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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-02
(54)【発明の名称】ヒト化ＣＸＣＬ１３遺伝子を有する非ヒト動物
(51)【国際特許分類】
A01K 67/027 20060101AFI20230526BHJP
C12N 15/90 20060101ALI20230526BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230526BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230526BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230526BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20230526BHJP
C12Q 1/06 20060101ALN20230526BHJP
【ＦＩ】
A01K67/027 ZNA
C12N15/90 100Z
C12N15/90 104Z
C12N15/12
C12N15/11 Z
C12N5/10
G01N33/48 N
C12Q1/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022562072
(86)(22)【出願日】2021-04-20
(85)【翻訳文提出日】2022-10-11
(86)【国際出願番号】 US2021028087
(87)【国際公開番号】W WO2021216505
(87)【国際公開日】2021-10-28
(31)【優先権主張番号】63/013,148
(32)【優先日】2020-04-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】597160510
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】フルレタ， ダヴォル
(72)【発明者】
【氏名】トゥ， ナシン
(72)【発明者】
【氏名】グリンドリー， ジャスティン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045AA29
2G045CB01
2G045CB17
4B063QA05
4B063QR72
4B063QR77
4B063QX01
4B065AA91X
4B065AA91Y
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA46
(57)【要約】
本明細書において、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含むように遺伝子改変された齧歯類（マウスおよびラットなどであるがこれらに限定されない）が開示される。本明細書に開示される齧歯類は、慢性リンパ性白血病細胞などのヒト細胞のより良好な生着および増殖を支持することが示されている。かかる遺伝子改変齧歯類を作製するための組成物および方法、ならびに候補治療薬剤（例えば、候補抗癌剤）を試験するためのかかる遺伝子改変齧歯類を使用する方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
齧歯類Ｃｘｃｌ１３核酸配列とヒトＣＸＣＬ１３核酸配列とを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を、ゲノムに含む遺伝子改変齧歯類動物であって、前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８様ドメインと実質的に同一であるケモカインＩＬ－８様ドメインを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３ポリペプチドをコードする、遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項2】
前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３ポリペプチドが、前記ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と実質的に同一である成熟タンパク質配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項3】
前記ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項4】
前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質が、齧歯類シグナルペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項5】
前記齧歯類シグナルペプチドが、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質のシグナルペプチドである、請求項４に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項6】
前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列が、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～４を含む、請求項１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項7】
前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列が、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３と、エクソン４と、エクソン５のコード部分とを含む、請求項１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項8】
前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列が、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３と、エクソン４と、エクソン５とを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項9】
前記齧歯類Ｃｘｃｌ１３核酸配列が、齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン１を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項10】
前記齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、内因性Ｃｘｃｌ１３遺伝子である、請求項９に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項11】
前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン１、およびヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～５を含む、請求項１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項12】
前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、齧歯類Ｃｘｃｌ１３プロモーターに作動可能に連結される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項13】
前記齧歯類Ｃｘｃｌ１３プロモーターが、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位の内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３プロモーターである、請求項１２に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項14】
前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位に位置する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項15】
前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位での齧歯類Ｃｘｃｌ１３ゲノムＤＮＡの前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸との置換の結果として形成される、請求項１４に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項16】
前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、前記内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位における前記齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン２～３と、エクソン４のコード部分とを含む齧歯類ゲノムＤＮＡの、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～５との置換の結果として形成される、請求項１４に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項17】
前記齧歯類が、前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子に対してホモ接合性である、請求項１～１６のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項18】
内因性齧歯類Ｓｉｒｐα座位にヒト化Ｓｉｒｐα遺伝子を、内因性齧歯類Ｂａｆｆ座位にヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を、内因性齧歯類Ａｐｒｉｌ座位にヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子を、内因性齧歯類ＩＬ－６座位にヒト化ＩＬ－６遺伝子を、またはそれらの組み合わせを、ゲノムにさらに含む、請求項１～１７のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項19】
ＲＡＧ２遺伝子およびＩＬ－２ＲＧ遺伝子が破壊されている、請求項１～１８のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項20】
前記齧歯類が、マウスまたはラットである、請求項１～１９のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項21】
ゲノムが齧歯類Ｃｘｃｌ１３核酸配列とヒトＣＸＣＬ１３核酸配列とを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含み、前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８様ドメインと実質的に同一であるケモカインＩＬ－８様ドメインを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３ポリペプチドをコードする、単離された齧歯類組織または細胞。
【請求項22】
前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン１、およびヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～５を含む、請求項２１に記載の単離された齧歯類組織または細胞。
【請求項23】
前記齧歯類細胞が、齧歯類胚性幹細胞である、請求項２１または２２に記載の単離された齧歯類組織または細胞。
【請求項24】
前記齧歯類が、マウスまたはラットである、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の単離された齧歯類組織または細胞。
【請求項25】
請求項２３に記載の齧歯類胚性幹細胞を含む、齧歯類胚。
【請求項26】
遺伝子改変齧歯類を作製する方法であって、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含むように齧歯類ゲノムを改変することであって、前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、齧歯類Ｃｘｃｌ１３核酸配列と、ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列とを含み、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８様ドメインと実質的に同一であるケモカインＩＬ－８様ドメインを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３ポリペプチドをコードする、改変すること、および、
前記改変された齧歯類ゲノムを含む齧歯類を作製すること、を含む、方法。
【請求項27】
前記改変することが、前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列を含む核酸分子を、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞のゲノム内に導入することと、
前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列が、齧歯類Ｃｘｃｌ１３ゲノムＤＮＡを置換するために内因性Ｃｘｃｌ１３座位内に組み込まれており、それによって前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を形成する、齧歯類ＥＳ細胞を取得することと、
前記取得された齧歯類ＥＳ細胞から齧歯類動物を生成することと、を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列が、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～４を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項29】
前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列が、前記ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と実質的に同一であるポリペプチドをコードする、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項30】
前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列が、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３と、エクソン４と、エクソン５のコード部分とを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列が、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～５を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項32】
前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、前記内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン１と、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～５とを含み、前記内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位で前記内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３プロモーターに作動可能に連結される、請求項２７に記載の方法。
【請求項33】
前記齧歯類が、マウスまたはラットである、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
標的化核酸構築物であって、齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位でヌクレオチド配列に相同である５’ヌクレオチド配列および３’ヌクレオチド配列が隣接する、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位で齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子内に組み込まれるべきヒトＣＸＣＬ１３核酸を含み、
前記齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子内への前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列の組み込みが、齧歯類Ｃｘｃｌ１３ゲノムＤＮＡの前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列との置換をもたらし、それによってヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を形成し、
前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列が、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８様ドメインと実質的に同一であるポリペプチドをコードする、標的化核酸構築物。
【請求項35】
前記ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列が、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～５を含む、請求項３４に記載の標的化核酸構築物。
【請求項36】
前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項３４または３５に記載の標的化核酸。
【請求項37】
疾患を治療するための候補薬剤を試験する方法であって、前記疾患に罹患しているヒト対象に由来する細胞を、請求項１～２０のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類動物に導入することと、
前記齧歯類動物を候補薬剤と接触させることと、
候補薬剤が前記細胞の減少または除去に有効であるかどうかを分析することと、を含む、方法。
【請求項38】
前記疾患が癌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記疾患が白血病である、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記候補薬剤が、任意選択的に小分子化合物、核酸分子、または抗体から選択される抗癌化合物である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項41】
ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含む齧歯類ゲノムであって、前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、齧歯類Ｃｘｃｌ１３核酸配列およびヒトＣＸＣＬ１３核酸配列を含み、前記ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８様ドメインと実質的に同一であるケモカインＩＬ－８様ドメインを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３ポリペプチドをコードする、齧歯類ゲノム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０１３，１４８号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
参照による配列表の援用
本出願は、２０２０年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０１３，１４８号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
参照による配列表の援用
【0002】
２０２１年４月１６日に作製され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３８３５７ＷＯ＿１０５７４ＷＯ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇという名称の１４ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの形態をとる配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
齧歯類を含む非ヒト動物は、例えばヒト造血幹細胞、または患者由来の異種移植組織もしくは細胞など、ヒト細胞のレシピエントとして使用されている。生着されたヒト細胞の生存および増殖を支持および促進する改善された非ヒト動物系が望まれ、それにより、関連する疾患の発症および治療薬の開発のより良好な理解が促進される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
齧歯類内因性Ｃｘｃｌ１３遺伝子のヒト化は、例えば慢性リンパ性白血病細胞などの、ヒト細胞のより良好な生着および増殖を支持する齧歯類動物を生じさせることが、本開示に従って確立されている。したがって、Ｃｘｃｌ１３ヒト化齧歯類動物、このような齧歯類を作製するための組成物および方法、ならびにこのような齧歯類を、候補治療薬剤（例えば、候補抗癌剤）を試験するために使用する方法が本明細書に開示される。
【0005】
一態様では、齧歯類Ｃｘｃｌ１３核酸配列とヒトＣＸＣＬ１３核酸配列とを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子をゲノムに含む遺伝子改変齧歯類動物であって、このヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子がヒト化Ｃｘｃｌ１３ポリペプチドをコードする、遺伝子改変齧歯類動物が本明細書に開示される。
【0006】
一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３ポリペプチドは、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８様ドメインと実質的に同一であるケモカインＩＬ－８様ドメインを含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３ポリペプチドは、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と実質的に同一である成熟タンパク質配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【0007】
一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３ポリペプチドは齧歯類シグナルペプチドを含む。一部のこうした実施形態では、齧歯類シグナルペプチドは、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質のシグナルペプチドである。
【0008】
一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子中のヒトＣＸＣＬ１３核酸配列は、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８様ドメインと実質的に同一であるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～４を含む。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列は、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と実質的に同一であるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３と、エクソン４と、エクソン５のコード部分とを含む。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３と、エクソン４と、エクソン５とを含む。
【0009】
一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子中の齧歯類Ｃｘｃｌ１３核酸配列は、齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン１を含む。一部の実施形態では、齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子は内因性Ｃｘｃｌ１３遺伝子である。
【0010】
一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン１と、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～５とを含む。
【0011】
一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、齧歯類Ｃｘｃｌ１３プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、齧歯類Ｃｘｃｌ１３プロモーターは、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位における内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３プロモーターである。他の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、任意選択的に内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位で、ヒトＣｘｃｌ１３プロモーターに作動可能に連結される。
【0012】
一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位以外の座位に位置する。一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位に位置し、一部のこうした実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位における齧歯類Ｃｘｃｌ１３ゲノムＤＮＡのヒトＣＸＣＬ１３核酸との置換の結果として形成されてもよい。一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位における齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン２～３と、エクソン４のコード部分とを含む齧歯類ゲノムＤＮＡの、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～５との置換の結果として形成される。
【0013】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物は、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物は、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子についてホモ接合性である。
【0014】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類のゲノムは、内因性齧歯類Ｓｉｒｐα座位にヒト化Ｓｉｒｐα遺伝子を、内因性齧歯類Ｂａｆｆ座位にヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を、内因性齧歯類Ａｐｒｉｌ座位にヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子を、内因性齧歯類ＩＬ－６座位にヒト化ＩＬ－６遺伝子を、またはそれらの組み合わせを、さらに含み得る。
【0015】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物は、ＲＡＧ２およびＩＬ－２ＲＧダブルノックアウト齧歯類などの免疫不全である。
【0016】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物は、マウスまたはラットから選択される。
【0017】
別の態様では、単離された齧歯類組織または細胞が本明細書に開示され、そのゲノムは本明細書に記載されるヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、齧歯類胚性幹細胞である。齧歯類胚性幹細胞を含む齧歯類胚も開示される。
【0018】
さらなる態様では、本明細書において、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含むように齧歯類ゲノムを改変することであって、このヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が、齧歯類Ｃｘｃｌ１３核酸配列およびヒトＣＸＣＬ１３核酸配列を含み、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８様ドメインと実質的に同一であるケモカインＩＬ－８様ドメインを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３ポリペプチドをコードする、改変することと、この改変齧歯類ゲノムを含む齧歯類を作製することと、を含む、遺伝子改変齧歯類を作製する方法が開示される。
【0019】
一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列を含む核酸分子を齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞のゲノム内に導入し、ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列が、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位で齧歯類Ｃｘｃｌ１３ゲノムＤＮＡを置換するために内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位内に組み込まれており、それによってヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を形成する齧歯類ＥＳ細胞を取得することによって、および得られた齧歯類ＥＳ細胞を使用して齧歯類動物を生成することによって、齧歯類ゲノムが改変される。
【0020】
一部の実施形態では、齧歯類ＥＳ細胞に導入されるヒトＣＸＣＬ１３核酸配列は、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８様ドメインと実質的に同一であるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～４を含む。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列は、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と実質的に同一であるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３と、エクソン４と、エクソン５のコード部分とを含む。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～５を含む。
【0021】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位で形成されるヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン１と、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～５とを含み、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位で内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３プロモーターに作動可能に連結される。
【0022】
別の態様では、遺伝子改変動物を作製するのに有用である標的化核酸構築物が開示される。標的化構築物は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位のヌクレオチド配列と相同な５’ヌクレオチド配列と３’ヌクレオチド配列とに隣接する、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位で齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子に組み込まれるべきヒトＣＸＣＬ１３核酸配列を含んでもよく、ここで内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子へのヒトＣＸＣＬ１３核酸配列の組み込みは、齧歯類Ｃｘｃｌ１３ゲノムＤＮＡのヒトＣＸＣＬ１３核酸配列との置換をもたらし、それによってヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を形成する。一部の実施形態では、標的化構築物のヒトＣＸＣＬ１３核酸配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～４を含む。一部の実施形態では、標的化構築物のヒトＣＸＣＬ１３核酸配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３と、エクソン４と、エクソン５のコード部分とを含む。一部の実施形態では、標的化構築物のヒトＣＸＣＬ１３核酸配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～５を含む。
【0023】
さらに別の態様では、疾患を治療するための候補薬剤を試験するための方法が開示される。方法は、疾患に罹患しているヒト対象に由来する細胞を、本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類動物に導入すること、齧歯類動物を候補薬剤と接触させること、および候補薬剤が細胞の減少または除去に有効であるかどうかを分析することを含む。齧歯類からの細胞の減少または除去に有効な候補薬剤は、疾患の治療に有用であると考えられる。
【0024】
一部の実施形態では、疾患は、癌、例えば、固形腫瘍または血液癌である。一部の実施形態では、疾患は白血病である。
【0025】
一部の実施形態では、候補薬剤は、任意選択的に小分子化合物、核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）、または抗体から選択される抗癌化合物である。
［図面の簡単な説明］
［図面の簡単な説明］
【0026】
本明細書において援用され、かつ本明細書の一部を成す添付の図面は、いくつかの実施形態を例証し、説明と共に、本開示の組成物および方法を例証する。
【0027】
別段の示唆が無い限り、図は、ヒトエクソン配列には中空のボックス、マウスエクソン配列には閉じたボックス、マウスイントロンには一本線、ヒトイントロンには二重線、選択カセットにはテキストを含む中空のボックス（例えば、Ｌｏｘｐ）を使用する。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1A】図１Ａは、マウスＣｘｃｌ１３座位のヒト化のための例示的な戦略を示す。マウスエクソン２～３（これはマウスＣｘｃｌ１３ケモカインドメインをコードする）およびマウスエクソン４のコード部分を含む、内因性マウスＣｘｃｌ１３座位の連続マウスＣｘｃｌ１３ゲノム断片は、ヒトＣＸＣＬ１３エクソン３～４（ヒトＣＸＣＬ１３ケモカインドメインをコードする）と、ヒトＣＸＣＬ１３エクソン５（ヒトＣＸＣＬ１３の３’ＵＴＲをエクソン５の一部として含む）とを含むヒトＣＸＣＬ１３ゲノム断片によって置換される。置換は、内因性マウスＣｘｃｌ１３座位でヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を結果として生じさせ、これはマウスネイティブＣｘｃｌ１３プロモーターを含み、マウスＣｘｃｌ１３エクソン１およびヒトＣＸＣＬ１３エクソン３～５（ヒトＣＸＣＬ１３ ３’ＵＴＲを含む）に作動可能に連結し、マウスＣｘｃｌ１３の３’ＵＴＲが続く。ヒト化に使用されるヒトＣＸＣＬ１３ゲノム断片は、選択カセット（例えば、ユビキチンプロモーターの制御下にあるハイグロマイシン耐性遺伝子、ＬｏｘＰ部位に隣接する）を含んで、正しく標的化されたクローンのスクリーニングを容易にすることができる。
【0029】
【0030】
【0031】
【図1F】図１Ｆは、マウスＣｘｃｌ１３（配列番号４）、ヒトＣＸＣＬ１３（配列番号２）、およびヒト化（ハイブリッド）Ｃｘｃｌ１３（配列番号８）タンパク質配列のアラインメントを示す。タンパク質のシグナルペプチドおよびケモカインＩＬ－８－様ドメインは、ボックスで示されている。ケモカインＩＬ－８－様ドメイン内の二つのＮ末端システインは、矢印で示されている。三角形は、イントロンがどこにあるか（位置およびサイズ、上部でマウスおよび下部でヒト）を表し、ケモカインＩＬ－８－様ドメインが、第二および第三のコードエクソン（マウスＣｘｃｌ１３のエクソン２～３またはヒトＣＸＣＬ１３のエクソン３～４）によってコードされることを図示している。
【0032】
【0033】
【発明を実施するための形態】
【0034】
本明細書において、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含むように遺伝子改変された齧歯類（マウスおよびラットなどであるがこれらに限定されない）が開示される。本明細書に開示される齧歯類は、慢性リンパ性白血病細胞などのヒト細胞のより良好な生着および増殖を支持することが示されている。かかる遺伝子改変齧歯類を作製するための組成物および方法、ならびに候補治療薬剤（例えば、候補抗癌剤）を試験するためにかかる遺伝子改変齧歯類を使用する方法が提供され、さらに以下に記載される。
【0035】
ＣＸＣＬ１３遺伝子
Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）は、Ｂリンパ球ケモアトラクタント（ＢＬＣ）またはＢ細胞誘引性ケモカイン１（ＢＣＡ－１）としても知られ、ＣＸＣケモカインファミリーに属するタンパク質リガンドである。ＣＸＣケモカインの二つのＮ末端システインは、一つのアミノ酸によって分離され、「Ｘ」を有するこの名称で表される。
Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）は、Ｂリンパ球ケモアトラクタント（ＢＬＣ）またはＢ細胞誘引性ケモカイン１（ＢＣＡ－１）としても知られ、ＣＸＣケモカインファミリーに属するタンパク質リガンドである。ＣＸＣケモカインの二つのＮ末端システインは、一つのアミノ酸によって分離され、「Ｘ」を有するこの名称で表される。
【0036】
ＣＸＣＬ１３は、Ｂ細胞および濾胞性ＢヘルパーＴ細胞（またはＴＦＨ細胞）に対して選択的に走化性であり、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ５と相互作用することによってその効果を誘発する。ＣＸＣＬ１３は、肝臓、脾臓、リンパ節、およびパイエル板に強く発現し、Ｂ細胞活性化、クラス切り替え、および体細胞超変異のために、胚中心にＢ細胞およびＴＦＨ細胞を引き付けるための重要なケモカインであると考えられる。
【0037】
ヒトＣＸＣＬ１３、マウスＣｘｃｌ１３、およびラットＣｘｃｌ１３の核酸配列およびタンパク質配列、ならびに例示的なヒト化Ｃｘｃｌ１３の核酸配列およびタンパク質配列を含む例示的な配列が、配列表に開示され、表１に要約される。ヒトＣＸＣＬ１３、マウスＣｘｃｌ１３、およびヒト化（ハイブリッド）Ｃｘｃｌ１３タンパク質配列のアラインメントを図１Ｆに提供する。
【表1-1】
【表1-2】
【0038】
Ｃｘｃｌ１３ヒト化齧歯類
本明細書に開示される齧歯類は、生殖系列にヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含む。
本明細書に開示される齧歯類は、生殖系列にヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含む。
【0039】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のヌクレオチド配列とヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のヌクレオチド配列とをゲノムに含むヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を、含む。本明細書において使用される場合、「遺伝子のヌクレオチド配列」は、遺伝子の全部または一部のゲノム配列、ｍＲＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列を含む。例えば、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子の全部または一部のゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、またはｃＤＮＡ配列であってもよく、齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のヌクレオチド配列は、齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子（例えば、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子）の全部または一部のゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、またはｃＤＮＡ配列であってもよい。齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のヌクレオチド配列とヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のヌクレオチド配列とは、互いに作動可能に連結され、その結果、齧歯類ゲノム中のヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、保存されたタンパク質構造をヒトＣＸＣＬ１３および齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質と共有するヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質をコードし、すなわち、シグナルペプチドと、Ｎ末端Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフを有するケモカインＩＬ－８－様ドメインを含む成熟タンパク質とからなる。
【0040】
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類はヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子をゲノムに含み、このヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインと実質的に同一であるケモカインＩＬ－８－様ドメインを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質をコードする。
【0041】
一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインと実質的に同一であるケモカインＩＬ－８－様ドメインは、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインと少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるポリペプチドである。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインと実質的に同一であるケモカインＩＬ－８－様ドメインは、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインと３個、２個、または１個以下のアミノ酸だけ異なるポリペプチドである。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインと実質的に同一であるケモカインＩＬ－８－様ドメインは、ドメインのＮまたはＣ末端部分のみでヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインとは異なる、例えば、アミノ酸の追加、欠失、または置換を有するが、ドメインのＮまたはＣ末端部分で３個、２個、または１個以下のアミノ酸だけ異なる、ポリペプチドである。「ドメインのＮまたはＣ末端部分」とは、ドメインのＮまたはＣ末端からアミノ酸５個以内を意味する。
【0042】
一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインは、配列番号２のアミノ酸３０～９１を含む。したがって、一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類はヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子をゲノムに含み、これは、配列番号２のアミノ酸３０～９１に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一であるケモカインＩＬ－８－様ドメインを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質をコードする。特定の実施形態では、遺伝子改変齧歯類はヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子をゲノムに含み、これは、そのアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸３０～９１に記載されるケモカインＩＬ－８－様ドメインを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質をコードする。
【0043】
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類はヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子をゲノムに含み、このヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と実質的に同一である成熟タンパク質配列を含むヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質をコードする。
【0044】
一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と実質的に同一である成熟タンパク質配列は、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるポリペプチド配列である。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と実質的に同一である成熟タンパク質配列は、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と、３個、２個、または１個以下のアミノ酸だけ異なるポリペプチド配列である。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と実質的に同一である成熟タンパク質配列は、ドメインのＮまたはＣ末端部分のみでヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列とは異なる、例えば、アミノ酸の追加、欠失、または置換を有するが、成熟タンパク質のＮまたはＣ末端部分で３個、２個、または１個以下のアミノ酸だけ異なる、ポリペプチドである。「成熟タンパク質のＮまたはＣ末端部分」とは、成熟タンパク質のＮまたはＣ末端からアミノ酸５個以内を意味する。
【0045】
一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列は、配列番号２のアミノ酸２３～１０９を含む。したがって、一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類はヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子をゲノムに含み、これは、配列番号２のアミノ酸２３～１０９に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一である成熟タンパク質配列を含むヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質をコードする。特定の実施形態では、遺伝子改変齧歯類はヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子をゲノムに含み、これは、配列番号２のアミノ酸２３～１０９に記載される成熟タンパク質配列を含むヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質をコードする。
【0046】
一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のシグナルペプチドと実質的に同一であるシグナルペプチドを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質をコードする。例えば、ヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質は、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のシグナルペプチドと配列が少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるシグナルペプチド、またはヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のシグナルペプチドと３個、２個、もしくは１個以下のアミノ酸だけ異なるシグナルペプチドを含んでもよい。特定の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のシグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸１～２２に記載されるアミノ酸配列を含む。
【0047】
一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質などの、齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質のシグナルペプチドと実質的に同一であるシグナルペプチドを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質をコードする。例えば、ヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質は、齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質のシグナルペプチドと配列が少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるシグナルペプチド、または齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質タンパク質のシグナルペプチドと３個、２個、もしくは１個以下のアミノ酸だけ異なるシグナルペプチドを含んでもよい。特定の実施形態では、マウスＣｘｃｌ１３タンパク質のシグナルペプチドは、配列番号４のアミノ酸１～２１に記載されるアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、ラットＣｘｃｌ１３タンパク質のシグナルペプチドは、配列番号６のアミノ酸１～２１に記載されるアミノ酸配列を含む。
【0048】
上述のように、遺伝子改変齧歯類のゲノム中のヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のヌクレオチド配列（または「ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列」）と、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のヌクレオチド配列（または「内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３ヌクレオチド配列」）とを含む。
【0049】
一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子によってコードされるヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８様ドメインと実質的に同一であるポリペプチド（例えば、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインと、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるポリペプチド、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインと、３個、２個、または１個以下のアミノ酸だけ異なるポリペプチド、あるいは、ドメインのＮまたはＣ末端部分のみでヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインとは異なる、例えば、アミノ酸の追加、欠失、または置換を有するが、ドメインのＮまたはＣ末端部分で３個、２個、または１個以下のアミノ酸だけ異なる、ポリペプチド）をコードする。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のゲノム断片である。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～４を含むゲノム断片である。
【0050】
一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子によってコードされるヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と実質的に同一であるポリペプチド（例えば、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるポリペプチド、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と、３個、２個、または１個以下のアミノ酸だけ異なるポリペプチド、あるいは、ドメインのＮまたはＣ末端部分のみでヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列とは異なる、例えば、アミノ酸の追加、欠失、または置換を有するが、ドメインのＮまたはＣ末端部分で３個、２個、または１個以下のアミノ酸だけ異なる、ポリペプチド）をコードする。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のゲノム断片である。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３と、エクソン４と、（最後のコードエクソンとなる）エクソン５のコード部分とを含む、ゲノム断片である。
【0051】
一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、エクソン５の３’ＵＴＲを含む、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～エクソン５を含むゲノム断片である。一部のこうした実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のイントロン２の３’部分をさらに含む。
【0052】
一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子中の齧歯類Ｃｘｃｌ１３ヌクレオチド配列は、齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質のシグナルペプチドと実質的に同一であるポリペプチド（例えば、齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質のシグナルペプチドと配列が少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるポリペプチド、または齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質タンパク質のシグナルペプチドと３個、２個、または１個以下のアミノ酸だけ異なるポリペプチド）をコードする。一部の実施形態では、齧歯類Ｃｘｃｌ１３ヌクレオチド配列は、齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン１を含む。特定の実施形態では、齧歯類Ｃｘｃｌ１３ヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン１を含み、一部のこうした実施形態では、齧歯類Ｃｘｃｌ１３ヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン１、およびイントロン１の５’部分を含む。
【0053】
一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、例えば、内因性Ｃｘｃｌ１３座位での内因性齧歯類５’転写制御配列など、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの５’転写制御配列などの、齧歯類Ｃｘｃｌ１３制御配列に作動可能に連結され、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子の発現が齧歯類Ｃｘｃｌ１３ ５’制御配列の制御下におかれるようにする。
【0054】
一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位にある。一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、例えば、ランダムな組み込みの結果として、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位以外の座位にある。ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位以外の座位にある一部の実施形態では、齧歯類は、例えば、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子の不活性化（例えば、全部または一部の欠失）の結果として、齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質を発現することができない。
【0055】
ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子が内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位にある一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位における内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のヌクレオチド配列のヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のヌクレオチド配列との置換の結果生じ得る。
【0056】
一部の実施形態では、置換される内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位の内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のヌクレオチド配列は、齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインを実質的にコードする内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のゲノム断片である。一部の実施形態では、置換される齧歯類ゲノム断片は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン２～３を含む。
【0057】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位で齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のゲノム断片を置換するヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位で齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のゲノム断片を置換するヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のゲノム断片である。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位で齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のゲノム断片を置換するヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のゲノム断片は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソンの全部または一部を含み、このエクソンは、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインを実質的にコードする（すなわち、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインと実質的に同一であるポリペプチドをコードする）。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位で齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のゲノム断片を置換するヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のゲノム断片は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソンの全部または一部を含み、このエクソンは、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列を実質的にコードする（すなわち、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟タンパク質配列と実質的に同一であるポリペプチドをコードする）。一部の実施形態では、ヒトゲノム断片は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～４を含む。一部の実施形態では、ヒトゲノム断片は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～４と、エクソン５のコード部分とを含む。一部の実施形態では、ヒトゲノム断片は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～エクソン５（すなわち、エクソン５の３’ＵＴＲを含む）を含む。
【0058】
一部の実施形態では、置換後に内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位に残り、挿入されたヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列に作動可能に連結する内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のゲノム配列は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質のシグナルペプチドを実質的にコードする。一部の実施形態では、置換後、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位に残る内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のゲノム配列は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン１を含む。
【0059】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位の内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン２～３と、エクソン４のコード部分とを含むゲノム断片は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～５を含むゲノム断片で置換されている。結果として、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３座位で形成され、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン１と、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～５（ヒトエクソン５の３’ＵＴＲを含む）とを含み、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子の３’ＵＴＲが続く。かかるヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、内因性齧歯類シグナルペプチドおよび成熟ヒトＣＸＣＬ１３ポリペプチドを含むヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質をコードする。
【0060】
一部の実施形態では、本明細書に提供される齧歯類は、そのゲノムにおいて、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子に対しヘテロ接合性である。一部の実施形態では、本明細書に提供される齧歯類は、そのゲノムにおいて、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子に対しホモ接合性である。
【0061】
一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子は、齧歯類において、例えば齧歯類の血清において、コードされたヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質の発現をもたらす。一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質は、対照齧歯類（例えば、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を有していないが、完全齧歯類内因性Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含む齧歯類）中の対応する齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質と類似した、または実質的に同一のパターンで発現され、例えば、齧歯類の肝臓、脾臓、リンパ節、およびパイエル板での発現である。一部の実施形態では、ヒト化Ｃｘｃｌ１３タンパク質は、対照齧歯類（例えば、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を有していないが、完全齧歯類内因性Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含む齧歯類）中の対応する齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質と同等の、または実質的に同一のレベルで発現され、例えば、それの発現において、５０％、７５％、または１００％を超えて異なることがない。
【0062】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、例えば、内因性齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子の不活性化（例えば、全部または一部の欠失）または置換（全部または一部）の結果として、齧歯類Ｃｘｃｌ１３タンパク質を発現することができない。
【0063】
Ｃｘｃｌ１３ヒト化齧歯類における追加の任意の遺伝子特徴
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、そのゲノム中に、ヒト化Ｓｉｒｐａ遺伝子、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子、ヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子、ヒト化ＩＬ－６遺伝子、またはそれらの組み合わせをさらに含む。内因性齧歯類Ｓｉｒｐα、Ｂａｆｆ、Ａｐｒｉｌ、およびＩＬ－６遺伝子のヒト化は、ＷＯ２０１５／０４２５５７Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＷＯ２０１５／０７７０７１Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＷＯ２０１５／０７７０７２（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、およびＷＯ２０１３／０６３５５６Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）にそれぞれ記載されており、それらすべてが参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、齧歯類は、これらの追加のヒト化遺伝子のうちの一つ以上を含み、一つ以上の追加のヒト化遺伝子のいずれかに対してホモ接合性またはヘテロ接合性である。一部の実施形態では、齧歯類は、これらの追加のヒト化遺伝子のうちのすべてを含み、これらの追加のヒト化遺伝子の各々に対してホモ接合性またはヘテロ接合性である。一部の実施形態では、齧歯類は、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子に対してホモ接合性またはヘテロ接合性であり、これらの追加のヒト化遺伝子のうちの一つ以上、またはすべてを含み、これらの追加のヒト化遺伝子のいずれかに対してホモ接合性またはヘテロ接合性である。一部の実施形態では、齧歯類は、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子に対してホモ接合性であり、これらの追加のヒト化遺伝子の各々に対してホモ接合性である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、そのゲノム中に、ヒト化Ｓｉｒｐａ遺伝子、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子、ヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子、ヒト化ＩＬ－６遺伝子、またはそれらの組み合わせをさらに含む。内因性齧歯類Ｓｉｒｐα、Ｂａｆｆ、Ａｐｒｉｌ、およびＩＬ－６遺伝子のヒト化は、ＷＯ２０１５／０４２５５７Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＷＯ２０１５／０７７０７１Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＷＯ２０１５／０７７０７２（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、およびＷＯ２０１３／０６３５５６Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）にそれぞれ記載されており、それらすべてが参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、齧歯類は、これらの追加のヒト化遺伝子のうちの一つ以上を含み、一つ以上の追加のヒト化遺伝子のいずれかに対してホモ接合性またはヘテロ接合性である。一部の実施形態では、齧歯類は、これらの追加のヒト化遺伝子のうちのすべてを含み、これらの追加のヒト化遺伝子の各々に対してホモ接合性またはヘテロ接合性である。一部の実施形態では、齧歯類は、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子に対してホモ接合性またはヘテロ接合性であり、これらの追加のヒト化遺伝子のうちの一つ以上、またはすべてを含み、これらの追加のヒト化遺伝子のいずれかに対してホモ接合性またはヘテロ接合性である。一部の実施形態では、齧歯類は、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子に対してホモ接合性であり、これらの追加のヒト化遺伝子の各々に対してホモ接合性である。
【0064】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、そのゲノム中にヒト化Ｓｉｒｐａ遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｓｉｒｐａ遺伝子は、ヒトＳＩＲＰαタンパク質の細胞外ドメインの全部または一部を含むヒト化Ｓｉｒｐαタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ｓｉｒｐａ遺伝子は、リガンド結合（すなわち、ＣＤ４７への結合）に関与するヒトＳＩＲＰαタンパク質の細胞外部分を含むヒト化Ｓｉｒｐαタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ｓｉｒｐａ遺伝子は、ヒトＳＩＲＰαタンパク質、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１０３５１１１．１に記載されるヒトＳＩＲＰαタンパク質のアミノ酸残基２８～３６２を含むヒト化Ｓｉｒｐαタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ｓｉｒｐα遺伝子は、ヒトＳＩＲＰα遺伝子のエクソン２、３、および４を含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｓｉｒｐα遺伝子は、内因性齧歯類Ｓｉｒｐα座位に位置する。一部の実施形態では、ヒト化Ｓｉｒｐα遺伝子は、ヒトＳＩＲＰα遺伝子のエクソン２～４による内因性齧歯類Ｓｉｒｐα座位での内因性齧歯類Ｓｉｒｐα遺伝子のエクソン２～４の置換の結果として形成される。一部の実施形態では、ヒト化Ｓｉｒｐα遺伝子は、内因性齧歯類Ｓｉｒｐα座位に位置し、内因性齧歯類Ｓｉｒｐα遺伝子のエクソン１、ヒトＳＩＲＰα遺伝子のエクソン２～４、および内因性齧歯類Ｓｉｒｐα遺伝子のエクソン５～８を含み、この場合においてヒト化Ｓｉｒｐα遺伝子は、内因性齧歯類Ｓｉｒｐα座位で齧歯類Ｓｉｒｐαプロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、内因性齧歯類Ｓｉｒｐαタンパク質を発現することができない（例えば、内因性齧歯類Ｓｉｒｐα遺伝子の破損または置換の結果として）。
【0065】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、そのゲノム中にヒト化Ｂａｆｆ遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、ヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外ドメインの全部または一部を含むヒト化Ｂａｆｆタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、受容体結合に関与するヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分を含むヒト化Ｂａｆｆタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、ヒトＢＡＦＦタンパク質、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００６５６４．１に記載されるヒトＢＡＦＦタンパク質のアミノ酸残基１４２～２８５を含むヒト化Ｂａｆｆタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３～６を含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、内因性齧歯類Ｂａｆｆ座位に位置する。一部の実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３～６による内因性齧歯類Ｂａｆｆ座位での、エクソン３～６と、エクソン７のコード部分とを含む内因性齧歯類ＢａｆｆゲノムＤＮＡの置換の結果として形成される。一部の実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、内因性齧歯類Ｂａｆｆ座位に位置し、内因性齧歯類Ｂａｆｆ遺伝子のエクソン１～２、およびヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３～６を含み、この場合においてヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、内因性齧歯類Ｂａｆｆ座位で齧歯類Ｂａｆｆプロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、内因性齧歯類Ｂａｆｆタンパク質を発現することができない（例えば、内因性齧歯類Ｂａｆｆ遺伝子の破損または置換の結果として）。
【0066】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、そのゲノム中にヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、ヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子は、ヒトＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外ドメインの全部または一部を含むヒト化Ａｐｒｉｌタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子は、受容体結合に関与するヒトＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分を含むヒト化Ａｐｒｉｌタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子は、ヒトＡＰＲＩＬタンパク質、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００３７９９．１に記載されるヒトＡＰＲＩＬタンパク質のアミノ酸残基８７～２５０を含むヒト化Ａｐｒｉｌタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子は、ヒトＡＰＲＩＬ遺伝子のエクソン２～６を含む。一部の実施形態では、ヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子は、内因性齧歯類Ａｐｒｉｌ座位に位置する。一部の実施形態では、ヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子は、ヒトＡＰＲＩＬ遺伝子のエクソン２～６による、エクソン２～エクソン６のコード部分を含む内因性齧歯類ＡｐｒｉｌゲノムＤＮＡの置換の結果として形成される。一部の実施形態では、ヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子は、内因性齧歯類Ａｐｒｉｌ座位に位置し、内因性齧歯類Ａｐｒｉｌ遺伝子のエクソン１、およびヒトＡＰＲＩＬ遺伝子のエクソン２～６を含み、この場合においてヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子は、内因性齧歯類Ａｐｒｉｌ座位で齧歯類Ａｐｒｉｌプロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、内因性齧歯類Ａｐｒｉｌタンパク質を発現することができない（例えば、内因性齧歯類Ａｐｒｉｌ遺伝子の破損または置換の結果として）。
【0067】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、そのゲノム中にヒト化ＩＬ－６遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、ヒト化ＩＬ－６遺伝子は、ヒトＩＬ－６タンパク質、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００５９１．１に記載されるヒトＩＬ－６タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化ＩＬ－６遺伝子は、ヒトＩＬ－６遺伝子のエクソン１～エクソン５のコード部分を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＩＬ－６遺伝子は、内因性齧歯類ＩＬ－６座位に位置する。一部の実施形態では、ヒト化ＩＬ－６遺伝子は、ヒトＩＬ－６遺伝子のエクソン１～エクソン５のコード部分による、エクソン１のコード部分～エクソン５のコード部分を含む内因性齧歯類ＩＬ－６ゲノムＤＮＡの置換の結果として形成される。一部の実施形態では、ヒト化ＩＬ－６遺伝子は、内因性齧歯類ＩＬ－６座位に位置し、内因性齧歯類ＩＬ－６遺伝子のエクソン１の非コード部分、ヒトＩＬ－６遺伝子のエクソン１～５のコード部分を含み、この場合においてヒト化ＩＬ－６遺伝子は、内因性齧歯類ＩＬ－６座位で齧歯類ＩＬ－６プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、内因性齧歯類ＩＬ－６タンパク質を発現することができない（例えば、内因性齧歯類ＩＬ－６遺伝子の破損または置換の結果として）。
【0068】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類はさらに、ＲＡＧ２およびＩＬ－２ＲＧ遺伝子を破損させ、内因性ＲＡＧ２またはＩＬ－２受容体ガンマ鎖（「γｃ」としても知られる）タンパク質を発現することができない。ＲＡＧ２およびＩＬ－２ＲＧダブルノックアウト（ＤＫＯ）齧歯類は、既知の免疫不全齧歯類であり（例えば、Ｔｒａｇｇｉａｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ－ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｍｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：１０４－１０７を参照）、（例えば、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨークから）市販により容易に入手可能である。
【0069】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、ヒト化Ｓｉｒｐα遺伝子、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子、ヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子のうちの一つ以上（例えば、すべて）について、すべてそれぞれの内因性座位で（例えば、上述の置換の結果として）ホモ接合性であり、ＲＡＧ２遺伝子およびＩＬ－２ＲＧ遺伝子の両方についてホモ接合性ヌルである。
【0070】
一部の実施形態では、本開示の齧歯類は、非限定的な例として、マウス、ラット、およびハムスターを含む。一部の実施形態では、齧歯類はネズミ上科から選択される。一部の実施形態では、本開示の齧歯類は、ヨルマウス科（例えば、マウス様のハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄラットおよびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、ロックマウス、オジロラット、マダガスカルラットおよびマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、およびメクラネズミ科（例えば、メクラネズミ、タケネズミ、および高原モグラネズミ）から選択された科由来の動物である。一部の実施形態では、本開示の齧歯類は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。一部の実施形態では、本開示のマウスは、ネズミ科のメンバー由来のものである。
【0071】
一部の実施形態では、齧歯類は、マウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである。一部のある実施形態では、齧歯類は、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統のマウスである（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６；Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９（５）：１０２４－１０２８，１０３０，１０３２を参照）。一部の実施形態では、齧歯類は、１２９系統およびＣ５７ＢＬ／６系統を混合したマウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、前述の１２９系統の混合、または前述のＢＬ／６系統の混合であるマウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統のマウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、ＢＡＬＢ系統および別の前述の系統の混合であるマウスである。
【0072】
一部の実施形態では、齧歯類は、ラットである。一部の特定の実施形態では、ラットは、ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載のラット系統は、ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される二つ以上の系統の混合である。
【0073】
遺伝子改変齧歯類の組織および細胞
一部の実施形態では、本明細書に記載されるヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子をゲノムに含む、単離された齧歯類細胞または組織が、本明細書に開示される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子をゲノムに含む、単離された齧歯類細胞または組織が、本明細書に開示される。
【0074】
一部の実施形態では、組織は、脂肪、膀胱、脳、乳房、骨髄、目、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、膵臓、血漿、血清、皮膚、脾臓、胃、胸腺、精巣、卵子、およびこれらの組み合わせから選択される。
【0075】
一部の実施形態では、細胞は、樹状細胞、リンパ球（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞）、マクロファージ、および単球から選択される。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、齧歯類胚性幹細胞、または齧歯類卵子である。
【0076】
ヒト化齧歯類を作製するための組成物および方法
齧歯類座位に組み込まれることが望ましいヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列を含む標的化ベクター（または核酸構築物）が本明細書に開示される。
齧歯類座位に組み込まれることが望ましいヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列を含む標的化ベクター（または核酸構築物）が本明細書に開示される。
【0077】
一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質のケモカインＩＬ－８－様ドメインと実質的に同一であるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、配列番号２のアミノ酸３０～９１に記載されるアミノ酸配列に実質的に同一であるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟部分と実質的に同一であるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、配列番号２のアミノ酸２３～１０９に記載されるアミノ酸配列に実質的に同一であるポリペプチドをコードする。
【0078】
一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３およびエクソン４を含む。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３と、エクソン４と、エクソン５のコード部分とを含む。一部の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３遺伝子のエクソン３～エクソン５を含む。
【0079】
標的化ベクターはまた、５’および３’相同アームとしても知られる、組み込まれるべきヒトヌクレオチド配列に隣接する５’および３’齧歯類配列を含み、相同組換えと、ヒトヌクレオチド配列の標的齧歯類座位（例えば、内因性Ｃｘｃｌ１３座位）への組み込みとを介在する。典型的には、５’および３’の隣接齧歯類配列は、ヒトヌクレオチド配列によって置換されるべき対応する齧歯類ヌクレオチド配列に標的齧歯類座位で隣接する、ヌクレオチド配列である。例えば、齧歯類Ｃｘｃｌ１３エクソン２～４を含む齧歯類ゲノム配列が、ヒトＣＸＣＬ１３エクソン３～５を含むヒトゲノム配列と置換される実施形態では、標的化ベクター中の５’隣接配列は、齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のイントロン１の５’部分を含んでもよく、３’隣接配列は、齧歯類Ｃｘｃｌ１３遺伝子のエクソン４の３’ＵＴＲの５’部分を含んでもよい。
【0080】
一部の実施形態では、標的化ベクターは選択マーカー遺伝子を含む。一部の実施形態では、標的化ベクターは一つ以上の部位特異的組換え部位を含む。一部の実施形態では、標的化ベクターは、部位特異的組換え部位に隣接した選択マーカー遺伝子を含み、その結果、選択マーカー遺伝子は、部位間の組換えの結果として欠失され得る。
【0081】
例示的な実施形態では、標的化ベクターは、細菌相同組換えおよびＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して齧歯類Ｃｘｃｌ１３ゲノムＤＮＡを担持する細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンから生成される（例えば、Ｕ．Ｓ．６，５８６，２５１、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２－６５９を参照）。細菌相同組換えの結果として、齧歯類ゲノム配列は、ＢＡＣクローンから欠失され、ヒトヌクレオチド配列が挿入され、５’および３’齧歯類相同アームに隣接したヒトヌクレオチド配列を担持する改変ＢＡＣクローンが得られる。一部の実施形態では、ヒトヌクレオチド配列は、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質の成熟部分、または少なくともケモカインＩＬ－８－様ドメインをコードするｃＤＮＡ配列、またはヒトゲノムＤＮＡであってもよい。改変ＢＡＣクローンは、直線化されると、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞に導入することができる。
【0082】
一部の実施形態では、本発明は、改変齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞を作るための本明細書に記述された標的化ベクターの利用法を提供する。標的化ベクターは、例えばエレクトロポレーションによって齧歯類ＥＳ細胞に導入することができる。マウスＥＳ細胞とラットＥＳ細胞の両方が、共に当技術分野で説明されている。例えば、マウスＥＳ細胞、および遺伝子改変マウスを作製するＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法について記述するＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、およびＵＳ２００８－００７８０００Ａ１（これらすべてはその全体で参照により本明細書に援用される）、ラットＥＳ細胞、および遺伝子改変ラットを作製する方法について記述するＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、ＵＳ２０１４／０３１０８２８Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ４６７：２１１－２１５、およびＴｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．６（６）：ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１１．３３８（これらすべてはその全体で参照により本明細書に援用される）を参照されたい、これらを使用して改変齧歯類胚を作製することができ、次いでこれを使用して齧歯類動物を作製することができる。
【0083】
一部の実施形態では、追加の望ましい遺伝的特徴（例えば、ヒト化Ｓｉｒｐａ遺伝子、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子、ヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子、ヒト化ＩＬ－６遺伝子に対してホモ接合性、ならびに／またはＲＡＧ２－／－およびＩＬ－２ＲＧ－／－）を既に含むＥＳ細胞は、ヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列を含む標的化ベクターとのエレクトロポレーションでレシピエント細胞として使用される。一部の実施形態では、これらの付加的な望ましい遺伝的特徴は、後に導入されてもよい（例えば、ヒト化Ｃｘｃｌ１３齧歯類を、一つ以上の望ましい遺伝的特徴を有する第二の齧歯類と交配させることによって）。
【0084】
一部の実施形態において、ゲノムに組み込まれたヒトＣＸＣＬ１３ヌクレオチド配列を有するＥＳ細胞を選択することができる。一部の実施形態では、ＥＳ細胞は、齧歯類対立遺伝子の喪失および／またはヒト対立遺伝子の獲得アッセイに基づいて選択される。一部の実施形態では、次いで選択されたＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、それらすべてがその全体で参照により援用される、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、およびＵＳ２００８－００７８０００Ａ１を参照）、または、両方がその全体で参照により援用される、ＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１およびＵＳ２０１４／０３１０８２８Ａ１に記載の方法を使用することにより、前桑実胚期の胚（例えば、８細胞期胚）への注入に使用する。一部の実施形態では、ドナーＥＳ細胞を含む胚はインキュベートし、代理母に移植して、Ｆ０齧歯類を産生する。ヒトヌクレオチド配列を保有する齧歯類の仔は、齧歯類対立遺伝子の喪失および／またはヒト対立遺伝子の獲得アッセイを使用した、尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝子型決定により特定することができる。
【0085】
一部の実施形態では、ヒト化遺伝子に対してヘテロ接合性の齧歯類を交配させ、ホモ接合性齧歯類をする生成することができる。
【0086】
本明細書に記載されるＣｘｃｌ１３ヒト化齧歯類は、別の齧歯類と交配または交雑させることができる。したがって、交配の方法ならびにかかる交配から得られた子孫もまた、本開示の実施形態である。
【0087】
一部の実施形態では、本明細書において上で記載された第一の齧歯類、例えば、ゲノムがヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含む齧歯類を、第二の齧歯類と交配させ、ゲノムがヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含む子孫齧歯類を生成することを含む方法が提供される。子孫は、交配で使用される第二の齧歯類から遺伝する他の望ましい表現型または遺伝子改変を有してもよい。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子についてホモ接合性である。
【0088】
一部の実施形態では、ゲノムがヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含む子孫齧歯類が提供され、この子孫齧歯類は、ゲノムがヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を含む第一の齧歯類を、第二の齧歯類と交配させることを含む方法によって生成される。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子についてホモ接合性である。
【0089】
一部の実施形態では、第二の齧歯類は、ヒト化Ｓｉｒｐα遺伝子、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子、ヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子、ヒト化ＩＬ－６遺伝子、またはそれらの組み合わせをゲノムに含む。
【0090】
一部の実施形態では、第二の齧歯類は、ＲＡＧ２およびＩＬ－２ＲＧダブルノックアウト（ＤＫＯ）齧歯類（ＲＡＧ２－／－およびＩＬ－２ＲＧ－／－）である。
【0091】
一部の実施形態では、第二の齧歯類は、そのゲノム中に、ヒト化Ｓｉｒｐα遺伝子、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子、ヒト化Ａｐｒｉｌ遺伝子、ヒト化ＩＬ－６遺伝子を、それぞれの内因性座位に含み、かつＲＡＧ２－／－、およびＩＬ－２ＲＧ－／－である。
【0092】
ヒト化齧歯類を用いる方法
本明細書に開示される齧歯類は、化合物のヒト疾患治療に対する可能性を特定および試験するための有用なインビボシステムおよび生体材料の供給源を提供する。
本明細書に開示される齧歯類は、化合物のヒト疾患治療に対する可能性を特定および試験するための有用なインビボシステムおよび生体材料の供給源を提供する。
【0093】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物を使用して、ヒトＣＸＣＬ１３を標的とする、および／またはＣＸＣＬ１３－ＣＸＣＲ５相互作用を調節する薬剤が開発される。一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類を使用して、ヒトＣＸＣＬ１３に特異的に結合する候補薬剤（例えば、抗体）をスクリーニングおよび開発する。一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物を使用して、薬剤（例えば、抗ヒトＣＸＣＬ１３抗体）の結合プロファイルを決定する。
【0094】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物を使用して、ヒトＣＸＣＬ１３活性を遮断または調節する効果を測定する。一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物は、ヒトＣＸＣＬ１３に結合して阻害する候補薬剤に曝露され、ヒトＣＸＣＬ１３依存性プロセスに対する効果について分析される。例えば、本明細書に開示されるＣｘｃｌ１３ヒト化齧歯類動物は、ヒトＣＸＣＬ１３に結合して阻害する候補薬剤に曝露することができ、ヒト造血ＣＤ３４＋細胞の生着後の胚中心の発達、Ｂ細胞発生、および血清ヒトイムノグロブリンレベルに対する候補薬剤の効果について分析される。齧歯類動物は、好ましくは免疫不全動物であり、例えば、Ｒａｇ２－／－ ＩＬ－２ＲＧ－／－遺伝子型を有する齧歯類であり、より好ましくはＲａｇ２－／－ ＩＬ－２ＲＧ－／－ Ｓｉｒｐαｈｕ／ｈｕ Ｂａｆｆｈｕ／ｈｕ Ａｐｒｉｌｈｕ／ｈｕ ＩＬ－６ｈｕ／ｈｕ 遺伝子型を有する。
【0095】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物は、患者由来の異種移植組織または細胞の維持のための改善されたインビボシステムを提供する。一部の実施形態では、患者由来の異種移植片細胞は、癌細胞である。一部の実施形態では、癌細胞は、固形腫瘍の細胞である。一部の実施形態では、癌細胞は、癌性血液細胞、例えば、白血病、骨髄腫、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫を有する患者の血液細胞である。一部の実施形態では、患者由来の異種移植片細胞は、慢性リンパ性白血病（ＣＣＬ）細胞である。
【0096】
本明細書に開示される齧歯類動物は、ヒト癌細胞標的化治療薬剤の有効性を評価するために用いることができる。様々な実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物は、ヒト癌細胞（例えば、ＣＣＬ細胞）で生着され、このようなヒト癌細胞を標的とする薬剤候補が齧歯類動物に投与される。薬剤の治療有効性は次に、薬剤投与後の齧歯類動物中のヒト細胞をモニタリングすることによって、例えば、齧歯類動物中のヒト癌細胞の成長または転移が、薬剤の投与の結果として阻害されるかどうかを評価することによって、決定される。非ヒト動物で試験できる薬剤には、小分子化合物、すなわち１５００ｋＤ、１２００ｋＤ、１０００ｋＤ、または８００ダルトン未満の分子量の化合物、および大分子化合物（タンパク質など、例えば抗体、または抗体の抗原結合性断片）の両方を含み、これらはヒト細胞を標的化する（例えば、結合するおよび／または作用する）ことによってヒト疾患および状態の治療に対して意図する治療効果を持つ。
【0097】
本明細書は、限定するものとして解釈すべきではない以下の実施例により、さらに例示される。全ての引用参考文献（本出願全体で引用される文献参照、発行特許、および公表された特許出願を含む）は、それらの全体が参照により本明細書に明確に援用される。
【実施例】
【0098】
以下の実施例は、本明細書に請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法がどのようになされて評価されるのかに関して、当業者に完全な開示および説明を提供するように示されており、単に例示的であることを意図しており、本開示を限定することを意図していない。
【0099】
実施例１ ヒト化ＣＸＣＬ１３マウスの生成
マウスＣｘｃｌ１３座位は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用してヒト化された（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２－６５９を参照のこと。両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。得られたヒト化Ｃｘｃｌ１３座位は、内因性マウスＣｘｃｌ１３プロモーターを含有し、マウスＣｘｃｌ１３エクソン１、ヒトＣＸＣＬ１３エクソン３およびエクソン４（ヒトＣＸＣＬ１３ケモカインドメインをコードする）、ならびにヒトＣＸＣＬ１３エクソン５（ヒト３’ＵＴＲを含む）に作動可能に連結し、内因性マウスＣｘｃｌ１３ ３’ＵＴＲが続いた。図１Ａを参照。
マウスＣｘｃｌ１３座位は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用してヒト化された（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２－６５９を参照のこと。両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。得られたヒト化Ｃｘｃｌ１３座位は、内因性マウスＣｘｃｌ１３プロモーターを含有し、マウスＣｘｃｌ１３エクソン１、ヒトＣＸＣＬ１３エクソン３およびエクソン４（ヒトＣＸＣＬ１３ケモカインドメインをコードする）、ならびにヒトＣＸＣＬ１３エクソン５（ヒト３’ＵＴＲを含む）に作動可能に連結し、内因性マウスＣｘｃｌ１３ ３’ＵＴＲが続いた。図１Ａを参照。
【0100】
マウスＣｘｃｌ１３座位をヒト化するために、マウスＣｘｃｌ１３配列に隣接したヒトＣＸＣＬ１３ケモカインドメインをコードする核酸を担持するための初期プラスミドを生成した。より具体的には、この初期プラスミドは、５’から３’に：（ｉ）ＸｈｏＩ部位、（ｉｉ）２４９ｂｐのマウスＣｘｃｌ１３配列（マウスイントロン１の５’部分）（「Ｕｐ－Ｂｏｘ」）、（ｉｉｉ）ヒトＣＸＣＬ１３の、イントロン２の３’部分（１５０ｂｐ）、エクソン３（１３３ｂｐ）、イントロン３（２７７８ｂｐ、ＡｇｅＩ部位およびＳａｌＩ部位を含む）、エクソン４（８１ｂｐ）、イントロン４（２９３ｂｐ）、およびエクソン５（８４７ｂｐ、３’ＵＴＲを含む）を含むヒトＣＸＣＬ１３核酸配列、（ｉｖ）マウスＣｘｃｌ１３の３’ＵＴＲの５’部分（１４０ｂｐ、「Ｄｏｗｎ－Ｂｏｘ」）、ならびに（ｖ）ＸｈｏＩ部位を含有した。プラスミドはまた、ＬｏｘＰ部位に隣接したユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する選択カセットを含有した。次いで、このＢＨＲドナープラスミド（細菌相同組換えを意味する「ＢＨＲ」）をＸｈｏＩで消化し、マウスＣｘｃｌ１３配列（Ｕｐ－ＢｏｘおよびＤｏｗｎ－Ｂｏｘ）に隣接した、ヒトＣＸＣＬ１３核酸配列および選択カセットを含有する断片（本明細書では「ＢＨＲドナー」と称される）を放出した。図１Ｂを参照。
【0101】
その後、ＢＨＲドナーを使用して、マウスＣｘｃｌ１３細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＲＰ２３－１６２ｎ１８（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を改変した。細菌相同組換えを介して、マウスエクソン２～３（マウスＣｘｃｌ１３ケモカインドメインをコードする）と、マウスエクソン４のコード部分とを含むマウスＣｘｃｌ１３ ＢＡＣの連続核酸断片を、ＢＨＲドナーからのヒトＣＸＣＬ１３核酸配列で置換し、マウスＣｘｃｌ１３エクソン１、およびヒトＣＸＣＬ１３エクソン３～５（ヒトエクソン３と４の間に挿入されたハイグロマイシンカセットを有する）を含有するキメラヒト化Ｃｘｃｌ１３核酸を担持する改変ＢＡＣを生じさせ、マウスＣｘｃｌ１３の３’ＵＴＲが続いた。図１Ｂ～１Ｃを参照。
【0102】
次いで、改変ＢＡＣを標的化ベクターとして使用し、ｈＳＩＲＰ－アルファ（またはヒトＳＩＲＰａ）、ＲＡＧ２－／－ＩＬ２Ｒｇ－／－改変を含むマウス胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロポレーションした。組み込みの成功は、例えば、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，上記に記載される対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイによって確認された。ヒトＣＸＣＬ１３配列の存在を検出し、マウスＣｘｃｌ１３配列の損失および／または保持を確認するためにＭＯＡアッセイに使用されるプライマーおよびプローブを表２に示し、それらの位置を図１Ｄに示す。適正に標的化されたＥＳ細胞クローンを選択した後、ハイグロマイシン選択カセットをＣｒｅリコンビナーゼによって切除した。カセットの欠失後のヒト化Ｃｘｃｌ１３座位を図１Ｅに示す。得られたヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子のコード配列とコードされたアミノ酸配列とを、それぞれ配列番号７および配列番号８に明記する。ヒトＣＸＣＬ１３（配列番号２）、マウスＣｘｃｌ１３（配列番号４）、およびヒト化Ｃｘｃｌ１３（配列番号８）タンパク質配列のアラインメントを図１Ｆに提供する。
【表2-1】
【表2-2】
【0103】
明確に標的化されたＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により、前桑実胚（８細胞）期のマウス胚に顕微注入した（例えば、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、およびＵＳ２００８－００７８０００Ａ１を参照、その全てが参照により本明細書に組み込まれる）。ドナーＥＳ細胞を含むマウス胚をインビトロでインキュベートし、次に代理母に移植して、完全にドナーＥＳ細胞に由来するＦ０マウスを産生した。ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子を保有するマウスを、上述のＭＯＡアッセイを使用した遺伝子型判定により特定した。ヒト化Ｃｘｃｌ１３遺伝子に対してヘテロ接合性のマウスを、ホモ接合性に交配させた。
【0104】
Ｃｘｃｌ１３ヒト化に対してホモ接合性のマウスがヒト化タンパク質を発現したかを判定するために、ヒト化マウスまたは対照マウス（マウスＣＸＣＬ１３タンパク質を発現するマウス）を、すべて、非生着ｈＳＩＲＰ－アルファＲａｇ２－／－ ＩＬ－２ＲＧ－／－バックグラウンド上で試験した。ヒト化ＣＸＣＬ１３ ＥＳ細胞の二つの異なるクローンに由来するマウス（クローン１およびクローン２として指定）を試験した。マウスを安楽死させ、心臓穿刺を介して血液を採取した。血清を調製し、製造業者の指示に従って、ヒトＣＸＣＬ１３ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号ＤＣＸ１３０）により血清中のヒトＣＸＣＬ１３レベルを評価した。
【0105】
上述のＣｘｃｌ１３ヒト化に対してヘテロ接合性のマウスは、成熟ヒトＣＸＣＬ１３を血清中に発現することが見出された（図２）。
【0106】
実施例２．ヒト化Ｃｘｃｌ１３マウスは、強化されたヒト慢性リンパ性白血病細胞生着を示した。
材料および方法
マウス－ＮＳＧマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから購入した。ＳＩＲＰａｈｕ／ｈｕ Ｒａｇ２－／－ ＩＬ２Ｒｇ－／－およびヒト化ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＩＬ－６（ＳＲＧ－ＢＡ６）を含むマウス、ならびにＳＩＲＰαｈｕ／ｈｕ Ｒａｇ２－／－ ＩＬ２Ｒｇ－／－およびヒト化ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＩＬ－６、およびＣＸＣＬ１３（ＳＲＧ－ＢＡ６－１３）を含むマウスを、ＥＳ細胞への連続標的化および交配の組み合わせを用いてＲｅｇｅｎｅｒｏｎで生成した。これらのマウスにおけるマウスＳｉｒｐα、Ｂａｆｆ、Ａｐｒｉｌ、およびＩＬ－６遺伝子のヒト化は、それぞれ、ＷＯ２０１５／０４２５５７Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＷＯ ２０１５／０７７０７１Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＷＯ２０１５／０７７０７２（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、およびＷＯ２０１３／０６３５５６Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）に記載されている（それらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）。マウスは生後６～１６週の間であり、異種移植が実施されたときに、致死量以下（２Ｇｙ）で放射線照射された。
材料および方法
マウス－ＮＳＧマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから購入した。ＳＩＲＰａｈｕ／ｈｕ Ｒａｇ２－／－ ＩＬ２Ｒｇ－／－およびヒト化ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＩＬ－６（ＳＲＧ－ＢＡ６）を含むマウス、ならびにＳＩＲＰαｈｕ／ｈｕ Ｒａｇ２－／－ ＩＬ２Ｒｇ－／－およびヒト化ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＩＬ－６、およびＣＸＣＬ１３（ＳＲＧ－ＢＡ６－１３）を含むマウスを、ＥＳ細胞への連続標的化および交配の組み合わせを用いてＲｅｇｅｎｅｒｏｎで生成した。これらのマウスにおけるマウスＳｉｒｐα、Ｂａｆｆ、Ａｐｒｉｌ、およびＩＬ－６遺伝子のヒト化は、それぞれ、ＷＯ２０１５／０４２５５７Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＷＯ ２０１５／０７７０７１Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＷＯ２０１５／０７７０７２（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、およびＷＯ２０１３／０６３５５６Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）に記載されている（それらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）。マウスは生後６～１６週の間であり、異種移植が実施されたときに、致死量以下（２Ｇｙ）で放射線照射された。
【0107】
患者材料－－慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者の新鮮な末梢血由来の単核細胞を、勾配遠心分離により単離し、次いで直接使用または凍結保存した。細胞を、製造業者のプロトコルに従ってＴｒａｃｅＶｉｌｏｔまたはＣＦＳＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、マウスに静脈内注射した。５×１０７～１×１０８細胞を各マウスに注射した。
【0108】
フローサイトメトリー－マウスは、異種移植の２週間後に眼窩後方から採血した。赤血球を溶解した。単核細胞を２％ウシ胎児血清と共にＰＢＳ中に懸濁し、以下に記載される抗体で染色し、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ細胞絶対数計数用ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、フローサイトメトリーに供した。ＢｉｏｌｅｇｅｎｄまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからの以下のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用した：抗ｍＣＤ４５（３０Ｆ１１）、抗Ｔｅｒ１１９、抗ｈＣＤ４５（ＨＩ３０）、抗ｈＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、抗ｈＣＤ１９（ＨＩＢ１９）、抗ｈＣＤ５（Ｌ１７Ｆ１２）。抗体は、ＡＰＣ、ＡＰＣＣｙ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＢＶ－６０５、またはＢＶ－７１１に直接連結した。データはＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０機器上で取得され、ＦｌｏｗＪｏプログラムによって分析された。
【0109】
ゲーティング戦略－シングレット生細胞を、ｈＣＤ４５＋ｍＣＤ４５－集団に対してゲーティングした。ＣＬＬ細胞を、ｈＣＤ１９＋ｈＣＤ５＋ｈＣＤ３－としてさらにゲーティングした。増殖するＣＬＬ細胞を、ＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ－ｌｏｗまたはＣＦＳＥ－ｌｏｗのいずれかとしてさらにゲーティングした。
【0110】
結果
１２のＣＬＬ患者サンプルの生着を、ＮＳＧとＳＲＧ－ＢＡ６マウスの間で、またはＮＳＧとＳＲＧ－ＢＡ６－１３マウスの間で比較した。各系統のマウス２～３匹を、同じ患者サンプルで異種移植した。異種移植の２週間後、マウスを採血してＣＬＬ生着を評価した。ＣＬＬ細胞頻度（ｈＣＤ１９＋ｈＣＤ５＋ｈＣＤ３－）、およびそれらの増殖状態（ＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ－ｌｏｗまたはＣＦＳＥ－ｌｏｗ）の明らかな差異は、ＮＳＧ系統とＳＲＧ－ＢＡ６系統の間では観察されなかった。対照的に、増殖（５つの患者サンプルうち４つ）およびＣＬＬ細胞数（３つの患者サンプルのうち３つ）は、ＮＳＧマウスと比較して、ＳＲＧ－ＢＡ６－１３マウスにおいて顕著に増加した（図３）。結果は、内因性Ｃｘｃｌ１３遺伝子のヒト化が、免疫不全マウスにおけるＣＬＬ患者サンプルの生着を強化したことを示す。
１２のＣＬＬ患者サンプルの生着を、ＮＳＧとＳＲＧ－ＢＡ６マウスの間で、またはＮＳＧとＳＲＧ－ＢＡ６－１３マウスの間で比較した。各系統のマウス２～３匹を、同じ患者サンプルで異種移植した。異種移植の２週間後、マウスを採血してＣＬＬ生着を評価した。ＣＬＬ細胞頻度（ｈＣＤ１９＋ｈＣＤ５＋ｈＣＤ３－）、およびそれらの増殖状態（ＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ－ｌｏｗまたはＣＦＳＥ－ｌｏｗ）の明らかな差異は、ＮＳＧ系統とＳＲＧ－ＢＡ６系統の間では観察されなかった。対照的に、増殖（５つの患者サンプルうち４つ）およびＣＬＬ細胞数（３つの患者サンプルのうち３つ）は、ＮＳＧマウスと比較して、ＳＲＧ－ＢＡ６－１３マウスにおいて顕著に増加した（図３）。結果は、内因性Ｃｘｃｌ１３遺伝子のヒト化が、免疫不全マウスにおけるＣＬＬ患者サンプルの生着を強化したことを示す。
【図1A】
【図1B-C】
【図1D-E】
【図1F】
【図2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】