特表 2023-523066 ミスフォールドＴＤＰ－４３に対する単鎖抗体およびイントラボディならびに使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-01

(54)【発明の名称】ミスフォールドＴＤＰ－４３に対する単鎖抗体およびイントラボディならびに使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230525BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230525BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230525BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20230525BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230525BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230525BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20230525BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230525BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20230525BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20230525BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/867 Z

C12N15/864 100Z

C12N5/10

C07K16/18

A61K39/395 N

A61K48/00

A61K31/711

A61K35/76

A61P25/02

A61P21/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022565772

(86)(22)【出願日】2021-04-29

(85)【翻訳文提出日】2022-12-26

(86)【国際出願番号】 CA2021050597

(87)【国際公開番号】W WO2021217267

(87)【国際公開日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】63/017,363

(32)【優先日】2020-04-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】300066874

【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア

(71)【出願人】

【識別番号】514316411

【氏名又は名称】プロミス、ニューロサイエンシズ、インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＭＩＳ ＮＥＵＲＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110003421

【氏名又は名称】弁理士法人フィールズ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ニール、アール．キャッシュマン

(72)【発明者】

【氏名】ヨハンネ、カプラン

(72)【発明者】

【氏名】ベイベイ、ザオ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA05

4C084ZA22

4C084ZA94

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC23

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4C085GG08

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZA22

4C086ZA94

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087NA05

4C087ZA22

4C087ZA94

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、単鎖抗体、例えば、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関連でＷ６８に特異的に結合する抗体をコードする核酸およびベクター、ならびに単鎖抗体、核酸およびベクターを、それを必要とする対象に投与する方法に関する。
【選択図】図２０

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単鎖抗体をコードする配列を含んでなる核酸であって、前記単鎖抗体はミスフォールドＴＤＰ－４３においてＴｒｐ－６８に結合し、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなる重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなり、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、リンカーによって連結され、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下のように配列を含んでなり：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＳＮＹＶ 配列番号 １６；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＷＦＡＧＩＶＤＴＴ 配列番号 １７；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＮＰＶＧＳＶＮＬ 配列番号 １８；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＳＮＮＲ 配列番号 １９；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＹＡＳ 配列番号 ２０；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＷＲＧＡＲＴＤＧＶＤ 配列番号 ２１、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＲＹＹ 配列番号 １０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＩＰＧＧＴＴ 配列番号 １１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ 配列番号 １２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＮＮＮＨ 配列番号 １３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＥＡＳ 配列番号 １４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＳＧＹＫＲＶＴＴＤＧＩＡ 配列番号 １５、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＳＳＹＶ 配列番号 ２２；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＳＤＴＧＩＮＴ 配列番号 ２３；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＲＹＴＧＤＴＹＬＧＮＦＮＬ 配列番号 ２４；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＮＹ 配列番号 ２５；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＡＳ 配列番号 ２６；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＧＷＲＳＬＮＡ 配列番号 ２７、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＥＦＳＦＳＳＲＹＷ 配列番号 ２８；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＴＧＳＩＤＡＴ 配列番号 ２９；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＧＳＤＡＷＧＬＹＦＮＬ 配列番号 ３０；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＨＫＮＮＹ 配列番号 ３１；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＦＡＳ 配列番号 ３２；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＶＹＳＧＲＩＦＡ 配列番号 ３３、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＴ 配列番号 ３４；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＧＧＩＧＳＴ 配列番号 ３５；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＧＲＧＤＩ 配列番号 ３６；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＲ 配列番号 ３７；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＧＡＳ 配列番号 ３８；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＧＮＹＤＣＳＳＶＤＣＧＡ 配列番号 ３９、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＡＹＹ 配列番号 ４０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＴＩＰＩＧＲＴ 配列番号 ４１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ 配列番号 ４２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＮＮＮＱ 配列番号 ４３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＱＡＳ 配列番号 ４４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＹＫＳＰＴＴＤＧＩＡ 配列番号 ４５、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＡ 配列番号 ４６；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＮＹＥＴ 配列番号 ４７；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＤＩＦＲＴＮＴＮＬ 配列番号 ４８；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＮＧ 配列番号 ４９；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＦＴＳ 配列番号 ５０；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＧＧＹＤＣＳＳＲＶＣＧＡ 配列番号 ５１、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＮ 配列番号 １２０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＧＴＧＧＩＴ 配列番号 １２１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＳＳＧＳＤＷＷＦＨＩ 配列番号 １２２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＮＮＮＮ 配列番号 １２３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＲＡＳ 配列番号 １２４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＱＧＹＦＳＧＦＩＴＴ 配列番号 １２５、

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＴＦＳＳＹＹ 配列番号 １３０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＮＳＮＧＧＳＴ 配列番号 １３１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＱＮＹＥＧＡＹ 配列番号 １３２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ 配列番号 １３３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＶＳ 配列番号 １３４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＦＱＳＳＨＶＰＷＴ 配列番号 １３５、または

ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＴＦＳＳＹＹ 配列番号 １４０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＮＴＮＧＧＳＴ 配列番号 １４１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＱＮＹＥＧＡＹ 配列番号 １４２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ 配列番号 １４３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＶＳ 配列番号 １４４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＦＱＳＳＨＶＰＷＴ 配列番号 １４５
好ましくは、前記ＣＤＲ配列は、配列番号１０～１５、１６～２１、１２０～１２５または１３０～１３５を含んでなる、核酸。

【請求項2】

前記抗体が、ｉ）配列番号９８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号９８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１０～１２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号９９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号９９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１３～１５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１に記載の核酸。

【請求項3】

前記抗体が、ｉ）配列番号１００において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１００に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１６～１８において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または前記抗体が、ｉ）配列番号１０１において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１９～２１において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７８において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７９において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１に記載の核酸。

【請求項4】

前記抗体が、ｉ）配列番号１０２において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号２２～２４において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１０３において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号２５～２７において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８０において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８１において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１に記載の核酸。

【請求項5】

前記抗体が、ｉ）配列番号１０４において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号２８～３０において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１０５において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号３１～３３において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８２において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８３において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１に記載の核酸。

【請求項6】

前記抗体が、ｉ）配列番号１０６において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号３４～３６において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１０７において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号３７～３９において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８４において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８５において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１に記載の核酸。

【請求項7】

前記抗体が、ｉ）配列番号１０８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４０～４２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１０９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４３～４５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１に記載の核酸。

【請求項8】

前記抗体が、ｉ）配列番号１１０において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１１０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４６～４８において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１１１において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１１１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４９～５１において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８８において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８９において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１に記載の核酸。

【請求項9】

前記抗体が、ｉ）配列番号１２８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１２８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１２０～１２２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１２９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１２９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１２３～１２５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１２６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１２７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１に記載の核酸。

【請求項10】

前記抗体が、ｉ）配列番号１３８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１３８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１３０～１３２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１３９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１３９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１３３～１３５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１３６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１３７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１に記載の核酸。

【請求項11】

前記抗体が、ｉ）配列番号１４８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１４８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１４０～１４２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体が、ｉ）配列番号１４９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１４９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１４３～１４５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１４６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または、前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１４７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる、請求項１に記載の核酸。

【請求項12】

重鎖可変ドメイン、リンカー、および軽鎖可変ドメインの配向が、重鎖可変ドメイン－リンカー－軽鎖可変ドメインである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項13】

重鎖可変ドメイン、リンカー、および軽鎖可変ドメインの配向が、軽鎖可変ドメイン－リンカー－重鎖可変ドメインである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項14】

リンカーが約１０～約２５アミノ酸、好ましくは１５または２０アミノ酸である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項15】

リンカーが、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_３（配列番号１８０）、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_４（配列番号１８１）、およびＧＳＴＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１８２）から選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項16】

ターゲティング部分リンカーによって、場合により、連結されていてよいターゲティング部分をさらにコードする、請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項17】

ターゲティング部分がリソソームターゲティング配列およびオートファジーターゲティング配列から選択される、請求項１６に記載の核酸。

【請求項18】

リソソームターゲティング配列が、ＹＰＴＬ（配列番号１７３）、ＫＳＩＲＳＧＹＥＶＭ（配列番号１７４）およびＲＷＲＫＳＨＳＳＳＹＴＰＬＳＧＳＴＹＰＥＧＲＨ（配列番号１７５）から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の核酸。

【請求項19】

単鎖抗体がイントラボディである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項20】

シグナルペプチドおよび／または細胞透過性ペプチドをさらにコードする、請求項１～１８のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項21】

単鎖抗体がｓｃＦＶ、ミニボディまたはナノボディである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項22】

単鎖抗体がヒト化されている、請求項１～２１のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項23】

配列が、配列番号２０３、２０５、２０７、２０９、２１３、２１５、２１７、２１９、２２３、２２５、２２７、２２９、２３３、２３５、２３７、２３９、２４３、２４５、２４７、２４９、２５３、２５５、２５７、および／または２５９のいずれかの抗体およびリンカー部分、ならびに、場合により、リソソームターゲティング配列をコードする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項24】

配列が、配列番号７６～８９、配列番号１２６～１２７、配列番号１３６～１３７、１４６～１４７のいずれか１つ、またはそれらのコドン最適化配列を含んでなる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項25】

配列が、配列番号２０２、２０４、２０６、２０８、２１２、２１４、２１６、２１８、２２２、２２４、２２６、２２８、２３２、２３４、２３６、２３８、２４２、２４４、２４６、２４８、２５２、２５４、２５６、および／または２５８のいずれかの抗体およびリンカー部分、ならびに、場合により、リソソームターゲティング配列を含んでなる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項26】

請求項１～２５のいずれか一項に記載の核酸を含んでなる発現カセットまたはベクター。

【請求項27】

前記ベクターがレンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、場合により、ＡＡＶ血清型９である、請求項２６に記載のベクター。

【請求項28】

請求項１～２５のいずれか一項に記載の核酸、請求項２６または２７に記載の発現カセットまたはベクターによってコードされる単鎖抗体。

【請求項29】

請求項２８に記載の抗体および検出可能な標識を含んでなる免疫複合体。

【請求項30】

請求項１～２５のいずれか一項に記載の核酸、または請求項２６もしくは２７に記載のベクターによってコードされる単鎖抗体を組換え発現する細胞。

【請求項31】

請求項１～２５のいずれか一項に記載の核酸、請求項２６もしくは２７に記載の発現カセットもしくはベクター、請求項２８に記載の単鎖抗体、請求項２９に記載の免疫複合体、または請求項３０に記載の細胞を、場合により、希釈液および／または薬学上許容可能な担体とともに含んでなる組成物。

【請求項32】

２つ以上の異なる核酸を、場合により、希釈液および／または薬学上許容可能な担体とともに含んでなる、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

２つ以上の異なる発現カセットまたはベクターを、場合により、希釈液および／または薬学上許容可能な担体とともに含んでなる、請求項３１に記載の組成物。

【請求項34】

２つ以上の異なる単鎖抗体を、場合により、希釈液および／または薬学上許容可能な担体とともに含んでなる、請求項３１に記載の組成物。

【請求項35】

２つ以上の異なる免疫複合体を、場合により、希釈液および／または薬学上許容可能な担体とともに含んでなる、請求項３１に記載の組成物。

【請求項36】

２つ以上の異なる細胞を、場合により、希釈液および／または薬学上許容可能な担体とともに含んでなる、請求項３１に記載の組成物。

【請求項37】

脂質粒子、場合により、リポソーム、ナノ粒子またはナノソームを含んでなる、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項38】

くも膜下腔内、脳実質内または脳室内投与のために好適に処方された、請求項３１～３７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項39】

対象を治療する方法であって、有効量の請求項１～２５のいずれか一項に記載の核酸、請求項２６もしくは２７に記載の発現カセットもしくはベクター、請求項２８に記載の抗体、または請求項３１～３８のいずれか一項に記載の組成物、場合により、１つ以上の核酸、１つ以上の発現カセットもしくはベクター、または１つ以上の抗体および／もしくは組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、方法。

【請求項40】

請求項１～２５のいずれか一項に記載の２つ以上の核酸の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

請求項２６または２７に記載の２つ以上の発現カセットまたはベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、請求項３９に記載の方法。

【請求項42】

請求項２８に記載の２つ以上の抗体の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、請求項３９に記載の方法。

【請求項43】

請求項３１～３８のいずれか一項に記載の２つ以上の組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、請求項３９に記載の方法。

【請求項44】

前記対象が、ＴＤＰ－４３タンパク質症を有すると疑われる、それを発症するリスクにある、またはそれと診断されている、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記ＴＤＰ－４３タンパク質症が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ＴＤＰ）、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、および大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から選択される、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記核酸、発現カセットもしくはベクター、抗体、または組成物が、別のＴＤＰ－４３タンパク質症の治療と組み合わせて投与される、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記核酸、発現カセット、ベクター、単鎖抗体、または組成物が、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、脳室内投与、くも膜下腔内投与、眼窩内投与、眼投与、脊髄内投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアロゾル投与または経口投与により投与される、請求項３９～４６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２０年４月２９日に出願された米国仮出願第６３／０１７，３６３号の優先権を主張する特許協力条約出願である。先行出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされ、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。

【0002】

配列表の組込み
２０２１年４月２９日に作成されたコンピューター可読形式の配列表「Ｐ６１４５６ＰＣ００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＬｉｓｔｉｎｇＳＴ２５．ｔｘｔ」（１５４，６５４バイト）は、引用することにより本明細書の一部とされる。

【0003】

分野
本開示は、ＴＤＰ－４３単鎖抗体、より具体的には、細胞内ミスフォールドＴＤＰ－４３を標的とするためのイントラボディに関する。

【背景技術】

【0004】

背景
４３ｋＤａのトランス活性化応答（ＴＡＲ）エレメントＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ－４３）は、４１４アミノ酸タンパク質であり、Ｎ末端ユビキチン様ドメイン（ＮＴＤ、残基１～８０）、残基１０６～１７７（ＲＲＭ１）および残基１９２～２５９（ＲＲＭ２）から構成される２つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、ならびにＣ末端ドメイン（ＣＴＤ、残基２７４～４１４）から構成される。ＮＴＤは、核局在化（残基８２～９８におけるＮＬＳモチーフ、ＮＬＳ１ Ｋ８２ＲＫ８４およびＫ９５ＶＫＲ９８）を指示するドメインに隣接する。ＲＲＭ２は、残基２３９から２５０にかけて核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む。

【0005】

ＴＤＰ－４３は主に、ＲＮＡ代謝において中心的役割を果たす核タンパク質である。罹患ニューロン内の病原性封入体は、翻訳後修飾されたＴＤＰ－４３を含み得るため、ＴＤＰ－４３は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）疾患スペクトラムにおける研究の焦点となっている。ＴＤＰ－４３のＣＴＤは疾患と特に関連しているが、それは、ほぼ総ての家族性ＡＬＳ／ＦＴＤ関連変異がＴＤＰ－４３において認められる場所であるからである。

【0006】

ＴＤＰ－４３は、孤発型および家族型両方のＡＬＳおよびＦＴＤを有する患者の神経封入体において高リン酸化、ユビキチン化、および断片化されることが認められた［４］。

【0007】

機能的ＴＤＰ－４３は、細胞ストレス時に形成される細胞質凝集体と区別される核オリゴマーとして存在し得る。機能的ＴＤＰ－４３のオリゴマー化は、そのＲＮＡスプライシング機能のために必要である。核におけるＮＴＤにより駆動されたＴＤＰ－４３のオリゴマー化は、細胞質誤局在化および病的凝集の形成を阻害し得る［９］。

【0008】

生理学的ＴＤＰ－４３オリゴマー化は、核磁気共鳴分光法および電子顕微鏡法の組合せでの２．１Ａ結晶構造により明らかにされた、動的なソレノイド様構造を採用し得る、そのＮ末端ドメインにより媒介される［９］。

【0009】

ＴＤＰ－４３の凝集体（封入体）は現在、ＡＬＳのほぼ総て（およそ９７％）の症例およびＦＴＤの症例のおよそ半数（およそ４０％）において認められている。ＴＤＰ－４３は、ＡＬＳ患者の運動ニューロンおよびグリア細胞において認められる細胞質封入体の主成分の１つである。

【0010】

ＴＤＰ－４３封入体の前駆体は、機能的ＴＤＰ－４３よりはるかに低い濃度を有し得る。ミスフォールドＴＤＰ－４３が低濃度であることによって、この標的がとらえにくいものとなっている。

【0011】

細胞質ヒトＴＤＰ－４３を発現するトランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウスにおける脳由来病的ＴＤＰ－４３ ＦＴＬＤ－ＴＤＰ種子の脳内注射は、時間依存的に脳に伝播したデノボＴＤＰ－４３病変の誘導をもたらしている［１０］。

【0012】

ＴＤＰ－４３に結合する抗体がこれまで記載されてきた。

【0013】

「神経変性疾患の予後および／または診断のための方法、候補化合物および神経変性疾患を治療するための化合物の同定方法」と題するＷＯ２０１２１７４６６６は、抗ＴＤＰ－４３抗体を使用して、ＴＤＰ－４３とＮＦ－kＢ ｐ６５との間の相互作用の評価を通じて、ＡＬＳおよびＦＴＤなどの神経変性疾患を診断する方法を開示している。

【0014】

「神経変性疾患の治療に有用なＴＤＰ－４３結合性ポリペプチド」と題するＷＯ２０１６０８６３２０は、ＡＬＳおよびＦＴＤの治療のための、ＴＤＰ－４３のＲＲＭ１ドメインに結合して、ＮＦ－ｋＢとのその相互作用を妨害する抗体を開示している。

【0015】

細胞内で発現でき、天然に折り畳まれたＴＤＰ－４３よりもミスフォールドＴＤＰ－４３に優先的に結合する抗体が望まれる。

【発明の概要】

【0016】

概要
本発明者らは、細胞質のミスフォールドＴＤＰ－４３を標的とすることができ、例えば、細胞質のミスフォールドＴＤＰ－４３を含んでなる細胞で発現されると、その分解を増加させることができる単鎖イントラボディを同定した。

【0017】

単鎖イントラボディは、ミスフォールドＴＤＰ－４３においてはアクセス可能であるが、天然に折り畳まれた非疾患関連ＴＤＰ－４３においては利用不可能である立体配座Ｎ末端エピトープに結合する抗体に由来する。Ｎ末端ＴＤＰ－４３配列ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）を含んでなる免疫原に対して惹起された抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３凝集体に優先的に結合した。残基Ｗ６８は、ミスフォールドＴＤＰ－４３凝集体に対する抗体特異性を付与するのに重要な残基であることがわかった。

【0018】

ある側面は、ミスフォールドＴＤＰ－４３に結合し、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなる重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる単鎖抗体を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域はリンカーによって連結されている。重鎖および軽鎖の可変領域とリンカーの配向は、重鎖の可変領域－リンカー－軽鎖の可変領域または軽鎖の可変領域－リンカー－重鎖の可変領域であり得る。

【0019】

ある実施形態において、単鎖抗体は、ｓｃＦｖ、ナノボディ、ミニボディである。

【0020】

さらなる側面は、本明細書に記載の抗体と、陽電子放出放射性核種などの検出可能な標識、ＦＬＡＧタグまたはｍｙｃタグなどの融合タグ、またはリソソームまたはオートファジーターゲティング配列などのターゲティング部分とを含んでなる免疫複合体を含んでなる。

【0021】

さらなる側面は、本明細書に記載の単鎖抗体をコードする単離核酸、ならびに、例えば、本明細書に記載の単鎖抗体を送達および／または発現するための、前記核酸を含んでなるベクターを含んでなる。

【0022】

さらなる側面は、本明細書に記載の単鎖抗体を組換え発現する細胞を含んでなる。

【0023】

さらなる側面は、本明細書に記載の単鎖抗体、免疫複合体、単離核酸、ベクター、または細胞を含んでなる組成物を含む。

【0024】

ＴＤＰ－４３タンパク質症を有する対象を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の単鎖抗体をコードする核酸または免疫複合体を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる方法が、さらに提供される。

【0025】

本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の趣旨および範囲内での種々の変更および改変は、この詳細な説明から当業者に明らかになるであろうから、詳細な説明および具体例は、本開示の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示として示されるものであると理解されるべきである。

【0026】

ここで本開示の実施形態を図面と関連して説明する：

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】図１は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＬＹＳ－２Ｆ７を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳＴＤＰ－４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＬＹＳ－２Ｆ７は、抗ＦＬＡＧを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図2】図２は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＬＹＳ－１Ｈ３－１Ｋ３を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＬＹＳ－１Ｈ３－１Ｋ３は、抗ＦＬＡＧを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図3】図３は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＬＹＳ－２８Ｈ３－２８Ｋ１を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳＴＤＰ－４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＬＹＳ－２８Ｈ３－２８Ｋ１は、抗ＦＬＡＧを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図4】図４は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＬＹＳ－１４Ｈ１－１４Ｋ２を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳＴＤＰ－４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＬＹＳ－１４Ｈ１－１４Ｋ２は、抗ＦＬＡＧを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図5】図５Ａは、ｄＮＬＳＴＤＰ－４３およびＹＰＴＬ－２Ｆ７を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＹＰＴＬ－２Ｆ７は、抗ＦＬＡＧを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図6】図６は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＹＰＴＬ－１Ｈ３－１Ｋ３を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＹＰＴＬ－１Ｈ３－１Ｋ３は、抗ＦＬＡＧを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図7】図７は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＹＰＴＬ－２８Ｈ３－２８Ｋ１を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＹＰＴＬ－２８Ｈ３－２８Ｋ１は、抗ＦＬＡＧを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図8】図８は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＹＰＴＬ－１４Ｈ１－１４Ｋ２を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳＴＤＰ－４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＹＰＴＬ－１４Ｈ１－１４Ｋ２は、抗ＦＬＡＧを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図9】図９は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＭＹＣＬ１５Ｈ－２Ｆ７を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳＴＤＰ－４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＭＹＣＬ１５Ｈ－２Ｆ７は、抗ＭＹＣを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図10】図１０は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＭＹＣＨ１５Ｌ－２Ｆ７を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳＴＤＰ－４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２Ｆ７は、抗ＭＹＣを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図11】図１１は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＭＹＣＨ２０Ｌ－２Ｆ７を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳＴＤＰ－４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＭＹＣＨ２０Ｌ－２Ｆ７は、抗ＭＹＣを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図12】図１２は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＭＹＣＬ１５Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３は、抗ＭＹＣを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図13】図１３は、ｄＮＬＳＴＤＰ－４３およびＭＹＣＬ２０Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＭＹＣＬ２０Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３は、抗ＭＹＣを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図14】図１４は、ｄＮＬＳＴＤＰ－４３およびＭＹＣＨ１５Ｌ－２８Ｈ３－２８Ｋ１を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳＴＤＰ－４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２８Ｈ３－２８Ｋ１は、抗ＭＹＣを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図15】図１５は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＭＹＣＬ１５Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳＴＤＰ－４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２は、抗ＭＹＣを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図16】図１６は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＭＹＣＨ１５Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳＴＤＰ－４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＭＹＣＨ１５Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２は、抗ＭＹＣを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図17】図１７は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＭＹＣＬ２０Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳＴＤＰ－４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＭＹＣＬ２０Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２は、抗ＭＹＣを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図18】図１８は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＭＹＣＨ２０Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２を過剰発現する細胞の免疫細胞化学を示す。ｄＮＬＳＴＤＰ－４３は、抗ＨＡを使用して検出し、ＭＹＣＨ２０Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２は、抗ＭＹＣを使用して検出した。マージは、ＤＡＰＩで染色された核に関して共局在のレベルを示している。

【図19】図１９は、ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３およびＬＹＳ－２Ｆ７、ＬＹＳ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、またはＬＹＳ－１４Ｈ１－１４Ｋ２を過剰発現する細胞のウエスタンブロットを示す。ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３の発現レベルは、抗ＨＡを使用して検出した。ＬＹＳ－２Ｆ７、ＬＹＳ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＬＹＳ－１４Ｈ１－１４Ｋ２の発現レベルは、抗ＦＬＡＧを使用して検出した。ローディング対照としてアクチンを使用した。ＥＶ（空ベクター）は、参照陰性対照プラスミドである。

【図20】図２０は、ｄＮＬＳＴＤＰ－４３およびＹＰＴＬ－１４Ｈ１－１４Ｋ２を過剰発現する細胞のウエスタンブロットを示す。ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３の発現レベルは、抗ＨＡを使用して検出した。ＹＰＴＬ－１４Ｈ１－１４Ｋ２の発現レベルは、抗ＦＬＡＧを使用して検出した。ローディング対照としてアクチンを使用した。ＥＶは、参照陰性対照である。

【図21】図２１は、ｄＮＬＳＴＤＰ－４３およびＭＹＣＬ１５Ｈ－２Ｆ７、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２Ｆ７、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、またはＭＹＣＨ２０Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２を過剰発現する細胞のウエスタンブロットを示す。ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３の発現レベルは、抗ＨＡを使用して検出した。ＭＹＣＬ１５Ｈ－２Ｆ７、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２Ｆ７、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、およびＭＹＣＨ２０Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２の発現レベルは、抗ＭＹＣを使用して検出した。ローディング対照としてアクチンを使用した。ＥＶは、参照陰性対照である。

【発明の具体的説明】

【0028】

本開示の詳細な説明
Ｉ．定義

【0029】

本明細書で使用する場合、「ＴＤＰ－４３」（トランス活性化応答エレメント（ＴＡＲ）ＤＮＡ結合タンパク質４３）、あるいは「ＴＤＰ４３」、または特に限定されない限り「ＴＤＰ」という用語は、本明細書で使用する場合、野生型ＴＤＰ－４３、天然ＴＤＰ－４３、ならびに総ての種由来の変異型およびその類似体を含むミスフォールド型を含むあらゆる形態のＴＤＰ－４３、特に、ヒトＴＤＰ－４３（すなわち、ｈＴＤＰ－４３）を意味する。ヒトＴＤＰ－４３は、一般に４１４アミノ酸残基のタンパク質であり、アミノ酸配列（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ１３１４８）およびヌクレオチド配列（例えば、アクセッション番号ＨＧＮＣ：１１５７１）は、以前に特徴付けられている。

【0030】

「野生型」は、本明細書で使用する場合、非変異タンパク質または天然に存在するタンパク質の一次アミノ酸配列を指す。

【0031】

「天然」は、本明細書で使用する場合、特定のタンパク質またはその一部の正常な三次元構造を指す。天然ＴＤＰ－４３は、場合により、「天然に折り畳まれた」ＴＤＰ－４３、「正常に折り畳まれた」ＴＤＰ－４３および／または「健常な」ＴＤＰ－４３という。したがって、用語「天然ＴＤＰ－４３」、または「天然に折り畳まれたＴＤＰ－４３」は、本明細書において、新生翻訳後に天然に折り畳まれたＴＤＰ－４３、および／または、限定されるものではないが、Ｘ線結晶解析においてもしくは核磁気共鳴スペクトルから再構築された天然構造を示す非共有結合された個々のＴＤＰ－４３ペプチドを含んでなる分子構造を有する、非病態（例えば、正常細胞）において折り畳まれた、二量体ＴＤＰ－４３および三量体ＴＤＰ－４３を含む多量体を指す。天然ＴＤＰ－４３は、そのＮＴＤを介して多量体を形成し、天然に折り畳まれた場合のＴＤＰ－４３は、一般に核である。ＴＤＰ－４３のミスフォールド凝集体は、細胞質であり得、一般に細胞質である。

【0032】

「ミスフォールド」は、本明細書で使用する場合、ポリペプチドまたはその一部の二次構造および三次構造を指し、ポリペプチドが、その適切に機能する状態でのそのポリペプチドに関して正常ではないコンフォメーションをとっていることを示す。ミスフォールディングは、タンパク質における変異、例えば、アミノ酸の欠失、置換、または付加により生じ得るが、野生型配列タンパク質も、疾患においてミスフォールドされ得、例えば、微小環境条件および／またはアミノ酸修飾、例えば、ニトロ化、酸化、カルボニル化もしくは他の修飾の結果として、疾患特異的エピトープを露出させ得る。他の翻訳後修飾としては、異常なユビキチン化、リン酸化、アセチル化、ＳＵＭＯ化、およびＣ末端フラグメントへの切断が挙げられる。ミスフォールドＴＤＰ４３は、凝集および／または細胞質であり得る。ＴＤＰ－４３の文脈において、天然ＴＤＰ－４３は、そのＮＴＤを介して多量体を形成する。ミスフォールド多量体（例えば、疾患関連オリゴマー）は一般に、タンパク質の他の領域、例えば、そのＬＣＤおよび／またはＲＲＭ１ドメインを介してオリゴマー化する。したがって、「ミスフォールドＴＤＰ－４３ポリペプチド」、または本明細書においてポリペプチドに言及する場合の「ミスフォールドＴＤＰ－４３」は、細胞質であるかつ／または凝集している、そのＬＣＤおよび／またはＲＲＭ１ドメインを介してオリゴマー化しているＴＤＰ－４３ポリペプチド、非天然二量体および三量体、ならびに大型の凝集体（例えば、５個以上のサブユニット）を含む。ミスフォールドＴＤＰ－４３は、タンパク質機能の喪失、毒性、アミロイド様特徴（例えば、コンゴーレッド染色）の獲得および病原性凝集体の伝播をもたらす凝集体を形成する傾向がある。

【0033】

用語「変異体ＴＤＰ－４３」は、ＴＤＰ－４３の形態、特に、例えば、［６］に記載のバイオインフォマティクスツールに記載の変異を含む、例えば、ＦＴＤまたは家族性ＡＬＳの特徴である置換などのアミノ酸置換をもたらす遺伝子変異の結果として生じるＴＤＰ－４３の内因型を指す。

【0034】

用語「ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）」は、配列番号１において示されるアミノ酸配列：アスパラギン酸、アラニン、グリシン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、およびロイシンを意味する。同様に、ＧＷＧは、一文字アミノ酸コードにより同定されるアミノ酸配列を指す。文脈に応じて、アミノ酸配列への言及は、ＴＤＰ－４３または単離ペプチドにおける配列を指し得る。配列ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）は、ＴＤＰ－４３のアミノ酸一次配列における残基６５～７１に相当する。

【0035】

用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および修飾Ｌ－アミノ酸およびＤ－アミノ酸の総てを含む。アミノ酸の原子は、例えば、異なる同位体を含み得る。例えば、アミノ酸は、水素に対して置換された重水素、窒素１４に対して置換された窒素１５、および炭素１２に対して置換された炭素１３および他の同様の変化を含んでなり得る。

【0036】

「保存的アミノ酸置換」は、本明細書で使用する場合、１つのアミノ酸残基が、タンパク質の所望の特性を消失させることなく、別のアミノ酸残基と置き換わるものである。好適な保存的アミノ酸置換は、類似の疎水性、極性、およびＲ基のサイズを有するアミノ酸を互いに置換することによって行うことができる。保存的アミノ酸置換の例としては、以下のものが挙げられる：

【0037】

【表1】

【0038】

用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖、ヒト化および他のキメラ抗体、または完全ヒト抗体、ならびにそれらの結合フラグメントを含むものとする。ベクター化抗体またはイントラボディも含まれる。抗体は、組換え源由来のものでもよく、かつ／または、トランスジェニック動物において産生されたものでもよい。生化学的技術を使用することによって産生され得る、または、ライブラリーから単離され得るヒト抗体も含まれる。ヒト化抗体またはキメラ抗体は、１以上のアイソタイプまたはクラス由来の配列を含んでもよい。

【0039】

句「単離抗体」は、抗体の産生源、例えば、動物、ハイブリドーマまたは他の細胞株（例えば、抗体を産生する組換え細胞）から除去されている、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）またはイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で産生された抗体を指す。単離抗体は、場合により「精製」され、それは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の純度を意味する。

【0040】

用語「イントラボディ（単数または複数）」は、本明細書で使用する場合、細胞内で発現されるかまたは発現させることができ、細胞内タンパク質に結合する抗体を指し、例えば、イントラボディは、細胞内局在化および細胞内機能のために改変または適合された抗体である。イントラボディは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインおよびリンカーを、場合により、いずれかの可変ドメイン配向で、例えば、重鎖可変ドメイン－リンカー－軽鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメイン－リンカー－重鎖可変ドメインで含んでなる。文脈に応じて、用語「イントラボディ」は、核酸分子またはポリペプチド分子を指すことがある。

【0041】

用語「リンカー」は、本明細書で使用する場合、２つの配列を接続または連結する、例えば、２つのポリペプチドドメインを連結する合成配列（例えば、ポリペプチド中のアミノ酸配列または中の核酸配列）を指す。リンカーは、それが検出可能な標識を連結していることを示す「タグリンカー」またはそれが、軽鎖可変領域に連結された重鎖可変領域の場合のようにリンカーも含んでなり得るポリペプチドにターゲティング部分を連結していることを示すターゲティング部分リンカーであり得る。

【0042】

用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、本明細書で使用する場合、エピトープ結合を定義すると一般に理解される抗体の特定の超可変領域を指す。ＣＤＲ配列を同定する計算法としては、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴが挙げられる。当業者ならば、本明細書に含まれる配列を考慮して、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａなどに基づいてＣＤＲ配列を同定することもできるであろう。

【0043】

用語「検出可能な標識」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載のペプチド、抗体または他の化合物に付加または導入することができるペプチド配列、蛍光タンパク質などの部分であって、直接的にまたは間接的にのいずれかで検出可能なシグナルを発生することができる部分を指す。

【0044】

用語「ミスフォールドＴＤＰ－４３において選択的に提示されるまたはアクセス可能であるエピトープ」は、本明細書で使用する場合、単量体型、二量体型または凝集型であるか否かを問わず、例えばＡＬＳまたはＦＴＤ（例えば、疾患関連ミスフォールドＴＤＰ－４３）において存在するミスフォールドＴＤＰ－４３上で選択的に提示されるまたは抗体がアクセス可能であるが、ＴＤＰ－４３の天然の正しく折り畳まれたホモ二量体型の分子表面上ではそうではないエピトープを指す。本明細書において示されるように、Ｗ６８は、ミスフォールドＴＤＰ－４３において選択的に提示されるまたはアクセス可能である。

【0045】

用語「大きな親和性」は、本明細書で使用する場合、抗体Ｘが、標的Ｚよりも強力に（Ｋ_ｏｎ）かつ／または小さな解離定数（Ｋ_ｏｆｆ）で標的Ｙに結合する、抗体結合の程度を指し、この文脈において、抗体Ｘは、Ｚよりも標的Ｙに対して大きな親和性を有する。同様に、用語「小さな親和性」は、本明細書において、抗体Ｘが、標的Ｚよりも弱い強さおよび／または大きな解離定数で標的Ｙに結合する、抗体結合の程度を指し、この文脈において、抗体Ｘは、Ｚよりも標的Ｙに対して小さな親和性を有する。抗体とその標的抗原との間の結合の親和性は、１／Ｋ_Ｄに等しいＫ_Ａで表すことができ、ここで、Ｋ_Ｄはｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆに等しい。ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆ値は、表面プラズモン共鳴を使用して測定することができる（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを使用して測定可能）。

【0046】

用語「核酸配列」は、本明細書で使用する場合、天然に存在する塩基、糖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオチドモノマーの配列を指す。この用語は、天然に存在しないモノマーまたはその部分を含んでなる修飾または置換された配列も含む。本出願の核酸配列は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む天然に存在する塩基を含んでもよい。配列は、修飾された塩基を含有してもよい。このような修飾された塩基の例としては、アザおよびデアザのアデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。核酸は、二本鎖または一本鎖のいずれかであり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、用語「核酸」は、相補的核酸配列ならびにコドン最適化等価物または同義コドン等価物を含む。用語「単離核酸配列」は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ技術により産生された場合には細胞材料もしくは培養培地を、または化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸を指す。単離核酸はまた、核酸が由来する核酸に天然的に隣接する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）も実質的に含まない。

【0047】

「動作可能に連結された」は、核酸が、核酸の発現を可能にする様式で調節配列に連結されていることを意味するものとする。好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫の遺伝子を含む、種々の源に由来し得る。適当な調節配列の選択は、選択される宿主細胞に依存し、当業者により容易に達成され得る。このような調節配列の例としては、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）が挙げられる。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベクターに応じて、他の配列、例えば、複製起点、さらなるＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性を付与する配列を、発現ベクターに組み込んでもよい。

【0048】

用語「ベクター」は、本明細書で使用する場合、核酸分子が、例えば、原核細胞および／または真核細胞に導入される、かつ／または、ゲノムに組み込まれることを可能にする、核酸分子のための任意の中間ビヒクルを含んでなり、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベースのベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどを含む。用語「プラスミド」は、本明細書で使用する場合、一般に、染色体ＤＮＡを独立に複製することができる、染色体外遺伝物質の構築物、通常、環状ＤＮＡ二本鎖を指す。

【0049】

「少なくとも中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、溶液中での２つの相補的核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子の全部または一部に対して生じ得る。ハイブリダイズ部分は、一般に、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）ヌクレオチド長である。当業者は、核酸二本鎖またはハイブリッドの安定性は、ナトリウム含有緩衝液中において、ナトリウムイオン濃度および温度の関数（Ｔｍ＝８１．５℃－１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）－６００／ｌ）、または類似の式）により決定されることを認識するであろう。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件におけるパラメーターは、ナトリウムイオン濃度および温度である。公知の核酸分子と類似であるが同一ではない分子を同定するために、１％のミスマッチはＴｍの約１℃の減少をもたらすと想定され得、例えば、核酸分子が９５％超の同一性を有するようにする場合、最終洗浄温度は約５℃減少する。これらの考察に基づき、当業者は、適当なハイブリダイゼーション条件を容易に選択できるであろう。好ましい複数の実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される。例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するために以下の条件が使用され得る：上記の式に基づいたＴｍ－５℃における５倍塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５倍デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションに次いで、６０℃での０．２倍ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄。中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃での３倍ＳＳＣ中の洗浄工程を含む。しかしながら、等価なストリンジェンシーは、代替の緩衝液、塩および温度を使用して達成され得ると理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる指針は、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 2002、およびSambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001において見出され得る。

【0050】

本明細書で使用する場合、抗体に関して「結合する」または「特異的に結合する」とは、抗体が、その標的抗原を認識し、かつ構造的に異なる抗原および／または修飾配列もしくは変異配列を有する抗原に対するよりも大きな親和性でその標的に結合することを意味する。例えば、多価抗体は、少なくとも１ｅ－６、少なくとも１ｅ－７、少なくとも１ｅ－８、少なくとも１ｅ－９または少なくとも１ｅ－１０のＫ_Ｄでその標的に結合する。少なくとも１ｅ－８超の親和性が好ましい。１つの可変ドメインを含んでなるＦａｂフラグメントなどの抗原結合フラグメントは、非フラグメント化抗体との多価相互作用よりも１０倍または１００倍小さな親和性でその標的を見出し得る。

【0051】

用語「選択的」または「優先的」は、ある形態のＴＤＰ－４３（例えば、天然タンパク質またはミスフォールドタンパク質）に選択的／優先的に結合する抗体に関して本明細書で使用する場合、結合タンパク質が、少なくとも３倍、または少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、または少なくとも５００倍以上の大きな親和性でその形態に結合することを意味する。したがって、特定のコンフォメーション（例えば、ミスフォールドタンパク質）に対してより選択的な抗体は、別の形態と比較して、少なくとも３倍、または少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、または少なくとも５００倍以上大きな親和性で、特定の形態のＴＤＰ－４３に優先的に結合する。

【0052】

用語「動物」または「対象」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物、場合により、ヒトを含むまたは除く、動物界の全メンバーを含む。

【0053】

用語「治療すること」または「治療」は、本明細書で使用する場合、および当技術分野で十分理解されるように、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益なまたは所望の臨床結果は、限定されるものではないが、検出可能であるか検出不能であるかを問わず、１以上の症状または状態の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の安定化した（すなわち、悪化していない）状態、疾患の伝播の予防、疾患進行の遅延または緩徐化、病態の改善または緩和、疾患の再発の減少、および寛解（部分または完全を問わず）を含み得る。「治療すること」および「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存と比較して、生存を延長することも意味し得る。「治療すること」および「治療」は、本明細書で使用する場合、例えば、家族型のＡＬＳなどの家族型と関連する変異を有すると同定された対象における予防的治療も含む。ＡＬＳなどのＴＤＰ－４３タンパク質症を有する対象は、疾患進行を遅延または緩徐化するために治療され得る。対象は、進行を予防するために、本明細書に記載の化合物、抗体（ベクター化抗体もしくはイントラボディを含む）、免疫原、免疫複合体、または組成物で治療され得る。

【0054】

本開示の範囲の理解において、用語「からなる」およびその派生語は、本明細書で使用する場合、言及された特徴、要素、成分、群、整数および／または工程の存在を指定し、かつ他の言及されていない特徴、要素、成分、群、整数および／または工程の存在を除外する限定的な用語であるものとする。

【0055】

本明細書における終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される総ての数および分数を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４および５を含む）。総ての数およびそれらの分数は、用語「約」により修飾されると想定されることも理解される。さらに、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容によってそうではないことが明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。用語「約」は、言及されている数のプラスまたはマイナス０．１～５０％、５～５０％、または１０～４０％、好ましくは、１０～２０％、より好ましくは、１０％または１５％を意味する。

【0056】

さらに、特定の項に記載の定義および実施形態は、当業者により理解されるように、それらが好適である本明細書に記載の他の実施形態に適用可能であるものとする。例えば、以下の節において、本発明の異なる側面がより詳細に定義されている。そのように定義された各側面は、そうではないことが明確に示されていない限り、任意の他の１つの側面または複数の側面と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であると示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示された任意の他の１つの特徴または複数の特徴と組み合わせてもよい。

【0057】

ＩＩ．抗体、免疫複合体、細胞および核酸
実施例に記載のように、単鎖抗体を調製し、ベクター化した。

【0058】

単鎖抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３においてアクセス可能であるが天然に折り畳まれた非疾患関連ＴＤＰ－４３においては利用不可能であるＮ末端エピトープに向けられる。Ｎ末端ＴＤＰ－４３配列ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）を含んでなる免疫原に対して惹起された抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３凝集体に優先的に結合した。残基Ｗ６８は、ミスフォールドＴＤＰ－４３凝集体に対する抗体特異性を付与するのに重要な残基であることがわかった。

【0059】

一つの実施形態において、単鎖抗体はイントラボディである。

【0060】

単鎖抗体は、イントラボディとしての場合、場合により、リソソームターゲティングまたはオートファジーターゲティングシグナルを含む。ミスフォールドＴＤＰ－４３に特異的ないくつかの抗体の重鎖および軽鎖可変領域を、様々なリンカーを使用して、様々な配向で連結した。ベクター化された単鎖抗体またはイントラボディは、その核局在化シグナルの欠失を含んでなる突然変異体ｄＮＬＳ－ＴＤＰ－４３とともに細胞内で発現された。ｄＮＬＳ－ＴＤＰ－４３は細胞質に局在し、そこで凝集体を形成する。本明細書で実証されるように、ベクター化抗体は、細胞内ミスフォールドＴＤＰ－４３凝集体と共局在し、その分解を誘導することができた。ベクター化抗体は、細胞に対して毒性がなく、正常なＴＤＰ－４３機能への干渉がないことが確認された。

【0061】

ある側面は、ミスフォールドＴＤＰ－４３のＷ６８に結合し、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含んでなる重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる単鎖抗体を含み、ここで、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、リンカーによって連結されている。重鎖および軽鎖の可変領域とリンカーの配向は、重鎖の可変領域－リンカー－軽鎖の可変領域または軽鎖の可変領域－リンカー－重鎖の可変領域であり得る。いくつかの実施形態では、単鎖抗体は、リソソームまたはオートファジーターゲティング配列をさらに含む。

【0062】

ある実施形態において、単鎖抗体は、以下を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＴＦＳＳＹＹ 配列番号 １３０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＮＳＮＧＧＳＴ 配列番号 １３１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＱＮＹＥＧＡＹ 配列番号 １３２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ 配列番号 １３３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＶＳ 配列番号 １３４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＦＱＳＳＨＶＰＷＴ 配列番号 １３５、
ＣＤＲ配列を有する。

【0063】

配列番号１３０～１３５のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関連でＷ６８に特異的に結合する。単鎖抗体は、抗体２Ｆ７のＣＤＲ配列を含んでなる。

【0064】

ある実施形態において、前記単鎖抗体は、ｉ）配列番号１３８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１３８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１３０～１３２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記単鎖抗体は、ｉ）配列番号１３９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１３９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１３３～１３５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１３６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１３７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0065】

ある実施形態において、単鎖抗体は、以下を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＲＹＹ 配列番号 １０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＩＰＧＧＴＴ 配列番号 １１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ 配列番号 １２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＮＮＮＨ 配列番号 １３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＥＡＳ 配列番号 １４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＳＧＹＫＲＶＴＴＤＧＩＡ 配列番号 １５、
ＣＤＲ配列を有する。

【0066】

配列番号１０～１５のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関連でＷ６８に特異的に結合する。単鎖抗体は、抗体１Ｈ３－１Ｋ３のＣＤＲ配列を含んでなる。

【0067】

ある実施形態において、前記単鎖抗体は、ｉ）配列番号９８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号９８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１０～１２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり、かつ／または前記単鎖抗体は、配列番号９９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号９９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１３～１５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、ここで、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0068】

ある実施形態において、単鎖抗体は、以下を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＮ 配列番号 １２０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＧＴＧＧＩＴ 配列番号 １２１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＳＳＧＳＤＷＷＦＨＩ 配列番号 １２２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＮＮＮＮ 配列番号 １２３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＲＡＳ 配列番号 １２４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＱＧＹＦＳＧＦＩＴＴ 配列番号 １２５、
ＣＤＲ配列を有する。

【0069】

配列番号１２０～１２５のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関連でＷ６８に特異的に結合する。単鎖抗体は、抗体２８Ｈ３－２８Ｋ１のＣＤＲ配列を含んでなる。

【0070】

ある実施形態において、前記単鎖抗体は、ｉ）配列番号１２８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１２８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１２０～１２２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり、かつ／または前記単鎖抗体は、配列番号１２９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１２９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１２３～１２５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、ここで、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１２６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１２７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0071】

ある実施形態において、単鎖抗体は、以下を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＳＮＹＶ 配列番号 １６；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＷＦＡＧＩＶＤＴＴ 配列番号 １７；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＮＰＶＧＳＶＮＬ 配列番号 １８；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＳＮＮＲ 配列番号 １９；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＹＡＳ 配列番号 ２０；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＷＲＧＡＲＴＤＧＶＤ 配列番号 ２１、
ＣＤＲ配列を有する。

【0072】

配列番号１６～２１のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関連でＷ６８に特異的に結合する。一つの実施形態において、前記単鎖抗体は、抗体１４Ｈ１－１４Ｋ２のＣＤＲ配列を含んでなる。

【0073】

ある実施形態において、前記単鎖抗体は、ｉ）配列番号１００において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１００に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１６～１８において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり、かつ／または前記単鎖抗体は、配列番号１０１において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１９～２１において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、ここで、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７８において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７９において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0074】

ある実施形態において、単鎖抗体は、以下を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＳＳＹＶ 配列番号 ２２；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＳＤＴＧＩＮＴ 配列番号 ２３；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＲＹＴＧＤＴＹＬＧＮＦＮＬ 配列番号 ２４；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＮＹ 配列番号 ２５；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＡＳ 配列番号 ２６；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＧＷＲＳＬＮＡ 配列番号 ２７、
ＣＤＲ配列を有する。

【0075】

配列番号１６～２１のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関連でＷ６８に特異的に結合する。一つの実施形態において、前記単鎖抗体は、抗体１７のＣＤＲ配列を含んでなる。

【0076】

ある実施形態において、前記単鎖抗体は、ｉ）配列番号１０２において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号２２～２４において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり、かつ／または前記抗体は、配列番号１０３において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号２５～２７において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、ここで、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８０において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８１において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0077】

ある実施形態において、単鎖抗体は、以下を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＥＦＳＦＳＳＲＹＷ 配列番号 ２８；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＴＧＳＩＤＡＴ 配列番号 ２９；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＧＳＤＡＷＧＬＹＦＮＬ 配列番号 ３０；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＨＫＮＮＹ 配列番号 ３１；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＦＡＳ 配列番号 ３２；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＶＹＳＧＲＩＦＡ 配列番号 ３３、
ＣＤＲ配列を有する。

【0078】

配列番号１６～２１のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関連でＷ６８に特異的に結合する。一つの実施形態において、前記単鎖抗体は、抗体２０のＣＤＲ配列を含んでなる。

【0079】

ある実施形態において、前記単鎖抗体は、ｉ）配列番号１０４において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号２８～３０において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり、かつ／または前記抗体は、配列番号１０５において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号３１～３３において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、ここで、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８２において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８３において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0080】

ある実施形態において、単鎖抗体は、以下を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＴ 配列番号 ３４；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＧＧＩＧＳＴ 配列番号 ３５；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＧＲＧＤＩ 配列番号 ３６；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＲ 配列番号 ３７；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＧＡＳ 配列番号 ３８；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＧＮＹＤＣＳＳＶＤＣＧＡ 配列番号 ３９、
ＣＤＲ配列を有する。

【0081】

配列番号１６～２１のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関連でＷ６８に特異的に結合する。一つの実施形態において、前記単鎖抗体は、抗体３０のＣＤＲ配列を含んでなる。

【0082】

ある実施形態において、前記単鎖抗体は、ｉ）配列番号１０６において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号３４～３６において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり、かつ／または前記抗体は、配列番号１０７において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号３７～３９において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、ここで、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８４において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８５において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0083】

ある実施形態において、単鎖抗体は、以下を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＦＳＡＹＹ 配列番号 ４０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＴＩＰＩＧＲＴ 配列番号 ４１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＧＧＰＴＧＮＳＨＦＴＬ 配列番号 ４２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＥＳＶＹＮＮＮＱ 配列番号 ４３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＱＡＳ 配列番号 ４４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＡＧＹＫＳＰＴＴＤＧＩＡ 配列番号 ４５、
ＣＤＲ配列を有する。

【0084】

配列番号１６～２１のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関連でＷ６８に特異的に結合する。一つの実施形態において、前記単鎖抗体は、抗体３８のＣＤＲ配列を含んでなる。

【0085】

ある実施形態において、前記単鎖抗体は、ｉ）配列番号１０８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４０～４２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり、かつ／または前記抗体は、配列番号１０９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１０９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４３～４５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、ここで、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0086】

ある実施形態において、単鎖抗体は、以下を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＳＬＳＳＹＡ 配列番号 ４６；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＹＮＹＥＴ 配列番号 ４７；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＡＲＤＩＦＲＴＮＴＮＬ 配列番号 ４８；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＶＹＫＮＮＧ 配列番号 ４９；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＦＴＳ 配列番号 ５０；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＬＧＧＹＤＣＳＳＲＶＣＧＡ 配列番号 ５１、
ＣＤＲ配列を有する。

【0087】

配列番号１６～２１のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関連でＷ６８に特異的に結合する。一つの実施形態において、前記単鎖抗体は、抗体３６のＣＤＲ配列を含んでなる。

【0088】

ある実施形態において、前記単鎖抗体は、ｉ）配列番号１１０において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１１０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４６～４８において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり、かつ／または前記抗体は、配列番号１１１において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１１１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号４９～５１において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、ここで、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８８において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号８９において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0089】

ある実施形態において、単鎖抗体は、以下を含んでなる：
ＣＤＲ－Ｈ１： ＧＦＴＦＳＳＹＹ 配列番号 １４０；
ＣＤＲ－Ｈ２： ＩＮＴＮＧＧＳＴ 配列番号 １４１；
ＣＤＲ－Ｈ３： ＶＲＱＮＹＥＧＡＹ 配列番号 １４２；
ＣＤＲ－Ｌ１： ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ 配列番号 １４３；
ＣＤＲ－Ｌ２： ＫＶＳ 配列番号 １４４；および
ＣＤＲ－Ｌ３： ＦＱＳＳＨＶＰＷＴ 配列番号 １４５
ＣＤＲ配列を有する。

【0090】

配列番号１６～２１のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体は、ミスフォールドＴＤＰ－４３のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関連でＷ６８に特異的に結合する。一つの実施形態において、前記単鎖抗体は、抗体３Ｆ１１のＣＤＲ配列を含んでなる。

【0091】

ある実施形態において、前記抗体は、ｉ）配列番号１４８において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１４８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１４０～１４２において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり；かつ／または、前記抗体は、ｉ）配列番号１４９において示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１４９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、ＣＤＲ配列は配列番号１４３～１４５において示される、もしくはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列、を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなり、場合により、前記重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１４６において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされ、かつ／または前記軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１４７において示されるヌクレオチド配列またはコドン縮重もしくはその最適化バージョンによりコードされる。

【0092】

ｉｉ）のアミノ酸配列はまた９５％超の配列同一性を有し得る。様々な実施形態において、前記アミノ酸配列は、本明細書に提供される配列に対して少なくとも９６％の同一性を有する。様々な実施形態において、前記アミノ酸配列は、本明細書に提供される配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する。様々な実施形態において、前記アミノ酸配列は、本明細書に提供される配列に対して少なくとも９８％の同一性を有する。様々な実施形態において、前記アミノ酸配列は、本明細書に提供される配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する。

【0093】

ある実施形態において、前記単鎖抗体は、配列番号９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１２８、１３８、または１４８のいずれか１つにおいて示される保存的置換アミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる。ある実施形態において、前記単鎖抗体は、配列番号９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１２９、１３９、または１４９のいずれか１つにおいて示される保存的置換アミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる。例えば、前記重鎖可変領域および／または前記軽鎖可変領域、場合によりフレームワーク領域１、２および／または３は、１、２、３、４または５個の保存的アミノ酸置換を含み得る。

【0094】

一つの実施形態において、前記単鎖抗体は、シグナルペプチドを含んでなる。例えば、シグナルペプチドは、重鎖シグナルペプチドまたは軽鎖シグナルペプチドであり得る。例示的な重鎖シグナル配列としては、ＭＮＦＧＬＲＬＩＬＬＶＬＶＬＫＧＶＬＣ（２Ｆ７の天然シグナル配列）（配列番号１６０）、ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱ（配列番号１６１）、ＭＥＬＧＬＳＷＩＦＬＬＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号１６２）、ＭＥＬＧＬＲＷＶＦＬＶＡＩＬＥＧＶＱＣ（配列番号１６３）、ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号１６４）、ＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号１６５）、ＭＤＷＴＷＲＦＬＦＶＶＡＡＡＴＧＶＱＳ（配列番号１６６）、ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号１６７）、ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ（配列番号１６８）およびＭＤＬＬＨＫＮＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号１６９）を含む／含んでなる。例示的な軽鎖シグナル配列としては、ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＳＳ（２Ｆ７の天然シグナル配列）（配列番号１７０）、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＳＧＡＲＣ（配列番号１７１）およびＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１７２）を含む。分泌可能な単鎖抗体を含んでなるベクター構築物を使用して、分泌されたＴＤＰ－４３を標的とし、細胞間伝播を最小限に抑えるための抗体の局所細胞外貯蔵所を提供することができる。

【0095】

本明細書において示されるように、本明細書に記載のイントラボディは、ミスフォールドＴＤＰ－４３に特異的に結合かつ／または選択的に結合し、天然ＴＤＰ－４３には結合しない。選択的結合は、本明細書に記載のように、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴測定を使用して測定することができる。イントラボディは、細胞内で機能するように意図された抗体療法であり、例えば、毒性タンパク質をブロックし、健康な細胞へのそれらの伝播を防ぐ。

【0096】

実施例に記載のように、イントラボディは、マウスおよびウサギモノクローナル抗体に由来する。

【0097】

イントラボディはヒト化することができる。非ヒト種由来の（例えば、マウスまたはウサギ由来の）抗体のヒト化は、文献において十分に記載されている。例えば、ＥＰ－Ｂ１ ０ ２３９４００およびCarter & Merchant 1997 （Curr Opin Biotechnol 8, 449-454, 1997、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる）参照。ヒト化抗体はまた、容易に商業的に得られる（例えば、Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain）。

【0098】

ヒト化型の齧歯類抗体は、ＣＤＲグラフティングにより容易に作製される（Riechmann et al. Nature, 332:323-327, 1988）。このアプローチにおいて、齧歯類モノクローナル抗体の抗原結合部位を含んでなる６個のＣＤＲループは、対応するヒトフレームワーク領域に連結される。フレームワーク領域のアミノ酸は、抗原認識に影響を及ぼし得るため、ＣＤＲグラフティングはしばしば、親和性が低い抗体をもたらす（Foote & Winter. J Mol Biol, 224: 487-499, 1992）。抗体の親和性を維持するために、部位特異的変異誘発または他の組換え技術により特定のフレームワーク残基を置き換えることがしばしば必要であり、抗原結合部位のコンピューターモデリングにより支援され得る（Co et al. J Immunol, 152: 2968-2976, 1994）。

【0099】

ヒト化型の抗体は、場合により、リサーフェシングにより得られる（Pedersen et al. J Mol Biol, 235: 959-973, 1994）。このアプローチでは、齧歯類抗体の表面残基のみがヒト化される。

【0100】

ある実施形態において、前記単鎖抗体は、キメラ抗体、例えば、ヒト化抗体である。

【0101】

重鎖可変鎖および軽鎖可変鎖を連結するリンカーは、長さが少なくとも５アミノ酸以上、好ましくは少なくとももしくは約１０アミノ酸または少なくとももしくは約１５アミノ酸であり、例えば、約２５アミノ酸未満であるべきである。使用することができるリンカー配列には、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_３（配列番号１８０）_、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_４（配列番号１８１）およびＧＳＴＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１８２）が含まれる。他のリンカーには、Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ（配列番号１８３）；Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（配列番号１８４）、Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ－Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｎ（配列番号１８５）、Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ（配列番号１８６）、Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ（配列番号１８７）、Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ（配列番号１８８）、およびＧｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ（配列番号１８９）が含まれる。単鎖抗体が融合タグまたはターゲティング部分などの検出可能な標識を含んでなる場合、それは、直接的にまたは間接的に、例えば、タグリンカー、またはターゲティング部分リンカーを介して、融合することができ、場合により、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１９０）を含んでなるかまたはＧＧＧＧＳ（配列番号１９０）である。さらなる側面は、検出可能な標識にコンジュゲートされた単鎖抗体である。ある実施形態において、検出可能な標識は、陽電子放出放射性核種である。陽電子放出放射性核種は、例えば、ＰＥＴイメージングにおいて使用され得る。そのような実施形態において、単鎖抗体は、融合細胞透過性ペプチドなどの細胞透過性部分を含んでなり得る。細胞透過性ペプチドは、ＴＡＴ、例えば、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１９１）、ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣ（ｃ－Ｔａｔ）（配列番号１９２）またはＧＤＩＭＧＥＷＧＮＥＩＦＧＡＩＡＧＦＬＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＨＡ－Ｔａｔ）（配列番号１９３）、またはその他、例えば、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ８）（配列番号１９４）およびＣＲＲＲＲＲＲＲＲＣ（ｃＲ８）（配列番号１９５）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ペネトラチン）（配列番号１９６）ならびにＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（トランスポータン）（配列番号１９７）に由来し得る。ＣＰＰ配列の各側のＣ残基は、ジスルフィド結合の形成および環化を可能にする。ＨＡは、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質を指す。細胞透過性ペプチドは、例えば、炭素－１１、窒素－１３、酸素－１５、フッ素－１８、ガリウム－６８、ジルコニウム－８９、ルビジウム－８２およびイットリウム９０などのＰＥＴイメージングに好適な放射性核種を含んでなり得る。トレーサー分子をペプチドに共有結合により連結するための方法は、当技術分野で知られている。

【0102】

したがって、ある実施形態は、本明細書に記載の単鎖抗体および検出可能な標識、例えば、融合タグまたはターゲティング部分を含んでなる免疫複合体を提供する。

【0103】

融合タグは、ＦＬＡＧタグまたはＭＹＣタグとすることができ、タグは、Ｎ末端またはＣ末端とすることができ、直接的にまたはリンカーを介して間接的にコンジュゲートすることができる。別の実施形態において、前記単鎖抗体は、リソソームターゲティングシグナルなどのターゲティング部分にコンジュゲートされる。

【0104】

ある実施形態において、前記ターゲティング部分は、リソソームまたはオートファジーターゲティングシグナルである。例えば、リソソームターゲティング部分は配列ＹＰＴＬ（配列番号１７３）、ＫＳＩＲＳＧＹＥＶＭ（配列番号１７４）、ＲＷＲＫＳＨＳＳＳＹＴＰＬＳＧＳＴＹＰＥＧＲＨ（配列番号１７５）であり得るかまたはそれらを含んでなり得る。使用することができる他のリソソームターゲティング配列には、古典的なチロシンベースのＮＰＸＹ（配列番号１７６）およびＹＸＸφ（配列番号１７７）配列（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基であり得、φは嵩高い疎水性残基である）、ジロイシンベースの［Ｄ／Ｅ］ＸＸＸＬ［Ｌ／Ｉ］（配列番号１７８）またはＤＸＸＬＬ（配列番号１７９）配列が含まれる。

【0105】

一つの実施形態において、前記単鎖抗体は、抗体およびリンカー部分と、場合により、配列番号２０３、２０５、２０７、２０９、２１３、２１５、２１７、２１９、２２３、２２５、２２７、２２９、２３３、２３５、２３７、２３９、２４３、２４５、２４７、２４９、２５３、２５５、２５７、および／または２５９のいずれかのリソソームターゲティング部分（例えば、タグおよびタグを連結する配列（タグリンカー）を除外し、存在しない場合は開始メチオニンを含む）を含んでなり得る。

【0106】

前記抗体は、実施例に記載のように調製することができ、例えば、重鎖および軽鎖可変領域を発現ベクターにクローニングし、発現させることができる。抗体が産生される（例えば、精製される）場合、分泌を指示するために、シグナル配列が利用される。

【0107】

本明細書に記載のように、前記単鎖抗体は、細胞内のミスフォールドＴＤＰ－４３凝集体を標的とするためのイントラボディとして好適である。このような構築物では、抗体が細胞内で好適に発現されるため、シグナル配列は組み込まれない。

【0108】

したがって、さらなる側面は、本明細書に記載の単鎖抗体または免疫複合体をコードする単離核酸である。

【0109】

融合した重鎖および軽鎖を含んでなり、例えば、本明細書に記載のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３領域を含んでなる重鎖をコードし、かつ、本明細書に記載のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３領域を含んでなる軽鎖をコードする、本明細書に記載の単鎖抗体および免疫複合体をコードする核酸も提供され、表３、９、１０、１１、１２、１３および１４のいずれかに記載の核酸配列および本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれかをコードするものが含まれる。

【0110】

例えば、核酸配列は、配列番号７６～８９、配列番号１２６～１２７、配列番号１３６～１３７、１４６～１４７のいずれか１つおよび／または配列番号２０２、２０４、２０６、２０８、２１２、２１４、２１６、２１８、２２２、２２４、２２６、２２８、２３２、２３４、２３６、２３８、２４２、２４４、２４６、２４８、２５２、２５４、２５６および／または２５８のいずれかの抗体およびリンカー部分、ならびに、場合により、リソソームターゲティング部分（例えば、タグおよびタグを連結する配列（すなわち、タグリンカー）を除外し、存在しない場合は開始メチオニンコドンおよび停止コドンを含む）を含んでなる。

【0111】

本開示はまた、本明細書に開示される単鎖抗体をコードする核酸配列のバリアントを提供する。

【0112】

例えば、前記バリアントは、少なくとも中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本明細書に開示される抗体をコードする核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、またはコドン縮重または最適化配列を含む。別の実施形態において、バリアント核酸配列は、配列番号７６～８９、配列番号１２６～１２７、配列番号１３６～１３７、配列番号１４６～１４７のいずれか１つおよび／または配列番号２０２、２０４、２０６、２０８、２１２、２１４、２１６、２１８、２２２、２２４、２２６、２２８、２３２、２３４、２３６、２３８、２４２、２４４、２４６、２４８、２５２、２５４、２５６および／または２５８のいずれかの抗体およびリンカー部分、ならびに、場合により、リソソームターゲティング部分を含んでなる核酸配列に対して少なくとも７０％、最も好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、さらに最も好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する。バリアント配列は、例えば、ＣＤＲ配列の外側に保存的変化を有する抗体および例えば、ヒト細胞における発現のために最適化された、本明細書に記載の抗体配列のコドン最適化バージョンをコードする。

【0113】

別の側面は、本明細書に開示される核酸を含んでなる発現カセットまたはベクターである。発現カセットは、例えば、単鎖抗体およびリンカーをコードする核酸、および核酸に動作可能に連結されたプロモーターなどの調節配列を含んでなり得る。ある実施形態において、前記ベクターは単離ベクターである。

【0114】

前記ベクターは、任意のベクター、好適には、本明細書に記載の単鎖抗体を産生するのに好適な発現ベクターであり得る。ある実施形態において、前記ベクターは、例えば、単鎖抗体（例えば、イントラボディ）を発現するのに好適である。

【0115】

核酸分子は、例えば、実施例に記載されているように、タンパク質の発現を保証する適当な発現ベクターに、公知の様式で組み込んでもよい。

【0116】

ベクターの構築には、当技術分野で知られている分子クローニング技術を使用することができる。ある実施形態において、発現ベクターおよびインサートは、適当な制限酵素で消化され、Ｔ４ポリメラーゼによってライゲートされる。ライゲーション反応物はコンピテント細胞に変換される。個々のコロニーを採取し、一晩培養物を増殖させ、診断用の制限消化のためにＤＮＡを精製する。

【0117】

可能性のある発現ベクターとしては、限定されるものではないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス（例えば、レンチウイルスベクターを含む複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。

【0118】

一つの実施形態において、前記ベクターは、神経細胞に形質導入することができるアデノ随伴ウイルスである（例えば、ＡＡＶ血清型９）。

【0119】

前記ベクターは、好適な調節配列を含んでなり得る。

【0120】

好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫の遺伝子を含む、種々の源に由来し得る。このような調節配列の例としては、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）が挙げられる。さらに、トランスフェクト/感染/形質導入される細胞および使用されるベクターに応じて、他の配列、例えば、複製起点、さらなるＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性を付与する配列を、発現ベクターに組み込んでもよい。ある実施形態において、前記調節配列は、神経組織および／または細胞における発現を指示するまたは増大させる。ある実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。組換え発現ベクターは、本明細書に記載の抗体を発現するためのベクターで形質転換、感染またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子も含有してもよい。組換え発現ベクターは、例えば、本明細書に記載のタグおよび標識を含む、例えば検出を助けることができる、融合部分（例えば、抗体「融合タンパク質」を作成するための）をコードする他の発現カセットを含有してもよい。

【0121】

核酸およびベクターを使用して、単鎖抗体を細胞、例えば、対象の細胞に送達することができる。

【0122】

ウイルスベクター、「裸の」ＤＮＡ、脂質または他のナノ粒子中のＤＮＡ、アジュバントを補助としたＤＮＡ、遺伝子銃などを含む、細胞に形質導入するための広範なアプローチを使用することができる。例えば、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターも、細胞にイントラボディを形質導入するために使用することができる。本発明の実施に有用な他のベクター系には、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスに基づくベクターが含まれる。

【0123】

別の側面において、本明細書に記載の単鎖抗体を組換え発現する（例えば、組換え細胞）および／または本明細書に記載の単鎖抗体をコードする核酸、発現カセットもしくはベクターを含んでなる、細胞も提供される。ある実施形態において、前記細胞は、本明細書に記載の抗体を発現するか、または本明細書に開示される核酸、発現カセットもしくはベクターを含んでなる、単離細胞である。

【0124】

ある実施形態において、前記細胞は、本明細書に記載の抗体を産生することができる細胞である。

【0125】

ＩＶ．組成物
さらなる側面は、本明細書に記載の単離抗体、免疫複合体、核酸、発現カセットまたはベクターを含んでなる組成物である。本明細書に記載の抗体、免疫複合体、核酸またはベクターを２つ以上含んでなる組成物も提供される。

【0126】

一つの実施形態において、前記組成物は、２つ以上の単離抗体（例えば、２つ以上の異なる抗体）を含んでなる。

【0127】

別の実施形態において、前記組成物は、２つ以上の免疫複合体（例えば、２つ以上の異なる免疫複合体）を含んでなる。

【0128】

別の実施形態において、前記組成物は、２つ以上の核酸（例えば、２つ以上の異なる核酸）を含んでなる。

【0129】

別の実施形態において、前記組成物は、２つ以上の発現カセット（例えば、２つ以上の異なる発現カセット）を含んでなる。

【0130】

別の実施形態において、前記組成物は、２つ以上のベクター（例えば、２つ以上の異なるベクター）を含んでなる。

【0131】

ある実施形態において、前記２つ以上は２つ、例えば、２つの抗体または２つの免疫複合体などである。ある実施形態において、前記２つ以上は３つである。ある実施形態において、前記２つ以上は４つである。ある実施形態において、前記２つ以上は５つである。別の実施形態において、前記２つ以上は６つである。ある実施形態において、前記２つ以上は７つである。

【0132】

別の側面は、本明細書に記載の単鎖抗体を含んでなる組成物である。本明細書に記載の単鎖抗体を２つ以上含んでなる組成物も提供される。

【0133】

一つの実施形態において、前記組成物は、抗体２Ｆ７のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体を含んでなる。

【0134】

別の実施形態において、前記組成物は、抗体１Ｈ３－１Ｋ３のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体を含んでなる。

【0135】

別の実施形態において、前記組成物は、抗体２８Ｈ３－２８Ｋ１のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体を含んでなる。

【0136】

別の実施形態において、前記組成物は、抗体１４Ｈ１－１４Ｋ２のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体を含んでなる。

【0137】

別の実施形態において、前記組成物は、抗体１７のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体を含んでなる。

【0138】

別の実施形態において、前記組成物は、抗体２０のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体を含んでなる。

【0139】

別の実施形態において、前記組成物は、抗体３０のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体を含んでなる。

【0140】

別の実施形態において、前記組成物は、抗体３８のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体を含んでなる。

【0141】

別の実施形態において、前記組成物は、抗体３６のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体を含んでなる。

【0142】

別の実施形態において、前記組成物は、抗体３Ｆ１のＣＤＲを含んでなる単鎖抗体を含んでなる。

【0143】

前記単鎖抗体は、リソソームターゲティング部分を含んでなり得る。

【0144】

一つの実施形態において、前記組成物は、ＬＹＳ－２Ｆ７、ＬＹＳ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、ＬＹＳ－１４Ｈ１－１４Ｋ２、ＹＰＴＬ－１４Ｈ１－１４Ｋ２、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２Ｆ７、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、およびＭＹＣＨ２０Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２からなる群から選択される単鎖抗体を含んでなる。

【0145】

ある実施形態において、前記組成物は、ＬＹＳ－２Ｆ７およびＭＹＣＨ１５Ｌ－２Ｆ７からなる群から選択される単鎖抗体を含んでなる。

【0146】

一つの実施形態において、前記組成物は、ＬＹＳ－１４Ｈ１－１４Ｋ２、ＹＰＴＬ－１４Ｈ１－１４Ｋ２およびＭＹＣＨ２０Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２からなる群から選択される単鎖抗体を含んでなる。

【0147】

別の実施形態において、前記組成物は、ＬＹＳ－２Ｆ７、ＬＹＳ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、ＬＹＳ－１４Ｈ１－１４Ｋ２、ＹＰＴＬ－１４Ｈ１－１４Ｋ２、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２Ｆ７、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、およびＭＹＣＨ２０Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２からなる群から選択される２つ以上の単鎖抗体を含んでなる。

【0148】

ある実施形態において、前記２つ以上は２つの単鎖抗体である。ある実施形態において、前記２つ以上は３つである。ある実施形態において、前記２つ以上は４つである。ある実施形態において、前記２つ以上は５つである。ある実施形態において、前記２つ以上は６つである。ある実施形態において、前記２つ以上は７つである。

【0149】

ある実施形態において、前記組成物は、希釈液を含んでなる。核酸およびベクターのための好適な希釈液としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水およびエタノールが挙げられる。

【0150】

前記組成物は、核酸および／またはベクターの送達を補助するためのリポソームなどの脂質粒子、ナノ粒子、またはナノソームを含んでなり得る。

【0151】

抗体もしくはそのフラグメントを含むポリペプチドおよび／または細胞のための好適な希釈液としては、限定されるものではないが、生理食塩水、ｐＨ緩衝液ならびにグリセロール溶液またはポリペプチドおよび／もしくは細胞を凍結させるのに好適な他の溶液が挙げられる。

【0152】

ある実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の核酸またはベクターを含んでなる。別の実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の抗体またはその一部および希釈液を含んでなる。ある実施形態において、前記組成物は無菌組成物である。

【0153】

前記組成物は、くも膜下腔内、脳実質内または脳室内投与のために処方することができる。

【0154】

ある実施形態において、前記組成物は、薬学上許容可能な担体、希釈液、および／または賦形剤を含んでなる。ある実施形態において、前記組成物は、例えば、ミスフォールドＴＤＰ－４３を標的とすることなど、本明細書に記載の方法のためのものである

【0155】

ある実施形態において、前記組成物は、薬学上許容可能な担体、希釈液、および／または賦形剤を含んでなる。ある実施形態において、前記組成物は、例えば、それを必要とする対象、例えば、ＴＤＰ－４３タンパク質症を有する対象を治療することなど、本明細書に記載の方法のための医薬組成物である。

【0156】

前記組成物は、本明細書に記載の１以上の抗体を含んでなり得る。

【0157】

ＶＩ．方法
本明細書に記載の単鎖抗体、核酸およびベクターを作製する方法が含まれる。

【0158】

特に、単鎖抗体、例えば、ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関連でＷ６８に対して選択的な単鎖抗体を作製する方法が提供される。ＣＤＲを単鎖抗体足場に移植することができ、または重鎖および軽鎖可変領域を増幅し、ベクターにクローニングすることができる。

【0159】

単鎖抗体、場合により、イントラボディを含んでなるベクターを、いくつかの方法により調製することができる。ベクターの構築には、当技術分野で知られている分子クローニング技術を使用することができる。実施例に記載のように、ｓｃＦｖ核酸は、ＦＬＡＧタグ－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－Ｌｙｓリンカー－リソソームターゲティング配列形式などの様々な形式で構築した。抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、それぞれ、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４から構成し得る。ＶＨ配列およびＶＬ配列を連結するためのリンカーならびにリソソームターゲティング部分を連結するためのリンカーは、それぞれ、３回および１回のＧＧＧＧＳのタンデムリピートから構成し得る。ｓｃＦｖ核酸は、５’－ＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ－３’制限配列などの制限部位に隣接し、ＤＮＡシンセサイザーで固相ホスホロアミダイト化学法を使用して個々のホスホロアミダイトモノマーを逐次的に連結することにより合成することができる。得られた一本鎖ｓｃＦｖ遺伝子インサートを、標準的なＰＣＲによって増幅して、二本鎖インサートを生成することができ、これを、次に、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（－）ベクターなどのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素消化ベクターにクローニングすることができる。

【0160】

他の方法も使用することができる。例えば、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ社、チャッツワース、カリフォルニア州）を使用して、ハイブリドーマ細胞株から単離することができる。ｃＤＮＡは、例えば、製造業者の説明書に従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ、カタログ番号１２３７１－０１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州）を使用してオリゴｄＴプライミングにより合成することができる。重鎖（ＶＨ）および軽鎖（Ｖκ）の可変領域は、ユニバーサルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の混合物を使用することにより、第一鎖ｃＤＮＡとは別に増幅することができる。重鎖および軽鎖のＰＣＲ産物は、それぞれ、ＰｓｔＩ／ＢｓｔＥＩＩおよびＳａｃＩ／ＸｈｏＩなどの制限酵素で切断することができ、アガロースゲル精製することができる。ＶＬおよびＶＨに対応するｃＤＮＡインサートは、例えば、ｐＢＺＵＴ７ベクターにクローニングし、配列決定することができる。ＶＨおよびＶＬドメインは、ＰＣＲによって組み立てられ、一緒に連結して、全長ｓｃＦｖ核酸を生成することができる。ｓｃＦｖ核酸は、次いで、Ｍｙｃタグの上流にサブクローニングすることができる。構築物はまた、効率的な分泌のためのシグナル配列、検出を容易にするためのｃ－ｍｙｃエピトープもしくはＦＬＡＧなどのタグ、またはリソソームシグナル配列もしくはオートファジーシグナル配列などのターゲティング部分などの１つ以上の部分を含むように設計することができる。

【0161】

得られた単鎖抗体の構造は、（ＨＣ ＦＲ１－ＨＣ ＣＤＲ１－ＨＣ ＦＲ２－ＨＣ ＣＤＲ２－ＨＣ ＦＲ３－ＨＣ ＣＤＲ３－ＨＣ ＦＲ４）_ＶＨ－リンカー－（ＬＣ ＦＲ１－ＬＣ ＣＤＲ１－ＬＣ ＦＲ２－ＬＣＣＤＲ２－ＬＣ ＦＲ３－ＬＣ ＣＤＲ３－ＬＣ ＦＲ４）_ＶＬ－任意にＬｙｓリンカー－任意にリソソームターゲティング配列などのターゲティング部分であり得、ここで、ＨＣ ＦＲ１は重鎖フレームワーク１領域であり、ＨＣ ＦＲ２は重鎖フレームワーク２領域であり、ＨＣ ＦＲ３は重鎖フレームワーク３領域であり、ＨＣ ＦＲ４は重鎖フレームワーク４領域であり、ＬＣ ＦＲ１は軽鎖フレームワーク１領域であり、ＬＣ ＦＲ２は軽鎖フレームワーク２領域であり、ＬＣ ＦＲ３は軽鎖フレームワーク３領域であり、ＬＣ ＦＲ４は軽鎖フレームワーク４領域である。

【0162】

また、例えば、細胞においてまたは対象においてミスフォールドＴＤＰ－４３を検出する方法も提供される。

【0163】

本明細書に記載の標識単鎖抗体（分泌シグナルを付加することにより産生される）は、ミスフォールドＴＤＰ－４３の位置を検出するために、対象に投与することもできる。前記測定することは、例えば、免疫蛍光またはＰＥＴトレーサーによるものであってもよい。前記方法は、共局在染色、例えば、ｐａｎ－ＴＤＰ－４３染色も含み得る。

【0164】

細胞内ミスフォールドＴＤＰ－４３レベルを低減する方法であって、本明細書に記載の核酸、ベクター、または、前記核酸またはベクターを含む組成物を、それを必要とする対象、例えば、ＴＤＰ－４３タンパク質症を有すると疑われる、それを発症するリスクにある、またはそれと診断されている対象に投与することを含んでなる方法も提供される。

【0165】

例えば、ＴＤＰ－４３タンパク質症を有する対象を治療する方法であって、核酸、発現カセット、ベクター、単鎖抗体、または本明細書に記載の前記核酸、発現カセットもしくはベクターもしくは単鎖抗体を含んでなる組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる方法も提供される。

【0166】

ある実施形態において、前記ＴＤＰ－４３タンパク質症は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ＴＤＰ）、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、および大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）から選択される。

【0167】

いくつかの実施形態において、核酸、ベクター、または組成物は、別のＴＤＰ－４３タンパク質症治療と組み合わせて、対象に投与される。他のＴＤＰ－４３タンパク質症治療としては、限定されるものではないが、ＡＬＳに対する治療、例えば、リルゾール（リルテックまたはＴｉｇｌｕｔｉｋ（商標））、エダラボン（ラジカヴァ（商標））、およびニューデクスタ（商標）（デキストロメトルファンおよびキニジンの組合せ）が挙げられる。

【0168】

前記核酸またはベクターは、例えば、薬学上許容可能な担体、希釈液および／または賦形剤と例えば組み合せて、本明細書に記載の組成物に含まれ得、かつ例えば、核酸またはベクターの送達を補助するためのナノ粒子またはナノソームにおいて処方され得る。

【0169】

本明細書に記載の組成物、抗体、免疫複合体、核酸、およびベクターは、例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、脳室内投与、くも膜下腔内投与、眼窩内投与、眼投与、脊髄内投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアロゾル投与または経口投与により投与され得る。

【0170】

他の複数の実施形態は、本明細書に記載の組成物、抗体、免疫複合体、核酸、およびベクターの、血液脳関門を介する輸送を促進することで知られる生物活性分子との同時投与を企図する。

【0171】

特定の複数の実施形態において、米国特許第７，０１２，０６１号「血液脳関門の透過性を増大させる方法」（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載のように、血液脳関門の透過性を一過性に増大させるように向けられたものなど、血液脳関門を介して本明細書に記載の組成物、抗体、免疫複合体、核酸、およびベクターを投与する方法も企図される。

【0172】

それを必要とする対象または細胞における本明細書に記載の１以上の抗体の発現のための、本明細書に記載の組成物および／または核酸のウイルス送達も、本明細書において企図される。ある側面は、有効量の本明細書に記載の開示のベクター化抗体、または前記ベクター化抗体を含んでなる組成物を、場合により、別のＴＤＰ－４３タンパク質症治療と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、ＴＤＰ－４３タンパク質症を有する対象を治療する方法を含む。一つの実施形態において、前記ベクター化抗体は、本明細書に記載の抗体をコードする核酸を含んでなるウイルスベクターである。一つの実施形態において、前記方法は、それを必要とする対象におけるイントラボディの細胞内発現のためのものである。イントラボディは、例えば、細胞内ミスフォールドＴＤＰ－４３凝集を阻害し得るか、またはミスフォールド凝集体のクリアランスを促進する。

【0173】

例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ９）およびレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用することができる。非ウイルスベクターも使用することができる。特定の複数の実施形態において、前記核酸、ベクターまたは組成物は、脳室内注射またはくも膜下腔内注射され得る。他の実施形態において、前記核酸、ベクターまたは組成物は、例えば、分泌される単鎖抗体の持続的産生のための貯蔵所を使用して、静脈内または皮下または筋肉内に投与することができる。

【0174】

上記の開示は、一般に、本出願を説明するものである。より完全な理解は、以下の具体的な実施例を参照することにより得ることができる。これらの実施例は、例示の目的のためにのみ説明され、本出願の範囲を限定することを意図したものではない。状況が便宜を示唆し得るか、与え得る限り、形態の変更および均等物の置換が企図される。特定の用語が本明細書において使用されているが、このような用語は、説明的な意味であることを意図し、限定の目的のためのものではない。

【0175】

以下の限定されない例は、本開示の例示的なものである：

【実施例】

【0176】

実施例１
ミスフォールドＴＤＰ－４３の検出
抗体は、配列番号１を含む免疫原を用いてウサギで産生された。抗体はアフィニティー精製された。アフィニティー精製抗体を、免疫細胞化学を使用した細胞トランスフェクションアッセイにおいて、天然ＴＤＰ－４３ポリペプチドおよびミスフォールドＴＤＰ－４３ポリペプチドに結合するそれらの能力に関して試験した。

【0177】

結果
核局在化シグナルにおける三重ミスセンスタンデム変異を有するＨＡ－タグＴＤＰ－４３構築物によりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、ＨＡ抗体により検出された、細胞質におけるＴＤＰ－４３凝集体を示している。ＨＡ陽性凝集体も、ΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３ Ｗ６８Ｓトランスフェクト細胞では明らかである。アフィニティー精製ポリクローナル抗体は、トリプトファン６８残基（Ｔｒｐ６８）を含んでなる、ΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３トランスフェクト細胞における凝集体を認識するが、Ｔｒｐ６８がセリンに変異している場合、同じ反応性は示さない。したがって、抗ＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）ポリクローナルウサギ抗体は、Ｔｒｐ６８残基を含んでなるミスフォールドＴＤＰ－４３ＮＴＤに対する選択性を有する。

【0178】

ＨＡタグ野生型ＴＤＰ－４３は、核局在化シグナルに変化をもたらさずに過剰発現する場合、一般に核に局在化し、核ＴＤＰ－４３は、ＧＳ２４０またはＧＳ２４３アフィニティー精製血清に結合しない。興味深いことに、ＧＳ２４０およびＧＳ２４３は、これらの細胞の細胞質に存在する場合、依然として野生型ＴＤＰ－４３に結合し、それにより、Ｎ末端ユビキチン様ドメイン（ＮＴＤ）は、細胞質に誤局在する場合、ＷＴＴＤＰ－４３においてミスフォールドされ得ることが示唆される。

【0179】

ＧＳ２４０およびＧＳ２４３ポリクローナル抗体は、ＴＤＰ－４３凝集体の非存在下で最小の反応性を示す。両抗体の反応性は、細胞質中の凝集体におけるミスフォールドＴＤＰ－４３に対して選択的であり、Ｔｒｐ６８の存在を必要とする。

【0180】

実施例２
マウスモノクローナル抗体の産生
マウスモノクローナル抗体は、ＫＬＨに連結されたＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）、例えば、ＤＡＧＷＧＮＬｃ（配列番号９）を含んでなるペプチドを使用して産生した。ハイブリドーマを開発し、分析した。陽性クローンを同定し、アイソタイプを決定した。

【0181】

実施例３
ウサギモノクローナル抗体の産生

【0182】

Ｃ末端システインを介してＫＬＨにコンジュゲートしたＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）ペプチド（ペプチド－ＫＬＨ）を、ＴＤＰ－４３ペプチドに特異的なモノクローナル抗体を分泌するＢ細胞の作製のためのウサギ免疫化に使用した。単離Ｂ細胞の間接的ＥＬＩＳＡ試験に基づき、Ｂ細胞を、ＲＮＡ単離および組換えプラスミドＤＮＡの作製のために選択した。精製ｍＡｂの作製のために、機能的抗原結合組換えｍＡｂをトランスフェクトし、発現させた。

【0183】

実施例４
モノクローナル抗体のクローニングおよびシークエンシング
マウスｍＡｂのクローニング
いくつかのマウスハイブリドーマクローンに関する重鎖免疫グロブリン遺伝子および軽鎖免疫グロブリン遺伝子の可変領域を同定し、配列決定した。

【0184】

配列を以下の表２、３および４に示し、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を、表３および４において下線および太字で示す。

【0185】

ウサギｍＡｂのクローニング
抗体ＲＮＡの単離および組換えプラスミドＤＮＡの作製を行った重鎖および軽鎖可変領域を、ウサギ重鎖およびカッパ定常領域を含有する別々の哺乳動物発現ベクターにクローン化した。

【0186】

トップ組換えｍＡｂ（１つの重鎖および１つの軽鎖を含有するＤＮＡ構築物）を、以下の表２、３および４に示すように配列決定し、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を、表３および４において下線および太字で示す。

【0187】

【表2】

【0188】

【表3】

【0189】

【0190】

【0191】

【表4】

【0192】

【0193】

実施例５
直接結合アッセイ
ペプチド（ＢＳＡにコンジュゲートした）に対する抗血清、ハイブリドーマ上清または精製抗体の結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用した表面プラズモン共鳴により調べることができる。

【0194】

高密度（少なくとも１０００レスポンスユニット（ＲＵ））のフローセルに固定化された抗原を使用して、結合分析を行う。選択されたクローンの希釈を、結合を評価するための表面に逐次的に注入する。

【0195】

親和性速度論および特異性分析のために、ＤＡＱＷＧＮＬ（配列番号１）またはＧＷＧを含んでなり、かつＢＳＡにコンジュゲートされたペプチドを、隣接するフローセルに低密度（５０～１００ＲＵ）で固定化する。次いで、選択されたクローン（４．７ｎＭ～７５ｎＭ）の段階２倍希釈を、６０μｌ／分で３分間表面に逐次的に注入した後、解離相が続く。二重参照減算の後、センサーグラムをラングミュア１：１結合モデルに当てはめる。同じセンサーチップおよび同じ条件を用いて、最大３回の別々の分析を、連続した３日間で行う。

【0196】

結合分析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ－２）（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ ＧｍｂＨ社、ハンブルク、ドイツ）を使用して行うこともできる。ＭＡＳＳ－２は、高強度レーザー光および高速光学走査を使用して、結合相互作用をリアルタイムでモニタリングする表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージング分析バイオセンサーである。ペプチド－ＢＳＡコンジュゲートを、標準的なアミンカップリング化学を使用して、Ｈｉｇｈ Ａｍｉｎｅ Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＨＡＣ）センサーチップの別々のフローセルに共有結合的に固定化し、未反応部位を遮断する。隣接するフローセルを、参照対照表面としてのＢＳＡで同様に固定化する。

【0197】

モノクローナル抗体の結合速度論
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を用いて、ペプチドエピトープに対するモノクローナル抗体の結合速度論を測定した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートしたペプチドを、センサーチップのフローセルに非常に低密度（およそ５０ＲＵ）で固定化した。３１．２５ｎＭから０．２４ｎＭに４倍希釈した精製マウスまたはウサギモノクローナル抗体を、表面におよそ５分間逐次的に注入した後、緩衝液における解離および表面再生が続いた。速度論曲線当てはめおよびラングミュア１：１相互作用モデルを用いて、結合パラメーターを計算した。マウスおよびウサギ両方のモノクローナル抗体は、以下の表５に示すように、ペプチドエピトープに対してナノモル以下の高い親和性を示した。ウサギモノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体（１０^－１０ｎＭ範囲）と比較して大きな親和性（１０^－１１ｎＭ範囲）を示した。

【0198】

【表5】

【0199】

実施例６
エピトープは、天然に折り畳まれたＴＤＰ Ｎ末端ドメインではそうではないが、変性ＴＤＰ Ｎ末端ドメインにおける抗体により認識される
ＴＤＰ－４３のＮ末端ドメイン（残基１～８０）を、大腸菌におけるプラスミドから発現させ、以前に記載の通りに精製した(Wang et al. 2018 EMBO)。ウエスタンブロット解析のために、製造業者の仕様書に従って、Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓシステムを使用してネイティブＰＡＧＥを行った。製造業者の仕様書に従って、Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓシステムを使用して変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。ブロットをＴＢＳＴ中５％粉乳においてブロッキングし、次いで、精製ウサギポリクローナル抗体ＧＳ２４０で４℃にて一晩インキュベートした。ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（Ｂｉｏｒａｄ社、米国）での検出のために、ロバ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国）を使用した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）基質を、製造業者の説明書に従って使用した。抗体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上の変性ＴＤＰ－４３ ＮＴＤのみを認識および染色し、ネイティブＰＡＧＥゲル上のＴＤＰ－４３ ＮＴＤに対してはそうではなく、それにより、エピトープは、天然に折り畳まれたＴＤＰ－４３においてアクセス不可能であり、ミスフォールディング時に露出するようになることが確認された。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、天然型または変性型のＴＤＰ－４３ ＮＴＤは、単量体のままであることを示している。参考のために、分子量マーカーを重ねている。

【0200】

実施例７
患者サンプルの免疫組織化学
脳および脊髄サンプルをＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋから得、処理および染色した。ホルマリン固定、パラフィン包埋組織からの切片（８μＭ厚）を脱パラフィンし、その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．３％Ｈ_２Ｏ_２に３０分間浸漬し、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチした。ホルマリン固定は、組織標本における抗原部位を遮蔽し得るタンパク質架橋を形成する。タンパク質架橋を壊すために、スライドを熱およびトリス－ＥＤＴＡ（ｐＨ９）で前処理した。一次試験抗体を１：４０００（ウサギポリクローナルＧＳ２４０抗体、３Ｅ８マウスモノクローナル抗体）または１：２０００（マウスモノクローナル抗体３Ｆ１１および２Ｆ７）の希釈で、４℃にて一晩インキュベートした。二次ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ／マウス抗体（ＥＶ－ＧαＭ ＨＲＰ、ＤＡＫＯ社）を室温で３０分間加え、次いで、色素原３，３，－ジアミノベンジジン（ＤＡＫＯ社）を１０分間加えた。切片をヘマトキシリンで対比染色した。

【0201】

前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）Ｂ型患者由来の脳切片の染色が行われた。ウサギポリクローナルＧＳ２４０抗体は、白質（ＷＭ）および灰白質（ＧＭ）の両方において病的ＴＤＰ４３の染色を示している。３Ｆ１１および３Ｅ８モノクローナル抗体は、ＧＭにおいて病的ＴＤＰ－４３を主に検出しているが、一方、２Ｆ７モノクローナル抗体は、ＷＭおよびＧＭの両方において染色を示している。ウサギポリクローナルＧＳ２４０抗体は、ＡＬＳ脊髄切片でも試験し、運動ニューロンおよび周囲組織において陽性を示した。これらの結果は、抗体は、患部組織においてｉｎ ｓｉｔｕで示される病原性ＴＤＰ－４３のエピトープを認識できることを示している。

【0202】

実施例８
モノクローナル抗ＴＤＰ４３抗体によるトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の代表的な染色
実施例１に記載のように、免疫組織化学を使用した細胞トランスフェクションアッセイにおいて、マウスモノクローナル抗体およびウサギモノクローナル抗体を、ミスフォールドＴＤＰ－４３に対する選択的結合に関して試験した。簡単に述べれば、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ＨＡタグΔＮＬＳ－ＴＤＰ４３（細胞質凝集体を形成する）もしくはＨＡタグ野生型（ＷＴ）ＴＤＰ－４３（核において発現した）をコードするプラスミドまたは空ベクターでトランスフェクトした。抗ＴＤＰ－４３抗体を、染色のために１０ｕｇ／ｍｌに希釈し、蛍光標識抗ウサギＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧを、検出用二次抗体として使用した。ニワトリ抗ＨＡタグ抗体、次いで蛍光標識抗ニワトリ二次抗体を、トランスフェクトＴＤＰ－４３の検出のために使用した。トランスフェクトΔＮＬＳ－ＴＤＰ４３は、細胞質に誤局在し、そこでは、抗ＨＡタグ抗体での染色により容易に検出される凝集体を形成する。２Ｆ７抗体は、マージ画像における２個の染色シグナルの共局在により確認されるように、同じ凝集体を認識した。対照的に、ＨＡタグ抗体により核において検出されるトランスフェクトＷＴＴＤＰ－４３は、２Ｆ７抗体により染色されなかった。予想されたように、空ベクターでトランスフェクトした細胞は、ＨＡタグ染色を全く示さない。それらは、２Ｆ７抗体による染色を全く示さず、これにより、２Ｆ７は内因性核ＷＴ ＴＤＰ－４３の認識もできないことが示された。

【0203】

試験した他の抗体でも同様の結果が得られ、それらを表６に要約する。試験した抗体による染色のこのパターンは、ＷＴ ＴＤＰ－４３と比較したＴＤＰ－４３のミスフォールド病原性凝集体に対するそれらの選択性を示している。

【0204】

【表6】

【0205】

実施例９
生理学的ストレス顆粒の免疫細胞化学
ミスフォールドＴＤＰ－４３に対するモノクローナル抗体が生理学的ストレス顆粒と反応したかどうかを決定するために、ストレスを受けたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に対して染色を行った。簡単に述べれば、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に対して、１ｎＭ亜ヒ酸ナトリウムへの６０分間の曝露により、ストレスを与えた。次いで、細胞を、ストレス顆粒マーカーＧ３ＢＰ１に対する蛍光標識抗体または１０ｕｇ／ｍｌのモノクローナル抗ＴＤＰ－４３試験抗体で染色した後、標識二次抗体で検出した。１つの抗体を除いて、試験した他の抗体で同様の結果が得られ、それらは以下の表７に含まれる。ストレスを受けた細胞は、細胞質におけるＧ３ＢＰ１＋ストレス顆粒の大量の点状の染色を示した。比較して、３Ｆ１１抗体で染色した同じ細胞は、Ｇ３ＢＰ１染色の位置において細胞質顆粒の存在を示さず、３Ｆ１１はこれらの細胞におけるストレス顆粒と反応しないことが示された。生理学的ストレス顆粒におけるＴＤＰ－４３に対する試験した抗体の結合の欠如は、それらがこれらのストレス顆粒の保護機能を妨げる可能性は低いことを示唆するものである。

【0206】

【表7】

【0207】

実施例１０
選択されたｍＡｂのキャラクタリゼーション
トリプトファン６８（Ｔｒｐ６８）がセリンに変異したＨＡタグΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３（Ｗ６８Ｓ）との比較でＨＡタグΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において形成された細胞質凝集体の認識に関して、モノクローナル抗体を試験した。空ベクターを対照として使用した。細胞を、２μｇ／ｍｌのＴＤＰ－４３ウサギモノクローナル抗体２８、１μｇ／ｍｌのマウスｐａｎＴＤＰ－４３、または０．５μｇ／ｍｌのニワトリ抗ＨＡタグのいずれかで染色した。蛍光標識二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－抗ウサギ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗マウスおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８－抗ニワトリを、結合一次抗体の検出のために使用した。核をヘキスト３３３４２色素で染色した。ＨＡタグΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３でトランスフェクトした細胞において、２８抗体は、ミスフォールドΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３のＨＡ陽性凝集体とともに共局在した細胞質凝集体を染色した。対照的に、Ｔｒｐ６８を欠くΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３－Ｗ６８Ｓにより形成された細胞質凝集体の染色は認められなかった。予想されたように、空ベクターでトランスフェクトした細胞は、ＨＡタグ染色を全く示さなかった。それらは、２８Ｈ３－２８Ｋ１による染色を全く示さず、これにより、抗体は内因性核ＷＴ ＴＤＰ－４３を認識しないことが確認された。ｐａｎ－ＴＤＰ－４３抗体は、両形態のトランスフェクトＴＤＰ－４３および内因性核ＴＤＰ－４３により形成された細胞質凝集体を認識した。
試験したほとんどの他の抗体でも同様の結果が得られ、それらを表８に要約する。ポリクローナルウサギ抗体で認められたように、試験したモノクローナル抗体による染色のこのパターンは、溶媒露出Ｔｒｐ６８残基を含んでなるミスフォールドＴＤＰ－４３ ＮＴＤに対するそれらの選択性を示している。ΔＮＬＳ－ＴＤＰ－４３－Ｗ６８Ｓのいくつかの凝集体に結合したクローン２０は、生理学的ストレス顆粒に結合した。

【0208】

【表8】

【0209】

実施例１１
ＨＥＫ２９３細胞におけるミスフォールドＴＤＰ－４３伝播の抗体遮断
ドナーＨＥＫ２９３細胞を、ミスフォールドＴＤＰ－４３を発現させるために、ＴＤＰ－４３のＨＡタグ核局在化シグナル欠損変異体、ＨＡ－ΔＮＬＳＴＤＰ－４３で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、条件培地をドナー細胞から回収し、１，０００ｇで１０分間遠心分離して、浮遊細胞デブリを培地から除去した。清澄な条件培地を、３０ｕｇ／ｍｌの各個々のＴＤＰ－４３ミスフォールディング特異的抗体または対照マウスＩｇＧ１（Ｂｉｏｇｅｎ社）で、室温で１時間、一定に回転させながらインキュベートした後、それにナイーブレシピエントＨＥＫ２９３細胞を加えた。試験した抗体には、ＴＤＰ－４３のＮ末端エピトープに対する３つのマウスモノクローナル抗体（３Ｆ１１、２Ｆ７、３Ｅ８）および立体構造ＲＲＭ１エピトープ（ＷＯ２０１８／２１８３５２として発表されているＰＣＴ ＣＡ／２０１８／０５０６３４）に対する抗体（９Ｃ５）が含まれた。インキュベーションの４８時間後、レシピエント細胞培地を除去し、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、２％ＳＤＳに溶解した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイを使用して測定した。２５ｕｇのライセートを１０％ＮｕＰａｇｅゲル（Ｔｈｅｒｍｏ社）上で分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移し、次いで、ＨＡタグ（Ａｂｃａｍ社、ウサギ、１：１０００）またはローディング対照としてのＧＡＰＤＨ（Ｔｈｅｒｍｏ社、マウス、１：５０Ｋ）に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。ＨＡおよびＧＡＰＤＨ免疫反応性をＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで検出し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂを使用して強度を定量化した。

【0210】

ＨＡ－ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３でトランスフェクトしたドナー細胞は、多量のＨＡタグＴＤＰ－４３を含有していた。対照マウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１）で処置したドナー細胞上清でインキュベートしたナイーブレシピエント細胞は、検出可能な量のＨＡタグＴＤＰ－４３を含有しており、ＨＡ－ｄＮＬＳ－ＴＤＰ－４３タンパク質のミスフォールド凝集体が、ドナー細胞からレシピエント細胞へと細胞外伝播したことが示された。ミスフォールディング特異的ＴＤＰ－４３抗体で前処置したドナー細胞上清でインキュベートしたレシピエント細胞は、比較的少ない量のＨＡタグＴＤＰ－４３を含有しており、抗体による伝播の阻害が示された。陰性対照として、非トランスフェクトドナー細胞由来の上清でインキュベートしたレシピエント細胞は、検出可能なＨＡタグＴＤＰ－４３を全く含有していなかった。各抗体に関して、ＨＡタグシグナルをＧＡＰＤＨシグナルに対して最初に正規化し（ＨＡ強度／ＧＡＰＤＨ強度）、試験抗体に関して得られた値を、対照ｍＩｇＧ１で得られた値で割った。対照ｍＩｇＧ１と比較して、試験した総ての抗体は、ドナー細胞上清からミスフォールドＨＡ－ｄＮＬＳ－ＴＤＰ－４３の伝播を阻害し、レシピエント細胞における低レベルのＨＡタグＴＤＰ－４３をもたらした。

【0211】

実施例１２
ベクター生成
ミスフォールドＴＤＰ－４３に対する抗体からの短い重鎖可変領域を使用して、様々な単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）イントラボディ構築物を設計した。ミスフォールドＴＤＰ－４３のＤＡＧＷＧＮＬ（配列番号１）との関連で少なくともＷ６８を含んでなるエピトープに結合する抗体２Ｆ７、１Ｈ３－１Ｋ３、２８Ｈ３－２８Ｋ１、および１４Ｈ１－１４Ｋ２からの可変重鎖（Ｖ_Ｈ）領域および可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）領域を、様々なアミノ酸リンカーを使用して連結した。Ｖ_Ｈ－リンカー－Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ－リンカー－Ｖ_Ｈのいずれかの一般的配列でｓｃＦｖペプチドを構築した。イントラボディの発現および局在を検出するために、ＦＬＡＧまたはＭＹＣタグ領域をｓｃＦｖに連結した、実施例１３。リソソームターゲティング領域ＹＰＴＬもまた、いくつかのイントラボディのｓｃＦｖペプチドに連結した。

【0212】

２Ｆ７、１Ｈ３－１Ｋ３、２８Ｈ３－２８Ｋ１、および１４Ｈ１－１４Ｋ２の構築を本明細書に記載する。

【0213】

以下の構造を有する抗体のそれぞれについて、６つの異なるタイプの単鎖抗体構築物を生成した：
（ａ）ＦＬＡＧタグ－Ｖ_Ｈ－（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー－Ｖ_Ｌ－Ｇ_４Ｓリンカー－リソソームターゲティングタグ構築物；
（ｂ）Ｖ_Ｈ－（Ｇ_４Ｓ）３リンカー－Ｖ_Ｌ－ＦＬＡＧタグ－ＹＰＴＬ構築物；
（ｃ）１５アミノ酸リンカー－ＭＹＣタグ構築物を介してＶ_Ｈに連結されたＶ_Ｌ；
（ｄ）１５アミノ酸リンカー－ＭＹＣタグ構築物を介してＶ_Ｌに連結されたＶ_Ｈ；
（ｅ）２０アミノ酸リンカー－ＭＹＣタグ構築物を介してＶ_Ｈに連結されたＶ_Ｌ；および
（ｆ）２０アミノ酸リンカー－ＭＹＣタグ構築物を介してＶ_Ｌに連結されたＶ_Ｈ。

【0214】

各ｓｃＦｖ構築物のポリヌクレオチド配列を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）またはｐｃＤＮＡ３．１（－）などの発現プラスミドにクローニングすることによって、ＴＤＰ－４３ ＳｃＦｖベクター構築物を生成した。

【0215】

ベクターおよびｓｃＦｖインサートをＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素によって消化した。酵素消化後、ベクターとインサートをＴ４ポリメラーゼによって連結した。１～２ｕＬのライゲーション反応物をＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換した。個々の細菌のコロニーを採取し、ＤＮＡ精製のために一晩培養物を増殖させた。ＤＮＡ精製後、精製したＤＮＡのＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの診断用の制限消化を行った。最終プラスミドを配列決定した。

【0216】

ａ）Ｎ末端ＦＬＡＧタグリソソーム構築物
グループａ）リソソームターゲティングタグを含んでなるｓｃＦｖ構築物は、ＬＹＳ－２Ｆ７、ＬＹＳ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＬＹＳ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＬＹＳ－１４Ｈ１－１４Ｋ２と特定されている。リソソームターゲティング構築物ＬＹＳ－２Ｆ７、ＬＹＳ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＬＹＳ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＬＹＳ－１４Ｈ１－１４Ｋ２のアミノ酸およびポリヌクレオチドの配列を以下の表９に示す。ＬＹＳ－２Ｆ７、ＬＹＳ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＬＹＳ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＬＹＳ－１４Ｈ１－１４Ｋ２のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域はそれぞれ、抗体２Ｆ７、１Ｈ３－１Ｋ３、２８Ｈ３－２８Ｋ１、および１４Ｈ１－１４Ｋ２からの対応するＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域に基づいている。

【0217】

【表9】

【0218】

【0219】

ｂ）Ｃ末端ＦＬＡＧ ＹＰＴＬ構築物
グループｂ）構築物を含んでなるＹＰＴＬは、ＹＰＴＬ－２Ｆ７、ＹＰＴＬ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＹＰＴＬ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＹＰＴＬ－１４Ｈ１－１４Ｋ２と特定されている。構築物ＹＰＴＬ－２Ｆ７、ＹＰＴＬ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＹＰＴＬ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＹＰＴＬ－１４Ｈ１－１４Ｋ２のアミノ酸およびポリヌクレオチドの配列を以下の表１０に示す。ＹＰＴＬ－２Ｆ７、ＹＰＴＬ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＹＰＴＬ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＹＰＴＬ－１４Ｈ１－１４Ｋ２のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域はそれぞれ、抗体２Ｆ７、１Ｈ３－１Ｋ３、２８Ｈ３－２８Ｋ１、および１４Ｈ１－１４Ｋ２からの対応するＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域に基づいている。

【0220】

【表10】

【0221】

【0222】

ｃ）Ｖ _Ｌ が１５アミノ酸リンカーを介してＶ _Ｈ に連結されたＣ末端ＭＹＣタグ構築物：
Ｖ_Ｌが１５アミノ酸リンカーを介してＶ_Ｈに連結されたＭＹＣタグ構築物は、ＭＹＣＬ１５Ｈ－２Ｆ７、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＬ１５Ｈ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＭＹＣＬ１５Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２である。これらの構築物は、Ｖ_Ｌ－１５アミノ酸ＳｃＦｖリンカー配列－Ｖ_Ｈ－３アミノ酸ＭＹＣリンカー配列－ＭＹＣタグの一般的な配列を有する。構築物ＭＹＣＬ１５Ｈ－２Ｆ７、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＬ１５Ｈ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＭＹＣＬ１５Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２のアミノ酸およびポリヌクレオチドの配列を以下の表１１に示す。ＭＹＣＬ１５Ｈ－２Ｆ７、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＬ１５Ｈ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＭＹＣＬ１５Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域はそれぞれ、抗体２Ｆ７、１Ｈ３－１Ｋ３、２８Ｈ３－２８Ｋ１、および１４Ｈ１－１４Ｋ２からの対応するＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域に基づいている。

【0223】

【表11】

【0224】

【0225】

ｄ）Ｖ _Ｈ が１５アミノ酸リンカーを介してＶ _Ｌ に連結されたＭＹＣ構築物
Ｖ_Ｈが１５アミノ酸リンカーを介してＶ_Ｌに連結されたＭＹＣ構築物は、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２Ｆ７、ＭＹＣＨ１５Ｌ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＭＹＣＨ１５Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２である。これらの構築物は総て、Ｖ_Ｈ－１５アミノ酸ＳｃＦｖリンカー配列－Ｖ_Ｌ－３アミノ酸ＭＹＣリンカー配列－ＭＹＣタグの一般的な配列を有する。構築物ＭＹＣＨ１５Ｌ－２Ｆ７、ＭＹＣＨ１５Ｌ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＭＹＣＨ１５Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２のアミノ酸およびポリヌクレオチドの配列を以下の表１２に示す。ＭＹＣＨ１５Ｌ－２Ｆ７、ＭＹＣＨ１５Ｌ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＭＹＣＨ１５Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域はそれぞれ、抗体２Ｆ７、１Ｈ３－１Ｋ３、２８Ｈ３－２８Ｋ１、および１４Ｈ１－１４Ｋ２からの対応するＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域に基づいている。

【0226】

【表12】

【0227】

【0228】

ｅ）Ｖ _Ｌ が２０アミノ酸リンカーを介してＶ _Ｈ に連結されたＭＹＣ構築物：
各抗体のＶＨおよびＶＬ領域を最適化し、合成した。各ｓｃＦｖフラグメントをＶＨおよびＶＬ鋳型から増幅し、同時に、１５ａａリンカーを付加した。ＰＣＲ精製後、シームレスライゲーションプロトコールによりｓｃＦｖフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。

【0229】

Ｖ_Ｈが１５アミノ酸リンカーを介してＶ_Ｌに連結されたＭＹＣ構築物は、ＭＹＣＬ２０Ｈ－２Ｆ７、ＭＹＣＬ２０Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＬ２０Ｈ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＭＹＣＬ２０Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２である。これらの構築物は総て、Ｖ_Ｌ－２０アミノ酸ＳｃＦｖリンカー配列－Ｖ_Ｈ－３アミノ酸ＭＹＣリンカー配列－ＭＹＣタグの一般的な配列を有する。構築物ＭＹＣＬ２０Ｈ－２Ｆ７、ＭＹＣＬ２０Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＬ２０Ｈ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＭＹＣＬ２０Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２のアミノ酸およびポリヌクレオチドの配列を以下の表１３に示す。ＭＹＣＬ２０Ｈ－２Ｆ７、ＭＹＣＬ２０Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＬ２０Ｈ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＭＹＣＬ２０Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域はそれぞれ、抗体２Ｆ７、１Ｈ３－１Ｋ３、２８Ｈ３－２８Ｋ１、および１４Ｈ１－１４Ｋ２からの対応するＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域に基づいている。

【0230】

【表13】

【0231】

【0232】

ｆ）Ｖ _Ｈ が２０アミノ酸リンカーを介してＶ _Ｌ に連結されたＭＹＣ構築物：
各抗体のＶＨおよびＶＬ領域を最適化し、合成した。各ｓｃＦｖフラグメントをＶＨおよびＶＬ鋳型から増幅し、同時に、２０ａａリンカーを付加した。ＰＣＲ精製後、シームレスライゲーションプロトコールによりｓｃＦｖフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。

【0233】

Ｖ_Ｈが２０アミノ酸リンカーを介してＶ_Ｌに連結されたＭＹＣ構築物は、ＭＹＣＨ２０Ｌ－２Ｆ７、ＭＹＣＨ２０Ｌ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＨ２０Ｌ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＭＹＣＨ２０Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２である。これらの構築物は総て、Ｖ_Ｈ－２０アミノ酸ＳｃＦｖリンカー配列－Ｖ_Ｌ－３アミノ酸ＭＹＣリンカー配列－ＭＹＣタグの一般的な配列を有する。構築物、ＭＹＣＨ２０Ｌ－２Ｆ７、ＭＹＣＨ２０Ｌ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＨ２０Ｌ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＭＹＣＨ２０Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２のアミノ酸およびポリヌクレオチドの配列を以下の表１４に示す。ＭＹＣＨ２０Ｌ－２Ｆ７、ＭＹＣＨ２０Ｌ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＨ２０Ｌ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＭＹＣＨ２０Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域はそれぞれ、抗体２Ｆ７、１Ｈ３－１Ｋ３、２８Ｈ３－２８Ｋ１、および１４Ｈ１－１４Ｋ２からの対応するＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域に基づいている。

【0234】

【表14】

【0235】

【0236】

ｓｃＦｖベクター構築物は、実施例１３に記載するように、トランスフェクションおよび発現研究のために使用した。

【0237】

実施例１３
免疫細胞化学および共局在
以下に記載する方法を使用して、ｄＮＬＳＴＤＰ－４３を含むまたは含まないＨＥＫ２９３細胞で様々な構築物を発現させた。免疫細胞化学および共局在分析も以下に記載するように行った。

【0238】

ＬＹＳ－２Ｆ７、ＬＹＳ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＬＹＳ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＬＹＳ－１４Ｈ１－１４Ｋ２ＴＤＰ－４３イントラボディは、トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞においてｄＮＬＳＴＤＰ－４３の細胞質凝集体と相互作用する（図１～４）。これらのイントラボディはどれも核内の内因性野生型ＴＤＰ４３との認識できる相互作用を示さない。ＴＤＰ４３イントラボディの過剰発現は、細胞の生存能力に影響を与えず、これらが本質的な正常なＴＤＰ４３の機能を妨げないことを示している。

【0239】

同様に、ＹＰＴＬ－２Ｆ７、ＹＰＴＬ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＹＰＴＬ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＹＰＴＬ－１４Ｈ１－１４Ｋ２ＴＤＰ－４３イントラボディの過剰発現は、ＨＥＫ２９３細胞の生存能力に影響を与えず、これらのイントラボディが正常なＴＤＰ４３の本質的な機能を妨げないことを示している（図５～８）。ＹＰＴＬ－２Ｆ７、ＹＰＴＬ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＹＰＴＬ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＹＰＴＬ－１４Ｈ１－１４Ｋ２は総て、凝集した細胞質ｄＮＬＳ－ＴＤＰ－４３と強い相互作用を示すが、正常な核ＴＤＰ－４３とは示さない（図５～８）。

【0240】

過剰発現されたＭＹＣＬ１５Ｈ－２Ｆ７、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２Ｆ７、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２、およびＭＹＣＨ１５Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２ＴＤＰ－４３イントラボディは、ミスフォールドＴＤＰ４３細胞質凝集体と共局在する（図９、１０、１２、１４、１５および１６）。これらのイントラボディはどれも核内の内因性野生型ＴＤＰ４３との認識できる相互作用を示さない。ＭＹＣＬ１５Ｈ－２Ｆ７、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２Ｆ７、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２、およびＭＹＣＨ１５Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２は総て、凝集した細胞質ｄＮＬＳ－ＴＤＰ－４３と強い相互作用を示す（図９、１０、１２、１４、１５および１６）。

【0241】

過剰発現されたＭＹＣＬ２０Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、およびＭＹＣＬ２０Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２ＴＤＰ－４３イントラボディは、ミスフォールドＴＤＰ４３細胞質凝集体と共局在する（図１３および１７）。ＭＹＣＬ２０Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、およびＭＹＣＬ２０Ｈ－１４Ｈ１－１４Ｋ２ＴＤＰ－４３は、凝集した細胞質ｄＮＬＳ－ＴＤＰ－４３と強い相互作用を示すが、正常な核ＴＤＰ－４３とは示さない（図１３および１７）。

【0242】

過剰発現されたＭＹＣＨ２０Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２ＴＤＰ－４３イントラボディは、ミスフォールドＴＤＰ４３細胞質凝集体と共局在する（図１８）。ＭＹＣＨ２０Ｌ－２Ｆ７はより低い発現を示した（図１１）。イントラボディはどれも核内の内因性野生型ＴＤＰ４３との認識できる相互作用を示さない。

【0243】

ｄＮＬＳ－ＴＤＰ－４３の分解
ｄＮＬＳ－ＴＤＰ－４３分解に対するイントラボディ発現の効果を、以下に記載するように評価した。

【0244】

この結果は、ＬＹＳ－２Ｆ７、ＬＹＳ－２８Ｈ３－２８Ｋ１、およびＬＹＳ－１４Ｈ１－１４Ｋ２、ＹＰＴＬ－１４Ｈ１－１４Ｋ２、ＭＹＣＨ１５Ｌ－２Ｆ７、ＭＹＣＬ１５Ｈ－１Ｈ３－１Ｋ３、およびＭＹＣＨ２０Ｌ－１４Ｈ１－１４Ｋ２イントラボディがｄＮＬＳＴＤＰ－４３分解を促進することを示している（図１９、２０、および２１）。

【0245】

材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胎児腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州）から購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）^－１（２ｍＭ）および抗生物質（５０Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中５％ＣＯ_２、３７℃にて維持した。

【0246】

機能的核局在化シグナル（ＮＬＳ）を欠くＴＤＰ４３の突然変異体であるＨＡタグ付きｄＮＬＳＴＤＰ－４３を、個々のＴＤＰ４３単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）プラスミドまたは対照空ベクター（ＥＶ）と１：５比で、製造業者の説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。

【0247】

ｄＮＬＳＴＤＰ－４３によるＴＤＰ４３イントラボディの検出のための免疫細胞化学
トランスフェクションの７２時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％ＰＦＡに室温にて１５分間固定し、続いて、２０ｍＭグリシンで室温にて１０分間、絶えず揺動しながら洗浄を行って、残留するＰＦＡをクエンチした。次に、細胞をＰＢＳ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０％正常ヤギ血清、および０．１％トリトン－Ｘ－１００を含むブロッキングバッファーとともに室温にて３０分間培養した後、一次抗体を添加した。ＬＹＳおよびＹＰＴＬ ＴＤＰ４３イントラボディとｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３との相互作用を調べるため、マウスモノクローナル抗Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ミズーリ州、米国、Ｆ１８０４、１：２０００）をＴＤＰ４３ ｓｃＦｖ構築物発現の検出用に使用し、ウサギポリクローナル抗ＨＡ（Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、イギリス、ａｂ９１１０、１：１０００）をｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３用に使用した。Ｍｙｃ ＴＤＰ４３イントラボディとｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３との相互作用を調べるために、ウサギポリクローナル抗ｃ－Ｍｙｃ（Ａｂｃａｍ社、ａｂ９１０６、１：１０００）をｓｃＦｖ発現の検出用に使用し、ラットモノクローナル抗ＨＡ（Ｓｉｇｍａ社、１：２０００）をｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３用に使用した。一次抗体を２時間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳ／０．１％トリトン－Ｘ－１００（ＰＢＳＴ）で１０分間×３回、絶えず揺動しながら洗浄し、続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ヤギ抗ウサギ、抗マウス、または抗ラット二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１：１０００）とともに暗所にて室温で３０分間インキュベーションを行った。次に、細胞をＰＢＳＴで１０分間×３回洗浄し、５％ＰＢＳに浸漬し、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉ－ｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、Ｐ３６９３１）を用いて取り付けた。細胞を共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社ＴＣＳ ＳＰ８ ＭＰ、ウェッツラー、ドイツ）によって分析した。

【0248】

ウエスタンブロッティングおよび分解の定量
トランスフェクションの７２時間後、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、２％ＳＤＳに溶解し、続いて、３０％の出力で１５秒間超音波処理を行って、総タンパク質を抽出した。タンパク質含量をＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって決定した。１０μｇのタンパク質を４～１２％ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－ＴｒｉｓＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、５％脱脂粉乳および０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で室温にて１時間ブロッキングした。以下の一次抗体を４℃にて一晩インキュベートした：ＬＹＳおよびＹＰＴＬ構築物用のウサギモノクローナル抗Ｆｌａｇ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ダンバーズ、マサチューセッツ州、米国、１４７９３５、１：２０００）および、ＭＹＣタグ付き構築物ＴＤＰ－４３ ｓｃＦｖ発現検出用のウサギ抗ｃ－Ｍｙｃ（Ａｂｃａｍ社、１：５００）、ｄＮＬＳＴＤＰ－４３検出用のウサギ抗ＨＡ（Ａｂｃａｍ社、１：４０００）、ならびにローディング対照用のマウス抗β－アクチン（ａｂｍ社、リッチモンド、ブリティッシュコロンビア州、カナダ、Ｇ０４３、１：１０００）。次いで、メンブレンをＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）で室温にて１０分間×３回、絶えず揺動しながら洗浄し、続いて、室温にて３０分間、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウス（Ｓｉｇｍａ社、１：５０００）またはロバ抗ウサギ二次抗体（Ｓｉｇｍａ社、ＡＰ１８２Ｐ、１：５０００）のインキュベーションを行った。次いで、メンブレンをＴＢＳＴで１０分間×３回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて発光させた。画像は、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）で撮影した。

【0249】

ウエスタンブロットバンドの強度を測定するためにＩｍａｇｅＪを使用した。ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３分解に対するＴＤＰ４３ ｓｃＦｖイントラボディの効果を定量するために、各トランスフェクション条件の対応するβ－アクチンによりＨＡ強度を最初に正規化した。次いで、各ｄＮＬＳ－ＴＤＰ４３／ｓｃＦｖ共トランスフェクションの正規化ＨＡ強度を「ｄＮＬＳ＋ＥＶ」対照と比較した。

【0250】

好ましい実施例であると現在考えられているものを参照して本出願を説明したが、本出願は開示された実施例に限定されないと理解されるべきである。反対に、本出願は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる種々の改変および均等な構成を網羅することを意図するものである。

【0251】

総ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされると具体的かつ個別に示された場合と同程度に、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。具体的には、例えば、表または他所に示されるアクセッション番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含む、本明細書において示される各アクセッション番号に関連した配列は、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。

【0252】

特許請求の範囲は、好ましい実施形態および実施例により限定されてはならないが、全体として明細書と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。

【0253】

明細書において言及された参照文献の引用

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

2023523066000001.app

【国際調査報告】