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特表2023-522963炎症性疾患を治療するためのパルミトイル化／脱パルミトイル化サイクルの標的化
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-01
(54)【発明の名称】炎症性疾患を治療するためのパルミトイル化／脱パルミトイル化サイクルの標的化
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20230525BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20230525BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230525BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20230525BHJP
A61K 31/20 20060101ALI20230525BHJP
A61K 31/336 20060101ALI20230525BHJP
A61K 31/7072 20060101ALI20230525BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230525BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230525BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230525BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230525BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230525BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230525BHJP
A61P 19/06 20060101ALI20230525BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230525BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230525BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230525BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230525BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61K31/7105
A61K48/00
A61K31/496
A61K31/20
A61K31/336
A61K31/7072
A61P1/04
A61P25/00
A61P19/02
A61P29/00 101
A61P37/06
A61P3/10
A61P19/06
A61P11/06
A61P17/06
A61P29/00
C12N15/09 100
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022564164
(86)(22)【出願日】2021-04-23
(85)【翻訳文提出日】2022-12-21
(86)【国際出願番号】 US2021028811
(87)【国際公開番号】W WO2021216980
(87)【国際公開日】2021-10-28
(31)【優先権主張番号】63/014,735
(32)【優先日】2020-04-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508298488
【氏名又は名称】コーネル ユニヴァーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】ヘニング・リン
(72)【発明者】
【氏名】ミンミン・チャン
(72)【発明者】
【氏名】タオ・ユー
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB11
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA02
4C086CA04
4C086EA16
4C086EA17
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA01
4C086ZA62
4C086ZA68
4C086ZA89
4C086ZA96
4C086ZB08
4C086ZB11
4C086ZB15
4C086ZC31
4C086ZC35
4C206AA01
4C206AA02
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4C206ZA68
4C206ZA89
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4C206ZB08
4C206ZB11
4C206ZB15
4C206ZC31
4C206ZC35
(57)【要約】
本開示は、炎症性障害を治療するための方法であって、該障害を患う患者に炎症誘発性転写因子のＳ－パルミトイル化を制御する酵素の有効量の阻害剤を投与することを含む方法を対象とする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
炎症性障害を治療するための方法であって、該障害を患う患者に炎症誘発性転写因子のＳ－パルミトイル化を制御する酵素の有効量の阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項2】
酵素は、ジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼ７（ＺＤＨＨＣ７）またはジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼ３（ＺＤＨＨＣ３）である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
酵素はリゾホスホリパーゼ２（ＬＹＰＬＡ２）である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
酵素の阻害剤は核酸阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
核酸阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、人工マイクロＲＮＡ、およびリボザイムからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
酵素の阻害剤はゲノム編集システムである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
ゲノム編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステム、ＴＡＬＥＮシステム、ＺＦＮシステム、および相同組換えからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする第１の核酸、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第２の核酸を患者に導入することを含み、前記ｇＲＮＡは、酵素をコードする遺伝子に特異的である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
酵素の阻害剤は小分子阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
酵素はＬＹＰＬＡ２であり、阻害剤は、以下の化学式：【化1】
【請求項11】
酵素はジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼであり、阻害剤は、２－ブロモパルミチン酸、セルレニン、またはツニカマイシンから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
障害は自己免疫障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
自己免疫障害は、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、ループス、移植片対宿主病、１型糖尿病、痛風、喘息、および乾癬からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
障害は内毒素性ショックである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本願は、２０２０年４月２４日に出願された米国仮出願第６３／０１４，７３５号からの優先権の利益を主張するものであり、その内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
本願は、２０２０年４月２４日に出願された米国仮出願第６３／０１４，７３５号からの優先権の利益を主張するものであり、その内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所によって付与された認可番号Ｒ３５ＧＭ１３１８０８およびＲ０１ＧＭ１２１５４０の下で政府の支援を受けて為されたものである。政府は本発明にある特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって付与された認可番号Ｒ３５ＧＭ１３１８０８およびＲ０１ＧＭ１２１５４０の下で政府の支援を受けて為されたものである。政府は本発明にある特定の権利を有する。
【0003】
参照による配列表の組み入れ
２０２１年４月２０日に作成され、３８３４２ＷＯ＿９３４６＿０２＿ＰＣ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと命名され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された、５２ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表を、参照によって本明細書に組み入れる。
２０２１年４月２０日に作成され、３８３４２ＷＯ＿９３４６＿０２＿ＰＣ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと命名され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された、５２ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表を、参照によって本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【0004】
システインパルミトイル化（Ｓ－パルミトイル化）は、タンパク質の膜結合およびタンパク質－タンパク質相互作用を制御する、重要なタンパク質翻訳後修飾（ＰＴＭ）である。Ｓ－パルミトイル化は、保存されたＡｓｐ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｃｙｓ配列モチーフからＤＨＨＣとして知られる２３種のパルミトイルトランスフェラーゼによって触媒され、アシル－タンパク質チオエステラーゼ（ＡＰＴ１、ＡＰＴ２、およびＡＢＨＤファミリーメンバー）によって除去される。数千のヒトタンパク質がＳ－パルミトイル化を経ることが知られているが、この修飾がどのように制御されて特定の生物学的機能をモジュレートするのかはあまり理解されていない。
【0005】
潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの慢性炎症性疾患の治療の選択肢は限られている。ＩＢＤの病因論はわかっていないが、ＩＢＤと免疫制御異常の関連は広く研究されてきた。ＩＢＤ患者には炎症誘発性細胞が数多く存在することがその進行に寄与しており、炎症誘発性細胞の分化を阻止することが疾患の治療に有用であり得るはずである。
【0006】
強力な免疫抑制性サイトカインとして、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）は、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からの制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の分化を誘導することによって抗炎症エフェクター／記憶免疫細胞の成熟および機能を抑制する。しかし、インターロイキン－６（ＩＬ－６）と合わさると、ＴＧＦβは、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からの炎症誘発性Ｔヘルパー１７（Ｔｈ１７）の分化を促進する。Ｔｈ１７細胞は、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体ガンマｔ（ＲＯＲ－γｔ、遺伝子名ＲＯＲＣ）およびインターロイキン－１７（ＩＬ－１７、遺伝子名ＩＬ１７Ａ）の発現によって特徴付けられる。多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、および関節リウマチ（ＲＡ）などの多くの免疫関連疾患は、アンバランスなＴｒｅｇ／Ｔｈ１７細胞比を有する慢性の炎症過程であり、そのことから、Ｔ細胞の分化が免疫疾患に鍵となる役割を果たすことが示唆される。ＴＧＦβシグナル伝達経路はＴ細胞の分化に重要な役割を果たすことから、ＴＧＦβの相反する機能がどのように制御されているのかを理解することは、免疫関連疾患を治療するのに有用であり得るはずである。
【0007】
ＴＨ１７細胞は、インターロイキン－１７（ＩＬ－１７、ＩＬ１７Ａによってコードされる）およびレチノイン酸受容体関連オーファン受容体ガンマｔ（ＲＯＲγｔ、ＲＯＲＣによってコードされる）の発現によって特徴付けられる、炎症誘発性Ｔ細胞のサブグループである。ＴＨ１７細胞の分化の加速は、ＩＢＤにおいて重要な病原性役割を有しており、ＴＨ１７細胞が数多く存在することは、ＩＢＤのマウスモデルおよび患者において疾患活動性と相関している。ＩＢＤ患者の血清はサイトカインに富んでおり、それによってナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からＴＨ１７への分化が可能となる。特定のサイトカインの刺激の下で、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３は、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）によってリン酸化される。ｐ－ＳＴＡＴ３は、鍵となる転写因子として、下流の標的遺伝子（ＲＯＲＣおよびＩＬ１７Ａ）の発現およびＴＨ１７細胞の分化を促進する。ＴＨ１７の分化にＳＴＡＴ３の役割が重要であることから、ＳＴＡＴ３がどのように制御されているのかを理解することは、ＴＨ１７細胞を制御する新たな方法を提供し得るはずである。
【0008】
ＴＧＦβシグナルの細胞内導入は、細胞膜上でＴＧＦβがＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）に結合することによって開始される。続いて、ＴＧＦβＲＩＩは、ＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）をリン酸化し、活性化する。ＴＧＦβに対する一次応答体として、マザーズアゲンストデカペンタプレジックホモログ（ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ ｈｏｍｏｌｏｇ）２および３（ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３）は、ＴＧＦβ受容体制御型ＳＭＡＤ（Ｒ－ＳＭＡＤ）と高度に相同である。それらは、ＴＧＦβＲによって動員され、カルボキシ末端（Ｃ末端）上の２つのセリン残基（ＳＭＡＤ２ではＳｅｒ４６５／Ｓｅｒ４６７、ＳＭＡＤ３ではＳｅｒ４２３／Ｓｅｒ４２５）でリン酸化される。ＳＭＡＤ４は、唯一知られているヒトＣｏ－ＳＭＡＤとして、Ｒ－ＳＭＡＤと組んで転写共制御因子を複合体へ動員する。ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３は、同じ上流シグナル伝達経路および多くの下流のパートナーを共有しているが、それらはＴ細胞の分化では相反する機能を有し、ＳＭＡＤ２はＴｈ１７を促進し、ＳＭＡＤ３はＴｒｅｇを促進する。以前の研究から、ＳＭＡＤ２のＳｅｒ２５５が細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）によってリン酸化されるとＳＴＡＴ３とのその相互作用が促進され、次いでＳＭＡＤ２－ＳＴＡＴ３複合体が核に移行してＴｈ１７細胞の分化を促進すること、一方、カルボキシ末端がリン酸化されていないＳＭＡＤ３はＳＴＡＴ３と相互作用してＴｈ１７細胞の分化を抑圧することが示唆されている。この知見は、ＳＭＡＤ２のＳｅｒ２５５リン酸化がＴｈ１７－Ｔｒｅｇのバランスを取っている可能性があることを示唆しているが、このリン酸化過程がどのように制御されているかはほとんどわかっていない。この制御機構を理解すれば、Ｔｈ１７－Ｔｒｅｇ比を制御し、免疫関連疾患を治療する新たな治療戦略を提供することができる。
【0009】
マザーズアゲンストデカペンタプレジックホモログ２および３（ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３）は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）に応答する同じ一次シグナル経路を共有しているが、それらはＴ細胞の分化に関して相反する作用を有しており、ＳＭＡＤ２は炎症誘発性Ｔヘルパー１７（Ｔｈ１７）を促進し、一方ＳＭＡＤ３は、抗炎症制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を促進する。それらの相反するＴ細胞分化機能がどのように実現され、制御されているのかは未だに理解されておらず、それを理解することは炎症性疾患の治療に役立つ可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本開示のある態様は、炎症性障害を治療するための方法であって、該障害を患う患者に炎症誘発性転写因子のＳ－パルミトイル化を制御する酵素の有効量の阻害剤を投与することを含む方法を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
幾つかの実施形態では、酵素は、ジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼ７（ＺＤＨＨＣ７）またはジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼ３（ＺＤＨＨＣ３）である。
【0012】
幾つかの実施形態では、酵素はリゾホスホリパーゼ２（ＬＹＰＬＡ２）である。
【0013】
幾つかの実施形態では、酵素の阻害剤は核酸阻害剤である。
【0014】
幾つかの実施形態では、核酸阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、人工マイクロＲＮＡ、およびリボザイムからなる群から選択される。
【0015】
幾つかの実施形態では、酵素の阻害剤は、ゲノム編集システムである。幾つかの実施形態では、ゲノム編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステム、ＴＡＬＥＮシステム、ＺＦＮシステム、および相同組換えからなる群から選択される。
【0016】
幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする第１の核酸、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第２の核酸を患者に導入することを含み、前記ｇＲＮＡは、酵素をコードする遺伝子に特異的である。
【0017】
幾つかの実施形態では、酵素の阻害剤は小分子阻害剤である。
【0018】
幾つかの実施形態では、酵素はＬＹＰＬＡ２であり、阻害剤は、以下の化学式：
を有するＭＬ３４９である。
【化1】
【0019】
幾つかの実施形態では、酵素はジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼであり、阻害剤は、２－ブロモパルミチン酸、セルレニン、またはツニカマイシンから選択される。
【0020】
幾つかの実施形態では、障害は自己免疫障害である。幾つかの実施形態では、自己免疫障害は、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、ループス、移植片対宿主病、１型糖尿病、痛風、喘息、および乾癬からなる群から選択される。
【0021】
幾つかの実施形態では、障害は、内毒素性ショック、例えばＬＰＳに誘導される内毒素性ショックである。
【0022】
本特許または特許出願は、少なくとも１枚のカラー図面を含む。カラー図面（１枚または複数）を有する本特許または特許出願公開の複写は、申請および必要な料金の支払いによって特許庁より提供される。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1-1】図１Ａ～１Ｄは、ＤＨＨＣ７（ＺＤＨＨＣ７と同義）に誘導されるパルミトイル化がＳＴＡＴ３の膜移行を促進することを示す図である。（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ－ＳＴＡＴ３およびＨＡ－ＤＨＨＣ７をトランスフェクトした。ヒドロキシルアミン（ＮＨ２ＯＨ）で処理した場合または処理していない場合のＳＴＡＴ３のパルミトイル化レベルを、Ａｌｋ１４標識を使用して検出した。（Ｂ）左、野生型およびＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞における内在性ＳＴＡＴ３およびＪＡＫ２の細胞内局在を、共焦点画像分析を使用して分析した。スケールバー、５０μｍ。右、ピアソン相関係数を使用したＳＴＡＴ３とＪＡＫ２の共局在の定量化。（Ｃ）左、ＤＨＨＣ７を異所的に発現するＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ－ＳＴＡＴ３およびＥＧＦＰ－ＳＴＡＴ３（Ｃ１０８Ｓ）の細胞内局在。スケールバー、１００μｍ。右、ＳＴＡＴ３が核から形質膜および内膜に移行したＤＨＨＣ７陽性細胞のパーセンテージ。（Ｄ）野生型およびＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ－ＳＴＡＴ３をトランスフェクトし、Ａｌｋ１４で標識した。細胞成分分画を実施し、ゲルに使用する野生型およびノックアウト細胞分画に確実に等量のＳＴＡＴ３が存在するように、ＳＴＡＴ３のタンパク質レベルを調整した。膜（ｍｅｍ．）、細胞質（ｃｙｔｏ．）、および核（ｎｕｃ．）分画における免疫沈降ＳＴＡＴ３のパルミトイル化レベルをゲル内蛍光によって可視化した。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図2-1】図２Ａ～２Ｈは、ＡＰＴ２がＳＴＡＴ３の脱パルミトイル化酵素であり、パルミトイル化／脱パルミトイル化がｐ－ＳＴＡＴ３の核局在を促進することを示す図である。（Ａ）Ｃ１０８は、ＳＴＡＴ３の主要なパルミトイル化部位である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＨＡ－ＤＨＨＣ７およびＦｌａｇ－ＳＴＡＴ３（野生型または変異体）をトランスフェクトし、Ａｌｋ１４で標識した。ＳＴＡＴ３をプルダウンし、Ａｌｋ１４標識およびウエスタンブロット分析に供した。（Ｂ）左、ＤＨＨＣ７またはＤＨＨＳ７を再導入したＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞成分分画におけるＳＴＡＴ３およびｐ－ＳＴＡＴ３の野生型またはＣ１０８Ｓ変異体の分布。右、相対的なｐ－ＳＴＡＴ３レベルの定量化。（Ｃ）ＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞に様々なＥＧＦＰ－ＳＴＡＴ３構築物およびＨＡタグ付きＤＨＨＣ７をトランスフェクトした後、共焦点画像分析を使用してＳＴＡＴ３およびｐ－ＳＴＡＴ３の細胞内局在を分析した。スケールバー、５０μｍ。（Ｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、野生型ＡＰＴ２を過剰発現させると、Ａｌｋ１４標識で判定したときにＦｌａｇ－ＳＴＡＴ３のパルミトイル化レベルが減少したが、Ｃ２ＳまたはＳ１２２Ａ変異体を過剰発現させても減少しなかった。（Ｅ）ＡＰＴ２は、野生型ＳＴＡＴ３をＹ７０５Ｆ変異体より優先的に脱パルミトイル化する。ＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示したプラスミドをトランスフェクトし、Ａｌｋ１４で標識した。ＳＴＡＴ３のパルミトイル化をゲル内蛍光で判定し（左）、定量化した（右）。（Ｆ）ＡＰＴ２を阻害またはノックダウンすると、Ｆｌａｇ－ＳＴＡＴ３のパルミトイル化が増大する。ＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＨＡ－ＤＨＨＣ７およびＦｌａｇ－ＳＴＡＴ３を再導入し、ＬＹＰＬＡ２ ｓｉＲＮＡまたは２０μＭのＭＬ３４９で３６時間処理した後に、Ａｌｋ１４標識およびゲル内蛍光検出を行った。（Ｇ）左、ＡＰＴ２ノックダウンＨＥＫ２９３Ｔ細胞の異なる細胞成分分画におけるＳＴＡＴ３およびｐ－ＳＴＡＴ３の分布を。右、これらの分画における相対的なＳＴＡＴ３およびｐ－ＳＴＡＴ３レベルの定量化。（Ｈ）左、１μＭのＪＡＫ２阻害剤フェドラチニブで処理した場合または処理していない場合の、ＤＨＨＣ７過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞成分分画におけるＳＴＡＴ３およびｐ－ＳＴＡＴ３の分布。右、これらの分画における相対的なＳＴＡＴ３レベルの定量化。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図3】図３Ａ～３Ｅは、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルがＴＨ１７細胞の分化を促進することを示す図である。（Ａ）ＤＨＨＣ７は、マウス脾細胞において野生型ＳＴＡＴ３のリン酸化を促進したが、Ｃ１０８Ｓ変異体のリン酸化は促進しなかった。左、ＳＴＡＴ３およびｐ－ＳＴＡＴ３のブロット；右、相対的なｐ－ＳＴＡＴ３レベルの定量化。（Ｂ）Ａでの脾細胞サンプルにおけるＴＨ１７細胞の分化をフローサイトメトリーによって定量化した。（Ｃ）ＡＰＴ２を阻害すると、ＴＨ１７細胞の分化は用量依存的に減少する。マウス脾細胞をサイトカインカクテル（３ｎｇ ｍｌ－１ ＴＧＦ－β、４０ｎｇ ｍｌ－１ ＩＬ－６、３０ｎｇ ｍｌ－１ ＩＬ－２３、２０ｎｇ ｍｌ－１ ＴＮＦ、および１０ｎｇ ｍｌ－１ ＩＬ－１β）および様々な濃度のＭＬ３４９で４日間処理し、次いで収集し、フローサイトメトリーによって分析して、ＣＤ４およびＩＬ－１７陽性細胞を検出した。（Ｄ）脾細胞においてＤＨＨＣ７をノックアウトすると、ＴＨ１７細胞の分化が阻害される。野生型およびＤＨＨＣ７ノックアウトマウス脾細胞をサイトカインカクテルで４日間処理して分化を開始させ、次いで細胞を収集し、フローサイトメトリーによって分析してＣＤ４およびＩＬ－１７陽性細胞を検出した。（Ｅ）左、野生型およびＤＨＨＣ７ノックアウト脾細胞のＳＴＡＴ３およびｐ－ＳＴＡＴ３のブロット。右、相対的なｐ－ＳＴＡＴ３レベルの定量化。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図4-1】図４Ａ～４Ｉは、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルが大腸炎を悪化させることを示す図である。（Ａ）、（Ｂ）健常な参加者（Ｃｔｒｌ）２６人、クローン病患者２４人（ＣＤ；寛解期（ｒｅｍ．）７人および活動期（ａｃｔ．）１７人）、および潰瘍性大腸炎患者１０人（ＵＣ；寛解期１人および活動期９人）からヒトＰＢＭＣを抽出した。ｑＰＣＲを使用してＬＹＰＬＡ２およびＺＤＨＨＣ７ ｍＲＮＡレベルを分析した。相対的なｐ－ＳＴＡＴ３レベルをウエスタンブロットによって定量化した。ｃ、ｄ、ＩＬ１７Ａ（Ｃ）またはｐ－ＳＴＡＴ３（Ｄ）とＩＢＤ患者３４人における、示した遺伝子のｍＲＮＡレベルの相関関係。（Ｅ）、（Ｆ）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、自由に摂取する飲料水中２．５％ＤＳＳで処理し、ＤＳＳ処理を開始した日にＭＬ３４９を１日１回腹腔内注射した。体重の変化（Ｅ）および脾臓におけるＴＨ１７細胞のレベル（Ｆ）を評価した。（Ｇ）、（Ｈ）、野生型およびＤＨＨＣ７ノックアウトマウスを、自由に摂取する飲料水中２．５％のＤＳＳで処理した。体重の変化（Ｇ）および脾臓におけるＴＨ１７細胞のレベル（Ｈ）を評価した。（Ｉ）、パルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルによるＳＴＡＴ３の制御のモデル。ＤＨＨＣ７によってＳＴＡＴ３がパルミトイル化されると、ＳＴＡＴ３の膜動員およびリン酸化が促進される。ＡＰＴ２は、ＳＴＡＴ３よりｐ－ＳＴＡＴ３を選択的に脱パルミトイル化することによってｐ－ＳＴＡＴ３の核移行を促進する。パルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルは、ＳＴＡＴ３の膜局在およびリン酸化、ならびにｐ－ＳＴＡＴ３の核移行を駆動する。このサイクルの方向は、ＡＰＴ２がＳＴＡＴ３よりｐ－ＳＴＡＴ３を優先することによって確保される。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表される。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図5】図５Ａ～５Ｇは、ＳＭＡＤ２がＤＨＨＣ７によってパルミトイル化されることを示す図である。（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｆｌａｇ－ＳＭＡＤ２および示したＨＡ－ＤＨＨＣプラスミドをトランスフェクトし、Ａｌｋ１４代謝標識およびゲル内蛍光を使用してパルミトイル化レベルを判定した。使用したすべてのＤＨＨＣ遺伝子はマウス由来であり、ＤＨＨＣ１０／Ｚｄｈｈｃ１１、ＤＨＨＣ１１／Ｚｄｈｈｃ２３、ＤＨＨＣ１３／Ｚｄｈｈｃ２４、およびＤＨＨＣ２２／Ｚｄｈｈｃ１３を除いてタンパク質番号は遺伝子番号と一致している。（Ｂ）Ａにおける相対的なパルミトイル化レベルの定量化。パルミトイル化レベルは、ＳＭＡＤ２のタンパク質レベルによって正規化し、対照（Ａｌｋ１４を有するが、ＤＨＨＣ過剰発現を有しない）のレベルを１に設定した。（Ｃ）、（Ｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にそれぞれＦｌａｇ－ＳＭＡＤ３およびＦｌａｇ－ＳＭＡＤ４、ならびに示したＨＡ－ＤＨＨＣプラスミドをトランスフェクトした。Ａｌｋ１４標識およびゲル内蛍光を使用してパルミトイル化レベルを検出した。（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＨＡ－ＤＨＨＣ１－２３プラスミドをトランスフェクトし、ＮＨ２ＯＨ処理を有するＡＢＥアッセイによってパルミトイル化レベルを検出した。（Ｆ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にそれぞれＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２およびＦｌａｇ－ＳＭＡＤ３、ならびに示したＨＡ－ＤＨＨＣ７プラスミドをトランスフェクトした。Ａｌｋ１４標識および免疫ブロットを使用してパルミトイル化レベルを検出した。（Ｇ）ＤＨＨＣ７ ＷＴおよびノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳＭＡＤ２のパルミトイル化レベルを、ＡＢＥを使用して検出した。定量化データは、平均±ＳＥＭとして表す。アスタリスク（＊）は有意差（＊＊Ｐ＜０．０１）を示す。
【図6】図６Ａ～６Ｆは、Ｃｙｓ４１およびＣｙｓ８１がパルミトイル化されるとＳＭＡＤ２の膜動員が促進されることを示す図である。（Ａ）、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＨＡ－ＤＨＨＣ７および様々なＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２システイン変異体をトランスフェクトし、Ａｌｋ１４で標識した。免疫沈降ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化レベルをゲル内蛍光で可視化した。（Ｃ）ＳＭＡＤ２ Ｃ４１／８１Ｓ変異体は、ＤＨＨＣ７によってパルミトイル化することができなかった。ＤＨＨＣ７ ＷＴおよびＫＯ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２ Ｃ４１／８１Ｓ変異体プラスミドをトランスフェクトし、Ａｌｋ１４で処理した。免疫沈降ＳＭＡＤ２ Ｃ４１／８１ＳのＳ－パルミトイル化レベルをゲル内蛍光によって可視化した。（Ｄ）ＤＨＨＣ７を異所的に発現するＤＨＨＣ７ ＫＯ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳＭＡＤ２－ＷＴおよびＣ４１／８１Ｓ変異体の細胞内局在を示す共焦点画像分析。スケールバー、５０μｍ。（Ｅ）ＳＭＡＤ２ Ｃ４１／８１Ｓ変異によってＳＭＡＤ２の細胞質局在が減少し、核局在が増大する。ＤＨＨＣ７ ＫＯ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＨＡ－ＤＨＨＣ７および示したＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２構築物をトランスフェクトし、細胞成分分画を実施した。次いで等量の核および膜分画をウエスタンブロットによって分析した（左）。相対的なＳＭＡＤ２レベルを定量化した（右）。（Ｆ）ＷＴまたは不活性変異体ＤＨＨＣ７を異所的に発現するＤＨＨＣ７ ＫＯ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の様々な細胞成分分画におけるＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化。この細胞にＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２をトランスフェクトし、Ａｌｋ１４で標識した。細胞分画を実施し、ＳＭＡＤ２のタンパク質レベルをＣＢＢによって再調整して、ＷＴおよび変異体細胞分画中のＳＭＡＤ２が確実に等しくゲル分析にロードされるようにした。膜（Ｍｅｍ）、細胞質（Ｃｙｔｏ）、および核（Ｎｕｃ）分画における免疫沈降ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化レベルをゲル内蛍光によって可視化した。定量化データは、平均±ＳＥＭとして表す。アスタリスク（＊）は有意差を示す（＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図7】図７Ａ～７Ｇは、ＡＰＴ２がＳＭＡＤ２の脱パルミトイル化酵素であり、ＳＭＡＤ２のＣ末端リン酸化がＳ－パルミトイル化とは無関係であることを示す図である。（Ａ）ＨＡタグ付きマウスＤＨＨＣ１－２３を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２（ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｃ２））のＣ末端リン酸化（Ｓｅｒ４６５／Ｓｅｒ４６７）レベル。ＳＭＡＤ２をＦｌａｇビーズでプルダウンし、ウエスタンブロット分析に供した。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＨＡタグ付きＤＨＨＣ７およびＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２ ＷＴおよびＣ４１／８１Ｓ変異体プラスミドをトランスフェクトし、Ａｌｋ１４で処理した。免疫沈降ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化レベルをゲル内蛍光によって可視化し、ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｃ２）レベルをウエスタンブロット分析によって検出した。（Ｃ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＨＡタグ付きＤＨＨＣ７および示した通りのＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２プラスミドをトランスフェクトし、ＴＧＦβで処理した。ＳＭＡＤ２をＦｌａｇビーズでプルダウンし、ウエスタンブロット分析に供した。（Ｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＨＡタグ付きＤＨＨＣ７および示した通りのＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２プラスミドをトランスフェクトし、示した通りの１０μＭのＡＰＴ阻害剤で２４時間処理した。免疫沈降ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化レベルをゲル内蛍光によって可視化した。（Ｅ）ＷＴ ＡＰＴ２は、ＤＨＨＣ７によって導入されたＷＴ ＳＭＡＤ２へのＳ－パルミトイル化をアミノ酸４２５～４６７で切断した変異体へのＳ－パルミトイル化よりよく除去することができた。ＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示したプラスミドをトランスフェクトした。細胞をＡｌｋ１４で標識し、ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化をゲル内蛍光によって判定した。（Ｆ）ＷＴ ＡＰＴ２は、ＤＨＨＣ７によって導入されたＷＴ ＳＭＡＤ２へのＳ－パルミトイル化を除去することができ、Ｃ末端リン酸化変異体でも同様であった。ＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示したプラスミドをトランスフェクトした。この細胞をＡｌｋ１４で標識し、ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化をゲル内蛍光によって判定し、ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｃ２）レベルをウエスタンブロット分析によって検出した。（Ｇ）ＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示したプラスミドをトランスフェクトした。ＳＭＡＤ２をＦｌａｇビーズでプルダウンし、ウエスタンブロット分析に供した。
【図8】図８Ａ～８Ｅは、ＤＨＨＣ７がＳＭＡＤ２のリンカーリン酸化（ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３））および活性を促進することを示す図である。（Ａ）Ｆｌａｇ－ＳＭＡＤ２ ＷＴを過剰発現させると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＲＯＲＣ ｍＲＮＡレベルが増加したが、変異体を過剰発現させても増加しなかった。（Ｂ）ＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示したプラスミドをトランスフェクトした。ＳＭＡＤ２をＦｌａｇビーズでプルダウンし、ウエスタンブロット分析に供した。（Ｃ）ＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示したプラスミドをトランスフェクトした。細胞溶解物をウエスタンブロット分析に供した。（Ｄ）ＤＨＨＣ７ ＷＴおよびノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の様々な細胞成分分画におけるＳＭＡＤ２およびｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）の分布（左）。相対的なＳＭＡＤ２およびｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）レベルを定量化した（右）。（Ｅ）Ｆｌａｇタグ付きＳＭＡＤ２をＤＨＨＣ７ ＷＴおよびノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、共焦点画像分析を使用してＳＭＡＤ２およびｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）の細胞内局在を分析した（左）。相対的なｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）レベルを定量化した（右）。スケールバー、５０μｍ。これらの値は、平均±ＳＥＭとして表した。＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図9-1】図９Ａ～９Ｇは、ＤＨＨＣ７誘導Ｓ－パルミトイル化がＳＭＡＤ２のＳＭＡＤ４およびＳＴＡＴ３との相互作用を促進することを示す図である。（Ａ）、（Ｂ）Ｆｌａｇ－ＳＭＡＤ４は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、示したＤＨＨＣ７過剰発現と共発現させると、ＨＡ－ＳＭＡＤ２をプルダウンした。ＨＡ－ＳＭＡＤ２のＦｌａｇ－ＳＭＡＤ４との相互作用は、変異体ＤＨＨＣ７の過剰発現での方がＷＴと比較してはるかに弱かった。ＨＡ－ＳＭＡＤ２ Ｃ４１／８１Ｓ変異体のＦｌａｇ－ＳＭＡＤ４との相互作用の方がはるかに弱かった。（Ｃ）Ｆｌａｇ－ＳＴＡＴ３は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、示したＤＨＨＣ７と共発現させると、ＨＡ－ＳＭＡＤ２をプルダウンした。ＨＡ－ＳＭＡＤ２のＦｌａｇ－ＳＴＡＴ３との相互作用は、変異体ＤＨＨＣ７での方がＷＴ ＤＨＨＣ７よりもはるかに弱かった。Ｆｌａｇ－ＳＴＡＴ３のＨＡ－ＳＭＡＤ２ Ｃ４１／８１Ｓ変異体との相互作用は、ＨＡ－ＳＭＡＤ２ ＷＴとの相互作用よりもはるかに弱かった。（Ｄ）Ｆｌａｇ－ＳＭＡＤ２は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、示したＤＨＨＣ７と共発現させると、ＨＡ－ＳＴＡＴ３をプルダウンした。ＨＡ－ＳＴＡＴ３のＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２との相互作用は、変異体ＤＨＨＣ７を発現する細胞での方がＷＴ ＤＨＨＣ７よりもはるかに弱かった。ＨＡ－ＳＴＡＴ３のＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２ Ｃ４１／８１Ｓ変異体との相互作用は、Ｆｌａｇ－ＳＭＡＤ２ ＷＴとの相互作用よりもはるかに弱かった。（Ｅ）Ｆｌａｇ－ＳＭＡＤ２およびＨＡ－ＳＴＡＴ３の局在を、ＷＴおよびＤＨＨＣ７ ＫＯ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における共焦点画像分析を使用して分析した（左）。スケールバーは５０μｍであった。ＳＭＡＤ２とＳＴＡＴ３の共局在を、ピアソン相関係数を使用して定量化した（右）。（Ｆ）ＷＴおよび変異体Ｆｌａｇ－ＳＭＡＤ２は、ＤＨＨＣ７を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＨＡ－ＳＴＡＴ３をプルダウンした。Ｆｌａｇ－ＳＭＡＤ２ Ｓ２５５Ａ変異体のＨＡ－ＳＴＡＴ３との相互作用の方がはるかに弱かった。（Ｇ）Ｆｌａｇ－ＳＭＡＤ２ ＷＴとＨＡ－ＤＨＨＣ７ ＷＴを共過剰発現させると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＲＯＲＣ ｍＲＮＡレベルが増加したが、変異体を共発現させても増加しなかった。定量化データは、平均±ＳＥＭとして表す。アスタリスク（＊）は、有意差を示す（＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図10-1】図１０Ａ～１０Ｆは、ＳＭＤＡ２のパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルがＴｈ１７細胞の分化を促進することを示す図である。（Ａ）ＤＨＨＣ７は、マウス脾細胞におけるＳＭＡＤ２のリンカーリン酸化を促進する。ＳＭＡＤ２およびｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）のブロットを示し（左）、相対的なｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）レベルを定量化する（右）。ＤＨＨＣ７は、ＳＭＡＤ２ Ｃ４１／８１Ｓ変異体のリンカーリン酸化も促進したが、その程度ははるかに少なかった。（Ｂ）（Ａ）に使用したサンプルについてのＴｈ１７細胞の分化のフローサイトメトリーでの定量化。（Ｃ）ＡＰＴ２は、マウス脾細胞においてＳＭＡＤ２ ＷＴまたはＣ４１／８１Ｓ変異体のいずれのリンカーリン酸化にも有意な影響を及ぼさない。ＳＭＡＤ２およびｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）のブロットを示し（左）、相対的なｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）レベルを定量化する（右）。（Ｄ）（Ｃ）に使用したサンプルについてＴｈ１７細胞の分化のフローサイトメトリーでの定量化。（Ｅ）ＷＴおよびＺｄｈｈｃ７ノックアウトマウス脾細胞におけるＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２による内在性ＳＴＡＴ３のプルダウン。ＳＴＡＴ３のＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２との相互作用は、Ｚｄｈｈｃ７ノックアウト脾細胞での方がはるかに弱かった。示されたブロットを示し（左）、相対的なＳＴＡＴ３／ＳＭＡＤ２相互作用レベルを定量化する（右）。（Ｆ）ＷＴおよびＡＰＴ２ノックアウトマウス脾細胞におけるＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２による内在性ＳＴＡＴ３のプルダウン。ＳＴＡＴ３のＦｌａｇ－ＳＭＡＤ２との相互作用は、ＡＰＴ２ノックアウト脾細胞での方が弱かった。示されたブロットを示し（左）、相対的なＳＴＡＴ３－ＳＭＡＤ２相互作用レベルを定量化する（右）。定量化データは、平均±ＳＥＭとして表す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図11】図１１Ａ～１１Ｃは、ＭＳマウスモデルにおいてＳＭＡＤ２をＳ－パルミトイル化すると臨床スコアが加速されることを示す図である。ＷＴ、Ｚｄｈｈｃ７ノックアウト、およびＬｙｐｌａ２ノックアウトＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを開始時にＭＯＧ３５－５５および百日咳毒素で処理し、免疫化後２日目に第２の用量の百日咳毒素で処理した。体重の変化（Ａ）、臨床スコア（Ｂ）、および脾臓におけるＴｈ１７細胞レベル（Ｃ）が、示した通りに観察された。定量化データは、平均±ＳＥＭとして表す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図12】図１２Ａ～１２Ｄは、汎ＤＨＨＣ阻害剤である２－ＢＰが、インフラマソームを活性化するＬＰＳプライミング段階でのサイトカインｍＲＮＡの発現を減少させることを示す図である。骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を１００ｎｇ／ｍＬリポ多糖（ＬＰＳ）で処理した。これは、ＢＭＤＭを抗原刺激してインフラマソームを活性化することができる。パルミトイルトランスフェラーゼ（ＤＨＨＣ）のすべてのＤＨＨＣファミリーを阻害する小分子である２－ブロモパルミチン酸（２－ＢＰ）をＬＰＳと共に１０μＭまたは２５μＭで添加した。細胞をＬＰＳおよび２－ＢＰと共に６時間培養し、次いで幾つかの炎症誘発性サイトカイン：（Ａ）ＩＬ－１ベータ、（Ｂ）ＩＬ－６、（Ｃ）ＩＬ－１２ベータ、および（Ｄ）ＩＬ－１８のｍＲＮＡレベルを定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって測定した。２－ＢＰは、すべてのこれらのサイトカインのｍＲＮＡレベルを濃度依存的に減少させることができ、そのことからＤＨＨＣを阻害するとインフラマソームを活性化するプライミング段階を減少させることができることが示唆される。
【図13】２－ＢＰがＮＬＲＰ３に媒介されるインフラマソームの活性化に影響を及ぼすことを示す図である。腹膜マクロファージを最初にＤＭＥＭ培地（血清を有しない）中ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）で４時間抗原刺激し、次いで２－ＢＰ（２５μＭ）およびＡＴＰ（５ｍＭ）またはナイジェリシン（１０μＭ）を細胞培養物に添加し、１時間インキュベートした。ＡＴＰおよびナイジェリシンは、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化するのに汎用される２種の試薬である。次いで、培地に分泌されるＩＬ－１ベータのレベルを測定することによってＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化をモニタリングした。
【図14】図１４Ａ～１４Ｂは、ＤＨＨＣ７をノックアウトするとインフラマソームの活性化中に骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）でのＩＬ－１ｂおよびＩＬ－１８の分泌が減少することを示す図である。ＤＨＨＣ７ ＷＴおよびノックアウトＢＭＤＭをＤＥＭＥ培地中ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）で一晩抗原刺激した。翌日、この培地をＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＡＴＰ（５ｍＭ）を有するＤＭＥＭ、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびナイジェリシン（１０μＭ）を有するＤＭＥＭに変え、１時間インキュベートしてＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化した。次いで培地を収集して、ＥＬＩＳＡキットを使用して分泌された（Ａ）ＩＬ－１ベータおよび（Ｂ）ＩＬ－１８を測定した。その結果から、ＤＨＨＣ７をノックアウトするとＮＬＲＰ３インフラマソームの活性が有意に減少し得ることが示された。
【図15】ＡＰＴ２をノックアウトしてもインフラマソームの活性化中にＢＭＤＭでのＩＬ－１ｂの分泌にわずかな影響しか及ぼさないことを示す図である。ＡＰＴ２ ＷＴおよびノックアウトＢＭＤＭをＤＥＭＥ培地中ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）で４時間抗原刺激した。次いで、この培地をＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）およびＡＴＰ（５ｍＭ）を有するＤＭＥＭ、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびナイジェリシン（１０μＭ）を有するＤＭＥＭに変え、１時間インキュベートしてＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化した。次いで培地を収集し、ＥＬＩＳＡキットを使用して分泌されたＩＬ－１ベータを測定した。その結果から、ＡＰＴ２をノックアウトしてもＮＬＲＰ３インフラマソームの活性が減少し得るが、ＤＨＨＣ７のノックアウトと比較して少ないことが示された。
【図16】ＤＨＨＣ７をノックアウトするとマウスにおいてインフラマソームの活性化：ＬＰＳに誘導される内毒素性ショックが減少することを示す図である。成体（＞８週齢）のＢ６．１２９Ｐ２（ＦＶＢ）ＤＨＨＣ７ ＷＴまたはノックアウトマウスに滅菌ＰＢＳ緩衝液中ＬＰＳ（３５ｍｇ／ｋｇ）約１００μＬを腹腔内注射した。１２時間後に、マウスを安楽死させ、血清中のＩＬ－１ベータレベルを分析するために血液を収集した。ＤＨＨＣ７をノックアウトすると血清に分泌されたＩＬ－１ベータの量が有意に減少し、そのことからＤＨＨＣ７をノックアウトするとマウスにおけるインフラマソームの活性化が減少することが示唆された。
【図17】図１７Ａ～１７Ｂは、ループス腎炎マウスモデル：ＡＰＴ２阻害剤ＭＬ３４９がマウスの尿中のタンパク質濃度を減少させることを示す図である。（Ａ）尿中のタンパク質濃度（全データ点）、（Ｂ）尿中のタンパク質濃度（平均したもの、エラーバーを有する）。２５週齢のＮＺＢ／Ｗ Ｆ１雌マウスにビヒクル溶液（ＤＭＳＯ＋ＰＢＳ）または２５ｍｇ／ＫｇのＡＰＴ２阻害剤ＭＬ３４９のいずれかを週３回、ＩＰ注射によって８週間投与した。４週間処理した後に、尿を収集し、尿中のタンパク質濃度を測定することによるタンパク尿分析を通して、マウスをループス発症率について毎週評価した。このデータから、ＡＰＴ２阻害剤ＭＬ３４９は尿中のタンパク質濃度を減少させることができることが示された。
【発明を実施するための形態】
【0024】
本開示の発明者らは、幾つかの炎症誘発性転写因子がパルミトイル化／脱パルミトイル化サイクルを経ること、そのことが、それらの炎症誘発性作用に極めて重要であることを見出した。本発明者らはまた、炎症誘発性転写因子のパルミトイル化／脱パルミトイル化サイクルを中断することが炎症性障害の治療に有益であることを見出した。
【0025】
治療方法
幾つかの実施形態では、本方法は、炎症性障害を患う患者に１つまたは複数の炎症誘発性転写因子のＳ－パルミトイル化を制御する酵素の有効量の阻害剤を投与することを含む。
幾つかの実施形態では、本方法は、炎症性障害を患う患者に１つまたは複数の炎症誘発性転写因子のＳ－パルミトイル化を制御する酵素の有効量の阻害剤を投与することを含む。
【0026】
本明細書で使用される場合、「炎症性障害」という語句は、異常なまたは望ましくない炎症に関する障害、例えば、それらに関連するまたはそれらによって引き起こされる障害を指す。幾つかの実施形態では、炎症性障害は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、関節リウマチ、血管炎、肺疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および肺間質疾患（例えば、特発性肺線維症（ＩＰＦ））、乾癬、痛風、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息、鼻炎）、または内毒素性ショック（例えば、グラム陰性菌の血流感染からのもの、ＬＰＳに誘導される内毒素性ショック）から選択される。幾つかの実施形態では、炎症性障害は自己免疫障害である。幾つかの実施形態では、自己免疫障害は、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、ループス、移植片対宿主病、１型糖尿病、または乾癬から選択される。
【0027】
障害を「治療すること」とは、障害の発症を抑制するもしくは遅延させる、症状の発生もしくは頻度を抑制するもしくは低減させる、障害の進行を遅らせる、および／または障害の症状を改善することを意味する。
【0028】
本明細書で使用される場合、「炎症誘発性」という用語は、炎症を促進する作用を指す。炎症誘発性転写因子は、炎症誘発性分子、例えば、炎症誘発性サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）サイトカイン、例えば、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ベータ、ＩＬ－１７、またはＩＬ－１８）、または炎症誘発性転写因子、例えばＲＯＲ－γｔなどの転写を指示する転写因子であり得る。幾つかの実施形態では、炎症誘発性転写因子はシグナル伝達因子兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）である。幾つかの実施形態では、炎症誘発性転写因子はマザーズアゲンストデカペンタプレジックホモログ２（ＳＭＡＤ２）である。幾つかの実施形態では、ＳＴＡＴ３および／またはＳＭＡＤ２はＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ベータ、ＩＬ－１７、またはＩＬ－１８などの炎症誘発性サイトカインの転写を正に制御し、ＴＨ１７細胞の分化を加速させる。
【0029】
幾つかの実施形態では、炎症誘発性転写因子のＳ－パルミトイル化を制御する酵素は、ジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態では、酵素は、ジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼ７（ＺＤＨＨＣ７）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５５６２５（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、１０２１９３（マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）））またはジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼ３（ＺＤＨＨＣ３）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１３０４（ヒト）、６９０３５（マウス））である。ヒトＺＤＨＨＣ７のアミノ酸配列は配列番号１に示し、ヒトＺＤＨＨＣ７のヌクレオチド配列は配列番号７に示す。マウスＺＤＨＨＣ７のアミノ酸配列は配列番号２に示し、マウスＺＤＨＨＣ７のヌクレオチド配列は配列番号８に示す。ヒトＺＤＨＨＣ３のアミノ酸配列は配列番号３に示し、ヒトＺＤＨＨＣ３のヌクレオチド配列は配列番号９に示す。マウスＺＤＨＨＣ３のアミノ酸配列は配列番号４に示し、マウスＺＤＨＨＣ３のヌクレオチド配列は配列番号１０に示す。ヒトＬＹＰＬＡ２のアミノ酸配列は配列番号５に示し、ヒトＬＹＰＬＡ２のヌクレオチド配列は配列番号１１に示す。マウスＬＹＰＬＡ２のアミノ酸配列は配列番号６に示し、マウスＬＹＰＬＡ２のヌクレオチド配列は配列番号１２に示す。
【0030】
幾つかの実施形態では、炎症誘発性転写因子のＳ－パルミトイル化を制御する酵素は、アシルタンパク質チオエステラーゼ２（ＡＰＴ２）とも呼ばれる、リゾホスホリパーゼ２（ＬＹＰＬＡ２）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１１３１３（ヒト）、２６３９４（マウス））である。
【0031】
幾つかの実施形態では、本開示の阻害剤は、単独で、または他の薬物と組み合わせて投与される。
【0032】
幾つかの実施形態では、本開示の阻害剤は小分子阻害剤である。本明細書での「小分子」という用語は、一般に２０００ダルトン未満、１５００ダルトン未満、１０００ダルトン未満、８００ダルトン未満、または６００ダルトン未満の分子量を有する、小さい有機化学化合物を指す。
【0033】
幾つかの実施形態では、有効量の小分子阻害剤は、約０．２ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの小分子阻害剤である。他の実施形態では、有効量の小分子阻害剤は、約０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、または２００ｍｇ／ｋｇの小分子阻害剤である。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、所与の値の±１０％を指す。
【0034】
ある実施形態では、小分子阻害剤は、投与の前に医薬として許容される担体と組み合わせることができる。本開示の目的上、「医薬として許容される担体」は、標準的な医薬担体のいずれかを意味する。適切な担体の例は当技術分野でよく知られており、それらとして、リン酸緩衝食塩溶液および様々な湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかが挙げることができるが、これらに限定されない。他の担体として、錠剤、顆粒剤、およびカプセル剤などに使用される添加剤を挙げることができる。典型的には、そのような担体は、賦形剤、例えば、デンプン、乳、糖、ある種のクレイ、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、タルク、植物性脂肪もしくは植物脂、ガム、グリコール、または他の公知の賦形剤を含む。そのような担体は、香味料もしくは着色添加剤または他の成分も含んでもよい。そのような担体を含む組成物は、よく知られている従来の方法によって製剤化される。
【0035】
小分子阻害剤は、医薬として許容される担体と混合して任意の従来の形態の医薬製剤を作製することができ、そのような形態として、とりわけ、固体形態、例えば、錠剤、カプセル剤（例えば、硬または軟カプセル剤）、丸剤、カシェ剤、散剤、顆粒剤など；液体形態、例えば、液剤、懸濁剤；または微粉化粉末、スプレー、エアロゾルなどが挙げられる。
【0036】
幾つかの実施形態では、本開示の小分子阻害剤は、様々な投与経路、例えば、経口、口鼻、または非経口経路によって投与することができる。
【0037】
「経口（ｏｒａｌ）」または「経口的な（ｐｅｒｏｒａｌ）」投与は、口を通してまたは経由して物質を対象の体内に導入することを指し、嚥下もしくは口腔粘膜を通した輸送（例えば、舌下または口腔吸収）またはその両方を含む。
【0038】
「口鼻」投与は、鼻および口を通してまたは経由して物質を対象の体内に導入することを指し、例えば、１滴または複数の液滴を鼻に入れることによって行われるようなものである。口鼻投与は、経口および経鼻投与に関連する輸送過程を含む。
【0039】
「非経口投与」は、消化管を含まない経路を通してまたは経由して物質を対象の体内に導入することを指す。非経口投与として、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、皮内投与、腹腔内投与、眼球内投与、および静脈内投与が挙げられる。
【0040】
幾つかの実施形態では、酵素はＬＹＰＬＡ２であり、小分子阻害剤は、以下の化学式：
を有するＭＬ３４９である。
【化2】
【0041】
幾つかの実施形態では、酵素はジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼであり、小分子阻害剤は、次式：
を有する２－ブロモパルミチン酸（２－ＢＰ）である。
【化3】
【0042】
幾つかの実施形態では、酵素はジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼであり、小分子阻害剤は、次式：
を有するセルレニンである。
【化4】
【0043】
幾つかの実施形態では、酵素はジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼであり、小分子阻害剤は、次式：
を有するツニカマイシンである。
【化5】
【0044】
幾つかの実施形態では、酵素の阻害剤は核酸阻害剤である。「核酸阻害剤」は、標的遺伝子の発現または活性を低減させるまたは防止することができる核酸である。例えば、ジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の発現の阻害剤は、ジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子産物の転写および／または翻訳を低減させまたは排除し、それによってジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現を低減させることができる。例えば、ジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の発現の阻害剤は、ジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子産物の転写および／または翻訳を低減させまたは排除し、それによって，ジンクフィンガーＤＨＨＣ型パルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現を低減させることができる。
【0045】
幾つかの実施形態では、核酸阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、人工マイクロＲＮＡ、およびリボザイムからなる群から選択される。
【0046】
幾つかの実施形態では、酵素の阻害剤はゲノム編集システムである。
【0047】
幾つかの実施形態では、ゲノム編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステム、ＴＡＬＥＮシステム、ＺＦＮシステム、および相同組換えからなる群から選択される。
【0048】
幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする第１の核酸、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第２の核酸を患者に導入することを含み、前記ｇＲＮＡは、酵素をコードする遺伝子に特異的である。
【実施例1】
【0049】
材料および方法
Ｚｄｈｈｃ７ノックアウトマウス
本研究プロジェクトに使用したマウス系統、Ｂ６．１２９Ｐ２（ＦＶＢ）－Ｚｄｈｈｃ７ｔｍ１．２Ｌｕｓｃ／Ｍｍｍｈ、ＲＲＩＤ：ＭＭＲＲＣ＿０４３５１１－ＭＵは、ＮＩＨによって資金提供された系統保存機関である、ミズーリ大学のＭｕｔａｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＭＲＲＣ）から得た。それは、Ｂ．Ｌｕｓｃｈｅｒ（ペンシルベニア州立大学）によってＭＭＲＲＣに寄贈されたものである。遺伝子型の同定は、ＭＭＲＲＣのプロトコルに従って実施した。野生型対立遺伝子のプライマーは次の通りである：フォワード：ＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡＣＡ（配列番号１３）およびリバース：ＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＣＧＣＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡ（配列番号１４）。変異型対立遺伝子のプライマーは次の通りである：フォワード：ＴＣＣＣＣＴＧＡＴＧＴＡＴＧＣＧＡＡＴＧＴＣＣ（配列番号１５）およびリバース：ＡＡＣＡＧＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＡＡＴＧＴＣＡＧ（配列番号１６）。
Ｚｄｈｈｃ７ノックアウトマウス
本研究プロジェクトに使用したマウス系統、Ｂ６．１２９Ｐ２（ＦＶＢ）－Ｚｄｈｈｃ７ｔｍ１．２Ｌｕｓｃ／Ｍｍｍｈ、ＲＲＩＤ：ＭＭＲＲＣ＿０４３５１１－ＭＵは、ＮＩＨによって資金提供された系統保存機関である、ミズーリ大学のＭｕｔａｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＭＲＲＣ）から得た。それは、Ｂ．Ｌｕｓｃｈｅｒ（ペンシルベニア州立大学）によってＭＭＲＲＣに寄贈されたものである。遺伝子型の同定は、ＭＭＲＲＣのプロトコルに従って実施した。野生型対立遺伝子のプライマーは次の通りである：フォワード：ＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡＣＡ（配列番号１３）およびリバース：ＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＣＧＣＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡ（配列番号１４）。変異型対立遺伝子のプライマーは次の通りである：フォワード：ＴＣＣＣＣＴＧＡＴＧＴＡＴＧＣＧＡＡＴＧＴＣＣ（配列番号１５）およびリバース：ＡＡＣＡＧＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＡＡＴＧＴＣＡＧ（配列番号１６）。
【0050】
ＤＳＳに誘導されるマウス大腸炎モデル
マウスプロトコル２０１９－０００９は、コーネル大学の実験動物委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）に承認された。すべての動物は、ＩＡＣＵＣの規則に従って特定病原菌不在条件下で飼育した。マウス（６～８週齢）は、示した通りに異なる群に無作為に分けた（群当たりマウス８匹、雌雄混合）。大腸炎は、マウスが自由に摂取する飲料水中３．０％のＤＳＳ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）で処理することによって誘導した。ＭＬ３４９溶液は、示した用量で一日おきにマウスに腹腔内注射した。すべてのマウスを安楽死させ、脾臓を単離してＴ細胞を検出した。盲腸から肛門までの距離を測定した。病理学検査のために結腸を４％パラホルムアルデヒドで固定した。この試験は非盲検であった。
マウスプロトコル２０１９－０００９は、コーネル大学の実験動物委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）に承認された。すべての動物は、ＩＡＣＵＣの規則に従って特定病原菌不在条件下で飼育した。マウス（６～８週齢）は、示した通りに異なる群に無作為に分けた（群当たりマウス８匹、雌雄混合）。大腸炎は、マウスが自由に摂取する飲料水中３．０％のＤＳＳ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）で処理することによって誘導した。ＭＬ３４９溶液は、示した用量で一日おきにマウスに腹腔内注射した。すべてのマウスを安楽死させ、脾臓を単離してＴ細胞を検出した。盲腸から肛門までの距離を測定した。病理学検査のために結腸を４％パラホルムアルデヒドで固定した。この試験は非盲検であった。
【0051】
一般的な試薬および抗体
次の試薬および抗体を商業的供給元から購入した：阻害剤カクテル（トリコスタチンＡ（ＴＳＡ、Ｔ８５５２、Ｓｉｇｍａ）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ）、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐ００４４、Ｓｉｇｍａ））、フェドラチニブ（Ｓ２７３６、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ユニバーサルヌクレアーゼ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ）（８８７００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ブラッドフォードアッセイ（２３２００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ；ＤＴＴ１００、Ｇｏｌｄｂｉｏ）、酵素結合化学発光（ＥＣＬ）プラス（３２１３２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（４４７２９０８、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ストレプトアビジンアガロース（２０３５９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ＰＬＵＳ－Ａｇａｒｏｓｅ（ｓｃ－２００３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ｆｌａｇアガロースゲル（Ａ２２２０、Ｓｉｇｍａ）、および抗ＨＡ親和性ゲル（Ｅ６７７９、Ｓｉｇｍａ）。抗体は、次の通りである：ＳＴＡＴ３（９１３９、ＣＳＴ）、ホスホ－ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（ａｂ７６３１５、Ａｂｃａｍ）、β－アクチン（Ｃ４）ＨＲＰ（ＳＣ－４７７７８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｎａ／Ｋ－ＡＴＰアーゼ（ＳＣ－２１７１２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ヒストンＨ３（４４９９Ｓ、ＣＳＴ）、Ｆｌａｇ ＨＲＰ（Ａ８５９２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨＡ－プローブ（Ｙ－１１）（ＳＣ８０５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＨＡ－プローブ（Ｆ－７）（ＳＣ７３９２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＤＨＨＣ７（ａｂ１３８２１０、Ａｂｃａｍ）、ＤＨＨＣ７（Ｒ１２－３６９１、Ａｓｓａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ－１１０４６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ヤギ抗マウスＩｇＧ（８８９０Ｓ、ＣＳＴ）、マウスＣＤ４ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（５６０７６７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、マウスＩＬ－１７Ａ ＰＥ（５６０７６７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（７０７６Ｓ、ＣＳＴ）、および抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（７０７４Ｓ、ＣＳＴ）。
次の試薬および抗体を商業的供給元から購入した：阻害剤カクテル（トリコスタチンＡ（ＴＳＡ、Ｔ８５５２、Ｓｉｇｍａ）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ）、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐ００４４、Ｓｉｇｍａ））、フェドラチニブ（Ｓ２７３６、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ユニバーサルヌクレアーゼ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ）（８８７００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ブラッドフォードアッセイ（２３２００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ；ＤＴＴ１００、Ｇｏｌｄｂｉｏ）、酵素結合化学発光（ＥＣＬ）プラス（３２１３２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（４４７２９０８、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ストレプトアビジンアガロース（２０３５９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ＰＬＵＳ－Ａｇａｒｏｓｅ（ｓｃ－２００３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ｆｌａｇアガロースゲル（Ａ２２２０、Ｓｉｇｍａ）、および抗ＨＡ親和性ゲル（Ｅ６７７９、Ｓｉｇｍａ）。抗体は、次の通りである：ＳＴＡＴ３（９１３９、ＣＳＴ）、ホスホ－ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（ａｂ７６３１５、Ａｂｃａｍ）、β－アクチン（Ｃ４）ＨＲＰ（ＳＣ－４７７７８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｎａ／Ｋ－ＡＴＰアーゼ（ＳＣ－２１７１２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ヒストンＨ３（４４９９Ｓ、ＣＳＴ）、Ｆｌａｇ ＨＲＰ（Ａ８５９２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨＡ－プローブ（Ｙ－１１）（ＳＣ８０５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＨＡ－プローブ（Ｆ－７）（ＳＣ７３９２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＤＨＨＣ７（ａｂ１３８２１０、Ａｂｃａｍ）、ＤＨＨＣ７（Ｒ１２－３６９１、Ａｓｓａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ－１１０４６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ヤギ抗マウスＩｇＧ（８８９０Ｓ、ＣＳＴ）、マウスＣＤ４ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（５６０７６７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、マウスＩＬ－１７Ａ ＰＥ（５６０７６７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（７０７６Ｓ、ＣＳＴ）、および抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（７０７４Ｓ、ＣＳＴ）。
【0052】
クローニングおよび変異誘発
ＡＰＴ２およびＤＨＨＣ１－２３マウスプラスミドは、Ｍ．Ｆｕｋａｔａによって提供された。ＤＨＨＣ３／７／１９ヒトプラスミドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから得た。様々なタグを有するＳＴＡＴ３発現ベクターは、Ａｄｄｇｅｎｅから得た。プラスミドの点変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発によって生成した。
ＡＰＴ２およびＤＨＨＣ１－２３マウスプラスミドは、Ｍ．Ｆｕｋａｔａによって提供された。ＤＨＨＣ３／７／１９ヒトプラスミドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから得た。様々なタグを有するＳＴＡＴ３発現ベクターは、Ａｄｄｇｅｎｅから得た。プラスミドの点変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発によって生成した。
【0053】
細胞培養およびトランスフェクション
ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣから得た）は、１０％仔ウシ血清（ＣＳ、１２１３３Ｃ、Ｓｉｇｍａ）および細胞増殖を向上させるための追加の５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、２６１４００７９、Ｇｉｂｃｏ）を有するＤＭＥＭ培地（１１９６５－９２、Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。ＺＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、以前に記載される通りに生成した。簡単に述べると、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の設計はＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（ＭＩＴ）を使用して実施して、潜在的なオフターゲット作用を最小限に抑えた。３対のｇＲＮＡ配列（＃１、５’－ｃａｃｃｇＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣＧＴＣＣ－３’（配列番号１７）、５’－ａａａｃＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣｃ－３’（配列番号１８）；＃２、５’－ｃａｃｃｇＣＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣ－３’（配列番号１９）、５’－ａａａｃＧＧＡＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣＧｃ－３’（配列番号２０）；＃３、５’－ｃａｃｃｇＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣＣＧＴＧＡ－３’（配列番号２１）、５’－ａａａｃＴＣＡＣＧＧＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧｃ－３’（配列番号２２））をｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２ ベクター（４９５３５、Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングして、ＺＤＨＨＣ７標的化ベクターを生成した。次いで、ＦｕＧｅｎｅ ６（Ｅ２６９１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて標的化ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。空のｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２ベクターを対照とした。トランスフェクション後にピューロマイシン（２μｇ ｍｌ－１；Ｐ－６００－１００、ＧｏｌｄＢｉｏ）を培養培地に２４時間添加し、限界希釈法を使用して細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに単一細胞として播種した。ＺＤＨＨＣ７のノックアウトをウエスタンブロットによって確認し、モノクローナルＺＤＨＨＣ７ノックアウト細胞株の３つの独立した菌株をさらなる実験用に選択した。
ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣから得た）は、１０％仔ウシ血清（ＣＳ、１２１３３Ｃ、Ｓｉｇｍａ）および細胞増殖を向上させるための追加の５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、２６１４００７９、Ｇｉｂｃｏ）を有するＤＭＥＭ培地（１１９６５－９２、Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。ＺＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、以前に記載される通りに生成した。簡単に述べると、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の設計はＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（ＭＩＴ）を使用して実施して、潜在的なオフターゲット作用を最小限に抑えた。３対のｇＲＮＡ配列（＃１、５’－ｃａｃｃｇＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣＧＴＣＣ－３’（配列番号１７）、５’－ａａａｃＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣｃ－３’（配列番号１８）；＃２、５’－ｃａｃｃｇＣＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣ－３’（配列番号１９）、５’－ａａａｃＧＧＡＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣＧｃ－３’（配列番号２０）；＃３、５’－ｃａｃｃｇＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣＣＧＴＧＡ－３’（配列番号２１）、５’－ａａａｃＴＣＡＣＧＧＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧｃ－３’（配列番号２２））をｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２ ベクター（４９５３５、Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングして、ＺＤＨＨＣ７標的化ベクターを生成した。次いで、ＦｕＧｅｎｅ ６（Ｅ２６９１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて標的化ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。空のｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２ベクターを対照とした。トランスフェクション後にピューロマイシン（２μｇ ｍｌ－１；Ｐ－６００－１００、ＧｏｌｄＢｉｏ）を培養培地に２４時間添加し、限界希釈法を使用して細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに単一細胞として播種した。ＺＤＨＨＣ７のノックアウトをウエスタンブロットによって確認し、モノクローナルＺＤＨＨＣ７ノックアウト細胞株の３つの独立した菌株をさらなる実験用に選択した。
【0054】
脾細胞は、古典的な方法によってマウスから単離した。簡単に述べると、切除した脾臓をスライスして小片にし、５０ｍｌの円錐管に取付けたストレーナー（３５２３５０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上に置いた。スライスした脾臓を、シリンジのプランジャー端部を使用して押してストレーナーを通し、これらの細胞を、過剰な４℃のＰＢＳでストレーナーを通して洗浄した。細胞懸濁液を５００ｇで５分間４℃で遠心分離した。細胞ペレットを赤血球溶解緩衝液（Ｒ７７５７、Ｓｉｇｍａ）２ｍｌに５分間ＲＴで懸濁させ、ＰＢＳ３０ｍｌで希釈した。細胞を５００ｇで５分間ＲＴで遠心分離した。細胞ペレットを３７℃のＤＭＥＭ培地２０ｍｌに懸濁させ、パーコール密度勾配培地（１７０８９１０２、ＶＷＲ）１０ｍｌとよく混合し、２，５００ｇで５分間ＲＴで遠心分離した。収集した細胞を、１０％ＦＢＳを加えた３７℃のＲＰＭＩ １６４０培地（１２６３３０１２、Ｇｉｂｃｏ）中に１ｍｌ当たり細胞５×１０６個で播種した。脾細胞をＴＨ１７分化条件下（３ｎｇ ｍｌ－１ ＴＧＦ－β（１００－２１、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、４０ｎｇ ｍｌ－１ ＩＬ－６（２００－０６、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、３０ｎｇ ｍｌ－１ ＩＬ－２３（２００－２３、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、２０ｎｇ ｍｌ－１腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（３００－０１Ａ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、および１０ｎｇ ｍｌ－１ ＩＬ－１β（２００－０１Ｂ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ））で培養した。
【0055】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の場合は、ＦｕＧｅｎｅ ６（Ｅ２６９１、Ｐｒｏｍｅｇａ）またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（２４７６５、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して一過性トランスフェクションを実施した。脾細胞の場合は、製造業者のプロトコルに従って、推奨される緩衝液（１６５２６７７、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌシステムを使用して一過性トランスフェクションを行った。ＬＹＰＬＡ２ノックダウンは、ｓｉＲＮＡ（１３６３６６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて実施した。
【0056】
クリックケミストリーおよびゲル内蛍光検出
細胞を５０μＭのパルミチン酸類似体Ａｌｋｉｎｅ １４（Ａｌｋ１４）で５時間処理し、収集し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを有する１％ ＮＰ－４０溶解緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０）に溶解させた。１６，０００ｇで２０分間４℃で遠心分離した後、上清を収集した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイ（２３２００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって判定した。標的タンパク質を抗Ｆｌａｇアガロースビーズで精製し、ビーズをＩＰ洗浄緩衝液５０μｌに懸濁させた。クリックケミストリー試薬を次の順序でビーズに添加した：４ｍＭ ＴＡＭＲＡアジド（４７１３０、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）１μＬ、１０ｍＭトリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）（Ｔ２９９３、Ｔｃｉｃｈｅｍｉｃａｌｓ）１．２μｌ、４０ｍＭ ＣｕＳＯ４１μｌ、４０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ塩酸塩）（５８０５６０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）１μｌ。反応混合物を完全に混合し、暗所で３０分間、室温でインキュベートした。次いで、６Ｘ－ＳＤＳローディング緩衝液２０μｌを添加し、得られた混合物を９５℃で１０分間加熱した。混合物の半分をヒドロキシルアミン（４３８２２７、Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ７．４、最終濃度５００μＭ）でも処理し、さらに５分間９５℃で加熱してＳ－パルミトイル化を除去した。サンプルを、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。高いＳＴＡＴ３レベルを有する過剰発現したサンプルについては、ゲルを脱染緩衝液（５０％ＣＨ３ＯＨ、４０％水、および１０％酢酸）と共に２～８時間４℃で振盪することによってインキュベートし、次いで水中でインキュベートし、それによってバックグラウンドを下げることができるようにした。そうでない場合は、ゲルを簡単に水中で洗浄した。Ｔｙｐｈｏｏｎ ７０００ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｍｏｄｅ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してゲルを走査して、ローダミン蛍光シグナルを記録した。走査後に、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ（Ｂ７９２０、Ｓｉｇｍａ）で染色してタンパク質のロードを確認した。
細胞を５０μＭのパルミチン酸類似体Ａｌｋｉｎｅ １４（Ａｌｋ１４）で５時間処理し、収集し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを有する１％ ＮＰ－４０溶解緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０）に溶解させた。１６，０００ｇで２０分間４℃で遠心分離した後、上清を収集した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイ（２３２００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって判定した。標的タンパク質を抗Ｆｌａｇアガロースビーズで精製し、ビーズをＩＰ洗浄緩衝液５０μｌに懸濁させた。クリックケミストリー試薬を次の順序でビーズに添加した：４ｍＭ ＴＡＭＲＡアジド（４７１３０、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）１μＬ、１０ｍＭトリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）（Ｔ２９９３、Ｔｃｉｃｈｅｍｉｃａｌｓ）１．２μｌ、４０ｍＭ ＣｕＳＯ４１μｌ、４０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ塩酸塩）（５８０５６０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）１μｌ。反応混合物を完全に混合し、暗所で３０分間、室温でインキュベートした。次いで、６Ｘ－ＳＤＳローディング緩衝液２０μｌを添加し、得られた混合物を９５℃で１０分間加熱した。混合物の半分をヒドロキシルアミン（４３８２２７、Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ７．４、最終濃度５００μＭ）でも処理し、さらに５分間９５℃で加熱してＳ－パルミトイル化を除去した。サンプルを、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。高いＳＴＡＴ３レベルを有する過剰発現したサンプルについては、ゲルを脱染緩衝液（５０％ＣＨ３ＯＨ、４０％水、および１０％酢酸）と共に２～８時間４℃で振盪することによってインキュベートし、次いで水中でインキュベートし、それによってバックグラウンドを下げることができるようにした。そうでない場合は、ゲルを簡単に水中で洗浄した。Ｔｙｐｈｏｏｎ ７０００ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｍｏｄｅ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してゲルを走査して、ローダミン蛍光シグナルを記録した。走査後に、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ（Ｂ７９２０、Ｓｉｇｍａ）で染色してタンパク質のロードを確認した。
【0057】
アシル－ビオチン交換
アシル－ビオチン交換（ＡＢＥ）アッセイは、次のように実施した：サンプルを、５０ｍＭ Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）（Ｅ３８７６、Ｓｉｇｍａ）および５０Ｕ ｍｌ－１ヌクレアーゼ（８８７００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を有する溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％ＳＤＳ、阻害剤カクテル）１ｍｌに懸濁させた。サンプルを室温（ＲＴ）で２時間穏やかに混合しながら可溶化し、１６，０００ｇで２０分間遠心分離した。上清のタンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイを使用して判定した。各サンプルのタンパク質（２μｇ）をクロロホルム／メタノール／水（ｖ／ｖ １：４：３）で沈殿させ、簡単に風乾し、ＲＴで穏やかに混合することによって５ｍＭビオチン－ＨＰＤＰ（１６４５９、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を有する溶解緩衝液１ｍｌに溶解させた。次いでサンプルを二等分し、それぞれ１Ｍヒドロキシルアミンまたは陰性対照（１Ｍ ＮａＣｌ）０．５ｍｌとＲＴで３時間インキュベートした。サンプルを再び沈殿させ、再懸濁緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２、２％ＳＤＳ、８Ｍ尿素、５ｍＭ ＥＤＴＡ）２００μｌに溶解させた。各サンプルについて、２０μｌをローディング対照として使用し、１８０μｌをＰＢＳで１：１０に希釈し、ストレプトアビジンビーズ２０μｌと共に一晩４℃で振盪しながらインキュベートした。１％ＳＤＳを含むＰＢＳでビーズを３回洗浄した。ビーズおよびローディング対照をＳＤＳローディング緩衝液に混合し、９５℃で１０分間加熱した。次いでサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ウエスタンブロット分析に供した。
アシル－ビオチン交換（ＡＢＥ）アッセイは、次のように実施した：サンプルを、５０ｍＭ Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）（Ｅ３８７６、Ｓｉｇｍａ）および５０Ｕ ｍｌ－１ヌクレアーゼ（８８７００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を有する溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％ＳＤＳ、阻害剤カクテル）１ｍｌに懸濁させた。サンプルを室温（ＲＴ）で２時間穏やかに混合しながら可溶化し、１６，０００ｇで２０分間遠心分離した。上清のタンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイを使用して判定した。各サンプルのタンパク質（２μｇ）をクロロホルム／メタノール／水（ｖ／ｖ １：４：３）で沈殿させ、簡単に風乾し、ＲＴで穏やかに混合することによって５ｍＭビオチン－ＨＰＤＰ（１６４５９、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を有する溶解緩衝液１ｍｌに溶解させた。次いでサンプルを二等分し、それぞれ１Ｍヒドロキシルアミンまたは陰性対照（１Ｍ ＮａＣｌ）０．５ｍｌとＲＴで３時間インキュベートした。サンプルを再び沈殿させ、再懸濁緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２、２％ＳＤＳ、８Ｍ尿素、５ｍＭ ＥＤＴＡ）２００μｌに溶解させた。各サンプルについて、２０μｌをローディング対照として使用し、１８０μｌをＰＢＳで１：１０に希釈し、ストレプトアビジンビーズ２０μｌと共に一晩４℃で振盪しながらインキュベートした。１％ＳＤＳを含むＰＢＳでビーズを３回洗浄した。ビーズおよびローディング対照をＳＤＳローディング緩衝液に混合し、９５℃で１０分間加熱した。次いでサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ウエスタンブロット分析に供した。
【0058】
ウエスタンブロット
細胞を１％ＮＰ４０溶解緩衝液で溶解させ、以下の標準プロトコルを使用してタンパク質をブロットした。シグナルは、Ｔｙｐｈｏｏｎ走査装置でＥＣＬ ｐｌｕｓ（３２１３２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の化学発光を使用して検出した。
細胞を１％ＮＰ４０溶解緩衝液で溶解させ、以下の標準プロトコルを使用してタンパク質をブロットした。シグナルは、Ｔｙｐｈｏｏｎ走査装置でＥＣＬ ｐｌｕｓ（３２１３２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の化学発光を使用して検出した。
【0059】
細胞成分分画
細胞を収集し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む細胞成分分画緩衝液（２５０ｍＭスクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁させた。細胞を氷上で２５ゲージの注射針でホモジナイズした。溶解物を１，０００ｇで５分間遠心分離し；ペレットを核分画とした。除核後の上清を６，０００ｇで５分間遠心分離して、ミトコンドリア分画を除去した。６，０００ｇでの上清を２０，０００ｇで２時間の遠心分離に供し；ペレットを膜分画とした。２０，０００ｇでの上清を細胞質分画とした。すべての分画を４％ＳＤＳ溶解緩衝液（４％ＳＤＳ、５０ｍＭトリエタノールアミンｐＨ７．４、および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解させた。次いで小分けした等量の様々な分画をウエスタンブロット分析に供した。
細胞を収集し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む細胞成分分画緩衝液（２５０ｍＭスクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁させた。細胞を氷上で２５ゲージの注射針でホモジナイズした。溶解物を１，０００ｇで５分間遠心分離し；ペレットを核分画とした。除核後の上清を６，０００ｇで５分間遠心分離して、ミトコンドリア分画を除去した。６，０００ｇでの上清を２０，０００ｇで２時間の遠心分離に供し；ペレットを膜分画とした。２０，０００ｇでの上清を細胞質分画とした。すべての分画を４％ＳＤＳ溶解緩衝液（４％ＳＤＳ、５０ｍＭトリエタノールアミンｐＨ７．４、および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解させた。次いで小分けした等量の様々な分画をウエスタンブロット分析に供した。
【0060】
免疫蛍光検査
細胞を３５ｍｍのガラス底皿（ＭａｔＴｅｋ）中に播種し、４％パラホルムアルデヒド（ｖ／ｖ、ＰＢＳ中）で３０分間固定した。固定した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．１％サポニン／５％ＢＳＡ／ＰＢＳで３０分間透過処理およびブロッキングした。透過処理した細胞を一次抗体と共に暗所で一晩４℃でインキュベートし、その後二次抗体と共に暗所で１時間ＲＴでインキュベートした。サンプルをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（０１００－０１、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）またはＤＡＰＩ Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（０１００－２０、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）で封入し、倒立共焦点顕微鏡（ＬＳＭ８８０、Ｚｅｉｓｓ）を使用して観察した。
細胞を３５ｍｍのガラス底皿（ＭａｔＴｅｋ）中に播種し、４％パラホルムアルデヒド（ｖ／ｖ、ＰＢＳ中）で３０分間固定した。固定した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．１％サポニン／５％ＢＳＡ／ＰＢＳで３０分間透過処理およびブロッキングした。透過処理した細胞を一次抗体と共に暗所で一晩４℃でインキュベートし、その後二次抗体と共に暗所で１時間ＲＴでインキュベートした。サンプルをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（０１００－０１、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）またはＤＡＰＩ Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（０１００－２０、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）で封入し、倒立共焦点顕微鏡（ＬＳＭ８８０、Ｚｅｉｓｓ）を使用して観察した。
【0061】
ｑＰＣＲ
遺伝子発現分析のために、製造業者の標準プロトコルに従ってＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ｑＰＣＲを実施した。
遺伝子発現分析のために、製造業者の標準プロトコルに従ってＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ｑＰＣＲを実施した。
【0062】
フローサイトメトリー分析
ＦＡＣＳ分析のために、サンプル当たり細胞１×１０６個を使用してフローサイトメトリーを実施した。ＴＨ１７細胞をサイトカインカクテル：３ｎｇ ｍｌ－１ ＴＧＦ－β（１００－２１、Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）、４０ｎｇ ｍｌ－１ ＩＬ－６（２００－０６、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、３０ｎｇ ｍｌ－１ ＩＬ－２３（２００－２３、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、２０ｎｇ ｍｌ－１ ＴＮＦ（３００－０１Ａ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、および１０ｎｇ ｍｌ－１ ＩＬ－１β（２００－０１Ｂ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で刺激し、次いでＣｙ５．５－ＣＤ４（５６０７６７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で標識した。透過処理および固定化後、細胞をＰＥ－ＩＬ－１７（５６０７６７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で標識した。細胞をＡｔｔｕｎｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって検出し、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ６ソフトウェア（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で分析した。
ＦＡＣＳ分析のために、サンプル当たり細胞１×１０６個を使用してフローサイトメトリーを実施した。ＴＨ１７細胞をサイトカインカクテル：３ｎｇ ｍｌ－１ ＴＧＦ－β（１００－２１、Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）、４０ｎｇ ｍｌ－１ ＩＬ－６（２００－０６、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、３０ｎｇ ｍｌ－１ ＩＬ－２３（２００－２３、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、２０ｎｇ ｍｌ－１ ＴＮＦ（３００－０１Ａ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、および１０ｎｇ ｍｌ－１ ＩＬ－１β（２００－０１Ｂ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で刺激し、次いでＣｙ５．５－ＣＤ４（５６０７６７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で標識した。透過処理および固定化後、細胞をＰＥ－ＩＬ－１７（５６０７６７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で標識した。細胞をＡｔｔｕｎｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって検出し、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ６ソフトウェア（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で分析した。
【0063】
統計分析
定量分析はＳＰＳＳ １７．０で実施し、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表した。群間の比較はスチューデントｔ検定を使用して実施し、他のデータは一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して分析した。
定量分析はＳＰＳＳ １７．０で実施し、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表した。群間の比較はスチューデントｔ検定を使用して実施し、他のデータは一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して分析した。
【実施例2】
【0064】
ＳＴＡＴ３はＤＨＨＣ７によってパルミトイル化される
ＳＴＡＴ３の形質膜への動員は、そのリン酸化に不可欠である。本発明者らはまず、Ｓ－パルミトイル化がＳＴＡＴ３の膜結合に寄与するのかどうかを調査した。
ＳＴＡＴ３の形質膜への動員は、そのリン酸化に不可欠である。本発明者らはまず、Ｓ－パルミトイル化がＳＴＡＴ３の膜結合に寄与するのかどうかを調査した。
【0065】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるマウスＤＨＨＣの存在下でのＳＴＡＴ３のパルミトイル化を可視化するために、本発明者らは、アルキンタグ付きパルミチン酸類似体Ａｌｋ１４を代謝標識として使用した。これは、クリックケミストリーによって蛍光色素ＴＡＭＲＡアジドにコンジュゲートすることができる。ＤＨＨＣ７（Ｚｄｈｈｃ７によってコードされる）およびＤＨＨＣ３（Ｚｄｈｈｃ３によってコードされる）は、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化レベルを増加させた。定量化によって、ＤＨＨＣ７が発現するとＳＴＡＴ３のパルミトイル化が５．４倍増大すること；ＤＨＨＣ３の作用の方が弱いことが明らかになった。パルミトイル化は、システインまたはリシン残基で（それぞれ硫黄または窒素で）生じ得るが、Ｓ－パルミトイル化だけがヒドロキシルアミンに感受性である。ヒドロキシルアミンで処理するとＳＴＡＴ３でのパルミトイル化シグナルの９０％超が除去されたことから、ＤＨＨＣ７によるＳＴＡＴ３のパルミトイル化が主にシステインで生じることが示唆される（図１Ａ）。
【0066】
ＤＨＨＣ７が内在性ＳＴＡＴ３パルミトイルトランスフェラーゼであることを確認するために、本発明者らは、ＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびマウス脾細胞を生成した。ＤＨＨＣ７ノックアウト細胞におけるＳＴＡＴ３のＳ－パルミトイル化は、対照細胞と比較して有意に減少した。野生型ＤＨＨＣ７を再発現させると、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化が有意に増大したが、保存されたモチーフにシステインからセリンへの置換を含む触媒的に不活性なＤＨＨＳ７変異体を再発現させても増大しなかった。本発明者らはさらに、Ｓ－パルミトイル化を検出するために汎用される別の方法であるアシル－ビオチン交換アッセイを使用して、ＤＨＨＣ７に促進されるＳＴＡＴ３のパルミトイル化を確認した。
【0067】
ヒトＤＨＨＣ１９がＳＴＡＴ３のパルミトイルトランスフェラーゼとして作用することが報告されていることを考慮して、本発明者らは、ヒトとマウスのＤＨＨＣの配列の相違が知見の相違を説明することができるのかどうかを検討した。本発明者らは、ヒトＤＨＨＣ３、ＤＨＨＣ７、およびＤＨＨＣ１９を試験し、ヒトＤＨＨＣ７が最も効率的なＳＴＡＴ３パルミトイルトランスフェラーゼであることを見出した。
【0068】
ＳＴＡＴファミリーには７つのメンバーが存在し、そのうちＳＴＡＴ１がＳＴＡＴ３にもっともよく類似している。アシル－ビオチン交換アッセイを使用して、本発明者らは、ＳＴＡＴ１もパルミトイル化されることを示した；しかし、そのパルミトイル化レベルは、ＤＨＨＣ７の存在下では増加しなかった。
【0069】
パルミトイル化はＳＴＡＴ３を膜に向かわせる
ＳＴＡＴ３のパルミトイル化部位を位置付けるために、本発明者らはＳＴＡＴ３の１４個のシステイン残基を各々独立にセリンに変異させ、変異体のパルミトイル化状態を調べた。ＳＴＡＴ３のパルミトイル化シグナルは、Ｃｙｓ１０８を変異させたときだけ顕著な減少を示した。注目すべきことに、ＳＴＡＴ３（Ｃ１０８Ｓ）とＤＨＨＣ７の間の相互作用も、野生型ＳＴＡＴ３が関与する相互作用と比較して減少した。ＤＨＨＣ７およびＤＨＨＣ３の過剰発現のいずれも、ＳＴＡＴ３（Ｃ１０８Ｓ）のパルミトイル化を増大させることができなかった。
ＳＴＡＴ３のパルミトイル化部位を位置付けるために、本発明者らはＳＴＡＴ３の１４個のシステイン残基を各々独立にセリンに変異させ、変異体のパルミトイル化状態を調べた。ＳＴＡＴ３のパルミトイル化シグナルは、Ｃｙｓ１０８を変異させたときだけ顕著な減少を示した。注目すべきことに、ＳＴＡＴ３（Ｃ１０８Ｓ）とＤＨＨＣ７の間の相互作用も、野生型ＳＴＡＴ３が関与する相互作用と比較して減少した。ＤＨＨＣ７およびＤＨＨＣ３の過剰発現のいずれも、ＳＴＡＴ３（Ｃ１０８Ｓ）のパルミトイル化を増大させることができなかった。
【0070】
Ｓ－パルミトイル化はタンパク質を膜に向かわせることができること、およびＳＴＡＴ３はＪＡＫ２と相互作用するために形質膜に動員される必要があるという理由から、本発明者らは次にＳ－パルミトイル化がＳＴＡＴ３の膜動員に影響を及ぼすのかどうかを調べた。野生型ＳＴＡＴ３は、形質膜、内膜上、および核内に局在していた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＤＨＨＣ７をノックアウトすると、ＳＴＡＴ３の膜局在は減少するが、その核局在は増大した（図１Ｂ）。これと一致して、ＳＴＡＴ３（Ｃ１０８Ｓ）が核内に顕著に見出されたことから、パルミトイル化はＳＴＡＴ３の膜局在を促進することが示唆される。さらに、ＤＨＨＣ７ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＤＨＨＣ７を再発現させると、野生型ＳＴＡＴ３の膜動員を引き起こしたが、ＳＴＡＴ３（Ｃ１０８Ｓ）の膜動員は引き起こさなかった（図１Ｃ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とマウス脾細胞の両方において、ＤＨＨＣ７はＳＴＡＴ３のパルミトイル化を誘導し、膜における修飾タンパク質の量を増加させたが、核分画では増加させなかった（図１Ｄ）。内在性ＳＴＡＴ３のＪＡＫ２との共局在の程度は、野生型の方がＤＨＨＣ７ノックアウト細胞よりも大きかった（図１Ｂ）。総括すると、これらの結果から、ＤＨＨＣ７に触媒されるパルミトイル化は、ＳＴＡＴ３の膜局在およびＪＡＫ２とのその相互作用を促進することが示唆される。
【0071】
ＤＨＨＣ７はＳＴＡＴ３の活性化を促進する
ＳＴＡＴ３の転写活性は、Ｙ７０５でのそのリン酸化に依存する。本発明者らは次に、パルミトイル化がＳＴＡＴ３のリン酸化を促すことができるのかどうかを調べた。パルミトイル化スクリーニングと一致して、ＳＴＡＴ３のリン酸化は、ＤＨＨＣ７またはＤＨＨＣ３の発現によって顕著に（かつ選択的に）増大し、ＤＨＨＣ７の方が有効であった。内在性ＳＴＡＴ３のリン酸化は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とマウス脾細胞の両方においてＤＨＨＣ７の発現によって同様に制御されていた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＤＨＨＣ７をノックアウトすると、内在性野生型ＳＴＡＴ３のリン酸化は減少したが、異所的に発現された変異体ＳＴＡＴ３（Ｃ１０８Ｓ）のリン酸化は減少しなかった。したがって、本発明者らは、ＤＨＨＣ７はＳＴＡＴ３のリン酸化を制御すると結論付けた。
ＳＴＡＴ３の転写活性は、Ｙ７０５でのそのリン酸化に依存する。本発明者らは次に、パルミトイル化がＳＴＡＴ３のリン酸化を促すことができるのかどうかを調べた。パルミトイル化スクリーニングと一致して、ＳＴＡＴ３のリン酸化は、ＤＨＨＣ７またはＤＨＨＣ３の発現によって顕著に（かつ選択的に）増大し、ＤＨＨＣ７の方が有効であった。内在性ＳＴＡＴ３のリン酸化は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とマウス脾細胞の両方においてＤＨＨＣ７の発現によって同様に制御されていた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＤＨＨＣ７をノックアウトすると、内在性野生型ＳＴＡＴ３のリン酸化は減少したが、異所的に発現された変異体ＳＴＡＴ３（Ｃ１０８Ｓ）のリン酸化は減少しなかった。したがって、本発明者らは、ＤＨＨＣ７はＳＴＡＴ３のリン酸化を制御すると結論付けた。
【0072】
本発明者らは次に、ＤＨＨＣ７を野生型ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ３（Ｃ１０８Ｓ）、およびＳＴＡＴ３（Ｙ７０５Ｆ）と共に共発現させた。ＳＴＡＴ３（Ｃ１０８Ｓ）のリン酸化は野生型ＳＴＡＴ３のリン酸化に対して低減したが、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化状態は、Ｙ７０５リン酸化部位の変異によって影響を受けなかった（図２Ａ）。よって、ＳＴＡＴ３のリン酸化はパルミトイル化によって促されるが、リン酸化はＤＨＨＣ７によるパルミトイル化に影響を及ぼさない。
【0073】
細胞成分分画から、ＤＨＨＣ７はＳＴＡＴ３の膜動員を増大させるだけでなく、膜上および核内に位置するｐ－ＳＴＡＴ３シグナルも増加させることが示された。注目すべきことに、ｐ－ＳＴＡＴ３のＳＴＡＴ３に対する比率は、核分画でのみＤＨＨＣ７によって増加した。ＳＴＡＴ３（Ｃ１０８Ｓ）の膜動員およびリン酸化は、野生型ＳＴＡＴ３のものに対して低減した（図２Ｂ）。同様に、免疫蛍光画像分析から、ＤＨＨＣ７発現細胞において野生型ＳＴＡＴ３は、主に核内に局在するＳＴＡＴ３（Ｃ１０８Ｓ）と比較して広く形質膜および内膜に位置しており、高いリン酸化レベルを有することが示された（図２Ｃ）。これらのデータから、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化は、ＪＡＫ２キナーゼが位置する膜へのそれらの動員を促進することによって、そのリン酸化を促すことがさらに裏付けられる。
【0074】
ＡＰＴ２はｐ－ＳＴＡＴ３を脱パルミトイル化する
ＡＰＴは、脱パルミトイル化によって標的タンパク質の膜局在の制御に関与する。ＡＰＴ１およびＡＰＴ２は両方ともＣｙｓ２でパルミトイル化することが可能であり、それによってそれらの膜局在および膜内の基質への接近が促進される。最近、ＡＰＴ１が主にミトコンドリアに局在することが示された。したがって、本発明者らは、ＳＴＡＴ３がＡＰＴ２の基質であるのかどうかを試験することに焦点を合わせた。赤血球凝集素（ＨＡ）タグ付きＳＴＡＴ３とＦｌａｇタグ付きＡＰＴ２は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において互いに結合することが見出された。野生型ＡＰＴ２は、変異体ＡＰＴ２（Ｃ２Ｓ）より強くＳＴＡＴ３と相互作用した。ＡＰＴ２が発現すると、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化シグナルが減少した（図２Ｄ）。ＡＰＴ２のＣ２Ｓ変異体または触媒的に不活性なＳ１２２Ａ変異体は、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化シグナルを減少させることができなかった（図２Ｄ）。ＡＰＴ２ノックダウンおよびＭＬ３４９でのＡＰＴ２の薬理学的阻害も、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化を増大させた（図２Ｆ）。これらの結果から、ＡＰＴ２はＳＴＡＴ３を脱パルミトイル化できることが示される。
ＡＰＴは、脱パルミトイル化によって標的タンパク質の膜局在の制御に関与する。ＡＰＴ１およびＡＰＴ２は両方ともＣｙｓ２でパルミトイル化することが可能であり、それによってそれらの膜局在および膜内の基質への接近が促進される。最近、ＡＰＴ１が主にミトコンドリアに局在することが示された。したがって、本発明者らは、ＳＴＡＴ３がＡＰＴ２の基質であるのかどうかを試験することに焦点を合わせた。赤血球凝集素（ＨＡ）タグ付きＳＴＡＴ３とＦｌａｇタグ付きＡＰＴ２は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において互いに結合することが見出された。野生型ＡＰＴ２は、変異体ＡＰＴ２（Ｃ２Ｓ）より強くＳＴＡＴ３と相互作用した。ＡＰＴ２が発現すると、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化シグナルが減少した（図２Ｄ）。ＡＰＴ２のＣ２Ｓ変異体または触媒的に不活性なＳ１２２Ａ変異体は、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化シグナルを減少させることができなかった（図２Ｄ）。ＡＰＴ２ノックダウンおよびＭＬ３４９でのＡＰＴ２の薬理学的阻害も、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化を増大させた（図２Ｆ）。これらの結果から、ＡＰＴ２はＳＴＡＴ３を脱パルミトイル化できることが示される。
【0075】
本発明者らは次に、ＡＰＴ２による脱パルミトイル化がＳＴＡＴ３のリン酸化および転写活性を制御するのかどうかを評価した。ＤＨＨＣ７に触媒されるパルミトイル化がＳＴＡＴ３活性を促進することを考慮して、本発明者らはＡＰＴ２をノックダウンするとＳＴＡＴ３活性が増大すると予想した。しかし、ＡＰＴ２をノックダウンすると、ＳＴＡＴ３の転写活性とその核移行の両方が阻害された（図２Ｇ）。さらに、野生型ＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２を共発現させると、それらの変異体対応物より大きく下流遺伝子の発現が促進された。ＳＴＡＴ３の二量体化は、その転写活性に重要であり、様々な翻訳後修飾によって制御されていることが報告されている；しかし、それはパルミトイル化によって影響を受けなかった。
【0076】
パルミトイル化と脱パルミトイル化の両方がＳＴＡＴ３のシグナル伝達を促進するという知見を説明するために、本発明者らは、ＳＴＡＴ３の脱パルミトイル化が主にｐ－ＳＴＡＴ３で生じ、ｐ－ＳＴＡＴ３を膜から放出させてその核移行を促進する役割を果たすと提案する。この仮説を試験するために、本発明者らは、ＨＡタグ付きリン酸化部位変異体ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５Ｆ）を生成し、ＳＴＡＴ３－ＡＰＴ２相互作用実験を繰り返した。野生型ＳＴＡＴ３と比較して、ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５Ｆ）とＡＰＴ２の間の結合は低減した。物理的相互作用研究の結果と一致して、ＡＰＴ２によるＳＴＡＴ３（Ｙ７０５Ｆ）の脱パルミトイル化は、はるかに効率が低かった（図２Ｅ）。ＪＡＫ２をフェドラチニブで阻害すると、ＳＴＡＴ３のリン酸化は予想通りに減少した；しかし、膜に局在するＳＴＡＴ３のレベルは増加し、それに対して核ＳＴＡＴ３のレベルは減少した（図２Ｈ）。総括すると、これらのデータから、ＡＰＴ２がＳＴＡＴ３よりｐ－ＳＴＡＴ３の脱パルミトイル化および核移行を優先的に促進するという仮説が裏付けられる。
【実施例3】
【0077】
ＳＴＡＴ３パルミトイル化サイクルはＴＨ１７を促進する
ＳＴＡＴ３がＴＨ１７細胞の分化に重要であるという理由から、本発明者らは、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルがマウス脾臓細胞からのＴＨ１７細胞の生成を促進するかどうかを評価した。ＴＨ１７分化条件下で、ＳＴＡＴ３が野生型ＤＨＨＣ７と共発現されると、不活性なＤＨＨＳ７と共発現されたときよりＳＴＡＴ３のリン酸化および転写活性は大きく促進された（図３Ａ）。これらの結果は、フローサイトメトリーを使用するＴＨ１７細胞の定量化によってさらに確認された（図３Ｂ）。ＭＬ３４９によってＡＰＴ２を阻害すると、ＳＴＡＴ３標的遺伝子（ＲＯＲＣおよびＣＣＮＤ１）の発現およびＴＨ１７細胞の分化が有意に減少した（図３Ｃ）。Ｚｄｈｈｃ７のノックアウトによっても、ＴＨ１７細胞の分化（図３Ｄ）およびＳＴＡＴ３のリン酸化（図３Ｅ）が減少した。したがって、パルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルは、ＳＴＡＴ３のシグナル伝達およびＴＨ１７の分化に重要である。
ＳＴＡＴ３がＴＨ１７細胞の分化に重要であるという理由から、本発明者らは、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルがマウス脾臓細胞からのＴＨ１７細胞の生成を促進するかどうかを評価した。ＴＨ１７分化条件下で、ＳＴＡＴ３が野生型ＤＨＨＣ７と共発現されると、不活性なＤＨＨＳ７と共発現されたときよりＳＴＡＴ３のリン酸化および転写活性は大きく促進された（図３Ａ）。これらの結果は、フローサイトメトリーを使用するＴＨ１７細胞の定量化によってさらに確認された（図３Ｂ）。ＭＬ３４９によってＡＰＴ２を阻害すると、ＳＴＡＴ３標的遺伝子（ＲＯＲＣおよびＣＣＮＤ１）の発現およびＴＨ１７細胞の分化が有意に減少した（図３Ｃ）。Ｚｄｈｈｃ７のノックアウトによっても、ＴＨ１７細胞の分化（図３Ｄ）およびＳＴＡＴ３のリン酸化（図３Ｅ）が減少した。したがって、パルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルは、ＳＴＡＴ３のシグナル伝達およびＴＨ１７の分化に重要である。
【0078】
ＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２はＩＢＤ患者において上方制御される
活性化されたＳＴＡＴ３は、様々な自己免疫疾患の予後不良を示唆するものであり、ＴＨ１７細胞のレベルは、腸の炎症の過程および重篤度に影響を及ぼす鍵となる要因である。ＺＤＨＨＣ７およびＬＹＰＬＡ２－
パルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルを促進する遺伝子－の発現レベルがヒトにおける腸の炎症に相関するかどうかを判定するために、健常な参加者２６人、クローン病患者２４人、および潰瘍性大腸炎患者１０人からヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を抽出し、分析した。ＺＤＨＨＣ７およびＬＹＰＬＡ２ ｍＲＮＡは、ＩＢＤ患者、とりわけ潰瘍性大腸炎患者において上方制御されていた（図４Ａ）。ＳＴＡＴ３の下流標的遺伝子－ＲＯＲＣおよびＩＬ１７Ａ－も高度に発現していた。加えて、より活動的なＩＢＤを有する個体からの細胞は、ＺＤＨＨＣ７、ＬＹＰＬＡ２、ＲＯＲＣ、およびＩＬ１７Ａのより高い発現レベルを示す（図４Ｂ）。ＳＴＡＴ３標的遺伝子（ＲＯＲＣおよびＩＬ１７Ａ）の発現とＺＤＨＨＣ７およびＬＹＰＬＡ２の発現の間には有意な相関関係が存在した（図４Ｃ）。さらに、ｐ－ＳＴＡＴ３レベルは、ＰＢＭＣにおけるＺＤＨＨＣ７およびＬＹＰＬＡ２ ｍＲＮＡのレベルと相関していた（図４Ｄ）。注目すべきことに、ＺＤＨＨＣ７のｍＲＮＡレベルは、ＳＴＡＴ３標的遺伝子のレベル－ならびにｐ－ＳＴＡＴ３のレベル－とＩＢＤ患者においてのみ相関しており、それに対してＬＹＰＬＡ２のｍＲＮＡレベルとＳＴＡＴ３標的遺伝子のｍＲＮＡレベルは、健常な参加者およびＩＢＤ患者の両方において優れた相関関係を示した（図４Ｃおよび４Ｄ）。これらの結果から、ＬＹＰＬＡ２の発現の変化が、よりＩＢＤに関連している可能性があることが示唆される。ＺＤＨＨＣ７の発現は、ＳＴＡＴ３標的遺伝子の発現にあまりよく相関しなかった。これはおそらく、上のデータが示すように、ＤＨＨＣ３もＳＴＡＴ３を制御することが可能であったことが理由であると思われる。この仮説と一致して、ＩＢＤ患者ではＺＤＨＨＣ３発現レベルも健常な参加者と比較して増加していた。
活性化されたＳＴＡＴ３は、様々な自己免疫疾患の予後不良を示唆するものであり、ＴＨ１７細胞のレベルは、腸の炎症の過程および重篤度に影響を及ぼす鍵となる要因である。ＺＤＨＨＣ７およびＬＹＰＬＡ２－
パルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルを促進する遺伝子－の発現レベルがヒトにおける腸の炎症に相関するかどうかを判定するために、健常な参加者２６人、クローン病患者２４人、および潰瘍性大腸炎患者１０人からヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を抽出し、分析した。ＺＤＨＨＣ７およびＬＹＰＬＡ２ ｍＲＮＡは、ＩＢＤ患者、とりわけ潰瘍性大腸炎患者において上方制御されていた（図４Ａ）。ＳＴＡＴ３の下流標的遺伝子－ＲＯＲＣおよびＩＬ１７Ａ－も高度に発現していた。加えて、より活動的なＩＢＤを有する個体からの細胞は、ＺＤＨＨＣ７、ＬＹＰＬＡ２、ＲＯＲＣ、およびＩＬ１７Ａのより高い発現レベルを示す（図４Ｂ）。ＳＴＡＴ３標的遺伝子（ＲＯＲＣおよびＩＬ１７Ａ）の発現とＺＤＨＨＣ７およびＬＹＰＬＡ２の発現の間には有意な相関関係が存在した（図４Ｃ）。さらに、ｐ－ＳＴＡＴ３レベルは、ＰＢＭＣにおけるＺＤＨＨＣ７およびＬＹＰＬＡ２ ｍＲＮＡのレベルと相関していた（図４Ｄ）。注目すべきことに、ＺＤＨＨＣ７のｍＲＮＡレベルは、ＳＴＡＴ３標的遺伝子のレベル－ならびにｐ－ＳＴＡＴ３のレベル－とＩＢＤ患者においてのみ相関しており、それに対してＬＹＰＬＡ２のｍＲＮＡレベルとＳＴＡＴ３標的遺伝子のｍＲＮＡレベルは、健常な参加者およびＩＢＤ患者の両方において優れた相関関係を示した（図４Ｃおよび４Ｄ）。これらの結果から、ＬＹＰＬＡ２の発現の変化が、よりＩＢＤに関連している可能性があることが示唆される。ＺＤＨＨＣ７の発現は、ＳＴＡＴ３標的遺伝子の発現にあまりよく相関しなかった。これはおそらく、上のデータが示すように、ＤＨＨＣ３もＳＴＡＴ３を制御することが可能であったことが理由であると思われる。この仮説と一致して、ＩＢＤ患者ではＺＤＨＨＣ３発現レベルも健常な参加者と比較して増加していた。
【0079】
ＡＰＴ２またはＤＨＨＣ７を標的化するとマウスにおける大腸炎が低減する
本発明者らは、ＭＬ３４９でのＡＰＴ２の薬理学的阻害が、ＩＢＤの実験モデルである、マウスにおけるデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導大腸炎を低減させることができるのかどうかを試験した。マウスによるＭＬ３４９（５０ｍｇ ｋｇ－１）の忍容性は良好であった。大腸炎のＤＳＳ誘導マウスモデルにおいて、ＭＬ３４９で前処理した後にＤＳＳで処理すると、体重減少が有意に減弱し、生存率が増大した。このことから、ＭＬ３４９処理がＤＳＳ誘導大腸炎を有効に防止することができることが示された。ＤＳＳで処理した後にＭＬ３４９で処理しても、マウスにおける体重減少および結腸の短縮が有意に減弱したことから（図４Ｅ）、ＭＬ３４９がＤＳＳ誘導大腸炎を緩和できることが示された。さらに、インビトロでの結果と一致して（図３）、ＭＬ３４９は、マウス脾細胞におけるＴＨ１７細胞のレベルを有意に減少させた（図４Ｆ）。
本発明者らは、ＭＬ３４９でのＡＰＴ２の薬理学的阻害が、ＩＢＤの実験モデルである、マウスにおけるデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導大腸炎を低減させることができるのかどうかを試験した。マウスによるＭＬ３４９（５０ｍｇ ｋｇ－１）の忍容性は良好であった。大腸炎のＤＳＳ誘導マウスモデルにおいて、ＭＬ３４９で前処理した後にＤＳＳで処理すると、体重減少が有意に減弱し、生存率が増大した。このことから、ＭＬ３４９処理がＤＳＳ誘導大腸炎を有効に防止することができることが示された。ＤＳＳで処理した後にＭＬ３４９で処理しても、マウスにおける体重減少および結腸の短縮が有意に減弱したことから（図４Ｅ）、ＭＬ３４９がＤＳＳ誘導大腸炎を緩和できることが示された。さらに、インビトロでの結果と一致して（図３）、ＭＬ３４９は、マウス脾細胞におけるＴＨ１７細胞のレベルを有意に減少させた（図４Ｆ）。
【0080】
これらの知見のさらなる裏付けを提供するために、本発明者らはＺｄｈｈｃ７ノックアウトマウスも大腸炎モデルに使用した。機構モデル（図４Ｉ）に基づいて、本発明者らは、Ｚｄｈｈｃ７のノックアウトもＤＳＳ誘導大腸炎を低減させるはずであると予測した。実際に、本発明者らは、Ｚｄｈｈｃ７をノックアウトするとＴＨ１７細胞の分化が減少し、マウスがＤＳＳ誘導大腸炎から保護されることを見出した（図４Ｇおよび４Ｈ）。したがって、本発明者らは、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルがＴＨ１７関連免疫異常の有望な治療標的となり得るはずであると提案する。
【0081】
転写因子ＳＴＡＴ３は、特定の刺激の下で形質膜に動員され、ＪＡＫ２によってリン酸化されることが知られている。ｐ－ＳＴＡＴ３は、次いで核に移行し、標的遺伝子の発現を促進する。しかし、ＳＴＡＴ３が膜に動員される機構についてはほとんど知られていない。ここに、本発明者らは、ＳＴＡＴ３のＣｙｓ１０８がＤＨＨＣ７によって（そしてより少ない程度でＤＨＨＣ３によって）パルミトイル化され、それによって膜動員およびＪＡＫ２によるリン酸化が促進されることを示した。パルミトイル化が膜分布およびシグナル伝達の出力に重要であることはよく知られているが、シグナル伝達を促進するためにどのようにパルミトイル化と脱パルミトイル化のバランスが取られているのかは根本的に未対応の問題であった。パルミトイル化はＳＴＡＴ３を細胞膜に係留するが、核移行するためには、それは脱パルミトイル化されなければならない。本発明者らは、ＡＰＴ２が、非リン酸化ＳＴＡＴ３よりｐ－ＳＴＡＴ３を選択的に脱パルミトイル化することによってｐ－ＳＴＡＴ３の核移行に寄与することを示した。これらの結果から、パルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルが、無駄なサイクルではなく、ＳＴＡＴ３の活性化を駆動するというモデル（図４Ｉ）が示唆される。このサイクルがない場合、ＳＴＡＴ３はまだホモ二量体を形成して核に移行することができるのに、ほとんどのＳＴＡＴ３がその不活性な非リン酸化状態で存在することになる（図４Ｉ）。
【0082】
ＳＴＡＴ３の恒常的活性化は、免疫異常を有する患者におけるＴＨ１７の分化に寄与し、それによって不十分な臨床転帰に至る。ＳＴＡＴ３は、ＩＢＴのマウスモデルにおいて、ＴＨ１７細胞の分化を阻害し、大腸炎を減弱させるための有効な標的であることが判明した。本研究から、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルがＴＨ１７細胞の分化に影響を及ぼすことが実証され、ＤＨＨＣ７とＡＰＴ２の両方が、大腸炎を治療するための新たな治療標的になり得ることが示唆される。ＴＨ１７細胞は、様々な免疫異常、例えば、ＩＢＤ、高ＩｇＥ症候群、および関節炎の経過および重篤度に影響を及ぼす鍵となる要因であることから、ＳＴＡＴ３のパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルは、多くの他の自己免疫障害の治療のための潜在的な治療標的になり得ると思われる。
【0083】
翻訳後修飾は、リン酸化およびユビキチン化の周知のシグナル伝達機能によって証明されるように、細胞のシグナル伝達を媒介するのに特に適している。タンパク質のＳ－パルミトイル化は、翻訳後修飾として数十年前に発見されたが、ヒトにおける３，０００近いタンパク質がこの修飾を受けることが知られているという事実にもかかわらず、それがどのように細胞のシグナル伝達に寄与するのかほとんど理解されていない。本研究は、パルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルが特定の方向で進行して細胞のシグナル伝達を促進することができ、この場合のサイクルの方向が、リン酸化基質に対するＡＰＴ２の特異性によって確保されることを実証した。本実施例は、数多くの他の細胞シグナル伝達過程におけるＳ－パルミトイル化のシグナル伝達機能を理解するための重要な洞察を提供することができると思われる。
【実施例4】
【0084】
ＳＭＡＤはＤＨＨＣ７によってパルミトイル化される
Ｒ－Ｓｍａｄファミリーには、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、およびＳＭＡＤ８／９を含めた６つのメンバーが存在し、それらはＴＧＦβＲの直接的なシグナル伝達およびＴ細胞の分化に重要な役割を果たしており、ＳＭＡＤ２は最もＳＭＡＤ３に類似している。以前の研究から、不活性なＲ－Ｓｍａｄをリン酸化する鍵は、ＴＧＦβＲおよびＥＲＫが位置する形質膜および細胞質にＳＭＡＤを動員することであることが見出されている。本発明者らは、ＳＴＡＴ３がＳ－パルミトイル化によって制御されるのと同様に、Ｓ－パルミトイル化がＲ－ＳＭＡＤの膜結合にある役割を果たしているのではないかと考えた。今までのところ、タンパク質のＳ－パルミトイル化に関するデータベースであるＳｗｉｓｓＰａｌｍに基づくと、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３のＳ－パルミトイル化は報告されていない。
Ｒ－Ｓｍａｄファミリーには、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、およびＳＭＡＤ８／９を含めた６つのメンバーが存在し、それらはＴＧＦβＲの直接的なシグナル伝達およびＴ細胞の分化に重要な役割を果たしており、ＳＭＡＤ２は最もＳＭＡＤ３に類似している。以前の研究から、不活性なＲ－Ｓｍａｄをリン酸化する鍵は、ＴＧＦβＲおよびＥＲＫが位置する形質膜および細胞質にＳＭＡＤを動員することであることが見出されている。本発明者らは、ＳＴＡＴ３がＳ－パルミトイル化によって制御されるのと同様に、Ｓ－パルミトイル化がＲ－ＳＭＡＤの膜結合にある役割を果たしているのではないかと考えた。今までのところ、タンパク質のＳ－パルミトイル化に関するデータベースであるＳｗｉｓｓＰａｌｍに基づくと、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３のＳ－パルミトイル化は報告されていない。
【0085】
本発明者らは、アルキンタグ付きパルミチン酸類似体である代謝性Ａｌｋ１４での代謝標識、その後のクリックケミストリーによるＴＡＭＲＡアジドコンジュゲーション、およびゲル内蛍光を使用して、ＳＭＡＤ２／３のパルミトイル化を検出した。本発明者らは、ＳＭＡＤ２をＡｌｋ１４によって標識することができ、その標識がＤＨＨＣ７（遺伝子名Ｚｄｈｈｃ７）発現によって有意に増大し得ることを見出した（図５Ａ～５Ｂ）。パルミトイル化シグナルの定量化から、ＳＭＡＤ２のパルミトイル化がＤＨＨＣ７によって６倍増大することが示された（図５Ｂ）。ＤＨＨＣ３もＳＭＡＤ２のパルミトイル化を増大させたが、その変化は有意ではなかった（図５Ｂ）。対照的に、ＳＭＡＤ３およびＳＭＡＤ４のＡｌｋ１４標識は実質的に検出不可能であり、過剰発現したＤＨＨＣ７が存在しても、標識は極めて弱いままであった（図５Ｃ、５Ｄ、および５Ｆ）。アシル－ビオチン交換（ＡＢＥ）アッセイも使用して、様々なマウスＤＨＨＣを発現するＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるＳＭＡＤ２のパルミトイル化シグナルを可視化した。Ａｌｋ１４標識データと一致して、ＤＨＨＣ７のみがＳＭＡＤ２のパルミトイル化を有意に促進した（図５Ｅ）。ＤＨＨＣ７が内在性ＳＭＡＤ２パルミトイルトランスフェラーゼであるかをさらに判定するために、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞においてＤＨＨＣ７をノックアウトした。ＡＢＥアッセイに基づくと、ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化は、ＤＨＨＣ７のノックアウトによって有意に低減された（図５Ｇ）。
【0086】
Ｃｙｓ４１およびＣｙｓ８１のパルミトイル化はＳＭＡＤ２の膜動員を促進する
ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化部位を特定するために、ＳＭＡＤ２の１５個のシステイン残基の各々をセリンに変異させ、各々の変異体のＳ－パルミトイル化状態をＡｌｋ１４標識によって判定した。本発明者らは、Ｃｙｓ４１およびＣｙｓ８１変異体がＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化シグナルを有意に低減させ、Ｃｙｓ４１／８１二重変異体がパルミトイル化シグナルをほとんど有していないことを見出した（図６Ａ～６Ｂ）。ＤＨＨＣ７をノックアウトしてもＳＭＡＤ２ Ｃｙｓ４１／８１Ｓｅｒ変異体のＳ－パルミトイル化が低減しなかったことから（図６Ｃ）、ＤＨＨＣ７に触媒されるＳＭＡＤ２のパルミトイル化は、主にこれらの２つのＣｙｓ残基で生じることが示唆される。
ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化部位を特定するために、ＳＭＡＤ２の１５個のシステイン残基の各々をセリンに変異させ、各々の変異体のＳ－パルミトイル化状態をＡｌｋ１４標識によって判定した。本発明者らは、Ｃｙｓ４１およびＣｙｓ８１変異体がＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化シグナルを有意に低減させ、Ｃｙｓ４１／８１二重変異体がパルミトイル化シグナルをほとんど有していないことを見出した（図６Ａ～６Ｂ）。ＤＨＨＣ７をノックアウトしてもＳＭＡＤ２ Ｃｙｓ４１／８１Ｓｅｒ変異体のＳ－パルミトイル化が低減しなかったことから（図６Ｃ）、ＤＨＨＣ７に触媒されるＳＭＡＤ２のパルミトイル化は、主にこれらの２つのＣｙｓ残基で生じることが示唆される。
【0087】
Ｓ－パルミトイル化は、タンパク質を細胞膜に向かわせることができ、一方、ＳＭＡＤ２は、ＴＧＦβＲおよびＥＲＫと相互作用するために形質膜および細胞質にそれぞれ動員される必要がある。本発明者らは、Ｓ－パルミトイル化がＳＭＡＤ２の局在に及ぼす影響について研究した。本発明者らは、ＷＴ ＳＭＡＤ２が形質膜、細胞質（おそらく細胞質内の膜オルガネラ）、および核に位置する一方で、ＳＭＡＤ２のＣ４１／８１Ｓ変異体が主に核に位置することを見出した（図６Ｄ～６Ｅ）。さらにまた、ＤＨＨＣ７は、膜および細胞質におけるＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化を増大させたが、核分画におけるＳＭＡＤ２のパルミトイル化は増大させなかった（図６Ｆ）。これによって、パルミトイル化がＳＭＡＤ２の膜および細胞質局在を促進することがさらに裏付けられる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＤＨＨＣ７をノックアウトしたときも、ＳＭＡＤ２の膜局在が低減し、核局在が増大した。これらの知見から、ＤＨＨＣ７に触媒されるＳ－パルミトイル化がＳＭＡＤ２の膜局在を促進することが示される。
【0088】
Ｓ－パルミトイル化はＳＭＡＤ２のＣ末端リン酸化に影響を及ぼさない
ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３の転写活性は、Ｃ末端（ＳＭＡＤ２ではＳｅｒ４６５／Ｓｅｒ４６７、ＳＭＡＤ３ではＳｅｒ４２３／Ｓｅｒ４２５）でのリン酸化によって活性化される。上の、実施例２において、本発明者らは、ＤＨＨＣ７に誘導されるＳ－パルミトイル化が、別の転写因子ＳＴＡＴ３のリン酸化を促進し、その転写活性を促進できることを実証した。よって、本発明者らは、ＳＭＡＤ２のパルミトイル化が同様の効果を有し、パルミトイル化がＳＭＡＤ２のＣ末端Ｓｅｒ４６５／Ｓｅｒ４６７のリン酸化を促進し、その転写活性を活性化し得るという仮説を立てた。本発明者らは、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞においてＨＡタグ付きＤＨＨＣタンパク質とＦＬＡＧタグ付きＳＭＡＤ２とを共発現させると、ＳＭＡＤ２のＣ末端Ｓｅｒ４６５／Ｓｅｒ４６７のリン酸化（ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｃ２））が増大するのかどうかを調べた。驚いたことに、ＤＨＨＣ７はｐ－ＳＭＡＤ２（Ｃ２）レベルを促進しなかった（図７Ａ）。さらに、ＳＭＡＤ２ ＷＴとＳ－パルミトイル化欠損Ｃ４１／８１Ｓ変異体は両方とも、ＤＨＨＣ７発現およびＴＧＦβ処理下で同様のｐ－ＳＭＡＤ２（Ｃ２）レベルを有していた（図７Ｂ～７Ｃ）。したがって、ＤＨＨＣ７に誘導されるＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化は、ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｃ２）レベルに影響を及ぼさない。
ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３の転写活性は、Ｃ末端（ＳＭＡＤ２ではＳｅｒ４６５／Ｓｅｒ４６７、ＳＭＡＤ３ではＳｅｒ４２３／Ｓｅｒ４２５）でのリン酸化によって活性化される。上の、実施例２において、本発明者らは、ＤＨＨＣ７に誘導されるＳ－パルミトイル化が、別の転写因子ＳＴＡＴ３のリン酸化を促進し、その転写活性を促進できることを実証した。よって、本発明者らは、ＳＭＡＤ２のパルミトイル化が同様の効果を有し、パルミトイル化がＳＭＡＤ２のＣ末端Ｓｅｒ４６５／Ｓｅｒ４６７のリン酸化を促進し、その転写活性を活性化し得るという仮説を立てた。本発明者らは、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞においてＨＡタグ付きＤＨＨＣタンパク質とＦＬＡＧタグ付きＳＭＡＤ２とを共発現させると、ＳＭＡＤ２のＣ末端Ｓｅｒ４６５／Ｓｅｒ４６７のリン酸化（ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｃ２））が増大するのかどうかを調べた。驚いたことに、ＤＨＨＣ７はｐ－ＳＭＡＤ２（Ｃ２）レベルを促進しなかった（図７Ａ）。さらに、ＳＭＡＤ２ ＷＴとＳ－パルミトイル化欠損Ｃ４１／８１Ｓ変異体は両方とも、ＤＨＨＣ７発現およびＴＧＦβ処理下で同様のｐ－ＳＭＡＤ２（Ｃ２）レベルを有していた（図７Ｂ～７Ｃ）。したがって、ＤＨＨＣ７に誘導されるＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化は、ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｃ２）レベルに影響を及ぼさない。
【0089】
ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化はＡＰＴ２によって除去される
Ｓ－パルミトイル化は、アシルタンパク質チオエステラーゼ（ＡＰＴ１、ＡＰＴ２、およびＡＢＨＤファミリーメンバー）によって除去することができる。ＡＰＴ２（ＬＹＰＬＡ２、リゾホスホリパーゼ２）は、ＳＴＡＴ３の膜局在の制御に関与しており、脱パルミトイル化基質として非リン酸化ＳＴＡＴ３よりｐ－ＳＴＡＴ３を選好する。本発明者らは、どのアシルタンパク質チオエステラーゼがＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化を制御するのかを調べた。Ｆｌａｇタグ付きＳＭＡＤ２を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、パルモスタチンＢ（汎脱パルミトイル化酵素阻害剤）、ＭＬ３４８（ＡＰＴ１特異的阻害剤）、またはＭＬ３４９（ＡＰＴ２特異的阻害剤）で処理した。本発明者らは、ＭＬ３４９とパルモスタチンＢの両方がＳ－パルミトイル化シグナルを有意に強化するが、ＭＬ３４８はそうではないことを見出した。このことから、ＡＰＴ２がＳＭＡＤ２を脱パルミトイルし得ることが示される（図７Ｄ）。この結果をさらに確認するために、本発明者らは、ＡＰＴ２の触媒活性を伴わない変異体であるＳｅｒ１２２Ａｌａ（Ｓ１２２Ａ）を使用し、Ｓ１２２Ａ変異体ＡＰＴ２が、ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化シグナルを低減できないことを見出した（図７Ｅ～７Ｆ）。これらのデータから、ＡＰＴ２がＳＭＡＤ２を脱パルミトイル化することができることが示唆される。
Ｓ－パルミトイル化は、アシルタンパク質チオエステラーゼ（ＡＰＴ１、ＡＰＴ２、およびＡＢＨＤファミリーメンバー）によって除去することができる。ＡＰＴ２（ＬＹＰＬＡ２、リゾホスホリパーゼ２）は、ＳＴＡＴ３の膜局在の制御に関与しており、脱パルミトイル化基質として非リン酸化ＳＴＡＴ３よりｐ－ＳＴＡＴ３を選好する。本発明者らは、どのアシルタンパク質チオエステラーゼがＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化を制御するのかを調べた。Ｆｌａｇタグ付きＳＭＡＤ２を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、パルモスタチンＢ（汎脱パルミトイル化酵素阻害剤）、ＭＬ３４８（ＡＰＴ１特異的阻害剤）、またはＭＬ３４９（ＡＰＴ２特異的阻害剤）で処理した。本発明者らは、ＭＬ３４９とパルモスタチンＢの両方がＳ－パルミトイル化シグナルを有意に強化するが、ＭＬ３４８はそうではないことを見出した。このことから、ＡＰＴ２がＳＭＡＤ２を脱パルミトイルし得ることが示される（図７Ｄ）。この結果をさらに確認するために、本発明者らは、ＡＰＴ２の触媒活性を伴わない変異体であるＳｅｒ１２２Ａｌａ（Ｓ１２２Ａ）を使用し、Ｓ１２２Ａ変異体ＡＰＴ２が、ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化シグナルを低減できないことを見出した（図７Ｅ～７Ｆ）。これらのデータから、ＡＰＴ２がＳＭＡＤ２を脱パルミトイル化することができることが示唆される。
【0090】
続いて、本発明者らは、ＡＰＴ２が、ＳＴＡＴ３の場合と同様に非リン酸化ＳＭＡＤ２よりｐ－ＳＭＡＤ２を選好するのかどうかを評価した。本発明者らはまず、カルボキシ末端が切断されたＳＭＡＤ２（ΔＣ ＳＭＡＤ２、Ｇｌｕ４２５からＳｅｒ４６７までが切断されたもの）を使用し、ＷＴ ＳＭＡＤ２と比較して、ΔＣ ＳＭＡＤ２がＡＰＴ２の脱パルミトイル化作用を非常に受けにくいことを見出した（図７Ｅ）。これにより、ＡＰＴ２による脱パルミトイル化がＳＭＡＤ２のＣ末端に依存することが示唆された。しかし、ｐ－ＳＴＡＴ３の選好性とは異なり、Ｓｅｒ４６５、Ｓｅｒ４６７のいずれか、またはその両方を変異させてもＡＰＴによる脱パルミトイル化に影響を及ぼさなかったことから、ＡＰＴ２は、ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｃ２）に対して非リン酸化ＳＭＡＤ２より選好性を示さなかった（図７Ｆ）。さらにまた、ＡＰＴ２は、Ｓｅｒ４６５／Ｓｅｒ４６７でのＳＭＡＤ２のリン酸化に有意な影響を及ぼさなかった（図７Ｇ）。よって、ＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２はＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化を制御するが、それらはＣ末端セリンでのＳＭＡＤ２のリン酸化に影響を及ぼさない。
【0091】
ＤＨＨＣ７に誘導されるＳ－パルミトイル化はＳＭＡＤ２のリン酸化をリンカー領域で促進する。
ＤＨＨＣ７に誘導されるＳ－パルミトイル化がＳＭＡＤ２の転写機能を促進するのかどうかを見出すために、本発明者らは、リアルタイムＰＣＲによって下流遺伝子の発現を評価した。本発明者らは、ＷＴ ＤＨＨＣ７とＳＭＡＤ２とを共発現させると、不活性な変異体ＤＨＨＣ７とＳＭＡＤ２との共発現、またはＷＴ ＤＨＨＣ７とＳ－パルミトイル化欠損ＳＭＡＤ２ Ｃ４１／８１Ｓ変異体との共発現より高いＲＯＲＣ発現が誘導されることを見出した（図８Ａ）。これらの結果から、ＤＨＨＣ７に触媒されるＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化は、ＳＭＡＤ２のＣ末端リン酸化レベルが同様であっても、その転写活性に影響を及ぼすことが強く裏付けられる。
ＤＨＨＣ７に誘導されるＳ－パルミトイル化がＳＭＡＤ２の転写機能を促進するのかどうかを見出すために、本発明者らは、リアルタイムＰＣＲによって下流遺伝子の発現を評価した。本発明者らは、ＷＴ ＤＨＨＣ７とＳＭＡＤ２とを共発現させると、不活性な変異体ＤＨＨＣ７とＳＭＡＤ２との共発現、またはＷＴ ＤＨＨＣ７とＳ－パルミトイル化欠損ＳＭＡＤ２ Ｃ４１／８１Ｓ変異体との共発現より高いＲＯＲＣ発現が誘導されることを見出した（図８Ａ）。これらの結果から、ＤＨＨＣ７に触媒されるＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化は、ＳＭＡＤ２のＣ末端リン酸化レベルが同様であっても、その転写活性に影響を及ぼすことが強く裏付けられる。
【0092】
ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３は、アミノ末端（Ｎ末端）のマッドホモロジー１（Ｍａｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－１）（ＭＨ１）ドメイン、リンカー領域、およびＣ末端のＭＨ２ドメインから構成される。リンカー領域（ＳＭＡＤ２ではＳｅｒ２４５／２５０／２５５、ＳＭＡＤ３ではＳｅｒ２０４／２０８／２１３）でのリン酸化もＲ－ＳＭＡＤの転写活性に重要である。本発明者らは、パルミトイル化がリンカー領域でのＳＭＡＤ２のリン酸化（ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３））を制御することができるのかどうかを調べた。興味深いことに、Ｃ末端リン酸化とは異なり、ＳＭＡＤ２ Ｃ４１／８１Ｓ変異体またはＡＰＴ２に誘導される脱パルミトイル化がｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）を減少させたことから、ＳＭＡＤ２のリンカー領域のリン酸化はＤＨＨＣ７によって有意に増大した（図８Ｂ）。ＳＭＡＤ３は、ＳＭＡＤ２と極めて類似しており、同じリンカー領域ドメインを有するが、パルミトイル化されず（図５Ｃ）、そのリンカー領域のリン酸化はＤＨＨＣ７によって影響を受けない（図８Ｃ）。
【0093】
細胞成分分画から、ＤＨＨＣ７をノックアウトすると、ＳＭＡＤ２の細胞質局在が減少するだけでなく、細胞質および核に位置するｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）も減少することが示された（図８Ｄ）。興味深いことに、ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）のＳＭＡＤ２に対する比率は、細胞質分画よりもさらに核分画で減少した（図８Ｄ）。同様に、免疫蛍光検査から、ＤＨＨＣ７発現細胞において、ＳＭＡＤ２がＤＨＨＣ７ノックアウト細胞より高い細胞質局在および高いリン酸化レベルを有することが示された（図８Ｅ）。すべてのデータから、ＤＨＨＣ７に触媒されるＳＭＡＤ２パルミトイル化が、リンカー領域でのＳＭＡＤ２リン酸化を促進することが示唆された。
【0094】
Ｓ－パルミトイル化はＳＭＡＤ２のＳＴＡＴ３およびＳＭＡＤ４への結合を促進する
本発明者らは次に、ＤＨＨＣ７がどのようにＳＭＡＤ２の機能を促進するのかを調査した。ＳＭＡＤ２の転写活性にはＳＭＡＤ４の結合が重要であることから、本発明者らはタンパク質プルダウンアッセイを行い、ＳＭＡＤ２とＳＭＡＤ４の間の相互作用がＤＨＨＣ７に誘導されるＳ－パルミトイル化によって増大し（図９Ａ）、ＳＭＡＤ２とＳＭＡＤ４の結合が触媒的に不活性なＤＨＨＣ７またはＳＭＡＤ２ Ｃｙｓ４１／８１Ｓｅｒ変異体のいずれかによって減少することを見出した（図９Ｂ）。
本発明者らは次に、ＤＨＨＣ７がどのようにＳＭＡＤ２の機能を促進するのかを調査した。ＳＭＡＤ２の転写活性にはＳＭＡＤ４の結合が重要であることから、本発明者らはタンパク質プルダウンアッセイを行い、ＳＭＡＤ２とＳＭＡＤ４の間の相互作用がＤＨＨＣ７に誘導されるＳ－パルミトイル化によって増大し（図９Ａ）、ＳＭＡＤ２とＳＭＡＤ４の結合が触媒的に不活性なＤＨＨＣ７またはＳＭＡＤ２ Ｃｙｓ４１／８１Ｓｅｒ変異体のいずれかによって減少することを見出した（図９Ｂ）。
【0095】
リンカー領域のＳｅｒ２５５がＥＲＫによってリン酸化されたＳＭＡＤ２は、ＲＯＲγｔおよびＩＬ－１７Ａを発現する際にＳＴＡＴ３の共活性化因子としての役割を果たす。本発明者らは、パルミトイル化がＳＭＡＤ２－ＳＴＡＴ３結合を促すことができるのかどうかを調べた。ＤＨＨＣ７は、ＳＭＡＤ２／ＳＴＡＴ３複合体の形成を誘導したが、触媒的に不活性なＤＨＨＣ７またはＳＭＡＤ２ Ｃｙｓ４１／８１Ｓｅｒ変異体は、複合体の形成を減少させた（図９Ｃ～９Ｄ）。同様に、免疫蛍光検査から、ＤＨＨＣ７発現細胞においてＳＭＡＤ２はＤＨＨＣ７ノックアウト細胞より多くのＳＴＡＴ３との細胞質および核の共局在を有することが示され、それによってＤＨＨＣ７がＳＭＡＤ２とＳＴＡＴ３の間の相互作用を促進することが示唆された（図９Ｅ）。ＳＭＡＤ２ではリンカー領域に３つのリン酸化部位（Ｓｅｒ２４５／２５０／２５５）が存在することから、本発明者らは、どの部位がＳＭＡＤ２／ＳＴＡＴ３複合体の形成の鍵となる部位なのかを変異誘発によって確認した。本発明者らは、ＳＭＡＤ２のＳｅｒ２５５Ａｌａ変異体がＳＴＡＴ３との親和性を有意に減少させることを見出した（図９Ｆ）。本発明者らは最後に、リアルタイムＰＣＲによるＲＯＲＣ発現を評価し、ＷＴ ＳＭＡＤ２が、ＳＴＡＴ３に結合したＣｙｓ４１／８１Ｓｅｒ変異体ＳＭＡＤ２と比較してＲＯＲＣの発現を促進することを見出した（図９Ｇ）。これらのデータから、ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化は、ＳＭＡＤ２リンカー領域のリン酸化を促進することによって、ＳＭＡＤ４およびＳＴＡＴ３との結合を促すことのさらなる裏付けが提供される。
【0096】
ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化サイクルはＴＨ１７細胞の分化を促進する
ＳＭＡＤ２およびそのＳＴＡＴ３との結合がナイーブＴ細胞からＴＨ１７細胞への分化に鍵となる役割を果たしていることを考慮して、本発明者らは、ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化がＴＨ１７細胞の産生を制御できるかをマウス脾細胞で調べた。上の実施例３のデータから、ＳＴＡＴ３パルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルが、ＳＴＡＴ３の活性およびＴＨ１７細胞の分化に重要であることが示されている。よって、本発明者らは、同様のパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルもＳＭＡＤ２の活性を制御し、ＴＨ１７の分化に寄与しているのではないかと考えた。ＷＴ ＳＭＡＤ２と比較して、脾細胞におけるＣ４１／８１Ｓ ＳＭＡＤ２は、減少したｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）を示した（図１０Ａ）。Ｚｄｈｈｃ７をノックアウトすると、ＷＴ ＳＭＡＤ２とＣ４１／８１Ｓ ＳＭＡＤ２の両方でｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）が減少した（図１０Ａ）。Ｚｄｈｈｃ７のノックアウトがｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）Ｃ４１／８１Ｓも減少させたという事実から、ＤＨＨＣ７は、リンカー領域におけるＳＭＡＤ２のリン酸化に寄与し得る他の基質を有する可能性があることが示唆される。ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）レベルと一致して、ＴＨ１７細胞の分化レベルは、Ｃ４１／８１Ｓ変異体またはＺｄｈｈｃ７ノックアウトのいずれによっても阻害された（図１０Ｂ）。Ｚｄｈｈｃ７のノックアウトは、ＳＭＡＤ２ Ｃ４１／８１Ｓ変異体に弱い作用を及ぼした。これはおそらく、前に示したようにＤＨＨＣ７がＴＨ１７の分化に重要な別の因子であるＳＴＡＴ３も制御するからであると思われる。ＡＰＴ２をノックアウトすると、ＷＴ ＡＰＴと比較して、脾細胞におけるｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）がわずかに増加したが、その相違は統計的に有意ではなかった（図１０Ｃ）。興味深いことに、ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）レベルとは異なり、ＡＰＴ２をノックアウトすると、ＷＴまたはＣ４１／８１Ｓ変異体ＳＭＡＤ２を過剰発現する脾細胞（図１０Ｄ）におけるＴＨ１７細胞の分化が阻害された。本発明者らは次に、ＳＭＡＤ２／ＳＴＡＴ３複合体の形成を評価した。Ｚｄｈｈｃ７をノックアウトすると、ＳＭＡＤ２とＳＴＡＴ３の間の結合が減少した（図１０Ｅ）。パルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルが重要であるという考えと一致して、ＡＰＴ２をノックアウトするとＳＭＡＤ２－ＳＴＡＴ３結合も減少し、これはＴＨ１７細胞の分化の結果とも一致する（図１０Ｆ）。上のデータから、ＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２によって触媒されるパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルが、ＳＭＡＤ２－ＳＴＡＴ３結合およびＴＨ１７の分化の促進に有意な役割を果たしていることが示唆される。
ＳＭＡＤ２およびそのＳＴＡＴ３との結合がナイーブＴ細胞からＴＨ１７細胞への分化に鍵となる役割を果たしていることを考慮して、本発明者らは、ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化がＴＨ１７細胞の産生を制御できるかをマウス脾細胞で調べた。上の実施例３のデータから、ＳＴＡＴ３パルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルが、ＳＴＡＴ３の活性およびＴＨ１７細胞の分化に重要であることが示されている。よって、本発明者らは、同様のパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルもＳＭＡＤ２の活性を制御し、ＴＨ１７の分化に寄与しているのではないかと考えた。ＷＴ ＳＭＡＤ２と比較して、脾細胞におけるＣ４１／８１Ｓ ＳＭＡＤ２は、減少したｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）を示した（図１０Ａ）。Ｚｄｈｈｃ７をノックアウトすると、ＷＴ ＳＭＡＤ２とＣ４１／８１Ｓ ＳＭＡＤ２の両方でｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）が減少した（図１０Ａ）。Ｚｄｈｈｃ７のノックアウトがｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）Ｃ４１／８１Ｓも減少させたという事実から、ＤＨＨＣ７は、リンカー領域におけるＳＭＡＤ２のリン酸化に寄与し得る他の基質を有する可能性があることが示唆される。ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）レベルと一致して、ＴＨ１７細胞の分化レベルは、Ｃ４１／８１Ｓ変異体またはＺｄｈｈｃ７ノックアウトのいずれによっても阻害された（図１０Ｂ）。Ｚｄｈｈｃ７のノックアウトは、ＳＭＡＤ２ Ｃ４１／８１Ｓ変異体に弱い作用を及ぼした。これはおそらく、前に示したようにＤＨＨＣ７がＴＨ１７の分化に重要な別の因子であるＳＴＡＴ３も制御するからであると思われる。ＡＰＴ２をノックアウトすると、ＷＴ ＡＰＴと比較して、脾細胞におけるｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）がわずかに増加したが、その相違は統計的に有意ではなかった（図１０Ｃ）。興味深いことに、ｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）レベルとは異なり、ＡＰＴ２をノックアウトすると、ＷＴまたはＣ４１／８１Ｓ変異体ＳＭＡＤ２を過剰発現する脾細胞（図１０Ｄ）におけるＴＨ１７細胞の分化が阻害された。本発明者らは次に、ＳＭＡＤ２／ＳＴＡＴ３複合体の形成を評価した。Ｚｄｈｈｃ７をノックアウトすると、ＳＭＡＤ２とＳＴＡＴ３の間の結合が減少した（図１０Ｅ）。パルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルが重要であるという考えと一致して、ＡＰＴ２をノックアウトするとＳＭＡＤ２－ＳＴＡＴ３結合も減少し、これはＴＨ１７細胞の分化の結果とも一致する（図１０Ｆ）。上のデータから、ＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２によって触媒されるパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルが、ＳＭＡＤ２－ＳＴＡＴ３結合およびＴＨ１７の分化の促進に有意な役割を果たしていることが示唆される。
【0097】
ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化を阻害すると多発性硬化症マウスモデルにおけるＴｈ１７細胞の分化および炎症が減弱する。
ＴＨ１７の炎症誘発性の役割が多発性硬化症の病理発生に寄与することは良く知られている。ＳＭＡＤ２のパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルを標的化することがＴＨ１７を促進し、炎症を悪化させることになることをさらに試験するために、本発明者らは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ３５－５５）に誘導される実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウス（ＭＳの古典的実験モデル）におけるＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２ノックアウトの作用を研究した。ＭＯＧ３５－５５および百日咳毒素を投与してＥＡＥを誘導した後、ＷＴ、ＤＨＨＣ７ノックアウト、またはＡＰＴ２ノックアウトマウスにおいて体重に有意な低減がなかった（図１１Ａ）。続いて、本発明者らは、マウスの臨床症状をスコア化し、ＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２ノックアウトマウスが両方とも、ＷＴマウスと比較して低い臨床スコアを有していたことを見出した（図１１Ｂ）。さらにまた、インビトロでのデータと一致して（図９Ｃ～９Ｄ）、ＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２ノックアウトは両方ともマウス脾臓におけるＴＨ１７の分化をそれぞれ減少させた（図１１Ｃ）。これらの知見から、ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化がＭＳマウスの炎症を防止するのに有効な標的であることが示される。
ＴＨ１７の炎症誘発性の役割が多発性硬化症の病理発生に寄与することは良く知られている。ＳＭＡＤ２のパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルを標的化することがＴＨ１７を促進し、炎症を悪化させることになることをさらに試験するために、本発明者らは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ３５－５５）に誘導される実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウス（ＭＳの古典的実験モデル）におけるＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２ノックアウトの作用を研究した。ＭＯＧ３５－５５および百日咳毒素を投与してＥＡＥを誘導した後、ＷＴ、ＤＨＨＣ７ノックアウト、またはＡＰＴ２ノックアウトマウスにおいて体重に有意な低減がなかった（図１１Ａ）。続いて、本発明者らは、マウスの臨床症状をスコア化し、ＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２ノックアウトマウスが両方とも、ＷＴマウスと比較して低い臨床スコアを有していたことを見出した（図１１Ｂ）。さらにまた、インビトロでのデータと一致して（図９Ｃ～９Ｄ）、ＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２ノックアウトは両方ともマウス脾臓におけるＴＨ１７の分化をそれぞれ減少させた（図１１Ｃ）。これらの知見から、ＳＭＡＤ２のＳ－パルミトイル化がＭＳマウスの炎症を防止するのに有効な標的であることが示される。
【0098】
ＴＧＦβ受容体の直接基質としての制御型ＳＭＡＤ（Ｒ－ＳＭＡＤ）は、核－細胞質シャトリングを受け、ＴＧＦβシグナル伝達に重大な役割を果たす。多くの翻訳後修飾がこの過程に関与する。例えば、Ｒ－ＳＭＡＤの活性化にはＣＯＯＨ末端尾部のリン酸化が重大であり、リンカー領域のリン酸化は機能的なＤＮＡ結合転写因子との複合体形成に不可欠である。ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３は多くの共通の機能を共有しているが、それらはＴ細胞の分化においては相反する役割を有しており、ＳＭＡＤ２はＴＨ１７を促進するが、ＳＭＡＤ３はＴｒｅｇを促進する。細胞がこれらの２つの類似したＲ－ＳＭＡＤをどのように制御して一方または他方のＴ細胞分化過程を有利に行うのかは未だに不明瞭である。本開示において、本発明者らは、ＳＭＡＤ２はパルミトイル化されるがＳＭＡＤ３はパルミトイル化されず、パルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルが、核－細胞質シャトリングおよびＣｏ－ＳＭＡＤ（ＳＭＡＤ４）およびＳＴＡＴ３とのその結合を促すことを見出した。本研究から、ＳＭＡＤ２のパルミトイル化はリンカー領域でのそのリン酸化を促進するが、ＴＨ１７の分化に活性であるためには、それがＳＴＡＴ３と結合し、ＡＰＴによって脱パルミトイル化されて核に移行しなければならないことが実証された。本研究の結果から、Ｓ－パルミトイル化サイクルが、多発性硬化症マウスモデルにおいてナイーブＴ細胞をＴｒｅｇ細胞ではなくＴｈ１７細胞に分化するように駆動し、炎症を促進することが示された。
【0099】
パルミトイル化の細胞内動態は、保存されたＡｓｐ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｃｙｓ配列モチーフの存在によって定義される、ＤＨＨＣとして知られる２３種のパルミトイルトランスフェラーゼのファミリーによって制御される。ほとんどのＤＨＨＣ酵素は、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体の膜、および形質膜を含めた細胞膜に局在する。Ｓ－パルミトイル化は、アシルタンパク質チオエステラーゼ（ＡＰＴ１、ＡＰＴ２、およびＡＢＨＤファミリーメンバー）によって除去される。すべてのＤＨＨＣおよびＡＰＴをスクリーニングして、本発明者らは、ＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２がＳＭＡＤ２のパルミトイル化および脱パルミトイル化をそれぞれ触媒し、ＴＨ１７細胞の分化を促進することを見出した。しかし、ＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２に触媒されるＳＭＡＤ２のパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルがＳＭＡＤ２のリン酸化および生物学的機能をどのように制御するのかについての機構的な詳細は、ＳＴＡＴ３のそれとは異なっている。ＤＨＨＣ７は、ＳＴＡＴ３をＮ末端（Ｃｙｓ１０８）でパルミトイル化し、膜動員およびＣ末端（Ｔｙｒ７０５）でのリン酸化を促進する。ＡＰＴ２は、リン酸化されたＳＴＡＴ３（ｐ－ＳＴＡＴ３）の方に高い親和性を有し、それを脱パルミトイル化して、それを核へ移行させる。ここで、本発明者らは、ＤＨＨＣ７がＳＭＡＤ２をパルミトイル化するが、ＴＧＦｂＲに媒介されるＳＭＡＤ２のＣ末端でのリン酸化を促進しないことを見出した。その代わりに、パルミトイル化は、ＥＲＫによって触媒されるリンカー領域でのＳＭＡＤ２のリン酸化を促進する。ＳＭＡＤ２の脱パルミトイル化の場合、ＡＰＴ２は、それがリン酸化されたＳＴＡＴ３を選好するのとは異なり、Ｃ末端でリン酸化されたＳＭＡＤ２（Ｓｅｒ４６５／Ｓｅｒ４６７）を選好しない。本発明者らは、ＳＴＡＴ３が、ＳＭＡＤ２のパートナーとして、リンカーリン酸化ＳＭＡＤ２と優先的に結合し、核へ移行してＲＯＲＣおよびＩＬ１７Ａ遺伝子を促進することを見出した。ＳＭＡＤ２－ＳＴＡＴ３複合体の核移行は、ＡＰＴ２に触媒される脱パルミトイル化によって促進される。本発明者らは、Ｓｅｒ２５５でのリン酸化が、ＳＭＡＤ２とＳＴＡＴ３の間の結合を促進する主要なリン酸化部位であることを確認した。これは、ＤＨＨＣ７およびＡＰＴ２によって制御されるパルミトイル化－脱パルミトイル化サイクルが、ＳＭＡＤ２－ＳＴＡＴ３複合体を活性化してＴＨ１７の分化を促進することを表している。
【0100】
ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３は高度に相同であり、同じ上流のシグナル伝達経路および多くの下流のシグナル伝達の結果さえ共有しているが、それらは、Ｔ細胞の分化の過程では相反してＴＨ１７およびＴｒｅｇ細胞をそれぞれ促進する。前の報告から、ＴＨ１７の分化の促進におけるＳＭＡＤ２のリンカーリン酸化の重要な役割が解明されたが、ナイーブＴ細胞が非リン酸化ＳＭＡＤ３ではなくｐ－ＳＭＡＤ２（Ｌ３）とのＳＴＡＴ３の相互作用をどのように制御しているのかは未対応の問題である。本研究から、ＤＨＨＣ７に触媒されるＳ－パルミトイル化が、Ｔｒｅｇを抑制しながらＴＨ１７を促進する機構であり得ることが示唆される。なぜなら、データから、ＳＭＡＤ２はＤＨＨＣ７によってパルミトイル化されるが、ＳＭＡＤ３はパルミトイル化されないことが示唆されたからである。本発明者らは、より活性なＤＨＨＣ７を有するナイーブＴ細胞では、ＳＭＡＤ２がパルミトイル化され、リンカー領域でリン酸化され、ＳＴＡＴ３と結合し、ＴＨ１７経路を促進するのであろうと推測する。対照的に、ＤＨＨＣ７が存在しないときは、ＳＭＡＤ３がＳＴＡＴ３と複合体を形成し、それによってＴｒｅｇの分化が有利になるのであろう。
【0101】
ＴＧＦβに誘導されるＳＭＡＤ２は、ＩＬ－１７の発現によって特徴付けられる炎症誘発性ＴＨ１７細胞において、重要な転写因子として作用する。ＴＨ１７細胞は、ＭＳ患者に数多く存在し、再発中にはさらに増加する。よって、ＴＨ１７軸からの細胞は、ＭＳ治療薬の主要な標的となる。興味深いことに、ＭＳ患者からの循環ＣＤ４＋Ｔ細胞では、健常な対照と比較して、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、およびＳＭＡＤ４の遺伝子発現に差がないことが観察された。これらから、ＳＭＡＤ２の翻訳後の制御がＭＳの病理発生に極めて重要であり得ることが示唆された。Ｓ－パルミトイル化がＴＨ１７の分化におけるＳＭＡＤ２の役割を促進することを発見した後、本発明者らは、ＭＳのＥＡＥモデルにおいて、ＤＨＨＣ７またはＡＰＴ２を標的化することによってＳＭＡＤ２－ＳＴＡＴ３結合を撹乱すると、ＴＨ１７細胞の分化が阻害され、マウスが保護されることをさらに実証した。これらの結果から、ＳＭＡＤ２／ＳＴＡＴ３のＳ－パルミトイル化を標的化することが有望なＭＳ治療方針であることが示唆される。ＴＨ１７細胞が、種々の自己免疫疾患（ＩＢＤ、関節炎、１型糖尿病など）だけでなく、がん、移植片対宿主病、および感染性疾患にも重要な役割を果たしていることを考慮すると、ＤＨＨＣ７－ＡＰＴ２に制御されるパルミトイル化サイクルは、種々の疾患に対する新たな洞察および治療戦略を提供することが予想される。
【実施例5】
【0102】
汎ＤＨＨＣ阻害剤である２－ＢＰは、インフラマソームを活性化するプライミング段階でのサイトカインｍＲＮＡの発現を減少させる
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）で処理した。これは、ＢＭＤＭを抗原刺激してインフラマソームを活性化することができる。パルミトイルトランスフェラーゼ（ＤＨＨＣ）のすべてのＤＨＨＣファミリーを阻害する小分子である２－ブロモパルミチン酸（２－ＢＰ）をＬＰＳと共に１０μＭまたは２５μＭで添加した。細胞をＬＰＳおよび２－ＢＰと共に６時間培養し、次いで幾つかの炎症誘発性サイトカイン：ＩＬ－１ベータ（図１２Ａ）、ＩＬ－６（図１２Ｂ）、ＩＬ－１２ベータ（図１２Ｃ）、およびＩＬ－１８（図１２Ｄ）のｍＲＮＡレベルを定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって測定した。２－ＢＰは、すべてのこれらのサイトカインのｍＲＮＡレベルを濃度依存的に減少させることができ、そのことからＤＨＨＣを阻害するとインフラマソームを活性化するプライミング段階を減少させることができることが示唆される。
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）で処理した。これは、ＢＭＤＭを抗原刺激してインフラマソームを活性化することができる。パルミトイルトランスフェラーゼ（ＤＨＨＣ）のすべてのＤＨＨＣファミリーを阻害する小分子である２－ブロモパルミチン酸（２－ＢＰ）をＬＰＳと共に１０μＭまたは２５μＭで添加した。細胞をＬＰＳおよび２－ＢＰと共に６時間培養し、次いで幾つかの炎症誘発性サイトカイン：ＩＬ－１ベータ（図１２Ａ）、ＩＬ－６（図１２Ｂ）、ＩＬ－１２ベータ（図１２Ｃ）、およびＩＬ－１８（図１２Ｄ）のｍＲＮＡレベルを定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって測定した。２－ＢＰは、すべてのこれらのサイトカインのｍＲＮＡレベルを濃度依存的に減少させることができ、そのことからＤＨＨＣを阻害するとインフラマソームを活性化するプライミング段階を減少させることができることが示唆される。
【0103】
２－ＢＰがＮＬＲＰ３に媒介されるインフラマソームの活性化に影響を及ぼす
腹膜マクロファージを最初にＤＭＥＭ培地（血清を有しない）中ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）で４時間抗原刺激し、次いで２－ＢＰ（２５μＭ）およびＡＴＰ（５ｍＭ）またはナイジェリシン（１０μＭ）を細胞培養物に添加し、１時間インキュベートした。ＡＴＰおよびナイジェリシンは、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化するのに汎用される２種の試薬である。次いで、培地に分泌されるＩＬ－１ベータのレベルを測定することによってＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化をモニタリングした（図１３）。このデータから、ＤＨＨＣを２－ＢＰで阻害するとＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化が減少し得ることが裏付けられる。
腹膜マクロファージを最初にＤＭＥＭ培地（血清を有しない）中ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）で４時間抗原刺激し、次いで２－ＢＰ（２５μＭ）およびＡＴＰ（５ｍＭ）またはナイジェリシン（１０μＭ）を細胞培養物に添加し、１時間インキュベートした。ＡＴＰおよびナイジェリシンは、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化するのに汎用される２種の試薬である。次いで、培地に分泌されるＩＬ－１ベータのレベルを測定することによってＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化をモニタリングした（図１３）。このデータから、ＤＨＨＣを２－ＢＰで阻害するとＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化が減少し得ることが裏付けられる。
【0104】
ＤＨＨＣ７をノックアウトするとインフラマソームの活性化中に骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）でのＩＬ－１ｂおよびＩＬ－１８の分泌が減少する。
ＤＨＨＣ７ ＷＴおよびノックアウトＢＭＤＭをＤＥＭＥ培地中ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）で一晩抗原刺激した。翌日、この培地をＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＡＴＰ（５ｍＭ）を有するＤＭＥＭ、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびナイジェリシン（１０μＭ）を有するＤＭＥＭに変え、１時間インキュベートしてＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化した。次いで培地を収集して、ＥＬＩＳＡキットを使用して分泌されたＩＬ－１ベータ（図１４Ａ）およびＩＬ－１８（図１４Ｂ）を測定した。その結果から、ＤＨＨＣ７をノックアウトするとＮＬＲＰ３インフラマソームの活性が有意に減少し得ることが示された。
ＤＨＨＣ７ ＷＴおよびノックアウトＢＭＤＭをＤＥＭＥ培地中ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）で一晩抗原刺激した。翌日、この培地をＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＡＴＰ（５ｍＭ）を有するＤＭＥＭ、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびナイジェリシン（１０μＭ）を有するＤＭＥＭに変え、１時間インキュベートしてＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化した。次いで培地を収集して、ＥＬＩＳＡキットを使用して分泌されたＩＬ－１ベータ（図１４Ａ）およびＩＬ－１８（図１４Ｂ）を測定した。その結果から、ＤＨＨＣ７をノックアウトするとＮＬＲＰ３インフラマソームの活性が有意に減少し得ることが示された。
【0105】
ＡＰＴ２をノックアウトしてもインフラマソームの活性化中にＢＭＤＭでのＩＬ－１ｂの分泌にわずかな影響しか及ぼさない。
ＡＰＴ２ ＷＴおよびノックアウトＢＭＤＭをＤＥＭＥ培地中ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）で４時間抗原刺激した。次いで、この培地をＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）およびＡＴＰ（５ｍＭ）を有するＤＭＥＭ、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびナイジェリシン（１０μＭ）を有するＤＭＥＭに変え、１時間インキュベートしてＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化した。次いで培地を収集し、ＥＬＩＳＡキットを使用して分泌されたＩＬ－１ベータを測定した。その結果から、ＡＰＴ２をノックアウトしてもＮＬＲＰ３インフラマソームの活性が減少し得るが、ＤＨＨＣ７のノックアウトと比較して少ないことが示された（図１５）。
ＡＰＴ２ ＷＴおよびノックアウトＢＭＤＭをＤＥＭＥ培地中ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）で４時間抗原刺激した。次いで、この培地をＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）およびＡＴＰ（５ｍＭ）を有するＤＭＥＭ、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびナイジェリシン（１０μＭ）を有するＤＭＥＭに変え、１時間インキュベートしてＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化した。次いで培地を収集し、ＥＬＩＳＡキットを使用して分泌されたＩＬ－１ベータを測定した。その結果から、ＡＰＴ２をノックアウトしてもＮＬＲＰ３インフラマソームの活性が減少し得るが、ＤＨＨＣ７のノックアウトと比較して少ないことが示された（図１５）。
【0106】
ＤＨＨＣ７をノックアウトするとマウスにおいてインフラマソームの活性化：ＬＰＳに誘導される内毒素性ショックが減少する。
成体（＞８週齢）のＢ６．１２９Ｐ２（ＦＶＢ）ＤＨＨＣ７ ＷＴまたはノックアウトマウスに滅菌ＰＢＳ緩衝液中ＬＰＳ（３５ｍｇ／ｋｇ）約１００μＬを腹腔内注入した。１２時間後に、マウスを安楽死させ、血清中のＩＬ－１ベータレベルを分析するために血液を収集した。ＤＨＨＣ７をノックアウトすると血清に分泌されたＩＬ－１ベータの量が有意に減少し、そのことからＤＨＨＣ７をノックアウトするとマウスにおけるインフラマソームの活性化が減少することが示唆された（図１６）。
成体（＞８週齢）のＢ６．１２９Ｐ２（ＦＶＢ）ＤＨＨＣ７ ＷＴまたはノックアウトマウスに滅菌ＰＢＳ緩衝液中ＬＰＳ（３５ｍｇ／ｋｇ）約１００μＬを腹腔内注入した。１２時間後に、マウスを安楽死させ、血清中のＩＬ－１ベータレベルを分析するために血液を収集した。ＤＨＨＣ７をノックアウトすると血清に分泌されたＩＬ－１ベータの量が有意に減少し、そのことからＤＨＨＣ７をノックアウトするとマウスにおけるインフラマソームの活性化が減少することが示唆された（図１６）。
【0107】
ループス腎炎マウスモデル：ＡＰＴ２阻害剤ＭＬ３４９がマウスの尿中のタンパク質濃度を減少させる。
２５週齢のＮＺＢ／Ｗ Ｆ１雌マウスにビヒクル溶液（ＤＭＳＯ＋ＰＢＳ）または２５ｍｇ／ＫｇのＡＰＴ２阻害剤ＭＬ３４９のいずれかを週３回、ＩＰ注射によって８週間投与した。４週間処理した後に、尿を収集し、尿中のタンパク質濃度を測定することによるタンパク尿分析を通して、マウスをループス発症率について毎週評価した。このデータから、ＡＰＴ２阻害剤ＭＬ３４９は尿中のタンパク質濃度を減少させることができることが示された（図１７Ａ～１７Ｂ）。本発明者らがこの実験を行ったのはこれが初めてであり、実験の開始後、本発明者らは、この疾患の表現型が２５週目ですでに極めて重度であることに気が付いた。ＭＬ３４９の治療をより早く始めていれば、その効果はより明白で顕著であり得たと予想される。
２５週齢のＮＺＢ／Ｗ Ｆ１雌マウスにビヒクル溶液（ＤＭＳＯ＋ＰＢＳ）または２５ｍｇ／ＫｇのＡＰＴ２阻害剤ＭＬ３４９のいずれかを週３回、ＩＰ注射によって８週間投与した。４週間処理した後に、尿を収集し、尿中のタンパク質濃度を測定することによるタンパク尿分析を通して、マウスをループス発症率について毎週評価した。このデータから、ＡＰＴ２阻害剤ＭＬ３４９は尿中のタンパク質濃度を減少させることができることが示された（図１７Ａ～１７Ｂ）。本発明者らがこの実験を行ったのはこれが初めてであり、実験の開始後、本発明者らは、この疾患の表現型が２５週目ですでに極めて重度であることに気が付いた。ＭＬ３４９の治療をより早く始めていれば、その効果はより明白で顕著であり得たと予想される。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】