特表 2023-522817 血液脳関門の透過性を増加させるための交流電界の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-01

(54)【発明の名称】血液脳関門の透過性を増加させるための交流電界の使用

(51)【国際特許分類】

   A61N 1/32 20060101AFI20230525BHJP

【ＦＩ】

A61N1/32

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022549350

(86)(22)【出願日】2021-04-21

(85)【翻訳文提出日】2022-08-16

(86)【国際出願番号】 IB2021053305

(87)【国際公開番号】W WO2021214693

(87)【国際公開日】2021-10-28

(31)【優先権主張番号】63/015,099

(32)【優先日】2020-04-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/071,748

(32)【優先日】2020-08-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ

(71)【出願人】

【識別番号】519275847

【氏名又は名称】ノボキュア ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】カルシュテン・ハーゲマン

(72)【発明者】

【氏名】マリオ・ローア

(72)【発明者】

【氏名】アルムト・エフ・ケスラー

(72)【発明者】

【氏名】マルゴルツァタ・ブレク

(72)【発明者】

【氏名】カローラ・フォルスター

(72)【発明者】

【氏名】キャサリン・ブラミ

(72)【発明者】

【氏名】ハダス・サラ・ヘルシュコヴィチ

(72)【発明者】

【氏名】タリ・ボロシン－セラ

【テーマコード（参考）】

4C053

【Ｆターム（参考）】

4C053JJ02

4C053JJ04

4C053JJ06

4C053JJ21

4C053JJ32

(57)【要約】

多くの薬および他の分子は、通常、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できない。しかし、特定の最適な周波数（例えば、１００ｋＨｚ）の交流電界が脳に印加されると、ＢＢＢはそれらの分子に対して透過性となる。交流電界が停止されると、ＢＢＢは最終的に元の不透過性状態に戻る。その後、最適な周波数で交流電界を再印加することでＢＢＢを再び開く。通常、交流電界の多くの周波数（例えば、２００ｋＨｚ）は、最適な周波数よりも透過性を誘発するのに効果がないか、効果が低くなる。しかし、最適な周波数で交流電界を印加することによって一度ＢＢＢが開かれると、非最適な周波数での交流電界は以前に開かれたＢＢＢの透過性を維持することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験者の脳の血液脳関門を越えて物質を送達するための方法であって、
前記被験者の脳に交流電界を第１の期間印加するステップであって、前記被験者の脳に前記交流電界を前記第１の期間印加することで、前記被験者の脳における前記血液脳関門の透過性を増加させる、ステップと、
前記第１の期間が経過した後に第１の物質を前記被験者に投与するステップであって、前記血液脳関門の増加した透過性が、前記第１の物質が前記血液脳関門を通過することを可能にする、ステップと、
前記血液脳関門が回復するのに十分な時間、前記交流電界の印加を停止するステップと、
前記血液脳関門が回復した後、前記被験者の脳に交流電界を第２の期間印加するステップであって、前記被験者の脳に前記交流電界を前記第２の期間印加することで、前記被験者の脳の前記血液脳関門の透過性を増加させる、ステップと、
前記第２の期間が経過した後に第２の物質を前記被験者に投与するステップであって、前記血液脳関門の増加した透過性が、前記第２の物質が前記血液脳関門を通過することを可能にする、ステップと、
を含む方法。

【請求項2】

前記交流電界が、７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間の周波数で印加される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記交流電界が、少なくとも５０ｋＨｚの周波数で印加される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記第２の期間が、少なくとも２４時間である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記第２の期間が、少なくとも４８時間である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記交流電界が、前記被験者の脳の少なくとも一部において少なくとも１Ｖ／ｃｍの電界強度を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記交流電界が、７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間の周波数で印加され、前記第２の期間が少なくとも２４時間であり、前記交流電界が、前記被験者の脳の少なくとも一部において少なくとも１Ｖ／ｃｍの電界強度を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記第２の物質の投与が静脈内に行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記第２の物質の投与が経口的に行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の物質および前記第２の物質が同一である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記第１の物質および前記第２の物質のうちの少なくとも１つがパクリタキセルを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

被験者の脳の血液脳関門を越えて物質を送達するための方法であって、
前記被験者の脳に第１の周波数での第１の交流電界を第１の期間印加するステップであって、前記被験者の脳に前記第１の周波数での前記第１の交流電界を前記第１の期間印加することで、前記被験者の脳の前記血液脳関門の透過性を増加させる、ステップと、
前記第１の期間に続いて、前記被験者の脳に第２の周波数での第２の交流電界を第２の期間印加するステップであって、前記第２の周波数は前記第１の周波数とは異なり、前記第２の周波数での前記第２の交流電界が、前記血液脳関門の透過性を維持するように作用する、ステップと、
前記第１の期間が経過してから少なくとも２４時間後に前記物質を前記被験者に投与するステップであって、前記血液脳関門の維持された透過性が、前記物質が前記血液脳関門を通過することを可能にする、ステップと、
を含む方法。

【請求項13】

前記第１の周波数が７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記第１の周波数が５０ｋＨｚから１９０ｋＨｚの間である、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記第２の周波数が少なくとも１９０ｋＨｚである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記第１の周波数が少なくとも５０ｋＨｚであり、前記第２の周波数が前記第１の周波数よりも高い、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

前記第１の期間が少なくとも２４時間である、請求項１２に記載の方法。

【請求項18】

前記第２の期間が、少なくとも１週間の長さである単一の中断されない時間間隔を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項19】

前記第２の期間が、前記被験者の脳に前記第２の周波数での前記第２の交流電界が印加される複数の非連続の時間間隔を含み、前記複数の非連続の間隔が、合計で少なくとも１週間になる、請求項１２に記載の方法。

【請求項20】

被験者の脳の血液脳関門を越えて物質を送達するための方法であって、
ある期間被験者の脳に交流電界を印加するステップであって、前記期間前記被験者の脳に前記交流電界を印加することで、前記被験者の脳の血液脳関門の透過性を増加させる、ステップと、
前記期間が経過した後に前記被験者にパクリタキセルを投与するステップであって、前記血液脳関門の増加した透過性が、パクリタキセルまたはその少なくとも１つの代謝物が前記血液脳関門を通過することを可能にする、ステップと、
を含む方法。

【請求項21】

前記交流電界が、７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間の周波数で印加される、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記期間が少なくとも２４時間である、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

前記期間が少なくとも４８時間である、請求項２０に記載の方法。

【請求項24】

前記交流電界が、前記被験者の脳の少なくとも一部において少なくとも１Ｖ／ｃｍの電界強度を有する、請求項２０に記載の方法。

【請求項25】

前記交流電界が７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間の周波数で印加され、前記期間が少なくとも２４時間であり、前記交流電界が前記被験者の脳の少なくとも一部において少なくとも１Ｖ／ｃｍの電界強度を有する、請求項２０に記載の方法。

【請求項26】

前記物質が少なくとも４ｋＤａの分子量を有する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記物質が少なくとも６９ｋＤａの分子量を有する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記物質が、前記物質が非漏出性ＢＢＢを通過することを通常は妨げる少なくとも１つの特徴を有する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願６３／０１５，０９９（２０２０年４月２４日出願）および６３／０７１，７４８（２０２０年８月２８日出願）の利益を主張し、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

通常、脳の微小血管は、血液と脳組織との間の物質の移動を厳密に調節する。脳の微小血管によるこの調節は、血液脳関門（ＢＢＢ）と呼ばれ、脳毛細血管内皮細胞間に形成する細胞間密着結合（ＴＪ）によるものである。脳の毛細血管では、ＴＪタンパク質は末梢微小血管よりも５０～１００倍多く発現している。ＴＪは、膜貫通タンパク質（クローディンおよびオクルディン）と細胞質アクセサリータンパク質（ＺＯ－１および－２、シンギュリン、ＡＦ－６、および７Ｈ６）の複雑な複合体によって形成される。アクチン細胞骨格に結合することにより、これらのタンパク質は強力な細胞間結合を形成する。脳の微小血管の内皮を形成する脳内皮細胞は、物質に対するＢＢＢの耐性の約７５～８０％を担っており、星状細胞や周皮細胞などの他の細胞が残りの耐性を与える。

【0003】

ＢＢＢは毛細血管の周りの密着結合で構成されており、通常、疎水性分子（傍細胞輸送ではなく経細胞輸送）の拡散を可能にしながら、微細な物体、および大きなまたは親水性分子の脳への拡散を制限する。

【0004】

健康な人では、ＢＢＢは有害物質（バクテリア、ウイルス、潜在的に有害な大きな分子、または親水性分子など）が脳に入るのを防ぐため、非常に重要な機能を果たす。しかし、ＢＢＢの働きが困難をもたらす状況がある。例えば、患者の脳の病気を治療するために、大きなまたは親水性の薬物分子を送達することが望ましい場合がある。しかし、ＢＢＢが正常に働いている場合、これらの薬物はＢＢＢによって脳への侵入がブロックされる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許第６８６８２８９号明細書

【特許文献2】米国特許第７５６５２０５号明細書

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一態様は、被験者の脳の血液脳関門を越えて物質を送達するための第１の方法に関する。第１の方法は、被験者の脳に交流電界を第１の期間印加することを含み、被験者の脳に交流電界を第１の期間印加することで、被験者の脳の血液脳関門の透過性を増加させる。第１の方法はまた、第１の期間が経過した後に第１の物質を被験者に投与することを含み、被験者の脳の血液脳関門の増加した透過性が、第１の物質が血液脳関門を通過することを可能にする。第１の方法はまた、血液脳関門が回復するのに十分な時間、交流電界の印加を停止することを含む。第１の方法はまた、血液脳関門が回復した後、被験者の脳に交流電界を第２の期間印加することを含む。被験者の脳に交流電界を第２の期間印加することで、被験者の脳の血液脳関門の透過性を増加させる。第１の方法はまた、第２の期間が経過した後に第２の物質を被験者に投与することを含み、血液脳関門の透過性の増加が、第２の物質が血液脳関門を通過することを可能にする。

【0007】

第１の方法のいくつかの例では、交流電界は７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間の周波数で印加される。第１の方法のいくつかの例では、交流電界は少なくとも５０ｋＨｚの周波数で印加される。第１の方法のいくつかの例では、第２の期間は少なくとも２４時間である。第１の方法のいくつかの例では、第２の期間は少なくとも４８時間である。第１の方法のいくつかの例では、交流電界は、被験者の脳の少なくとも一部において少なくとも１Ｖ／ｃｍの電界強度を有する。

【0008】

第１の方法のいくつかの例では、交流電界は７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間の周波数で印加され、第２の期間は少なくとも２４時間であり、交流電界は、被験者の脳の少なくとも一部において少なくとも１Ｖ／ｃｍの電界強度を有する。

【0009】

第１の方法のいくつかの例では、第２の物質の投与は静脈内に行われる。第１の方法のいくつかの例では、第２の物質の投与は経口的に行われる。第１の方法のいくつかの例では、第１の物質と第２の物質は同一である。第１の方法のいくつかの例では、第１の物質および第２の物質のうちの少なくとも１つはパクリタキセルを含む。

【0010】

本発明の別の態様は、被験者の脳の血液脳関門を越えて物質を送達するための第２の方法に関する。第２の方法は、被験者の脳に第１の周波数での第１の交流電界を第１の期間印加することを含み、被験者の脳に第１の周波数での第１の交流電界を第１の期間印加することで、被験者の脳の血液脳関門の透過性を増加させる。第２の方法はまた、第１の期間に続いて、被験者の脳に第２の周波数での第２の交流電界を第２の期間印加することを含み、第２の周波数は第１の周波数とは異なり、第２の周波数での第２の交流電界は、血液脳関門の透過性を維持するように作用する。第２の方法はまた、第１の期間が経過してから少なくとも２４時間後に物質を被験者に投与することを含み、血液脳関門の維持された透過性が、物質が血液脳関門を通過することを可能にする。

【0011】

第２の方法のいくつかの例では、第１の周波数は７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間である。

【0012】

第２の方法のいくつかの例では、第１の周波数は５０ｋＨｚから１９０ｋＨｚの間である。任意選択で、これらの場合、第２の周波数は少なくとも１９０ｋＨｚである。

【0013】

第２の方法のいくつかの例では、第１の周波数は少なくとも５０ｋＨｚであり、第２の周波数は第１の周波数よりも高い。第２の方法のいくつかの例では、第１の期間は少なくとも２４時間である。第２の方法のいくつかの例では、第２の期間は、少なくとも１週間の長さである単一の中断されない時間間隔を含む。

【0014】

第２の方法のいくつかの例では、第２の期間は、被験者の脳に第２の周波数での第２の交流電界が印加される複数の非連続の時間間隔を含み、複数の非連続の時間間隔が、合計で少なくとも１週間になる。

【0015】

本発明の別の態様は、被験者の脳の血液脳関門を越えて物質を送達するための第３の方法に関する。第３の方法は、ある期間被験者の脳に交流電界を印加することを含み、その期間被験者の脳に交流電界を印加することで、被験者の脳の血液脳関門の透過性を増加させる。第３の方法はまた、その期間が経過した後に被験者にパクリタキセルを投与することを含み、血液脳関門の増加した透過性が、パクリタキセルまたはその少なくとも１つの代謝物が血液脳関門を通過することを可能にする。

【0016】

第３の方法のいくつかの例では、交流電界は７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間の周波数で印加される。第３の方法のいくつかの例では、期間は少なくとも２４時間である。第３の方法のいくつかの例では、期間は少なくとも４８時間である。第３の方法のいくつかの例では、交流電界は、被験者の脳の少なくとも一部において少なくとも１Ｖ／ｃｍの電界強度を有する。

【0017】

第３の方法のいくつかの例では、交流電界は、７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間の周波数で印加され、期間は少なくとも２４時間であり、交流電界は被験者の脳の少なくとも一部において少なくとも１Ｖ／ｃｍの電界強度を有する。

【0018】

任意選択で、上記の第１、第２、または第３の方法のいずれの場合においても、物質は少なくとも４ｋＤａの分子量または少なくとも６９ｋＤａの分子量を有する。

【0019】

任意選択で、上記の第１、第２、または第３の方法のいずれの場合においても、物質は、物質が非漏出性ＢＢＢを通過するのを通常は妨げる少なくとも１つの特徴を有する。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】ＢＢＢの人工の生体外バージョンを作成するために、未分化のマウスの脳毛細血管内皮細胞（ｃｅｒｅｂＥＮＤ）をカバーガラスおよびトランスウェルインサート上で成長させるための生体外実験の例示的なセットアップを示す。

【図2A】人工ＢＢＢでの完全性および透過性試験の結果を示している。

【図2B】人工ＢＢＢでの完全性および透過性試験の結果を示している。

【図3A】人工ＢＢＢの増加した透過性が、細胞死によって引き起こされたものではないことを示すデータを示している。

【図3B】人工ＢＢＢの増加した透過性が、細胞死によって引き起こされたものではないことを示すデータを示している。

【図4】生体内実験のためにラットの脳をスライスした位置を示している。

【図5】ラットの脳の異なるセクションにおけるこの生体内実験のＥＢ蓄積を示している。

【図6】この生体内実験についてのラット脳における平均ＥＢ蓄積を、すべてのセクションにわたって平均したものである。

【図7】造影ＭＲＩを使用して決定された、生体内での交流電界によって誘発されるラット脳の３つの異なるセクションにおけるＢＢＢ透過性の増加を示している。

【図8】造影ＭＲＩを使用して決定された、生体内での交流電界によって誘発されるラット皮質におけるＢＢＢ透過性の増加を示している。

【図9】交流電界の印加と被験者への物質の投与との間の適切なタイミング関係を示している。

【図10】対照と比較した、交流電界＋パクリタキセル治療を組み合わせたＧＢＭ腫瘍における細胞増殖の減少を示すグラフである。

【図11】３つの対照と比較した、交流電界＋パクリタキセル治療を組み合わせたＧＢＭ腫瘍における腫瘍体積の倍増のプロットである。

【図12】被験者の脳の血液脳関門を越えて物質を送達するための方法のフローチャートである。

【図13】ＢＢＢ透過性を誘発するための第１の周波数、および細胞毒性を誘発するための第２の周波数を生成する二重周波数装置のブロック図である。

【図14】被験者の脳の血液脳関門を越えて物質を送達するための別の方法のフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本出願は、交流電界を使用してＢＢＢの透過性を一時的に増加させ、通常はＢＢＢによってブロックされる物質がＢＢＢを通過できるようにするための新しいアプローチについて説明する。

【0022】

ＢＢＢの人工生体外バージョンを作成するために未分化のマウスの脳毛細血管内皮細胞（ｃｅｒｅｂＥＮＤ）をカバーガラスおよびトランスウェルインサート上で成長させる、一連の生体外実験が実施され、図１は、これらの実験のセットアップを示している。次に、細胞を交流電界（１００～３００ｋＨｚ）で２４時間、４８時間、および７２時間処理した。交流電界の方向を２つの垂直方向の間で１秒ごとに切り替えた（つまり、繰り返しシーケンスで、一方の方向に１秒、次にもう一方の方向に１秒）。次に、以下の効果を分析した：（ａ）細胞形態（密着結合タンパク質クローディン５およびＺＯ－１の免疫蛍光染色）；（ｂ）ＢＢＢの完全性（経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を使用）；および（ｃ）ＢＢＢ透過性（フローサイトメトリー用にデキストラン（ＦＩＴＣ）に結合したフルオレセインイソチオシアネートを使用）。

【0023】

第１の一連の実験は、細胞の形態と配向の視覚化、および染色されたタンパク質の局在の視覚化を含む。この実験は、交流電界の周波数が人工ＢＢＢにどのように影響するかを確認するために設計された。ここでは、細胞をカバーガラス上で成長させ、４つの異なる周波数（１００ｋＨｚ、１５０ｋＨｚ、２００ｋＨｚ、および３００ｋＨｚ）で、１．７Ｖ／ｃｍの電界強度で７２時間交流電界を印加した。交流電界の方向を２つの垂直方向の間で１秒ごとに切り替えた。交流電界を印加しない対照もあった。次に、クローディン５、ＺＯ－１、および４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の存在を示す細胞形態画像（それぞれ異なる色に染色された）が得られた。クローディン５とＺＯ－１は、無傷のＢＢＢの存在を示している。この一連の細胞形態画像は、交流電界が、密着結合タンパク質の細胞境界から細胞質への非局在化によって人工ＢＢＢを妨害し、１００ｋＨｚで最も劇的な影響を与えることを明らかにした。

【0024】

第２の一連の実験もまた、細胞形態の視覚化を含む。この実験は、交流電界が印加されている時間の長さが人工ＢＢＢにどのように影響するかを確認するために設計された。内皮細胞をカバーガラス上で成長させ、周波数１００ｋＨｚの交流電界を３つの異なる期間（２４時間、４８時間、７２時間）および対照に印加した。交流電界の方向を２つの垂直方向の間で１秒ごとに切り替えた。次に、（それぞれ異なる色に染色された）クローディン５とＤＡＰＩの存在を示す細胞形態画像が得られた。この一連の細胞形態画像は、第１の一連の実験に関連して上記で説明した現象が２４時間後に既に見られ、その影響が７２時間後に最も顕著であることを明らかにした。

【0025】

第３の一連の実験もまた、細胞形態の視覚化を含む。この実験は、内皮細胞がカバーガラスの代わりにトランスウェルインサート上で成長したことを除いて、第２の一連の実験と同様であった。結果は、第２の一連の実験の結果と同様であった。ＴＪタンパク質の非局在化は２４時間後に見られ、その影響は７２時間後に最も顕著であった。上記の３つの実験は、交流電界が細胞の構造変化を引き起こし、ＢＢＢ透過性の増加の原因である可能性があるという結論を支持する。

【0026】

図２Ａおよび２Ｂは、人工ＢＢＢを１００ｋＨｚの周波数で７２時間交流電界に（交流電界の方向を２つの垂直方向の間で１秒ごとに切り替えて）さらした後、および対照に対しての、それぞれ完全性および透過性試験の結果を示す。より具体的には、図２Ａは、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）試験の結果を示しており、これは、交流電界が人工ＢＢＢの完全性を対照の３５％に低下させたことを明らかにしている。図２Ｂは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）透過性試験の結果を示しており、交流電界が、分子量４ｋＤａのＦＩＴＣ－デキストランに対する人工ＢＢＢの透過性を対照の１１０％まで増加させたことを明らかにしている。これらの実験は、交流電界が、通常は非漏出性のＢＢＢを通過することができない分子に対するＢＢＢの透過性を増加させるという結論をさらに支持する。

【0027】

まとめると、これらの生体外実験は、特定の周波数で交流電界を十分な時間印加することが、細胞境界から細胞質への密着結合タンパク質（クローディン５、ＺＯ－１）の非局在化（１００ｋＨｚで最も劇的な影響）を引き起こし、ＢＢＢの透過性を高めることを明らかにしている。交流電界効果は、２４時間後にすでに現れ、７２時間後に最も顕著になる。より具体的には、ＢＢＢの透過性を増加させるために交流電界を使用した後、４ｋＤａの分子がＢＢＢを通過することができる。

【0028】

次に、交流電界をオフにした後にＢＢＢに何が起こるかを決定するために、追加の生体外実験を実施した。これらの実験では、交流電界を停止した後に人工ＢＢＢがどのように回復するかを示すために、細胞形態の視覚化を使用した。これらの実験では、内皮細胞をカバーガラス上で成長させ、１．７Ｖ／ｃｍの電界強度で７２時間１００ｋＨｚの交流電界で処理した。交流電界の方向を２つの垂直方向の間で１秒ごとに切り替えた。次に、交流電界をオフにし、交流電界を停止した後、細胞を９６時間追跡した。（染色された）クローディン５の存在を示す細胞形態画像は、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間で取得された。これらの画像は、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間の画像で、細胞境界と細胞質との間のクローディンの局在の漸進的な変化を明らかにした。さらに、これらの４つの画像を対照のそれぞれの画像（最初の７２時間または最後の９６時間のいずれの間にも交流電界が印加されなかった）と比較すると、内皮細胞の形態は交流電界の停止後４８時間で部分的に回復し、交流電界を停止してから９６時間後にＢＢＢが完全に回復した（すなわち、対照と同等であった）ことが明らかになった。

【0029】

図３Ａおよび３Ｂは、上記の人工ＢＢＢの透過性の観察された変化が細胞死に起因する可能性があるかどうかを決定するために設計された生体外実験の結果を示す。この実験では、（ａ）交流電界を７２時間印加した後、９６時間交流電界を印加しない場合と、（ｂ）交流電界をまったく印加しない対照との細胞数を比較することにより、細胞分裂を試験した。内皮細胞をカバーガラス上で成長させ、１．７Ｖ／ｃｍの電界強度で７２時間１００ｋＨｚの交流電界で処理した。交流電界の方向を２つの垂直方向の間で１秒ごとに切り替えた。次に、交流電界をオフにし、交流電界を停止した後、細胞を９６時間追跡した。交流電界および対照の１ｍｌあたりの細胞数が数えられ、その結果を図３Ａおよび３Ｂ（それぞれ対照および交流電界）を示す。これらの結果は、交流電界の印加中または印加後に細胞数の統計的に有意な増加がなかったことを明らかにし、上記のＢＢＢ透過性の変化が細胞死に起因し得なかったことを示している。

【0030】

別の生体外実験では、上記の人工ＢＢＢの透過性の観察された変化が細胞死に起因する可能性があるかどうかを判断するために、アポトーシスのＴＵＮＥＬアッセイを使用した。この実験では、内皮細胞をカバーガラス上で成長させ、１．７Ｖ／ｃｍの電界強度で７２時間１００ｋＨｚの交流電界で処理した。交流電界の方向を２つの垂直方向の間で１秒ごとに切り替えた。対照では、交流電界は印加されなかった。（それぞれ異なる色に染色された）アポトーシス（ＴＵＮＥＬ）と核（ＤＡＰＩ）を示す細胞形態画像は、２４、４８、および７２時間後に取得された。これらの画像はいずれもアポトーシスの追加の証拠を明らかにせず、交流電界が細胞死を引き起こさなかったことを示している。これは、上記のＢＢＢ透過性の変化が細胞死に起因するものではなかったことを確認する。

【0031】

ラットでの一連の生体内実験も、交流電界への曝露によって引き起こされる血管透過性の増加を定量化するために実行された。これらの実験では、血清アルブミン（分子サイズ約６９ｋＤａ）に対して非常に高い親和性を持つアゾ染料であるエバンスブルー（ＥＢ）染料を使用した。分子サイズが大きいため、血清アルブミンは通常、ＢＢＢを通過できない。しかし、ＢＢＢの透過性が十分に増加している場合、血清アルブミン分子の一部は（それに結合しているＥＢ染料とともに）ＢＢＢを越え、ラットの脳でＥＢを探すことで検出できる。

【0032】

この一連の実験では、１００ｋＨｚの交流電界をラットの脳に７２時間印加し、交流電界の方向を２つの垂直方向の間で１秒ごとに切り替えた。これは、各ラットの頭を剃り、容量結合電極の第１のペアをラットの頭の上部と下部に配置し、容量結合電極の第２のペアをラットの頭の左側と右側に配置することによって達成された。次に、１００ｋＨｚのＡＣ電圧が上下の電極の間に１秒間印加され、続いて１００ｋＨｚのＡＣ電圧が左右の電極の間に１秒間、繰り返し印加された。

【0033】

表１に示す条件下および表１に示す時間、ＥＢが麻酔下で尾静脈に静脈内注射され（注射すると、ＥＢはすぐにアルブミンに結合する）、すべての場合でＥＢは２時間循環された。次に、以下のステップを実行した。（ａ）生理食塩水による心臓内灌流；（ｂ）脳を脳スライサーで４つにスライスする；（ｃ）染色を特定するために断片を写真に撮り、重み付けした；（ｄ）ＴＣＡ５０％（１：３）および遠心分離で組織をホモジナイズした後のＥＢ抽出、および（ｅ）６１０ｎｍでのＥＢ定量。結果は、組織１ｇあたりのＥＢμｇとして示される。

【0034】

【表1】

【0035】

実験中、グループ２の２匹の動物とグループ４の１匹の動物を除外した（処理の中断、尾静脈へのＥＢの注射の失敗）。交流電界で処理された動物（グループ１と２）の間に違いはなく、よって、これらの動物は一緒にグループ化された。同様に、偽熱動物と対照動物（グループ３および４）との間に差はなかったため、これらの動物は一緒にグループ化された。

【0036】

ラットの脳は、図４に示される位置で脳スライサーを使用して４つの断片にスライスされた。次に、これら４つの特定のセクションでのＥＢ蓄積を測定した。さらに、これら４つのセクションのそれぞれの電界強度を決定するために、コンピューターシミュレーションが実行された。表２は、これら４つのセクションのそれぞれでシミュレーションから得られた電界強度を示しており、すべての値はＶ／ｃｍ ＲＭＳで示されている。

【0037】

【表2】

【0038】

セクション１から４におけるＥＢ蓄積の結果は、図５に示されている。これらの結果の要約は次のとおりである：（１）電界強度が最も高いセクション１、２（前頭大脳）で統計的に有意な増加が観察され、電界強度がより低いより後部のセクション（３、４）でより小さな増加（統計的に有意ではなかった）が観察された。

【0039】

図６は、４つのセクション１～４すべてにわたって平均された、ラット脳における平均ＥＢ蓄積を示している。この結果は、７２時間交流電界で処理されたラットの脳におけるＥＢのより高い蓄積を明らかにし、この結果は統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。

【0040】

上記の生体内実験は：（１）交流電界の印加は、脳組織への約６９ｋＤａの平均分子サイズの分子のＢＢＢ通過を可能にする；（２）ＢＢＢの透過性の増加は、交流電界の印加を終了後２時間維持される；および（３）ＢＢＢの増加した透過性は、脳のさまざまなセクションの間で異なることを立証している。後者は、脳のさまざまなセクションに課されたさまざまな電界強度の結果である可能性がある。これらの実験は、交流電界が、通常は非漏出性ＢＢＢを通過できない分子に対するＢＢＢの透過性を高めるという我々の結論をさらに支持する。

【0041】

別の一連の生体内実験では、５匹のラットを１００ｋＨｚの交流電界で７２時間処理し、４匹の対照ラットを同じ時間交流電界で処理しなかった。７２時間の終わりに、４ｋＤａの蛍光化合物ＴＲＩＴＣ－デキストランを麻酔下で尾静脈に静脈内注射し、すべての場合で２分間循環させた。次に、脳を取り出し、凍結し、切片化し、蛍光スキャナーでスキャンした。すべてのスライドは同じ条件でスキャンされた。得られた画像は、（対照と比較して）交流電界にさらされたラットの脳組織における蛍光４ｋＤＡＴＲＩＴＣ－デキストランの有意に高いレベルの蓄積を明らかにし、交流電界がＢＢＢの透過性を高めることが再びまた確認される。

【0042】

ガドリニウム造影剤（Ｇｄ－ＤＴＰＡ、Ｍａｇｎｅｔｏｌ、ＭＷ５４７）の静脈内注射を伴うダイナミック造影ＭＲＩ（ＤＣＥ－ＭＲＩ）を使用して、さらに別の一連の生体内実験を行った。これらの実験では、試験ラットは１００ｋＨｚの交流電界で７２時間処理され、対照ラットは同じ時間交流電界で処理されなかった。この７２時間後、交流電界をオフにし、ラットに麻酔をかけ、一連の６０回のＴ１ｗＭＲＩスキャン（各スキャンの持続時間は２８秒）を取得した。ガドリニウム造影剤は、これらの６０回のスキャンの７回目にラットの尾静脈に注入された。

【0043】

各ラットの画像分析には、（１）各ボクセルの最初の６回のＴ１ｗＭＲＩスキャン（つまり、ガドリニウム注射前のスキャン）の平均を計算することによって各ボクセルのベースラインを決定すること、（２）ベースラインに対する時間の経過に伴う信号変化率（つまり、ガドリニウム蓄積）をボクセル単位で計算すること、（３）脳を前部、中部、後部に分割すること、（４）３つのセグメントのそれぞれについて、それぞれのセグメントのすべてのボクセルにわたるベースラインに対する平均信号変化率を生成すること、（５）４つの連続する時点（つまり、４つのスキャン）を一緒に平均することが含まれていた。最後に、任意のグループ内のすべてのラットからのデータを一緒に平均した。

【0044】

脳の３つのセグメント（すなわち、前部、中部、および後部）のそれぞれについてのこのＤＣＥ－ＭＲＩ実験の結果が図７に示されている。このデータは、交流電界で処理されたラットの脳組織における造影剤の蓄積（ＴＴＦｉｅｌｄｓとラベル付けされた下向きの三角形のトレース）が対照ラット（対照とラベル付けされた正方形のトレース）よりも有意に高かったことを明らかにしている。さらに、この区別は、交流電界が最も高い電界強度を有していた脳の部分である後脳で最も顕著であった。このことから、交流電界が生体内でＢＢＢの透過性を高めることに成功したと結論付けることができる。

【0045】

ＢＢＢの透過性のこの増加が一時的なものであるかどうかを試験するために、同じ試験条件を繰り返したが、交流電界なしでさらに９６時間続けた。この９６時間の期間の後、一連の６０Ｔ１ｗＭＲＩスキャン（各スキャンの持続時間は２８秒）が、上記と同じ手順（ガドリニウム注入を含む）を使用して取得された。脳の３つのセグメントのそれぞれについてのＤＣＥ－ＭＲＩ実験のこの部分の結果もまた、図８に示されている。このデータは、交流電界で７２時間、続いて交流電界なしで９６時間処理したラットの脳組織における造影剤の蓄積（ＴＴＦｉｅｌｄｓ＋９６ｈとラベル付けされたダイヤモンドのトレース）が対照ラット（対照＋９６ｈとラベル付けされた上向きの三角形のトレース）と有意に異ならなかったことを示している。このことから、交流電界を停止した後、ＢＢＢの透過性は正常に戻ったと結論付けることができる。

【0046】

交流電界をラット（ｎ＝２）に印加する前に、同じ手順を使用して、追加の一連の６０回のＴ１ｗＭＲＩスキャン（各スキャンの持続時間は２８秒）も取得した。脳の３つのセグメント（すなわち、前部、中部、および後部）のそれぞれについてのＤＣＥ－ＭＲＩ実験のこの部分の結果もまた、図８に示されている（“前”とラベル付けされたトレースを参照）。

【0047】

図８は、７２時間のＴＴＦｉｅｌｄｓ（ｎ＝６）の脳の３つのセグメントすべて（つまり、前部、中部、および後部）の平均と、７２時間のＴＴＦｉｅｌｄｓなしの対照（ｎ＝３）を、標準偏差バーとともに示している。２つのグループを比較するために、対応のあるｔ検定が使用され、ｐ＜０．０００１であった。

【0048】

交流電界を印加した後にＢＢＢを通過できる分子のサイズの上限はまだ決定されていないことに留意されたい。しかし、（ａ）分子量４ｋＤａのＦＩＴＣ－デキストランを使用した本明細書に記載の生体外実験、および（ｂ）（分子サイズが約６９ｋＤａの血清アルブミンに結合する）ＥＢを使用した本明細書に記載の生体内実験に基づき、上限は少なくとも約６９ｋＤａであるように見え、最も確実には少なくとも４ｋＤａである。

【0049】

ＢＢＢの透過性を自由に可逆的に増加させることができるという意味は、これらの物質には通常は物質が非漏出性ＢＢＢを通過することを妨げる少なくとも１つの特徴があるにもかかわらず、被験者のＢＢＢを越えて多くの物質を送達することが可能になったため、広範囲に及んでいる。これらの意味の多くは、被験者の脳の血液脳関門を越えて、治療薬および診断薬を含むがこれらに限定されない物質を送達することを含む。

【0050】

例には以下が含まれるが、これらに限定されない：癌を治療するためにＢＢＢを越えて化学療法剤を送達する（この状況では、脳への薬物の増加した透過性のため、他の身体の部位に強い副作用を持つ脳腫瘍や転移の治療薬の投与量を減らすことができる可能性がある）；免疫療法のためにＢＢＢを越えて抗体および／または細胞ベースの治療法を送達する；診断目的および研究（脳活動の監視など）のために、ＢＢＢを越えて造影剤染料、レポーター、およびマーカーを送達する；感染症を治療するためにＢＢＢを越えて抗菌剤を送達する；ウイルス感染を治療するために、ＢＢＢを越えて抗ウイルス剤またはウイルス中和抗体を送達する；寄生虫を治療するためにＢＢＢを越えて駆虫剤を送達する；神経変性疾患および自己免疫疾患を治療するために、ＢＢＢを越えて薬剤を送達する；精神科治療薬を送達する；抗てんかん薬を送達する；水頭症薬を送達する；脳卒中介入および回復薬を送達する；脳に不足している化合物を、ＢＢＢを越えて送達して、それらの化合物が不足している状態を治療する（例えば、パーキンソン病などを治療するため）。

【0051】

上記の試験は生体外および生きたラットで行われたが、他の動物およびヒトでも同様の結果が得られると予想される。

【0052】

本明細書に記載の方法はまた、生きている被験者の脳に交流電界を印加することによって、生体内の状況で適用することができる。被験者の脳に電界をかけることで、ＢＢＢの透過性が高まり、通常はＢＢＢによってブロックまたは妨げられる分子が通過できるようになる。これは、例えば、電極を被験者の皮膚の上または下に配置することによって達成することができ、その結果、これらの電極の選択されたサブセットの間にＡＣ電圧を印加することで、被験者の脳に交流電界を印加する。

【0053】

例えば、１対の電極を、被験者の頭の前部および後部に配置することができ、第２の対の電極を、被験者の頭の右側および左側に配置することができる。いくつかの実施形態では、電極は、被験者の身体に容量結合されている（例えば、導電性プレートを含み、導電性プレートと被験者の身体との間に誘電体層が配置されている電極を使用することによって）。しかし、代替の実施形態では、誘電体層を省略してもよく、その場合、導電性プレートは、被験者の身体と直接接触するであろう。別の実施形態では、電極を、患者の皮膚の下に皮下挿入することができる。

【0054】

ＡＣ電圧発生器は、選択された周波数（例えば、１００ｋＨｚ、または５０から１９０ｋＨｚの間）で、左右の電極の間に第１の期間（例えば、１秒）ＡＣ電圧を印加し、これにより、力線の最も大きな成分が被験者の頭の横軸に平行である交流電界が誘発される。次に、ＡＣ電圧発生器は、同じ周波数（または異なる周波数）で、前後の電極の間に第２の期間（例えば、１秒）ＡＣ電圧を印加し、これにより、力線の最も大きな成分が被験者の頭の矢状軸に平行である交流電界が誘導される。それから、この２つのステップのシーケンスが、処理期間中繰り返される。任意選択で、熱センサーが電極に含まれ、ＡＣ電圧発生器は、電極で検出された温度が高くなりすぎた場合に、電極に印加されるＡＣ電圧の大きさを減少させるように構成できる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加の電極対が追加され、シーケンスに含まれ得る。代替の実施形態では、一対の電極のみが使用され、その場合、力線の方向は切り替えられない。この生体内実施形態のパラメータのいずれか（例えば、周波数、電界強度、持続時間、方向切り替え速度、および電極の配置）は、生体外実施形態に関連して上記のように変更され得ることに留意されたい。しかし、電界が常に被験者にとって安全であり続けることを保証するために、生体内の状況では注意を払う必要がある。

【0055】

ＢＢＢの透過性を高めるための多種多様な用途は、生体内の状況で容易に想像することができる。一例では、脳での腫瘍細胞（例えば、神経膠芽腫細胞）による薬物取り込みの局所的な増強は、化学療法または他の抗腫瘍剤の投与前または投与中の期間（例えば、７２時間、または少なくとも２４時間）脳に交流電界を印加することによって誘発され得る。

【0056】

図９は、交流電界の印加と生きている患者への物質の投与との間のタイミングの適切な関係を示している。上記のデータに基づいて、物質が所与の時間ｔ＝０で導入または投与されると仮定すると、交流電界は所与の時間の前（例えば、ｔ＝０の７２時間前）に始まり、所与の時間の後（例えば、ｔ＝０から１２時間後まで）の時間間隔継続することができる。この状況では、物質が投与される前、および物質がＢＢＢに到達する前に、ＢＢＢの透過性が増加し始める。これにより、物質が到着するとすぐにＢＢＢを通過できるようになる。化学療法の場合、交流電界の印加を開始し、７２時間後に化学療法剤を投与し、さらに追加の時間間隔（例えば、化学療法剤を投与した時間から１２時間後まで）の交流電界を印加することに相当する。

【0057】

図９に関連して上で論じた時間間隔は、中断されないか、または好ましくは短い休憩を含むことができることに留意されたい。例えば、１２時間の間隔は、１２時間の単一の中断されないブロックで満たすことができる。あるいは、１２時間の間隔は、交流電界を６時間印加し、続いて１時間休憩し、続いて交流電界をさらに６時間印加することにより、満たすことができる。同様の休憩は、任意選択で、物質の投与に先立つ７２時間の間隔を中断することもある。また、図９の状況において、物質が生きている患者に投与される場合、物質の投与は、静脈内、経口、皮下、髄腔内、脳室内、および腹腔内を含むがこれらに限定されない様々なアプローチのいずれかを使用して実施され得ることも留意されたい。

【0058】

いくつかの好ましい実施形態では、交流電界の周波数は、１９０ｋＨｚ未満（例えば、５０から１９０ｋＨｚの間、または２５から１９０ｋＨｚの間）である。上記の実験に基づいて、１９０ｋＨｚ未満の周波数を、少なくとも２４時間の期間と組み合わせて使用することで、透過性の変化が（これらの範囲外での動作と比較して）増加する。

【0059】

被験者が交流電界で処理されたときに、パクリタキセル（ＰＴＸ、通常はＢＢＢを通過できない薬剤である）がＢＢＢを越えることができるかどうかを判断するために、別の一連の生体内実験が行われた。これらの実験の１つでは、神経膠芽腫は、実験の０日目にＧＢＭ Ｆ９８細胞を同所性に注射することによってラットに誘発された。６日目に、各ラットの脳のＭＲＩスキャンの第１のセットが取得された。７日目から１０日目に、１００ｋＨｚの交流電界をすべてのラットに印加した。１０日目（すなわち、７２時間電界を印加した後）に、他のラットには注射しなかったが、一部のラットに２５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸを腹腔内注射した。続いて、１３日目（すなわち、ＰＴＸ投与の３日後）に、各ラットの脳のＭＲＩスキャンの第２のセットが取得された。Ｋｉ６７（赤）およびＤＡＰＩ（青）染色は、試験ラットと対照ラットで評価された。観察されたＫｉ６７／ＤＡＰＩ比の定量化は、図１０に示すように、対照（交流電界のみ）と比較して、交流電界＋ＰＴＸ処理の組み合わせによるＧＢＭ腫瘍の細胞増殖の有意な減少を明らかにした。

【0060】

１３日目のＫｉ６７／ＤＡＰＩ比を定量化する代わりに、１５日目の腫瘍体積の倍増を決定するために、ＭＲＩスキャンと死後組織切片を使用したしたことを除いて、１５ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＸを使用した同様の実験を行った。これらの実験からの腫瘍体積が図１１に示されている。そしてここでも、実験により、３つの対照すべて（すなわち、熱のみ、熱＋ＰＴＸ、および交流電界のみ）と比較して、交流電界＋ＰＴＸ処理の組み合わせによるＧＢＭ腫瘍の腫瘍体積増加倍率の有意な減少が明らかになった。まとめると、これら２つの実験は、パクリタキセルが交流電界（１００ｋＨｚ）との組み合わせでのみＧＢＭ細胞増殖と腫瘍成長に影響を与えることを示している。そして、本発明者らは、交流電界が、ＰＴＸ（またはその代謝物）がＢＢＢを通過することを可能にすると結論付けた。

【0061】

交流電界の強度と、ＢＢＢの完全性および透過性に対するこれらの電界の影響との間の関係を決定するための実験も実施された。生体外実験では、細胞の完全性と透過性における１００ｋＨｚの交流電界の影響を、ＴＥＥＲ測定およびＦＩＴＣ－デキストラン透過性アッセイによって評価した。この実験は３回繰り返され、統計的有意性は対応のない両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して評価された。この実験では、マウスのｃｅｒｅｂＥＮＤ細胞を使用して作成された人工ＢＢＢが、それぞれ１．６２、０．９７、および０．７６Ｖ／ｃｍ ＲＭＳの電界強度で２４～７２時間１００ｋＨｚの交流電界で処理された。この細胞は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（緑色）に結合したクローディン－５抗体免疫蛍光染色で染色され、核はＤＡＰＩ（青）で染色された。

【0062】

得られた画像を目視検査すると、以下の結果が明らかになった。０．９７Ｖ／ｃｍの場合、交流電界が印加された時間（２４～７２時間）に関係なく、画像はいくつかの形態学的変形を明らかにした。細胞は紡錘状の外観を失い、擦り切れた境界を持つより大きな細胞に変化した。１．６２Ｖ／ｃｍの場合の対応する効果は、０．９７Ｖ／ｃｍの場合よりも劇的であった。一方、０．７６Ｖ／ｃｍの電界を使用して処理された細胞は、交流電界投与の期間に関係なく、端に向かって先細りになる長くて狭い細胞で、対照とより類似しているように見えた。膜の擦り切れた輪郭の存在は０．７６Ｖ／ｃｍの場合に顕著であり、より大きな細胞の存在も明らかであったが、これらの影響は０．９７Ｖ／ｃｍの場合と比較してわずかであった。これらの発見は、交流電界に対する細胞の応答が電界強度に依存することを示している。

【0063】

交流電界の強度とＢＢＢの完全性および透過性におけるこれらの電界の影響との関係は、１００ｋＨｚの交流電界を７２時間印加した後のガドリニウム（Ｇｄ）取り込みを測定するために、連続ダイナミック造影（ＤＣＥ）ＭＲＩを使用したラットの生体内実験からも明らかであった。ラットの脳は、３つの領域（前部、後部、および中央）に分割され、これら３つの領域への交流電界送達のシミュレーションにより、１．５±０．６Ｖ／ｃｍ ＲＭＳ、２．１±１．２Ｖ／ｃｍ ＲＭＳ、および２．７±１．７Ｖ／ｃｍ ＲＭＳの電界強度が得られた。連続ＤＣＥ ＭＲＩの結果は、Ｇｄ注射の約１０分後に中脳および後脳で有意に増加した信号増強を示し（対照ラットと比較して）、Ｇｄ蓄積の増加を意味する。一方、脳の前部では有意なＧｄ蓄積は観察されず、これは、この領域の強度が低いことと一致している。これらの発見はまた、交流電界に対する細胞の応答が電界強度に依存することを示している。

【0064】

この実験の他の発見は以下の通りであった：対照ラット（交流電界を使用して処理されなかった）において有意なＧｄ蓄積は観察されなかった。さらに、交流電界をオフにしてから９６時間までＧｄ注入を遅らせた場合、Ｇｄの有意な蓄積はなかった。後者の発見は、それらのラットのＢＢＢが元の状態に回復したと結論付けることを導く。対照の脳、および交流電界が回された後にＧｄ注入が９６時間まで延期されたラットの脳では最小限の増強が観察されたのに対し、造影剤投与の２０から２３分後のＧｄ蓄積の空間分布の分析は、Ｇｄ増強が試験ラットの脳全体に分布していることを示した。

【0065】

交流電界を印加することによって以前に開いた後に（ＢＢＢが回復するのに十分な時間、交流電界を停止することによって）閉じたＢＢＢを、その後、ＢＢＢへ交流電界をもう一度印加することによって再度開くことができるかどうかを決定するために、別の一連の実験を行った。この実験では、クローディン－５抗体免疫蛍光染色で染色されたマウスのｃｅｒｅｂＥＮＤ細胞を使用して作成された人工ＢＢＢを試験し、核をＤＡＰＩで染色した。ＢＢＢは、１．６２Ｖ／ｃｍの電界強度で７２時間、１００ｋＨｚの交流電界で処理され、電界の方向は２つの垂直方向の間で１秒ごとに切り替えられた。この初めの７２時間の間隔の後に、交流電界が印加されなかった９６時間の回復期間が続いた。続いて、１．６２Ｖ／ｃｍの電界強度で９６時間の第２の間隔、１００ｋＨｚの交流電界を印加した。交流電界は対照には印加されなかった。

【0066】

上で説明したように、クローディン５は無傷のＢＢＢの存在を示している。初めの７２時間後に得られた画像の目視検査は、交流電界が、細胞境界から細胞質への密着結合タンパク質の非局在化によって人工ＢＢＢを妨害したことを明らかにし、人工ＢＢＢがもはや無傷ではなかったことを示す。９６時間の回復期間後に得られた画像の目視検査は、人工ＢＢＢが元の無傷の状態に戻っていることを明らかにし、外観が対照と類似していた。そして特に、第２の間隔の７２時間中と第２の間隔の終わりの両方で得られた画像の目視検査は、細胞境界から細胞質への密着結合タンパク質の非局在化によって、交流電界が再び人工ＢＢＢを妨害したことを明らかにし、人工ＢＢＢが再び無傷ではなくなったことを示す。これらの発見は、以前に開かれ、その後閉じられたＢＢＢが、交流電界をＢＢＢに印加することによって、実際にその後再び開かれることができることを示している。これは、ＣＮＳ疾患治療のための薬の反復投与に特に有利であり得る。

【0067】

これを考慮して、図１２に示されている、被験者の脳の血液脳関門を越えて物質を送達するための以下の方法を使用することができる。第１に、ステップＳ１０において、交流電界（例えば、７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間の周波数）が第１の期間、被験者の脳に印加される。好ましくは、交流電界は、被験者の脳の少なくとも一部において少なくとも１Ｖ／ｃｍの電界強度を有する。被験者の脳に第１の期間交流電界を印加することで、被験者の脳の血液脳関門の透過性が増加する。場合によっては、第１の期間は少なくとも２４時間であり、場合によっては、第１の期間は少なくとも４８時間である。

【0068】

次に、ステップＳ２０では、第１の期間が経過した後、第１の物質が被験者に（例えば、静脈内または経口的に）投与される。血液脳関門の増加した透過性によって、第１の物質が血液脳関門を通過できるようになる。次に、ステップＳ３０において、血液脳関門が回復するのに十分な時間、交流電界の印加が停止される。

【0069】

ステップＳ５０では、血液脳関門が回復した後、交流電界（例えば、７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間の周波数）が第２の期間、被験者の脳に印加される。好ましくは、交流電界は、被験者の脳の少なくとも一部において少なくとも１Ｖ／ｃｍの電界強度を有する。被験者の脳に第２の期間の交流電界を印加することで、被験者の脳の血液脳関門の透過性が増加する。場合によっては、第２の期間は少なくとも２４時間であり、場合によっては、第２の期間は少なくとも４８時間である。

【0070】

次に、ステップＳ６０では、第２の期間が経過した後、第２の物質（例えば、第１の物質と任意選択で同一であり得る）が被験者に（例えば、静脈内または経口的に）投与される。血液脳関門の増加した透過性によって、第２の物質が血液脳関門を通過できるようになる。任意選択で、第１の物質および第２の物質の少なくとも１つはパクリタキセルである。

【0071】

図１２に示される方法のいくつかの例では、交流電界は７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間の周波数で印加され、第２の期間は少なくとも２４時間であり、交流電界は、被験者の脳の少なくとも一部において少なくとも１Ｖ／ｃｍの電界強度を有する。

【0072】

本明細書に記載の方法は、被験者の脳が腫瘍を含む場合に、被験者の脳の血液脳関門を越えて物質を送達するために使用され得る。脳腫瘍（例えば、膠芽腫）を治療するための既存のアプローチの１つは、５０から５００ｋＨｚの間、好ましくは１００から３００ｋＨｚの間の周波数で交流電界を腫瘍に印加することである。膠芽腫の場合、２００ｋＨｚが最も好ましい周波数である。これらの周波数での交流電界は、ＴＴＦｉｅｌｄｓと呼ばれ、米国特許第６，８６８，２８９号および第７，５６５，２０５号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。簡単に言えば、これらの２つの出願は、有糸分裂中に分裂している細胞を破壊することを説明している。ＴＴＦｉｅｌｄｓの有効性は、電界の方向が周期的に切り替えられる場合、腫瘍の少なくとも一部の電界強度が１Ｖ／ｃｍ以上である場合、および電界が長期間（例えば、数週間または数か月）、休憩をできるだけ少なくしながら印加される場合に向上する。

【0073】

脳腫瘍の患者では、ＴＴＦｉｅｌｄｓで腫瘍を治療し、同じ患者の血液脳関門を越えて物質を送達することが望ましい状況が発生する可能性がある（例えば、腫瘍に対する追加の攻撃ラインを提供するために、治療効果のある量の化学療法薬がＢＢＢを通過するのを助ける）。状況によっては、腫瘍の治療とＢＢＢの透過性を増加する両方のために、交流電界の単一周波数を使用することができる可能性がある。他の状況では、異なる周波数の交流電界を使用することが望ましい場合がある：第１の周波数は、ＢＢＢの透過性を増加するために改善された結果を提供するために選択され、第２の周波数は、ＴＴＦｉｅｌｄｓの抗腫瘍作用のための改善された結果を提供するために選択される。後者の状況では、通常、第２の周波数は第１の周波数よりも高くなる。

【0074】

図１０は、ＢＢＢ透過性を誘発するための第１の周波数、および細胞毒性を誘発するための第２の周波数を生成する装置のブロック図である。この装置は、従来のオプチューン（登録商標）フィールドジェネレータユニットと同様のＡＣ電圧発生器４４を含むが、２つの異なる周波数で動作する機能がある。第１の周波数は５０から１９０ｋＨｚの間であり、第２の周波数は５０から５００ｋＨｚの間である。いくつかの実施形態では、第１の周波数は７５ｋＨｚから１２５ｋＨｚの間であり、第２の周波数は１５０ｋＨｚから２５０ｋＨｚの間である。

【0075】

２つの異なる周波数で動作する機能は、例えば、リレーを使用して、構成要素の第１のセットまたは構成要素の第２のセットのいずれかをＡＣ電圧を生成する従来の回路に切り替え、発振器の動作周波数を調整することによって実施され得る。ＡＣ電圧発生器４４は、制御入力の状態に応じて、第１の周波数または第２の周波数のいずれかを出力するように構成される。制御入力が第１の状態にあるとき、ＡＣ電圧発生器４４は第１の周波数を出力し、制御入力が第２の状態にあるとき、ＡＣ電圧発生器４４は第２の周波数を出力する。コントローラ４２は、ＡＣ電圧発生器４４が第２の周波数を出力するように、制御入力を第２の状態にするようにプログラムされている。コントローラ４２はまた、第１の周波数に切り替える要求を受け入れるようにプログラムされている。図１０に示される実施形態では、要求は、押しボタン、タッチスクリーンなどを含むがこれらに限定されない様々な従来のアプローチのいずれかを使用して実装され得るユーザインターフェース４０を介して到着する。代替の実施形態では、要求は、タブレット、スマートフォンなどからＲＦ（例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、ＷｉＦｉなど）を介して到着し得る。

【0076】

要求を受信すると、コントローラ４２は、制御入力を第１の状態にし、ＡＣ電圧発生器４４が一定の時間間隔（例えば、７２時間）の間、第１の周波数を出力するようにする。この時間間隔が経過した後、コントローラ４２は、制御入力を第２の状態にし、ＡＣ電圧発生器４４が第２の周波数の出力に戻るようにする。

【0077】

任意選択で、ＡＣ電圧発生器４４は、制御入力の状態に応じて、１つまたは複数の追加の周波数（例えば、第３の周波数、第４の周波数など）を出力するように構成され得る。好ましくは、これらの追加の周波数のそれぞれは、細胞毒性を誘発するように選択される。これらの実施形態では、コントローラ４２は、要求が到着する前に、ＡＣ電圧発生器４４に第２の周波数、および１つまたは複数の追加周波数を出力させる状態を介して制御入力を循環させるようにプログラムされる。コントローラ４２はまた、第１の周波数に切り替える要求を受け入れるようにプログラムされている。要求を受信すると、コントローラ４２は、制御入力を第１の状態にし、ＡＣ電圧発生器４４が一定の時間間隔（例えば、７２時間）の間、第１の周波数を出力するようにする。この時間間隔が経過した後、コントローラ４２は、ＡＣ電圧発生器４４に第２の周波数、および１つまたは複数の追加の周波数を出力させる状態を介して制御入力を循環させることに戻る。

【0078】

図１３に示されるシステムは、ある人物がＴＴＦｉｅｌｄｓと化学療法を含む併用療法によって治療されている腫瘍を有する場合に特に有用である。この状況では、システムはほとんどの場合第２の周波数で動作し、最大の細胞毒性効果を提供する。しかし、ある人物が化学療法の投薬のために化学療法クリニックを訪れる前に、医療従事者（またはユーザ）が、このシステムを、ＢＢＢ透過性を促進する第１の周波数に切り替えるために、ユーザインターフェース４０を作動させる。この状況では、ユーザインターフェースの作動は、例えば、化学療法の予想される開始の７２時間前に行われ得る。

【0079】

あるいは、要求を（例えば、ユーザインターフェース４０から）受信すると、コントローラ４２は、ＡＣ電圧発生器４４が第１の周波数を一定時間間隔（例えば、１時間）出力した後、第２の周波数と第１の周波数との間を往復する（例えば、１時間ごとに切り替える）ように、制御入力を制御することができる。最終的に（例えば、関連する物質が患者の血流から排出されたとき）、コントローラ４２は、ＡＣ電圧発生器４４が第２の周波数の出力に戻るように制御入力を制御する。

【0080】

Ｏｐｔｕｎｅで使用される従来の電極に類似した電極のセット（図示せず）は、ＡＣ電圧発生器４４の出力に接続されている。

【0081】

ＢＢＢを開くために最適化された１つの周波数（例えば、１００ｋＨｚ）で交流電界を印加し、続いて交流電界の周波数を別の周波数（例えば、２００ｋＨｚ）に切り替えることによってＢＢＢが開いたときのＢＢＢ透過性への影響を確認するために、追加の実験が行われた。

【0082】

より具体的には、これらの実験は、クローディン－５抗体免疫蛍光染色で染色されたマウスのｃｅｒｅｂＥＮＤ細胞を使用して作成された人工ＢＢＢを試験し、核をＤＡＰＩで染色した。このＢＢＢは、１．６２Ｖ／ｃｍの電界強度の１００ｋＨｚの交流電界で、７２時間処理され、電界の方向は２つの垂直方向の間で１秒ごとに切り替えられた。この初めの７２時間の間隔の後、１００ｋＨｚの交流電界を停止し、１．６２Ｖ／ｃｍの電界強度の２００ｋＨｚの交流電界を５日間の第２の間隔で印加した。交流電界は対照には印加されなかった。

【0083】

上で説明したように、クローディン５は開放したＢＢＢの存在を示す。初めの７２時間後に得られた画像の目視検査は、１００ｋＨｚの交流電界が、密着結合タンパク質の細胞境界から細胞質への非局在化によって人工ＢＢＢを妨害したことを明らかし、人工ＢＢＢが開いていたことを示している。特に、第２の間隔（つまり、５日間隔）を通して取得された画像の目視検査は、元の２００ｋＨｚの交流電界が印加されなくなったにもかかわらず、人工ＢＢＢが開いたままであることを明らかにした。これらの発見は、ＢＢＢを開くために最適化された１つの周波数（例えば、１００ｋＨｚ）で以前に開かれたＢＢＢは、異なる周波数の交流電界が印加された場合、異なる周波数が閉じた状態から開いた状態に切り替えるのに有効でなかったとしても、開いた状態を維持することを示している。言い換えれば、異なる周波数は、以前に開いたＢＢＢの透過性を維持するように作用する。

【0084】

これを考慮して、図１４に示されている、被験者の脳の血液脳関門を越えて物質を送達するための以下の方法を使用することができる。第１に、ステップＳ１２０において、第１の周波数（例えば、１００ｋＨｚ、７５～１２５ｋＨｚ、または５０～１９０ｋＨｚ）での第１の交流電界が、第１の期間（例えば、少なくとも２４時間）被験者の脳に印加される。第１の周波数で第１の交流電界を被験者の脳に第１の期間印加することで、被験者の脳の血液脳関門の透過性が増加する。続いて、ステップＳ１３０において、第２の周波数（例えば、２００ｋＨｚまたは１９０～２１０ｋＨｚ）での第２の交流電界が、第２の期間、被験者の脳に印加される。第２の周波数は第１の周波数とは異なり、第２の周波数での第２の交流電界は、血液脳関門の透過性を維持するように作用する。

【0085】

次に、ステップＳ１４０において、物質は、第１の期間が経過した少なくとも２４時間後に被験者に投与される。血液脳関門の維持された透過性により、物質は血液脳関門を通過できる。

【0086】

図１４に示される方法のいくつかの例では、第２の期間は、少なくとも１週間の長さである単一の中断されない時間間隔を含む。図１４に示される方法の他の例では、第２の期間は、第２の交流電界が第２の周波数で被験者の脳に印加される、複数の非連続の時間間隔を含み、複数の非連続の時間間隔は少なくとも１週間まで集合的に合算される。

【0087】

上記の方法のいずれかに関連して、交流電界の終了後、十分な時間が経過した後、ＢＢＢは元の低透過性状態に回復すべきことに留意されたい。これは、被験者の安全のために多くの状況で重要になり得る。

【0088】

上記の生体外データはマウスの細胞を使用して得られたものであるが、予備データは生体外でヒト細胞に対して同様の効果を示していることにも留意されたい。

【0089】

本発明は特定の実施形態を参照して開示されてきたが、添付の特許請求の範囲で定義されるように、本発明の範囲および範囲から逸脱することなく、記載された実施形態に対する多数の修正、変更、および変更が可能である。したがって、本発明は、記載された実施形態に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲の文言およびその同等物によって定義される全範囲を有することが意図されている。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【国際調査報告】