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特表2023-523250マイクロ流体チップおよびそれを使用する生体模倣システム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-02
(54)【発明の名称】マイクロ流体チップおよびそれを使用する生体模倣システム
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20230526BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20230526BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230526BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230526BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12M1/00 C
C12M3/00 A
C12N5/10
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022564393
(86)(22)【出願日】2021-04-22
(85)【翻訳文提出日】2022-12-12
(86)【国際出願番号】 US2021028612
(87)【国際公開番号】W WO2021216848
(87)【国際公開日】2021-10-28
(31)【優先権主張番号】63/013,903
(32)【優先日】2020-04-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】503115205
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】リー，ウォンジェ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029AA08
4B029BB11
4B029CC02
4B029CC08
4B029CC10
4B029GA08
4B029GB10
4B063QA05
4B063QA20
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QS31
4B063QS39
4B063QX01
4B065AA93X
4B065AC20
4B065BC41
4B065CA44
(57)【要約】
開口部を介して隣接する第２のチャネルと流体連通する第１のチャネルを備えるマイクロ流体チップが、本明細書に記載されており、第１のチャネルおよび第２のチャネルの高さは、第１のチャネルまたは第２のチャネルに注入される液体がそれぞれ第１のチャネルまたは第２のチャネル内に実質的に閉じ込められるように、またはそれらの間の液体の流れが制御されるように、開口部で十分な表面張力を生じるように選択され、表面張力は、液体の通過を制限または選択的に制御する非物理的マイクロ流体バリアを生成する。また、血液脳関門などのヒト臓器の構造および機能をモデル化し、様々な研究または治療剤に対するそのような臓器のインビボ様生理学的応答を研究する際にそのようなマイクロ流体チップを使用する、インビトロ生体模倣システムも記載されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
平面；前記平面上に形成され、第１の幅、第１の高さ、および第１の長さによって画定される第１の容積を有する第１のチャネルであって、前記第１の容積が第１の方向に延在する、第１のチャネル；ならびに
前記第１のチャネルに隣接する前記平面上に形成される第２のチャネルであって、第２の幅、第２の高さ、および第２の長さによって画定される第２の容積を有し、前記第２の容積が前記第１の方向に延在し、前記第２の高さが前記第１の高さよりも高い、第２のチャネル
を備える、マイクロ流体チップであって、
前記第１のチャネルは、前記第１の長さの少なくとも一部分に沿って延在する第１の開口部を介して前記第２のチャネルと流体連通し、前記第１の開口部は、前記平面から前記第１の高さまで延在し；
前記第１の高さおよび前記第２の高さは、前記第１のチャネルまたは前記第２のチャネルに注入される液体がそれぞれ前記第１の容積または前記第２の容積内に実質的に閉じ込められるように、またはそれらの間の前記液体の流れが制御されるように、前記第１の開口部で十分な表面張力を生じるようなサイズであり、前記表面張力は、前記液体の通過を制限または選択的に制御する非物理的マイクロ流体バリアを生成する
マイクロ流体チップ。
【請求項2】
前記第１のチャネルに隣接する前記平面上に形成される第３のチャネルであって、第３の幅、第３の高さ、および第３の長さによって画定される第３の容積を有し、前記第３の容積が前記第１の方向に延在し、前記第３の高さが前記第１の高さよりも高い、第３のチャネルをさらに含み、
前記第３のチャネルは、前記第１の長さの少なくとも一部分に沿って延在する第２の開口部を介して前記第１のチャネルと流体連通し、前記第２の開口部は、前記平面から前記第１の高さまで延在し；
前記第１の高さおよび前記第３の高さは、前記第１のチャネルまたは前記第３のチャネルに注入される液体がそれぞれ前記第１の容積または前記第３の容積内に実質的に閉じ込められるように、またはそれらの間の前記液体の流れが制御されるように、前記第２の開口部で十分な表面張力を生じるようなサイズであり、前記表面張力は、前記液体の通過を制限または選択的に制御する第２の非物理的マイクロ流体バリアを生成する、
請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項3】
前記第２のチャネルに隣接する前記平面上に形成される第３のチャネルであって、第３の幅、第３の高さ、および第３の長さによって画定される第３の容積を有し、前記第３の容積が前記第１の方向に延在し、前記第３の高さが前記第２の高さよりも低い、第３のチャネルをさらに含み、
前記第３のチャネルは、前記第２の長さの少なくとも一部分に沿って延在する第２の開口部を介して前記第２のチャネルと流体連通し、前記第２の開口部は、前記平面から前記第３の高さまで延在し；
前記第２の高さおよび前記第３の高さは、前記第２のチャネルまたは前記第３のチャネルに注入される液体がそれぞれ前記第２の容積または前記第３の容積内に実質的に閉じ込められるように、またはそれらの間の前記液体の流れが制御されるように、前記第２の開口部で十分な表面張力を生じるようなサイズであり、前記表面張力は、前記液体の通過を制限または選択的に制御する第２の非物理的マイクロ流体バリアを生成する
請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載のマイクロ流体チップ；および前記第１のチャネルの前記第１の容積内に閉じ込められた細胞外マトリックスであって、前記細胞外マトリックスの側壁が前記第１の開口部を横切って延在し、前記第１のチャネルと前記第２のチャネルとの間に前記非物理的マイクロ流体バリアを形成する、細胞外マトリックス
を備える、生体模倣システム。
【請求項5】
前記第１のチャネルと前記第２のチャネルとの間の前記第１の開口部に配置された上皮バリアをさらに備える、請求項４に記載の生体模倣システム。
【請求項6】
前記上皮バリアが連続的である、請求項５に記載の生体模倣システム。
【請求項7】
前記上皮バリアが内皮細胞を含む、請求項５または６に記載の生体模倣システム。
【請求項8】
前記上皮バリアが内皮バリアである、請求項７に記載の生体模倣システム。
【請求項9】
前記内皮バリアが脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）を含む、請求項８に記載の生体模倣システム。
【請求項10】
前記内皮バリアがヒトＢＭＥＣを含む、請求項８に記載の生体模倣システム。
【請求項11】
前記第２のチャネルに周皮細胞をさらに含む、請求項４～１０のいずれか１項に記載の生体模倣システム。
【請求項12】
前記第１のチャネルの前記細胞外マトリックスに第１の細胞をさらに含む、請求項４～１１のいずれか１項に記載の生体模倣システム。
【請求項13】
前記第１の細胞が神経細胞である、請求項１２に記載の生体模倣システム。
【請求項14】
前記神経細胞が、ヒト人工多能性幹細胞由来の神経前駆細胞、星状細胞、ミクログリア、またはそれらの組合せを含む、請求項１３に記載の生体模倣システム。
【請求項15】
前記第１の細胞が、心臓細胞、骨格筋細胞、肝細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）、腎細胞、骨細胞、皮膚細胞、食道細胞、腸細胞、胃細胞、結腸細胞、肺細胞、または膵臓細胞である、請求項１２に記載の生体模倣システム。
【請求項16】
前記細胞外マトリックスがヒドロゲルを含む、請求項４～１５のいずれか１項に記載の生体模倣システム。
【請求項17】
前記ヒドロゲルが基底膜抽出物（ＢＭＥ）を含む、請求項１６に記載の生体模倣システム。
【請求項18】
前記第２のチャネルの前記第２の容積内に閉じ込められる第１の媒体をさらに含む、請求項４～１７のいずれか１項に記載の生体模倣システム。
【請求項19】
前記第３の高さが前記第１の高さよりも高く、前記生体模倣システムが、前記第３のチャネルの前記第３の容積内に閉じ込められる第２の媒体をさらに含む、請求項４～１８のいずれか１項に記載の生体模倣システム。
【請求項20】
前記第３の高さが前記第２の高さよりも低く、前記生体模倣システムが、前記第３のチャネルの前記第３の容積内に閉じ込められる第２の細胞外マトリックスをさらに含む、請求項４～１８のいずれか１項に記載の生体模倣システム。
【請求項21】
血管柄付きの組織モデルである、請求項４～２０のいずれか１項に記載の生体模倣システム。
【請求項22】
前記血管柄付きの組織モデルが、血液脳関門モデルまたは脳卒中モデルである、請求項２１に記載の生体模倣システム。
【請求項23】
前記血管柄付きの組織モデルが、心臓モデル、骨格筋モデル、肝臓モデル、腎臓モデル、骨モデル、皮膚モデル、食道モデル、胃モデル、結腸モデル、腸モデル、肺モデル、または膵臓モデルである、請求項２１に記載の生体模倣システム。
【請求項24】
請求項４～２３のいずれか１項に記載の生体模倣システムを調製する方法であって、前記マイクロ流体チップの前記第１のチャネルに細胞外マトリックス前駆体を堆積させること；および
前記細胞外マトリックス前駆体を硬化させて、前記第１のチャネルに前記細胞外マトリックスをもたらすこと
を含む、方法。
【請求項25】
前記細胞外マトリックス前駆体を硬化させることは、前記細胞外マトリックス前駆体をインキュベートすることを含み、前記方法が、前記第１のチャネルの前記細胞外マトリックスに隣接する前記第２のチャネルに前記第１の媒体を堆積させることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記第１のチャネルと前記第２のチャネルとの間の前記第１の開口部に連続的な内皮バリアを培養することをさらに含み、前記第１の媒体が周皮細胞をさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項27】
治療剤をスクリーニングする方法であって、請求項４～２３のいずれか１項に記載の生体模倣システムの前記マイクロ流体チップの前記第２のチャネルに前記治療剤を堆積させること；および
前記マイクロ流体チップを撮像すること
を含む、方法。
【請求項28】
前記治療剤が、幹細胞、小分子、またはペプチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法を実施することをさらに含む、請求項２７または２８に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
政府支援条項
本発明は、国立衛生研究所によって配賦された契約ＮＩＨ ＴＲＡＩＮＩＮＧ ＧＲＡＮＴ Ｋ２５ ＣＡ２０１５４５の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって配賦された契約ＮＩＨ ＴＲＡＩＮＩＮＧ ＧＲＡＮＴ Ｋ２５ ＣＡ２０１５４５の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0002】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／０１３，９０３号の利益および優先権を主張し、その全開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／０１３，９０３号の利益および優先権を主張し、その全開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
本開示は、血液脳関門などのヒト臓器の構造および機能をモデル化し、様々な研究または治療剤に対するそのような臓器のインビボ様生理学的応答を研究するための、複数のマイクロ流体チャネルを備えるインビトロ生体模倣システムに関する。
【背景技術】
【0004】
複数のマイクロ流体チャネルの様々な構造を特徴とするマイクロ流体デバイスは、ヒト生体系の構造および機能を模倣し、様々な研究または治療剤に対するそのようなモデルの生理学的応答を調査するために、三次元（３Ｄ）細胞培養および臓器チップモデルで使用されている。このようなマイクロ流体ベースのヒト生体模倣システムは、従来の細胞ベースのアッセイよりも正確な生理学的応答を実現することができ、時間と費用のかかるインビボ動物試験を取って代わる可能性があるため、前臨床薬物開発において大いに有望である。中枢神経系（ＣＮＳ）、血液脳関門（ＢＢＢ）および神経血管ユニット（ＮＶＵ）などのそのような臓器チップモデルを利用するヒト生体模倣システムは、臓器特異的治療有効性、毒性または疾患モデリングのハイスループットでリアルタイムの評価を可能にし、新しい薬物および細胞療法を開発するコストを効果的に削減可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
動物を使用するインビボＢＢＢモデルは複雑さおよびコストが高いにもかかわらず、動物試験をクリアした薬物候補の高いパーセンテージがその後の臨床試験で失敗したという理由のため、多くの臓器チップモデルの中で、マイクロ流体ＢＢＢモデルは特に有望な応用を提示する。ＢＢＢは、ＣＮＳに恒常的な環境を提供し、健康な脳機能にとって重要である。しかしながら、ＢＢＢの独特なバリア特性は、多くの小分子および大分子が治療上意味のある結果をもたらすのに十分な量で脳領域に入ることを制限するため、ＣＮＳ障害の処置を困難にする。したがって、脳を標的とする薬物の輸送有効性をモニターし、様々な疾患における病理学的な神経血管の機能を調べることを可能にする、予測的で費用効果の高いインビトロヒトＢＢＢモデルを開発することが望ましい。
【0006】
近年、虚血性脳卒中後の神経機能を修復させるための有望な治療的処置として、幹細胞療法が登場している。しかしながら、研究されている候補の幹細胞タイプの数が増え、各々が独特な特性を有するにもかかわらず、候補の細胞療法の神経修復能を体系的に評価することができる有効なインビトロアッセイプラットフォームが存在しない。ある用量の幹細胞を虚血性脳に移植する場合、その治療有効性は、主に、これらの外来細胞に対するＮＶＵの応答に依存する。かなりの数の研究は脳卒中の処置について幹細胞の神経修復能を支持しているが、これらの観察のいくつかと相反する報告もある。これは、部分的に、実験がすべて異なる条件下で行われたため、および／または複雑な回復プロセスの異なる態様に焦点を合わせたためである可能性がある。したがって、脳微小血管内皮細胞が機能的ヒトＢＢＢを模倣するインタクトなバリアを形成するように向けられ、他の構成細胞が健康状態および虚血状態の両方においてインビボ様挙動を再現する、マイクロ流体チップ上のＮＶＵの形態で一貫した再現性のある虚血性脳卒中モデルを開発することが望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本開示は、マイクロ流体チップおよびそのようなマイクロ流体チップを使用する生体模倣システム、ならびにそれを調製および使用して、例えば様々な組織の構造および機能をモデル化する方法を提供する。
【0008】
態様では、本開示は、平面；平面上に形成され、第１の幅、第１の高さ、および第１の長さによって画定される第１の容積を有する第１のチャネルであって、第１の容積が第１の方向に延在する、第１のチャネル；ならびに第１のチャネルに隣接する平面上に形成される第２のチャネルであって、第２の幅、第２の高さ、および第２の長さによって画定される第２の容積を有し、第２の容積が第１の方向に延在し、第２の高さが第１の高さよりも高い、第２のチャネルを備えるマイクロ流体チップを提供し、第１のチャネルは、第１の長さの少なくとも一部分に沿って延在する第１の開口部を介して第２のチャネルと流体連通し、第１の開口部は、平面から第１の高さまで延在し；第１の高さおよび第２の高さは、第１のチャネルまたは第２のチャネルに注入される液体がそれぞれ第１の容積または第２の容積内に実質的に閉じ込められるように、またはそれらの間の液体の流れが制御されるように、第１の開口部で十分な表面張力を生じるようなサイズであり、表面張力は、液体の通過を制限または選択的に制御する非物理的マイクロ流体バリアを生成する。
【0009】
いくつかの実施形態では、そのようなマイクロ流体チップは、第１のチャネルに隣接する平面上に形成される第３のチャネルであって、第３の幅、第３の高さ、および第３の長さによって画定される第３の容積を有し、第３の容積が第１の方向に延在し、第３の高さが第１の高さよりも高い、第３のチャネルをさらに含み、第３のチャネルは、第１の長さの少なくとも一部分に沿って延在する第２の開口部を介して第１のチャネルと流体連通し、第２の開口部は、平面から第１の高さまで延在し；第１の高さおよび第３の高さは、第１のチャネルまたは第３のチャネルに注入される液体がそれぞれ第１の容積または第３の容積内に実質的に閉じ込められるように、またはそれらの間の液体の流れが制御されるように、第２の開口部で十分な表面張力を生じるようなサイズであり、表面張力は、液体の通過を制限または選択的に制御する第２の非物理的マイクロ流体バリアを生成する。
【0010】
いくつかの実施形態では、そのようなマイクロ流体チップは、第２のチャネルに隣接する平面上に形成される第３のチャネルであって、第３の幅、第３の高さ、および第３の長さによって画定される第３の容積を有し、第３の容積が第１の方向に延在し、第３の高さが第２の高さよりも低い、第３のチャネルをさらに含み、第３のチャネルは、第２の長さの少なくとも一部分に沿って延在する第２の開口部を介して第２のチャネルと流体連通し、第２の開口部は、平面から第３の高さまで延在し；第２の高さおよび第３の高さは、第２のチャネルまたは第３のチャネルに注入される液体がそれぞれ第２の容積または第３の容積内に実質的に閉じ込められるように、またはそれらの間の液体の流れが制御されるように、第２の開口部で十分な表面張力を生じるようなサイズであり、表面張力は、液体の通過を制限または選択的に制御する第２の非物理的マイクロ流体バリアを生成する。
【0011】
本開示の態様は、本明細書に記載のマイクロ流体チップ；および第１のチャネルの第１の容積内に閉じ込められた細胞外マトリックスであって、細胞外マトリックスの側壁が第１の開口部を横切って延在し、第１のチャネルと第２のチャネルとの間に非物理的マイクロ流体バリアを形成する、細胞外マトリックスを備える、生体模倣システムをさらに含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、そのような生体模倣システムは、第１のチャネルと第２のチャネルとの間の第１の開口部に配置された上皮バリアをさらに備える。
【0013】
実施形態では、生体模倣システムは血管柄付きの組織モデルである。いくつかの実施形態では、血管柄付きの組織モデルは、血液脳関門モデル、脳卒中モデル、心臓モデル、骨格筋モデル、肝臓モデル、腎臓モデル、骨モデル、皮膚モデル、食道モデル、胃モデル、結腸モデル、腸モデル、肺モデル、または膵臓モデルである。
【0014】
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載の生体模倣システムを調製する方法を含み、方法は、マイクロ流体チップの第１のチャネルに細胞外マトリックス前駆体を堆積させること；および細胞外マトリックス前駆体を硬化させて、第１のチャネルに細胞外マトリックスをもたらすことを含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、細胞外マトリックス前駆体を硬化させることは、細胞外マトリックス前駆体をインキュベートすることを含み、方法は、第１のチャネルの細胞外マトリックスに隣接する第２のチャネルに第１の媒体を堆積させることをさらに含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、方法は、第１のチャネルと第２のチャネルとの間の第１の開口部に連続的な内皮バリアを培養することをさらに含み、第１の媒体は周皮細胞をさらに含む。
【0017】
本開示の態様はまた、治療剤をスクリーニングする方法を含み、方法は、治療剤を本明細書に記載の生体模倣システムのマイクロ流体チップの第２のチャネルに堆積させること、およびマイクロ流体チップを撮像することを含む。
【0018】
本開示のさらなる態様は、治療剤をスクリーニングする方法を含み、方法は、本明細書に記載の生体模倣システムを調製する方法を実施すること；治療剤をマイクロ流体チップの第２のチャネルに堆積させること；およびマイクロ流体チップを撮像することを含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、治療剤は、幹細胞、小分子、またはペプチドを含む。
図面のいくつかの表示の簡単な説明
図において、同一の参照番号は類似の要素を同一視する。図中の要素のサイズおよび相対位置は、必ずしも縮尺通りに描かれておらず、これらの要素のいくつかは、図の読みやすさを向上させるために拡大および配置されている。さらに、描かれている要素の特定の形状は、特定の要素の実際の形状に関するいかなる情報を伝達することを意図するものではなく、図での認識の容易さのためにのみ選択されている。
図面のいくつかの表示の簡単な説明
図において、同一の参照番号は類似の要素を同一視する。図中の要素のサイズおよび相対位置は、必ずしも縮尺通りに描かれておらず、これらの要素のいくつかは、図の読みやすさを向上させるために拡大および配置されている。さらに、描かれている要素の特定の形状は、特定の要素の実際の形状に関するいかなる情報を伝達することを意図するものではなく、図での認識の容易さのためにのみ選択されている。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】本開示の一実施形態によるマイクロ流体チップの透視図である。
【図2】本開示の一実施形態によるマイクロ流体チップの断面図である。
【図3】本開示の一実施形態によるマイクロ流体チップの上面図である。
【図4】本開示の一実施形態によるマイクロ流体チップの上面図である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本開示は、第１の高さを有する第１のチャネル、および第１の高さよりも高い第２の高さを有する第２のチャネルを備えるマイクロ流体チップに関し、第１のチャネルは、第１の開口部を介して第２のチャネルと流体連通し、第１の高さおよび第２の高さは、第１のチャネルまたは第２のチャネルに注入される液体が第１のチャネルまたは第２のチャネル内に実質的に閉じ込められるように、またはそれらの間の液体の流れが制御されるように、第１の開口部で十分な表面張力を生じるようなサイズであり、表面張力は、液体の通過を制限または選択的に制御する非物理的マイクロ流体バリアを生成する。また、そのようなマイクロ流体チップを備える生体模倣システム、ならびにその製造方法および使用方法も記載されている。
【0022】
本開示のマイクロチップおよび生体模倣システムは、以下の利点のうちの１つまたは複数を有する。
【0023】
（ａ）隣接するチャネル間の開口部に物理的構造（例えば、毛細管圧力バリアまたは膜）は存在しない。これは、チャネル間の界面での妨害されない相互作用を可能にするだけでなく、隣接するチャネル間の開口部での細胞外マトリックスの側壁上の上皮レイヤが連続的でインタクトであることも可能にする。毛細管圧力バリアは、チャネル間の界面での細胞相互作用を妨げ得、上皮レイヤに物理的欠陥を引き起こす可能性がある。そのような欠陥は、上皮レイヤを通るショートカットを治療剤にもたらす可能性がある。したがって、連続したインタクトな上皮レイヤは、治療剤の一貫した評価につながる。
【0024】
（ｂ）記載されているＭＰＳは、患者由来の細胞を使用し、個々の患者に固有な病態生理学的状態をシミュレートする個別化されたスクリーニングモデルを可能にする。
【0025】
（ｃ）記載されているインビトロ虚血性脳卒中モデルは、誘発された炎症および組織完全性の低下および内因性神経保護および組織リモデリングを示す。
【0026】
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用されるある特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立つだろう。追加の定義は、本開示を通して説明されている。
【0027】
本明細書で使用される場合、「チャネル」という用語は、マイクロ流体チャネル、すなわちレイヤの上に形成される密閉された通路を指す。チャネルは、幅、高さ、および長さによって画定される容積を有し、そのうちの少なくとも１つはサブミリメートル範囲内にある。理解されるように、チャネルという用語は、直線チャネル、ならびに２つ以上の方向に延在する部分を有するチャネル（すなわち、ベンドまたはカーブを有するチャネル）および分岐チャネルを包含する。チャネルは、典型的には、ある体積の液体を注入することができる入口を備える。チャネルはまた、任意に、出口またはベントを備える。マイクロ流体チャネルによって囲まれた容積は、典型的にはマイクロリットルまたはサブマイクロリットル範囲である。いくつかの実施形態では、チャネルの断面寸法は、１ミリメートル未満、５００マイクロメートル未満、１００マイクロメートル未満、５０マイクロメートル未満、または２５マイクロメートル未満である。
【0028】
「臓器チップ」としても公知な「生体模倣システム」は、インビトロで臓器の機能単位をモデル化するように設計された微細加工プラットフォームを指す。生体模倣システムは、異なる細胞タイプ間（例えば、上皮と血管内皮との間）の密接な接触を可能にし、同時に化学物質の時空間勾配および機械的歪みを生じて臓器機能を模倣する。
【0029】
本明細書で使用される場合、「生体組織」は、本明細書に記載の方法を使用して培養および／またはアッセイされる機能的に相互接続された細胞の集合を指す。細胞は、細胞凝集体、または患者からの特定の組織試料であり得る。例えば、「生体組織」は、オルガノイド、組織生検、腫瘍組織、切除された組織材料および胚体を包含する。
【0030】
本明細書で使用される「幹細胞」という用語は、様々な成熟ヒト細胞系統を生じることができる全能性または多能性前駆細胞を指す。言い換えれば、幹細胞は、様々なタイプの細胞に分化することができる未分化細胞または部分分化細胞である。
【0031】
本明細書で使用される場合、「小分子」という用語は、１ナノメートル（ｎｍ）程度のサイズの、いくつかの生物学的活性を有し得る低分子量（＜９００ダルトン）の有機化合物を指す。
【0032】
「ペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを指す。ペプチドには、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然には存在しないアミノ酸ポリマー、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマーが含まれる。
【0033】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに後に改変されるそれらのアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、およびＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα－炭素を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、およびメチオニンメチルスルホニウム）を指す。そのような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学的化合物を指す。
【0034】
「プローブ」は、分析物を検出するために使用することができる原子または分子の群である。分析物に応答して、プローブの測定可能な特性が変化する。「発光プローブ」は、光を放出するプローブまたは分子を指す。発光プローブのタイプには、生物発光、化学発光、電気化学発光、エレクトロルミネセント、およびフォトルミネセントが含まれる。プローブはそれ自体で発光してもよく、または得られる発光は、発光プローブが関与する化学反応または酵素反応の結果であってもよい。あるいは、プローブは蛍光であってもよい。
【0035】
「蛍光」は、特定の周波数の光を吸収し、異なる周波数の光を放出することができる分子を指す。
【0036】
「ポリマー」という用語は、繰り返されたサブユニットから構成される高分子を含む材料を指す。各々のサブユニットはモノマーと呼ばれる。ポリマーは、天然、半合成、または合成であり得る。
【0037】
「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」という単語の使用は、続いて記載される事象または状況が生じてもよいか、または生じなくてもよいことを意味し、その記載が、その事象または状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。
【0038】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特に明記しない限り、示された範囲、値、または構造の±２０％、±１０％、±５％、または±１％を意味する。本明細書で使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は、列挙された構成要素の「１つまたは複数」を指すことを理解されたい。代替（例えば、「または」）の使用は、代替のいずれか一方、両方、またはそれらの任意の組合せを意味すると理解されるべきである。
【0039】
文脈がそうでないことを求めない限り、本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのそれらの変形、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「有する（ｈａｖｅ）」などの同義語およびそれらのバリアントは、オープンで包括的な意味で解釈されるべきである。すなわち、リスト中の項目の列挙は、本技術の材料、組成物、デバイス、および方法においても有用であり得る他の同様の項目を排除しないように、「含むが、限定されない」としてのものである。本明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」というオープンエンドの用語は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、または有する（ｈａｖｉｎｇ）などの用語の同義語として、本開示を記載および特許請求するために使用されているが、本技術またはその実施形態は、代わりに、列挙された成分「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などのより限定的な用語を使用して記載されてもよい。
【0040】
他に定義されない限り、本明細書におけるすべての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【0041】
本明細書を通して「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「ある実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」への言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造、または特性が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して様々な箇所での「一実施形態では」または「ある実施形態では」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指すとは限らない。同様に、「できる（ｃａｎ）」および「可能性がある（ｍａｙ）」という用語およびそれらのバリアントは非限定的であることを意図しており、その結果、実施形態がある特定の要素または特徴を含むことができる、または含む可能性があるという記述は、それらの要素または特徴を含まない本技術の他の実施形態を排除しない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。
【0042】
本明細書では、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比の範囲、または整数範囲は、特に明記しない限り、記述された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合にはその分数（整数の１／１０および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどの任意の物理的特徴に関して本明細書に記述された任意の数の範囲は、特に明記しない限り、記述された範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。
【0043】
以下の説明では、本開示の様々な実施形態の完全な理解をもたらすために、ある特定の具体的な詳細が記載されている。しかしながら、当業者は、本開示がこれらの詳細なしで実践され得ることを理解するであろう。
【0044】
マイクロ流体チップ
上記のように、本開示は、異なる高さを有するチャネルを備えるマイクロ流体チップを提供する。本開示のマイクロ流体チップのある実施形態の透視図を図１に示す。図１のマイクロ流体チップの断面を図２に示す。
上記のように、本開示は、異なる高さを有するチャネルを備えるマイクロ流体チップを提供する。本開示のマイクロ流体チップのある実施形態の透視図を図１に示す。図１のマイクロ流体チップの断面を図２に示す。
【0045】
マイクロ流体チップ１００は、第１のチャネル１０４が形成される平面１０２を備える。第１のチャネル１０４は、第１の方向に延在する第１の容積１０６を有する。第１の容積１０６は、第１の幅１１０、第１の高さ１１２、および第１の長さ１１４によって画定される。第１のチャネル１０４に隣接する平面１０２上には、第２のチャネル１１６が形成される。第２のチャネル１１６は、第１の方向に延在し、第２の幅１２０、第２の高さ１２２、および第２の長さ１２４によって画定される第２の容積１１８を有する。図示されるように、第２の高さ１２２は第１の高さ１１２よりも高い。
【0046】
第１のチャネル１０４は、第１の長さ１１４の少なくとも一部分に沿って延在する第１の開口部１２６（図２に示す）を介して第２のチャネル１１６と流体連通しており、第１の開口部１２６は平面１０２から第１の高さ１１２まで延在する。様々な実施形態では、第１の開口部１２６は、第１の長さ１１４の２５％から７５％に沿って延在する。特定の実施形態では、第１の開口部は、第１の長さの約５０％に沿って延在する。
【0047】
本開示のマイクロ流体チップでは、第１の開口部１２６は遮られていない。言い換えれば、第１の開口部１２６には、毛細管圧力バリア（例えば、フェーズガイド、リム、リッジ、ピラーなど）または膜などの物理的バリアが存在しない。代わりに、第１の高さ１１２および第２の高さ１２２は、第１のチャネルまたは第２のチャネルに注入される液体がそれぞれ第１の容積または第２の容積内に実質的に閉じ込められるように、またはそれらの間（すなわち、第１の容積と第２の容積との間）の液体の流れが制御されるように、第１の開口部１２６で十分な表面張力を生じるようなサイズであり、表面張力は、液体の通過を制限または選択的に制御する非物理的マイクロ流体バリアを生成する。言い換えれば、第１の高さと第２の高さとの間の差は、第１のチャネルに注入される液体が開口部を通って第２のチャネルに広がらないように十分な表面張力をもたらす。
【0048】
したがって、本開示は、平面；平面上に形成され、第１の幅、第１の高さ、および第１の長さによって画定される第１の容積を有する第１のチャネルであって、第１の容積が第１の方向に延在する、第１のチャネル；ならびに第１のチャネルに隣接する平面上に形成される第２のチャネルであって、第２の幅、第２の高さ、および第２の長さによって画定される第２の容積を有し、第２の容積が第１の方向に延在し、第２の高さが第１の高さよりも高い、第２のチャネルを備えるマイクロ流体チップを提供し、第１のチャネルは、第１の長さの少なくとも一部分に沿って延在する第１の開口部を介して第２のチャネルと流体連通し、第１の開口部は、平面から第１の高さまで延在し；第１の高さおよび第２の高さは、第１のチャネルまたは第２のチャネルに注入される液体がそれぞれ第１の容積または第２の容積内に実質的に閉じ込められるように、またはそれらの間（すなわち、第１の容積と第２の容積との間）の液体の流れが制御されるように、第１の開口部で十分な表面張力を生じるようなサイズであり、表面張力は、液体の通過を制限または選択的に制御する非物理的マイクロ流体バリアを生成する。
【0049】
大気圧がマイクロ流体チャネル内の毛細管圧よりも低い場合、十分な表面張力がもたらされる。理解されるように、マイクロ流体チャネル（Ｐｃ）内の毛細管圧は、以下の式に基づいて計算することができる：
【0050】
【数1】
【0051】
ここで、
γ＝マイクロ流体チャネル内の液体の表面張力
ｈ＝チャネルの高さ
ｗ＝チャネルの幅。
γ＝マイクロ流体チャネル内の液体の表面張力
ｈ＝チャネルの高さ
ｗ＝チャネルの幅。
【0052】
θｂｏｔｔｏｍ、θｔｏｐ、θｌｅｆｔ、θｒｉｇｈｔ＝マイクロ流体チャネルに注入される液体の底部、上部、左、および右の接触角。
【0053】
隣り合うチャネル間の高さの差は、以下の式に従って、Ｐｃを大気圧Ｐａよりも高くすることを可能にする：
【0054】
【数2】
【0055】
実施形態では、本開示のマイクロ流体チップは、第１のチャネルと第２のチャネルとの間に第１の開口部、および第１のチャネルと第３のチャネルとの間に第２の開口部を有する少なくとも３つのチャネルを備える（以下でさらに詳細に論じる）。このような構成では、中央（すなわち、第１）のチャネルに対して左または右の表面は存在しない。したがって、θｌｅｆｔ＝θｒｉｇｈｔ＝０。
【0056】
【数3】
【0057】
Ｐａ＝大気圧
様々な実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも７０％である。いくつかの実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも６０％である。いくつかの実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも５０％である。さらなる実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも２５％である。特定の実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも１０％である。開口部のサイズ、ひいてはチャネル間の接触面積のサイズを最大にするために、第１の高さと第２の高さとの間の差を可能な限り最小にすることが好ましい。
様々な実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも７０％である。いくつかの実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも６０％である。いくつかの実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも５０％である。さらなる実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも２５％である。特定の実施形態では、第１の高さ１１２は、第２の高さ１２２の少なくとも１０％である。開口部のサイズ、ひいてはチャネル間の接触面積のサイズを最大にするために、第１の高さと第２の高さとの間の差を可能な限り最小にすることが好ましい。
【0058】
それぞれのチャネルの具体的な寸法は、具体的な目的または設計のために変更することができる。実施形態では、第１の高さは１０マイクロメートル（μｍ）～９００μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、第１の高さは１０μｍ～７２０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、第１の高さは７５マイクロメートルμｍ～７２０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、第１の高さは１０μｍ～４５０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、第１の高さは７５μｍ～４５０μｍの範囲である。特定の実施形態では、第１の高さは約１００μｍである。実施形態では、第１の幅は１．２５ミリメートル（ｍｍ）～２．５ｍｍの範囲である。特定の実施形態では、第１の幅は約１．５ｍｍである。他の実施形態では、第１の幅は約２ｍｍである。実施形態では、第２の高さは３００μｍ～１０００μｍの範囲である。実施形態では、第２の高さは３００μｍ～８００μｍの範囲である。さらなる実施形態では、第２の高さは３００μｍ～５００μｍの範囲である。特定の実施形態では、第２の高さは約４００μｍである。別の特定の実施形態では、第２の高さは約７００μｍである。いくつかの実施形態では、第２の幅は０．７５ｍｍ～１．５ｍｍの範囲である。特定の実施形態では、第２の幅は約１ｍｍである。特定の実施形態では、第１の高さは約１００μｍであり、第１の幅は約２ｍｍであり、第２の高さは約４００μｍであり、第２の幅は約１ｍｍである。
【0059】
様々なチャネルは、任意の適切な長さを有することができる。チャネルの長さはチャネル間の開口部に生成する表面張力に影響を与えないため、チャネルの長さを選択する際に他の要因を考慮することができる。例えば、特定のチャネルの長さは、部分的には、（例えば、隣接するチャネルの入口（複数可）、出口（複数可）、またはベント（複数可）間の距離を増加させることによって）チャネル間の汚染を最小限に抑えるために選択されてもよい。図３に図示するように、第２の長さ１２４は、チャネルの端部を離間させるために、第１の長さ１１４よりも大幅に長くてもよい。様々な実施形態では、第１の長さは５ｍｍ～１０ｍｍの範囲である。特定の実施形態では、第１の長さは約８ｍｍである。いくつかの実施形態では、第２の長さは１．５センチメートル（ｃｍ）～２．５ｃｍの範囲である。特定の実施形態では、第２の長さは約２ｃｍである。いくつかの実施形態では、第２のチャネルの長さは０．５ｃｍ～１．５ｃｍの範囲である。特定の実施形態では、第２の長さは約１ｃｍである。具体的な実施形態では、第１の長さは約８ｍｍであり、第２の長さは約２ｃｍである。２つを超えるチャネル、例えば３つのチャネルを備えるマイクロ流体チップでは、第３のチャネルの長さは第２のチャネルの長さと同じであってもよい。他の実施形態では、第３のチャネルの長さは、第２のチャネルの長さよりも長い。さらなる実施形態では、第３のチャネルの長さは、第２のチャネルの長さよりも短い。なおさらなる実施形態では、第２および／または第３のチャネルの長さは、第１のチャネルの長さよりも短い。
【0060】
上記のように、マイクロ流体チャネルの各々は、特定の用途に必要とされるように、入口、ならびに出口またはベントを備えることができる。様々な実施形態では、各々のマイクロ流体チャネルは、液体の充填、排出、および灌流を容易にするために入口および出口を備える。そのような入口および出口は、一般に、カバーレイヤのアパーチャーとして形成されるが、他の構成も企図される。
【0061】
図１および図２に示すように、本開示のマイクロ流体チップは、第１のチャネル１０４に隣接する第３のチャネル１２８を備えてもよい。第３のチャネル１２８は、第１の方向に延在し、第３の幅１３２、第３の高さ１３４、および第３の長さ１３６によって画定される第３の容積１３０を有する。図示された構成では、第３のチャネル１２８は、第１の長さ１１４の少なくとも一部分に沿って延在する第２の開口部１３８を介して第１のチャネル１０４と流体連通している。第２の開口部１３８は、平面１０２から第１の高さ１１２まで延在する。示されるように、第３の高さ１３４は第１の高さ１１２よりも高い。さらに、第１の高さ１１２および第３の高さ１３４は、第１のチャネル１０４または第３のチャネル１２８に注入される液体がそれぞれ第１の容積１０６または第３の容積１３０内に実質的に閉じ込められるように、またはそれらの間（すなわち、第１の容積と第３の容積との間）の液体の流れが制御されるように、第２の開口部１３８で十分な表面張力を生じるようなサイズであり、表面張力は、液体の通過を制限または選択的に制御する第２の非物理的マイクロ流体バリアを生成する。第１の高さ１１２および第３の高さ１３４は、第１の高さ１１２および第２の高さ１２２に関して上述したのと同様にサイズ設定される。いくつかの実施形態では、第２の高さ１２２および第３の高さ１３４は同じである。
【0062】
別の実施形態では、第２のチャネルに隣接する平面上に第３のチャネルが形成される。第３のチャネルは、第１の方向に延在し、第３の幅、第３の高さ、および第３の長さによって画定される第３の容積を有する。この構成では、第３のチャネルは、第３の長さの少なくとも一部分に沿って延在する第２の開口部を介して第２のチャネルと流体連通している。第２の開口部は、平面から第２の高さよりも低い第３の高さまで延在する。さらに、第２の高さおよび第３の高さは、第２のチャネルまたは第３のチャネルに注入される液体がそれぞれ第２の容積または第３の容積内に実質的に閉じ込められるように、またはそれらの間（すなわち、第２の容積と第３の容積との間）の液体の流れが制御されるように、第２の開口部で十分な表面張力を生じるようなサイズであり、表面張力は、液体の通過を制限または選択的に制御する第２の非物理的マイクロ流体バリアを生成する。したがって、第２の高さおよび第３の高さは、第１の高さおよび第２の高さに関して上述したのと同様にサイズ設定される。いくつかの実施形態では、第１の高さおよび第３の高さは同じである。
【0063】
図１および図２のマイクロ流体チップは３つのチャネルで図示されているが、本開示のマイクロ流体チップが任意の適切な数のチャネルを有し得ることは前述の説明から明らかであろう。例示的な２チャネルマイクロ流体チップを図４に示す。第１のチャネルおよび第２のチャネルに関して上で論じたように、隣接するチャネル間の高さの差がそれぞれの開口部に十分な表面張力をもたらす限り、任意の適切な数（例えば、２、３、４、５、６つなど）および配置のチャネルを使用することができる。
【0064】
さらに、本開示のマイクロ流体チップは、インビトロ細胞ベースのアッセイ、医薬品スクリーニングアッセイ、毒性アッセイなど、例えば、ハイスループットスクリーニングフォーマットでの使用を可能にするために、マルチウェルフォーマットとも呼ばれるマルチアレイフォーマットであってもよい。例えば、６、１２、２４、４８、９６、３８４、または１５３６個の試料ウェル（例えば、単一の試料を試験するためのマルチチャネル配置）が矩形マトリックスに配置されたマルチアレイ培養プレート。実施形態では、マイクロ流体チップは、標準ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳマイクロタイター・プレート・フォーマットの１つまたは複数の寸法に適合する。
【0065】
本開示のマイクロ流体チップは、フォトリソグラフィ技術、ホットエンボス技術、ソフトエンボス技術、エッチング技術、複製モールドまたは射出モールド技術などの任意の適切な技術を使用して構築することができる。
【0066】
生体模倣システムおよびその作製方法
本開示のマイクロ流体チップを備える生体模倣システム（ＭＰＳ）も本明細書に記載されている。そのようなＭＰＳは、第１のチャネルの第１の容積内に閉じ込められた細胞外マトリックスを含む。細胞外マトリックスの側壁は、第１の開口部を横切って延在し、第１のチャネルと第２のチャネルとの間に非物理的マイクロ流体バリアを形成する。
本開示のマイクロ流体チップを備える生体模倣システム（ＭＰＳ）も本明細書に記載されている。そのようなＭＰＳは、第１のチャネルの第１の容積内に閉じ込められた細胞外マトリックスを含む。細胞外マトリックスの側壁は、第１の開口部を横切って延在し、第１のチャネルと第２のチャネルとの間に非物理的マイクロ流体バリアを形成する。
【0067】
細胞外マトリックスは、上皮細胞をその表面上で培養することができる任意の適切なゲルであり得る。例えば、細胞外マトリックスは、ヒドロゲル、アガロース、ゼラチン、デキストラン、キトサン、シリカゲルなどを含む、合成ポリマーまたは天然ポリマー（例えば、バイオポリマー）を含み得る。実施形態では、細胞外マトリックスは、基底膜抽出物、ヒトもしくは動物組織または細胞培養物由来の細胞外マトリックス、動物組織由来の細胞外マトリックス、合成細胞外マトリックス、ヒドロゲル、コラーゲン、軟寒天、卵白、またはそれらの組合せを含む。
【0068】
細胞外マトリックスはまた、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、Ｄ－リジン、エンタクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはそれらの組合せなどの成長および／または分化基質を含み得る。別の実施形態では、マトリックスは、ラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチンおよびヘパリン硫酸プロテオグリカンを含み得る。いくつかのそのような実施形態では、マトリックスはまた、成長因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ（コレゲナーゼ）、他のプロテイナーゼ（プラスミノーゲン活性化因子）、またはそれらの組合せを含む。別の実施形態では、細胞外マトリックスは、基底膜抽出物、細胞外マトリックス成分、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、Ｄ－リジン、エンタクチン、ヘパランスルフィドプロテオグリカン、またはそれらの組合せを含む。
【0069】
実施形態では、細胞外マトリックスはヒドロゲルを含む。本明細書で使用される場合、「ヒドロゲル」は、架橋された親水性ポリマー鎖の三次元ネットワークである。細胞培養に使用されるヒドロゲルは、天然および／または合成材料を含み得る。細胞培養に適した天然ヒドロゲルは、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、またはマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）などのタンパク質および細胞外マトリックス成分、ならびにキトサン、アルギネート、またはシルクフィブリルなどの他の生物源に由来する材料を含み得る。適切な合成ヒドロゲルは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）、およびポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）などの非天然分子から形成され得る。
【0070】
いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスは基底膜抽出物を含む。基底膜は、タンパク質およびプロテオグリカンを含み、インビボで上皮細胞の下にある薄い細胞外マトリックスである。上皮細胞は基底膜と協働して固体バリアを形成し、内部の生命活動を保護する。
【0071】
細胞外マトリックスは、細胞外マトリックス前駆体の形態でマイクロ流体チップにもたらされる。本明細書で使用される場合、「細胞外マトリックス前駆体」は、硬化すると、本明細書に記載の細胞外マトリックスをもたらす液体ポリマーまたはプレポリマーを指す。
【0072】
細胞外マトリックス前駆体がもたらされた後、隣接するチャネルにさらなる液体を導入する前に、少なくとも部分的に硬化（すなわち、ゲル化）される。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスは、液体を隣接するチャネルに導入する前に完全に硬化される。したがって、本開示のＭＰＳを調製する方法は、マイクロ流体チップの第１のチャネルに細胞外マトリックス前駆体を堆積させること；および細胞外マトリックス前駆体を硬化させて、第１のチャネルに細胞外マトリックスをもたらすことを含む。細胞外マトリックス前駆体を硬化させるために使用される条件は、使用される細胞外マトリックスに応じて変化し得るだろう。特定の細胞外マトリックス前駆体に適した任意の硬化方法を使用することができる。実施形態では、細胞外マトリックス前駆体を硬化させることは、細胞外マトリックス前駆体を固化させることを含む。特定の実施形態では、細胞外マトリックス前駆体を硬化させることは、細胞外マトリックス前駆体を固化させると同時に、細胞外マトリックス前駆体をインキュベートすることを含む。細胞外マトリックス前駆体は、例えば、約３７℃でインキュベートされ得る。他の実施形態では、細胞外マトリックス前駆体を硬化させることは、細胞外マトリックス前駆体を架橋剤とインキュベートすることを含む。さらなる実施形態では、細胞外マトリックス前駆体を硬化させることは、イオン重合、熱重合、または光重合を含む。
【0073】
実施形態では、細胞外マトリックスはまた、細胞（例えば、生体組織試料から）を含む。例えば、生体組織は、オルガノイド、組織生検、腫瘍組織、切除された組織材料、または胚体を含み得る。生体組織試料は、特定の組織または臓器に関連する表現型から得られるか、それに由来するか、またはそれを示す細胞、例えば、神経細胞、心臓細胞、肝細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）、腎細胞、骨格筋細胞、骨細胞、皮膚細胞、食道細胞、腸細胞、胃細胞、結腸細胞、肺細胞、または膵臓細胞を含み得る。特定の実施形態では、細胞は神経細胞である。いくつかのそのような実施形態では、神経細胞は、ヒト人工多能性幹細胞由来の神経前駆細胞、星状細胞、ミクログリア、またはそれらの組合せを含む。生体組織試料は、健常組織または疾患組織に由来してもよい。他の適切な細胞には、ヒトｉＰＳＣ由来の細胞、胚性幹細胞、および他の多能性細胞、前駆細胞、分化可能細胞などが含まれる。例えば、ニューロン、内皮細胞、上皮細胞、星状細胞、周皮細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）、線維芽細胞、骨細胞など。
【0074】
いくつかの実施形態では、細胞が細胞外マトリックス前駆体に堆積された後、それは硬化される。いくつかのそのような実施形態では、細胞は、第１のチャネルに堆積される前に細胞外マトリックス前駆体中に存在する。他の実施形態では、細胞は、細胞外マトリックスの中または上に導入される。
【0075】
上記のように、細胞外マトリックス前駆体は、さらなる液体を隣接するチャネルに導入する前に硬化される。したがって、実施形態では、本開示のＭＰＳを調製する方法は、細胞外マトリックス前駆体を硬化させることを含み、媒体は、第１のチャネルの細胞外マトリックスに隣接する第２のチャネルに堆積される。したがって、特定の実施形態では、本開示のＭＰＳを調製する方法は、細胞外マトリックス前駆体をインキュベートすることによって細胞外マトリックス前駆体を硬化させることを含み、媒体は、第１のチャネルの細胞外マトリックスに隣接する第２のチャネルに堆積される。
【0076】
いくつかのそのような実施形態では、媒体は、細胞外マトリックスを含むチャネル（例えば、第１のチャネル）に隣接するチャネル（例えば、第２のチャネル）の容積内に閉じ込められる。例えば、いくつかの実施形態では、媒体は、第２のチャネルの第２の容積内に閉じ込められる。実施形態では、マイクロ流体チップは、第１のチャネルに隣接する第３のチャネルを備え、第３の高さは第１の高さよりも高い。いくつかのそのような実施形態では、ＭＰＳは、第３のチャネルの第３の容積内に閉じ込められた第２の媒体をさらに含む。
【0077】
他の実施形態では、マイクロ流体チップは、第２のチャネルに隣接する第３のチャネルを備え、第３の高さは第２の高さよりも低い。いくつかのそのような実施形態では、ＭＰＳは、第３のチャネルの第３の容積内に閉じ込められた第２の細胞外マトリックスをさらに含む。
【0078】
本開示のＭＰＳでは、上皮バリアとも呼ばれる上皮レイヤが、隣接するチャネル間の開口部に配置される。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＰＳは、第１のチャネルと第２のチャネルとの間の第１の開口部に配置された上皮バリアを備える。
【0079】
実施形態では、上皮バリア（例えば、内皮バリア）は連続的である。いくつかの実施形態では、上皮バリアは、７５％のコンフルエンスである場合、連続的である。本明細書で使用される場合、「コンフルエンス」は、付着性上皮細胞によって覆われる、隣接するチャネル間の開口部における細胞外マトリックスの側壁の割合の推定値として使用される。実施形態では、上皮バリアは、８５％のコンフルエンスである場合、連続的である。実施形態では、上皮バリアは、９０％のコンフルエンスである場合、連続的である。実施形態では、上皮バリアは、９５％のコンフルエンスである場合、連続的である。特定の実施形態では、上皮バリアは、コンフルエントである（すなわち、細胞外マトリックスの側壁の約１００％が付着細胞によって覆われている）場合、連続的であると考えられる。
【0080】
任意の適切な上皮細胞を使用することができる。本明細書で使用される場合、「上皮細胞」は、上皮起源の細胞、または細胞を上皮細胞として特定するマーカーを発現する状態に分化される細胞を指す。
【0081】
細胞は、動物細胞（例えば、上皮細胞、上皮細胞株由来の細胞、上皮初代細胞）であり得る。例えば、細胞は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒト）に由来し得る。特定の実施形態では、細胞はヒト細胞（例えば、上皮細胞、上皮細胞株由来の細胞、上皮初代細胞）である。使用され得る上皮細胞の例としては、前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）、膵島細胞（例えば、ベータ細胞）、肺上皮細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、胃上皮細胞、大腸および小腸上皮細胞、尿道上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、胆嚢細胞、および下垂体細胞が挙げられる。さらに、形質転換された細胞または樹立された細胞株も使用することができる。本明細書で使用される場合、「細胞株」という用語は、連続的に成長する細胞または不死化した細胞を指す。言い換えれば、細胞株は、通常は無制限に増殖しないが、変異のために正常な細胞老化を回避し、代わりに分裂を継続することができる多細胞生物由来の細胞の集団である。
【0082】
実施形態では、上皮バリアは内皮細胞を含む。「内皮細胞」は、内皮起源の細胞、または細胞を内皮細胞として特定するマーカーを発現する状態に分化される細胞である。いくつかの実施形態では、上皮バリアは内皮バリアである。いくつかの実施形態では、内皮細胞は幹細胞に由来する。特定の実施形態では、内皮細胞は、人工多能性幹細胞に由来する。いくつかの実施形態では、内皮細胞は、血液増殖内皮細胞を含む。上皮バリアを形成する上皮細胞（例えば、内皮細胞）は、生体組織試料を得た対象と同じ対象から得られてもよいか、または同じ対象に由来してもよい。特定の実施形態では、内皮バリアは脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）を含む。特定の実施形態では、内皮バリアはヒトＢＭＥＣを含む。
【0083】
本開示のＭＰＳを調製する方法の実施形態は、第１のチャネルと第２のチャネルとの間の第１の開口部に連続的な内皮バリアを培養することを含む。上記のように、そのような上皮バリア（例えば、内皮バリア）は、細胞外マトリックス前駆体が硬化された後、および媒体が隣接するチャネルに堆積された後に、細胞外マトリックスの側壁で培養される。いくつかの実施形態では、上皮細胞は、上皮バリアに隣接するチャネル（例えば、第２のチャネル）の媒体に堆積され、マイクロ流体チップは、上皮細胞が細胞外マトリックスの側壁に沈降するように傾けられる。
【0084】
細胞外マトリックスを含むチャネルに隣接するチャネルに含まれる媒体は、チャネルの機能に応じて選択される。例えば、上皮バリアに隣接するチャネル（例えば、第２のチャネル）の媒体は、典型的には、上皮細胞が注入された後に栄養素および酸素をもたらす増殖培地である。さらに、そのようなチャネルに含まれる媒体は、様々な時点で変更または置換されてもよい。
【0085】
いくつかの実施形態では、上皮バリアに隣接するチャネル（例えば、第２のチャネル）の媒体は周皮細胞をさらに含む。言い換えれば、いくつかの実施形態では、周皮細胞は第２のチャネルに含まれる。そのような実施形態では、第２のチャネルの媒体は、内皮細胞の培地と周皮細胞の培地との組合せを含み得る。
【0086】
実施形態では、流れは少なくとも１つのチャネルでシミュレートされる。様々な実施形態では、流れは、マイクロ流体チップを第１の方向に揺動させることによってシミュレートされる。そのような実施形態では、上皮バリアが確立される（例えば、上皮バリアが、７５％、８５％、９０％、９５％、または１００％のコンフルエンスを有する）まで、マイクロ流体チップで流れはシミュレートされない。
【0087】
理解され得るように、本開示のＭＰＳは、媒体含有チャネル（例えば、第２のチャネル）が「血液」チャネルとして作用し、細胞外マトリックス含有チャネル（例えば、第１のチャネル）が組織（例えば、脳、心臓、肝臓、腎臓、骨格筋、骨、皮膚、食道、腸、胃、結腸、肺、膵臓など）チャネルとして作用する血管柄付きの組織モデルとしての使用によく適している。したがって、実施形態では、本開示のＭＰＳは血管柄付きの組織モデルである。いくつかの実施形態では、血管柄付きの組織モデルは、血液脳関門モデルまたは脳卒中モデルである。さらなる実施形態では、血管柄付きの組織モデルは、心臓モデル、骨格筋モデル、肝臓モデル、腎臓モデル、骨モデル、皮膚モデル、食道モデル、胃モデル、結腸モデル、腸モデル、肺モデル、または膵臓モデルである。
【0088】
特定の実施形態では、本開示のマイクロ流体チップは、ヒト血液脳関門（ＢＢＢ）に適用される場合、３つのチャネル：血流をシミュレートするための「血液側」チャネル（すなわち、上で論じたように、第２のチャネル）；神経細胞がヒドロゲルマトリックス中に天然の３Ｄ構造を形成する中央の「脳」チャネル（すなわち、上で論じたように、第１のチャネル）；および「脳」チャネルの神経細胞への追加の流体アクセスを提供する「脳脊髄液（ＣＳＦ）側」チャネル（すなわち、上で論じたように、第３のチャネル）を備える。好ましい実施形態では、中央の「脳」チャネルは、チャネルの上面と下面との間に表面張力を生じるために高さが低くなるように構成され、これは「脳」チャネル内に液体ヒドロゲル前駆体を安定して含むように動作する。ＢＢＢモデルのこの実施形態は、「血液側」チャネルと「脳」チャネルとの間に明確に画定された境界をもたらす連続的で物理的にインタクトな内皮バリアを生じることができる。
【0089】
使用方法
本開示はまた、本明細書に記載のＭＰＳを使用する方法を提供する。特に、本開示のマイクロ流体デバイスおよびその上に製造されるＭＰＳは、ＢＢＢ、ＮＶＵ、ＣＮＳ、血管、肝臓、腎臓、腸、またはがん腫瘍などのこれらのチップおよびモデルを使用して、様々なヒト生体系をアッセイまたは試験する方法に使用され得る。さらに、ＭＰＳは、３Ｄ細胞培養、共培養、遊走試験、細胞傷害性試験、および様々な他の細胞アッセイに使用され得る。特定の実施形態では、本開示のＭＰＳは血管柄付きの組織モデルである。様々な実施形態では、血管柄付きの組織モデルは、心臓モデル、骨格筋モデル、肝臓モデル、腎臓モデル、骨モデル、皮膚モデル、食道モデル、胃モデル、結腸モデル、腸モデル、肺モデル、または膵臓モデルである。
本開示はまた、本明細書に記載のＭＰＳを使用する方法を提供する。特に、本開示のマイクロ流体デバイスおよびその上に製造されるＭＰＳは、ＢＢＢ、ＮＶＵ、ＣＮＳ、血管、肝臓、腎臓、腸、またはがん腫瘍などのこれらのチップおよびモデルを使用して、様々なヒト生体系をアッセイまたは試験する方法に使用され得る。さらに、ＭＰＳは、３Ｄ細胞培養、共培養、遊走試験、細胞傷害性試験、および様々な他の細胞アッセイに使用され得る。特定の実施形態では、本開示のＭＰＳは血管柄付きの組織モデルである。様々な実施形態では、血管柄付きの組織モデルは、心臓モデル、骨格筋モデル、肝臓モデル、腎臓モデル、骨モデル、皮膚モデル、食道モデル、胃モデル、結腸モデル、腸モデル、肺モデル、または膵臓モデルである。
【0090】
例えば、本開示のＭＰＳは、治療剤（複数可）をスクリーニングする方法に使用され得る。そのような方法では、本開示のＭＰＳが上述のように調製される。上皮バリアが確立された後、治療剤は、上皮バリアに隣接するチャネル（例えば、第２のチャネル）の媒体に堆積される。適切な期間の後、マイクロ流体チップが分析される。いくつかの実施形態では、分析はイメージング研究を含む。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックス中の細胞または組織は溶解され得、遺伝子発現が分析され得る。そのようなスクリーニング方法は、任意の適切な治療剤（複数可）に使用され得る。例えば、治療剤は、幹細胞、小分子、またはペプチドであり得る。
【0091】
例として、本開示のＭＰＳは、上述のように調製され得る（例えば、（１）生体組織試料を含む細胞外マトリックス前駆体を第１のチャネルに堆積させること、（２）細胞外マトリックス前駆体を硬化させること、（３）内皮細胞および周皮細胞を含む媒体を第１のチャネルに隣接する第２のチャネルに堆積させること、ならびに（４）第１のチャネルと第２のチャネルとの間の開口部の細胞外マトリックスの側壁で連続的な内皮バリアを培養することによって）。ＭＰＳが調製され、内皮バリアが確立された後、治療剤は第２のチャネルに堆積される。適切な期間の後、ＭＰＳが分析される。例えば、マイクロ流体チップを染色し、撮像してもよい。あるいは、または加えて、細胞外マトリックスおよび包埋細胞が溶解され、遺伝子発現が分析される。さらに、第３のチャネルから媒体を除去し、例えば、治療剤、代謝産物などの濃度について分析されてもよい。そのような方法は、複数の治療剤と連続してまたは並行して繰り返され得る。いくつかの実施形態では、各々の治療剤に対していくつかの反復が行われる。
【0092】
いくつかの実施形態では、スクリーニング方法は、特定の患者に特異的である。そのような実施形態では、スクリーニングの結果を処置の決定に使用することができる。特定の実施形態では、本開示のＭＰＳで使用される細胞は、患者由来の細胞である。いくつかのそのような実施形態では、個々の患者に固有な病態生理学的状態もＭＰＳでシミュレートされる。
【0093】
様々な実施形態では、ＭＰＳの部分は、撮像の前に染色される。いくつかの実施形態では、プローブは、撮像の前にＭＰＳに導入される。任意の適切な染色（例えば、ＣＤ３１、フォン・ヴィレブランド因子など）またはプローブ（例えば、発光プローブ）を、公知のプロトコルに従って使用することができる。イメージング研究は、例えば、神経変性を評価するため、幹細胞の浸潤を追跡するため、虚血性脳卒中モデルにおけるニューロンの細胞質カルシウム振動を記録するため、内皮バリアの状態を評価するためなどに使用され得る。
【0094】
キット
本開示はさらに、本明細書に記載のＭＰＳの調製またはＭＰＳの使用（例えば、治療剤（複数可）をスクリーニングする方法において）に使用するためのキットを提供する。本開示のキットは、上で論じたように、マイクロ流体チップを含む。いくつかの実施形態では、本開示のキットはまた、細胞外マトリックス前駆体またはその成分を含む。特定の実施形態では、本開示のキットは、マイクロ流体チップおよび血管新生促進化合物を含む。
本開示はさらに、本明細書に記載のＭＰＳの調製またはＭＰＳの使用（例えば、治療剤（複数可）をスクリーニングする方法において）に使用するためのキットを提供する。本開示のキットは、上で論じたように、マイクロ流体チップを含む。いくつかの実施形態では、本開示のキットはまた、細胞外マトリックス前駆体またはその成分を含む。特定の実施形態では、本開示のキットは、マイクロ流体チップおよび血管新生促進化合物を含む。
【0095】
そのようなキットは、治療剤（複数可）の評価に必要な、１種または複数の試薬、アッセイの対照、または他の供給品、例えば、シリンジ、アンプル、バイアル、チューブ、チュービング、フェイスマスク、無針流体移送デバイス、注入キャップ、スポンジ、滅菌付着ストリップ、Ｃｈｌｏｒａｐｒｅｐ、手袋などをさらに含み得る本明細書に記載のキットのいずれかの内容物において変化があってもよい。
【0096】
キットは、本明細書に開示の方法においてキットを使用するための書面の説明書をさらに含み得る。様々な実施形態では、書面の説明書は、試薬の調製に関する説明書；キットの使用に関連する結果を解釈するための適切な基準レベル；関連廃棄物の適切な処分などを含み得る。書面の説明書は、キット内に提供される印刷された説明書の形態であり得るか、または書面の説明書は、キットを収容する容器の一部分に印刷され得る。書面の説明書は、シート、パンフレット、ブローシャ、ＣＤ－ＲＯＭ、またはコンピュータ可読デバイスの形態であり得るか、またはウェブサイトなどの遠隔地で説明書を見つけるための指示を提供することができる。書面の説明書は、英語および／または国内もしくは地域の言語であってもよい。
【0097】
実施例１
幹細胞療法の神経修復能の系統的評価のための生体模倣脳卒中モデル
幹細胞療法は、虚血性脳卒中後に神経機能を修復させるための有望な処置選択肢として浮上している。各々が独特な特性を有する候補の幹細胞タイプの数が増えているにもかかわらず、それらの神経修復能を体系的に評価するための実験的プラットフォームが不足している。幹細胞を虚血性脳に移植する場合、治療有効性は、これらの外来細胞に対する神経血管ユニット（ＮＶＵ）の応答に主に依存する。マイクロ流体チップ上に機能的ＮＶＵを有する虚血性脳卒中の生体模倣システム（ＭＰＳ）を開発した。新しいチップ設計は、組み込まれた細胞が機能的血液脳関門（ＢＢＢ）を形成し、健康な条件と虚血性条件の両方でインビボ様挙動を復元するのを容易にした。ＭＰＳを使用して、移植された幹細胞を追跡し、遺伝子発現レベルに反映されたそれらの神経修復挙動を特性評価した。各々のタイプの幹細胞は、直接的な細胞置換ではなく、主に内因性回復を補助することによって、独特な神経修復効果を示した。神経機能にとって重要なシナプス活性の回復は、ニューロン自体の再生ではなく、ＮＶＵにおける構造的および機能的完全性の回復とより密接に相関した。
幹細胞療法の神経修復能の系統的評価のための生体模倣脳卒中モデル
幹細胞療法は、虚血性脳卒中後に神経機能を修復させるための有望な処置選択肢として浮上している。各々が独特な特性を有する候補の幹細胞タイプの数が増えているにもかかわらず、それらの神経修復能を体系的に評価するための実験的プラットフォームが不足している。幹細胞を虚血性脳に移植する場合、治療有効性は、これらの外来細胞に対する神経血管ユニット（ＮＶＵ）の応答に主に依存する。マイクロ流体チップ上に機能的ＮＶＵを有する虚血性脳卒中の生体模倣システム（ＭＰＳ）を開発した。新しいチップ設計は、組み込まれた細胞が機能的血液脳関門（ＢＢＢ）を形成し、健康な条件と虚血性条件の両方でインビボ様挙動を復元するのを容易にした。ＭＰＳを使用して、移植された幹細胞を追跡し、遺伝子発現レベルに反映されたそれらの神経修復挙動を特性評価した。各々のタイプの幹細胞は、直接的な細胞置換ではなく、主に内因性回復を補助することによって、独特な神経修復効果を示した。神経機能にとって重要なシナプス活性の回復は、ニューロン自体の再生ではなく、ＮＶＵにおける構造的および機能的完全性の回復とより密接に相関した。
【0098】
機能的ＢＢＢの再構築のためのチップ設計
インビトロモデルの重要な利点は、細胞挙動のリアルタイムモニタリングの能力である。マイクロ流体チップは３つのチャネル；血流をシミュレートするための「血液側」チャネル、神経細胞がヒドロゲルマトリックス中に天然の３Ｄ構造を形成する「脳」チャネル、および「脳」チャネルの神経細胞への追加のアクセスを提供する「脳脊髄液（ＣＳＦ）側」チャネルを有する。０日目に、神経組織を展開することによって試料を調製し、神経細胞を脳チャネルのヒドロゲルに注入した。神経増殖培地と星状細胞培地の混合培地も、０日目に血液側チャネルおよびＣＳＦ側チャネルに加えた。３日目に、神経分化培地と星状細胞培地の混合培地を、血液側チャネルおよびＣＳＦ側チャネルに加えた。５日目に、血管の発達が始まった。内皮細胞培地と周皮細胞培地の混合培地中の血管細胞を血液側チャネルに注入し、神経分化培地と星状細胞培地の混合培地をＣＳＦ側チャネルに流して加えた。１０日目に、グルコースを含まない媒体を血液側チャネルおよびＣＳＦ側チャネルに加え、マイクロ流体チップを２％酸素でインキュベートすることによって虚血を誘発した。１１日目に、血液側チャネルの内皮細胞培地と周皮細胞培地の混合培地に幹細胞を注入し、神経分化培地と星状細胞培地の混合培地をＣＳＦ側チャネルに加えることによって幹細胞移植を行った。１８日目に、結果を分析した。このプロセスは、表１により詳細に記載されている。
インビトロモデルの重要な利点は、細胞挙動のリアルタイムモニタリングの能力である。マイクロ流体チップは３つのチャネル；血流をシミュレートするための「血液側」チャネル、神経細胞がヒドロゲルマトリックス中に天然の３Ｄ構造を形成する「脳」チャネル、および「脳」チャネルの神経細胞への追加のアクセスを提供する「脳脊髄液（ＣＳＦ）側」チャネルを有する。０日目に、神経組織を展開することによって試料を調製し、神経細胞を脳チャネルのヒドロゲルに注入した。神経増殖培地と星状細胞培地の混合培地も、０日目に血液側チャネルおよびＣＳＦ側チャネルに加えた。３日目に、神経分化培地と星状細胞培地の混合培地を、血液側チャネルおよびＣＳＦ側チャネルに加えた。５日目に、血管の発達が始まった。内皮細胞培地と周皮細胞培地の混合培地中の血管細胞を血液側チャネルに注入し、神経分化培地と星状細胞培地の混合培地をＣＳＦ側チャネルに流して加えた。１０日目に、グルコースを含まない媒体を血液側チャネルおよびＣＳＦ側チャネルに加え、マイクロ流体チップを２％酸素でインキュベートすることによって虚血を誘発した。１１日目に、血液側チャネルの内皮細胞培地と周皮細胞培地の混合培地に幹細胞を注入し、神経分化培地と星状細胞培地の混合培地をＣＳＦ側チャネルに加えることによって幹細胞移植を行った。１８日目に、結果を分析した。このプロセスは、表１により詳細に記載されている。
【0099】
【表1】
【0100】
ＮＰＣ：神経前駆細胞
ＮＥＭ：神経増殖培地
ＡＭ：血清不含星状細胞培地
ＡＣＭ：星状細胞馴化培地
ＮＤＭ：神経分化培地
ＥＣＭ：内皮細胞培地
ＰＭ：周皮細胞培地
ヒドロゲルマトリックスについては、ラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチン、フィブロネクチン、エンタクチン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンの主要成分を有する、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）腫瘍（Ｃｕｌｔｒｅｘ（商標）、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）から精製された可溶性形態の基底膜を使用した。ＥＨＳ腫瘍由来の基底膜は、脳組織の生理的剛性の範囲内で０．５ｋＰａ前後の弾性係数を有し、ＮＰＣの神経分化、および神経の生存や機能を補助する。以前のチップ設計では、各々のマイクロ流体チャネルをマイクロポールによって分離して、指定されたチャネル内に液体ヒドロゲルプレポリマーを閉じ込めるのに必要な表面張力を生じさせた。内皮は、構造全体のｘ－ｙ平面に垂直な「脳」チャネルのヒドロゲルの側壁に形成されることになっていた。しかしながら、これらのマイクロポールが内皮細胞と干渉し、それらが連続的でインタクトな内皮を形成するのを防ぎ、物理的欠陥を生じることが発見された。これらの欠陥は、血流中の幹細胞または生物活性物質が虚血的に損傷した脳に達するための人工的に容易なショートカットとして機能し得るので、幹細胞療法の実際の有効性の評価を妨げる可能性があった。
ＮＥＭ：神経増殖培地
ＡＭ：血清不含星状細胞培地
ＡＣＭ：星状細胞馴化培地
ＮＤＭ：神経分化培地
ＥＣＭ：内皮細胞培地
ＰＭ：周皮細胞培地
ヒドロゲルマトリックスについては、ラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチン、フィブロネクチン、エンタクチン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンの主要成分を有する、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）腫瘍（Ｃｕｌｔｒｅｘ（商標）、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）から精製された可溶性形態の基底膜を使用した。ＥＨＳ腫瘍由来の基底膜は、脳組織の生理的剛性の範囲内で０．５ｋＰａ前後の弾性係数を有し、ＮＰＣの神経分化、および神経の生存や機能を補助する。以前のチップ設計では、各々のマイクロ流体チャネルをマイクロポールによって分離して、指定されたチャネル内に液体ヒドロゲルプレポリマーを閉じ込めるのに必要な表面張力を生じさせた。内皮は、構造全体のｘ－ｙ平面に垂直な「脳」チャネルのヒドロゲルの側壁に形成されることになっていた。しかしながら、これらのマイクロポールが内皮細胞と干渉し、それらが連続的でインタクトな内皮を形成するのを防ぎ、物理的欠陥を生じることが発見された。これらの欠陥は、血流中の幹細胞または生物活性物質が虚血的に損傷した脳に達するための人工的に容易なショートカットとして機能し得るので、幹細胞療法の実際の有効性の評価を妨げる可能性があった。
【0101】
したがって、マイクロポールなしであるが、依然として同じ微視的焦点面においてリアルタイムモニタリング能力を有する新しいチップ設計が開発された。新しい設計では、中央の「脳」チャネルの高さを下げて、上面と底面との間に表面張力を生じさせ、液体ヒドロゲルプレポリマーを「脳」チャネルに安定して保持させた。新しいチップの「血液側」チャネルと「脳」チャネルとの間に明確に画定された境界が形成された。再構築された内皮は、それ自体を横切る蛍光プローブ（ＦＩＴＣ－デキストラン、４ｋＤａ）の自由拡散を首尾よく防止した。ウイルスおよび細菌などの多くの病原体は４ｋＤａより大きく、天然のＢＢＢはこれらの病原体が脳に入るのを防ぐので、４ｋＤａのプローブサイズはＢＢＢの機能性を評価するのに有用である。
【0102】
共焦点顕微鏡画像の単層は、マイクロポールを有する以前のチップ設計で生成されたバリアとは対照的に、連続的で物理的にインタクトな内皮バリアを示した。さらに、新しいチップ設計は、マイクロメートル規模の特徴がなく、チップ製造におけるソフトリソグラフィプロセスの必要性を排除し、３Ｄプリンタによる製造を可能にする。
【0103】
内皮形成の前に、「脳」チャネルからの遊走後、「血液側」チャネルに星状細胞の小さな集団が見られた（全体に組み込まれた星状細胞の０．９±０．３（ｓ．ｄ．）％、ｎ＝３）。これらの遊走した星状細胞は周皮細胞と一緒に、ＢＭＥＣを補助して、２Ｄ培養において星状細胞および周皮細胞の両方と共培養された場合のＢＭＥＣの形態のように、「血液側」チャネル全体にわたって滑らかな丸い形状の正常な形態を維持した。「血液側」チャネルの星状細胞および周皮細胞は、互いに接続されたＢＭＥＣとして底部で内皮細胞のレイヤの下に定着し、成熟して内皮を形成した。これは、内皮細胞－細胞間ジャンクションが隣り合う内皮細胞間の接続を強化する血管新生プロセスに起因した可能性がある。
【0104】
細胞組成および流れの存在に応じた異なる条件下での内皮の気密性を、見かけの透過係数を計算することによって調べた。星状細胞および周皮細胞の存在下では、内皮は、プローブであるＦＩＴＣ－デキストランの拡散を妨げるために著しく締め付けるようになった。培養培地の流れを導入した後、透過性のさらなる有意な低下が観察された。流れの存在下での内皮のこの締付けは、適切な機械的刺激によるＢＢＢにおける傍細胞接続性の増強の報告と一致する。得られたＢＢＢモデルの透過係数は、４ｋＤａおよび７０ｋＤａのＦＩＴＣ－デキストランについてそれぞれ約６×１０－７ｃｍ／ｓおよび約８×１０－８ｃｍ／ｓであり、以前に報告された他のインビトロおよびインビボＢＢＢモデルのそれらに匹敵した。再構築されたＢＢＢはまた、機能的ＢＢＢの場合と同様に、予想されるサイズ選択的透過性を示し；プローブサイズが小さいほど、ＢＢＢを横切る拡散が良好になる。
【0105】
ＢＢＢの気密性を評価するための別の標準的な尺度は、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）である。ＴＥＥＲ測定は、バリア完全性を定量化するための単純で、無標識かつ非侵襲的な方法である。マイクロ流体ＢＢＢモデルについて報告されているＴＥＥＲ値は数百～数千Ωｃｍ２の広範囲であるが、透過係数は４ｋＤａ ＦＩＴＣ－デキストランについて１×１０－６ｃｍ／ｓ前後の比較的狭い範囲内である。これは、ＴＥＥＲ値が測定方法および実験手順に大きく依存するためである可能性がある。直流（ＤＣ）は細胞を損傷する可能性があるため、交流（ＡＣ）がＴＥＥＲ測定に広く使用されている。また、４つの電極を使用する４極ＡＣ ＴＥＥＲ測定は、電極－電解質界面での分極インピーダンスによる影響を受けにくいため、２極ＡＣ測定よりも正確である。しかしながら、チップのＢＢＢの小さい表面積のため、ＢＢＢを横切る抵抗は、市販されている４電極ＡＣ ＴＥＥＲメータの測定可能な範囲を超えて、数メガオームに達すると予想された。したがって、２極ＤＣ測定を使用し、チップのＢＢＢのＴＥＥＲ値は、流れの下で３７０±２０（ｓ．ｄ．）Ω・ｃｍ２であった。測定されたＴＥＥＲ値は、いくつかのマイクロ流体ＢＢＢモデルで報告されたものよりも低かったが、条件間に意義のある差を示した。
【0106】
内皮の物理的無傷性が確認された時点で、生化学的にインタクトなバリアとしての再構築された内皮の機能的特性を調べた。インビボでの脳内皮の重要な機能の１つは、血流中の任意の炎症促進性物質から脳実質中の神経細胞を隔離することである。チップの各々のチャネルで細胞の元々の表現型を維持するために、２つの異なるタイプの媒体：「血液側」チャネルの血清含有内皮媒体および「ＣＳＦ側」チャネルの血清不含グリア細胞媒体を展開した。この設定の理由は、内皮細胞はインビトロでそれらの元々の表現型を維持するために血清を必要とするが、グリア細胞は血清含有培養培地中で炎症促進性挙動を示すからである。全血から抽出される血清は、タンパク質、ホルモン、ミネラル、成長因子、および脂質の未定義な混合物である。したがって、再構築されたＢＢＢは、「血液側」チャネルにおける血清からの任意の炎症促進性物質の侵入を防止する必要がある。ＢＢＢを含まない試料では、脳内の常在免疫細胞タイプであるミクログリアは、血清に直接曝露されたため、予想通り炎症促進性挙動を示した。対照的に、再構築されたＢＢＢを有する試料では、ミクログリアはそのような炎症促進性挙動を示さず、チップのＢＢＢが天然のＢＢＢと同様に、生化学的にインタクトなバリアとして確認された。
【0107】
幹細胞療法に対して臨床的に重要なプラットフォームであるために、チップのＢＢＢはまた、侵入細胞の形質に基づいて異なる応答を示すべきである。各々の幹細胞タイプの神経修復効果は、狭いＢＢＢを横切って浸潤し、病変部位に達するそれらの能力に依存し得るが、治療における幹細胞の候補タイプに対する天然のＢＢＢ応答についてはほとんど知られていない。したがって、ＢＢＢの細胞選択的応答性を示すための有効な尺度として、２つのヒト乳がん細胞株ＭＢ－２３１およびその脳転移性誘導体集団ＭＢ－２３１Ｂｒの十分に確立された転移の挙動を使用した。ＭＢ－２３１Ｂｒは、ＢＢＢを横切って特異的に浸潤し、動物モデルにおいてＭＢ－２３１よりもはるかに強い転移の傾向を示す。再構築されたＢＢＢは、これらの２種類の浸潤がん細胞に対する予想される細胞特異的応答を示し、インビボ様機能性を確認し、侵入細胞の形質に対するその感受性を検証した。
【0108】
虚血の確立
チップにおいて機能的ＢＢＢの形成を確認した後、虚血性条件を確立した。虚血性損傷には２つの主要なゾーンがある：コア梗塞ゾーンおよび虚血性ペナンブラ（梗塞周囲縁とも呼ばれる）。コア梗塞ゾーンは、血液供給がないことおよび神経細胞の重度の壊死を特徴とし、不可逆的に損傷していると考えられる。対照的に、不可逆的に損傷されたコアを取り囲む縁部である虚血性ペナンブラは、細胞が生存するのに十分な血液供給を有するだけであり、適切に連通して機能するのに十分ではない。この梗塞周囲縁は、脳卒中後の回復のための治療標的と考えられている。したがって、この梗塞周囲ゾーンを再現し、細胞を十分に損傷し、さらに細胞死を最小限に抑える虚血性条件を確立することを目標とした。
チップにおいて機能的ＢＢＢの形成を確認した後、虚血性条件を確立した。虚血性損傷には２つの主要なゾーンがある：コア梗塞ゾーンおよび虚血性ペナンブラ（梗塞周囲縁とも呼ばれる）。コア梗塞ゾーンは、血液供給がないことおよび神経細胞の重度の壊死を特徴とし、不可逆的に損傷していると考えられる。対照的に、不可逆的に損傷されたコアを取り囲む縁部である虚血性ペナンブラは、細胞が生存するのに十分な血液供給を有するだけであり、適切に連通して機能するのに十分ではない。この梗塞周囲縁は、脳卒中後の回復のための治療標的と考えられている。したがって、この梗塞周囲ゾーンを再現し、細胞を十分に損傷し、さらに細胞死を最小限に抑える虚血性条件を確立することを目標とした。
【0109】
最適化された虚血性条件は、流れの非存在下で２４時間、血清およびグルコースを枯渇させた２％Ｏ２である。この虚血性条件は、損傷した細胞膜を通して放出された細胞外乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の量によって測定される検出可能な細胞傷害性を誘導する一方、細胞生存率を保持した。インビボでの虚血性脳で観察されるように、通常は正常酸素条件下で細胞の細胞質に見出される低酸素誘導因子－１α（ＨＩＦ－１α）が核に移行したことも観察された。遺伝子発現の変化パターンによれば、動物虚血性脳卒中モデルでちょうど報告されているように、虚血性傷害は、アポトーシスおよび抗アポトーシスシグナル伝達カスケードの両方で遺伝子を上方制御した。酸化還元反応も上方制御され、虚血における活性酸素種の細胞内レベルの上昇に対して細胞が自身を保護したことを意味した。神経栄養因子および血管新生因子の上方制御は、虚血性損傷細胞が自身を修復およびリモデル化しようとする試みを示唆する。細胞はまた、炎症促進性サイトカインおよびインテグリンの遺伝子発現の上方制御に示されるように、虚血性脳卒中に対する典型的な神経炎症応答を示した。細胞外マトリックスタンパク質の下方制御された発現は、マトリックスメタロプロテイナーゼ活性の増強された活性および細胞とＥＣＭとの間の減少した相互作用と一緒に、虚血性傷害が組織完全性およびその後の組織リモデリングプロセスの障害を引き起こしたことを意味する。全体として、これらの遺伝子発現パターンは、多くの他のインビボ脳卒中モデルで報告されているように、虚血性条件が予想通りに炎症および組織完全性の低下を首尾よく誘発し、内因性神経保護および組織リモデリングも伴ったことを集合的に示す。
【0110】
ＮＶＵ挙動の検証
再構築されたＮＶＵの機能性を検証するために、健康および虚血性条件下の両方で、様々なレベルでの個々の細胞の挙動を調べた。遺伝子レベルで、一連の脳卒中後の病的状態に関連する遺伝子の発現変化を測定し、それらの機能的特性に基づいて分類した。遺伝子のほとんどは細胞特異的ではなく、複数の細胞プロセスに関与するので、このグループ化は、実験における細胞集団にわたる応答の全体的なパターンを概説する目的のためだけである。
再構築されたＮＶＵの機能性を検証するために、健康および虚血性条件下の両方で、様々なレベルでの個々の細胞の挙動を調べた。遺伝子レベルで、一連の脳卒中後の病的状態に関連する遺伝子の発現変化を測定し、それらの機能的特性に基づいて分類した。遺伝子のほとんどは細胞特異的ではなく、複数の細胞プロセスに関与するので、このグループ化は、実験における細胞集団にわたる応答の全体的なパターンを概説する目的のためだけである。
【0111】
ニューロンは、中枢神経系の主要な構成要素であり、神経機能において重要な役割を果たす。インビトロでの初代ヒトニューロンの短い寿命および限られた増殖能力を考慮して、ヒトｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）由来の神経前駆細胞（ＮＰＣ）を脳卒中モデルで使用し、チップの培養条件をそれらの神経分化のために最適化した。分化したＮＰＣは、細胞体および軸索の分枝および樹状突起のニューロン形態を示し、シナプスでの神経伝達物質の放出を調節するタンパク質のファミリーである微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ－２）ならびにシナプシンＩおよびＩＩ（ＳＹＮ）などの成熟ニューロンマーカーを発現した。それらはまた、星状細胞との近さを維持した。虚血性条件下では、正常酸素状態で観察される滑らかで透明な樹状突起形態と比較して、変性ニューロンの典型的な形態である樹状突起のビーズ化または断片化を示した。それらはまた、インビボ虚血性脳卒中モデルからの報告と一致して、神経変性マーカーＦｌｕｏｒｏ－Ｊａｄｅ染色によって染色された。
【0112】
虚血による遺伝子発現の変化は、内因性修復が神経突起形成およびシナプス形成に関与する遺伝子群の上方制御をもたらしたが、シナプス可塑性に関連する遺伝子の下方制御を伴ったことを示している。興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸塩の過剰刺激と同時に、抑制性神経伝達物質であるガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）（ＡＢＡＴおよびＧＡＢＲＢ１は、それぞれＧＡＢＡ異化作用のための酵素およびＧＡＢＡ受容体の１つにコードされている）の低下した活性も観察された。これらの発現パターンは、虚血性条件における神経興奮と抑制との間の乱れたバランスを意味し、虚血性脳卒中において典型的に観察される興奮毒性に潜在的につながる。
【0113】
分化したＮＰＣにおける細胞質カルシウム（Ｃａ２＋）振動パターンに虚血性条件がどのように反映されるかも調べた。細胞質Ｃａ２＋イメージングは、個々のニューロンにおける活動電位発生の間接的であるが正確な尺度を提供し、シナプス活性から細胞間コミュニケーション、付着、神経変性およびアポトーシスに及ぶ様々な神経機能を表す。細胞質Ｃａ２＋画像は、分化したＮＰＣが、細胞質Ｃａ２＋シグナルの典型的な４つのパターン：振動性（遊離Ｃａ２＋の短時間の増加の繰返し）、一過性（膜カルシウムチャネルを介したＣａ２＋流入による短時間の上昇）、持続性（外部および内部の両方の貯蔵によるＣａ２＋レベルの持続的な増加）、または顕著でないシグナルを呈したことを示す。虚血性傷害は、顕著でないＣａ２＋シグナルを示す細胞の比率を減少させた一方、一過性シグナルおよび持続性シグナルの両方を示す細胞の比率を増加させた。細胞質において蓄積したＣａ２＋レベルは、動物脳卒中モデルにおいて神経死をもたらすと考えられている。虚血による振動シグナル変化の分析は、振幅においてはわずかな変化であるが、振動の周波数においては有意な増加を明らかにし、細胞へのＣａ２＋流入の増加を示している。Ｃａ２＋の過剰流入は、神経興奮と抑制との間の乱れたバランスと一緒に、虚血性試料において興奮毒性の神経変性を示している。
【0114】
脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）は、脳血管系ＢＢＢの主要な細胞性要素である。ヒト初代ＢＭＥＣを全体を通して使用した。ＢＭＥＣは、他の組織に見られる内皮細胞と比較して、高いミトコンドリア密度、開窓の欠如、低いピノ細胞活性、ならびに高密度の付着性およびタイトジャンクションを有する。タイトジャンクションは、内皮細胞の傍細胞気密性およびＢＢＢを横切る透過性を決定する。閉鎖帯－１（ＺＯ－１）は、他の接合要素、細胞間張力、血管新生、およびＢＢＢ形成を調節する主要なジャンクションのアダプタータンパク質である。「血液側」チャネルを通る流れは、ＺＯ－１の発現を増加させ、細胞体の形状をシミュレートされた血流の方向に沿って伸長させた。流れを有する試料において上方制御されたＺＯ－１発現は、他のジャンクションタンパク質、ＶＥ－カドヘリンおよびクローディン－５の発現の上方制御をもたらした。虚血性試料のＺＯ－１発現は、流れを有する正常酸素状態の試料と比較して有意に減少したが、流れなしの正常酸素状態の試料と統計学的に同等であった。重要なことに、正常酸素条件下で細胞膜に主に局在するＺＯ－１の発現は、虚血性条件下で細胞体全体に広がる。虚血性試料のＺＯ－１のこの分散した空間分布は、蛍光プローブ（４ｋＤａ ＦＩＴＣ－デキストラン）の透過性の増加をもたらし、虚血下での傍細胞気密性の減少を表す。これらの結果は、内皮細胞間の傍細胞気密性が、それらの発現の全体的なレベルよりもむしろ、細胞膜のタイトジャンクション局在化の程度によってより有意に影響されることを示唆する。虚血性試料のＢＭＥＣは、血管新生因子の１つである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を有意に増加させ、動物脳卒中モデルで観察されるように、脳卒中後の血管再編成が起こったことを示唆した。遺伝子レベルでは、虚血性傷害は内皮傍細胞の接続性を減少させたが、動物脳卒中モデルで観察されるように、免疫細胞を動員するための血管収縮および付着分子に関与する遺伝子を上方制御した。
【0115】
ＢＭＥＣ挙動は、様々な実験条件において十分に文書化されている。ヒトＢＭＥＣの単培養では、流れによって誘導されるせん断応力は、タイトジャンクションタンパク質の発現またはそれらの形態に有意に影響しなかった。一方、ウシＢＭＥＣの単培養における流れの条件は、タイトジャンクションタンパク質の上方制御および流れ方向に沿った形態学的アラインメントをもたらした。別のインビトロ研究では、ラットＢＭＥＣは、星状細胞および周皮細胞の両方との適切な相互作用を必要とし、このモデルで観察されたように、それらの元々のパターンのタイトジャンクション局在化を細胞膜の周りに示した。総合すると、これらの結果は、ヒトＢＭＥＣがインビボ様挙動を示すためには、元々のＢＢＢ微小環境の重要な構成要素のいくつか：血流による機械的刺激およびＮＶＵのヘテロ細胞ネットワークが必要であることを示唆している。この脳卒中モデルは、これらの微小環境特徴の両方を提供し、ヒトＢＭＥＣのインビボ様挙動を可能にする。
【0116】
周皮細胞は、微小血管系の壁細胞であり、ＢＢＢ透過性、血管新生、クリアランス、脳血流、神経炎症および幹細胞活性を調節する。ヒト初代脳血管周皮細胞を使用した。チップの周皮細胞は、周皮細胞特異的マーカーの１つである、血小板由来の成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲβ）を発現し、成熟内皮と「脳」チャネルの側壁との間に位置した。周皮細胞は虚血性損傷に応答して活性化され、血管炎症に寄与した。周皮細胞と内皮細胞との相互作用は、正常な条件下での血管安定性にとって極めて重要であり、下方制御された。
【0117】
星状細胞は、脳における主要なグリア細胞タイプであり、ＮＶＵにおけるヘテロ細胞相互作用において多くの媒介的役割を果たす。ヒト初代星状細胞を全体を通して使用した。それらの役割の１つは、神経の代謝活性を感知し、それに応じて血流を一致させるように血管拡張および血管収縮を調整することである。星状細胞は、内皮細胞との直接的な接触に基づく相互作用を介してこれらの中間的な役割を果たす。酸素および栄養素は、「血液側」および「ＣＳＦ側」チャネルのみを介して供給され、その結果、「脳」チャネルの星状細胞は、栄養素にアクセスするために境界で形成された内皮レイヤに向かって遊走し、その終足を伸長させなければならず、そうして、それとの物理的接触を形成する。この物理的接触は、脳内の最も豊富な水チャネルであるアクアポリン－４（ＡＱＰ４）によってコードされる水チャネルタンパク質の免疫蛍光染色によって間接的に確認された。星状細胞における水チャネルは、正常な条件下で血管と直接接触している星状細胞の終足の周りに局在している。この分極した位置は、Ｏ２、ＣＯ２、およびＮＯを含むガス交換におけるそれらの媒介的役割を反映している。虚血などの炎症状態では、星状細胞におけるＡＱＰ４の免疫反応性が終足から傷み、ＡＱＰ４の媒介的役割の乱れを意味する。さらに、虚血性試料の星状細胞は、異常な肥大、大量の増殖、および上方制御されたグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）発現レベルを特徴とする反応性アストログリオーシスを示した。星状細胞は、従来の２Ｄ培養条件においてこれらの挙動を示すことができなかった。遺伝子発現パターンは、インビボ脳卒中モデルにおいて報告されるように、Ａ１（炎症誘発性）およびＡ２（虚血誘発性）表現型の両方と混合された星状細胞の異種集団を明らかにする。活性化した星状細胞は、次に、他の脳卒中モデルからの報告と一致して、虚血性脳卒中モデルにおけるニューロンに対するそれらの栄養サポートを減少させた。
【0118】
ミクログリアは常在マクロファージであり、脳内の唯一の免疫細胞タイプである。ヒト初代ミクログリアでの信頼できるバッチ間再現性の問題のために、形質転換されたヒトミクログリア細胞株（ＨＭＣ３、ＡＴＣＣ）を使用した。脳のミクログリアは、任意の損傷または感染に対して即時の炎症促進性応答を示す。活性化されると、それらの炎症促進性形態変化は、プロセスの収縮および肥厚、ならびに細胞体の肥大によって表れ、これは虚血性試料において首尾よく再現された。それらはまた、炎症発症の数時間以内に、炎症促進性（Ｍ１）表現型マーカーの１つであるインターロイキン－１β（ＩＬ－１β）を速やかに分泌する。しかし、このＩＬ－１βの上方制御は一時的であり、持続的ではない。一方、分化クラスター６８（ＣＤ６８）およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ－１）の発現は、Ｍ１期中に上方制御され、その後の抗炎症（Ｍ２）期全体にわたって持続する。これらのＩＬ－１βおよびＣＤ６８免疫反応性のインビボ様時間的パターンは、脳卒中モデルにおいて観察された。対照的に、従来の２Ｄ培養条件は、ミクログリアにおいてこれらの挙動変化を誘導することができなかった。遺伝子発現パターンは、インビボ研究で観察されるように、虚血発症が、炎症促進性（Ｍ１表現型）および抗炎症性（Ｍ２ａおよびＭ２ｂ表現型）ミクログリアマーカーの両方の上方制御をもたらしたことを示した。Ｍ２ａおよびＭ２ｂの両方は食作用に関与し、抗炎症性サイトカインを産生するが、それらの活性化シグナル経路は互いに異なる。対照的に、通常は不活性化段階のマーカーとみなされるＭ２ｃ表現型は、脳卒中モデルにおいて虚血発症後の２４時間の時間枠ではほとんど現れず、Ｍ２ｃマクロファージが炎症の下方制御後にのみ現れたという報告と一致した。他の多くの免疫受容体および化学誘引物質も、上方制御された発現レベルを示した。以前に報告されたように、自然免疫応答および適応免疫応答の両方に関与する遺伝子は、概して虚血性条件で上方制御された。免疫細胞の調節および神経発生の両方に関与するプリン受容体の遺伝子発現はむしろ一貫していないように見えたが、虚血直後に全体的な免疫応答が十分に調節されていないことも明らかであった。これらの遺伝子発現の変化は、他の虚血性脳卒中モデルで観察されるように、虚血性損傷の悪化から修復を助けるまで、虚血性傷害が広範囲の免疫応答を誘因したことを示す。
【0119】
幹細胞の神経修復能の特性評価
かなりの数の研究は脳卒中の処置について幹細胞の神経修復能を支持しているが、これらの観察のいくつかと相反する報告もいくつかある。これは、部分的に、実験がすべて異なる条件下で行われたため、および／または複雑な回復プロセスの異なる態様に焦点を合わせたためである可能性がある。インビトロ系であるため、本脳卒中モデルは、多数の試料および反復にわたって同一の実験条件を可能にする。したがって、それは、臨床的に関連する幹細胞の神経修復能力を体系的に調べるための有効なプラットフォームとして役立つ。この脳卒中モデルにおいて検討される幹細胞には、ヒト人工多能性幹細胞由来の神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）、ヒト胚性幹細胞由来の神経幹細胞（ｈＮＳＣ）、ヒト造血幹細胞（ｈＨＳＣ）、骨髄由来の間葉系間質／幹細胞（ｈＢＭＳＣ）、脂肪由来の間葉系間質／幹細胞（ｈＡＭＳＣ）、および内皮細胞前駆細胞（ｈＥＰＣ）が含まれる。幹細胞を用いない再灌流処置のみの効果を、虚血性傷害後に酸素およびグルコースを再導入することによって調べた。
かなりの数の研究は脳卒中の処置について幹細胞の神経修復能を支持しているが、これらの観察のいくつかと相反する報告もいくつかある。これは、部分的に、実験がすべて異なる条件下で行われたため、および／または複雑な回復プロセスの異なる態様に焦点を合わせたためである可能性がある。インビトロ系であるため、本脳卒中モデルは、多数の試料および反復にわたって同一の実験条件を可能にする。したがって、それは、臨床的に関連する幹細胞の神経修復能力を体系的に調べるための有効なプラットフォームとして役立つ。この脳卒中モデルにおいて検討される幹細胞には、ヒト人工多能性幹細胞由来の神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）、ヒト胚性幹細胞由来の神経幹細胞（ｈＮＳＣ）、ヒト造血幹細胞（ｈＨＳＣ）、骨髄由来の間葉系間質／幹細胞（ｈＢＭＳＣ）、脂肪由来の間葉系間質／幹細胞（ｈＡＭＳＣ）、および内皮細胞前駆細胞（ｈＥＰＣ）が含まれる。幹細胞を用いない再灌流処置のみの効果を、虚血性傷害後に酸素およびグルコースを再導入することによって調べた。
【0120】
虚血性脳卒中後の神経修復は、神経細胞再生および免疫抑制から、血管構造の修復まで、およびＮＶＵにおけるヘテロ細胞相互作用の回復までの広範な一連のプロセスを伴う。これらの態様の各々に関与する１２３個の関連遺伝子を、ヒト神経発生ＰＣＲアレイ（Ｑｉａｇｅｎ）およびチップにおける虚血性応答に関する実験データに基づいて選択した。選択されたセットの全体的な遺伝子発現は、概してすべてのタイプの幹細胞の組込みおよび再灌流のみによって上方制御された。発現が４倍を超える変化を有する遺伝子を考慮すると、ｈＮＰＣおよびｈＮＳＣは、大部分が強く上方制御された遺伝子と関連していたが、ｈＢＭＳＣについては反対であった。ｈＥＰＣは、ほぼ同数の強く上方制御された遺伝子および下方制御された遺伝子が見つかった。
【0121】
幹細胞の取込みおよび再灌流は、概して神経系における細胞の生成（神経発生）に正の影響を及ぼしたが、この影響の程度は幹細胞のタイプによって異なった。さらに、すべての群はニューロン遊走、ニューロン分化、ニューロン運命拘束、軸索形成、およびグリア新生に関与する遺伝子の発現を増強したが、ｈＢＭＳＣもニューロン分化およびニューロン運命拘束に対して阻害的影響を示した。注目すべきことに、再灌流は、弱い程度であるにしても、ニューロン遊走に関与するすべての遺伝子の発現を上方制御した。シナプス応答に関しては、ｈＥＰＣおよび再灌流が同等に強い増強効果および阻害効果を示したという事実を除いて、シナプス組織化およびシナプス可塑性の調節において同様のパターンが明らかにされ、すべての実験群からの優位に正の影響が認められる。
【0122】
脳卒中後の回復プロセスでは、虚血によって開始される炎症を抑制することも重要である。ｈＮＰＣおよびｈＮＳＣは炎症関連遺伝子を最も強く上方制御した。ｈＡＭＳＣもわずかに上方制御したが、ｈＡＭＳＣ、ｈＢＭＳＣ、ｈＨＳＣおよび灌流は、炎症応答群の遺伝子をわずかに抑制した。より特異的な炎症応答を調べるために、グリア表現型マーカーの発現を測定し、それらの炎症挙動に対する移転された幹細胞の影響を調べた。
【0123】
ＢＭＥＣに対する効果に関しては、ｈＮＰＣ、ｈＮＳＣおよびｈＥＰＣはタイトジャンクションタンパク質１（ＴＪＰ１）の発現を上方制御したが、クローディン５（ＣＬＤＮ５）の発現は、ＴＪＰ１とＣＬＤＮ５が密接に相互作用してＢＢＢを形成するという事実にもかかわらず、すべての群で下方制御された。脳損傷後の免疫細胞の動員に関与する内皮付着分子の１つであるＰＥＣＡＭ１の発現は、すべて効果的に下方制御された。周皮細胞に対する効果に関しては、ｈＡＭＳＣのみが反応性周皮細胞マーカーであるＣＳＰＧ４の発現を抑制した。血管新生の媒介における周皮細胞の役割に関与するＣＤ２４８の発現は、ｈＮＳＣおよびｈＡＭＳＣのみによって上方制御され、概して残りによって抑制された。ミクログリア活性への影響に関しては、通常、炎症期全体を通して上方制御される、ミクログリア反応性マーカーであるＣＤ６８の発現を、すべての群が抑制できなかった。対照的に、炎症促進性Ｍ１表現型マーカーであるＣＤ８６は、ｈＡＭＳＣおよびｈＨＳＣを除いて、すべての群によって首尾よく抑制された。ｈＨＳＣは、抗炎症性Ｍ２ａ表現型マーカーであるＣＤ２０６の発現を増強したが、ｈＥＰＣおよびｈＢＭＳＣは、抗炎症性Ｍ２ｂ表現型マーカーであるＣＤ３２ａの発現を促進した。ｈＢＭＳＣ、ｈＡＭＳＣおよび再灌流は、ミクログリア不活性化表現型マーカーであるＣＤ１６３の発現を上方制御した。星状細胞に対する効果に関しては、汎反応性星状細胞マーカーであるＶＩＭの発現を抑制する群はなかった。ｈＮＰＣは、Ａ１（炎症）反応性星状細胞マーカーであるＣ３の発現を首尾よく抑制した唯一のものであった。すべての群において、Ａ２（虚血）反応性星状細胞マーカーであるＣＤ１０９の発現は下方制御された。総合すると、これらの星状細胞反応性マーカーの発現パターンは、虚血性傷害の７日後には虚血自体からの影響はほとんどなく、しかも星状細胞は依然としてそれらの炎症挙動を保持していたことを示唆している。星状細胞の神経栄養サポートに関与するＩＦＩＴＭ３の発現はすべての群において上方制御された一方、類似の機能を有する別の遺伝子であるＦＡＢＰ７の発現は、ｈＮＰＣ、ｈＥＰＣ、およびｈＢＭＳＣによってのみ上方制御された。全体的な遺伝子発現パターンの複雑さは、６タイプすべての幹細胞および再灌流が、虚血によって誘発される神経炎症を抑制するために独自の経路を有することを示唆している。
【0124】
遺伝子発現パターンを階層的にクラスター化した場合、ｈＮＰＣおよびｈＮＳＣは、神経細胞に対するより制限された運命的拘束を伴って、残りとは別個の群として際立った。２つの群（神経差次的容量（ＮＤＣ）を有する群対ＮＤＣを有しない群）間の差次的発現解析により、２７個の遺伝子を同定した。同定された遺伝子のＧＯエンリッチメント解析をＳＴＲＩＮＧデータベースに基づいて行い、ＮＤＣを有する幹細胞が神経発生および他の密接に関連するＧＯタームにおいて有益であることを見出した。ＮＤＣを有する幹細胞はまた、虚血性および出血性脳血管疾患の重要な調節因子であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のシグナルカスケードの調節に正の効果を有した。
【0125】
幹細胞の各々のタイプの神経修復特性をよりよく区別するために、ＧＯエンリッチメント解析を、幹細胞取込み後に４倍を超える発現変化を有する遺伝子に焦点を当てて行い、各々の幹細胞タイプの主要な治療用経路を同定した。ｈＮＰＣは、神経発生、特にニューロンの生成に関して最大の可能性を示したが、それは他の修復機能に対しても刺激効果を有した。ｈＮＳＣの影響は、組織構造の形成および成熟化ならびに多細胞生物の発生などの多様な態様にわたってより均一に広がる。ｈＮＳＣはまた、ＮＶＵ機能を修復するための基本的な環境である血管を発生させること、および虚血的に損傷した構造を再編成するための重要な特徴である細胞の移動を促進することにおいて強い能力を示した。ｈＮＳＣの他の相対的な利点には、環境変化に対する増強された適応、および免疫のより良好な調節が含まれた。注目すべきことに、ｈＮＳＣは急性炎症応答を強く抑制した。ｈＮＳＣはまた、京都遺伝子ゲノム百科事典（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）（ＫＥＧＧ）データベースに基づいて、がんにおける経路と最も関連が少なかった。ＧＯタームの全範囲にわたって、ｈＥＰＣは同時の促進および阻害の傾向を示した一方、ｈＢＭＳＣはそれらのほとんどを一貫して阻害した。
【0126】
上位３つの影響力のある幹細胞タイプ（ｈＮＰＣ、ｈＮＳＣ、およびｈＥＰＣ）と比較して、残りの実験群（ｈＢＭＳＣ、ｈＡＭＳＣ、ｈＨＳＣ、および再灌流療法）は、遺伝子発現の比較的小さな変化を誘導した。これらの群に対して、２倍を超える発現変化を有する遺伝子のＧＯエンリッチメント解析も行った。３つの最も影響力のある幹細胞タイプについての以前の解析から明らかになった明確な特性とは異なり、これらの群は、関連する機能について一緒にグループ化されたＧＯタームに対して比較的一貫性のない影響を示した。いくつかの一貫した傾向は、ｈＨＳＣによる神経発生の促進およびｈＡＭＳＣおよび再灌流による血管系発生阻害であった。
【0127】
シナプス活性を、脳卒中後の回復の程度を推定するための重要かつ信頼できるパラメータとしてさらに調べた。少なくとも４倍または２倍の発現変化を有する遺伝子のＧＯエンリッチメント解析に基づいて、シナプスおよび神経伝達物質に関連するＧＯタームの有意性を比較し、各々の幹細胞タイプがどの程度シナプス活性を促進したかを調べた。この解析はまた、シナプスレベルでの神経修復の多くの態様におけるｈＮＳＣの強い正の効果の性質：シナプス編成およびシナプス伝達、ならびにグルタミン酸、アセチルコリン、およびＧＡＢＡなどの関連する神経伝達物質の伝達経路の調節を明らかにした。シナプスの分子的および機能的複雑性ならびに神経機能におけるそれらの協調の重要性を考慮すると、ｈＮＳＣは、評価されたすべての幹細胞の中で非常に有望な治療剤として際立っている。
【0128】
移植された幹細胞の追跡
脳卒中に対する移植された幹細胞の神経修復効果の根底にある正確な機構は依然として不明である一方、幹細胞療法の治療効果は、栄養因子および免疫調節性サイトカインの放出、内因性幹細胞遊走の促進、ならびに内因性神経可塑性および機能回復の増強などの間接的な機構によって媒介されるという証拠が蓄積している。しかしながら、まれではあるが、移植された幹細胞が宿主細胞を直接置換し、損傷した神経回路を再構成するという報告もある。幹細胞を梗塞した脳実質に引き付ける主な要因は、このＮＶＵモデルでも観察されるサイトカイン、ＣＡＭ、およびＭＭＰの上方制御などのＮＶＵの炎症応答であると思われる。
脳卒中に対する移植された幹細胞の神経修復効果の根底にある正確な機構は依然として不明である一方、幹細胞療法の治療効果は、栄養因子および免疫調節性サイトカインの放出、内因性幹細胞遊走の促進、ならびに内因性神経可塑性および機能回復の増強などの間接的な機構によって媒介されるという証拠が蓄積している。しかしながら、まれではあるが、移植された幹細胞が宿主細胞を直接置換し、損傷した神経回路を再構成するという報告もある。幹細胞を梗塞した脳実質に引き付ける主な要因は、このＮＶＵモデルでも観察されるサイトカイン、ＣＡＭ、およびＭＭＰの上方制御などのＮＶＵの炎症応答であると思われる。
【0129】
この脳卒中モデルを用いると、移植された幹細胞を追跡し、直接的な細胞置換の程度を評価することが可能であった。細胞置換の主要な指標の各々を調べた：ＢＢＢへの付着の程度、生存細胞の数、「脳」チャネルへの浸潤の程度およびＮＶＵにおける様々な神経細胞タイプへの分化。まず、レンチウイルス因子を使用して、ＧＦＰを発現する幹細胞を調製した。ＢＢＢに最初に付着した幹細胞の数は、ほとんどの場合、チップ内の総細胞数の５％未満であった。幹細胞注入の７日後、ＢＢＢに結合したものの細胞生存率は、概して減少した（ｈＮＰＣ、ｈＮＳＣ、およびｈＨＳＣ）か、またはわずかに増加した（ｈＢＭＳＣおよびｈＡＭＳＣ）。ｈＥＰＣは、対照的に、激しく増殖し、「脳」チャネルに浸潤した。移植の７日後の同じ時点において、これらの移植された幹細胞のすべては、それらが２Ｄ培養物において元々発現したそれらの幹細胞マーカーをほとんど発現しなかった。これは、非常に限られた数の細胞のみがそれらの予測される系統のマーカーを発現するのに十分に成熟していたため、それらがその時点までに分化を首尾よく完了したことを意味しない。ｈＮＰＣおよびｈＮＳＣのみが検出可能な神経分化を示し、それらでさえもチップ中の総細胞数の０．０１％未満であった。極めて限られた幹細胞の分化は、直接的な細胞置換が幹細胞療法の神経修復効果の根底にある主要な機構ではないことを示唆しており、それに対する最近の増加する証拠に加えられる。
【0130】
考察
データは、構成細胞のインビボ様挙動に必要なＮＶＵ微小環境の３つの重要な態様：インタクトなＢＢＢの形成、ヘテロ細胞ネットワーク、および血流による適切な機械的刺激を明らかにした。脳様微小環境は、このモデルの細胞がそれらの生来の挙動を保持し、虚血性傷害に対する臨床的に重要な応答を示すことを確実にする。このモデルは、前臨床試験で使用される幹細胞の神経修復能を調べるための効率的なスクリーニングプラットフォームとして役立った。各々のタイプの幹細胞が複雑な疾患進行および回復プロセスの間に遺伝子活性にどのように影響したかを体系的に分析した。また、この脳卒中モデルを虚血的に損傷したＮＶＵに移植された幹細胞の挙動を追跡するためにも使用した。
データは、構成細胞のインビボ様挙動に必要なＮＶＵ微小環境の３つの重要な態様：インタクトなＢＢＢの形成、ヘテロ細胞ネットワーク、および血流による適切な機械的刺激を明らかにした。脳様微小環境は、このモデルの細胞がそれらの生来の挙動を保持し、虚血性傷害に対する臨床的に重要な応答を示すことを確実にする。このモデルは、前臨床試験で使用される幹細胞の神経修復能を調べるための効率的なスクリーニングプラットフォームとして役立った。各々のタイプの幹細胞が複雑な疾患進行および回復プロセスの間に遺伝子活性にどのように影響したかを体系的に分析した。また、この脳卒中モデルを虚血的に損傷したＮＶＵに移植された幹細胞の挙動を追跡するためにも使用した。
【0131】
このマイクロ流体チップの設計は、機能的ＢＢＢを確立する必要性によく適しており、同時に、ＢＢＢを横切って移動する移植された幹細胞のリアルタイムモニタリングを可能にした。同様のチップ設計が、機能的ＢＢＢを構築するために提案されている：マイクロポール（ＡＩＭ Ｂｉｏｔｅｃｈ）または流れガイド構造（ＰｈａｓｅＧｕｉｄｅ（商標）技術、Ｍｉｍｅｔａｓ）を使用して細胞を隣同士に配置すること。そのようなチップの設計は、３Ｄ環境においてＢＢＢを通過する薬物または細胞の挙動を観察するのに有用である。
【0132】
この設計を、フェーズガイドまたは多孔質膜を使用するものなどの先行技術の設計と識別するものは、２つの隣り合うチャネル間に物理的構造が存在しないことであり、これにより、物理的構造に起因するいかなる潜在的な干渉もない細胞相互作用が可能になる。
【0133】
脳卒中モデルは、脳卒中の処置のための各々の候補幹細胞タイプの神経修復挙動を首尾よく明らかにした。神経細胞に分化する能力を有する幹細胞である、ｈＮＰＣおよびｈＮＳＣの利点は、脳卒中後の回復プロセスに関連する多くの態様において一貫して際立っていた。ｉＰＳＣ由来のｈＮＰＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＳＣＣ０３５）を、その子孫の８０％超が確実に神経細胞に分化するように製造業者によって試験した。この研究で使用されたｈＮＳＣは、妊娠１３．５週の胎児皮質脳組織（Ｍ０３１クローン）から最初に単離され、神経細胞に分化する子孫細胞を自己複製および産生する能力のために神経幹細胞として分類された。ＧＯ解析に基づくと、ｈＮＰＣはニューロンの生成において最も強い能力を示し、ｈＮＳＣはＮＶＵにおける全体的な構造的および機能的完全性に対して説得力のある正の効果を示した。注目すべきことに、グリア新生、血管発生、および免疫系プロセスなどのＮＶＵ機能性の回復も、両方ともｈＮＳＣによって媒介される増強されたシナプス活性と関連していた。神経ネットワークおよび神経機能の再配線におけるシナプス活性の重要性を考慮すると、この結果は、ＮＶＵ全体の機能性を修復することが、ニューロン自体を補充することよりも脳卒中の処置にとってより重要であり得ることを示唆している。これらの結果を解釈する際に、このアプローチの限界も考慮することが重要である。第１に、有効性評価は、ＧＯ機能解析によって表されるように遺伝子レベルのみに焦点を当て、脳卒中後の回復に関連する異なるレベルにわたる相互作用の全範囲を網羅しなかった。トランスクリプトミクスはまた、細胞または組織特異的な変化を示すことに限界がある全細胞集団に対して行われた。また、ＧＯ解析結果の過剰解釈のリスクは常に存在する。第２に、ＢＢＢを横切る末梢免疫細胞からの寄与は、このモデルでは対処されず、虚血後の炎症においても重要な役割を果たす可能性があった。組み込まれたニューロンは、成熟ニューロンではなく神経前駆細胞から分化したため、チップは、不均一な成熟度を有するニューロンのサブセットを含む可能性があった。第３に、チップ内の流れは、揺動シェーカーによって生じる双方向性であったので、内皮細胞は、インビボでの一方向の血流と比較して、機械的伝達の異なるシグナル経路を活性化した可能性があった。
【0134】
移植された幹の追跡の結果は、幹細胞の治療効果が、直接的な細胞置換ではなく、主に内因性回復を支援する間接的な機構を介して生じることを示唆している。遺伝子発現の変化分析の時点で、試料中に残った幹細胞の数は、ほとんどが全細胞集団の１％未満であった。そのような小さな集団の存在自体は、全細胞集団に対する遺伝子発現において、観察された程度の倍数変化を誘導するための主要な推進力とはなり得なかった。これは、残りの幹細胞の存在自体が有効性評価にわずかな影響を及ぼしたことを意味する。移植された幹細胞が虚血性領域にほとんど達しなかったが、依然として有意な治療効果を誘導したという同様の観察が、動物モデルおよびクリニックの両方において報告された。これらの観察および示唆に基づくと、細胞療法のための候補幹細胞の前臨床評価は、インビボで移植された幹細胞自体の運命を追跡するよりも、構造的および機能的の両方で、損傷したＮＶＵを修復するそれらの能力に焦点を当てる場合、より効果的であり、重要であろう。
【0135】
以前の研究の多くは、様々な条件における各々の幹細胞タイプの神経修復能だけでなく、幹細胞がそれらの治療効果を発揮する機構についても、相反する結果を提示している。これらの論争の考えられる理由は、有効性評価がいくつかの態様のみに集中しており、全体的な回復プロセスに対する包括的な分析を欠いているという事実であろう。別の理由は、疾患進行および処置を複雑にする、高血圧、高コレステロール、および糖尿病などの、しばしば脳卒中に伴う併存症であろう。したがって、幹細胞療法は、個々の患者の包括的な健康状態に基づく個別化されたアプローチを用いるのが最も効果的であろう。インビトロ脳卒中モデルは、本明細書に記載のものと同様に、患者由来の細胞を利用し、個々の患者に固有な病態生理学的状態をシミュレートすることによって、個別化された幹細胞療法を開発するための理想的なプラットフォームとして役立つであろう。個別化された脳卒中モデルは、次に、多くの異なる候補幹細胞をスクリーニングし、所与の患者のための最適な幹細胞レジメンを特定するための効率的な試験台として役立つであろう。最近の研究のいくつかに提示されているマルチオミクスアプローチは、脳卒中後の神経修復プロセスの理解をさらに広げることができ、インビトロ脳卒中モデルはその目的にも容易に適用可能である。
【0136】
総合すると、本アプローチは、インビトロでの正常および虚血性条件においてＮＶＵの挙動を首尾よく再現し、幹細胞療法の効率的かつ体系的な評価を可能にし、動物モデルおよび現在利用可能なインビトロモデルの両方の限界を克服した。これらの知見、特に様々な幹細胞の神経修復能の特性評価は、研究およびクリニックにおける進歩した幹細胞療法の方向性を導くことができる。提示された実験プラットフォームはまた、血管系に関連する広範囲の他の疾患に直ちに適用可能であり、精密医療の分野における新たな可能性を開く。
【0137】
方法
細胞培養
ＮＶＵ構成細胞
ヒト初代星状細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１８００）を、星状細胞培地（ＡＭ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１８０１）中、２％ポリ－Ｌ－リジン溶液（Ｓｉｇｍａ）を含むＴ７５プレコートフラスコで培養した。形質転換されたヒトミクログリア細胞株（ＨＭＣ３、ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ－３３０４）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ）で維持した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＳＣＣ０３５）を、ＮＥＭ中、１％マトリゲル（ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘ Ｈｉｈｇ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を含むＴ７５プレコートフラスコで維持した。ヒト初代脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１０００）を、内皮細胞培地（ＥＣＭ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１００１）中、２％コラーゲン溶液（Ｓｉｇｍａ）を含むＴ７５プレコートフラスコで培養した。ヒト脳血管周皮細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１２００）を、周皮細胞培地（ＰＭ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１２０１）中、２％ポリ－Ｌ－リジン溶液（Ｓｉｇｍａ）を含むＴ７５プレコートフラスコで増殖させた。マトリゲルでコーティングされたＴ７５フラスコおよびポリ－Ｌ－リジン溶液でコーティングされたものを、３７℃でそれぞれ１時間および一晩のインキュベーションによって調製した。コラーゲンでコーティングされたＴ７５フラスコを、４℃で一晩のインキュベーションによって調製した。
細胞培養
ＮＶＵ構成細胞
ヒト初代星状細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１８００）を、星状細胞培地（ＡＭ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１８０１）中、２％ポリ－Ｌ－リジン溶液（Ｓｉｇｍａ）を含むＴ７５プレコートフラスコで培養した。形質転換されたヒトミクログリア細胞株（ＨＭＣ３、ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ－３３０４）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ）で維持した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＳＣＣ０３５）を、ＮＥＭ中、１％マトリゲル（ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘ Ｈｉｈｇ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を含むＴ７５プレコートフラスコで維持した。ヒト初代脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１０００）を、内皮細胞培地（ＥＣＭ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１００１）中、２％コラーゲン溶液（Ｓｉｇｍａ）を含むＴ７５プレコートフラスコで培養した。ヒト脳血管周皮細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１２００）を、周皮細胞培地（ＰＭ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１２０１）中、２％ポリ－Ｌ－リジン溶液（Ｓｉｇｍａ）を含むＴ７５プレコートフラスコで増殖させた。マトリゲルでコーティングされたＴ７５フラスコおよびポリ－Ｌ－リジン溶液でコーティングされたものを、３７℃でそれぞれ１時間および一晩のインキュベーションによって調製した。コラーゲンでコーティングされたＴ７５フラスコを、４℃で一晩のインキュベーションによって調製した。
【0138】
幹細胞
ヒト内皮前駆細胞（ｈＥＰＣ）をＣｅｌｐｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｐｅｄｒｏ、カタログ番号：３７０８９－０１）から購入し、完全ｈＥＰＣ増殖培地（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｍ３６０５３－０５ＥＳ）中、ｈＥＰＣ増殖用細胞外マトリックスで予めコーティングされたＴ７５フラスコ（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｅ３６０５３－０５－Ｔ７５）で増殖させた。ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：Ａ１５６５２）およびヒト脂肪由来の間葉系幹細胞（ｈＡＭＳＣ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：ＰＣＳ－５００－０１１）を、間葉系幹細胞培地（ＭＳＣＭ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：７５０１）で維持した。妊娠１３．５週の胎児皮質脳組織から最初に単離され（Ｍ０３１クローン）、胚性幹細胞株Ｈ９に由来するヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ、ＮＲ１）を、ｈｉＰＳＣ由来のＮＳＣと同じ条件で培養した。ヒト造血幹細胞（ｈＨＳＣ）をＡＴＣＣ（カタログ番号：ＰＣＳ－８００－０１２）から購入し、継代培養せずに実験に直接使用した。培地を２～３日ごとに交換した。細胞を、コンフルエンシーがおよそ８０％に達したときに継代した。０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用して、形質転換されたミクログリア、ｈＢＭＳＣ、およびｈＡＭＳＣを継代した。０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用して、星状細胞、ＢＭＥＣ、周皮細胞、ｈＥＰＣ、およびｈＮＳＣを剥がした。ｈＮＰＣは、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）細胞解離試薬（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：Ａ１１１０５０１）を使用して継代した。
ヒト内皮前駆細胞（ｈＥＰＣ）をＣｅｌｐｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｐｅｄｒｏ、カタログ番号：３７０８９－０１）から購入し、完全ｈＥＰＣ増殖培地（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｍ３６０５３－０５ＥＳ）中、ｈＥＰＣ増殖用細胞外マトリックスで予めコーティングされたＴ７５フラスコ（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｅ３６０５３－０５－Ｔ７５）で増殖させた。ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：Ａ１５６５２）およびヒト脂肪由来の間葉系幹細胞（ｈＡＭＳＣ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：ＰＣＳ－５００－０１１）を、間葉系幹細胞培地（ＭＳＣＭ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：７５０１）で維持した。妊娠１３．５週の胎児皮質脳組織から最初に単離され（Ｍ０３１クローン）、胚性幹細胞株Ｈ９に由来するヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ、ＮＲ１）を、ｈｉＰＳＣ由来のＮＳＣと同じ条件で培養した。ヒト造血幹細胞（ｈＨＳＣ）をＡＴＣＣ（カタログ番号：ＰＣＳ－８００－０１２）から購入し、継代培養せずに実験に直接使用した。培地を２～３日ごとに交換した。細胞を、コンフルエンシーがおよそ８０％に達したときに継代した。０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用して、形質転換されたミクログリア、ｈＢＭＳＣ、およびｈＡＭＳＣを継代した。０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用して、星状細胞、ＢＭＥＣ、周皮細胞、ｈＥＰＣ、およびｈＮＳＣを剥がした。ｈＮＰＣは、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）細胞解離試薬（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：Ａ１１１０５０１）を使用して継代した。
【0139】
マイクロ流体チップの設計および製造
マイクロ流体チップのマスターモールドを、ステレオリソグラフィ３Ｄプリンタを使用して製造した。印刷されたモールドを９９％イソプロピルアルコールで広範囲に洗浄して未反応モノマーおよび硬化剤を除去し、ＵＶ光チャンバ（波長：３６５ｎｍおよび４０５ｎｍ、出力：４８Ｗ）内で５０℃のホットプレート上で一晩インキュベートした。この洗浄プロセスを少なくとも３日間繰り返した後、チップ製造に使用した。次いで、モールドの表面をシリコーン離型剤（ＣＲＣ、カタログ番号：０３３００）でスプレーコーティングし、その上にＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ１８２、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を注いだ。６５℃でおよそ５時間熱硬化させた後、固化したＰＤＭＳレプリカをモールドから剥がした。生検パンチを使用してＰＤＭＳレプリカの各々のチャネルの両端に穴（直径１．５ｍｍ）を開けた。次いで、プラズマ処理（Ｈａｒｒｉｃｋ Ｐｌａｓｍａ、カタログ番号：ＰＤＣ－３２Ｇ）によって、ＰＤＭＳレプリカを前洗浄した顕微鏡ガラススライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に結合させた。細胞播種前に、滅菌のためにマイクロ流体チップを一晩ＵＶした。
マイクロ流体チップのマスターモールドを、ステレオリソグラフィ３Ｄプリンタを使用して製造した。印刷されたモールドを９９％イソプロピルアルコールで広範囲に洗浄して未反応モノマーおよび硬化剤を除去し、ＵＶ光チャンバ（波長：３６５ｎｍおよび４０５ｎｍ、出力：４８Ｗ）内で５０℃のホットプレート上で一晩インキュベートした。この洗浄プロセスを少なくとも３日間繰り返した後、チップ製造に使用した。次いで、モールドの表面をシリコーン離型剤（ＣＲＣ、カタログ番号：０３３００）でスプレーコーティングし、その上にＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ１８２、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を注いだ。６５℃でおよそ５時間熱硬化させた後、固化したＰＤＭＳレプリカをモールドから剥がした。生検パンチを使用してＰＤＭＳレプリカの各々のチャネルの両端に穴（直径１．５ｍｍ）を開けた。次いで、プラズマ処理（Ｈａｒｒｉｃｋ Ｐｌａｓｍａ、カタログ番号：ＰＤＣ－３２Ｇ）によって、ＰＤＭＳレプリカを前洗浄した顕微鏡ガラススライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に結合させた。細胞播種前に、滅菌のためにマイクロ流体チップを一晩ＵＶした。
【0140】
機能的ＮＶＵチップの再構築
脳組織の再構築
マイクロ流体チップに機能的脳組織を構築するために、ヒトｉＰＳＣ由来のＮＰＣ、星状細胞、およびミクログリアを基底膜抽出物（ＢＭＥ）ヒドロゲル（Ｃｕｌｔｒｅｘ（商標）は、成長因子基底膜マトリックスＲ１型を減少させた、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、カタログ番号：３４３３－００１－Ｒ１）に包埋し、次いで、チップの「脳」チャネルに注入した。ｈＮＰＣを、２ｍＭグルタミンおよび０．０２μｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を補充した神経増殖培地（ＮＥＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＳＣＭ００４）に懸濁した。安静状態の星状細胞およびミクログリアを得るために、これらをそれぞれ血清を含まないＡＭおよび星状細胞馴化培地（ＡＣＭ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１８１１）中で、注入前の１日間維持した。各々の細胞タイプの懸濁液の密度は約８×１０６細胞／ｍＬであった。ｈＮＰＣ、星状細胞およびミクログリアを８：４：１（ｎ／ｎ／ｎ）の比で混合し、次いで、ＢＭＥタイプＲ１ヒドロゲルプレポリマー（ゲル：細胞＝４：１（ｖ／ｖ））と混合することによって、細胞混合物を調製した。ベンダーによれば、ｈｉＰＳＣ由来のＮＰＣの８０％超が成熟ニューロンにコミットし、ニューロン、星状細胞およびミクログリアについての最終的な細胞比が、ナイーブな脳と同様に、５～６：４～５：１（ｎ：ｎ：ｎ）の範囲になる。ゲル－細胞混合物を、コールドパック上に置かれたチップの「脳」チャネルに注入した。「脳」チャネルに組み込まれた神経細胞の総数は、４×１０４前後であった。注入後、チップを長方形の４ウェル細胞培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：２６７０６１）に移し、ゲル化のために細胞培養インキュベータにおいて３７℃で３０分間インキュベートした。ゲル化後、ＮＥＭ、血清不含ＡＭおよびＡＣＭの血清不含混合培地（８：４：１、ｖ／ｖ／ｖ）（ＮＥＭ／ＡＭと呼ばれる）を「血液側」および「ＣＳＦ側」チャネルの両方に注入し、次いで毎日交換した。注入後３日目から、ＮＥＭを、（ＮＥＭ／ＡＭ）と呼ばれる神経分化培地（ＮＥＭ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＳＣＭ１１１）で置換した。培養培地を、ＢＢＢ再構築までの次の２日間、１日おきに交換した。
脳組織の再構築
マイクロ流体チップに機能的脳組織を構築するために、ヒトｉＰＳＣ由来のＮＰＣ、星状細胞、およびミクログリアを基底膜抽出物（ＢＭＥ）ヒドロゲル（Ｃｕｌｔｒｅｘ（商標）は、成長因子基底膜マトリックスＲ１型を減少させた、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、カタログ番号：３４３３－００１－Ｒ１）に包埋し、次いで、チップの「脳」チャネルに注入した。ｈＮＰＣを、２ｍＭグルタミンおよび０．０２μｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を補充した神経増殖培地（ＮＥＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＳＣＭ００４）に懸濁した。安静状態の星状細胞およびミクログリアを得るために、これらをそれぞれ血清を含まないＡＭおよび星状細胞馴化培地（ＡＣＭ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号：１８１１）中で、注入前の１日間維持した。各々の細胞タイプの懸濁液の密度は約８×１０６細胞／ｍＬであった。ｈＮＰＣ、星状細胞およびミクログリアを８：４：１（ｎ／ｎ／ｎ）の比で混合し、次いで、ＢＭＥタイプＲ１ヒドロゲルプレポリマー（ゲル：細胞＝４：１（ｖ／ｖ））と混合することによって、細胞混合物を調製した。ベンダーによれば、ｈｉＰＳＣ由来のＮＰＣの８０％超が成熟ニューロンにコミットし、ニューロン、星状細胞およびミクログリアについての最終的な細胞比が、ナイーブな脳と同様に、５～６：４～５：１（ｎ：ｎ：ｎ）の範囲になる。ゲル－細胞混合物を、コールドパック上に置かれたチップの「脳」チャネルに注入した。「脳」チャネルに組み込まれた神経細胞の総数は、４×１０４前後であった。注入後、チップを長方形の４ウェル細胞培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：２６７０６１）に移し、ゲル化のために細胞培養インキュベータにおいて３７℃で３０分間インキュベートした。ゲル化後、ＮＥＭ、血清不含ＡＭおよびＡＣＭの血清不含混合培地（８：４：１、ｖ／ｖ／ｖ）（ＮＥＭ／ＡＭと呼ばれる）を「血液側」および「ＣＳＦ側」チャネルの両方に注入し、次いで毎日交換した。注入後３日目から、ＮＥＭを、（ＮＥＭ／ＡＭ）と呼ばれる神経分化培地（ＮＥＭ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＳＣＭ１１１）で置換した。培養培地を、ＢＢＢ再構築までの次の２日間、１日おきに交換した。
【0141】
ＢＢＢ再構築
ＢＭＥＣおよびヒト周皮細胞を、約１×１０６細胞／ｍＬの密度で、それぞれＥＣＭおよびＰＭに懸濁した。ＢＭＥＣおよび周皮細胞を文献に基づいて９：１（ｎ／ｎ）の比で混合し、神経細胞を「脳」チャネルで４日間共培養した後、１０μＬの細胞懸濁液をチップの「血液側」チャネルに注入した。「血液側」チャネルの総細胞数は１×１０４前後であった。チップを、ＢＭＥＣおよび周皮細胞が「脳」チャネルのヒドロゲルの側壁に付着するようにわずかに傾け、それを３時間インキュベートした。次いで、古い培地を除去し、新鮮な混合培地（ＥＣＭ：ＰＭ＝９：１（ｖ／ｖ）、最終血清含有量４．７％（ｖ／ｖ）（ＥＣＭ／ＰＭと呼ばれる）を、「血液側」チャネルに注入して、付着していない細胞および残屑を除去した。「血液側」チャネルのＥＣＭおよびＰＭの混合培地、ならびに「ＣＳＦ側」チャネルのＮＤＭ、ＡＭおよびＡＣＭの混合培地を１日おきに交換した。チップをＢＢＢ形成のためにさらに３日間培養した。周皮細胞を追跡する実験では、ＢＭＥＣおよび周皮細胞をそれぞれＤｉＤおよびＤｉＯ細胞標識溶液（Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で予備染色し、それらの核全体をＮｕｃＢｌｕｅ（商標）Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（商標）試薬（Ｔｈｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で対比染色した。
ＢＭＥＣおよびヒト周皮細胞を、約１×１０６細胞／ｍＬの密度で、それぞれＥＣＭおよびＰＭに懸濁した。ＢＭＥＣおよび周皮細胞を文献に基づいて９：１（ｎ／ｎ）の比で混合し、神経細胞を「脳」チャネルで４日間共培養した後、１０μＬの細胞懸濁液をチップの「血液側」チャネルに注入した。「血液側」チャネルの総細胞数は１×１０４前後であった。チップを、ＢＭＥＣおよび周皮細胞が「脳」チャネルのヒドロゲルの側壁に付着するようにわずかに傾け、それを３時間インキュベートした。次いで、古い培地を除去し、新鮮な混合培地（ＥＣＭ：ＰＭ＝９：１（ｖ／ｖ）、最終血清含有量４．７％（ｖ／ｖ）（ＥＣＭ／ＰＭと呼ばれる）を、「血液側」チャネルに注入して、付着していない細胞および残屑を除去した。「血液側」チャネルのＥＣＭおよびＰＭの混合培地、ならびに「ＣＳＦ側」チャネルのＮＤＭ、ＡＭおよびＡＣＭの混合培地を１日おきに交換した。チップをＢＢＢ形成のためにさらに３日間培養した。周皮細胞を追跡する実験では、ＢＭＥＣおよび周皮細胞をそれぞれＤｉＤおよびＤｉＯ細胞標識溶液（Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で予備染色し、それらの核全体をＮｕｃＢｌｕｅ（商標）Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（商標）試薬（Ｔｈｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で対比染色した。
【0142】
ＢＢＢのせん断応力
脳微小血管系のような生理学的範囲の流れのせん断応力（０．０１～１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２）を適用するために、試料を揺動シーソーシェーカー（Ｍｉｍｅｔａｓ、ＯｒｇａｎｏＦｌｏｗ（登録商標）Ｌ）上に置くことによって拍動性の双方向の流れを生じさせた。モデルの設計パラメータを、以下の式に基づいて調節した：
脳微小血管系のような生理学的範囲の流れのせん断応力（０．０１～１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２）を適用するために、試料を揺動シーソーシェーカー（Ｍｉｍｅｔａｓ、ＯｒｇａｎｏＦｌｏｗ（登録商標）Ｌ）上に置くことによって拍動性の双方向の流れを生じさせた。モデルの設計パラメータを、以下の式に基づいて調節した：
【0143】
【数4】
【0144】
ここで、τ＝せん断応力（ｄｙｎｅ／ｃｍ２）、Ｑ＝流量（ｃｃ／ｓ）、μ＝培養培地の粘度、ｂ＝チャネル幅、およびｈ＝チャネル高さである。ポアズイユの法則に基づき、
【0145】
【数5】
【0146】
【数6】
【0147】
（四角いチャネルの水力直径）、
ここで、
ここで、
【0148】
【数7】
【0149】
（入口と出口との間の圧力差）、
【0150】
【数8】
【0151】
Ｌ＝チャネル長、ρ＝液体比重である。所与の期間中の平均せん断応力は、以下のパラメータに比例する：
【0152】
【数9】
【0153】
ｈ＝２２０μｍ、ｂ＝４００μｍ、θ＝７°（ＯｒｇａｎｏＰｌａｔｅ、Ｍｉｍｅｔａｓ）、および１６分のチルト周波数を用いた実験設定の以前の研究では、最大せん断応力は、Ｐｙｔｈｏｎソフトウェアでシミュレートした数値モデルに基づいて１．７ｄｙｎｅ／ｃｍ２と推定された。本構成（ｈ＝４００μｍ、ｂ＝１ｍｍ、θ＝４°、１分のチルト周波数）は、より高い周波数で３．４ｄｙｎｅ／ｃｍ２の最大せん断応力を生じると予想された。
【0154】
インビトロ虚血性条件の誘導
虚血を誘発するために、チップを、２％Ｏ２および５％ＣＯ２を含むＥＶＯＳ ｆｌ自動イメージングシステムのインキュベーションチャンバに２４時間置いた。チップを低酸素チャンバでインキュベートする前に、培養培地を、窒素ガスで１分間フラッシュし、使用前に同じ低酸素条件（２％Ｏ２および５％ＣＯ２）で一晩保存した、血清およびグルコース不含ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１９６６０２５）で置換した。虚血期間中に流れはなかった。正常酸素条件の試料を、５％ＣＯ２および大気Ｏ２濃度（約２０％）のインキュベータで培養した。
虚血を誘発するために、チップを、２％Ｏ２および５％ＣＯ２を含むＥＶＯＳ ｆｌ自動イメージングシステムのインキュベーションチャンバに２４時間置いた。チップを低酸素チャンバでインキュベートする前に、培養培地を、窒素ガスで１分間フラッシュし、使用前に同じ低酸素条件（２％Ｏ２および５％ＣＯ２）で一晩保存した、血清およびグルコース不含ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１９６６０２５）で置換した。虚血期間中に流れはなかった。正常酸素条件の試料を、５％ＣＯ２および大気Ｏ２濃度（約２０％）のインキュベータで培養した。
【0155】
細胞生存率および細胞傷害性の測定
Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（商標）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ｌ３２２４）およびＬＤＨ－Ｃｙｔｏｘ Ａｓｓａｙ（商標）キット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：４２６４０１）をそれぞれ使用して、細胞生存率および細胞傷害性を測定した。細胞生存率は、生存細胞の数を細胞の総数で割ったものとして計算した。虚血の相対細胞傷害性を、４９０ｎｍの波長で読み取った光学密度（ＯＤ）に基づいて以下のように計算した：
Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（商標）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ｌ３２２４）およびＬＤＨ－Ｃｙｔｏｘ Ａｓｓａｙ（商標）キット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：４２６４０１）をそれぞれ使用して、細胞生存率および細胞傷害性を測定した。細胞生存率は、生存細胞の数を細胞の総数で割ったものとして計算した。虚血の相対細胞傷害性を、４９０ｎｍの波長で読み取った光学密度（ＯＤ）に基づいて以下のように計算した：
【0156】
【数10】
【0157】
再構築されたＢＢＢの機能的特性評価
物理的にインタクトなバリアとしてのＢＢＢの評価
マイクロ流体チップに形成されたＢＢＢの物理的無傷性を評価するために、ＦＩＴＣコンジュゲートデキストラン（７０ｋＤａおよび４ｋＤａ）を「血液側」チャネルに注入し、それを横切る拡散をモニタリングした。蛍光画像（４８８ｎｍでの）をプローブ注入後１時間の異なる時点で得て、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて蛍光強度を測定した。透過係数は、以下の式により算出した。
物理的にインタクトなバリアとしてのＢＢＢの評価
マイクロ流体チップに形成されたＢＢＢの物理的無傷性を評価するために、ＦＩＴＣコンジュゲートデキストラン（７０ｋＤａおよび４ｋＤａ）を「血液側」チャネルに注入し、それを横切る拡散をモニタリングした。蛍光画像（４８８ｎｍでの）をプローブ注入後１時間の異なる時点で得て、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて蛍光強度を測定した。透過係数は、以下の式により算出した。
【0158】
【数11】
【0159】
Ａ＝膜の表面積、Ｃ０＝ドナー側の初期濃度、
【0160】
【数12】
【0161】
Ｖｂｒａｉｎ＝「脳」チャネルのヒドロゲル体積、
【0162】
【数13】
【0163】
【数14】
【0164】
Ｉｏ＝初期蛍光強度
この式は、イメージング境界を横切るフラックスが無視でき、経内皮フラックスが一定であると仮定する。本明細書に記載のチップでは、これらの仮定は、１５分未満の時間間隔（Δｔ）で問題なく満たされた；すなわち、５、１０および１５分のΔｔで計算したＰａｐｐの間に有意差はなかった（ｎ＝５、ｐ値＞０．０５）。Δｔを１０分に設定した。以下の式を使用して、バリア全体の
この式は、イメージング境界を横切るフラックスが無視でき、経内皮フラックスが一定であると仮定する。本明細書に記載のチップでは、これらの仮定は、１５分未満の時間間隔（Δｔ）で問題なく満たされた；すなわち、５、１０および１５分のΔｔで計算したＰａｐｐの間に有意差はなかった（ｎ＝５、ｐ値＞０．０５）。Δｔを１０分に設定した。以下の式を使用して、バリア全体の
【0165】
【数15】
【0166】
および内皮自体の
【0167】
【数16】
【0168】
に基づいて、ＢＢＢの
【0169】
【数17】
【0170】
を計算した。
【0171】
【数18】
【0172】
生化学的にインタクトなバリアとしてのＢＢＢの評価
形成された内皮が、「脳」チャネル内の神経細胞を「血液側」チャネルの血清から隔離することができるかどうかを調べた。最初に、１０％ＦＢＳを含有する、ＥＣＭおよびＰＭ（９：１、ｖ／ｖ）の血清含有培地を「血液側」チャネルに加えた。２４時間のインキュベーション後、ミクログリアの挙動を、その反応性マーカーであるイオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ－１）およびその活性化マーカーである分化６８（ＣＤ６８）で免疫染色することによって研究した。
形成された内皮が、「脳」チャネル内の神経細胞を「血液側」チャネルの血清から隔離することができるかどうかを調べた。最初に、１０％ＦＢＳを含有する、ＥＣＭおよびＰＭ（９：１、ｖ／ｖ）の血清含有培地を「血液側」チャネルに加えた。２４時間のインキュベーション後、ミクログリアの挙動を、その反応性マーカーであるイオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ－１）およびその活性化マーカーである分化６８（ＣＤ６８）で免疫染色することによって研究した。
【0173】
侵入細胞に対する細胞選択的バリアとしてのＢＢＢの評価
再構築されたＢＢＢが様々なタイプの侵入細胞に対して異なる応答を示すことができるかどうかを調べた；２種類のヒト乳がん細胞株（ＭＢ－２３１およびその脳転移性誘導体集団ＭＢ－２３１Ｂｒ）をこの目的のために試験した。細胞をＶｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｉＯ細胞標識溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｖ２２８８６）で予備染色した。予備染色のために、細胞を細胞培養インキュベータにおいて染色培地（培養培地１ｍＬあたり５μＬの標識溶液）と共に２０分間インキュベートし、滅菌ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４）で３回洗浄した。そして、１０μＬの細胞を１×１０６細胞／ｍＬの密度で「血液側」チャネルに注入した。細胞がヒドロゲル境界上に堆積するように、チップをわずかに傾けた。ＥＶＯＳ ｆｌ自動イメージングシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、がん細胞注入の１日後または１０日後に画像を撮影した。
再構築されたＢＢＢが様々なタイプの侵入細胞に対して異なる応答を示すことができるかどうかを調べた；２種類のヒト乳がん細胞株（ＭＢ－２３１およびその脳転移性誘導体集団ＭＢ－２３１Ｂｒ）をこの目的のために試験した。細胞をＶｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｉＯ細胞標識溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｖ２２８８６）で予備染色した。予備染色のために、細胞を細胞培養インキュベータにおいて染色培地（培養培地１ｍＬあたり５μＬの標識溶液）と共に２０分間インキュベートし、滅菌ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４）で３回洗浄した。そして、１０μＬの細胞を１×１０６細胞／ｍＬの密度で「血液側」チャネルに注入した。細胞がヒドロゲル境界上に堆積するように、チップをわずかに傾けた。ＥＶＯＳ ｆｌ自動イメージングシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、がん細胞注入の１日後または１０日後に画像を撮影した。
【0174】
神経変性染色
虚血によって誘発された神経変性を、Ｆｌｕｏｒｏ－Ｊａｄｅ Ｃ（ＦＪＣ）Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、製造業者のプロトコル（Ｂｉｏｓｅｎｓｉｓ、ｂｉｏｓｅｎｓｉｓ（登録商標）Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－Ｄｉｌｕｔｅ（ＲＴＤ）ＴＭ Ｆｌｕｏｒｏ－Ｊａｄｅ（登録商標）Ｃ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ、カタログ番号：ＴＲ－１００－ＦＪ）に従って、いくつかの修正を加えて研究した。染色溶液が、ニューロンが成長しているチップの中央チャネルのヒドロゲル中に十分に拡散することを確実にするために、プロトコルの染色溶液のインキュベーション時間を３倍にした。染色後、試料をＰＢＳで少なくとも３回洗浄した。各々の洗浄について、インキュベーション時間は５～１０分であった。ＥＶＯＳ ｆｌ顕微鏡（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて画像を取得した。
虚血によって誘発された神経変性を、Ｆｌｕｏｒｏ－Ｊａｄｅ Ｃ（ＦＪＣ）Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、製造業者のプロトコル（Ｂｉｏｓｅｎｓｉｓ、ｂｉｏｓｅｎｓｉｓ（登録商標）Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－Ｄｉｌｕｔｅ（ＲＴＤ）ＴＭ Ｆｌｕｏｒｏ－Ｊａｄｅ（登録商標）Ｃ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ、カタログ番号：ＴＲ－１００－ＦＪ）に従って、いくつかの修正を加えて研究した。染色溶液が、ニューロンが成長しているチップの中央チャネルのヒドロゲル中に十分に拡散することを確実にするために、プロトコルの染色溶液のインキュベーション時間を３倍にした。染色後、試料をＰＢＳで少なくとも３回洗浄した。各々の洗浄について、インキュベーション時間は５～１０分であった。ＥＶＯＳ ｆｌ顕微鏡（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて画像を取得した。
【0175】
ＮＶＵチップの免疫細胞化学（ＩＣＣ）
ＮＶＵチップの細胞の固定のために、５０～６０μＬの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を液滴として各々のチャネルの入口に加え、少なくとも３０分間チャネル内に保持した。固定されたヒドロゲルマトリックスを、３０～４０μＬのＰＢＳ液滴を各々のチャネルの入口に加えることによって穏やかに洗浄した。この洗浄を少なくとも５回繰り返した。次いで、ＮＶＵチップの細胞を、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１０～１５分間透過処理した。透過処理した細胞をＰＢＳで５回洗浄し、次いでＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中、５％正常ロバ血清で４０分～１時間ブロッキングした。ブロックキングした細胞を、１次抗体（チャネルあたり３０～４０μＬ）と共に４℃で少なくとも一晩インキュベートした。１次抗体の希釈率は以下の通りであった：ヒツジポリクローナル抗ヒトＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＡＦ８０６、１：２０）、ウサギポリクローナル抗ヒトＧＦＡＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｇ９２６９、１：１００）、ニワトリポリクローナル抗ヒトＧＦＡＰ（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：１７３００６、１：５００）、ウサギポリクローナル抗ヒトＡＱＰ４（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号：ＮＢＰ１－８７６７９、１：２０００）、マウスモノクローナル抗ヒトＺＯ－１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：３３９１００、１：１００）、ウサギポリクローナル抗ヒトフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｆ３５２０、１：２００）、マウスモノクローナル抗ヒトｖＷＦ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：ＡＭＡＢ９０９３１、１：５００）、マウスモノクローナル抗ヒトポドプラニン（ＰＤＰＮ）（Ｅ－１）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号：ＳＣ３７６６９５、１：１００）、ウサギポリクローナル抗ヒトシナプシン１／２（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号：１０６００３、１：１，０００）、ニワトリポリクローナル抗ヒトＭＡＰ２（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ａｂ５３９２、１：１０，０００）、ヤギポリクローナル抗ヒトＩＢＡ－１（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ａｂ５０７６、１：２００）、ウサギポリクローナル抗ヒトＩＬ－１β（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ａｂ９７２２、１：１００）、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ６８（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号：ＭＡＣ５７０９、１：１００）、ウサギモノクローナル抗ヒトＣＤ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１９Ｈ８Ｌ４、１：５００）、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ３４（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号：ＢＩ－３Ｃ５、１：２５０）、マウスモノクローナル抗ヒトネスチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号：ＭＡ１－５８４０、１：２５０）、ウサギモノクローナル抗ヒトＰＤＧＦＲβ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号：３１６９、１：１００）、およびマウスモノクローナル抗ヒトＨＩＦ－１α（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ａｂ６０６６、１：２００）。１次抗体インキュベーション中の乾燥を防ぐために、チップを含むプレートを蒸留水で加湿した。インキュベートした試料をブロッキング溶液で５回洗浄し、次いで、ＤｙＬｉｇｈｔ４０５抗ウサギ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗ニワトリ、マウス、またはウサギ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４抗マウス、ウサギ、またはヒツジ、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７抗マウス、ウサギ、またはヒツジを含む様々な２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、室温で少なくとも２時間、１：５００の希釈で試料に加えた。免疫染色したスライドをＰｒｏＬｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ退色防止試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でマウントし、２４時間硬化させた。固定したヒドロゲル構造の崩壊を防ぐために、ＰＦＡ、ＰＢＳ、およびブロッキング溶液を含むすべての緩衝液を、ＩＣＣの全手順を通して出口リザーバから完全には除去しなかった。
ＮＶＵチップの細胞の固定のために、５０～６０μＬの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を液滴として各々のチャネルの入口に加え、少なくとも３０分間チャネル内に保持した。固定されたヒドロゲルマトリックスを、３０～４０μＬのＰＢＳ液滴を各々のチャネルの入口に加えることによって穏やかに洗浄した。この洗浄を少なくとも５回繰り返した。次いで、ＮＶＵチップの細胞を、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１０～１５分間透過処理した。透過処理した細胞をＰＢＳで５回洗浄し、次いでＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中、５％正常ロバ血清で４０分～１時間ブロッキングした。ブロックキングした細胞を、１次抗体（チャネルあたり３０～４０μＬ）と共に４℃で少なくとも一晩インキュベートした。１次抗体の希釈率は以下の通りであった：ヒツジポリクローナル抗ヒトＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＡＦ８０６、１：２０）、ウサギポリクローナル抗ヒトＧＦＡＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｇ９２６９、１：１００）、ニワトリポリクローナル抗ヒトＧＦＡＰ（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：１７３００６、１：５００）、ウサギポリクローナル抗ヒトＡＱＰ４（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号：ＮＢＰ１－８７６７９、１：２０００）、マウスモノクローナル抗ヒトＺＯ－１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：３３９１００、１：１００）、ウサギポリクローナル抗ヒトフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｆ３５２０、１：２００）、マウスモノクローナル抗ヒトｖＷＦ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：ＡＭＡＢ９０９３１、１：５００）、マウスモノクローナル抗ヒトポドプラニン（ＰＤＰＮ）（Ｅ－１）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号：ＳＣ３７６６９５、１：１００）、ウサギポリクローナル抗ヒトシナプシン１／２（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号：１０６００３、１：１，０００）、ニワトリポリクローナル抗ヒトＭＡＰ２（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ａｂ５３９２、１：１０，０００）、ヤギポリクローナル抗ヒトＩＢＡ－１（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ａｂ５０７６、１：２００）、ウサギポリクローナル抗ヒトＩＬ－１β（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ａｂ９７２２、１：１００）、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ６８（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号：ＭＡＣ５７０９、１：１００）、ウサギモノクローナル抗ヒトＣＤ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１９Ｈ８Ｌ４、１：５００）、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ３４（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号：ＢＩ－３Ｃ５、１：２５０）、マウスモノクローナル抗ヒトネスチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号：ＭＡ１－５８４０、１：２５０）、ウサギモノクローナル抗ヒトＰＤＧＦＲβ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号：３１６９、１：１００）、およびマウスモノクローナル抗ヒトＨＩＦ－１α（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ａｂ６０６６、１：２００）。１次抗体インキュベーション中の乾燥を防ぐために、チップを含むプレートを蒸留水で加湿した。インキュベートした試料をブロッキング溶液で５回洗浄し、次いで、ＤｙＬｉｇｈｔ４０５抗ウサギ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗ニワトリ、マウス、またはウサギ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４抗マウス、ウサギ、またはヒツジ、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７抗マウス、ウサギ、またはヒツジを含む様々な２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、室温で少なくとも２時間、１：５００の希釈で試料に加えた。免疫染色したスライドをＰｒｏＬｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ退色防止試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でマウントし、２４時間硬化させた。固定したヒドロゲル構造の崩壊を防ぐために、ＰＦＡ、ＰＢＳ、およびブロッキング溶液を含むすべての緩衝液を、ＩＣＣの全手順を通して出口リザーバから完全には除去しなかった。
【0176】
ＢＢＢの３Ｄ画像
Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０共焦点顕微鏡を用いて、１０倍および２０倍の倍率で免疫染色したＢＢＢ構造の蛍光画像を取得した。ＮＶＵチップを、Ｚ＝０～１００μｍの範囲の異なる焦点面、８～１０μｍ間隔でスキャンした。画像の３Ｄ再構築のために、ＩｍａｇｅＪのプラグインの３Ｄビューアを使用した。
Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０共焦点顕微鏡を用いて、１０倍および２０倍の倍率で免疫染色したＢＢＢ構造の蛍光画像を取得した。ＮＶＵチップを、Ｚ＝０～１００μｍの範囲の異なる焦点面、８～１０μｍ間隔でスキャンした。画像の３Ｄ再構築のために、ＩｍａｇｅＪのプラグインの３Ｄビューアを使用した。
【0177】
カルシウムイメージングおよび分析
ｉＰＳＣ由来のＮＰＣから分化したニューロンにおける細胞質カルシウム振動を記録するために、ｉＰＳＣ由来のＮＰＣを、脳組織およびＢＢＢの再構築のプロセスに記載されているように、他の細胞との組込みの前にＤｉＬ（１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号：Ｄ２８２）で予備染色した。カルシウムイメージングの１時間前に、５μＭ Ｆｌｕｏ－４ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ｆ１４２０１）をチップの入口に加えた。自発的なカルシウム振動を、３７℃および５％ＣＯ２下で共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ＬＳＭ ７１０、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＤｉＬ標識された細胞において観察した。カルシウムシグナリングを、２秒／フレームの速度で１０分間、タイムラプスビデオ記録モードで記録した。記録された画像を、Ｔｉｍｅ Ｓｅｒｉｅｓ ａｎａｌｙｚｅｒ Ｖ３プラグインを用いたＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した。各々のＤｉＬ標識された細胞におけるカルシウム動態をＲＯＩ（関心領域）分析で追跡し、周波数および振幅（ΔＦ／Ｆ０）などの各々の細胞におけるカルシウム振動のパラメータを、ＩＤＬ（対話型デジタル言語）で書かれた特注スクリプトを使用して計算した。追跡したカルシウムシグナルから細胞外バックグラウンドシグナルを差し引いて、次に、細胞内基底線（Ｆ０）に対して正規化した。
ｉＰＳＣ由来のＮＰＣから分化したニューロンにおける細胞質カルシウム振動を記録するために、ｉＰＳＣ由来のＮＰＣを、脳組織およびＢＢＢの再構築のプロセスに記載されているように、他の細胞との組込みの前にＤｉＬ（１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号：Ｄ２８２）で予備染色した。カルシウムイメージングの１時間前に、５μＭ Ｆｌｕｏ－４ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ｆ１４２０１）をチップの入口に加えた。自発的なカルシウム振動を、３７℃および５％ＣＯ２下で共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ＬＳＭ ７１０、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＤｉＬ標識された細胞において観察した。カルシウムシグナリングを、２秒／フレームの速度で１０分間、タイムラプスビデオ記録モードで記録した。記録された画像を、Ｔｉｍｅ Ｓｅｒｉｅｓ ａｎａｌｙｚｅｒ Ｖ３プラグインを用いたＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した。各々のＤｉＬ標識された細胞におけるカルシウム動態をＲＯＩ（関心領域）分析で追跡し、周波数および振幅（ΔＦ／Ｆ０）などの各々の細胞におけるカルシウム振動のパラメータを、ＩＤＬ（対話型デジタル言語）で書かれた特注スクリプトを使用して計算した。追跡したカルシウムシグナルから細胞外バックグラウンドシグナルを差し引いて、次に、細胞内基底線（Ｆ０）に対して正規化した。
【0178】
リアルタイム定量的ＰＣＲ
細胞集団全体の遺伝子発現パターンを評価した。各々の実験条件からの６つを超えるチップを使用して、分析のためにＲＮＡを抽出した。異なるバッチからの細胞を使用して、複数のチップを同時に調製するのに十分な細胞数を確保した。両方のサイドチャネルの培養培地を除去し、新鮮なＰＢＳで置換した。プロセスを２回繰り返し、その間に５分間インキュベーションした。ＰＢＳの除去後、５０ｕＬのＲＬＴ緩衝液＋溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号：１０５３３９３）を両方のサイドチャネルに注入し、５分間インキュベートした。チップ内のすべてのタイプの細胞、特に「脳」チャネルのものを収集するために、徹底的なピペッティングが必要であった。次いで、全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号：７４１０４）を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。ＲＮＡの品質および濃度をＡｇｉｌｅｎｔ ２１０ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって決定した。各々のチップから得られたＲＮＡ量は、各々の実験条件について以下の通りであった：正常酸素状態下で１０日間のチップは、約２５０ｎｇを生じた；同じ条件の後に２４時間の虚血は約１３０ｎｇを生じた；正常酸素状態下で１８日間、神経修復効果の評価の対照群として使用されたチップは、約４００ｎｇ；再灌流のみのチップ、約２００ｎｇ；移植された幹細胞のチップは、幹細胞タイプに応じて約３５０ｎｇ～７５０ｎｇ。全ＲＮＡを、高キャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：４３６８８１４）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムｑＰＣＲを、目的の遺伝子の発現レベルを定量するために、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号：１７２５２７２Ａ）を使用してＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。ｑＰＣＲ増幅を、９５℃で３０秒、９５℃で１５秒、および６５℃で５０秒の４０サイクルで達成した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲソフトウェアを使用して、シグナルをノイズから区別し、さらに手動でチェックして、得られたＣｔ値が実際に本物のシグナルに由来したことを確認した。カスタマイズされたｑＰＣＲプレートは、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌによって設計および製造された。神経発生ｑＰＣＲプレートはＱｉａｇｅｎから購入した。周知の虚血性挙動を有する１２個の遺伝子を最初に選択し、それらの発現の再現性を三連で確認した。最終の１２３個の遺伝子の発現を、各々の実験条件について６つを超える独立したチップで測定した。
細胞集団全体の遺伝子発現パターンを評価した。各々の実験条件からの６つを超えるチップを使用して、分析のためにＲＮＡを抽出した。異なるバッチからの細胞を使用して、複数のチップを同時に調製するのに十分な細胞数を確保した。両方のサイドチャネルの培養培地を除去し、新鮮なＰＢＳで置換した。プロセスを２回繰り返し、その間に５分間インキュベーションした。ＰＢＳの除去後、５０ｕＬのＲＬＴ緩衝液＋溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号：１０５３３９３）を両方のサイドチャネルに注入し、５分間インキュベートした。チップ内のすべてのタイプの細胞、特に「脳」チャネルのものを収集するために、徹底的なピペッティングが必要であった。次いで、全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号：７４１０４）を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。ＲＮＡの品質および濃度をＡｇｉｌｅｎｔ ２１０ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって決定した。各々のチップから得られたＲＮＡ量は、各々の実験条件について以下の通りであった：正常酸素状態下で１０日間のチップは、約２５０ｎｇを生じた；同じ条件の後に２４時間の虚血は約１３０ｎｇを生じた；正常酸素状態下で１８日間、神経修復効果の評価の対照群として使用されたチップは、約４００ｎｇ；再灌流のみのチップ、約２００ｎｇ；移植された幹細胞のチップは、幹細胞タイプに応じて約３５０ｎｇ～７５０ｎｇ。全ＲＮＡを、高キャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：４３６８８１４）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムｑＰＣＲを、目的の遺伝子の発現レベルを定量するために、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号：１７２５２７２Ａ）を使用してＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。ｑＰＣＲ増幅を、９５℃で３０秒、９５℃で１５秒、および６５℃で５０秒の４０サイクルで達成した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲソフトウェアを使用して、シグナルをノイズから区別し、さらに手動でチェックして、得られたＣｔ値が実際に本物のシグナルに由来したことを確認した。カスタマイズされたｑＰＣＲプレートは、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌによって設計および製造された。神経発生ｑＰＣＲプレートはＱｉａｇｅｎから購入した。周知の虚血性挙動を有する１２個の遺伝子を最初に選択し、それらの発現の再現性を三連で確認した。最終の１２３個の遺伝子の発現を、各々の実験条件について６つを超える独立したチップで測定した。
【0179】
幹細胞の神経修復能の評価
様々なタイプの幹細胞の神経修復能を調べた。虚血性傷害の２４時間後、「ＣＳＦ側」チャネルにおいて、血清およびグルコース不含ＤＭＥＭ培地を、ＮＤＭ／ＡＭ（８：４：１（ｖ／ｖ／ｖ）の比でのＮＤＭ、血清不含ＡＭ、およびＡＣＭの混合培地）で置換した。次いで、幹細胞を、ＥＣＭ／ＰＭ（９：１（ｖ／ｖ）の比での血清含有ＥＣＭおよびＰＭの混合培地）中に５×１０６細胞／ｍＬの密度で回収し、１０４細胞を「血液側」チャネルに注入した。この設定は、幹細胞療法のために最も広く使用されている経路である、幹細胞移植のための血管内経路に相当する。幹細胞を３時間インキュベートして細胞付着を可能にし、浮遊細胞を新鮮なＥＣＭ／ＰＭで穏やかに洗い流した。さらなる分析の前に、両方のサイドチャネルの培地をさらに７日間毎日交換した。
様々なタイプの幹細胞の神経修復能を調べた。虚血性傷害の２４時間後、「ＣＳＦ側」チャネルにおいて、血清およびグルコース不含ＤＭＥＭ培地を、ＮＤＭ／ＡＭ（８：４：１（ｖ／ｖ／ｖ）の比でのＮＤＭ、血清不含ＡＭ、およびＡＣＭの混合培地）で置換した。次いで、幹細胞を、ＥＣＭ／ＰＭ（９：１（ｖ／ｖ）の比での血清含有ＥＣＭおよびＰＭの混合培地）中に５×１０６細胞／ｍＬの密度で回収し、１０４細胞を「血液側」チャネルに注入した。この設定は、幹細胞療法のために最も広く使用されている経路である、幹細胞移植のための血管内経路に相当する。幹細胞を３時間インキュベートして細胞付着を可能にし、浮遊細胞を新鮮なＥＣＭ／ＰＭで穏やかに洗い流した。さらなる分析の前に、両方のサイドチャネルの培地をさらに７日間毎日交換した。
【0180】
幹細胞の追跡
チップの幹細胞の挙動を追跡するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を担持するレンチウイルスベクターを使用して、幹細胞ｈＮＰＣ、ｈＮＳＣ（ＮＲ１）、ｈＡＭＳＣ、ｈＢＭＳＣ、およびｈＥＰＣをトランスフェクトした。ｈＨＳＣのウイルストランスフェクション効率が十分でなかったため、ｈＨＳＣについては予備染色法を使用した。すぐに使用可能なＧＦＰレンチウイルス粒子をＧｅｎＴａｒｇｅｔ Ｉｎｃ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入し、いくつかの修正を加えた製造業者のプロトコルに従って使用した。より具体的には、細胞を４８ウェルプレートでコンフルエンシーが５０％～７５％に達するまで培養した。形質導入前に細胞培養培地を除去し、０．２５ｍＬの新鮮な培地および１５μＬのウイルス溶液を各々のウェルに加えた。望ましい形質導入効率を達成するため、細胞を、培地交換をその間に行わずに細胞培養インキュベータで２～３日間培養した。ｈＨＳＣをＶｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｉＯ細胞標識溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｖ２２８８６）で予備染色した。１×１０６細胞／ｍＬのｈＨＳＣを、細胞培養インキュベータにおいて９６ウェルプレートの染色培地（培養培地１ｍＬあたり１０μＬの標識溶液）と共に２０分間インキュベートし、使用のために滅菌ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４）で３回洗浄した。虚血性傷害後に各々の幹細胞をチップの「血液側」チャネルに注入した後、幹細胞の浸潤を追跡するために最大７日間１日おきに画像を撮影した。７日間の最後に、幹細胞を幹細胞性マーカー（ｈＮＰＣおよびｈＮＳＣに対してはネスチン、ｈＢＭＳＣおよびｈＡＭＳＣに対してはＣＤ４４、ｈＥＰＣおよびｈＨＳＣに対してはＣＤ３４）および分化マーカー（神経発生に対してはＭＡＰ２、グリア新生に対してはＧＦＡＰ、および血管発生のためのフォン・ヴィレブランド因子）に対して免疫染色した。がん細胞および幹細胞の両方の管外漏出の程度を画像スコアリングによって定量化した（ＩｍａｇｅＪ、ＮＩＨ）。
チップの幹細胞の挙動を追跡するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を担持するレンチウイルスベクターを使用して、幹細胞ｈＮＰＣ、ｈＮＳＣ（ＮＲ１）、ｈＡＭＳＣ、ｈＢＭＳＣ、およびｈＥＰＣをトランスフェクトした。ｈＨＳＣのウイルストランスフェクション効率が十分でなかったため、ｈＨＳＣについては予備染色法を使用した。すぐに使用可能なＧＦＰレンチウイルス粒子をＧｅｎＴａｒｇｅｔ Ｉｎｃ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入し、いくつかの修正を加えた製造業者のプロトコルに従って使用した。より具体的には、細胞を４８ウェルプレートでコンフルエンシーが５０％～７５％に達するまで培養した。形質導入前に細胞培養培地を除去し、０．２５ｍＬの新鮮な培地および１５μＬのウイルス溶液を各々のウェルに加えた。望ましい形質導入効率を達成するため、細胞を、培地交換をその間に行わずに細胞培養インキュベータで２～３日間培養した。ｈＨＳＣをＶｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｉＯ細胞標識溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｖ２２８８６）で予備染色した。１×１０６細胞／ｍＬのｈＨＳＣを、細胞培養インキュベータにおいて９６ウェルプレートの染色培地（培養培地１ｍＬあたり１０μＬの標識溶液）と共に２０分間インキュベートし、使用のために滅菌ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４）で３回洗浄した。虚血性傷害後に各々の幹細胞をチップの「血液側」チャネルに注入した後、幹細胞の浸潤を追跡するために最大７日間１日おきに画像を撮影した。７日間の最後に、幹細胞を幹細胞性マーカー（ｈＮＰＣおよびｈＮＳＣに対してはネスチン、ｈＢＭＳＣおよびｈＡＭＳＣに対してはＣＤ４４、ｈＥＰＣおよびｈＨＳＣに対してはＣＤ３４）および分化マーカー（神経発生に対してはＭＡＰ２、グリア新生に対してはＧＦＡＰ、および血管発生のためのフォン・ヴィレブランド因子）に対して免疫染色した。がん細胞および幹細胞の両方の管外漏出の程度を画像スコアリングによって定量化した（ＩｍａｇｅＪ、ＮＩＨ）。
【0181】
統計的方法
各独立した実験を少なくとも３回繰り返し、結果を平均±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として示した。蛍光画像の定量的分析のために、異なる試料から少なくとも３つの画像を取得し、画像分析ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して、目的の態様を定量的に分析した。統計的有意性は、２つの群の比較のためには片側スチューデントｔ検定、および複数の群の比較のためにはボンフェローニ－ホルム事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｄａｎｉｅｌ’ｓ ＸＬ Ｔｏｏｌｂｏｘ）を使用して評価した。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
各独立した実験を少なくとも３回繰り返し、結果を平均±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として示した。蛍光画像の定量的分析のために、異なる試料から少なくとも３つの画像を取得し、画像分析ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して、目的の態様を定量的に分析した。統計的有意性は、２つの群の比較のためには片側スチューデントｔ検定、および複数の群の比較のためにはボンフェローニ－ホルム事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｄａｎｉｅｌ’ｓ ＸＬ Ｔｏｏｌｂｏｘ）を使用して評価した。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
【0182】
上述した様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。米国仮特許出願第６３／０１３，９０３号を含む、本明細書で言及されているおよび／または出願データシートに列挙されている、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、なおさらなる実施形態を提供するために、様々な特許、出願および刊行物の概念を用いるように変更することができる。
【0183】
これらおよび他の変更は、上記の詳細な説明に照らして、実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、特許請求の範囲を明細書および特許請求の範囲に開示された具体的な実施形態に限定すると解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲と共にすべての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【国際調査報告】