特表 2023-522985 ＨＬＡクラスＩ ＭＨＣの細胞切除

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-01

(54)【発明の名称】ＨＬＡクラスＩ ＭＨＣの細胞切除

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/867 20060101AFI20230525BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230525BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20230525BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20230525BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20230525BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230525BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20230525BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230525BHJP

【ＦＩ】

C12N15/867 Z

C12N15/63 Z ZNA

C12N15/113 Z

C12N5/10

C12N15/12

C12N5/0783

C12N5/0789

C12N15/85 Z

A61P29/00

A61P37/06

A61K35/17

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022564243

(86)(22)【出願日】2021-04-23

(85)【翻訳文提出日】2022-12-20

(86)【国際出願番号】 US2021028808

(87)【国際公開番号】W WO2021216978

(87)【国際公開日】2021-10-28

(31)【優先権主張番号】63/014,344

(32)【優先日】2020-04-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518174569

【氏名又は名称】エーゼットセラピーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】アシュトン－リッカルト， フィリップ ジー．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA05

4C087NA14

4C087ZB08

4C087ZB11

(57)【要約】

本発明は、細胞ベースの免疫療法を含む、移植用の細胞の免疫原性を低減するための組成物および方法を提供する。標的化部分ならびに他のシグナル伝達および／または自殺遺伝子とともに、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）改変ＲＮＡをコードするベクターは、操作されたＣＡＲ Ｔ制御性細胞または任意の供給源に由来する他の治療用細胞の効率的生成を可能にする。本発明は、例えば、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）改変ＲＮＡ；およびキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）、をコードするベクターを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）改変ＲＮＡ；および
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）、
をコードするベクター。

【請求項2】

前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、請求項１に記載のベクター。

【請求項3】

前記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、請求項１に記載のベクター。

【請求項4】

前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされる、請求項３に記載のベクター。

【請求項5】

前記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む、請求項１に記載のベクター。

【請求項6】

前記ｓｈＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされ、１またはこれより多くのヘアピンループ配列は、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされる、請求項５に記載のベクター。

【請求項7】

形質導入した細胞におけるＢ２Ｍ発現を、野生型と比較して少なくとも７５％ノックダウンするように操作可能な、請求項１に記載のベクター。

【請求項8】

形質導入した細胞におけるＢ２Ｍ発現を、野生型と比較して少なくとも８０％ノックダウンするように操作可能な、請求項１に記載のベクター。

【請求項9】

形質導入した細胞におけるＢ２Ｍ発現を、野生型と比較して少なくとも８５％ノックダウンするように操作可能な、請求項１に記載のベクター。

【請求項10】

形質導入した細胞におけるＢ２Ｍ発現を、野生型と比較して少なくとも９０％ノックダウンするように操作可能な、請求項１に記載のベクター。

【請求項11】

形質導入した細胞におけるＢ２Ｍ発現を、野生型と比較して少なくとも９５％ノックダウンするように操作可能な、請求項１に記載のベクター。

【請求項12】

前記ＣＡＲは、グリア細胞マーカーを特異的に結合する、請求項１に記載のベクター。

【請求項13】

前記ＣＡＲは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）マーカーを特異的に結合する、請求項１に記載のベクター。

【請求項14】

前記ＣＡＲは、Ｔヘルパー１細胞（Ｔｈ１）マーカーを特異的に結合する、請求項１に記載のベクター。

【請求項15】

前記ＣＡＲは、Ｔヘルパー１７細胞（Ｔｈ１７）マーカーを特異的に結合する、請求項１に記載のベクター。

【請求項16】

前記ＣＡＲは、膵島細胞、膵臓β細胞、心筋細胞、単球、マクロファージ、骨髄系細胞、腸細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、腎臓ポドサイト、腎臓尿細管細胞、上皮細胞、唾液腺細胞、肺細胞、線維芽細胞、結合組織細胞、ランゲルハンス細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、皮膚細胞、毛包細胞、および毛球細胞からなる群より選択される細胞に特異的なマーカーに特異的に結合する、請求項１に記載のベクター。

【請求項17】

自殺遺伝子をさらにコードする、請求項１に記載のベクター。

【請求項18】

ＰＥＴレポーター遺伝子をさらにコードする、請求項１に記載のベクター。

【請求項19】

ＴＫ自殺／ＰＥＴレポーター遺伝子をさらにコードする、請求項１に記載のベクター。

【請求項20】

β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）改変ＲＮＡおよびキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードするベクターで形質導入された、操作された細胞。

【請求項21】

前記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項22】

前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされる、請求項２１に記載の操作された細胞。

【請求項23】

前記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項24】

前記ｓｈＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされ、１またはこれより多くのヘアピンループ配列は、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされる、請求項２３に記載の操作された細胞。

【請求項25】

等価な野生型細胞のＢ２Ｍ発現の２５％またはこれ未満のＢ２Ｍ発現を有する、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項26】

等価な野生型細胞のＢ２Ｍ発現の２０％またはこれ未満のＢ２Ｍ発現を有する、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項27】

等価な野生型細胞のＢ２Ｍ発現の１５％またはこれ未満のＢ２Ｍ発現を有する、 請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項28】

等価な野生型細胞のＢ２Ｍ発現の１０％またはこれ未満のＢ２Ｍ発現を有する、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項29】

等価な野生型細胞のＢ２Ｍ発現の５％またはこれ未満のＢ２Ｍ発現を有する、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項30】

前記ＣＡＲは、ＣＮＳグリア細胞マーカーを特異的に結合する、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項31】

前記ＣＡＲは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）マーカーを特異的に結合する、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項32】

前記ＣＡＲは、Ｔヘルパー１細胞（Ｔｈ１）マーカーを特異的に結合する、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項33】

前記ＣＡＲは、Ｔヘルパー１７細胞（Ｔｈ１７）マーカーを特異的に結合する、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項34】

前記ＣＡＲは、膵島細胞、膵臓β細胞、心筋細胞、単球、マクロファージ、骨髄系細胞、腸細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、腎臓ポドサイト、腎臓尿細管細胞、上皮細胞、唾液腺細胞、肺細胞、線維芽細胞、結合組織細胞、ランゲルハンス細胞。ケラチノサイト、メラノサイト、皮膚細胞、毛包細胞、および毛球細胞、希突起膠細胞、星状細胞、ミクログリア細胞からなる群より選択される細胞に特異的なマーカーに特異的に結合する、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項35】

前記細胞は、幹細胞およびリンパ球からなる群より選択される、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項36】

前記細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項37】

前記細胞は、被験体における同種異系移植片のドナーに由来する、請求項２０に記載の操作された細胞。

【請求項38】

被験体において自己免疫疾患または炎症性疾患を処置する方法であって、前記方法は、治療上有効な量の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を前記被験体に投与することを包含し、それぞれが、被験体における免疫応答を抑制する様式で、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）改変ＲＮＡおよび細胞の表面上のリガンドを特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現し、それによって、前記被験体において前記自己免疫疾患または炎症性疾患を処置する方法。

【請求項39】

前記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされる、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項42】

前記ｓｈＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされ、１またはこれより多くのヘアピンループ配列は、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされる、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記Ｔｒｅｇは、野生型ＴｒｅｇのＢ２Ｍ発現の２５％またはこれ未満のＢ２Ｍ発現を有する、請求項３８に記載の方法。

【請求項44】

前記被験体は、ヒトである、請求項３８に記載の方法。

【請求項45】

前記Ｔｒｅｇは、自家ではない、請求項３８に記載の方法。

【請求項46】

前記細胞は、グリア細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ｔヘルパー１細胞（Ｔｈ１）、およびＴヘルパー１７細胞（Ｔｈ１７）からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。

【請求項47】

β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）改変ＲＮＡをコードするベクターであって、前記ベクターの配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される配列を含む、ベクター。

【請求項48】

前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、請求項４７に記載のベクター。

【請求項49】

前記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、請求項４７に記載のベクター。

【請求項50】

前記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む、請求項４７に記載のベクター。

【請求項51】

前記ｓｈＲＮＡは、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされる１またはこれより多くのヘアピンループ配列を含む、請求項５０に記載のベクター。

【請求項52】

形質導入した細胞におけるＢ２Ｍ発現を、野生型と比較して少なくとも７５％ノックダウンするように操作可能な、請求項４７に記載のベクター。

【請求項53】

形質導入した細胞におけるＢ２Ｍ発現を、野生型と比較して少なくとも８０％ノックダウンするように操作可能な、請求項４７に記載のベクター。

【請求項54】

形質導入した細胞におけるＢ２Ｍ発現を、野生型と比較して少なくとも８５％ノックダウンするように操作可能な、請求項４７に記載のベクター。

【請求項55】

形質導入した細胞におけるＢ２Ｍ発現を、野生型と比較して少なくとも９０％ノックダウンするように操作可能な、請求項４７に記載のベクター。

【請求項56】

形質導入した細胞におけるＢ２Ｍ発現を、野生型と比較して少なくとも９５％ノックダウンするように操作可能な、請求項４７に記載のベクター。

【請求項57】

自殺遺伝子をさらにコードするする、請求項４７に記載のベクター。

【請求項58】

ＰＥＴレポーター遺伝子をさらにコードする、請求項４７に記載のベクター。

【請求項59】

ＴＫ自殺／ＰＥＴレポーター遺伝子をさらにコードする、請求項４７に記載のベクター。

【請求項60】

β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）改変ＲＮＡをコードするベクターで形質導入された、操作された細胞であって、前記ベクターの配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される配列を含む、操作された細胞。

【請求項61】

前記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、請求項６０に記載の操作された細胞。

【請求項62】

前記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む、請求項６０に記載の操作された細胞。

【請求項63】

前記ｓｈＲＮＡは、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされる１またはこれより多くのヘアピンループ配列を含む、請求項６２に記載の操作された細胞。

【請求項64】

等価な野生型細胞のＢ２Ｍ発現の２５％またはこれ未満のＢ２Ｍ発現を有する、請求項６０に記載の操作された細胞。

【請求項65】

等価な野生型細胞のＢ２Ｍ発現の２０％またはこれ未満のＢ２Ｍ発現を有する、請求項６０に記載の操作された細胞。

【請求項66】

等価な野生型細胞のＢ２Ｍ発現の１５％またはこれ未満のＢ２Ｍ発現を有する、請求項６０に記載の操作された細胞。

【請求項67】

等価な野生型細胞のＢ２Ｍ発現の１０％またはこれ未満のＢ２Ｍ発現を有する、請求項６０に記載の操作された細胞。

【請求項68】

等価な野生型細胞のＢ２Ｍ発現の５％またはこれ未満のＢ２Ｍ発現を有する、請求項６０に記載の操作された細胞。

【請求項69】

前記細胞は、幹細胞およびリンパ球からなる群より選択される、請求項６０に記載の操作された細胞。

【請求項70】

前記細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である、請求項６０に記載の操作された細胞。

【請求項71】

前記細胞は、被験体における同種異系移植片のドナーに由来する、請求項６０に記載の操作された細胞。

【請求項72】

被験体において自己免疫疾患または炎症性疾患を処置する方法であって、前記方法は、治療上有効な量の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を前記被験体に投与することを包含し、それぞれが、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）改変ＲＮＡを被験体における免疫応答を抑制する様式で発現し、それによって、前記被験体において自己免疫疾患または炎症性疾患を処置する方法。

【請求項73】

前記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされる、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む、請求項７２に記載の方法。

【請求項76】

前記ｓｈＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされ、１またはこれより多くのヘアピンループ配列は、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされる、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記Ｔｒｅｇは、野生型ＴｒｅｇのＢ２Ｍ発現の２５％またはこれ未満のＢ２Ｍ発現を有する、請求項７２に記載の方法。

【請求項78】

前記被験体は、ヒトである、請求項７２に記載の方法。

【請求項79】

前記Ｔｒｅｇは、自家ではない、請求項７２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月２３日出願の米国仮特許出願第６３／０１４，３４４号（これは、その全体において参考として援用される）の利益および優先権を主張する。

【0002】

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、これにより、その全体において本明細書に参考として援用される、１１の配列を有する配列表を含む。上記のＡＳＣＩＩコピー（作成日：２０２１年４月２１日）は、４８２１６ＷＯ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、大きさは６，２８７バイトである。

【0003】

発明の分野
本発明は、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体タンパク質をコードするヒト白血球抗原の細胞切除のための組成物および方法を提供する。

【背景技術】

【0004】

背景
幹細胞移植および種々の免疫療法を含む細胞ベースの処置の出現は、がんを含む疾患の処置において顕著な見込みを示した。特に、キメラ抗原レセプターを発現する操作されたＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、標的化免疫療法における新たな武器として脚光を浴びている。さらに、特許出願公開ＷＯ ２０１９／１９０８７９（本明細書に参考として援用される）において考察されるように、Ｔ制御性リンパ球（Ｔｒｅｇｓ）を含む他の免疫細胞は、キメラ抗原レセプターを発現するように操作され得、自己免疫疾患および炎症性疾患において免疫応答および炎症を調節するために使用され得る。

【0005】

これらの治療は、それら自体のハードルおよび移植された細胞の免疫原性に関連するリスクがある。意図した治療に対する免疫反応のリスクは、概して問題であるが、処置目的が免疫抑制の場合には、前述の操作されたＴｒｅｇと同様に、さらなる免疫応答を引き出すことは、特に懸念される。免疫原性を緩和する既存の方法としては、処置されるべき患者から採取される自家細胞の使用が挙げられる。しかしこのような方法は、処置の遅れに伴う問題を引き起こし、大規模生産を妨げる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】国際公開第２０１９／１９０８７９号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

要旨
本発明の組成物および方法は、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）改変ＲＮＡを使用して、種々の細胞においてＨＬＡクラスＩ ＭＨＣ発現を低減させる。クラスＩ ＭＨＣ発現の低減により、細胞は、外来物質として認識される可能性や、不要な免疫応答を誘導する可能性がより低くなる。

【0008】

Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡをコードするベクターは、Ｔｒｅｇ細胞のような細胞を形質導入して、Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡを発現させるために使用され得る。Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはスモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含み得、Ｂ２ＭコードｍＲＮＡを標的にして、その翻訳を妨害し、クラスＩ ＭＨＣ発現を低減して、その結果、免疫原性が低減したＢ２Ｍノックダウン細胞を生じさせるように操作することができる。

【0009】

任意の細胞において免疫原性を低減する能力は、細胞移植に依拠する任意の処置または技術（例えば、ＣＡＲ Ｔｒｅｇ療法）のための新たな細胞供給源を開拓し、自家の出発材料の必要性を回避することによって、大規模生成および備蓄を可能にし得る。操作されたＣＡＲ Ｔｒｅｇのようなある特定の技術において、形質導入は、Ｔｒｅｇ細胞においてＣＡＲまたは他の標的化部分を発現するために既に要求される。よって、好ましい実施形態において、Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡおよび標的化部分（例えば、ＣＡＲ）の両方をコードする単一のベクターは、Ｂ２Ｍノックダウンに起因して、免疫原性が低減したＣＡＲ Ｔｒｅｇを生成するために使用され得る。このような単純化された、単一のベクターのアプローチは、より大規模の生成をさらに支援する。

【0010】

ある特定の実施形態において、さらなるエレメントは、ベクターの中にコードされ得る（例えば、安全スイッチ、ならびに細胞生成の間の発現をモニタリングする、ならびに治療用細胞および投与後のそれらの発現プロフィールのモニタリング／追跡のための手段を提供するにあたって有用である自殺遺伝子およびレポーター遺伝子を含む）。レポーター発現は、操作された免疫抑制性細胞の所望のＣＮＳ濃度を確実にするために、グリア細胞標的化ＣＡＲ Ｔｒｅｇのような標的化治療において使用される場合に特に有用であり得る。

【0011】

注記されるように、いくつかの実施形態は、免疫細胞を選択するおよび／または組織を選択するために特異的標的化を通じて免疫応答および炎症をモジュレートするために使用され得るＢ２Ｍ改変された、標的化Ｔ制御性リンパ球（Ｔｒｅｇ）を含む。このようなＴｒｅｇは、種々の標的細胞または組織を特異的に認識しかつ結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）、抗体、またはその機能的成分（例えば、１本鎖可変性フラグメント（ｓｃＦｖ））に連結され得、免疫抑制性Ｔｒｅｇまたはタンパク質は、炎症を低減するために、よって、炎症関連疼痛および変性を低減するために、炎症した組織に引き寄せられる。このような細胞におけるＢ２Ｍ発現のノックダウン（これは、標的化部分およびＢ２Ｍ改変ＲＮＡの両方をコードする単一のベクターでの形質導入を介して達成され得る）は、上記操作されたＴｒｅｇ細胞の供給源とは無関係に、不要な免疫原性を回避する助けになり得る。本発明のＢ２Ｍ改変ベクターおよび方法は、特許公開ＷＯ ２０１９／１９０８７９に記載されるとおりの神経変性障害を処置するために、ならびに他の免疫疾患および炎症性疾患を処置するために、標的化Ｔｒｅｇ療法と適合性である。よって、それらの出願において記載されるグリア細胞および他の細胞／組織標的化部分をコードするベクターは、本明細書で企図される。

【0012】

本発明の局面は、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）改変ＲＮＡおよびキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）、抗体、またはその機能的成分をコードするベクターを含む。ある特定の実施形態において、上記ベクターは、レンチウイルスベクターである。

【0013】

上記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み得る。上記ｓｉＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５を含み得る。ある特定の実施形態において、上記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含み得る。上記ｓｈＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される配列、ならびに配列番号６および配列番号７からなる群より選択される１またはこれより多くのヘアピンループ配列を含み得る。

【0014】

種々の実施形態において、上記ベクターは、形質導入した細胞におけるＢ２Ｍ発現を、野生型と比較して少なくとも７５％、野生型と比較して少なくとも８０％、野生型と比較して少なくとも８５％、野生型と比較して少なくとも９０％、または野生型と比較して少なくとも９５％ノックダウンするように操作可能であり得る。

【0015】

ある特定の実施形態において、上記ＣＡＲは、グリア細胞マーカー、抗原提示細胞（ＡＰＣ）マーカー、Ｔヘルパー１細胞（Ｔｈ１）マーカー、またはＴヘルパー１７細胞（Ｔｈ１７）マーカーを特異的に結合し得る。いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、膵島細胞、膵臓β細胞、心筋細胞、単球、マクロファージ、骨髄系細胞、腸細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、腎臓ポドサイト、腎臓尿細管細胞、上皮細胞、唾液腺細胞、肺細胞、線維芽細胞、結合組織細胞、ランゲルハンス細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、皮膚細胞、毛包細胞、希突起膠細胞、星状細胞、ミクログリア細胞、および毛球細胞からなる群より選択される細胞に特異的なマーカーに特異的に結合し得る。

【0016】

本発明のベクターは、自殺遺伝子および／またはＰＥＴレポーター遺伝子をさらにコードし得る。ある特定の実施形態において、上記ベクターは、ＴＫ自殺／ＰＥＴレポーター遺伝子をコードし得る。

【0017】

ある特定の局面において、本発明は、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）改変ＲＮＡおよびキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードするベクターで形質導入された、操作された細胞を含み得る。上記操作された細胞は、別の点で等価な野生型細胞のＢ２Ｍ発現の２５％もしくはこれ未満、２０％もしくはこれ未満、１５％もしくはこれ未満、１０％もしくはこれ未満、または５％もしくはこれ未満のＢ２Ｍ発現を有し得る。

【0018】

上記操作された細胞は、幹細胞およびリンパ球であり得る。ある特定の実施形態において、上記細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり得る。上記細胞は、被験体において同種異系移植片のドナーに由来し得る。上記操作されたＴｒｅｇ細胞は、ＣＡＲ分子の付加なしの同種異系ドナーに由来し得る。

【0019】

本発明の局面は、被験体において自己免疫疾患または炎症性疾患を処置する方法であって、上記被験体に、治療上有効な量の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を投与し、各々が、被験体における免疫応答を抑制する様式で、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）改変ＲＮＡおよび細胞の表面上のリガンドを特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現し、それによって、上記被験体において自己免疫疾患または炎症性疾患を処置することによる方法を包含する。上記被験体は、ヒトであり得る。上記Ｔｒｅｇは、自家のものでなくてもよい。種々の実施形態において、上記自己免疫疾患または炎症性疾患は、以下であり得る：アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、バッテン病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ドラベ症候群、クラッベ病、ギラン－バレー症候群、ハンチントン病、低酸素性虚血性脳症、ウェスト症候群、レビー小体型認知症、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、片頭痛、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、パーキンソン病、ペリツェウス－メルツバッハー病（ＰＭＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、プリオン病、進行性核上性麻痺、レット症候群、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、トゥレット症候群、外傷性脳傷害、熱帯性痙性不全対麻痺（ＴＳＰ）、腹痛、欠神発作、急性脊髄傷害、嗜癖、記憶喪失、不安障害、摂食障害、関節痛、毛細血管拡張性運動失調症（Ａ－Ｔ）、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、自閉症、自己免疫脳炎、背部痛、双極性障害、膀胱痛、ブローカ失語症、がん疼痛、脳浮腫、化学療法誘発性疼痛、群発性頭痛症候群、認知障害、認知機能障害、複合性局所疼痛症候群、認知症、歯痛、うつ病、糖尿病性神経障害性疼痛、薬物誘発性ジスキネジア、ジストニア、脳脊髄炎、てんかん、てんかん性脳症、本態性振戦、疲労、線維筋痛症、片麻痺、痛覚過敏、炎症性疼痛、不眠症、間質性膀胱炎、脳内出血、頭蓋内圧亢進、ケネディ病、レノックス－ガストー症候群、局所麻酔効果、大うつ病性障害、ＭＥＬＡＳ症候群、髄膜脳炎、侵害受容性疼痛、モートン中足部痛（Ｍｏｒｔｏｎ’ｓ ｍｅｔａｔａｒｓａｌｇｉａ）、運動ニューロン病、運動障害、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症（ＭＳ）、筋痙縮、筋骨格疼痛、筋肉痛、筋膜性疼痛症候群、ナルコレプシー、神経傷害、神経障害性疼痛、神経毒性症候群、強迫性障害、眼痛、アヘン離脱症候群、変形性関節症疼痛、パニック障害、麻痺、部分発作、末梢神経傷害、広汎性発達障害（ＰＤＤ）、リウマチ性多発筋痛（ＰＭＲ）、帯状疱疹後神経痛、術後痛、一次性進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）、精神病、神経根障害、再発性多発性硬化症（ＲＭＳ）、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＲ）、レストレスレッグス症候群、関節リウマチ疼痛、分裂情動障害、統合失調症、坐骨神経痛、二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）、睡眠障害、禁煙、社交不安障害、痙性斜頚（頚部ジストニア）、脊髄障害、スティッフパーソン症候群（ＳＰＳ）、タウオパチー、腱および靱帯の疼痛、強直間代（大発作）発作、三叉神経痛、上肢筋痙縮、血管性認知症、血管運動症状（非閉経期）、および内臓痛、１型糖尿病、移植、心筋炎（cardiomyositis）、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、ＧＶＨＤ、セリアック病、自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）；原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、全身性エリテマトーデス、皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、全身性強皮症、膜性糸球体腎症(ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ)（ＭＧＮ）、膜性腎症（ＭＮ）、微小変化型疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｃｈａｎｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＣＤ）；ＩｇＡ腎症、ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＶ）、シェーグレン症候群、強皮症、全身性硬化症（ＳＳｃ）、白斑、非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、円形脱毛症、ＣＯＶＩＤ－１９またはウイルス感染から生じる他の炎症性疾患。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、Ｂ２Ｍ改変標的化ＣＡＲ－Ｔｒｅｇを図示する。

【図2】図２は、種々のｓｈＲＮＡコードベクターで形質導入したＨＥＫ－２９３細胞に対する抗Ｂ２Ｍ染色でのメジアン蛍光ＦＡＣＳ結果を図示する。

【図3】図３は、種々のｓｈＲＮＡコードベクターで形質導入したＨＥＫ－２９３細胞に対する抗ＨＬＡ ＡＢＣ染色でのメジアン蛍光ＦＡＣＳ結果を図示する。

【図4A】図４Ａ～４Ｂは、種々のｓｈＲＮＡコードＧＦＰ＋ベクターで形質導入し、抗Ｂ２Ｍまたは抗ＨＬＡ ＡＢＣで染色したＨＥＫ－２９３細胞に関する平均蛍光強度を示す。

【図4B】図４Ａ～４Ｂは、種々のｓｈＲＮＡコードＧＦＰ＋ベクターで形質導入し、抗Ｂ２Ｍまたは抗ＨＬＡ ＡＢＣで染色したＨＥＫ－２９３細胞に関する平均蛍光強度を示す。

【図5A】図５Ａ～５Ｄは、種々のｓｈＲＮＡコードベクターで形質導入したＨＥＫ－２９３細胞に関するＧＦＰで測定した形質導入効率、ならびにＧＦＰ＋細胞およびＧＦＰ－細胞に対する抗Ｂ２Ｍおよび抗ＨＬＡ ＡＢＣの染色強度を示す。

【図5B】図５Ａ～５Ｄは、種々のｓｈＲＮＡコードベクターで形質導入したＨＥＫ－２９３細胞に関するＧＦＰで測定した形質導入効率、ならびにＧＦＰ＋細胞およびＧＦＰ－細胞に対する抗Ｂ２Ｍおよび抗ＨＬＡ ＡＢＣの染色強度を示す。

【図5C】図５Ａ～５Ｄは、種々のｓｈＲＮＡコードベクターで形質導入したＨＥＫ－２９３細胞に関するＧＦＰで測定した形質導入効率、ならびにＧＦＰ＋細胞およびＧＦＰ－細胞に対する抗Ｂ２Ｍおよび抗ＨＬＡ ＡＢＣの染色強度を示す。

【図5D】図５Ａ～５Ｄは、種々のｓｈＲＮＡコードベクターで形質導入したＨＥＫ－２９３細胞に関するＧＦＰで測定した形質導入効率、ならびにＧＦＰ＋細胞およびＧＦＰ－細胞に対する抗Ｂ２Ｍおよび抗ＨＬＡ ＡＢＣの染色強度を示す。

【図6A】図６Ａ～６Ｄは、種々のｓｈＲＮＡコードベクターで形質導入したＨＥＫ－２９３細胞に関するＧＦＰで測定した形質導入効率、ならびにＩｇＧ１ ＰＥ／ＩｇＧ１ ＡＰＣアイソタイプコントロール抗体での染色強度を示す。

【図6B】図６Ａ～６Ｄは、種々のｓｈＲＮＡコードベクターで形質導入したＨＥＫ－２９３細胞に関するＧＦＰで測定した形質導入効率、ならびにＩｇＧ１ ＰＥ／ＩｇＧ１ ＡＰＣアイソタイプコントロール抗体での染色強度を示す。

【図6C】図６Ａ～６Ｄは、種々のｓｈＲＮＡコードベクターで形質導入したＨＥＫ－２９３細胞に関するＧＦＰで測定した形質導入効率、ならびにＩｇＧ１ ＰＥ／ＩｇＧ１ ＡＰＣアイソタイプコントロール抗体での染色強度を示す。

【図6D】図６Ａ～６Ｄは、種々のｓｈＲＮＡコードベクターで形質導入したＨＥＫ－２９３細胞に関するＧＦＰで測定した形質導入効率、ならびにＩｇＧ１ ＰＥ／ＩｇＧ１ ＡＰＣアイソタイプコントロール抗体での染色強度を示す。

【図7】図７は、Ｂ２Ｍ遺伝子にわたるｓｈＲＮＡ標的位置の配列マップを示す。

【図8】図８は、ＣＡＲまたは他の標的化成分ありまたはなしのユニバーサルドナー（ＵＤ）Ｔｒｅｇの生成を図示する。出発細胞タイプは、正常ドナー血液の末梢血単核白血球（ＰＢＭＣ）から精製した天然の（ｎ）Ｔｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^－）である。ｎＴｒｅｇは、Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡおよび必要に応じて、ＣＡＲ Ｂ２Ｍ単独をコードするレンチウイルスベクターで形質導入され得る。操作されたｎＴｒｅｇの両方のタイプは、内因性Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の発現を保持し、ダウンレギュレートされたＢ２Ｍ発現およびＨＬＡクラスＩ ＭＨＣの切除を有する。ＣＡＲ／ｓｈＲＮＡ Ｂ２Ｍ配列で形質導入されたｎＴｒｅｇのみが、規定された細胞タイプ上のタンパク質標的に対して特異的なＣＡＲを発現する。ＨＬＡクラスＩ ＭＨＣの切除は、ＭＨＣミスマッチ患者への養子移入後に、アロ反応性免疫細胞からの免疫攻撃からＴｒｅｇｓを防御する。ＵＤ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇによる免疫抑制は、内因性ＴＣＲを介するアロＨＬＡクラスＩＩ ＭＨＣの認識およびＣＡＲによる規定された細胞表面標的タンパク質の認識のいずれかによって、誘発される。ＵＤ Ｔｒｅｇによる免疫抑制は、内因性ＴＣＲによるアロクラスＩＩ ＭＨＣの認識によって誘発されるのみである。

【発明を実施するための形態】

【0021】

詳細な説明
本発明の組成物および方法は、Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡをコードするベクターでの形質導入を介した種々の細胞における免疫原性の低減に関する。好ましい実施形態において、上記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を通じてＢ２Ｍの発現を妨げて、それによって、細胞表面上でのＭＣＨ クラスＩタンパク質のディスプレイを低減または防止するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。よって、本発明の操作された細胞は、レシピエント患者における免疫応答を誘導するリスクの増大なしに、より容易に入手可能な非自家の供給源から由来し得る。細胞ベースの免疫療法（例えば、ＣＡＲ Ｔｒｅｇ免疫抑制）と組み合わせた場合、単一のベクターは、Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡおよび標的化部分（例えば、ＣＡＲ）および他の遺伝子（例えば、報告遺伝子もしくは自殺遺伝子）の発現を誘導するために使用され得る。図１は、ＭＨＣクラスＩ細胞表面ディスプレイを低減するために、細胞特異的ＣＡＲおよびＢ２Ｍ改変ｓｈＲＮＡを発現する本発明の操作されたＴｒｅｇ細胞を図示する。

【0022】

「主要組織適合遺伝子複合体抗原」（「ヒト白血球抗原」、ＨＬＡともいわれる「ＭＨＣ」）は、細胞の表面上で見出されるタンパク質分子であり、免疫攻撃を誘導するために、細胞傷害性Ｔ細胞への外来タンパク質のディスプレイを介する細胞ベースの免疫応答において重要である。ＨＬＡ抗原は、２つの大きなクラス： ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩに分けられる。ＭＨＣクラスＩに相当するＨＬＡ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ）は、細胞が自己として認識されることを可能にする一方で、ＭＨＣクラスＩＩに相当するＨＬＡ（ＤＰ、ＤＭ、ＤＯ、ＤＱおよびＤＲ）は、リンパ球と抗原提示細胞との間の反応に関与する。両方ともが、移植した器官の拒絶に関わりがある。米国特許第９，９９７，８０７号（本明細書に参考として援用される）を参照のこと。

【0023】

Ｂ２Ｍは、α１タンパク質、α２タンパク質、およびα３タンパク質とともに、ＭＨＣクラスＩタンパク質の成分であり、ＭＨＣクラスＩペプチド提示に必須である。Ｂ２Ｍは、細胞表面上のα３鎖の側にあり、膜貫通領域を有しない。Ｂ２Ｍが、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現およびペプチド結合の溝の安定性に必要であり、その結果、Ｂ２Ｍがないと、細胞表面上で検出可能なＭＨＣクラスＩの量が非常に制限されることが、研究から示された。よって、細胞におけるＢ２Ｍ発現の低減または排除は、外来物質としての細胞の認識を回避し、免疫原性を低減する助けになり得る。従って、Ｂ２Ｍ発現の干渉を介するクラスＩ ＭＨＣ切除は、移植用の細胞を操作することにおける使用のための非自家の細胞供給源の新たな供給源を開拓し得る。

【0024】

ヒトＢ２Ｍ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号８）およびＢ２Ｍタンパク質のペプチド配列（配列番号９； ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ｐ６１７６９（Ｂ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ））を、図７に示す。隣接する配列を含むヒトＢ２Ｍを、以下の配列番号１０に示す（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００４０４８）：

【化1-1】

【化1-2】

【0025】

Ｂ２Ｍタンパク質（配列番号９）は、シグナル伝達部分
MSRSVALAVLALLSLSGLEA (配列番号11)
を含む。

【0026】

好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、形質導入された細胞においてＢ２Ｍ発現のＲＮＡ干渉のために使用される。Ｂ２Ｍ遺伝子内の選択したｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ標的は、図７においてマッピングされたように選択した。免疫原性を低減させるためのＢ２Ｍの遺伝的切除の例は、以前の研究において示されている。以下を参照のこと： Ｃｈａｎｇら， ２０１４， Ｂｒｏａｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｔ－Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（５）； Ａｌｄｒｉｃｈら， １９９４， Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ－ ａｎｄ ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＴＡＰ１ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ， ＰＮＡＳ， ９１：６５２５－６５２８； Ｗａｎｇら， ２０１５， Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ２－Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｍｉｎｉｍｉｚｅｓ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ４：１２３４－１２４５； Ｚｉｊｌｓｔｒａら， １９９０， β２－Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｉｃｅ Ｌａｃｋ ＣＤ４^－８^＋ Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ， Ｎａｔｕｒｅ， ３４４：７４２－７４６； 米国特許公開２０１９／０２３３７９７；これらの各々の内容は、本明細書に参考として援用される。

【0027】

本発明は、細胞ベースの免疫療法およびその他の処置のための標的化された細胞を、任意の供給源から免疫原性を抑えて効率的に生成するための、新たなＢ２Ｍ改変ＲＮＡ配列およびＢ２Ｍ改変ＲＮＡをコードするベクターを、さらなるＣＡＲ、報告遺伝子および自殺遺伝子とともに提供する。本発明のＢ２Ｍ改変ベクターは、形質導入した細胞におけるＢ２Ｍ発現を、野生型と比較して少なくとも７５％、野生型と比較して少なくとも８０％、野生型と比較して少なくとも８５％、野生型と比較して少なくとも９０％、または野生型と比較して少なくとも９５％ノックダウンし得る。

【0028】

種々の実施形態において、上記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、または１本鎖干渉ＲＮＡであり得る。好ましい実施形態において、上記Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。ＳｉＲＮＡは、２本鎖非コードＲＮＡであり、長さが概して２０～２５塩基対である。それは、転写後にｍＲＮＡを分解し、それによって翻訳を妨げることによって、相補的ヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現に干渉する。ある特定の実施形態において、Ｂ２Ｍ改変ｓｉＲＮＡをコードするベクター配列は、以下の配列のうちの１またはこれより多くのものを含む：

【化2】

【0029】

それらの配列を含む上記のｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列をコードするＢ２Ｍ改変ベクターは、相当するＩＤ番号（例えば、７０３、７０４、７０５、７０６、および７０７）によって、本明細書で言及され得る。ベクター７２８（実施例中で考察される）は、コントロールとして含まれ、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡ中の任意の標的配列に相補的ではないスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含む。ヒトＢ２Ｍ遺伝子配列は、上記で参照されるｓｉＲＮＡ配列の各々についての標的領域とともに、図７に示される。

【0030】

ＳｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して標的遺伝子発現をサイレントにするために使用され得るタイトなヘアピンターンを有する人工ＲＮＡ分子である。ＳｈＲＮＡは、プラスミドベクターに組み込まれ得、安定な発現のためにゲノムＤＮＡへと組み込まれ、標的ｍＲＮＡのより長いノックダウン効果を生成する。適用において、上記ｓｈＲＮＡ分子は細胞内でプロセシングされてｓｉＲＮＡを形成し、続いて、遺伝子発現をノックダウンする。ある特定の実施形態において、以下のうちの１つのようなヘアピンループは、本発明のＢ２Ｍ改変ｓｈＲＮＡを生成するために、ｓｉＲＮＡ配列に付加され得る：

【化3】

【0031】

以下で考察される実施例に関しては、ベクター７０３、７０４ａ、７０５、７０６、および７０７は、配列番号６におけるヘアピン配列とともに、それらそれぞれのｓｉＲＮＡ配列を含む。ベクター７０４ｂ（実施例中で考察される）は、配列番号７におけるヘアピンループとともに、配列番号２におけるｓｉＲＮＡを含む。本発明は、本明細書で提供される配列のある特定のバリエーションが、所望のレベルのＢ２Ｍ発現干渉をなお示し得ることを認識する。よって、種々の実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号１～７と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％ 同一性を有する配列を含み得る。

【0032】

種々の実施形態において、ベクターは、レポーター遺伝子を含み得る。レポーター遺伝子は、細胞中でのそれらの検出がその遺伝子の発現を確認するように、同定可能なマーカーをコードする。レポーター遺伝子は、その遺伝子の発現を定量し、それらが含まれるベクターの形質導入効率を推測するためにさらに使用され得る、発現される場合に測定可能なシグナルを提供し得る。一般に使用されるレポーター遺伝子としては、容易に観察および測定され得る緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような視覚的シグナルを提供するものが挙げられる。ある特定の実施形態において、本発明のベクターは、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）レポーター遺伝子を含み得る。以下を参照のこと： Ｙａｇｈｏｕｂｉら， ２０１２， Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ： Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｔｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ， ２（４）：３７４－３９１（本明細書に参考として援用される）。ＰＥＴレポーター遺伝子の使用は、発現、および従って、形質導入効率を決定するために、ＰＥＴスキャンを使用して非侵襲性の画像化を可能にする。さらに、標的化細胞ベースの治療（例えば、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ処置）において使用される場合、ＰＥＴレポーター発現は、その投与した細胞の局在化を非侵襲的にモニターして、その細胞が標的組織中で適切に濃縮されていることを検証するために使用され得る。例えば、ＣＮＳ－グリア細胞標的化ＣＡＲ－Ｔｒｅｇにおいて発現される場合、ＰＥＴレポーターは、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇが血液脳関門を横断し、標的グリア細胞に達していることを検証するために、脳のＰＥＴスキャンと併せて使用され得る。

【0033】

ある特定の実施形態において、ベクターは、自殺遺伝子をさらに含み得る。自殺遺伝子は、細胞を、活性化の際にアポトーシスを通じてそれ自体を殺滅させ得る。自殺遺伝子は、有害反応の場合に、遺伝子改変した細胞を選択的に殺滅するように安全スイッチとして組み込まれ得る。よって、それらは、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ免疫抑制のような細胞ベースの免疫療法において有用であり得る。好ましい実施形態において、ＴＫ自殺／ＰＥＴレポーター遺伝子は、ＰＥＴ報告および自殺安全スイッチの二重機能を提供するために、ベクターの中に含められ得る。Ｇｓｃｈｗｅｎｇら， ２０１４， ＨＳＶ－ｓｒ３９ＴＫ ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｇｅｎｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｉｃｅ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ７４（１８）：５１７３－５１８３（本明細書に参考として援用される）を参照のこと。

【0034】

Ｂ２Ｍ改変Ｔｒｅｇおよび他の細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞または他の操作された細胞を調製するために公知の方法によって操作され得る。Ｔｒｅｇ細胞は、その後のクラスＩ ＭＨＣ切除に起因して任意の供給源から単離され得る。次いで、Ｔｒｅｇ細胞の遺伝子は、公知の技術（例えば、エレクトロポレーション、ウイルスベクター、またはＢ２Ｍ改変ＲＮＡ、最適な操作されたキメラ抗原レセプター、レポーター遺伝子、および自殺遺伝子のうちの１またはこれより多くのものをコードする核酸でのトランスフェクションの他の形態）を通じて改変され得る。次いで、操作された細胞は、処置のために患者の系へと導入する前に実験的に検証され得る。好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは、Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡならびに種々の標的化、シグナル伝達、および自殺遺伝子で細胞を形質導入するために使用され得る。Ｅｌｅｇｈｅｅｒｔら， ２０１８， Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｆａｓｔ， ｓｃａｌａｂｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， １３， ２９９１－３０１７（本明細書に参考として援用される）を参照のこと。

【0035】

好ましい実施形態において、上記形質導入された細胞は、幹細胞またはリンパ球（例えば、Ｔｒｅｇ）であり得る。本発明の操作されたＴｒｅｇを使用して、種々の神経変性疾患を含む種々の自己免疫疾患および／または炎症性疾患を処置することができる。操作された細胞は、細胞特異的マーカーを標的にして、免疫細胞を標的とするかまたは組織を標的とするようにＴｒｅｇを向かわせ、多種多様な疾患の症状に寄与する自己免疫による攻撃および炎症を中断させ得る。

【0036】

上記で注記されるように、Ｂ２Ｍ改変ＲＮＡ、レポーター、および／または自殺遺伝子に加えて、ベクターは、標的細胞マーカーを特異的に結合する、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）、抗体、または１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードし得る。標的細胞は、ＡＰＣまたはＴヘルパー細胞（Ｔｈ１またはＴｈ１７）のような免疫細胞であってもよいし、免疫応答の抑制が所望される特異的組織であってもよい。神経変性疾患、自己免疫疾患、および／または炎症性疾患を処置するための例示的な標的細胞、リガンド、および標的化部分は、特許公開ＷＯ ２０１９／１９０８７９に記載され、本発明は、このような標的化部分の組み込みおよび本明細書で記載されるＢ２Ｍ改変ベクターにおける処置方法を企図する。

【0037】

種々の実施形態において、ベクターは、特異的細胞または組織を標的化するために、ＣＡＲ、ｓｃＦｖ、または抗体をコードし得る。ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞）に対する特異性を提供し得る操作されたレセプターである。ＣＡＲは、腫瘍細胞特異性を、がん免疫療法における使用のための細胞傷害性Ｔリンパ球に付与するために使用されている。以下を参照のこと：Ｃｏｕｚｉｎ－Ｆｒａｎｋｅｌ， ２０１３， Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３４２（６１６５）：１４３２－３３； Ｓｍｉｔｈら， ２０１６， Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＣＡＲ） Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃａｎｃｅｒｓ： Ｓｕｍｍａｒｙ ａｎｄ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ， ２（２）：５９－６８；これらの各々の内容は、本明細書に参考として援用される。類似の原理を使用して、本発明の化合物および方法は、上記の免疫細胞または他の特異的細胞タイプ上で見出されるマーカーに特異的であるＣＡＲを操作することを包含するが、細胞特異的ＣＡＲを、細胞傷害性Ｔ細胞にグラフトする代わりに、それらは、操作された免疫抑制性Ｔｒｅｇ上にグラフトされる。本発明のＣＡＲ－Ｔｒｅｇは、同じまたは２もしくはこれより多くの異なる細胞マーカーを標的化する多数のキメラ抗原レセプターを発現し得る。

【0038】

ＳｃＦｖは、免疫グロブリンの重鎖（Ｖ_Ｈ）および軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域を含む融合タンパク質である。ＳｃＦｖは、所望の標的分子で免疫したマウスまたは他の動物のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ遺伝子をクローニングすることによって作製され得る。次いで、上記Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ遺伝子は、種々のｓｃＦｖを形成するために、複数の配向において、および種々のリンカーとともに発現され得、これは、次いで、所望の安定性、発現レベル、および特異的マーカーまたは細胞に対する結合親和性を提供するために、実験的に検証され得る。

【0039】

細胞マーカーを標的化する抗体は、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）またはＡＢｃｌｏｎａｌ（Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡからの特注の抗体を生成するための商業的に利用可能なサービスを含む、当該分野で公知の方法によって生成され得る。

【0040】

操作されたＴｒｅｇを生成するために、出発細胞タイプは、天然の（ｎ）Ｔｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^－）であり、これは使用され得る。上記ｎＴｒｅｇは、正常ドナー血液に由来する末梢血単核白血球（ＰＢＭＣ）から精製され得る。ＣＡＲ遺伝子は、Ｂ２Ｍに対するｓｈＲＮＡとｃｉｓにおいてレンチウイルスベクターでの形質導入によってｎＴｒｅｇへと導入され得る。ある特定の実施形態において、標的化ＣＡＲ遺伝子は除外され得、その結果、ｎＴｒｅｇは、レンチウイルスベクター上のＢ２Ｍに対するｓｈＲＮＡで単に操作される。ＣＡＲ発現があってもなくても、上記操作されたｎＴｒｅｇは、内因性Ｔ 細胞レセプター（ＴＣＲ）の発現を保持し、Ｂ２ＭのダウンレギュレーションおよびＨＬＡクラスＩ ＭＨＣの切除を示すはずである。ＣＡＲ／ｓｈＲＮＡ Ｂ２Ｍ配列で形質導入されたｎＴｒｅｇｓのみが、規定の細胞タイプ上のタンパク質標的に対して特異的なＣＡＲを発現する。ＨＬＡ－クラスＩ ＭＨＣの切除は、ＭＨＣミスマッチ患者への養子移入の後に、アロ反応性免疫細胞からの免疫による攻撃からＴｒｅｇを防御し得る。ＵＤ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇによる免疫抑制は、内因性ＴＣＲを介するアロＨＬＡクラスＩＩ ＭＨＣの認識またはＣＡＲによる規定の細胞表面標的タンパク質の認識のいずれかによって誘発され得る。あるいは、ＵＤ Ｔｒｅｇによる免疫抑制は、ＣＡＲ認識によって誘発され得ない。なぜならＣＡＲは発現されず、代わりに内因性ＴＣＲによるアロクラスＩＩ ＭＨＣの認識によって誘発されるからである。

【0041】

制御性Ｔ細胞またはＴｒｅｇは、免疫系をモジュレートし、エフェクターＴ細胞の誘導および増殖を概してダウンレギュレートする。Ｔｒｅｇは、自己免疫応答を防止し、免疫系による自己および非自己の区別を助ける。制御性Ｔ細胞は、トランスフォーミング成長因子β、インターロイキン３５、およびインターロイキン１０を含む阻害性サイトカインを生成し、インターロイキン－１０を発現するように他の細胞タイプを誘導し得る。Ｔｒｅｇはまた、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂを生成し得、これは、続いて、エフェクター細胞のアポトーシスを誘導し得る。Ｔｒｅｇはまた、樹状細胞との直接的相互作用および免疫抑制性のインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼの誘導を通じて逆シグナル伝達を介して機能する。Ｔｒｅｇはまた、免疫抑制性アデノシンの生成とともに、外酵素ＣＤ３９およびＣＤ７３を介する免疫応答をダウンレギュレートし得る。Ｔｒｅｇはまた、ＬＡＧ３によって、およびＴＩＧＩＴによって、樹状細胞との直接的相互作用を介する免疫応答を抑制する。別の制御機序は、ＩＬ－２フィードバックループを経るものである。Ｔｒｅｇによる免疫抑制の別の機序は、分子ＣＴＬＡ－４の活性化によるエフェクターＴ細胞上のＣＤ２８を介する共刺激の防止を介するものである。

【0042】

本発明のＢ２Ｍ改変ＣＡＲ－Ｔｒｅｇは、本明細書で記載される治療用化合物のうちの１またはこれより多くを含むキャリアシステムへと組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、上記キャリアシステムは、ジスルフィド架橋したポリエチレンイミン（ＣＬＰＥＩ）および脂質を含むナノ粒子であり得る。上記脂質は、胆汁酸（例えば、コール酸、デオキシコール酸、およびリトコール酸）であり得る。このようなキャリアシステムは、以下の実施例においてさらに記載される。他の例示的キャリアシステムは、例えば、Ｗｉｔｔｒｕｐら（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ／ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １６：５４３－５５２， ２０１５）（その内容は、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載される。

【0043】

図８は、ユニバーサルドナー（ＵＤ） ＣＡＲ－ＴｒｅｇまたはＴｒｅｇの生成を図示する。その出発細胞タイプは、正常ドナー血液の末梢血単核白血球（ＰＢＭＣ）から精製した天然の（ｎ）Ｔｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^－）であり得る。ｎＴｒｅｇは、ＣＡＲおよびＢ２Ｍに対するｓｈＲＮＡ、または上記ｓｈＲＮＡ単独のいずれかをコードするレンチウイルスベクターで形質導入され得る。操作されたｎＴｒｅｇの両方のタイプが、内因性Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の発現、従って内因性Ｔｒｅｇ機能性を保持するはずである。操作されたｎＴｒｅｇの両方のタイプはまた、Ｂ２ＭダウンレギュレーションおよびＨＬＡ－クラスＩ ＭＨＣの切除を示すはずである。さらに、ＣＡＲ／ｓｈＲＮＡ Ｂ２Ｍ配列で形質導入された上記ｎＴｒｅｇは、規定の細胞タイプ上でタンパク質標的に対して特異的なＣＡＲを発現し得る。ＨＬＡ－クラスＩ ＭＨＣの切除は、ＭＨＣミスマッチ患者への養子移入後に、アロ反応性免疫細胞からの免疫攻撃から上記操作されたＴｒｅｇｓを防御する。ＵＤ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇによる免疫抑制は、内因性ＴＣＲを介するアロＨＬＡクラスＩＩ ＭＨＣの認識およびＣＡＲによる規定された細胞表面標的タンパク質の認識のいずれかによって、誘発され得る。ＵＤ Ｔｒｅｇによる免疫抑制は、内因性ＴＣＲによるアロクラスＩＩ ＭＨＣの認識によって誘発され得るのみである。

【0044】

語句「非経口投与」および「非経口投与される」とは、本明細書で使用される場合、通常は、注射による経腸的および局所投与以外の投与の様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内注射および注入が挙げられるが、これらに限定されない。

【0045】

語句「全身投与」、「全身投与される、「末梢投与および「末梢投与される」とは、本明細書で使用される場合、患者の系へと入り、従って、代謝および他の類似のプロセスを受けるように、中枢神経系へと直接投与される以外の化合物、薬物または他の物質の投与（例えば、皮下投与）を意味する。

【0046】

本発明の化合物が、ヒトおよび哺乳動物へと、医薬品として投与される場合、それらは、それ自体、または例えば、０．１～９９．５％（より好ましくは、０．５～９０％）の有効成分、すなわち、少なくとも１種の本発明の治療用化合物およびまたは／その誘導体を、薬学的に受容可能なキャリアとの組み合わせにおいて含む医薬組成物として与えられ得る。

【0047】

各薬剤の有効投与量は、各々、患者の年齢、体重、性別および臨床歴としての代表的な要因を考慮して、当業者によって容易に決定され得る。一般に、本発明の化合物の適切な１日量は、治療効果を生じるために有効な最低用量である化合物の量である。このような有効用量は一般に、上記の要因に依存する。

【0048】

望ましい場合には、上記活性化合物の有効１日量が、１日を通して適切な間隔で別個に投与される２回、３回、４回、５回、６回またはこれより多くの部分用量として、必要に応じて、単位投与形態において投与され得る。

【0049】

本発明の医薬組成物は、本発明の化合物、またはその機能的誘導体のうちの１またはこれより多くのものの「治療上有効な量」または「予防上有効な量」を含む。「有効量」は、定義の節の中で、本明細書で定義されるとおりの量であり、所望の治療結果、例えば、神経障害性のおよび／または炎症性の疼痛と関連する作用の減少または防止を達成するために必要な投与量および期間での、そのために有効な量を指す。本発明の化合物またはその機能的誘導体の治療上有効な量は、被験体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに上記治療用化合物が被験体において所望の応答を引き出す能力のような要因に応じて変動し得る。治療上有効な量はまた、上記治療剤の任意の毒性または有害な作用より、治療上有益な効果が勝る量である。

【0050】

「予防上有効な量」とは、所望の予防的効果を達成するために必要な投与量および期間での、そのために有効な量を指す。代表的には、予防的用量は、疾患より前に、または疾患のより早期のステージで被験体に使用されることから、予防上有効な量は、治療上有効な量より少ない可能性がある。予防上または治療上有効な量はまた、上記化合物の任意の毒性または有害な作用より、治療上有益な効果が勝る量である。

【0051】

投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的応答）を提供するために調整され得る。例えば、単一ボーラスが投与されてもよいし、いくつかの分割用量が、経時的に投与されてもよいし、上記用量が、治療状況の急迫によって示されるように比例して低減または増大されてもよい。投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与単位形態において非経口的組成物を製剤化することは、特に有利である。本発明の医薬組成物における有効成分の実際の投与レベルは、患者にとって毒性であることなく、特定の被験体、組成物、および投与様式に関する所望の治療応答を達成するために有効な有効成分の量を得るために変化させることができる。

【0052】

用語「投与単位（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ）」とは、本明細書で使用される場合、処置される哺乳動物被験体のための単位投与量として適した、物理的に別個の単位を指す；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連付けられた状態において、その所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定の量を含む。本発明の投与単位形態に関する仕様は、（ａ）化合物の特有の特徴、および（ｂ）このような活性化合物を、個体における過敏症の処置のために調合する技術に固有の限界によって規定されかつ直接的に依存する。

【0053】

いくつかの実施形態において、治療上有効な量は、細胞培養アッセイまたは動物モデル（通常は、マウス、ウサギ、イヌ、またはブタ）のいずれかにおいて、最初に概算され得る。動物モデルはまた、所望の濃度範囲および投与経路を達成するために使用され得る。次いで、このような情報は、他の被験体における投与のための有用な用量および経路を決定するために使用され得る。一般には、上記治療上有効な量は、被験体において神経障害性のおよび／または炎症性の疼痛を低減または阻害するために十分である。いくつかの実施形態において、上記治療上有効な量は、被験体において神経障害性のおよび／または炎症性の疼痛を排除するために十分である。

【0054】

特定の患者に関する投与量は、従来の考慮事項を使用して（例えば、適切な従来の薬理学的プロトコールによって）当業者によって決定され得る。医師は、例えば、適切な応答が得られるまで、最初に比較的低用量を、後にその用量を増大させて処方し得る。患者に投与される用量は、患者において経時的に有益な治療応答をもたらす、または例えば、症状、もしくは他の適切な活動を、上記適用に応じて低減するために十分である。上記用量は、特定の製剤の有効性、および本発明の化合物またはその機能的誘導体の活性、安定性または血清半減期、ならびに患者の状態、ならびに処置されるべき患者の体重または表面積によって決定される。上記用量の大きさはまた、特定の被験体における特定のベクター、製剤などの投与に付随する任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。本発明の１またはこれより多くの化合物またはその機能的誘導体を含む治療用組成物は、当該分野で周知の方法に従って、有効性、組織代謝を確認し、投与量を概算するために、疾患の１またはこれより多くの適切なインビトロおよび／またはインビボ動物モデル（例えば、神経障害性のおよび／または炎症性の疼痛のモデル）において必要に応じて試験される。特に、投与量は、関連アッセイにおいて、処置 対 非処置の活性、安定性または他の適切な手段（例えば、処置された 対 処置されていない細胞または動物モデルの比較）によって最初に決定され得る。製剤は、例えば、患者の体重および全般的な健康状態に適用されるように、関連する製剤のＬＤ５０、および／または本発明の化合物もしくはその機能的誘導体の種々の濃度での任意の副作用の観察によって決定される割合で投与される。投与は、単一用量または分割用量を介して達成され得る。

【0055】

投与することは、代表的には、薬学的に受容可能な投与形態を投与することを包含し、上記投与形態は、本明細書で記載される化合物の投与形態を意味し、例えば、錠剤、糖衣錠、散剤、エリキシル剤、シロップ剤、液体調製物（懸濁剤を含む）、スプレー剤、吸入用錠剤、ロゼンジ剤、乳剤、液剤、粒剤、カプセル剤、および坐剤、ならびに液体の注射用調製物（リポソーム調製物を含む）を含む。技術および製剤は、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．，最新版（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）中に見出され得る。投与することは、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、または鼻内に行われ得る。化合物は、単独で、または適切な薬学的キャリアとともに投与されてもよく、固体または液体の形態にあり得る（例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、または乳剤）。

【0056】

上記有効成分を含む医薬組成物は、経口用途に適した形態において（例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性の懸濁剤、分散性の散剤もしくは粒剤、乳剤、硬質もしくは軟質カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤として）存在し得る。経口用途が意図された組成物は、医薬組成物の製造に関して当該分野で公知の任意の方法に従って調製され得、このような組成物は、薬学的に洗練されたかつ口に合う調製物を提供するために、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤および保存剤から選択される１またはこれより多くの剤を含み得る。錠剤は、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に受容可能な賦形剤と混合した状態で上記有効成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム）；造粒剤および崩壊剤（例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸）；結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア）および滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）であり得る。上記錠剤は、コーティングされていなくてもよいし、消化管での崩壊および吸収を遅らせ、それによって、長期間にわたって持続した作用を提供する公知の技術によってコーティングされていてもよい。例えば、時間遅延物質（例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル）が使用され得る。それらはまた、放出制御のための浸透圧治療錠剤（ｏｓｍｏｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｂｌｅｔ）を形成するために、米国特許第４，２５６，１０８号、同第４，１６６，４５２号および同第４，２６５，８７４号（これらの各々の内容は、それらの全体において本明細書に参考として援用される）に記載される技術によってコーティングされ得る。

【0057】

経口用途のための製剤はまた、有効成分が不活性固体希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合される硬質ゼラチンカプセル剤として、または有効成分が水または油媒体（例えば、ラッカセイ油、流動パラフィンまたはオリーブ油）と混合される軟質ゼラチンカプセル剤として提示され得る。

【0058】

製剤はまた、親（非イオン化）化合物とβ－シクロデキストリンの誘導体、特に、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンとの複合体を含み得る。

【0059】

代替の経口製剤は、放出制御製剤を使用して達成され得、ここで上記化合物は、腸溶性コーティング中に被包される。

【0060】

水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤と混合した状態で活性物質を含む。このような賦形剤は、懸濁化剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガム）；分散剤または湿潤剤、例えば、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、または、ポリオキシエチレンと脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合生成物などの、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）である。上記水性懸濁剤はまた、１またはこれより多くの保存剤（例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エチル、またはｐ－ヒドロキシ安息香酸ｎ－プロピル）、１またはこれより多くの着色剤、１またはこれより多くの矯味矯臭剤、および１またはこれより多くの甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）を含み得る。

【0061】

油性懸濁剤は、植物性油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナツ油）、またはミネラルオイル（例えば、流動パラフィン）中に有効成分を懸濁することによって製剤化され得る。上記油性懸濁剤は、濃化剤（例えば、蜜蝋、固形パラフィン、またはセチルアルコール）を含み得る。甘味剤（例えば、上で示されるもの）および矯味矯臭剤は、口にあう経口調製物を提供するために添加され得る。これらの組成物は、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）の添加によって保存され得る。

【0062】

水の添加による水性懸濁剤の調製に適した分散性散剤および粒剤は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１またはこれより多くの保存剤と混合した状態で上記有効成分を提供する。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤が例示され、例えば、甘味剤、矯味矯臭剤、および着色剤もまた、存在し得る。

【0063】

本発明の医薬組成物はまた、水中油型乳剤の形態にあり得る。その油相は、植物性油（例えば、オリーブ油またはラッカセイ油）またはミネラルオイル（例えば、流動パラフィン）またはこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然に存在するガム（例えば、アカシアガムまたはトラガカントガム）、天然に存在するホスファチド（例えば、ダイズレシチン（soya bean, lecithin）、および脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルまたは部分エステル（例えば、ソルビタンモノオレエート）および上記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。上記乳剤はまた、甘味剤および矯味矯臭剤を含み得る。

【0064】

シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロース）とともに製剤化され得る。このような製剤はまた、粘滑剤、保存剤、ならびに矯味矯臭剤および着色剤を含み得る。上記医薬組成物は、無菌の注射用水性懸濁剤または油性懸濁剤の形態にあり得る。この懸濁剤は、上で言及されているそれらの適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、公知の技術に従って製剤化され得る。上記無菌の注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の無菌の注射用液剤または懸濁剤の形態にあり得る（例えば、１，３－ブタンジオール中の液剤として）。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液がある、さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、任意の無刺激の不揮発性油が使用され得る（合成のモノグリセリドまたはジグリセリドが挙げられる）。さらに、脂肪酸（例えば、オレイン酸）は、注射剤の調製における用途が見出される。

【0065】

各活性薬剤はまた、薬物の直腸投与のために坐剤の形態で投与され得る。これらの組成物は、上記薬物と、通常の温度で固体であるが、直腸温度では液体であり、従って、薬物を放出するために直腸の中で融解する適切な非刺激性の賦形剤とを混合することによって調製され得る。このような材料は、カカオ脂およびポリエチレングリコールである。

【0066】

局所使用のためには、クリーム剤、軟膏剤、ゼリー剤、液剤または懸濁剤が適切である。局所適用は、洗口液およびうがい薬の使用を含む。

【0067】

用語「医薬組成物」とは、本明細書で記載されるとおりの化合物、ならびに投与様式および投与形態の性質に応じて、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクル（例えば、保存剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、矯味矯臭剤、香料、抗細菌剤、抗真菌剤、滑沢剤および分散剤）を含む少なくとも１種の成分を含む組成物を意味する。

【0068】

用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、本明細書で記載されるように、任意のキャリア、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを意味するために使用される。懸濁化剤の例としては、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、およびトラガカント、またはこれらの物質の混合物が挙げられる。微生物活動の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など）によって確実にされ得る。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含めることは、望ましい場合がある。注射用の医薬形態の長期吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。適切なキャリア、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール、これらの適切な混合物、植物性油（例えば、オリーブ油）、および注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。賦形剤の例としては、ラクトース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、およびリン酸二カルシウムが挙げられる。崩壊剤の例としては、デンプン、アルギン酸、およびある特定の複合ケイ酸塩（ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｉｌｉｃａｔｅ）が挙げられる。滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、および高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。

【0069】

用語「薬学的に受容可能な」とは、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などがなく、合理的な利益／リスク比で釣り合っているヒトおよび下等動物の細胞と接触した状態での使用に適していることを意味する。

【実施例】

【0070】

実施例
実施例１－ＨＥＫ２９３細胞におけるＢ２Ｍノックダウン
ＨＥＫ２９３細胞を、上記で記載されるとおりのｓｈＲＮＡ配列７０３～７０７および７２８（ｓｉＲＮＡ配列番号１～５と配列番号６または７のヘアピンループとを含む）および形質導入効率をモニターするためにＧＦＰレポーター遺伝子をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。上記構築物は、ＧＦＰによって測定される場合、９０％またはこれより良好な形質導入を有した。

【0071】

細胞を染色し、蛍光活性化セルソーティングを使用して、形質導入なしのコントロール（ＮＶ）およびスクランブルｓｈＲＮＡコードベクター（７２８）と比較して、種々のｓｈＲＮＡベクターのノックダウン効果を測定した。図２は、抗Ｂ２Ｍ染色でのメジアン蛍光ＦＡＣＳ結果を示し、図３は、抗ＨＬＡ ＡＢＣ染色でのメジアン蛍光ＦＡＣＳ結果を示す。示されるように、配列番号１～５（７０３～７０７）は各々、上記２つのコントロールと比較して、表面Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－Ａ／Ｂ／ＣクラスＩ ＭＨＣ発現の両方に対して有意なノックダウン効果を有した。ベクター７０３（配列番号１をコードする）および７０７（配列番号５をコードする）は、最も有意なノックダウン効果を示した。さらに、Ｂ２Ｍノックダウンレベルは、種々のベクターにわたってＨＬＡノックダウンレベルと一致した。

【0072】

図４Ａ～Ｂは、種々のｓｈＲＮＡをコードするＧＦＰ＋ ベクターで形質導入し、抗Ｂ２Ｍまたは抗ＨＬＡ ＡＢＣ染色で染色したＨＥＫ－２９３細胞の平均蛍光強度を示す。図５Ａ～５Ｄは、種々のｓｈＲＮＡコードベクターで形質導入し、抗Ｂ２Ｍおよび抗ＨＬＡ染色で染色したＨＥＫ－２９３細胞のＧＦＰで測定した形質導入効率を示す。図６Ａ～６Ｄは、種々のｓｈＲＮＡコードベクターで形質導入し、ＩｇＧ１ ＰＥ ＩｇＧ１ ＡＰＣアイソタイプコントロールで染色したＨＥＫ－２９３細胞のＧＦＰで測定した形質導入効率を示す。配列番号１～５を含むｓｉＲＮＡ（７０３～７０７）を有するベクターの形質導入効率およびＢ２Ｍノックダウン効果は、図４Ａ～Ｂ、図５Ａ～Ｄ、および図６Ａ～Ｄにおいて示される結果によってさらに裏付けられる。

【0073】

均等物および参照による援用
本明細書で引用される全ての参考文献は、各個々の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、または特許が、それらの全体において全ての目的のために参考として援用されることが具体的にかつ個々に示される場合と同程度に、参考として援用される。この参照による援用の陳述は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．５７（ｂ）（１）に従って、各々のおよびあらゆる個々の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、または特許（これらの各々は、このような引用が参照による援用の専用の陳述の直ぐ隣にないとしても、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．５７（ｂ）（２）に従って明らかに特定される）に関連することが出願人によって意図される。本明細書内に参照による援用の専用の陳述の包含は、あるとしても、参照による援用のこの一般的な陳述を弱めることにはならない。本明細書中の参考文献の引用は、その参考文献が関連する先行技術であるという承認として意図されることはなく、これらの刊行物または文書の内容または日付に関して何らかの承認を構成するものでもない。

【0074】

本発明は、好ましい実施形態および種々の代替の実施形態を参照しながら詳細に示されかつ記載されてきたが、形態および詳細における種々の変更が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく本発明の中で行われ得ることは、関連分野の当業者によって理解される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7】

【図8】

【配列表】

2023522985000001.app

【国際調査報告】