特表 2023-523324 抗体のプロテインＡクロマトグラフィー精製

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-02

(54)【発明の名称】抗体のプロテインＡクロマトグラフィー精製

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/22 20060101AFI20230526BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20230526BHJP

【ＦＩ】

C07K1/22

C07K16/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022565602

(86)(22)【出願日】2021-04-26

(85)【翻訳文提出日】2022-10-26

(86)【国際出願番号】 US2021029195

(87)【国際公開番号】W WO2021222120

(87)【国際公開日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】63/016,025

(32)【優先日】2020-04-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】503102674

【氏名又は名称】アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ゴーダワット， ラフル

(72)【発明者】

【氏名】フリードマン， エイブラハム

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

開示されるのは、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入の低下をもたらす、プロテインＡクロマトグラフィーカラム及びアルギニン洗浄を使用して抗体を精製するための方法である。この方法は、抗体を含む組成物をプロテインＡクロマトグラフィーカラムに負荷することと、カラムを洗浄溶液で洗浄することとを含むことができる。ある実施形態では、洗浄は、繰り返される。本開示は例えば、抗体を精製するための方法であって、抗体を含む組成物をプロテインＡクロマトグラフィーカラムに負荷することと、前記カラムを洗浄溶液で洗浄することとを含む方法、を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体を精製するための方法であって、抗体を含む組成物をプロテインＡクロマトグラフィーカラムに負荷することと、前記カラムを洗浄溶液で洗浄することとを含む方法。

【請求項2】

前記洗浄溶液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、リン酸塩、酢酸塩、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、尿素、カプリル酸ナトリウム、又はその組み合わせからなる群から選択される第１の成分を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記洗浄溶液が、トリス、リン酸塩、酢酸塩、又はその組み合わせからなる群から選択される第１の成分を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記洗浄溶液が、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＣＨＡＰＳ、ＴＭＡＣ、尿素、及びカプリル酸ナトリウムからなる群から選択される第２の成分をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記洗浄溶液が、アルギニン、ＴＭＡＣ、カプリル酸塩、又はその組み合わせを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記洗浄溶液が、アルギニンを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記洗浄溶液が、ＴＲＩＳ緩衝液を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記第１の成分の濃度が、約１ｍＭ～約５０ｍＭである、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記第１の成分の濃度が、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約５ｍＭ～約２５ｍＭ、又は約２ｍＭ～約３０ｍＭである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の成分の濃度が、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、又は５０ｍＭである、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記第２の成分の濃度が、約１ｍＭ～約５０Ｍである、請求項２～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記第２の成分の濃度が、約０．１ｍＭ～５Ｍ、１０ｍＭ～１Ｍ、０．５Ｍ～２．５Ｍ、又は０．２Ｍ～１Ｍである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記第２の成分の濃度が、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ、又は１０Ｍである、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記第２の成分の濃度が、約０．１％～２５％である、請求項２～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記第２の成分の濃度が、約０．１％～５％、０．５％～１６％、１０％～２０％、又は１％～２５％である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記第２の成分の濃度が、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は３０％である、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記洗浄溶液が、それぞれ独立に約０．１％～３０％の濃度の、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＣＨＡＰＳ、ＴＭＡＣ、尿素、カプリル酸ナトリウム、トリス、リン酸塩、酢酸塩、又はその組み合わせを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

各濃度が、独立に、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は３０％である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記洗浄溶液が、それぞれ独立に約１ｍＭ～１０Ｍの濃度の、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＣＨＡＰＳ、ＴＭＡＣ、尿素、カプリル酸ナトリウム、トリス、リン酸塩、酢酸塩、又はその組み合わせを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記濃度が、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ、又は１０Ｍである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記洗浄溶液が、約１ｍＭ～５０ｍＭの量の、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、リン酸、又は酢酸緩衝液を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記量が、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、又は５０ｍＭである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記洗浄溶液が、約ｐＨ１～１１のｐＨを有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記洗浄溶液が、約ｐＨ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１のｐＨを有する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び０．５アルギニンを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１５％プロピレングリコールを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１％ポリソルベート８０を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、５ｍＭトリスを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記洗浄溶液が、ｐＨ５の、５ｍＭ酢酸塩を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記洗浄溶液が、ｐＨ５の、２５ｍＭ酢酸塩及び１Ｍ ＮａＣｌを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１％ ＣＨＡＰＳを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び０．５ ＴＭＡＣを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１Ｍ尿素を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭ及び５０ｍＭカプリル酸ナトリウムを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記方法が、３回の洗浄を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記第１の洗浄が、約１０～２０ｍＭリン酸塩及び約１００～２００ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄溶液を使用する、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記第２の洗浄が、約１０～３０ｍＭトリス及び約０．１Ｍ～１Ｍアルギニンを含む洗浄溶液を使用する、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

前記第３の洗浄が、約１０～３０ｍＭ酢酸塩及び約１００～２００ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄溶液を使用する、請求項３６に記載の方法。

【請求項40】

前記洗浄溶液のｐＨが、約ｐＨ４～１０である、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記洗浄溶液のｐＨが、約ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ７、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ８、ｐＨ９、又はｐＨ１０である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記洗浄が、約０℃～５０℃で行われる、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記抗体が、モノクローナル、組換え、キメラ、又はヒト化抗体である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記抗体が、線維反応性モノクローナル抗体である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記抗体が、ヒト化されている、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記抗体を精製することをさらに含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記抗体を製剤化することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記精製された抗体が、混入物を実質的に含まない、請求項４６に記載の方法。

【請求項49】

前記混入物が、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記洗浄ステップが、繰り返される、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

（ａ）抗体発現細胞を産生するための予備培養；
（ｂ）抗体発現細胞をバイオリアクター中で増殖させること；
（ｃ）濾過によって抗体を回収すること；
（ｄ）３回の洗浄を含むプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを実施すること；
（ｅ）ウイルス不活化のためにカラムを低ｐＨ保持にかけること；
（ｆ）陽イオン交換クロマトグラフィーを実施すること；
（ｇ）陰イオン交換クロマトグラフィーを実施すること；
（ｈ）ウイルス濾過；
（ｉ）限外濾過及び透析濾過；及び
（ｊ）最終調製及び最終濾過
を含む、抗体を精製するための方法。

【請求項52】

前記洗浄溶液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、リン酸塩、酢酸塩、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、尿素、カプリル酸ナトリウム、又はその組み合わせからなる群から選択される第１の成分を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記洗浄溶液が、トリス、リン酸塩、酢酸塩、又はその組み合わせからなる群から選択される第１の成分を含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記洗浄溶液が、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＣＨＡＰＳ、ＴＭＡＣ、尿素、及びカプリル酸ナトリウムからなる群から選択される第２の成分をさらに含む、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記洗浄溶液が、アルギニン、ＴＭＡＣ、カプリル酸塩、又はその組み合わせを含む、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記洗浄溶液が、アルギニンを含む、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記洗浄溶液が、ＴＲＩＳ緩衝液を含む、請求項５１～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記第１の成分の濃度が、約１ｍＭ～約５０ｍＭである、請求項５２～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記第１の成分の濃度が、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約５ｍＭ～約２５ｍＭ、又は約２ｍＭ～約３０ｍＭである、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記第１の成分の濃度が、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、又は５０ｍＭである、請求項５８に記載の方法。

【請求項61】

前記第２の成分の濃度が、約１ｍＭ～約５０Ｍである、請求項５２～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記第２の成分の濃度が、約０．１ｍＭ～５Ｍ、１０ｍＭ～１Ｍ、０．５Ｍ～２．５Ｍ、又は０．２Ｍ～１Ｍである、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記第２の成分の濃度が、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ、又は１０Ｍである、請求項６１に記載の方法。

【請求項64】

前記第２の成分の濃度が、約０．１％～２５％である、請求項５２～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記第２の成分の濃度が、約０．１％～５％、０．５％～１６％、１０％～２０％、又は１％～２５％である、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記第２の成分の濃度が、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は３０％である、請求項６４に記載の方法。

【請求項67】

前記洗浄溶液が、それぞれ独立に約０．１％～３０％の濃度の、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＣＨＡＰＳ、ＴＭＡＣ、尿素、カプリル酸ナトリウム、トリス、リン酸塩、酢酸塩、又はその組み合わせを含む、請求項５１～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

各濃度が、独立に、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は３０％である、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記洗浄溶液が、それぞれ独立に約１ｍＭ～１０Ｍの濃度の、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＣＨＡＰＳ、ＴＭＡＣ、尿素、カプリル酸ナトリウム、トリス、リン酸塩、酢酸塩、又はその組み合わせを含む、請求項５１～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記濃度が、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ、又は１０Ｍである、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記洗浄溶液が、約１ｍＭ～５０ｍＭの量の、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、リン酸、又は酢酸緩衝液を含む、請求項５１～７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記量が、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、又は５０ｍＭである、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記洗浄溶液が、約ｐＨ１～１１のｐＨを有する、請求項５１～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記洗浄溶液が、約ｐＨ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１のｐＨを有する、請求項５１～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び０．５アルギニンを含む、請求項５１～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１５％プロピレングリコールを含む、請求項５１～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１％ポリソルベート８０を含む、請求項５１～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む、請求項５１～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、５ｍＭトリスを含む、請求項５１～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記洗浄溶液が、ｐＨ５の、５ｍＭ酢酸塩を含む、請求項５１～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記洗浄溶液が、ｐＨ５の、２５ｍＭ酢酸塩及び１Ｍ ＮａＣｌを含む、請求項５１～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１％ ＣＨＡＰＳを含む、請求項５１～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び０．５ ＴＭＡＣを含む、請求項５１～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１Ｍ尿素を含む、請求項５１～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記洗浄溶液が、ｐＨ９の、２５ｍＭ及び５０ｍＭカプリル酸ナトリウムを含む、請求項５１～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記方法が、３回の洗浄を含む、請求項５１～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記第１の洗浄が、約１０～２０ｍＭリン酸塩及び約１００～２００ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄溶液を使用する、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記第２の洗浄が、約１０～３０ｍＭトリス及び約０．１Ｍ～１Ｍアルギニンを含む洗浄溶液を使用する、請求項８６に記載の方法。

【請求項89】

前記第３の洗浄が、約１０～３０ｍＭ酢酸塩及び約１００～２００ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄溶液を使用する、請求項８６に記載の方法。

【請求項90】

前記洗浄溶液のｐＨが、約ｐＨ４～１０である、請求項８６～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記洗浄溶液のｐＨが、約ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ７、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ８、ｐＨ９、又はｐＨ１０である、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記洗浄が、約０℃～５０℃で行われる、請求項５１～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記抗体が、モノクローナル、組換え、キメラ、又はヒト化抗体である、請求項５１～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記抗体が、線維反応性モノクローナル抗体である、請求項５１～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記抗体が、ヒト化されている、請求項５１～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記抗体を精製することをさらに含む、請求項５１～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記抗体を製剤化することをさらに含む、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記精製された抗体が、混入物を実質的に含まない、請求項９６に記載の方法。

【請求項99】

前記混入物が、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）である、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

前記洗浄ステップが、繰り返される、請求項１～９９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

これは、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０２０年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０１６，０２５号の優先権を主張する、特許協力条約に基づく国際出願である。

【背景技術】

【0002】

分野
本開示は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、抗体を精製する方法に関する。

【0003】

関連技術の説明
プロテインＡクロマトグラフィーは、プロテインＡと抗体の結晶化可能断片（Ｆｃ）との間の強力且つ特異的な相互作用に依拠する、広く使用される高選択的な方法である。しかし、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が、最終産物を汚染する可能性があり、これを処理中に除去することが好ましい。この技術的問題の解決法は、特許請求の範囲において特徴付けられる実施形態によって提供される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本出願は、プロテインＡを使用して抗体を単離し、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入の低下をもたらす方法に関する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

ある実施形態では、抗体を精製するための方法は、抗体を含む組成物をプロテインＡクロマトグラフィーカラムに負荷することと、カラムを洗浄溶液で洗浄することとを含むことができる。ある実施形態では、洗浄は、繰り返される。

【0006】

一実施形態では、抗体を精製するための方法は、（ａ）抗体発現細胞を産生するための予備培養；（ｂ）抗体発現細胞をバイオリアクター中で増殖させること；（ｃ）濾過によって抗体を回収すること；（ｄ）３回の洗浄を含むプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを実施すること；（ｅ）ウイルス不活化のためにカラムを低ｐＨ保持にかけること；（ｆ）陽イオン交換クロマトグラフィーを実施すること；（ｇ）陰イオン交換クロマトグラフィーを実施すること；（ｈ）ウイルス濾過；（ｉ）限外濾過及び透析濾過；及び（ｊ）最終調製及び最終濾過を含む。

【0007】

一実施形態では、洗浄溶液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、リン酸塩、酢酸塩、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、尿素、カプリル酸ナトリウム、又はその組み合わせからなる群から選択される第１の成分を含む。ある実施形態では、洗浄溶液は、トリス、リン酸塩、酢酸塩、又はその組み合わせからなる群から選択される第１の成分を含む。

【0008】

一実施形態では、洗浄溶液は、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＣＨＡＰＳ、ＴＭＡＣ、尿素、及びカプリル酸ナトリウムからなる群から選択される第２の成分をさらに含む。ある実施形態では、洗浄溶液は、アルギニン、ＴＭＡＣ、カプリル酸塩、又はその組み合わせを含む。ある実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを含む。ある実施形態では、洗浄溶液は、ＴＲＩＳ緩衝液を含む。

【0009】

一実施形態では、第１の成分の濃度は、約１ｍＭ～約５０ｍＭである。ある実施形態では、第１の成分の濃度は、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約５ｍＭ～約２５ｍＭ、又は約２ｍＭ～約３０ｍＭである。ある実施形態では、第１の成分の濃度は、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、又は５０ｍＭである。

【0010】

一実施形態では、第２の成分の濃度は、約１ｍＭ～約５０Ｍである。ある実施形態では、第２の成分の濃度は、約０．１ｍＭ～５Ｍ、１０ｍＭ～１Ｍ、０．５Ｍ～２．５Ｍ、又は０．２Ｍ～１Ｍである。ある実施形態では、第２の成分の濃度は、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ、又は１０Ｍである。

【0011】

一実施形態では、第２の成分の濃度は、約０．１％～２５％である。ある実施形態では、第２の成分は、約０．１％～５％、０．５％～１６％、１０％～２０％、又は１％～２５％である。ある実施形態では、第２の成分は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は３０％である。

【0012】

一実施形態では、洗浄溶液は、それぞれ独立に約０．１％～３０％の濃度の、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＣＨＡＰＳ、ＴＭＡＣ、尿素、カプリル酸ナトリウム、トリス、リン酸塩、酢酸塩、又はその組み合わせを含む。ある実施形態では、各濃度は、独立に、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は３０％である。

【0013】

一実施形態では、洗浄溶液は、それぞれ独立に約１ｍＭ～１０Ｍの濃度の、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＣＨＡＰＳ、ＴＭＡＣ、尿素、カプリル酸ナトリウム、トリス、リン酸塩、酢酸塩、又はその組み合わせを含む。ある実施形態では、その濃度は、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ、又は１０Ｍである。

【0014】

一実施形態では、洗浄溶液は、約１ｍＭ～５０ｍＭの量の、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、リン酸、又は酢酸緩衝液を含む。ある実施形態では、その量は、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、又は５０ｍＭである。

【0015】

一実施形態では、洗浄溶液は、約ｐＨ１～１１のｐＨを有する。ある実施形態では、洗浄溶液は、約ｐＨ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１のｐＨを有する。

【0016】

一実施形態では、洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び０．５アルギニンを含む。

【0017】

一実施形態では、洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１５％プロピレングリコールを含む。

【0018】

一実施形態では、洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１％ポリソルベート８０を含む。

【0019】

一実施形態では、洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む。

【0020】

一実施形態では、洗浄溶液は、ｐＨ９の、５ｍＭトリスを含む。

【0021】

一実施形態では、洗浄溶液は、ｐＨ５の、５ｍＭ酢酸塩を含む。

【0022】

一実施形態では、洗浄溶液は、ｐＨ５の、２５ｍＭ酢酸塩及び１Ｍ ＮａＣｌを含む。

【0023】

一実施形態では、洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１％ ＣＨＡＰＳを含む。

【0024】

一実施形態では、洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び０．５ ＴＭＡＣを含む。

【0025】

一実施形態では、洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１Ｍ尿素を含む。

【0026】

一実施形態では、洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭ及び５０ｍＭカプリル酸ナトリウムを含む。

【0027】

一実施形態では、この方法は、３回の洗浄を含む。ある実施形態では、第１の洗浄は、約１０～２０ｍＭリン酸塩及び約１００～２００ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄溶液を使用する。ある実施形態では、第２の洗浄は、約１０～３０ｍＭトリス及び約０．１Ｍ～１Ｍアルギニンを含む洗浄溶液を使用する。ある実施形態では、第３の洗浄は、約１０～３０ｍＭ酢酸塩及び約１００～２００ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄溶液を使用する。

【0028】

ある実施形態では、洗浄溶液のｐＨは、約ｐＨ４～１０である。一実施形態では、洗浄溶液のｐＨは、約ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ７、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ８、ｐＨ９、又はｐＨ１０である。

【0029】

一実施形態では、洗浄は、約０℃～５０℃で行われる。ある実施形態では、洗浄は、約４℃で行われる。

【0030】

一実施形態では、抗体は、モノクローナル、組換え、キメラ、又はヒト化抗体である。ある実施形態では、抗体は、線維反応性モノクローナル抗体である。ある実施形態では、抗体は、ヒト化されている。

【0031】

一実施形態では、この方法は、抗体を精製することをさらに含む。一実施形態では、精製された抗体は、混入物を実質的に含まない。一実施形態では、この方法は、抗体を製剤化することをさらに含む。ある実施形態では、混入物は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）である。

【0032】

本開示の性質、目的、及び利点のさらなる理解のために、同様の数字が同様の要素を表す以下の図面と併用して、以下の詳細な説明に対して、参考文献が読まれるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】抗体を製造するためのプロセスフロー図を示す。

【図2】アフィニティークロマトグラフィーを使用して抗体を調製する例示的方法のフローチャートを表す。

【図3】負荷、洗浄１、洗浄２、洗浄３、溶出、剥離（ｓｔｒｉｐ）、平衡化、及びクリーニングを示す、抗体を調製するための方法のクロマトグラム対照を表す。Ａは、ＵＶ １ ２８０ Ｃｈｒｏｍ．１：ＳＰＰＤ－２０－００６３－０１Ｃ ＰｒｏＡ Ｗａｓｈであり；Ｂは、ｐＨ Ｃｈｒｏｍ．１：ＳＰＰＤ－２０－００６３－０１Ｃ ＰｒｏＡ Ｗａｓｈであり、Ｃは、Ｃｏｎｄ Ｃｈｒｏｍ．１：ＳＰＰＤ－２０－００６３－０１Ｃ ＰｒｏＡ Ｗａｓｈである。

【図4】図３に示された洗浄２の代わりに０．５Ｍアルギニンでの洗浄を含む、抗体を調製するための本明細書に記載された方法のクロマトグラムを表す。Ａは、ＵＶ １ ２８０ Ｃｈｒｏｍ．１：ＳＰＰＤ－２０－００６３－０１Ｃ ＰｒｏＡ Ｗａｓｈであり；Ｂは、ｐＨ Ｃｈｒｏｍ．１：ＳＰＰＤ－２０－００６３－０１Ｃ ＰｒｏＡ Ｗａｓｈであり；Ｃは、Ｃｏｎｄ Ｃｈｒｏｍ．１：ＳＰＰＤ－２０－００６３－０１Ｃ ＰｒｏＡ Ｗａｓｈである。

【図5】ＥＬＩＳＡによって測定される、様々な「洗浄２」緩衝液を使用する結果を表す。０．５Ｍアルギニン洗浄を使用する試みが、最も低い宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入を示した。

【発明を実施するための形態】

【0034】

主題の開示をさらに記載する前に、本開示が、以下に記載される開示の特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。なぜなら、これらの特定の実施形態の変更を行うことができ、また、これはやはり、添付の特許請求の範囲の範囲内であるからである。用いられる用語が、特定の実施形態を説明するためのものであり、制限的であることを意図したものではないことも理解されたい。代わりに、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によって確立されることとなる。

【0035】

この明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈によって他に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれる。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学は、この開示が属する当業者に共通に理解されるのと同じ意味を有する。

【0036】

本明細書で使用する場合、要素の量を修飾する用語「約」は、例えば、実世界において溶液を使用するために使用される典型的な測定、計量、及び液体処理手順を通して；これらの手順における故意でない誤りを通して；組成物を作製するために又は方法を実施するために用いられる成分の製造、起源、又は純度の違いを通して；生じる可能性がある、数として表される量の変動を指す。用語「約」はまた、ある特定の最初の混合物に由来する組成物についての、異なる平衡条件に起因して異なる量を包含する。用語「約」によって修飾されるかどうかにかかわらず、特許請求の範囲には、その分量に対する等価物が含まれる。一実施形態では、用語「約」は、報告された数値の１０％以内、好ましくは５％以内、より好ましくは２％以内、最も好ましくは１％以内を意味する。

【0037】

抗体産生－クロマトグラフィー及び混入物
抗体を調製するための例示的方法の概要を、図１及び２に示す。抗体産生のための方法は、一般に、抗体産生細胞（限定はされないが：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、Ｓｐ２／０マウス骨髄腫細胞、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞が含まれる）を培養すること、細胞培養物から抗体を収集すること、及び抗体を含む組成物をクロマトグラフィーカラムに負荷して、混入物、例えば宿主細胞タンパク質を洗い落とすことを含む。Ｉｃｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＭＡＢＳ １０（２）：３２５－３３４。クロマトグラフィーカラムは、免疫グロブリン（Ｉｇ）－結合分子が共有結合的に付着（固定化）されている固定の基質を含有する。免疫グロブリン結合分子は、当技術分野で公知であり、これには、限定はされないが：プロテインＡ；プロテインＧ；プロテインＡ／Ｇ（遺伝子操作された組換え型のプロテインＡ及びプロテインＧ）；及びプロテインＬが含まれる。プロテインＡ、Ｇ、及びＬは、すべて、十分に特徴付けられた抗体結合特性をもつ細菌タンパク質である。Ｉｇ結合分子への付着に適した固定の基質は、当技術分野で公知であり、これには、限定はされないが：磁気ビーズ；ビーズ状アガロース；及びポリスチレン－ジビニルベンゼンが含まれる。

【0038】

培養培地中の抗体は、カラム内の固定化されたＩｇ結合分子に結合し、所望される通りに洗浄され、次いで、抗体は溶出される。次いで、溶出された抗体は、ウイルス不活化、及びその後の陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を受ける。次いで、生じた生成物を、濾過し（膜濾過を使用することが含まれる）、次いで、精製された抗体産生物の最終調製を行う。当技術分野で依然として残っている問題は、抗体組成物中に存在している容認できない量の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）である。

【0039】

クロマトグラフィーは、抗体の調製において広く使用される分離及び精製技術である。抗体産生細胞を、バイオリアクター中で増殖させ、次いで、回収し、それに続いて、少なくとも３つの単位操作（第１の捕捉、第２の精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及び最終のポリッシング（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）が含まれる）を行う。いくつかのモノクローナル抗体精製プロセスは、プロテインＡベースのクロマトグラフィーでのモノクローナル抗体捕捉を利用する。

【0040】

精製及びポリッシングステップは、一般に、陽イオン及び陰イオン交換クロマトグラフィーを組み込んでいるが、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーも使用することができる。これらのステップは、追加のウイルス、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、及びＤＮＡクリアランスを提供し、凝集体、所望されない産物バリアント種、及び他の微量混入物を除去することができる。各クロマトグラフィーステップ、すなわち陽イオン交換又は陰イオン交換は、標的タンパク質及び不純物の物理化学的特性に応じて、結合及び溶出、又はフロースルーモードで実施することができる。

【0041】

クロマトグラフィーの頑強な性質にもかかわらず、混入物、特に宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、依然として問題である。本発明者らは、驚いたことに、プロテインＡクロマトグラフィー中にアルギニンを含む第２の洗浄を使用することが、最終産物中のＨＣＰ混入の量を、予想外且つ有意に低下させることを発見した。

【0042】

抗体を調製するための例示的方法の概要を、図１及び図２に示す。プロテインＡクロマトグラフィー部分では、宿主細胞タンパク質を含めた混入物を除去するために、３回の洗浄を実施することができる。第１の洗浄（洗浄１）は、ｐＨ７．２の、約２０ｍＭリン酸塩及び約１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む洗浄溶液を含むことができる。第２の洗浄（洗浄２）は、約２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）及び約０．５Ｍアルギニン；約２５ｍＭトリス及び約０．５Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）；約２５ｍＭトリス及び約５０ｍＭカプリル酸ナトリウム；約２５ｍＭトリス及び約１％ ３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）；約２５ｍＭトリス及び約１％ポリソルベート８０（ＰＳ８０）；約２５ｍＭトリス及び約１Ｍ尿素；及び約２５ｍＭトリス及び約２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）からなる群から、好ましくは約２５ｍＭトリス及び約０．５Ｍアルギニン；約２５ｍＭトリス及び約０．５Ｍ ＴＭＡＣ；及び約２５ｍＭトリス及び約５０ｍＭカプリル酸ナトリウムからなる群から、最も好ましくは約２５ｍＭトリス及び約０．５Ｍアルギニンから選択される、ｐＨ９．０の洗浄溶液を含むことができる。第３の洗浄（洗浄３）は、ｐＨ６．５の、約２０ｍＭ酢酸塩及び約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄溶液を含むことができる。洗浄は、連続的に行うことができる。本発明者らは、驚いたことに、第２の洗浄の追加及び／又は改変が、宿主細胞タンパク質混入を実質的に低下させることを発見した。

【0043】

洗浄試薬
洗浄は、緩衝液（第１の成分）及び塩（第２の成分）を含むことができる。各洗浄溶液のための緩衝液は、独立に、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、リン酸、又は酢酸緩衝液であり得る。緩衝液は、約１～５０ｍＭトリスであり得る。緩衝液は、約１～５０ｍＭ酢酸塩であり得る。緩衝液は、約１～５０ｍＭリン酸塩であり得る。濃度は、約１ｍＭ～５０ｍＭ、５ｍＭ～２５ｍＭ、又は２ｍＭ～３０ｍＭであり得る。濃度は、約０．１Ｍ～５Ｍ、０．５Ｍ～２．５Ｍ、又は０．２Ｍ～１０Ｍであり得る。濃度は、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、５１ｍＭ、５２ｍＭ、５３ｍＭ、５４ｍＭ、５５ｍＭ、５６ｍＭ、５７ｍＭ、５８ｍＭ、５９ｍＭ、６０ｍＭ、６１ｍＭ、６２ｍＭ、６３ｍＭ、６４ｍＭ、６５ｍＭ、６６ｍＭ、６７ｍＭ、６８ｍＭ、６９ｍＭ、７０ｍＭ、７１ｍＭ、７２ｍＭ、７３ｍＭ、７４ｍＭ、７５ｍＭ、７６ｍＭ、７７ｍＭ、７８ｍＭ、７９ｍＭ、８０ｍＭ、８１ｍＭ、８２ｍＭ、８３ｍＭ、８４ｍＭ、８５ｍＭ、８６ｍＭ、８７ｍＭ、８８ｍＭ、８９ｍＭ、９０ｍＭ、９１ｍＭ、９２ｍＭ、９３ｍＭ、９４ｍＭ、９５ｍＭ、９６ｍＭ、９７ｍＭ、９８ｍＭ、９９ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭ、７００ｍＭ、７５０ｍＭ、８００ｍＭ、８５０ｍＭ、９００ｍＭ、９５０ｍＭ、又は１Ｍであり得る。濃度は、約０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ、又は１０Ｍであり得る。例えば、緩衝液は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｍＭトリスであり得；緩衝液は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｍＭ酢酸塩であり得；緩衝液は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｍＭリン酸塩であり得る。

【0044】

各洗浄溶液は、独立に、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソベート（ｐｏｌｙｓｏｂａｔｅ）８０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＴＭＡＣ、尿素、カプリル酸ナトリウム、又はその混合物をさらに含むことができる。各洗浄溶液は、約１ｍＭ～１０Ｍの濃度の、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＣＨＡＰＳ、ＴＭＡＣ、尿素、カプリル酸ナトリウム、又はその混合物を含むことができる。濃度は、約１ｍＭ～５０ｍＭ、５ｍＭ～２５ｍＭ、又は２ｍＭ～３０ｍＭであり得る。濃度は、約０．１Ｍ～５Ｍ、０．５Ｍ～２．５Ｍ、又は０．２Ｍ～１０Ｍであり得る。濃度は、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、５１ｍＭ、５２ｍＭ、５３ｍＭ、５４ｍＭ、５５ｍＭ、５６ｍＭ、５７ｍＭ、５８ｍＭ、５９ｍＭ、６０ｍＭ、６１ｍＭ、６２ｍＭ、６３ｍＭ、６４ｍＭ、６５ｍＭ、６６ｍＭ、６７ｍＭ、６８ｍＭ、６９ｍＭ、７０ｍＭ、７１ｍＭ、７２ｍＭ、７３ｍＭ、７４ｍＭ、７５ｍＭ、７６ｍＭ、７７ｍＭ、７８ｍＭ、７９ｍＭ、８０ｍＭ、８１ｍＭ、８２ｍＭ、８３ｍＭ、８４ｍＭ、８５ｍＭ、８６ｍＭ、８７ｍＭ、８８ｍＭ、８９ｍＭ、９０ｍＭ、９１ｍＭ、９２ｍＭ、９３ｍＭ、９４ｍＭ、９５ｍＭ、９６ｍＭ、９７ｍＭ、９８ｍＭ、９９ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭ、７００ｍＭ、７５０ｍＭ、８００ｍＭ、８５０ｍＭ、９００ｍＭ、９５０ｍＭ、又は１Ｍであり得る。濃度は、約０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ、又は１０Ｍであり得る。

【0045】

各洗浄溶液は、独立に、約０．１％～３０％の濃度の、アルギニン、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＣＨＡＰＳ、ＴＭＡＣ、尿素、カプリル酸ナトリウム、又はその混合物を含むことができる。濃度は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は３０％であり得る。

【0046】

洗浄溶液のｐＨは、独立に、約４～約１０であり得る。ｐＨは、約５～約９、約６～約９、約７～約９、及び約８～約９であり得る。ｐＨは、約５、６、７、８、９、又は１０であり得る。ｐＨは、約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は１０．０であり得る。

【0047】

洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び０．５アルギニンを含むことができる。洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１５％プロピレングリコールを含むことができる。洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１％ポリソルベート８０を含むことができる。洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを含むことができる。洗浄溶液は、ｐＨ９の５ｍＭトリスを含むことができる。洗浄溶液は、ｐＨ５の５ｍＭ酢酸塩を含むことができる。洗浄溶液は、ｐＨ５の、２５ｍＭ酢酸塩及び１Ｍ ＮａＣｌを含むことができる。洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１％ ＣＨＡＰＳを含むことができる。洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び０．５ ＴＭＡＣを含むことができる。洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１Ｍ尿素を含むことができる。洗浄溶液は、ｐＨ９の、２５ｍＭ及び５０ｍＭカプリル酸ナトリウムを含むことができる。

【実施例】

【0048】

実施例１－３回洗浄方法を使用するＣＡＥＬ－１０１精製
図１に概要を示した方法を使用して、ＣＡＥＬ－１０１抗体（軽鎖線維反応性モノクローナル抗体）を調製した。各ステップでのＨＣＰ混入を、図３及び４に概要を示した通りに測定した。精製プロセス中、生成物の品質を改善するために、プロテインＡクロマトグラフィーステップに第２の洗浄を導入した。１１種の異なる洗浄溶液を試験した：
１． ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び０．５アルギニン；
２． ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１５％プロピレングリコール；
３． ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１％ポリソルベート８０；
４． ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び２０ｍＭ ＥＤＴＡ；
５． ｐＨ９．０の、５ｍＭトリス；
６． ｐＨ５の、５ｍＭトリス；
７． ｐＨ５の、２５ｍＭ酢酸塩及び１Ｍ ＮａＣｌ；
８． ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１％ ＣＨＡＰＳ；
９． ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び０．５ ＴＭＡＣ；
１０． ｐＨ９の、２５ｍＭトリス及び１Ｍ尿素；及び
１１． ｐＨ９の、２５ｍＭ及び５０ｍＭカプリル酸ナトリウム。

【0049】

第１の洗浄溶液（図３及び４、「洗浄１」）は、ｐＨ７．２の、２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含んでおり、第３の洗浄溶液（図３及び４、「洗浄３」）は、ｐＨ６．５の、２０ｍＭ酢酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含んでいた。

【0050】

１１種の実験用第２洗浄溶液と、２０ｍＭリン酸塩、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を含む対照洗浄溶液との間で、プロセス性能の結果を測定した。

【0051】

【表1】

【0052】

１１種の実験用第２洗浄溶液及び対照溶液（３連で試験）はすべて、ほとんど同一の溶出濃度、溶出体積、及び回収率を示した。これは、第２洗浄溶液はいずれも、抗体の潜在的回収率に不都合な影響を与えなかったことを示唆する。

【0053】

１１種の実験用第２洗浄溶液及び対照溶液を、ＨＣＰ混入の量、回収率、及び回収物による対数減少値（ＬＲＶ）について試験した。

【0054】

【表2】

【0055】

表２のＨＣＰ結果を、図５にも示す。

【0056】

本発明者らは、驚いたことに、第２洗浄溶液として、（すべてｐＨ９．０の）２５ｍＭトリス及び０．５Ｍアルギニン、２５ｍＭトリス及び０．５Ｍ ＴＭＡＣ、２５ｍＭトリス及び５０ｍＭカプリル酸ナトリウム、２５ｍＭトリス及び１％ ＣＨＡＰＳ、２５ｍＭトリス及び１％ ＰＳ８０、２５ｍＭトリス及び１Ｍ尿素、又は２５ｍＭトリス及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを使用することが、ＨＣＰクリアランスを、対照に対して少なくとも２倍高めることを発見した。本発明者らはまた、驚いたことに、（すべてｐＨ９．０の）２５ｍＭトリス及び０．５Ｍアルギニン、２５ｍＭトリス及び０．５Ｍ ＴＭＡＣ、又は２５ｍＭトリス及び５０ｍＭカプリル酸ナトリウムを使用することが、ＨＣＰクリアランスを、対照に対して少なくとも５倍高めることを発見した。本発明者らは、驚いたことに、これらの第２洗浄溶液を使用することが、追加の単位コストをかけずに、抗体精製プロセスにＨＣＰ頑強性をもたらすことができることを発見した。

【0057】

この明細書に引用したすべての参考文献を、それぞれの参考文献が、あたかも具体的且つ個々に参照によって組み込まれることが示されるがごとく、参照によって本明細書に組み込む。あらゆる参考文献の引用は、出願日よりも前のその開示に関するものであり、本開示が、先行発明という理由でこうした参考文献に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されるべきでない。

【0058】

上に記載した要素のそれぞれ、又は２つ以上は、共に、上に記載した型とは異なる他の型の方法においても、有用に適用することができることが理解されよう。さらに分析しなくとも、前述のものは、本開示の主旨を十分に明らかにすることとなるので、他の人は、現在の知識を適用することによって、添付の特許請求の範囲に記述されるこの開示の包括的又は特定の態様の基本的特性をかなり構成する、従来の技術の見地からの特徴を省かずに、これを様々な用途に容易に適用することができる。前述の実施形態は、例として示されるに過ぎず；本開示の範囲は、次の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】