特表 2023-522848 改善された部位特異的改変のための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-01

(54)【発明の名称】改善された部位特異的改変のための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20230525BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20230525BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230525BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/09 100

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N15/52 Z

C12N15/54

C12N15/55

C07K19/00

C12N9/00

C12N9/10

C12N9/16 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022561099

(86)(22)【出願日】2021-04-07

(85)【翻訳文提出日】2022-12-05

(86)【国際出願番号】 EP2021059062

(87)【国際公開番号】W WO2021204877

(87)【国際公開日】2021-10-14

(31)【優先権主張番号】63/104,123

(32)【優先日】2020-10-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/006,997

(32)【優先日】2020-04-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】391008951

【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ

【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】マレスカ，マルチェッロ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050DD02

4B050DD20

4B050LL01

4B050LL10

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA27

4B065CA29

4B065CA31

4B065CA44

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA89

4H045EA20

4H045EA60

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、改善された遺伝子編集効率のためのタンパク質、組成物、方法、及びキットを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓヌクレアーゼと、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、又はそれらの組み合わせと、を含む融合タンパク質を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼと、（ｉｉ）逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、又はそれらの組み合わせと、を含む融合タンパク質であって、前記Ｃａｓヌクレアーゼが、二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成することができる融合タンパク質。

【請求項2】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、又はＣａｓ１４である、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、配列番号１、２９、又は３０のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記Ｃａｓ９が、ＩＩＢ型Ｃａｓ９である、請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記融合タンパク質が、Ｃａｓヌクレアーゼと、逆転写酵素と、を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記逆転写酵素が、ＭＭＬＶ逆転写酵素又はＲ２逆転写酵素である、請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

前記逆転写酵素が、配列番号２～３のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項５又は６に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

前記融合タンパク質が、Ｃａｓヌクレアーゼと、ＤＮＡポリメラーゼと、を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼミュー、ＤＮＡポリメラーゼデルタ、又はＤＮＡポリメラーゼイプシロンである、請求項７に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号４～６のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項７又は８に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

前記融合タンパク質が、Ｃａｓヌクレアーゼと、ＤＮＡリガーゼと、を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

前記ＤＮＡリガーゼが、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼである、請求項１１に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

前記ＤＮＡリガーゼが、配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１１又は１２に記載の融合タンパク質。

【請求項14】

ＤＮＡ－結合又はＲＮＡ－結合ドメインを更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項15】

前記ＤＮＡ－結合ドメインが、ジンクフィンガーＤＮＡ－結合ドメイン、転写因子、又はアデノ随伴ウイルスＲｅｐタンパク質である、請求項１４に記載の融合タンパク質。

【請求項16】

前記ＲＮＡ－結合ドメインが、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ２）である、請求項１４に記載の融合タンパク質。

【請求項17】

前記ＲＮＡ－結合ドメインが、ＫＨドメインを含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。

【請求項18】

前記ＲＮＡ－結合ドメインが、ヘテロ核リボ核タンパク質Ｋ（ｈｎＲＮＰＫ）である、請求項１７に記載の融合タンパク質。

【請求項19】

前記ＤＮＡ－結合ドメインが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を結合することができる、請求項１４に記載の融合タンパク質。

【請求項20】

ＤＮＡ－結合ドメインが、はるか上流のエレメント結合タンパク質（ＦＵＢＰ）である、請求項１９に記載の融合タンパク質。

【請求項21】

前記ＤＮＡ－結合又は前記ＲＮＡ－結合ドメインが、配列番号８～１１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項22】

（ｉ）と（ｉｉ）との間にポリペプチドリンカーを更に含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項23】

配列番号１８～２６のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項24】

ａ）請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、
ｂ）前記融合タンパク質と複合体を形成し、（ｉ）ガイド配列と、（ｉｉ）前記逆転写酵素、前記ＤＮＡポリメラーゼ、又は前記ＤＮＡリガーゼのための鋳型配列と、を含むポリヌクレオチドと、
を含む組成物。

【請求項25】

前記ポリヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

前記ガイド配列がＲＮＡを含み、前記鋳型配列がＤＮＡを含む、請求項２４に記載の組成物。

【請求項27】

前記鋳型配列が、脱塩基部位、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカー、又はその両方を含む、請求項２４に記載の組成物。

【請求項28】

前記ガイド配列が、約１５～約２０ヌクレオチド長である、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項29】

前記ポリヌクレオチドが、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項30】

前記組成物が、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む第２のポリヌクレオチドを含む、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項31】

前記鋳型配列が、プライマー－結合配列及び対象とする配列を含む、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項32】

前記プライマー－結合配列及び前記対象とする配列が、ＤＮＡを含む、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

前記対象とする配列が、ＤＮＡを含む、請求項３１に記載の組成物。

【請求項34】

前記鋳型配列が、約２５～約１００００ヌクレオチド長である、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項35】

前記プライマー－結合配列が、約４～約３０ヌクレオチド長である、請求項２４～３４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項36】

前記対象とする配列が、約５ヌクレオチド長～約９０００ヌクレオチド長である、請求項２４～３５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項37】

前記ポリヌクレオチドが、前記ガイド配列と前記鋳型配列との間にスペーサーを含む、請求項２４～３６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項38】

前記スペーサーが、約１０～約２００ヌクレオチド長である、請求項３７に記載の組成物。

【請求項39】

前記スペーサーが、前記逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼのための停止配列を含む、請求項３７又は３８に記載の組成物。

【請求項40】

前記スペーサーが、２つ以上の停止配列を含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項41】

前記停止配列が、二次構造を含む、請求項３９又は４０に記載の組成物。

【請求項42】

前記二次構造が、ヘアピンループである、請求項４１に記載の組成物。

【請求項43】

ａ）請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、
ｂ）前記融合タンパク質と複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドと、
ｃ）前記逆転写酵素、前記ＤＮＡポリメラーゼ、又は前記ＤＮＡリガーゼのための鋳型配列を含む鋳型ポリヌクレオチドと、を含む組成物。

【請求項44】

前記ガイドポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項４３に記載の組成物。

【請求項45】

前記鋳型ポリヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、請求項４３に記載の組成物。

【請求項46】

前記鋳型配列が、ＤＮＡを含む、請求項４３に記載の組成物。

【請求項47】

前記鋳型配列が、脱塩基部位、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカー、又はその両方を含む、請求項４３に記載の組成物。

【請求項48】

前記ガイド配列が、約１５～約２０ヌクレオチド長である、請求項４３～４７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項49】

前記ガイドポリヌクレオチドが、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む、請求項４３～４８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項50】

前記組成物が、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む第３のポリヌクレオチドを更に含む、請求項４３～４８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項51】

前記鋳型配列が、約２５～約１００００ヌクレオチド長である、請求項４３～５０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項52】

前記鋳型配列が、対象とする配列を含む、請求項４３～５１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項53】

前記対象とする配列が、約５ヌクレオチド長～約９８００ヌクレオチド長である、請求項５２に記載の組成物。

【請求項54】

前記対象とする配列が、ＤＮＡを含む、請求項５２又は５３に記載の組成物。

【請求項55】

前記鋳型ポリヌクレオチドが、プライマー－結合配列を更に含む、請求項４３～５４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項56】

前記プライマー－結合配列が、約４～約３０ヌクレオチド長である、請求項５５に記載の組成物。

【請求項57】

前記プライマー－結合配列及び前記対象とする配列が、ＤＮＡを含む、請求項５５又は５６に記載の組成物。

【請求項58】

前記鋳型ポリヌクレオチドが、前記逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼのための停止配列を更に含む、請求項４３～５７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項59】

前記鋳型ポリヌクレオチドが、２つ以上の停止配列を含む、請求項５８に記載の組成物。

【請求項60】

前記停止配列が、二次構造を含む、請求項５８又は５９に記載の組成物。

【請求項61】

前記二次構造が、ヘアピンループである、請求項６０に記載の組成物。

【請求項62】

前記鋳型ポリヌクレオチドが、対象となる配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、請求項４３～６１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項63】

請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項64】

請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項65】

請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む細胞。

【請求項66】

請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド又は請求項６４に記載のベクターを含む細胞。

【請求項67】

請求項２４～６２のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞。

【請求項68】

標的ポリヌクレオチド中の標的配列において部位特異的改変を提供する方法であって、前記標的ポリヌクレオチドを請求項２４～６２のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む方法。

【請求項69】

前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記ガイド配列が、前記標的配列にハイブリダイズすることができる、請求項６８又は６９に記載の方法。

【請求項71】

前記接触が、前記Ｃａｓヌクレアーゼが前記標的配列において二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成するのに十分な条件下で行われる、請求項６８～７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記鋳型配列が、対象とする配列を含む、請求項６８～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記鋳型配列が、前記標的配列にハイブリダイズすることができるプライマー－結合配列を含む、請求項６８～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記接触が、前記逆転写酵素が前記対象とする配列の相補鎖を転写するのに十分な条件下で行われる、請求項６８～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記鋳型配列を開裂して前記対象とする配列を含む二本鎖配列を生成することを更に含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記開裂が、ＲＮアーゼＨにより行われる、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記接触が、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記対象とする配列を含む二本鎖配列を生成するのに十分な条件下で行われる、請求項６８～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記接触が、前記ＤＮＡリガーゼが前記対象とする配列を前記開裂された標的配列にライゲートするのに十分な条件下で行われる、請求項６８～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記対象とする配列を含む前記二本鎖配列が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により、前記開裂された標的配列に挿入される、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記対象とする配列を含む前記二本鎖配列が、ＤＮＡリガーゼにより、前記開裂された標的配列に挿入される、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記標的ポリヌクレオチド中の第２の標的配列において第２の二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成することを更に含む、請求項６８～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記対象とする配列が、前記標的配列と前記第２の標的配列との間の前記標的ポリヌクレオチドの配列を置換する、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むキット。

【請求項84】

前記融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチド及び／又は前記ポリヌクレオチドを発現させるためのベクターを更に含む、請求項８３に記載のキット。

【請求項85】

前記逆転写酵素、前記ＤＮＡポリメラーゼ、又は前記ＤＮＡリガーゼのための鋳型配列を含む鋳型ポリヌクレオチド及び／又は前記鋳型ポリヌクレオチドを発現させるためのベクターを更に含む、請求項８３に記載のキット。

【請求項86】

ｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを更に含む、請求項８３又は８４に記載のキット。

【請求項87】

ＲＮアーゼＨを更に含む、請求項８３～８６のいずれか一項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、改善された遺伝子編集効率のためのタンパク質、組成物、方法、及びキットを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓヌクレアーゼと、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、又はそれらの組み合わせと、を含む融合タンパク質を提供する。

【背景技術】

【0002】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのプログラム可能なヌクレアーゼは、標的部位で挿入及び欠失（インデル）の混合物を誘導することによって遺伝子を破壊できる部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することができる。しかしながら、鋳型依存相同性配向型修復（ＨＤＲ）に依存するＤＳＢ修復は、低い頻度を有し得るが、高効率の鋳型非依存非相同末端結合（ＮＨＥＪ）はエラーが発生しやすく、所望の挿入を優先しない場合がある。

【0003】

非特許文献１は、開裂部位に短い配列を挿入することができる逆転写酵素に融合された、一本鎖切断を生成するプログラム可能なニッカーゼを利用するプライム編集の開発について記載している。しかしながら、プライム編集は、最大２２塩基対の短い配列のみを挿入することができ、ＲＮＡの除去及び標的部位への一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションの複雑なメカニズムに依存し、細胞平衡による重複する「フラップ」配列の除去も必要とする。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ５７６：１４９－１５７（２０１９））

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼと、（ｉｉ）逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、又はそれらの組み合わせと、を含む融合タンパク質であって、Ｃａｓヌクレアーゼが、二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成することができる融合タンパク質を提供する。

【0006】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼと、（ｉｉ）逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、又はそれらの組み合わせと、を含む融合タンパク質であって、Ｃａｓヌクレアーゼが、二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成することができる融合タンパク質を提供する。

【0007】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ＩＩＢ型Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼと、逆転写酵素と、を含む。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＭＭＬＶ逆転写酵素又はＲ２逆転写酵素である。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、配列番号２～３のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼと、ＤＮＡポリメラーゼと、を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼミュー、ＤＮＡポリメラーゼデルタ、又はＤＮＡポリメラーゼイプシロン、Ｒｅｖ３、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４～６のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼと、ＤＮＡリガーゼと、を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ－結合又はＲＮＡ－結合ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合ドメインは、ジンクフィンガーＤＮＡ－結合ドメイン、転写因子、又はアデノ随伴ウイルスＲｅｐタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－結合ドメインは、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ２）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－結合ドメインは、ＫＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－結合ドメインは、ヘテロ核リボ核タンパク質Ｋ（ｈｎＲＮＰＫ）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合ドメインは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を結合することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合ドメインは、はるか上流のエレメント結合タンパク質（ＦＵＢＰ）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合又はＲＮＡ－結合ドメインは、配列番号８～１１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、（ｉ）と（ｉｉ）との間にポリペプチドリンカーを更に含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１８～２６のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書で提供される融合タンパク質と、（ｂ）融合タンパク質と複合体を形成し、（ｉ）ガイド配列と、（ｉｉ）逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼのための鋳型配列と、を含むポリヌクレオチドと、を含む組成物を提供する。

【0015】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列はＲＮＡを含み、鋳型配列はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、脱塩基部位、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカー、又はその両方を含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１５～約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む第２のヌクレオチドを含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、鋳型配列は、プライマー－結合配列及び対象とする配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列及び対象とする配列は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約２５～約１００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約４～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５ヌクレオチド長～約９８００ヌクレオチド長である。

【0017】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ガイド配列と鋳型配列との間にスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約１０～約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼのための停止配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、２つ以上の停止配列を含む。いくつかの実施形態では、停止配列は、二次構造を含む。いくつかの実施形態では、二次構造は、ヘアピンループである。

【0018】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書で提供される融合タンパク質と、（ｂ）融合タンパク質と複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドと、（ｃ）逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼのための鋳型配列を含む鋳型ポリヌクレオチドと、を含む組成物を提供する。

【0019】

いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、脱塩基部位、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカー、又はその両方を含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１５～約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む第３のポリヌクレオチドを更に含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約２５～約１００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、対象とする配列を含む。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５ヌクレオチド長～約９８００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、ＤＮＡを含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、プライマー－結合配列を更に含む。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約１０～約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列及び対象とする配列は、ＤＮＡを含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼのための停止配列を更に含む。いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、２つ以上の停止配列を含む。いくつかの実施形態では、停止配列は、二次構造を含む。いくつかの実施形態では、二次構造は、ヘアピンループである。

【0023】

いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、対象となる配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

【0025】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される融合タンパク質を含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は本明細書で提供されるベクターを含む細胞を提供する。

【0026】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される組成物を含む細胞を提供する。

【0027】

いくつかの実施形態では、本開示は、標的ポリヌクレオチド中の標的配列において部位特異的改変を提供する方法であって、標的ポリヌクレオチドを本明細書で提供される組成物と接触させることを含む方法を提供する。

【0028】

いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、標的配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、接触は、Ｃａｓヌクレアーゼが標的配列において二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成するのに十分な条件下で行われる。

【0029】

いくつかの実施形態では、鋳型配列は、対象とする配列を含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、標的配列にハイブリダイズすることができるプライマー－結合配列を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、接触は、逆転写酵素が対象とする配列の相補鎖を転写するのに十分な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、方法は、鋳型配列を開裂して対象とする配列を含む二本鎖配列を生成することを更に含む。いくつかの実施形態では、開裂は、ＲＮアーゼＨにより行われる。

【0031】

いくつかの実施形態では、接触は、ＤＮＡポリメラーゼが対象とする配列を含む二本鎖配列を生成するのに十分な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、接触は、ＤＮＡリガーゼが対象とする配列を開裂された標的配列にライゲートするのに十分な条件下で行われる。

【0032】

いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により、開裂された標的配列に挿入される。いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、ＤＮＡリガーゼにより、開裂された標的配列に挿入される。

【0033】

いくつかの実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中の第２の標的配列において第２の二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成することを更に含む。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、標的配列と第２の標的配列との間の標的ポリヌクレオチドの配列を置換する。

【0034】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される融合タンパク質を含むキットを提供する。

【0035】

いくつかの実施形態では、キットは、融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドを発現させるためのベクターを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼのための鋳型配列を含む鋳型ポリヌクレオチド及び／又は鋳型ポリヌクレオチドを発現させるためのベクターを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含むヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＲＮアーゼＨを更に含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９－ＲＴ融合物をｐｅｇＲＮＡ及びＤＮＡＰＫ阻害剤と併用して、遺伝子編集効率を高める。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1A-1D】図１Ａ～１Ｄは、本明細書の実施形態で記載される例示的な方法を示す。図１Ａ及び１Ｂは、「ＮＨＥＪ促進ドメイン」、例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼに融合されたＣａｓ９、ＰＲｉｍｅｄ ＩＮＳｅｒｔｉｏｎ（ＰＲＩＮＳ）と呼ばれる融合タンパク質を示す。図１Ａでは、「ＳＰＲＩＮｇＲＮＡ」（シングルプライム化挿入ガイドＲＮＡ）は、対象とする配列（「ｉｎｓ」）及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）を含む。図１Ｂでは、融合タンパク質は、ＤＮＡ又はＲＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＣＰ２、ＺＦ、ＴＡＬＥ、ＦＢＰ、Ｐｕｍｉｌｉｏ、ＨＵＨ、又はＳＮＡＰ）を更に含み、ＰＢＳを伴う対象とする配列は分離ポリヌクレオチドとして提供される。図１Ｃは、図１Ａに示されるＰＲＩＮＳ複合体の作用メカニズムを示す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチドにて二本鎖開裂を生成する。ＰＢＳ及び対象とする配列を含有するＣａｓ９複合体中の鋳型配列を使用して、対象とする配列の複製を含む二本鎖挿入配列を生成する。次いで、生成された二本鎖挿入配列を、ＮＨＥＪにより開裂された標的ポリヌクレオチドにライゲートすることができる。図１Ｄは、挿入及び欠失を組み合わせるための更なる実施形態を示す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチドに二本鎖切断を生成する。ＰＢＳ及び対象とする配列を含有するＣａｓ９複合体中の鋳型配列を使用して、対象とする配列の複製を含む二本鎖挿入配列を生成する。次いで、生成された二本鎖挿入配列は、ＮＨＥＪによって、第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によって下流で生成された別の切断にライゲートすることができる。２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の間の配列は、対象となる配列に置換される。

【図2A-2E】図２Ａ～２Ｅは、本明細書の実施形態で記載される例示的な方法を示す。図２Ａは、標的配列中で二本鎖切断を生じさせる挿入配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を有するＣａｓ９－ＲＴ融合タンパク質（ＰＲＩＮＳ）を示す。ＰＲＩＮＳは伸長のためにｇＲＮＡに結合する。図２Ｂは伸長の結果を示し、伸長された配列は破線で示される。図２Ｃは、例えばＲＮアーゼＨによる、伸長配列における二本鎖切断の生成を示す。図２Ｄは、ＮＨＥＪによる開裂された標的配列への伸長配列の組み込みを示す。図２Ｅは、挿入された配列を示す。

【図3A-3B】図３Ａ及び３Ｂは実施例１に関し、ＡＡＶＳ１部位でのＣａｓ９編集（図３Ａ）対ＰＲＩＮＳ編集（図３Ｂ）の比較を示す。相対編集頻度は、実施例１に記載されているようにＲＩＭＡによって決定された。挿入は楕円で示されている。図３Ｂは、ＰＲＩＮＳが配列ＡＡＧＡＴＧの鋳型挿入を容易にし、ＰＲＩＮＳがＣａｓ９を介して挿入を促進することを示す。全ての挿入は、元の配列ＡＡＧＡＴＧに由来する。

【図4】図４は、本明細書の実施形態で記載される例示的な方法を示す。Ｃａｓヌクレアーゼは、ｇＲＮＡによって標的配列にガイドされ、二本鎖ＤＮＡ切断を生成する。鋳型配列は、開裂されたＤＮＡとハイブリダイズするプライマー－結合配列を含み、プライマーとして機能し、対象とする配列を含む。例えばＣａｓ９ヌクレアーゼに融合した逆転写酵素は、プライマーから第１のｃＤＮＡを合成する。第１のｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖は、ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼによって生成される。第１のｃＤＮＡ及び第１のｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖はハイブリダイズして二本鎖配列を生成し、ＤＮＡ修復経路、例えばＮＨＥＪによって開裂されたＤＮＡに挿入することができる。

【図5A-5D】図５Ａ～５Ｄは、実施例２に関連し、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）（Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７６：１４９－１５７（２０１９）により記載されているとおり）を利用したプライム編集対ＡＡＧＡＴＧ配列を挿入するためのＡＡＶＳ１部位でのシングルプライム化挿入ガイドＲＮＡ（ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ）を利用したＰＲＩＮＳ編集の比較を示す。相対編集頻度は、本明細書に記載の断片分析によって決定された。図５Ａ（ＰＲＩＮＳ）の図５Ｂ（プライム編集）との比較は、ＰＲＩＮＳがプライム編集よりも効率的であることを示している。図５Ｃ及び５Ｄは、ＰＲＩＮＳのＮＨＥＪ依存性を実証する。図５Ｃ及び５Ｄは、ＮＨＥＪに関与するＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ阻害剤の存在下でのＰＲＩＮＳ（図５Ｃ）及びプライム編集（図５Ｄ）挿入頻度の比較を示す。

【図6】図６は、実施例３に関し、ＡＡＶＳ１部位でＰＲＩＮＳとともにｐｅｇＲＮＡ及びｓｐｒｉｎｇＲＮＡを使用してＡＡＧＡＴＧ配列を挿入する効果を示す。相対編集頻度は、本明細書に記載の断片分析によって決定された。図６に示されるとおり、ｐｅｇＲＮＡ及びｓｐｒｉｎｇＲＮＡは、ＰＲＩＮＳによるＤＮＡ挿入を、プライム編集と同様の経路又はＰＲＩＮＳと同様の経路（プライム化編集挿入）のいずれかによって促進することができる。

【図7】図７は、実施例４に関し、ＤＮＡ依存性キナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）阻害剤ＡＺＤ７６４８の存在下又は非存在下で、ＰＲＩＮＳ編集又はプライム編集を使用した効果を示す。特異的な組み込みは、本明細書に記載されているように、ＮＧＳ Ａｍｐｌｉｃｏｎ－Ｓｅｑによって決定された。棒グラフは、ｎ＝２の平均を標準偏差で表す。「＃１」又は「＃２」とラベル付けされた棒は、様々なｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（ＰＲＩＮＳ編集の場合）又は様々なｐｅｇＲＮＡ（プライム編集の場合）を指す。

【図8】図８は、実施例５に関する。図８は、本明細書に記載されるように、ｓｐｒｉｎｇＲＮＡを含むＤＮＡ鋳型配列（「ＤＮＡテール」）又はｓｐｒｉｎｇＲＮＡを含むＲＮＡ鋳型配列（「ＲＮＡテール」）のいずれかを使用した、Ｃａｓ９＋ＲＴ（「ＰＥ０」）融合物、Ｃａｓ９＋ＤＮＡポリメラーゼＤ（「ＰＥ０ ＰｏｌＤ」）融合物、Ｃａｓ９＋Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（「ＰＥ０ Ｐｈｉ」）融合物、又はＣａｓ９対照を使用した場合の編集効率のまとめを示す。

【図9】図９は、実施例５に関する。図９は、本明細書に記載のとおり、Ｃａｓ９＋ＲＴ（「ＰＥ０」）融合タンパク質と３つの異なるガイドＲＮＡ（１つはＲＮＡテール（「１２３ＲＮＡ ＭＳ」）を含み、２つはＤＮＡテール（「１２３ＤＮＡ」及び「１２３ＤＮＡ ＰＳ」）を含む）を使用した編集パターンを示す。図９の上部、中央、及び下部のパネルは、それぞれ１２３ＲＮＡ ＭＳテール、１２３ＤＮＡテール、又は１２３ＤＮＡ ＰＳテールを使用したＰＥ０の編集パターンを示している。

【図10】図１０は、実施例５に関する。図１０は、本明細書に記載のとおり、Ｃａｓ９＋ＤＮＡポリメラーゼＤ（「ＰＥ０ ＰｏｌＤ」）融合タンパク質と３つの異なるガイドＲＮＡ（１つはＲＮＡテール（「１２３ＲＮＡ ＭＳ」）を含み、２つはＤＮＡテール（「１２３ＤＮＡ」及び「１２３ＤＮＡ ＰＳ」）を含む）を使用した編集パターンを示す。図１０の上部、中央、及び下部のパネルは、それぞれ１２３ＲＮＡ ＭＳテール、１２３ＤＮＡテール、又は１２３ＤＮＡ ＰＳテールを使用したＰＥ０ ＰｏｌＤの編集パターンを示している。

【図11】図１１は、実施例５に関する。図１１は、本明細書に記載のとおり、Ｃａｓ９＋Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（「ＰＥ０ Ｐｈｉ」）融合タンパク質と３つの異なるガイドＲＮＡ（１つはＲＮＡテール（「１２３ＲＮＡ ＭＳ」）を含み、２つはＤＮＡテール（「１２３ＤＮＡ」及び「１２３ＤＮＡ ＰＳ」）を含む）を使用した編集パターンを示す。図１１の上部、中央、及び下部のパネルは、それぞれ１２３ＲＮＡ ＭＳテール、１２３ＤＮＡテール、又は１２３ＤＮＡ ＰＳテールを使用したＰＥ０ Ｐｈｉの編集パターンを示している。

【図12】図１２は、実施例５に関する。図１２は、本明細書に記載のとおり、Ｃａｓ９と３つの異なるガイドＲＮＡ（１つはＲＮＡテール（「１２３ＲＮＡ ＭＳ」）を含み、２つはＤＮＡテール（「１２３ＤＮＡ」及び「１２３ＤＮＡ ＰＳ」）を含む）を使用した編集パターンを示す。図１２の上部、中央、及び下部のパネルは、それぞれ１２３ＲＮＡ ＭＳテール、１２３ＤＮＡテール、又は１２３ＤＮＡ ＰＳテールを使用したＣａｓ９の編集パターンを示している。

【図13】図１３は、実施例６に関する。図１３は、ＰＲＩＮＳ編集（「ＰＲＩＮＳ＃１」及び「ＰＲＩＮＳ＃２」と表示）及びプライム編集（「ＰＥ＃１」及び「ＰＥ＃２」と表示）の例示的なガイドＲＮＡデザインを示す。図１３で示されるように、プライム編集ガイドＲＮＡは、更なる３’相同性領域を含む。

【図14A-14B】図１４Ａ及び１４Ｂは、実施例６に関する。図１４Ａ及び１４Ｂは、ＰＲＩＮＳ編集又はプライム編集を用いた、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤ＡＺＡ７６４８の存在下又は非存在下での、図１３に示される異なるガイドＲＮＡの使用効果を示す。特異的な組み込みは、本明細書に記載されているように、ＮＧＳ Ａｍｐｌｉｃｏｎ－Ｓｅｑによって決定された。棒グラフは、ｎ＝２の平均を標準偏差で表す。

【図15】図１５は、実施例７に関する。図１５は、本明細書に記載のジフテリア毒素選択系の例示的な概略図を示す。図１５で示されるように、ＤＴ受容体であるＨｂＥＧＦのイントロンは、ＰＲＩＮＳ編集又はＣａｓ９編集標的として選択された。二重対立遺伝子の大きな欠失のみが、細胞にＤＴ抵抗性を提供する。

【図16】図１６は、実施例７に関する。図１６は、Ｃａｓ９－ＲＴ融合物（ＰＲＩＮＳ編集、「ＰＥ０」）、Ｃａｓ９、又はＣａｓ９ニッカーゼ－ＲＴ融合物（プライム編集、「ＰＥ２」）、及び３つの異なるガイドＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の顕微鏡画像を示す。陽性対照は、ＨｂＥＧＦを標的とするＣａｓ９でトランスフェクトされた細胞を示す。

【図17】図１７は、実施例８に関する。図１７は、本明細書に記載されるように、Ｃａｓ９とＲＴの間（「ＰＲＩＮＳ＿ＭＳ２＿ｖ１」）又はＲＴの下流（「ＰＲＩＮＳ＿ＭＳ２＿ｖ２」）のいずれかにＭＣＰドメインを含有する２つのＣａｓ９＋ＲＴ融合タンパク質の例示的な概略図を示す。３つの異なるポリヌクレオチド系を試験した：（１）分離ポリヌクレオチドとしてのＭＳ２アプタマーに融合した逆転写酵素のためのガイドＲＮＡ及び鋳型ポリヌクレオチド、（２）対照、非標的ガイドＲＮＡ、並びに（３）逆転写酵素鋳型に融合したガイドＲＮＡ。

【図18】図１８は、実施例８に関する。図１８は、Ｃａｓ９＋ＲＴ＋ＭＣＰ融合タンパク質を、図１７に記載の３つの異なるポリヌクレオチド系とともに使用して、所望の配列ＡＡＧＡＴＧを挿入するためのＰＲＩＮＳ編集の編集効率を示す。

【図19】図１９は実施例９に関し、Ｃａｓ１２及び標的ＥＸＭ１のための例示的なガイドＲＮＡを示す。

【図20】図２０は実施例１０に関し、Ｃａｓ９－ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質によるＰＲＩＮＳ編集の結果を示す。ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ挿入配列の挿入頻度は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９－ＲＴ（「ＰＥ０」）、又は様々なＤＮＡポリメラーゼ：３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がないＫｌｅｎｏｗ断片（「Ｃａｓ９－Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ－」）、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＫｌｅｎｏｗ断片（「Ｃａｓ９－Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ＋」）、又はＲＥＶ３ポリメラーゼ（「Ｃａｓ９－ＲＥＶ３」）に融合したＣａｓ９でトランスフェクトされた細胞で分析した：各円は、各々独立したトランスフェクションごとの正確な挿入の頻度を表す。点線は、Ｃａｓ９のみによる挿入の平均値（すなわち、バックグラウンド値）を表し、試験された各条件についてのバックグラウンドとの差は、多重比較ＡＮＯＶＡ（Ｂｒｏｗｎ－Ｆｏｒｓｙｔｈｅ及びＷｅｌｃｈ調整）によって計算された。１０～１５回の測定値の平均及び標準偏差は、ウィスカープロットとして表される。＊＊＊：ｐ＜０．０００５；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。

【図21A-21C】図２１Ａ～２１Ｃは実施例１１に関し、キメラｓｐｒｉｎｇＲＮＡを用いたＣａｓ９－ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質によるＰＲＩＮＳ編集の結果を示す。Ｃａｓ９－ＤＮＡポリメラーゼの、ＤＮＡ及びＲＮＡ挿入配列並びにＰＢＳを有するキメラｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（「ＤｉＨＰ」）又はＤＮＡ挿入配列を有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（「ＤｉＲＰ」）との同時トランスフェクションは、図２７Ａに示されるように、全体的な挿入効率を増加させ、図２７Ｂに示されるように、所望の配列を挿入する頻度を増加させる。図２７Ａ及び２７Ｂでは、各記号（円形、四角形、又は六角形）は、サンプルごとに観察される編集を表す。円形はｓｐｒｉｎｇＲＮＡを表し、四角形はＤｉＨＰを表し、六角形はＤｉＲＰを表す。平均及び標準偏差は、ウィスカープロットにより表される。図２７Ｃは、Ｃａｓ９、ＰＥ０、及びＣａｓ９－ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質のｓｐｒｉｎｇＲＮＡ、ＤｉＨＰ、及びＤｉＲＰとの代表的な編集パターンを示す。図２７Ｃでは、挿入は、指定された配列とともに影付きの長方形で表され、欠失は接続線で表される。

【図22】図２２は、実施例１２に関し、改変（脱塩基部位又はＴＥＧリンカー）を有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡを用いたＣａｓ９－ＲＴによるＰＲＩＮＳ編集の結果を示す。Ｃａｓ９－ＲＴの改変したｓｐｒｉｎｇＲＮＡとの同時トランスフェクションにより、所望の長さの挿入頻度が増加したため、より正確な改変が行われた。

【図23A-23B】図２３Ａ～２３Ｂは、実施例１３に関する。図２３Ａは、蛍光標識ＰＣＲプライマーで増幅しキャピラリー電気泳動で分解した後の、ＰＥ０（上パネル）並びに個別に表現されたＣａｓ９及びＲＴ（下パネル）とのＰＲＩＮＳ編集後の、ＡＡＶＳ１遺伝子座のエレクトログラムを示す。アスタリスクは、野生型配列に対応するＤＮＡ産物を表し、６ｂｐの挿入のある大きな分子はＰＲＩＮＳ編集された配列に対応する。図２３Ｂは、個別に発現させたＣａｓ９、ＰＥ０、Ｃａｓ９及びＲＴ、並びに個別に発現させたＣａｓ９－ＬｉｇＤ及びＲＴのＰＲＩＮＳ編集の結果を示す。Ｃａｓ９－ＬｉｇＤ及びＲＴの同時発現は、Ｃａｓ９及びＲＴの同時発現と比較して、所望の配列の挿入を改善した。円形は、＞４の生物学的複製の個々の編集測定値を表す。平均及び標準偏差は、クロスバー及びウィスカープロットにより表される。統計的差異はＡＮＯＶＡによって計算された（＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。

【図24A-24B】図２４Ａ～２４Ｂは実施例１４に関し、ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ ＰＢＳにおけるミスマッチを伴う又は伴わないＰＲＩＮＳ編集効率の結果を示す。図２４Ａは、核酸塩基ミスマッチのないｓｐｒｉｎｇＲＮＡを使用したＰＲＩＮＳ編集が、６ｂｐの挿入配列について３７．１３％の相対挿入頻度を有したことを示す。図２４Ｂは、ＰＢＳの３’末端に２ｂｐの核酸塩基ミスマッチを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡを使用したＰＲＩＮＳ編集が、４ｎｔの挿入配列（元の６ｂｐ配列から２ｂｐミスマッチを引いたもの）について５９．５９％の相対挿入頻度を有したことを示す。

【図25】図２５は実施例１５に関連し、以下のＤＮＡ修復遺伝子の１つで部分的に欠損した細胞におけるＰＲＩＮＳ編集の結果を示す：ＰＲＫＤＣ（ＤＮＡＰＫとしても知られる）、ＬＩＧ４、ＴＰ５３ＢＰ１、ＰＡＲＰ１、ＰＯＬＱ、ＬＩＧ３、及びＡＴＭ。実験は、ＤＭＳＯ対照（「ｄ」）又はＤＮＡＰＫ阻害剤（「ｉ」）の存在下で３回行った。左のパネルは、Ｃａｓ９－ＲＴ融合物（「ＰＥ０」）及びｓｐｒｉｎｇＲＮＡを用いた実験を示す。右のパネルは、ＰＥ０及びｐｅｇＲＮＡを用いた実験を示す。

【図26A-26B】図２６Ａ～２６Ｂは、実施例１６に関する。図２６Ａ～２６Ｂにおける配列番号２９は、ＭＨＣａｓ９用のｔｒａｃｒＲＮＡスキャホールド、６ｂｐの挿入配列、及びＰＢＳを含有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡを示す。図２６Ａは、ＭＨＣａｓ９－ＲＴによる最も効率的なＰＲＩＮＳ編集イベントを示す。図２６Ｂは、ＭＨＣａｓ９－ＲＴによる最も頻度の高い１０個のＰＲＩＮＳ編集イベントを示しており、最も頻度の高い３つの編集イベントによって示されるように、ＲＴが、鋳型挿入だけでなく、ＭＨＣａｓ９によって生成されたオーバーハング配列（ＣＣＣ）の伸長も仲介していることを示している。

【図27A-27B】図２７Ａ～２７Ｂは、実施例１７に関し、ｐｅｇＲＮＡを用いたＣａｓ９－ＲＴによる標的化置換／挿入及び欠失の結果を示す。図２７Ａは、ＤＭＳＯ又はＤＮＡＰＫ阻害剤（ＤＮＡＰＫｉ）を用いたＡＡＶＳ１遺伝子座でのＡからＧへの置換の頻度を示す。図２７Ｂは、ＤＭＳＯ又はＤＮＡＰＫｉによるＡＡＶＳ１遺伝子座での１ヌクレオチドの欠失の頻度を示す。

【発明を実施するための形態】

【0038】

本開示は、改善されたＣＲＩＳＰＲ系及びその成分、並びにそれらを使用する方法に関する。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的ポリヌクレオチド、例えば標的ＤＮＡ配列の部位で、ガイドポリヌクレオチド及びＣａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを含む。天然ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、細菌免疫ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）では、外来ＤＮＡはＣＲＩＳＰＲアレイに組み込まれ、次いでＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を生成する。ｃｒＲＮＡは、外来ＤＮＡ部位に相補的なプロトスペーサー領域を含み、ＣＲＩＳＰＲ系によってもコードされるトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ステムループなどの二次構造を形成し、Ｃａｓ９タンパク質に結合することができる。ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドはＣａｓ９と会合し、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体はプロトスペーサー配列を持つ外来ＤＮＡを認識して開裂し、侵入するウイルス又はプラスミドに対する免疫を付与する。

【0039】

その最初の発見以来、広範な調査は遺伝子編集を含む遺伝子工学におけるＣＲＩＳＰＲ系の応用可能性に焦点を当ててきた（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３（２０１３）；及びＭａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３－８２６（２０１３）を参照）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、本明細書に記載されている天然のＣＲＩＳＰＲ系の成分を利用しており、広範囲の生物や細胞株で、遺伝子編集などの部位特異的なゲノム改変に使用されている。遺伝子編集に加えて、ＣＲＩＳＰＲ系は、複数の他の用途、例として調節遺伝子発現、遺伝子回路構築、機能的ゲノム学などを有する（Ｓａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２：３４７－３５５（２０１４）に概説）。

【0040】

本明細書において特に定義しない限り、本開示において使用される科学技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。更に、文脈から別の解釈が要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書において使用される「ａ」又は「ａｎ」（１つの）は、１つ以上を意味し得る。本明細書において使用され、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同時に使用される場合、語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は２つ以上を意味し得る。本明細書において使用される「別の」又は「さらなる」は、少なくとも第２のもの以上を意味し得る。

【0041】

核酸分子は、別の核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡに、温度及び溶液イオン強度の適切な条件の下で、核酸分子の一本鎖形態が当該別の核酸分子にアニールし得る場合、「ハイブリダイズ可能である」又は「ハイブリダイズされる」。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、特にその中の第１１章及び表１１．１に例示されている。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、２つの相補的核酸ポリヌクレオチドの所望のハイブリダイゼーション産物の選択的な形成又は維持を、潜在的に交差反応又は干渉する他のポリヌクレオチドの存在下で実現するように選択することができる。ストリンジェントな条件は、配列依存性である；典型的には、相補的配列が長いほど、より短い相補的配列よりも高い温度にて特異的にハイブリダイズする。通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、特定のポリヌクレオチドについて、定義されたイオン強度、化学変性剤の濃度、ｐＨ、及びハイブリダイゼーションパートナーの濃度での熱融点（Ｔ_ｍ）（すなわち、配列の５０％が、実質的に相補的な配列にハイブリダイズする温度）よりも約５℃～約１０℃低い。通常、ヌクレオチド配列は、Ｇ塩基及びＣ塩基のパーセンテージが高いほど、Ｇ塩基及びＣ塩基のパーセンテージがより低いヌクレオチド配列よりもストリンジェントな条件の下で、ハイブリダイズする。通常、ストリンジェンシーは、温度を上げることによって、ｐＨを上げることによって、イオン強度を低下させることによって、且つ／又は化学核酸変性剤（例えば、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、及び炭酸エチレン）の濃度を上げることによって、増大させることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ、５００ｍＭ、２００ｍＭ、１００ｍＭ、又は５０ｍＭ未満の塩濃度又はイオン強度；約２０℃、３０℃、４０℃、６０℃、又は８０℃超のハイブリダイゼーション温度；及び約１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％を上回る化学変性剤濃度を含む。多くの要因が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与え得るので、パラメータの組み合わせは、任意のパラメータ単独の絶対値よりも重要であり得る。

【0042】

例えば５５℃のＴｍに対応する、例示的な低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件として、５×クエン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（ＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、及びホルムアミドなし；又は３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び０．５％ＳＤＳが挙げられる。約５５℃～約６５℃のより高いＴ_ｍに対応する例示的な中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件として、４０％ホルムアミド及び５×又は６×ＳＣＣが挙げられる。６５℃を超える最も高いＴｍに対応する例示的な高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件として、５０％ホルムアミド及び５×又は６×ＳＣＣが挙げられる。

【0043】

更に例示的なハイブリダイゼーション条件としては、およそ６．５～８．５のｐＨの、約２０ｍＭ～２００ｍＭのイオン強度を有する、約１５℃～４０℃の温度の緩衝溶液（例えば、およそ２０ｍＭ～２００ｍＭの緩衝成分を有するリン酸、トリス、又はＨＥＰＥＳ緩衝溶液）が挙げられる。例えば、バッファは、塩を、約１０ｍＭ～約１Ｍ、約２０ｍＭ～約５００ｍＭ、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、又は約５０ｍＭの濃度にて含んでもよい。例示的な塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、及びＣＨ_３ＣＯＯＮＨ_４が挙げられる。

【0044】

用語「相補的」は、互いにハイブリダイズし得るヌクレオチド塩基間の関係を記載するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンは、チミンに相補的であり、シトシンは、グアニンに相補的である。したがって、本開示には、本明細書で開示又は使用される完全配列に相補的な単離核酸断片及びそれらと実質的に類似する核酸配列も含まれる。

【0045】

用語「相同組換え」は、外来ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）の別の核酸（例えば、ＤＮＡ）分子中への挿入、例えば染色体中のベクターの挿入を指す。場合により、ベクターは、相同組換えについて特異的な染色体部位を標的化する。特異的相同組換えのため、ベクターは、典型的には、相補的結合及び染色体中へのベクターの組み込みを可能とするために染色体の配列と相同性の十分に長い領域を含有する。より長い相補性の領域及びより大きい配列類似性の程度は、相同組換えの効率を増加させ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質又は組成物は、切断、例えば核酸配列中の二本鎖切断を生成することにより相同組換えを促進する。

【0046】

本明細書で使用する場合、用語「操作可能に連結される」とは、対象とするポリヌクレオチド、例えばヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの発現を可能にするように調節エレメントに連結されることを意味する。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、プロモーターである。いくつかの実施形態では、対象とするポリペプチドを発現するポリヌクレオチドは、発現ベクター上でプロモーターに操作可能に連結されている。

【0047】

「ベクター」は、宿主細胞中に核酸をクローニングし、及び／又は移行させる任意の手段である。ベクターは、別のＤＮＡセグメントを付着させて付着セグメントの複製を生じさせることができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、ｉｎ ｖｉｖｏでＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製し得る任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えば、非対称分配により多数の細胞世代後に細胞の集団から除去／消失されるエピソーマルベクターである。用語「ベクター」には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで細胞中に核酸を導入するためのウイルス性及び非ウイルス性手段の両方が含まれる。当該技術分野で知られている多数のベクターを使用して、核酸を操作し、応答エレメント及びプロモーターを遺伝子に組み込んだりすることができる。ベクターは、１つ以上の調節領域、並びに／又は核酸導入結果（どの組織への導入、発現期間など）の選択、測定、及びモニタリングに有用な選択マーカーを含み得る。

【0048】

考えられるベクターとしては、例えば、プラスミド又は改変ウイルス、例として、例えば、バクテリオファージ、例えば、ラムダ誘導体、又はプラスミド、例えば、ＰＢＲ３２２若しくはｐＵＣプラスミド誘導体、又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターが挙げられる。例えば、好適ベクター中への、応答エレメント及びプロモーターに対応するＤＮＡ断片の挿入は、相補的粘着末端を有する選択ベクター中に適切なＤＮＡ断片をライゲートすることにより達成することができる。代わりに、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に改変することができるか、又はポリヌクレオチド（リンカー）をＤＮＡ末端中にライゲートすることにより任意の部位を産生することができる。このようなベクターは、細胞ゲノム中にマーカーを組み込んだ細胞の選択を提供する選択マーカー遺伝子を含有するように改変することができる。このようなマーカーは、マーカーを組み込み、そのマーカーによりコードされるタンパク質を発現する宿主細胞の同定及び／又は選択を可能とする。

【0049】

ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞及び生存動物対象における広範な遺伝子送達用途において使用されている。使用することができるウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノウイルスアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタインバール、アデノウイルス、ジェミニウイルス、及びカリモウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを利用して、本明細書に記載のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを利用して、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0050】

ベクターは、既知の方法、例として、限定されるものではないが、トランスフェクション、形質導入、細胞融合、及びリポフェクションにより所望の宿主細胞中に導入することができる。ベクターは、種々の調節エレメント、例としてプロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、ベクター設計は、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９５７－６３（２０１３）により設計された構築物をベースとすることができる。

【0051】

当該技術分野において公知の方法を使用して、本明細書で提供されるポリヌクレオチド及び／又はベクターを伝播させることができる。好適な宿主系及び成長条件を確立したら、組換え発現ベクターを伝播させ、多量に調製することができる。本明細書で説明する通り、使用され得る発現ベクターとしては、以下のベクター又はその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト又は動物ウイルス、例えばワクシニアウイルス又はアデノウイルス、昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）並びにプラスミド及びコスミド ＤＮＡベクター。

【0052】

用語「プラスミド」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を担持することが多く、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である外部染色体エレメントを指す。このようなエレメントは、任意の資源に由来する自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はポリヌクレオチド、線状、環状、又はスーパーコイルドの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、その中では多数のポリヌクレオチドが、適切な３’非翻訳配列とともに選択遺伝子産物についてのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を細胞中に導入し得るユニーク構築物中に結合し、又は組換えされている。いくつかの実施形態では、プラスミドを利用して、本明細書に記載のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、プラスミドを利用して、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0053】

本明細書において使用される用語「トランスフェクション」は、細胞中への外因性核酸分子、例えばベクターの導入を意味する。「トランスフェクトされた」細胞は、細胞内部の外因性核酸分子を含み、「形質転換された」細胞は、細胞内の外因性核酸分子が細胞の表現型変化を誘導する細胞である。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込むことができ、及び／又は一時的若しくは長期間にわたり染色体外で細胞により維持させることができる。外因性核酸分子又は断片を発現する宿主細胞又は生物は、本明細書では、「組換え」、「形質転換」、又は「トランスジェニック」生物と称される。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の発現ベクターのいずれか、例えばヌクレアーゼ、融合タンパク質、又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0054】

用語「宿主細胞」は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すか、又は「宿主細胞」はそのような細胞の子孫を指す場合もある。例えば、変異又は環境の影響により改変が後の世代に発生する場合があるため、そのような後代は、親細胞と同一ではない場合があるが、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。

【0055】

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、それとしては、コード及び非コードアミノ酸、化学的若しくは生化学的改変又は誘導体化アミノ酸、並びに改変ペプチド骨格を有するポリペプチドを挙げることができる。

【0056】

タンパク質又はポリペプチドの始点は、「Ｎ末端」（及びアミノ末端、ＮＨ_２末端、Ｎ末端部、又はアミン末端としても呼ばれる）として知られ、これらはタンパク質又はポリペプチドの第１のアミノ酸残基の遊離アミン（－ＮＨ_２）基を指す。タンパク質又はポリペプチドの終点は、「Ｃ末端」（及びカルボキシ末端、カルボキシル末端、Ｃ－末端部、又はＣＯＯＨ末端としても呼ばれる）として知られ、これは、タンパク質又はポリペプチドの最後のアミノ酸残基の遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を指す。

【0057】

本明細書で使用するとき、「アミノ酸」は、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）及びアミノ（－ＮＨ_２）基の両方を含有する化合物を指す。「アミノ酸」は、天然及び非天然（すなわち合成）のアミノ酸の両方を指す。３文字及び１文字の略記を有する天然アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ；Ａ）；アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）；アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）；システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）；グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）；グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）；イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）；ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）；リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）；メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）；プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）；セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）；トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）；トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）；チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）；及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）が挙げられる。非天然又は合成アミノ酸としては、上記で提供される天然アミノ酸とは異なる側鎖を含み、例えば、フルオロフォア、翻訳後修飾、金属イオンキレート剤、光ケージ及び光架橋部分、独特の反応性官能基、並びにＮＭＲ、ＩＲ、及びＸ線結晶プローブが挙げられ得る。例示的な非天然又は合成アミノ酸は、例えば、Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：２０４（２０１３）及びＷａｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｃｈｅｍ ２：１５（２０１４）で提供される。非天然アミノ酸はまた、例えば、シトルリン（Ｃｉｔ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、及びピロリジン（Ｐｙｌ）などの、タンパク質又はポリペプチドに典型的に組み込まれない天然に存在する化合物を含み得る。

【0058】

「アミノ酸置換」は、野生型又は天然発生アミノ酸の、その野生型又は天然発生アミノ酸に対して異なるアミノ酸による、そのアミノ酸残基における１つ以上の置換を含むポリペプチド又はタンパク質を指す。置換アミノ酸は、合成又は天然発生アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、置換アミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される天然発生アミノ酸である。いくつかの実施形態では、置換アミノ酸は、非天然又は合成アミノ酸である。置換変異体は、略語系を使用して記述される場合がある。例えば、５番目のアミノ酸残基が置換されている置換変異は「Ｘ５Ｙ」と略記することができ、「Ｘ」は、置き換えられるべき野生型又は天然発生アミノ酸であり、「５」は、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列内のアミノ酸残基位置であり、「Ｙ」は、置換、又は非野生型又は非天然発生アミノ酸である。

【0059】

「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、又は核酸は、その天然環境から取り出された分子である。「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、又は核酸は賦形剤、例えば、希釈剤又は助剤と配合することができ、依然として単離されているとみなされることも理解される。本明細書で使用する場合、「単離」は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、又は核酸の任意の特定レベルの純度を必ずしも意味するものではない。

【0060】

用語「組換え」は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に関して使用される場合、天然に存在することが公知でない遺伝子材料の新たな組み合わせのそれら、又はその組み合わせから生じるそれらを意味する。組換え分子は、組換え技術の分野において利用可能な技術のいずれか、例として、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子スプライシング（例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用）及び核酸分子、ペプチド又はタンパク質の固相合成により産生することができる。

【0061】

用語「ドメイン」は、ポリペプチド又はタンパク質に関して使用される場合、タンパク質中の区別される機能的及び／又は構造的単位を意味する。ドメインは、タンパク質の全体的な役割に寄与する特定の機能又は相互作用を担う場合がある。ドメインは、種々の生物学的コンテクストで存在し得る。類似のドメインは、異なる機能を有するタンパク質中で見出すことができる。或いは、低い配列同一性（すなわち、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、又は約１％未満の配列同一性）を有するドメインは、同一の機能を有し得る。

【0062】

ポリペプチド又はタンパク質に関して使用される場合、用語「モチーフ」は、一般的に、タンパク質の機能に重要であり得る、典型的には長さが２０アミノ酸より短い保存アミノ酸残基の組を指す。特定の配列モチーフは、様々なタンパク質において、特定の細胞内位置に対するタンパク質の結合又は標的化などの一般的な機能を媒介することができる。モチーフの例としては、核局在化シグナル、マイクロボディ標的化モチーフ、分泌を防止又は促進するモチーフ並びにタンパク質の認識及び結合を促進するモチーフが挙げられるが、これらに限定されない。モチーフデータベース及び／又はモチーフ検索ツールは、当該分野で公知であり、これとしては、例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ（ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｈｔｍｌ）、Ｐｆａｍ（ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）、ＰＲＩＮＴＳ（ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｂｓｍ／ｄｂｂｒｏｗｓｅｒ／ＰＲＩＮＴＳ／ＰＲＩＮＴＳ．ｈｔｍｌ）、及びＭｉｎｉｍｏｔｉｆ Ｍｉｎｅｒが挙げられる。

【0063】

本明細書で使用するとき、「操作された」タンパク質とは、タンパク質中に所望の特性を達成するための１つ以上の改変を含むタンパク質を意味する。例示的な改変としては、挿入、欠失、置換、及び／又は別のドメイン若しくはタンパク質との融合が挙げられるが、これらに限定されない。「融合タンパク質」（「キメラタンパク質」とも呼ばれる）は、典型的には２つの別個の遺伝子によってコードされる少なくとも２つのドメインを含むタンパク質であり、それらが単一のユニットとして転写及び翻訳されるように結合され、これにより、各ドメインの機能特性を有する単一のポリペプチドが生成される。本開示の操作されたタンパク質としては、ヌクレアーゼ及び融合タンパク質、例えばＣａｓヌクレアーゼ及び逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼが挙げられる。

【0064】

いくつかの実施形態では、操作されたタンパク質は、野生型タンパク質から生成される。本明細書で使用する場合、「野生型」タンパク質又は核酸は、天然の未改変タンパク質又は核酸である。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、生物であるストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離することができる。野生型は、「変異型」と対比され得、変異型は、タンパク質又は核酸のアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列中に１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、操作されたタンパクは、実質的に、野生型タンパク質と同一の活性、例えば、野生型タンパク質の約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％％超、又は約９９％超の活性を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で記載される融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼは、実質的に、野生型Ｃａｓヌクレアーゼと同一の活性を有する。

【0065】

本明細書において使用される用語「配列類似性」又は「％類似性」は、核酸配列間又はアミノ酸配列間の同一性又は対応性の程度を指す。ポリヌクレオチドの文脈において、「配列類似性」は、１つ以上のヌクレオチド塩基の変化が１つ以上のアミノ酸の置換をもたらすが、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の機能的特性に影響しない核酸配列を指す。また、「配列類似性」は、結果として生じる転写産物の機能的特性に実質的に影響しないポリヌクレオチドの改変、例えば、１つ以上のヌクレオチド塩基の欠失又は挿入を指し得る。したがって、本開示は、特定の例示的な配列よりも多くのものを包含することが理解される。ヌクレオチド塩基の置換を形成する方法は、コードされるポリペプチドの生物活性の保持を判定する方法と同様に、既知である。

【0066】

更に、当業者であれば、本開示によって包含される類似のポリヌクレオチドが、ストリンジェントな条件下で、本明細書中で例示される配列とハイブリダイズする能力によっても定義されることを認識する。本開示の類似のポリヌクレオチドは、本明細書中で開示されるポリヌクレオチドと、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である。

【0067】

ポリペプチドの文脈において、「配列類似性」は、アミノ酸の約４０％超が同一であり、又はアミノ酸の約６０％超が機能的に同一である２つ以上のポリペプチドを指す。「機能的に同一」又は「機能的に類似の」アミノ酸は、化学的に類似の側鎖を有する。例えば、アミノ酸は、機能的類似性に従って以下のようにグループ分けすることができる：
正荷電側鎖：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ；
負荷電側鎖：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
極性非荷電側鎖：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
疎水性側鎖：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ；
その他：Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ。

【0068】

いくつかの実施形態では、本開示の類似のポリペプチドは、約４０％、少なくとも約４０％、約４５％、少なくとも約４５％、約５０％、少なくとも約５０％、約５５％、少なくとも約５５％、約６０％、少なくとも約６０％、約６５％、少なくとも約６５％、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸を有する。

【0069】

いくつかの実施形態では、本開示の類似のポリペプチドは、約６０％、少なくとも約６０％、約６５％、少なくとも約６５％、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％機能的に同一であるアミノ酸を有する。

【0070】

配列類似性は、当該分野において既知の方法を使用する配列アラインメント、例えばＢＬＡＳＴ、ＭＵＳＣＬＥ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＣｌｕｓｔａｌＸを含む）、及びＴ－Ｃｏｆｆｅｅ（異型、例えばＭ－Ｃｏｆｆｅｅ、Ｒ－Ｃｏｆｆｅｅ、及びＥｘｐｒｅｓｓｏを含む）によって判定することができる。

【0071】

ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が指定された比較ウィンドウで整列されている場合に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの同一性パーセントを決定することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列の特定の一部のみをアラインして配列同一性が決定される。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列の特定のドメインのみをアラインして配列類似性が判定される。比較ウィンドウは、配列をアラインして比較することができる少なくとも１０個～１０００個超の残基、少なくとも２０～約１０００個の残基、又は少なくとも５０～５００個の残基のセグメントであり得る。配列同一性の判定のためのアラインメント方法は周知であり、公的に利用可能なデータベース、例えばＢＬＡＳＴを使用して実行することができる。例えば、いくつかの実施形態では、２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）のとおり修正されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８（１９９０）のアルゴリズムを用いて判定される。そのようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラム、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴ＋又はＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、プログラム、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３により実行されて、本開示のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５（１７）：３３８９－３４０２（１９９７）に記載のとおり利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。

【0072】

いくつかの実施形態では、ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、本明細書中で提供される参照ポリペプチド又はポリヌクレオチド（又は参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドの断片）と、７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８％、９９％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、本明細書中で提供される参照ポリペプチド又はポリヌクレオチド（又は参照ポリペプチド又は核酸分子の断片）と、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。

【0073】

本明細書で使用する場合、「複合体」は、２つ以上の会合しているポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの群を指す。複合体形成の文脈において、用語「会合する」又は「会合」は、共有結合することなく、静電的、疎水性／親水性、及び／又は水素結合相互作用を介して互いに結合した分子を指す。互いに共有結合した異なる部分を含む分子が知られている。いくつかの実施形態では、複合体は、複合体の全ての成分が一緒に存在する場合に形成され、すなわち、自己集合複合体である。いくつかの実施形態では、複合体は、複合体の異なる成分間の化学的相互作用、例えば、水素結合などを介して形成される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質又はポリペプチドによるポリヌクレオチドの二次構造認識を通じて、タンパク質又はポリペプチド、例えばＲＮＡ誘導タンパク質と複合体を形成する。

【0074】

融合タンパク質
本開示の融合タンパク質は、野生型Ｃａｓヌクレアーゼに比べて向上した遺伝子編集効率を提供する。

【0075】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼと、（ｉｉ）逆転写酵素、又はＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼと、を含む融合タンパク質であって、Ｃａｓヌクレアーゼが、二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成することができる融合タンパク質を提供する。

【0076】

本明細書で記載されるとおり、融合タンパク質は、典型的には、異なる機能を有する少なくとも２つのドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。一般に、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の一部である。本明細書で記載されるとおり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、部位特異的ゲノム改変のために利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓヌクレアーゼ及びガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓヌクレアーゼを結合及び／又は活性化するポリペプチド結合セグメントと、標的配列にハイブリダイズするガイド配列（例えば、ｃｒＲＮＡ）とを含む。本明細書で使用する場合、「セグメント」とは、分子の一部、セクション、又は領域、例えば、ガイドポリヌクレオチド分子のヌクレオチドの連続ストレッチを指す。「セグメント」の定義は、特に具体的に定義されない限り、特定の数の総塩基対に限定されない。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含まず、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系における分離ポリヌクレオチドして提供される。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼを活性化する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼの活性化は、ヌクレアーゼ活性を開始又は増加させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼの活性化は、ヌクレアーゼの標的ポリヌクレオチド中の標的配列への結合を含む。

【0077】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、系内のヌクレアーゼタンパク質に基づいて、Ｉ型～ＶＩ型に分類することができる。例えば、Ｃａｓ９はＩＩ型系で見つけることができるが、Ｃａｓ１２はＶ型系で見つけることができる。各タイプは、更に亜型に分類することができる。例えば、ＩＩ型は亜型ＩＩ－Ａ、ＩＩ－Ｂ、及びＩＩ－Ｃを含むことができ、Ｖ型は亜型Ｖ－Ａ及びＶ－Ｂを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系及びＣａｓヌクレアーゼの分類は、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３１１：４７－７５（２０１５）；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｃｔ ２０１８；３２５－３３６；及びＫｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｂ ３７４：２０１８００８７（２０１８）で更に議論されている。本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼは、別段の指定がない限り、任意の型又はバリアントを包含することができる。

【0078】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、二本鎖ポリヌクレオチド開裂、例えば二本鎖ＤＮＡ開裂を生成することができる。一般に、Ｃａｓヌクレアーゼは、１つ以上のヌクレアーゼドメイン、例えばＲｕｖＣ及びＨＮＨなどを含むことができ、二本鎖ＤＮＡを開裂することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含み、その各々が二本鎖ＤＮＡの１本の鎖を開裂する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、平滑末端を生成する。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼのＲｕｖＣ及びＨＮＨは、各ＤＮＡ鎖を同じ位置で開裂し、それによって平滑末端を生成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、粘着末端を生成する。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼのＲｕｖＣ及びＨＮＨは、各ＤＮＡ鎖を異なる位置で開裂（すなわち、「オフセット」で切断）し、それによって粘着末端を生成する。本明細書において使用される用語「粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄｓ）」、「段違い末端」、又は「付着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄｓ）」は、不均等の長さの鎖を有する核酸断片を指す。「平滑末端」と対照的に、粘着末端は、二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）上の段違い切断により生成される。付着又は粘着末端は、非対合ヌクレオチド、又は「オーバーハング」、例えば、３’又は５’オーバーハングを有する突出一本鎖を有する。

【0079】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。Ｃａｓ９は、本明細書に記載のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に見られる。例示的なＣａｓ９タンパク質としては、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｉｓｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、及びその他多数の細菌由来のＣａｓ９タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。更なる例示的なＣａｓ９ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，７７１，９４５号明細書、同第９，０２３，６４９号明細書、同第１０，０００，７７２号明細書、及び同第１０，４０７，６９７号明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、配列番号１のポリペプチドを指す。

【0080】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ＩＩＢ型Ｃａｓ９である。一般に、ＩＩＢ型Ｃａｓ９タンパク質は、本明細書に記載されるように、粘着末端を生成することができる。例示的なＩＩＢ型Ｃａｓ９タンパク質としては、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、サテレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、ウォリネラ－サクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、及びその他多数の細菌由来のＣａｓ９タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＩＢ型Ｃａｓ９は、配列決定された腸メタゲノムＭＨ０２４５＿ＧＬ０１６１８３０．１（ＭＨＣａｓ９）由来である。更なるＩＩＢ型Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、国際公開第２０１９／０９９９４３号パンフレットに記載されている。

【0081】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、配列番号１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されたポリヌクレオチドによってコードされる。

【0082】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２である。Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは、「Ｃｐｆ１」又は「Ｃ２ｃ１」ヌクレアーゼとして知られることもあり、本明細書に記載のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に見られる。Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは、典型的には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼよりも小さく、粘着末端を生成することができる。例示的なＣａｓ１２タンパク質としては、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ラクノスピラ種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐ．）、プレボテラ種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）、及びその他多数の細菌由来のＣａｓ１２タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。更なるＣａｓ１２ヌクレアーゼは、例えば米国特許第９，５８０，７０１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３号明細書、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１（２０１５）、及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６０：４３６－４３９（２０１８）に記載されている。

【0083】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２は、配列番号２９を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２は、配列番号２９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されたポリヌクレオチドによってコードされる。

【0084】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ１４である。もともと古細菌で発見されたＣａｓ１４ヌクレアーゼは、典型的には、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を標的とする小さな酵素であり、ＰＡＭ配列を必要としない。Ｃａｓ１４は古細菌のＤＰＡＮＮ上門に見られ、例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２：８３９－８４２（２０１８）及び米国特許出願公開第２０２０／００８７６４０号明細書に更に記載されている。

【0085】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１４は、配列番号３０を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１４は、配列番号３０に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号３０に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１４は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されたポリヌクレオチドによってコードされる。

【0086】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼと、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、又はそれらの組み合わせと、を含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、逆転写酵素を含む。逆転写酵素（ＲＴと略されることもある）は、逆転写と呼ばれるプロセスであるＲＮＡ鋳型からのＤＮＡ（例えば、相補的ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）を生成するために使用される酵素である。典型的な逆転写反応は、ＲＮＡ鋳型及びＲＮＡ鋳型の末端に結合するプライマーを用いて開始される。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、プライマー（例えばＰＢＳ）に結合し、第１のｃＤＮＡを提供するプロセスにおいて（例えばＲＮＡ鋳型に基づいて）ｃＤＮＡ鎖を合成する。対象とする配列を挿入するためのＣａｓヌクレアーゼ、逆転写酵素、ポリメラーゼ、及びＮＨＥＪの使用の例示的で非限定的な概要を図４で提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮアーゼ、例えばＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ鋳型を除去する。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＲＮアーゼ活性、例えばＲＮアーゼＨを含む。いくつかの実施形態では、次いで、第１のｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖は、ＤＮＡポリメラーゼにより合成され、二本鎖配列を生成する。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復メカニズム、例えばＮＨＥＪを使用して、対象とする配列を含む二本鎖配列を二本鎖ポリヌクレオチドに挿入することができる。

【0088】

例示的な逆転写酵素としては、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍ－ＭｕＬＶ）逆転写酵素、Ｒ２逆転写酵素、及びＨＩＶ逆転写酵素が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＭＭＬＶ逆転写酵素又はＲ２逆転写酵素である。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ活性が可能である。

【0089】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチド、例えば標的ＤＮＡ配列中の標的配列において二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成する。いくつかの実施形態では、開裂されたＤＮＡの１つの鎖は、融合タンパク質の逆転写酵素のためのプライマーとして機能する。いくつかの実施形態では、逆転写酵素のための鋳型配列を含有する鋳型ポリヌクレオチドが提供され、逆転写酵素が第１のｃＤＮＡを生成する。いくつかの実施形態では、鋳型配列はＲＮＡである、ＲＮアーゼは鋳型配列を除去する。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＲＮアーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、分離ＲＮアーゼにより除去される。いくつかの実施形態では、ＲＮアーゼは、ＲＮアーゼＨである。いくつかの実施形態では、第１のｃＤＮＡに対して相補的なＤＮＡ鎖は、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば分離ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素によって生成される。いくつかの実施形態では、第１のｃＤＮＡ及び第１のｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖をハイブリダイズして、二本鎖配列を形成する。いくつかの実施形態では、二本鎖配列は、開裂された標的配列に挿入することができる。いくつかの実施形態では、二本鎖配列は、ＤＮＡ修復経路により、開裂された標的配列に挿入される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復経路は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同性配向型修復（ＨＤＲ）、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、二本鎖配列は、ライゲーションにより、例えばＤＮＡリガーゼを使用して、開裂された標的配列に挿入される。

【0090】

いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、配列番号２～３のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、配列番号２～３のいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２～３のいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されたポリヌクレオチドによってコードされる。

【0091】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼを含む。ＤＮＡポリメラーゼは、既存の１本のＤＮＡ鎖にヌクレオチドを付加することによりＤＮＡを合成する酵素である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素によって生成された第１の合成鎖から二本鎖配列を生成する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖ＤＮＡ鋳型（ｓｓＤＮＡ）から二本鎖ＤＮＡを生成する。

【0092】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチド、例えば標的ＤＮＡ配列中の標的配列において二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成する。いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチド、例えばｓｓＤＮＡ鋳型が提供され、融合タンパク質のＤＮＡポリメラーゼは、ｓｓＤＮＡ鋳型から二本鎖配列を生成する。いくつかの実施形態では、二本鎖配列は、開裂された標的配列に挿入することができる。いくつかの実施形態では、二本鎖配列は、ＤＮＡ修復経路により、開裂された標的配列に挿入される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復経路は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、又は相同性配向型修復（ＨＤＲ）である。いくつかの実施形態では、二本鎖配列は、ライゲーションにより、例えばＤＮＡリガーゼを使用して、開裂された標的配列に挿入される。

【0093】

例示的なＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、及びＶ；ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）α、β、λ、γ、σ、μ、δ、ε、η、ι、κ、ζ、θ、Ｒｅｖ１、及びＲｅｖ３；例えば、Ｂｓｔ、Ｔ４、及びΦ２９（ｐｈｉ２９）ＤＮＡポリメラーゼを含む等温ＤＮＡポリメラーゼ；並びに例えば、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｔｈ、及びＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを含む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ修復経路の一部である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復経路ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌβ、Ｐｏｌγ、Ｐｏｌσ、又はＰｏｌμである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｒｅｖ３である。ＤＮＡ修復経路は、本明細書に更に記載される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、高処理能力を有する、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼは、単一の結合イベントで多数のヌクレオチドを処理することができる。いくつかの実施形態では、高処理能力のＤＮＡポリメラーゼは、１つの結合事象当たり、１００ｂｐ超、２００ｂｐ超、３００ｂｐ超、４００ｂｐ超、５００ｂｐ超、６００ｂｐ超、７００ｂｐ超、８００ｂｐ超、１ｋｐ超、５ｋｐ超、１０ｋｐ超、５０ｋｂ超、又は１００ｋｂ超が可能である。いくつかの実施形態では、高処理能力のＤＮＡポリメラーゼは、長い鋳型及び高ＧＣ含有量などの二次構造を有する配列の合成に有利である。いくつかの実施形態では、高処理能力のＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌα、Ｐｏｌδ、Ｐｏｌε、又はΦ２９ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼμ（ミュー）、ＤＮＡポリメラーゼδ（デルタ）、又はＤＮＡポリメラーゼε（イプシロン）である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼの触媒的に活性な断片又はトランケーションを含む。本明細書で使用する場合、酵素の「触媒的に活性な」断片、トランケーション、又はドメインは、断片又はトランケーションが、全長又は野生型酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）と実質的に同じ活性を有することを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書の酵素の触媒的に活性な断片、トランケーション、又はドメインは、全長又は野生型酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の活性の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、又は２００％超を有する。いくつかの実施形態では、本明細書の酵素の触媒的に活性な断片、トランケーション、又はドメインは、全長又は野生型酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）と比べて１つ以上の改善された特性、例えば改善された安定性及び／又は処理能力を有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０１４），ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３２４００１１１１で記載されるＲｅｖ３のトランケーションである。

【0094】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４～６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４～６のいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４～６のいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されたポリヌクレオチドによってコードされる。

【0095】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡリガーゼを含む。ＤＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を触媒することにより、ＤＮＡ鎖の結合を促進する酵素である。ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ中の一本又は二本鎖切断を修復することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、一本鎖ＤＮＡをライゲートする。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、二本鎖ＤＮＡの平滑末端をライゲートする。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、二本鎖ＤＮＡの粘着末端をライゲートする。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、二本鎖挿入配列の二本鎖ポリヌクレオチドへの組換えを促進する。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドで２つの二本鎖ポリヌクレオチド開裂が起こる場合（例えば、第１の標的部位及び第２の標的部位で）、ＤＮＡリガーゼは二本鎖ポリヌクレオチドの組換えを促進し、それによって第１の標的部位と第２の標的部位の間の配列を除去することができる。

【0096】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチド、例えば標的ＤＮＡ配列中の標的配列において二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成する。いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ鋳型が提供され、融合タンパク質のＤＮＡリガーゼは、鋳型ポリヌクレオチドを開裂された標的配列にライゲートする。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、平滑末端を含む二本鎖ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、粘着末端を含む二本鎖ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、一本鎖ポリヌクレオチドである。

【0097】

例示的なＤＮＡリガーゼとしては、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ、並びにＡｍｐｌｉｇａｓｅ ＤＮＡリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４リガーゼである。

【0098】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、配列番号７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されたポリヌクレオチドによってコードされる。

【0099】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ－結合又はＲＮＡ－結合ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡ－結合又はＲＮＡ－結合ドメインは、融合タンパク質と鋳型ポリヌクレオチドを互いに近接させる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合又はＲＮＡ－結合ドメインは、鋳型ポリヌクレオチドの融合タンパク質への結合を促進する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合又はＲＮＡ－結合ドメインは、鋳型ポリヌクレオチド及び融合タンパク質を互いに近接させることにより、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼ反応の効率を改善する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合又はＲＮＡ－結合ドメインは、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼ反応から生じる二本鎖配列を、開裂された標的配列に組み込む効率を高める。

【0100】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ－結合ドメインを更に含む。したがって、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼ、逆転写酵素、及びＤＮＡ－結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡ－結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、及びＤＮＡ－結合ドメインを含む。ＤＮＡ結合ドメインは、ウイルス、細菌、及び真核生物（哺乳類など）の転写因子の一部として見つけることができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合ドメインは、一本鎖ＤＮＡに結合する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合ドメインは、二本鎖ＤＮＡに結合する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合ドメインは、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡの両方に結合する。二本鎖ＤＮＡを結合する例示的なＤＮＡ－結合ドメインとしては、ヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）、ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化様エフェクター（ＴＡＬＥ）、核内低分子ＲＮＡ活性化タンパク質（ＳＮＡＰ）、ロイシンジッパー、ウィングドヘリックス、ヘリックス－ループ－ヘリックス、ＨＭＧ－ｂｏｘ、Ｗｏｒ３、及びＯＢ－ｆｏｌｄが挙げられるが、これらに限定されない。一本鎖ＤＮＡに結合する例示的なＤＮＡ－結合ドメインとしては、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｔ４ｇ３２）、ウイルス性Ｒｅｐタンパク質などのＨＵＨ酵素、及びはるか上流のエレメント結合タンパク質１（ＦＵＢＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。更なるＤＮＡ－結合ドメインは、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ Ｂ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ．４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ；２００２．ＤＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｙｅｓｕｄｈａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）８（８）：１９２（２０１７）；及びＶｉｄａｎｇｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ９９（１２）：１０８２－１０９６（２０１３）で提供される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合ドメインは、ジンクフィンガーＤＮＡ－結合ドメイン、転写因子、又はアデノ随伴ウイルスＲｅｐタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合ドメインは、はるか上流のエレメント結合タンパク質（ＦＵＢＰ）である。

【0101】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＲＮＡ－結合ドメインを更に含む。したがって、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼ、逆転写酵素、及びＲＮＡ－結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＲＮＡ－結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、及びＲＮＡ－結合ドメインを含む。ＲＮＡ－結合ドメインは、ＲＮＡプロセシングタンパク質の一部として見つけることができ、例えば、ＲＮＡ生合成、成熟、輸送、細胞局在化、及び安定性に関与している。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－結合ドメインは、ＲＮＡ認識モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－結合ドメインは、二本鎖ＲＮＡ－結合モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－結合ドメインは、ジンクフィンガーを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－結合ドメインは、例えば、ヘテロ核リボ核タンパク質Ｋ（ｈｎＲＮＰＫ）などのＫＨドメインを含む。例示的なＲＮＡ－結合ドメインとしては、限定されるものではないが、ＮＯＶＡ１、ＡＤＡＲ、ＣＰＳＦ、ＴＡＰ／ＮＸＦ１：ｐ１５、ＺＢＰ１、Ｅｌａｖ、Ｓｘｌ、ｔｒａ－２、ＦＯＧ－１、ＭＯＧ－１、ＭＯＧ－４、ＭＯＧ－５、ＲＮＰ－４、ＧＬＤ－１、ＧＬＤ－３、ＤＡＺ－１、ＰＧＬ１、ＯＭＡ－１、ＯＭＡ２、ＭＥＣ－８、ＵＮＣ－７５、ＥＸＣ－７、Ｐｕｍｉｌｉｏ、Ｎａｎｏｓ、ＦＭＲＰ、ＣＰＥＢ、Ｓｔａｕｆｅｎ１、ＦＸＲ１、及びＭＣＰ２が挙げられる。更なるＲＮＡ－結合ドメインは、例えば、Ｌｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８（６）：４７９－４９０（２００７）及びＧｌｉｓｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５８２（１４）：１９７７－１９８６（２００８）で提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－結合ドメインは、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ２）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－結合ドメインは、ＫＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－結合ドメインは、ｈｎＲＮＰＫである。

【0102】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合又はＲＮＡ－結合ドメインは、配列番号８～１１のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－結合又はＲＮＡ－結合ドメインは、配列番号８～１１のいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８～１１のいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0103】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、配列番号１８～２６のいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。

【0104】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む。本明細書で使用する場合、「核局在化シグナル」又は「核局在化配列」（ＮＬＳ）は、核輸送による細胞核中への輸送のためにタンパク質を「タグ付けする」ポリペプチドを指し、すなわち、ＮＬＳを有するタンパク質は、細胞核中に輸送される。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質表面上で露出される正電荷Ｌｙｓ又はＡｒｇ残基を含む。例示的な核局在化配列としては、ＳＶ４０ラージＴ－抗原、核質、ＥＧＬ－１３、ｃ－Ｍｙｃ及びＴＵＳ－タンパク質由来のＮＬＳが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１４）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２９）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３０）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号３１）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号３２）を含む。他の核局在化配列としては、ｈｎＲＮＰ Ａ１の酸性Ｍ９ドメイン、酵母転写抑制因子Ｍａｔα２中の配列ＫＩＰＩＫ（配列番号３３）及びＰＹ－ＮＬＳが挙げられるが、これらに限定されない。

【0105】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼドメインを連結するリンカー、並びに逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼからの立体障害なしにＣａｓヌクレアーゼを配置できるように、十分な長さ及び／又は柔軟性を備えている。いくつかの実施形態では、リンカーは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼがＣａｓヌクレアーゼからの立体障害なしにそれぞれの反応を実行できるように、十分な長さ及び／又は柔軟性を備えている。いくつかの実施形態では、リンカーは、約３～約１００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約５～約８０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～約６０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約２０～約５０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約２５～約４０アミノ酸長である。例示的なリンカー配列は、本明細書に記載されており、例えば、配列番号１５～１６である。

【0106】

ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は：（ａ）本明細書で提供される融合タンパク質と、（ｂ）融合タンパク質と複合体を形成し、（ｉ）ガイド配列と、（ｉｉ）逆転写酵素、又はＤＮＡリポリメラーゼのための鋳型配列と、を含むポリヌクレオチドと、を含む組成物を提供する。

【0107】

いくつかの実施形態では、組成物のポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ガイドポリヌクレオチドの成分を含む。本明細書で記載されるとおり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。ＲＮＡガイドポリヌクレオチドは、本明細書においては、「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、又は「ＤＮＡ－標的化ＲＮＡ」と称され得る。

【0108】

いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ガイド配列及びポリペプチド－結合セグメントを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド中の標的配列とハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのポリペプチド結合セグメントは、Ｃａｓヌクレアーゼに結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド－結合セグメントは、本明細書で提供される融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼに結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド－結合セグメントは、Ｃａｓヌクレアーゼを結合及び／又は活性化する。

【0109】

いくつかの実施形態では、組成物のポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド中の標的配列とハイブリダイズすることができるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物のポリヌクレオチドは、融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼに結合することができるポリペプチド－結合セグメントを含み、それにより融合タンパク質と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む第２のポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼを活性化する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼの活性化は、そのヌクレアーゼ活性を開始又は増加させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼの活性化は、ヌクレアーゼの標的配列への結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチド中の標的配列において二本鎖ポリヌクレオチドを生成する。

【0110】

いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１０～約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１２～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１５～約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、又は約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、標的配列にハイブリダイズするのに十分な長さである。

【0111】

いくつかの実施形態では、組成物のポリヌクレオチドは、鋳型配列を含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、プライマー－結合配列及び対象とする配列を含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、標的配列と相同性領域を含む。いくつかの実施形態では、相同性領域は、プライマー－結合配列である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、プライマー－結合配列に続く標的配列に対してミスマッチのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、プライマー－結合配列に続く標的配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチのヌクレオチドを含む。本明細書で使用する場合、「ミスマッチのヌクレオチド」は、塩基対を形成しないヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、ミスマッチのヌクレオチドを含む鋳型配列は、ミスマッチのヌクレオチドを含まない鋳型配列に比べて挿入頻度が高い。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、標的配列と１つ以上の相同性追加領域を含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、２つの相同性領域を含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、少なくとも２つの相同性領域を含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、５’から３’方向に、第１の相同性領域、対象とする配列、及び第２の相同性領域を含む。いくつかの実施形態では、もう１つの追加相同性領域は、対象とする配列の標的配列への挿入を容易にする。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、一本鎖である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、二本鎖である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、対象とする配列及びプライマー－結合配列は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、ゼノ核酸（ＸＮＡ）を含む。本明細書で使用する場合、ＸＮＡは、そのポリマー鎖に非天然の骨格を含む核酸を指す。例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ骨格のリボース糖の代わりに、ＸＮＡは、ヘキソース、トレオース、グリコール、シクロヘキセニル、デオキシリボースなどを含むことができる。ＸＮＡは、例えば、Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．（２０１０），Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ３２（４）：３２２－３３１に更に記載されている。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、アプタマーを含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼによる対象とする配列の伸長を防止する改変を含む。いくつかの実施形態では、改変は、脱塩基部位（アプリン／アピリミジン部位又はＡＰ部位としても知られる）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカー、又はその両方を含む。いくつかの実施形態では、改変により、対象とする配列の過度の伸長が防止され、それによって対象とする配列の挿入精度が向上する。

【0112】

融合タンパク質が、Ｃａｓヌクレアーゼ及び逆転写酵素を含む実施形態では、ポリヌクレオチドは、逆転写酵素のための鋳型配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチド、例えば標的ＤＮＡ配列中の標的配列において二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成し、開裂されたＤＮＡの１つの鎖は、鋳型配列上のプライマー－結合配列にハイブリダイズし、逆転写酵素が鋳型配列を逆転写するためのプライマーとして機能する。いくつかの実施形態では、対象とする配列は逆転写酵素によって逆転写され、第１のｃＤＮＡを生成する。いくつかの実施形態では、第１のｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖はＤＮＡポリメラーゼによって生成され、それによって対象とする配列を含む二本鎖配列を生成する。いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、例えば、本明細書に記載されるライゲーション又はＤＮＡ修復経路により、開裂された標的配列に挿入される。いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、又はリコンビナーゼのための認識部位を更に含み、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、又はリコンビナーゼは、二本鎖配列を標的ポリヌクレオチドに組み込む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の鋳型配列上の相同性領域は、対象とする配列を含む二本鎖配列を開裂された標的配列に挿入するのを容易にする。

【0113】

融合タンパク質が、Ｃａｓヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを含む実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼのための鋳型を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチド、例えば標的ＤＮＡ配列中の標的配列において二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成し、開裂されたＤＮＡの１つの鎖は、鋳型配列上のプライマー－結合配列にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼのためのプライマーとして機能する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは対象とする配列に相補的なＤＮＡ鎖を合成し、それにより対象とする配列を含む二本鎖配列を生成する。いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、例えば、本明細書に記載されるライゲーション又はＤＮＡ修復経路により、開裂された標的配列に挿入される。いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、又はリコンビナーゼのための認識部位を更に含み、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、又はリコンビナーゼは、二本鎖配列を標的ポリヌクレオチドに組み込む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の鋳型配列上の相同性領域は、対象とする配列を含む二本鎖配列を開裂された標的配列に挿入するのを容易にする。

【0114】

いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約１０～約２５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約１５～約２００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約２０～約１５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約２５～約１００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約２５００、約５０００、約７５００、約１００００、約１５０００、約２００００、又は約２５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約１０ヌクレオチド長超、約１５ヌクレオチド長超、約２０ヌクレオチド長超、約２５ヌクレオチド長超、約３０ヌクレオチド長超、約３５ヌクレオチド長超、約４０ヌクレオチド長超、約４５ヌクレオチド長超、又は約５０ヌクレオチド長超である。

【0115】

いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約３～約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約４～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約５～約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約７～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約１０～約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１２、約１５、約１７、約２０、約２２、約２５、約２７、約３０、約３２、約３５、約３８、又は約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、開裂された標的ＤＮＡ配列の領域とハイブリダイズするのに十分な長さのものである。

【0116】

いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約１～約２００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約２～約１７０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約３～約１５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約４～約１２０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５～約１００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約１０～約９０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５０～約８０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約１００～約７０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約２００～約６０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５００～約５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１２５０、約１５００、約１７５０、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、約７０００、約７５００、約８０００、約８５００、約９０００、約１００００、約１２５００、約１５０００、約１７５００、又は約２５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５ヌクレオチド長超、約１０ヌクレオチド長超、約１５ヌクレオチド長超、約２０ヌクレオチド長超、約２５ヌクレオチド長超、約３０ヌクレオチド長超、約３５ヌクレオチド長超、約４０ヌクレオチド長超、約４５ヌクレオチド長超、又は約５０ヌクレオチド長超である。

【0117】

いくつかの実施形態では、組成物のポリヌクレオチドは、ガイド配列と鋳型配列との間にスペーサーを更に含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、対象とする配列の相補鎖を転写又は合成した後に逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼが停止されるように、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼのための停止配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、２つ以上の停止配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は５つ超の停止配列を含む。いくつかの実施形態では、複数の停止配列は、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼを停止する際の冗長をもたらす。いくつかの実施形態では、停止配列は、逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼの活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、停止配列は、鋳型配列からの逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼの解離を促進する。

【0118】

いくつかの実施形態では、停止配列は、二次構造を含む。いくつかの実施形態では、二次構造は、逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼ活性の阻害剤である。いくつかの実施形態では、二次構造は、鋳型配列からの逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼの解離を促進する。いくつかの実施形態では、二次構造は、ヘアピンループ（ステムループとしても知られる）である。いくつかの実施形態では、二次構造は、シュードノットである。

【0119】

いくつかの実施形態では、スペーサーは、約５～約５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約１０～約４００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約１０～約３００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約１０～約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約２０～約１５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約３０～約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約５０～約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約７５、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、又は約２００ヌクレオチド長である。

【0120】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書で提供される融合タンパク質と、（ｂ）融合タンパク質と複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドと、（ｃ）逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼのための鋳型配列を含む鋳型ポリヌクレオチドと、を含む組成物を提供する。

【0121】

ガイドポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、組成物のガイドポリヌクレオチドは、標的配列とハイブリダイズすることができるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物のガイドポリヌクレオチドは、融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼに結合することができるポリペプチド－結合セグメントを含み、それにより融合タンパク質と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む第３のポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼを活性化する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼの活性化は、そのヌクレアーゼ活性を開始又は増加させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼの活性化は、ヌクレアーゼの標的配列への結合を含む。

【0122】

いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１０～約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１２～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１５～約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、又は約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、標的配列にハイブリダイズするのに十分な長さである。

【0123】

鋳型ポリヌクレオチドの成分、例えば、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼの鋳型配列、プライマー－結合配列、停止配列、対象とする配列、及び／又は追加相同性領域は、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約１０～約２５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約１５～約２００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約２０～約１５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約２５～約１００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約２５００、約５０００、約７５００、約１００００、約１５０００、約２００００、又は約２５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、約１０ヌクレオチド長超、約１５ヌクレオチド長超、約２０ヌクレオチド長超、約２５ヌクレオチド長超、約３０ヌクレオチド長超、約３５ヌクレオチド長超、約４０ヌクレオチド長超、約４５ヌクレオチド長超、又は約５０ヌクレオチド長超である。

【0124】

いくつかの実施形態では、鋳型配列は、対象とする配列を含む。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約１～約２００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約２～約１７０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約３～約１５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約４～約１２０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５～約１００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約１０～約９０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５０～約８０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約１００～約７０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約２００～約６０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５００～約５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１２５０、約１５００、約１７５０、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、約７０００、約７５００、約８０００、約８５００、約９０００、約１００００、約１２５００、約１５０００、約１７５００、又は約２５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５ヌクレオチド長超、約１０ヌクレオチド長超、約１５ヌクレオチド長超、約２０ヌクレオチド長超、約２５ヌクレオチド長超、約３０ヌクレオチド長超、約３５ヌクレオチド長超、約４０ヌクレオチド長超、約４５ヌクレオチド長超、又は約５０ヌクレオチド長超である。

【0125】

いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のプライマー－結合配列を更に含む。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約３～約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約４～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約５～約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約７～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約１０～約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー－結合配列は、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１２、約１５、約１７、約２０、約２２、約２５、約２７、約３０、約３２、約３５、約３８、又は約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼによって開裂された標的配列をハイブリダイズするのに十分な長さである。

【0126】

いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼのための停止配列を含む。いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、２つ以上の停止配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は５つ超の停止配列を含む。いくつかの実施形態では、停止配列は、二次構造を含む。いくつかの実施形態では、二次構造は、逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼ活性の阻害剤である。いくつかの実施形態では、二次構造は、鋳型配列からの逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼの解離を促進する。いくつかの実施形態では、二次構造は、ヘアピンループ（ステムループとしても知られる）である。いくつかの実施形態では、二次構造は、シュードノットである。

【0127】

融合タンパク質が、ＤＮＡ－結合又はＲＮＡ－結合ドメインを更に含む実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ－結合又はＲＮＡ－結合ドメインに結合することができる配列を更に含む。ＦＵＢＰについて、例えばジンクフィンガーＤＮＡ－結合ドメイン、転写因子、アデノ随伴ウイルスＲｅｐタンパク質などのＤＮＡ－結合ドメインに結合するためのＤＮＡ配列の非限定的な例は、例えば、Ｂｕｌｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８（１３）：７１５８－７１６３（２００１）；Ｆｏｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１９；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｚ１００１；Ｇｅａｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ １４（９）：ｅ０２１５４９５（２０１９）；Ｗｏｎｄｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１（３）：２５２８－２５３４（１９９７）；Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５（４７）：１８２９６－１８３０１（２００８）、及びＨｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５（１１）：７４９－７６０（２０１４）に記載されている。例えばＭＣＰ２などのＲＮＡ－結合ドメインに結合するためのＲＮＡ配列の非限定的な例は、例えば、Ｃａｓｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６３：６９６－７１０（２０１６）；Ｒｕｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ７：１１０２５（２０１６）；Ｐｅａｂｏｄｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １２（２）：５９５－６００（１９９３），及びＨｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５（１１）：７４９－７６０（２０１４）に記載されている。

【0128】

いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、対象となる配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。ＡＡＶは、対象とする配列を標的細胞に送達するように操作できる非エンベロープウイルスである。例えば、Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３１（４）：３１７－３３４（２０１７）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、一本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、対象とする配列、及びターミネーターを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＩＴＲ及び対象とする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ウイルス遺伝子を含まない。いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドはＡＡＶベクターを含み、融合タンパク質はＣａｓヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、又は約５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクター中の対象とする配列は、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１２００、約１５００、約１７００、約２０００、約２２００、約２５００、約２７００、約３０００、約３２００、約３５００、約３７００、約４０００、約４２００、約４５００、又は約４７００ヌクレオチド長である。

【0129】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１８～２６のいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする。

【0130】

いくつかの実施形態では、本明細書のポリヌクレオチド、例えば融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイド配列及び鋳型配列を含むポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、並びに／又は鋳型ポリヌクレオチドは、真核細胞での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、本明細書のポリヌクレオチドは、細菌細胞中での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、本明細書のポリヌクレオチドは、哺乳類細胞中での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、本明細書のポリヌクレオチドは、ヒト細胞中での発現のためにコドン最適化されている。本明細書で使用する場合、「コドン最適化」は、組換え又は異種タンパク質発現の収量及び効率を増加させるためにその発現を宿主のｔＲＮＡ存在量にマッチさせるようにコドンを調整することを指す。コドン最適化法は当該技術分野で公知であり、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎツール、ＥｎｔｅｌｅｃｈｏｎからのＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｔａｂｌｅ分析ツール、ＧＥＮＥＭＡＫＥＲからのＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎソフトウェア、ＡｐｔａｇｅｎからのＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅソフトウェア、並びにＤＮＡ Ｂｕｉｌｄｅｒ、ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ、及びＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅアルゴリズムなどの他のソフトウェアなどのソフトウェアプログラムを使用して、実施されてもよい。

【0131】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイド配列及び鋳型配列を含むポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、鋳型ポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド並びにガイド配列及び鋳型配列を含むポリヌクレオチドは、単一ベクター上にある。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド並びにガイド配列及び鋳型配列を含むポリヌクレオチドは、１つ以上のベクター上にある。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、及び鋳型オリゴヌクレオチドは、単一のベクター上にある。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、及び鋳型オリゴヌクレオチドは、１つ以上のベクター上にある。

【0132】

様々な種類のベクター、例えば、ウイルス及び非ウイルスベクターが、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、細菌発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ヒト発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、植物発現ベクターである。

【0133】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタインバールウイルス、アデノウイルス、ジェミニウイルス、又はカリモウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスベクターである。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びレンチウイルスベクターによるウイルス形質導入（投与は、局所的、標的化、又は全身的であり得る）が、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法のための送達方法として使用されている。ウイルスベクターなどのベクターを細胞に導入する方法（例えばトランスフェクション）は、本明細書に記載される。

【0134】

いくつかの実施形態では、ベクターは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結された調節エレメントを更に含み、ポリヌクレオチドは、ガイド配列及び鋳型配列、ガイドポリヌクレオチド、並びに／又は鋳型ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、細菌プロモーターである。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、哺乳類プロモーターである。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ターミネーターである。調節エレメントは、本明細書で更に記載されている。

【0135】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質、ガイド配列及び鋳型配列を含むポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、並びに／又は鋳型ポリヌクレオチドは、送達粒子を介して細胞に導入される。送達粒子は、例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド及びタンパク質などの外因性生体物質を送達するために使用することができる。いくつかの実施形態では、送達粒子は、固体、半固体、エマルション、又はコロイドである。いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質系粒子、リポソーム、ミセル、ベシクル、又はエキソソームである。いくつかの実施形態では、送達粒子は、ナノ粒子である。送達粒子は、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２９３７０３号明細書、同第２０１２／０２５１５６０号明細書、同第２０１３／０３０２４０１号明細書、米国特許第５，５４３，１５８号明細書、米国特許第５，８５５，９１３号明細書、米国特許第５，８９５，３０９号明細書、米国特許第６，００７，８４５号明細書、及び米国特許第８，７０９，８４３号明細書に更に記載されている。

【0136】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質、ガイド配列及び鋳型配列を含むポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、並びに／又は鋳型ポリヌクレオチドは、ベシクルを介して細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ベシクルは、エキソソーム又はリポソームを含む。外因性生体物質を標的細胞に送達するために操作されたベシクルは、例えば、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：３４１（２０１１）、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７：２１１２－２１１６（２０１２）、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４０（１７）：ｅ１３０（２０１２）、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３（８）：１００２－１００７（２００５）、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４４１：１１１－１１４（２００６）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９：７７５－７８０ （２０１２）に記載されている。

【0137】

細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される融合タンパク質を含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイド配列及び鋳型配列を含むポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、鋳型ポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイド配列及び鋳型配列を含むポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、鋳型ポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む本明細書で提供されるベクターを含む細胞を提供する。

【0138】

いくつかの実施形態では、細胞は、細菌細胞である。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、実験室株である。このような細菌細胞の例としては、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｖ．コレラ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｂ．サブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．クレセンタス（Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、Ｍ．ジェニタリウム（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、Ａ．フィシェリ（Ａ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ａ．ビネランジイ（Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、食料及び／又は飲料の調製に用いられる細菌からなる。こうした細胞の非限定的な例示の属としては、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラキバクテリウム（Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、グルコナセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）、ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）、Ｋｏｃｕｒｉａ（コクリア）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｌ．アセトトレランス（Ｌ．ａｃｅｔｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｌ．アシジピスシス（Ｌ．ａｃｉｄｉｐｉｓｃｉｓ）、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．アリメンタリウス（Ｌ．ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブチエリ（Ｌ．ｂｕｃｈｅｒｉ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．カルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．ヒルガルジイ（Ｌ．ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、Ｌ．ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、Ｌ．キムチイ（Ｌ．ｋｉｍｃｈｉｉ）、Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びＬ．サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）を含む）リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ペジオコックス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）及びザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0139】

いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、動物又はヒト細胞、細胞系（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、又は細胞株（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎ）のものである。動物又は哺乳類の細胞、細胞系、又は細胞株の例としては、限定されるものではないが、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）、チャイニーズハムスター卵母（ＣＨＯ）、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＥＢＸ、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６、又はＥｂｖｌ３、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１及びＣＯＳ７）、ＱＣ１－３、ＨＥＫ－２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢ１、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解細胞又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ ＦＵＴ８ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ ＧＳノックアウト細胞であり得る。

【0140】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト幹細胞である。幹細胞は、例えば、多能性幹細胞、例として、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、誘発された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）及び間充織幹細胞（ＭＳＣ）であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の細胞のいずれかの分化形態である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、培養下の任意の初代細胞に由来する細胞である。

【0141】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、肝細胞、例えばヒト肝細胞、動物肝細胞、又は非実質細胞である。例えば、真核細胞は、付着型代謝試験用ヒト肝細胞、付着型誘導試験用ヒト肝細胞、付着型ヒト肝細胞、懸濁液試験用ヒト肝細胞（例として、１０－ドナー及び２０－ドナープール肝細胞）、ヒト肝臓クッパー細胞、ヒト肝臓星細胞、イヌ肝細胞（例として、単一及びプールビーグル肝細胞）、マウス肝細胞（例として、ＣＤ－１及びＣ５７ＢＩ／６肝細胞）、ラット肝細胞（例として、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ及びＷｉｓｔａｒ肝細胞）、サル肝細胞（例として、カニクイザル又はアカゲザル肝細胞）、ネコ肝細胞（例として、ドメスティックショートヘア肝細胞）及びウサギ肝細胞（例として、ニュージーランドホワイト肝細胞）であり得る。

【0142】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、植物細胞である。例えば、植物細胞は、作物植物、例えばキャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ又はイネのものであり得る。植物細胞は、藻類、樹木又は野菜のものであり得る。植物細胞は、単子葉若しくは双子葉植物のもの又は作物若しくは穀類植物、生産植物、果実若しくは野菜のものであり得る。例えば、植物細胞は、樹木、例えば柑橘樹木、例えばオレンジ、グレープフルーツ又はレモン樹木；モモ又はネクタリン樹木；リンゴ又はナシ樹木；堅果樹木、例えばアーモンド又はクルミ又はピスタチオ樹木；ナス属の植物、例えばジャガイモ、トマト、ナス、コショウ、パプリカ；ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物、ラクツカ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物、スピナシア属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；カプシカム属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココアなどのものであり得る。

【0143】

部位特異的改変の方法
いくつかの実施形態では、本開示は、標的ポリヌクレオチド中の標的配列において部位特異的改変を提供する方法であって、標的ポリヌクレオチドを本明細書で提供される組成物と接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）本明細書で記載される融合タンパク質と、（ｂ）ガイド配列及び鋳型配列を含む本明細書で記載されるポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）本明細書で記載される融合タンパク質と、（ｂ）本明細書で記載されるガイドポリヌクレオチドと、（ｃ）本明細書で記載される鋳型オリゴヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、二本鎖である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。

【0144】

例示的な方法は、図１及び２に図示されている。図１Ａ及び１Ｂは、「ＮＨＥＪ促進ドメイン」、例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼに融合されたＣａｓ９を示す。図１Ａでは、「ＳＰＲＩＮｇＲＮＡ」（シングルプライム化挿入ガイドＲＮＡ）は、対象とする配列（「ｉｎｓ」）及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）を含む。図１Ｂでは、融合タンパク質は、ＤＮＡ又はＲＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＣＰ２、ＺＦ、ＴＡＬＥ、ＦＢＰ、Ｐｕｍｉｌｉｏ、ＨＵＨ、又はＳＮＡＰ）を更に含み、ＰＢＳを伴う対象とする配列は分離ポリヌクレオチドとして提供される。図１Ｃは、図１Ａに示されるＰＲＩＮＳ複合体の作用メカニズムを示す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチドに二本鎖開裂を生成する。ＰＢＳ及び対象とする配列を含有するＣａｓ９複合体中の鋳型配列を使用して、対象とする配列を複製する。次いで、生成された二本鎖配列を、ＮＨＥＪにより開裂された標的ポリヌクレオチドにライゲートすることができる。

【0145】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼ及び逆転写酵素を含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のポリヌクレオチドのガイド配列又はガイドポリヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的配列をハイブリダイズすることにより融合タンパク質を標的配列に誘導する。いくつかの実施形態では、方法の接触工程は、Ｃａｓヌクレアーゼが標的配列において二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成するのに十分な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、開裂された標的配列の１つの鎖は、逆転写酵素のためのプライマーである。いくつかの実施形態では、組成物中のポリヌクレオチドの鋳型配列又は鋳型ポリヌクレオチドは、プライマーに結合することができるプライマー－結合部位を含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、対象とする配列を含む。いくつかの実施形態では、方法の接触工程は、逆転写酵素が標的配列にハイブリダイズされたプライマー－結合配列を認識し、対象とする配列の相補鎖を逆転写して第１のｃＤＮＡを生成するのに十分な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、第１のｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼが第１のｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成し、それによって対象とする配列を含む二本鎖配列を生成することができるように、鋳型配列はＲＮアーゼによって第１のｃＤＮＡから除去される。逆転写酵素がＲＮアーゼ活性が可能であるいくつかの実施形態では、鋳型配列は逆転写酵素により除去される。いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮアーゼを提供して鋳型配列を除去することを更に含む。いくつかの実施形態では、ＲＮアーゼはＲＮアーゼＨである。ＲＮアーゼＨは、ＤＮＡにハイブリダイズされるＲＮＡを特異的に加水分解することができる。

【0146】

いくつかの実施形態では、ＲＮアーゼ、例えばＲＮアーゼＨによる第１のｃＤＮＡからの鋳型配列の除去、例えば消化又は開裂後、ＤＮＡポリメラーゼは、第１のｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を生成し、それによって対象とする配列を含む二本鎖配列を生成する。逆転写酵素がＤＮＡポリメラーゼ活性が可能であるいくつかの実施形態では、第１のｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖は、逆転写酵素によって生成される。方法が細胞中で行われるいくつかの実施形態では、第１のｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖は、細胞中のネイティブなＤＮＡポリメラーゼによって生成される。方法がｉｎ ｖｉｔｒｏで行われるいくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡポリメラーゼを提供して第１のｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を生成することを更に含む。いくつかの実施形態では、第１のｃＤＮＡ及び第１のｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖はハイブリダイズして、対象とする配列を含む二本鎖配列を形成する。いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、開裂された標的配列に挿入することができる。いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、ＤＮＡ修復経路、例えば非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により、開裂された標的配列に挿入される。いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、ＤＮＡリガーゼにより、開裂された標的配列に挿入される。いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、又はリコンビナーゼのための認識部位を更に含み、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、又はリコンビナーゼは、二本鎖配列を標的ポリヌクレオチドに組み込む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の鋳型配列上の相同性領域は、対象とする配列を含む二本鎖配列を開裂された標的配列に挿入するのを容易にする。

【0147】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、組成物中のポリヌクレオチドのガイド配列又はガイドポリヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的配列をハイブリダイズすることにより融合タンパク質を標的配列に誘導する。いくつかの実施形態では、方法の接触工程は、Ｃａｓヌクレアーゼが標的配列において二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成するのに十分な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、開裂された標的配列の１つの鎖は、ＤＮＡポリメラーゼのためのプライマーである。いくつかの実施形態では、組成物中のポリヌクレオチドの鋳型配列又は鋳型ポリヌクレオチドは、プライマーに結合することができるプライマー－結合部位を含む。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、対象とする配列を含む。いくつかの実施形態では、方法の接触工程は、ＤＮＡポリメラーゼが標的配列にハイブリダイズされたプライマー－結合配列を認識し、対象とする配列を含む二本鎖配列を生成するのに十分な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、開裂された標的配列に挿入することができる。いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、ＤＮＡ修復経路、例えば非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により、開裂された標的配列に挿入される。いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、ＤＮＡリガーゼにより、開裂された標的配列に挿入される。いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、又はリコンビナーゼのための認識部位を更に含み、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、又はリコンビナーゼは、二本鎖配列を標的ポリヌクレオチドに組み込む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の鋳型配列上の相同性領域は、対象とする配列を含む二本鎖配列を開裂された標的配列に挿入するのを容易にする。

【0148】

いくつかの実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中の第２の標的配列において第２の二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成することを更に含む。いくつかの実施形態では、第２の標的配列は、標的配列の上流である。いくつかの実施形態では、第２の標的配列は、標的配列の下流である。いくつかの実施形態では、第２の二本鎖ポリヌクレオチド開裂は、第２のＣａｓヌクレアーゼによって生成される。いくつかの実施形態では、例えば、逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼによって生成された対象とする配列を含む二本鎖配列の一端は、開裂された標的配列と結合され、二本鎖配列の他端は、開裂された第２の標的配列と結合され、それにより、標的配列と第２の標的配列との間で標的ポリヌクレオチドの配列を置換する。そのような実施形態は、図１Ｄに例示されている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチドに二本鎖切断を生成する。ＰＢＳ及び対象とする配列を含有するＣａｓ９複合体中の鋳型配列を使用して、対象とする配列を複製する。次いで、生成された二本鎖配列は、ＮＨＥＪによって、第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によって下流で生成された別の切断にライゲートすることができる。２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の間の標的ポリヌクレオチド上の配列は、対象となる配列に置換される。

【0149】

いくつかの実施形態では、対象とする配列を含む二本鎖配列は、ＤＮＡ修復経路により、開裂された標的配列に挿入される。方法が細胞中で行われる実施形態では、二本鎖配列は、細胞固有のＤＮＡ修復経路成分によって標的配列に挿入される。ＤＮＡ修復経路としては、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路、及び相同性配向型修復（ＨＤＲ）経路が挙げられる。ＮＨＥＪは相同な鋳型を必要としない。一般に、ＮＨＥＪは、ＨＤＲと比較して高い修復効率を有するものの、忠実度は低いが、二本鎖切断が適合性のある粘着末端又はオーバーハングを有する場合、誤りは低減する。二本鎖切断の両側にミクロ相同性（例えば、約２～約１０塩基対）を有するＭＭＥＪ。ＨＤＲは修復を指示するために相同な鋳型を必要とし、ＨＤＲ修復は、典型的には、ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪと比較して忠実度は高いが、効率が低くなる。いくつかの実施形態では、方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に十分な条件下で行われる。

【0150】

いくつかの実施形態では、例えば、逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼによって生成された対象とする配列を含む二本鎖配列は、ライゲーションにより開裂された標的配列に挿入される。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、リガーゼ、例えば、ＤＮＡリガーゼによって行われる。いくつかの実施形態では、方法は、リガーゼを提供することを更に含む。リガーゼは、本明細書に更に記載されている。いくつかの実施形態では、リガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼである。

【0151】

いくつかの実施形態では、例えば、逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼによって生成された対象とする配列を含む二本鎖配列は、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、又はリコンビナーゼの認識部位を更に含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、又はリコンビナーゼは、二本鎖配列を標的ポリヌクレオチドに組み込む。エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、及びリコンビナーゼによる配列組み込みのメカニズムは、当業者に公知であり、例えば、Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２７（４）：６７１－６７６（１９９８）、Ｎｅｓｍｅｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ６２：１１８７－１１９５（２０１０）、及びＨａｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１（２）：１５７－１７８（１９９７）に更に記載されている。

【0152】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼ及びＤＮＡリガーゼを含み、組成物は、二本鎖鋳型ポリヌクレオチドを含み、二本鎖鋳型ポリヌクレオチドは、対象となる配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物中のポリヌクレオチドのガイド配列又はガイドポリヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的配列をハイブリダイズすることにより融合タンパク質を標的配列に誘導する。いくつかの実施形態では、方法の接触工程は、Ｃａｓヌクレアーゼが標的配列において二本鎖ポリヌクレオチド開裂を生成するのに十分な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、二本鎖鋳型ポリヌクレオチドは、ライゲーションにより、開裂された標的配列に挿入することができる。いくつかの実施形態では、鋳型配列及び開裂された標的配列は相補的な粘着末端を含み、ＤＮＡリガーゼは粘着末端をライゲートすることができる。いくつかの実施形態では、鋳型配列及び開裂された標的配列は、平滑末端を含み、ＤＮＡリガーゼは平滑末端をライゲートすることができる。いくつかの実施形態では、方法の接触工程は、ＤＮＡリガーゼが対象とする配列を含む鋳型配列を開裂された標的配列にライゲートするのに十分な条件下で行われ、それにより、鋳型配列を開裂された標的配列に組み込む。リガーゼは、本明細書に更に記載されている。いくつかの実施形態では、リガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質はＣａｓヌクレアーゼ及びＤＮＡリガーゼを含み、鋳型配列は対象となる配列及びプライマー－結合配列を含み、方法は標的ポリヌクレオチドを逆転写酵素と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、対象とする配列の相補鎖を逆転写し、それによって、本明細書に記載の対象とする配列を含む二本鎖配列を形成する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡリガーゼは、二本鎖配列を開裂された標的配列にライゲートする。

【0153】

組成物がガイド配列及び鋳型配列を含むポリヌクレオチドを含むいくつかの実施形態では、鋳型配列は、開裂部位及び融合タンパク質に近接している。組成物が鋳型ポリヌクレオチドを含むいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、鋳型ポリヌクレオチドを結合するためのＤＮＡ－結合ドメイン又はＲＮＡ－結合ドメインを更に含み、それにより、鋳型配列を開裂部位及び融合タンパク質に近接するようにする。いくつかの実施形態では、鋳型配列が融合タンパク質に近接していると、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼの活性が促進される。いくつかの実施形態では、鋳型配列が開裂部位に近接していると、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼ反応から生じる二本鎖配列の開裂された標的配列への組み込みが促進される。

【0154】

いくつかの実施形態では、本方法は、開裂された標的配列に近接して二本鎖配列を提供することによって、二本鎖配列を開裂された標的配列に組み込む効率を向上させる。いくつかの実施形態では、本方法は、開裂された標的配列のリライゲーションを低減することによって、二本鎖配列を開裂された標的配列に組み込む効率を向上させる。いくつかの実施形態では、本方法は、二本鎖開裂を生成するために融合逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼなしでＣａｓヌクレアーゼを利用する方法と比較して、改善された効率を有する。いくつかの実施形態では、本方法は、二本鎖開裂を生成するために融合逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡリガーゼなしでＣａｓヌクレアーゼを利用する方法と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、若しくは少なくとも２００倍、又はそれ以上の効率を有する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象となる配列を開裂された標的配列に近接させない方法と比較して、改善された効率を有する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象となる配列を開裂された標的配列に近接させない方法と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、若しくは少なくとも２００倍、又はそれ以上の効率を有する。

【0155】

いくつかの実施形態では、本方法は、対象となる長い配列を標的配列に挿入することができる。例えば、本方法は、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼがそのような長さの配列を生成する能力を有する限り、約１０，０００ヌクレオチド長の配列を標的配列に挿入することができる。高処理能力を有する逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼの例が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５ヌクレオチド長超、約１０ヌクレオチド長超、約１５ヌクレオチド長超、約２０ヌクレオチド長超、約２５ヌクレオチド長超、約３０ヌクレオチド長超、約３５ヌクレオチド長超、約４０ヌクレオチド長超、約４５ヌクレオチド長超、又は約５０ヌクレオチド長超である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約１～約２００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約２～約１７０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約３～約１５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約４～約１２０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５～約１００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約１０～約９０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５０～約８０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約１００～約７０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約２００～約６０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対象とする配列は、約５００～約５０００ヌクレオチド長である。

【0156】

いくつかの実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。いくつかの実施形態では、方法は、細胞中で行われる。細胞の例は、本明細書で提供される。

【0157】

キット
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される融合タンパク質を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キット中の融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター、例えば本明細書で記載のベクター上に提供される。

【0158】

いくつかの実施形態では、キットは、融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、ベクター、例えば本明細書で記載のベクター上に提供される。

【0159】

いくつかの実施形態では、キットは、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼのための鋳型配列を含む鋳型ポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、ベクター、例えば本明細書で記載のベクター上に提供される。

【0160】

いくつかの実施形態では、キットは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼを結合及び／又は活性化する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、ベクター、例えば本明細書で記載のベクター上に提供される。

【0161】

いくつかの実施形態では、キットは、ＤＮＡポリメラーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼミュー、ＤＮＡポリメラーゼデルタ、又はＤＮＡポリメラーゼイプシロンを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＤＮＡリガーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＲＮアーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＲＮアーゼＨを更に含む。

【0162】

いくつかの実施形態では、キットは、融合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、及び／又はＲＮアーゼのための反応緩衝液及び／又は保存緩衝液を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＤＮＡ開裂反応、逆転写酵素反応、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ＤＮＡリガーゼ反応、及び／又はＲＮａｓｅ反応を行うための試薬を更に含む。いくつかの実施形態では、試薬は、ＡＴＰ、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ_２、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）、及び／又はＲＮアーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の対照、例えば、融合タンパク質のための対照標的ポリヌクレオチドを含む。例えば、対照標的ポリヌクレオチドは、融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼによって一定の効率で特異的に開裂されるように設計することができ、それによってＣａｓヌクレアーゼの活性を較正することができる。

【0163】

いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の容器を含む。いくつかの実施形態では、キットは、消耗品、例えば、方法の１つ以上の工程中にサンプル及び／若しくは試薬を含むように設計されたチューブ、バイアル、又はプレート；液体サンプル及び試薬を移すためのピペット若しくはピペットチップ；方法で使用されるチューブ、バイアル、プレート、及び／若しくはその他の消耗品のカバー及びシール；消耗品を保持するためのラック；サンプルを識別するためのラベル；並びに／又は本明細書に記載の方法のように、キットを利用して標的ポリヌクレオチドの標的配列において部位特異的改変を提供するための説明書を更に含む。

【0164】

本明細書に引用される全ての参考文献、例えば、特許、特許出願、論文、教科書など、及びこれらに引用される参考文献は、それらがまだ引用されていない限りにおいて、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

【実施例】

【0165】

実施例１．
本実施例では、Ｃａｓ９及び逆転写酵素に融合したＣａｓ９（「ＰＲＩＮＳ」）を、対応するガイドＲＮＡとともに細胞に導入した。

【0166】

ＨＥＫ２９３細胞を、１ｍＬの完全増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）に１２ウェルプレートの１ウェルあたり２×１０^５細胞の密度でトランスフェクションの前日に播種した。ＣＲＩＳＰＲ複合体成分は、野生型Ｃａｓ９又はＰＲＩＮＳを発現する０．５５μｇのプラスミドと、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とする０．５５μｇのｇＲＮＡを５２μＬの総量で組み合わせることによって調製した。ＰＲＩＮＳ用のガイドＲＮＡ配列は、配列番号２７～２８に記載されており、ＡＡＶＳ１部位を標的として、ＡＡＧＡＴＧ配列を挿入する。この混合物に、３．３μＬのＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ試薬を添加した。溶液をピペッティング（約１５回）又は簡単なボルテックスによって注意深く混合し、次いで室温で５～１０分間インキュベートした。細胞が入った各ウェルに、５０μＬの複合体を添加し、ウェルを振盪させた。

【0167】

トランスフェクションの３日後、ゲノムＤＮＡを抽出し、Ａｍｐｌｉｃｏｎ－Ｓｅｑを実施して編集された配列を増幅した。Ｔａｈｅｒｉ－Ｇｈａｈｆａｒｏｋｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４６（１６）：８４１７－８４３４（２０１８）で記載されているように、Ａｍｐｌｉｃｏｎ－ＳｅｑデータでＲａｔｉｏｎａｌ ＩｎＤｅｌ Ｍｅｔａ－Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＩＭＡ）を実行し、Ｃａｓ９誘導の変化を分析した。

【0168】

結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａで示されるように、Ｃａｓ９をトランスフェクトしたほとんどの細胞が、可変長の欠失を有した。図３Ｂでは、ＰＲＩＮＳをトランスフェクトした細胞は、挿入イベントの数が多く（楕円で示される）、Ｃａｓ９と比較して編集効率が高かった。

【0169】

実施例２．
本実施例では、ＲＴに融合したＣａｓ９ニッカーゼ（「ＰＥ」）及びＲＴに融合したＣａｓ９（ＰＲＩＮＳ）は、対応するＰＥ用のプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）及びＰＲＩＮＳ用のシングルプライム化編集挿入ガイドＲＮＡ（ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ）とともに、実施例１に記載のＡＡＶＳ１部位を標的とする両方を細胞に導入した。ＰＥ及びｐｅｇＲＮＡは、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７６：１４９－１５７（２０１９）に記載されている。要約すると、ｐｅｇＲＮＡは、標的配列に相補的なガイド配列、及び標的配列と相同な２つの領域が隣接する挿入用配列（ＡＡＧＡＴＧ）を含む鋳型配列を含み、そのうちの１つはプライマー結合配列として機能する。ｓｐｒｉｎｇＲＮＡは、標的配列に相補的なガイド配列、挿入用配列（ＡＡＧＡＴＧ）を含む鋳型配列、及びプライマー－結合配列を含む。

【0170】

図５Ａ及び５Ｂは、それぞれＰＲＩＮＳ／ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ及びＰＥ／ｐｅｇＲＮＡの挿入頻度を示す。相対的な編集頻度は断片分析によって決定された（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３（９）：ｅ５９（２０１５）を参照のこと）。ＰＲＩＮＳは４２．４％の挿入率で、１４．３％の挿入しかなかったＰＥよりも効率的である。

【0171】

ＰＲＩＮＳについてＮＨＥＪへの依存性を実証するために、ＮＨＥＪに関与することが知られている特定のＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡＰＫ）のための２．５μＭの阻害剤を使用して、同じ実験を繰り返した。図５Ｃ及び５Ｄにおける結果は、それぞれＰＲＩＮＳ／ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ及びＰＥ／ｐｅｇＲＮＡの挿入頻度を示す。ＰＥではＤＮＡＰＫ阻害の効果は観察されなかったが（図５Ｄ）、ＰＲＩＮＳはＤＮＡＰＫ阻害剤の存在下で挿入頻度を減少させた（図５Ｃ）。

【0172】

実施例３．
本実施例では、ＲＴに融合したＣａｓ９ニッカーゼ（「ＰＥ」）、ＲＴに融合したＣａｓ９（ＰＲＩＮＳ）は、両方とも、実施例２に記載されているように、ＡＡＶＳ１部位を標的とするｐｅｇＲＮＡで試験された。

【0173】

挿入頻度は、実施例２に記載の断片分析によって分析した。図６の結果は、ｐｅｇＲＮＡがＰＲＩＮＳによる挿入を促進できることを示す。Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７６：１４９－１５７（２０１９）に記載されているとおり、ＰＲＩＮＳは、おそらくＰＥと同様の方法でｐｅｇＲＮＡを利用できる可能性がある。

【0174】

実施例４．ＰＲＩＮＳ編集対プライム編集の作用メカニズムの決定
本実施例では、ＰＲＩＮＳ編集のためにＲＴに融合されたＣａｓ９の作用メカニズムを評価し、プライム編集のためにＲＴに融合されたＣａｓ９ニッカーゼのメカニズムと比較した。ＰＲＩＮＳ編集及びプライム編集がＤＮＡ修復に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を利用するかどうかを判断するために、ＮＨＥＪ経路の既知の酵素であるＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）の阻害剤を導入した。

【0175】

ＨＥＫ－Ｔ細胞をＤＮＡ－ＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８で４時間処理した後、実施例２について上述したように、ＰＲＩＮＳ編集及びプライム編集のための成分をトランスフェクトした。ＡＡＶＳ１遺伝子座への特定の６ｂｐ組み込み（ＡＡＧＡＴＧ）の割合は、ＮＧＳ Ａｍｐｌｉｃｏｎ－Ｓｅｑを使用して評価した。

【0176】

結果を図７に示す。棒グラフは、ｎ＝２の平均を標準偏差で表す。「＃１」又は「＃２」とラベル付けされた棒は、様々なｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（ＰＲＩＮＳ編集の場合）又は様々なｐｅｇＲＮＡ（プライム編集の場合）を指す。データは、ＰＲＩＮＳ媒介組み込みがＤＮＡ－ＰＫ阻害によって大幅に減少することを示したが、プライム編集は比較的影響を受けなかった。

【0177】

実施例５．ＤＮＡ及びＲＮＡ鋳型配列並びにＤＮＡポリメラーゼ融合物の評価
本実施例では、ｓｐｒｉｎｇＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型配列（「ＤＮＡテール」）又はＲＮＡ鋳型配列（「ＲＮＡ テール」）を使用して調製した。Ｃａｓ９＋ＲＴ（「ＰＥ０」）、Ｃａｓ９＋ＤＮＡポリメラーゼＤ（「ＰＥ０ ＰｏｌＤ」）、Ｃａｓ９＋Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（「ＰＥ０ Ｐｈｉ」）、及びＣａｓ９対照の融合物を試験した。３つのガイドＲＮＡ（１つはＲＮＡテール（「１２３ＲＮＡ ＭＳ」）を含み、２つはＤＮＡテール（「１２３ＤＮＡ」及び「１２３ＤＮＡ ＰＳ」）を含む）は、Ａｇｉｌｅｎｔによって合成した。配列を表１に示す。

【0178】

【表1】

【0179】

１日目にＦＵＧＥＮＥを使用して融合タンパク質を細胞にトランスフェクトし、２日目にガイドＲＮＡをＲＮＡｉＭＡＸでトランスフェクトした。

【0180】

結果を図８～１２に示す。図８は、様々なタンパク質による編集効率の概要を示している。すべての融合タンパク質は、Ｃａｓ９と比較して、ＤＮＡテール配列でより高い編集効率を達成した。図９～１２の上部、中央、及び下部のパネルは、それぞれ１２３ＲＮＡ ＭＳテール、１２３ＤＮＡテール、又は１２３ＤＮＡ ＰＳテールを使用した示されたタンパク質（ＰＥ０、ＰＥ０ ＰｏｌＤ、ＰＥ０ Ｐｈｉ、又はＣａｓ９）の編集パターンを示している。驚くべきことに、ＤＮＡテールを含むガイドＲＮＡは、図９に示されるように、ＰＥ０を使用して同様の編集パターンを達成した。図１０及び１１は、ＤＮＡポリメラーゼＰｏｌＤ及びＰｈｉ２９がＤＮＡテールをコピーできるが、ＲＮＡテールをコピーできないことを示している。

【0181】

実施例６．ガイド配列の評価
本実施例では、様々なガイド配列が設計され、ＰＲＩＮＳ編集又はプライム編集によるＤＮＡ編集への影響を評価した。本明細書の実施形態で記載されるように、ＰＲＩＮＳ編集は、単一のＰＲＩＮＳガイドＲＮＡ（ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ）を利用して、特定のゲノム遺伝子座を標的化して改変する。Ｃａｓ９標的化系のための従来のｓｇＲＮＡに見られるスペーサー及びスキャホールド配列に加えて、ｓｐｒｉｎｇＲＮＡには、標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズし、逆転写用のプライマーとして機能するプライマー結合部位（ＰＢＳ）を含む３’伸長が含まれる。ＰＢＳの後には、所望の改変を含むＤＮＡ合成鋳型が続く。比較すると、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）は、図１３に示されるように、ＤＮＡ合成鋳型に続く追加の相同性領域を含む。

【0182】

ＰＲＩＮＳ編集及びプライム編集に対する異なるプライマー設計の効果を研究するために、実施例２で上述したように、及び実施例４で上述したようにＤＮＡ－ＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８の非存在下又は存在下で、ＨＥＫ－Ｔ細胞をＰＲＩＮＳ編集及びプライム編集成分で同時トランスフェクトした。

【0183】

結果を図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。データは、ＰＲＩＮＳ編集（図１４Ａ）及びプライム編集（図１４Ｂ）を用いたＡＡＶＳ１遺伝子座への特異的６ｂｐ組み込み（ＡＡＧＡＴＧ）のパーセンテージを表す。棒グラフは、ｎ＝２の平均を標準偏差で表す。「＃１」又は「＃２」と標識された棒は、図１３に示されるように、異なるｓｐｒｉｎｇＲＮＡ及びｐｅｇＲＮＡ設計を指す。結果は、ＰＲＩＮＳ編集がｓｐｒｉｎｇＲＮＡ及びｐｅｇＲＮＡの両方の設計で機能することを示している。ＰＲＩＮＳ編集とｐｅｇＲＮＡ及びＤＮＡ－ＰＫ阻害剤との組み合わせは、最高の特異的編集をもたらし、同じｐｅｇＲＮＡを使用した場合、プライム編集よりも２倍優れていた。プライム編集は、ｐｅｇＲＮＡで検出可能な改変を生成したが、ｓｐｒｉｎｇＲＮＡでは検出可能な改変を生成しなかった。

【0184】

実施例７．ＰＲＩＮＳ編集毒性の評価
本実施例では、Ｃａｓ９編集と比較したＰＲＩＮＳ編集の毒性は、二本鎖切断の生成後に誘発される大きな欠失の数を決定することによって評価された。

【0185】

ジフテリア毒素（ＤＴ）選択系（例えば、２０２０年４月１２日に出願された米国仮出願第６２／８３３，４０４号明細書及びＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６０２５０号明細書に記載されている）を使用して、大きな欠失の量を評価した。図１５は、実験設計の概略を示す。要約すると、ＤＴ受容体であるＨｂＥＧＦのイントロンは、ＰＲＩＮＳ編集又はＣａｓ９編集標的として選択された。二重対立遺伝子の大きな欠失のみが、細胞にＤＴ抵抗性を提供し、したがって、ＤＴ処理後の細胞生存率は、大きな欠失の量を示す。

【0186】

細胞を、Ｃａｓ９－ＲＴ融合物（ＰＲＩＮＳ編集、「ＰＥ０」）、Ｃａｓ９、又はＣａｓ９ニッカーゼ－ＲＴ融合物（プライム編集、「ＰＥ２」）、及び３つの異なるガイドＲＮＡでトランスフェクトした。図１６の結果は、同量のＤＮＡで同数の細胞をトランスフェクトした後、ＰＥ０プレートがＣａｓ９プレートと比較してより少ない細胞を示し、ＰＲＩＮＳ編集による大きな欠失の数が少ないことを示している。ＰＲＩＮＳ編集による大きな欠失の数は、ＰＥ２によるプライム編集に匹敵する。

【0187】

実施例８．外因性鋳型ポリヌクレオチドの評価
本実施例では、ＰＲＩＮＳ編集又はプライム編集のためのガイドＲＮＡに融合されていない外因性鋳型ポリヌクレオチドの付加を評価した。

【0188】

実験設計の模式図を図１７に示す。ＭＳ２アプタマーに結合するＭＣＰドメインは、Ｃａｓ９とＲＴの間（「ＰＲＩＮＳ＿ＭＳ２＿ｖ１」）又はＲＴの下流（「ＰＲＩＮＳ＿ＭＳ２＿ｖ２」）のいずれかで、ＰＲＩＮＳ編集に使用されるＣａｓ９－ＲＴタンパク質に融合された。逆転写用の鋳型は、ガイドＲＮＡの代わりにＭＳ２アプタマーに融合された。ＰＲＩＮＳ＿ＭＳ２、ＭＳ２－ＲＴ鋳型、及び標的ｇＲＮＡをＨＥＫ－Ｔ細胞に同時トランスフェクトし、標的化挿入について試験した。対照ｇＲＮＡ及びｇＲＮＡに融合したＲＴ鋳型は、それぞれ陰性対照と陽性対照として機能した。

【0189】

図１８の結果は、ｇＲＮＡに融合したＲＴ鋳型を使用したＰＲＩＮＳ編集よりも編集効率が低いにもかかわらず、ＤＮＡ配列がＰＲＩＮＳ編集によって特異的にＭＳ２－ＲＴ鋳型からうまく複製及び挿入されたことを示している。

【0190】

実施例９．ＰＲＩＮＳ編集のためのＣａｓ１２融合物の評価
本実施例では、Ｃａｓ１２－ＲＴ融合タンパク質は、ＰＲＩＮＳ編集及びプライム編集能力について評価された。

【0191】

ＲＴは、ＬｂＣａｓ１２（ＬｂＣｐｆ１としても知られている）に融合された。ガイドＲＮＡは、ＥＭＸ１及びＤＮＭＴ１部位でＰＲＩＮＳ編集（ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ）及びプライム編集（ｐｅｇＲＮＡ）用に設計された。ＥＭＸ１を標的とする例示的なガイドＲＮＡを図１９に示し、以下の配列が含まれ、一重下線は挿入配列を示し、二重下線は相同性配列を示す：

【化1】

【0192】

上記のガイドＲＮＡを使用したＥＭＸ１部位での挿入は、表２に示すように決定された。

【0193】

【表2】

【0194】

突然変異の型は、表３に示されるように決定した。

【0195】

【表3】

【0196】

表２及び３の結果は、ＰＲＩＮＳ編集を使用して、ＤＮＡ配列が特異的にＣａｓ１２－ＲＴ融合タンパク質によってうまく複製及び挿入されたことを示している。全体の編集効率は約０．２５％であった。

【0197】

実施例１０．Ｃａｓ９－ＤＮＡポリメラーゼ融合物を用いたＰＲＩＮＳ編集
ＤＮＡポリメラーゼに融合したＣａｓ９は、ＰＲＩＮＳ編集について評価された。ＤＮＡポリメラーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで逆転写酵素活性を示すことが報告されている（例えば、Ｒｉｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１２（２）：３８７－３９６（１９９３）を参照されたい）。以下に示すように、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９－ＲＴ融合物（「ＰＥ０」）、又はＤＮＡポリメラーゼと融合したＣａｓ９のいずれかを発現するプラスミドを、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするシングルプライム化編集挿入ガイドＲＮＡ（ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ）を発現するプラスミドとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。Ｃａｓ９－ＤＮＡポリメラーゼ融合物には、次のＤＮＡポリメラーゼ構築物が含まれていた：

【0198】

Ｃａｓ９－Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ^＋：Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのコドン最適化Ｋｌｅｎｏｗ断片；

【0199】

Ｃａｓ９－Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ^－：ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を無効にするＤ３５５Ａ及びＥ３５７Ａ突然変異を伴うＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのコドン最適化Ｋｌｅｎｏｗ断片；

【0200】

Ｃａｓ９－ＲＥＶ３：ヒトＲＥＶ３ポリメラーゼの触媒的に活性なトランケーション、これは、全長ＲＥＶ３（ＲＥＶ ＴＲ５と表示：Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０１４），ｄｏｉ：１０．１０７３：ｐｎａｓ．１３２４００１１１１を参照）と比較して、安定性が高く、発現レベルが高いことが確認された。

【0201】

トランスフェクションの７２時間後に細胞を回収した。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＡＶＳ１遺伝子座をＰＣＲによって増幅し、イルミナシーケンスプラットフォームを使用して配列決定を行った。

【0202】

図２０の結果は、３つのＣａｓ９－ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質が、ＰＲＩＮＳ編集が可能であったことを示す。

【0203】

実施例１１．Ｃａｓ９－ＤＮＡポリメラーゼ融合物及びキメラｓｐｒｉｎｇＲＮＡを用いたＰＲＩＮＳ編集
キメラｓｐｒｉｎｇＲＮＡは、Ｃａｓ９、ＰＥ０、及びＣａｓ９－ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質を用いたＰＲＩＮＳ編集で評価された。ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｃａｓ９、ＰＥＯ、又は実施例１０に記載の３つのＣａｓ９－ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸを使用して、以下の合成ｓｐｒｉｎｇＲＮＡのうちの１つを２ｐｍｏｌ用いて細胞を更にトランスフェクトした：

【0204】

ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ－全てのＲＮＡヌクレオチド；配列はガイドＲＮＡ配列を含む；Ｃａｓ９を結合するためのｔｒａｃｒＲＮＡスキャホールド；並びにｓｐｒｉｎｇＲＮＡの３’にある６－ヌクレオチド挿入配列（「ＡＡＴＡＴＧ」）及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）；

【0205】

キメラｓｐｒｉｎｇＲＮＡ ＤｉＨＰ－ｓｐｒｉｎｇＲＮＡについての上記と同じ配列、挿入配列及びＰＢＳの１０ヌクレオチドを除く全てのＲＮＡヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである；

【0206】

キメラｓｐｒｉｎｇＲＮＡ ＤｉＲＰ－ｓｐｒｉｎｇＲＮＡについての上記と同じ配列、挿入配列を除く全てのＲＮＡヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。

【0207】

トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収した。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＡＶＳ１遺伝子座をＰＣＲによって増幅し、イルミナシーケンスプラットフォームを使用して配列決定を行った。

【0208】

図２１Ａ～Ｃの結果は、Ｃａｓ９－ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質が、キメラＤＮＡ含有ｓｐｒｉｎｇＲＮＡを使用した場合、ＰＥ０に匹敵する効率でＰＲＩＮＳ編集が可能であったことを示す。

【0209】

実施例１２．Ｃａｓ９－ＤＮＡポリメラーゼ融合物及び改変されたｓｐｒｉｎｇＲＮＡを用いたＰＲＩＮＳ編集
化学修飾を施した様々なｓｐｒｉｎｇＲＮＡをＰＲＩＮＳ編集で評価した。ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｃａｓ９又はＰＥ０を発現するプラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸを使用して、以下のｓｐｒｉｎｇＲＮＡのうちの１つを２ｐｍｏｌ用いて細胞を更にトランスフェクトした：

【0210】

ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ－全てのＲＮＡヌクレオチド；配列はガイドＲＮＡ配列を含む；Ｃａｓ９を結合するためのｔｒａｃｒＲＮＡスキャホールド；並びに６－ヌクレオチド挿入配列（「ＡＡＴＡＴＧ」）及びｓｐｒｉｎｇＲＮＡの３’にあるプライマー結合部位（ＰＢＳ）；

【0211】

脱塩基部位を有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ－ｓｐｒｉｎｇＲＮＡについての上記と同じ配列、挿入配列の３番目のヌクレオチドがｄＳｐａｃｅｒヌクレオチド１’２’－ジデオキシリボース（脱塩基部位）に置き換えられていることを除く全てのＲＮＡヌクレオチド；

【0212】

ＴＥＧリンカーを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ－ｓｐｒｉｎｇＲＮＡについての上記と同じ配列、挿入配列の３番目のヌクレオチドがトリエチレングリコール（ＴＥＧ）に共有結合されていることを除く全てのＲＮＡヌクレオチド。

【0213】

トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収した。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＡＶＳ１遺伝子座をＰＣＲによって増幅し、イルミナシーケンスプラットフォームを使用して配列決定を行った。

【0214】

図２２の結果は、化学的に改変されたｓｐｒｉｎｇＲＮＡが挿入物の過度の伸長を防ぎ、突然変異誘発の精度を高めることができたことを示している。

【0215】

実施例１３．Ｃａｓ９－ＤＮＡリガーゼ融合物を用いたＰＲＩＮＳ編集
細胞は、別々の発現プラスミド及びｓｐｒｉｎｇＲＮＡを含むプラスミド上でＣａｓ９及びＲＴとトランスフェクトされ、ＰＲＩＮＳ編集について評価された。図２３Ａで示されるように、ＰＲＩＮＳ編集は、依然として、Ｃａｓ９及びＲＴタンパク質の同時発現で発生した（アスタリスクは野生型配列を示す）。

【0216】

次いで、ＤＮＡリガーゼに融合したＣａｓ９は、ＰＲＩＮＳ編集について評価した。Ｃａｓ９は、ＤＮＡ切断の非相同末端結合に関与するＤＮＡリガーゼであるヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＬｉｇＤに融合された（「Ｃａｓ９－ＬｉｇＤ」）。Ｃａｓ９－ＬｉｇＤ融合タンパク質を発現するプラスミドを、ＲＴを発現するプラスミド及びｓｐｒｉｎｇＲＮＡプラスミドと同時トランスフェクトし、ＰＲＩＮＳ編集について評価した。

【0217】

図２３Ｂの結果は、Ｃａｓ９－ＬｉｇＤ融合タンパク質及びＲＴの同時トランスフェクションが、Ｃａｓ９及びＲＴの同時発現と比較して、所望の配列の挿入を改善したことを示す。

【0218】

実施例１４．挿入物及びｓｐｒｉｎｇＲＮＡにおけるＰＢＳのミスマッチ
ｓｐｒｉｎｇＲＮＡの５’と３’の間の相同性を低下させるために、ｓｐｒｉｎｇＲＮＡのプライマー結合部位（ＰＢＳ）にミスマッチが導入され、ＰＢＳにアニーリングされた標的ＤＮＡ鎖の３’末端の間に２つのミスマッチが生じた。典型的には、鋳型との３’ミスマッチが存在する場合、ＤＮＡのプライム化効率が低下する。驚くべきことに、図２４Ａ～２４Ｂで示されるように、４ｂｐ挿入配列（元の６ｂｐ配列から２ｂｐミスマッチを差し引いたもの）の挿入は、完全に相補的な６ｂｐ挿入の挿入よりも効率的であった。２ｂｐミスマッチを伴う４ｂｐ挿入は５９．５９％の相対挿入効率を有し（図２４Ｂ）、ミスマッチを伴わない６ｂｐ挿入は３７．１３％の相対挿入効率を有した（図２４Ａ）。

【0219】

実施例１５．ＰＲＩＮＳのＤＮＡ修復経路及びプライム編集効率
ｓｐｒｉｎｇＲＮＡを用いたＰＥ０のＰＲＩＮＳ編集効率及びｐｅｇＲＮＡを用いたＰＥ０のプライム編集効率は、以下のＤＮＡ修復遺伝子が部分的に欠損している細胞系で評価された：ＰＲＫＤＣ（ＤＮＡＰＫとしても知られる）、ＬＩＧ４、ＴＰ５３ＢＰ１、ＰＡＲＰ１、ＰＯＬＱ、ＬＩＧ３、及びＡＴＭ。細胞はまた、ＤＮＡＰＫ阻害剤の存在下又は非存在下で培養した。

【0220】

結果は図２５に示され、また、これらの遺伝子の欠失又はＰＲＫＤＣタンパク質の阻害によりＰＲＩＮＳ効率が低下したため、ＰＲＩＮＳ編集はＰＲＫＤＣ及びＴＰ５３ＢＰ１などのＮＨＥＪ経路酵素に依存していることを示す。図２５はまた、ＰＲＫＤＣ、ＬＩＧ４、若しくはＴＰ５３ＢＰ１の阻害又は欠失がより高い挿入効率をもたらしたため、ＰＥ０及びｐｅｇＲＮＡによるプライム編集がＮＨＥＪ酵素と逆相関を有したことを示す。

【0221】

実施例１６．ＰＲＩＮＳ編集のためのＩＩ－Ｂ型Ｃａｓ９融合物の評価
ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質、配列決定された腸メタゲノムＭＨ０２４５＿ＧＬ０１６１８３０．１由来のＣａｓ９（ＭＨＣａｓ９）を含む融合タンパク質は、粘着末端（「オーバーハング」）及びＭＭＬＶ逆転写酵素を生成する。ＳｐｒｉｎｇＲＮＡは、ＭＨＣａｓ９に結合し、実施例１０に記載されたようにＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とする６ヌクレオチド挿入配列を含むように設計された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、ゲノムＤＮＡを抽出し、Ａｍｐｌｉｃｏｎ－Ｓｅｑを使用して標的挿入を検出した。

【0222】

図２６Ａの結果は、ＭＨＣａｓ９－ＲＴ融合タンパク質が、標的遺伝子座でＰＲＩＮＳ媒介挿入をうまく実施したことを示す。最も効率的な挿入物は０．０７２％の挿入頻度であった。図２６Ｂは、ＭＨＣａｓ９－ＲＴによる最も頻繁な１０個の編集イベントを示している。ＲＴは挿入配列の挿入を媒介するだけでなく、最も頻繁な３つの編集イベントによって示されるように、ＭＨＣａｓ９によって生成されたオーバーハング配列（ＣＣＣ）も伸長した。

【0223】

実施例１７．ＭＨＣａｓ９－ＲＴ融合物を用いた標的化挿入及び欠失
前の実施例で説明したＣａｓ９－ＲＴ融合タンパク質（「ＰＥ０」）を、ｐｅｇＲＮＡを使用して標的化された挿入及び欠失を行う能力について評価した。Ｃａｓ９ニッカーゼ－ＲＴ融合物及びｐｅｇＲＮＡを利用するプライム編集とは対照的に、ｐｅｇＲＮＡを用いたＰＥ０は、二本鎖ＤＮＡ切断を導入するため、プライム編集に関与しない二本鎖ＤＮＡ切断修復経路によって修復される。ＰｅｇＲＮＡ及びプライム編集は、実施例２及びＡｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７６：１４９－１５７（２０１９）に記載されている。

【0224】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＭＨＣａｓ９－ＲＴを発現するプラスミド及びＡＡＶＳ１部位を標的とするｐｅｇＲＮＡと、前の実施例に記載されるようにトランスフェクトされた。２つの異なるｐｅｇＲＮＡ構築物を試験した：１）１ヌクレオチドの欠失を提供する構築物；及び２）ＰＡＭ－３部位でＡからＧへの置換を生成するための構築物。トランスフェクション後、ゲノムＤＮＡは、前の実施例に記載されているように、ＮＧＳによって抽出及び処理された。

【0225】

図２７Ａ（ＡからＧへの置換）及び２７Ｂ（１ヌクレオチドの欠失）の結果は、ｐｅｇＲＮＡを用いたＰＥ０が置換／挿入及び欠失を誘導できることを示している。図２７Ａ及び２７Ｂの棒グラフの濃い灰色の部分は、所望の突然変異を表し、薄い灰色の部分は望ましくない突然変異を表す。実験は、ＤＮＡＰＫ阻害剤（ＤＮＡＰＫｉ）の存在下でも実施され、望ましくない突然変異と比較して所望の突然変異のパーセンテージが増加した。

【0226】

配列
様々なポリヌクレオチド及びポリペプチドの配列を、本明細書で提供する。

【0227】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列（配列番号１）

【化2】

【0228】

Ｃａｓ１２ヌクレアーゼ（ＬｂＣａｓ１２ａ）のアミノ酸配列（配列番号２９）

【化3】

【0229】

Ｃａｓ１４ヌクレアーゼ（Ｃａｓ１４ａ１）のアミノ酸配列（配列番号３０）

【化4】

【0230】

ＭＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸配列（配列番号２）

【化5】

【0231】

Ｒ２逆転写酵素のアミノ酸配列（配列番号３）

【化6】

【0232】

Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号４）

【化7】

【0233】

ＤＮＡポリメラーゼデルタのアミノ酸配列（配列番号５）

【化8】

【0234】

Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号６）

【化9】

【0235】

Ｔ４ ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列（配列番号７）

【化10】

【0236】

ＭＥＰＣ２のアミノ酸配列（配列番号８）

【化11】

【0237】

Ｒｅｐタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）

【化12】

【0238】

Ｔ４遺伝子３２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０）

【化13】

【0239】

ＦＵＢＰのアミノ酸配列（配列番号１１）

【化14】

【0240】

核局在化配列（配列番号１２～１４）
ＭＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１２）
ＳＧＧＳＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１３）
ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１４）

【0241】

リンカー配列（配列番号１５～１６）
ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号１５）
ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧ（配列番号１６）

【0242】

ＲＥＰ＿Ｙ１５６Ｆ（１－１９７）－Ｃａｓ９ Ｐ２Ａ ＥＧＦＰのアミノ酸配列（配列番号１７）

【化15】

【0243】

Ｃａｓ９－ＭＭＬＶ ＲＴのアミノ酸配列（配列番号１８）

【化16】

【0244】

ＭＣＰ２－ＲＴのアミノ酸配列（配列番号１９）

【化17】

【0245】

Ｃａｓ９－Ｐｈｉ２９のアミノ酸配列（配列番号２０）

【化18】

【0246】

Ｃａｓ９－ＰｏｌＤのアミノ酸配列（配列番号２１）

【化19】

【0247】

Ｃａｓ９－Ｒ２ ＲＴのアミノ酸配列（配列番号２２）

【化20】

【0248】

Ｃａｓ９－Ｔ４ ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列（配列番号２３）

【化21】

【0249】

Ｃａｓ９－ＭＣＰ２ ＭＭＬＶ ＲＴのアミノ酸配列（配列番号２４）

【化22】

【0250】

Ｃａｓ９－Ｔ４ ＤＮＡ Ｐｏｌのアミノ酸配列（配列番号２５）

【化23】

【0251】

Ｔ４ｇｐ３２－ＦＵＢＰのアミノ酸配列（配列番号２６）

【化24】

【0252】

ＡＡＶＳ １２３ ＡＡＧＡＴＧ ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列（配列番号２７）

【化25】

【0253】

ＡＡＶＳ １２３ ＡＡＧＡＴＧ ２０伸長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列（配列番号２８）

【化26】

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図21-4】

【図22】

【図23-1】

【図23-2】

【図24-1】

【図24-2】

【図25】

【図26】

【図27】

【国際調査報告】