▶ アデア ファーマシューティカルズ エスアーエスの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-02
(54)【発明の名称】腸内ビフィズス菌の増殖の刺激
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20230526BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230526BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20230526BHJP
A61K 35/747 20150101ALI20230526BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230526BHJP
A61P 1/12 20060101ALI20230526BHJP
A61P 39/02 20060101ALI20230526BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230526BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A ZNA
C12N1/20 E
C12N15/09 Z
A23L33/135
A61K35/747
A61P1/04
A61P1/12
A61P39/02
A61P29/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022563988
(86)(22)【出願日】2021-04-30
(85)【翻訳文提出日】2022-12-19
(86)【国際出願番号】 EP2021061392
(87)【国際公開番号】W WO2021219846
(87)【国際公開日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】63/018,908
(32)【優先日】2020-05-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520363535
【氏名又は名称】アデア ファーマシューティカルズ エスアーエス
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ワルダ，アリチャ
(72)【発明者】
【氏名】ヒル，コリン
(72)【発明者】
【氏名】ペレット，スティーブン
【テーマコード（参考）】
4B018
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B018MD87
4B018ME11
4B065AA30X
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC56
4C087CA08
4C087CA10
4C087MA02
4C087MA52
4C087NA14
4C087ZA66
4C087ZA68
4C087ZA73
4C087ZB11
4C087ZC37
(57)【要約】
本開示は、腸内ビフィズス菌の増殖を刺激し、それにより腸の健康を維持／改善するための組成物を提供する。製品LACTEOL（登録商標）を含む、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞を含む組成物が特に対象となる。組成物で治療され得る具体的な症状の例は、抗生物質起因性下痢、腸内毒素症、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞を含む組成物。
【請求項2】
ラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞も含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項3】
ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞が増殖されている培地を含む組成物。
【請求項4】
ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞が増殖されている培地も含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項5】
ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞が増殖されている培地も含む、請求項２に記載の使用のための組成物。
【請求項6】
ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞が増殖されている培地の上清を含む組成物。
【請求項7】
ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、請求項６に記載の上清の画分５２を含む組成物であって、画分５２は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析において約５２００ｍ／ｚで単一ピークを有するサイズ排除ＨＰＬＣ画分である、組成物。
【請求項8】
ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及び／又はラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の前記細胞は、死細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項9】
ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、LACTEOL（登録商標）を含む組成物。
【請求項10】
前記対象は、健康なヒトである、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項11】
前記対象は、前記腸の疾患を有するヒトである、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項12】
前記腸疾患は、抗生物質起因性下痢、腸内毒素症、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）から選択される、請求項１１に記載の使用のための組成物。
【請求項13】
医薬組成物、食品サプリメント又は栄養サプリメントの形態である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項14】
前記食品サプリメント又は栄養サプリメントは、ミルク、ヨーグルト若しくはヨーグルトスタイルの製品、チーズ、アイスクリーム、穀類ベースの製品、ミルクベースの粉末、乳児用調製乳、栄養調合乳、乾燥経口用粗粒若しくは粉末、湿潤経口用ペースト若しくはゼリー、乾燥経管栄養のための粗粒若しくは粉末又は湿潤経管栄養のための流動物から選択される食品中に含まれる、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の背景
[0001] 本開示は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することができる作用剤に関する。
[0001] 本開示は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することができる作用剤に関する。
【背景技術】
【0002】
[0002] 腸内微生物叢組成物は、宿主の健康状態において重要な役割を果たし得る。特に、微生物叢の破壊は、下痢、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）、肥満症、アレルギー及び行動障害及び自閉症などの発達障害と関連付けられている。微生物叢組成物に影響するように設計された方策としては、プロバイオティクス、プレバイオティクス及びシンバイオティクス（プロバイオティクス菌と、この細菌及び他の細菌の増殖を刺激するプレバイオティクス菌との組み合わせ）の摂取が挙げられる。微生物叢を調節するアプローチとしては、抗菌（抗生物質又はバクテリオシンなど）の補充又は糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）など、より抜本的な方法があるが、予測は困難である。微生物代謝産物のレベルの変化は、鬱病、結腸直腸癌、心血管疾患、肥満症及び２型糖尿病などの症状とも関連している。したがって、神経伝達物質、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）、インドール、胆汁酸、コリン代謝産物、乳酸及びビタミンなどの微生物由来分子は、健康及び満足な状態において重要な役割を果たす。
【0003】
[0003] ＳＣＦＡは、非消化性食事性炭水化物の微生物発酵中に産生される。ＳＣＦＡ産生が宿主エネルギー代謝に直接寄与し得、酢酸及びプロピオン酸が肝臓及び周辺臓器によって吸収及び代謝され、酪酸が主に結腸上皮によって利用され、特定の細菌によってエネルギー源として使用され得る。更に、ＳＣＦＡは、細胞分化の調節、抗癌性及び抗炎症作用又は満腹の増強及び食欲の抑制によって有益な作用を有する。ビフィズス菌によるプロピオン酸及び酢酸の産生は、宿主の健康に対するその有益な作用の理由の１つとして示唆されている。
【0004】
[0004] ビフィズス菌は、ヒト胃腸管内に見出されることが多い嫌気性のグラム陽性細菌である。健康な成人において、総糞便微生物叢の４．４％及び１７．９％がビフィズス菌である。一般に、ビフィズス菌のレベルが高いほど、腸内の内毒素レベルの低減、腸管透過性の低減、細菌移行率の低減及び代謝改善など、有益な作用と関連付けられる。同時に、ビフィズス菌数の減少は、多様な障害と関連付けられている。したがって、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の刺激は、多くの疾患を予防し、及び／又はその程度を低減し、また生活の質を向上させる有効な方策である。内因性のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の刺激が特に対象となる。
【0005】
[0005] ラクトバシラス（Lactobacillus）は、グラム陽性の通性嫌気性又は微好気性で棒状の非胞子形成細菌の属である。それらは、乳酸菌グループの主要部分である（すなわち、それらは、糖を乳酸に変換する）。ヒトにおいて、それらは、多くの身体部位で微生物叢の重要な成分を構成する。ラクトバシラス（Lactobacillus）は、現在、１８０を超える種を含み、多様な生物を包含する。本開示の目的のために、ラクトバシラス（Lactobacillus）の参照としては、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）が挙げられ、それは、最近、リモシラクトバシラス・ファーメンタム（LimosiLactobacillus fermentum）と命名された。したがって、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びリモシラクトバシラス・ファーメンタム（LimosiLactobacillus fermentum）は、本開示において区別なく使用される。
【0006】
[0006] 本発明者らは、ここで、驚くべきことに、ラクトバシラス（Lactobacillus）株の細胞（例えば、死細胞）、及び／又はその上清（すなわち無細胞上清）及び細胞画分と共に、かかる細胞が増殖されている培地を含む組成物が哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激し得ることを見出した。これらの組成物及び画分は、健康な哺乳動物（例えば、ヒト）の腸の維持並びに抗生物質起因性下痢、腸内毒素症、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの腸内のビフィズス菌量の増加によって促進される疾患の治療に特に有用である。本開示の態様を要約する報告は、２０２１年２月１２日にオンラインで公開されたApplied and Microbiology Environmental, doi: 10.1128/AEM.02459-20（Wardaら）（http://aem.asm.org）に記載されている。この記事及びその具体的な内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0007】
[0007] 本明細書で使用される「培地」とは、好ましくは、ＭＲＳブロス（すなわち寒天成分を含まない従来のＭＲＳ製品）であり、ラクトバシラス属（Lactobacillus）の１つ又は複数の株の細胞増殖から生じる物質を含む。
【0008】
[0008] 哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することができる本開示の１つの特定の製品は、LACTEOL（登録商標）である。LACTEOL（登録商標）は、再水和及び／又は食事性処置に補足される、成人及び小児における下痢の対症療法薬として市販されている。しかしながら、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖の刺激について、それは、以前に報告されていなかった。
【0009】
[0009] 哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することができる本開示の他の特定の製品は、低ラクトースLACTEOL（登録商標）（ＬＬＬと本明細書で呼ばれる）である。ＬＬＬは、市販されるLACTEOL（登録商標）完成品を形成するために、ラクトースを添加する前のLACTEOL（登録商標）を製造するための製品である。ＬＬＬは、LACTEOL（登録商標）中にラクトースを１０％（ｗ／ｗ）未満含有する。
【0010】
[0010] 哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することができる本開示の他の特定の製品は、LACTEOL（登録商標）の成分、すなわちラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）である。
【0011】
[0011] LACTEOL（登録商標）、ＬＬＬ及びラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の上清及び細胞（例えば、死細胞）の画分、例えば哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することができる、画分（Fraction）５２と指定されるLACTEOL（登録商標）上清の画分も特に対象となる。
【0012】
[0012] 本開示は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖の刺激を担う、画分５２に含まれる１種又は複数の化合物に更に関する。
【0013】
[0013] LACTEOL（登録商標）中の活性成分は、ラクトバシラス（Lactobacillus）ＬＢ株（ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の組合せ）の加熱死細胞を含有する培養液及び発酵培地から誘導される。ラクトバシラス（Lactobacillus）死細胞を含む本開示の他の活性製品と共に、LACTEOL（登録商標）は、組成物のコンシステンシー及び効果、貯蔵の容易さ、脆弱な患者における感染のリスクがないこと、細菌毒性又は抗生物質抵抗性カセットの転座がないことなど、プロバイオティクスなどの生きた生物を含有する製品と比べて潜在的な多くの利点を有し、その製品は、抗生物質又は抗真菌剤と合わせて使用した場合に活性を維持する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0014】
発明の概要
[0014] 本明細書の全体を通して、「治療」及び「治療すること」という用語は、指定の病状又は疾患に対する本開示の組成物の予防的及び保護的使用も含むことを意図する。
[0014] 本明細書の全体を通して、「治療」及び「治療すること」という用語は、指定の病状又は疾患に対する本開示の組成物の予防的及び保護的使用も含むことを意図する。
【0015】
[0015] 本開示の一態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖の刺激に使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）を含む組成物を提供する。
【0016】
[0016] 本開示の別の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖の刺激に使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）を含む組成物を提供する。
【0017】
[0017] 本開示の更なる態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖の刺激に使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞又はラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞が増殖されている培地を含む組成物を提供する。
【0018】
[0018] 本開示の別の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖の刺激に使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞が増殖されている培地と共に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）を含む組成物を提供する。
【0019】
[0019] 本開示の別の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖の刺激に使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞が増殖されている培地と共に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）を含む組成物を提供する。
【0020】
[0020] 本開示の更なる態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖の刺激に使用するためのLACTEOL（登録商標）を提供する。
【0021】
[0021] 本開示の別の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖の刺激に使用するためのＬＬＬを提供する。
【0022】
[0022] 本開示の別の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖の刺激に使用するためのLACTEOL（登録商標）又はＬＬＬの上清画分又は細胞画分を提供する。
【0023】
[0023] 本開示の特定の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖の刺激に使用するためのLACTEOL（登録商標）又はＬＬＬの上清画分を提供する。
【0024】
[0024] 本開示の更なる特定の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖の刺激に使用するための画分５２（本明細書に定義される）を提供する。
【0025】
[0025] 本開示の別の特定の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖の刺激に使用するための、画分５２内の１種又は複数の化合物を提供する。
【0026】
[0026] 本開示の一態様は、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康を改善する方法であって、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）の有効量を患者に投与して、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることを含む方法を提供する。
【0027】
[0027] 本開示の更なる態様は、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康を改善する方法であって、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）、例えばラクトバシラス（Lactobacillus）ＬＢの細胞（例えば、死細胞）の有効量を患者に投与して、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることを含む方法を提供する。
【0028】
[0028] 本開示の別の態様は、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康を改善する方法であって、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞又はラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞が増殖されている培地の有効量を患者に投与して、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることを含む方法を提供する。
【0029】
[0029] 本開示の更なる態様は、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康を改善する方法であって、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞が増殖されている培地と共に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）の有効量を患者に投与して、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることを含む方法を提供する。
【0030】
[0030] 本開示の別の態様は、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康を改善する方法であって、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞が増殖されている培地と共に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）の有効量を患者に投与して、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることを含む方法を提供する。
【0031】
[0031] 本開示の別の態様は、LACTEOL（登録商標）の有効量を患者に投与して、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることを含む、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康を改善する方法を提供する。
【0032】
[0032] 本開示の更なる態様は、ＬＬＬの有効量を患者に投与して、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることを含む、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康を改善する方法を提供する。
【0033】
[0033] 本開示の別の態様は、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康を改善する方法であって、LACTEOL（登録商標）又はＬＬＬの上清画分又は細胞画分の有効量を患者に投与して、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることを含む方法を提供する。
【0034】
[0034] 本開示の特定の態様は、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康を改善する方法であって、LACTEOL（登録商標）又はＬＬＬの上清画分の有効量を患者に投与して、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることを含む方法を提供する。
【0035】
[0035] 本開示の更なる態様は、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康を改善する方法であって、画分５２の有効量を患者に投与して、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることを含む方法を提供する。
【0036】
[0036] 本開示の別の態様は、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康を改善する方法であって、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させる能力を示す、画分５２の１種又は複数の化合物の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。
【0037】
[0037] 本明細書で使用される「腸の健康を改善する」及び「腸の健康を改善すること」という用語は、（１）腸内毒素症などの腸疾患の出現を予防又は緩和するための、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激する本開示の製品の予防的使用；及び（２）抗生物質起因性下痢、腸内毒素症、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの腸及び消化管の疾患を治療するための、腸内のビフィズス菌の増殖を刺激する本開示の製品の使用を含む。
【0038】
[0038] 本開示の一態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることにより、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康の改善に使用するための、１種又は複数の薬剤として許容される担体又は賦形剤と共に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）を含む医薬組成物を提供する。
【0039】
[0039] 本開示の更なる態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることにより、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康の改善に使用するための、１種又は複数の薬剤として許容される担体又は賦形剤と共に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）、例えばラクトバシラス（Lactobacillus）ＬＢの細胞（例えば、死細胞）を含む医薬組成物を提供する。
【0040】
[0040] 本開示の別の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることにより、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康の改善に使用するための、１種又は複数の薬剤として許容される担体又は賦形剤と共に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞又はラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞が増殖されている培地を含む医薬組成物を提供する。
【0041】
[0041] 本開示の更なる態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることにより、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康の改善に使用するための、１種又は複数の薬剤として許容される担体又は賦形剤と共に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞が増殖されている培地と共にラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）を含む医薬組成物を提供する。
【0042】
[0042] 本開示の別の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることにより、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康の改善に使用するための、１種又は複数の薬剤として許容される担体又は賦形剤と共に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞が増殖されている培地と共にラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）を含む医薬組成物を提供する。
【0043】
[0043] 本開示の別の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることにより、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康の改善に使用するための、LACTEOL（登録商標）の有効量を含む医薬組成物を提供する。
【0044】
[0044] 本開示の別の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることにより、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康の改善に使用するための、１種又は複数の薬剤として許容される担体又は賦形剤と共に、ＬＬＬの有効量を含む医薬組成物を提供する。
【0045】
[0045] 本開示の別の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることにより、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康の改善に使用するための、１種又は複数の薬剤として許容される担体又は賦形剤と共に、LACTEOL（登録商標）又はＬＬＬの上清画分又は細胞画分の有効量を含む医薬組成物を提供する。
【0046】
[0046] 本開示の特定の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることにより、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康の改善に使用するための、１種又は複数の薬剤として許容される担体又は賦形剤と共に、LACTEOL（登録商標）又はＬＬＬの上清画分の有効量を含む医薬組成物を提供する。
【0047】
[0047] 本開示の更なる態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることにより、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康の改善に使用するための、１種又は複数の薬剤として許容される担体又は賦形剤と共に、画分５２の有効量を含む医薬組成物を提供する。
【0048】
[0048] 本開示の別の態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の量を増加させることにより、動物（ヒトを含む）患者における腸の健康の改善に使用するための、１種又は複数の薬剤として許容される担体又は賦形剤と共に、画分５２の１種又は複数の化合物の有効量を含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0049】
図面の説明
【図1】[0049]ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）ロード及び水、乳酸、ラクトース又はLACTEOL（登録商標）が補充された容器内での糞便発酵の２４時間前及び２４時間後の総菌数の当量を示す。
【図2A】[0050]１０倍希釈培地における、ある範囲の幼児及び成人関連ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）株の増殖に対するLACTEOL（登録商標）の作用を示す。
【図2B】[0050]１０倍希釈培地における増殖に対するLACTEOL（登録商標）成分［上清、細胞及び低ラクトースLACTEOL（登録商標）（ＬＬＬ）］の作用を示す。
【図2C】[0050]１０倍希釈培地における増殖に対するLACTEOL（登録商標）用量の作用を示す。
【図2D】[0050]１０倍希釈培地における増殖に対する酵素的又は物理的に処理されたLACTEOL（登録商標）の作用を示す。
【図2E】[0050]１０倍希釈培地における増殖に対する酵素的又は物理的に処理されたLACTEOL（登録商標）の作用を示す。
【図2F】[0050]１０倍希釈培地における増殖に対するLACTEOL（登録商標）様製剤の作用を示す。
【図2G】[0050]１５倍希釈培地における増殖に対するＬＬＬ及びＬｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）［上清、細胞及び透析された］の作用を示す。
【図3A】[0051]１５倍希釈培地におけるＢ．ロンガム（B. longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７（Ｂ１）の２４時間増殖に対するプロバイオティクスの作用を示す。
【図3B】[0051]１５倍希釈培地におけるＢ．ロンガム（B. longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７（Ｂ１）の２４時間増殖に対するプロバイオティクスの作用を示す。
【図4A】[0052]Ｂ．ロンガム（B. longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７の２４時間増殖に対するLACTEOL（登録商標）、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９及びＬＬＬのＳＰＥ Ｃ１８精製を示す。
【図4B】[0052]Ｂ．ロンガム（B. longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７の２４時間増殖に対するLACTEOL（登録商標）、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９及びＬＬＬのＳＰＥ Ｃ１８精製を示す。
【図4C】[0052]Ｂ．ロンガム（B. longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７の２４時間増殖に対するLACTEOL（登録商標）、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９及びＬＬＬのＳＰＥ Ｃ１８精製を示す。
【図5】[0053]１０倍希釈培地におけるビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖に対するアンモニウム沈殿画分のＣ１８精製の作用を示す。
【図6】[0054]サイズ排除カラムを通したLACTEOL（登録商標）及びその画分の紫外線吸収クロマトグラムを示す。
【図7】[0055]Ｃ１８精製１／２濃度LACTEOL（登録商標）のＨＰＬＣ画分に応じたビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖（１５倍希釈培地）を示す。
【図8】[0056]Ｃ１８精製LACTEOL（登録商標）の画分５２及び周囲画分のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析結果を示す。
【図9】[0057]ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の２４時間増殖（１５倍希釈培地）に対するLACTEOL（登録商標）様製剤の濃度作用を示す。
【図9A】[0057]LACTEOL（登録商標）の重量当量の全量及び半量でのＬｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）株の上清の作用を示す。
【図9B】[0057]LACTEOL（登録商標）の重量当量の全量及び半量での細胞と上清の組合せの作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【0050】
詳細な説明
[0059] 本開示は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激し、それにより腸の健康を維持及び改善することを促進する微生物組成物に関する。
[0059] 本開示は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激し、それにより腸の健康を維持及び改善することを促進する微生物組成物に関する。
【0051】
[0060] 本開示の適切な組成物は、一態様において、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）又はラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）の混合物、例えばラクトバシラス（Lactobacillus）ＬＢを含む。本開示の特定の組成物は、LACTEOL（登録商標）を含む。
【0052】
[0061] 別の態様において、本開示の適切な組成物は、LACTEOL（登録商標）、ＬＬＬ又はラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の成分を含む。
【0053】
[0062] 特定の態様において、適切な組成物は、LACTEOL（登録商標）、ＬＬＬ又はラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の上清及び／又は細胞を含む。
【0054】
[0063] 本開示の特定の組成物は、LACTEOL（登録商標）又はＬＬＬの上清の画分を含む。特に対象となる１つのかかる画分は、画分５２である。
【0055】
[0064] 別の態様において、本開示の適切な組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）の腸内の有益なビフィズス菌の増殖の刺激を担う、画分５２内の１種又は複数の化合物を含む。
【0056】
[0065] 更なる態様において、本開示の適切な組成物は、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞又はラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）が増殖される培地を含む。
【0057】
[0066] 別の態様において、本開示の適切な組成物は、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞が増殖される培地と共に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）を含む。
【0058】
[0067] 更に別の態様において、本開示の適切な組成物は、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞が増殖される培地と共に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）を含む。
【0059】
[0068] 本明細書で言及される生物学的寄託物は、Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15に位置するCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）において寄託された。発酵培地中のラクトバシラス（Lactobacillus）ＬＢは、参照コードＭＡ６５／４Ｅ（ＭＡ６５／４Ｅ－１ｂ：ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ＭＡ６５／４Ｅ－２ｚ：ラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）でＣＮＣＭにおいて寄託されている。ＭＡ６５／４Ｅは、１９９１年８月２６日に寄託された。ラクトバシラス（Lactobacillus）ＬＢの個々の２つの菌株は、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ＣＮＣＭＩ－２９９８（参照：ＭＡ６５／４Ｅ－１ｂ；最初の寄託日：１９９２年８月２６日；ブダペスト条約に従うための変換日：２００３年３月２７日）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）、ＣＮＣＭＩ－４８３１（参照：ＭＡ６５／４Ｅ－２ｚ；最初の寄託日：１９９２年８月２６日；ブダペスト条約に従うために最初の寄託を変換する要求：２０１３年１２月２０日；２０１４年１月９日発行の変換受領）として、ブダペスト条約下において記録されている。
【0060】
[0069] ラクトバシラス（Lactobacillus）ＬＢ死細胞は、発酵培地中で生細胞を約１１０℃において約１時間加熱することによって得ることができる。ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の死細胞又はその混合物は、加熱死プロセスを介して同様の手法で得ることができる。
【0061】
[0070] 混合物として使用した場合、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）とラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）との重量比は、約９９：１～約１：９９、例えば９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、１：９を含む約９：１～１：９のいずれかの適切な比であり得る。ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）とラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）との重量比は、特に約９：１であり得る。
【0062】
[0071] LACTEOL（登録商標）は、本発明で使用される適切な組成物中に配合される前に、発酵培地と共にラクトバシラス（Lactobacillus）ＬＢの死細胞を乾燥させることによって（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥又は流動床乾燥によって）調製され得る。特定の態様において、乾燥前にラクトースが湿潤発酵生成物に添加され得る。別の態様において、ラクトースは、配合工程の一部として乾燥後に添加され得る。
【0063】
[0072] LACTEOL（登録商標）は、加熱死されたラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）とラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）との乾燥した組み合わせを培地において約９：１の比で含有する。
【0064】
[0073] ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の死細胞又はその混合物、例えばラクトバシラス（Lactobacillus）ＬＢは、乾燥工程を省くか又は水などの適切な液体で乾燥生成物を再構成することにより、ラクトースを含んで又は含まずに液体状態でも使用され得る。
【0065】
[0074] LACTEOL（登録商標）、ＬＬＬ又はラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の上清及び細胞は、遠心などの従来の分離技術に続いて固体材料を液体から分離することにより（例えば、濾過により）、それぞれLACTEOL（登録商標）、ＬＬＬ又はラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の溶液から調製され得る。LACTEOL（登録商標）又はＬＬＬの上清の画分は、サイズ排除ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーによって得ることができる。溶媒－溶媒抽出を用いて及び固相抽出カラム、例えばＣ１８精製によって画分が精製／濃縮され得る。画分からの活性化合物は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー、タンデム質量分析）を用いて分析され、特徴付けられ得る。
【0066】
[0075] 画分５２は、サイズ排除ＨＰＬＣによって得られ、Ｃ１８を用いた複数の実行で精製されたLACTEOL（登録商標）又はＬＬＣの上清の画分であり；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析において、画分５２は、約５２００ｍ／ｚ（５２３７．０８ｍ／ｚなど）で単一ピークを有する。
【0067】
[0076] 一態様において、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）又はその混合物、例えばラクトバシラス（Lactobacillus）ＬＢは、所望の効果を達成するのに十分な量で本開示の組成物に存在する。本開示の例示的な一実施形態において、ラクトバシラス（Lactobacillus）ＬＢ株の死細胞は、本開示の組成物中において、約１０億細胞数／ｇ以上、例えば約１００～約１０００億細胞数／ｇ、例えば約４００～約８００億細胞数／ｇ（例えば、約６００億細胞数／ｇ）の割合で存在する。
【0068】
[0077] 本開示の組成物は、適切な用量で経口投与され得、その用量は、対象の年齢、体重及び性別、治療される病状並びに投与期間及び投与経路などの因子に応じて異なる。通常通りに訓練を受けた医師又は獣医師は、それぞれのヒト又は非ヒト動物患者に対して本開示の医薬組成物の有効用量を容易に決定し、処方することができる。適切な剤形の本開示の医薬組成物は、好都合には、１日１回又は２回患者に投与され得る。幼児又はそれより若い小児において、２０～４０ｋｇの範囲の体重に基づいて成人投薬量のおよそ１／２が投与され得、２０ｋｇ未満の体重に基づいて成人投薬量のおよそ１／４が投与され得る。
【0069】
[0078] 本開示の組成物の好都合な１回量は、例えば、カプセル剤、又は錠剤、又はサッシェなどの標準的製剤剤形において、１日１回又は２回、成人ヒト患者に投与される、約２０００ｍｇまでのいずれかの有効用量であり得る。
【0070】
[0079] 本開示の組成物は、食品若しくは栄養サプリメントとして又は食品、例えばヨーグルト中でも投与され得る。この場合、約１００ｇまでの非常に高い用量を摂取することができる。
【0071】
[0080] 本開示の医薬組成物は、薬剤的に利用可能な担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化され得、当業者によって容易に実行することができる方法に従い、単位用量で製造されるか又は高投薬量容器内に収容され得る。本明細書において、その剤形は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、粉末を含有するサッシェ又は液剤、例えば水性媒体含有溶液、懸濁剤又は乳剤であり得る。
【0072】
[0081] 例えば、一態様において、カプセル剤として医薬組成物を製剤化するために、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の乾燥（例えば、凍結乾燥）細胞又はラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞の混合物、例えばラクトバシラス（Lactobacillus）ＬＢは、（任意選択的に発酵培地及び／又は凍結乾燥添加剤と共に）１種又は複数の適切な非毒性の薬剤的に利用可能な不活性担体及び賦形剤と混合され得る。例としては、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、希釈剤、着色剤及び乾燥剤が挙げられる。適切な結合剤は、限定されないが、デンプン、ゼラチン、グルコース若しくはβ－ラクトースなどの天然糖、又はトウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカントゴムなどの合成ガム、又はオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム若しくは塩化ナトリウムであり得る。崩壊剤としては、限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト又はキサンタンガムが挙げられる。適切な滑沢剤としては、タルク及びステアリン酸マグネシウムが挙げられる。適切な乾燥剤としては、ケイ酸が挙げられ、適切な希釈剤としては、無水ラクトースなどのラクトースが挙げられる。適切な凍結乾燥添加剤としては、ラクトース一水和物及び炭酸カルシウムなどの金属炭酸塩が挙げられる。製品混合物は、ゼラチンカプセルなどの標準的カプセルケーシングに収容され得る。
【0073】
[0082] 別の態様において、経口懸濁剤のための粉末状の本開示の医薬組成物は、例えば、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の乾燥（例えば、凍結乾燥）細胞又はラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞を（任意選択的に発酵培地及び／又は凍結乾燥添加剤と共に）１種又は複数の適切な非毒性の薬剤的に利用可能な不活性担体及び賦形剤と混合することによって調製され得る。例としては、希釈剤、着香剤、甘味剤及び乾燥剤が挙げられる。適切な乾燥剤としては、ケイ酸が挙げられ、適切な希釈剤としては、ラクトース、例えば無水ラクトース又はショ糖が挙げられ、後者は、甘味剤としての役割も果たし得る。適切な凍結乾燥添加剤としては、ラクトース一水和物及び炭酸カルシウムなどの金属炭酸塩が挙げられる。粉末生成物は、飲用液体と混合する準備が整った状態で標準的サッシェに収容され得る。
【0074】
[0083] 経口投与のための組成物は、液体若しくは固体食品又は栄養性製品（例えば、栄養サプリメント）の一部でもあり得る。例としては、ミルク、ヨーグルト若しくはヨーグルトスタイルの製品、チーズ、アイスクリーム、穀類ベースの製品、ミルクベースの粉末、乳児用調製乳、栄養調合乳、乾燥経口用粗粒若しくは粉末、湿潤経口用ペースト若しくはゼリー、乾燥経管栄養のための粗粒若しくは粉末又は湿潤経管栄養のための流動物が挙げられる。
【0075】
[0084] 更に、本開示の組成物と共に使用される任意選択的な更なる活性成分も存在し得る。任意選択的な活性成分としては、例えば、ビタミン、抗生物質、プロバイオティクス又はプレバイオティクスが挙げられる。その更なる活性成分及び本開示の組成物は、同時投与されるか又は個々の組成物として別々に（例えば、逐次的に）投与され得る。代わりに、活性成分は、同じ組成物に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）又はラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）の混合物、例えばラクトバシラス（Lactobacillus）ＬＢとして、任意選択的に発酵培地及び／又は凍結乾燥添加剤と共に組み込まれ得る。
【0076】
[0085] 本開示の組成物及びその画分は、健康な哺乳動物（例えば、ヒト）の腸の維持並びに腸内のビフィズス菌の量を増加させることによって促進され得る、疾患、例えば抗生物質起因性下痢、腸内毒素症、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療に特に有用である。
【0077】
[0086] 本開示の具体的な実施形態を以下に示す：
実施形態１：腸疾患の発症に対してヒト又は非ヒト動物対象を保護する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量のラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞を対象に投与することを含む方法。
実施形態２：腸疾患の発症に対してヒト又は非ヒト動物対象を保護する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量のラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞を対象に投与することを含む方法。
実施形態３：ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及び／又はラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞は、死細胞である、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態４：腸疾患の発症に対してヒト又は非ヒト動物対象を保護する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量の製品LACTEOL（登録商標）を対象に投与することを含む方法。
実施形態５：腸疾患の発症に対してヒト又は非ヒト動物対象を保護する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量の、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）が増殖されている培地の上清を対象に投与することを含む方法。
実施形態６：腸疾患の発症に対してヒト又は非ヒト動物対象を保護する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量の、実施形態５の上清の画分５２を対象に投与することを含む方法。
実施形態７：対象は、健康なヒトである、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８：ヒト又は非ヒト動物対象において腸疾患を治療する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量のラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞を対象に投与することを含む方法。
実施形態９：ヒト又は非ヒト動物対象において腸疾患を治療する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量のラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞を対象に投与することを含む方法。
実施形態１０：ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及び／又はラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞は、死細胞である、実施形態８又は９に記載の方法。
実施形態１１：ヒト又は非ヒト動物対象において腸疾患を治療する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量の製品LACTEOL（登録商標）を対象に投与することを含む方法。
実施形態１２：ヒト又は非ヒト動物対象において腸疾患を治療する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量の、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）が増殖されている培地の上清を対象に投与することを含む方法。
実施形態１３：ヒト又は非ヒト動物対象において腸疾患を治療する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量の、実施形態１２の上清の画分５２を対象に投与することを含み、画分５２は、サイズ排除ＨＰＬＣによって得られ、Ｃ１８を用いた複数の実行で精製されたLACTEOL（登録商標）又はＬＬＣの上清の画分であり；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析において、それは、約５２００ｍ／ｚ（５２３７．０８ｍ／ｚなど）で単一ピークを有する、方法。
実施形態１４：対象は、ヒトである、実施形態８～１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５：腸疾患は、抗生物質起因性下痢、腸内毒素症、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）から選択される、実施形態８～１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞を含む組成物。
実施形態１７：ラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞も含む、実施形態１５に記載の組成物。
実施形態１８：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞が増殖されている培地を含む組成物。
実施形態１９：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞と、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞が増殖されている培地とを含む組成物。
実施形態２０：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞が増殖されている培地と共に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞を含む組成物。
実施形態２１：ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及び／又はラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞は、死細胞である、実施形態１６～２０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２２：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、LACTEOL（登録商標）を含む組成物。
実施形態２３：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）が増殖されている培地の上清を含む組成物。
実施形態２４：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、実施形態２２の上清の画分５２を含む組成物。
実施形態２５：対象は、健康なヒトである、実施形態１６～２４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２６：腸の疾患を治療するための、実施形態１６～２４のいずれか１つ記載の使用のための組成物。
実施形態２７：ヒト対象における腸の疾患を治療するための、実施形態１６～２４のいずれか１つ記載の使用のための組成物。
実施形態２８：腸疾患は、抗生物質起因性下痢、腸内毒素症、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）から選択される、実施形態２６又は２７に記載の使用のための組成物。
実施形態２９：医薬組成物、食品サプリメント又は栄養サプリメントの形態である、実施形態１６～２８のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
実施形態３０：前記食品サプリメント又は栄養サプリメントは、ミルク、ヨーグルト若しくはヨーグルトスタイルの製品、チーズ、アイスクリーム、穀類ベースの製品、ミルクベースの粉末、乳児用調製乳、栄養調合乳、乾燥経口用粗粒若しくは粉末、湿潤経口用ペースト若しくはゼリー、乾燥経管栄養のための粗粒若しくは粉末又は湿潤経管栄養のための流動物から選択される食品中に含まれる、実施形態２９に記載の使用のための組成物。
実施形態１：腸疾患の発症に対してヒト又は非ヒト動物対象を保護する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量のラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞を対象に投与することを含む方法。
実施形態２：腸疾患の発症に対してヒト又は非ヒト動物対象を保護する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量のラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞を対象に投与することを含む方法。
実施形態３：ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及び／又はラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞は、死細胞である、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態４：腸疾患の発症に対してヒト又は非ヒト動物対象を保護する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量の製品LACTEOL（登録商標）を対象に投与することを含む方法。
実施形態５：腸疾患の発症に対してヒト又は非ヒト動物対象を保護する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量の、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）が増殖されている培地の上清を対象に投与することを含む方法。
実施形態６：腸疾患の発症に対してヒト又は非ヒト動物対象を保護する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量の、実施形態５の上清の画分５２を対象に投与することを含む方法。
実施形態７：対象は、健康なヒトである、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８：ヒト又は非ヒト動物対象において腸疾患を治療する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量のラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞を対象に投与することを含む方法。
実施形態９：ヒト又は非ヒト動物対象において腸疾患を治療する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量のラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞を対象に投与することを含む方法。
実施形態１０：ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及び／又はラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞は、死細胞である、実施形態８又は９に記載の方法。
実施形態１１：ヒト又は非ヒト動物対象において腸疾患を治療する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量の製品LACTEOL（登録商標）を対象に投与することを含む方法。
実施形態１２：ヒト又は非ヒト動物対象において腸疾患を治療する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量の、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）が増殖されている培地の上清を対象に投与することを含む方法。
実施形態１３：ヒト又は非ヒト動物対象において腸疾患を治療する方法であって、ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激するのに有効な量の、実施形態１２の上清の画分５２を対象に投与することを含み、画分５２は、サイズ排除ＨＰＬＣによって得られ、Ｃ１８を用いた複数の実行で精製されたLACTEOL（登録商標）又はＬＬＣの上清の画分であり；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析において、それは、約５２００ｍ／ｚ（５２３７．０８ｍ／ｚなど）で単一ピークを有する、方法。
実施形態１４：対象は、ヒトである、実施形態８～１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５：腸疾患は、抗生物質起因性下痢、腸内毒素症、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）から選択される、実施形態８～１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞を含む組成物。
実施形態１７：ラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞も含む、実施形態１５に記載の組成物。
実施形態１８：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞が増殖されている培地を含む組成物。
実施形態１９：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞と、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞が増殖されている培地とを含む組成物。
実施形態２０：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞が増殖されている培地と共に、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞を含む組成物。
実施形態２１：ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及び／又はラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞は、死細胞である、実施形態１６～２０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２２：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、LACTEOL（登録商標）を含む組成物。
実施形態２３：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の細胞（例えば、死細胞）及びラクトバシラス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）の細胞（例えば、死細胞）が増殖されている培地の上清を含む組成物。
実施形態２４：ヒト又は非ヒト動物の腸内のビフィズス菌の増殖を刺激することにより、ヒト又は非ヒト動物対象の腸の健康を維持及び／又は改善するのに使用するための、実施形態２２の上清の画分５２を含む組成物。
実施形態２５：対象は、健康なヒトである、実施形態１６～２４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２６：腸の疾患を治療するための、実施形態１６～２４のいずれか１つ記載の使用のための組成物。
実施形態２７：ヒト対象における腸の疾患を治療するための、実施形態１６～２４のいずれか１つ記載の使用のための組成物。
実施形態２８：腸疾患は、抗生物質起因性下痢、腸内毒素症、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）から選択される、実施形態２６又は２７に記載の使用のための組成物。
実施形態２９：医薬組成物、食品サプリメント又は栄養サプリメントの形態である、実施形態１６～２８のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
実施形態３０：前記食品サプリメント又は栄養サプリメントは、ミルク、ヨーグルト若しくはヨーグルトスタイルの製品、チーズ、アイスクリーム、穀類ベースの製品、ミルクベースの粉末、乳児用調製乳、栄養調合乳、乾燥経口用粗粒若しくは粉末、湿潤経口用ペースト若しくはゼリー、乾燥経管栄養のための粗粒若しくは粉末又は湿潤経管栄養のための流動物から選択される食品中に含まれる、実施形態２９に記載の使用のための組成物。
【0078】
[0087] 本開示は、例示的な実施形態及び具体的な実施例を参照して本明細書において記述されており、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における修正形態がなされ得ることが当業者によって理解されるであろう。
【実施例】
【0079】
実施例
実施例１
LACTEOL（登録商標）製剤
[0088] 糞便発酵容器に供給するために、LACTEOL（登録商標）粉末が使用された。
実施例１
LACTEOL（登録商標）製剤
[0088] 糞便発酵容器に供給するために、LACTEOL（登録商標）粉末が使用された。
【0080】
糞便発酵 － 凍結標準化接種材料（ＦＳＩ）の調製
[0089] O’Donell MM et al. in Journal of Microbiological Methods. (2016) vol. 9, pages 9-16によって記載された方法と類似の手法で凍結標準化接種材料を調製した。簡潔には、ボランティア／ドナー（ｎ＝５）は、厳密な基準に準拠した：すべてのドナーは、健康な成人であり、提供前の６か月間にわたって抗生物質を摂取しなかった。ドナーからの糞便試料をプラスチック容器に収集し、嫌気的条件の発生器（GENbox anaer、BioMerieux、フランス）を備えたジップバッグに入れ、４℃で保管した。平均で９時間以内に無酸素雰囲気（１０％Ｈ２、０％Ｏ２、０％Ｎ２）下の嫌気性チャンバ（Don Whitley、West Yorkshire、英国）内に糞便試料を移した。嫌気性チャンバ内において、７０μｍフィルター挿入物（Sparks lab supplies、アイルランド）を備えた大きいストマッカーバッグに一緒にプールした。０．０５％（ｗ／ｖ）ｌ－システイン塩酸塩（Sigma Aldrich、アイルランド）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液４００ミリリットル（ｐＨ６．８）（更にリン酸緩衝液と呼ばれる）をストマッカーバッグに添加し、続いて手作業で試料を均質化した。次いで、Sorvall SLA-3000遠心機において、濾過されたスラリーを４０００×ｇで２５分間遠心し、再び嫌気性キャビネット内で４００ｍｌリン酸緩衝液に再懸濁した。次いで、第２の遠心（４０００×ｇで２５分間）を行い、続いて４００ｍｌリン酸緩衝液に再懸濁した。次いで、得られた糞便細菌懸濁液に２００ｍｌのグリセロールを補充し、アリコートに分けて、使用するまで－８０℃で１～９週間凍結した（以下ではＦＳＩと呼ばれる）。遠心工程を除いて、すべての処理は、嫌気性キャビネット内で行われた。ＦＳＩの使用前に、アリコートを、発酵容器内に接種する前に３７℃で０．５～１時間にわたって解凍した。
[0089] O’Donell MM et al. in Journal of Microbiological Methods. (2016) vol. 9, pages 9-16によって記載された方法と類似の手法で凍結標準化接種材料を調製した。簡潔には、ボランティア／ドナー（ｎ＝５）は、厳密な基準に準拠した：すべてのドナーは、健康な成人であり、提供前の６か月間にわたって抗生物質を摂取しなかった。ドナーからの糞便試料をプラスチック容器に収集し、嫌気的条件の発生器（GENbox anaer、BioMerieux、フランス）を備えたジップバッグに入れ、４℃で保管した。平均で９時間以内に無酸素雰囲気（１０％Ｈ２、０％Ｏ２、０％Ｎ２）下の嫌気性チャンバ（Don Whitley、West Yorkshire、英国）内に糞便試料を移した。嫌気性チャンバ内において、７０μｍフィルター挿入物（Sparks lab supplies、アイルランド）を備えた大きいストマッカーバッグに一緒にプールした。０．０５％（ｗ／ｖ）ｌ－システイン塩酸塩（Sigma Aldrich、アイルランド）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液４００ミリリットル（ｐＨ６．８）（更にリン酸緩衝液と呼ばれる）をストマッカーバッグに添加し、続いて手作業で試料を均質化した。次いで、Sorvall SLA-3000遠心機において、濾過されたスラリーを４０００×ｇで２５分間遠心し、再び嫌気性キャビネット内で４００ｍｌリン酸緩衝液に再懸濁した。次いで、第２の遠心（４０００×ｇで２５分間）を行い、続いて４００ｍｌリン酸緩衝液に再懸濁した。次いで、得られた糞便細菌懸濁液に２００ｍｌのグリセロールを補充し、アリコートに分けて、使用するまで－８０℃で１～９週間凍結した（以下ではＦＳＩと呼ばれる）。遠心工程を除いて、すべての処理は、嫌気性キャビネット内で行われた。ＦＳＩの使用前に、アリコートを、発酵容器内に接種する前に３７℃で０．５～１時間にわたって解凍した。
【0081】
糞便発酵 － 遠位結腸モデル
[0090] Fooks LJ及びGibson GRによってAnaerobe (2003) vol. 9 (5), pages 231-42に記載されたように、１リットル当たりの発酵容器（総容積２００ｍｌ）における最終濃度：ペプトン２ｇ、酵母抽出物２ｇ、ＮａＣｌ ０．７６ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．０４ｇ、ＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏ ０．００７ｇ、ＭｇＳＯ４－７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ、ＮａＨＣＯ３ ２ｇ、Tween 80 ２ｍｌ、Ｌ－システイン－ＨＣｌ ０．５ｇ、胆汁酸塩０．５ｇ、可溶性デンプン１０ｇ、ヘミン（３滴の１Ｍ ＮａＯＨに溶解された）０．０５ｇ及びビタミンＫ１（Sigma Aldrich）１０μｌでデンプン補充糞便培地を調製した。LACTEOL（登録商標）３．４ｇ／１００ｍｌ（１００ｍｌ中、３４０ｍｇでLACTEOL（登録商標）の１０個のサッシェ／カプセルに対応する）又は対照として乳酸（３０ｍＭ）、ラクトース（３６ｍＭ）若しくは水の均等な量のいずれかがベース培地１８０ｍｌに補充された。必要に応じて、水を添加して体積を１８７．５ｍｌにした。MultiForsシステム（Infors、英国）の発酵容器に培地を添加し、そのｐＨを６．８に調整し、それぞれの容器を酸素不含Ｎ２で少なくとも１２０分間スパージして、嫌気的条件を確立した。ＦＳＩ １２．５ｍｌを使用して、各容器に接種した。発酵を３７℃で２４時間にわたって実施し、１Ｍ ＮａＯＨ又は１Ｍ ＨＣｌの自動添加によってｐＨ６．８で一定に維持し；酸素不含Ｎ２でスパージし、２００ｒｐｍで連続して攪拌した。発酵からＴ０、１時間（Ｔ１）、２時間（Ｔ２）、３時間（Ｔ３）、４時間（Ｔ４）、５時間（Ｔ５）、６時間（Ｔ６）、２２（Ｔ２２）及び２４時間（Ｔ２４）後の時点で容器のそれぞれから試料を取り除き、処理まで－８０℃で保存した。条件のそれぞれを少なくとも３重反復で試験した。
[0090] Fooks LJ及びGibson GRによってAnaerobe (2003) vol. 9 (5), pages 231-42に記載されたように、１リットル当たりの発酵容器（総容積２００ｍｌ）における最終濃度：ペプトン２ｇ、酵母抽出物２ｇ、ＮａＣｌ ０．７６ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．０４ｇ、ＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏ ０．００７ｇ、ＭｇＳＯ４－７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ、ＮａＨＣＯ３ ２ｇ、Tween 80 ２ｍｌ、Ｌ－システイン－ＨＣｌ ０．５ｇ、胆汁酸塩０．５ｇ、可溶性デンプン１０ｇ、ヘミン（３滴の１Ｍ ＮａＯＨに溶解された）０．０５ｇ及びビタミンＫ１（Sigma Aldrich）１０μｌでデンプン補充糞便培地を調製した。LACTEOL（登録商標）３．４ｇ／１００ｍｌ（１００ｍｌ中、３４０ｍｇでLACTEOL（登録商標）の１０個のサッシェ／カプセルに対応する）又は対照として乳酸（３０ｍＭ）、ラクトース（３６ｍＭ）若しくは水の均等な量のいずれかがベース培地１８０ｍｌに補充された。必要に応じて、水を添加して体積を１８７．５ｍｌにした。MultiForsシステム（Infors、英国）の発酵容器に培地を添加し、そのｐＨを６．８に調整し、それぞれの容器を酸素不含Ｎ２で少なくとも１２０分間スパージして、嫌気的条件を確立した。ＦＳＩ １２．５ｍｌを使用して、各容器に接種した。発酵を３７℃で２４時間にわたって実施し、１Ｍ ＮａＯＨ又は１Ｍ ＨＣｌの自動添加によってｐＨ６．８で一定に維持し；酸素不含Ｎ２でスパージし、２００ｒｐｍで連続して攪拌した。発酵からＴ０、１時間（Ｔ１）、２時間（Ｔ２）、３時間（Ｔ３）、４時間（Ｔ４）、５時間（Ｔ５）、６時間（Ｔ６）、２２（Ｔ２２）及び２４時間（Ｔ２４）後の時点で容器のそれぞれから試料を取り除き、処理まで－８０℃で保存した。条件のそれぞれを少なくとも３重反復で試験した。
【0082】
ＤＮＡの単離
[0091] 軽微な修正を加えた製造元の推奨に従い、QIAamp Fast DNA Stool Miniキット（Qiagen、ドイツ）を使用し、使用されたビーズ式破砕（FastPrep-24、MP Biomedicals、米国）溶液の体積を６００μｌに増加させ、最終溶離体積を３０μｌ ＴＡＥに低減して、糞便発酵試料からのＤＮＡ単離を行った。Qubit dsDNA BRアッセイキットを使用し、品質評価のためにゲル上に試料５μｌを流して、ＤＮＡ濃度を測定することにより、ＤＮＡ量及び品質の評価を行った。
[0091] 軽微な修正を加えた製造元の推奨に従い、QIAamp Fast DNA Stool Miniキット（Qiagen、ドイツ）を使用し、使用されたビーズ式破砕（FastPrep-24、MP Biomedicals、米国）溶液の体積を６００μｌに増加させ、最終溶離体積を３０μｌ ＴＡＥに低減して、糞便発酵試料からのＤＮＡ単離を行った。Qubit dsDNA BRアッセイキットを使用し、品質評価のためにゲル上に試料５μｌを流して、ＤＮＡ濃度を測定することにより、ＤＮＡ量及び品質の評価を行った。
【0083】
１６Ｓメタゲノミクス － 微生物叢分析
ＤＮＡ増幅、索引付け、正規化及びシークエンシング
[0092] Warda AKらによってBehavioural brain research (2018) vol. 362, pages 213-23に記載されたように、ライブラリーの作製を行った。Phusion Polymerase Master Mix及びＶ３－Ｖ４（フォワード５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ－３’（配列番号１）；リバース５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ－３’（配列番号２））プライマー（９８℃３０秒；９８℃１０秒、５５℃１５秒、７２℃２０秒の２５サイクル；７２℃５分）を使用して、１６Ｓ遺伝子のＶ３及びＶ４領域を増幅した。Qubit dsDNA HSアッセイキット及びゲル上へのランニングにより、アンプリコンを品質及び量についてチェックし、Ampure XP磁気ビーズを使用してクリーニングした。Phusion Polymerase Master Mix and Nextera XT Index Kit（９５℃３０秒；９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒の８サイクル；７２℃５分）を用いて、インデックスＰＣＲにクリーニングされたアンプリコン５μｌを鋳型として使用した。索引付けされたアンプリコンを、Ampure X磁気ビーズを用いてクリーニングし、Qubit dsDNA HSアッセイキット及びゲル上へのランニングにより、品質及び量をチェックした。すべての試料を水中で４ｎＭに規準化し、続いて各試料５μｌを一緒にプールし、Illumina MiSeqシークエンシングのためにGTAC（ドイツ）に送った。
ＤＮＡ増幅、索引付け、正規化及びシークエンシング
[0092] Warda AKらによってBehavioural brain research (2018) vol. 362, pages 213-23に記載されたように、ライブラリーの作製を行った。Phusion Polymerase Master Mix及びＶ３－Ｖ４（フォワード５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ－３’（配列番号１）；リバース５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ－３’（配列番号２））プライマー（９８℃３０秒；９８℃１０秒、５５℃１５秒、７２℃２０秒の２５サイクル；７２℃５分）を使用して、１６Ｓ遺伝子のＶ３及びＶ４領域を増幅した。Qubit dsDNA HSアッセイキット及びゲル上へのランニングにより、アンプリコンを品質及び量についてチェックし、Ampure XP磁気ビーズを使用してクリーニングした。Phusion Polymerase Master Mix and Nextera XT Index Kit（９５℃３０秒；９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒の８サイクル；７２℃５分）を用いて、インデックスＰＣＲにクリーニングされたアンプリコン５μｌを鋳型として使用した。索引付けされたアンプリコンを、Ampure X磁気ビーズを用いてクリーニングし、Qubit dsDNA HSアッセイキット及びゲル上へのランニングにより、品質及び量をチェックした。すべての試料を水中で４ｎＭに規準化し、続いて各試料５μｌを一緒にプールし、Illumina MiSeqシークエンシングのためにGTAC（ドイツ）に送った。
【0084】
１６Ｓデータ分析
[0093] 未加工読み取り値の質をFastQC v0.11.3で可視化した。次いで、Callahan BJ et al .Nat Methods (2016) vol. 13 (7), pages 581-3に従い、DADA2パッケージ（v1.03）で分析するために読み取り値をR v3.3.0にインポートした。シークエンシングプロセス中に導入されたエラーを修正し、リボソーム配列バリアント（ＲＳＶ）を産生した。これらをエクスポートし、ChimeraSlayer gold database v20110519と共にUSEARCH v8.1.1861に実装されたデノボ及び参照ベースのキメラのフィルタリングを用いて、更なるキメラをフィルタリングした。残りのＲＳＶをＲＤＰデータベース１１．４バージョンに対してmothur v1.38［Schloss PD et al. in Applied and environmental microbiology (2009) vol. 75 (23), pages 7537-41を参照されたい］で分類し、ＳＰＩＮＧＯで種レベルに分類した［Allard G et al. in BMC bioinformatics (2015) vol, 16, page 324を参照されたい］。細菌又は古細菌のドメイン分類を有するＲＳＶのみを更なる分析のために保持した。中間点で根付いたＲＳＶ配列の系統樹をFastTreeで作成した［Price MN et al. Molecular biology and evolution (2009) vol. 26 (7), pages 1641-50を参照されたい］。PhyloSeq v1.16.2を使用して、α多様性及びβ多様性が作成され、Ape v3.5で実行される主座標分析にも使用された。有意差分析をＲＳＶレベルについてESeq2 v1.12.4［Love MI et al. Genome Biol. (2014) vol. 15 (12), page 550を参照されたい］で行い、属に対して、門についてのウィルコクソン検定を行った。ベンジャミニホッホベルク法を用いて、必要に応じてＰ値を調整した。Ｒにおけるすべての可視化がggplot2 v2.2.1で実施された。この刊行物で議論されているシークエンシングデータは、Sequence Read Archive（ＳＲＡ）に寄託されており、アクセッション番号ＰＲＪＮＡ５４５４０５でアクセス可能である。
[0093] 未加工読み取り値の質をFastQC v0.11.3で可視化した。次いで、Callahan BJ et al .Nat Methods (2016) vol. 13 (7), pages 581-3に従い、DADA2パッケージ（v1.03）で分析するために読み取り値をR v3.3.0にインポートした。シークエンシングプロセス中に導入されたエラーを修正し、リボソーム配列バリアント（ＲＳＶ）を産生した。これらをエクスポートし、ChimeraSlayer gold database v20110519と共にUSEARCH v8.1.1861に実装されたデノボ及び参照ベースのキメラのフィルタリングを用いて、更なるキメラをフィルタリングした。残りのＲＳＶをＲＤＰデータベース１１．４バージョンに対してmothur v1.38［Schloss PD et al. in Applied and environmental microbiology (2009) vol. 75 (23), pages 7537-41を参照されたい］で分類し、ＳＰＩＮＧＯで種レベルに分類した［Allard G et al. in BMC bioinformatics (2015) vol, 16, page 324を参照されたい］。細菌又は古細菌のドメイン分類を有するＲＳＶのみを更なる分析のために保持した。中間点で根付いたＲＳＶ配列の系統樹をFastTreeで作成した［Price MN et al. Molecular biology and evolution (2009) vol. 26 (7), pages 1641-50を参照されたい］。PhyloSeq v1.16.2を使用して、α多様性及びβ多様性が作成され、Ape v3.5で実行される主座標分析にも使用された。有意差分析をＲＳＶレベルについてESeq2 v1.12.4［Love MI et al. Genome Biol. (2014) vol. 15 (12), page 550を参照されたい］で行い、属に対して、門についてのウィルコクソン検定を行った。ベンジャミニホッホベルク法を用いて、必要に応じてＰ値を調整した。Ｒにおけるすべての可視化がggplot2 v2.2.1で実施された。この刊行物で議論されているシークエンシングデータは、Sequence Read Archive（ＳＲＡ）に寄託されており、アクセッション番号ＰＲＪＮＡ５４５４０５でアクセス可能である。
【0085】
ｑＰＣＲ
[0094] 単離ＤＮＡを用いて、総微生物ロード及びビフィズス菌ロードを相対的に定量化した。LightCycler480プレート及び接着性カバー（Roche）を使用して、３８４ウェルLightCycler 480 PCR（Roche）で反応を実施した。１５μｌ反応は、水６．５μｌ、２×SensiFAST（商標）SYBR No-ROX Master Mix（Bioline）７．５μｌ、それぞれ１０μＭプライマー（フォワード及びリバース）０．３μｌ及びＤＮＡ試料１μｌをそれぞれ含有した。ＤＮＡの代わりに水を使用して、鋳型対照（ＮＴＣ）は、作成しなかった。使用前に試料を１００倍希釈した。各反応を四重反復で実施した。総菌数に使用されたプライマーＵ１６ＳＲＴ－Ｆ（５－ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ－３（配列番号３）、Ｕ１６ＳＲＴ－Ｒ（５－ＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ－３（配列番号４））及びビフィズス菌定量化に使用されたプライマーＢｉｆ－ｘｆｐ－Ｆ１（５－ＣＧＴＣＣＧＴＴＣＴＡＣＣＣＧＡＴＧ－３（配列番号５））、Ｂｉｆ－ｘｆｐ－Ｒ１（５－ＧＧＴＣＴＴＣＴＴＧＣＣＧＴＣＧＡＴ－３（配列番号６））。サイクルパラメータは、９５℃で５分間、続いて９５℃で１０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で３０秒の４５サイクルであった。融解曲線分析（６０～９７℃）は、非特異的な増幅を排除するためにすべてのプログラムの最後に含まれた。交差点（Ｃｐ）値及び融解温度は、ソフトウェア機器を使用して自動的に計算された。ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７の一晩増殖された培養液１０ｍｌから単離されたＤＮＡの１０倍希釈を用いて、プライマーの効率をチェックし、Ｕ１６ＳＲＴ及びＢｉｆ－ｘｆｐプライマーのそれぞれについて、９５．７％及び９５．５％に等しいＥが得られた。両方の微生物群に対する標準曲線として、同じ希釈範囲を用いてＣＦＵ／ｍｌをＣｐ値と相関させた。同時に、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７ゲノムにおける１６Ｓ遺伝子の４コピーに基づいて、１６Ｓｒ ＲＮＡコピー数／ｍｌを計算した［ｒｒｎＤＢデータベースに基づいて、細菌ゲノムの平均コピー数は、４．９である（https://rrndb.umms.med.umich.edu/；２０１８年１２月１２日エントリー）］。
[0094] 単離ＤＮＡを用いて、総微生物ロード及びビフィズス菌ロードを相対的に定量化した。LightCycler480プレート及び接着性カバー（Roche）を使用して、３８４ウェルLightCycler 480 PCR（Roche）で反応を実施した。１５μｌ反応は、水６．５μｌ、２×SensiFAST（商標）SYBR No-ROX Master Mix（Bioline）７．５μｌ、それぞれ１０μＭプライマー（フォワード及びリバース）０．３μｌ及びＤＮＡ試料１μｌをそれぞれ含有した。ＤＮＡの代わりに水を使用して、鋳型対照（ＮＴＣ）は、作成しなかった。使用前に試料を１００倍希釈した。各反応を四重反復で実施した。総菌数に使用されたプライマーＵ１６ＳＲＴ－Ｆ（５－ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ－３（配列番号３）、Ｕ１６ＳＲＴ－Ｒ（５－ＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ－３（配列番号４））及びビフィズス菌定量化に使用されたプライマーＢｉｆ－ｘｆｐ－Ｆ１（５－ＣＧＴＣＣＧＴＴＣＴＡＣＣＣＧＡＴＧ－３（配列番号５））、Ｂｉｆ－ｘｆｐ－Ｒ１（５－ＧＧＴＣＴＴＣＴＴＧＣＣＧＴＣＧＡＴ－３（配列番号６））。サイクルパラメータは、９５℃で５分間、続いて９５℃で１０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で３０秒の４５サイクルであった。融解曲線分析（６０～９７℃）は、非特異的な増幅を排除するためにすべてのプログラムの最後に含まれた。交差点（Ｃｐ）値及び融解温度は、ソフトウェア機器を使用して自動的に計算された。ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７の一晩増殖された培養液１０ｍｌから単離されたＤＮＡの１０倍希釈を用いて、プライマーの効率をチェックし、Ｕ１６ＳＲＴ及びＢｉｆ－ｘｆｐプライマーのそれぞれについて、９５．７％及び９５．５％に等しいＥが得られた。両方の微生物群に対する標準曲線として、同じ希釈範囲を用いてＣＦＵ／ｍｌをＣｐ値と相関させた。同時に、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７ゲノムにおける１６Ｓ遺伝子の４コピーに基づいて、１６Ｓｒ ＲＮＡコピー数／ｍｌを計算した［ｒｒｎＤＢデータベースに基づいて、細菌ゲノムの平均コピー数は、４．９である（https://rrndb.umms.med.umich.edu/；２０１８年１２月１２日エントリー）］。
【0086】
代謝産物分析
[0095] 試料を氷上で解凍し、最高速度で１分間遠心した。０．２μｍフィルターを通して上清を濾過し、ＨＰＬＣ容器に移し、測定まで－２０℃で保管した。MS-Omicsによって試料の分析を以下の通りに行った：塩酸を使用してＳＣＦＡ分析試料を酸性化し、重水素標識化内標準を添加した。すべての試料を無作為な順序で分析した。四重極検出器（5977B、Agilent）と連結されたＧＣ（7890B、Agilent）に設置された高極性カラム（Zebron- ZB-FFAP、GC Cap.カラム３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を使用して分析を実施した。代謝産物分析を目立たせるために、Smartら（DOI:10.1038/nprot.2010.108）によって記載されたプロトコルに従い、クロロギ酸メチルで試料を誘導体化した。すべての試料を無作為な順序で分析した。四重極型質量検出器（5977B、Agilent）と連結されたガスクロマトグラフィー（7890B、Agilent）を使用して分析を実施した。いずれの場合にも、ChemStation（Agilent）によってシステムを制御した。JohnsenによってJournal of chromatography A. (2017) vol. 1503, pages 57-64に記載されたPARADISeソフトウェアを使用して、Matlab R2014b（Mathworks, Inc.）にデータをインポート及び処理する前に、Chemstation（Agilent）を使用してnetCDFフォーマットに生データを変換した。
[0095] 試料を氷上で解凍し、最高速度で１分間遠心した。０．２μｍフィルターを通して上清を濾過し、ＨＰＬＣ容器に移し、測定まで－２０℃で保管した。MS-Omicsによって試料の分析を以下の通りに行った：塩酸を使用してＳＣＦＡ分析試料を酸性化し、重水素標識化内標準を添加した。すべての試料を無作為な順序で分析した。四重極検出器（5977B、Agilent）と連結されたＧＣ（7890B、Agilent）に設置された高極性カラム（Zebron- ZB-FFAP、GC Cap.カラム３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を使用して分析を実施した。代謝産物分析を目立たせるために、Smartら（DOI:10.1038/nprot.2010.108）によって記載されたプロトコルに従い、クロロギ酸メチルで試料を誘導体化した。すべての試料を無作為な順序で分析した。四重極型質量検出器（5977B、Agilent）と連結されたガスクロマトグラフィー（7890B、Agilent）を使用して分析を実施した。いずれの場合にも、ChemStation（Agilent）によってシステムを制御した。JohnsenによってJournal of chromatography A. (2017) vol. 1503, pages 57-64に記載されたPARADISeソフトウェアを使用して、Matlab R2014b（Mathworks, Inc.）にデータをインポート及び処理する前に、Chemstation（Agilent）を使用してnetCDFフォーマットに生データを変換した。
【0087】
結果
微生物の変化 － １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子メタゲノミクス
[0096] 発酵中に収集された試料からＤＮＡを単離し、１６Ｓｒ ＲＮＡ遺伝子アンプリコンシークエンシングを行った。遺伝子レベルにおいて、すべての実験容器における発行開始時に高い多様性が確認され、ヒト腸マイクロバイオームの高い多様性を意味した。経時的に組成物が徐々にすべての容器において変化し、水の容器で起こった変化が最も遅く、乳酸及びLACTEOL（登録商標）容器内で起こった変化が最も速かった。実際に、エシェリキア（Escherichia）／シゲラ（Shigella）の最初の増加後、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の相対存在量の劇的な増加がLACTEOL（登録商標）容器で起こり、他の容器ではその程度が少なかった。確認された変化は、反復容器において再現性があったが、おそらく１グループ当たりの試料数が限定されていたため、科レベルでの有意な変化を検出することはできなかった（ウィルコクソン検定）。属レベルでは、水容器内で２４時間にわたって統計学的に有意な変化が確認され（ウィルコクソン検定）、この条件について４重反復が実施され、これは、このグループに対して力を増加させた可能性が高い。同様に、Chao1及びShannon指数によって測定されるα－多様性も経時的に明らかに減少した。α多様性のこの低下は、閉じたシステムで起こる種の自然な損失を反映する可能性が高い。しかしながら、選択された分類群の有意な異常増殖の現象において、残りの分類群のレベルが検出レベル未満であり得るため、α多様性の低下も確認され得る。それにもかかわらず、０、６及び２４時間で試験された条件間でのα多様性の統計学的に有意な変化だけでなく、個々の条件に対する変化も確認されなかった。４重反復を有した水容器を除外すると、１つの条件当たりの反復数の制限が再びその原因であり得る。
微生物の変化 － １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子メタゲノミクス
[0096] 発酵中に収集された試料からＤＮＡを単離し、１６Ｓｒ ＲＮＡ遺伝子アンプリコンシークエンシングを行った。遺伝子レベルにおいて、すべての実験容器における発行開始時に高い多様性が確認され、ヒト腸マイクロバイオームの高い多様性を意味した。経時的に組成物が徐々にすべての容器において変化し、水の容器で起こった変化が最も遅く、乳酸及びLACTEOL（登録商標）容器内で起こった変化が最も速かった。実際に、エシェリキア（Escherichia）／シゲラ（Shigella）の最初の増加後、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の相対存在量の劇的な増加がLACTEOL（登録商標）容器で起こり、他の容器ではその程度が少なかった。確認された変化は、反復容器において再現性があったが、おそらく１グループ当たりの試料数が限定されていたため、科レベルでの有意な変化を検出することはできなかった（ウィルコクソン検定）。属レベルでは、水容器内で２４時間にわたって統計学的に有意な変化が確認され（ウィルコクソン検定）、この条件について４重反復が実施され、これは、このグループに対して力を増加させた可能性が高い。同様に、Chao1及びShannon指数によって測定されるα－多様性も経時的に明らかに減少した。α多様性のこの低下は、閉じたシステムで起こる種の自然な損失を反映する可能性が高い。しかしながら、選択された分類群の有意な異常増殖の現象において、残りの分類群のレベルが検出レベル未満であり得るため、α多様性の低下も確認され得る。それにもかかわらず、０、６及び２４時間で試験された条件間でのα多様性の統計学的に有意な変化だけでなく、個々の条件に対する変化も確認されなかった。４重反復を有した水容器を除外すると、１つの条件当たりの反復数の制限が再びその原因であり得る。
【0088】
[0097] 個体間の微生物叢多様性（β多様性）を更に調べるために、主座標分析（ＰＣｏＡ）アプローチを用いた。微生物叢組成物の明確なシフトが実験の２４時間中に起こったことが明らかとなり、発酵の長さは、多様性に対して主な影響を有し、ＰＣ１は、閉じたシステムで予想される変動の６６．０７％を説明する。初めに、すべての容器が互いに確実にクラスター形成し、これは、開始条件が十分に標準化されたことを再び意味する。発酵の最後に、微生物叢がＰＣ２に沿って広がる（変動の１２．４４％が説明される）。特に、LACTEOL（登録商標）容器からの微生物叢は、ラクトース容器からの微生物叢と共にＰＣ２軸の上部にクラスター形成し、乳酸容器からの微生物叢は、水容器からの微生物叢と共にＰＣ２軸の低い部分にクラスター形成した（図２）。０、６及び２４時間で試験された条件間でのβ多様性の統計学的に有意な変化だけでなく、個々の条件に対する変化も確認されなかった。１条件当たりの反復数の制限が再びその原因であり得る。
【0089】
[0098] 最後に、ＲＳＶレベルでの分析により、より具体的に分類学的差を評価することが可能となった。２６ＲＳＶの存在量が増加したのに対して、３３ＲＳＶは、水の容器と比べてLACTEOL（登録商標）容器において低減した。同時に、３ＲＳＶ及び１４ＲＳＶのみの存在量が、水の容器とそれぞれ比較して乳酸及びラクトース容器で変化した。特に、LACTEOL（登録商標）容器で増加した６ＲＳＶは、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に割り当てられ、それらの１つのみ、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）を種のレベルに割り当てることができた。ラクトース容器では、水の容器と比較して、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）に割り当てられた５ＲＳＶのレベルが増加し、それらの３つのみがLACTEOL（登録商標）容器と重複した。
【0090】
[0099] 経時的な存在量の変化の分析により、少なくとも１つの条件において、豊富さが異なる３０２ＲＳＶが得られた。特に、３６ＲＳＶは、すべての条件で経時的に増加したのに対して、１０８ＲＳＶは、低減した。８ＲＳＶは、LACTEOL（登録商標）容器において、２０ＲＳＶは、ラクトースにおいて、４ＲＳＶは、乳酸において、及び１９ＲＳＶは、水の容器において特異的に変化した。
【0091】
LACTEOL（登録商標）は、発酵中のビフィズス菌の数を増加させる
[00100] 発光の開始時、容器のいずれかの間でビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）レベル（一元配置分散分析；Ｆ３，８＝０．９１２、ｐ＝０．４７７）及び総細菌ロード（一元配置分散分析；Ｆ３，８＝０．０７４、ｐ＝０．９７２）の差はなかった（図１）。２４時間の発酵後、容器間のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）レベルの差があった（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０３１）（図１）。水及びLACTEOL（登録商標）が補充された容器におけるビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）レベルは、有意に異なり（手作業の事後検定（post-hoc）、多重比較に対して制御されたｐ値、ｐ＝０．００７＜α／ｋ）、他のすべての容器間の他の差はわずかであった。また、各容器における経時的なビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の増加は、有意ではなかった（関連試料のウィルコクソン符号順位検定、ｐ＝０．１０９）。同時に、容器補充は、２４時間発酵で総細菌ロードに対して有意な効果を有しなかった（ウェルチの検定、ｐ＝０．１０８；ブラウン・フォーサイス検定、ｐ＝０．２８５）（図１）。時間の経過による変化もなかった（関連試料のウィルコクソン符号順位検定、ｐ≧０．１０９）。
[00100] 発光の開始時、容器のいずれかの間でビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）レベル（一元配置分散分析；Ｆ３，８＝０．９１２、ｐ＝０．４７７）及び総細菌ロード（一元配置分散分析；Ｆ３，８＝０．０７４、ｐ＝０．９７２）の差はなかった（図１）。２４時間の発酵後、容器間のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）レベルの差があった（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０３１）（図１）。水及びLACTEOL（登録商標）が補充された容器におけるビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）レベルは、有意に異なり（手作業の事後検定（post-hoc）、多重比較に対して制御されたｐ値、ｐ＝０．００７＜α／ｋ）、他のすべての容器間の他の差はわずかであった。また、各容器における経時的なビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の増加は、有意ではなかった（関連試料のウィルコクソン符号順位検定、ｐ＝０．１０９）。同時に、容器補充は、２４時間発酵で総細菌ロードに対して有意な効果を有しなかった（ウェルチの検定、ｐ＝０．１０８；ブラウン・フォーサイス検定、ｐ＝０．２８５）（図１）。時間の経過による変化もなかった（関連試料のウィルコクソン符号順位検定、ｐ≧０．１０９）。
【0092】
代謝産物の変化
[00101] 発酵プロセスのモニタリングにより、乳酸又は水の対照と比較して、LACTEOL（登録商標）の存在下でｐＨを制御するために、およそ４倍多い量のＮａＯＨが必要であること（及び長期の必要性）が明らかとなった。このことから、LACTEOL（登録商標）の存在下では、発酵プロセスによってより多量の酸が生成されたこと及びこのプロセスがより長い時間維持されたことが示唆される。発酵前及び後に容器に存在する化合物の性質を解明するために、メタボロミクス分析を実施した。水、乳酸及びラクトースが補充された容器から発酵開始時に収集された試料は、互いに密接にクラスターを形成したのに対して、LACTEOL（登録商標）容器からの試料は、別々のクラスターを形成した。特に、最初に、３３のアノテートされた化合物は、水の容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において高いレベルを有した。２４時間の発酵後、すべての容器における代謝組成物がシフトし、LACTEOL（登録商標）容器における変化が最も顕著であった。この段階では、３９のアノテートされた化合物は、水の容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において有意に高いレベルを有した。
[00101] 発酵プロセスのモニタリングにより、乳酸又は水の対照と比較して、LACTEOL（登録商標）の存在下でｐＨを制御するために、およそ４倍多い量のＮａＯＨが必要であること（及び長期の必要性）が明らかとなった。このことから、LACTEOL（登録商標）の存在下では、発酵プロセスによってより多量の酸が生成されたこと及びこのプロセスがより長い時間維持されたことが示唆される。発酵前及び後に容器に存在する化合物の性質を解明するために、メタボロミクス分析を実施した。水、乳酸及びラクトースが補充された容器から発酵開始時に収集された試料は、互いに密接にクラスターを形成したのに対して、LACTEOL（登録商標）容器からの試料は、別々のクラスターを形成した。特に、最初に、３３のアノテートされた化合物は、水の容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において高いレベルを有した。２４時間の発酵後、すべての容器における代謝組成物がシフトし、LACTEOL（登録商標）容器における変化が最も顕著であった。この段階では、３９のアノテートされた化合物は、水の容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において有意に高いレベルを有した。
【0093】
短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）
[00102] 産生された代謝産物の性質を同定するために、本発明者らは、ＳＣＦＡ、特にその有益な作用について知られている酪酸に注目した。発酵の開始前に、個々のＳＣＦＡのレベルは、低く、本発明者らにより、酢酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０３７；ボンフェローニ（Bonferroni）事後検定、ｐ＞０．０５）、イソ酪酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０２３；ボンフェローニ事後検定、ｐ＞０．０５）及び吉草酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝１．０００）のレベルにおいて容器間の差は確認されなかった。LACTEOL（登録商標）容器において、本発明者らは、乳酸容器と比べてわずかに高いレベルの酪酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０３０；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０５０）及びプロピオン酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０２６；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０１６）を検出したが、水又はラクトース容器と比べて差はなかった（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＜０．０５；ボンフェローニ事後検定、ｐ＞０．０５）。ギ酸のレベルは、乳酸容器とラクトース容器との間でのみ異なった（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０１２；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０１３）。２４時間の発酵後、本発明者らは、他のすべての容器と比べてLACTEOL（登録商標）容器の酢酸レベルが高いことを確認した。更に、２４時間の発酵後、ギ酸レベルは、水容器及びラクトース容器と比べてLACTEOL（登録商標）容器において有意に高かった。発酵後、プロピオン酸（Ｆ（３，９）＝０．３８２、ｐ＝０．７６９）、酪酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．４０１）、イソ酪酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０９４）及び吉草酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．２０５）レベルにおいて容器間で有意な差はなかった。すべての試料中のイソ吉草酸、ヘキサン酸及びヘプタン酸のレベルは、検出下限（ＬＯＤ）未満であった。更に、発酵前の吉草酸濃度は、ＬＯＤ未満であった。
[00102] 産生された代謝産物の性質を同定するために、本発明者らは、ＳＣＦＡ、特にその有益な作用について知られている酪酸に注目した。発酵の開始前に、個々のＳＣＦＡのレベルは、低く、本発明者らにより、酢酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０３７；ボンフェローニ（Bonferroni）事後検定、ｐ＞０．０５）、イソ酪酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０２３；ボンフェローニ事後検定、ｐ＞０．０５）及び吉草酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝１．０００）のレベルにおいて容器間の差は確認されなかった。LACTEOL（登録商標）容器において、本発明者らは、乳酸容器と比べてわずかに高いレベルの酪酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０３０；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０５０）及びプロピオン酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０２６；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０１６）を検出したが、水又はラクトース容器と比べて差はなかった（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＜０．０５；ボンフェローニ事後検定、ｐ＞０．０５）。ギ酸のレベルは、乳酸容器とラクトース容器との間でのみ異なった（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０１２；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０１３）。２４時間の発酵後、本発明者らは、他のすべての容器と比べてLACTEOL（登録商標）容器の酢酸レベルが高いことを確認した。更に、２４時間の発酵後、ギ酸レベルは、水容器及びラクトース容器と比べてLACTEOL（登録商標）容器において有意に高かった。発酵後、プロピオン酸（Ｆ（３，９）＝０．３８２、ｐ＝０．７６９）、酪酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．４０１）、イソ酪酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０９４）及び吉草酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．２０５）レベルにおいて容器間で有意な差はなかった。すべての試料中のイソ吉草酸、ヘキサン酸及びヘプタン酸のレベルは、検出下限（ＬＯＤ）未満であった。更に、発酵前の吉草酸濃度は、ＬＯＤ未満であった。
【0094】
ＴＣＡサイクル
[00103] 発酵前に、水と比較して高いレベルのコハク酸がLACTEOL（登録商標）容器において検出され（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０１８、ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０１０）、高いレベルのフマル酸がラクトース容器において検出された（Ｆ（３，９）＝５．５９９、ｐ＝０．０１９；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０１７）。予想通り、乳酸のレベルは、水と比較して乳酸容器において高かった（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０１０、ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．００８）。乳酸レベルは、LACTEOL（登録商標）容器で増加したが、多重比較基準に合格しなかった（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０１０、対比較ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０２８、多重比較調整ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．１７１）。ピルビン酸の差は、乳酸容器とラクトース容器との間で検出された（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０１３、ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０１９）。２４時間の発酵後、フマル酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０２５、ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０３５）、コハク酸（Ｆ（３，９）＝２２．２３９、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定ｐ＜０．０００５）及び乳酸（Ｆ（３，９）＝１２０．２９４、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定ｐ＜０．０００５）のレベルは、水と比較してLACTEOL（登録商標）容器で高かった。LACTEOL（登録商標）容器において見出されたレベルではなく、水と比較して（ボンフェローニ事後検定、両方に対してｐ＜０．０００５）、乳酸のレベルも乳酸（Ｆ（３，９）＝１２０．２９４、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定ｐ＝０．００１）容器及びラクトース（Ｆ（３，９）＝１２０．２９４、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定ｐ＜０．０００５）容器において高かった。残りの６つのＴＣＡサイクル化合物についての測定において、発酵前及び／後に容器間の差はなかった（クラスカル・ウォリス検定ｐ＞０．０５）。
[00103] 発酵前に、水と比較して高いレベルのコハク酸がLACTEOL（登録商標）容器において検出され（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０１８、ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０１０）、高いレベルのフマル酸がラクトース容器において検出された（Ｆ（３，９）＝５．５９９、ｐ＝０．０１９；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０１７）。予想通り、乳酸のレベルは、水と比較して乳酸容器において高かった（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０１０、ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．００８）。乳酸レベルは、LACTEOL（登録商標）容器で増加したが、多重比較基準に合格しなかった（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０１０、対比較ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０２８、多重比較調整ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．１７１）。ピルビン酸の差は、乳酸容器とラクトース容器との間で検出された（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０１３、ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０１９）。２４時間の発酵後、フマル酸（クラスカル・ウォリス検定、ｐ＝０．０２５、ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０３５）、コハク酸（Ｆ（３，９）＝２２．２３９、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定ｐ＜０．０００５）及び乳酸（Ｆ（３，９）＝１２０．２９４、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定ｐ＜０．０００５）のレベルは、水と比較してLACTEOL（登録商標）容器で高かった。LACTEOL（登録商標）容器において見出されたレベルではなく、水と比較して（ボンフェローニ事後検定、両方に対してｐ＜０．０００５）、乳酸のレベルも乳酸（Ｆ（３，９）＝１２０．２９４、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定ｐ＝０．００１）容器及びラクトース（Ｆ（３，９）＝１２０．２９４、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定ｐ＜０．０００５）容器において高かった。残りの６つのＴＣＡサイクル化合物についての測定において、発酵前及び／後に容器間の差はなかった（クラスカル・ウォリス検定ｐ＞０．０５）。
【0095】
アミノ酸
[00104] 発酵前に、１９個の試験されたアミノ酸のうち、１２個は、水容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において高いレベルを有した。特にトリプトファンレベルは、他の容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において高かった（Ｆ（３，９）＝１７．４３１、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定、ｐ≦０．００６）。発酵後、１９個の試験されたアミノ酸のうち、１０個は、水の容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において高いレベルを有した。
[00104] 発酵前に、１９個の試験されたアミノ酸のうち、１２個は、水容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において高いレベルを有した。特にトリプトファンレベルは、他の容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において高かった（Ｆ（３，９）＝１７．４３１、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定、ｐ≦０．００６）。発酵後、１９個の試験されたアミノ酸のうち、１０個は、水の容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において高いレベルを有した。
【0096】
他の代謝産物
[00105] 発酵前に、試験、同定及びアノテートされた６１個の化合物のうち、２０個は、水の容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において高いレベルを有した。発酵後、試験、同定及びアノテートされた６１個の化合物のうち、２６個は、水の容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において高いレベルを有した。
[00105] 発酵前に、試験、同定及びアノテートされた６１個の化合物のうち、２０個は、水の容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において高いレベルを有した。発酵後、試験、同定及びアノテートされた６１個の化合物のうち、２６個は、水の容器と比較してLACTEOL（登録商標）容器において高いレベルを有した。
【0097】
結論
[00106] 実施例１では、ヒト糞便試料が接種された嫌気性バッチ培養物中の微生物叢組成物へのLACTEOL（登録商標）の影響を調べた。LACTEOL（登録商標）は、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）及びＬ．デルブルエッキイー（L. delbrueckii）によって初期発酵中に産生された乳酸並びに凍結乾燥プロセスを促進するために産生後に添加されるラクトースを含有することが知られている。したがって、水以外の更なる対照として、本発明者らは、個々に乳酸及びラクトースでの補充を含めた。マイクロバイオーム分析及び代謝産物分析の両方から発酵前に収集された試料の密なクラスター形成が示され、一方では製剤の再現性が確認され、他方ではヒト腸マイクロバイオームの高い組成多様性が確認された。予想されるように、本発明者らは、マイクロバイオームに関して容器間の差を認識しなかった。しかしながら、LACTEOL（登録商標）容器は、対照を除いて、この条件設定で主にアミノ酸の高レベルの点に関して変化した代謝産物プロファイルを示した。
[00106] 実施例１では、ヒト糞便試料が接種された嫌気性バッチ培養物中の微生物叢組成物へのLACTEOL（登録商標）の影響を調べた。LACTEOL（登録商標）は、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）及びＬ．デルブルエッキイー（L. delbrueckii）によって初期発酵中に産生された乳酸並びに凍結乾燥プロセスを促進するために産生後に添加されるラクトースを含有することが知られている。したがって、水以外の更なる対照として、本発明者らは、個々に乳酸及びラクトースでの補充を含めた。マイクロバイオーム分析及び代謝産物分析の両方から発酵前に収集された試料の密なクラスター形成が示され、一方では製剤の再現性が確認され、他方ではヒト腸マイクロバイオームの高い組成多様性が確認された。予想されるように、本発明者らは、マイクロバイオームに関して容器間の差を認識しなかった。しかしながら、LACTEOL（登録商標）容器は、対照を除いて、この条件設定で主にアミノ酸の高レベルの点に関して変化した代謝産物プロファイルを示した。
【0098】
[00107] すべての容器におけるマイクロバイオーム及び代謝産物の両方が経時的にシフトし、LACTEOL（登録商標）容器の変化が最も顕著であった。LACTEOL（登録商標）補充により、２４時間発酵中のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の相対的及び絶対的存在量が増加した。LACTEOL（登録商標）容器におけるこの増殖と合致して、本発明者らは、ビフィズス菌によって産生されることが以前に示された酢酸、ギ酸及び乳酸のレベルの増加を確認した。ビフィズス菌又はＳＣＦＡのいずれかの存在は、一般に有益であるとみなされている。
【0099】
実施例２
LACTEOL（登録商標）製剤
[00108] 増殖実験において、再構成LACTEOL（登録商標）粉末（０．３４ｇ／ｍｌ）を使用した。代わりに、低ラクトースLACTEOL（登録商標）（ＬＬＬ）を使用した。各調製物は、別段の指定がない限り、溶液１ｍｌにつき５×１０９～１×１０１０細胞体を含有する。
LACTEOL（登録商標）製剤
[00108] 増殖実験において、再構成LACTEOL（登録商標）粉末（０．３４ｇ／ｍｌ）を使用した。代わりに、低ラクトースLACTEOL（登録商標）（ＬＬＬ）を使用した。各調製物は、別段の指定がない限り、溶液１ｍｌにつき５×１０９～１×１０１０細胞体を含有する。
【0100】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）接種材料の製造
[00109] Ｌ－システイン（最終濃度０．６ｇ／Ｌ）及びレズザリン（rezuzarin）（最終濃度１ｍｇ／Ｌ）を補充したＭＲＳブロス（Difco、BD）１０ｍｌを含有する嫌気性ハンゲートチューブにビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）株（表１）の－８０℃ストック１００μｌを注入した。チューブを３７℃で一晩インキュベートした。別段の指定がない限り、１００倍希釈された一晩培養液１００μｌを接種材料として使用した。Ｂ．ビフィダム（B. bifidum）ＬＭＧ１１０４１及びＢ．ガリカム（B. gallicum）ＡＰＣ８３８株については、一晩の増殖が不十分であるため、１０倍希釈一晩培養液１００μｌを使用した。
[00109] Ｌ－システイン（最終濃度０．６ｇ／Ｌ）及びレズザリン（rezuzarin）（最終濃度１ｍｇ／Ｌ）を補充したＭＲＳブロス（Difco、BD）１０ｍｌを含有する嫌気性ハンゲートチューブにビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）株（表１）の－８０℃ストック１００μｌを注入した。チューブを３７℃で一晩インキュベートした。別段の指定がない限り、１００倍希釈された一晩培養液１００μｌを接種材料として使用した。Ｂ．ビフィダム（B. bifidum）ＬＭＧ１１０４１及びＢ．ガリカム（B. gallicum）ＡＰＣ８３８株については、一晩の増殖が不十分であるため、１０倍希釈一晩培養液１００μｌを使用した。
【0101】
【表1】
【0102】
【表2】
【0103】
ビフィドジェニック（Bifidogenic）アッセイ
[00110] 嫌気性ハンゲートチューブ内のＬ－システイン（最終濃度０．６ｇ／Ｌ）及びレサズリン（最終濃度１ｍｇ／Ｌ）が補充された、ベース培地（１０倍又は１５倍希釈；水が補充された場合のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の増殖なし又は最低限の増殖に必要とされる培地のそれぞれのバッチに対して設定された希釈率）ＭＲＳブロス９ｍｌに試験溶液（LACTEOL（登録商標）製剤）又は対照の１つ（主に水）１ｍｌを補充した。次に、ハンゲートチューブに接種し、シリンジ及び針を使用してＴ０試料を採取して、酸素のアクセスを制限した。ハンゲートチューブを３７℃及び一定間隔でインキュベートし、試料を採取した。収集された試料をＰＢＳ中で連続希釈し、Ｌ－システイン（最終濃度０．６ｇ／Ｌ）を補充された新たなＭＲＳ寒天平板上に１００μｌを二重反復でプレーティングした。コロニーのカウント前に、嫌気性発生器（BioMerieux）を備えた広口瓶内でプレートを３７℃で少なくとも４８時間インキュベートした。
[00110] 嫌気性ハンゲートチューブ内のＬ－システイン（最終濃度０．６ｇ／Ｌ）及びレサズリン（最終濃度１ｍｇ／Ｌ）が補充された、ベース培地（１０倍又は１５倍希釈；水が補充された場合のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の増殖なし又は最低限の増殖に必要とされる培地のそれぞれのバッチに対して設定された希釈率）ＭＲＳブロス９ｍｌに試験溶液（LACTEOL（登録商標）製剤）又は対照の１つ（主に水）１ｍｌを補充した。次に、ハンゲートチューブに接種し、シリンジ及び針を使用してＴ０試料を採取して、酸素のアクセスを制限した。ハンゲートチューブを３７℃及び一定間隔でインキュベートし、試料を採取した。収集された試料をＰＢＳ中で連続希釈し、Ｌ－システイン（最終濃度０．６ｇ／Ｌ）を補充された新たなＭＲＳ寒天平板上に１００μｌを二重反復でプレーティングした。コロニーのカウント前に、嫌気性発生器（BioMerieux）を備えた広口瓶内でプレートを３７℃で少なくとも４８時間インキュベートした。
【0104】
LACTEOL（登録商標）処理
（ａ）酵素的処理
[00111] LACTEOL（登録商標）溶液５ｍｌに１０ｍｇのプロテイナーゼＫ（１ｍＭ ＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏが添加された）、トリプシン、ペプシン、プロナーゼ、リゾチーム又はα－キモトリプシンを補充した。LACTEOL（登録商標）溶液の細胞及び上清画分５ｍｌにセルラーゼ１０００単位、α－グルコシダーゼ２５単位、α－アミラーゼ１０００単位及びβ－ガラクトシダーゼ１２５単位を補充した。チューブを振盪しながら３７℃で４時間、続いて９２℃で１時間インキュベートした。ビフィドジェニックアッセイで試験するまで、酵素的処理されたLACTEOL（登録商標）、細胞及び上清画分を４℃で保存した。α－アミラーゼ及びβ－ガラクトシダーゼで処理された上清のｐＨは、酵素添加前に７．１６に増加し、インキュベーション後に元のｐＨに調整して戻し、濾過した。酵素的処理された細胞又は上清１ｍｌをビフィドジェニックアッセイ（１０倍希釈培地）で使用した。
（ａ）酵素的処理
[00111] LACTEOL（登録商標）溶液５ｍｌに１０ｍｇのプロテイナーゼＫ（１ｍＭ ＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏが添加された）、トリプシン、ペプシン、プロナーゼ、リゾチーム又はα－キモトリプシンを補充した。LACTEOL（登録商標）溶液の細胞及び上清画分５ｍｌにセルラーゼ１０００単位、α－グルコシダーゼ２５単位、α－アミラーゼ１０００単位及びβ－ガラクトシダーゼ１２５単位を補充した。チューブを振盪しながら３７℃で４時間、続いて９２℃で１時間インキュベートした。ビフィドジェニックアッセイで試験するまで、酵素的処理されたLACTEOL（登録商標）、細胞及び上清画分を４℃で保存した。α－アミラーゼ及びβ－ガラクトシダーゼで処理された上清のｐＨは、酵素添加前に７．１６に増加し、インキュベーション後に元のｐＨに調整して戻し、濾過した。酵素的処理された細胞又は上清１ｍｌをビフィドジェニックアッセイ（１０倍希釈培地）で使用した。
【0105】
（ｂ）物理的処理
透析
[00112］ 水１５ｍｌに再懸濁されたLACTEOL（登録商標）５．１ｇを、洗浄された１ｋＤａ透析チューブ（Pur-A-Lyser Magna1000、Sigma）に移した。次いで、チューブを脱イオン水４．５Ｌに入れ、４℃で４日間攪拌しながらインキュベートした。水は、毎日取り換えた。チューブの内容物をハンゲートチューブに移し、ビフィドジェニックアッセイ（１０倍希釈培地）で使用する前に４℃で保管した。
透析
[00112］ 水１５ｍｌに再懸濁されたLACTEOL（登録商標）５．１ｇを、洗浄された１ｋＤａ透析チューブ（Pur-A-Lyser Magna1000、Sigma）に移した。次いで、チューブを脱イオン水４．５Ｌに入れ、４℃で４日間攪拌しながらインキュベートした。水は、毎日取り換えた。チューブの内容物をハンゲートチューブに移し、ビフィドジェニックアッセイ（１０倍希釈培地）で使用する前に４℃で保管した。
【0106】
音波処理
[00113] LACTEOL（登録商標）溶液を遠心し、上清を濾過し、細胞ペレットを２回洗浄した。上清及び細胞画分を４時間超音波処理し、ビフィドジェニックアッセイ（１０倍希釈培地）で使用する前に４℃で保管した。
[00113] LACTEOL（登録商標）溶液を遠心し、上清を濾過し、細胞ペレットを２回洗浄した。上清及び細胞画分を４時間超音波処理し、ビフィドジェニックアッセイ（１０倍希釈培地）で使用する前に４℃で保管した。
【0107】
代替の処理 － プロバイオティクス
実験室で製造された乳酸桿菌（Lactobacilli）調製物の製造
[00114] ラクトバシラス（Lactobacillus）株（表１）をＭＲＳプレート上に－８０℃ストックから画線した。ＭＲＳブロス１０ｍｌに単一コロニーを接種し、３７で一晩、嫌気的にインキュベートした。Ｌ－システイン（最終濃度０．６ｇ／Ｌ）が補充されたＭＲＳブロスを含むフラスコについて、１％接種材料を使用した。Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）２ｚの増殖のための培地にカゼインからの１％ペプシンを補充し、その増殖の必要条件を促進した。３７℃で一晩嫌気性インキュベーションした後、フラスコの内容物を大きいペトリ皿に分散させ、凍結乾燥まで－８０℃に置いた。凍結乾燥内容物をプレートから掻き取り、１１０℃で１時間熱処理する（LACTEOL（登録商標）製造中に適用される熱処理）前に０．３４ｇ／ｍｌ水に再懸濁し、使用まで４℃で保存した。
実験室で製造された乳酸桿菌（Lactobacilli）調製物の製造
[00114] ラクトバシラス（Lactobacillus）株（表１）をＭＲＳプレート上に－８０℃ストックから画線した。ＭＲＳブロス１０ｍｌに単一コロニーを接種し、３７で一晩、嫌気的にインキュベートした。Ｌ－システイン（最終濃度０．６ｇ／Ｌ）が補充されたＭＲＳブロスを含むフラスコについて、１％接種材料を使用した。Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）２ｚの増殖のための培地にカゼインからの１％ペプシンを補充し、その増殖の必要条件を促進した。３７℃で一晩嫌気性インキュベーションした後、フラスコの内容物を大きいペトリ皿に分散させ、凍結乾燥まで－８０℃に置いた。凍結乾燥内容物をプレートから掻き取り、１１０℃で１時間熱処理する（LACTEOL（登録商標）製造中に適用される熱処理）前に０．３４ｇ／ｍｌ水に再懸濁し、使用まで４℃で保存した。
【0108】
ビフィズス菌に対する市販の製品の効果
[00115] その日用量に対応する濃度で市販の製品の溶液を調製した。特に、カルチュレル（Culturelle）１カプセルの内容物（ラクチカゼイバチルス・ラムノサス（Lacticaseibacllus rhamnosus）ＧＧ及びイヌリンの１００億個の細胞）を水１ｍｌに再懸濁した。エンテロゲルミナ（Enterogermina）の３つの小瓶の内容物（ＳＡＮＯＦＩ；チルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＳＩＮ、Ｂ．クラウジイ（B. clausii）Ｏ／Ｃ、Ｂ．クラウジイ（B. clausii）Ｔ及びＢ．クラウジイ（B. clausii）Ｎ／Ｒ）の芽胞６０億個）を遠心し（４６９６×ｇで１０分間）、水１ｍｌに再懸濁した。バイオガイア（BioGaia）（リモシラクトバシラス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＤＳＭ１７９３８の１０８ＣＦＵ）５滴を水１ｍｌに再懸濁した。ウルトラリヴレ（Ultra Levure）１カプセルの内容物（BIOCODEX；サッカロマイセス・ブラウディ（Saccharomyces boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－７４５ ２００ｍｇ）を水１ｍｌに再懸濁した。LACTEOL（登録商標）１カプセルの当量（３４０ｍｇ、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）及びＬｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）の１００億個の細胞）を水１ｍｌに再懸濁した。市販の製品溶液１ｍｌを用いて、修正ビフィドジェニックアッセイ（１５倍希釈培地）におけるその効果を試験した。連続希釈された試料を、Ｌ－システイン（０．６ｇ／Ｌ）、シクロヘキシミド（７０ｍｇ／Ｌ）及びムピロシン（５０ｍｇ／Ｌ）を有するＭＲＳプレート上にプレーティングした。製品カウントの選択的計数をＬｂ．ラムノサス（Lb. rhamnosus）ＧＧ（ＭＲＳカウントからビフィズス菌数を引き算する）、Ｂ．クラウジイ（B. clausii）（ＢＨＩ上にプレーティング、好気性インキュベーション）、Ｌｂ．ロイテリ（Lb. reuteri）ＤＳＭ１７９３８（ＭＲＳ＋テトラサイクリン（３０μｇ／ｍＬ）、嫌気性）及びサッカロマイセス・ブラウディ（Saccharomyces boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－７４５（サブロー（Saboraud）（４％ブドウ糖）、好気性インキュベーション）について実施した。
[00115] その日用量に対応する濃度で市販の製品の溶液を調製した。特に、カルチュレル（Culturelle）１カプセルの内容物（ラクチカゼイバチルス・ラムノサス（Lacticaseibacllus rhamnosus）ＧＧ及びイヌリンの１００億個の細胞）を水１ｍｌに再懸濁した。エンテロゲルミナ（Enterogermina）の３つの小瓶の内容物（ＳＡＮＯＦＩ；チルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＳＩＮ、Ｂ．クラウジイ（B. clausii）Ｏ／Ｃ、Ｂ．クラウジイ（B. clausii）Ｔ及びＢ．クラウジイ（B. clausii）Ｎ／Ｒ）の芽胞６０億個）を遠心し（４６９６×ｇで１０分間）、水１ｍｌに再懸濁した。バイオガイア（BioGaia）（リモシラクトバシラス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＤＳＭ１７９３８の１０８ＣＦＵ）５滴を水１ｍｌに再懸濁した。ウルトラリヴレ（Ultra Levure）１カプセルの内容物（BIOCODEX；サッカロマイセス・ブラウディ（Saccharomyces boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－７４５ ２００ｍｇ）を水１ｍｌに再懸濁した。LACTEOL（登録商標）１カプセルの当量（３４０ｍｇ、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）及びＬｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）の１００億個の細胞）を水１ｍｌに再懸濁した。市販の製品溶液１ｍｌを用いて、修正ビフィドジェニックアッセイ（１５倍希釈培地）におけるその効果を試験した。連続希釈された試料を、Ｌ－システイン（０．６ｇ／Ｌ）、シクロヘキシミド（７０ｍｇ／Ｌ）及びムピロシン（５０ｍｇ／Ｌ）を有するＭＲＳプレート上にプレーティングした。製品カウントの選択的計数をＬｂ．ラムノサス（Lb. rhamnosus）ＧＧ（ＭＲＳカウントからビフィズス菌数を引き算する）、Ｂ．クラウジイ（B. clausii）（ＢＨＩ上にプレーティング、好気性インキュベーション）、Ｌｂ．ロイテリ（Lb. reuteri）ＤＳＭ１７９３８（ＭＲＳ＋テトラサイクリン（３０μｇ／ｍＬ）、嫌気性）及びサッカロマイセス・ブラウディ（Saccharomyces boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－７４５（サブロー（Saboraud）（４％ブドウ糖）、好気性インキュベーション）について実施した。
【0109】
LACTEOL（登録商標）精製
固相抽出Ｃ１８カラム
[00116] すべてのＣ１８精製において、Strata Ｃ１８固相抽出カラム（Phenomenex）１０ｇの最大結合能力であることから、LACTEOL（登録商標）製剤の半量（１０ｍｌ中１．７ｇに等しい）を使用した。結果的に、フロー、洗浄液及び溶離画分は、別段の指定がない限り、半量であった。半量のLACTEOL（登録商標）を５０００ｒｐｍで５分間遠心した（ローターTX-400を備えたServall ST 16R）。得られた上清を０．２μｍフィルターで濾過し、固体粒子を除去した。Strata Ｃ１８固相抽出カラム（Phenomenex）１０ｇを真空ポンプに連結し、メタノール１２０ｍｌでコンディショニングし、ＨＰＬＣ水１２０ｍｌで平衡化した。濾過した上清をカラムに適用し、重力で通過させ、得られたフロースルーを回収した。次に、カラムを５％メタノール１２０ｍｌで洗浄し、洗浄液を回収した。カラムを真空乾燥させてから５分後、メタノール１２０ｍｌをカラムに適用して、吸着剤に依然として結合している画分を溶離させ、溶離液を回収した。回収された洗浄液及び溶離画分を回転蒸発させて、溶媒を除去し、水中での初期濃度に試料を濃縮した。フロースルー、洗浄液及び溶離画分を濾過滅菌（０．２μｍフィルター）し、使用するまで４℃で保管した。
固相抽出Ｃ１８カラム
[00116] すべてのＣ１８精製において、Strata Ｃ１８固相抽出カラム（Phenomenex）１０ｇの最大結合能力であることから、LACTEOL（登録商標）製剤の半量（１０ｍｌ中１．７ｇに等しい）を使用した。結果的に、フロー、洗浄液及び溶離画分は、別段の指定がない限り、半量であった。半量のLACTEOL（登録商標）を５０００ｒｐｍで５分間遠心した（ローターTX-400を備えたServall ST 16R）。得られた上清を０．２μｍフィルターで濾過し、固体粒子を除去した。Strata Ｃ１８固相抽出カラム（Phenomenex）１０ｇを真空ポンプに連結し、メタノール１２０ｍｌでコンディショニングし、ＨＰＬＣ水１２０ｍｌで平衡化した。濾過した上清をカラムに適用し、重力で通過させ、得られたフロースルーを回収した。次に、カラムを５％メタノール１２０ｍｌで洗浄し、洗浄液を回収した。カラムを真空乾燥させてから５分後、メタノール１２０ｍｌをカラムに適用して、吸着剤に依然として結合している画分を溶離させ、溶離液を回収した。回収された洗浄液及び溶離画分を回転蒸発させて、溶媒を除去し、水中での初期濃度に試料を濃縮した。フロースルー、洗浄液及び溶離画分を濾過滅菌（０．２μｍフィルター）し、使用するまで４℃で保管した。
【0110】
硫酸アンモニウム沈殿
[00117] 低ラクトースLACTEOL（登録商標）（ＬＬＬ）溶液（１０ｍｌ中の３．４ｇに等しい）を５０００ｒｐｍで１０分間（装置の詳細）遠心した。０．２μｍフィルターを通して、得られた上清を濾過し、固体粒子を除去した。徐々に硫酸アンモニウム３．１８ｇ（飽和５０％に達することを目標として）を上清１０ｍｌに室温において二重反復で溶解した。振とうしながら、室温で１つのフラスコを６時間インキュベートし、第２のフラスコを１時間インキュベートした。次に、フラスコの内容物を４℃で５０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心した。第２フラスコからの上清に硫酸アンモニウムを補充して、飽和６０％に到達させ、上述のようにインキュベートした。飽和８０％に達するまでこのアプローチを続けた（飽和９０％に達するのに必要とされる硫酸アンモニウムは溶解しなかった）。異なる段階で回収された沈殿物を緩衝液（１５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）１０ｍｌに溶解し、Ｃ１８カラムを使用して脱塩するまで４℃で保管した（上記を参照されたい）。
[00117] 低ラクトースLACTEOL（登録商標）（ＬＬＬ）溶液（１０ｍｌ中の３．４ｇに等しい）を５０００ｒｐｍで１０分間（装置の詳細）遠心した。０．２μｍフィルターを通して、得られた上清を濾過し、固体粒子を除去した。徐々に硫酸アンモニウム３．１８ｇ（飽和５０％に達することを目標として）を上清１０ｍｌに室温において二重反復で溶解した。振とうしながら、室温で１つのフラスコを６時間インキュベートし、第２のフラスコを１時間インキュベートした。次に、フラスコの内容物を４℃で５０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心した。第２フラスコからの上清に硫酸アンモニウムを補充して、飽和６０％に到達させ、上述のようにインキュベートした。飽和８０％に達するまでこのアプローチを続けた（飽和９０％に達するのに必要とされる硫酸アンモニウムは溶解しなかった）。異なる段階で回収された沈殿物を緩衝液（１５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）１０ｍｌに溶解し、Ｃ１８カラムを使用して脱塩するまで４℃で保管した（上記を参照されたい）。
【0111】
ＨＰＬＣ分析
未処理試料のＨＰＬＣ分析
[00118] ミリＱ水中において、２分の１（LACTEOL（登録商標）及びＬＬＬ）及び７分の１（Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）及びＬｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii））に上清試料を希釈した。１ｍｌ／分で３０％アセトニトリルの均一濃度勾配を流すToso Haasゲル浸透カラム（直列でTSK gel G2000SW及びG2000SWXL、５μ、７．８×３０ｃｍ）にアリコート１００μｌを適用した。ＨＰＬＣ溶離剤を２１４ｎｍで紫外線吸収によってモニターし、アッセイのために３５分間にわたって１分間隔で画分を回収した。
未処理試料のＨＰＬＣ分析
[00118] ミリＱ水中において、２分の１（LACTEOL（登録商標）及びＬＬＬ）及び７分の１（Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）及びＬｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii））に上清試料を希釈した。１ｍｌ／分で３０％アセトニトリルの均一濃度勾配を流すToso Haasゲル浸透カラム（直列でTSK gel G2000SW及びG2000SWXL、５μ、７．８×３０ｃｍ）にアリコート１００μｌを適用した。ＨＰＬＣ溶離剤を２１４ｎｍで紫外線吸収によってモニターし、アッセイのために３５分間にわたって１分間隔で画分を回収した。
【0112】
Ｃ１８精製試料のＨＰＬＣ分析
[00119] １ｍｌ／分で３５分間にわたって３０％アセトニトリル０．１％ＴＦＡの均一濃度勾配を流すToso Haasゲル浸透カラム（直列でTSK gel G2000SW及びG2000SWXL、５μ、７．８×３０ｃｍ）に上清試料のアリコート２７×８０μｌ（合計２１６０μｌ）を適用した。ＨＰＬＣ溶離剤を２１４ｎｍで紫外線吸収によってモニターし、アッセイのために１分間隔で画分を回収した。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析において画分３７～６０を試験し、遠心後にビフィドジェニックアッセイにおいて試験した。
[00119] １ｍｌ／分で３５分間にわたって３０％アセトニトリル０．１％ＴＦＡの均一濃度勾配を流すToso Haasゲル浸透カラム（直列でTSK gel G2000SW及びG2000SWXL、５μ、７．８×３０ｃｍ）に上清試料のアリコート２７×８０μｌ（合計２１６０μｌ）を適用した。ＨＰＬＣ溶離剤を２１４ｎｍで紫外線吸収によってモニターし、アッセイのために１分間隔で画分を回収した。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析において画分３７～６０を試験し、遠心後にビフィドジェニックアッセイにおいて試験した。
【0113】
非ビフィズス菌株の試験
[00120] Ｅ．フェシウム（E. faecium）及び大腸菌（E. coli）の－８０℃ストックをトリプトンダイズ寒天（ＴＳＡ、製造元）及びLuria-Bertani（ＬＢ、製造元）プレート上にそれぞれ画線し、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを使用して、ＴＳＢ又はＬＢブロスのいずれか２０ｍｌを接種し、続いて３７℃で一晩インキュベートした。１．１×ＭＲＳブロス（０．６ｇ／Ｌ Ｌ－システイン、１ｍｇ／Ｌレサズリン）或いは希釈範囲のＬＢ（水若しくはＰＢＳ中）又はＰＢＳのいずれか９ｍｌを含有する嫌気性ハンゲートチューブに水１ｍｌ又はLACTEOL（登録商標）溶液１ｍｌを補充し、１００倍希釈一晩培養液１００μｌを接種した。嫌気性チューブを３７℃で一晩インキュベートした。収集した試料を連続希釈し、ＴＳＡ又はＬＢプレートのいずれかにプレーティングし、続いて３７℃で一晩好気性インキュベーションを行った。
[00120] Ｅ．フェシウム（E. faecium）及び大腸菌（E. coli）の－８０℃ストックをトリプトンダイズ寒天（ＴＳＡ、製造元）及びLuria-Bertani（ＬＢ、製造元）プレート上にそれぞれ画線し、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを使用して、ＴＳＢ又はＬＢブロスのいずれか２０ｍｌを接種し、続いて３７℃で一晩インキュベートした。１．１×ＭＲＳブロス（０．６ｇ／Ｌ Ｌ－システイン、１ｍｇ／Ｌレサズリン）或いは希釈範囲のＬＢ（水若しくはＰＢＳ中）又はＰＢＳのいずれか９ｍｌを含有する嫌気性ハンゲートチューブに水１ｍｌ又はLACTEOL（登録商標）溶液１ｍｌを補充し、１００倍希釈一晩培養液１００μｌを接種した。嫌気性チューブを３７℃で一晩インキュベートした。収集した試料を連続希釈し、ＴＳＡ又はＬＢプレートのいずれかにプレーティングし、続いて３７℃で一晩好気性インキュベーションを行った。
【0114】
結果
選択されたビフィズス菌の増殖に対するLACTEOL（登録商標）及びLACTEOL（登録商標）様製剤の効果
[00121] LACTEOL（登録商標）は、純粋培養における乳児関連及び成人関連ビフィズス菌の増殖を刺激した。具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７（Ｂ１；ｔ４＝１８．５５５、ｐ＜０．０００５）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）亜種ロンガム（longum）ＪＣＭ７０５３（Ｂ２；ｔ４＝１５．６２６、ｐ＝０．００３）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）ＬＭＧ１１０４１（ＡＴＣＣ２９５２１）（Ｂ３；ｔ４＝－７．４３２、ｐ＝０．００２）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）ＪＣＭ７０１７（Ｂ４；ｔ４＝７．６６７、ｐ＝０．０１６）、ビフィドバクテリウム・ガリカム（Bifidobacterium gallicum）ＡＰＣ８３８（ＡＴＣＣ４９８５０）（Ｂ５；ｔ４＝－２．８２８、ｐ＝０．０４７）、ビフィドバクテリウム・アンギュラタム（Bifidobacterium angulatum）ＡＰＣ３２９（ＡＴＣＣ２７５３５）（Ｂ７；ｔ４＝１２．０６５、ｐ＜０．０００５）及びビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）亜種ロンガム（longum）ＡＰＣ２７４４（ＡＴＣＣ１５７０７）（Ｂ８；ｔ４＝１４．６０３、ｐ＜０．０００５）（図２Ａ）である。より詳細には、LACTEOL（登録商標）は、純粋培養においてＢ．ロンガム（B. longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７の増殖を刺激した（ＡＮＯＶＡ；Ｆ４，１０＝１０８．６５０、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５）（図２Ｂ）。同時に、LACTEOL（登録商標）の可溶性画分（上清）及び不溶性画分（主に細胞）の両方は、LACTEOL（登録商標）と同程度にＢ．ロンガム（B. longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７の増殖を刺激した（ボンフェローニ事後検定、水と比較してすべてｐ＜０．０００５であり、LACTEOL（登録商標）と比較してそれぞれｐ＝１、ｐ＝０．１６５である）（図２Ｂ）。LACTEOL（登録商標）の低ラクトースバージョンも完全LACTEOL（登録商標）と同等の増殖刺激を示した（（ボンフェローニ事後検定、水と比較してｐ＜０．０００５、LACTEOL（登録商標）と比較してｐ＝０．２２５）（図２Ｂ）。
選択されたビフィズス菌の増殖に対するLACTEOL（登録商標）及びLACTEOL（登録商標）様製剤の効果
[00121] LACTEOL（登録商標）は、純粋培養における乳児関連及び成人関連ビフィズス菌の増殖を刺激した。具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７（Ｂ１；ｔ４＝１８．５５５、ｐ＜０．０００５）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）亜種ロンガム（longum）ＪＣＭ７０５３（Ｂ２；ｔ４＝１５．６２６、ｐ＝０．００３）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）ＬＭＧ１１０４１（ＡＴＣＣ２９５２１）（Ｂ３；ｔ４＝－７．４３２、ｐ＝０．００２）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）ＪＣＭ７０１７（Ｂ４；ｔ４＝７．６６７、ｐ＝０．０１６）、ビフィドバクテリウム・ガリカム（Bifidobacterium gallicum）ＡＰＣ８３８（ＡＴＣＣ４９８５０）（Ｂ５；ｔ４＝－２．８２８、ｐ＝０．０４７）、ビフィドバクテリウム・アンギュラタム（Bifidobacterium angulatum）ＡＰＣ３２９（ＡＴＣＣ２７５３５）（Ｂ７；ｔ４＝１２．０６５、ｐ＜０．０００５）及びビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）亜種ロンガム（longum）ＡＰＣ２７４４（ＡＴＣＣ１５７０７）（Ｂ８；ｔ４＝１４．６０３、ｐ＜０．０００５）（図２Ａ）である。より詳細には、LACTEOL（登録商標）は、純粋培養においてＢ．ロンガム（B. longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７の増殖を刺激した（ＡＮＯＶＡ；Ｆ４，１０＝１０８．６５０、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５）（図２Ｂ）。同時に、LACTEOL（登録商標）の可溶性画分（上清）及び不溶性画分（主に細胞）の両方は、LACTEOL（登録商標）と同程度にＢ．ロンガム（B. longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７の増殖を刺激した（ボンフェローニ事後検定、水と比較してすべてｐ＜０．０００５であり、LACTEOL（登録商標）と比較してそれぞれｐ＝１、ｐ＝０．１６５である）（図２Ｂ）。LACTEOL（登録商標）の低ラクトースバージョンも完全LACTEOL（登録商標）と同等の増殖刺激を示した（（ボンフェローニ事後検定、水と比較してｐ＜０．０００５、LACTEOL（登録商標）と比較してｐ＝０．２２５）（図２Ｂ）。
【0115】
[00122] ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の増殖は、LACTEOL（登録商標）用量に依存する（図２Ｃ；ＡＮＯＶＡ；Ｆ５，１１＝５９．６５４、ｐ＜０．０００５）。半量のLACTEOL（登録商標）は、LACTEOL（登録商標）と同程度に増殖を刺激したのに対して（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）、１００倍希釈LACTEOL（登録商標）におけるビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）カウントは、水の対照における場合と同じであった（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）。LACTEOL（登録商標）活性は、酵素的処理によって影響を受けず、熱処理は、通常、酵素を不活性化するために使用された（９２℃で１時間）。ある範囲のタンパク質分解酵素（図２Ｄ）及び擬似処理LACTEOL（登録商標）（図２Ｄ）で処理されたLACTEOL（登録商標）製剤は、純粋培養におけるＢ．ロンガム（B. longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７の増殖を刺激した（ＡＮＯＶＡ；Ｆ８，１８＝７３．５８２、ｐ＜０．０００５；水と比較したボンフェローニ事後検定、すべてｐ＜０．０００５；LACTEOL（登録商標）と比較したボンフェローニ事後検定、すべてｐ＝１）（図２Ｄ）。炭水化物消化酵素（図２Ｅ）及びその疑似処理バージョン（図２Ｅ）で処理されたLACTEOL（登録商標）製剤の上清及び細胞画分は、純粋培養におけるＢ．ロンガム（B. longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７の増殖を刺激した（ＡＮＯＶＡ；Ｆ１０，２２＝８５．７８３、ｐ＜０．０００５；水と比較したボンフェローニ事後検定、すべてｐ＜０．０００５；LACTEOL（登録商標）の上清又は細胞画分と比較したボンフェローニ事後検定、すべてｐ＞０．０５）（図１Ｅ）。興味深いことに、１ｋＤａ透析LACTEOL（登録商標）も純粋培養におけるＢ．ロンガム（B. longum）亜種インファンティス（infantis）ＡＴＣＣ１５６９７の増殖を刺激したが（図２Ｄ；ＡＮＯＶＡ；Ｆ８，１８＝７３．５８２、ｐ＜０．０００５；水と比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５）、LACTEOL（登録商標）のレベルには刺激しなかった（ＡＮＯＶＡ；Ｆ８，１８＝７３．５８２、ｐ＜０．０００５；LACTEOL（登録商標）と比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５）。音波処理は、LACTEOL（登録商標）の上清又は細胞画分の活性に影響しなかった（図２Ｅ；ＡＮＯＶＡ；Ｆ１０，２２＝８５．７８３、ｐ＜０．０００５；水と比較したボンフェローニ事後検定、すべてｐ＜０．０００５；LACTEOL（登録商標）の上清又は細胞画分と比較したボンフェローニ事後検定、すべてｐ＝０．０５）。LACTEOL（登録商標）様製剤に応答した２４時間増殖レベルに差があった（図２Ｆ；ＡＮＯＶＡ；Ｆ１０，２１＝１４１．３６８、ｐ＜０．０００５）。LACTEOL（登録商標）及びＬｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂは、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の増殖を同等に刺激し（互いに比較されるボンフェローニ事後検定、ｐ＝１、水との比較ではｐ＜０．０００５）、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９、Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）ＡＰＣ２４２１、Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）ＡＰＣ２５１６、Ｌｂ．ロイテリ（Lb. reuteri）ＡＰＣ２４８２は、増殖を促進しなかった（ボンフェローニ事後検定、すべてｐ＜０．０００５）。プレート上で回収されたＣＵＦが６以下であったため、Ｌｂ．ホミニシス（Lb. hominis）ＡＰＣ２５１２の補充は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）に対する明らかな死滅作用を有した。Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）２ｚ及びＬｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）亜種ブルガリクス（bulgaricus）ＡＰＣ２４９３は、水の補充と同じ作用を有した（ボンフェローニ事後検定、それぞれｐ＝１及びｐ＝０．０６０）。
【0116】
[00123] ＬＬＬ及びＬｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂの両方について、上清及び全製剤（上清及び細胞を含有する）は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の増殖を等しく刺激したが（図２Ｇ；ＡＮＯＶＡ；Ｆ９，２０＝１１３．９８８、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定、ｐ≧０．５１４）、LACTEOL（登録商標）と同じレベルではなかった（ボンフェローニ事後検定、ｐ≦０．０３９）。ＬＬＬ細胞（Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂ細胞ではないが）並びにＬＬＬ及びＬｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂの非透析成分は、同等の中間のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖刺激を示した（互いに比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＝１、水及びLACTEOL（登録商標）と比較してｐ≦０．０３６）。
【0117】
ビフィズス菌の増殖に対する市販のプロバイオティクス製剤の作用
[00124］ 市販の製品とのインキュベーション前に、条件間で差はなかった（ＡＮＯＶＡ；Ｆ５、１２＝０．６２７、ｐ＝０．６８３）。２４時間のインキュベーション後、ビフィズス菌数は、有意に異なった（ＡＮＯＶＡ；Ｆ５，１２＝５７４．５３５、ｐ＜０．０００５）。カルチュレルの補充により、ビフィズス菌の回復が防がれた（互いに比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５）。エンテロゲルミナ及びバイオガイアの両方は、ビフィズス菌数に影響せず、水と同等の菌数であった（水と比較したボンフェローニ事後検定、それぞれｐ＝０．１９２及びｐ＝０．２４２）。最後に、カルチュレルは、ＬＬＬと同等のレベルにビフィズス菌の増殖を刺激した（水と比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５；低ラクトースLACTEOL（登録商標）と比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）（図３Ａ）。２４時間にわたり、市販の製品：カルチュレル（ウィルコクソン検定、ｐ＝０．１０９）、エンテロゲルミナ（ｔ２＝１．９４１、ｐ＝０．１９２）、バイオガイア（ｔ２＝０．５９５、ｐ＝０．６１２）及びウルトラリヴレ（ｔ２＝－０．２５３、ｐ＝０．８２４）を構成する微生物の数は、変化しなかった（図３Ｂ）。
[00124］ 市販の製品とのインキュベーション前に、条件間で差はなかった（ＡＮＯＶＡ；Ｆ５、１２＝０．６２７、ｐ＝０．６８３）。２４時間のインキュベーション後、ビフィズス菌数は、有意に異なった（ＡＮＯＶＡ；Ｆ５，１２＝５７４．５３５、ｐ＜０．０００５）。カルチュレルの補充により、ビフィズス菌の回復が防がれた（互いに比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５）。エンテロゲルミナ及びバイオガイアの両方は、ビフィズス菌数に影響せず、水と同等の菌数であった（水と比較したボンフェローニ事後検定、それぞれｐ＝０．１９２及びｐ＝０．２４２）。最後に、カルチュレルは、ＬＬＬと同等のレベルにビフィズス菌の増殖を刺激した（水と比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５；低ラクトースLACTEOL（登録商標）と比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）（図３Ａ）。２４時間にわたり、市販の製品：カルチュレル（ウィルコクソン検定、ｐ＝０．１０９）、エンテロゲルミナ（ｔ２＝１．９４１、ｐ＝０．１９２）、バイオガイア（ｔ２＝０．５９５、ｐ＝０．６１２）及びウルトラリヴレ（ｔ２＝－０．２５３、ｐ＝０．８２４）を構成する微生物の数は、変化しなかった（図３Ｂ）。
【0118】
LACTEOL（登録商標）製剤の精製
ＳＰＥＣ１８精製
[00125] Ｃ１８カラムに対して最適化精製プロトコルを用いて半量LACTEOL（登録商標）上清を処理することにより、得られた画分のビフィズス菌ＣＦＵ数の差が生じた（図４Ａ；ＡＮＯＶＡ、Ｆ５，１２＝１１７．５４６、ｐ＜０．０００５）。フロースルー（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）を除いて、すべての画分が水の対照と比べて有意な差を示した（ボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５）。洗浄液及びプールされた画分は、半量LACTEOL（登録商標）上清と比較して差を示さず（ボンフェローニ事後検定、それぞれｐ＝１及びｐ＝０．０６６）、活性画分が洗浄液画分中に存在することが示された。半量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂ（図４Ｂ；ＡＮＯＶＡ、Ｆ５，１２＝１１０．０８７、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０５３）及び半量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９（図４Ｂ；ＡＮＯＶＡ、Ｆ５，１２＝５７．４７３、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）の両方のＣ１８精製からの洗浄液画分は、半量ＬＬＬ上清（及びそれ自体の半量上清）と同じレベルのビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖刺激を示したのに対して、フロー及び溶離画分は、増殖刺激を示さなかった。Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂの全量洗浄液画分（半量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂの２倍濃度の洗浄液画分）を試験した場合、本発明者らは、ＬＬＬ（図４Ｃ；ＡＮＯＶＡ、Ｆ１５，３２＝１８９．９３９、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）及び半量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂ（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．７００）上清と同じビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖刺激を確認した。半量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９上清は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖を刺激したが（全量又は半量ＬＬＬ及びＬｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９のレベルにではないが）、全量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９上清は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖（水と比較したボンフェローニ事後検定、それぞれｐ＜０．０００５及びｐ＝１）を刺激せず、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９上清中の濃度依存性ビフィドスタティック化合物の存在を意味する。しかしながら、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９の全量洗浄液画分（半量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９の２倍濃縮洗浄液画分）の場合、同じビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖刺激が半量ＬＬＬ上清と同様に見られ（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）、ビフィドスタティック化合物がＣ１８精製プロセス中に少なくとも部分的に除去されることが示唆される。
ＳＰＥＣ１８精製
[00125] Ｃ１８カラムに対して最適化精製プロトコルを用いて半量LACTEOL（登録商標）上清を処理することにより、得られた画分のビフィズス菌ＣＦＵ数の差が生じた（図４Ａ；ＡＮＯＶＡ、Ｆ５，１２＝１１７．５４６、ｐ＜０．０００５）。フロースルー（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）を除いて、すべての画分が水の対照と比べて有意な差を示した（ボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５）。洗浄液及びプールされた画分は、半量LACTEOL（登録商標）上清と比較して差を示さず（ボンフェローニ事後検定、それぞれｐ＝１及びｐ＝０．０６６）、活性画分が洗浄液画分中に存在することが示された。半量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂ（図４Ｂ；ＡＮＯＶＡ、Ｆ５，１２＝１１０．０８７、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．０５３）及び半量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９（図４Ｂ；ＡＮＯＶＡ、Ｆ５，１２＝５７．４７３、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）の両方のＣ１８精製からの洗浄液画分は、半量ＬＬＬ上清（及びそれ自体の半量上清）と同じレベルのビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖刺激を示したのに対して、フロー及び溶離画分は、増殖刺激を示さなかった。Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂの全量洗浄液画分（半量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂの２倍濃度の洗浄液画分）を試験した場合、本発明者らは、ＬＬＬ（図４Ｃ；ＡＮＯＶＡ、Ｆ１５，３２＝１８９．９３９、ｐ＜０．０００５；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）及び半量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂ（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．７００）上清と同じビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖刺激を確認した。半量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９上清は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖を刺激したが（全量又は半量ＬＬＬ及びＬｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９のレベルにではないが）、全量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９上清は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖（水と比較したボンフェローニ事後検定、それぞれｐ＜０．０００５及びｐ＝１）を刺激せず、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９上清中の濃度依存性ビフィドスタティック化合物の存在を意味する。しかしながら、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９の全量洗浄液画分（半量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９の２倍濃縮洗浄液画分）の場合、同じビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖刺激が半量ＬＬＬ上清と同様に見られ（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）、ビフィドスタティック化合物がＣ１８精製プロセス中に少なくとも部分的に除去されることが示唆される。
【0119】
硫酸アンモニウム沈殿
[00126] ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の２４時間増殖後の菌数の差が確認された（図５；独立した試料のクラスカル・ウォリス検定、χ２（２３）＝６９．９９８、ｐ＜０．０００５）。硫酸アンモニウム沈殿物のＣ１８浄化からの洗浄液１の画分は、一貫して、最も多いビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）菌数を与えた。硫酸アンモニウム濃度のそれぞれの段階的増加により、ＬＬＬ及び水と同等のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖の刺激を示す製剤が得られた。
[00126] ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の２４時間増殖後の菌数の差が確認された（図５；独立した試料のクラスカル・ウォリス検定、χ２（２３）＝６９．９９８、ｐ＜０．０００５）。硫酸アンモニウム沈殿物のＣ１８浄化からの洗浄液１の画分は、一貫して、最も多いビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）菌数を与えた。硫酸アンモニウム濃度のそれぞれの段階的増加により、ＬＬＬ及び水と同等のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖の刺激を示す製剤が得られた。
【0120】
LACTEOL（登録商標）及びその画分のＨＰＬＣ分析
[00127] ２つの製造元の株のLACTEOL（登録商標）、ＬＬＬ及び上清の紫外線吸収プロファイルから、製剤の非常に多様な組成が確認された。Ｃ１８又はＳＩ１カラムのいずれかを用いたＳＰＥ精製により、ビフィズス菌の増殖に影響を及ぼさない大きい割合の化合物を除去し、その結果、２３分あたりでシンプルな紫外線吸収ピークが生じた（図６）。
[00127] ２つの製造元の株のLACTEOL（登録商標）、ＬＬＬ及び上清の紫外線吸収プロファイルから、製剤の非常に多様な組成が確認された。Ｃ１８又はＳＩ１カラムのいずれかを用いたＳＰＥ精製により、ビフィズス菌の増殖に影響を及ぼさない大きい割合の化合物を除去し、その結果、２３分あたりでシンプルな紫外線吸収ピークが生じた（図６）。
【0121】
[00128] 濃縮後、Ｃ１８精製された半量LACTEOL（登録商標）を用いた複数のＨＰＬＣ実行中に回収された画分がビフィドジェニックアッセイにおいて試験された。画分５２は、より高いビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）数を有したことから、有望な結果を示した。しかしながら、これは、ネガティブ対照（濃縮ＨＰＬＣ溶媒）を用いた１回反復であり、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）レベルの低減を示した（図７）。
【0122】
[00129] ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析から、測定試料からのピークではなく、質量分析測定セットアップから得られた顕著なピークを有する、画分５１、５２及び５３の類似のプロファイルが明らかとなった。画分５２において、本発明者らは、２５００～３０００ｍ／ｚの範囲の質量出現の増加を確認し、不確定分子の存在が示された。５２３７．０８ｍ／ｚでの単一ピークが画分５２に存在するが、隣接画分には存在しなかった（図８）。
【0123】
ビフィズス菌の増殖に対するLACTEOL（登録商標）様製剤の濃度依存性作用
[00130] LACTEOL（登録商標）様製剤の上清を試験した場合、差が確認された（図９Ａ；ＡＮＯＶＡ；Ｆ１５，３２＝１８９．９３９、ｐ＜０．０００５）。全量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９製剤の上清は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖を刺激しなかったのに対して（水と比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１及びＬＬＬの全量（ＬＬＬと比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂと比較してｐ＝０．０２４）並びに半量上清（１／２ＬＬＬ上清と比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．００９、１／２Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂ上清と比較してｐ＜０．０００５）のレベルにではないが、その半分の濃度は、増殖を刺激した（水と比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５）。上清及び細胞の両方を含有する製剤を使用した場合、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の２４時間増殖に対する濃度依存的作用も確認された（図９Ｂ；ＡＮＯＶＡ；Ｆ１２，２６＝１２０．８３８、ｐ＜０．０００５）。Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）ＡＰＣ２４２１、Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）ＡＰＣ２５１６及びＬｂ．ロイテリ（Lb. reuteri）ＡＰＣ２４８２の全濃度は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の２４時間増殖を刺激することもできず（水と比較したボンフェローニ事後検定、それぞれｐ＝１、ｐ＝０．９１２及びｐ＝１）、しかしながら、その半分の濃度は、ＬＬＬについて確認されたレベル（ＬＬＬと比較したボンフェローニ事後検定、すべてｐ＜０．０００５）ではないが、増殖を刺激した（水と比較したボンフェローニ事後検定、すべてｐ＜０．０００５）。対照的に、ＬＬＬの半分の濃度は、全濃度ＬＬＬと比較して少ない刺激を生じさせ（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．００３）、Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）２ｚ（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．１０４）及びＬｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）亜種ブルガリクス（bulgaricus）ＡＰＣ２４９３（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．１１２）の半濃度及び全濃度は、濃度に依存しない同等の刺激を示した。
[00130] LACTEOL（登録商標）様製剤の上清を試験した場合、差が確認された（図９Ａ；ＡＮＯＶＡ；Ｆ１５，３２＝１８９．９３９、ｐ＜０．０００５）。全量Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９製剤の上清は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖を刺激しなかったのに対して（水と比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１及びＬＬＬの全量（ＬＬＬと比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂと比較してｐ＝０．０２４）並びに半量上清（１／２ＬＬＬ上清と比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．００９、１／２Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂ上清と比較してｐ＜０．０００５）のレベルにではないが、その半分の濃度は、増殖を刺激した（水と比較したボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０００５）。上清及び細胞の両方を含有する製剤を使用した場合、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の２４時間増殖に対する濃度依存的作用も確認された（図９Ｂ；ＡＮＯＶＡ；Ｆ１２，２６＝１２０．８３８、ｐ＜０．０００５）。Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）ＡＰＣ２４２１、Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）ＡＰＣ２５１６及びＬｂ．ロイテリ（Lb. reuteri）ＡＰＣ２４８２の全濃度は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の２４時間増殖を刺激することもできず（水と比較したボンフェローニ事後検定、それぞれｐ＝１、ｐ＝０．９１２及びｐ＝１）、しかしながら、その半分の濃度は、ＬＬＬについて確認されたレベル（ＬＬＬと比較したボンフェローニ事後検定、すべてｐ＜０．０００５）ではないが、増殖を刺激した（水と比較したボンフェローニ事後検定、すべてｐ＜０．０００５）。対照的に、ＬＬＬの半分の濃度は、全濃度ＬＬＬと比較して少ない刺激を生じさせ（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．００３）、Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）２ｚ（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．１０４）及びＬｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）亜種ブルガリクス（bulgaricus）ＡＰＣ２４９３（ボンフェローニ事後検定、ｐ＝０．１１２）の半濃度及び全濃度は、濃度に依存しない同等の刺激を示した。
【0124】
ビフィズス菌に対するＭＲＷの作用
[00131] １０倍希釈培地において、濃縮ＭＲＳ（ｃＭＲＳ；LACTEOL（登録商標）の重量当量）は、LACTEOL（登録商標）と同等の程度にビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖を刺激し（図１０Ａ；ＡＮＯＶＡ；Ｆ３，８＝１２．０７８、ｐ＝０．００２；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）、ＬＬＬ及びその上清（ボンフェローニ事後検定、ｐ≦０．００３）よりも優れていた。半濃縮ＭＲＳ（１／２ｃＭＲＳ）のＣ１８画分を補充した後、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）数の差があった（図１０Ｂ；独立した試料クラスカル・ウォリス検定；クラスカル・ウォリス検定、χ２（５）＝１５．２２２、ｐ＝０．００９）。１／２ｃＭＲＳに続いて、１／２ｃＭＲＳ Ｃ１８洗浄液画分は、数値的に最も高い数を有する。
[00131] １０倍希釈培地において、濃縮ＭＲＳ（ｃＭＲＳ；LACTEOL（登録商標）の重量当量）は、LACTEOL（登録商標）と同等の程度にビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖を刺激し（図１０Ａ；ＡＮＯＶＡ；Ｆ３，８＝１２．０７８、ｐ＝０．００２；ボンフェローニ事後検定、ｐ＝１）、ＬＬＬ及びその上清（ボンフェローニ事後検定、ｐ≦０．００３）よりも優れていた。半濃縮ＭＲＳ（１／２ｃＭＲＳ）のＣ１８画分を補充した後、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）数の差があった（図１０Ｂ；独立した試料クラスカル・ウォリス検定；クラスカル・ウォリス検定、χ２（５）＝１５．２２２、ｐ＝０．００９）。１／２ｃＭＲＳに続いて、１／２ｃＭＲＳ Ｃ１８洗浄液画分は、数値的に最も高い数を有する。
【0125】
結論
[00132] 実施例１において、LACTEOL（登録商標）の補充により、２４時間のヒト糞便発酵中にビフィズス菌の相対的及び絶対的存在量の両方が増加することが実証された。実施例２から、LACTEOL（登録商標）がビフィズス菌の増殖を刺激するという発酵槽データが確認される。例えば、乳児及び成人の個体から単離された試験ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）株の７１％（７つのうちの５つ）の増殖刺激によってこれが説明される。LACTEOL（登録商標）活性は、最も高い活性が３４ｍｇ／ｍｌで見られる用量依存性であり、１００分の１の用量（０．３４ｍｇ／ｍｌ）では効果がない。
[00132] 実施例１において、LACTEOL（登録商標）の補充により、２４時間のヒト糞便発酵中にビフィズス菌の相対的及び絶対的存在量の両方が増加することが実証された。実施例２から、LACTEOL（登録商標）がビフィズス菌の増殖を刺激するという発酵槽データが確認される。例えば、乳児及び成人の個体から単離された試験ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）株の７１％（７つのうちの５つ）の増殖刺激によってこれが説明される。LACTEOL（登録商標）活性は、最も高い活性が３４ｍｇ／ｍｌで見られる用量依存性であり、１００分の１の用量（０．３４ｍｇ／ｍｌ）では効果がない。
【0126】
[00133] プレバイオティクスは、一般に、ビフィズス菌の増殖を刺激するために使用され、特にラクツロース及びＧＯＳなどのラクトース関連化合物並びにイヌリン及びＦＯがビフィズス菌の増殖の刺激について知られている。しかしながら、LACTEOL（登録商標）（ＬＬＬ）の低ラクトースバージョンがLACTEOL（登録商標）と同等の活性を示したことから、ビフィズス菌の刺激は、LACTEOL（登録商標）に存在するラクトースに起因しなかった。
【0127】
[00134] ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖を刺激する能力は、プロバイオティクス製剤の中で一般的な特性ではない。その１日量での３種の市販の細菌産物は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖を刺激しなかった。これらは、Ｂ．クラウジイ（B. clausii）の芽胞、Ｌｂ．ロイテリ（Lb. reuteri）ＤＳＭ１７９３８及びＬｂ．ラムノサス（Lb. rhamnosus）ＧＧの細胞を含んだ。興味深いことに、Ｌｂ．ラムノサス（Lb. rhamnosus）ＧＧ製剤の補充は、イヌリンを含有し、この既知のプレバイオティクスの存在にもかかわらず、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）細胞を完全に不活性化した。対照的に、Ｓ．ブラウディ（S. boulardii）ＣＮＣＭＩ－７４５を含有する酵母ベースの製剤は、LACTEOL（登録商標）と類似の様式でビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖を刺激した。
【0128】
[00135] LACTEOL（登録商標）上清及び細胞画分の両方は、ビフィズス菌の増殖の同等の刺激を示した。しかしながら、ＬＬＬ細胞及びＬｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂ細胞は、等しい刺激を示さず、ラクトース添加及び／又は噴霧乾燥／凍結乾燥プロセスが細胞画分の活性に影響を及ぼすことが示唆された。
【0129】
[00136] LACTEOL（登録商標）製造に使用される２種類の株の中では、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）のみがLACTEOL（登録商標）と同等のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）増殖の刺激を示し、Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）は、増殖の増強を示さなかったか又は極めてわずかな増殖の増強を示した。更に、試験された乳酸桿菌（Lactobacilli）によって産生された他の５つの全量製剤のいずれも、LACTEOL（登録商標）レベルまでビフィズス菌の増殖を刺激することができなかった。意外なことに、これらの製剤の半濃度は、ビフィズス菌の増殖に対してより多様な影響を有した。半量製剤のうちの４つは、LACTEOL（登録商標）のレベルにではないが、刺激作用を示した（Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９、Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）ＡＰＣ２４２１、Ｌｂ．デルブルエッキイー（Lb. delbrueckii）ＡＰＣ２５１６、Ｌｂ．ロイテリ（Lb. reuteri）ＡＰＣ２４８２）。これは、これらの４種の株の全量製剤が抑制的であるのに対して、半量製剤が刺激作用を有する点で別の意外な結果である。
【0130】
[00137] ７つの分離実験を行って、ビフィズス菌の増殖の刺激を担う１種又は複数の化合物を同定した。最初に、LACTEOL（登録商標）活性を担う化合物は、水性マトリックスから疎水性又は極性有機検体を抽出するために通常使用されるＣ１８カラムを用いて部分的に精製できることが実証された。活性化合物は、５％メタノール洗浄液でカラムから遊離され、これらの化合物がカラム吸着剤にごく弱く結合されたことが示された。一般に、LACTEOL（登録商標）、ＬＬＬ及びＬｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）１ｂの半量製剤の再構成洗浄液画分は、それらの非精製製剤と同程度の活性であり、はるかによりきれいなクロマトグラムを有した。洗浄液画分が全濃度に濃縮された場合、その活性は、LACTEOL（登録商標）上清に等しく、抑制的化合物がいくらか除去されたことが再度実証された。興味深いことに、Ｌｂ．ファーメンタム（Lb. fermentum）ＡＰＣ２４９のＣ１８精製により、不純物だけでなく、この株によって生成されたビフィドスタティック化合物も除去された。第２に、サイズ排除カラムから回収された濃縮画分をビフィドジェニックアッセイにおいて試験し、画分５２が増殖刺激性化合物を包含する可能性を有すると同時に、画分５２のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析によって潜在的な興味深いピークが生じたことが明らかとなった。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図8-5】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【配列表】
【国際調査報告】