほとんどの細胞型の核に局在するＲＮＡ／ＤＮＡ結合タンパク質である（６）。ＦＵＳの細胞質凝集は、ＦＵＳ変異を有するＡＬＳ患者の脳及び脊髄ニューロン（６）、及び変異がない（すなわち、野生型タンパク質）ＦＴＬＤの約１０％（１１）において報告されている。

【0009】

ＲＡＣＫ１発現を増減させる分子について説明されている。

【0010】

ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００３４４７は、疾患のマーカーとしてのドーパミン受容体相互作用タンパク質について説明し、ＧＮＢ２Ｌ１（ＲＡＣＫ１）遺伝子に含まれる１以上の核酸配列のバリアント型の有無を決定すること、その変異型の存在は疾患又は疾患に対する感受性の指標であることを説明している。

【0011】

ＵＳ８９１６５３０特許は、個別化癌治療のための方法を説明し、癌の治療に対して上方制御されたＲＡＣＫ１遺伝子発現をノックダウンする際に使用するための特異的アンチセンス／ｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ配列に言及している。

【0012】

ＵＳ１５／８４４６０１は、癌治療薬として薬剤を投与することによって、ＧＮＢ２Ｌ１を含む遺伝子の発現レベルを増加させる方法について説明している。

【0013】

ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０６５１１６は、エキソソームなどの薬物負荷細胞外小胞の親和性ベースの単離及び精製について説明しており、エキソソームは、親和性精製を可能にするように操作されている。

【0014】

ＣＮ１０１９８５０３７は、腫瘍の治療のためのＲＡＣＫ１遺伝子を阻害するための特異的ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用について説明している。

【0015】

ＴＤＰ－４３－ｏｐａｔｈｙ又はＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙに対する追加の治療が望ましい。

【発明の概要】

【0016】

第１の態様において本明細書に開示されるのは、配列番号１～１６、４９～５１又は２８９～４９９のいずれか１つから選択される核酸標的の少なくとも一部に相補的である部分を含むオリゴマー化合物である。

【0017】

一実施形態において、該オリゴマー化合物は、長さが１４～４０ヌクレオチドである。

【0018】

一実施形態において、該核酸標的配列は、配列番号２～６、８、１０～１６、４９～５１、２９２～２９４及び２９６～４９９のうちのいずれか１つから選択される。一実施形態において、該核酸標的配列は、配列番号２～６、８、１０～１６、４９～５１、２９２～２９４及び２９６～２９８のうちのいずれか１つから選択される。一実施形態において、該核酸標的は、配列番号２、３、２９２、２９７及び２９８のうちのいずれか１つから選択される配列である。

【0019】

該標的配列は、ＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡに存在する。ヒトＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡの配列は、例えばＮＣＢＩ参照配列アクセッションコードＮＭ＿００６０９８．５で提供され、配列番号５００を有している。ヒトＲＡＣＫ１プレｍＲＮＡの配列は、例えばアクセッションコードＮＣ＿０００００５．１０配列インデックス１８１２３６８９７～１８１２４８０９６で提供される。

【0020】

一実施形態において、該部分は核酸標的配列と相補的であり、該核酸標的配列は、配列番号１～１６、４９～５１及び２８９～４９９のうちのいずれか１つから選択される配列であるか、又はそれを含む。一実施形態において、該部分は核酸標的配列と相補的であり、該核酸標的配列は、配列番号２～６、８、１０～１６、４９～５１、２９２～２９４及び２９６～４９９のうちのいずれか１つから選択される配列であるか、又はそれを含む。一実施形態において、該部分は核酸標的配列と相補的であり、該核酸標的配列は、配列番号２～６、８、１０～１６、４９～５１、２９２～２９４及び２９６～２９８のうちのいずれか１つから選択される配列であるか、又はそれを含む。一実施形態において、該部分は核酸標的配列と相補的であり、該核酸標的配列は、配列番号２、３、２９２、２９７及び２９８のうちのいずれか１つであるか、又はそれを含む。

【0021】

該オリゴマー化合物は、天然の若しくは修飾されたモノマー又はそれらの組み合わせで構成され得る。該オリゴマー化合物は、一本鎖又は二本鎖であり得、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド（例えば、一本鎖又は二本鎖）であり得る。

【0022】

該オリゴマー化合物は、例えば、配列番号７８～２８８のうちのいずれか１つ、好ましくは配列番号８１～８３及び８５～８７のうちのいずれか１つ、より好ましくは配列番号８１、８６及び８７のうちのいずれか１つの配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。

【0023】

該オリゴマー化合物は、核酸標的の１つを標的とし、天然又は非天然のオーバーハング配列を含むｓｉＲＮＡ化合物であり得る。

【0024】

一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列番号１７～３２及び５２～５４のうちのいずれか１つの配列を含むガイド鎖を含む。

【0025】

ｓｉＲＮＡ配列などの二本鎖オリゴマー化合物は、同一の３'－オーバーハング配列又は同一でない３'－オーバーハング配列を有することができる。１つはネイティブで、もう１つはネイティブでなくてもよい。

【0026】

該オリゴマー化合物は、ｓｈＲＮＡであってよい。一実施形態において、該オリゴマー化合物は、１以上の細胞透過性部分を含む。

【0027】

さらなる態様において、本明細書に開示されるオリゴマー化合物を含むベクターが開示される。

【0028】

さらなる態様において、前記オリゴマー化合物又はベクターと希釈剤とを含む組成物が開示される。

【0029】

本明細書に開示される態様は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から任意に選択されるＴＤＰ４３－ｏｐａｔｈｙ又はＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象の中枢神経系の細胞、特に、ニューロン及び／又はアストロサイト細胞内のＲＡＣＫ１ ＲＮＡ、任意にＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡ及び／又はＲＡＣＫ１プレｍＲＮＡをノックダウンすることを含む方法に関する。

【0030】

本明細書に開示される別の態様は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から任意に選択されるＴＤＰ４３－ｏｐａｔｈｙ又はＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、１以上のアンチセンス分子、任意に本明細書に開示される前記オリゴマー化合物のうちの１以上を投与することを含む方法である。

【0031】

別の態様は、細胞内のＴＤＰ－４３及び／若しくはＦＵＳ凝集を低下又は阻害する方法であって、細胞内のＲＡＣＫ１レベルを低下させるのに十分な量及び十分な時間、１以上のアンチセンス分子、任意にＲＡＣＫ１を標的とする前記オリゴマー化合物のうちの１以上、本明細書に開示される組成物及び／又はベクターを細胞内に導入することを含む方法である。

【0032】

さらなる態様は、それを必要とする対象において、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）例えば、ＴＤＰ－４３型ＦＴＬＤ又はＦＵＳ型ＦＴＬＤ、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から任意に選択されるＴＤＰ－４３－ｏｐａｔｈｙを治療するための、又は細胞におけるＴＤＰ－４３及び／若しくはＦＵＳ凝集を低下又は阻害するための本明細書に記載の１以上のアンチセンス分子、組成物、ベクター及び／又は方法の使用である。

【0033】

一態様において、それを必要とする対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から任意に選択されるＴＤＰ－４３－ｏｐａｔｈｙの治療に使用するための本明細書に記載の１以上のアンチセンス分子、組成物、ベクター及び／又は方法も提供される。

【0034】

さらに、態様は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基球性包接体疾患（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から任意に選択されるＴＤＰ－４３－ｏｐａｔｈｙの治療のための医薬の調製のための、本明細書に記載の１以上のアンチセンス分子、組成物、ベクター及び／又は方法の使用を含む。

【0035】

一実施形態において、該アンチセンス分子、任意にオリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。

【0036】

本開示の実施形態を、これから、以下の図面に関連して説明する。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】図１は、野生型及びｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３（ＨＡ）及びＲＡＣＫ１について染色した細胞の一連の画像である。

【図2】図２は、野生型及びＦＵＳ（ＨＡ）とＲＡＣＫ１の異なる変異型について染色した細胞の一連の画像である。

【図3】図３は、ＳＯＤ１（ＳＯＤ１００）及びＲＡＣＫ１の異なる変異型について染色した細胞の一連の画像である。

【図4】図４は、ＤＥ－ＲＡＣＫ１、Ｒ４９５ｘ－ＦＵＳ、及びＲＡＣＫ１について染色した細胞の一連の画像である。

【図5】図５は、ＤＥ－ＲＡＣＫ１、Ｐ５２５Ｌ－ＦＵＳ、及びＲＡＣＫ１について染色した細胞の一連の画像である。

【図6】図６Ａは、新たに合成されたタンパク質（ＳＵｎＳＥＴ）にタグを付けるためにピューロマイシンを用いる翻訳の表面センシングのためのゲル電気泳動ウェスタンブロッティングの結果を示す。図６Ｂは、ａ－チューブリンに正規化された全体的な翻訳レベルを示すグラフを示す。図６Ｃは、全体的な翻訳レベル±ＲＡＣＫ１ ｓｉＲＮＡの比を示すグラフを示す。

【図7】図７は、Ｒ４９５ｘ－ＦＵＳ、ピューロマイシン（ＰＭＹ）、及び核（ＤＡＰＩ）について染色した細胞の一連の画像である。

【図8】図８は、ｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３、ピューロマイシン（ＰＭＹ）、及び核（ＤＡＰＩ）について染色した細胞の一連の画像である。

【図9】図９は、ＲＡＣＫ１及びｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３±ｓｉＲＮＡについて染色した細胞の一連の画像である。

【図10】図１０は、ＲＡＣＫ１及びＰａｎ ＴＤＰ－４３±ｓｉＲＮＡについて染色した細胞の一連の画像である。

【図11】図１１は、ＲＡＣＫ１及びＲ４９５ｘ－ＦＵＳ±ｓｉＲＮＡについて染色した細胞の一連の画像である。

【図12】図１２は、ＲＡＣＫ１及びＰ５２５Ｌ－ＦＵＳ±ｓｉＲＮＡについて染色した細胞の一連の画像である。

【図13】図１３は、ＲＡＣＫ１及びＲ４９５ｘ－ＦＵＳ＋ｓｉＲＮＡについて染色した細胞の一連の画像である。

【図14】図１４は、ＲＡＣＫ１及びＰａｎ ＦＵＳ±ｓｉＲＮＡについて染色した細胞の一連の画像である。

【図15】図１５は、ＲＡＣＫ１、ＤＡＰＩ、４０Ｓリボソームサブユニット（Ｒｐｓ６）、及びｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３について染色した細胞の一連の画像である。

【図16】図１６は、ＲＡＣＫ１、ＤＡＰＩ、４０Ｓリボソームサブユニット（Ｒｐｓ６）、及びＲ４９５ｘ－ＦＵＳについて染色した細胞の一連の画像である。

【図17】図１７は、ＲＡＣＫ１、ＤＡＰＩ、４０Ｓリボソームサブユニット、及びＰ５２５Ｌ－ＦＵＳについて染色した細胞の一連の画像である。

【図18】図１８は、ＲＡＣＫ１、ＤＡＰＩ、６０Ｓリボソームサブユニット（ＲＰＬ１４）、及びｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３について染色した細胞の一連の画像である。

【図19】図１９は、ＲＡＣＫ１、ＤＡＰＩ、６０Ｓリボソームサブユニット（ＲＰＬ１４）、及びＲ４９５ｘ－ＦＵＳについて染色した細胞の一連の画像である。

【図20】図２０は、ＲＡＣＫ１、ＤＡＰＩ、６０Ｓリボソームサブユニット（ＲＰＬ１４）、及びＰ５２５Ｌ－ＦＵＳについて染色した細胞の一連の画像である。

【図21】図２１Ａは、ＲＡＣＫ１、４０Ｓリボソームサブユニット（Ｒｐｓ６）、及びｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３＋ＲＡＣＫ１ ｓｉＲＮＡについて染色した細胞の一連の画像である。図２１Ｂは、ＲＡＣＫ１、６０Ｓリボソームサブユニット（ＲＰＬ１４）、及びｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３＋ＲＡＣＫ１ ｓｉＲＮＡについて染色した細胞の一連の画像である。

【図22】図２２Ａは、ＲＡＣＫ１、４０Ｓリボソームサブユニット（Ｒｐｓ６）、及びＰ５２５Ｌ－ＦＵＳ＋ＲＡＣＫ１ ｓｉＲＮＡについて染色した細胞の一連の画像である。図２２Ｂは、ＲＡＣＫ１、６０Ｓリボソームサブユニット（ＲＰＬ１４）、及びＰ５２５Ｌ－ＦＵＳ＋ＲＡＣＫ１ ｓｉＲＮＡについて染色した細胞の一連の画像である。

【図23】図２３は、ＲＡＣＫ１ノックダウンによる全体的な翻訳の救済モデルである。

【図24】図２４は、ＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ予測のホットスポットスコアのプロットである。円のマーカーは、ホットスポットスコアのピークであり、ｓｉＲＮＡによって標的化される可能性のある領域に対応する。プラスマーカーは、文献からの既存の有効なｓｉＲＮＡの位置を示す（表１）。星のマーカーは、本明細書で作製及び試験したｓｉＲＮＡ（表２）に対応する。三角のマーカーは、予測の陰性対照である（表５）。

【図25】図２５は、ＲＡＣＫ１ プレｍＲＮＡ上のｓｉＲＮＡ予測のホットスポットスコア（ＨＳ）を示す一連のプロットである。ここには８つのエクソン領域が抽出されており、イントロン／エクソン境界が示されている。位置４４０６、５７５０及び１０３８２は、潜在的なスプライスブロッキングｓｉＲＮＡデザインである（表４）。

【図26】図２６は、ＲＡＣＫ１をノックダウンする際の有効性について表２のｓｉＲＮＡを試験するウェスタンブロットの画像である。サンタクルーズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、陽性対照であり、[７]と同じ配列を有する。

【図27】図２７は、ＲＡＣＫ１－ＲＮＡｉの有無にかかわらず、野生型若しくは変異型のｈＴＤＰ４３のいずれかを発現するか、又は発現しないハエを生成するために使用されるＵＡＳ－Ｇａｌ４発現系の模式図である。

【図28】図２８Ａ～２８Ｌは、様々な遺伝子型のハエの眼の代表的な写真である。ＧＭＲは、Ａ１（図２８Ａ～２８Ｄ）又はＡ６（図２８Ｅ～２８Ｈ、２８Ｋ、２８Ｌ）に示される導入遺伝子の発現を促進する。非促進対照がＡ６に示されている（図２８Ｉ、２８Ｊ）。

【図29】図２９は、変性スコアが１にとどまるハエの割合を示すグラフである。

【図30】図３０は、異なるＡＳＯで処理したＨｅＬａ細胞におけるＲＡＣＫ１の検出のためのウェスタンブロッティング結果を示す。レーンのローディング対照：チューブリン。

【図31】図３１は、１に設定し、上点線で表した、未処理（ＵＴ）細胞に対するＡＳＯ処理ＨｅＬａ細胞におけるＲＡＣＫ１タンパク質発現を示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0038】

特に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。例えば、用語「細胞」は、単一の細胞並びに複数の細胞又は細胞の集団を含む。一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質及びオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの化学及びハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである（例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２を参照されたい）。

【0039】

本明細書で使用される用語「投与」は、髄腔内、脳室内、実質内又は鼻腔内投与経路などの任意の有効な経路によって、アンチセンス分子、任意に本明細書に開示されるオリゴマー化合物若しくはアンチセンス分子を含むベクター、例えば、ｓｈＲＮＡを含む組成物などの化合物若しくは分子を対象に提供するか又は与えることを意味する。

【0040】

本明細書で使用される用語「有効量」は、ＲＡＣＫ１タンパク質、ＴＤＰ－４３凝集及び／又はＦＵＳ凝集を低減若しくは排除するため、又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）などのＴＤＰ４３－ｏｐａｔｈｙ若しくはＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患を治療するためなどの、所望の応答を生成するのに十分な、アンチセンス分子、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくは抗ＲＡＣＫ１ ｓｉＲＮＡなどの化合物又は分子の量を指す。

【0041】

本明細書で使用される用語「治療する」又は「治療」は、当技術分野で十分に理解されるように、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益又は所望の臨床結果には、限定されないが、１以上の症状若しくは状態の軽減又は改善、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の広がりの防止、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、疾患の再発の減少、並びに寛解（部分的又は全体的を問わず）、検出可能か検出不能かどうかが含まれ得る。「治療する」及び「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して長い生存期間を意味することができる。例えば、初期段階のＡＬＳ又はＦＴＬＤを有する対象は、疾患進行を防止するために、例えば、神経変性の悪化を防ぐために、本明細書に記載のオリゴマー化合物などのアンチセンス分子（複数可）で治療することができる。

【0042】

本明細書で使用される用語「希釈剤」は、投与される活性化合物の生理活性又は特性を阻害せず、対象を刺激せず、投与される化合物の生物学的活性及び特性を損なわない医薬として許容される担体を指す。希釈剤には、当業者に周知の任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤、塩、防腐剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑剤、そのような材料及びそれらの組み合わせが含まれる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９）。任意の従来の担体が活性成分と不適合である限りを除いて、医薬組成物におけるその使用が企図される。

【0043】

本明細書で使用される用語「相補性」又は「相補的」は、本明細書に開示されるオリゴマー化合物、又はその一部などのアンチセンス分子が、ＲＡＣＫ１ ＲＮＡ、例えば、ＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡ及び／又はＲＡＣＫ１ プレｍＲＮＡの標的配列にハイブリダイズし、それによってＲＡＣＫ１を「ノックダウン」する（例えば、ＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡ及び／又はプレｍＲＮＡを少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％又はそれ以上低下させる）能力を意味する。アンチセンス分子と標的ＲＮＡとの間の相補性は、完全（１００％相補的）であり得るが、いくつかのミスマッチは許容される。例えば、アンチセンス分子は、標的ＲＮＡに対して７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相補的であり得るか、又は任意の１０個のモノマーストレッチにおいて最大１、２又は３個のミスマッチを含むことができる。

【0044】

本明細書で使用される用語「逆相補体」は、その５'末端から３'末端の方向の核酸配列の相補鎖を意味する。例えば、５'から３'方向の配列がＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＣＴＧＣＣＧＧＴ（配列番号８１）である場合、その逆相補体はＡＣＣＧＧＣＡＧＡＴＴＧＴＣＴＣＴＧＧＡ（配列番号２９２）である。

【0045】

本明細書で使用する「少なくとも一部に相補的」は、例えば、インビトロアッセイで測定した場合、ＲＡＣＫ１レベルを低下させるのに十分な、ＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡ又はＲＡＣＫ１プレｍＲＮＡなどのＲＡＣＫ１ ＲＮＡに対する相補性を有する、本明細書に開示されるオリゴマー化合物などのアンチセンス分子を指す。「少なくとも一部に相補的」は、例えば、ＲＡＣＫ１ ＲＮＡの少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個の連続ヌクレオチドに相補的を含む。

【0046】

例えば、本明細書に開示されるオリゴマー化合物のうちのいずれか１つを含む、本明細書で使用される用語「アンチセンス分子」は、その少なくとも一部が核酸である化合物を含み、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む分子、ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを含む分子を含む。用語アンチセンス分子は、例えば、典型的には一本鎖であるアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに典型的には二本鎖であるｓｉＲＮＡ化合物並びにｓｈＲＮＡ分子を含む。アンチセンス分子は、ＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的である抗ＲＡＣＫ１アンチセンス分子である。

【0047】

本明細書で使用される用語「オリゴマー化合物」は、オリゴヌクレオチドを含む本明細書に開示される化合物に関し、その少なくとも一部は、ＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡ若しくはＲＡＣＫ１プレｍＲＮＡなどのＲＡＣＫ１ ＲＮＡ、又はその一部に相補的である。該オリゴマー化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドを含むことができ、１以上の修飾（すなわち非天然の）モノマーを含むことができる。「オリゴマー化合物」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ構築物を含む。該オリゴマー化合物は、ＲＡＣＫ１ ＲＮＡに相補的である部分からなることができるが、追加の１以上の追加の分子、グループ又は部分（例えば、細胞透過性部分）を含むこともできる。

【0048】

本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「ＡＳＯ」は、ＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡ又はＲＡＣＫ１プレｍＲＮＡなどのＲＡＣＫ１ ＲＮＡの少なくとも一部に相補的で、限定されないが、ミックスマー、ギャップマー、テイルマー、ヘッドマー及びブロックマー、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２'－Ｏ－置換アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、２'－Ｏ－メチルホスホロチオエート、２'－Ｏ－メトキシエチルホスホロチオエート）、ロック核酸（ＬＮＡ）などを含むヌクレオチド配列を含む核酸、例えば、一本鎖核酸である。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、センス核酸に水素結合することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに結合するＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又は化学類似体（すなわち、修飾塩基）を含むことができる。

【0049】

本明細書で使用される用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的であるガイド鎖を含むｓｉＲＮＡを指す。

【0050】

本明細書で使用される用語「ガイド鎖」は、それが結合のために標的とするＲＮＡ配列に相補的である二本鎖ｓｉＲＮＡなどのアンチセンス分子の部分又は鎖を指す。それは、天然の及び／又は修飾された塩基を含むことができる。「ガイド鎖」は、ｓｉＲＮＡを指す場合に使用することができ、「部分」はアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又は他のアンチセンス分子を指す場合に使用することができる。

【0051】

本明細書で使用される用語「ｓｈＲＮＡ構築物」は、発現時に、ＲＡＣＫ１の発現をノックダウンすることができるベクター及びｓｈＤＮＡインサートを含む構築物を指し、該ベクターは、レンチウイルス及び非ウイルスベクターなどのウイルスベクターを含み、ｓｈＤＮＡは、ＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的であるガイド鎖を含むショートヘアピンＲＮＡを生成するように発現され得る。本明細書で使用される用語「ガイド鎖」は、それが結合するために標的とするＲＮＡ配列に相補的である、発現される二本鎖ｓｈＲＮＡの鎖を指す。

【0052】

本明細書で使用される用語「ロック核酸」又は「ＬＮＡ」は、２'－Ｏ，４'－Ｃメチレン架橋の導入によってリボースがＣ３'エンド立体構造でロックされる二環式ＲＮＡ類似体を指す。望ましいＬＮＡモノマー及びそれらの合成方法は、米国特許第６，０４３，０６０号、同第６，２６８，４９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／０７４５５、ＷＯ０１／００６４１、ＷＯ９８／３９３５２、ＷＯ００／５６７４６、ＷＯ００／５６７４８及びＷＯ００／６６６０４並びに以下の論文：Ｍｏｒｉｔａら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２（１）：７３－７６，２００２；Ｈａｋａｎｓｓｏｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１（７）：９３５－９３８，２００１；Ｋｏｓｈｋｉｎら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６（２５）：８５０４－８５１２，２００１；Ｋｖａｅｒｎｏら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６（１６）：５４９８－５５０３，２００１；Ｈａｌｋａｎｓｓｏｎら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５（１７）：５１６１－５１６６，２０００；Ｋｖａｅｒｎｏら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５（１７）：５１６７－５１７６，２０００；Ｐｆｕｎｄｈｅｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８（９）：２０１７－２０３０，１９９９；及びＫｕｍａｒら Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８（１６）：２２１９－２２２２，１９９８にも開示されており、それらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0053】

用語「ミックスマー」は、天然のヌクレオチドと非天然のヌクレオチドの両方を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。しかし、ギャップマー、テイルマー、ヘッドマー及びブロックマーとは異なり、６以上の天然のヌクレオチドの連続配列はない。

【0054】

本明細書で使用される用語「ギャップマー」は、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を支持する複数のヌクレオシドを有する内部ＤＮＡベース領域（例えば、「ギャップ」）に、標的結合を促進する１以上のＲＮＡベースヌクレオシド（例えば、５'及び３'「ウイング」）が隣接するアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。ギャップヌクレオシドは、ウイングヌクレオシドとは異なる。非限定的な例において、ギャップマーは、表８に記載の２－ＭＯＥ修飾ＲＮＡ残基が隣接するＤＮＡ残基を含む。５'ウイングと３'ウイングは同じ化学修飾を有してよいが、５'ウイングと３'ウイングの間に異なる修飾が企図され、ヌクレオチド長の違いも企図される。

【0055】

本明細書で使用される用語「モルホリノオリゴヌクレオチド」は、リボース又はデオキシリボースの糖部分を置換するメチレンモルホリン環などのモルホリノモノマー、並びにＤＮＡ及びＲＮＡのアニオン性リン酸塩を置換する非イオン性ホスホロジアミデート結合を含む非天然オリゴヌクレオチドを指す。例えば、イントロンエレメントを標的とするアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡスプライシングを調節することができる（１２）。モルホリノオリゴヌクレオチドは、約２５個のモルホリノモノマーの短鎖であり得る。各モルホリノオリゴヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）の塩基対合表面の小さな（約２５塩基）領域をブロックする。用語「モルホリノモノマー」は、核酸塩基、６員モルホリン環及び非イオン性ホスホロジアミデートサブユニット間結合を含むサブユニットを指す。

【0056】

本明細書で使用される用語「細胞透過性部分」は、本明細書に開示されるオリゴマー化合物などの化合物又は化合物の細胞外空間から細胞内への移動を媒介する官能基を指す。

【0057】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その」は、内容が特に明確に指示をしない限り、複数の参照を含む。そのため、例えば、「化合物」を含有する組成物は、２種以上の化合物の混合物を含む。用語「又は」は、内容が特に明確に指示をしない限り、「及び／又は」を含む意味で一般的に使用されることにも留意すべきである。

【0058】

本願及び請求項（複数可）で使用される単語「からなる」及びその派生語は、述べられた特徴、要素、成分、グループ、整数、及び／又は工程の存在を特定するクローズエンド用語であり、また、他の述べられていない特徴、要素、成分、グループ、整数及び／又は工程の存在を除外することを意図している。

【0059】

本明細書における端点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される全ての数値及び小数を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、及び５を含む）。また、全ての数及びその小数は、用語「約」によって修飾されると推定されることも理解されたい。

【0060】

本明細書で使用される用語「約」、「実質的に」及び「およそ」は、最終結果が著しく変化しないように、修飾された用語の合理的な量の偏差を意味する。これらの程度の用語は、この偏差が修飾する単語の意味を否定しない場合、修飾された用語の少なくとも±５％又は少なくとも±１０％の偏差を含むものとして解釈されるべきである。

【0061】

特定の節に記載される定義及び実施形態は、当業者によって理解されるように、それらが適切であると本明細書に記載の他の実施形態に適用可能であることを意図する。

【0062】

本明細書で実証されるように、ＲＡＣＫ１は、変異型ＦＵＳ及びＳＯＤ１と共凝集し、変異型ＴＤＰ４３と共に、例えば、ＡＬＳにおけるこれらの変異検証済み封入体の毒性について共通の経路を構成し得る。

【0063】

また、培養細胞におけるＲＡＣＫ１のノックダウンが、おそらく脱凝集タンパク質の核内への拡散による、核局在配列を欠く変異タンパク質の部分的な核送還を伴いながら[Ｐｉｎａｒｂａｓｉら，２０１８]、ＦＵＳ若しくはＴＤＰ４３封入体の形成を低下又は阻害し得ることも本明細書で実証されている。理論に拘束されることを望まないが、ＲＡＣＫ１共凝集体へのポリリボソームの動員は、ミスフォールディングにおける毒性の機能獲得、及びＰＦＡＲを有する６０ｓリボソームサブユニットの動員によるＡＬＳ／ＦＴＬＤ関係タンパク質の増加に寄与し得る。本明細書に記載のデータは、ＲＡＣＫ１と変異型ＴＤＰ－４３又はＦＵＳとの共凝集がリボソームサブユニットの隔離によって全体的な翻訳を抑制し、ＲＡＣＫ１のｓｉＲＮＡノックダウンが全体的な翻訳及び６０ｓリボソームＰＦＡＲの可能性のある病理学的シャペロン活性を救出できることを示している。

【0064】

タンパク質凝集体に動員されるＲＡＣＫ１の神経毒性は、正常なＲＡＣＫ１活性に対する機能喪失を含む多くの要因に起因し得る。しかし、凝集したＲＡＣＫ１の毒性機能獲得は、ＡＬＳ及び他のＴＤＰ－４３タンパク質症（すなわち、ＴＤＰ－４３－ｏｐａｔｈｙ）において観察されるタンパク質翻訳欠損の原因の１つであり得る。

【0065】

また、ＲＡＣＫ１の細胞特異的インビボノックダウンが、野生型又は変異型ヒトＴＤＰ－４３のトランスジェニック過剰発現によって引き起こされる神経変性を改善することも本明細書で実証される。

【0066】

したがって、一態様において、配列番号１～１６、４９～５１及び２８９～４９９のうちのいずれか１つから選択される核酸標的配列の少なくとも一部に相補的である部分を含むオリゴマー化合物が提供される。

【0067】

該核酸標的配列の少なくとも一部に相補的であるオリゴマー化合物の部分は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり得る。一実施形態において、該該オリゴマー化合物は、長さが１４～６０ヌクレオチドである。一実施形態において、該オリゴマー化合物は、長さが１４～５０ヌクレオチドである。一実施形態において、該オリゴマー化合物は、長さが１４～４０ヌクレオチドである。一実施形態において、該オリゴマー化合物は、標的配列の少なくとも一部に相補的な部分に対応し、長さが１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、該オリゴマー化合物は、標的配列に相補的な部分の５'方向及び／又は３'方向に１以上の追加のヌクレオチドを含む。例えば、該オリゴマー化合物は、部分の上流及び下流に最大１５又は最大２０ヌクレオチドを含むことができる。一実施形態において、該オリゴマー化合物は、長さが１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドである。

【0068】

核酸標的配列は、表２、３、４若しくは８の配列又はその中の配列のうちのいずれかの一部であり得る。一実施形態において、該核酸標的配列は、表１からの核酸標的配列と同じ配列を有していない。一実施形態において、該核酸標的配列は、表５からの核酸標的配列と同じ配列を有していない。該オリゴマー化合物は、表２、３、４若しくは８のうちのいずれかにおける配列の逆相補体、若しくはその一部であるか、又それを含むことができる。

【0069】

一実施形態において、該核酸標的配列は、配列番号２～６、８、１０～１６、４９～５１、２９２～２９４及び２９６～４９９のうちのいずれか１つから選択される。

【0070】

一実施形態において、該核酸標的配列は、配列番号２～６、８、１０～１６、４９～５１、２９２～２９４及び２９６～２９８のうちのいずれか１つから選択される。

【0071】

一実施形態において、該核酸標的配列は、配列番号２、３、２９２、２９７及び２９８のうちのいずれか１つから選択される。

【0072】

一実施形態において、該部分は該核酸標的配列と相補的であり、該核酸標的配列は、配列番号２～６、８、１０～１６、４９～５１、２９２～２９４及び２９６～４９９のうちのいずれか１つから選択される配列であるか、又はそれを含む。

【0073】

一実施形態において、該部分は核酸標的配列と相補的であり、該核酸標的配列は、配列番号２～６、８、１０～１６、４９～５１、２９２～２９４及び２９６～２９８のうちのいずれか１つから選択される配列であるか、又はそれを含む。

【0074】

一実施形態において、該部分は核酸標的配列と相補的であり、該核酸標的配列は、配列番号２、３、２９２、２９７及び２９８のうちのいずれか１つであるか、又はそれを含む。

【0075】

一実施形態において、該部分は、ＧＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＡＴＣ（配列番号２）又はＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＡ（配列番号３）に相補的である。好ましい実施形態において、該部分はＧＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＡＴＣ（配列番号２）に相補的である。好ましい実施形態において、該部分はＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＡ（配列番号３）に相補的である。好ましい実施形態において、該部分は配列番号８１に相補的である。好ましい実施形態において、該部分は配列番号８６に相補的である。好ましい実施形態において、該部分は配列番号８７に相補的である。

【0076】

該オリゴマー化合物は、任意に１以上の修飾残基を含むＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はそれらのハイブリッドであり得る。標的はＲＮＡである。標的は本明細書においてＤＮＡとして表されてもよいが、当業者は、配列内のチミジン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）と置換されることを認識する。同様に、該オリゴマー化合物は本明細書においてＲＮＡとして表されてもよいが、当業者は、ＤＮＡ化合物がウラシル（Ｕ）の代わりにチミジン（Ｔ）を含むことを認識する。

【0077】

アンチセンス分子は、分子の生物学的安定性を増大させるか、又は標的ＲＮＡ若しくはＤＮＡと共に形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された、天然のヌクレオチド及び／又は様々に修飾された（非天然の）ヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る。ホスホロチオエート誘導体などの誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドが使用できる。修飾ヌクレオチドの他の例には、Ｎ３’－Ｐ５’ホスホロアミダート、２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノ核酸類似体（ＦＡＮＡ）、モルホリノモノマーを用いたもの、並びにシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）（すなわち、シクロヘキセン環で置換されたＤＮＡのフラノース部分）及びトリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）（すなわち、シクロプロパン単位が融合したヌクレオシドの中心Ｃ（３’）及びＣ（５’）の間の追加のエチレン架橋を含むヌクレオチド）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（すなわち、Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位）に見出されるものを含み得、かつ／又はロック核酸（ＬＮＡ）であり得る。アンチセンス分子は、標的鎖に対して、又はその一部に対してのみ相補的であり得る。

【0078】

アンチセンス分子は、非修飾オリゴヌクレオチドと同様に機能し得る少なくとも１つの非天然型モノマーを含むことができる。化学修飾は、例えば、ロック核酸（ＬＮＡ）に見られるものであり得るか、又は２'－フルオロ（２'－Ｆ）、２'－Ｏ－メトキシエチル（２'－ＭＯＥ）又は２'－Ｏ－メチル（２'－Ｏ－Ｍｅ）であり得、これらは、リン酸基中の非架橋酸素原子の１つが硫黄で置換されている糖部分若しくはホスホロチオエート（ＰＳ）結合が６員モルホリン環で置換されているリボース部分又はモルホリノモノマーの２’位で修飾されている。ホスホロチオエート及びホスホロアミダート結合は、上述のアンチセンス分子のうちのいずれかに組み込むことができる。他のヌクレオシド間結合には、例えば、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミダート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、及びスルホンヌクレオシド間結合が含まれる。そのような修飾又は置換された核酸は、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの特性のために天然の形態よりも好ましい場合がある。この用語はまた、２以上の化学的に別個の領域を含むキメラ核酸を含む。例えば、キメラ核酸は、有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞への取り込みの増加）を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域を含んでいてもよく、又は本開示の２以上の核酸が結合してキメラ核酸を形成してもよい。

【0079】

アンチセンス分子は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＡｇｒａｗａｌ Ｓ．＆ Ｇａｉｔ Ｍ．Ｊ．（２０１９） 核酸医薬におけるヌクレオチド類似体の歴史と開発（Ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇｓ） Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，（ｐｐ１－２１）．Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙに記載の様々な方法を用いて精製することができる。アンチセンス分子又はその核酸成分は、例えば、アンチセンス配列が高効率調節領域の制御下で生成され、その活性が、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る組換えプラスミド、ファージミド又は弱毒化ウイルスの形態で細胞に導入される発現ベクターを用いて生物学的に生成することができる。さらに、アンチセンス分子、例えば、ｓｉＲＮＡは、製造業者、例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）から購入することができる。

【0080】

別の実施形態において、該オリゴマー化合物は、修飾されていないＲＮＡ、ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡの混合物を含む。

【0081】

一実施形態において、該オリゴマー化合物は、修飾されたＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡの混合物を含む。

【0082】

さらなる実施形態において、該オリゴマー化合物は、化学修飾された１以上のヌクレオチドモノマーを含む。さらなる実施形態において、化学修飾は２’位に修飾を含む。別の実施形態において、化学修飾は、２’Ｏメチル（２’）－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’Ｏ－ＭＯＥ）、２’フルオロ（２’Ｆ）及び２’－Ｏ，４’－Ｃメチレン架橋、すなわちロック核酸モノマー（ＬＮＡＭ）から選択される。

【0083】

該オリゴマー化合物は、修飾骨格を含むことができる。一実施形態において、該オリゴマー化合物は、少なくとも１つの修飾が生じたヌクレオシド間結合を含む。一実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。一実施形態において、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホロアミダート結合である。例えば、全てのヌクレオシド間結合は、例えば、実施例４に記載のホスホロチオエート修飾されている。ホスホロチオエート結合は、ＲｐとＳｐの混合鏡像異性体であってよく、又はそれらがＲｐ若しくはＳｐのいずれかの形態で立体規則的又は実質的に立体規則的に作られてよい。

【0084】

さらなる実施形態において、該オリゴマー化合物は、複数のヌクレオチドモノマーの修飾を含む。別の実施形態において、ヌクレオチドモノマーの全てが修飾される。例えば、表８を参照すると、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、全ての塩基の間にホスホロチオエート結合を有し、中央ＤＮＡ塩基に隣接するＲＮＡ塩基は２’－ＭＯＥ修飾されている。

【0085】

本明細書に記載のように、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボでＲＡＣＫ１レベルを低下させることが見出された。

【0086】

一実施形態において、該オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0087】

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、例えば、ＤＮＡとＲＮＡの混合物であり得、１以上の修飾ヌクレオチドを含むことができる。

【0088】

さらなる実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、複数のロック核酸モノマー（ＬＮＡＭ）を含む。

【0089】

さらなる実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ロック核酸（ＬＮＡ）、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマー又はＬＮＡ／ＲＮＡミックスマーである。

【0090】

別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、複数のＲＮＡヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のＲＮＡヌクレオチドが隣接する例えば、複数のＤＮＡヌクレオチド、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のＤＮＡヌクレオチドを含むギャップマー、例えば、実施例４に記載のギャップマーである（表８）。

【0091】

一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７８～２８８のうちのいずれか１つの配列を含むか、又はその配列である。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８１～８３又は８５～２８８のうちのいずれか１つの配列を含むか、又はその配列である。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８１～８３又は８５～８７のうちのいずれか１つの配列を含むか、又はその配列である。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８１の配列を含むか、又はその配列である。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８２の配列を含むか、又はその配列である。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８３の配列を含むか、又はその配列である。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８５の配列を含むか、又はその配列である。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８６の配列を含むか、又はその配列である。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８７の配列を含むか、又はその配列である。

【0092】

一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノオリゴヌクレオチドである。

【0093】

本明細書で実証されるように、ｓｉＲＮＡ配列はＲＡＣＫ１のノックダウンに成功した。

【0094】

一実施形態において、該オリゴマー化合物は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。

【0095】

ｓｉＲＮＡは、表２、３、４、若しくは８のうちのいずれかにおける配列の逆相補体、その一部又はＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡにおいて５’若しくは３’に延びるより長い配列を含むガイド鎖を含むことができる。例えば、表２、３又は４を参照して、ガイド鎖は、括弧内に示されるヌクレオチドの逆相補体を含むことができる。ｓｉＲＮＡなどの二本鎖アンチセンス分子は、例えば、表２、３及び４の括弧内に示されるヌクレオチドなどの天然配列に対応する一本鎖オーバーハング残基、又は非天然オーバーハング残基を含むことができる。したがって、ｓｉＲＮＡは、括弧内に示される配列を含んでも、含まなくてもよいか、又はｔｔ又はＲＮＡの状況ではｕｕなどの非天然ヌクレオチドで置換することができる。

【0096】

標的は、ＲＡＣＫ１標的配列の上流又は下流に追加のヌクレオチドを含むことができる。例えば、標的配列は、列挙されたＲＡＣＫ１標的配列に対して５’側に２個のヌクレオチド、例えば、それぞれ、５’ＧＡオーバーハングを有するＴＴＴＡＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＴＣＡＴＴ（配列番号１）、５’ＡＴオーバーハングを有するＧＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＡＴＣ（配列番号２）、５’ＧＴオーバーハングを有するＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＡ（配列番号３）、５’ＴＧオーバーハングを有するＧＣＴＡＡＣＴＧＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡ（配列番号４）、５’ＧＧオーバーハングを有するＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＴ（配列番号５）、５’ＡＡオーバーハングを有するＧＧＡＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＴＧＴＴＡ（配列番号６）、５’ＡＡオーバーハングを有するＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＣＧＣＴＡＧＡＴ（配列番号７）、５’ＧＧオーバーハングを有するＣＴＡＴＣＴＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴ（配列番号８）、５’ＡＣオーバーハングを有するＣＡＧＧＧＡＴＧＡＧＡＣＣＡＡＣＴＡＴ（配列番号９）、５’ＧＣオーバーハングを有するＣＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＴＡＴ（配列番号１０）、５’ＣＡオーバーハングを有するＣＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＴＧＴＧＧＴＴ（配列番号１１）、５’ＴＡオーバーハングを有するＣＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＡＡＴＡ（配列番号１２）、５’ＣＴオーバーハングを有するＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴ（配列番号１３）、５’ＧＣオーバーハングを有するＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＡＣＣＡＡ（配列番号１４）、５’ＧＧオーバーハングを有するＧＴＡＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＣＴＡＣＴＡ（配列番号１５）、５’ＣＧオーバーハングを有するＣＧＣＡＧＴＴＣＣＣＧＧＡＣＡＴＧＡＴ（配列番号１６）５’ＡＧオーバーハングを有するＧＴＡＣＧＧＡＣＴＡＡＧＧＴＡＧＡＴＴ（配列番号４９）、５’ＴＧオーバーハングを有するＴＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＴＴＡＧＡＴＡＡ（配列番号５０）、５’ＣＣオーバーハングを有するＴＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＴＴＴＡＧＡＧ（配列番号５１）を含むことができる。オーバーハングを含むオリゴマー化合物において、オーバーハングは、括弧内の残基の逆相補体に対応してよく、又はｔｔなどの非標的残基であり得、下線のついた配列は非天然であることを示す。

【0097】

別の実施形態において、ガイド鎖は、５’ＡＴオーバーハングを有するＧＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＡＴＣ（配列番号２）、又は５’ＧＴオーバーハングを有するＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＡ（配列番号３）に相補的である。好ましい実施形態において、ガイド鎖は、５’ＡＴオーバーハングを有するＧＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＡＴＣ（配列番号２）に相補的である。好ましい実施形態において、ガイド鎖は、５’ＧＴオーバーハングを有するＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＡ（配列番号３）に相補的である。

【0098】

オーバーハングは、例えば、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ、ｄＡ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＧ及び修飾塩基からの任意の２つのヌクレオチドの組合せであり得る。

【0099】

一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列５’－３’ＧＡＵＡＡＣＵＵＣＵＵＧＣＵＵＣＡＧＵＵＣ（配列番号１８）を含むガイド鎖であるか又はそれを含む。別の実施形態において、該配列は、５’－３’ＵＵＵＡＵＣＵＣＧＡＧＡＵＣＣＡＧＡＧ（配列番号１９）である。

【0100】

一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、３’（ＡＵ）オーバーハング（すなわち３’末端にさらなるＡＵヌクレオチド）を有する配列５’～３’ＧＡＵＡＡＣＵＵＣＵＵＧＣＵＵＣＡＧＵＵＣ（配列番号１８）を含むガイド鎖であるか又はそれを含む。別の実施形態において、該配列は、３’（ＡＣ）オーバーハングを有する５’－３’ＵＵＵＡＵＣＵＣＧＡＧＡＵＣＣＡＧＡＧ（配列番号１９）である。

【0101】

別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、３’（ＡＵ）オーバーハングを有する５’－３’ＧＡＵＡＡＣＵＵＣＵＵＧＣＵＵＣＡＧＵＵＣ（配列番号１８）、及び／又は３’（ｇｕ）オーバーハングを有するＵＵＵＡＵＣＵＣＧＡＧＡＵＣＣＡＧＡＧ（配列番号１９）の配列を含むガイド鎖であるか又はそれを含む。さらなる実施形態において、該配列は、３’（ＡＵ）オーバーハングを有する５’－３’ＧＡＵＡＡＣＵＵＣＵＵＧＣＵＵＣＡＧＵＵＣ（配列番号１８）である。別の実施形態において、該配列は、３’（ｇｕ）オーバーハングを有する５’－３’ＵＵＵＡＵＣＵＣＧＡＧＡＵＣＣＡＧＡＧ（配列番号１９）である。

【0102】

一実施形態において、ガイド鎖は、３’（ＡＵ）オーバーハングを有するＧＡＵＡＡＣＵＵＣＵＵＧＣＵＵＣＡＧＵＵＣ（配列番号１８）、又は３’（ｇｕ）オーバーハングを有するＵＵＵＡＵＣＵＣＧＡＧＡＵＣＣＡＧＡＧ（配列番号１９）を含む。

【0103】

該ｓｉＲＮＡは、例えば、一本鎖又は二本鎖であり得る。該オリゴマー化合物は、例えば、３’（ａｕ）オーバーハングを有するｓｓ５’－３’ＧＡＡＣＵＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＵＵＡＵＣ（配列番号３４）、及び３’（ＡＵ）オーバーハングを有するａｓ５’－３’ＧＡＵＡＡＣＵＵＣＵＵＧＣＵＵＣＡＧＵＵＣ（配列番号１８）を有する二本鎖であり得、「ｓｓ」はセンス鎖又はパッセンジャー鎖を指し、「ａｓ」はガイド鎖となり得るアンチセンス鎖を指す。ガイド鎖は、その一部であるか、又は追加の残基を含むこともできる。

【0104】

ｓｉＲＮＡは、例えば、３’（ｇｕ）オーバーハングを有するｓｓ５’-３’ＣＵＣＵＧＧＡＵＣＵＣＧＡＧＡＵＡＡＡ（配列番号３５）；及び３’（ｇｕ）オーバーハングを有するａｓ５’－３’ＵＵＵＡＵＣＵＣＧＡＧＡＵＣＣＡＧＡＧ（配列番号１９）を有する二本鎖であり得、「ｓｓ」はセンス鎖を指し、「ａｓ」はアンチセンス鎖を指す。

【0105】

一実施形態において、ｓｉＲＮＡは約２１～２５残基及び任意に二本鎖である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、長さが２１残基である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、長さが２２残基である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、長さが２３残基である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、長さが２４残基である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、長さが２５残基である。

【0106】

一実施形態において、該オリゴマー化合物は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。ｓｉＲ－２及びｓｉＲ－３の非限定的な例を用いて、ｓｈＲＮＡは、例えば；
ｓｉＲ－２ ５’－３’：ＧＡＡＣＵＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＵＵＡＵＣ（配列番号３４）（ループ）ＧＡＵＡＡＣＵＵＣＵＵＧＣＵＵＣＡＧＵＵＣ（配列番号１８）
ｓｉＲ－３ ５’－３’：ＣＵＣＵＧＧＡＵＣＵＣＧＡＧＡＵＡＡＡ（配列番号３５）（ループ）ＵＵＵＡＵＣＵＣＧＡＧＡＵＣＣＡＧＡＧ（配列番号３５）
を含むことができる。

【0107】

一実施形態において、該アンチセンス分子は、ベクター、例えば、プラスミド、又はレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターに含まれる。

【0108】

ｓｈＲＮＡの状況において、ループ領域は、安定なループを形成し得るヌクレオチドの任意の組み合わせであり得、通常、５～１０ｎｔで構成される。ｓｈＲＮＡの末端は、化学修飾することができ、かつ／又はさらなるオーバーハングヌクレオチドを含むことができる。

【0109】

いくつかの実施形態において、標的は、本明細書で特定される配列の一部である。例えば、標的は、長さが１９～３０ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、標的配列の少なくとも一部に相補的であるオリゴマー化合物の部分は、１以上の代替ヌクレオチドを含む。例えば、該部分は、化合物の３’半分に１以上の代替ヌクレオチド、特に３’オーバーハングを含んでよい。例えば、アンチセンスｓｉＲＮＡの５’末端と中間との間の配列がｍＲＮＡを認識するのに関与し、中間残基（ｎｔ１０～１１）は、典型的には切断部位認識であることが判明した。

【0110】

該オリゴマー化合物は、輸送試薬、又はオリゴマー化合物若しくは複数のオリゴマー化合物を発現するベクター例えば、組換えプラスミド若しくはウイルスベクターに含まれる細胞透過性部分を含むことができる。

【0111】

一実施形態において、該オリゴマー化合物は、１以上の細胞透過性部分を含む。細胞内取り込みを促進する細胞透過性部分（又は細胞付着部分）の非限定的な例には、ペプチド、例えば、ペネトリン、Ｐｉｐ’ｓ（ＰＭＯ／ＰＮＡ内部移行ペプチド）、糖類、例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、抗体、例えば、Ｆａｂ断片、炭水化物、脂質、例えば、コレステロール、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が含まれる。該細胞透過性部分は、標的配列に相補的であるオリゴマー化合物の部分の５’末端、３’末端及び／又は内部ヌクレオチドに作用可能に連結又はコンジュゲートすることができる。一実施形態において、該細胞透過性部分は、５’末端及び／又は３’末端にコンジュゲートされる。二本鎖ｓｉＲＮＡの状況において、該細胞透過性部分は、好ましくは、例えば、３’末端でパッセンジャー鎖に結合される。該オリゴマー化合物は、様々な方法を用いて該細胞透過性部分に連結させることができる。例えば、該オリゴマー化合物は、例えば、Ｌａｎｇｅｌらの国際特許出願公開ＷＯ２００８／０６３１１３及びＴｒｏｙらの米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０２６０７５６号に記載されているように、該部分に共有結合させることができる。該部分は、例えば、ＴｒｏｙらのＷＯ２００８／０３３２８５及びＡｌｌｕｉｓらのＷＯ２００７／０６９０６８に記載されているように、化学的リンカーを介して該オリゴマー化合物に連結することもできる。

【0112】

別の態様は、標的配列の少なくとも一部に相補的であるオリゴマー化合物又はその一部を含むベクターである。例えば、該オリゴマー化合物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、又はγ－レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターに含まれる。該ベクターは、任意に構成的発現を提供するための組み込みベクターであり得るか、又は任意に一過性発現のための核外ベクターであり得る。

【0113】

別の態様は、オリゴマー化合物、任意に抗ＲＡＣＫ１ ｓｉＲＮＡ、抗ＲＡＣＫ１ ｓｈＲＮＡ構築物、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、抗ＲＡＣＫ１ギャップマー若しくはモルホリノオリゴヌクレオチド）及び希釈剤を含む組成物である。希釈剤は、例えば、ＲＮａｓｅを含まない水又は生理食塩水であり、任意に無菌であり得る。

【0114】

該組成物は、該アンチセンス分子を送達するためのリポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、又はナノソームなどの脂質粒子を含むことができる。

【0115】

上述のように、該アンチセンス分子は、ベクター中に含めることができる。ベクターは、例えば、プラスミドベクター、細菌ベクター又はレンチウイルス粒子若しくはＡＡＶなどのウイルスベクターであり得る。該組成物は、例えば、ＲＡＣＫ１を標的とするための複数のオリゴマー化合物及び／又は他のアンチセンス分子を含むことができる。

【0116】

本明細書に記載の組成物は、有効量の活性物質が医薬として許容されるビヒクルとの混合物中で組み合わされるように、任意にワクチンとして対象に投与することができる医薬として許容される組成物の調製のためのそれ自体公知の方法によって調製することができる。

【0117】

該医薬組成物は、限定されないが、凍結乾燥粉末又は水性若しくは非水性の無菌注入用溶液又は懸濁液を含み、これらは、組成物を意図されたレシピエントの組織又は血液と実質的に適合させる抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び溶質をさらに含有し得る。このような組成物中に存在し得る他の成分には、例えば、水、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎなど）、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油が含まれる。即時注入溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、錠剤、又は濃縮された溶液若しくは懸濁液から調製され得る。該組成物は、例えば、限定されないが、対象への投与前に滅菌水又は生理食塩水で再構成される凍結乾燥粉末として供給され得る。

【0118】

該組成物は、医薬として許容される塩の形態であってよく、これには、限定されないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの遊離アミノ基で形成されたもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール（２－ｅｔｈｙｌａｒｎｉｎｏ）などに由来するものなどの遊離カルボキシル基で形成されるものが含まれる。

【0119】

本明細書に記載の組成物、オリゴマー化合物及びベクターは、例えば、髄腔内、脳室内、頭蓋内、脊髄内、眼窩内、眼、大槽内、実質内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル又は経口投与用に製剤化することができる。好ましい実施形態において、組成物、オリゴマー化合物及びベクターは、髄腔内投与用に製剤化される。

【0120】

また、別の態様において提供されるのは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から任意に選択されるＴＤＰ４３－ｏｐａｔｈｙ又はＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象のニューロン及び／又はアストロサイト細胞などの中枢神経系の細胞中のＲＡＣＫ１をノックダウンすることを含む方法である。

【0121】

「ノックダウン」は、ＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡ及び／又はプレｍＲＮＡを標的とする、本明細書に記載のオリゴマー化合物などのアンチセンス分子を用いて達成することができる。

【0122】

また別の態様において提供されるのは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から任意に選択されるＴＤＰ４３－ｏｐａｔｈｙ又はＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に１以上のアンチセンス分子、例えば、本明細書に開示される１以上のオリゴマー化合物を投与することを含む方法である。

【0123】

また、別の態様において提供されるのは、ＴＤＰ－４３及び／又はＦＵＳ凝集を含む疾患細胞などの細胞におけるＴＤＰ－４３及び／若しくはＦＵＳ凝集を低減又は阻害する方法であって、細胞内のＲＡＣＫ１レベルを低下させるのに十分な量及び十分な時間、ＲＡＣＫ１を標的とする１以上のアンチセンス分子を細胞に投与するか、又は細胞内に導入することを含む方法である。一実施形態において、該量及び／又は時間は、ＴＤＰ－４３凝集を低下させ、かつ／又は核内ＴＤＰ－４３を部分的に回復させるのに十分である。一実施形態において、該量及び／又は時間は、ＦＵＳ凝集を低下させ、かつ／又は核内ＦＵＳを部分的に回復させるのに十分である。

【0124】

アンチセンス分子、例えば、本開示のオリゴマー化合物は、ネイキッドアンチセンス分子として単独で投与され得る。本明細書で使用する「ネイキッド」は、アンチセンス分子が送達ビヒクル（例えば、ウイルスベクター）又は送達物質（例えば、リポソーム）、例えば、ウイルスベクター、輸送試薬を用いて投与されないことを意味する。

【0125】

一実施形態において、該アンチセンス分子（複数可）は、輸送試薬と共に、組換えプラスミドとして、又はアンチセンス分子（複数可）を発現するウイルスベクターとして細胞に投与及び／又は細胞内に導入される。さらなる実施形態において、該アンチセンス分子（複数可）は、エレクトロポレーションを介して細胞内に導入される。

【0126】

別の実施形態において、該アンチセンス分子（複数可）は、１以上の細胞透過性部分を含む。このような文脈において、該アンチセンス分子は、単独で、すなわちネイキッドで、例えば、髄腔内に注入することができ、アンチセンス分子の他の要素は、例えば、細胞内への送達を容易にする化学修飾（複数可）に依存する。別の実施形態において、１以上のアンチセンス分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ構築物である。別の実施形態において、該アンチセンス分子（複数可）は、前述のオリゴマー化合物のうちの１以上である。

【0127】

他の実施形態において、１以上のアンチセンス分子はさらに、表１に列挙される核酸標的配列を標的とする。

【0128】

例えば、１以上のアンチセンス分子は、例えば、配列番号８１、８６又は８７のうちのいずれか１つを含むか又はそれらからなる本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子である。

【0129】

例えば、１以上のアンチセンス分子は、例えば、３’ｔｔオーバーハングを有するセンス５’－ＣＣＵＵＵＡＣＡＣＧＣＵＡＧＡＵＧＧＵ（配列番号５０１）及びＣＣＴＴＴＡＣＡＣＧＣＴＡＧＡＴＧＧＴ（配列番号７５）を標的とする３’－ｔｇを有するアンチセンス５’－ＡＣＣＡＵＣＵＡＧＣＧＵＧＵＡＭＧＧ（配列番号５０２）を含むｓｉＲＮＡ分子であり得る。

【0130】

別の実施形態において、１以上のアンチセンス分子は、前述の組成物を介して導入される。

【0131】

一実施形態において、細胞は罹患細胞である。一実施形態において、細胞は、ニューロン又はアストロサイトなどの中枢神経系の細胞である。一実施形態において、細胞は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）タンパク質症などのＴＤＰ４３－ｏｐａｔｈｙ若しくはＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患、又は疾患タンパク質がＲＡＣＫ１と相互作用するタンパク質フォールディング疾患を有する対象に存在する。例えば、ＴＤＰ４３－ｏｐａｔｈｙは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉性認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）である。別の実施形態において、ＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患は、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）又は好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）である。

【0132】

別の実施形態において、１以上のアンチセンス分子は、前述のオリゴマー化合物であり、かつ／又は前述の組成物に含まれる。一実施形態において、該アンチセンス分子及び／又は組成物は、輸送試薬と共に、又はアンチセンス分子を発現する組換えプラスミド若しくはウイルスベクターとして細胞内に投与又は導入される。輸送試薬は、リポソームなどの脂質粒子、ナノ粒子、又はナノソームであり得る。一実施形態において、輸送試薬はリポソームである。

【0133】

別の実施形態において、該アンチセンス分子及び／又は組成物は、鼻腔内、粘膜、経口、舌下、経皮、局所、吸入、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃による、皮膚パッチ、点眼剤若しくはマウスウォッシュの形態又は血管内投与を含む適切な非経口又は経腸投与経路；特に髄腔内、脳室内、実質内又は脳室内投与；例えば、カテーテル又は例えば、出口カテーテルを介して脳又は脊髄内の室に接続される移植リザーバを使用する他の配置装置で投与される。

【0134】

他の実施形態において、該医薬組成物は、脳又はＣＮＳの他の部分に直接投与される。例えば、そのような方法には、埋め込み型カテーテル及びポンプの使用が含まれ、これはカテーテルを通して注入部位に予め決定された用量を排出するのに役立つ。当業者はさらに、脳内の所望の投与部位又は注入部位に隣接してカテーテルを位置付けるために、カテーテルの視覚化を可能にする外科的技術によってカテーテルが移植され得ることを認識する。そのような技術は、参照により本明細書に組み込まれるＥｌｓｂｅｒｒｙらの米国特許第５，８１４，０１４号の「脳注入による神経変性障害を治療する技術（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｂｙ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）」に記載されている。また、米国特許出願２００６０１２９１２６（Ｋａｐｌｉｔｔ及びＤｕｒｉｎｇ 「患者の脳に物質を注入するための注入装置及び方法（Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｆｕｓｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ Ａ ｐａｔｉｅｎｔ）」）に記載されているものなどの方法も企図される。脳及びＣＮＳの他の部分に薬物を送達するための装置が市販されている（例えば、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ（登録商標） ＥＬ注入システム；Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）。

【0135】

別の実施形態において、該医薬組成物は、血液脳関門を横切る受容体媒介輸送を可能にするために、投与される化合物を改変するなどの方法を用いて脳に投与される。

【0136】

他の実施形態は、アンチセンス分子と、血液脳関門を横切る輸送を促進することが知られている生物活性のある分子との同時投与を企図する。

【0137】

特定の実施形態において、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７０１２０６１号 「血液脳関門の透過性を増加させる方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）」に記載されているような血液脳関門の透過性を一過的に増加させることを対象とする方法などの、血液脳関門を横切って本明細書に記載のアンチセンス分子を投与する方法も企図される。

【0138】

投与経路が経口である場合、該医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末、溶液又はエリキシル剤の形態であり得る。錠剤形態で投与する場合、該医薬組成物は、ゼラチン又はアジュバントなどの固体担体をさらに含有し得る。錠剤、カプセル剤、及び粉末は、約５～９５％のアンチセンス分子、及び好ましくは約２５～９０％のアンチセンス分子を含有する。液体形態で投与する場合、水、石油、落花生油、鉱油、大豆油、ゴマ油などの動植物起源の油、又は合成油などの液体担体を添加してもよい。医薬組成物の液体形態は、生理食塩水、デキストロース又は他の糖類溶液又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールをさらに含有し得る。液体形態で投与する場合、該医薬組成物は、約０．５～９０重量％のアンチセンス分子又は約１～５０％のアンチセンス分子を含有する。

【0139】

投与が、非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃による、皮膚パッチ、又は点眼剤若しくはマウスウォッシュ形態の投与である場合、アンチセンス分子は、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形態であり得、アンチセンス分子（複数可）に加えて、塩化ナトリウム注入剤、リンゲル注入剤、デキストロース注入剤、デキストロースと塩化ナトリウム注入剤、乳酸リンゲル注入剤などの等張ビヒクル、又は当技術分野で知られている他のビヒクルを含有し得る。該医薬組成物はまた、安定剤、防腐剤、緩衝剤、抗酸化剤又は当業者に公知の他の添加剤も含有し得る。

【0140】

該医薬組成物中のアンチセンス分子の量は、治療されている病態の性質及び重症度、並びに対象が受けた、又は受けている前の治療及び同時治療の性質に依存する。本開示の方法を実施するために使用される様々な医薬組成物は、１日あたり体重ｋｇあたり約１マイクログラム～約５０ｍｇのアンチセンス分子を含み得ることが企図される。本明細書に開示される医薬組成物による治療期間は、疾患、疾患の重症度及び各個々の対象の病態及び潜在的な特異体質の応答に応じて変化する。

【0141】

別の実施形態において、ＴＤＰ－４３－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）若しくは前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）である。別の実施形態において、ＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患は、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）又は好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）である。

【0142】

別の実施形態において、対象はヒトである。

【0143】

別の態様は、それを必要とする対象において筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）若しくはハンチントン病（ＨＤ）を治療するための、又は疾患細胞などの細胞においてＴＤＰ－４３及び／若しくはＦＵＳを低下及び／又は脱凝集させるための１以上のアンチセンス分子、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（複数可）若しくはｓｉＲＮＡ分子（複数可）などの前述のオリゴマー化合物の使用、及び／又は方法である。

【0144】

別の態様は、任意に、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、神経細胞性中間径フィラメント封入体病（ＮＩＦＩＤ）、好塩基性封入体病（ＢＩＢＤ）又は大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から選択されるＴＤＰ４３－ｏｐａｔｈｙ又はＦＵＳ－ｏｐａｔｈｙ神経変性疾患の治療に使用するための１以上のアンチセンス分子、例えば、本明細書に開示されるオリゴマー化合物である。

【0145】

一実施形態において、医薬の製造における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴマー化合物、ｓｉＲＮＡ分子（複数可）及び／又は組成物を含む上述の抗ＲＡＣＫ１アンチセンス分子の使用である。

【0146】

さらに、特定の節に記載される定義及び実施形態は、当業者によって理解されるように、それらが適切である本明細書に記載の他の実施形態に適用可能であることが意図される。例えば、以下の節において、本開示の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義された各態様は、明確に反対のことが示されない限り、他の任意の態様又は複数の態様と組み合わせてもよい。特に、好ましい又は有利であると示される任意の特徴は、好ましい又は有利であると示される任意の他の特徴又は複数の特徴と組み合わせてよい。

【0147】

上記開示は、一般に、本出願について説明する。より完全な理解は、以下の具体例を参照することによって得ることができる。これらの実施例は、例示のみを目的として記載されており、適用の範囲を限定することを意図するものではない。形式の変更及び同等物の置換は、状況が示唆又は好都合になる可能性があるので考慮される。特異的用語が本明細書で使用されているが、そのような用語は説明的な意味で意図されており、限定のためではない。

【0148】

以下の非限定的な実施例は、本開示の例示である。

【0149】

実施例
培養細胞におけるＲＡＣＫ１のノックダウンは、ＦＵＳ及びＴＤＰ４３変異型の凝集を減少させるか又は阻害することができ、これは、核局在化配列を欠く変異タンパク質の部分的な核送還を伴う。

【0150】

ＲＡＣＫ１とＴＤＰ４３又はＦＵＳとの共凝集がリボソームサブユニットの隔離による全体的な翻訳を抑制し、ＲＡＣＫ１のｓｉＲＮＡノックダウンが全体的な翻訳を救済し、ＴＤＰ－４３媒介性神経変性を防止できることを示すデータが本明細書にある。

【0151】

実施例１
ヒト胚性腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞株をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）－１（２ｍＭ）及び抗生物質（５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）を補充したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、５％ＣＯ_２、３７℃で維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造業者の指示に従って、リポフェクタミンＬＴＸ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＨＡタグ付きｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３、Ｒ４９５ｘ－ＦＵＳ、又はＰ５２５Ｌ－ＦＵＳ ｃＤＮＡプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に細胞を分析した。

【0152】

ＲＡＣＫ１ノックダウンは、製造業者の指示に従ってヒトＲＡＣＫ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－３６３５４）を特異的に標的とする３つの１９～２５ヌクレオチドｓｉＲＮＡプールをリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて導入し、７２時間インキュベートし、続いて上記のＨＡタグ付きｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３、Ｒ４９５－ＦＵＳ、又はＰ５２５Ｌ－ＦＵＳのｃＤＮＡプラスミドをトランスフェクションすることによって達成した。

【0153】

翻訳の表面センシング（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）（ＳＵｎＳＥＴ）を、全体的な翻訳を監視するために行った。ｃＤＮＡトランスフェクションの４８時間後に、細胞を５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と馴化培地中で、３７℃で１０分間インキュベートし、その後直ちに免疫細胞化学的又は生化学的手順を行った。

【0154】

ＨＡタグ付きｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３、Ｒ４９５ｘ－ＦＵＳ、Ｐ５２５Ｌ－ＦＵＳ、ＳＯＤ１変異型、ＲＡＣＫ１、及び全体的なタンパク質翻訳の発現を視覚化するために免疫細胞化学（ＩＣＣ）を行った。細胞をリン酸生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で、室温（ＲＴ）で１５分間固定し、続いて２０ｍＭグリシンで一定の揺動によりＲＴで１０分間洗浄した。次いで、細胞を、ＰＢＳ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０％正常ヤギ血清、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を含むブロッキング緩衝液とＲＴで３０分間インキュベートした。以下の一次抗体：ウサギポリクローナル抗ＨＡ（Ａｂｃａｍ，ａｂ９１１０，１：１０００）、ニワトリポリクローナル抗ＨＡ（Ａｂｃａｍ，ａｂ９１１１，１：８，０００）、マウスモノクローナル抗ＲＡＣＫ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６１０１７８，１：５００）、及びマウスモノクローナル抗ピューロマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，クローン １２Ｄ１０，１：１０００）とＲＴで１時間、又は４℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００で一定の揺動により１０分間、３回洗浄し、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ヤギ抗ウサギ、マウス、又はニワトリの二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：１０００）と暗所で、ＲＴで３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００で１０分間、３回洗浄し、５％ＰＢＳに浸漬し、ＤＡＰＩを有するＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉ－ｆａｄｉｎｇ Ｍｏｕｎｔ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐ３６９３１）でマウントした。細胞を共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８ ＭＰ）により分析した。

【0155】

全体的な翻訳レベルを定量するために、上記のＳＵｎＳＥＴ後に、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、２％ＳＤＳに溶解し、続いて３０％パワーで１５秒間超音波処理して、総タンパク質を抽出した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定した。各トランスフェクションから１０μｇのタンパク質を、４～１２％ ＮｕＰａｇｅ ＳＤＳ ＰＡＧＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分離し、ＰＶＤＦ膜上に移し、５％スキムミルクと０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で、ＲＴで１時間ブロッキングした。以下の一次抗体：ウサギ抗ＨＡ（Ａｂｃａｍ，ａｂ９１１０，１：１０００）、マウス抗ＲＡＣＫ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６１０１７８，１：２０００）、マウス抗ピューロマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，クローン１２Ｄ１０，１：１０，０００）、マウス抗ａチューブリン（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ，６６０３１－１－Ｉｇ，１：２０，０００）と４℃で一晩インキュベートした。膜を、一定の揺動によりＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）で１０分間、ＲＴで３回洗浄し、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗マウス又は抗ウサギ二次抗体（ＧＥ、１：５０００）とＲＴで３０分間インキュベートした。次いで、膜をＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発色した。

【0156】

結果
本明細書に記載の方法を用いて、ｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３の細胞質凝集体がＲＡＣＫ１凝集及び共凝集を誘導し（図１）、ｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３凝集体がトランスフェクト細胞における全体的な翻訳を抑制することが実証される（図８）。さらに、変異型ＳＯＤ１の細胞質凝集体がＲＡＣＫ１凝集及び共凝集を誘導することが実証される（図３）。

【0157】

ｄＮＬＳ ＦＵＳ、Ｒ４９５ｘ－ＦＵＳとＰ５２５Ｌ－ＦＵＳの細胞質凝集体が、ＲＡＣＫ１凝集及び共凝集を誘導する（図２）ことが実証され、ｄＮＬＳ－ＦＵＳでトランスフェクトされた個々の細胞が全体的な翻訳抑制を実証する（図７）。リボソーム結合欠損変異型（ＤＥ－ＲＡＣＫ１）が変異ＦＵＳ、Ｒ４９５ｘ－ＦＵＳとＲＡＣＫ１の共凝集を破壊し（図４）、Ｐ５２５Ｌ－ＦＵＳとＲＡＣＫ１の共凝集を部分的に破壊することも実証される（図５）。さらに、変異ＦＵＳが全体的な翻訳を抑制し、これはＲＡＣＫ１ノックダウンによって救済することができることが実証される（図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃ）。

【0158】

ＲＡＣＫ１を標的とするｓｉＲＮＡ（ＲＡＣＫ１ ｓｉＲＮＡ）は、ＲＡＣＫ１をノックダウンし、細胞質におけるｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３凝集を減弱させ、核発現を部分的に回復させる（図９）が、空ベクターをトランスフェクトした細胞における内因性核内ＴＤＰ４３発現には影響しない（図１０）。

【0159】

ＲＡＣＫ１ ｓｉＲＮＡは、細胞質における変異ＦＵＳ、Ｒ４９５ｘ－ＦＵＳ（図１１）及びＰ５２５Ｌ－ＦＵＳ（図１２）の凝集を減弱させ、変異ＦＵＳ、Ｒ４９５ｘ－ＦＵＳの核内発現を部分的に回復させる（図１３）。ＲＡＣＫ１ ｓｉＲＮＡは、空ベクターをトランスフェクトした細胞における内因性核内ＦＵＳ発現に影響を及ぼさない（図１４）。

【0160】

ｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３、ＲＡＣＫ１と４０Ｓ（マーカーとしてのリボソーム小サブユニット、Ｒｐｓ６）は共凝集し（図１５）、ｄＮＬＳ Ｒ４９５ｘ－ＦＵＳ、ＲＡＣＫ１と４０Ｓは共凝集し（図１６）、ｄＮＬＳ Ｐ５２５Ｌ－ＦＵＳ、ＲＡＣＫ１と４０Ｓは共凝集する（図１７）。さらに、ｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３、ＲＡＣＫ１と６０Ｓ（マーカーとしてのリボソーム大サブユニット、ＲＰＬ１４）は共凝集し（図１８）、ｄＮＬＳ Ｒ４９５ｘ－ＦＵＳ、ＲＡＣＫ１と６０Ｓは共凝集し（図１９）、ｄＮＬＳ、Ｐ５２５Ｌ－ＦＵＳ、ＲＡＣＫ１と６０Ｓは共凝集する（図２０）。

【0161】

ＲＡＣＫ１ノックダウン時に、「救済された」核ｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３（図２１Ａ及び２１Ｂ）又はｄＮＬＳ ＦＵＳ、Ｐ２５Ｌ－ＦＵＳ（図２２Ａ及び２２Ｂ）は、いずれのリボソームサブユニットとも会合しない。ｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３（図２１Ａ及び２１Ｂ）又はｄＮＬＳ ＦＵＳ、Ｐ５２５Ｌ－ＦＵＳ（図２２Ａ及び２２Ｂ）が細胞質内に残存する場合、典型的な大きな凝集体とは対照的に、より拡散したパターンを示すことが多く、リボソームと相互作用したままである。

【0162】

ｄＮＬＳ ＦＵＳ又はＴＤＰ－４３とＲＡＣＫ１共凝集体がポリリボソーム４０Ｓ及び６０Ｓサブユニットを補足し、全体的な翻訳抑制をもたらす（図１５～２０）。ＲＡＣＫ１ノックダウンは、ｄＮＬＳ ＦＵＳ又はＴＤＰ－４３凝集体を細胞質内に分散させるか、又は細胞の一部でそれらの核発現を回復させ、その結果、凝集体からポリリボソームを放出し、全体的な翻訳を救済する（図２１～２３）。ＳＵｎＳＥＴ ＩＣＣは、ｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３凝集体とは異なり、フィラメント状／散在性のｄＮＬＳ ＴＤＰ－４３発現細胞が正常な全体的な翻訳を示すことを示す（図８）。このデータは、ＲＡＣＫ１をノックダウンすることが、内因性核内ＴＤＰ－４３に影響を与えることなく病理学的ＴＤＰ－４３／ＦＵＳ凝集体及び翻訳機構の機能を正常化する大きな可能性を提示し、ＲＡＣＫ１をＡＬＳ及びＦＴＬＤにとって非常に魅力的な治療標的にすることを示唆する。

【0163】

実施例２
以下の方法を用いてＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡｓを設計した。

【0164】

工程１．ｓｉＲＮＡメタ予測結果を５つのサーバー（下に列挙した）から収集した。候補ｓｉＲＮＡの開始位置について、５つのサーバーについてサーバベースの予測スコアを記録する。各サーバーのスコア定義は異なり、次のように定義する。
Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒのＢＬＯＣＫ－Ｉｔ（商標）ＲＮＡｉデザイナーツール：半分の星の間隔で０から５個の星（０～５）の予測品質を与える（リンク：ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／ｓｅｔＯｐｔｉｏｎ．ｄｏ？ｄｅｓｉｇｎＯｐｔｉｏｎ＝ｓｉｒｎａ）。スコアを、０．１間隔で最大スコア１に正規化した。
ｓｉＤｉｒｅｃｔのＲＮＡｉ設計ツール：このサーバーは、配列内の各開始位置に対して１又は０のスコアが与えられるはい／いいえのバイナリ予測を与える。（リンク：ｈｔｔｐ：／／ｓｉｄｉｒｅｃｔ２．ｒｎａｉ．ｊｐ／ｄｅｓｉｇｎ．ｃｇｉ）。
ロチェスター大学医療センターのＭａｔｈｅｗｓ研究室のＯｌｉｇｏＷａｌｋ ｓｉＲＮＡデザインツール：このサーバーは、効率的なｓｉＲＮＡであるために、所与の配列に０～１の連続確率を与える（リンク：ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｓｅｒｖｅｒ＿ｅｘｅ／ｏｌｉｇｏｗａｌｋ／ｏｌｉｇｏｗａｌｋ＿ｆｏｒｍ．ｃｇｉ）。この確率は、スコアに直接変換される。
ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｓｉＲＮＡウィザードデザインツール：このサーバーは、予測が行われていない場合、予測を有効なｓｉＲＮＡ、中程度のｓｉＲＮＡ、又は効果のないｓｉＲＮＡのうちのいずれかに分類する（リンク：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｒｎａｗｉｚａｒｄ／ｄｅｓｉｇｎ＿ａｄｖａｎｃｅｄ.ｐｈｐ）。これらのカテゴリーは、それぞれ１、０．５、又は０のスコアに変換される。
ＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔのｓｉＲＮＡターゲットファインダー：このサーバーは、各予測に対して正規化されていないスコアを与える（リンク：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ／ｓｉｒｎａ－ｔａｒｇｅｔ－ｆｉｎｄｅｒ）。スコア値は、その後、最大予測スコアで割ることによって１に正規化した。

【0165】

工程２．正規化後、５つのサーバーからのスコアを合計し、合計Ｓ（ｘ）を得た。Ｓ（ｘ）は、各塩基対にスコアが割り当てられているか、ゼロである可能性があるため、サイト間で非常に変動する、すなわちバラバラである。Ｓ（ｘ）のバラバラな分布を平滑化するために、ｓｉｇｍａ＝８ｂｐでＧａｕｓｓｉａｎフィルタを適用すると、平滑化されたホットスポットスコアＨＳ（ｘ）が得られる（図２４はスプライシング後のＲＡＣＫ１エクソンｍＲＮＡのＨＳ（ｘ）を示し、図２５はスプライシング前のＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡの８つのイントロン領域のＨＳ（ｘ）を示す）。

【0166】

工程３．ＨＳ（ｘ）のピークは、効果的なｓｉＲＮＡ予測を与えると予測されるＲＮＡ配列のゾーンを示す。

【0167】

既知のｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを表１に提供し、それらの開始位置を図２４にプラス記号としてラベルする。Ｓａｎｔａ ＣｒｕｚのｓｉＲＮＡは、２４６、６３１及び８９２から始まる位置から始まるｍＲＮＡに結合する３つの配列の混合物である。下段の括弧内に示される配列「（ａａ）」は、標的配列ではないが、アンチセンス分子がｓｉＲＮＡである場合に組み込むことができるオーバーハング配列である。

【0168】

【表1】

【0169】

ＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡに対する合成ｓｉＲＮＡを表２に提供する。それらに対応するピークは、図２４において星のマーカーとしてラベル付けされている。

【表2】

【表3】

【0170】

ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ：コード領域（配列１０８～１０５９）内で、図２４中の他の重要なピークは、位置８８７、９０９、４７４、２１２、６４６、６１８、７４８、７７９、６８５、２４２、５８４、２９５、５０８、９８８、４０５、１６０及び１７８を含む。それらの対応する標的化配列を表３に列挙する。配列は、高いＨＳ（ｘ）から低いＨＳ（ｘ）の順に列挙されている。

【表4】

【表5】

【0171】

プレｍＲＮＡ（スプライスブロッキングｓｉＲＮＡ）を標的とするｓｉＲＮＡ：スプライスブロッキングｓｉＲＮＡは、ＲＡＣＫ１プレｍＲＮＡのイントロンとエクストロン領域の境界に結合するように設計されている。ホットスポットスコアＨＳ（ｘ）をｍＲＮＡと同じ方法で構築する。エクストロン－イントロン境界のホットスポットスコアを抽出し、図２５に示す。提案する標的配列を表４に示す。配列は、タンパク質翻訳の５’から３’まで、又はＮ末端からＣ末端まで列挙されている。

【0172】

【表6】

【表7】

【0173】

陰性対照ｓｉＲＮＡ：予測方法の有効性を試験するために、低いＨＳ（ｘ）スコア領域を陰性対照として用いた。図２４における各ゼロスコア領域の中央を、図２４のより広いゼロスコア領域からより狭いゼロスコア領域の順に表５に列挙する。

【表8】

【表9】

【0174】

結果
ｓｉＲ－２及びｓｉＲ－３ ｓｉＲＮＡ配列はＲＡＣＫ１のノックダウンに成功した（図２６）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの前日に、１ウェルあたり２５０，０００細胞の密度で６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に播種した。１０μＭストックの陰性対照又はＲＡＣＫ１ ｓｉＲＮＡを、製造業者の指示に従ってリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞に導入し、１ウェルあたり２５ｐｍｏｌ（又は１０，０００細胞あたり１ｐｍｏｌ）の最終濃度を達成した。トランスフェクション後７２時間の時点で、細胞を２％ＳＤＳで溶解し、続いて３０％パワーで１５秒間超音波処理して、総タンパク質を抽出した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定した。各試料から１０μｇのタンパク質を４～１２％のＮｕＰＡＧＥ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で分離し、ＰＶＤＦ膜上に移し、上記のようにＲＡＣＫ１及びローディング対照α－チューブリンについてウェスタンブロットした。ウェスタンブロットバンド強度を、ＩｍａｇｅＪを用いて定量化した。ＲＡＣＫ１強度を、各レーンにおける対応するαチューブリン強度に正規化した。次いで、各トランスフェクションの正規化したＲＡＣＫ１強度を、トランスフェクトしていない（ＵＴ）細胞と比較した。

【0175】

実施例３：ＲＡＣＫ１のノックダウンは、インビボでのｈＴＤＰ－４３誘導性神経変性を防止する
実施例１に示すように、培養細胞内でのＲＡＣＫ１ノックダウンは、凝集を低下させること；核の局在化を回復すること；及びＴＤＰ－４３誘導性タンパク質合成抑制を緩和することを含む多くの方法でｈＴＤＰ－４３発現によって引き起こされる表現型を改善する。これらの知見を拡張するために、ＲＡＣＫ１ノックダウンによるｈＴＤＰ４３誘導毒性の低下が、ニューロンにおいてもインビボで生じ、生体ネットワーク内で機能することが本明細書でさらに実証された。

【0176】

モジュール標的発現を可能にするキイロショウジョウバエ発現系を用いた。ＵＡＳ－Ｇａｌ４発現系（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，２０１２；図２７Ａ及び２７Ｂで説明）を用いて、目的の対立遺伝子の発現をＧＭＲプロモーターによって促進し、ひいてはニューロン変性の読み出し情報に広く使用される細胞集団の網膜ニューロンに大幅に発現を制限した。ヒトＴＤＰ４３対立遺伝子の野生型（ＷＴ）及びＡＬＳ関連点変異（Ｑ３３１Ｋ）（Ｅｌｄｅｎら ２０１０）を使用した。ＲＡＣＫ１－ＲＮＡｉの有無にかかわらず、網膜ニューロン内でｈＴＤＰ４３のＷＴ又はＱ３３１Ｋのいずれかを発現するハエを作製した（図２７Ｂ）。

【0177】

図２７Ａを参照すると、一般に、ハエの１系統は、タンパク質Ｇａｌ４の発現を促進する選択した細胞集団に特異的なプロモーターからなる導入遺伝子を保有する。別の安定なハエの系統は、タンパク質コード又はＲＮＡｉであり得る目的の配列の発現を促進するために、上流活性化配列（ＵＡＳ）を有する導入遺伝子を保有する。ＵＡＳが活性ではないと、これらのハエは導入遺伝子を発現しない。しかし、これらの２系統のハエを交配し、各導入遺伝子の１つのコピーを有する子孫を生成すると、Ｆ１ハエは目的の細胞内でのみＧａｌ４タンパク質を生成し、次いでＵＡＳに結合して活性化し、目的の遺伝子／標的の生成をオンにする（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，２０１２）。図２７Ｂを参照して、網膜ニューロンでＧａｌ４を発現するＧＭＲ－Ｇａｌ４ドライバー系統（Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ（ＢＤＳＣ）系統＃９１４６から入手）を使用し、５つのＵＡＳ系統：
１）ＵＡＳ－ｈＴＤＰ４３^ＷＴ（Ｅｌｄｅｎら，２０１０；ＢＤＳＣ ＃７９５８７より入手）
２）ＵＡＳ－ｈＴＤＰ４３^{Ｑ３３１Ｋ}（Ｅｌｄｅｎら，２０１０；ＢＤＳＣ ＃７９５９０より入手）
３）ＵＡＳ－ＲＡＣＫ１－ＲＮＡｉ（Ｐｅｒｋｉｎｓら，２０１５；ＢＤＳＣ ＃６０３９９より入手）
４）同じ染色体上で３と組換えた１
５）同じ染色体上で３と組換えた２
のうちの１つと交配させた。

【0178】

これらの交配により、ＲＡＣＫ１－ＲＮＡｉの有無にかかわらず、網膜ニューロンにおいて野生型又は変異型ｈＴＤＰ４３のいずれかを発現するハエを生成する。ＲＮＡｉを調製するために用いられるショートヘアピンＲＮＡは、ヘアピンＩＤ＃ ＳＨ０４７－Ｄ１２を有し；フォワードオリゴはＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡ（配列番号７６）であり、リバースオリゴはＴＴＣＣＡＣＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＴＧ（配列番号７７）である。親系統は各導入遺伝子についてヘテロ接合性であり、マーカーを有するバランサー染色体も有するので、ドライバーのみ又は非促進ＵＡＳ導入遺伝子のみを保有する実験ハエの同胞も生成される。これらのハエは対照として使用する。

【0179】

各遺伝子型のハエのコホートを成体期の最初の６日間（Ａ１～Ａ６）監視し、網膜ニューロン変性について毎日スコア化した。様々な遺伝子型の対照ハエは、正常な眼形態のベースラインを提供する。代表的な写真を図２８Ａ～２８Ｌに提供し、統計解析と共に詳細な数値を図２９並びに以下の表６及び表７に示す。軽度の変性を示す眼では、単眼は腹側縁（矢印）から欠損する場合が多く、この縁が明らかに無傷である変性のない目とは対照的である。さらに、死にかけている単眼の暗い点が観察できる。

【0180】

図２８Ａ、２８Ｅ、２８Ｉ（左列）に示すように、ｈＴＤＰ４３^ＷＴはＡ１（図２８Ａ）で軽度の神経変性を引き起こし、これはＡ６まで持続し（図２８Ｅ）、対照には存在しない（図２８Ｉ）。図２８Ｂ、２８Ｆ、２８Ｊ（第２カラム）に示すように、ｈＴＤＰ４３^ＷＴとＲＡＣＫ１－ＲＮＡｉを共発現するハエは、Ａ１（図２８Ｂ）又はＡ６（図２８Ｆ）で変性はなく、対照（図２８J）と区別がつかない。図２８Ｃ、２８Ｇ、２８Ｋ（第３カラム）に示すように、ｈＴＤＰ４３^{Ｑ３３１Ｋ}はＡ１では軽度（図２８Ｃ）の変性を引き起こすが、時間の経過とともに悪化し、Ａ６では一部は軽度（図２８Ｇ）で、一部は中等度（図２８Ｋ）の症例をもたらす。ＲＡＣＫ１－ＲＮＡｉをｈＴＤＰ４３^{Ｑ３３１Ｋ}と共発現させると、変性はＡ１（図２８Ｄ）からＡ６（図２８Ｈ）まで軽度のままである。図２８Ｌは、ＲＡＣＫ１－ＲＮＡｉのみのＧＭＲ発現が表現型を引き起こさないことを示すさらなる対照である。Ｌｉら、２０１０によって公表されたシステム：０＝正常；１＝２５％未満の単眼喪失；２＝２５～５０％の単眼喪失；３＝壊死の小さな領域（黒い斑点）を伴う５０～７５％の単眼喪失；４＝壊死の大きな領域を伴う７５％超の単眼喪失に従ってハエをスコア化した。各パネルでは、右上の数字は、その目に与えられたスコアを示す。

【0181】

網膜変性の定量化を図２９に示す。表６は、ハエの眼についての神経変性スコアの結果を示す。

【表10】

遺伝子型あたり約５０匹のハエを毎日スコア化した。実験ハエについて、３行は、Ａ１～Ａ６の各日に０、１又は２のスコアが付与されたハエの割合を示す。ＧＭＲ＞ｈＴＤＰ４３^ＷＴの１００％に１のスコアを毎日付与し、ＧＭＲ＞ｈＴＤＰ４３^ＷＴＲＡＣＫ１－ＲＮＡｉの１００％に０のスコアを毎日付与した。ＧＭＲ＞ｈＴＤＰ４３^{Ｑ３３１Ｋ}ハエ全てにはＡ１とＡ２に１のスコアを付与したが、その後に悪化した割合が増加し、２のスコアを付与した。ＧＭＲ＞ｈＴＤＰ４３^{Ｑ３３１Ｋ}ＲＡＣＫ１－ＲＮＡｉ全てにＡ１～Ａ６で１のスコアを付与した。様々な対照には、全ての齢で０のスコアを付与した。表７に示すように、カイ二乗検定をペアごとの比較として行い、極端に低いｐ値は、示したコホートの全てのペアが互いに有意に異なっていたことを示す：ｈＴＤＰ４３^ＷＴは対照とは異なり（１行目）；変異型ＴＤＰ４３はＷＴと異なり（３行目）；ＲＡＣＫ１－ＲＮＡｉの添加は、両方のｈＴＤＰ４３^ＷＴ（２行目）及びｈＴＤＰ４３^{Ｑ３３１Ｋ}（４行目）に有意差をもたらす。図２９で、ＧＭＲ＞ｈＴＤＰ４３^{Ｑ３３１Ｋ}（齢とともに悪化する唯一の遺伝子型）のカプラン・マイヤー曲線は、どの所定の日にもスコアが１のままである（２に低下するのではなく）ハエの割合を示す。これは、非常に有意に異なるＧＭＲ＞ｈＴＤＰ４３^{Ｑ３３１Ｋ}ＲＡＣＫ１－ＲＮＡｉと比較して示されている（ログランク検定：ｐ＝０．００２。エラーバーは９５％信頼区間である）。

【0182】

【表11】

【0183】

網膜ニューロンでｈＴＤＰ－４３^ＷＴを発現する全てのハエが、軽度の神経変性を示し、公表された知見（Ｅｌｄｅｎら，２０１０）を再現したことが判明した。これはＡ１で明らかであり（図２８Ａ）、続く５日間にわたって変化しなかった（図２８Ｅ、並びに表６及び７、上段）。際立って対照的に、ＲＡＣＫ１－ＲＮＡｉとｈＴＤＰ－４３^ＷＴを共発現するハエの１００％が、全ての齢において、変性のない正常な眼形態を示した（図２８Ｂ、２８Ｆ、表６及び７、２行目）。そのため、ＲＡＣＫ１ノックダウンはｈＴＤＰ－４３^ＷＴ誘導変性を完全に救済する。変異型ｈＴＤＰ－４３^{Ｑ３３１Ｋ}の発現はまた、ハエの１００％において網膜ニューロン変性を引き起こした（図２８Ｃ、２８Ｇ、２８Ｋ）。これは、ｈＴＤＰ－４３^ＷＴ発現によって引き起こされるものよりも重篤であり、また時間の経過とともに顕著に悪化し（表６及び７、３行目、図２９）、そのため、疾患の２つの特徴を具現化した。対照的に、ＲＡＣＫ１－ＲＮＡｉとｈＴＤＰ－４３^{Ｑ３３１Ｋ}を共発現するハエは、軽度の変性を示し、Ａ１からＡ６まで軽度のままであった。（図２Ｄ、２Ｈ、表６及び７、４行目、図２９）。そのため、ＲＡＣＫ１ノックダウンは、ｈＴＤＰ－４３^{Ｑ３３１Ｋ}によって引き起こされる経時的な神経変性の悪化を完全に防止する。

【0184】

実施例４：アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）結合ヒトＲＡＣＫ１ ｍＲＮＡを作製し、表８で詳述する。塩基への修飾は以下のとおりである。ＡＳＯは、全ての塩基間にホスホロチオエート結合を有する。２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）修飾を、中央の１０個のＤＮＡ塩基と共に各末端の５つのＲＮＡ塩基に使用し、「ギャップマー」構造を形成する。ＡＳＯ配列がＲＡＣＫ１に結合するｍＲＮＡ開始位置が示されている。ＡＳＯ配列をＤＮＡとして表してもよいが、チミジン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）であるＲＮＡも企図される。

【0185】

【表12】

【0186】

実施例５：アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ及びインビボ研究
細胞培養
実施例４に記載のＡＳＯ＃１～＃１０をヒト由来野生型ＨｅＬａ細胞で試験した。１０％ウシ胎児血清、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）－１（２ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を補充したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、５％ＣＯ_２で細胞を培養した。ＡＳＯ処理の１日前に、ナイーブ細胞を１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）Ｃｏｓｔａｒ（商標）平底細胞培養プレート、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１ｍｌ培地中７５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、２０～３０％培養密度に達するまで一晩増殖させた。

【0187】

ＡＳＯ処理
実施例４に記載の２５０ｎＭ、５００ｎＭ、又は１μＭのＡＳＯ＃１～＃１０を、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、１μＭのＡＳＯあたり５μｌのＲＮＡｉＭＡＸの割合で細胞に導入した。細胞を、ＡＳＯ／ＲＮＡｉＭＡＸ複合体を含む新鮮な培地で、溶解するまで７２時間インキュベートした。

【0188】

タンパク質抽出及びイムノブロッティング
細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、２％ＳＤＳで溶解し、２５％振幅で１０秒間超音波処理した。溶解物を１４，０００ ＲＰＭで１０分間遠心分離することによって清澄化し、タンパク質濃度をＢＣＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。各試料３～５μｇを４～１２％ＮｕＰＡＧＥＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳＰＡＧＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で分離し、ＰＶＤＦ膜上に移し、続いて標準的な手順に従ってウェスタンブロッティングを行った。以下の一次抗体：ＲＡＣＫ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：１，０００）及びローディング対照αチューブリン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈ、１：２０，０００）をウェスタンブロッティングに使用した。バンド強度を、ＩｍａｇｅＪを用いて定量化した。結果を図３０及び図３１に示す。図からわかるように、ＲＡＣＫ１発現の減少は、未処理細胞と比較してＡＳＯ処理細胞において、特にＡＳＯ ＃４、＃９又は＃１０で処理した細胞において見られる。ＡＳＯ ＃４は、低用量（０．２５μＭ）でのＲＡＣＫ１発現の減少に有効であったため、より高用量（０．５μＭ又は１μＭ）では調査しなかった。

【0189】

インビボ研究
ＡＳＯ ＃９及び＃１０を研究のために選択した。１．０μＬ容量中２００μＭのＡＳＯを、各ＡＳＯについて２匹、すなわちＡＳＯ ＃９又はＡＳＯ ＃１０、又は陰性対照ＡＳＯの６匹のマウスの右線条体に直接片側に注入し、各マウス脳の左線条体は非注入対照として機能した。注入の７日後に、線条体をマイクロ解剖し、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ）を補充した２００μＬのラジオイムノ沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５；１５０ｍＭのＮａＣｌ；１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００；１％のデオキシコール酸；０．１％のＳＤＳ；１ｍＭのＥＤＴＡ））中でスタンドアップホモジナイザーを用いてホモジナイズした。試料を４℃で１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清のタンパク質濃度をＢＣＡにより推定した。各試料の２５μｇを４～１２％ＮｕＰＡＧＥ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離した。ウェスタンブロッティング分析では、以下の抗体：ＲＡＣＫ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：１，０００）、ａチューブリン（ローディング対照、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈ、１：５０，０００）を使用した。ＩｍａｇｅＪを用いて、バンド強度を定量した。

【0190】

ウェスタンブロットによって測定し、チューブリン発現に正規化すると、右線条体におけるＡＳＯ ＃９又はＡＳＯ ＃１０の注入は、対照ＡＳＯの注入と比較して、ＲＡＣＫ１をより少なくした。

【0191】

本出願は、現在好ましい例であると考えられているものを参照して説明されているが、開示した実施例に限定されないことを理解されたい。それとは反対に、本願は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれる様々な改変及び同等のアレンジメントを包含することが意図される。

【0192】

全ての刊行物、特許及び特許出願は、各個々の刊行物、特許又は特許出願が参照によりその全体が組み込まれることを具体的かつ個々に示される場合と同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、例えば、表又は他の場所に提供される登録番号及び／又はバイオマーカー配列（例えば、タンパク質及び／又は核酸）を含む本明細書に提供される各登録番号に関連付けられる配列は、参照によりその全体が組み込まれる。

【0193】

特許請求の範囲は、好ましい実施形態及び実施例によって限定されるべきではなく、全体としての記載と一致する最も広い解釈を与えられるべきである。
参考文献

【化1】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【手続補正書】

【提出日】2022-12-19

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2023522622000001.app

【国際調査報告】