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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-01
(54)【発明の名称】ガン免疫療法を研究するための動物モデル
(51)【国際特許分類】
C12N 5/073 20100101AFI20230525BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230525BHJP
C12N 5/078 20100101ALN20230525BHJP
C12N 5/09 20100101ALN20230525BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20230525BHJP
【ＦＩ】
C12N5/073
C12Q1/02
C12N5/078
C12N5/09
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022564564
(86)(22)【出願日】2021-04-21
(85)【翻訳文提出日】2022-12-19
(86)【国際出願番号】 EP2021060385
(87)【国際公開番号】W WO2021214137
(87)【国際公開日】2021-10-28
(31)【優先権主張番号】20305399.6
(32)【優先日】2020-04-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522413685
【氏名又は名称】オンコファクトリー
【氏名又は名称原語表記】ＯＮＣＯＦＡＣＴＯＲＹ
(71)【出願人】
【識別番号】595040744
【氏名又は名称】サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
(71)【出願人】
【識別番号】596096180
【氏名又は名称】ユニベルシテ・クロード・ベルナール・リヨン・プルミエ
(71)【出願人】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】カステラーニ，ヴァレリー
(72)【発明者】
【氏名】デロワ－ブルジョワ，セリーヌ
(72)【発明者】
【氏名】コステシャレイレ，クレリア
(72)【発明者】
【氏名】ジャロッソン，ロレイン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA05
4B063QQ08
4B063QR48
4B063QX01
4B065AA90X
4B065AA93X
4B065AA94X
4B065AC20
4B065BB19
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、キメラキジ科鳥類胚であって、両方のタイプの外因性細胞：ａ．少なくとも１種のガン細胞の集団及びｂ．少なくとも１種の免疫細胞の集団を含み、ここで、前記外因性ガン細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在し、前記外因性免疫細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在しかつ／又は前記胚の血管中を循環する、キメラキジ科鳥類胚に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
キメラキジ科鳥類胚であって、両方のタイプの外因性細胞：
ａ．少なくとも１種のガン細胞の集団及び
ｂ．少なくとも１種の免疫細胞の集団
を含み、
ここで、前記外因性ガン細胞は、前記胚の少なくとも１種の組織に存在し、前記外因性免疫細胞は、前記胚の少なくとも１種の組織に存在しかつ／又は前記胚の血管中を循環する、
キメラキジ科鳥類胚。
【請求項2】
免疫細胞の集団が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなる、請求項１記載のキメラキジ科鳥類胚。
【請求項3】
免疫細胞の集団が、リンパ球、特に、遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞からなる、請求項１記載のキメラキジ科鳥類胚。
【請求項4】
ガン細胞が、患者の腫瘍に由来する、請求項１～３のいずれか一項記載のキメラキジ科鳥類胚。
【請求項5】
細胞の集団が両方とも、ヒト細胞である、請求項１～４のいずれか一項記載のキメラキジ科鳥類胚。
【請求項6】
両方のタイプの外因性細胞が、同じ少なくとも１種の胚組織に局在し、特に、免疫細胞が、ガン細胞により形成された腫瘍に存在する、請求項１～５のいずれか一項記載のキメラキジ科鳥類胚。
【請求項7】
ガン細胞が存在する前記少なくとも１種の胚組織が、ガン細胞の集団の性質に関連し、特に、ガン患者において原発性及び／又は続発性腫瘍が形成される代表的な組織／臓器である、請求項１～６のいずれか一項記載のキメラキジ科鳥類胚。
【請求項8】
外因性細胞の少なくとも１種の集団がラベルされている、請求項１～７のいずれか一項記載のキメラキジ科鳥類胚。
【請求項9】
下記工程：・免疫細胞の集団及びガン細胞の集団の両方をキジ科鳥類胚に導入する工程と、
・このキメラ胚を３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程とを含む、
請求項１～８のいずれか一項記載のキメラキジ科鳥類胚を得るための方法。
【請求項10】
下記工程：・ＨＨ１０期とＨＨ３０期との間の発生段階にあるキジ科鳥類胚の少なくとも１種の組織に免疫細胞の集団及びガン細胞の集団の両方を共移植する工程と、
・このキメラ胚を３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程とを含む、請求項９記載の方法。
【請求項11】
下記工程：・ＨＨ１０期とＨＨ３０期との間の発生段階にあるキジ科鳥類胚の少なくとも１種の組織に少なくとも１種のガン細胞の集団を移植する工程と、
・前記少なくとも１種の免疫細胞の集団を前記胚の血管内に注入する工程と、
・移植された胚を３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程とを含む、請求項９記載の方法。
【請求項12】
前記ガン細胞の集団の前記移植することを前記ガン細胞の集団の性質に関連し、特に、ガン患者において原発性及び／又は続発性腫瘍が形成される代表的な組織／臓器である少なくとも１種の胚組織において行う、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項13】
請求項１～８のいずれか一項記載のキメラキジ科鳥類胚からなる、ヒトのガンの研究のための動物モデル。
【請求項14】
下記群：免疫療法、化学療法、ターゲット療法、ホルモン療法、抗ガン剤および治療酵素の中から選択される少なくとも１種の抗ガン療法をスクリーニングするための、請求項１３記載の動物モデルの使用。
【請求項15】
遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を評価するための、請求項１３記載の動物モデルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、ガン細胞、特に、ガン細胞と免疫細胞との関係を研究するための動物モデルに関する。本発明の動物モデルは、免疫療法戦略の研究に特に関連する。
本発明は、ガン細胞、特に、ガン細胞と免疫細胞との関係を研究するための動物モデルに関する。本発明の動物モデルは、免疫療法戦略の研究に特に関連する。
【0002】
緒言
実験動物におけるヒトのガンのモデル化は、新しい抗ガン療法の開発に伴う前臨床試験における中心的な問題である。その効果ために開発された動物モデルについての主な評価基準は、モデルの信頼性並びに実行の速度及びコストである。
実験動物におけるヒトのガンのモデル化は、新しい抗ガン療法の開発に伴う前臨床試験における中心的な問題である。その効果ために開発された動物モデルについての主な評価基準は、モデルの信頼性並びに実行の速度及びコストである。
【0003】
腫瘍研究のために開発され、現在使用されている動物モデルは、主に、マウスモデルである。これらのモデルの準備には、比較的長い実行時間及び高いコストが掛かる。加えて、ある種のガン細胞は、マウス動物モデルに移植することができない。
【0004】
キジ科鳥類胚、特に、ニワトリ又はウズラの胚は、ｅｘ ｖｉｖｏ実験を行うため、特に、胚発生の研究及び異種移植実験を行うための魅力的なモデルである。それは、実際に、安価であり、非常に入手しやすく、取り扱いが容易である。さらに、倫理委員会による研究の承認は必要とされない。胚発生の最初の３分の２の間の鳥類胚の使用は、「動物実験」とは見なされないためである（European Directive 2010/63/EU）。それは、細胞増殖、分化及び遊走の研究のために選択されるモデルである。また、この動物モデルを、腫瘍を研究するのにも使用することができる。
【0005】
キジ科鳥類胚を使用する古典的な研究モデルは、胚体外構造での、より正確には、絨毛尿膜（ＣＡＭ）上への外因性細胞の移植である。腫瘍細胞は、ニワトリ胚膜上に移植される。約２日間のインキュベーション後、腫瘍が形成される。この腫瘍は、成長するために、特に発達した胚膜脈管構造を利用する。このような系により、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍において観察されるものと同様の細胞的特徴及び分子的特徴を有するｉｎ ｖｉｖｏヒト腫瘍、特に、神経膠芽腫を再現することが可能となった。
【0006】
また、この絨毛尿膜移植モデルは、治療用分子、特に、腫瘍血管新生を阻害するための分子をスクリーニングするのにも広く使用されている。例えば、ＷＯ第２０１５／０７４０５０号及びＵＳ第２０１３／０１７１６８０号には、胚体外構造への悪性ヒト造血細胞の異種移植が記載されており、ガン細胞は、羊膜嚢、卵黄嚢又はＣＡＭの血管内に注入される。
【0007】
ＷＯ第２０２０／０７５１６８号には、両方ともヒドロゲル中に分散されたガン細胞及び免疫細胞のＣＡＭ上の移植片が記載されている。
【0008】
Park et al.（２００９）には、ニワトリ胚の卵黄嚢へのヒト造血内皮前駆細胞の導入が記載されており、これらの前駆細胞は、ニワトリ胚の造血臓器に移植することが可能であった。
【0009】
ニワトリ胚の血管又は神経管の管腔へのガン細胞の導入が幾つか報告されている。
【0010】
Carter et al.（２０１２）には、ニワトリ胚の血管へのヒト神経芽細胞腫細胞の注入が報告されている。Boulland et al.（２０１０年）には、胚体外血管又は神経管に形成された病変へのヒト幹細胞の注入が開示されている。
【0011】
Busch et al.（２０１２）には、ニワトリ胚の脳の菱脳胞の内腔へのメラノーマ細胞の注入が記載されている。
【0012】
Jayachandran et al.（２０１５）には、ニワトリ胚の神経管の内腔へのメラノーマ細胞の注入が教示されている。一方、Joel et al.（２０１３）には、同じ位置へのヒト神経膠芽腫細胞の注入が教示されている。
【0013】
これらの技術のいずれによっても、胚の組織への腫瘍細胞の移植、したがって、腫瘍の形成が可能ではない。反対に、これらの位置に導入されたガン細胞は、より良性の表現型に再プログラミングされ、すぐに消失してしまう傾向がある。
【0014】
ＷＯ２０１６／０５３９８号及び同第２０１７／１０３０２５号の両方には、ガン細胞が胚体外構造内にではなく、キジ科鳥類胚の組織内に移植され、前記胚の血管又は管の管腔のいずれにも注入されない、新規な動物モデルが記載されている。有利には、胚の組織へのガン細胞の導入により、胚内を循環するホルモンシグナルにより誘導される遊走の経路をガン細胞が辿ることが可能となる。この動物モデルにおいて、ガン細胞は、その性質に従って特定の組織に遊走し、ついで、前記組織内に移植され、腫瘍を形成する。
【0015】
本発明は、ガン細胞と免疫細胞との相互作用の研究のために特に設計された、ガンの研究のための別の動物モデルの開発に関する。この動物モデルは、免疫療法剤及び／又は細胞のスクリーニングに特に有用である。
【0016】
免疫療法治療戦略
免疫療法は、がん患者の免疫系がガンと戦うのを助ける／高める処置の一種と定義することができる。実際、その正常な機能の一部として、免疫系は、異常な細胞、特に、腫瘍細胞を検出し、破壊することが可能であり、初期に破壊され、したがって、検出されない多くのガンの増殖を防ぐ可能性が最も高い。診断された腫瘍の場合、免疫細胞は、前記腫瘍内及びその周囲に見出される。腫瘍浸潤リンパ球又はＴＩＬと呼ばれるこれらの免疫細胞の存在は、免疫系が腫瘍に応答している徴候である。一般的には、腫瘍内又は腫瘍周囲のリンパ球の存在は、良好な予後のマーカーである。
免疫療法は、がん患者の免疫系がガンと戦うのを助ける／高める処置の一種と定義することができる。実際、その正常な機能の一部として、免疫系は、異常な細胞、特に、腫瘍細胞を検出し、破壊することが可能であり、初期に破壊され、したがって、検出されない多くのガンの増殖を防ぐ可能性が最も高い。診断された腫瘍の場合、免疫細胞は、前記腫瘍内及びその周囲に見出される。腫瘍浸潤リンパ球又はＴＩＬと呼ばれるこれらの免疫細胞の存在は、免疫系が腫瘍に応答している徴候である。一般的には、腫瘍内又は腫瘍周囲のリンパ球の存在は、良好な予後のマーカーである。
【0017】
残念ながら、一部の腫瘍は、免疫系を逃れる方法を見出し、これは、破壊を回避するための手段であることが確立されている。
【0018】
例えば、ガン細胞は、
・免疫系に見えにくくなるような遺伝的変化を有する場合があり、
・表面に免疫細胞を停止させるタンパク質を有する場合がありかつ／又は
・ガン細胞に対して免疫系が応答する方法を妨げるように、腫瘍周囲の正常細胞を変化させる場合がある。
・免疫系に見えにくくなるような遺伝的変化を有する場合があり、
・表面に免疫細胞を停止させるタンパク質を有する場合がありかつ／又は
・ガン細胞に対して免疫系が応答する方法を妨げるように、腫瘍周囲の正常細胞を変化させる場合がある。
【0019】
免疫療法の主な目標は、免疫系とガン細胞との間の相互作用を回復させることである。ガンを処置し、ガン患者自身の免疫系による腫瘍細胞の検出及び／又は破壊を刺激するために、幾つかのタイプの免疫療法が使用されている。これらは、
・免疫チェックポイント阻害剤（これは、免疫「チェックポイント」を遮断する薬剤である。これらのチェックポイントは、免疫応答が強くなり過ぎないように維持する免疫系の正常な部分である。それらを遮断することによって、これらの薬剤により、免疫細胞がガンに対してより強力に応答することが可能となる）、
・免疫系モデュレーター（これは、ガンに対する身体の免疫応答を増強する）、
・モノクローナル抗体（これは、ガン細胞上の特異的ターゲットに結合するように設計されている。モノクローナル抗体は、ガン細胞が免疫系によりよく見え、免疫系により、より破壊されるであろうように、ガン細胞を「マーク」することが可能である。ガン治療におけるモノクローナル抗体の使用は、Ｂ細胞リンパ腫の処置のための抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブについて、１９９７年に最初に導入された）
・Ｔ細胞移入療法（これは、Ｔ細胞がガンと戦う本来の能力を回復させかつ／又は高める処置である。また、Ｔ細胞移入療法を養子細胞療法、養子免疫療法又は免疫細胞療法と呼ぶこともできる）
を含む。
・免疫チェックポイント阻害剤（これは、免疫「チェックポイント」を遮断する薬剤である。これらのチェックポイントは、免疫応答が強くなり過ぎないように維持する免疫系の正常な部分である。それらを遮断することによって、これらの薬剤により、免疫細胞がガンに対してより強力に応答することが可能となる）、
・免疫系モデュレーター（これは、ガンに対する身体の免疫応答を増強する）、
・モノクローナル抗体（これは、ガン細胞上の特異的ターゲットに結合するように設計されている。モノクローナル抗体は、ガン細胞が免疫系によりよく見え、免疫系により、より破壊されるであろうように、ガン細胞を「マーク」することが可能である。ガン治療におけるモノクローナル抗体の使用は、Ｂ細胞リンパ腫の処置のための抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブについて、１９９７年に最初に導入された）
・Ｔ細胞移入療法（これは、Ｔ細胞がガンと戦う本来の能力を回復させかつ／又は高める処置である。また、Ｔ細胞移入療法を養子細胞療法、養子免疫療法又は免疫細胞療法と呼ぶこともできる）
を含む。
【0020】
１９９６年に、Ｔ細胞疲弊の重要な要素であるＣＴＬＡ－４を遮断することにより、マウスにおける直腸ガンの拒絶がもたらされることが示された（Leach et al., 1996）。
【0021】
Ｔ細胞疲弊
腫瘍微小環境（ＴＭＥ、すなわち、ガン細胞、炎症性細胞及びサプレッション性サイトカイン）に存在するＴリンパ球は、一般的には、「疲弊」している。Ｔ細胞疲弊は、機能性の喪失及び阻害性分子の発現により特徴付けられる。疲弊したＴ細胞は、エフェクター分子、例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びグランザイムＢを分泌する能力を欠き、阻害性レセプター、例えば、ＰＤ１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３及びＣＴＬＡ－４を発現する(McLane et al., 2019）。
腫瘍微小環境（ＴＭＥ、すなわち、ガン細胞、炎症性細胞及びサプレッション性サイトカイン）に存在するＴリンパ球は、一般的には、「疲弊」している。Ｔ細胞疲弊は、機能性の喪失及び阻害性分子の発現により特徴付けられる。疲弊したＴ細胞は、エフェクター分子、例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びグランザイムＢを分泌する能力を欠き、阻害性レセプター、例えば、ＰＤ１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３及びＣＴＬＡ－４を発現する(McLane et al., 2019）。
【0022】
Ｔ細胞の疲弊した表現型を逆転させることを目的とする治療戦略は、過去１０年間の焦点であった。複数のタイプのガンの管理における顕著な進歩が達成されている。特に、αＰＤ１（ペンブロリズマブ、ニボルマブ）及び／又はαＣＴＬＡ－４（イピリムマブ）の臨床データは、圧倒的な成功を示している。驚くことではないが、ＰＤ１のリガンドである腫瘍組織上でのＰＤＬ１の発現は、これらの免疫療法剤に対するより良好な応答率と関連している。
【0023】
特異的エピトープのターゲット化－ＣＡＲ－Ｔ
免疫療法における別のパラダイムシフトは、ＣＡＲ－Ｔ細胞と称されるキメラ抗原レセプター－Ｔ細胞の出現である。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、特異的エピトープをターゲットとするキメラレセプターを発現するように遺伝子改変された自己Ｔ細胞である。ＣＡＲの特異的部分は、膜貫通ドメインを介して、ＣＤ２８、４１ＢＢ及びＣＤ３εのシグナル伝達ドメインに接続され、これにより、養子移入時のＴ細胞の効率的な活性化及び最適な生存が可能となる（Feins et al., 2019）。
免疫療法における別のパラダイムシフトは、ＣＡＲ－Ｔ細胞と称されるキメラ抗原レセプター－Ｔ細胞の出現である。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、特異的エピトープをターゲットとするキメラレセプターを発現するように遺伝子改変された自己Ｔ細胞である。ＣＡＲの特異的部分は、膜貫通ドメインを介して、ＣＤ２８、４１ＢＢ及びＣＤ３εのシグナル伝達ドメインに接続され、これにより、養子移入時のＴ細胞の効率的な活性化及び最適な生存が可能となる（Feins et al., 2019）。
【0024】
ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の使用により、Ｂ細胞白血病において顕著な成功が達成されている。しかしながら、固形腫瘍のためのＣＡＲ－Ｔ細胞戦略は、おそらく、多因子性の理由、例えば、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の接近可能性の欠如、前記ＴＭＥの免疫サプレッション能力及び腫瘍関連抗原免疫原性／不均一性の結果として、はるかに効率的ではないと考えられる。それにもかかわらず、固形腫瘍のためのＣＡＲ－Ｔ細胞の新たな構築物が、幾つかの新たなターゲット、ＴＭＥへの異なるアドレスモード及び試験されるＣＡＲ－Ｔ細胞持続性／生存のための種々の戦略により、依然として研究されている(Martinez & Moon, 2019）。
【0025】
さらに、別の焦点は、ドナー由来の同種ＣＡＲ－Ｔ細胞の開発である。実際、この技術は、自己アプローチを上回る多くの潜在的な利点、例えば、患者処置のための凍結保存されたバッチの即時利用可能性、ＣＡＲ－Ｔ細胞製品の可能性のある標準化、複数の細胞改変のための時間、異なるターゲットに対するＣＡＲ－Ｔ細胞の再投与又は組み合わせ及び最後になるが、工業化されたプロセスを使用したコスト削減を有する。したがって、同種ＣＡＲ－Ｔ細胞の開発は、活発な研究分野である。
【0026】
免疫療法を研究するためのモデル
新たな治療戦略の出現及びより大きな程度で、免疫モデュラトリー介入に対する応答の明らかな不均一性により、処置を開始する前に患者を分類するための実用的なモデルが必要である。
新たな治療戦略の出現及びより大きな程度で、免疫モデュラトリー介入に対する応答の明らかな不均一性により、処置を開始する前に患者を分類するための実用的なモデルが必要である。
【0027】
臨床的観点から、患者のスコアリングは、バイオマーカーの発現、例えば、ＰＤ１／ＰＤＬ１軸、遺伝的／トランスクリプトームスクリーニング、適切なＴＩＬの存在及び／又は腫瘍との関連でこれらのＴＩＬがエフェクター機能を達成する能力等に基づくことができる。
【0028】
さらに、患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）の幾つかのマウスモデルが開発されている。一般的な戦略は、免疫不全マウスレシピエントに、患者由来の腫瘍組織を移植し、最終的に、患者由来の免疫細胞を共移植することである。
【0029】
しかしながら、このアプローチは時間がかかり、高価であり、移植の成功率が１０％と低い場合があるため信頼性がない。このような動物モデルの生成のための努力及び金銭的投資は、臨床的状況と適合しない（Jung et al., 2018）。
【0030】
この状況を考慮して、ガン細胞と免疫細胞とのｉｎ ｖｉｖｏ相互作用を、優先的には、患者ごとに研究するための新規な動物モデルが、積極的に探索されている。また、ＣＡＲ－Ｔ操作細胞を試験するための前臨床モデルも必要である（Siegler and Wang, 2018）。
【0031】
この文脈において、本発明は、免疫療法剤及び／又は細胞のスクリーニング並びに患者の分類に特に有用な、キメラキジ科鳥類胚からなる、新規な動物モデルを提案する。
【0032】
発明の概要
本発明は、キメラキジ科鳥類胚であって、両方のタイプの外因性細胞：
ａ．少なくとも１種のガン細胞の集団及び
ｂ．少なくとも１種の免疫細胞の集団
を含み、ここで、前記外因性ガン細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在し、前記外因性免疫細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在しかつ／又は前記胚の血管中を循環する、キメラキジ科鳥類胚に関する。
本発明は、キメラキジ科鳥類胚であって、両方のタイプの外因性細胞：
ａ．少なくとも１種のガン細胞の集団及び
ｂ．少なくとも１種の免疫細胞の集団
を含み、ここで、前記外因性ガン細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在し、前記外因性免疫細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在しかつ／又は前記胚の血管中を循環する、キメラキジ科鳥類胚に関する。
【0033】
また、本発明は、下記工程：
・免疫細胞の集団及びガン細胞の集団の両方をキジ科鳥類胚に導入する工程と、
・このキメラ胚を３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程とを含む、上記されたキメラキジ科鳥類胚を得るための方法に関する。
・免疫細胞の集団及びガン細胞の集団の両方をキジ科鳥類胚に導入する工程と、
・このキメラ胚を３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程とを含む、上記されたキメラキジ科鳥類胚を得るための方法に関する。
【0034】
この方法の少なくとも２つの実現形態は、本明細書において、
１）下記工程：
・ＨＨ１０期とＨＨ３０期の間の発生段階にあるキジ科鳥類胚の少なくとも１種の組織に免疫細胞の集団及びガン細胞の集団の両方を共移植する工程と、
・このキメラ胚を３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程とを含む、方法及び
２）下記工程：
・ＨＨ１０期とＨＨ３０期の間の発生段階にあるキジ科鳥類胚の少なくとも１種の組織に少なくとも１種のガン細胞の集団を移植する工程と、
・前記少なくとも１種の免疫細胞の集団を前記胚の血管内に注入する工程と、
・移植された胚を３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程とを含む、方法であると考えられる。
１）下記工程：
・ＨＨ１０期とＨＨ３０期の間の発生段階にあるキジ科鳥類胚の少なくとも１種の組織に免疫細胞の集団及びガン細胞の集団の両方を共移植する工程と、
・このキメラ胚を３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程とを含む、方法及び
２）下記工程：
・ＨＨ１０期とＨＨ３０期の間の発生段階にあるキジ科鳥類胚の少なくとも１種の組織に少なくとも１種のガン細胞の集団を移植する工程と、
・前記少なくとも１種の免疫細胞の集団を前記胚の血管内に注入する工程と、
・移植された胚を３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程とを含む、方法であると考えられる。
【0035】
また、本発明は、上記されたキメラキジ科鳥類胚又は先で提案された方法により得られたキメラキジ科鳥類胚からなる、ヒトのガンの研究のための動物モデルに関する。
【0036】
また、本発明は、下記群：免疫療法、化学療法、ターゲット療法、ホルモン療法、抗ガン剤および治療酵素の中から選択される少なくとも１種の抗ガン療法をスクリーニングするための、このような動物モデルの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図3】図３：ニワトリ胚への注入後のＰＢＭＣの生存。ＰＢＭＣを種々の用量で注入した（横軸に表される）；％ 細胞生存を縦軸に表わす。各印（三角形、正方形、菱形、円）は、注入されたＰＢＭＣの測定数について独立した実験を表わす。
【図4】図４：フローサイトメトリーによる移植後のＰＢＭＣ部分集団の分析。ＰＢＭＣの移植後の免疫細胞の部分集団の相対的割合の決定。ＰＢＭＣ：移植前の細胞。ＡＶＩ－ＰＢＭＣ：コラゲナーゼ処理胚からのPercoll単離後（胚の４８時間のインキュベーション後）に移植され、分析されたＰＢＭＣ細胞。（４Ａ)ＣＤ１９＋及びＣＤ３＋細胞を定量化する。値を総特定リンパ球の比で表わす。ＣＤ３＋／ＣＤ４＋及びＣＤ３＋／ＣＤ８＋の比も示す。（４Ｂ）鳥類胚への移植前（ＰＢＭＣ）及び移植後２日（ＡＶＩ－ＰＢＭＣ）でのサンプルにおける免疫細胞の部分集団（生きているＣＤ４５＋集団にわたる）のＦＡＣＳ分析による比較。（４Ｃ）鳥類胚への移植前（ＰＢＭＣ）及び移植後２日（ＡＶＩ－ＰＢＭＣ）での免疫細胞の活性化マーカー及び疲弊マーカー（生きているＣＤ４５＋ＣＤ３＋集団にわたる）のＦＡＣＳ分析による比較。活性化のマーカー：ヒトＣＤ６９及びＣＤ２５；疲弊のマーカー：ヒトＴＩＭ－３及びＰＤ－１。
【図5】図５：鳥類胚への移植後に形成された腫瘍の顕微鏡写真。ＰＢＭＣ及び腫瘍細胞をニワトリ胚のターゲット部位に共移植した。移植前に、両方の細胞プールを蛍光バイタルトレーサー（ＰＢＭＣについては赤色、腫瘍細胞については緑色）でラベルした。移植後２日で、胚を回収し、共焦点顕微鏡で画像化して、移植細胞を可視化した。ＰＢＭＣ細胞成分が形成された腫瘍内に存在した。マージ）両方のタイプの細胞が可視化されている；ＰＢＭＣ）ＰＢＭＣのみが可視化されている；腫瘍細胞）腫瘍細胞のみが可視化されている。
【図8】図８：個々の胚のサイズ及び重量の指標である体／サイズ面積（ＢＳＡ）を、Ｐｍｅｌａ細胞単独を移植された胚（Ｇｌｏ）並びにＰｍｅｌａ細胞及びＰＢＭＣを共移植された胚（ＧＬＯ－ＰＢＭＣ）について測定した。ＢＳＡの統計的差異は観察されなかった。
【図9】図９：Ｐｍｅｌａ細胞を単独で又はヒトＰＢＭＣと組み合わせて移植した場合の条件を比較する腫瘍体積の測定（方法１）。グラフは、両方の条件間で統計的差異を示さない。データを胚の体サイズ面積（ＢＳＡ）に対して正規化した。
【図10】図１０：（１０Ａ）２種類のガン細胞（Ｐｍｅｌａ細胞：ＧＬＯ；ＭＤＡＭ細胞：ＭＤＡＭ）とのＰＢＭＣの共移植後の免疫細胞部分集団の割合の表示。値を総特定リンパ球（ＣＤ３＋）の比で表現する。（１０Ｂ）表面細胞マーカー（ＰＤ１、ＴＩＭ－３、ＣＤ６９及びＣＤ２５）の発現をＦＡＣＳにより、Ｔリンパ球のＣＤ４＋及びＣＤ８＋部分集団について測定する：左側にＣＤ８＋、右側にＣＤ４＋（生きているＣＤ４５＋ＣＤ３＋集団にわたる）。選別された細胞は、以下のものである：移植前のＰＢＭＣ単独（黒色）、胚への単独移植後のＡＶＩ－ＰＢＭＣ（濃い灰色）並びにＡＶＩ－ＰＢＭＣ＋ＭＤＡＭＢ２３１：腫瘍細胞及びＰＢＭＣの共移植後（薄い灰色）。測定を移植後４８時間で行う。
【図11】図１１：Keytrudaの効果 （１１Ａ）細胞の部分集団をコラゲナーゼ処理胚からのＰＢＭＣのPercoll単離後にＦＡＣＳにより特定した。ＦＡＣＳによるＰＤ１表面発現の検出。抗ＰＤ１（Keytruda）は、移植されたＰＢＭＣ由来のヒトＴ細胞により発現されるＰＤ１に結合することが可能であり、このため、ＦＡＣＳ分析におけるＰＤ１の検出に使用される抗ＰＤ１抗体と競合し、これにより、ＰＤ１検出の低下がもたらされる。このため、Keytrudaが、そのターゲットに達すると、検出されたＰＤ－１レベルの低下がもたらされる。ＰＢＭＣＳを移植された鳥類胚における、Keytruda(５mg/mlに希釈）又は陰性対照についてはＮａＣｌの静脈内注射後のＰＤ１発現の分析。陰性対照は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞を１００％（生きているＣＤ４５＋ＣＤ３＋集団内）とすると任意に考える。Keytruda処理胚におけるＣＤ８＋細胞及びＣＤ４＋細胞での定量化を対照に対して正規化されたものとして表わす。（１１Ｂ)ＭＤＡＭＢ４３６乳ガン細胞（上図）及びＭＤＡＭＢ２３１細胞（下図）におけるＰＤＬ１発現を胚への移植後にＦＡＣＳにより測定する。（１１Ｃ）ＰＢＭＣを腫瘍細胞：Ｐｍｅｌａ（ＰＤＬ１陰性細胞系統）又はＭＤＡＭＢ４３６（ＰＤＬ１弱陽性細胞系統）と共移植した。その後、移植され、単離されたＰＢＭＣ細胞を免疫刺激性抗ヒトＰＤ１であるKeytruda（Ｋ）で処理し又は処理しなかった：＋Ｋは、Keytrudaの存在下を意味する。活性化のマーカー（左側のＣＤ６９、ＨＬＡＤＲ）及び疲弊のマーカー（右側のＣＴＬＡ４、ＰＤ１）を鳥類胚にヒト腫瘍細胞（Ｐｍｅｌａ又はＭＤＡＭ）との共移植後のＰＢＭＣにおいて決定した。値を総特定リンパ球（ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋）の比において、ＣＤ４＋集団及びＣＤ８＋集団を超える頻度で表現する。標準偏差は、異なる健常ドナー由来のＰＢＭＣのプールからのデータを示す。左グラフ：ＣＤ４＋、右グラフ：ＣＤ８＋。（１１Ｄ）ＰＢＭＣ及びＭＤＡＭＢ２３１腫瘍細胞を共移植された胚のKeytruda（濃い灰色）又はＮａＣｌ（薄い灰色）による２４時間処理後のＴ ＣＤ８＋細胞（左側）及びＣＤ４＋細胞（右側）の再分割（生きているＣＤ４５＋ＣＤ３＋集団にわたる）。結果を％ 対照量で表わす；白い矢印は、Keytruda（５mg/ml）処置条件における疲弊マーカー（ＰＤ１及びＴＩＭ－３）の発現の減少を示す。
【図12】図１２：移植ニワトリ胚における腫瘍のサイズ （１２Ａ）Ａ３７５メラノーマ細胞をヒトＰＢＭＣと共移植することにより形成された腫瘍の体積に対する抗ＰＤ１処理（Keytruda）の効果の分析。前記腫瘍は、鳥類胚モデルに形成される。（１２Ｂ）ヒトＰＢＭＣ及びＭＤＡＭＢ２３１腫瘍細胞を共移植された鳥類胚への抗ＰＤ１（Keytruda）投与の腫瘍体積に対する効果 左パネル：体サイズ面積（ＢＳＡ）に対するKeytrudaの効果；中央パネル：元の腫瘍体積のヒストグラム；右パネル：正規化腫瘍体積／ＢＳＡ 全ての結果から、ＮａＣｌ処理胚と比較して、抗ＰＤ１処理状態において腫瘍体積の有意な減少が示される。（１２Ｃ）転移性メラノーマに罹患した患者からのヒトＰＢＭＣ及び腫瘍サンプルを共移植された鳥類胚への抗ＰＤ１（Keytruda）投与の効果。転移数（左側）及び転移性腫瘍の体積（中央）を評価した。右側の写真は、ＮａＣｌ処理後（上側）及びKeytruda処理後（下側）の腫瘍の拡大を示す。
【0038】
本発明の実施態様の詳細な説明
本発明は、キメラキジ科鳥類胚であって、両方のタイプの外因性細胞：
ａ．少なくとも１種のガン細胞の集団及び
ｂ．少なくとも１種の免疫細胞の集団
を含み、ここで、前記外因性ガン細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在し、前記外因性免疫細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在しかつ／又は前記胚の血管中を循環する、キメラキジ科鳥類胚に関する。
本発明は、キメラキジ科鳥類胚であって、両方のタイプの外因性細胞：
ａ．少なくとも１種のガン細胞の集団及び
ｂ．少なくとも１種の免疫細胞の集団
を含み、ここで、前記外因性ガン細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在し、前記外因性免疫細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在しかつ／又は前記胚の血管中を循環する、キメラキジ科鳥類胚に関する。
【0039】
特に断りない限り、本明細書で使用される下記用語及び表現は、本発明の意味において、下記意味を有することが意図される。
【0040】
「キジ科鳥類」という用語は、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、クジャク、ホロホロチョウ及び他の家禽動物を含むキジ目（又はキジ目）の鳥類を指す。好ましくは、胚は、ニワトリ（Gallus gallus）又はウズラ（Coturnix japonica）由来であろう。これらの２種は、一般的に、実験室で使用される。
【0041】
「キジ科鳥類胚」という用語は、胚が３５℃～４２℃の温度に加熱されたインキュベーター内に置かれることにより、適切な条件下で正常に発生する、受精したキジ科鳥類卵を指す。
【0042】
本発明の具体的な実施態様では、キジ科鳥類胚は、ニワトリ胚である。
【0043】
「キメラ胚」という用語は、内因性細胞と称される前記胚由来の細胞を有し、少なくとも１種の他の生物由来の外因性細胞をさらに有する胚を指し、前記外因性細胞は、移植片としての受入れ後に胚の不可欠な部分となり、レシピエント胚の組織内でそれらの発生を継続する。このキメラ胚は、成体キメラ生物を作り出すのに十分に発生することを意図するものではなく、短期間の間、外因性細胞を支持するためにのみ使用される。このキジ科鳥類胚は、キメラ生物を生じさるものではなく、外因性細胞の集団に関する研究が完了するとすぐに、有効な倫理的規則に従って殺処分されるであろう。
【0044】
「外因性細胞」という用語は、レシピエント生物、本例では、キジ科鳥類胚に導入された別の生物由来の細胞を指す。
【0045】
「細胞の集団」という用語は、全て同じ性質及び機能を有する、類似する細胞群を指す。例えば、「免疫細胞の集団」は、Ｔリンパ球であろうし、別の集団は、Ｂリンパ球であろうし、別の集団は、マクロファージであろう。
【0046】
「ガン」という用語は、この病理に罹患した生物の最初は正常な細胞の、形質転換により、突然変異又は遺伝的不安定性により形成される悪性細胞の生物中の存在により特徴付けられる病理を指す。
【0047】
「ガン細胞」という用語は、液体腫瘍又は固形腫瘍に由来する悪性細胞を指す。「ガン細胞の集団」は、例えば、メラノーマ細胞であろうし、別の集団は、神経膠芽腫細胞であろうし、別の集団は、乳ガン細胞であろう。
【0048】
「免疫細胞」という用語は、全て「白血球」と称される免疫系の細胞を指す。これらの細胞を２つの主要なファミリー：好中球及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、すなわち、丸い核を有する血球に分類することができる。それらは両方とも、同じ造血前駆細胞から生じるが、「免疫細胞」という用語は、「赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ」とも称される赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）を含まない。
【0049】
前記ＰＢＭＣは、
－Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ（ナチュラルキラー）細胞を含むリンパ球
－単球、マクロファージ及び樹状細胞
を含む。
－Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ（ナチュラルキラー）細胞を含むリンパ球
－単球、マクロファージ及び樹状細胞
を含む。
【0050】
「組織」という用語は、生物において特定の機能を行う、同じ起源からの類似する細胞及びそれらの細胞外マトリックスの集合体を指す。組織は、臓器、筋肉、結合組織、上皮、腺、神経組織（中枢又は末梢）又はその特定の機能が依然として未知である胚組織であることができる。したがって、「胚組織」は、未だ完全に分化していない、典型的又は成体組織に相同な任意の胚組織を指す。
【0051】
さらに、本発明の意味において、「胚組織」は、特に、
－前記胚の胚体外付属物、例えば、絨毛尿膜（ＣＡＭ）並びに
－管（例えば、神経管）の管腔及び血管（例えば、血管）
を除いた、胚の任意の組織を指す。
－前記胚の胚体外付属物、例えば、絨毛尿膜（ＣＡＭ）並びに
－管（例えば、神経管）の管腔及び血管（例えば、血管）
を除いた、胚の任意の組織を指す。
【0052】
「前記胚の少なくとも１種の組織に存在する」という表現は、本発明の意味における鳥類胚の組織中の外因性細胞の存在を指す。これらの細胞は、好ましくは、腫瘍の形態に凝集される。
【0053】
「前記胚の血管中を循環する」という表現は、鳥類胚の血液循環中、すなわち、前記胚の血管中を循環している外因性免疫細胞が存在することを指す。
【0054】
鳥類の胚に存在する免疫細胞の集団
キメラキジ科鳥類胚は、少なくとも１種の免疫細胞の集団を含む。
キメラキジ科鳥類胚は、少なくとも１種の免疫細胞の集団を含む。
【0055】
優先的には、この少なくとも１種の免疫細胞の集団は、下記：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ(ナチュラルキラー）細胞を含むリンパ球の中から選択される。
【0056】
具体的な実施態様では、全ての免疫細胞の集団は、１つの生物、特に、同じヒトに由来する。ヒト由来の免疫細胞を、血液サンプルを採取し、続けて、異なるタイプの血液細胞を分離することにより、容易に収集することができる。
【0057】
本発明の具体的な実施態様では、キメラキジ科鳥類胚は、１種の免疫細胞の集団のみを含む。
【0058】
本発明のより具体的な実施態様では、免疫細胞の集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなる。
【0059】
本発明の別の具体的な実施態様では、免疫細胞の集団は、リンパ球からなる。
【0060】
本発明の別の具体的な実施態様では、免疫細胞の集団は、Ｂリンパ球(Ｂ細胞）からなる。
【0061】
本発明の別の具体的な実施態様では、免疫細胞の集団は、Ｔリンパ球(Ｔ細胞）からなる。
【0062】
本発明の別の具体的な実施態様では、免疫細胞の集団は、遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞からなる。
【0063】
遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、特異的な腫瘍エピトープをターゲットとする特異的レセプターを発現させるために、当業者に周知の任意の方法に従って遺伝子改変されたＣＡＲ－Ｔ細胞を指す。これらの細胞は、腫瘍細胞をターゲットとし、それを認識して、それらを破壊することが可能である。本発明の意味において、遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、自己（患者から生じ、その後、前記患者に再注入される）又は同種（ドナーから生じ、任意の人間に注射可能となるように改変される）であることができる。
【0064】
有利には、これらの遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍特異的抗原を認識し、Ｔ細胞活性化を誘引し、同時刺激シグナルを持続することが可能なキメラレセプターを発現する。
【0065】
鳥類の胚に存在するガン細胞の集団
キメラキジ科鳥類胚は、少なくとも１種のガン細胞の集団を含む。
キメラキジ科鳥類胚は、少なくとも１種のガン細胞の集団を含む。
【0066】
具体的な実施態様では、全てのガン細胞の集団は、１つの生物、特に、同じヒトに由来する。ヒト由来のガン細胞を当業者に公知の任意の技術により得ることができる。
【0067】
本発明の具体的な実施態様では、キメラキジ科鳥類胚は、１種のガン細胞の集団のみを含む。
【0068】
前記胚の少なくとも１種の組織に存在する外因性ガン細胞は、任意の起源のものであることができる。特に、これらのガン細胞は、不死化ガン細胞系統又は腫瘍サンプル由来であることができる。
【0069】
本発明の具体的な実施態様では、外因性ガン細胞は、患者の腫瘍から生じる。
【0070】
本発明の実施態様によれば、外因性ガン細胞は、原発性又は続発性脳腫瘍に由来する細胞、例えば、神経膠芽腫細胞又は神経膠腫細胞、肺ガン細胞、特に、「ＥＧＦＲ突然変異」肺ガン細胞、乳ガン細胞、特に、ＨＥＲ２＋／ＥＲ＋乳ガン細胞、前立腺ガン細胞、肉腫細胞、メラノーマ細胞、生殖細胞腫瘍細胞、リンパ腫細胞、特に、濾胞性リンパ腫細胞、肝臓ガン細胞、消化器ガン細胞及び卵巣ガン細胞からなる群より選択される。
【0071】
両方の細胞の集団の特徴
本発明のキメラキジ科鳥類胚は、両方のタイプの外因性細胞を含む。本発明の具体的な実施態様では、両方の外因性細胞の集団は、ヒト細胞である。
本発明のキメラキジ科鳥類胚は、両方のタイプの外因性細胞を含む。本発明の具体的な実施態様では、両方の外因性細胞の集団は、ヒト細胞である。
【0072】
本発明の別の具体的な実施態様では、両方の外因性細胞の集団は、同じ生物、特に同じガン患者から生じる。
【0073】
本発明の別の実施態様では、両方の外因性細胞の集団は、少なくとも２種類の生物から生じる。例えば、
－少なくとも１種のガン細胞の集団は、患者の腫瘍から生じ、
－少なくとも１種の免疫細胞の集団は、ドナーから生じ、遺伝子操作された同種ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団である。
－少なくとも１種のガン細胞の集団は、患者の腫瘍から生じ、
－少なくとも１種の免疫細胞の集団は、ドナーから生じ、遺伝子操作された同種ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団である。
【0074】
この構成では、キメラ胚は、同種ＣＡＲ－Ｔ細胞が特定の患者由来のガン細胞を認識しかつ／又は破壊する能力を試験するのに使用される。
【0075】
この実施態様の別の例は、下記のとおりである。
－少なくとも１種のガン細胞の集団は、不死化細胞系統から生じ、
－少なくとも１種の免疫細胞の集団は、患者又は健常ドナーから生じる。
－少なくとも１種のガン細胞の集団は、不死化細胞系統から生じ、
－少なくとも１種の免疫細胞の集団は、患者又は健常ドナーから生じる。
【0076】
この構成では、キメラ胚は、患者由来の免疫細胞が特定のガン細胞を認識しかつ／又は破壊する能力を試験するのに使用される。
【0077】
実施態様の別の例は、下記のとおりである。
－少なくとも１種のガン細胞の集団は、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）マウスから生じ、
－少なくとも１種の免疫細胞の集団は、患者又は健常ドナーから生じる。
－少なくとも１種のガン細胞の集団は、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）マウスから生じ、
－少なくとも１種の免疫細胞の集団は、患者又は健常ドナーから生じる。
【0078】
この構成では、キメラ胚は、患者／健常ドナー由来の免疫細胞が特定のガン細胞を認識しかつ／又は破壊する能力を試験するのに使用される。
【0079】
別の構成では、
－少なくとも１種のガン細胞の集団は、患者もしくはヒト細胞系統又はマウスＰＤＸマウスから生じ、
－少なくとも１種の免疫細胞の集団は、ヒト免疫系が再構成されたヒト化マウスモデルから生じる。
－少なくとも１種のガン細胞の集団は、患者もしくはヒト細胞系統又はマウスＰＤＸマウスから生じ、
－少なくとも１種の免疫細胞の集団は、ヒト免疫系が再構成されたヒト化マウスモデルから生じる。
【0080】
この構成では、キメラ胚は、免疫細胞が特定のガン細胞を認識しかつ／又は破壊する能力を試験するのに使用される。
【0081】
本発明の別の好ましい実施態様では、少なくとも１種の外因性細胞の集団はラベルされる。好ましくは、免疫細胞の集団及びガン細胞の集団は両方とも、それらを区別するために、特に、２つの異なる色又はマーカーでラベルされる。
【0082】
鳥類胚における外因性細胞の局在
本発明のキメラキジ科鳥類胚において、
－外因性ガン細胞は、前記胚の少なくとも１種の組織に存在し、
－外因性免疫細胞は、前記胚の少なくとも１種の組織に存在しかつ／又は前記胚の血管中を循環する。
本発明のキメラキジ科鳥類胚において、
－外因性ガン細胞は、前記胚の少なくとも１種の組織に存在し、
－外因性免疫細胞は、前記胚の少なくとも１種の組織に存在しかつ／又は前記胚の血管中を循環する。
【0083】
したがって、本発明は、３つの別個の構成に関する。
(１) キメラキジ科鳥類胚、ここでガン細胞及び免疫細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在する；
(２) キメラキジ科鳥類胚、ここでガン細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在し、全ての免疫細胞が前記胚の血管中を循環する；及び
(３) キメラキジ科鳥類胚、ここでガン細胞及び免疫細胞が前記胚の少なくとも１種の組織中に存在し、一部の免疫細胞が前記胚の血管中を循環する。
(１) キメラキジ科鳥類胚、ここでガン細胞及び免疫細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在する；
(２) キメラキジ科鳥類胚、ここでガン細胞が前記胚の少なくとも１種の組織に存在し、全ての免疫細胞が前記胚の血管中を循環する；及び
(３) キメラキジ科鳥類胚、ここでガン細胞及び免疫細胞が前記胚の少なくとも１種の組織中に存在し、一部の免疫細胞が前記胚の血管中を循環する。
【0084】
３つの構成では、ガン細胞は、前記胚の少なくとも１種の組織に存在する。ガン細胞は全て、前記胚の１種の組織のみに再編成されることができ又は２種、３種、４種、５種もしくはそれ以上の異なる組織に存在することができる。
【0085】
具体的な実施態様では、ガン細胞は、少なくとも１つの腫瘍、すなわち、組織に挿入されたガン細胞の塊を形成する。
【0086】
構成（１）及び（３）の好ましい実施態様では、両方のタイプの外因性細胞は、同じ少なくとも１種の胚組織に局在し、特に、免疫細胞は、ガン細胞により形成される腫瘍に存在する。とりわけ、免疫細胞は、腫瘍に浸潤している。ガン細胞は、１つ以上の腫瘍を形成することができる。
【0087】
この構成は、腫瘍が身体の免疫細胞により浸潤されるｉｎ ｖｉｖｏ状況を反映するため、特に有利である。レシピエント胚における外因性ガン細胞及び免疫細胞のこの物理的会合は、体内の腫瘍の構造を反映する。したがって、本発明のキメラキジ科鳥類胚は、腫瘍細胞と免疫細胞との間の相互作用を研究するための関連動物モデルである。
【0088】
本発明の好ましい実施態様では、両方のタイプの外因性細胞は、物理的に会合している。特に、免疫細胞及びガン細胞は、胚の少なくとも１種の組織において、免疫細胞により浸潤された固体腫瘍を形成する。
【0089】
有利には、腫瘍は、免疫細胞の種々の部分集団、特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞により浸潤され、例は、移植された胚において形成された腫瘍に存在する免疫細胞集団の多様性を示す。図４Ｂに示されたように、移植されたＰＢＭＣの全ての部分集団は、移植後の胚において維持される。
【0090】
有利には、腫瘍は、活性化及び／又は疲弊のマーカーを発現する免疫細胞により浸潤される。特に、前記免疫細胞は、ＰＤ１及び／又はＴＩＭ－３消耗マーカーを発現する。興味深いことに、ＰＤ１を発現する免疫細胞は、抗ＰＤ１化合物による処理に応答する。
【0091】
本発明の具体的な実施態様では、胚において形成された腫瘍は、活性化（ＣＤ６９、ＣＤ２５）及び／又は疲弊（ＰＤ１、ＴＩＭ－３）のマーカーを発現する外因性免疫細胞を含む。
【0092】
有利には、移植後のキジ科鳥類胚において形成された腫瘍において、患者体内の腫瘍の代表的な生理学である免疫細胞と腫瘍細胞との間の「対話」が存在する。
【0093】
３つの構成の好ましい実施態様では、外因性ガン細胞は、ガン細胞の集団の性質に関連し、特に、ガン患者において原発性又は続発性腫瘍が形成される代表的な組織／臓器、すなわち、同等の組織又は臓器である少なくとも１種の胚組織に存在する。
【0094】
「代表的な組織」又は「同等の組織」という両方の用語は、互換的に使用され、非胚性ほ乳類組織と同等であるが、その胚性状態及びキジ科鳥類生物の形態にあるキジ科鳥類胚組織を指す。これらの用語は、特定の非胚性ほ乳類組織の組織性、細胞性及び／又は分子的態様を模倣する組織を指す。
【0095】
例えば、内胚葉から生じる胚性結腸は、ほ乳類の代表的な結腸臓器であり、外因性ガン細胞が、ガン結腸細胞である場合、それらは、前記内胚葉（ｅｎｄｏｄｅｒｍｉｃ ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）に存在する。
【0096】
別の例は、外因性ガン細胞が骨組織に転移する傾向がある乳ガン細胞である場合であり、この場合、外因性ガン細胞は、中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍ ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）から生じた胚性骨に存在する場合がある。
【0097】
本発明のキメラキジ科鳥類胚の得る方法
また、本発明は、下記連続する工程：
・外因性免疫細胞の集団及びガン細胞の集団の両方をキジ科鳥類胚に導入する工程と、
・このキメラ胚を好ましくは、３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程とを含む、前述のようなキメラキジ科鳥類胚を得るための方法に関する。
また、本発明は、下記連続する工程：
・外因性免疫細胞の集団及びガン細胞の集団の両方をキジ科鳥類胚に導入する工程と、
・このキメラ胚を好ましくは、３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程とを含む、前述のようなキメラキジ科鳥類胚を得るための方法に関する。
【0098】
「導入」という用語は、それ自体の細胞に加えて、外因性細胞を含むキメラ胚を作製するのに有用な任意の技術を指す。特に、細胞の導入は、胚の特定の組織への外因性細胞の移植である。
【0099】
インキュベーション工程を標準的な技術に従って、特に、湿度飽和インキュベーター中において行うものとする。
【0100】
インキュベーションの温度は、当業者の知識に従って、キジ科鳥類胚の性質に適合されるであろう。具体的な実施態様では、インキュベーター温度は、３５℃～４２℃に含まれ、ここで、範囲境界値が含まれる。優先的には、インキュベーション温度は、３７℃～４０℃に含まれ、好ましくは、ニワトリ胚について、約３８．５℃である。
【0101】
インキュベーション時間は、少なくとも６時間であり、これは、胚の少なくとも１種の組織へのガン細胞の最初の凝集を得るのに必要な時間である。優先的には、インキュベーション期間は、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間又は少なくとも４８時間である。インキュベーション期間は、一般的には、約２４時間又は約４８時間である。
【0102】
優先的には、胚のインキュベーション及び分析は、胚の完全な胚発生の前（すなわち、ニワトリ胚について、受精後２１日）に停止され、より優先的には、インキュベーション及び分析のプロセスは、胚発生の期間の最初の２／３、すなわち、受精後１４日の前に終了される。
【0103】
両方のタイプの方法は、本発明の目的であり、以下に詳述される。
【0104】
第１の実現態様では、本発明の方法は、下記連続する工程：
・ＨＨ１０期とＨＨ３０期の間の発生段階にあるキジ科鳥類胚の少なくとも１種の組織に免疫細胞の集団及びガン細胞の集団の両方を共移植する工程と、
・このキメラ胚を３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程と
を含む。
・ＨＨ１０期とＨＨ３０期の間の発生段階にあるキジ科鳥類胚の少なくとも１種の組織に免疫細胞の集団及びガン細胞の集団の両方を共移植する工程と、
・このキメラ胚を３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程と
を含む。
【0105】
「共移植」という用語は、本発明の意味において、１回のみの処理の間に、レシピエント胚の少なくとも１種の組織に両方のタイプの外因性細胞を導入することを指す。
【0106】
外因性細胞を下記：
－ターゲット組織に注入される懸濁細胞；
－免疫細胞とガン細胞との両方を含む腫瘍組織の固体片（ブロック）；
－単離された細胞の凝集体／ホモジネート
の形態で移植することができる。
－ターゲット組織に注入される懸濁細胞；
－免疫細胞とガン細胞との両方を含む腫瘍組織の固体片（ブロック）；
－単離された細胞の凝集体／ホモジネート
の形態で移植することができる。
【0107】
レシピエントキジ科鳥類胚への外因性細胞の移植を当業者に周知の方法に従って行う。実際に、キジ科鳥類胚には、卵殻に小さな開口を作った後、容易に接近可能である。特に、ガン細胞の移植を、空気式マイクロインジェクター（Picopump PV830, World Precision Instruments)を使用して行う。この技術は、特に、ＷＯ第２０１６／０５３９８号及び同第２０１７／１０３０２５号に提示されている。
【0108】
キジ科鳥類胚の幾つかの発生段階は、受精後のインキュベーション時間の関数として以前に定義されており、Hamburger及びHamilton(1951, J Morphol.)により定義された基準に従って決定される。
【0109】
本発明によれば、外因性細胞の移植時に、キジ科鳥類胚は、ＨＨ１０期とＨＨ３０期との間の発生段階にある。
【0110】
好ましくは、外因性細胞の導入時に、キジ科鳥類胚は、ＨＨ１２期とＨＨ２５期との間の発生段階にある。受精後４０時間～４．５日に起こる胚のこの発達段階は、胚発生の多くの重要な事象により特徴付けられ、その中で、体節の出現、大脳領域の細分化、胚の種々の領域の湾曲及び多数の臓器の形成により特徴付けられる。
【0111】
別の好ましい態様によれば、外因性細胞の導入時に、キジ科鳥類胚は、ＨＨ１０期とＨＨ１８期との間、ＨＨ１０期とＨＨ１５期との間又はＨＨ１２期とＨＨ１６期との間の発生段階にある。
【0112】
好ましくは、ガン細胞の移植をＨ１３期とＨＨ１５期の間、すなわち、受精後４８時間～５５時間、好ましくは、受精後５０時間～５３時間（ＨＨ１４期）の発生段階にあるレシピエントキジ科鳥類胚に行う。
【0113】
第２の実現態様では、本発明の方法は、下記工程：
・ＨＨ１０期とＨＨ３０期との間の発生段階にあるキジ科鳥類胚の少なくとも１種の組織に少なくとも１種のガン細胞の集団を移植する工程と、
・前記少なくとも１種の免疫細胞の集団を前記胚の血管内に注入する工程と、
・移植された胚を３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程と
を含む。
・ＨＨ１０期とＨＨ３０期との間の発生段階にあるキジ科鳥類胚の少なくとも１種の組織に少なくとも１種のガン細胞の集団を移植する工程と、
・前記少なくとも１種の免疫細胞の集団を前記胚の血管内に注入する工程と、
・移植された胚を３５℃～４２℃に含まれる温度で、少なくとも６時間インキュベーションする工程と
を含む。
【0114】
移植工程及びインキュベーション工程は、先に記載されており、先に示されたように行われる。
【0115】
この方法の実現形態において、「細胞を注入する」工程は、当業者に公知の任意の技術により、免疫細胞が胚の血液循環に導入される工程に対応する。
【0116】
この注入工程を、ガン細胞を移植する工程と同時に又は同工程の前もしくは同工程の後に行うことができる。特に、免疫細胞の注入工程を、胚の発生の後期、すなわち、ＨＨ３０期後に行うことができる。ただし、好ましい実施態様では、両方のタイプの外因性細胞を同時に胚に導入する。
【0117】
一部の場合には、実施例のセクションに示されるように、免疫細胞は、少なくとも１種の組織に移植されたガン細胞に結合し、腫瘍に浸潤するであろう。一部の他の場合には、免疫細胞は、胚の血管内を循環し、血液循環によるガン細胞の発達に作用するそれらの能力が試験されるであろう。一部の他の場合には、免疫細胞は、ガン細胞への結合及び胚の血管内での循環の両方をするであろう。
【0118】
具体的な実施態様では、ガン細胞の集団の移植を前記ガン細胞の集団の性質に関連し、特に、ガン患者において原発性及び／又は続発性腫瘍が形成される代表的な組織／臓器である少なくとも１種の胚組織において行う。
【0119】
本発明の意味において、前記「関連する」組織は、ガン細胞の起源に従う組織であるか又は通常前記ガン細胞によりコロニー形成される、すなわち、二次腫瘍（転移）が埋め込まれる組織であるかのいずれかである。
【0120】
外因性ガン細胞を、異なる組織、例えば、神経管を構成する組織（管腔ではない）、脳組織、消化構造、例えば、肝臓、腸又は膵臓を前もって形成する胚組織、皮膚、骨及び骨髄を前もって形成する胚組織又は体節領域において、レシピエント胚に移植することができる。
【0121】
動物モデル及びその使用
また、本発明は、上記提示されたキメラキジ科鳥類胚からなるか又は上記された方法のいずれか１つにより得ることが容易なヒトのガンの研究のための動物モデルに関する。
また、本発明は、上記提示されたキメラキジ科鳥類胚からなるか又は上記された方法のいずれか１つにより得ることが容易なヒトのガンの研究のための動物モデルに関する。
【0122】
また、本発明は、上記された方法のいずれか１つにより得られた、ヒトのガンの研究のための動物モデルに関する。
【0123】
本発明のこの動物モデルは、多くの用途を有する。
【0124】
特に、この動物モデルを、ガンに罹患した患者をモニターするのに使用することができる。実際、このような動物モデルにより、患者の腫瘍の発達をｅｘ ｖｉｖｏで、特に、時間Ｔ０（例えば、前記処置の開始前）及び時間Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３（例えば、ガン患者の処置の開始後）に処置を開始した後にモニターすることが可能となる。
【0125】
また、動物モデルを、ガンの処置を意図した治療用分子をスクリーニングするのにも使用することができる。
【0126】
特に、本発明は、下記群：
－免疫療法：患者の免疫細胞の抗腫瘍活性を促進することからなる治療戦略、
－化学療法：ガン細胞の生存、代謝、運動性及び／又は増殖に影響を及ぼす薬剤、
－ターゲット療法：ガン細胞により発現される特定の分子をターゲットとする抗体等の化合物の使用、
－ホルモン療法：ホルモン分子シグナル伝達をターゲットとする化合物の使用、
－抗ガン剤並びに
－治療酵素
の中から選択される少なくとも１種の抗ガン療法をスクリーニングするための、本発明の動物モデルの使用に関する。
－免疫療法：患者の免疫細胞の抗腫瘍活性を促進することからなる治療戦略、
－化学療法：ガン細胞の生存、代謝、運動性及び／又は増殖に影響を及ぼす薬剤、
－ターゲット療法：ガン細胞により発現される特定の分子をターゲットとする抗体等の化合物の使用、
－ホルモン療法：ホルモン分子シグナル伝達をターゲットとする化合物の使用、
－抗ガン剤並びに
－治療酵素
の中から選択される少なくとも１種の抗ガン療法をスクリーニングするための、本発明の動物モデルの使用に関する。
【0127】
とりわけ、本発明の動物モデルを遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を評価するのに使用することができる。具体的な実施態様では、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞は、任意の患者において使用されることが意図される同種ＣＡＲ－Ｔ細胞である。これらの同種細胞の有効性及び安全性を本発明の動物モデルにおいて試験することができる。
【0128】
実施例
本明細書において、本発明を特定の実施態様を参照して説明してきたが、これらの実施態様は、本発明の原理及び用途の単なる例示であることを理解されたい。したがって、多くの修正を例示された実施態様に対して行うことができること並びに添付の特許請求の範囲により定義された本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、他の構成を考案することができることを理解されたい。
本明細書において、本発明を特定の実施態様を参照して説明してきたが、これらの実施態様は、本発明の原理及び用途の単なる例示であることを理解されたい。したがって、多くの修正を例示された実施態様に対して行うことができること並びに添付の特許請求の範囲により定義された本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、他の構成を考案することができることを理解されたい。
【0129】
材料及び方法
gallus gallusの受精卵を専用農場、例えば、EARL MORIZEAU, DANGERS, FRANCEから取得し、使用するまで１４℃に維持した。ランニング実験のために、ハミルトン命名法に従って、発生段階ＨＨ１３～ＨＨ１６にある胚を得るために、卵を３８．５℃で５２時間インキュベーションした。
gallus gallusの受精卵を専用農場、例えば、EARL MORIZEAU, DANGERS, FRANCEから取得し、使用するまで１４℃に維持した。ランニング実験のために、ハミルトン命名法に従って、発生段階ＨＨ１３～ＨＨ１６にある胚を得るために、卵を３８．５℃で５２時間インキュベーションした。
【0130】
操作のために、窓を殻に開けた。
【0131】
ヒトＰＢＭＣ及び腫瘍細胞を、それらを挿入するマイクロインジェクター（Pipopump PV830, World Precision Instruments)を使用して移植した。
【0132】
(１)一部の実験では、ヒトＰＢＭＣを、絨毛尿膜上に存在する血管を通して、胚の血管に注入した。ガン細胞を、ＷＯ第２０１６／０５３９８号及び同第２０１７／１０３０２５号に記載された方法に従って移植する。
【0133】
(２)他の実験では、両方のタイプの細胞をヒト腫瘍細胞が腫瘍を形成する組織内の胚の選択された部位に共移植して、ヒト免疫細胞の間質を有する腫瘍を確立した。
【0134】
胚をガン細胞の移植後２４時間～４８時間にわたって、インキュベーションを維持した。それらを卵から収集し、種々の実験のために処理した。一部の実験では、胚をコラゲナーゼで消化し、ヒト細胞を更なる分析のために単離した。他の実験では、胚を４％ パラホルムアルデヒドにより、４℃で一晩固定した。胚を光学シート顕微鏡（LaVision Biotec）による撮像のために清澄化した。
【0135】
Ｉ．鳥類胚モデルにＰＢＭＣを移植する実現可能性の実証
実施例１
条件（１）：胚形成ニワトリ卵の殻を開けた。健常ドナーからのヒトＰＢＭＣを胚の脈管構造（血液循環）に注入した。
実施例１
条件（１）：胚形成ニワトリ卵の殻を開けた。健常ドナーからのヒトＰＢＭＣを胚の脈管構造（血液循環）に注入した。
【0136】
条件（２）：ＰＢＭＣを調製し、バイタル蛍光トレーサーでラベルし、鳥類胚のターゲット組織にマイクロキャピラリーを使用した注入により移植した。
【0137】
ＰＢＭＣ注入（１）又は移植（２）後２日で、胚を回収し、パラホルムアルデヒド中に固定し、立体顕微鏡により撮像し、ついで、清澄化し、光学シート顕微鏡を使用して撮像した。
【0138】
他の実験では、胚をコラゲナーゼで消化し、ＰＢＭＣをPercoll勾配で精製した。
【0139】
【0140】
実施例２
別の実験では、健常ドナーからのＰＢＭＣを、バイタル蛍光トレーサー（ＣＦＳＥ：カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）でラベル、ついで、受精５６時間後にニワトリ胚（ＨＨ１３～ＨＨ１５）の脈管構造に注入した。
別の実験では、健常ドナーからのＰＢＭＣを、バイタル蛍光トレーサー（ＣＦＳＥ：カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）でラベル、ついで、受精５６時間後にニワトリ胚（ＨＨ１３～ＨＨ１５）の脈管構造に注入した。
【0141】
２日後、胚を回収し、頭部除去後にコラゲナーゼで消化した。ＰＢＭＣを、FICOLL及びPERCOLL勾配技術を使用して単離し、蛍光ＰＢＭＣ細胞をＦＡＣＳにより分析した。
【0142】
結果を図２に示す。結果から、注入されたＰＢＭＣが胚への導入の４８時間後に生存していることが実証される。
【0143】
実施例３
ＰＢＭＣを胚の脈管構造に異なる用量で注入した。注入の２日（４８時間）後に、単離されたＰＢＭＣを計数して、％ 生存を決定した。
ＰＢＭＣを胚の脈管構造に異なる用量で注入した。注入の２日（４８時間）後に、単離されたＰＢＭＣを計数して、％ 生存を決定した。
【0144】
結果を図３に示す。細胞生存は、高用量、例えば、６×１０５個/μl（黒色三角）で、良好な生存が観察されたより少数のＰＢＭＣ(２倍希釈）の注入と比較して損なわれた。細胞の絶対数ではなく、注入された細胞の濃度は、細胞生存に重要なパラメータであると考えられる。
【0145】
実施例４
ヒト血液サンプルからのＰＢＭＣを調製し、産卵後５６時間（ＨＨ１４）に鳥類胚の組織に移植した。
ヒト血液サンプルからのＰＢＭＣを調製し、産卵後５６時間（ＨＨ１４）に鳥類胚の組織に移植した。
【0146】
移植後２日で、胚を回収し、コラゲナーゼを使用して消化した。免疫細胞を精製し、免疫細胞の部分集団を、全免疫細胞集団に対するＢリンパ球（ＣＤ１９＋）及びＴ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋）集団の割合を決定するために、ＦＡＣＳにおいて分子マーカーにより分析した。ついで、全ＰＢＭＣ集団（ＣＤ４５＋細胞）にわたる全ての主要なＰＢＭＣ部分集団：リンパ球（Ｂ及びＴ）、ナチュラルキラー、骨髄細胞（本明細書において、単球と称する）をモニターした。
【0147】
結果を図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃに示す。「ＰＢＭＣ」は、移植前の免疫細胞を指し、「ＡＶＩ－ＰＢＭＣ」は、コラゲナーゼ処理胚からのPercoll単離後に移植され、分析されたＰＢＭＣ細胞を指す。
【0148】
図４Ａにおいて、値は、総特定リンパ球（ＣＤ１９＋及びＣＤ３＋）の比で表現される。
【0149】
これらの条件下で、総免疫細胞集団に対するＢリンパ球の集団の割合は、新鮮なＰＢＭＣの集団と比較して、ニワトリ胚においてより低かった。この割合の差は、異種移植片（ＰＤＸ）のマウスモデルにおいても観察される。
【0150】
図４Ｂに、ニワトリ胚への免疫細胞の移植前（ＰＢＭＣ）及び移植後４８時間（ＡＶＩ－ＰＢＭＣ）の免疫細胞の部分集団再分配を示す。興味深いことに、全てのＰＢＭＣ部分集団は、ニワトリ胚への移植後に維持されていた。
【0151】
図４Ｃに、ニワトリ胚への免疫細胞の移植前（ＰＢＭＣ）及び移植後４８時間（ＡＶＩ－ＰＢＭＣ）での、免疫細胞による活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ２５）及び疲弊マーカー（ＰＤ１、ＴＩＭ－３）の発現を示す。Ｔリンパ球の２つの集団：ＣＤ８＋及びＣＤ４＋を分析する。
【0152】
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球Ｔ細胞の両方を移植した後に、ＣＤ６９が有意に増加したことを除いて、他のマーカーの発現は、移植後に維持されるか又はわずかに増加する。ＰＢＭＣの活性化はかなり弱い。これは、同種反応が弱いことを示す。ＰＢＭＣ移植は、胚の発生を妨げない。これは、ホスト及び移植されたＰＢＭＣが共存することができることを示す。
【0153】
ＩＩ．鳥類胚モデルへのＰＢＭＣと腫瘍細胞系統とを共移植する実現可能性の実証
実施例５．免疫細胞の外因性集団及びガン細胞の外因性集団の両方の導入
ヒトＰＢＭＣをバイタル蛍光トレーサーでラベルした。
実施例５．免疫細胞の外因性集団及びガン細胞の外因性集団の両方の導入
ヒトＰＢＭＣをバイタル蛍光トレーサーでラベルした。
【0154】
２つの蛍光ヒト腫瘍細胞系統を使用した。
－患者サンプルに由来する原発性メラノーマ細胞系統（Ｐｍｅｌａ、転移性ＢＲＡＦ Ｖ６００メラノーマ））（ＧＬＯとも称される）及び
－ＭＤＡＭＢ４３６細胞（市販のトリプルネガティブ乳ガン細胞系統）（ＭＤＡＭとも称される）
－患者サンプルに由来する原発性メラノーマ細胞系統（Ｐｍｅｌａ、転移性ＢＲＡＦ Ｖ６００メラノーマ））（ＧＬＯとも称される）及び
－ＭＤＡＭＢ４３６細胞（市販のトリプルネガティブ乳ガン細胞系統）（ＭＤＡＭとも称される）
【0155】
両方のタイプの細胞を材料及び方法セクションに提示されたように胚に導入する。
【0156】
条件（１）：ＰＢＭＣを胚の選択された組織に腫瘍細胞と共移植した。
【0157】
条件（２）：ＰＢＭＣを脈管構造に注入した。腫瘍細胞を胚の選択された組織に移植した。
【0158】
移植後２日で、胚を立体顕微鏡により撮像した。回収された胚を測定し、それらの重量を確定した。胚を清澄化し、共焦点光学シート顕微鏡により撮像した。画像を腫瘍体積の定量化のために、ソフトウェア（IMARIS）により処理した。
【0159】
両条件について、腫瘍内の免疫細胞の存在が観察された。免疫「随伴性」は、共移植法による細胞数に関してより堅牢であった。条件（１）についての結果を図５に示す。「マージ」写真は、両方のタイプの集団を表わす。
【0160】
【0161】
図６において、より明るいハロー（破線でマークで示す）は、鳥類胚に形成された腫瘍の周囲に再編成された免疫細胞を示す。
【0162】
図７において、ニワトリ胚に移植された腫瘍中の個々の腫瘍細胞がラベルされ（左側の写真）、ＰＢＭＣ由来の免疫細胞がラベルされている（右側の写真）。免疫細胞が腫瘍の周囲に再編成されている。
【0163】
実施例６．免疫細胞の有無による移植されたニワトリ胚のＢＳＡ及び腫瘍体積の測定
指標となる体サイズ面積（ＢＳＡ）を、ニワトリ胚へのＰＢＭＣの導入の毒性を決定するために測定する。
指標となる体サイズ面積（ＢＳＡ）を、ニワトリ胚へのＰＢＭＣの導入の毒性を決定するために測定する。
【0164】
図８に示された結果から、Ｐｍｅｌａ細胞単独が移植された胚（Ｇｌｏ）又はＰＢＭＣと共移植された胚（ＧＬＯ－ＰＢＭＣ）について、ＢＳＡの統計的差異が観察されなかったことが示される。
【0165】
図９に示された結果から、条件（１）に従って、Ｐｍｅｌａ細胞を単独で（Ｇｌｏ）又はヒトＰＢＭＣと組み合わせて（ＧＬＯ－ＰＢＭＣ）移植した場合の腫瘍体積の測定値が表わされる。
【0166】
グラフからは、移植されたガン細胞を有する胚とガン細胞及び免疫細胞の共移植片を有する胚との間で統計的差異が示されない。データを胚の体サイズ面積（ＢＳＡ）に対して正規化した。
【0167】
実施例７．腫瘍細胞とＰＢＭＣとの共移植
ニワトリ胚に、ＰＢＭＣを下記２つの腫瘍細胞系統：
－Ｐｍｅｌａ－転移性ＢＲＡＦ Ｖ６００メラノーマ由来の初代細胞（ＰＢＭＣ－ＧＬＯ）
－ＭＤＡＭＢ４３６及びＭＤＡＭＢ２３１－トリプルネガティブ乳ガン由来の不死化細胞系統（ＰＢＭＣ－ＭＤＡＭ）
のうちの少なくとも一方と共移植した。
ニワトリ胚に、ＰＢＭＣを下記２つの腫瘍細胞系統：
－Ｐｍｅｌａ－転移性ＢＲＡＦ Ｖ６００メラノーマ由来の初代細胞（ＰＢＭＣ－ＧＬＯ）
－ＭＤＡＭＢ４３６及びＭＤＡＭＢ２３１－トリプルネガティブ乳ガン由来の不死化細胞系統（ＰＢＭＣ－ＭＤＡＭ）
のうちの少なくとも一方と共移植した。
【0168】
移植後２日で、ＰＢＭＣを胚から精製し、異なる細胞集団の分子マーカー：ＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋をフローサイトメトリーにより分析した。結果を図１０Ａに示す。
【0169】
示されたように、ＰＢＭＣは、鳥類胚組織に移植された時に、移植前のそれらの休止状態と比較して反応する。腫瘍細胞の存在により、Ｔ細胞の活性が阻害され、ＣＤ６９及びＨＬＡＤＲマーカーのダウンレギュレーションがもたらされ、それらのレベルを新鮮なＰＢＭＣのレベルに戻す。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞上でのより高いレベルのＣＴＬＡ４が、ＰＢＭＣの移植後に観察される。Keytruda投与により、ＣＤ８ Ｔ細胞上でのＰＤ１発現／接近可能性の最小化がもたらされ。ＰＤ１遮断により、ＣＤ８区画上での非常に高いレベルのＣＴＬＡ４がもたらされる。これは、代償性発現を示唆している。
【0170】
図１０Ｂに、ニワトリ胚において、高いレベルでＰＤＬ１を発現するＰＢＭＣ及びＭＤＡＭＢ２３１細胞の共移植後の免疫細胞の表面上でのマーカー発現パターン（左側はＣＤ８＋、右側はＣＤ４＋）を示す。
【0171】
ガン細胞の存在下において、免疫細胞は、
〇特に、ＣＤ８＋プールにおける活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５発現の増加
〇疲弊マーカーＰＤ１及びＴＩＭ－３（免疫チェックポイント制御モデュレーターとも称される）発現の増加
を示す腫瘍に含まれる。
〇特に、ＣＤ８＋プールにおける活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５発現の増加
〇疲弊マーカーＰＤ１及びＴＩＭ－３（免疫チェックポイント制御モデュレーターとも称される）発現の増加
を示す腫瘍に含まれる。
【0172】
これらの結果から、共移植された腫瘍細胞の存在に対する免疫細胞の２段階反応が示される。
（ｉ）ＭＤＡＭＢ２３１腫瘍細胞は、単独で移植されたＰＢＭＣと比較して、ＣＤ６９及びＣＤ２５発現の増加により示されたように、Ｔ細胞を活性化する。
（ｉｉ）免疫チェックポイント制御モデュレーターであるＰＤ１及びＴＩＭ－３の発現の増加により示されるように、免疫応答の阻害はすでに目に見える。この発現パターンは、ガン細胞によるリンパ球に対する負の免疫レギュレーションを反映する（腫瘍細胞「逃れ」と相関する）。
（ｉ）ＭＤＡＭＢ２３１腫瘍細胞は、単独で移植されたＰＢＭＣと比較して、ＣＤ６９及びＣＤ２５発現の増加により示されたように、Ｔ細胞を活性化する。
（ｉｉ）免疫チェックポイント制御モデュレーターであるＰＤ１及びＴＩＭ－３の発現の増加により示されるように、免疫応答の阻害はすでに目に見える。この発現パターンは、ガン細胞によるリンパ球に対する負の免疫レギュレーションを反映する（腫瘍細胞「逃れ」と相関する）。
【0173】
このため、鳥類胚へのヒト免疫細胞の異種移植により、それらの活性化及びそれらの「中和」が誘引される。このことから、鳥類胚に導入された場合、Ｔ細胞は依然として機能的であり、同種細胞を認識することが可能であることが示される。
【0174】
ＩＩＩ．免疫療法により移植されたＰＢＭＣを処置する実現可能性の実証
実施例８．Keytruda (抗ＰＤ１）処置
この実験を、鳥類胚に導入されたＰＢＭＣのヒトＴ細胞状態を研究するために行った。Ｔ細胞区画は、幾つかの現在承認されているチェックポイント阻害剤、例えば、αＣＴＬＡ４及びＰＤ１軸遮断のターゲットである。
実施例８．Keytruda (抗ＰＤ１）処置
この実験を、鳥類胚に導入されたＰＢＭＣのヒトＴ細胞状態を研究するために行った。Ｔ細胞区画は、幾つかの現在承認されているチェックポイント阻害剤、例えば、αＣＴＬＡ４及びＰＤ１軸遮断のターゲットである。
【0175】
まず、移植されたＰＢＭＣ上でのＰＤ１レセプターの発現（図１１Ａ）及びガン細胞によるＰＤＬ１の発現（図１１Ｂ）を確認した。ＭＤＡＭＢ４３６細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、抗ＰＤＬ１抗体で免疫ラベルして、ＰＤ１リガンドであるＰＤＬ１の発現を決定した。同様の実験をＰｍｅｌａ細胞及びＭＤＡＭＢ２３１細胞について行った。
【0176】
ついで、ＭＤＡＭＢ４３６細胞又はＰｍｅｌａ細胞をヒトＰＢＭＣ細胞と共移植した。
【0177】
抗ＰＤ１抗体であるKeytruda(Pemzolibrumab, Merk)を移植後２４時間で注入した。移植後２日（４８時間）で、ＰＢＭＣを移植胚から単離し、ＦＡＣＳにより分析した。
【0178】
最後に、移植されたＰＢＭＣをPercoll密度分離により単離し、活性化マーカー（ＣＤ６９／ＨＬＡＤＲ）及び疲弊マーカー（ＣＴＬＡ４／ＰＤ１）について細胞を染色した。
【0179】
結果を以下にコメントする。
【0180】
ａ）移植された免疫細胞によるＰＤ１発現
図１１Ａに、２種類のドナー由来のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞における細胞表面上のＰＤ１発現のレベルを示す。ＰＤ１レセプターに拮抗するKeytruda(５倍に希釈）での処理後、ＰＤ１の検出は顕著に減少する。これらの結果から、Keytrudaは、移植された免疫細胞のＰＤ１レセプターに結合することが示される。
図１１Ａに、２種類のドナー由来のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞における細胞表面上のＰＤ１発現のレベルを示す。ＰＤ１レセプターに拮抗するKeytruda(５倍に希釈）での処理後、ＰＤ１の検出は顕著に減少する。これらの結果から、Keytrudaは、移植された免疫細胞のＰＤ１レセプターに結合することが示される。
【0181】
ｂ）移植されたガン細胞によるＰＤＬ１発現
結果を図１１Ｂに示す。インビトロで培養されたＭＤＡＭＢ４３６の約１０％は、ＰＤＬ１リガンドの発現を示す。Ｐｍｅｌａ細胞では、ＰＤＬ１発現は検出されなかった。ＰＤＬ１発現は、ＭＤＡＭＢ２３１において高い。
結果を図１１Ｂに示す。インビトロで培養されたＭＤＡＭＢ４３６の約１０％は、ＰＤＬ１リガンドの発現を示す。Ｐｍｅｌａ細胞では、ＰＤＬ１発現は検出されなかった。ＰＤＬ１発現は、ＭＤＡＭＢ２３１において高い。
【0182】
ｃ）Ｔ細胞状態
腫瘍細胞の中でも、Ｐｍｅｌａは、ＰＤＬ１陰性細胞系統であり、ＭＤＡＭＢ４３６は、弱ＰＤＬ１陽性細胞系統である。移植された鳥類胚を免疫療法である抗ヒトＰＤ１ Keytruda(Ｋ)で処理し又は処理しなかった。
腫瘍細胞の中でも、Ｐｍｅｌａは、ＰＤＬ１陰性細胞系統であり、ＭＤＡＭＢ４３６は、弱ＰＤＬ１陽性細胞系統である。移植された鳥類胚を免疫療法である抗ヒトＰＤ１ Keytruda(Ｋ)で処理し又は処理しなかった。
【0183】
細胞の部分集団をＰＢＭＣのPercoll単離後、ＦＡＣＳにより特定した。
【0184】
結果を図１１Ｃに示す。活性化マーカー（ＣＤ６９及びＨＬＡＤＲ、左側）及び疲弊マーカー（ＣＴＬＡ－４及びＰＤ１、右側）を、細胞の各集団：
－新鮮なＰＢＭＣ(どの胚にも導入していない）
－移植されたＰＢＭＣ
－移植されたＰＢＭＣ＋Ｋ：胚を抗ＰＤ１抗体であるKeytrudaで２４時間処理
－移植されたＰｍｅｌａ／ＰＢＭＣ：免疫細胞及びＰＤＬ１を発現しないガン細胞であるＰｍｅｌａの共移植
－移植されたＭＤＡＭ／ＰＢＭＣ：免疫細胞及びＰＤＬ１を発現するガン細胞であるＭＤＡＭの共移植
－移植されたＭＤＡＭ／ＰＢＭＣ＋Ｋ：胚を抗ＰＤ１抗体であるKeytrudaで２４時間処理
について決定した。
－新鮮なＰＢＭＣ(どの胚にも導入していない）
－移植されたＰＢＭＣ
－移植されたＰＢＭＣ＋Ｋ：胚を抗ＰＤ１抗体であるKeytrudaで２４時間処理
－移植されたＰｍｅｌａ／ＰＢＭＣ：免疫細胞及びＰＤＬ１を発現しないガン細胞であるＰｍｅｌａの共移植
－移植されたＭＤＡＭ／ＰＢＭＣ：免疫細胞及びＰＤＬ１を発現するガン細胞であるＭＤＡＭの共移植
－移植されたＭＤＡＭ／ＰＢＭＣ＋Ｋ：胚を抗ＰＤ１抗体であるKeytrudaで２４時間処理
について決定した。
【0185】
標準偏差は、種々の健常ドナーからのＰＢＭＣのプールからのデータを示す。値は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋集団及びＣＤ３＋ＣＤ８＋集団に対する特異的マーカーの比で表わされる。
【0186】
概ね、移植後に単離されたＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞は、活性化の徴候を示し、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ６９に対して大部分が陽性であったが、ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＨＬＡＤＲ発現を獲得した。
【0187】
阻害性レセプターに関して、本発明者らにより、ＰＢＭＣの移植後にＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞上により高いレベルのＣＴＬＡ４が観察されたが、より高いレベルのＰＤ１は、ＣＤ４ Ｔ細胞についてのみ当てはまった。
【0188】
このため、鳥類胚へのヒト免疫細胞の異種移植により、その活性化が誘引される。ヒト免疫細胞の活性化も、マウスモデルにおいて報告されている。このことは、鳥類胚に導入された場合、Ｔ細胞は依然として機能的であり、同種細胞を認識することが可能であることを示している。
【0189】
ＰＤ１遮断により、ＣＤ８区画上で非常に高いレベルのＣＴＬＡ４をもたらされる。これは、代償性発現を示唆した。
【0190】
ｄ)別の実験をＰＢＭＣと共移植されたＭＤＡＭＢ２３１細胞により行い、その後、移植された胚をKeytruda（５mg/ml）で処理した。
【0191】
共移植された免疫細胞上での活性化マーカー及び疲弊マーカーの発現を定量化した。結果を図１１Ｄに示す。
【0192】
疲弊マーカーであるＰＤ１及びＴＩＭ－３の発現は、Keytruda処置により減少する。これにより、Keytrudaが疲弊したＴリンパ球の応答性を回復させることが可能であることが確認される。
【0193】
活性化マーカーは、おそらく、Keytruda処置の後期に再構築されるであろう（２４時間の投与では、これらの活性化マーカーの発現を再構築するのには十分ではないと考えられる）。また、より高濃度のKeytrudaにより、細胞活性化の向上がもたらされるはずである。
【0194】
まとめると、２４時間のKeytruda投与により、ＰＤ１及びＴＩＭ－３の発現の減少により示されたように、免疫細胞の再活性化プロセスを開始することが可能である。
【0195】
ＩＶ．免疫療法処置に対する応答をモニターするためのモデルとしての、本発明の移植された鳥類胚の可能性の実証
実施例９．Ａ３７５細胞系統と共移植されたＰＢＭＣ
実施例９．Ａ３７５細胞系統と共移植されたＰＢＭＣ
【0196】
混合ヒト腫瘍細胞及び免疫細胞から構成される腫瘍が、抗ＰＤ１抗体処理に対して感受性であるかどうかを決定するために、ヒトメラノーマＡ３７５細胞系統を実験のために選択した。実際に、この細胞系統は、近年、顕著なレベルのＰＤＬ１を発現し、抗ＰＤ１免疫療法に応答することが報告された（Kuryk L, Moller AW, Jaderberg M, 2019）。
【0197】
Ａ３７５メラノーマ細胞を培養し、先に記載されたようにヒトＰＢＭＣ細胞と共移植した。
【0198】
抗ＰＤ１抗体であるKeytruda又は陰性対照（賦形剤）を移植後２４時間で、胚に注入した。
【0199】
移植後２～３日で、胚を回収し、共焦点光学シート顕微鏡による撮像のために処理した。腫瘍の体積を、IMARISソフトウェアを使用して定量化した。
【0200】
結果を図１２Ａに示す。Keytrudaの存在下において、腫瘍の体積が有意に減少する。これにより、ガン細胞の周囲に存在する免疫細胞がこの免疫療法処理に対して陽性に応答することが実証される。
【0201】
実施例１０．ＭＤＡＭＢ２３１細胞又は患者細胞と共移植されたＰＢＭＣ
実施例９の同じ実験を他のガン細胞：
－免疫療法に応答性であることが周知のＭＤＡＭＢ２３１及び
－転移性メラノーマに罹患した患者から生じた腫瘍サンプル
について行った。
実施例９の同じ実験を他のガン細胞：
－免疫療法に応答性であることが周知のＭＤＡＭＢ２３１及び
－転移性メラノーマに罹患した患者から生じた腫瘍サンプル
について行った。
【0202】
図１２Ｂに、腫瘍体積に対する、ヒトＰＢＭＣ及びＭＤＡＭＢ２３１腫瘍細胞を共移植された鳥類胚へのKeytruda投与の効果を示す（中央及び右パネルを参照のこと）。
【0203】
腫瘍体積の有意な減少が、Ｎａｃｌ投与と比較して、抗ＰＤ１処理条件において観察される。
【0204】
図１２Ｃに、ヒトＰＢＭＣ及び転移性メラノーマに罹患した患者からの腫瘍サンプルを共移植された鳥類胚へのKeytruda投与の効果を示す。
【0205】
転移体積の有意な減少が、Keytruda投与条件において観察される。
【0206】
また、鳥類胚組織における患者の腫瘍細胞により形成された転移の数を、蛍光ラベルされた腫瘍細胞の追跡及びその後の胚における蛍光シグナルの定量化により評価した。
【0207】
Keytrudaの投与後、腫瘍細胞の転移能は、「転移数」と題するヒストグラムに示されたように、有意に低下する。
【0208】
両方のヒストグラムから、抗ＰＤ１投与により、鳥類胚組織における患者の腫瘍細胞により形成される転移の体積及び数の有意な減少がもたらされることが示される。
【0209】
実施例１１．移植後４８時間及び７２時間でのＰＢＭＣの分析
胚を移植後４８時間（薄い灰色）又は７２時間（濃い灰色）で収集した。部分集団を生きているＣＤ４５＋集団にわたって観察し、移植前のＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ Ｄ０）と比較する。結果を図１３に示す。
胚を移植後４８時間（薄い灰色）又は７２時間（濃い灰色）で収集した。部分集団を生きているＣＤ４５＋集団にわたって観察し、移植前のＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ Ｄ０）と比較する。結果を図１３に示す。
【0210】
全ての主なＰＢＭＣ部分集団は、生きていることが見出される。また、一部の集団は、移植後４８時間(ナチュラルキラー集団）と比較して、７２時間でより高い割合である。鳥類ホストに対するＰＢＭＣの同種反応は、７２時間後の胚発生に影響を及ぼさない。したがって、４８時間の免疫療法処理をこのモデルにより達成することができる。
【0211】
参考文献
特許
ＷＯ第２０１５／０７４０５０号
ＵＳ第２０１３／０１７１６８０号
ＷＯ第２０１６／０５３９８号
ＷＯ第２０１７／１０３０２５号
ＷＯ第２０２０／０７５１６８号
特許
ＷＯ第２０１５／０７４０５０号
ＵＳ第２０１３／０１７１６８０号
ＷＯ第２０１６／０５３９８号
ＷＯ第２０１７／１０３０２５号
ＷＯ第２０２０／０７５１６８号
【0212】
書誌参照
【表1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13】
【国際調査報告】