特表 2023-523028 生体適合性材料並びにその作製及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-01

(54)【発明の名称】生体適合性材料並びにその作製及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   C08L 101/02 20060101AFI20230525BHJP

   C08B 37/08 20060101ALI20230525BHJP

   C08B 37/02 20060101ALI20230525BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20230525BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20230525BHJP

【ＦＩ】

C08L101/02

C08B37/08 Z

C08B37/02

A61K9/06

A61K47/36 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022564576

(86)(22)【出願日】2021-04-22

(85)【翻訳文提出日】2022-10-21

(86)【国際出願番号】 CN2021088989

(87)【国際公開番号】W WO2021213467

(87)【国際公開日】2021-10-28

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/086487

(32)【優先日】2020-04-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522413858

【氏名又は名称】プレリオン セラピューティクス （シェンチェン） リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】イー、イー

(72)【発明者】

【氏名】ジョウ、グワンチン

(72)【発明者】

【氏名】スン、ジョーシン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C090

4J002

【Ｆターム（参考）】

4C076AA09

4C076AA94

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076EE30

4C076EE37

4C076FF31

4C090AA09

4C090BA12

4C090BA67

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4C090BD08

4C090BD36

4C090BD37

4C090BD42

4C090CA35

4C090DA23

4J002AA03W

4J002AA03X

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4J002AA04X

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4J002AA07X

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4J002AB05X

4J002AD01W

4J002AD01X

4J002AD03W

4J002AD03X

4J002BG01W

4J002BG01X

4J002BG07W

4J002BG07X

4J002CH02W

4J002CH02X

4J002FD14W

4J002FD14X

4J002GB04

(57)【要約】

本開示は、少なくとも５００ｍＬ／ｇの高い固有粘度［η］を有する第１のポリマーと、第１のポリマーより低くかつ１８００ｍＬ／ｇ未満の低い固有粘度［η］を有する第２のポリマーと、を含む組成物を提供する。より詳細には、本開示はこの組成物で形成されたハイドロゲルと、医薬と、ハイドロゲルを生成するための方法とを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の反応基を有する少なくとも１つの第１のポリマーと、第２の反応基を有する少なくとも１つの第２のポリマーと、を含む組成物であって、
前記第１のポリマーが少なくとも５００ｍＬ／ｇの固有粘度［η］を有し、
前記第２のポリマーが前記第１のポリマーよりも低くかつ１８００ｍＬ／ｇ未満の固有粘度［η］を有し、
前記組成物中の前記第１のポリマーの濃度が、最大で約５ｍｇ／ｍＬである、組成物。

【請求項2】

前記第１のポリマーが、前記第２のポリマーと反応してハイドロゲルを形成することが可能である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記第１のポリマー及び／又は前記第２のポリマーが親水性及び／又は水溶性である、請求項１～２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項4】

前記第１のポリマー及び／又は前記第２のポリマーが、多糖、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）、エラスチン、コラーゲン、ポリエチレングリコール、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から独立して選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記第１のポリマー及び／又は前記第２のポリマーが、ヒアルロン酸、グアーガム、デンプン、キトサン、コンドロイチン硫酸、アルギナート、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から独立して選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記第１のポリマー及び／又は前記第２のポリマーが、ヒアルロン酸、デキストラン、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から独立して選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記第１のポリマーが第１のポリマーの誘導体を含み、前記第１のポリマーの誘導体が前記第１の反応基を含み、前記第１のポリマーの誘導体が求電子性である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記第１の反応基が、ビニル、アクリロイル、チオール、アルケン、チオールエステル、イソシアナート、イソチオシアナート、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化スルホニル、エポキシド、イミドエステル、フルオロフェニルエステル、カルボナート、カルボジイミド、ジスルフィド、アジリジン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記第１の反応基が、ビニルスルホン、マレイミド、アクリラート、メタクリラート、エポキシド、及びそれらの任意の組合せから選択される、請求項７～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

前記第２のポリマーが第２のポリマー誘導体を含み、前記第２のポリマー誘導体が前記第２の反応基を含み、前記第２のポリマー誘導体が求核性である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記第２の反応基が、チオール、アミン、アジド、ヒドラジド、ジエン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記第１のポリマーが、約５００，０００～約５，５００，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

前記第２のポリマーが、約３，０００～約８００，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記組成物中の前記第１のポリマーと前記第２のポリマーとの分子量（ＭＷ）比が約５００：１～約１．５：１である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

前記組成物中の前記第１のポリマーと前記第２のポリマーとの回転半径（Ｒｇ）比が約１５０：１～約１：１である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記組成物中の前記第１のポリマーと前記第２のポリマーとの質量比が約２０：１～約１：２０である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記組成物中の前記第１のポリマーと前記第２のポリマーとのモル比が約４：１～約１：５００である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

前記第１のポリマーが約５００ｍＬ／ｇ～約５０００ｍＬ／ｇの固有粘度［η］を有し得る、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

前記第２のポリマーが約５ｍＬ／ｇ～約１８００ｍＬ／ｇの固有粘度［η］を有し得る、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

前記組成物中の前記第１のポリマーと前記第２のポリマーの固有粘度間の比が約５００：１～約１：１である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

前記誘導体が約３％～約５０％の平均修飾度（ＤＭ）を有する、請求項７～２０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項22】

前記第１のポリマーの誘導体が第１のＤＭを有し、前記第２のポリマー誘導体が第２のＤＭを有し、前記第１のＤＭと前記第２のＤＭとの比が約２０：１～約１：２０である、請求項７～２１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項23】

前記第１のポリマーの誘導体が、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、１つ以上のマレイミド基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、又はそれらの組合せであり、前記第２のポリマー誘導体は１つ以上のチオール基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、又はそれらの組合せである、請求項７～２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

前記第１のポリマー及び／又は前記第２のポリマーが、形成されたハイドロゲル中の前記組成物中に含まれる、請求項７～２３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項25】

前記組成物が、前記第１のポリマー及び／又は前記第２のポリマーとは異なる架橋剤を何ら含まない、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項26】

請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物で形成されたハイドロゲル。

【請求項27】

生体適合性である請求項２６に記載のハイドロゲル。

【請求項28】

以下の特性：
１）５ｒａｄ／ｓ及び５％の歪みで動的振動せん断試験にて測定した際、５Ｐａ以下の貯蔵弾性率Ｇ’；並びに
２）約１０００／ｓ超のせん断速度で連続せん断試験にて測定した際、約５００ｍＰａ・ｓ以下の粘度；
３）５ｒａｄ／ｓ及び５％の歪みで動的振動せん断試験にて測定した際、貯蔵弾性率Ｇ’の約１００％以下の損失弾性率Ｇ’’、
のうち少なくとも１つを有する、請求項２６～２７のいずれか一項に記載のハイドロゲル。

【請求項29】

ハイドロゲルを生成するための方法であって、
ａ）請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物を提供することと；
ｂ）前記組成物を、ハイドロゲルの形成を可能にする条件に供することと、
を含む、方法。

【請求項30】

前記供することが、前記組成物を約１５℃～約５０℃でインキュベートすることを含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

請求項２６～２８のいずれか一項に記載のハイドロゲルを含む、医薬組成物。

【請求項32】

前記ハイドロゲルが薬物封入物として好適であるように調合されている、請求項３１に記載の医薬組成物。

【請求項33】

前記医薬組成物が薬物を含み、前記薬物が前記ハイドロゲル中に封入されている、請求項３１～３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

化学架橋されたポリマー－ポリマーハイドロゲルは、ポリマーを別のポリマーに架橋させることで形成される。ポリマーは、反応基で通常は修飾され、化学反応によって架橋する。

【0002】

架橋には、２つの主要なタイプが存在する。１つは、小分子架橋剤を用いてポリマーを架橋させることである。しかし小分子は人体にとって有毒である可能性があり、かつ望ましくない反応を引き起こす可能性があることから、多くの場合、これらは好適ではない。別のタイプの架橋は、異なるポリマー上のグラフト反応基に対するものであり、異なる反応基でグラフト化したポリマーは反応してハイドロゲルを形成し得る。このタイプの架橋は、例えば、機械的強度が低いハイドロゲルなどの望ましい特性のハイドロゲルの生成が可能である。既存の研究は、機械的強度が低いハイドロゲルが回転半径（Ｒｇ）が大きく、固有粘度（［η］）が大きい又は高分子量（ＭＷ）の１種以上の反応性ポリマーを反応させることで作製可能であると示唆している。

【0003】

したがって、製品製造に必要とされる適切に安定したポリマーを使用した、所望の特性を有するハイドロゲルを生成する必要が存在している。

【発明の概要】

【0004】

本開示は、ハイドロゲルを形成可能であるポリマー（例えば、生体適合性ポリマー）を含む組成物、並びにその作製及び使用方法を提供する。例えば、この組成物は少なくとも１つの第１のポリマーと少なくとも１つの第２のポリマーを含んでもよい。この第１のポリマーは、組成物中では少なくとも５００ｍＬ／ｇの固有粘度［η］を有してもよく、第２のポリマーは、第１のポリマーよりも低くかつ１８００ｍＬ／ｇ未満の固有粘度［η］（例えば、ウベローデ粘度計で測定）を有してもよい。組成物中の第１のポリマーの濃度は、最大で約５ｍｇ／ｍＬであってもよい。第１のポリマー及び第２のポリマーは、適切な品質管理試験及び輸送向けの長期保存（例えば、２４時間以上）期間の間、組成物中で安定している。組成物及びその中のポリマーは、製造されることができるハイドロゲル製品を形成するには有用である。第１のポリマー及び／又は第２のポリマーによって形成されたハイドロゲルは、生物活性剤（例えば、薬物）を封入することができる。また、生物活性剤はハイドロゲルから累積的に放出されることができる。

【0005】

さらに、本開示は本開示のポリマーで形成されたハイドロゲルを提供する。場合によっては、ハイドロゲルは比較的低いＧ’値の粘弾性固体であり得、Ｇ’’と比較して高いＧ’を有し得る。場合によっては、ハイドロゲルは低応力では比較的高い弾性であり得るが、高応力では比較的高い粘性であり得る。特定の場合には、低応力で高い弾性を有するハイドロゲルは、必ずしも高応力では高い弾性に対応しない場合がある。場合によっては、ハイドロゲルは低せん断速度で高い粘性を有し得るが、高せん断速度で低い粘性を有し得る。したがって、異なる条件（例えば、歪み、せん断速度、周波数）下で本開示のハイドロゲルの機械的特性（例えば、弾性挙動）を調節することが可能となる。

【0006】

いくつかの実施形態では、本開示の第１のポリマーはそれ自体を架橋せず、第２のポリマーはそれ自体を架橋しない。本開示に従って形成されたハイドロゲルは、比較的低いＧ’（例えば、約５Ｐａ未満のＧ’）、比較的大きい降伏歪み（例えば、≧１０％）を有する間には、Ｇ’’（例えば、Ｇ’’／Ｇ’＜１）と比較して高いＧ’を有し得る。本開示のハイドロゲルは、高せん断速度にて低い粘性（例えば、約０．５Ｐａ・ｓ以下の粘度）を有するが、これはわずかな力を加えることで表面全体に広げやすい可能性があることを示している。

【0007】

一態様では、本開示は第１の反応基を有する少なくとも１つの第１のポリマーと、第２の反応基を有する少なくとも１つの第２のポリマーと、を含む組成物を提供する。当該第１のポリマーは少なくとも５００ｍＬ／ｇの固有粘度［η］を有し、当該第２のポリマーは第１のポリマーよりも低くかつ１８００ｍＬ／ｇ未満の固有粘度［η］を有し、当該組成物中の当該第１のポリマーの濃度は、最大で約５ｍｇ／ｍＬである。

【0008】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、当該第２のポリマーと反応してハイドロゲルを形成することが可能である。

【0009】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマー及び／又は当該第２のポリマーは親水性かつ／又は水溶性である。

【0010】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマー及び／又は当該第２のポリマーは、多糖、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）、エラスチン、コラーゲン、ポリエチレングリコール、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から独立して選択される。

【0011】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマー及び／又は当該第２のポリマーは、ヒアルロン酸、グアーガム、デンプン、キトサン、コンドロイチン硫酸、アルギナート、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から独立して選択される。

【0012】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマー及び／又は当該第２のポリマーは、ヒアルロン酸、デキストラン、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から独立して選択される。

【0013】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは第１のポリマーの誘導体を含み、当該第１のポリマーの誘導体は第１の反応基を含み、当該第１のポリマーの誘導体は求電子性である。

【0014】

いくつかの実施形態では、当該第１の反応基は、ビニル、アクリロイル、チオール、アルケン、チオールエステル、イソシアナート、イソチオシアナート、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化スルホニル、エポキシド、イミドエステル、フルオロフェニルエステル、カルボナート、カルボジイミド、ジスルフィド、アジリジン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0015】

いくつかの実施形態では、当該第１の反応基は、ビニルスルホン、マレイミド、アクリラート、メタクリラート、エポキシド、及びそれらの任意の組合せから選択される。

【0016】

いくつかの実施形態では、当該第２のポリマーは第２のポリマー誘導体を含み、当該第２のポリマー誘導体は第２の反応基を含み、当該第２のポリマー誘導体は求核性である。

【0017】

いくつかの実施形態では、当該第２の反応基は、チオール、アミン、アジド、ヒドラジド、ジエン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0018】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、約５００，０００～約５，５００，０００ダルトンの分子量を有する。

【0019】

いくつかの実施形態では、当該第２のポリマーは、約３，０００～約８００，０００ダルトンの分子量を有する。

【0020】

いくつかの実施形態では、当該組成物中の当該第１のポリマーと当該第２のポリマーとの分子量（ＭＷ）比は、約５００：１～約１．５：１である。

【0021】

いくつかの実施形態では、当該組成物中の当該第１のポリマーと当該第２のポリマーとの回転半径（Ｒｇ）比は、約１５０：１～約１：１である。

【0022】

いくつかの実施形態では、当該組成物中の当該第１のポリマーと当該第２のポリマーとの質量比は、約２０：１～約１：２０である。

【0023】

いくつかの実施形態では、当該組成物中の当該第１のポリマーと当該第２のポリマーとのモル比は、約４：１～約１：５００である。

【0024】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは約５００ｍＬ／ｇ～約５０００ｍＬ／ｇの固有粘度［η］を有し得る。

【0025】

いくつかの実施形態では、当該第２のポリマーは約５ｍＬ／ｇ～約１８００ｍＬ／ｇの固有粘度［η］を有し得る。

【0026】

いくつかの実施形態では、当該組成物中の当該第１のポリマーと当該第２のポリマーの固有粘度間の比は約５００：１～約１：１である。

【0027】

いくつかの実施形態では、当該誘導体は約３％～約５０％の平均修飾度（ＤＭ）を有する。

【0028】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーの誘導体は第１のＤＭを有し、当該第２のポリマー誘導体は第２のＤＭを有し、当該第１のＤＭと当該第２のＤＭとの比は、約２０：１～約１：２０である。

【0029】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーの誘導体は１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、１つ以上のマレイミド基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、又はそれらの組合せであり、当該第２のポリマー誘導体は１つ以上のチオール基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、１つ以上のチオール基で修飾されたポリエチレングリコール誘導体、又はそれらの組合せである。

【0030】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマー及び／又は当該第２のポリマーは、形成されたハイドロゲル中の当該組成物中に含まれる。

【0031】

いくつかの実施形態では、当該組成物は、当該第１のポリマー及び／又は当該第２のポリマーとは異なる架橋剤を何ら含まない。

【0032】

別の態様では、本開示は本開示の組成物で形成されたハイドロゲルを提供する。

【0033】

いくつかの実施形態では、本開示の当該ハイドロゲルは生体適合性である。

【0034】

いくつかの実施形態では、当該ハイドロゲルは以下の特性のうち少なくとも１つを有する。すなわち、１）５％の歪み及び５ｒａｄ／ｓの周波数で動的振動せん断試験にて測定した際、５Ｐａ以下の貯蔵弾性率Ｇ’；２）約１００／ｓ超のせん断速度で連続せん断試験にて測定した際、約０．５Ｐａ・ｓ以下の粘度；３）５％の歪み及び５ｒａｄ／ｓの周波数で動的振動せん断試験にて測定した際、貯蔵弾性率Ｇ’の約１００％以下の損失弾性率Ｇ’’、である。

【0035】

別の態様では、本開示は、ａ）本開示の組成物を提供することと、ｂ）当該組成物を、ハイドロゲルの形成を可能にする条件に供することと、を含む、ハイドロゲルを生成するための方法を提供する。

【0036】

いくつかの実施形態では、当該供することは、当該組成物を約１５℃～約５０℃でインキュベートすることを含む。

【0037】

別の態様では、本開示は、本開示のハイドロゲルを含む医薬組成物を提供する。

【0038】

いくつかの実施形態では、当該ハイドロゲルは薬物封入物として好適であるように調合されている。

【0039】

いくつかの実施形態では、当該医薬組成物は薬物を含み、当該薬物は当該ハイドロゲル中に封入されている。

【0040】

本開示の追加の態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示され、説明されている以下の詳細な説明から、当業者に容易に明らかとなるだろう。理解されるように、本開示は他の異なる実施形態が可能である。また、そのいくつかの詳細は、すべて本開示から逸脱しない範囲にて、明らかになっている種々の点で変更可能である。したがって、図面及び説明は性質上、例示として見なされるべきであり、限定するものとして見なされるべきではない。

【0041】

参照による援用
この明細書で言及されているすべての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許又は特許出願が、それぞれ明確かつ独立して参照として援用されていることが示されるように、同程度にて参照として本明細書に援用される。

【0042】

本発明の新規特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の原理が使用されている例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び添付の図面（本明細書では「図（ｆｉｇｕｒｅ」）及び「図（ＦＩＧ．）」も含まれる）を参照することで、本発明の特徴及び利点がより良く理解されるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】ＨＡ－ＶＳポリマーの合成を示す。

【0044】

【図2】ＨＡ－ＳＨポリマーの合成を示す。

【0045】

【図3】本開示のハイドロゲルの形成を示す。

【0046】

【図4A】反応後、ＨＡ－ＳＨをアガロースハイドロゲル電気泳動（ａｇａｒｏｓｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＡＧＥ）にかけ、１日後、ｐＨ４のＨＣｌに対して約１ｍｇ／ｍＬの溶液として透析にかけることで測定した場合のＭＷの変化を示す。

【図4B】ＨＡ及びＨＡ－ＳＨのＡＧＥで測定した場合のＭＷ分布を示す。

【0047】

【図5】２．６ＭＤａ、２３％のＤＭのＨＡ－ＶＳのＧＰＣ曲線の例を示す。

【0048】

【図6A】４℃の溶液としてのＨＡ－ＳＨのＭＷの変化を示す。

【図6B】４℃の溶液として保存されているＨＡ－ＳＨのハイドロゲル浸透クロマトグラフィー（ｇｅｌ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＧＰＣ）曲線の例を示す。

【0049】

【図7A】４℃の溶液としてのＨＡ－ＳＨのＭＷの変化を示す。

【図7B】４℃の溶液として保存されているＧＰＣ曲線の例を示す。

【0050】

【図8A】５％のＤＭのデキストラン－ＳＨのＭＷの変化を示す。

【図8B】５％のＤＭのデキストラン－ＳＨのＧＰＣ曲線の例を示す。

【図8C】１２．５％のＤＭのデキストラン－ＳＨのＭＷの変化を示す。

【図8D】１２．５％のＤＭのデキストラン－ＳＨのＧＰＣ曲線の例を示す。

【0051】

【図9】異なるＨＡ－ＳＨ濃度のゲルのＧ’の変化の動向を示す。

【0052】

【図10】異なるＨＡ－ＶＳ濃度のゲルのＧ’の変化の動向を示す。

【0053】

【図11】異なるＤＭのゲルのＧ’の変化の動向を示す。

【0054】

【図12】デキストラン－ＳＨ形成ゲルのＧ’の変化の動向を示す。

【0055】

【図13】別のインキュベーション期間で１６．４％のＤＭ及び６７０ｋＤａのＨＡ－ＳＨのＡＧＥで測定した場合のＭＷの変化を示す。

【0056】

【図14A】周波数掃引試験を受けている４つのハイドロゲルのＧ’及びＧ’’を示す。

【図14B】周波数掃引試験を受けている４つのハイドロゲルのＧ’及びＧ’’を示す。

【0057】

【図15A】歪み掃引試験を受けている４つのハイドロゲルをＧ’及びＧ’’を示す。

【図15B】歪み掃引試験を受けている４つのハイドロゲルをＧ’及びＧ’’を示す。

【0058】

【図16A】ステップストレス試験を受けている４つのハイドロゲルの歪み応答を示す。

【図16B】ステップストレス試験を受けている４つのハイドロゲルの歪み応答を示す。

【0059】

【図17A】連続せん断試験を受けている４つのハイドロゲルのせん断粘度を示す。

【図17B】連続せん断試験を受けている４つのハイドロゲルのせん断粘度を示す。

【0060】

【図18】小分子モキシフロキサシンのハイドロゲルからの放出を示す。

【0061】

【図19】小分子レボフロキサシンのハイドロゲルからの放出を示す。

【0062】

【図20】タンパク質であるベバシズマブのハイドロゲルからの放出を示す。

【0063】

【図21】アプタマーのハイドロゲルＡｐ１からの放出を示す。

【0064】

【図22】アプタマーのハイドロゲルＡｐ２からの放出を示す。

【発明を実施するための形態】

【0065】

本発明の種々の実施形態が本明細書に示され、かつ記載されているが、かかる実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者は非常に多くの変形、変更及び代用を思い浮かべることができる。本明細書に記載される本発明の実施形態に対し、種々の代替形態が利用され得ることを理解されたい。

【0066】

本明細書で使用される場合、用語「ポリマー」は、一般に、重合によって形成され、繰り返し構造単位から本質的にはなる化学化合物又は化合物の混合物を指す。いくつかの実施形態では、ポリマーはハイドロゲル形成ポリマーであり得る。本明細書で使用される場合、用語「ハイドロゲル形成ポリマー」は、一般に、ハイドロゲルの形成に関係するポリマーを指す。これは、ハイドロゲルを形成可能な天然に存在するポリマー又は合成ポリマーであり得る。ハイドロゲル形成ポリマーは、ハイドロゲル形成に寄与する１つ以上のポリマーを含み得る。いくつかの実施形態では、ハイドロゲル形成ポリマーは、仮に本開示の組成物中に存在しているとしても、ハイドロゲル形成に関係することができないポリマー、及び／又はハイドロゲルを形成することができないポリマーを含まない。場合によっては、ハイドロゲル形成ポリマーは、「骨格ポリマー」及び「架橋ポリマー」とも呼ばれ得る。

【0067】

本明細書で使用される場合、用語「ハイドロゲル」は、一般には、水溶液（例えば、水）に懸濁された１つ以上のポリマーを含むゲル構造又はゲル状構造を指す。すべてのハイドロゲルは、互いの絡まり合いの結果として、マクロマー間にある程度の物理的引力を有する。通常、組織工学用途を意図したハイドロゲルは、追加の物理的相互作用又は化学架橋によって強化され得る。

【0068】

用語「求電子性」は、本明細書で使用される場合、一般には電子対への親和性を有することを指す。求電子性物質（例えば、分子又は分子の一部）は電子対受容体であってもよい。いくつかの実施形態では、求電子性分子又は求電子性基は、ビニル、アクリロイル、チオール、アルケン、チオールエステル、イソシアナート、イソチオシアナート、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化スルホニル、エポキシド、イミドエステル、フルオロフェニルエステル、カルボナート、カルボジイミド、ジスルフィド、アジリジン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、求電子性分子又は求電子性基は、ビニルスルホン、マレイミド、アクリラート、メタクリラート、エポキシド、及びそれらの任意の組合せを含んでもよい。

【0069】

用語「求核性」は、本明細書で使用される場合、一般には電子対を供与して求電子性物質との反応に関係する化学結合を形成可能である特性を有することを指す。いくつかの実施形態では、用語は物質の求核性及び求電子試薬への親和性を指すことがある。いくつかの実施形態では、求核性物質（例えば、分子又は分子の一部）は、チオール、アミン、アジド、ヒドラジド、アミン、ジエン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。

【0070】

用語「親水性」は、本明細書で使用される場合、一般には水の吸収が可能、又は水により濡れることが可能といった水への親和性を有することを指す。親水性分子又は親水性分子の一部は、水及び他の極性物質とのその相互作用が油又は他の疎水性溶媒とのそれらの相互作用よりも熱力学的により好ましいものである。

【0071】

用語「粘性」は、本明細書で使用される場合、流体又は半流動体中の流れに対する抵抗性といった特性を指す。

【0072】

用語「固有粘度［η］」は、本明細書で使用される場合、一般には高分子の形状、柔軟性及び高分子のモル質量に関する情報を含む高分子の希釈溶液から測定された値を指す。固有粘度は、「無限希釈」又はゼロ濃度の極限における還元比粘度として定義されている。本開示では、固有粘度［η］は、ウベローデ粘度計又は示差粘度計で測定されもよい。代替的には、固有粘度［η］は、固有粘度と分子量との間の確立された関係に由来するＭａｒｋ－Ｈｏｕｗｉｎｋの式により計算されてもよい。ポリマーの［η］は、例えば、異なる溶媒、異なる組成物の溶媒（例えば、異なる塩濃度）、又は異なる温度の異なる条件では異なっていてもよい。指定されていない場合、本特許における［η］値はハイドロゲル形成条件での［η］を指している。

【0073】

用語「実質的」は、本明細書で使用される場合、一般には最小量又はわずかな量を超える量を指し、「実質的には」は、一般には最小限又はわずかであることを超えることを指す。

【0074】

用語「貯蔵弾性率Ｇ’」は、本明細書で使用される場合、レオメータの動的振動モードで測定される際の正弦波の振動歪みに対する材料の弾性応答を一般には表す。

【0075】

用語「損失弾性率Ｇ’’」は、本明細書で使用される場合、レオメータの動的振動モードで測定される際、正弦波の振動歪みに対する材料の粘性応答を一般には表す。

【0076】

用語、「平均修飾度（ＤＭ）」は、本明細書で使用される場合、一般にはポリマーの１００繰り返し単位あたりの反応基の数を指す。本開示では、反応基は、ポリマーが生成される前又は後に追加されてもよい。いくつかの実施形態では、反応基は、ポリマーの調製プロセス中にポリマーに追加されてもよい。いくつかの実施形態では、反応基は、修飾プロセス中にポリマーに追加されてもよい。例えば、ＤＭはポリマー誘導体の修飾度を反映することがある。

【0077】

ポリマーの「回転半径（Ｒｇ）」又は「断面回転半径」といった用語は、本明細書で使用される場合、鎖の重力の中心からのポリマー鎖要素の平均距離を指す。

【0078】

用語「架橋」は、本明細書で使用される場合、一般には一方のポリマー鎖と別のポリマー鎖とを連結する結合を指す。これらは共有結合又はイオン結合であり得る。「ポリマー鎖」は、合成ポリマー又は天然ポリマー（例えばヒアルロン酸など）を指してもよい。

【0079】

用語「架橋剤」は、本明細書で使用される場合、一般には一方のポリマー鎖と別のポリマー鎖とを結合で連結する薬剤を指す。架橋剤は、共有結合又は非共有結合を介して架橋を達成することができる。「ポリマー鎖」は、合成ポリマー、天然ポリマー（例えばヒアルロン酸など）、又は天然ポリマーの誘導体を指し得る。ポリマー化学では、ポリマーが「架橋」される場合、通常はポリマーのバルク全体が架橋法の影響を受けていることを意味する。得られた機械的特性の変更は、架橋密度に強く依存している。架橋は、ポリマー間の化学反応によって形成され得る。

【0080】

用語「前駆体ポリマー」は、本明細書で使用される場合、一般には別のポリマー構造を形成するため、又はさらに修飾されるために使用されるポリマーを指す。この材料は、反応基によってさらに重合し、高分子量の構造を形成することができる。

【0081】

用語「組成物」は、本明細書で使用される場合、一般には種々の要素又は成分の生成物（液状又は固形）を指す。

【0082】

用語「生体適合可能な」又は「生体適合性」は、本明細書で使用される場合、毒性、外傷性又は生理学的に反応性がない、及び／又は免疫拒絶反応を引き起こすことがないことによる生体組織又は生体系に適合可能な状態を指す。

【0083】

用語「約」は、数値に関連して使用される場合、一般には提示された値を超える、又は値よりも１％～１５％未満（例えば、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１１％未満、１２％未満、１３％未満、１４％未満、又は１５％未満）高い若しくは低い値を指す。

【0084】

値の範囲（例えば、数値範囲）が与えられている場合、文脈が明確に指示しない限り、下限単位の１０分の１までのその範囲の上限及び下限と、他の指定範囲又はその指定範囲中の間に存在する値との間の、間に存在する各値は、本発明の範囲内に包含されている。こうしたより短い範囲の上限と下限は、任意の特別に除外された指定範囲中の限界を満たした場合に限り、このより短い範囲中に独立して含まれてもよく、本発明の範囲内にも包含される。この指定範囲が上限と下限のうち一方又は両方を含む場合、これらの含まれている限界のうちいずれか、又は両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。

【0085】

特段定義されない限り、本明細書で使用されている技術的用語及び化学用語のすべては、本発明が属する当業者に共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明される方法及び材料と類似又は同等の任意の方法及び材料もまた本発明の実践又は試験に使用することができるが、ここでは好ましい方法及び材料を説明する。本明細書で言及される刊行物すべては、これらの刊行物が引用されている関連の方法及び／又は材料を開示及び説明するために、参照として援用されている。

【0086】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば「粒子（ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」は複数のこうした粒子を含み、「配列（ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」に対する言及は、１つ以上の当該配列及び当業者に公知のこれらの等価物などに対する言及を含む。

【0087】

本開示を読んだ際に当業者に理解されるように、本明細書で説明かつ例示されている個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲又は精神から逸脱しない限り、他のいくつかの実施形態のうちいずれかの特徴から容易に分離され得る、又はこれらと容易に組み合わせられ得る別々の構成要素及び特徴を有する。任意の引用された方法は、引用された事象の順序で、又は論理的に可能である他の順序で実施することができる。これは、こうした組合せを支援することを意図している。

【0088】

本開示は、１つ以上のハイドロゲル形成ポリマーを含む組成物、並びにその作製及び使用方法を提供する。加えて、本開示はハイドロゲル並びにその作製及び使用方法を提供する。

【0089】

一態様では、本開示は、高い固有粘度［η］を有する少なくとも１個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上）の第１のポリマー、及び低い固有粘度［η］を有する少なくとも１個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上）の第２のポリマーを含み得る組成物を提供する。いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、少なくとも約５００ｍＬ／ｇ（例えば、少なくとも約５００ｍＬ／ｇ、少なくとも約６００ｍＬ／ｇ、少なくとも約７００ｍＬ／ｇ、少なくとも約８００ｍＬ／ｇ、少なくとも約９００ｍＬ／ｇ、少なくとも約１０００ｍＬ／ｇ、少なくとも約１１００ｍＬ／ｇ、少なくとも約１２００ｍＬ／ｇ、少なくとも約１３００ｍＬ／ｇ、少なくとも約１４００ｍＬ／ｇ、少なくとも約１５００ｍＬ／ｇ、少なくとも約１６００ｍＬ／ｇ、少なくとも約１７００ｍＬ／ｇ、少なくとも約１８００ｍＬ／ｇ、少なくとも約１９００ｍＬ／ｇ、少なくとも約２０００ｍＬ／ｇ、少なくとも約２２００ｍＬ／ｇ、少なくとも約２４００ｍＬ／ｇ、少なくとも約２８００ｍＬ／ｇ、少なくとも約２９００ｍＬ／ｇ、少なくとも約３０００ｍＬ／ｇ、少なくとも約３５００ｍＬ／ｇ、少なくとも約４０００ｍＬ／ｇ、少なくとも約４５００ｍＬ／ｇ、少なくとも約５０００ｍＬ／ｇ）の［η］を有してもよく、当該第２のポリマーは、第１のポリマーよりも低くかつ約１８００ｍＬ／ｇ（例えば、約１７００ｍＬ／ｇ未満、約１６００ｍＬ／ｇ未満、約１５００ｍＬ／ｇ未満、約１４００ｍＬ／ｇ未満、約１３００ｍＬ／ｇ未満、約１２００ｍＬ／ｇ未満、約１１００ｍＬ／ｇ未満、約１０００ｍＬ／ｇ未満、約９００ｍＬ／ｇ未満、約８００ｍＬ／ｇ未満、約７００ｍＬ／ｇ未満、約６００ｍＬ／ｇ未満、約５００ｍＬ／ｇ未満、約４００ｍＬ／ｇ未満、約３００ｍＬ／ｇ未満、約２００ｍＬ／ｇ未満、約１００ｍＬ／ｇ未満、約２０ｍＬ／ｇ未満、約１０ｍＬ／ｇ未満以下）未満の［η］を有してもよい。

【0090】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、約５００ｍＬ／ｇ～約５０００ｍＬ／ｇ（例えば、約５００ｍＬ／ｇ～約４６００ｍＬ／ｇ、約６００ｍＬ／ｇ～約４４００ｍＬ／ｇ、約８００ｍＬ／ｇ～約４２００ｍＬ／ｇ、約１０００ｍＬ／ｇ～約４０００ｍＬ／ｇ、約１５００ｍＬ／ｇ～約３５００ｍＬ／ｇ、約２０００ｍＬ／ｇ～約３５００ｍＬ／ｇ、約２５００ｍＬ／ｇ～約３５００ｍＬ／ｇなど）の固有粘度［η］を有してもよい。いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、約１０００ｍＬ／ｇ～約４０００ｍＬ／ｇの固有粘度［η］を有してもよい。例えば、当該第１のポリマーは、ウベローデ粘度計、毛細管粘度計と連結されたハイドロゲル浸透クロマトグラフィーで測定された際、又は分子量と［η］との間の発表されている関係に基づいて計算された際に約２５００ｍＬ／ｇ～約３５００ｍＬ／ｇの固有粘度［η］を有してもよい。

【0091】

いくつかの実施形態では、当該第２のポリマーは、約５ｍＬ／ｇ～約１８００ｍＬ／ｇ（例えば、約５ｍＬ／ｇ～約１６００ｍＬ／ｇ、約５ｍＬ／ｇ～約１４００ｍＬ／ｇ、約５ｍＬ／ｇ～約１２００ｍＬ／ｇ、約５ｍＬ／ｇ～約１０００ｍＬ／ｇ、約５ｍＬ／ｇ～約５００ｍＬ／ｇ、約５ｍＬ／ｇ～約４００ｍＬ／ｇ、約５ｍＬ／ｇ～約３００ｍＬ／ｇ、約５ｍＬ／ｇ～約２５０ｍＬ／ｇ、約１０ｍＬ／ｇ～約２００ｍＬ／ｇ、約１０ｍＬ／ｇ～約１５０ｍＬ／ｇ、約１５ｍＬ／ｇ～約１００ｍＬ／ｇなど）の固有粘度［η］を有してもよい。いくつかの実施形態では、［η］はウベローデ粘度計で測定されてもよい。例えば、当該第２のポリマーは、ウベローデ粘度計、毛細管粘度計と連結されたハイドロゲル浸透クロマトグラフィーで測定された際、又は分子量と［η］との間の発表されている関係に基づいて計算された際に約５ｍＬ／ｇ～約２００ｍＬ／ｇの固有粘度［η］を有してもよい。

【0092】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、約１０００ｍＬ／ｇ～約４０００ｍＬ／ｇの固有粘度［η］を有してもよく、当該第２のポリマーは、約５ｍＬ／ｇ～約２００ｍＬ／ｇの固有粘度［η］を有してもよい。

【0093】

本開示では、第１のポリマーは第１の固有粘度［η］（［η］１）を有し、第２のポリマーは第２の固有粘度は第２の固有粘度［η］（［η］２）を有する。いくつかの実施形態では、［η］１は［η］２よりも大きくてよく、［η］１と［η］２との間の比は約５００：１～約１：１（例えば、約５００：１～約１：１、約４００：１～約１：１、約３００：１～約１：１、約２００：１～約１：１、約１００：１～約１：１、約５０：１～約１：１、約３：１～約１：１、約２０：１～約１：１、約１０：１～約１：１、約５：１～約１：１、約５００：１～約１０：１、約５００：１～約４０：１、約５００：１～約５０：１、約５００：１～約１００：１、約５００：１～約２００：１、約５００：１～約３００：１、約５００：１～約４００：１、約４００：１～約２０：１、約２５０：１～約３０：１、約１５０：１～約４０：１など）であってもよい。例えば、［η］１と［η］２との間の比は、約３００：１～約２５：１であってもよい。

【0094】

いくつかの実施形態では、当該組成物中の当該第１のポリマーの濃度は、最大で約５ｍｇ／ｍＬであってもよい。いくつかの実施形態では、当該組成物中の当該第１のポリマーの濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約４ｍｇ／ｍＬ（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約４ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ～約３ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬなど）であってもよい。いくつかの実施形態では、当該組成物中の当該第１のポリマーの濃度は、約０．３ｍｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬであってもよい。

【0095】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、多糖、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）、エラスチン、コラーゲン、ポリエチレングリコール、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。例えば、組成物中の第１のポリマーは、多糖、１つ以上のタイプの多糖誘導体、ポリ（アクリル酸）、１つ以上のタイプのポリ（アクリル酸）誘導体、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）、１つ以上のタイプのポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）誘導体、エラスチン、１つ以上のタイプのエラスチン誘導体、コラーゲン、１つ以上のタイプのコラーゲン誘導体、ポリエチレングリコール、及び１つ以上のタイプのポリエチレングリコール誘導体並びにそれらの任意の組合せのうち１つ以上を含んでもよい。

【0096】

いくつかの実施形態では、当該第２のポリマーは、多糖、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）、エラスチン、コラーゲン、ポリエチレングリコール、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。例えば、組成物中の第２のポリマーは、多糖、１つ以上のタイプの多糖誘導体、ポリ（アクリル酸）、１つ以上のタイプのポリ（アクリル酸）誘導体、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）、１つ以上のタイプのポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）誘導体、エラスチン、１つ以上のタイプのエラスチン誘導体、コラーゲン、１つ以上のタイプのコラーゲン誘導体、ポリエチレングリコール、及び１つ以上のタイプのポリエチレングリコール誘導体及びそれらの任意の組合せのうち１つ以上を含んでもよい。

【0097】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、多糖、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）、エラスチン、コラーゲン、ポリエチレングリコール、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよく、当該第２のポリマーは、多糖、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）、エラスチン、コラーゲン、ポリエチレングリコール、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。

【0098】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、ヒアルロン酸、グアーガム、デンプン、キトサン、コンドロイチン硫酸、アルギナート、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。例えば、組成物中の第１のポリマーは、ヒアルロン酸、１つ以上のタイプのヒアルロン酸誘導体、グアーガム、１つ以上のタイプのグアーガム誘導体、デンプン、１つ以上のタイプのデンプン誘導体、キトサン、１つ以上のタイプのキトサン誘導体、コンドロイチン硫酸、１つ以上のタイプのコンドロイチン硫酸、アルギナート、１つ以上のタイプのアルギナート誘導体、カルボキシメチルセルロース及び１つ以上のタイプのカルボキシメチルセルロース誘導体、デキストラン、１つ以上のタイプのデキストラン誘導体、並びにそれらの任意の組合せのうち、１つ以上を含んでもよい。

【0099】

いくつかの実施形態では、当該第２のポリマーは、ヒアルロン酸、グアーガム、デンプン、キトサン、コンドロイチン硫酸、アルギナート、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。例えば、組成物中の第２のポリマーは、ヒアルロン酸、１つ以上のタイプのヒアルロン酸誘導体、グアーガム、１つ以上のタイプのグアーガム誘導体、デンプン、１つ以上のタイプのデンプン誘導体、キトサン、１つ以上のタイプのキトサン誘導体、コンドロイチン硫酸、１つ以上のタイプのコンドロイチン硫酸、アルギナート、１つ以上のタイプのアルギナート誘導体、カルボキシメチルセルロース及び１つ以上のタイプのカルボキシメチルセルロース誘導体、デキストラン、１つ以上のタイプのデキストラン誘導体、ポリエチレングリコール、１つ以上のタイプのポリエチレングリコール誘導体、並びにそれらの任意の組合せのうち、１つ以上を含んでもよい。

【0100】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、ヒアルロン酸、グアーガム、デンプン、キトサン、コンドロイチン硫酸、アルギナート、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよく、当該第２のポリマーは、ヒアルロン酸、グアーガム、デンプン、キトサン、コンドロイチン硫酸、アルギナート、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリエチレングリコール、その誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。

【0101】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、ヒアルロン酸、デキストラン、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。例えば、組成物中の第１のポリマーは、ヒアルロン酸、１つ以上のタイプのヒアルロン酸誘導体、デキストラン、１つ以上のタイプのデキストラン誘導体、及びそれらの任意の組合せを含んでもよい。

【0102】

いくつかの実施形態では、当該第２のポリマーは、ヒアルロン酸、デキストラン、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。例えば、組成物中の第２のポリマーは、ヒアルロン酸、１つ以上のタイプのヒアルロン酸誘導体、デキストラン、１つ以上のタイプのデキストラン誘導体、ポリエチレングリコール、及びそれらの任意の組合せを含んでもよい。

【0103】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、ヒアルロン酸、デキストラン、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよく、当該第２のポリマーは、ヒアルロン酸、デキストラン、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せから選択されてもよい。

【0104】

例えば、組成物中の当該第１のポリマーは、ヒアルロン酸誘導体のうち１つ以上を含んでもよく、当該第２のポリマーは、ヒアルロン酸誘導体であってもよい。別の例を挙げると、当該第１のポリマーはヒアルロン酸誘導体であってもよく、当該第２のポリマーはデキストラン誘導体であってもよい。

【0105】

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は少なくとも１つの第１のポリマー誘導体及び少なくとも１つの第２のポリマー誘導体を含んでもよく、当該第１のポリマー誘導体は第１の反応基を含んでもよく、当該第２のポリマー誘導体は第２の反応基を含んでもよい。第１の反応基は、第２の反応基とは異なってもよい。

【0106】

本開示の任意の態様に従い、ポリマー（例えば、ハイドロゲル形成ポリマー）は、例えば本開示のポリマー誘導体になるように、１つ以上の反応基で修飾されてもよい。一例では、本開示のポリマー（例えば、ハイドロゲル形成ポリマー）は１つ以上のビニルスルホン基で修飾されてもよい（又は１つ以上のビニルスルホン基を含む分子で修飾されてもよい）。別の例では、本開示のポリマー（例えば、ハイドロゲル形成ポリマー）は、１つ以上のチオール基で修飾されてもよい（又は１つ以上のチオール基を含む分子で修飾されてもよい）。

【0107】

本開示では、第１のポリマーは第１のポリマー誘導体を含んでもよく、当該第１のポリマー誘導体は第１の反応基を含んでもよく、第１のポリマー誘導体は求電子性であってもよい。いくつかの実施形態では、第１の反応基は、ビニル、マレイミド、アクリラート、メタクリラート、エポキシド、チオール、アルケン、チオールエステル、イソシアナート、イソチオシアナート、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化スルホニル、エポキシド、イミドエステル、フルオロフェニルエステル、カルボナート、カルボジイミド、ジスルフィド、アジリジン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、当該第１の反応基は、ビニル、アクリロイル、チオール、アルケン、チオールエステル、イソシアナート、イソチオシアナート、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化スルホニル、エポキシド、イミドエステル、フルオロフェニルエステル、カルボナート、カルボジイミド、ジスルフィド、アジリジン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。

【0108】

いくつかの実施形態では、当該第１の反応基は、ビニルスルホン、マレイミド、アクリラート、メタクリラート、エポキシド、及びそれらの任意の組合せから選択されてもよい。

【0109】

本開示では、第２のポリマーは第２のハイドロゲル形成ポリマー誘導体を含んでもよく、当該第２のポリマー誘導体は第２の反応基を含んでもよく、第２のハイドロゲル形成ポリマー誘導体は求核性であってもよい。

【0110】

いくつかの実施形態では、当該第２の反応基は、チオール、アミン、アジド、ヒドラジド、ジエン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。

【0111】

いくつかの実施形態では、第１の反応基は、ビニル、マレイミド、アクリラート、メタクリラート、エポキシド、チオール、アルケン、チオールエステル、イソシアナート、イソチオシアナート、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化スルホニル、エポキシド、イミドエステル、フルオロフェニルエステル、カルボナート、カルボジイミド、ジスルフィド、アジリジン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよく、第２の反応基は、チオール、アミン、アジド、ヒドラジド、ジエン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。

【0112】

いくつかの実施形態では、当該第１の反応基は、ビニルスルホン、マレイミド、アクリラート、メタクリラート、エポキシド、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよく、第２の反応基は、チオール、アミン、アジド、ヒドラジド、ジエン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、及びそれらの任意の組合せから選択されてもよい。

【0113】

例えば、第１の反応基はビニルスルホンを含んでもよく、第２の反応基はチオールを含んでもよい。

【0114】

いくつかの実施形態では、組成物中で、第１の反応基は１つ以上のビニルスルホンを含んでもよく、第２の反応基は１つ以上のチオールを含んでもよい。

【0115】

いくつかの実施形態では、第１のポリマー誘導体は、第２のポリマー誘導体と反応してハイドロゲルを形成することが可能であり得る。

【0116】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、約５００，０００～約５，５００，０００ダルトン（例えば、約５００，０００～約５，５００，０００ダルトン、約１，０００，０００～約５，５００，０００ダルトン、約１，５００，０００～約５，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００～約５，５００，０００ダルトン、約２，５００，０００～約５，５００，０００ダルトン、約３，０００，０００～約５，５００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン～約５，５００，０００ダルトン、約４，０００，０００～約５，５００，０００ダルトン、約４，５００，０００～約５，５００，０００ダルトン、又は約５００，０００～約５，０００，０００ダルトン、約５００，０００～約４，５００，０００ダルトン、約５００，０００～約４，０００，０００ダルトン、約５００，０００～約３，５００，０００ダルトン、約１，０００，０００～約３，０００，０００ダルトン、約１，０００，０００～約２，５００，０００ダルトン、約１，０００，０００～約２，０００，０００ダルトン、約１，０００，０００～約１，５００，０００ダルトン、又は約１，５００，０００～約５，０００，０００ダルトン、約２，０００，０００～約４，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００～約４，０００，０００ダルトン、約２，０００，０００～約３，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００～約３，０００，０００ダルトンなど）の分子量を有してもよい。いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーはヒアルロン酸であってもよい。

【0117】

いくつかの実施形態では、当該第２のポリマーは、約３，０００～約８００，０００ダルトン（例えば、約３，０００～約８００，０００ダルトン、約５，０００～約７００，０００ダルトン、約１０，０００～約６００，０００ダルトン、約１５，０００～約５００，０００ダルトン、約２０，０００～約４００，０００ダルトン、約２０，０００～約３００，０００ダルトン、約２０，０００～約２００，０００ダルトン、約２０，０００～約１００，０００ダルトン、約２０，０００～約９０，０００ダルトン、約２０，０００～約８０，０００ダルトン、約２０，０００～約７０，０００ダルトン、約２０，０００～約６０，０００ダルトン、約２０，０００～約５０，０００ダルトンなど）の分子量を有してもよい。いくつかの実施形態では、当該第２のポリマーは、約２０，０００～約８００，０００ダルトン（例えば、約２０，０００～約８００，０００ダルトン、約２０，０００～約７００，０００ダルトン、約２０，０００～約６００，０００ダルトン、約２０，０００～約５００，０００ダルトン、約２０，０００～約４００，０００ダルトン、約２０，０００～約３００，０００ダルトン、約２０，０００～約２００，０００ダルトン、約２０，０００～約１００，０００ダルトン、約２０，０００～約９０，０００ダルトン、約２０，０００～約８０，０００ダルトン、約２０，０００～約７０，０００ダルトン、約２０，０００～約６０，０００ダルトン、約２０，０００～約５０，０００ダルトンなど）の分子量を有してもよい。

【0118】

いくつかの実施形態では、当該組成物中の当該第１のポリマーと当該第２のポリマーとの間の分子量（ＭＷ）比は、約５００：１～約１．５：１（例えば、約５００：１～約１．５：１、約４５０：１～約１．５：１、約４００：１～約１．５：１、約３５０：１～約１．５：１、約３００：１～約１．５：１、約２５０：１～約１．５：１、約２００：１～約１．５：１、約１５０：１～約１．５：１、約１００：１～約１．５：１など）であってもよい。

【0119】

本開示では、組成物中の第１のポリマーは、約３０ｎｍ超（例えば、約３０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約４５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約３５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２５０ｎｍなど）の回転半径（Ｒｇ）を有してもよい。いくつかの実施形態では、組成物中の第１のポリマーは約３０ｎｍ～約５００ｎｍのＲｇを有してもよい。いくつかの実施形態では、組成物中の第１のポリマーは約１５０ｎｍ～約２５０ｎｍのＲｇを有してもよい。

【0120】

組成物中の第２のポリマーは、１００ｎｍ未満（例えば、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、約３ｎｍ～約９０ｎｍ、約３ｎｍ～約８０ｎｍ、約３ｎｍ～約７０ｎｍ、約３ｎｍ～約６０ｎｍ、約３ｎｍ～約５０ｎｍ、約３ｎｍ～約４０ｎｍ、約３ｎｍ～約３０ｎｍ、約３ｎｍ～約２０ｎｍ、約５ｎｍ～約２０ｎｍなど）の回転半径（Ｒｇ）を有してもよい。いくつかの実施形態では、組成物中の第２のポリマーは約３ｎｍ～約１００ｎｍのＲｇを有してもよい。いくつかの実施形態では、組成物中の第１のポリマーは約５ｎｍ～約２０ｎｍのＲｇを有してもよい。

【0121】

いくつかの実施形態では、当該組成物中の当該第１のポリマーと当該第２のポリマーとの間の回転半径（Ｒｇ）比は、約１５０：１～約１：１（例えば、約１５０：１～約１：１、約１００：１～約１：１、約８０：１～約１：１、約６０：１～約１：１、約５０：１～約１：１、約３０：１～約１：１、約３０：１～約５：１、約３０：１～約１０：１など）であってもよい。いくつかの実施形態では、当該組成物中の当該第１のポリマーと当該第２のポリマーとの間の回転半径（Ｒｇ）比は、約１：１超（例えば、約１５０：１～約１．１：１、約１００：１～約１．１：１、約８０：１～約１．１：１、約６０：１～約１．１：１、約５０：１～約１．１：１、約３０：１～約１．１：１、約３０：１～約５：１、約３０：１～約１０：１など）であってもよい。例えば、当該組成物中の当該第１のポリマーと当該第２のポリマーとの回転半径（Ｒｇ）比は、約３０：１～約１０：１であってもよい。

【0122】

いくつかの実施形態では、当該組成物中の当該第１のポリマーと当該第２のポリマーとの間のモル比は、約４：１～約１：５００（例えば、約４：１～約１：５００、約３：１～約１：５００、約２：１～約１：５００、約１：１～約１：５００、約４：１～約１：４００、約４：１～約４：３００、約４：１～約４：２００、約４：１～約１：１００、約３：１～約１：４００、約２：１～約１：３００、約１：１～約１：２００、約１：１～約１：１００、約１：１～約１：５００など）であってもよい。例えば、当該組成物中の当該第１のポリマーと当該第２のポリマーとのモル比は、約１：１～約１：５０であってもよい。

【0123】

いくつかの実施形態では、誘導体は、約３％～約５０％（例えば、約４％～約４５％、約５％～約４０％、約６％～約４０％、約７％～約４０％、約８％～約３９％、約８％～約３８％、約８％～約３５％、約９％～約３２％、約８％～約３０％、約１０％～約３０％、約１２％～約３０％、約１３％～約３０％、約１４％～約３０％、約１５％～約３５％、又は約１５％～約３０％）の平均修飾度（ＤＭ）を有してもよい。

【0124】

場合によっては、第１のポリマー誘導体は１つ以上のビニルスルホン基で修飾されてもよく、第２のポリマー誘導体は１つ以上のチオール基で修飾されてもよい。第１のポリマー誘導体は、第２のポリマー誘導体と反応してハイドロゲルを形成することが可能であり得る。

【0125】

本開示において、第１のポリマー誘導体は、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、１つ以上のマレイミド基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のマレイミド基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、１つ以上のアクリラート基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のアクリラート基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、１つ以上のメタクリラート基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のメタクリラート基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、又はそれらの組合せであってもよい。例えば、第１のポリマー誘導体は、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、又は１つ以上のマレイミド基で修飾されたヒアルロン酸誘導体であってもよい。

【0126】

本開示では、第２のポリマー誘導体は、１つ以上のチオール基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、１つ以上のアミン基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のアミン基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、又はそれらの組合せであってもよい。例えば、第２のポリマー誘導体は、１つ以上のチオール基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体であってもよい。

【0127】

本開示では、第１のポリマー誘導体は、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、１つ以上のマレイミド基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のマレイミド基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、１つ以上のアクリラート基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のアクリラート基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、１つ以上のメタクリラート基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のメタクリラート基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、又はそれらの組合せであってもよく、第２のポリマー誘導体は、１つ以上のチオール基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、１つ以上のアミン基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のアミン基で修飾されたヒアルロン酸誘導体、又はそれらの組合せであってもよい。場合によっては、第１のポリマー誘導体は、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸誘導体であってもよく、第２のポリマー誘導体は、１つ以上のチオール基で修飾されたデキストラン誘導体、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体であってもよい。第１のポリマー誘導体は、第２のポリマー誘導体と反応してハイドロゲルを形成することが可能であり得る。

【0128】

例えば、第１のポリマー誘導体は１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ－ＶＳ）を含んでもよく、第２のポリマー誘導体は１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ－ＳＨ）を含んでもよい。別の例を挙げると、第１のポリマー誘導体は１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ－ＶＳ）であってもよく、第２のポリマー誘導体は１つ以上のチオール基で修飾されたデキストラン誘導体（デキストラン－ＳＨ）であってもよい。別の例を挙げると、第１のポリマー誘導体は１つ以上のマレイミド基で修飾されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ－ＭＩ）であってもよく、第２のポリマー誘導体は１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ－ＳＨ）であってもよい。第１のポリマー誘導体は、第２のポリマー誘導体と反応して適切な条件下でポリマー－ポリマータイプのハイドロゲルを形成することが可能であり得る。

【0129】

いくつかの実施形態では、当該第１のポリマーは、形成されたハイドロゲル中の当該組成物中に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、当該第２のポリマーは、形成されたハイドロゲル中の当該組成物中に含まれてもよい。

【0130】

いくつかの実施形態では、当該組成物は、当該１つ以上のポリマーとは異なる架橋剤を何ら含まなくてもよい。

【0131】

いくつかの実施形態では、組成物は緩衝液を含んでもよい。緩衝液は水溶液であってもよく、水及び水溶液のｐＨ又は緩衝能力を調節するために有用である適切な塩を含んでもよい。

【0132】

本開示の組成物中のポリマーは、長期保存にとって卓越した安定性を有してもよい。本開示のポリマーは、長期保存中に分解し得ない。本開示のポリマーは、長期保存中に架橋又はそれ自体と凝集体を形成し得ない。本開示のポリマーは、安定した範囲の分子量を有してもよい。

【0133】

別の態様では、本開示は本開示の組成物で形成されたハイドロゲルを提供する。いくつかの実施形態では、本開示の当該ハイドロゲルは生体適合性がある。

【0134】

場合によっては、組成物中のほぼすべてのポリマーは、ハイドロゲルを形成可能であってもよく、場合によっては、組成物は１つ以上のポリマーとは異なる架橋剤を何ら含まなくてもよい。

【0135】

本開示によるハイドロゲルは、１つ以上の特異な特質／特性を有してもよい。

【0136】

本開示のハイドロゲルは、５％の歪み及び５ｒａｄ／ｓの周波数で動的振動せん断試験にて測定した際、５Ｐａ以下（例えば、４Ｐａ以下、３．５Ｐａ以下、３Ｐａ以下、２．５Ｐａ以下、少なくとも２．４Ｐａ、少なくとも２．２Ｐａ、少なくとも２Ｐａ、少なくとも１．８Ｐａ、１．６Ｐａ以下、１．５Ｐａ以下、１．４Ｐａ以下、１．２Ｐａ以下、１．０Ｐａ以下、０．８Ｐａ以下、０．７Ｐａ以下、０．６Ｐａ以下、０．５Ｐａ以下、０．４Ｐａ以下、０．３Ｐａ以下、０．２Ｐａ以下、０．１Ｐａ以下又はそれ未満）である貯蔵弾性率Ｇ’を有してもよい。

【0137】

本開示のハイドロゲルは、約１０００／ｓ超の周波数せん断速度で連続せん断試験にて測定した際、約１００ｍＰａ・ｓ以下の粘度を有してもよい。本開示のハイドロゲルは、約０．１／ｓ超の周波数せん断速度で連続せん断試験にて測定した際、少なくとも約５００ｍＰａ・ｓの粘度を有してもよい。０．１／ｓのせん断粘度は、１０００／ｓのせん断粘度よりも少なくとも１０倍高い。

【0138】

本開示のハイドロゲルは、５％の歪み及び５ｒａｄ／ｓの周波数で動的振動せん断試験にて測定した際、貯蔵弾性率Ｇ’の約１００％以下（例えば、約９０％以下、約８０％以下、約７０％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、又は約２０％以下）である損失弾性率Ｇ’’を有してもよい。

【0139】

いくつかの実施形態では、組成物は約６．０～約８．０（例えば、約６．１～約７．９、約６．２～約７．７、約６．３～約７．７、約６．４～約７．４、約６．５～約７．３、約６．６～約７．２、約６．７～約７．１、約６．８～約７、約６．３～約６．８、約６．３～約６．７、又は約６．４～約６．６）のｐＨを有してもよい。

【0140】

レオメータは、貯蔵弾性率、損失弾性率を測定するために使用されてもよく、動的振動せん断試験で使用されてもよい。別の例では、レオメータは、磁気コアを通り移動する機器プローブの結果としての電圧の変化を測定し得る変位センサ（例えば、線形可変差動トランスなど）を備えてもよい。レオメータは、温度制御システム、又は炉、駆動モータ（例えば、印加された力に対する負荷を提供し得る、プローブを負荷するための線形モータ）、モータからサンプルへの力に対する誘導として作用する駆動シャフトサポート及び誘導システム、試験されているサンプルを保持するための１つ以上のサンプルクランプ、をさらに備えてもよい。

【0141】

異なるタイプのレオメータ解析装置もまた使用してもよい。例えば、強制共鳴解析装置又は自由共鳴解析装置を使用してもよい。自由共鳴解析装置は、サンプルを吊り下げて振動させることで試験されるサンプルの減衰の自由振動を測定し得る。強制共鳴解析装置は、ある特定の周波数でサンプルを強制的に振動させ得るものであり、これは温度掃引の実施にとって信頼度が高いものとなり得る。解析装置は、応力（力）及び歪み（変位）制御の両方を目的として作製されてもよい。例えば、歪み制御においては、プローブは入れ替えられてもよく、サンプルの得られた応力は、異なるシャフトを使用し得るフォースバランス型トランスデューサを実装することで測定され得る。応力制御においては、設定された力を印加し、サンプルの得られた歪み又は変位が測定され得る。また、いくつかの他の実験条件（温度、周波数又は時間）は変更されてもよい。ねじれ解析装置又は軸方向解析装置により応力及び歪みを印加してもよい。ねじれ解析装置については、力はねじり運動中に印加される。軸方向解析装置は、曲げ試験、引っ張り試験、及び／又は圧縮試験に使用されてもよい。

【0142】

ポリマー及びハイドロゲルの粘弾性を調べるため、例えば温度掃引試験、周波数掃引試験、歪み掃引試験、ステップストレス試験、動的応力－歪み試験、連続せん断試験、又はそれらの組合せといった様々な試験モードを使用してもよい。

【0143】

様々な機械的特性は、レオメータで決定することができる。これらの特性としては、貯蔵弾性率（Ｇ’）、損失弾性率（Ｇ’’）、複素弾性率（Ｇ＊）、損失角（ｔａｎ（δ））、複素粘度（η＊）、同相成分（η’）及び異相成分（η’’）中の複素粘度（η＊）、複素コンプライアンス（Ｊ＊）、貯蔵コンプライアンス（Ｊ’）、損失コンプライアンス（Ｊ’’）、粘度（η）などが挙げられる。

【0144】

例えば、動的振動せん断試験では、正弦力（例えば、応力）が材料に印加され、得られた変位（歪み）が測定され得る。完全弾性固体については、得られた歪み及び応力は完全に同相であり得る。純粋粘性流体については、応力に対して９０度位相遅れした歪みが存在し得る。中間的な特質を有する粘弾性ポリマー又はハイドロゲルは、試験中に位相遅れを有することがあり、それに従って貯蔵弾性率及び損失弾性率が計算され得る。

【0145】

別の態様では、本開示はハイドロゲル（例えば、本開示のハイドロゲル）を生成するための方法を提供する。方法は、ａ）組成物を提供すること（例えば、本開示の１つ以上のポリマーを含む組成物）、及びｂ）ハイドロゲルの形成（例えば、ポリマーの架橋を可能にしてハイドロゲルを形成する）を可能にする条件に組成物を供すること、を含んでもよい。例えば、条件は約１５℃～約５０℃で組成物をインキュベートすることを含んでもよい。

【0146】

場合によっては、方法は、溶液中のポリマーを架橋し、ハイドロゲルを生成することを含んでもよい。例えば、ハイドロゲルの形成を可能にする条件はまた、溶液中のポリマーの架橋を可能にし得る。

【0147】

例えば、方法は、１）第１のポリマー（又は第１のポリマー誘導体）と第２のポリマー（又は第２のポリマー誘導体）（例えば、第１のポリマーは１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸を含んでもよく、第２のポリマーは１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸、デキストラン、又はポリエチレングリコールを含んでもよい）を水中で調製し、ｐＨを調節すること（例えば、緩衝溶液を追加することによる）と；２）予め設定した比で第１のポリマーと第２のポリマーを混合することであって、組成物中のポリマーの濃度は本開示に記載された通りであることと；３）本開示に従いハイドロゲルの形成を可能にする条件の下で混合物をインキュベートすることと、を含んでもよい。

【0148】

いくつかの実施形態では、組成物は組成物中のポリマー（例えば、第１のポリマー誘導体、又は第２のポリマー誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｅ））とは異なる架橋剤を何ら含まなくてもよい。

【0149】

いくつかの実施形態では、組成物は小分子架橋剤を何ら含まなくてもよい。

【0150】

特定の例では、第１のポリマー誘導体は１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸（例えば、ＨＡ－ＶＳ）であり、第２のポリマー誘導体は、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸又はデキストラン（例えば、ＨＡ－ＳＨ又はデキストラン－ＳＨ）である。

【0151】

別の態様では、本開示は、ハイドロゲルを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバント、医薬品、及び／又は診断用化合物をさらに含んでもよい。好適な薬学的に許容されるアジュバント、医薬品、及び／又は診断用化合物は水溶性、水難溶性及び水不溶性の医薬化合物であってもよい。医薬組成物は任意の形態であってもよい。好適な形態は、部分的には、用途の意図された形式及び位置に依存する。

【0152】

本開示では、組成物、ハイドロゲル、及び／又は医薬組成物は、生物活性剤（例えば、活性医薬成分又は薬物）をさらに含んでもよく、生物活性剤は組成物、ハイドロゲル及び／又は医薬組成物中に封入される。生物活性剤は、小分子、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、又は核酸であってもよい。例えば、生物活性剤は、抗菌剤、抗真菌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗生物質、抗体、血管新生抑制剤であってもよい。例えば、生物活性剤は眼疾患又は病状で使用する上で好適であり得る。生物活性剤は、３日超、３日間、２日間、１日間、１２時間、８時間、４時間、３時間、２時間、１時間又はそれ未満でハイドロゲルから累積的に放出されてもよい。

【0153】

例
以下の例は、以下の例は、本発明の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために記載されており、発明者らが自身の発明であると見なすものの範囲を限定し、かつ以下の実験はすべて、又は実施された実験のみを表そうと意図したものではない。使用される数（例えば、数量、温度など）に関する正確性を保証しようと努力してきているが、いくつかの実験誤差及び逸脱は考慮されなければならない。特段指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセルシウス温度であり、圧力は大気圧、又は大気圧付近の圧力である。標準的な省略語が使用されてもよい。例えば、ｂｐは１つ又は複数の塩基対であり；ｋｂは１つ又は複数のキロベースであり；ｐｌは１つ又は複数のピコリットルであり、ｓｅｃは１秒以上であり、ｍｉｎは１分以上であり；ｈ又はｈｒは１時間以上であり、ａａは１つ又は複数のアミノ酸であり；ｎｔは１つ又は複数のヌクレオチドであり、ｉ．ｍ．は筋肉内の（筋肉内に）であり；ｉ．ｐ．は腹腔内の（腹腔内に）であり；ｓ．ｃ．は皮下の（皮下に）、などである。

【0154】

例１ Ｒｇ及び［η］の測定
例えば多角度光散乱法（ｍｕｌｔｉａｎｇｌｅ ｌａｓｅｒ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＭＡＬＬ）検出器に連結されたハイドロゲル浸透クロマトグラフィー及び毛細管粘度計で、ポリマーのＲｇ及び［η］を直接測定することができる。例えば、ヒアルロン酸［ＨＡ］（Ｍｅｎｄｉｃｈｉ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｄｉｕｓ ｏｆ ｇｙｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ｍｏｌａｒ ｍａｓｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２００３；４（６）：１８０５－１８１０）、デキストラン（Ｉｏａｎ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｄｅｘｔｒａｎ．２．ｄｉｌｕｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０００；３３（１５），５７３０－５７３９、又はＫａｓａａｉ Ｍ．Ｒ．，Ｄｉｌｕｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｃｈａｉｎ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｄｅｘｔｒａｎ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ８８（２０１２）３７３－３８１）、カルボキシメチルセルロース（Ｈｏｏｇｅｎｄａｍ，Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｔｉｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９８：３１（１８），６２９７－６３０９、又はＳｉｔａｒａｍａｉａｈ ａｎｄ Ｇｏｒｎｉｎｇ，Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｉＦＦＩＧｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６２；（５８）１１０７－１１３１、又はＥ．Ａｒｉｎａｉｔｗｅ，Ｍ．Ｐａｗｌｉｋ，Ｄｉｌｕｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔｓ ａｎｄ ｄｅｇｒｅｅｓ ｏｆ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ９９（２０１４）４２３－４３１）、及びポリエチレングリコール（Ｄｅｖａｎａｎｄ Ｋ，Ｓｅｌｓｅｒ ＪＣ．Ａｓｙｍｐｔｏｔｉｃ ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．１９９１；２４（２２）：５９４３－５９４７、又はＷｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ：ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｑｕａｒｔｚ ｃｒｙｓｔａｌ ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ．，２０１９：ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４２８－０１８－０１６２－３）中の多くのポリマーのＲｇ及び［η］を測定した。

【0155】

Ｒｇ及び［η］値の一部を表１、表２及び表３に示す。

【表1】

【表2】

【表3】

【0156】

例２ ポリマー誘導体の調製
２．１ ＨＡ－ＶＳの調製

【0157】

ヒアルロン酸（ＨＡ）を、Ｙｕ及びＣｈａｕ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１５，１６（１），５６－６５）に説明されるようにペンダントＶＳで修飾した（図１）。簡単に言えば、脱イオン水（ＤＩ水）中にＨＡを溶解した。濃度は、ＨＡの分子量（ＭＷ）によっては０．１ｍｇ／ｍＬ～４０ｍｇ／ｍＬであった。高ＨＷのＨＡ（例えば、ＭＷ＞１ＭＤａ）に関しては、濃度はより低く、低ＭＷのＨＡ（例えば、ＭＷ＜１００ｋＤａ）に関しては、濃度はより高かった。

【0158】

完全に溶解させた後、５Ｍ ＮａＯＨを、０．１Ｍの最終濃度までポリマー溶液に滴下した。勢いよく混合させながらジビニルスルホン（ＤＶＳ）を直ちに加えた。ＤＶＳとＨＡのヒドロキシル基（ＯＨ）とのモル比は、少なくとも１．２５：１であった。目標の修飾度（ＤＭ）に応じてＤＶＳ濃度及び反応時間を選択した。所与の反応時間について、修飾度はまた、ＨＡとＤＶＳの両方の濃度、温度及び最終ＮａＯＨ濃度にも依存していた。ｐＨを３．５～４．５に低下させるため、１Ｍ ＨＣｌを加えて反応を停止させた。ポリマーを、透析バッグを使用する膜分離又はＤＩ水に対するタンジェンシャルフローろ過で精製した。指定しない限り、精製されたポリマーを溶液として４℃で保存した。修飾度（ＤＭ）の測定に関しては、ＨＡ－ＶＳをフリーズドライして^１ＨＮＭＲにより決定した。

【0159】

２．２ ＨＡ－ＳＨの調製

【0160】

ヒアルロン酸（ＨＡ）を、Ｙｕ及びＣｈａｕ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１５，１６（１），５６－６５）に説明されるようにペンダントチオール（ＳＨ）基で修飾した（図２）。簡単に言えば、ＨＡを最初に修飾し、ＨＡ－ＶＳとした（例２．１に説明）。ＨＡ－ＶＳ溶液を、Ｎ_２で少なくとも２０分間パージした。ビニルスルホン（ＶＳ）基に対して１０倍モル過剰の、又は０．０５Ｍ ＤＴＴ溶液を作製するために必要となる量（ＤＴＴ濃度が高いことに依存する）のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を、約４００ｍｇ／ｍＬで水（ｐＨは約５．５）中に溶解し、Ｎ_２で少なくとも５分間パージし、ＨＡ－ＶＳ溶液に加えた。ＨＡ－ＶＳ／ＤＴＴ溶液のｐＨはおよそ４であり、連続して系をＮ_２でパージした。その後、ＨＡ－ＶＳの１／１０の体積の０．５Ｍ リン酸緩衝液（ＰＢ）をＮ_２で少なくとも５分間パージし、ＨＡ－ＶＳ／ＤＴＴ溶液に加えた。少なくとも２５分間、反応させた。ｐＨを３．５～４．５に低下させるため、１Ｍ ＨＣｌを加えて反応を停止させた。ポリマーを、透析バッグを使用する膜分離、又はＨＣｌで調節されたｐＨ４のＤＩ水に対するタンジェンシャルフローろ過で精製した。指定しない限り、精製されたポリマーを溶液として４℃で保存した。ＨＡ－ＳＨのエルマンアッセイで修飾度（ＤＭ）を決定した。

【0161】

２．３ デキストラン－ＳＨの調製

【0162】

ビニルスルホン（ＶＳ）及びチオール（ＳＨ）官能化デキストラン、デキストラン－ＶＳ及びデキストラン－ＳＨを、既に報告されている方法（Ｙ．Ｙｕ ａｎｄ Ｙ．Ｃｈａｕ、「Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ’ｃｌｉｃｋ’ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｖｉｎｙｌ ｓｕｌｆｏｎｅ ｇｒｏｕｐｓ ｏｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ，」、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．９３７－９４２，２０１２）を参照）を使用して合成した。簡単に言えば、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）は水性アルカリ性状態でデキストランのヒドロキシル基と反応し、デキストラン－ＶＳを作製する（図１）。チオール官能化デキストランはジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用し、リン酸緩衝液中でデキストラン－ＶＳのＶＳ基と反応し、デキストラン－ＳＨを作製するが（図２）、官能化プロトコルは例２．２と同様のものである。ポリマーを、透析バッグを使用する膜分離、又はＨＣｌで調節されたｐＨ４のＤＩ水に対するタンジェンシャルフローろ過で精製した。指定しない限り、精製されたポリマーを溶液として４℃で保存した。^１Ｈ ＮＭＲを使用してデキストラン－ＶＳのＤＭを決定し、デキストラン－ＳＨのＤＭをエルマンアッセイで決定した。

【0163】

例３ 修飾された高固有粘度［η］のポリマーの安定性
例２．２及び例２．１に従い、ＨＡ－ＳＨ及びＨＡ－ＶＳを修飾した。高分子量ＨＡの安定性を示すため、これらのＨＡ誘導体を２．６ＭＤａ（［η］＝２９６０ｍＬ／ｇ、Ｒｇ＝１８３ｎｍ）の分子量のＨＡにより修飾した。アガロースハイドロゲル電気泳動（ＡＧＥ）でＨＡ－ＳＨの安定性を評価し、ＨＡ－ＶＳの安定性をゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で評価した。

【0164】

先行報告書（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｏｗｍａｎ、Ａｎ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４：２１９；２７８－２８７）によりＡＧＥのプロトコルを修正した。簡単に言えば、ＡＧＥローディングバッファ中、約１５％のＤＭのＨＡ－ＳＨサンプルを、ＴＥＡ緩衝液中、５ｍｇ／ｍＬの高融点温度アガロース（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）から構成されたアガロースゲルへと投入した。８０ｍＶで１時間、電気泳動を行った後、５０％エタノール中０．００５％のＳｔａｉｎ－Ａｌｌ（Ｓｉｇｍａ）で一晩、ハイドロゲルを染色した。１０％エタノールを用い、ハイドロゲルを留置した。

【0165】

ＧＰＣ条件を以下に列挙した：

【0166】

ＨＰＬＣ：Ｗａｔｅｒｓ ２６９５

【0167】

示差屈折率検出器：Ｗａｔｅｒｓ ２４１４

【0168】

移動相：０．２Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％のアジ化ナトリウム溶液

【0169】

流速：０．５ｍＬ／分

【0170】

カラム：Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｌｉｎｅａｒ、７．８ｘ３００ｍｍ、ＷＡＴ０１１５４５、００５Ｃ１８１２０１、Ｎｏ．ＫＮＣ－ＣＯＬ－００３。

【0171】

カラムサーモスタットの温度は３５℃であり、検出器の温度は３０℃であった。

【0172】

図４Ａ～図４Ｂの結果は、２．６ＭＤａのＨＡに由来するＨＡ－ＳＨ（１８００ｍＬ／ｇを超える固有粘度を有する）が溶液としては安定していないことを示した。図４Ａのレーン２及びレーン４は修飾されていないＨＡのＡＧＥ結果を示し、図４Ａのレーン１及びレーン３は、ｐＨ４の脱イオン水（ＨＣｌを用いて調節されたｐＨ）に対する約１ｍｇ／ｍＬの溶液としての、反応直後及び透析から１日後のＨＡ－ＳＨのＡＧＥ結果を示す。この結果は、ＨＡ－ＳＨの分子量は反応後標準であるが、酸性状態である透析の１日後には、ＨＡ－ＳＨのＭＷは、レーン３のウェルに閉鎖したスメアが出現したことによる証拠として増加したことを示した。図４Ｂのレーン２及びレーン３は、ＨＡ－ＳＨ及び修飾されていないＨＡのそれぞれの別のＡＧＥ結果を示す。

【0173】

加えて、ＨＡ－ＳＨが凍結乾燥された場合、凍結乾燥された粉末は溶液中に再度溶解できず、ゲルを形成する。

【0174】

対照的に、ＨＡ－ＶＳは長期間にわたり溶液として安定している（図５）。

【0175】

例４ 修飾された低固有粘度［η］のポリマーの安定性
低固有粘度ポリマーの安定性を示す例として、約６５ｋＤａ（［η］＝１０６ｍＬ／ｇ）、約６７０ｋＤａ（［η］＝１１５６ｍＬ／ｇ）のＨＡ－ＳＨ及びデキストラン－ＳＨ（すなわち、Ｄｅｘ－ＳＨ）、並びに約４５ｋＤａ（［η］＝２０ｍＬ／ｇ）のデキストランを使用した。例２．２に説明されているようにＨＡ－ＳＨを調製した。例２．３に説明されているように、Ｄｅｘ－ＳＨを調製した。ＧＰＣでサンプルの分子量安定性を評価し、試験方法を例３に説明した。

【0176】

ポリ（スチレンスルホン酸）ナトリウム塩ポリマー基準から生成したユニバーサル較正曲線と比較することでポリマーの分子量（ＭＷ）及び分子量分散度（ＰＤＩ）を評価した。

【0177】

ｐＨ３、４℃で溶液としてポリマーを保存した。

【0178】

例４．１ １５％のＤＭ及び６５ｋＤａのＨＡ－ＳＨの安定性
１５％のＤＭのＨＡ－ＳＨの結果を表４に示した。

【表4】

【0179】

驚くべきことに、液体形態でのＨＡ－ＳＨの保存条件は例３と同様であるにもかかわらず、表４からは、低固有粘度を有するＨＡ－ＳＨは少なくとも６０日間溶液として安定であったことが理解できる。加えて、ＭＷのわずかな増加が約９０日後に見られた。図６は、表４のポリマーのＭＷ変化の動向及び元のＧＰＳ曲線の例を示した。

【0180】

例４．２ ２５％のＤＭ及び６５ｋＤａのＨＡ－ＳＨの安定性
例４．１は驚くべきことに、低［η］ポリマーを修飾するのみで溶液中で安定しているＳＨポリマーを示しており、発明者らは、４℃にて溶液中で高ＤＭ（１０．１６ｍｇ／ｍＬ）のＳＨポリマーが安定可能かどうかをさらに調査した。

【表5】

【0181】

表５は、２５％のＤＭの６５ｋＤａのＨＡ－ＳＨの安定性の例を示した。結果は、ＨＡ－ＳＨのＭＷは少なくとも７０日間安定していたことを示した。図７は、表５のポリマーのＭＷ変化の動向及び元のＧＰＳ曲線の例を示した。

【0182】

例４．３ 約５％及び約１２．５％のＤＭ、４５ｋＤａのデキストラン－ＳＨの安定性
低［η］を有するＳＨポリマーの安定性をさらに実証するため、例２に従い、約４５ｋＤａのデキストランをデキストラン－ＳＨに修飾した。デキストラン－ＳＨの２つのＤＭとして５％及び１２．５％のものを例として使用した。デキストランは、単糖の繰り返しから構成されたポリマーであり、約４００ＤａのＭＷを有するＨＡの二糖の繰り返しと比較して繰り返し単位のＭＷが約１６０Ｄａであることに留意されたい。こうした理由について、したがって５％及び１２．５％のＤＭのデキストラン－ＳＨは１２％及び３０％のＤＭのＨＡ－ＳＨと同様のＳＨ密度を有する。

【0183】

試験結果を表６に示す。両方のポリマーのＭＷは少なくとも１８０日間増加しないことが明らかとなった。図８は、表６のポリマーのＭＷ変化の動向及び元のＧＰＳ曲線の例を示した。

【表6】

【0184】

４．４ １６．４％のＤＭ及び６７０ｋＤａのＨＡ－ＳＨの安定性

【0185】

発明者らは、わずかに高いＭＷ及び固有粘度のポリマーである６７０ｋＤａのＨＡ－ＳＨ（［η］＝１１５６ｍＬ／ｇ）が、４℃にて溶液（５．５ｍｇ／ｍＬ）中で安定であるかどうかをさらに調査した。この例では、ポリマーのＤＭは１６．４％であった。

【0186】

ｐＨ３の希釈ＨＣｌ溶液中にＨＡ－ＳＨを保存した。発明者らは、ポリマーが精製から１日後に安定していたことを見出した。７日後、ポリマーは依然として大半が非架橋状態であったが、一部の高ＭＷ部分を確認することができる。１４日後、高ＭＷのポリマー（矢印で指示されている）をＡＧＥ中で確認することができる。３０日後、単独でゲル形成するポリマーは、著しく自己架橋したことを示す。結果（図１３）は、材料は２．６ＭＤａのＨＡ－ＳＨと比較して比較的安定している。

【0187】

例５ 修飾された高［η］ポリマー及び修飾された低［η］ポリマーによるハイドロゲルの形成
例２に従い、ＨＡ－ＶＳ、ＨＡ－ＳＨ及びデキストラン－ＳＨを作製した。ＨＡ－ＶＳ及びＨＡ－ＳＨ又はデキストラン－ＳＨの濃度を最初に決定した。既知の体積のポリマー溶液をフリーズドライし、ポリマーの乾燥重量を測定した。正確な測定を保証するため、乾燥ポリマーは少なくとも４ｍｇであった。代替的には、既に説明したように（Ｏｕｅｓｌａｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＣＴＡＢ ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｓｓａｙｉｎｇ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｕｎｄｅｒ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｆｏｒｍ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２０１４）、ＣＴＡＢアッセイでＨＡ－ＶＳ及びＨＡ－ＳＨのポリマー濃度を測定し、中国薬局方に従い、偏光計でデキストラン－ＳＨのポリマー濃度を測定した。続いて、０．５Ｍ ＰＢを加えることで、既知の濃度のＨＡ－ＶＳ及びＨＡ－ＳＨ又はデキストラン－ＳＨをｐＨ７．４に調節した。ＰＢの最終濃度は約０．０２Ｍ～０．０５Ｍであった。続いて２５％のＮａＣｌを使用し、オスモル濃度を調節した。続いて、ポリマーを様々な目標の体積比及び質量比で混合し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）を加えることで目標の最終濃度に調節した。

【0188】

ハイドロゲルを形成するため、３７℃で２４時間、ポリマーをインキュベートした。ハイドロゲル形成反応を図３で実証した。インキュベーション期間後、慎重にピペッティングすることで、ゲル形成のため、ハイドロゲルを最初に視覚的にチェックした。ゲル状構造を首尾良く形成する条件について、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ製レオメータの６０ｍｍのコーンプレート治具（ＣＰ６０－１／Ｔ１）の下部プレート上に形成されたハイドロゲルを載せ、機械的特性（例えば、Ｇ’及びＧ’’）を測定した。ハイドロゲル形成の客観的指標として、線形粘弾性領域（ｌｉｎｅａｒ ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃ ｒｅｇｉｏｎ：ＬＶＲ）領域にてＧ’’値と比較すると高いＧ’値（例えば、Ｇ’＞Ｇ’’）を使用した。

【0189】

５．１ 様々な濃度のポリマーで形成されたハイドロゲル
原理を実証するものとして、大きな［η］ポリマー（２３％のＤＭで２．６ＭＤａのＨＡ－ＶＳ、［η］＝２９６０ｍＬ／ｇ）を小さな［η］ポリマー（１４％のＤＭで６５ｋＤａのＨＡ－ＳＨ、［η］＝１０６ｍＬ／ｇ）と以下のように混合した：

【0190】

グループ１：それぞれ、０．６４ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＳＨ、１．０１ｍｇ／ｍＬ、０．８１ｍｇ／ｍＬ、０．６５ｍｇ／ｍＬ、０．５２ｍｇ／ｍＬ、０．４２ｍｇ／ｍＬ、０．３３ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＶＳ。

【0191】

グループ２：それぞれ、０．４３ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＳＨ、１．０１ｍｇ／ｍＬ、０．８１ｍｇ／ｍＬ、０．６５ｍｇ／ｍＬ、０．５２ｍｇ／ｍＬ、０．４２ｍｇ／ｍＬ、０．３３ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＶＳ。

【0192】

グループ３：それぞれ、０．３４ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＳＨ、１．２７ｍｇ／ｍＬ、１．０１ｍｇ／ｍＬ、０．８１ｍｇ／ｍＬ、０．６５ｍｇ／ｍＬ、０．５２ｍｇ／ｍＬ、０．４１ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＶＳ。

【0193】

グループ４：それぞれ、０．２８ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＳＨ、１．２７ｍｇ／ｍＬ、１．０１ｍｇ／ｍＬ、０．８１ｍｇ／ｍＬ、０．６５ｍｇ／ｍＬ、０．５２ｍｇ／ｍＬ、０．４１ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＶＳ。

【0194】

５ｒａｄ／ｓの周波数及び５％の歪みで測定されたＧ’及びＧ’’（各調合物につきｎ＝３）を表７～表１０に示した。図９～図１０は、異なる調合物のＧ’の変化の動向を示した。これらの結果は、ＨＡ－ＶＳ濃度が一定に維持されている場合には、ＨＡ－ＳＨ濃度が減少するのに伴い機械的特性が減少することを示した。ＨＡ－ＳＨが一定に維持されている場合、ＨＡ－ＶＳ濃度が減少するのに伴い、機械的特性は減少する。２つのゲル形成するポリマー濃度を調節することで、望ましい値のＧ’を調節することができる。ＨＡ－ＶＳの濃度がその重なり濃度（ｃ＊）、すなわち約０．３３ｍｇ／ｍＬ未満である場合、ゲルを形成することはできない。重なり濃度は、

【0195】

ｃ＊＝１／［η］で計算することができる。

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【0196】

大きな［η］ポリマー（２３％のＤＭで２．６ＭＤａのＨＡ－ＶＳ、［η］＝２９６０ｍＬ／ｇ）を使用することで別のハイドロゲルを形成し、低ＭＷの小さな［η］ポリマー（１６．４％のＤＭで６７０ｋＤａのＨＡ－ＳＨ、例２．２で調製、［η］＝１１５６ｍＬ／ｇ）と混合した。０．８ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＶＳと０．４ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＳＨの混合物（ＨＡ－ＶＳとＨＡ－ＳＨとのモル比は１：１．９であった）については、ハイドロゲルを形成した。

【0197】

大きな［η］ポリマー（６７０ｋＤａのＨＡ－ＶＳ、例２．１で調製、［η］＝１１５６ｍＬ／ｇ）を使用することで別のハイドロゲルを形成し、低ＭＷの小さな［η］ポリマー（６５ｋＤａのＨＡ－ＳＨ、例２．２で調整、［η］＝１０６ｍＬ／ｇ）と混合した。この例では、ＨＡ－ＶＳの濃度は２．５ｍｇ／ｍＬであり、ＤＭは４０％であった。ＨＡ－ＳＨの濃度は０．４２ｍｇ／ｍＬであり、ＤＭは１４．３％であった。ＨＡ－ＶＳとＨＡ－ＳＨとのモル比は１：１．７であった。５％の歪み及び１ｒａｄ／ｓでは、Ｇ’は０．９６Ｐａであり、Ｇ’’は０．３８Ｐａであった。別の例では、ＨＡ－ＶＳの濃度は４ｍｇ／ｍＬであり、ＤＭは４０％であった。ＨＡ－ＳＨの濃度は０．０８ｍｇ／ｍＬであり、ＤＭは１４．３％であった。ＨＡ－ＶＳとＨＡ－ＳＨとのモル比は４．９：１であった。ゲルは形成されなかった。別の例では、ＨＡ－ＶＳの濃度は４ｍｇ／ｍＬであり、ＤＭは４０％であった。ＨＡ－ＳＨの濃度は０．１６ｍｇ／ｍＬであり、ＤＭは１４．３％であった。ＨＡ－ＶＳとＨＡ－ＳＨとのモル比は２．４：１であった。このゲルの機械的特性を表１１に示す。

【表11】

【0198】

５．２ 異なるＤＭのポリマーで形成されたハイドロゲル
小さな［η］ポリマーのＤＭは変化させることができ、ハイドロゲルを形成することができる。図１１は、２３％のＤＭ、１ｍｇ／ｍＬ、２．６ＭＤａのＨＡ－ＶＳと１４％又は２２％のＤＭ、６５ｋＤａのＨＡ－ＳＨとを混合することで作製されたハイドロゲルのＧ’値を示している。５ｒａｄ／ｓの周波数及び５％の歪みで値を測定した。調合は以下の通りである：

【0199】

グループ１：それぞれ、１４％のＤＭのＨＡ－ＳＨ、約０．１４ｍｇ／ｍＬ～約０．３ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＳＨ。

【0200】

グループ２：それぞれ、２２％のＤＭのＨＡ－ＳＨ、約０．１４ｍｇ／ｍＬ～約０．３ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＳＨ。結果（図１１）は、ＨＡ－ＶＳが一定に維持されている場合、ハイドロゲルの機械的強度は、ＨＡ－ＳＨの濃度及びＤＭが減少した場合には低下したことを示した。したがって、Ｇ’の望ましい値を、ハイドロゲル形成ポリマーのＤＭ及び濃度を調節することで調節することができた。

【0201】

５．３ デキストラン－ＳＨで形成されたハイドロゲル
別の小さな［η］のポリマーである、４５ｋＤａのデキストラン－ＳＨ（又は［η］＝２０ｍＬ／ｇ）を別の例で使用した。表１２及び図１２は、大きな［η］ポリマー（２３％のＤＭで２．６ＭＤａのＨＡ－ＶＳ、［η］＝２９６０ｍＬ／ｇ）及び４５ｋＤａ（又は［η］＝２０ｍＬ／ｇ）、１３％及び５％のＤＭのデキストラン－ＳＨから構成された異なる調合物のＧ’を示した。調合は以下の通りである：

【0202】

グループ１：それぞれ、０．８１ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＶＳ、１３％のＤＭ、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約０．３５ｍｇ／ｍＬのデキストラン－ＳＨ。

【0203】

グループ２：それぞれ、０．８１ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＶＳ、５％のＤＭ、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約０．３５ｍｇ／ｍＬのデキストラン－ＳＨ。

【0204】

グループ３：それぞれ、０．６５ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＶＳ、１３％のＤＭ、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約０．３５ｍｇ／ｍＬのデキストラン－ＳＨ。

【0205】

グループ４：それぞれ、０．６５ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＶＳ、５％のＤＭ、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約０．３５ｍｇ／ｍＬのデキストラン－ＳＨ。

【0206】

５ｒａｄ／ｓの周波数及び５％の歪みのＧ’及びＧ’’値を示した。これらの結果はそれぞれ、ＨＡ－ＶＳ濃度が減少するのに伴い機械的強度が減少し、デキストラン－ＳＨ（Ｄｅｘ－ＳＨ）修飾度が減少するのに伴い機械的強度が減少し、かつデキストラン－ＳＨ濃度が減少するのに伴い機械的強度が減少したことを示した。望ましい値のＧ’を、ハイドロゲル形成ポリマーのＤＭ及び濃度を調節することで調節することができた。

【表12】

【0207】

５．４ ＰＥＧ－ＳＨで形成されたハイドロゲル
大きな［η］ポリマー（２．６ＭＤのＨＡ－ＶＳ、例２．１で調製、［η］＝２９６０ｍＬ／ｇ）を使用することで別のハイドロゲルを形成し、小さな［η］ＰＥＧ－チオール（ＰＥＧ－ＳＨ）と混合した。

【0208】

大きな［η］ポリマー（２．６ＭＤのＨＡ－ＶＳ、例２．１で調製、［η］＝２９６０ｍＬ／ｇ）を使用することで別のハイドロゲルを形成し、小さな［η］の４アームＰＥＧ－チオール（５ＫＤａ、［η］は約１０ｍＬ／ｇ、市販品から入手）と混合した。この例では、ＨＡ－ＶＳを０．８ｍｇ／ｍＬに維持し、ＰＥＧジチオールは０．４ｍｇ／ｍＬ（サンプル１）、０．２ｍｇ／ｍＬ（サンプル２）及び０．１ｍｇ／ｍＬ（サンプル３）であった。５％の歪みで測定された機械的特性の例を表１３に示す：

【表13】

【0209】

例６ 修飾された高［η］ポリマー及び修飾された低［η］ポリマーによるハイドロゲルの機械的特性の測定
例２に従い、ＨＡ－ＶＳ、ＨＡ－ＳＨ及びデキストラン－ＳＨを作製した。例５に従い、ハイドロゲルを形成してレオメータに載せた。表１４に示されるようにハイドロゲルの４つの代表的な調合を例示目的のために例として示した。したがって、ＳＨポリマーに対するＨＡ－ＶＳのモル比は、Ｆ４に対するＦ１については１：６２、１：１２、１：１０、１：１６であった。

【表14】

【0210】

異なるタイプの機械的試験モードの下で、ハイドロゲルの機械的特性を測定した。試験の例を図１４～図１７に示した。

【0211】

図１４Ａ及び図１４Ｂは、周波数掃引試験の結果を示した。この試験では、振動歪みを５％に維持し、例えばＧ’及びＧ’’といった機械的特性を、異なる振動周波数で測定した。この試験は、非常に低いＧ’値にもかかわらず、ハイドロゲルは粘性液体である代わりに粘弾性固体であったことが実証された。これは、低周波数であってもＧ’がＧ’’よりも高いことが理由である。

【0212】

図１５Ａ及び図１５Ｂは、歪み掃引試験の結果を示した。この試験では、振動周波数を５ｒａｄ／ｓに維持し、例えばＧ’及びＧ’’といった機械的特性を、異なる振動歪みで測定した。この試験は、ハイドロゲルの線形粘弾性範囲（ＬＶＲ）を実証した。低せん断歪み（例えば、１％のＦ２及びＦ４）で同様のＧ’を有するハイドロゲルについては、高歪み（例えば、１００％）での挙動は異なり得る。Ｆ２は、Ｆ４と比較すると著しく弾性が低い（例えば、Ｇ’～Ｇ’’）。結果は、異なる歪みの下での弾性挙動は調節可能であることを示した。

【0213】

図１６Ａ及び図１６Ｂは、ステップストレス試験の結果を示した。ステップストレス試験では、一定の応力を材料に印加して得られた歪みを測定した。この試験では、発明者らは６０秒間一定の応力を印加し、続けて３０秒間０Ｐａとした（緩和）。その後、第２の一定の応力を印加し、続けてもう一度緩和させた。０．０５Ｐａ、０．１Ｐａ、０．２Ｐａ及び０．５Ｐａの４つの応力を段階的にハイドロゲルに印加した。結果は、材料は低応力条件では実際に粘弾性固体であることを示した。これは、材料の歪みがどの応力であってもほぼ一定であることが理由である。材料が粘性溶液である場合、歪み応答は印加された各応力に対して一定の速度で増加すると予想される。低応力でのハイドロゲルの固体特性を示す別の証拠は、応力を取り除いた際に（緩和）、ハイドロゲルが、負荷を瞬間的に取り除くとすぐに生じるばねの跳ね返り運動と同様に、弾性リンギングを伴いながら多少の違いはあるが初期位置に戻ったという点である。発明者らによる例では、ほとんどのハイドロゲルは低応力レベルでは比較的弾性（歪みはさらに一定であり、緩和はより顕著である）であったが、高応力レベルでは比較的粘性（歪みは増加しており、緩和はあまり顕著ではない）であった。低応力で高弾性を有するハイドロゲルは、必ずしも高応力では高弾性に対応しない。例えば、Ｆ１は他のハイドロゲルと比較して、０．０５Ｐａではより弾性（例えば、歪みは１０％にすぎない）であるが、０．５Ｐａではより粘性（例えば、歪み速度はより高い）である。

【0214】

図１７Ａ及び図１７Ｂは、連続せん断試験の結果であった。この試験では、異なるせん断速度で材料のせん断粘度を測定した。結果は、ハイドロゲルの粘度はせん断速度が増加するのにつれて減少したことを示した。ほとんどのハイドロゲルについては、低せん断速度（例えば、０．１／ｓ）のせん断粘度は少なくとも１０００ｍＰａ・ｓであり、高せん断速度（例えば、１０００／ｓ）のせん断粘度は１００ｍＰａよりも低かった。したがって、０．１／ｓの粘度は、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３及びＦ４については、約４２００ｍＰａ・ｓ、１４００ｍＰａ・ｓ、８１００ｍＰａ・ｓ及び２１００ｍＰａ・ｓであった。したがって、１０００／ｓの粘度は、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３及びＦ４については、約９ｍＰａ・ｓ、２３ｍＰａ・ｓ、３２ｍＰａ・ｓ及び３０ｍＰａ・ｓであった。一部のハイドロゲルは、例えばＦ１とＦ２を比較すると、低せん断速度で高い粘性を有するが、高せん断速度で低い粘性を有する。

【0215】

例７ マレイミド修飾されたヒアルロン酸（ＨＡ－ＭＩ）の合成
２．６ＭＤａの分子量を有するヒアルロン酸（ＨＡ）をＢｌｏｏｍａｇｅ Ｆｒｅｄａ（Ｊｉｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）から得た。

【0216】

Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸（ＭＩ）と４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）をＡｌａｄｄｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ得た。

【0217】

８ｍＬの１ｍＭ ＰＢ中にＨＡ（２４ｍｇ）を含有する溶液に、ＭＩ分子（１５．１０ｍｇ）を加えた。続いてこの混合物に約３５０μＬの０．１Ｍ ＮａＯＨを加え、ｐＨを６．０に調節した後、ＤＭＴＭＭ（６６．４ｍｇ）を加えた。ＨＡの－ＣＯＯＨとＭＩの－ＮＨ２とＤＭＴＭＭとのモル比は１：１：４であった。３２０μＬの２５％のＮａＣｌを加えた後、５０ｍＬのコニカルチューブ中で３２ｍＬのエタノールに沈殿させることで、７２時間で反応を停止した。沈殿物を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけ、上清液をデカントすることでこれを分離した。残渣のペレットを１０ｍＬのＤＩに再度溶解し、３日間、４ＬのＤＩ中で透析することでさらに精製した。透析緩衝液を１日に２回交換した。透析後のＤＩ中のＨＡ－ＭＩ濃度は１．６ｍｇ／ｍＬであり、ＤＭは４．８％であった。

【0218】

例８ ＨＡ－ＭＩからのハイドロゲルの形成
例７で作製したＨＡ－ＭＩを６５ｋＤａ及び１１．６％のＤＭのＨＡ－ＳＨとリン酸緩衝液中で混合した。約３００ｍＯｓｍの０．０２Ｍ リン酸緩衝生理食塩水では、最終濃度は、１．１ｍｇ／ｍＬ（ＨＡ－ＭＩ）、１ｍｇ／ｍＬ（ＨＡ－ＳＨ）であった。ハイドロゲルを形成した。

【0219】

例９ ハイドロゲル中での原薬（ａｃｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ：ＡＰＩ）の封入
例２に従い、ＨＡ－ＶＳ、ＨＡ－ＳＨ及びデキストラン－ＳＨを作製した。ハイドロゲル形成前に粉末形態のＡＰＩをポリマー混合物に加えたことを除き、ハイドロゲルを例５と同様に形成した。ハイドロゲルの１９個の代表的な調合を例示目的のために表１５に示した。４個の代表的な調合の機械的特性は、例５に従い測定したように、表１６に示した。

【表15】

【表16】

【0220】

例１０ ハイドロゲルからのＡＰＩ放出
モキシフロキサシンをＨｅｔｅｒｏ Ｄｒｕｇｓ Ｌｉｍｉｔｅｄから入手した。レボフロキサシンをＡｌａｄｄｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。ベバシズマブをＲｏｃｈｅから入手した。修飾ＲＮＡアプタマーをＳｙｎｂｉｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃから入手した。

【0221】

１０．１ モキシフロキサシンの放出

【0222】

以下の調合（表１７）は、モキシフロキサシンを含むハイドロゲルの形成のためのものであった。

【表17】

【0223】

例５に従ってハイドロゲルを形成した。このゲルを３７℃で２日間インキュベートしてから放出実験を行った。放出実験については、少量のゲル（２００～３００μｇ）を、３ｍＬの使い捨てプラスチック製ピペットで周囲温度の５ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。最終放出計算のため、ゲルの質量を測定した。続いて、５ｍＬのＰＢＳ溶液でエッペンドルフチューブをゆっくりと満たして、ゲルの擾乱(disturbing)を最小限に留めた。放出実験を３７℃で実施した。この場合、所定の各時点（０．１時間、１時間及び２時間）では、チューブを１０秒間穏やかに振盪させ、１０分間周囲温度で静置した。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を定量するため、１００μＬの放出緩衝液を採取した。注入前に、０．１Ｍ ＰＢで放出緩衝液を１０倍に希釈し、０．２２μｍのシリンジフィルタでろ過した。０．０５Ｍのリン酸水素二カリウム／アセトニトリル（８２／１８、ｖ／ｖ、ｐＨ＝３）からなる移動相を用い、１．０ｍＬ／分の流速、３７℃でＨＰＬＣを実施した。ＹＭＣ－Ｐａｒｋ Ｐｒｏ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３μｍ）に溶離液を流した。検出波長は２９３ｎｍであった。２、５、１０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬの線形範囲で基準としてモキシフロキサシンを使用し、濃度を測定した。３回反復して実験を行った。図１８は、モキシフロキサシンは急速に放出され、この放出は約２時間継続したことを示した。

【0224】

１０．２ レボフロキサシンの放出

【0225】

以下の調合（表１８）は、レボフロキサシンを含むハイドロゲルの形成のためのものであった。１０．１に従い、レボフロキサシンを含むハイドロゲルを形成した。２、５、１０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬの線形範囲で基準としてレボフロキサシンを使用し、濃度を測定した。図１９は、レボフロキサシンは急速に放出され、この放出は約２時間継続したことを示した。

【表18】

【0226】

１０．３ ＩｇＧタンパク質の放出

【0227】

以下の調合（表１９）は、タンパク薬物であるベバシズマブを含むハイドロゲルの形成のためのものであった。

【表19】

【0228】

例５と同様にハイドロゲルを形成した。ベバシズマブをタンパク薬物例として使用した。２５ｍｇ／ｍＬベバシズマブを含有する２００ｍＬのアバスチン（Ｒｏｃｈｅ（ＵＳＡ）から購入）を、９２６μＬ、１．６２ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＶＳ及び４０．５μＬ、１２．４ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＳＨ、２００μＬの０．５Ｍ リン酸緩衝液及び適切な量の２回脱イオン水と混合し、表１８に従って最終調合物とした。このゲルを３７℃で２日間インキュベートしてから放出実験を行った。放出実験については、少量のゲル（２００～３３０μｇ）を、３ｍＬの使い捨てプラスチック製ピペットで周囲温度の１０ｍＬのガラスバイアルに移し、最終放出計算のために質量を測定した。８ｍＬの放出緩衝液（ｐＨを７．４に調節した４０ｍＭのアルギニンを含有するＰＢＳ溶液）でガラスバイアルをゆっくりと満たして、ゲルの擾乱(disturbing)を最小限に留めた。放出を３７℃で実施した。この場合、所定の各時点（０．５時間、１時間、３時間、４．５時間、２４時間、及び７２時間）では、サンプルを１０秒間穏やかに振盪させ、１０分間周囲温度で静置した。その後、ＨＰＬＣを定量するため、４００μＬの放出緩衝液を採取した。注入前に、放出緩衝液を０．２２μｍのシリンジフィルタでろ過した。０．２Ｍ リン酸カリウム及び０．２５Ｍ 塩化カリウム（ｐＨ＝６．２）からなるリン酸緩衝液を用いて、流速０．５ｍＬ／分で３０分、ＨＰＬＣを実施した。注入体積５０μＬの溶離液をＶａｎｇｕａｒｄカートリッジホルダカラム及びＷａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ、２００Ａ、３．５μｍ）に順に流した。検出波長は２８０ｎｍであった。１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍＬの線形範囲で基準としベバシズマブを使用し、濃度を測定した。３回反復して実験を行った。図２０は、ベバシズマブは約５時間で急速に放出され、この放出は約１～３日間継続したことを示した。

【0229】

１０．４ アプタマーの放出

【0230】

以下の調合（表２０）は、ＲＮＡベースのアプタマーを含むハイドロゲルの形成のためのものであった。

【表20】

【0231】

例５と同様にハイドロゲルを形成した。アプタマー例として、以下のヌクレオチド配列及び官能基：５’末端が６個の炭素（Ｃ６）で保護され、３’末端が３’－ｄＴ－５’で保護されたＣｆＧｍＧｍＡＡＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ３’（配列番号１）のＭａｃｕｇｅｎに類似するアプタマーとＣｙ３蛍光色素とを使用した。Ｇｍ又はＡｍ及びＣｆ又はＵｆは、それらのそれぞれのプリン及びピリミジンの２－メトキシ及び２－フルオロバリアントを表し、Ｃ、Ａ、Ｕ及びＧはシチジル酸、アデニル酸、ウリジル酸及びグアニル酸を指定している。ハイドロゲル形成前の溶液を粉末形態のＡＰＩに加えたことを除き、ハイドロゲルを例５と同様に形成した。このゲルを３７℃で２日間インキュベートしてから放出実験を行った。放出実験については、少量のゲル（２００～３００μｇ）を、３ｍＬの使い捨てプラスチック製ピペットで周囲温度の１０ｍＬのガラスバイアルに移し、最終放出計算のために質量を測定した。続いて、５ｍＬのＰＢＳ溶液でガラスバイアルをゆっくりと満たして、ゲルの擾乱(disturbing)を最小限に留めた。放出を３７℃で３回反復して実施した。この場合、所定の各時点（０．５時間、１時間、２時間、４時間）では、サンプルを１０秒間穏やかに振盪させ、１０分間周囲温度で静置した。その後、２６０ｎｍでＵＶを定量するため、１０００μＬの放出緩衝液を採取した。３回反復して実験を行った。図２１及び図２２は、アプタマーはハイドロゲルから急速に放出され、この放出が約４時間継続したことを示した。

【0232】

本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、かつ記載されているが、かかる実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。本発明は、本明細書内で提供されている特定の例によって限定されることを意図してはいない。本発明は前述の明細書を参照してきているが、本明細書の実施形態の説明及び例示は、限定的な意味で解釈されることを意味していない。本発明から逸脱することなく、当業者は非常に多くの変形、変更及び代用がここで思い浮かぶであろう。さらには、本発明のすべての態様は、様々な条件及び変数に依存する本明細書に記載されている特定の描写、構成又は相対的な比率に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載される本発明の実施形態に対し、本発明を実際する際には種々の代替形態が利用され得ることを理解されたい。したがって、本発明はかかる任意の代替形態、修正形態、変形又は同等物をも網羅することと企図している。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義することを意図しており、かつこれらの請求項及び同等物の範囲内の方法及び構造は、これに包含されることを意図している。

【配列表フリーテキスト】

【0233】

配列表１ ＜２２３＞アプタマー
配列表１ ＜２２３＞ｃは、シチジル酸の２－フルオロバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｇは、グアニル酸の２－メトキシバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｇは、グアニル酸の２－メトキシバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｕは、ウリジル酸の２－フルオロバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｃは、シチジル酸の２－フルオロバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ａは、アデニル酸の２－メトキシバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｇは、グアニル酸の２－メトキシバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｕは、ウリジル酸の２－フルオロバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｇは、グアニル酸の２－メトキシバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ａは、アデニル酸の２－メトキシバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ａは、アデニル酸の２－メトキシバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｕは、ウリジル酸の２－フルオロバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｇは、グアニル酸の２－メトキシバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｃは、シチジル酸の２－フルオロバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｕは、ウリジル酸の２－フルオロバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｕは、ウリジル酸の２－フルオロバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ａは、アデニル酸の２－メトキシバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｕは、ウリジル酸の２－フルオロバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ａは、アデニル酸の２－メトキシバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｃは、シチジル酸の２－フルオロバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ａは、アデニル酸の２－メトキシバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｕは、ウリジル酸の２－フルオロバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｃは、シチジル酸の２－フルオロバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｃは、シチジル酸の２－フルオロバリアントを表す
配列表１ ＜２２３＞ｇは、グアニル酸の２－メトキシバリアントを表す

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

2023523028000001.app

【国際調査報告】