▶ ナブリバ セラピューティクス ゲーエムベーハーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-31
(54)【発明の名称】プレウロムチリンの治療的使用
(51)【国際特許分類】
C07C 321/22 20060101AFI20230524BHJP
A61K 31/22 20060101ALI20230524BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230524BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230524BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230524BHJP
A61P 37/00 20060101ALI20230524BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230524BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230524BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230524BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20230524BHJP
【ＦＩ】
C07C321/22 CSP
A61K31/22
A61P11/00
A61P31/12
A61P37/08
A61P37/00
A61P29/00
A61P17/00
A61P31/14
A61P31/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022562465
(86)(22)【出願日】2021-04-16
(85)【翻訳文提出日】2022-12-08
(86)【国際出願番号】 EP2021025140
(87)【国際公開番号】W WO2021209174
(87)【国際公開日】2021-10-21
(31)【優先権主張番号】20170072.1
(32)【優先日】2020-04-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20183292.0
(32)【優先日】2020-06-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】63/011,474
(32)【優先日】2020-04-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522400032
【氏名又は名称】ナブリバ セラピューティクス ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハフナー、マイケル
(72)【発明者】
【氏名】パオクナー、シュザンヌ
(72)【発明者】
【氏名】ヴィッカ、ヴォルフガング
(72)【発明者】
【氏名】リーデル、ローズマリー
(72)【発明者】
【氏名】イヴェジック － シェーンフェルト、ズリンカ
【テーマコード（参考）】
4C206
4H006
【Ｆターム（参考）】
4C206AA01
4C206AA02
4C206AA03
4C206JA23
4C206KA08
4C206KA15
4C206KA17
4C206MA01
4C206MA04
4C206MA36
4C206MA86
4C206NA14
4C206NA15
4C206ZA59
4C206ZA89
4C206ZB07
4C206ZB11
4C206ZB13
4C206ZB33
4H006AA01
4H006AA03
4H006AB22
4H006TA04
(57)【要約】
細菌によって媒介されない炎症性疾患の治療又は予防における特定の使用のための、式（Ｉ）の化合物であって、式中、ｎは０～４であり、ｍは０又は１であり、但し、硫黄原子及びＲ３は近接した位置にあり（ｍ＝０の場合、Ｒ３は位置２’にあり、ｍ＝１の場合、Ｒ３は位置１’にある）、Ｒはエチル又はビニルであり、Ｒ１は水素又は（Ｃ１～６）アルキルであり、Ｒ２は水素又は（Ｃ３～６）シクロアルキル、又は非置換（Ｃ１～６）アルキル、又はヒドロキシ、好ましくは１つ若しくは２つのヒドロキシのうちの１つ若しくは複数で置換された（Ｃ１～６）アルキル、メトキシ、ハロゲン、（Ｃ３～６）シクロアルキルであり、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、少なくとも１つの窒素原子、又は１つの窒素及び１つの更なるヘテロ原子、例えばＮ若しくはＯから選択されるものを含む５～７員複素環を形成するか、又はＲ１はヒドロキシであり、Ｒ２はホルミルであり、Ｒ３はＯＨ、ＯＲ４、ハロゲン原子であり、又はＲ３は２’に結合し、ｐが２又は３である－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－を表し、Ｒ４は非置換（Ｃ１～６）アルキル又は（Ｃ３～６）シクロアルキルである、化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、プロドラッグ若しくは代謝産物。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細菌によって媒介されない炎症性疾患の治療又は予防における特定の使用のための、式（Ｉ）の化合物であって、
【化1】
式中、
ｎは０～４であり、
ｍは０又は１であり、但し、硫黄原子及びＲ３は近接した位置にあり（ｍ＝０の場合、Ｒ３は位置２’にあり、ｍ＝１の場合、Ｒ３は位置１’にある）、
Ｒはエチル又はビニルであり、
Ｒ１は水素又は（Ｃ１～６）アルキルであり、
Ｒ２は水素、又は
－（Ｃ３～６）シクロアルキル、又は
－非置換（Ｃ１～６）アルキル、又は
－ヒドロキシ、好ましくは１つ若しくは２つのヒドロキシ
のうち１つ若しくは複数で置換された（Ｃ１～６）アルキル、
－メトキシ、
－ハロゲン、
－（Ｃ３～６）シクロアルキルであり、又は
Ｒ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、少なくとも１つの窒素原子、又は１つの窒素及び例えばＮ若しくはＯから選択される１つの更なるヘテロ原子を含む５～７員複素環を形成するか、又は
Ｒ１はヒドロキシであり、Ｒ２はホルミルであり、
Ｒ３はＯＨ、ＯＲ４、ハロゲン原子、又は
Ｒ３は２’に結合し、ｐが２又は３である－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－を表し、
Ｒ４は非置換（Ｃ１～６）アルキル又は（Ｃ３～６）シクロアルキルである、化合物、
又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、プロドラッグ若しくは代謝産物。
【請求項2】
前記化合物が、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）【化2】
（式中、各場合において、ｎ、Ｒ１及びＲ２は、請求項１に定義される通りである）
の化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項3】
前記化合物が、１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）－４－アミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン
１４－Ｏ－｛［（１Ｓ，２Ｓ，４Ｓ）－４－アミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｓ）－５－アミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン
１４－Ｏ－｛［（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）－５－アミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）－４－アミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｒ）－５－アミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン
１４－Ｏ－｛［（１Ｓ，２Ｓ，５Ｓ）－５－アミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）－３－アミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，３Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）－４－ジエチルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，４Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）－４－エチルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，４Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｓ）－５－エチルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｓ）－５－ジエチルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）－４－ジエチルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｒ）－５－ジエチルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，５Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）－３－エチルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，３Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）－３－ジエチルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，３Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）－４－（ホルミル－ヒドロキシ－アミノ）－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｓ）－５－（ホルミル－ヒドロキシ－アミノ）－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ／Ｓ）－３－（ホルミル－ヒドロキシ－アミノ）－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ／Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｓ）－２－ヒドロキシ－５－メチルアミノ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｓ）－５－アリルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｓ）－２－ヒドロキシ－５－（２－メトキシ－エチルアミノ）－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ＊）－２－ヒドロキシ－４－（２－ヒドロキシ－エチルアミノ）－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，４Ｓ＊）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ＊）－４－シクロヘキシルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，４Ｓ＊）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ＊）－４－シクロプロピルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，４Ｓ＊）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｓ＊）－４－シクロプロピルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ＊）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ＊）－４－シクロプロピルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ＊）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｒ＊）－２－ヒドロキシ－５－モルホリン－４－イル－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，５Ｓ＊）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｓ＊）－２－ヒドロキシ－５－モルホリン－４－イル－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ＊）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｓ）－５－アミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－１９，２０ジヒドロ－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｓ）－５－エチルアミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－１９，２０ジヒドロ－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｒ）－５－アミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－１９，２０ジヒドロ－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ，５Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－４－アミノメチル－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［５－アミノ－２－クロロ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン
１４－Ｏ－｛［４－アミノ－２－クロロ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン
１４－Ｏ－［（４－アミノ－１－ヒドロキシ－シクロヘキシルメチルスルファニル）－アセチル］－ムチリン
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシ－５－（３－メチルアミノ－プロピル）－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシ－４－（３－メチルアミノ－プロピル）－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－５－（３－アミノ－プロピル）－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－４－（３－アミノ－プロピル）－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（１Ｓ，２Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［（６Ｒ，８Ｒ）－８－アミノ－１，４－ジオキサ－スピロ［４．５］デカ－６－イルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン及びその（６Ｓ，８Ｓ）ジアステレオマー
１４－Ｏ－｛［４－アミノ－２－メトキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン
並びに
１４－Ｏ－｛［５－アミノ－２－メトキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用のための化合物。
【請求項4】
前記化合物がレファムリンであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項5】
前記化合物が、塩及び／又は溶媒和物の形態であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項6】
前記化合物が、レファムリン酢酸塩又はレファムリンイタコン酸塩としての形態のレファムリンであることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項7】
前記炎症性疾患が、不適切な又は慢性の炎症反応の結果であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項8】
前記炎症性疾患が、免疫応答の過剰反応状態、好中球優位の炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー、又は皮膚科的炎症性疾患、特に免疫応答の過剰反応状態又は好中球優位の炎症性疾患であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項9】
前記炎症性疾患が、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む急性肺損傷（ＡＬＩ）、敗血症、及びサイトカインストームを含むサイトカイン放出症候群からなる群から選択される免疫応答の過剰反応状態である、請求項８に記載の使用のための化合物。
【請求項10】
前記炎症性疾患が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、びまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）を含む気管支拡張症、閉塞性細気管支炎症候群、非好酸球性喘息からなる群から選択される好中球優位の炎症性疾患である、請求項９に記載の使用のための化合物。
【請求項11】
前記炎症性疾患が、ウイルスによって媒介される免疫応答の過剰反応状態、特にウイルス性敗血症、又は例えばインフルエンザ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）若しくはＣＯＶＩＤ－１９などのウイルス感染症に関連する急性呼吸器疾患である、請求項８又は９に記載の使用のための化合物。
【請求項12】
前記炎症性疾患が、微生物によって媒介されない炎症性疾患であることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項13】
前記炎症性疾患が、ウイルス感染症に関連する又はウイルス感染症によって引き起こされる状態であることを特徴とし、式Ｉの化合物が、前記ウイルス感染症自体を治療及び／又は予防するため、並びに前記炎症性状態を治療及び／又は予防するための両方で投与される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項14】
前記炎症性状態が、前記ウイルス感染症に関連する又は前記ウイルス感染症によって引き起こされる不適切な又は慢性の炎症反応の結果であることを特徴とする、請求項１３に記載の使用のための化合物。
【請求項15】
前記炎症性状態が、前記ウイルス感染症に関連する又は前記ウイルス感染症によって引き起こされる免疫応答の過剰反応状態であることを特徴とする、請求項１３に記載の使用のための化合物。
【請求項16】
前記ウイルス感染症に対する治療及び前記炎症性状態に対する治療の両方を必要とする患者の治療のための、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項17】
前記ウイルス感染症が、一本鎖プラス鎖又はマイナス鎖ＲＮＡウイルスによって媒介され、好ましくは、前記ウイルスが、
－特にヒトコロナウイルスを含むコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、
－特に麻疹ウイルスなどのパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）を含むパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、及び呼吸器合胞体ウイルスなどのニューモウイルス科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）、
－特にインフルエンザウイルスを含むオルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、
－特にデングウイルス及びジカウイルスを含むフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、並びに
－特にライノウイルスを含むピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項18】
前記ウイルス感染症が空気感染性疾患であることを特徴とする、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項19】
前記ウイルス感染症が呼吸器疾患であることを特徴とする、請求項１から１８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項20】
細菌によって媒介されない炎症性疾患を治療又は予防する方法であって、請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物、特にレファムリン、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、代謝産物のエステルを、このような治療を必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項21】
前記炎症性疾患が、不適切な又は慢性の炎症反応の結果である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記炎症性疾患が、免疫応答の過剰反応状態、好中球優位の炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー、又は皮膚科的炎症性疾患、特に免疫応答の過剰反応状態又は好中球優位の炎症性疾患である、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項23】
前記炎症性疾患が、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む急性肺損傷（ＡＬＩ）、敗血症、及びサイトカインストームを含むサイトカイン放出症候群からなる群から選択される免疫応答の過剰反応状態である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記炎症性疾患が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、びまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）を含む気管支拡張症、閉塞性細気管支炎症候群、非好酸球性喘息からなる群から選択される好中球優位の炎症性疾患である、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
免疫応答の過剰反応状態が、ウイルスによって媒介され、特にウイルス性敗血症、又は例えばインフルエンザ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）若しくはＣＯＶＩＤ－１９などのウイルス感染症に関連する急性呼吸器疾患である、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項26】
前記炎症性疾患が、微生物によって媒介されない炎症性疾患である、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記炎症性疾患が、ウイルス感染症に関連する又はウイルス感染症によって引き起こされる炎症性状態であり、前記ウイルス感染症自体を治療及び／又は予防するため、並びに前記炎症性状態を治療及び／又は予防するための両方で投与される、請求項２０から２６のいずれか一項に記載の治療又は予防の方法。
【請求項28】
前記炎症性状態が、前記ウイルス感染症に関連する又は前記ウイルス感染症によって引き起こされる不適切な又は慢性の炎症反応の結果である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記炎症性状態が、前記ウイルス感染症に関連する又は前記ウイルス感染症によって引き起こされる免疫応答の過剰反応状態であることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記ウイルス感染症に対する治療及び前記炎症性状態に対する治療の両方を必要とする患者の治療のための、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記ウイルス感染症が、一本鎖プラス鎖又はマイナス鎖ＲＮＡウイルスによって媒介され、好ましくは、前記ウイルスが、－特にヒトコロナウイルスを含むコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、
－特に麻疹ウイルスなどのパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）を含むパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、及び呼吸器合胞体ウイルスなどのニューモウイルス科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）、
－特にインフルエンザウイルスを含むオルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、
－特にデングウイルス及びジカウイルスを含むフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、並びに
－特にライノウイルスを含むピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）
からなる群から選択される、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項32】
前記ウイルス感染症が空気感染性疾患である、請求項２７から３１のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項33】
前記ウイルス性疾患が呼吸器疾患である、請求項２７から３２のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項34】
イタコン酸との酸付加塩としての形態のレファムリン、特に、イタコン酸レファムリン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、プレウロムチリンの新規な治療的使用に関する。
【背景技術】
【0002】
以下の式の化合物であるプレウロムチリンは、
例えば、担子菌類プレウロタス・ムチルス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｍｕｔｉｌｕｓ）及びＰ．パスケリアヌス（Ｐ．ｐａｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）によって産生される天然の抗生物質であり、例えば、メルクインデックス、第１２版、項目７６９４を参照されたい。
【化1】
例えば、担子菌類プレウロタス・ムチルス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｍｕｔｉｌｕｓ）及びＰ．パスケリアヌス（Ｐ．ｐａｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）によって産生される天然の抗生物質であり、例えば、メルクインデックス、第１２版、項目７６９４を参照されたい。
【0003】
プレウロムチリンの主要な環構造を有し、一級ヒドロキシ基で置換されているいくつかの更なるプレウロムチリンが、例えば抗菌剤として開発されている。それらの顕著な抗菌活性のために、国際公開第２００８／１１３０８９号に開示されているような、一群のプレウロムチリン誘導体、アミノ－ヒドロキシ置換シクロヘキシルスルファニルアセチルムチリンが特に興味深いことが見出されている。国際公開第２００８／１１３０８９号に記載されているように、１４－Ｏ－｛［（４－アミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシル）－スルファニル］－アセチル｝－ムチリンは、グラム陽性菌及びグラム陰性菌に対する活性のために特に有用な化合物である。
【0004】
プレウロムチリンに由来する医薬活性化合物（半合成化合物）は、細菌におけるリボソームタンパク質合成の阻害剤である。ヒトでの使用のための半合成プレウロムチリンの代表例は、膿痂疹及び感染性小裂傷、擦過傷又は縫合創の短期処置のために承認された局所剤であるレタパムリン（ＡｌｔａｒｇｅｔｏＰ（登録商標）、ＡｌｔａｂａｘＰ（登録商標）として承認）、及び成人の市中感染細菌性肺炎（ＣＡＢＰ）の処置のためのレファムリン（Ｘｅｎｌｅｔａ（登録商標）として承認）である。チアムリン（Ｄｅｎａｇａｒｄ（登録商標））及びバルネムリン（Ｅｃｏｎｏｒ（登録商標））は、長年にわたって獣医学において抗生物質として全身的に使用されてきた２つの他の半合成プレウロムチリン誘導体である。
【化2】
【0005】
プレウロムチリン由来の承認された半合成化合物は、とりわけ肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡを含む）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含む細菌生物に対して優れた活性を示している。
【0006】
炎症性疾患は、不適切な免疫応答によって引き起こされる。炎症は、例えば、細胞傷害、虚血、外傷、アレルゲン、又は病原体への曝露、及び免疫系が身体自身の組織を攻撃する場合（自己免疫疾患）を含む様々な原因に関連し得る。制御不能な、例えば、過度に興奮した免疫応答及び／又は持続的な、すなわち慢性状態は、炎症性疾患と考えられる。
【0007】
不適切な反応の場合、炎症反応は、敗血症などの全身を巻き込んで全身化され得るか、又は主に特定の臓器に影響を及ぼし得る。これは、例えば肺を含む身体の器官の機能不全をもたらし得る。例えば、急性肺損傷（ＡＬＩ）は、血管透過性の増加を伴う急性及び持続性肺炎症の症候群として定義される。肺胞－毛細血管膜への炎症性損傷、及び肺内部の過剰な制御されない炎症反応を特徴とする。急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、ＡＬＩの最も重症な形態であり欠陥のある酸化及び炎症、接着分子のアップレギュレーション、サイトカイン及びケモカインの産生の増加並びに過剰な肺細胞アポトーシスを伴う。これらの症候群は、多臓器機能不全症候群の発症に関連しており、多臓器機能不全症候群は、複数回の輸血、ショック、敗血症及び虚血－再灌流を伴う患者の死亡において極めて重要な役割を果たしており、治療に対して難治性のままである。
【0008】
慢性炎症は、免疫応答が持続すると起こり、身体を一定の警戒状態に保つ。経時的に、慢性炎症は、組織及び器官に悪影響を及ぼし得る。
【0009】
バルネムリンは、気管支肺胞洗浄液中のＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＩＬ－１βなどの炎症促進性サイトカインの濃度を減少させ、肺でのこれらのサイトカインの転写を抑制することが示されており（Ｃｈｅｎ，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ３３（５）：３０６－１４）、これはインビトロ試験と一致しており（Ｚｈａｎｇ，Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ ９（７－８）：８１０－８１６）、リポ多糖（ＬＰＳ）誘発性ＡＬＩに対する炎症反応中のオキシラジカルの効果的な捕捉及び上皮透過性の阻害を抑制し、これがバルネムリンの治療効果に寄与している可能性がある。更に、バルネムリンの前投与は、肺における肺の湿乾比（Ｗ／Ｄ）を有意に減少させ、肺水腫の発症を減弱させる可能性がある（Ｃｈｅｎ，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ３３（５）：３０６－１４）。
【0010】
リポ多糖誘発性肺好中球症モデルにおけるレファムリンの抗炎症活性の予備的分析をプレプリントとして発表した（Ｈａｆｎｅｒ，Ｐａｕｋｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．２０２０，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０６．２３．１６８３９３、ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０６．２３．１６８３９３）。
【0011】
レファムリンの潜在的な抗ウイルス効果及び抗炎症効果に関する特定の記述は、２０２０年５月１１日の「Ｑ１ ２０２０ Ｎａｂｒｉｖａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＰＬＣ Ｅａｒｎｉｎｇｓ Ｃａｌｌ」（その写しは、２０２０年６月１０日にダウンロードされたｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ｅｄｉｔｅｄ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ－ｎｂｒｖ－ｏｑ－ｅａｒｎｉｎｇｓ－１４４１０８６２１．ｈｔｍｌの下で、並びに２０２０年５月１１日のプレスリリース（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｎｖｅｓｔｏｒｓ．ｎａｂｒｉｖａ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ－ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｎｅｗｓ－ｒｅｌｅａｓｅ－ｄｅｔａｉｌｓ／ｎａｂｒｉｖａ－ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ－ｒｅｐｏｒｔｓ－ｆｉｒｓｔ－ｑｕａｒｔｅｒ－２０２０－ｆｉｎａｎｃｉａｌ）、２０２０年５月２８日にダウンロードされた）に記載されている。
【0012】
ウイルス性疾患は、世界における罹患率及び死亡率の主要な原因の１つである。インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、特定のアデノウイルス、ライノウイルス及びコロナウイルスなどの呼吸器ウイルス、特に新たに出現した重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＣＯＶＩＤ－１９）は、公衆衛生に大きな影響を及ぼす。
【0013】
Ａｓｈｅｓｈｏｖ，Ｉｇｏｒ Ｎ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ＆Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４／４（１９５４），３８０－３９４では、プレウロムチリンの抗ウイルス活性が、２ｍｇ／ｍＬの濃度でＡ型インフルエンザウイルス株（ＰＲ８）に対するプレロムチリン自体の抗ウイルス活性と共に初めて記載された。対照的に、プレウロムチリンは、この試験ではポリオウイルスに対して抗ウイルス活性を示さなかった。
【0014】
更に、Ａｌａｃｏｒｎ，Ｂａｌｂｉｎｏ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４（１９８４），２３１－２４３では、４０μＭ（１５μｇ／ｍＬ）のＨＳＶ－１によって誘導される細胞傷害活性の５０％保護（ＣＰＥ５０）を付与する試験化合物濃度での、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスの両方、特に単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）に対するプレウロムチリンの抗ウイルス活性、並びに水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に対する活性が記載されている。
【0015】
国際公開第２００９／１０６８３９号では、抗ウイルス剤としてのチアムリンの使用が主張されており、バルネムリンと比較して０．１～１０μｇ／ｍＬのチアムリン濃度のウイルスを接種した４時間後のウイルス取り込みアッセイにおけるインフルエンザＡウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）１型及び２型に対するチアムリンの効果、並びにエンドソームｐＨに対するチアムリンの効果が例示されている。バルネムリンは抗ウイルス活性を示さず、他のプレウロムチリン抗生物質がウイルスに効果を有することは見出されていないと述べられた。
【0016】
チアムリンによるエンドソーム又はリソソームｐＨの変化、並びにウイルス侵入の前提条件である、それに伴うウイルス膜とエンドソーム及びリソソームとの融合の阻止は、潜在的な作用機序として記載された。
【0017】
中国特許第１０３２０４７８７号及び中国特許第１０３２４２２１０号は両方とも、更なるプレウロムチリン誘導体を開示しており、一般に抗ウイルス薬におけるそれらの使用について言及しているが、抗ウイルス作用についての実際の証拠は開示していない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0018】
驚くべきことに、国際公開第２００８／１１３０８９号に開示されているプレウロムチリン誘導体は、抗菌活性とは関係なく、免疫調節及び抗炎症効果を示すことが今回見出された。
【0019】
したがって、第１の態様では、本発明は、細菌によって媒介されない炎症性疾患の治療又は予防における特定の使用のための、請求項１から６に記載の化合物、特にレファムリン、又はその任意の薬学的に許容される塩、溶媒和物、代謝産物のエステルに関する。
【0020】
更なる態様では、本発明は細菌によって媒介されない炎症性疾患を治療又は予防する方法に関し、請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物、特にレファムリン、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、代謝産物のエステルを、このような治療を必要とする対象に投与することを含む。
【0021】
更に、化合物は抗ウイルス活性を示す。したがって、化合物は、ウイルスによって媒介される疾患、すなわちウイルス感染症の治療及び予防、並びにそのような疾患を治療又は予防する方法における使用にも適している。
【0022】
したがって、別の態様では、本発明は、ウイルス感染症及びウイルス感染症に関連する又はウイルス感染症によって引き起こされる炎症性状態の治療又は予防における特定の使用のための、請求項１から６に記載の化合物、特にレファムリン、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、プロドラッグ若しくは代謝産物に関し、式Ｉの化合物は、ウイルス感染症自体を治療及び／又は予防するため、並びに炎症性状態を治療及び／又は予防するための両方で投与される。
【0023】
更なる態様では、本発明は、ウイルス感染症及びウイルス感染症に関連する又はウイルス感染症によって引き起こされる炎症性状態を治療又は予防する方法に関し、請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物、特にレファムリン、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、プロドラッグ若しくは代謝産物を投与することを含み、ウイルス感染症及び炎症性状態の両方が治療及び／又は予防される。
【0024】
更に別の態様では、本発明は、イタコン酸との酸付加塩としてのその形態のレファムリン、特に、イタコン酸レファムリンに関する。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】リポ多糖（ＬＰＳ）で負荷したマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の総細胞数を減少させることにおけるレファムリンの効果を実証する図である。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。バーの上の菱形の印は、未処置対照と比較して統計学的に有意な減少（ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定）を示す。
【図2】リポ多糖（ＬＰＳ）で負荷したマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好中球数の減少におけるレファムリンの効果を実証する図である。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。バーの上の菱形の印は、未処置対照と比較して統計学的に有意な減少（ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定）を示す。
【図3A】リポ多糖（ＬＰＳ）で負荷したマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の総細胞の数に対するデキサメタゾン、レファムリン及びバルネムリンの効果を実証する図である。
【図3B】リポ多糖（ＬＰＳ）で負荷したマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好中球の数に対するデキサメタゾン、レファムリン及びバルネムリンの効果を実証する図である。
【図3C】リポ多糖（ＬＰＳ）で負荷したマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のマクロファージの数に対するデキサメタゾン、レファムリン及びバルネムリンの効果を実証する図である。
【図3D】リポ多糖（ＬＰＳ）で負荷したマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のリンパ球の数に対するデキサメタゾン、レファムリン及びバルネムリンの効果を実証する図である。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。バーの上の菱形の印は、未処置対照と比較して統計学的に有意な減少（ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定）を示す。
【図4A】肺ホモジネート中の様々なマーカー、特にＴＮＦ－αの濃度に対するデキサメタゾン、レファムリン及びバルネムリンの効果を実証する図である。
【図4B】肺ホモジネート中の様々なマーカー、特にＩＬ－６の濃度に対するデキサメタゾン、レファムリン及びバルネムリンの効果を実証する図である。
【図4C】肺ホモジネート中の様々なマーカー、特にＩＬ－１βの濃度に対するデキサメタゾン、レファムリン及びバルネムリンの効果を実証する図である。
【図4D】肺ホモジネート中の様々なマーカー、特にＧＭ－ＣＳＦの濃度に対するデキサメタゾン、レファムリン及びバルネムリンの効果を実証する図である。
【図4E】肺ホモジネート中の様々なマーカー、特にＣＸＣＬ１の濃度に対するデキサメタゾン、レファムリン及びバルネムリンの効果を実証する図である。
【図4F】肺ホモジネート中の様々なマーカー、特にＣＸＣＬ２の濃度に対するデキサメタゾン、レファムリン及びバルネムリンの効果を実証する図である。
【図4G】肺ホモジネート中の様々なマーカー、特にＣＣＬ２の濃度に対するデキサメタゾン、レファムリン及びバルネムリンの効果を実証する図である。
【図4H】肺ホモジネート中の様々なマーカー、特にＭＭＰ９の濃度に対するデキサメタゾン、レファムリン及びバルネムリンの効果を実証する図である。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。バーの上の菱形の印は、未処置対照と比較して統計学的に有意な減少（ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定）を示す。
【図5】リポ多糖（ＬＰＳ）で負荷したマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の細胞数を減少させることにおける、イタコン酸ナトリウム並びに酢酸塩及びイタコン酸塩の形態のレファムリンの効果を実証する図である。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【図6A】インフルエンザ感染マウスモデルにおける臨床徴候、特に体重に対するレファムリン及びオセルタミビルの効果を実証する図である。
【図6B】インフルエンザ感染マウスモデルにおける臨床徴候、特に臨床スコアに対するレファムリン及びオセルタミビルの効果を実証する図である。
【図6C】インフルエンザ感染マウスモデルにおける臨床徴候、特に生存率に対するレファムリン及びオセルタミビルの効果を実証する図である。
【図6D】インフルエンザ感染マウスモデルにおける臨床徴候、特に肺試料組織病理スコアリングに対するレファムリン及びオセルタミビルの効果を実証する図である。
【図7】ＭＤＣＫ細胞において５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）として決定されたインフルエンザ感染マウスモデルにおける、肺ウイルス力価に対するレファムリン及びオセルタミビルの効果を実証する図である。
【図8A】インフルエンザ感染マウスモデルにおける感染後３日目及び６日目の免疫細胞数に対するレファムリン及びオセルタミビルの効果を実証する図である。
【図8B】インフルエンザ感染マウスモデルにおける感染後３日目の骨髄サブセットに対するレファムリン及びオセルタミビルの効果を実証する図である。
【図8C】インフルエンザ感染マウスモデルにおける感染後６日目の骨髄サブセット（好中球、肺胞マクロファージ、マクロファージ）に対するレファムリン及びオセルタミビルの効果を実証する図である。
【図8D】インフルエンザ感染マウスモデルにおける感染後３日目のリンパ球サブセットに対するレファムリン及びオセルタミビルの効果を実証する図である。
【図8E】インフルエンザ感染マウスモデルにおける感染後６日目のリンパ球サブセットに対するレファムリン及びオセルタミビルの効果を実証する図である。通常の一元配置分散分析、溶媒対照処置に対するダネットの多重比較を各時点について実行した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１の有意水準を表す。個々のデータポイントを外れ値として除外した。
【図9A】ウイルスによる感染後の６日目のＭＲＣ－５細胞におけるアルファコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）に対するレファムリンの効果を実証する図である。
【図9B】ウイルスによる感染後の６日目のＭＲＣ－５細胞におけるアルファコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）に対するチアムリンの効果を実証する図である。
【図9C】ウイルスによる感染後の６日目のＭＲＣ－５細胞におけるアルファコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）に対するレムデシビルの効果を実証する図である。
【図10A】ウイルスによる感染後の６日目のＨＥｐ２細胞における呼吸器合胞体ウイルスＡ型（ＲＳＶＡ２）に対するレファムリンの効果を実証する図である。
【図10B】ウイルスによる感染後の６日目のＨＥｐ２細胞における呼吸器合胞体ウイルスＡ型（ＲＳＶＡ２）に対するチアムリンの効果を実証する図である。
【図10C】ウイルスによる感染後の６日目のＨＥｐ２細胞における呼吸器合胞体ウイルスＡ型（ＲＳＶＡ２）に対するＴＭＣ３５３１２１の効果を実証する図である。
【発明を実施するための形態】
【0026】
レファムリンは一般式（Ｉ）の化合物のＩＮＮであり、より具体的には、レファムリンは式（ＶＩＩ）の化合物、
すなわち、１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）－４－アミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン（「ＢＣ－３７８１」としても知られる）である。
【化3】
すなわち、１４－Ｏ－｛［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）－４－アミノ－２－ヒドロキシ－シクロヘキシルスルファニル］－アセチル｝－ムチリン（「ＢＣ－３７８１」としても知られる）である。
【0027】
以下では、「レファムリン」という用語は、一般に、追加の説明なしに使用される場合、遊離塩基形態のレファムリン並びにその塩及び溶媒和物の両方を包含することが意図される。
【0028】
レファムリンは、ヒトにおける重篤な細菌感染症を処置するための全身的な使用のために開発されており、２０１９年に米国において、市中感染細菌性肺炎（ＣＡＢＰ）に罹患した成人を処置するための医学的使用のために承認された。
【0029】
本発明に従って使用される化合物は免疫調節効果を有することが見出された。
【0030】
実験の結果は、抗菌活性に加えて、レファムリンも免疫調節性であり、抗炎症効果を有することを示している。マウスにおけるリポ多糖（ＬＰＳ）誘発性肺炎症のインビボモデルを用いた実験から明らかなように、レファムリンは、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の総細胞、特に好中球数を用量依存的様式で減少させ、すなわち細胞浸潤を阻害することを実証した。更に、実験はまた、試験した全ての用量で炎症部位における炎症促進性メディエータ（例えば、サイトカイン、ケモカイン及び他の因子、例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ９）の濃度の著しい低下を示している。
【0031】
免疫細胞（例えば好中球）浸潤は、炎症促進性メディエータ（例えば、サイトカイン、ケモカイン及びマトリックスメタロプロテイナーゼ）の放出を含む多段階の免疫学的過程である。これらのサイトカインは、毛細血管内皮上の細胞接着分子の発現をアップレギュレートし、その後、走化性勾配に基づいて好中球の肺胞腔への遊走を媒介する。疾患の他の部位における炎症過程についても同様の機構が予想される。免疫機能の変化（例えば、炎症促進性メディエータ分泌の阻害）により、不適切な（過度に興奮した又は調節解除された）又は慢性炎症反応に基づく炎症性疾患を治療又は予防することができる。
【0032】
したがって、本発明は、炎症性疾患の治療における、請求項１から６に記載の化合物、特にレファムリンの使用に関し、炎症性疾患は、不適切な（過度に興奮した又は調節解除された）又は慢性炎症反応に基づいている。疾患は、細菌によって媒介されない疾患である。
【0033】
細菌によって媒介される疾患では、抗炎症処置が望ましい場合がある。本発明は、細菌によって媒介されない炎症性疾患の治療を包含する。
【0034】
一実施形態によれば、炎症性疾患は、微生物によって媒介されない炎症性疾患であってもよい。
【0035】
本発明の目的のために、「微生物」という用語はウイルスを包含しない。
【0036】
本発明の好ましい実施形態では、炎症性疾患は、不適切な（過度に興奮した又は調節解除された）又は慢性炎症反応の結果であり、特に疾患は、免疫応答の過剰反応状態、好中球優位の炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー、又は皮膚科的炎症性疾患である。
【0037】
好ましい実施形態では、炎症性疾患は、例えば急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む急性肺損傷（ＡＬＩ）、敗血症、及びサイトカインストームを含むサイトカイン放出症候群を含む免疫応答の過剰反応状態である。これらの状態では、免疫応答は調節解除されており、典型的には過度に興奮していると考えられる。
【0038】
特に、細菌によって媒介されない場合、そのような免疫応答の過剰反応状態は、非感染性状態（すなわち、微生物及びウイルスを含むいかなる病原体によっても媒介されない）又はウイルスによって媒介される状態であってもよい。
【0039】
一実施形態では、炎症性疾患は、ウイルスによって媒介される免疫応答の過剰反応状態である。この実施形態では、免疫応答の過剰反応状態（例えば、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む急性肺損傷（ＡＬＩ）、敗血症、サイトカインストームを含むサイトカイン放出症候群を含む）は、ウイルス感染症を伴い得る。
【0040】
特定の実施形態では、免疫応答の過剰反応状態は、ウイルスによって媒介され、特にウイルス性敗血症、又は例えばインフルエンザ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）若しくはＣＯＶＩＤ－１９などのウイルス感染症に関連する急性呼吸器疾患である。
【0041】
別の好ましい実施形態では、炎症性疾患は、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、びまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）を含む気管支拡張症、閉塞性細気管支炎症候群、非好酸球性喘息を含む好中球優位の炎症性疾患である。
【0042】
これらの疾患では、好中球顆粒球の活性によって免疫応答が支配的に調節解除される。好中球優位の炎症性疾患の治療には、古典的な抗炎症療法、例えば副腎皮質ステロイドはどれも有効ではなく、非ステロイド性抗炎症薬は好中球機能に影響を及ぼさないか、又は好中球の寿命を有害に延長する可能性があるため、医療上の必要性は明らかである。例１及び２の結果は、レファムリンの好中球細胞数に対する特異的効果を証明している。
【0043】
本発明の一実施形態によれば、炎症性疾患は自己免疫疾患である。本発明によれば、自己免疫疾患としては、例えば、多発性硬化症、炎症性腸疾患（クローン病、大腸炎）、関節リウマチ、１型糖尿病、乾癬などが挙げられる。これらの疾患は、免疫応答が身体自身の組織に向けられるため、調節解除された免疫応答に基づいている。更に、これらの疾患は、典型的には慢性炎症に関連する。
【0044】
本発明の別の実施形態によれば、炎症性疾患はアレルギーである。アレルギーでは、アレルゲンに対する反応が生理的ではないため、免疫応答は調節解除されていると考えられる。
【0045】
別の態様では、炎症性疾患は、呼吸器炎症性疾患又は皮膚科的炎症性疾患であってもよく、好ましくは呼吸器炎症性疾患であってもよい。呼吸器炎症性疾患としては、例えばＡＬＩ（ＡＲＤＳを含む）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、ＣＯＶＩＤ－１９、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、びまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）を含む気管支拡張症、閉塞性細気管支炎症候群、又は非好酸球性喘息が挙げられる。皮膚科的炎症性疾患としては、例えば、乾癬、ざ瘡又は酒さが含まれる。
【0046】
本発明の一実施形態では、疾患は細菌性肺炎ではなく、及び／又は細菌性肺炎に関連しない。
【0047】
本発明に従って使用される化合物は、抗ウイルス効果及び免疫調節効果の両方を有することが見出された。したがって、化合物は、炎症性状態がウイルス感染症に関連するか、又は炎症性状態がウイルス感染症によって引き起こされる状況において有用である。そのような状況では、二重の効果が望まれる。
【0048】
一実施形態では、炎症性状態は、ウイルス感染症に関連する又はウイルス感染症によって引き起こされる免疫応答の過剰反応状態である。
【0049】
特に、化合物は、ウイルス感染症に対する治療及び炎症性状態に対する治療の両方を必要とする患者の治療のためのものである。
【0050】
好ましい実施形態では、炎症性状態は、ウイルス感染症に関連する又はウイルス感染症によって引き起こされる不適切な（過度に興奮した又は調節解除された）又は慢性炎症反応の結果である。
【0051】
更なる実施形態では、ウイルス感染症に対する治療及び炎症性状態に対する治療の両方を必要とする患者の治療のための、本発明に従って投与される化合物、特にレファムリンの特定の使用が提供される。
【0052】
好ましい実施形態では、炎症性状態は、例えば急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む急性肺損傷（ＡＬＩ）、敗血症、及びサイトカインストームを含むサイトカイン放出症候群を含む、ウイルス感染症に関連する又はウイルス感染症によって引き起こされる免疫応答の過剰反応状態である。これらの状態では、免疫応答は調節解除されており、典型的には過度に興奮していると考えられる。
【0053】
特定の実施形態では、インフルエンザ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）又はＣＯＶＩＤ－１９などのウイルス感染症に関連する急性呼吸器症候群に罹患している患者を治療するための、本発明に従って投与される化合物、特にレファムリンの特定の使用が提供される。
【0054】
実験の結果（例６から１５）は、その抗菌活性に加えて、レファムリンがまた、様々なウイルスによって媒介される細胞傷害活性を積極的に減少させることを示す。この抗ウイルス効果は、一本鎖プラス鎖又はマイナス鎖ＲＮＡウイルスであることを特徴とするそのようなウイルスについて特に示された。抗ウイルス活性が、エンベロープ型ウイルス及び非エンベロープ型ウイルスの両方について、特にいくつかのエンベロープ型の一本鎖プラス鎖又はマイナス鎖ＲＮＡウイルス（コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）など）について示された。更に、麻疹ウイルスを含む調査されたウイルスのいくつかは、呼吸経路を含む伝染、特に空中伝染が知られている。コロナウイルス及び呼吸器合胞体ウイルスもまた、ヒトにおいて気道の感染を引き起こす。
【0055】
本発明の好ましい実施形態では、ウイルス感染症は、一本鎖プラス鎖又はマイナス鎖ＲＮＡウイルスによって媒介され、
好ましくは、ウイルスは、
－特にヒトコロナウイルスを含むコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、
－特に麻疹ウイルスなどのパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）を含むパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、及び呼吸器合胞体ウイルスなどのニューモウイルス科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）、
－特にインフルエンザウイルスを含むオルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、
－特にデングウイルス及びジカウイルスを含むフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、並びに
－特にライノウイルスを含むピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）
からなる群から選択される。
好ましくは、ウイルスは、
－特にヒトコロナウイルスを含むコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、
－特に麻疹ウイルスなどのパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）を含むパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、及び呼吸器合胞体ウイルスなどのニューモウイルス科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）、
－特にインフルエンザウイルスを含むオルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、
－特にデングウイルス及びジカウイルスを含むフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、並びに
－特にライノウイルスを含むピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）
からなる群から選択される。
【0056】
他の実施形態では、ウイルス感染症は空気感染性疾患である。空気感染性疾患は、空気によって伝染されるウイルスによって媒介される。
【0057】
ウイルス感染症は様々な臓器に影響を及ぼす可能性がある。本発明の好ましい実施形態では、疾患は、上気道及び下気道感染症、特に下気道感染症を含む呼吸器疾患である。
【0058】
本明細書で理解されるように治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）、治療（ｔｒｅａｔ）、又は治療すること（ｔｏ ｔｒｅａｔ）は、一方では、状態（炎症性疾患）がその終焉を迎えるように完全に治癒する（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｕｒｉｎｇ）、治癒（ｃｕｒａｔｉｏｎ）、又は治癒すること（ｔｏ ｃｕｒｅ）を含み、他方では、症状が少なくとも部分的に又は個別に軽減するように状態を改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）、改善、又は改善すること（ｔｏ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）も含む。
【0059】
治療は、典型的には、本発明に従って使用される化合物を、それを必要とする対象、例えば、一実施形態では、ウイルス感染症並びにウイルス感染症に関連する又はウイルス感染症によって引き起こされる炎症性状態の両方を有すると診断されている対象に投与することを含む。対象は、ウイルス感染症の早期症状及び炎症性状態の後期症状を含む病歴を有し得る、すなわち、ウイルス感染症が早期に診断され、炎症性状態が後に（同時に）診断される。したがって、好ましい実施形態では、本発明に従って使用するための化合物は、ウイルス感染症並びにウイルス感染症に関連する若しくはウイルス感染症によって引き起こされる炎症性状態の両方の症状を示すか、又は診断されている対象に投与される。
【0060】
予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、又は予防すること（ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ）は、状態が診断される前、又は状態の（全ての）疾患症状が発症する前に化合物を投与することを含む。
【0061】
例えば、本発明による予防は、対象がウイルスに感染したがウイルス感染症の症状を示さなかった場合（無症候性キャリア）、対象がウイルスに曝露された及び／又はウイルスに曝露されやすい、又は対象がウイルス感染症と診断されたがまだ炎症性状態ではない場合に考慮され得る。したがって、一実施形態では、式Ｉの化合物は、ウイルス感染症自体を治療し、ウイルスに関連する又はウイルスによって引き起こされる炎症性状態を予防するために投与される。
【0062】
本発明に従って投与される化合物、特にレファムリンの適切な投与量は、もちろん、例えば、個々の宿主、投与様式並びに処置される症状の性質及び重症度に応じて変化する。しかし、一般に、より大きな哺乳動物、例えばヒトにおける満足のいく結果のためには、示された１日投与量は、例えば１日に４回までの分割用量で好都合に投与される、本発明に従って使用される化合物の約０．５ｍｇ～３ｇの範囲にある。
【0063】
本発明に従って使用される化合物は、任意の従来の経路によって、例えば経鼻、頬側、経直腸、経口投与を含む例えば経腸的に、例えば静脈内、筋肉内、皮下投与を含む非経口的に、又は例えば肺、表皮、鼻腔内、気管内投与を含む局所的に、例えばコーティングされた若しくはコーティングされていない錠剤、カプセル、注射可能な溶液若しくは懸濁液の形態で、例えばアンプル、バイアルの形態で、軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、吸入剤粉末、フォーム、チンキ剤、リップスティック、ドロップ、スプレーの形態で、又は坐剤の形態で、例えば抗生物質剤トブラマイシン又はマクロライド、例えばエリスロマイシン、例えばクラリスロマイシン又はアジスロマイシンに類似した様式で投与することができる。
【0064】
好ましくは、本発明に従って使用される化合物は、吸入によって、静脈内若しくは皮下注射によって、又は経口的に投与される。
【0065】
注射用のレファムリンの好ましい医薬組成物は、国際公開第２０１６／２０２７８８号に開示されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0066】
本発明に従って使用される化合物、特にレファムリンは、薬学的に許容される塩、例えば酸付加塩の形態で、又は遊離形態で、場合により溶媒和物の形態で投与することができる。
【0067】
一実施形態では、化合物は塩及び／又は溶媒和物の形態である。
【0068】
本発明に従って使用される化合物の塩は、酸付加塩を含む。薬学的に許容される酸付加塩としては、本発明に従って使用される化合物と酸、例えば、フマル酸水素、フマル酸、酒石酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、マレイン酸、ナフタレン－１，５－スルホン酸、酢酸、リンゴ酸、乳酸、すなわちＬ－乳酸、コハク酸、サリチル酸、アゼライン酸、２－［（２，６－ジクロロフェニル）アミノ］ベンゼン酢酸、塩酸、重塩酸、好ましくは塩酸、酢酸、Ｌ－乳酸及びマレイン酸との塩が挙げられる。
【0069】
これらの中でも、レファムリンの場合、レファムリンの酢酸塩が特に好ましい。
【0070】
レファムリンの好ましい結晶形態及びレファムリンの結晶塩形態は、国際公開第２０１１／１４６９５４号に開示されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。これらのうち、国際公開第２０１１／１４６９５４号に開示されている結晶形態Ｂのレファムリンの酢酸塩が特に好ましい。
【0071】
本発明はまた、イタコン酸との酸付加塩としてのその形態のレファムリン、特にイタコン酸レファムリンを提供する。イタコン酸レファムリン、すなわちイタコン酸塩の形態の式ＶＩＩの化合物は、新規化合物（例３）として本明細書に開示されている。イタコン酸は脱プロトン化され、アニオンのイタコン酸水素及びイタコン酸イオンになることができる。カチオンとしてのレファムリン及びイタコン酸由来のアニオンを含む酸付加塩は、レファムリン及びイタコン酸の抗炎症効果を組み合わせる（例４）。
【0072】
好ましい実施形態では、本発明に従って使用される化合物は、レファムリン酢酸塩又はレファムリンイタコン酸塩としての形態のレファムリンである。
【0073】
本発明に従って使用される化合物、特にレファムリンは、単独で、又は１つ若しくは複数の他の薬学的に活性な薬剤と組み合わせて、本明細書で企図される薬学的治療に使用することができる。そのような他の薬学的に活性な薬剤としては、他の免疫調節剤、例えばグルココルチコイド、サイトカイン、インターフェロンなど、又は抗ウイルス剤が挙げられる。そのような抗ウイルス剤は、好ましくは、ヌクレオシド類似体及びヌクレオチド類似体並びにＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、例えば、レムデシビル又はリバビリン、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、例えば、ロピナビル又はリトナビル、ウイルスノイラミニダーゼ阻害剤、例えば、オセルタミビル、並びに抗ウイルス療法に使用される他の薬剤、例えば、ヒドロキシクロロキン、インターフェロン（インターフェロンアルファ及び／又はベータ）からなる群から選択することができる。
【0074】
組み合わせとしては、２つ以上の薬学的に活性な薬剤が同じ製剤中にある固定された組み合わせ、別々の製剤中の２つ以上の薬学的に活性な薬剤が、例えば同時投与のための説明書と共に同じパッケージで販売されるキット、及び薬学的に活性な薬剤が別々に包装されているが、同時投与又は逐次投与のための説明書が与えられている自由な組み合わせが挙げられる。
【0075】
別の実施形態では、本発明に従って使用される化合物、特にレファムリンは、ウイルス感染症並びにウイルス感染症に関連する若しくはウイルス感染症によって引き起こされる炎症性状態と診断されている患者に投与される唯一の活性薬剤である。すなわち患者は、ウイルス感染症及び炎症性状態の両方を治療及び／又は予防するためにただ１つの活性薬剤で治療される。
【0076】
本発明に従って使用される化合物、特にレファムリンを含む医薬組成物は、更に、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、例えば担体又は希釈剤、例えば充填剤、結合剤、崩壊剤、流動調整剤、潤滑剤、糖及び甘味料、香料、保存剤、安定剤、湿潤剤及び／又は乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩及び／又は緩衝剤を含むことができる。
【0077】
そのような医薬組成物は、例えば、従来の方法と同様に、例えば、混合、造粒、コーティング、溶解、噴霧乾燥、又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。単位剤形は、例えば、約０．５ｍｇ～約３０００ｍｇ、例えば、１０ｍｇ～約６００ｍｇを含有することができる。
【0078】
本発明によって企図される処置を必要とする対象は、細菌によって媒介されない炎症性疾患に罹患している任意の生きている対象であってもよい。対象は、ヒト又は動物であってもよい。
【0079】
例
本明細書では、例を含めて、以下の略語が使用される。
１Ｈ－ＮＭＲ プロトン核磁気共鳴分光法
℃ 摂氏
μＭ マイクロモル濃度
ＡＬＩ 急性肺損傷
ＡＲＤＳ 急性呼吸窮迫症候群
ＢＡＬＢ／ｃ 実験用マウス系統
ＢＡＬＦ 気管支肺胞洗浄液
ＢＣ－３７８１ レファムリン
ＣＣ 細胞対照
ＣＣＬ２ ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２
ＣｏＶ コロナウイルス
ＣＰＥ 細胞傷害活性、特にウイルス誘発性
ＣＸＣＬ１ ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１
ＣＸＣＬ２ ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド２
ＤＭＥＭ ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ｅｑ 当量
ＥＣ５０ 半数（５０％）効果濃度
ＦＢＳ ウシ胎仔血清
ＧＭ－ＣＳＦ 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ＨｅＬａ 不死性ヒト上皮細胞株
ＨＥｐ２ ヒト上皮細胞株
Ｈｕｈ７ ヒト肝細胞株
ＩＬ－１β インターロイキン１ベータ
ＩＬ－６ インターロイキン６（ＩＬ－６）
ＩＮ 鼻腔内
ＩＰ 腹腔内
ＬＰＳ リポ多糖
ＭＤＣＫ メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞
ＭＭＰ９ マトリックスメタロペプチダーゼ９
ＭＯＩ 感染多重度
ＭＲＣ－５ イギリス医学研究審議会細胞株５
Ｍ モル濃度
ＭＳ 質量分析
ｍ／ｚ 質量／電荷比
ＭＴＢＥ メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ｎｍ ナノメートル
ＰＢＳ リン酸緩衝液
ＰＯ 経口
ＳＣ 皮下
ＴＣ５０ 半数（５０％）毒性濃度
ＴＣＩＤ５０ ５０％（半数）組織培養感染量
ＴＮＦ－α 腫瘍壊死因子アルファ
ＶＣ ウイルスＣＰＥの減少
ＸＴＴ ２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキサニリド
本明細書では、例を含めて、以下の略語が使用される。
１Ｈ－ＮＭＲ プロトン核磁気共鳴分光法
℃ 摂氏
μＭ マイクロモル濃度
ＡＬＩ 急性肺損傷
ＡＲＤＳ 急性呼吸窮迫症候群
ＢＡＬＢ／ｃ 実験用マウス系統
ＢＡＬＦ 気管支肺胞洗浄液
ＢＣ－３７８１ レファムリン
ＣＣ 細胞対照
ＣＣＬ２ ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２
ＣｏＶ コロナウイルス
ＣＰＥ 細胞傷害活性、特にウイルス誘発性
ＣＸＣＬ１ ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１
ＣＸＣＬ２ ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド２
ＤＭＥＭ ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ｅｑ 当量
ＥＣ５０ 半数（５０％）効果濃度
ＦＢＳ ウシ胎仔血清
ＧＭ－ＣＳＦ 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ＨｅＬａ 不死性ヒト上皮細胞株
ＨＥｐ２ ヒト上皮細胞株
Ｈｕｈ７ ヒト肝細胞株
ＩＬ－１β インターロイキン１ベータ
ＩＬ－６ インターロイキン６（ＩＬ－６）
ＩＮ 鼻腔内
ＩＰ 腹腔内
ＬＰＳ リポ多糖
ＭＤＣＫ メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞
ＭＭＰ９ マトリックスメタロペプチダーゼ９
ＭＯＩ 感染多重度
ＭＲＣ－５ イギリス医学研究審議会細胞株５
Ｍ モル濃度
ＭＳ 質量分析
ｍ／ｚ 質量／電荷比
ＭＴＢＥ メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ｎｍ ナノメートル
ＰＢＳ リン酸緩衝液
ＰＯ 経口
ＳＣ 皮下
ＴＣ５０ 半数（５０％）毒性濃度
ＴＣＩＤ５０ ５０％（半数）組織培養感染量
ＴＮＦ－α 腫瘍壊死因子アルファ
ＶＣ ウイルスＣＰＥの減少
ＸＴＴ ２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキサニリド
【0080】
例１
目的：ＬＰＳ投与の４時間後にＢＡＬＦ中の総細胞数及び好中球数を決定することによって、ＬＰＳ誘発性肺好中球症のモデルにおいて、レファムリンの抗炎症効果を調べた。
目的：ＬＰＳ投与の４時間後にＢＡＬＦ中の総細胞数及び好中球数を決定することによって、ＬＰＳ誘発性肺好中球症のモデルにおいて、レファムリンの抗炎症効果を調べた。
【0081】
方法：それぞれ８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスからなる６群の動物を試験した。化合物レファムリンを、鼻腔内ＬＰＳ負荷の３０分前に投与した３５、７０及び１４０ｍｇ／ｋｇの皮下用量で試験した。既知の臨床的に使用される抗炎症薬である参照化合物デキサメタゾンを、０．５ｍｇ／ｋｇの用量でＬＰＳ負荷の１時間前に経口投与した。全てのマウスをＬＰＳ負荷前に麻酔し、ケタミン塩酸塩とキシラジン塩酸塩の混合物を腹腔内注射した。健常対照マウスに５０μＬの生理食塩水を投与し、他の全ての動物に５μｇの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＬＰＳ／５０μＬ生理食塩水を鼻腔内投与して、肺好中球増加症を誘導した。ＬＰＳ投与の約４時間後、過剰用量の麻酔薬をマウスに腹腔内投与して安楽死させた。気管切開術を行い、気管内に気管カテーテルをクランプした。肺を冷ＰＢＳで総体積１ｍＬ（０．４、０．３及び０．３ｍＬ）で３回洗浄した。回収したＢＡＬＦをエッペンドルフ試験管に入れ、卓上エッペンドルフ遠心機（５分／３５００ｒｐｍ／４℃）で遠心分離した。得られた細胞プラグをボルテックスによって６００μＬのＰＢＳに再懸濁した。ＢＡＬＦを、自動血液分析装置Ｓｙｓｍｅｘ ＸＴ－２０００ｉＶで総細胞数及び差次細胞数について直ちに分析した。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０４（米国カリフォルニア州ラホーヤのＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して行った。マン・ホイットニー検定を使用して群間差を決定し、Ｐ＜０．０５の場合に統計学的に有意であるとみなした。
【0082】
結果
鼻腔内ＬＰＳ負荷の４時間後のＢＡＬＦ分析（総細胞数及び好中球細胞数）の結果を図１～２に示す。ＬＰＳ負荷は、生理食塩水負荷対照と比較して、総細胞数及び好中球数の統計学的に有意な増加を誘導した。ＬＰＳ負荷動物と比較して、負荷の１時間前に参照物質デキサメタゾンＰＯで前処置したマウスは、ＢＡＬＦ中の総細胞数及び好中球細胞数の両方の統計学的に有意な減少を示した。用量依存的様式で、指示された用量でレファムリンで処置した全ての群において、総細胞数及び好中球細胞数の統計学的に有意な減少もあった（リポ多糖負荷に対してｐ＜０．０５）。細胞流入のほぼ完全な障害が１４０ｍｇ／ｋｇの最高用量で観察された。ＢＡＬＦ細胞数のレファムリンに関連する減少は、全てのレファムリン用量で、既知の抗炎症薬である基準物質デキサメタゾンでの処置後に見られるものと同等であった。注目すべきことに、１日あたり７０ｍｇ／ｋｇのレファムリンのＳＣへの曝露は、細菌性肺炎の治療のために２×６００ｍｇ経口又は２×１５０ｍｇ静脈内の承認された臨床１日用量を投与した場合にヒトにおいて達成される曝露に対応する。
鼻腔内ＬＰＳ負荷の４時間後のＢＡＬＦ分析（総細胞数及び好中球細胞数）の結果を図１～２に示す。ＬＰＳ負荷は、生理食塩水負荷対照と比較して、総細胞数及び好中球数の統計学的に有意な増加を誘導した。ＬＰＳ負荷動物と比較して、負荷の１時間前に参照物質デキサメタゾンＰＯで前処置したマウスは、ＢＡＬＦ中の総細胞数及び好中球細胞数の両方の統計学的に有意な減少を示した。用量依存的様式で、指示された用量でレファムリンで処置した全ての群において、総細胞数及び好中球細胞数の統計学的に有意な減少もあった（リポ多糖負荷に対してｐ＜０．０５）。細胞流入のほぼ完全な障害が１４０ｍｇ／ｋｇの最高用量で観察された。ＢＡＬＦ細胞数のレファムリンに関連する減少は、全てのレファムリン用量で、既知の抗炎症薬である基準物質デキサメタゾンでの処置後に見られるものと同等であった。注目すべきことに、１日あたり７０ｍｇ／ｋｇのレファムリンのＳＣへの曝露は、細菌性肺炎の治療のために２×６００ｍｇ経口又は２×１５０ｍｇ静脈内の承認された臨床１日用量を投与した場合にヒトにおいて達成される曝露に対応する。
【0083】
ＡＲＤＳの初期段階では、肺胞上皮及び内皮バリアの破壊を伴う広範囲の好中球性肺胞炎があり、これは間質及び肺胞腔におけるタンパク質に富む浮腫の形成をもたらす好中球肺浸潤の阻害は有益である可能性がある（Ｍａｔｔｈａｙ，Ｗａｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２２（８）：２７３１－２７４０）。
【0084】
例２
目的：上記に匹敵する第２の試験では、ＢＡＬＦ中の細胞数の決定に加えてサイトカイン及びケモカイン濃度の評価を含む、マウスのＬＰＳ誘発性肺好中球症モデルにおいて、１０、３０及び１００ｍｇ／ｋｇの用量のレファムリンの活性を更に調査し、バルネムリンと比較した。
目的：上記に匹敵する第２の試験では、ＢＡＬＦ中の細胞数の決定に加えてサイトカイン及びケモカイン濃度の評価を含む、マウスのＬＰＳ誘発性肺好中球症モデルにおいて、１０、３０及び１００ｍｇ／ｋｇの用量のレファムリンの活性を更に調査し、バルネムリンと比較した。
【0085】
方法：鼻腔内（ＩＮ）ＬＰＳ投与の前に、ケタミンとキシラジンの組み合わせを用いてマウスを腹腔内（ＩＰ）麻酔した。ＩＮ点滴注入のために、マウスを、（約１分間の）点滴注入の期間中及び期間後に頭を足の上に６０度～７５度まで上げて、傾けた仰臥位で保持した。負荷は、５０μＬの生理食塩水／マウス中の５μｇのＬＰＳによる処置の３０分後に行った。非負荷対照マウスに５０μＬの生理食塩水を与えた。群の大きさは、１群あたり８匹の動物であった。
【0086】
ＬＰＳ負荷の３０分前に、１ｍｇ／ｋｇの参照化合物デキサメタゾン（陽性対照）を腹腔内（ＩＰ）投与した。デキサメタゾンを水中０．５％メチルセルロースに溶解した。投与量は１０ｍＬ／ｋｇであった。１０、３０、又は１００ｍｇ／ｋｇのレファムリン又はバルネムリンを、ＬＰＳ負荷の３０分前に、肩の間に皮下（ＳＣ）投与した。レファムリン及びバルネムリンを０．９％生理食塩水に溶解した。０．９％生理食塩水を溶媒対照として使用した。投与量は１０ｍＬ／ｋｇであった。ＬＰＳ負荷の４時間後、マウスをケタミン（２００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１６ｍｇ／ｋｇ）の過剰投与によって屠殺し、その後、ＢＡＬＦ及び肺組織をサンプリングした。
【0087】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を回収するために、カニューレを気管に挿入し、その後、肺を３体積のＰＢＳ（０．４、０．３及び０．３ｍＬ、合計１ｍＬ）で洗浄した。回収したＢＡＬＦをエッペンドルフ試験管に入れ、卓上エッペンドルフ遠心機（５分／１３０３ｘｇ／４℃）で遠心分離し、ボルテックス上で閉じたチューブ内容物を振盪することによって細胞のプラグを６００μＬのＰＢＳに再懸濁した。再懸濁したＢＡＬ細胞を、自動血液分析装置Ｓｙｓｍｅｘ ＸＴ－２０００ｉＶで総細胞数及び差次細胞数について直ちに分析した。
【0088】
特定のマーカーを決定するために、肺組織試料を採取した。肺を露出させ、胸部を穏やかに開き、胸骨及び肋骨の両側を切断し、後ろをトリミングすることによって切除した。肺を取り出し、予め秤量した滅菌Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓに入れた。サンプリング後、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ試験管をもう一度秤量し、急速凍結し、分析まで－８０℃に置いた。組織をホモジナイズした。
【0089】
ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの濃度は、製造業者のプロトコル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってＭｏｕｓｅ Ｐｒｅｍｉｘｅｄ Ｍｕｌｔｉ－Ａｎａｌｙｔｅ Ｋｉｔを使用して決定した。標準希釈系列及び試料を並行して調製し、ビオチン抗体カクテルと共にインキュベートした。濃度は、それぞれのストレプトアビジン－フィコエリトリンコンジュゲートを使用して決定し、Ｌｕｍｉｎｅｘ２００装置で読み取った。これらのマーカーの濃度を、ＸＰＯＮＥＮＴソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）による標準曲線からの補間によって決定した。測定値（ＭＦＩ）をブランク補正し、標準曲線適合５パラメータロジスティックを用いた。
【0090】
ＭＭＰ－９及びＩＬ－１βの分析のために、マウスの全肺を－８０℃から解凍し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ ＣＫ２８硬組織チューブ中のプロテアーゼ阻害剤を補充した１ｍＬのＰＢＳ中で、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ機器及びプログラムを使用してホモジナイズし、１５秒間の休止を伴って６８００ｒｐｍで３０秒間振盪し、３回繰り返した。均質化後、試料を１８０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、分析のために上清を回収した。ＭＭＰ－９及びＩＬ－１βの濃度は、製造業者のプロトコル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってＭｏｕｓｅ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットを使用して決定した。標準的な希釈系列及び試料を、ＭＭＰ－９又はＩＬ－１β捕捉抗体を用いて調製したプレートを用いて並行して処置した。それぞれの検出抗体及び読み出し用試薬を用いて濃度を決定した。吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３機器を使用して４５０ｎｍで測定した。試料中のＭＭＰ９及びＩＬ－１βの濃度を、標準曲線からの補間によって決定した。
【0091】
統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８．１．１）を使用して行った。異常値は、Ｇｒｕｂｂｓ試験を用いて同定した。総細胞数及び差次的細胞数、並びにマーカー濃度の評価のために、ノンパラメトリック統計学（マン・ホイットニー検定）を行った。溶媒群に対する処置群間の差をｐ＜０．０５で統計学的に有意であるとみなした。
【0092】
結果
ＢＡＬＦ分析（細胞数）の結果を図３Ａ～３Ｄに示す。ＬＰＳ負荷は、生理食塩水負荷対照と比較して、総細胞数及び好中球数の有意な増加を誘導した。１０、３０、又は１００ｍｇ／ｋｇのレファムリンによる皮下前処置は、ＢＡＬＦ中の総細胞数を用量依存的に減少させた（図３Ａ）。変化は、１００ｍｇ／ｋｇで統計学的に有意である（ｐ＜０．０５）。以前の試験の結果のように、効果は抗炎症薬デキサメタゾン（陽性対照）に匹敵した。調べた全ての濃度のレファムリンの用量依存的かつ有意な減少が好中球細胞で観察された（図３Ｂ）。対照的に、マクロファージ及びリンパ球の細胞数は、レファムリン又はバルネムリンによって有意に影響されなかった（図３Ｃ及び３Ｄ）。
ＢＡＬＦ分析（細胞数）の結果を図３Ａ～３Ｄに示す。ＬＰＳ負荷は、生理食塩水負荷対照と比較して、総細胞数及び好中球数の有意な増加を誘導した。１０、３０、又は１００ｍｇ／ｋｇのレファムリンによる皮下前処置は、ＢＡＬＦ中の総細胞数を用量依存的に減少させた（図３Ａ）。変化は、１００ｍｇ／ｋｇで統計学的に有意である（ｐ＜０．０５）。以前の試験の結果のように、効果は抗炎症薬デキサメタゾン（陽性対照）に匹敵した。調べた全ての濃度のレファムリンの用量依存的かつ有意な減少が好中球細胞で観察された（図３Ｂ）。対照的に、マクロファージ及びリンパ球の細胞数は、レファムリン又はバルネムリンによって有意に影響されなかった（図３Ｃ及び３Ｄ）。
【0093】
炎症促進性サイトカインである腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターロイキン６（ＩＬ－６）及びインターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）は、生理食塩水対照と比較して、マウスモデルにおけるＬＰＳ負荷後の肺ホモジネートにおいて増加している（図４Ａ～図４Ｃ）。１０、３０、又は１００ｍｇ／ｋｇのレファムリンによる皮下前処置は、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６レベルを５０％以上低下させた（図４Ａ及び図４Ｂ）が、バルネムリンは、同じ用量と比較した場合、活性が低かった。１００ｍｇ／ｋｇのレファムリンによるＩＬ－１β皮下前処置では、肺ホモジネート中のＩＬ－１βレベルが２４％有意に低下した（図４Ｃ）。
【0094】
細胞遊走に影響を及ぼすことが知られているサイトカインである顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）がＬＰＳ誘発性マウスモデルにおいて増加した（図４Ｄ）。レファムリンは、肺ホモジネート中のＧＭ－ＣＳＦをほぼ完全に阻害した。バルネムリンはまた、ＧＭ－ＣＳＦレベルの低下を示したが、試験した全ての用量でレファムリンよりも活性が低かった（図４Ｄ）。
【0095】
ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）、（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＸＣＬ２）及び（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）の濃度は、生理食塩水対照と比較して、マウスモデルにおけるＬＰＳ負荷後の肺ホモジネートにおいて増加した（図４Ｅ～図４Ｇ）。ＣＸＣＬ１及びＣＸＣＬ２の両方のレベルは、１０、３０、又は１００ｍｇ／ｋｇのレファムリンによる皮下前処置によって有意に低下した（図４Ｅ及び図４Ｆ）。１０及び３０ｍｇ／ｋｇのより低い用量のバルネムリンは、レファムリンと比較して、ＣＸＣＬ１及びＣＸＣＬ２に対する効果が低かった。肺ホモジネート中のＬＰＳ誘発性ＣＣＬ２増加は、検討した全ての用量のレファムリンで完全に阻害されたが、バルネムリンは特に１０及び３０ｍｇ／ｋｇの用量では活性が低かった（図４Ｇ）。
【0096】
好中球遊走の調節因子であるマトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）は、ＬＰＳ誘発性マウスモデルにおいて増加した（図４Ｈ）。３０又は１００ｍｇ／ｋｇのレファムリンによる皮下前処置は、肺ホモジネート中のＭＭＰ９レベルをそれぞれ２６又は５３％低下させたが、１０ｍｇ／ｋｇではＭＭＰ９濃度を変化させなかった。バルネムリンは、調査した最高用量の１００ｍｇ／ｋｇでのみＭＭＰ９濃度を５０％低下させた（図４Ｈ）。
【0097】
結論として、この試験は、肺への好中球浸潤の阻害、並びに肺におけるサイトカイン及びケモカインレベルなどの炎症（促進性）因子の減少によって、マウスのＬＰＳ誘発性肺好中球症モデルにおけるレファムリンの抗炎症特性を実証した。
【0098】
このモデルにおけるレファムリンの阻害能は、臨床的に適切な用量で、調査されたパラメータのほとんどで、確立された抗炎症薬デキサメタゾン（陽性対照）と同程度の大きさである。同じ用量のバルネムリンと比較すると、驚くべきことに、ほとんどの炎症（促進性）マーカーについて、レファムリンはバルネムリンよりも強力な阻害剤であることが示された。
【0099】
ＬＰＳ投与は、好中球浸潤及び肺内サイトカインの増加を含む、ＡＲＤＳ又はＡＬＩで見られるものと同様の病理学的及び生物学的変化を誘導することができ、これらは急性肺損傷の実験モデルで広く試験されている（Ｍａｔｕｔｅ－Ｂｅｌｌｏ Ｇｕｓｔａｖｏ ｅｔ ａｌ．２００８，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９５：Ｌ３７９－３９９）。更に、試験は、肺への好中球動員の増加が、特に慢性疾患又はＡＲＤＳにおいて組織損傷に寄与し得ることを示唆している（Ｇｉａｃａｌｏｎｅ，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｄ ｅｔ ａｌ．２０２０，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２１（３）：８５１）。
【0100】
記載された好中球性炎症のマウスモデルにおいて低用量のレファムリン（例えば、１０～３０ｍｇ／ｋｇ）で既に観察された堅牢な抗炎症効果は、レファムリンがＬＰＳ誘発性炎症促進性シグナル伝達を阻害して好中球蓄積を減少させるか、又は肺へのＬＰＳ誘発性好中球浸潤を阻害してサイトカイン及びケモカインのレベルを減少させることを示唆している。両方の潜在的な機構は、レファムリン前処置後にインビボで観察される用量依存性抗炎症効果と一致する。
【0101】
例３
目的：この例は、カチオンとしてプロトン化形態のレファムリン及びジカルボキシイタコン酸から誘導されるアニオンとしてイタコン酸イオンを含む潜在的な新しい医薬品有効成分としてのイタコン酸レファムリンの合成を目的とする。
目的：この例は、カチオンとしてプロトン化形態のレファムリン及びジカルボキシイタコン酸から誘導されるアニオンとしてイタコン酸イオンを含む潜在的な新しい医薬品有効成分としてのイタコン酸レファムリンの合成を目的とする。
【0102】
方法及び結果
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の遊離塩基としてのレファムリン（１ｇ、１当量）の溶液に、イタコン酸（０．５当量）を添加し、室温で一晩撹拌した。得られた反応混合物をＭＴＢＥに滴加した。得られた沈殿物を濾過し、ＭＴＢＥで洗浄し、減圧下で乾燥させて、無色固体の形態のイタコン酸レファムリン（１．２０ｇ）を得た。
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の遊離塩基としてのレファムリン（１ｇ、１当量）の溶液に、イタコン酸（０．５当量）を添加し、室温で一晩撹拌した。得られた反応混合物をＭＴＢＥに滴加した。得られた沈殿物を濾過し、ＭＴＢＥで洗浄し、減圧下で乾燥させて、無色固体の形態のイタコン酸レファムリン（１．２０ｇ）を得た。
【数1】
【0103】
例４
目的：例１と同様にＬＰＳ誘発性肺好中球症の別の改変モデルにおいて、様々なレファムリン塩の抗炎症効果を、ＬＰＳ負荷の２４時間後に読み出して調査した。
目的：例１と同様にＬＰＳ誘発性肺好中球症の別の改変モデルにおいて、様々なレファムリン塩の抗炎症効果を、ＬＰＳ負荷の２４時間後に読み出して調査した。
【0104】
方法：試験化合物の水溶液を、鼻腔内ＬＰＳ負荷の３０分前に単回皮下用量として投与した（５μｇ／動物）。ＬＰＳ負荷の直前に、ケタミン（２ｍｇ／マウス）及びキシラジン（０．０８ｍｇ／マウス）の腹腔内（ＩＰ）注射によってマウス群（ｎ＝６）を麻酔した。肺好中球増加症を誘導するために、対照群のマウスに５０μＬの生理食塩水を投与し、他の全ての動物に５μｇのＬＰＳ／５０μＬ生理食塩水を鼻腔内投与した。対照として、生理食塩水（０．８６％ＮａＣｌ）をＬＰＳ負荷に対する陰性対照として鼻腔内に投与した。レファムリンをその酢酸塩の形態（Ｌｅｆ．Ａｃ）及びそのイタコン酸塩の形態（Ｌｅｆ．Ｉｔａｃｏｎ、上記の例３のように合成した）で調査し、両方とも７０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。比較のために、イタコン酸ナトリウム（Ｎａ．Ｉｔａｃｏｎ）を５５ｍｇ／ｋｇの用量で調査した。未処置対照には生理食塩水（０．８６％ＮａＣｌ）の皮下注射を行った。
【0105】
ＢＡＬＦ中の総細胞数及び顆粒球細胞数を、例１と同様に鼻腔内ＬＰＳ負荷の２４時間後に決定した。
【0106】
結果
ＢＡＬＦ分析の結果（細胞数）を図５に示す。酢酸レファムリンは、以前の試験（例１及び２）で示された効果に匹敵する細胞数の減少を示した。イタコン酸ナトリウム自体は、ＢＡＬＦ細胞数のいくらかの減少を既に示した。
ＢＡＬＦ分析の結果（細胞数）を図５に示す。酢酸レファムリンは、以前の試験（例１及び２）で示された効果に匹敵する細胞数の減少を示した。イタコン酸ナトリウム自体は、ＢＡＬＦ細胞数のいくらかの減少を既に示した。
【0107】
免疫調節薬としてのイタコン酸及び誘導体の特性は以前に記載されている（Ｙｕ Ｘｉａ－Ｈｕａ ｅｔ ａｌ．２０１９，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＆Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９７：１３４－１４１）。例えば、イタコン酸のエステル誘導体（イタコン酸４－オクチル）は、ＬＰＳ誘発性敗血症モデルにおいて保護効果を示した（Ｌｉａｏ，Ｓｈａｎ－Ｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｎａｔ Ｃｏｍｍ １０（１）；５０９１）。
【0108】
レファムリンのイタコン酸塩は、酢酸レファムリン又はイタコン酸ナトリウム単独と比較して、細胞数に対して最も顕著な効果を示した。この試験では、イタコン酸レファムリン処置は、最も低い総細胞数及び顆粒球細胞数をもたらし、したがって、レファムリンのイタコン酸形態の興味深い相乗効果又は相加効果を示唆している。
【0109】
例５
目的：インビボインフルエンザウイルスモデルにおいて、レファムリンの効果を調査した。インフルエンザウイルスモデルでは、マウスに適合させたインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）株をマウスに負荷した。マウス免疫系は、インフルエンザのマウスウイルス感染症モデルにおいてウイルス誘発性免疫応答に対する効果を試験するのに特に適している。
目的：インビボインフルエンザウイルスモデルにおいて、レファムリンの効果を調査した。インフルエンザウイルスモデルでは、マウスに適合させたインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）株をマウスに負荷した。マウス免疫系は、インフルエンザのマウスウイルス感染症モデルにおいてウイルス誘発性免疫応答に対する効果を試験するのに特に適している。
【0110】
方法：成体雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを１５匹の動物の３つの実験群に無作為に割り当て、１週間順化させた。処置は、－１日目に皮下投与して開始した。陰性対照群には、１日２回投与される溶媒を投与した。様々な投与量でレファムリンを調査した。低用量療法では、３５ｍｇ／ｋｇのレファムリンを－１日目から６日目まで１日２回（７０ｍｇ／ｋｇ／日の用量に相当）投与した。高用量療法では、レファムリンを１０５／ｍｇ／ｋｇ／日の用量で３回の注射で３日目まで投与し、注射部位での投与の問題のため３日目から変更した。以下の用量は、７０ｍｇ／ｋｇを１日２回投与した（１４０ｍｇ／ｋｇ／日に相当）。０日目に、全ての群にインフルエンザＡ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を負荷した。
【0111】
試験中、異常な毛の状態（立毛）、異常な姿勢（しゃがみ）、異常な呼吸（頻呼吸及び／又は不規則な呼吸数）、運動性の低下、眼脂、閉眼及び／又は生存を含む、動物をインフルエンザウイルス感染の臨床徴候について毎日スコア化した。疾患の重症度の徴候をスコアリングシステムに追加し、５の最大可能スコアを得た。臨床徴候が重度であると判断された場合、試験の予定された終了前に個々の動物を試験から離脱させた。
【0112】
６日目に、肺組織を解剖し、肉眼的病変について評価し、固定液中に保存し、組織病理について保存した。
【0113】
肉眼的評価後、肺硬化を以下の、肺胞内の浮腫／出血が占める視野の５０％超（全ての肺葉にわたる）、広範な血管変性のように評価した。６日目に取り出して固定した肺を組織病理学において顕微鏡で評価した。４つの主な読み出しを評価し（気管支／気管支変性／過形成、気管支間質性炎症、肺胞上皮炎／変性、肺胞上皮／出血）、スコア化して、１６の最大総組織病理スコアを得たが、数字が小さいほど、組織病理学的異常の徴候が少ないことを示す。
【0114】
肺試料も３日目及び６日目のウイルス力価のために処置し、保存した。３日目及び６日目に、肺を回収し、ホモジナイズし、清澄化して、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を用いたＴＣＩＤ５０アッセイによってウイルス量を決定した。
【0115】
３日目及び６日目に、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）試料を回収し、以下に詳述する抗体パネルを使用して免疫細胞成分のフローサイトメトリー分析のために細胞を処置した。フローサイトメトリー計数ビーズを使用して絶対細胞数を計数した。細胞を生存可能な単一事象からゲーティングした。免疫細胞サブセットに対する試験処置の効果を以下のマーカーＣＤ４５、ＴＣＲβ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６Ｇ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４９ｂ、Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ、ＣＤ６４及びｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅから分析した。３日目のオセルタミビル処置群のフローサイトメトリーデータは、処置エラーのため収集されなかった。
【0116】
結果
臨床モニタリングの結果を図６Ａ～図６Ｄに示す。オセルタミビルによる陽性対照処置は予想通りに機能した。オセルタミビルについて、臨床スコア及び体重減少の減少が観察された。レファムリンは、調査した用量で体重に有意な影響を及ぼさなかった（図６Ａ）。高用量では、レファムリンは、溶媒と比較して臨床スコアの増加及び生存率の低下をもたらし、これは、調査された用量、濃度及び製剤の局所耐容性（ＳＣ）問題に関連する可能性がある（図６Ｂ及び図６Ｃ）。より低用量のレファムリンでは、９０％の生存が達成されたが、溶媒群の２０％のみが６日目まで生存した（図６Ｃ）。
臨床モニタリングの結果を図６Ａ～図６Ｄに示す。オセルタミビルによる陽性対照処置は予想通りに機能した。オセルタミビルについて、臨床スコア及び体重減少の減少が観察された。レファムリンは、調査した用量で体重に有意な影響を及ぼさなかった（図６Ａ）。高用量では、レファムリンは、溶媒と比較して臨床スコアの増加及び生存率の低下をもたらし、これは、調査された用量、濃度及び製剤の局所耐容性（ＳＣ）問題に関連する可能性がある（図６Ｂ及び図６Ｃ）。より低用量のレファムリンでは、９０％の生存が達成されたが、溶媒群の２０％のみが６日目まで生存した（図６Ｃ）。
【0117】
更に、肉眼的に評価した肺硬化の有意な改善が低用量のレファムリンで観察された。組織病理学において、試験した標本内で、全体的な個々の動物スコアの範囲（４～１３の範囲）が明らかになった（図６Ｄ）。病変は、文献に記載されているものと同様であった。肺胞病態の程度／分布領域の増加は、細気管支の変性／増殖、気管支間質性炎症及び肺胞の浮腫／出血の増加と相関していた。高用量のレファムリンによる処置は、気管支変性及び肺胞炎症の有意な減少をもたらし、その結果、溶媒処置対照と比較してこの群では組織病理スコアの全体的に有意な減少をもたらし、オセルタミビルに匹敵した。
【0118】
肺のウイルス力価は、３日目と６日目の間に全ての群で減少した（図７）。レファムリンとオセルタミビルの両方の用量では、溶媒処置対照と比較して肺ウイルス力価が低下した。
【0119】
ＢＡＬＦのフローサイトメトリーの結果を図８Ａ～図８Ｅに示す。ＢＡＬＦ中の全免疫細胞数は、全ての試験群で３日目から６日目まで増加し（図８Ａ）、肺組織の炎症及び細胞変性を引き起こす進行性ウイルス感染症によって誘導される予想される免疫細胞浸潤を確認した。レファムリンは、試験した両用量で６日目までに肺における全免疫細胞浸潤を有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。図８Ｂ～図８Ｅは、３日目及び６日目の特定の免疫細胞サブセットの細胞数を示す。レファムリンは、６日目までに試験した両用量で好中球浸潤を有意に減少させた（図８Ｃ）。より高い用量で投与した場合、レファムリンは、Ｈ１Ｎ１負荷後６日目に肺における炎症性単球浸潤を有意に減少させた（図８Ｃ）。肺におけるＮＫ、ＣＤ４及びＣＤ８細胞の浸潤は、試験した両用量で６日目に減少した（図８Ｅ）。Ｂ細胞の減少は、６日目の最高用量でのみ有意であった（図８Ｅ）。
【0120】
ＢＡＬＦの結果により、ウイルス疾患モデルとの関連においても、特に肺への好中球浸潤に対するレファムリンの免疫調節効果が確認された。臨床的読み出し及び肺ウイルス力価に対する減少効果は、ウイルス性疾患の治療におけるレファムリンの可能性を更に支持している。
【0121】
例６
目的：アッセイでは、様々な濃度のレファムリン（ＢＣ－３７８１）による、アルファコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ又はＣｏＶ２２９Ｅ）感染６日後のＭＲＣ－５細胞において、ウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
目的：アッセイでは、様々な濃度のレファムリン（ＢＣ－３７８１）による、アルファコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ又はＣｏＶ２２９Ｅ）感染６日後のＭＲＣ－５細胞において、ウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
【0122】
方法：ＭＲＣ－５細胞を９６ウェル平底組織培養プレートに播種し（ウェルあたり３×１０３細胞の密度で）、一晩接着させた。その後、ＤＭＳＯに溶解した希釈試験化合物（酢酸塩としてのレファムリン、フマル酸塩としてのチアムリン）をプレートに添加し、ウイルスを添加する前に４時間インキュベートした。ウイルスを所定の力価に希釈して添加すると、感染後６日で８５～９５％の細胞死滅が得られた（ＭＯＩは０．００１）。
【0123】
３７℃及び５％ＣＯ２で６日間インキュベートした後、ＸＴＴテトラゾリウム色素染色によって細胞生存率を測定した。細胞培養プレートの光学密度を、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍで分光光度的に決定した。ウイルス感染細胞の減少パーセント及び非感染薬物対照ウェルの細胞生存パーセントを計算して、４パラメータカーブフィット分析を使用して、細胞傷害活性の５０％が阻害される有効濃度（ＥＣ５０）及び細胞毒性濃度（ＴＣ５０）を決定した。抗ウイルス化合物レムデシビルは陽性対照としての役割を果たした。
【0124】
結果
驚くべきことに、レファムリンは、細胞対照の生存率に細胞毒性効果を及ぼさない濃度である１０μＭの濃度でウイルスＣＰＥを９１．８２％減少させた。計算されたＥＣ５０は３．８７μＭであり、５０％のウイルス細胞傷害活性が阻害された。５０μＭのレファムリン濃度で、レファムリンは細胞毒性効果を示し、算出されたＴＣ５０は５５．３μＭであった。治療指数としても知られるＥＣ５０とＴＣ５０の比は１４．３であった。
驚くべきことに、レファムリンは、細胞対照の生存率に細胞毒性効果を及ぼさない濃度である１０μＭの濃度でウイルスＣＰＥを９１．８２％減少させた。計算されたＥＣ５０は３．８７μＭであり、５０％のウイルス細胞傷害活性が阻害された。５０μＭのレファムリン濃度で、レファムリンは細胞毒性効果を示し、算出されたＴＣ５０は５５．３μＭであった。治療指数としても知られるＥＣ５０とＴＣ５０の比は１４．３であった。
【0125】
対照的に、１０μＭの濃度のチアムリンは、ウイルスＣＰＥを１０．５３％しか低下させず、細胞毒性効果は観察されなかった。次に高い試験濃度である５０μＭでは、ＣＰＥは８１．６８％減少し、細胞毒性効果が観察された。計算されたＥＣ５０は２４．４μＭであり、計算されたＴＣ５０は６２．９μＭであった。チアムリンの治療指数は２．５８であり、驚くべきことに、レファムリンの治療指数よりもはるかに低かった。
【0126】
抗ウイルス化合物レムデシビルは、エボラウイルスの治療薬として開発されたものであり、コロナウイルスに対しても抗ウイルス活性を有することが知られている（臨床試験中）。したがって、レムデシビルは、本明細書において陽性対照としての役割を果たした。レムデシビルは、０．１１μＭのＥＣ５０、５超のＴＣ５０及び４５．５超の治療指数を示した。
【表1】
【0127】
結果を図９Ａ（レファムリン）、９Ｂ（チアムリン）及び９Ｃ（レムデシビル）にグラフで示す（ＶＣはウイルスＣＰＥの減少、ＣＣは細胞対照）。
【0128】
例７
目的：アッセイでは、様々な処置条件でのレファムリンに対する、アルファコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ又はＣｏＶ２２９Ｅ）感染後のＭＲＣ－５細胞において、ウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
目的：アッセイでは、様々な処置条件でのレファムリンに対する、アルファコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ又はＣｏＶ２２９Ｅ）感染後のＭＲＣ－５細胞において、ウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
【0129】
方法：試験候補に関して以下の違いを伴って、上記の例６と同様にアッセイを行った。ウイルス添加前の４時間、１時間又は０時間のインキュベーション及び感染１時間後の添加という異なる処置条件を用いて、レファムリン（酢酸塩として）を評価した。この特定の一連の実験では、コロナウイルスをアッセイ培地で１：２００に希釈し、１００μＬ／ウェルで添加して、未処置のウイルス対照ウェルで約９０％の細胞死滅を達成した（ＭＯＩは０．００１）。
【0130】
結果
抗ウイルス効果及び細胞毒性データを以下の表に要約する。レファムリンは、ウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）の阻害に対して時間依存的効果を示した。ウイルス曝露後（感染後１時間）の処置設定では、用量依存的効果が観察された。５０μＭの濃度で、ウイルスＣＰＥは８６．８３％低下した（データは詳細に示さず）。
抗ウイルス効果及び細胞毒性データを以下の表に要約する。レファムリンは、ウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）の阻害に対して時間依存的効果を示した。ウイルス曝露後（感染後１時間）の処置設定では、用量依存的効果が観察された。５０μＭの濃度で、ウイルスＣＰＥは８６．８３％低下した（データは詳細に示さず）。
【表2】
【0131】
例８
目的：このアッセイでは、様々な濃度のレファムリン（ＢＣ－３７８１）による、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶＡ２株）複製感染６日後のＨＥｐ２細胞において、ウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び胞生存率の阻害を測定した。
目的：このアッセイでは、様々な濃度のレファムリン（ＢＣ－３７８１）による、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶＡ２株）複製感染６日後のＨＥｐ２細胞において、ウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び胞生存率の阻害を測定した。
【0132】
方法：ＨＥｐ２細胞を９６ウェル平底組織培養プレートに播種し（ウェルあたり５×１０３細胞の密度で）、一晩接着させた。その後、ＤＭＳＯ中の希釈試験化合物（酢酸塩としてのレファムリン、フマル酸塩としてのチアムリン）をプレートに添加し、ウイルスを添加する前に４時間インキュベートした。ウイルスを所定の力価に希釈して添加すると、感染後６日で８５～９５％の細胞死滅が得られた（ＭＯＩは０．００１）。
【0133】
３７℃及び５％ＣＯ２で６日間インキュベートした後、ＸＴＴテトラゾリウム色素染色によって細胞生存率を測定した。細胞培養プレートの光学密度を、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍで分光光度的に決定した。ウイルス感染細胞の減少パーセント及び非感染薬物対照ウェルの細胞生存パーセントを計算して、４パラメータカーブフィット分析を使用して、細胞傷害活性の５０％が阻害される有効濃度（ＥＣ５０）及び細胞毒性濃度（ＴＣ５０）を決定した。抗ウイルス化合物ＴＭＣ３５３１２１（ＲＳＶ融合阻害剤）を陽性対照とした。
【0134】
結果
驚くべきことに、レファムリンは、細胞対照の生存率に対して細胞毒性効果を何ら有しない濃度である１０μＭ及び５０μＭの濃度で、ウイルスの細胞傷害活性（ＣＰＥ）をそれぞれ９２．１７％及び１００％低下させた。計算されたＥＣ５０は５．３４μＭであり、５０％のウイルスＣＰＥが阻害された。１００μＭのレファムリン濃度で、レファムリンは細胞毒性効果を示し、算出されたＴＣ５０は７０．７μＭであった。治療指数としても知られるＥＣ５０とＴＣ５０の比は１３．２であった。
驚くべきことに、レファムリンは、細胞対照の生存率に対して細胞毒性効果を何ら有しない濃度である１０μＭ及び５０μＭの濃度で、ウイルスの細胞傷害活性（ＣＰＥ）をそれぞれ９２．１７％及び１００％低下させた。計算されたＥＣ５０は５．３４μＭであり、５０％のウイルスＣＰＥが阻害された。１００μＭのレファムリン濃度で、レファムリンは細胞毒性効果を示し、算出されたＴＣ５０は７０．７μＭであった。治療指数としても知られるＥＣ５０とＴＣ５０の比は１３．２であった。
【0135】
対照的に、１０μＭの濃度のチアムリンは、ウイルスＣＰＥを１６．７６％しか低下させず、この濃度で細胞毒性効果（８４％生存率）が観察された。次に高い試験濃度である５０μＭでは、ウイルスＣＰＥは４３．２８％減少し、細胞毒性効果はより顕著であった（生存率７０．０％）。計算されたＥＣ５０は、６７．９μＭの計算されたＴＣ５０よりも高く、６７．９μＭ超であった。したがって、チアムリンの治療指数を計算することができなかった。驚くべきことに、抗ウイルス活性及び治療指数は、チアムリンよりもレファムリンの方がはるかに高かった。
【0136】
抗ウイルス化合物ＴＭＣ３５３１２１は、特異的な呼吸器合胞体ウイルス融合阻害剤として開発された（臨床試験中）。したがって、ＴＭＣ３５３１２１は、本明細書において陽性対照としての役割を果たした。ＴＭＣ３５３１２１は、０．００６μＭのＥＣ５０、０．１μＭ超のＴＣ５０及び１６７超の治療指数を示した。
【表3】
【0137】
結果を図１０Ａ（レファムリン）、１０Ｂ（チアムリン）及び１０Ｃ（ＴＭＣ３５３１２１）にグラフで示す（ＶＣはウイルスＣＰＥの減少、ＣＣは細胞対照）。
【0138】
例９
目的：このアッセイでは、感染多重度（ＭＯＩ）を変化させて、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶＡ２株）複製後のＨＥｐ２細胞において、ウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び胞生存率の阻害を測定した。
目的：このアッセイでは、感染多重度（ＭＯＩ）を変化させて、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶＡ２株）複製後のＨＥｐ２細胞において、ウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び胞生存率の阻害を測定した。
【0139】
方法：試験に関して以下の違いを伴って、上記の例８と同様にアッセイを行った。感染後６日目に８５～９５％の細胞死滅が得られるように、ウイルスを所定の力価に希釈して添加し、それぞれ０．００３、０．００１、０．０００８及び０．０００４のＭＯＩが得られるように、添加量を採用した。この試験では、レファムリン（酢酸塩として）を調査し、陽性対照についてはＴＭＣ３５３１２１を調査した。
【0140】
結果
抗ウイルス効果及び細胞毒性データを以下の表に要約する。レファムリンの低μＭ範囲のＥＣ５０値は、０．０００４のＭＯＩで再現された。対照的に、より高いＭＯＩ、したがって調査した細胞に対してより高いウイルス量は、レファムリンの抗ウイルス効果を減少させた。この効果は、非常に有効な対照物質ＴＭＣ３５３１２１ではあまり顕著ではない。
抗ウイルス効果及び細胞毒性データを以下の表に要約する。レファムリンの低μＭ範囲のＥＣ５０値は、０．０００４のＭＯＩで再現された。対照的に、より高いＭＯＩ、したがって調査した細胞に対してより高いウイルス量は、レファムリンの抗ウイルス効果を減少させた。この効果は、非常に有効な対照物質ＴＭＣ３５３１２１ではあまり顕著ではない。
【表4】
【表5】
【0141】
例１０
目的：このアッセイでは、２つの異なる呼吸器合胞体ウイルス株ＲＳＶ ＡＬＯＮＧ及びＲＳＶ Ｂ１８５３７の複製後のＨＥｐ２細胞において、ウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）阻害及び細胞生存率を測定した。
目的：このアッセイでは、２つの異なる呼吸器合胞体ウイルス株ＲＳＶ ＡＬＯＮＧ及びＲＳＶ Ｂ１８５３７の複製後のＨＥｐ２細胞において、ウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）阻害及び細胞生存率を測定した。
【0142】
方法：異なる濃度の試験化合物で４時間細胞前処置した後、ウェルあたり５×１０３細胞の密度で播種した細胞をウイルス株ＲＳＶ ＡＬＯＮＧ又はＲＳＶ Ｂ１８５３７とそれぞれインキュベートしたという違いを伴って、上記の例８と同様にアッセイを行った。ウイルスを希釈し、ＲＳＶ ＡＬＯＮＧ及びＲＳＶ Ｂ１８５３７についてそれぞれ０．０１及び０．００１のＭＯＩを生じる量で添加した。
【0143】
結果
抗ウイルス効果及び細胞毒性データを以下の表に要約する。対照化合物ＴＭＣ３５３１２１をレファムリンと並行して評価し、ＲＳＶ Ａ及びＲＳＶ Ｂの調査株に対して０．０１ｎＭのＥＣ５０値を得た。レファムリンはＲＳＶ Ｂ１８５３７に対して１７．７μＭのＥＣ５０値を得た。ＲＳＶ ＡＬＯＮＧに対する活性は、ＨＥｐ２細胞に対する細胞毒性があり、アッセイにおけるＴＣ５０値は７１．１μＭであったため、決定することができなかった。
抗ウイルス効果及び細胞毒性データを以下の表に要約する。対照化合物ＴＭＣ３５３１２１をレファムリンと並行して評価し、ＲＳＶ Ａ及びＲＳＶ Ｂの調査株に対して０．０１ｎＭのＥＣ５０値を得た。レファムリンはＲＳＶ Ｂ１８５３７に対して１７．７μＭのＥＣ５０値を得た。ＲＳＶ ＡＬＯＮＧに対する活性は、ＨＥｐ２細胞に対する細胞毒性があり、アッセイにおけるＴＣ５０値は７１．１μＭであったため、決定することができなかった。
【表6】
【表7】
【0144】
例１１
目的：アッセイでは、ＨｅＬａ細胞における麻疹ウイルス株Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎの複製中のウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
目的：アッセイでは、ＨｅＬａ細胞における麻疹ウイルス株Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎの複製中のウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
【0145】
方法：ＨｅＬａ細胞を９６ウェル平底組織培養プレートに播種し（ウェルあたり５×１０３細胞の密度で）、一晩接着させた。その後、希釈した試験化合物（酢酸塩としてのレファムリン、対照用のリバビリン）をプレートに添加し、ウイルスを添加する前に４時間インキュベートした。ウイルスを所定の力価に希釈して添加すると、感染後６日で８５～９５％の細胞死滅が得られた（１：５０希釈、ＭＯＩは０．００８）。
【0146】
細胞生存率の決定並びにＥＣ５０及びＴＣ５０の計算を、例６及び８に記載されるように行った。
【0147】
結果
抗ウイルス効果及び細胞毒性データを以下の表に要約する。リバビリンを、レファムリンと並行して対照化合物として評価し、１．８８μｇ／ｍＬのＥＣ５０値を得た。驚くべきことに、レファムリンは、０．８９μＭという更に低いＥＣ５０値をもたらし、８１．７という高い計算されたＴＩを有した。
抗ウイルス効果及び細胞毒性データを以下の表に要約する。リバビリンを、レファムリンと並行して対照化合物として評価し、１．８８μｇ／ｍＬのＥＣ５０値を得た。驚くべきことに、レファムリンは、０．８９μＭという更に低いＥＣ５０値をもたらし、８１．７という高い計算されたＴＩを有した。
【表8】
【0148】
例１２
目的：アッセイでは、Ｈｕｈ７細胞におけるデングウイルス株ＤＥＮＶ２Ｎｅｗ Ｇｕｉｎｅａの複製中のウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
目的：アッセイでは、Ｈｕｈ７細胞におけるデングウイルス株ＤＥＮＶ２Ｎｅｗ Ｇｕｉｎｅａの複製中のウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
【0149】
方法：Ｈｕｈ７細胞を９６ウェル平底組織培養プレートに播種し（ウェルあたり５×１０３細胞の密度で）、一晩接着させた。その後、希釈した試験化合物（酢酸塩としてのレファムリン、対照用のリバビリン）をプレートに添加し、ウイルスを添加する前に４時間インキュベートした。デングウイルス株ＤＥＮＶ２Ｎｅｗ ＧｕｉｎｅａをＡＴＣＣ（ＶＲ－１５８４）から入手し、ストックウイルスプールの産生のためにアカゲザル腎細胞で増殖させた。ウイルスを所定の力価に希釈して添加すると、感染後６日で８５～９５％の細胞死滅が得られた（ＭＯＩは０．００１）。
【0150】
細胞生存率の決定並びにＥＣ５０及びＴＣ５０の計算を、例６及び８に記載されるように行った。
【0151】
結果
抗ウイルス効果及び細胞毒性データを以下の表に要約する。リバビリンを、レファムリンと並行して対照化合物として評価し、４．７３μｇ／ｍＬのＥＣ５０値を得た。レファムリンは６．７９μＭのＥＣ５０値をもたらした。リバビリン及びレファムリンは両方とも、それぞれ４８．５μｇ／ｍＬ及び２３．３μＭの濃度でこの特定の細胞株に対して特定の細胞毒性を示した。
抗ウイルス効果及び細胞毒性データを以下の表に要約する。リバビリンを、レファムリンと並行して対照化合物として評価し、４．７３μｇ／ｍＬのＥＣ５０値を得た。レファムリンは６．７９μＭのＥＣ５０値をもたらした。リバビリン及びレファムリンは両方とも、それぞれ４８．５μｇ／ｍＬ及び２３．３μＭの濃度でこの特定の細胞株に対して特定の細胞毒性を示した。
【表9】
【0152】
例１３
目的：アッセイでは、４時間の細胞前処置後のＨｕｈ７細胞におけるジカウイルス株ＺＩＫＶＰＲＶＡＢＣ５９の複製中のウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
目的：アッセイでは、４時間の細胞前処置後のＨｕｈ７細胞におけるジカウイルス株ＺＩＫＶＰＲＶＡＢＣ５９の複製中のウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
【0153】
方法：Ｈｕｈ７細胞を９６ウェル平底組織培養プレートに播種し（ウェルあたり５×１０３細胞の密度で）、一晩接着させた。その後、希釈した試験化合物（酢酸塩としてのレファムリン、対照用のソホスブビル）をプレートに添加し、ウイルスを添加する前に４時間インキュベートした。ＡＴＣＣ（カタログＶＲ－１８４３）から入手したジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９をＡＴＣＣ（ＶＲ－１５８４）から入手し、ストックウイルスプールの産生のためにアカゲザル腎細胞で増殖させた。ウイルスを所定の力価に希釈して添加すると、感染後６日で８５～９５％の細胞死滅が得られた（ＭＯＩは０．００１）。
【0154】
細胞生存率の決定並びにＥＣ５０及びＴＣ５０の計算を、例６及び８に記載されるように行った。
【0155】
結果
抗ウイルス効果及び細胞毒性データを以下の表に要約する。対照化合物ソホスブビルをレファムリンと並行して評価し、０．６５μｇ／ｍＬのＥＣ５０値を得た。レファムリンは２．７８μＭのＥＣ５０値をもたらし、計算された治療指数は８．４２であった。
抗ウイルス効果及び細胞毒性データを以下の表に要約する。対照化合物ソホスブビルをレファムリンと並行して評価し、０．６５μｇ／ｍＬのＥＣ５０値を得た。レファムリンは２．７８μＭのＥＣ５０値をもたらし、計算された治療指数は８．４２であった。
【表10】
【0156】
例１４
目的：アッセイでは、４時間の細胞前処置後のＨ１－ＨｅＬａ細胞におけるヒトライノウイルス株ＨＲＶ１６株１１７５７の複製中のウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
目的：アッセイでは、４時間の細胞前処置後のＨ１－ＨｅＬａ細胞におけるヒトライノウイルス株ＨＲＶ１６株１１７５７の複製中のウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
【0157】
方法：Ｈ１－ＨｅＬａ細胞を９６ウェル平底組織培養プレートに播種し（ウェルあたり５×１０３細胞の密度で）、一晩接着させた。その後、希釈した試験化合物（酢酸塩としてのレファムリン、対照用のルピントリビル）をプレートに添加し、ウイルスを添加する前に４時間インキュベートした。ウイルスＨＲＶ１６１１７５７を所定の力価に希釈して添加すると、未処置ウイルス対照ウェルで８５～９５％の細胞死滅が得られた（ＭＯＩは０．０００５）。
【0158】
細胞生存率の決定並びにＥＣ５０及びＴＣ５０の計算を、例６及び８に記載されるように行った。
【0159】
結果
ライノウイルスの治療のために開発されたプロテアーゼ阻害剤であるルピントリビルを並行して評価し、４．９０ｎＭのＥＣ５０値を得た。レファムリンは９．３４μＭのＥＣ５０値をもたらし、計算された治療指数は２．５８であった。
ライノウイルスの治療のために開発されたプロテアーゼ阻害剤であるルピントリビルを並行して評価し、４．９０ｎＭのＥＣ５０値を得た。レファムリンは９．３４μＭのＥＣ５０値をもたらし、計算された治療指数は２．５８であった。
【表11】
【0160】
例１５
目的：アッセイでは、４時間の細胞前処置後のＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４の複製中のウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
目的：アッセイでは、４時間の細胞前処置後のＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４の複製中のウイルス誘発性細胞傷害活性（ＣＰＥ）及び細胞生存率の阻害を測定した。
【0161】
方法：ＭＤＣＫ細胞を９６ウェル平底組織培養プレートに播種し（ウェルあたり５×１０３細胞の密度で）、一晩接着させた。その後、希釈した試験化合物（酢酸塩としてのレファムリン、対照用のオセルタミビル）をプレートに添加し、ウイルスを添加する前に４時間インキュベートした。インフルエンザウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４を所定の力価に希釈して添加すると、未処置ウイルス対照ウェルで９０％の細胞死滅が得られた（ＭＯＩは０．０００４）。
【0162】
細胞生存率の決定並びにＥＣ５０及びＴＣ５０の計算を、例６及び８に記載されるように行った。
【0163】
結果
確立されたインフルエンザ薬物としてのオセルタミビルを並行して評価し、０．０６μＭのＥＣ５０値を得た。レファムリンは、２３μＭを超える濃度でＭＤＣＫ細胞に対して細胞毒性であった。５μＭのレファムリンでインフルエンザ媒介ＣＰＥの最大阻害率１８．４％が測定された。したがって、細胞毒性が５０μＭで観察されたので、ＥＣ５０をレファムリンについて決定することができなかった。注目すべきことに、関連するマウス適合インフルエンザＡ株（インフルエンザＡ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））を使用したインフルエンザ感染マウスモデル（上記の例５を参照）において、インビボ活性が観察された。
確立されたインフルエンザ薬物としてのオセルタミビルを並行して評価し、０．０６μＭのＥＣ５０値を得た。レファムリンは、２３μＭを超える濃度でＭＤＣＫ細胞に対して細胞毒性であった。５μＭのレファムリンでインフルエンザ媒介ＣＰＥの最大阻害率１８．４％が測定された。したがって、細胞毒性が５０μＭで観察されたので、ＥＣ５０をレファムリンについて決定することができなかった。注目すべきことに、関連するマウス適合インフルエンザＡ株（インフルエンザＡ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））を使用したインフルエンザ感染マウスモデル（上記の例５を参照）において、インビボ活性が観察された。
【表12】
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【国際調査報告】