特表 2023-523345 モジュール官能基を有する核酸ナノ粒子を含有する組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-02

(54)【発明の名称】モジュール官能基を有する核酸ナノ粒子を含有する組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/88 20060101AFI20230526BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230526BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230526BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20230526BHJP

   C12N 15/115 20100101ALI20230526BHJP

   C07K 17/02 20060101ALI20230526BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230526BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230526BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230526BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20230526BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20230526BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20230526BHJP

   A61K 47/56 20170101ALI20230526BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20230526BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230526BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20230526BHJP

【ＦＩ】

C12N15/88 Z ZNA

C12N15/09 110

C12N15/113 Z

C12N15/11 Z

C12N15/115 Z

C07K17/02

C07K16/00

A61K48/00

A61K31/7088

A61K31/7125

A61K47/54

A61K47/55

A61K47/56

A61K47/62

A61K47/68

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022565867

(86)(22)【出願日】2021-04-27

(85)【翻訳文提出日】2022-12-22

(86)【国際出願番号】 IB2021000284

(87)【国際公開番号】W WO2021220053

(87)【国際公開日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】63/015,735

(32)【優先日】2020-04-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522420513

【氏名又は名称】シックスフォールド バイオサイエンス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100107489

【弁理士】

【氏名又は名称】大塩 竹志

(72)【発明者】

【氏名】ラッシュワース， ジェイムズ ルーク

(72)【発明者】

【氏名】フット， ジョージ ウィリアム

(72)【発明者】

【氏名】ロッセル， アンナ ペルドリックス

(72)【発明者】

【氏名】ブルゾスコ， ズザンナ アレクサンドラ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA31

4C076AA95

4C076CC27

4C076EE59

4C076FF34

4C084AA13

4C084MA41

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB26

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA13

4C086ZB26

4H045AA10

4H045AA11

4H045BA54

4H045BA55

4H045BA60

4H045DA76

(57)【要約】

本発明は、対象の体内におけるカーゴ分子の機能を改善する要素に結合したカーゴ分子を含有する組成物を提供する。組成物は、治療目的および診断目的に有用である。さらに、本発明は、これらの組成物を生成することができる；コア分子を、生体直交型クリックケミストリーを介して、モジュール特性を付与するような方法で、官能化することができる方法を概説する。この官能化は、同時に、生物学的に関連するカーゴの搭載を可能にし、分子の全体的な構造に安定化をもたらす。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１またはそれを超えるカーゴ分子に共有結合的に連結したオリゴヌクレオチド
を含む組成物。

【請求項2】

コンジュゲーションを可能にする反応性部位で官能化されており；
核酸ナノ粒子に組み立てられている、
オリゴヌクレオチドを含む組成物。

【請求項3】

前記核酸ナノ粒子がカーゴ分子に結合しており、前記核酸ナノ粒子が、対象における前記カーゴ分子の生物学的活性を促進するように官能化されている、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記核酸ナノ粒子が、三量体、四量体、五量体または六量体である、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

以下の特徴の少なくとも１つを含む少なくとも１つの反応を介して、核酸ナノ粒子を少なくとも１つのカーゴ分子に結合させるステップを含む方法：
前記反応が１つのポットで行われる；
前記反応が水によって妨害されない；
前記反応が最小限の副産物を生成する；および
前記反応が単一反応生成物を与える高い熱力学的駆動力を含む。

【請求項6】

前記特徴の少なくとも１つを含む第１の反応を介して第１のカーゴ分子を結合させるステップと；
前記特徴の少なくとも１つを含む第２の反応を介して第２のカーゴ分子を結合させるステップと、
を含み、
前記第１の反応と前記第２の反応とが直交性である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記第１の反応が、前記核酸ナノ粒子中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの鎖に対する修飾を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記核酸ナノ粒子が、銅（Ｉ）アジド－アルキン付加環化を介して前記第１のカーゴ分子に結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記核酸ナノ粒子が、歪み促進型アジド－アルキン付加環化を介して前記第１のカーゴ分子に結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記核酸ナノ粒子が、逆電子要請型ディールスアルダー反応を介して前記第１のカーゴ分子に結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記核酸ナノ粒子が、ジスルフィド結合を介して前記第１のカーゴ分子に結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項12】

前記核酸ナノ粒子が、硫黄（ＶＩ）フッ化物交換を介して前記第１のカーゴ分子に結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項13】

前記核酸ナノ粒子が、ヒドラゾン形成を介して前記第１のカーゴ分子に結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項14】

前記核酸ナノ粒子が、チオール－エンラジカル付加を介して前記第１のカーゴ分子に結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項15】

前記核酸ナノ粒子が、チオール－イン反応を介して前記第１のカーゴ分子に結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項16】

前記核酸ナノ粒子が、チオール－マイケル付加を介して前記第１のカーゴ分子に結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項17】

前記核酸ナノ粒子が、チオール－イソシアネートケミストリーを介して前記第１のカーゴ分子に結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項18】

前記核酸ナノ粒子が、チオール－エポキシドケミストリーを介して前記第１のカーゴ分子に結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項19】

前記核酸ナノ粒子が、求核開環反応を介して前記第１のカーゴ分子に結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項20】

前記核酸ナノ粒子が、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションを介して前記第１のカーゴ分子に結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項21】

前記オリゴヌクレオチドの５’、３’または内部位置（ヌクレオチド上の任意の所与の位置）が、これらの方法を介して概説される共有結合の形成を可能にする官能基で修飾される、請求項８から２０に記載の方法。これらの結合は、それだけに限らないが、ＡＤＩＢＯ－ＰＥＧ４、Ｎ－［（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルオキシカルボニル］－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）４－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）１２－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）２４－アミド－ＤＢＣＯ、ジベンゾシクロオクチン－酸、ジベンゾシクロオクチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－酸、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－アルコール、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）メタンアミン塩酸塩、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エノール、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エニル２，５－ジオキソ－１－ピロリジニルカーボネート、２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタノエート、５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタン酸、５－ノルボルネン－２－酢酸スクシンイミジルエステル、５－ノルボルネン－２－エンド－酢酸、メチルテトラジン－ＮＨＳエステル、メチルテトラジン－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル、ＴＣＯ ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル、ＴＣＯ－アミン、テトラジン－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステル、
アルキン－ＰＥＧ５－酸、（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－（ｂｏｃ－アミノ）－５－ヘキシン酸、Ｎ－ｂｏｃ－４－ペンチン－１－アミン、ｂｏｃ－プロパルギル－Ｇｌｙ－ＯＨ、３－エチニルアニリン、４－エチニルアニリン、プロパルギルアミン塩酸塩、プロパルギルクロロホルメート、プロパルギル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、プロパルギル－ＰＥＧ２－酸、３－（４－アジドフェニル）プロピオン酸、３－アジド－１－プロパンアミン、３－アジド－１－プロパノール、４－カルボキシベンゼンスルホンアジド、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ペンタエチレングリコール、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）酸（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－アミン（式中、ｎは７、１１、２３、３５であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）ＮＨＳエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－ＴＦＰエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４、３６であり得る）、２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エタノール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ－［２－（ジグリコリル－アミノ）エチル］ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－トリエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－ウンデカエチレングリコール、１７－アジド－３，６，９，１２，１５－ペンタオキサヘプタデカン－１－アミン、１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデカン酸、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）アジド（式中、ｎは３、１１、２３であり得る）およびその組み合わせからなる群の化学部分で修飾された任意のオリゴヌクレオチドまたはカーゴ分子とカップリング反応を行うことによって形成され得る。

【請求項22】

前記核酸ナノ粒子が、刺激に応答性のリンカーを介して前記第１のカーゴに結合される、請求項７に記載の方法。

【請求項23】

前記刺激が、ｐＨ、光、温度、還元電位または酸素濃度からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記核酸ナノ粒子が共有結合的に安定化される、請求項７に記載の方法。

【請求項25】

ｏ－フタルアルデヒドと複合体化してイソインドールを生成する核酸
を含む組成物。

【請求項26】

アミンおよびチオール反応性部位で官能化されたオリゴヌクレオチドと；
これらの官能化オリゴヌクレオチドを自己組織化した核酸ナノ粒子と
を含む組成物。

【請求項27】

アミンおよびチオールが、オルト－フタルアルデヒドと同時に反応して、蛍光イソインドールを生成する、請求項２６に記載の組成物。

【請求項28】

前記蛍光部分がさらなるフルオロフォアにコンジュゲートされている、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

請求項７に概説されるように、前記核酸ナノ粒子が直交型クリックケミストリーを介してカーゴにコンジュゲートされている、請求項２６に記載の組成物。

【請求項30】

外部作用剤と複合体化してフルオロフォアを形成する反応性部分を含む核酸二本鎖を含む核酸ナノ粒子
を含む組成物。

【請求項31】

アミンおよびチオールが、オルト－フタルアルデヒドと同時に反応し、前記フルオロフォアが蛍光イソインドールである、請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

前記フルオロフォアがさらなるフルオロフォアにコンジュゲートされている、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

前記核酸ナノ粒子が直交型クリックケミストリーを介してカーゴ分子にコンジュゲートされている、請求項３０に記載の組成物。

【請求項34】

前記核酸ナノ粒子が、
疎水性部分と、
親水性部分と、
ヌクレオチド結合部分と
を含む成分を含む、請求項３に記載の組成物。

【請求項35】

前記疎水性部分および親水性部分が、前記核酸ナノ粒子に共有結合的に付着している、請求項３４に記載の組成物。

【請求項36】

前記疎水性部分および親水性部分が、アミド、アミン、またはエーテル結合を介して前記核酸に共有結合的に付着している、請求項３４に記載の組成物。

【請求項37】

前記親水性部分がアミンを含む、請求項３６に記載の組成物。

【請求項38】

前記親水性部分が、スペルミン、エチレンジアミン、メチルエチレンジアミン、エチルエチレンジアミン、イミダゾール、スペルミン－イミダゾール－４－イミン、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－グアニジニルエチレンイミン、ジメチルアミノエチルアクリレート、アミノビニルエーテル、４－イミダゾール酢酸、ジエチルアミノプロピルアミド、スルホンアミド（例えば、スルファジメトキシン スルファメトキサゾール、スルファジアジン、スルファメタジン）、アミノケタール、Ｎ－２－ヒドロキシルプロピルチメチルアンモニウムクロリド、イミダゾール－４－イミン、メチル－イミダゾール、２－（アミノメチル）イミダゾール、４－（アミノメチル）イミダゾール、４（５）－（ヒドロキシメチル）イミダゾール、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（（２－アミノエチル）（メチル）アミノ）プロパンアミド、２－（２－エトキシエトキシ）エタン－１－アミン、ビス（３－アミノプロピル）アミン、［Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシ］エチル、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（（２－アミノエチル）（エチル）アミノ）プロパンアミド、（Ｎ－（アミノエチル）カルバモイル）メチル、Ｎ－（２－（（２－アミノエチル）アミノ）エチル）アセトアミド３，３’－（（２－アミノエチル）アザンジイル）ビス（Ｎ－（２－アミノエチル）プロパンアミド）、グアニジルベンジルアミド、［３－（グアニジニウム）プロピル］、ジメチルエタノールアミン、１－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルメタンアミン、２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン、Ｎ－（２－（（２－（２－アミノエトキシ）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）アセトアミド、アミノブチル、アミノエチル、１－（２－アミノエチル）－３－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）－２－エチルグアニジン、１－（３－アミノ－３－オキソプロピル）－２，４，６－トリメチルピリジン－１－イウム、１－（１，３－ビス（カルボキシオキシ）プロパン－２－イル）－２，４，６－トリメチルピリジン－１－イウム、グアニジニルエチルアミン、エーテルヒドロキシルトリアゾール、およびβ－アミノエステルからなる群から選択される、請求項３７に記載の組成物。

【請求項39】

前記ヌクレオチドが、２－（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）エタン－１－オール、Ｎ－ブチル－２－ヒドロキシアセトアミド、（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）メタノール、アミノ（（２－（２－ヒドロキシアセトアミド）エチル）アミノ）メタンイミニウムおよび１－（２－（２－ヒドロキシアセトアミド）エチル）－２，４，６－トリメチルピリジン－１－イウムからなる群から選択される部分で官能化されている、請求項３６に記載の組成物。

【請求項40】

前記ヌクレオチド結合部分がシステインである、請求項３６に記載の組成物。

【請求項41】

前記核酸ナノ粒子が、受容体に依存しない方法で前記カーゴ分子のエンドソーム脱出を促進する、請求項３４に記載の組成物。

【請求項42】

前記核酸ナノ粒子が、細胞内の受容体に結合する成分を含む、請求項３４に記載の組成物。

【請求項43】

前記成分が、葉酸、ＴｆＲ－Ｔ１２、およびヘマグルチニンペプチドからなる群から選択される成分を含む、請求項３４に記載の組成物。

【請求項44】

前記カーゴ分子が、リソソーム内で切断され得るリンカーを介して前記核酸ナノ粒子に結合している、請求項３４に記載の組成物。

【請求項45】

前記カーゴ分子がカテプシンＢ切断可能リンカーに結合している、請求項３４に記載の組成物。

【請求項46】

前記カーゴ分子がプロテアーゼ切断可能リンカーに結合している、請求項３４に記載の組成物。

【請求項47】

前記カーゴ分子がピロリン酸ジエステルに結合している、請求項３４に記載の組成物。

【請求項48】

アルコール系求核試薬によるアンヒドロウリジンの処理を含む、２’－Ｏ置換ヌクレオシドを合成するための方法。

【請求項49】

前記処理が、バリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド、２－ｔｅｒｔ－ブチルイミノ－２－ジエチルアミノ－１，３－ジメチル－ペルヒドロ－１，３，２－ジアザホスホリン、ｎ－ブチルリチウム、ｓｅｃ－ブチルリチウム、ｔｅｒｔ－ブチルリチウム、ｄａｂｃｏ（登録商標）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルメチルアミン、ジメチルアミン、４－（ジメチルアミノ）ピリジン、エチルアミン、Ｎ－エチルジイソプロピルアミン、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド、リチウムｔｅｒｔ－ブトキシド、リチウムジシクロヘキシルアミド、リチウムジエチルアミド、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムジメチルアミド、リチウムエトキシド、リチウムイソプロポキシド、リチウムメトキシド、リチウム２，２，６，６－テトラメチルピペリジド、マグネシウムビス（ヘキサメチルジシラジド）、メチルアミン、メチルリチウム、モルホリン、ピペリジン、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、カリウムエトキシド、カリウムメトキシド、トリエチルアミンからなる群から選択される塩基を含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記処理が、臭化アルミニウム、塩化アルミニウム、アルミニウムイソプロポキシド、三塩化ホウ素（およびその様々な錯体）、三フッ化ホウ素（およびその様々な錯体）、ジシクロヘキシルボロン、臭化鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、モンモリロナイトＫ１０＆Ｋ３０、塩化スズ（ＩＶ）、塩化チタン（ＩＶ）、チタン（ＩＶ）イソプロポキシド、四塩化チタンからなる群から選択される塩基を含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項51】

カーゴ分子と；前記カーゴ分子に結合した核酸ナノ粒子であって、対象における前記カーゴ分子の生物学的活性を促進するように官能化されている核酸ナノ粒子と
を含む、組成物。

【請求項52】

前記核酸ナノ粒子が、細胞への内部移行を促進するように官能化されている、請求項５１に記載の組成物。

【請求項53】

前記カーゴ分子が、細胞への内部移行を促進するように官能化されている、請求項５１に記載の組成物。

【請求項54】

前記カーゴ分子が、前記細胞の脂質二重層を通した浸透を促進するアンカーコレステロール分子である、請求項５３に記載の組成物。

【請求項55】

前記官能化が、クラスリン媒介エンドサイトーシス、非クラスリン／非カベオラエンドサイトーシス、カベオラ媒介エンドサイトーシス、受動拡散、単純拡散、促進拡散、トランスサイトーシス、マクロピノサイトーシス、食作用、受容体媒介エンドサイトーシス、受容体拡散、小胞媒介輸送、能動輸送を介して前記細胞への内部移行を促進する、請求項５１に記載の組成物。

【請求項56】

前記核酸ナノ粒子が、エンドソーム、リソソーム、ピノソーム、またはファゴソームを介して前記細胞に侵入するか、またはプロセシングされ得る、請求項５５に記載の組成物。

【請求項57】

前記核酸ナノ粒子が、生体膜を横切って前記細胞に侵入し得る、請求項５６に記載の組成物。

【請求項58】

前記官能化が、前記細胞の細胞質、核、ミトコンドリアまたは他の細胞区画において効果を発揮し得る、請求項５５に記載の組成物。

【請求項59】

前記カーゴ分子が、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ペプチド、タンパク質、抗体および治療用低分子からなる群から選択される、請求項５１に記載の組成物。

【請求項60】

細胞傷害性ヌクレオチドがオリゴヌクレオチド骨格に組み込まれている、請求項５１記載の組成物。

【請求項61】

前記細胞傷害性ヌクレオチドが、アリストマイシン、ネオプラノシンＡ、リバビリン、ピラゾフリン、シタラビンアラビノシド（ａｒａ－Ｃ）、ゲムシタビン、クラドリビン（２－ＣｄＡ）、ショードマイシン、エラシタラビンからなる群から選択される、請求項６０に記載の組成物。

【請求項62】

リン酸プロドラッグが核酸骨格に組み込まれている、請求項６０に記載の組成物。

【請求項63】

前記リン酸プロドラッグが、９－［２－（ホスホノメトキシ）エチル］アデニンのビス（Ｓ－アシル－２－チオエチル）エステル誘導体、シクロＳａｌプロヌクレオチド、ＨｅｐＤｉｒｅｃｔプロドラッグまたはオクタデシルオキシエチル－シドホビルである、請求項６２に記載の組成物。

【請求項64】

前記オリゴヌクレオチドが核酸ナノ粒子に組み立てられている、請求項６０に記載の組成物。

【請求項65】

共有結合的に連結している２またはそれを超えるカーゴ分子を含む組成物。

【請求項66】

前記カーゴ分子の鎖が一般式

【化22】

（式中、
Ｃ１およびＣ２はカーゴ分子であり；
ｒは生体直交型反応の生成物として形成されるバイオコンジュゲーション結合であり；
Ｌは直鎖リンカーまたは分岐リンカーのいずれかであり；
ｋは０または１であり；
ｍは１または１より大きい任意の正の整数であり；
ｎは１または１より大きい任意の正の整数であり；
ｍ＞１、またはｎ＞１、またはｍ＞１とｎ＞１の両方の場合、以下が適用される：
（ｉ）各ｒは、同じであるか、または少なくとも２つの異なるバイオコンジュゲーション結合の混合物であり；
（ｉｉ）各Ｌは、同じであるか、または少なくとも２つの異なるリンカー分子の混合物であり；
（ｉｉｉ）各Ｃ２は、同じであるか、または少なくとも２つの異なるカーゴ分子の混合物である）
を有する、請求項６５に記載の組成物。

【請求項67】

前記カーゴ分子の少なくとも１つが生物学的機能を有する、請求項６６に記載の組成物。

【請求項68】

１またはそれを超えるカーゴ分子が、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、アルカロイド、ポリケチド、テトラピロール、テルペン／テルペノイド、フェニルプロパノイド、医薬化合物またはその組み合わせである、請求項６７に記載の組成物。

【請求項69】

前記カーゴ分子の少なくとも１つが、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、抗体、抗体断片、抗体模倣物、レクチン、脂質、ビタミン、ベンズアミド、低分子、またはその組み合わせである、請求項６７に記載の組成物。

【請求項70】

前記カーゴ分子の少なくとも２つが、（ｄＴ）ｎ、（ｄＡ）ｎ、ｄ（Ｃ）ｎ、ｄ（Ｇ）ｎ、（ｒＵ）ｎ、（ｒＡ）ｎ、（ｒＣ）ｎ、（ｒＧ）ｎ、またはその組み合わせ（式中、ｎは１～５０の任意の正の整数である）からなる群のオリゴヌクレオチドスペーサーを介して連結されたｓｉＲＮＡである、請求項６９に記載の組成物。

【請求項71】

前記２またはそれを超えるｓｉＲＮＡが、５’→５’、３’→３’または５’→３’方向に互いに結合している、請求項７０に記載の組成物。

【請求項72】

前記カーゴ分子の少なくとも１つが、肝細胞によって発現されるアシアロ糖タンパク質受容体を標的とし、１またはそれを超える標的化部分が、一価、二価、または三価分岐リンカーを介して連結されているＮ－アセチルガラクトサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン誘導体を含む、請求項６７に記載の組成物。

【請求項73】

前記少なくとも１つのＮ－アセチルガラクトサミン部分が、固相合成中または合成後にオリゴヌクレオチドカーゴ分子に結合され、前記結合が、前記オリゴヌクレオチドカーゴ分子の５’末端、３’末端または１またはそれを超える連続する内部位置で起こる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項74】

前記カーゴ分子の１またはそれより多くが、以下の脂質の少なくとも１つを含む、請求項６９に記載の組成物：
（ｉ）コレステロールまたはその誘導体；
（ｉｉ）リン脂質；
（ｉｉｉ）必要に応じて第四級アンモニウムイオンを含むカチオン性脂質；
（ｉｖ）必要に応じてリン酸基を含むアニオン性脂質；および
（ｖ）イオン化可能な脂質；および
（ｖｉ）分岐脂質。

【請求項75】

前記カーゴ分子の少なくとも１つが、切断可能リンカーによってさらなるカーゴ分子に連結されている、請求項６６に記載の組成物。

【請求項76】

前記カーゴ分子の少なくとも１つが、ジチオビスマレイミドエタンおよび１，４－ビス［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタンを含むチオール切断可能リンカーによってさらなるカーゴ分子に連結されている、請求項７５に記載の組成物。

【請求項77】

前記カーゴ分子の少なくとも１つが、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）を含むヒドロキシルアミン切断可能リンカーによってさらなるカーゴ分子に連結されている、請求項７５に記載の組成物。

【請求項78】

前記カーゴ分子の少なくとも１つが、ビス［２－（Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニルオキシ）エチル］スルホンを含む塩基切断可能リンカーによってさらなるカーゴ分子に連結されている、請求項７５に記載の組成物。

【請求項79】

前記カーゴ分子の少なくとも１つが、５－（ビス（メチルチオ）メチレン）－２，２－ジメチル－１，３－ジオキサン－４，６－ジオンを含むメルドラム酸誘導体によってさらなるカーゴ分子に連結されている、請求項７５に記載の組成物。

【請求項80】

前記カーゴ分子の少なくとも１つが、共有結合を介してさらなるカーゴ分子に連結されている、請求項６６に記載の組成物。

【請求項81】

前記カーゴ分子の少なくとも１つが、ダイサー基質によってさらなるカーゴ分子に連結されている、請求項６６に記載の組成物。

【請求項82】

前記カーゴ分子の少なくとも１つが、１，８－ビスマレイミド－ジエチレングリコール、１，１１－ビスマレイミド－トリエチレングリコール、１，４－ビスマレイミドブタン、ビスマレイミドヘキサン、ビスマレイミドエタン、トリス（２－マレイミドエチル）アミン）、Ｎ－α－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、Ｎ－β－マレイミドプロピルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸、Ｎ－γ－マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）、スクシンイミジル６－（３（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジルヨードアセテート、スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート、ＰＥＧ化された長鎖ＳＭＣＣ架橋剤、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレートおよびスルホ－ＮＨＳ等価物）、ｐ－マレイミドフェニルイソシアネートからなる群から選択されるリンカーによってさらなるカーゴ分子に連結されている、請求項６６に記載の組成物。

【請求項83】

前記カーゴ分子の少なくとも１つが、ＣｕＡＡＣ、ＳＰＡＡＣ、ＲｕＡＡＣ、ＩＥＤＤＡ、ＳｕＦＥｘ、ＳＰＡＮＣ、ヒドラゾン／オキシムエーテル形成、チオール－エンラジカル反応、チオール－インラジカル反応、チオール－マイケル付加反応、チオール－イソシアネート反応、チオール－エポキシドクリック反応、求核開環反応（バネ荷重反応）、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションからなる群から選択される反応を介してさらなるカーゴ分子に連結されている、請求項６６に記載の組成物。これらの結合は、それだけに限らないが、ＡＤＩＢＯ－ＰＥＧ４、Ｎ－［（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルオキシカルボニル］－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）４－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）１２－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）２４－アミド－ＤＢＣＯ、ジベンゾシクロオクチン－酸、ジベンゾシクロオクチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－酸、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－アルコール、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）メタンアミン塩酸塩、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エノール、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エニル２，５－ジオキソ－１－ピロリジニルカーボネート、２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタノエート、５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタン酸、５－ノルボルネン－２－酢酸スクシンイミジルエステル、５－ノルボルネン－２－エンド－酢酸、メチルテトラジン－ＮＨＳエステル、メチルテトラジン－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル、ＴＣＯ ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル、ＴＣＯ－アミン、テトラジン－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステル、
アルキン－ＰＥＧ５－酸、（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－（ｂｏｃ－アミノ）－５－ヘキシン酸、Ｎ－ｂｏｃ－４－ペンチン－１－アミン、ｂｏｃ－プロパルギル－Ｇｌｙ－ＯＨ、３－エチニルアニリン、４－エチニルアニリン、プロパルギルアミン塩酸塩、プロパルギルクロロホルメート、プロパルギル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、プロパルギル－ＰＥＧ２－酸、３－（４－アジドフェニル）プロピオン酸、３－アジド－１－プロパンアミン、３－アジド－１－プロパノール、４－カルボキシベンゼンスルホンアジド、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ペンタエチレングリコール、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）酸（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－アミン（式中、ｎは７、１１、２３、３５であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）ＮＨＳエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－ＴＦＰエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４、３６であり得る）、２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エタノール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ－［２－（ジグリコリル－アミノ）エチル］ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－トリエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－ウンデカエチレングリコール、１７－アジド－３，６，９，１２，１５－ペンタオキサヘプタデカン－１－アミン、１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデカン酸、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）アジド（式中、ｎは３、１１、２３であり得る）およびその組み合わせからなる群の化学部分で修飾された任意のカーゴ分子とカップリング反応を行うことによって形成され得る。

【請求項84】

前記カーゴ分子の鎖が、
核酸ナノ粒子にコンジュゲートしており、前記コンジュゲートが

【化23】

（式中、
ＰはＲＮＡナノ粒子であり；
ｒは生体直交型コンジュゲーション反応の生成物として形成されるバイオコンジュゲーション結合であり；
Ｌ１およびＬ２は直鎖または分岐リンカー分子のいずれかであり；
ｊは０または１であり；
Ｃ１およびＣ２はカーゴ分子であり；
ｋは１または１より大きい任意の正の整数であり；
ｌは０または１であり；
ｍは１または１より大きい任意の正の整数であり；
ｎは１または１より大きい任意の正の整数であり；
ｑは１または１より大きい任意の正の整数であり；
ｋ＞１またはｍ＞１またはｎ＞１またはｑ＞１のいずれかまたはその組み合わせである場合、以下が適用される：
（ｉ）ｒは、同じであるか、または少なくとも２つの異なるバイオコンジュゲーション結合の混合物であり；
（ｉｉ）Ｌ１は、同じであるか、または少なくとも２つの異なるリンカー分子の混合物であり；
（ｉｉｉ）Ｌ２は、同じであるか、または少なくとも２つの異なるリンカー分子の混合物であり；
（ｉｖ）Ｌ１およびＬ２は、同じまたは異なるリンカー分子であり；
（ｖ）Ｃ１は、同じであるか、または少なくとも２つの異なるカーゴ分子の混合物であり；
（ｖｉ）Ｃ２は、同じであるか、または少なくとも２つの異なるカーゴ分子の混合物であり；
（ｖｉｉ）Ｃ１およびＣ２は、同じまたは異なるリンカー分子である）
の一般式構造を有する、請求項６５に記載の組成物。

【請求項85】

少なくとも２つのカーゴ分子と；
前記少なくとも２つのカーゴ分子の各々に結合した核酸ナノ粒子と
を含む組成物。

【請求項86】

前記少なくとも２つのカーゴ分子の各々が生物学的機能を有する、請求項８６に記載の組成物。

【請求項87】

前記少なくとも２つのカーゴ分子の各々が、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ペプチド、タンパク質、抗体および治療用低分子からなる群から選択される、請求項８６に記載の組成物。

【請求項88】

前記少なくとも２つのカーゴ分子の２つ以上が同じ核酸ナノ粒子にコンジュゲートされている、請求項８５に記載の組成物。

【請求項89】

前記少なくとも２つのカーゴ分子の前記２つ以上が異なる、請求項８５に記載の組成物。

【請求項90】

前記２つ以上のカーゴ分子が同じである、請求項８５に記載の組成物。

【請求項91】

前記異なるカーゴ分子が等しくない量で前記ナノ粒子にコンジュゲートされている、請求項８９に記載の組成物。

【請求項92】

前記少なくとも２つのカーゴ分子が安定な共有結合を介してコンジュゲートされている、請求項８６に記載の組成物。

【請求項93】

前記少なくとも２つの分子が安定な共有結合を介して刺激応答性リンカーにコンジュゲートされている、請求項８６に記載の組成物。

【請求項94】

前記カーゴ分子の少なくとも１つが、ＣｕＡＡＣ、ＳＰＡＡＣ、ＲｕＡＡＣ、ＩＥＤＤＡ、ＳｕＦＥｘ、ＳＰＡＮＣ、ヒドラゾン／オキシムエーテル形成、チオール－エンラジカル反応、チオール－インラジカル反応、チオール－マイケル付加反応、チオール－イソシアネート反応、チオール－エポキシドクリック反応、求核開環反応（バネ荷重反応）、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションからなる群から選択される反応を介してさらなるカーゴ分子に連結されている、請求項９２に記載の組成物。これらの結合は、それだけに限らないが、ＡＤＩＢＯ－ＰＥＧ４、Ｎ－［（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルオキシカルボニル］－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）４－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）１２－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）２４－アミド－ＤＢＣＯ、ジベンゾシクロオクチン－酸、ジベンゾシクロオクチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－酸、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－アルコール、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）メタンアミン塩酸塩、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エノール、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エニル２，５－ジオキソ－１－ピロリジニルカーボネート、２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタノエート、５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタン酸、５－ノルボルネン－２－酢酸スクシンイミジルエステル、５－ノルボルネン－２－エンド－酢酸、メチルテトラジン－ＮＨＳエステル、メチルテトラジン－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル、ＴＣＯ ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル、ＴＣＯ－アミン、テトラジン－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステル、
アルキン－ＰＥＧ５－酸、（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－（ｂｏｃ－アミノ）－５－ヘキシン酸、Ｎ－ｂｏｃ－４－ペンチン－１－アミン、ｂｏｃ－プロパルギル－Ｇｌｙ－ＯＨ、３－エチニルアニリン、４－エチニルアニリン、プロパルギルアミン塩酸塩、プロパルギルクロロホルメート、プロパルギル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、プロパルギル－ＰＥＧ２－酸、３－（４－アジドフェニル）プロピオン酸、３－アジド－１－プロパンアミン、３－アジド－１－プロパノール、４－カルボキシベンゼンスルホンアジド、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ペンタエチレングリコール、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）酸（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－アミン（式中、ｎは７、１１、２３、３５であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）ＮＨＳエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－ＴＦＰエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４、３６であり得る）、２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エタノール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ－［２－（ジグリコリル－アミノ）エチル］ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－トリエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－ウンデカエチレングリコール、１７－アジド－３，６，９，１２，１５－ペンタオキサヘプタデカン－１－アミン、１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデカン酸、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）アジド（式中、ｎは３、１１、２３であり得る）およびその組み合わせからなる群の化学部分で修飾された任意のカーゴ分子とカップリング反応を行うことによって形成され得る。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その内容が参照により組み込まれる、２０２０年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０１５，７３５号の利益および優先権を主張する。

【0002】

発明の分野
本発明は、一般に、カーゴを送達するための核酸ナノ粒子を含む治療用組成物および同組成物を使用する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
過去１０年間で、広範囲の疾患に対する治療薬（例えば、がんを処置するための抗新生物剤）を送達するためのビヒクルとしての核酸ナノ粒子の開発に多くの努力が集中してきた。しかしながら、核酸ナノ粒子に基づく治療は、まだ克服されていない様々な問題に悩まされている。多くの有望な治療薬は、体内の正しい細胞に無傷で送達され、それらの細胞によって内部移行され、次いで、特定の細胞内部位に輸送される必要がある生物学的高分子であり、核酸ナノ粒子はしばしばそれらの機能の１またはそれより多くを実施することができない。さらに、現在の初期段階のオリゴヌクレオチドに基づく治療は、所与の適応症に対して特異的に設計されている。ナノ粒子の設計を変更する場合、安定性、合成の容易さ、および生物学的環境におけるその潜在的な挙動などの様々な因子を考慮する必要がある。したがって、ナノ粒子の設計を連続的に変更することは現実的ではない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

概要
本発明は、いくつかの異なる種類の結合を介して１またはそれを超えるカーゴに連結されたナノ粒子、例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ）ナノ粒子を使用して、がん細胞などの標的化細胞にカーゴを送達するための組成物を提供する。ＲＮＡナノ粒子などの核酸ナノ粒子は、体内の標的細胞にカーゴを送達するための構造足場としての、ならびに標的への経路中のカーゴの活性を保存し、到着するとその活性を促進する、および／またはオフターゲット部位でのその活性を阻害する機能的調節因子としての両方の役割を果たす。

【0005】

本発明の組成物は、がんを含む様々な障害を処置するのに有用である。作用機序の例としては、ｍＲＮＡの分解、ＤＮＡ複製の遮断、アポトーシスの促進、および免疫系による破壊のための細胞のタグ付けが挙げられる。本発明の組成物は、薬剤の活性が標的化細胞において誘発されるが他の細胞では遮断されることを可能にするので、化学療法剤などの潜在的に危険なカーゴの送達によく適している。

【0006】

ナノ粒子組成物は、生体直交型クリックケミストリー（図１）の使用を介して達成されるモジュール設計を有する。これらの反応は、ライゲーションと安定化の両方に使用される。「クリックケミストリー」は、高収率で、範囲が広く、副産物をほとんど～全く生成しない任意の反応を包含する。生成された任意の副産物は、容易に除去されるべきである。本発明は、「クリックケミストリー」として広く認められているいくつかの異なる結合を組み込んでおり、これらは本明細書で論じられる。手短に言えば、これらには、それだけに限らないが、銅（Ｉ）触媒アルキン－アジド付加環化（ＣｕＡＡＣ）、歪み促進型アルキン－アジド付加環化（ＳＰＡＡＣ）、ルテニウム触媒アジド－アルキン付加環化（ＲｕＡＡＣ）、逆電子要請型ディールスアルダー反応（ＩＥＤＤＡ）、硫黄フッ化物交換（ＳｕＦＥｘ）、歪み促進型アルキン－ニトロン付加環化（ＳＰＡＮＣ）、ヒドラゾン／オキシムエーテル形成、チオール－エンラジカル反応、チオール－インラジカル反応、チオール－マイケル付加反応、チオール－イソシアネート反応、チオール－エポキシドクリック反応、求核開環反応（バネ荷重反応（spring-loaded reaction））、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションが含まれる。

【0007】

本発明におけるモジュール設計は、極めて安定なコア足場を可能にする。送達システムに追加の官能基を付加する必要がある場合、核酸ナノ粒子全体を再設計する必要はなく、これをクリックすることができる。多くの現世代の核酸ナノ粒子は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの会合を促進するためにＤＮＡ／ＲＮＡ足がかりを利用し、これは、しばしばコア足場と会合する成分のインシリコ設計を必要とする（Ｋ．Ａ．Ａｆｏｎｉｎら Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｉｎｉｍａｌ ＲＮＡ Ｔｏｅｈｏｌｄｓ ｔｏ Ｔｒｉｇｇｅｒ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．１６（２０１６）１７４６－１７５３。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．５ｂ０４６７６）。本発明のモジュール設計は、カーゴ分子のより容易な結合を可能にし、したがって、配列設計において必要とされる最適化が少ないため、開発プロセスに関連する時間の有意な短縮をもたらす。モジュール設計はまた、合成および組み立てにおけるより大きな再現性ならびにより少ないバッチ間変動をもたらす。

【0008】

上記で概説した利点に加えて、モジュール設計はまた、増加したカーゴ容量およびより高い治療ペイロードを可能にする。交互の結合部位は、複数の固有の治療モダリティのコンジュゲーションを可能にし、１ナノ粒子当たりより多量の治療ペイロードの結合も可能にし、それによって、より効果的な併用療法をもたらす。例えば、六量体ＲＮＡナノ構造の構造は、以前に記録された足がかりコンジュゲーション（toehold conjugation）戦略（Ｋ．Ａ．Ａｆｏｎｉｎら Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．１４（２０１４）５６６２－５６７１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｎｌ５０２３８５ｋ）を使用したｓｉＲＮＡ治療用カーゴ分子の６つの結合部位に限定され得る。本明細書に記載されるように、足がかりコンジュゲーションの代わりにクリックケミストリーを使用すると、同様の六量体構造上の利用可能な結合部位が増加し、カーゴ分子の搭載容量の増加をもたらす。

【0009】

生体直交型クリックケミストリーの使用はまた、複数のカーゴ分子を核酸ナノ粒子に結合させる能力を可能にする。一実施形態では、これが、ナノ粒子にコンジュゲートした同じカーゴ分子の２つ以上を含み得る。別の実施形態では、これが、ナノ粒子にコンジュゲートした異なる生物学的機能を担う複数のカーゴ分子を含み得る。組成物は、同じ核酸ナノ粒子にコンジュゲートしたｓｉＲＮＡ分子、アプタマー、化学療法剤、細胞傷害性ヌクレオシドおよびエンドソーム脱出分子の複数のバリエーションを含み得る。この汎用性は、診断目的または治療目的のためのナノ粒子の設計および製造におけるより大きな柔軟性を可能にする。

【0010】

カーゴ分子はまた、「コンビナトリアル鎖」で互いに結合していてもよく、各カーゴ分子は可逆的リンカーまたは不可逆的リンカーを介して別のものに結合している。この概念は、さらに高い治療負荷を可能にする。一実施形態では、同じ配列を含む２またはそれを超えるｓｉＲＮＡを連結して、１リガンド－受容体相互作用当たりのサイレンシング効力の増加および細胞取り込みの増強のためのホモ多量体を形成する。別の実施形態では、同じｍＲＮＡを標的とする異なる配列を含む２またはそれを超えるｓｉＲＮＡを連結し、それによって、より完全なノックダウンのためのより大きな標的配列カバレッジ（スプライスバリアント、非翻訳領域を含む）および増加した表現型浸透度を可能にしてオフターゲット作用の影響を減少させる単一遺伝子標的化ヘテロ多量体を形成する。別の実施形態では、異なるｍＲＮＡを標的とする異なる配列を含む２またはそれを超えるｓｉＲＮＡを連結して、複数の遺伝子のコンビナトリアルサイレンシングのためのヘテロ多量体を形成する。このような複数遺伝子標的化ヘテロ多量体を併用療法として使用することによって、特に単一標的化ｓｉＲＮＡで効率的に処置することができないより複雑な疾患に対して、相乗的な治療効果を達成することができる。さらに別の実施形態では、ｓｉＲＮＡの直鎖ホモまたはヘテロ多量体鎖を、肝細胞への細胞型特異的標的化のために、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）などのさらなるカーゴ分子にさらにコンジュゲートする。一実施形態では、コンビナトリアル鎖が核酸ナノ粒子に結合している。１またはそれを超えるコンビナトリアル鎖が各ナノ粒子に結合していてもよい。別の実施形態では、コンビナトリアル鎖がコアナノ粒子から独立している。

【0011】

核酸ナノ粒子は、ナノ粒子中の核酸にコンジュゲートした成分を含み得る。成分は、核酸ナノ粒子中の核酸の２’位にコンジュゲートされ得る。成分は、核酸ナノ粒子中の核酸の塩基にコンジュゲートされ得る。成分は、オリゴヌクレオチドの５’末端にコンジュゲートされ得る。成分は、オリゴヌクレオチドの３’末端にコンジュゲートされ得る。成分は、核酸ナノ粒子中のヌクレオチドのリン含有結合にコンジュゲートされ得る。リン含有結合は、３－（２－ニトロフェニル）－プロピルホスホロアミダイト結合、３－フェニルプロピルホスホロアミダイト結合、アルキルホスホロチオエート結合、アミノブチルホスホロアミダイト結合、アリールホスホロチオエート結合、ジメチルアミノホスホロアミダイト結合、グアニジノブチルホスホロアミデート結合、またはホスホロチオエート結合であり得る。

【0012】

一実施形態では、本発明は、上記修飾ヌクレオチドまたはホスホロアミダイト上の記載されている位置の１つを適切なカップリングパートナーと一緒にライゲーションすることを含む。ＣｕＡＡＣ、ＳＰＡＡＣおよびＲｕＡＡＣの場合、前記方法が、アルキン基をアジド基と反応させてトリアゾール結合を形成することを含む。ＩＥＤＤＡの場合、前記方法が、１，２，４，５－テトラジンをオレフィンと反応させてジヒドロピリダジンを形成することを含み、ジヒドロピリダジンを対応するピリダジンにさらに酸化してもよい。ＳｕＦＥｘの場合、前記方法が、フッ化スルホニルを求核試薬と反応させて置換生成物を形成することを含む。ＳＰＡＮＣの場合、前記方法が、ジベンゾシクロオクチンをニトロンと反応させてＮ－アルキル化イソオキサゾリンを得ることを含む。ヒドラゾン形成の場合、前記方法が、ヒドラジンをカルボニルと反応させてヒドラゾンを得ることを含む。オキシムエーテル形成の場合、前記方法が、ヒドロキシルアミンをカルボニルと反応させることを含む。チオール－エンラジカル反応、チオール－インラジカル反応、チオール－イソシアネート反応、チオール－エポキシドクリック反応の場合、前記方法が、チオールを適切なカップリングパートナーと反応させることを含む。求核開環反応の場合、前記方法が、求核試薬を適切な歪み求電子試薬と反応させて所望の結合を生成することを含む。無痕跡型シュタウディンガーライゲーションの場合、前記方法が、ホスフィン（すなわち、（ジフェニルホスフィノ）メタンチオール）をチオエステルと反応させて所望の結合を形成することを含む。

【0013】

１またはそれを超えるカーゴ分子を結合させるために上に概説されるケミストリーを使用することに加えて、ナノ粒子中のヌクレオチド鎖を安定化するためにこれを使用することもできる。クリックケミストリー、特にＣｕＡＡＣの使用による熱力学的安定化が当技術分野で示されている（国際公開第２００８／１２００１６号参照）。この組成物は、核酸ナノ粒子構造を安定化するために上記の方法の組み合わせを使用する（図２）。

【0014】

別の実施形態では、核酸ナノ粒子が、クリックケミストリーまたは化学的ライゲーションを介してライゲーションされているオリゴヌクレオチドから構築され得る。このようなオリゴヌクレオチドに基づく構造は、当技術分野で公知である（国際公開第２０１５／１７７５２０号；米国特許出願公開第２０１７／０５７４１５号；Ｍ．Ｋｏｌｌａｓｃｈｉｎｓｋｉら、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＤＮＡ Ｃｌｉｃｋ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｒｅｐｌａｃｅｓ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｌｉｇａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３１（２０２０）５０７－５１２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｏｎｊｃｈｅｍ．９ｂ００８０５．）。

【0015】

別の実施形態では、本発明は核酸ナノ粒子を含み、個々のオリゴヌクレオチド鎖が、外部作用剤とカップリングしてフルオロフォアを生成することができるペンダント部分を有する。

【0016】

組成物は、ナノ粒子組み立ておよび細胞取り込みを可視化および監視するために使用することができる蛍光発生クリック部分を含み得る。これは、蛍光イソインドール架橋（ＦｌＩＣｋ）ケミストリーを含み得る。このような官能基は、アミンまたはチオール修飾ヌクレオチドを介して組み込まれ得る。次いで、これはカーゴのためのステープルまたは結合部位として作用し得る。

【0017】

組成物は上記の修飾の任意の組み合わせを含み得る。代替クリック反応をフルオロフォア生成反応と連結してもよい。

【0018】

組成物は複数のＲＮＡ分子を含み得る。例えば、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれを超えるＲＮＡ分子を含有し得る。

【0019】

核酸ナノ粒子はアプタマーを含み得る。

【0020】

核酸ナノ粒子は、ＲＮＡナノ粒子、ＤＮＡナノ粒子、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含有する粒子であり得る。

【0021】

自己組織化構築物は、それだけに限らないが、三量体、四量体、五量体または六量体を含む任意の数の形態の形をとり得る。

【0022】

別の実施形態では、核酸ナノ粒子が、複数の双直交クリック結合を有するＲＮＡ分子の二本鎖であり得る。これらは、刺激応答性リンカーを介してカーゴに結合されてもされなくてもよい。コア鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは別の種類のオリゴヌクレオチド治療薬（図３）であり得る。細胞傷害性薬物（Ｉ）、ＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ（ＩＩ）、標的化部分（例えばアプタマー）（ＩＩＩ）、エンドソーム脱出分子（ＩＶ）およびフルオロフォア（Ｖ）を含む様々なカーゴ分子が結合され得る。これらの部分は、刺激応答性リンカー（ＶＩ）を介して結合されてもされなくてもよい。

【0023】

別の態様では、本発明は、カーゴ分子と、対象におけるカーゴ分子の生物学的活性を促進するためにカーゴ分子に連結されている要素、例えば刺激応答性リンカーとを含む組成物（図４）を提供する。

【0024】

カーゴ分子は、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、細胞傷害性薬物もしくはその任意の組み合わせであり得るか、またはこれらを含み得る。ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子、ｌｎＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、またはｓｈＲＮＡ分子であり得る。カーゴ分子は、ＣＲＩＳＰＲ成分であり得るか、またはＣＲＩＳＰＲ成分をコードし得る。カーゴ分子は、キメラ抗原受容体であり得るか、またはキメラ抗原受容体をコードし得る。

【0025】

治療的に冗長なＲＮＡ足場を使用することに加えて、コア足場は、その治療効果を増強するためにいくつかの官能基を組み込むように修飾され得る。コアナノ足場は、例えば、細胞取り込みおよびエンドソーム脱出を促進し、それによって、カーゴの細胞質利用可能性を増加させるように修飾され得る。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図１は、モジュールクリックベース官能基を有する単純化された六量体核酸ナノ粒子を示す概略図である。直交型クリックハンドルを、既知のヌクレオチドおよび新規なヌクレオチドに組み込むことができる。

【図2】図２は、核酸ナノ粒子を安定化するための生体直交型クリックケミストリーの使用を示す概略図である。

【図3】図３は、六量体などのナノ構造へのさらなる組み立てを必要としない送達ビヒクルとしての二本鎖ＲＮＡを示す概略図である。細胞傷害性薬物（Ｉ）、ＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ（ＩＩ）、標的化部分（例えばアプタマー）（ＩＩＩ）、エンドソーム脱出分子（ＩＶ）およびフルオロフォア（Ｖ）を含む様々なカーゴ分子が直接結合されることが示されている。これらの部分は、刺激応答性リンカー（ＶＩ）を介して結合されてもされなくてもよい。

【図4】図４は、生体直交型クリックケミストリーを介してコンジュゲートされたカーゴを有する四量体核酸ナノ粒子を示す概略図である。示されるクリック化学には、ｓｉＲＮＡ（ＩＩ）のアルキン－アジド（Ｉ）およびジスルフィド結合（ＩＩＩ）が含まれる。アプタマー（ＩＶ）などの標的化分子のハイブリダイゼーションも可能である。

【図5】図５は、核酸ナノ粒子内で使用されるＤＮＡ／ＲＮＡの可能な２’修飾を概説する表である。

【図6】図６は、ＲＮＡヌクレオチドの構造修飾を示す。これらは、塩基上においてアジドで修飾されている。

【図7】図７は、生体直交型クリックケミストリーを可能にする可能なホスホロアミダイト修飾を示す表である。

【図8】図８は、オリゴヌクレオチドに対する逆電子要請型ディールスアルダー反応を示す概略図である。

【図9】図９は、チオール修飾オリゴヌクレオチドを用いて行うことができる可能なクリック反応を示す概略図である。これらには、ジスルフィド（Ｉ）、チオール－エン（ＩＩ）、チオール－イン（ＩＩＩ）、チオール－マレイミド（ＩＶ）、チオール－イソシアネート（Ｖ）およびチオール－エポキシ（ＶＩ）が含まれる。

【図10】図１０は、ある範囲の求核試薬による２，２’－アンヒドロ－１－（β－Ｄ－アラビノフラノシル）ウラシルの求核開環の最適化を示す概略図である。

【図11】図１１は、ヌクレオチドナノ粒子に適用される蛍光イソインドールクリック（ＦｌＩＣｋ）ケミストリーを要約する概略図である。隣接するアミンおよびチオールをオルトフタルアルデヒドで処理すると、結果として生じる縮合反応により検出可能なフルオロフォアが生成する。

【図12】図１２は、その蛍光能力を増加させるためのフルオロフォア（ローダミンＢ）のオルトフタルアルデヒドへのコンジュゲーションを示す概略図である。

【図13】図１３は、酸不安定性リンカーを介したエンドソーム脱出媒介ペプチドの核酸ナノ粒子への結合を示す概略図である。

【図14】図１４は、核酸ナノ粒子に組み込まれる可能な細胞傷害性ヌクレオチドを示す概略図である。刺激応答特性は、ジスルフィド結合を介して組み込まれ得る。

【図15】図１５は、ＣｕＡＡＣを介して生成され得る細胞傷害性ヌクレオチドを示す概略図である。

【図16】図１６は、ボロン酸ベースの細胞傷害性ヌクレオチドである。

【図17】図１７は、５’末端で核酸に複合体化することができる金属ベースの部分を示す概略図である。

【図18】図１８は、核酸ナノ粒子に組み込むことができる細胞傷害性化合物である９－［２－（ホスホノメトキシ）エチルアデニンの（Ｓ－アシル－２－チオエチル）エステル誘導体を示す概略図である。

【図19】図１９は、核酸ナノ粒子に組み込むことができる細胞傷害性化合物であるＨｅｐＤｉｒｅｃｔを示す概略図である。

【図20】図２０は、核酸ナノ粒子に組み込むことができる細胞傷害性化合物であるオクタデシルオキシエチル環状シドホビルを示す概略図である。

【図21】図２１は、コンビナトリアル鎖；２またはそれを超えるカーゴ分子を一緒に連結して治療薬搭載容量を増加させる方法の概念を概説する概略図である。組成物の非網羅的な例を示す（Ａ～Ｄ）。概略図では、Ｉ）コンビナトリアル鎖；ＩＩ）ナノ構造；ＩＩＩ）リンカー；ＩＶ）治療用カーゴ；Ｖ）標的化カーゴ；ＶＩ）細胞侵入カーゴ；ＶＩＩ）他の機能性カーゴが参照される。

【図22】図２２は、本発明の一実施形態の組成物のコア足場（ＳＱ－００００－００１）を概説する概略図である。

【図23】図２３は、本発明の一実施形態によるジスルフィド－ノルボルネン５’修飾子（modifier）の合成の概略図である。

【図24】図２４は、ＮＨＳ－エステルリンカーによる５’アミノ修飾ＲＮＡの修飾に使用される手順を概説する概略図である。

【図25】図２５は、５’アミノ修飾ＲＮＡとＮＨＳ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯの反応のＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。

【図26】図２６は、５’アミノ修飾ｓｉＲＮＡの分取ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。

【図27】図２７は、ＲＮＡ鎖の分析用ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。

【図28】図２８は、５’ノルボルネン修飾Ｃ－４．４ ＲＮＡと５’テトラジン修飾ｓｉＲＮＡ Ｓ－１．５のカップリング（１：１モル当量）後の経時的実験の重ね合わせた分析用ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。

【図29】図２９は、５’ノルボルネン修飾ＲＮＡ Ｃ－４．４と５’テトラジン修飾ｓｉＲＮＡ Ｓ－１．５のカップリング（１：２モル当量）後の経時的実験の重ね合わせた分析用ＲＰ－ＨＰＬＣを示す。

【図30】図３０は、５’ノルボルネン修飾ＲＮＡ Ｃ－４．４と５’テトラジン修飾ｓｉＲＮＡ Ｓ－１．５のカップリング（１：４モル当量）後の経時的実験の重ね合わせた分析用ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。

【図31】図３１は、５’ノルボルネン修飾ＲＮＡ Ｃ－４．４と５’テトラジン修飾アプタマーＡ－１．３のカップリングの分析用ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。

【図32】図３２は、精製された画分を示す、対応するＰＡＧＥ（１５％変性、２５０ Ｖ）を用いたＩＥＤＤＡカップリング鎖（ＮＡナノ粒子コア鎖Ｃ－４．４＋ｓｉＲＮＡ Ｓ－１．５）の精製を示すＨＰＬＣトレースを示す。

【図33】図３３は、アニーリングされたｓｉＲＮＡセンス鎖およびアンチセンス鎖を示す１８％ ＭＯＰＳ ＰＡＧＥ（１５０ Ｖ、２．５時間、ｇｅｌ ｒｅｄ染色）を示す。Ｔ

【図34】図３４は、３０℃で１：１モル当量のコア：アプタマーを使用したＩＥＤＤＡを介したアプタマーＡ－１．３へのコアＮＡナノ粒子鎖Ｃ－４．４のコンジュゲーションを示す１５％変性ＰＡＧＥ（２５０Ｖ、１時間、ｇｅｌ ｒｅｄ染色）を示す。

【図35】図３５は、完全組み立てＮＡナノ粒子（ＳＱ１－００００－００５）との代表的なＩＥＤＤＡコンジュゲーションを示すネイティブＰＡＧＥ（８％、１５０Ｖ、１時間）を示す。

【図36】図３６は、アジド官能化ｓｉＲＮＡ Ｓ－１．６を有するコア鎖Ｃ－４．３とのＳＰＡＡＣコンジュゲーションの変性ＰＡＧＥ（１５％、２５０Ｖ、１時間）を示す。

【図37】図３７は、Ｃ－５．２を形成するためのＣ－５．３のＣｙ７－ＮＨＳ標識（３０２ｎｍ ＧｅｌＲｅｄ／Ｃｙ７チャネル）の変性ＰＡＧＥ（１５％、２５０Ｖ、１時間）を示す。

【図38】図３８は、クリックされた鎖（１つの位置（鎖Ｃ－５．４）、または８つの位置（鎖Ｃ－５．５）でＰＥＧおよびコレステロール）の変性ゲル（１５％、２５０Ｖ、１時間）を示す。

【図39】図３９は、可逆的ジスルフィド架橋を介した５’－チオール修飾ｓｉＲＮＡセンス鎖Ｓ－１．１によるナノ粒子コア鎖Ｃ－１．１の官能化を示す変性ＰＡＧＥ（１５％、２５０Ｖ、１時間）を示す。

【図40】図４０は、マレイミド修飾ＧＦＷＦＧのＲＰ ＨＰＬＣトレースを示す。１５分で０～１００％Ｂ（Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ ＴＦＡ；Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ ＴＦＡ）。

【図41】図４１は、左パネルにおいて、同じ鎖のチオール－ＲＮＡ Ｃ－２．１対ペプチドコンジュゲートＲＮＡの変性ＰＡＧＥおよび右パネルにおいて、コンジュゲーション反応混合物の粗ＲＰ ＨＰＬＣトレースを示す。

【図42】図４２は、ＦｌＩＣｋケミストリーで使用するためのオルト－フタルアルデヒド含有ホスホロアミダイトの合成スキームを示す。

【図43】図４３は、ｑＰＣＲによって得られた、ジスルフィドまたはＩＥＤＤＡカップリングを介してＰＬＫ１標的化ｓｉＲＮＡにコンジュゲートした２０ｎＭのＲＮＡ鎖によるトランスフェクションの４８時間後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞におけるＰＬＫ１ ｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。

【図44】図４４は、ＩＥＤＤＡカップリング反応混合物の分析変性ＰＡＧＥ（２５０ Ｖ、１時間、ｇｅｌｒｅｄ染色）を示す。

【図45】図４５は、ｑＰＣＲによって得られた、２０ｎＭの示されたｓｉＲＮＡによるトランスフェクションの４８時間後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞におけるＰＬＫ１ ｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。

【図46】図４６は、２００ｎＭの濃度の１０％熱不活性化ＦＢＳを含む細胞培養培地中で２時間インキュベートした後の、０、１、２または４個のＥＧＦＲ標的化アプタマー（Ａ－１．１）を保有するＣｙ３標識構築物のＥＧＦＲ過剰発現Ａ４３１がん細胞への結合を示すグラフを示す。

【図47】図４７は、アプタマーが内部移行後にリソソームに蓄積することを示す顕微鏡像を示す。

【図48】図４８は、ＲＮＡナノ粒子が細胞への内部移行後に核周囲空間に蓄積することを示し、エンドソーム取り込みを示唆する顕微鏡像を示す。

【図49】図４９は、自己犠牲リバビリンホスホロアミダイトの合成スキームを示す。（ｉ）ＤＭＴｒＣｌ、ピリジン（ｉｉ）ＴＢＤＭＳＣｌ、ＡｇＮＯ_３、ピリジン（ｉｉｉ）２－（（２－（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）エチル）ジスルファニル（disulfaneyl））エチルアセテート、ＴＥＡ、ＤＣＭ、（ｉｖ）ＡｃＯＨ（ｖ）２－（（２－（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エチル）ジスルファニル）エチル（４－ニトロフェニル）カーボネート、ＴＥＡ、ＤＣＭ（ｖｉ）Ｋ_２ＣＯ_３、ＭｅＯＨ（ｖｉｉ）ＣＥＰ－Ｃｌ、ピリジン、ＤＣＭ。

【図50】図５０は、非変性ＰＡＧＥを介して組立体の３つの異なるバージョンを示す。

【図51】図５１は、ＧａｌＮＡｃ Ｃ３ ５’ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ）を介して一価および三価ＧａｌＮＡｃにカップリングしたコンビナトリアルカーゴ（ｓｉＲＮＡ）の概略図である。

【図52】図５２は、合成後ＩＥＤＤＡコンジュゲーションのための５’ＧａｌＮＡｃ修飾子の合成の概略図である。ＧａｌＮＡｃ Ｃ３ ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ）は、ＧａｌＮＡｃ Ｃ３ ５’ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ）および５’ノルボルネンホスホロアミダイトで鎖伸長され、標準的なＲＮＡ脱保護条件（ＡＭＡ／ＨＦ）がそれに続く。

【図53】図５３は、修飾ホスホロアミダイトを介してコレステロールおよび三価ＧａｌＮＡｃに二重コンジュゲートしたコンビナトリアルカーゴ（ｓｉＲＮＡ）の概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本発明は、細胞へのカーゴの送達を可能にする広範囲の組成物を提供する。これらの組成物は、カーゴの交換可能な結合を可能にする反応性部位で装飾される。カーゴの例としては、標的細胞における外因性ポリペプチドの発現を可能にするｍＲＮＡ分子、標的細胞における遺伝子発現の調節を可能にする他の種類のＲＮＡ分子、および他の種類の治療薬または診断薬が挙げられる。本発明の組成物は、細胞特異性、細胞内部移行能、生物学的分子の治療有効性を修正し、オフターゲット作用を低減し得る。

【0028】

核酸ナノ粒子を含むナノ粒子
ある特定の実施形態では、本発明の組成物がナノ粒子を含む。本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」は、ナノメートルスケールで測定される寸法を有する粒子を指す。例えば、ナノ粒子は、１～１０００ｎｍの直径、長さ、幅、または深さを有し得る。

【0029】

ＲＮＡナノ粒子は、定義される二次構造を有する個々のＲＮＡ分子の規則正しい配列から形成される。ＲＮＡ分子は、シュードノット、キッシングヘアピン、およびヘアピンループ、３ウェイジャンクションおよび４ウェイジャンクションなどの様々な構造モチーフを形成し、これらは分子の形状寸法と、塩基対形成を介して他のＲＮＡ分子と安定な相互作用を形成するその能力の両方に影響を及ぼす。典型的には、個々のＲＮＡ分子は、分子内塩基対形成から生じる二本鎖領域、および他のＲＮＡ分子と塩基対を形成することができるか、または他の方法で他の種類の分子に結合することができる一本鎖領域を有する。

【0030】

例えば、限定されないが、ナノアレイ、ナノケージ、ナノキューブ、ナノプリズム、ナノリング、ナノ足場、およびナノチューブを含む、規則的な二次元または三次元構造を有する様々なＲＮＡナノ構造が知られている。ナノリングは、軸の周りに整列させられた３個、４個、５個、６個、７個、８個またはそれを超えるＲＮＡ分子を含む対称構造または非対称構造であり得る。したがって、ナノリングは、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、またはより大きな数の多量体であり得る。ナノリングは、円形、三角形、四角形、五角形、六角形、七角形、八角形、または他の多角形の形状であり得る。シート、ケージ、デンドリマーおよびクラスターなどの他の種類のＲＮＡナノ粒子も可能であり、本発明の範囲内である。「ナノ足場」は、一般的に、他の分子を結合させることができるナノ構造を指す。様々な構造配置のＲＮＡナノ粒子は、例えば、その各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００５／００３，２９３号；国際公開第２００７／０１６，５０７号；国際公開第２００８／０３９，２５４号；国際公開第２０１０／１４８，０８５号；国際公開第２０１２／１７０，３７２号；国際公開第２０１５／０４２，１０１号；国際公開第２０１５／１９６，１４６号；国際公開第２０１６／１６８，７８４号；および国際公開第２０１７／１９７，００９号に記載されている。

【0031】

核酸ナノ粒子は、天然に存在するヌクレオチドを含有し得るか、または化学修飾ヌクレオチドを含有し得る。化学修飾ヌクレオチドは当技術分野で公知であり、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１８／１１８５８７号に記載されている。例えば、限定されないが、核酸ナノ粒子、治療薬およびアプタマーは、２’フルオロ、２’Ｏ－メチル、２－チオウリジン、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－アミン、５－メトキシウリジン、シュードウリジン、５－メチルシチジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、ロック核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ、およびホスホロチオエート修飾の１またはそれより多くを含有し得る。他の修飾ヌクレオチドには、５ｃａＣ、５ｆＣ、５ｈｏＣ、５ｈｍＣ、５ｍｅＣ／５ｆｕ、５ｍｅＣ／５ｍｏＵ、５ｍｅＣ／ｔｈＧ、５ｍｏＣ、５ｍｅＣ／５ｃａｍＵ、５ｍｅＣ，ψ、５ｍｅＣ／ψ、５ｍｏＣ／５ｍｏＵ、５ｍｏＣ／５ｍｅＵ、５ｈｍＣ／５ｍｅＵ、ｍｅ１ψ、５ｍｅＣ／ｍｅ１ψ、５ｍｏＵ、５ｃａｍＵ、ｍ６Ａ、５ｈｍＣ／ψ、５ｍｏＣ／ψ、ｍｅ６ＤＡＰ、ｍｅ４Ｃ、５ｆｕ、５－メトキシウリジン、２－アミノアデニン、２－チオシトシン、２－チオチミン、２－チオウラシル、３－メチルアデニン、４－チオウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－アリルシトシン、５－アリルウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－フルオロウラシル、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヨードウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルウラシル、６－Ｏ－メチルグアニン、６－チオグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザグアニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、５－メチルシチジン、シュードウリジン、イノシン、２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン、２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオエートアデノシン、２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオエートシチジン、２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオエートグアノシン、２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオエートウリジン、立体配座が制限されたヌクレオチド、および２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオエートシュードウリジンが含まれる。

【0032】

ナノ粒子の核酸は糖修飾を含有し得る。例えば、限定されないが、ナノ粒子の核酸は、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’ＭＯＥ）、２’－メトキシ（２’ＯＭｅ）、２’－フルオロ（２’Ｆ）、２’－Ｏ－アセタールエステル、２－グアニジノメチル－２－エチルブチリルオキシメチル（ＧＭＥＢｕＯＭ）、２－アミノ－２－メチルプロピオニルオキシメチル（ＡＭＰｒＯＭ）、２－アミノメチル－２－エチルブチリルオキシメチル（ＡＭＥＢｕＯＭ）、２’－Ｏ－ピバロイルオキシメチル（ＰｉｖＯＭ）、上記のアミンまたはペプチドで修飾された２’アミノロック核酸（ＬＮＡ）、２’－Ｏ－［Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシ］エチル、２’－Ｎ－［Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシ］エチル、２’－Ｎ－イミダゾールアセトアミド（２’－Ｎ－ｉｍｉｄａｚｏｌａｃｅｔｙａｍｉｄｅ）、２’－Ｏ－［３－（グアニジニウム）プロピル］、２’－Ｎ－［３－（グアニジニウム）プロピル］、２’－Ｏ－［３－（グアニジニウム）エチル］、２’－Ｎ－［３－（グアニジニウム）エチル］、２’－Ｏ－（Ｎ－（アミノエチル）カルバモイル）メチル、２’－Ｎ－（Ｎ－（アミノエチル）カルバモイル）メチル、２’－Ｏ－［Ｎ－（２－（（２－アミノエチル）アミノ）エチル）］アセトアミド、２’－Ｎ－［Ｎ－（２－（（２－アミノエチル）アミノ）エチル）］アセトアミド、２’－Ｎ－２，２，３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８－ペンタデカフルオロオクタンアミド、２’－Ｎ－イミダゾールアセトアミド、２’－Ｏ－イミダゾールメチル、２’－Ｎ－グアニジルベンジルアミド、および４’－Ｃ－グアニジニンカルボヒドラジドメチル（4'-C-guanidinincarbohydrazidomethyl）、２’－Ｏ－イミダゾールメチル、２’－Ｎ－イミダゾールメチルアミンエチルの１またはそれより多くを含有し得る。

【0033】

クリックケミストリー
クリックケミストリーを開発して、有機分子を一緒に結合して高収率および温和な条件下で生成物を得る簡単な方法を提供した。二置換１，２，３トリアゾールを形成するためのアジドとアルキンとの間の反応は、最初にＭｅｌｄａｌおよび共同研究者ら（Ｃ．Ｗ．Ｔｏｒｎｏｅら［１，２，３］－Ｔｒｉａｚｏｌｅｓ ｂｙ ｒｅｇｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）－ｃａｔａｌｙｚｅｄ １，３－ｄｉｐｏｌａｒ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｌｋｙｎｅｓ ｔｏ ａｚｉｄｅｓ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７（２００２）３０５７－３０６４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｊｏ０１１１４８ｊ．）ならびにＳｈａｒｐｌｅｓｓおよび共同研究者ら（Ｖ．Ｖ．Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら Ａ ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｈｕｉｓｇｅｎ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ：Ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）－ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ’’ｌｉｇａｔｉｏｎ’’ ｏｆ ａｚｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｌｋｙｎｅｓ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１（２００２）２５９６－２５９９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／１５２１－３７７３（２００２０７１５）４１：１４＜２５９６：：ＡＩＤ－ＡＮＩＥ２５９６＞３．０．ＣＯ；２－４．）によって別々に報告された。それ以後、この反応は、その単純さおよび温和な条件の使用のために、最も重要なコンジュゲーション反応の１つとして浮上した。

【0034】

ナノ粒子は、任意のアルキン保有部分を含有し得る。これは、化学的または酵素的に修飾されたヌクレオチドを介するものであり得る。アルキン修飾ヌクレオチドは当技術分野で公知であり、例えば国際公開第２０１７／１８９９７８号に記載されている。アルキン修飾ヌクレオチドは、糖上、２’位、またはヌクレオチド塩基上で修飾され得る。例えば、限定されないが、糖修飾核酸ナノ粒子は、４－アミノ－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－オン（２’ＯアルキンＣ）、１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン（２’ＯアルキンＵ）、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－（ヒドロキシメチル）－４－（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）テトラヒドロフラン－３－オール（２’ＯアルキンＡ）、２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）－１，９－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン（２’ＯアルキンＧ）の１またはそれより多くを含有し得る。さらなるＣＨ_２基またはエチレングリコール基をアルキン部分とＣＨ_２部分との間に付加してもよい。メチレンの代わりにエチレングリコール単位を使用してもよい（図５）。

【0035】

修飾が塩基上に現れるアルキン修飾ヌクレオチドは、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（ヒドロキシメチル）－５－（６－（プロパ－２－イン－１－イルアミノ）－９Ｈ－プリン－９－イル）テトラヒドロフラン－３，４－ジオール（Ｎ６プロパルギルＡ）、１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－４－（プロパ－２－イン－１－イルアミノ）ピリミジン－２（１Ｈ）－オン（Ｎ４プロパルギルＣ）、９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－２－（プロパ－２－イン－１－イルアミノ）－１，９－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン（Ｎ２プロパルギルＧ）、１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－３－（プロパ－２－イン－１－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン（Ｎ３プロパルギルＵ）の１またはそれより多くを含有し得る。

【0036】

ナノ粒子は、オリゴヌクレオチド配列の５’または３’末端に組み込まれるアルキン修飾リン酸を含有し得る（図７）。このようなホスホロアミダイトは、当技術分野、例えば米国特許出願公開第２００９１２４５７１号に記載されている。これらには、それだけに限らないが、２－シアノエチルプロパ－２－イン－１－イルジイソプロピルホスホロアミダイトおよびリン中心とアルキン部分との間の任意のメチレン伸長が含まれ得る。メチレンの代わりにエチレングリコール単位を使用してもよい。

【0037】

ナノ粒子は、任意のアジド保有部分を含有し得る。これは、化学的または酵素的に修飾されたヌクレオチドを介するものであり得る。アルキン修飾ヌクレオチドは、糖上、２’位、またはヌクレオチド塩基上で修飾され得る。例えば、限定されないが、糖修飾核酸ナノ粒子は、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－（アジドメトキシ）－２－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－３－オール、４－アミノ－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（アジドメトキシ）－４－ヒドロキシ－５（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－オン、２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（アジドメトキシ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－１，９－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン（Ｎ２アジドＧ）、１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（アジドメトキシ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオンの１またはそれより多くを含有し得る。

【0038】

ヌクレオチド塩基のアジド修飾は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１４７９２４号に記載されている。塩基修飾アジド化合物は、それだけに限らないが、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－２－（６－アジド－９Ｈ－プリン－９－イル）－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－３，４－ジオール（Ｎ６アジドＡ）、４－アジド－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－オン（Ｎ４アジドＣ）、２－アジド－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－１，９－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン（Ｎ２アジドＧ）の１またはそれより多くを含有し得る（図６）。

【0039】

ナノ粒子は、オリゴヌクレオチド配列の５’または３’末端に組み込まれるアジド修飾リン酸を含有し得る。これらには、それだけに限らないが、アジドメチル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイトおよびリン中心とアジド部分との間の任意のメチレン伸長が含まれ得る。メチレンの代わりにエチレングリコール単位を使用してもよい。

【0040】

微量の銅に関する潜在的な毒性の懸念のために、銅フリーアジド－アルキン付加環化は、文献において生物学的に関連する分子にますます普及している。歪み促進型アジド－アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）は、この問題を回避する便利な方法である。アルキンを活性化するためにＣｕ（Ｉ）を使用する代わりに、アルキンが歪みシクロオクチン誘導体に導入される（Ｎ．Ｊ．Ａｇａｒｄら Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｚｉｄｅｓ．、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１（２００６）６４４－６４８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｃｂ６００３２２８．）。この環ひずみを緩和したいという要求が、アジドとの反応を促進する。このアプローチは、オリゴヌクレオチド－アジド誘導体の合成後標識に使用されており（Ｍ．Ｌ．Ｗｉｎｚ．Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｎｅ－ｐｏｔ ｔｒｉｐｌｅ ｃｌｉｃｋ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５４（２０１８）１１７８１－１１７８４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ８ｃｃ０４５２０ｈ．）、本発明のモジュール設計の一部として適用することができる。アジド修飾ヌクレオチドを核酸ナノ粒子に組み込むことができる。次いで、組み立てられた構築物をシクロオクチン標識基質でタグ付けすることができる。

【0041】

逆電子要請型ディールスアルダーは、生体分子コンジュゲーションのための最も堅牢なクリックケミストリーの１つとして確立されており、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成後標識に使用されている（Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら Ｐｏｓｔ－Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ Ｉｎｖｅｒｓｅ－Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２（２０１０）８８４６－８８４７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｊａ１０２８７１ｐ．）；（Ａ．Ｍ．Ｐｙｋａら Ｄｉｅｌｓ－ａｌｄｅｒ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＲＮＡ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２５（２０１４）１４３８－１４４３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｂｃ５００３０２ｙ．）。その内容は参照により本明細書に組み込まれる。この付加環化反応は、遷移金属を使用せずに迅速に進行し、室温でのオリゴヌクレオチドの効率的な官能化を可能にする（図８）。

【0042】

ナノ粒子は、任意のノルボルネン（ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン）部分を含有し得る。これは、化学的または酵素的に修飾されたヌクレオチドを介するものであり得る。ノルボルネン修飾ヌクレオチドは、糖上、２’位、またはヌクレオチド塩基上で修飾され得る。例えば、限定されないが、糖修飾核酸ナノ粒子は、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－（ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－イルメトキシ）－２－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－３－オール、４－アミノ－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－イルメトキシ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－オン、１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－イルメトキシ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオンの１またはそれより多くを含有し得る（図５）。

【0043】

ナノ粒子は、オリゴヌクレオチド配列の５’末端に組み込まれるノルボルネン修飾リン酸を含有し得る。これらには、それだけに限らないが、当技術分野（Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら Ｐｏｓｔ－Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ Ｉｎｖｅｒｓｅ－Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２（２０１０）８８４６－８８４７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｊａ１０２８７１ｐ．）で記載されるアジドメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－イルメチル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト、およびリン中心とアジド部分との間の任意のメチレン伸長が含まれ得る。メチレンの代わりにエチレングリコール単位を使用してもよい（図７）。

【0044】

ナノ粒子は、任意のチオール部分を含有し得る。これは、化学的に修飾されたヌクレオチドを介するものであり得る（図５）チオール修飾ヌクレオチドは、糖上、２’位、またはヌクレオチド塩基上で修飾され得る。例えば、限定されないが、糖修飾核酸ナノ粒子は、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－（ヒドロキシメチル）－４－（２－メルカプトエトキシ）テトラヒドロフラン－３－オール（チオールＡ）、４－アミノ－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－（２メルカプトエトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－オン（チオールＣ）、２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－（２－メルカプトエトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）－１，９－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン（チオールＧ）、１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－（２－メルカプトエトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン（チオールＵ）の１またはそれより多くを含有し得る。糖と硫黄原子との間に任意の数のメチレン伸長が可能である。メチレンの代わりにエチレングリコール単位を使用してもよく、上記の組み合わせを使用してもよい。

【0045】

硫黄修飾ヌクレオチドとの可能なコンジュゲーション反応には、ジスルフィド形成（Ｆ．Ｇａｕｔｈｉｅｒら Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ＲＮＡ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｒｅｄｕｃｉｂｌｅ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｌｉｎｋｅｒ Ａｔｔａｃｈｅｄ ａｔ ｔｈｅ ２’－ＯＨ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｃａｒｂａｍａｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１９（２０１９）５６３６－５６４５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｅｊｏｃ．２０１９００７４０．）、チオール－エンラジカル反応（Ａ．Ｂ．Ｌｏｗｅ、Ｔｈｉｏｌ－ｅｎｅ’’ｃｌｉｃｋ’’ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｃｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒ ａｎｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ ｆｉｒｓｔ ｕｐｄａｔｅ、Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．５（２０１４）４８２０－４８７０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ４ｐｙ００３３９ｊ．）、チオール－インラジカル反応（［１］Ａ．Ｂ．Ｌｏｗｅ、Ｔｈｉｏｌ－ｙｎｅ’ｃｌｉｃｋ’／ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｒｅｃｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒ ａｎｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｇｕｉｌｄｆ）．５５（２０１４）５５１７－５５４９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｐｏｌｙｍｅｒ．２０１４．０８．０１５．）、チオール－マイケル付加（Ｒ．Ｍ．Ｈｅｎｓａｒｌｉｎｇ、Ｔｈｉｏｌ－ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ ’’ｃｌｉｃｋ’’ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：Ｒａｐｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｓｕｒｆａｃｅｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２（２０１１）８８－９０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ０ｐｙ００２９２ｅ．）、チオール－イソシアネート（Ｒ．Ｍ．Ｈｅｎｓａｒｌｉｎｇ、Ｔｈｉｏｌ－ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ ’’ｃｌｉｃｋ’’ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：Ｒａｐｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｓｕｒｆａｃｅｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２（２０１１）８８－９０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ０ｐｙ００２９２ｅ．）またはチオール－エポキシド開環（Ｍ．Ｃ．Ｓｔｕｐａｒｕ、Ｔｈｉｏｌ－ｅｐｏｘｙ’’ｃｌｉｃｋ’’ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｓｔｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．５４（２０１６）３０５７－３０７０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｐｏｌａ．２８１９５．）が含まれる（図９）。

【0046】

ナノ粒子は、任意のアミン部分を含有し得る。これは、化学的または酵素的に修飾されたヌクレオチドまたはホスホロアミダイトを介するものであり得る。アミン修飾ヌクレオチドは、糖上、２’位、またはヌクレオチド塩基上で修飾され得る。例えば、限定されないが、糖修飾核酸ナノ粒子は、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－（２－アミノエトキシ）－２－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－３－オール（アミノＡ）、４－アミノ－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（２－アミノエトキシ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－オン（アミノＣ）、２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（２－アミノエトキシ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－１，９－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン（アミノＧ）、１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（２－アミノエトキシ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオンの１またはそれより多くを含有し得る。糖とアミノ基との間に任意の数のメチレン伸長が可能である。メチレンの代わりにエチレングリコール単位を使用してもよい（図５）。

【0047】

四フッ化チオニル（ＳＯＦ_４）は、生体適合性の高いクリックケミストリーハンドルとして登場した。Ｓｈａｒｐｌｅｓｓおよび共同研究者らは近年、このハンドルを有する一連のコンビナトリアルＤＮＡタグを開発した（Ｆ．Ｌｉｕら Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ＳｕＦＥｘ Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｉｏｎｙｌ Ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＳＯＦ４）－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｈｕｂｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ ＤＮＡ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２０１９）８０２９－８０３３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１９０２４８９．）。本発明では、任意の求核試薬修飾オリゴヌクレオチド鎖がＳＯＦ_４基と反応するため、構築物に結合する基質上で任意のＳｕＦＥｘ修飾が起こる。

【0048】

四フッ化チオニルハンドルを、別のクリック官能基を有する分子にコンジュゲートしてもよい。

【0049】

従来のクリックケミストリーに加えて、例えば、パラジウム錯体を使用したチオールアリール化（（Ｅ．Ｖ．Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖａら、Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ ｐａｌｌａｄｉｕｍ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ．５２６（２０１５）６８７－６９１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１５７３９．）、オキシムライゲーション（Ｊ．Ｙ．Ａｘｕｐら Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９（２０１２）１６１０１－１６１０６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１１０２３１０９．）、ヒドラゾン形成（Ｄ．Ｋ．Ｋｏｅｌｍｅｌら、Ｏｘｉｍｅｓ ａｎｄ Ｈｙｄｒａｚｏｎｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１７（２０１７）１０３５８－１０３７６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｃｈｅｍｒｅｖ．７ｂ０００９０．）によって、またはカテプシンＢ応答性リンカーを介して（Ｆ．Ｂｒｙｄｅｎら、Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｌｉｎｋｅｒｓ ｏｎ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６（２０１８）１８８２－１８８９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ７ｏｂ０２７８０ｊ．）、直接的な共有結合的付着が達成され得る。

【0050】

共有結合安定化構造を生成するためのクリックケミストリーの使用
クリックケミストリーは、オリゴヌクレオチドの形成におけるライゲーション戦略として広く使用されている；リン酸骨格をトリアゾールで置き換えることによって生成された材料は、例えば、高い熱力学的安定性および酵素分解に対する増加した耐性を有する（Ａ．Ｈ．Ｅｌ－Ｓａｇｈｅｅｒら Ｃｌｉｃｋ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４５（２０１２）１２５８－１２６７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｒ２００３２１ｎ．）。本発明は、この原理を利用して、核酸ナノ粒子により高い安定性を付与する。

【0051】

ナノ粒子は、シュードノット、キッシングヘアピン、およびヘアピンループ、３ウェイジャンクションおよび４ウェイジャンクションにクリック部分を含有し得る（図２）。これらの修飾はまた、二本鎖全体に散在していてもよく、各核酸鎖全体の様々な点でリン酸骨格の代わりに存在していてもよい。

【0052】

ヘアピンおよび他の円形高次構造もまた、クリックケミストリーを介して形成され得る。Ｇ－ＣおよびＣ－Ｇ塩基対で構成されるヘアピンステムを生成するためのアルキンとアジドとの間の１，３－双極子付加環化が当技術分野で示されている（Ａ．Ｋｉｌｉｓｚｅｋら Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｈａｉｒｐｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｎｏｎ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４５（２０１７）４－１２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｘ１２２．）。この方法論は、円形構造を生成するために本発明で使用され得る。オリゴヌクレオチドの樹脂上合成（ｏｎ－ｒｅｓｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）もまた、環状構造を生成するために使用され得る（Ｊ．Ｌｉｅｔａｒｄら Ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｗａｖｅｓ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７３（２００８）１９１－２００．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｊｏ７０２１７７ｃ．）。

【0053】

官能化ヌクレオチドの製造方法
２，２’－アンヒドロ－１－（β－Ｄ－アラビノフラノシル）ウラシルは、ヌクレオシドケミストリーにおける重要な中間体として広く使用されており（Ａ．Ｍｉａｈら、２’，３’－Ａｎｈｙｄｒｏｕｒｉｄｉｎｅ．Ａ ｕｓｅｆｕｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．－Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１．（１９９８）３２７７－３２８３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ａ８０３５６３ｆ．）、その合成に向かう様々な経路が当技術分野で示されている（欧州特許出願公開第１９９２６３２Ａ１号）。この中間体の求核開環は、多くの異なる官能基の結合を可能にし、ユニバーサル核酸ナノ粒子の設計および開発において特に有用である。この反応は極めて非効率的であり、過酷な条件（１２０℃超、複数当量の強ルイス酸）の使用を必要とする。

【0054】

これらの制限を克服するために、２，２’－アンヒドロ－１－（β－Ｄ－アラビノフラノシル）ウラシルを、以下の試薬：ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジオキサン、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、ＤＭＦ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルプロピレン尿素（ＤＭＰＵ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびその組み合わせの１またはそれより多く；温度：室温～１６０℃；塩基（以下を含むが、これに限定されない）：バリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド、２－ｔｅｒｔ－ブチルイミノ－２－ジエチルアミノ－１，３－ジメチル－ペルヒドロ－１，３，２－ジアザホスホリン、ｎ－ブチルリチウム、ｓｅｃ－ブチルリチウム、ｔｅｒｔ－ブチルリチウム、ｄａｂｃｏ（登録商標）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルメチルアミン、ジメチルアミン、４－（ジメチルアミノ）ピリジン、エチルアミン、Ｎ－エチルジイソプロピルアミン、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド、リチウムｔｅｒｔ－ブトキシド、リチウムジシクロヘキシルアミド、リチウムジエチルアミド、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムジメチルアミド、リチウムエトキシド、リチウムイソプロポキシド、リチウムメトキシド、リチウム２，２，６，６－テトラメチルピペリジド、マグネシウムビス（ヘキサメチルジシラジド）、メチルアミン、メチルリチウム、モルホリン、ピペリジン、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、カリウムエトキシド、カリウムメトキシド、トリエチルアミン；ルイス酸（以下を含むが、これに限定されない）：臭化アルミニウム、塩化アルミニウム、アルミニウムイソプロポキシド、三塩化ホウ素（およびその様々な錯体）、三フッ化ホウ素（およびその様々な錯体）、ジシクロヘキシルボロン、臭化鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、モンモリロナイトＫ１０＆Ｋ３０、塩化スズ（ＩＶ）、塩化チタン（ＩＶ）、チタン（ＩＶ）イソプロポキシド、四塩化チタンで処理する。

【0055】

ＦｌＩＣｋケミストリー
蛍光イソインドール架橋（ＦｌＩＣｋ）反応は、近年、ペプチドの二次構造を安定化するための貴重なツールとして浮上した（Ｍ．Ｔｏｄｏｒｏｖｉｃら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｓｏｉｎｄｏｌｅ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ（ＦｌＩＣｋ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ Ｒａｐｉｄ，Ｕｓｅｒ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ Ｓｔａｐｌｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２０１９）１４２５８－１４２６２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１９０９７１９．）。この反応では、オルト－フタルアルデヒドを遊離アミン基およびチオール基を有する高分子に添加し、結果として生じる縮合反応により蛍光イソインドールが得られる。次いで、イソインドール基が、そのペプチド二次構造を安定化することができ、また、インビトロおよびインビボ研究に使用することができる蛍光シグナルを生成する。

【0056】

このような反応は、核酸ナノ粒子構築物の安定化を可能にし、生物学的研究のための固有蛍光を提供する（図１１）。蛍光イソインドール色素は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第９４１２９５５号および国際公開第２０１２／０２２９４５号に記載されている。この方法論は、鎖安定化に加えてフルオロフォアが生成されるので、他のステープリング方法よりも有利である。これはまた、さらなる蛍光部分の結合の使用を無効にする。

【0057】

蛍光部分を生成するために、チオール含有ヌクレオチドは、アミン修飾を有する隣接ヌクレオチドの近くに配置される必要がある。これらは、同じオリゴヌクレオチド鎖上、または二本鎖の対向する鎖上のヌクレオチドであり得る。これらはまた、キッシングステム－ループの一部であってもよい。次いで、組み立てられた核酸ナノ粒子構築物を、オルト－フタルアルデヒドまたはその類似体で処理する。

【0058】

オルト－フタルアルデヒド類似体は、既知の蛍光色素にコンジュゲートされたジアルデヒドを含み得る。これらには、それだけに限らないが、フルオレセイン、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ、４－ＭＵ、ピレン、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＳＲｈ_１０１、Ｒｈ_１１０、レソフリン、ＤＡＰＩ、またはＮＢＤが含まれ得る（図１２）。

【0059】

ＦｌＩＣｋステープリングは、アミンおよびチオール修飾ヌクレオチドを利用する。さらに、組成物はまた、蛍光タグ部位；チオール基およびアミン基が同じ分子上で４～５個の結合の範囲内で離れている新規なチオール－アミン系ヌクレオチドを組み込んでもよい。その例は、１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（３－アミノ－２－（メルカプトメチル）プロポキシ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオンとして以下に与えられる。

【化1】

【0060】

結合カーゴの機能
上に概説される修飾は、様々な官能基の結合を可能にする。これらには、それだけに限らないが、細胞傷害性薬物および他の治療薬、ｍＲＮＡ折り紙（mRNA origami）、エンドソーム脱出のメディエーターおよびタンパク質コロナを操作する部分が含まれる。これらの実体は、低分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、またはその組み合わせであり得る。

【0061】

細胞侵入
カーゴ分子の細胞内標的化は、治療カーゴを送達するために核酸ナノ粒子を使用する組成物の開発における重要な課題である。本発明は、具体的には、カーゴ分子の治療有効性を改善するための１またはそれを超える細胞侵入機序を有し、ＵＳＰＴＯ６２／８９４，３９０で行われた研究の拡張であるナノ粒子を含む組成物を提供することによって、この課題に対処する。

【0062】

エンドサイトーシスは、形質膜からの小胞の出芽および小胞のリソソームへのルーティングを伴い、ここではエンドサイトーシスされたカーゴが分解される。エンドソーム内のｐＨはリソソームへの経路で低下し、リソソームの酸性環境は高分子の分解を支持する。結果として、カーゴ分子を核酸ナノ粒子に結合させるためのｐＨ感受性リンカーの使用は、循環血液または他の細胞外環境の中性ｐＨでの確実な結合を可能にするが、小胞エンドサイトーシス経路におけるナノ粒子からのカーゴの放出を可能にする。例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕｊｒａｔｉ Ｍら、Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐＨ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ Ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２０１６ Ｊａｎ ２０；２７（１）：１９－３５，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｏｎｊｃｈｅｍ．５ｂ００５３８を参照されたい。

【0063】

エンドソーム脱出を促進するための１つのアプローチは、ヌクレオチドを修飾する、および／またはＲＮＡナノ粒子中のヌクレオチドに特定の特性を有する低分子をコンジュゲートすることである。修飾または付加は、ヌクレオチドの２’位、ヌクレオチドの塩基、またはリン含有骨格であり得る。例えば、限定されないが、コンジュゲートは、以下：２’－Ｏ－イミダゾールアセチル修飾、２’－Ｏ－［Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエトキシ］エチル修飾、アルキル－ホスホロチオエート、アミン（例えば、異なるｐＫａ値を有する第一級、第二級、第三級、およびイミダゾールアミンの組み合わせ）、コレステロール脂質、エンドソーム増強ドメイン、フッ化アルキン鎖、グアニジノブチルホスホロアミデート、疎水性基、正に荷電した部分、トリエチレングリコール、およびトリフルオロメチルキノリンであり得るか、またはこれらを含み得る。このような修飾は、他の種類の高分子のエンドソーム脱出を促進するために使用されてきた。例えば、トリプトファンまたはフェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸は、エンドソーム膜との相互作用および細孔形成のためにエンドソーム脱出を増強することができる。異なるｐＫａ値を有する第一級、第二級、第三級、およびイミダゾールアミンの組み合わせを含むアミンは、ｐＨ５～７でプロトン化され、粒子膜を破裂させ、カーゴをサイトゾルに放出することによってエンドソーム脱出を促進する。エンドソーム脱出を促進するための前記戦略の多くは、例えば、その各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉｕ ＤおよびＡｕｇｕｓｔｅ ＤＴ、Ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｆｒｏｍ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅｓ、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１５年１２月１０日；２１９：６３２－６４３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ．２０１５．０８．０４１；Ｓｉｎｇｈ ＤＤら、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｓｅｍｉｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２０１９年６月１９日．ｐｉｉ：Ｓ１０８４－９５２１（１８）３０１１１－３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｅｍｃｄｂ．２０１９．０５．００７；およびＬｏｎｎ Ｐら、Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｅｓｃａｐｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６年９月８日；６：３２３０１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３２３０１；Ｇｕｊｒａｔｉ Ｍら、Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐＨ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ Ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２０１６年１月２０日；２７（１）：１９－３５，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｏｎｊｃｈｅｍ．５ｂ００５３８；Ｄｅｇｌａｎｅ，Ｇ．ら、Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｇｒｏｕｐ ｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，２００６ ７（４）：６８４－９２頁、ＤＯＩ：１０．１００２／ｃｂｉｃ．２００５００４３３；Ｐｒｈａｖｃ，Ｍ．ら、２’－Ｏ－［２－［２－（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ］ｅｔｈｙｌ］ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ ｏｆ ｃｈａｒｇｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｓｔｅｒｅｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ、Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ、２００３．５（１２）：２０１７－２０頁、ＤＯＩ：１０．１０２１／ｏｌ０３４０９９１；Ｓｈｅｎ，Ｗ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ，２０１６．４（３９）：６４６８－６４７４頁；およびＫｕｒｒｉｋｏｆｆ，Ｋら、Ｒｅｃｅｎｔ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ、２０１６、１３（３）：３７３－８７頁、ＤＯＩ：１０．１５１７／１７４２５２４７．２０１６．１１２５８７９；Ｇｉｌｌｅｒｏｎ Ｊら、Ｉｍａｇｅ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３年７月；３１（７）：６３８－４６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６１２に記載されている。

【0064】

エンドサイトーシスまたはその他のいずれかを介して細胞侵入を促進する以下の分子の１またはそれより多くをナノ粒子中の核酸にコンジュゲートすることができる：ＵＮ ７９３８、トリフルオロメチルキノリン、ＵＮ ２３８３、ＣＰＷ１Ｆ１０、ＣＢＮ４０Ｄ１２、ＡＤＤ４１ Ｄ１４、ＡＤＤ２９ Ｆ１５、ＣＢＮ４０Ｈ１０、ＣＢＮ４０ Ｋ７、ＢＡＤＧＥ、ＣＢＮ３５ Ｃ２１、ＣＢＮＯ５３ Ｍ１９、ＣＰＷ１－Ｊ１８、メトキシクロル、ＣＰＷ０９７ Ａ２０、ＬＯＭＡＴＩＮ、グアナベンズ、ＵＮＣ７９３８、ＣＰＭ２、３－（ペルフルオロブタ－１－イル）－１－ヒドロキシプロピル、３－（ペルフルオロヘキサ－１－イル）－１－ヒドロキシプロピル、３－デアザプテリジン、α－トコフェロール、ベラパミル、ニゲリシン、３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，９－ペンタデカフルオロノナン－２－オン、またはＮ１－エチル－Ｎ１－メチル－Ｎ２－（７－（トリフルオロメチル）キノリン－４－イル）エタン－１，２－ジアミン、ＴｆＲ－Ｔ１２、メリチン、ＨＡ２、葉酸、オクタ－アルギニンコンジュゲートステアリル－Ｒ８、ロック核酸、ペプチド導入ドメインおよびフッ化または過フッ化化合物。

【0065】

いくつかの実施形態では、核酸ナノ粒子が、以下に示される、グアニジノブチルホスホロアミデートを有する：

【化2】

【0066】

いくつかの実施形態では、核酸ナノ粒子が、以下に示される、２’－Ｏ－イミダゾールアセチル修飾を有する：

【化3】

【0067】

いくつかの実施形態では、核酸ナノ粒子が、以下に示される、２’－Ｏ－［Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシ］エチル修飾を有する：

【化4】

【0068】

いくつかの実施形態では、核酸ナノ粒子が、コアＮＰ上にアームとして結合したトリエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを介してコンジュゲートしたコレステロール脂質を有するｄｓＤＮＡを有する。

【0069】

いくつかの実施形態では、核酸ナノ粒子が、ＲＮＡの分子に直接結合したコレステロールを有する。

【0070】

いくつかの実施形態では、核酸ナノ粒子が、ｄｓＤＮＡまたはｄｓＲＮＡに結合したアルキルホスホロチオエート（ＰＰＴ）の疎水性ベルトを有する。

【0071】

いくつかの実施態様では、核酸ナノ粒子が、約５．０～約７．０のｐＫａを有する成分を有する。

【0072】

いくつかの実施形態では、核酸ナノ粒子が疎水性成分を有する。

【0073】

いくつかの実施形態では、核酸ナノ粒子が、約７．０のｐＨで正に帯電している成分を有する。

【0074】

いくつかの実施形態では、核酸ナノ粒子がペプチドを有する。ペプチドは、表１の配列の１またはそれより多くを含み得る。

【表1】

【0075】

いくつかの実施形態では、核酸ナノ粒子が、疎水性部分と、親水性部分と、ヌクレオチド結合部分とを含む成分を有する。例えば、限定されないが、成分は以下の構造を有し得る：

【化5】

【0076】

親水性部分はアミンを含み得る。親水性部分は、スペルミン、エチレンジアミン、メチルエチレンジアミン、エチルエチレンジアミン、イミダゾール、スペルミン－イミダゾール－４－イミン、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－グアニジニルエチレンイミン、ジメチルアミノエチルアクリレート、アミノビニルエーテル、４－イミダゾール酢酸、ジエチルアミノプロピルアミド、スルホンアミド（例えば、スルファジメトキシン スルファメトキサゾール、スルファジアジン、スルファメタジン）、アミノケタール、Ｎ－２－ヒドロキシルプロピルチメチルアンモニウムクロリド（Ｎ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｌｐｒｏｐｙｌｔｉｍｅｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、イミダゾール－４－イミン、メチル－イミダゾール、２－（アミノメチル）イミダゾール、４－（アミノメチル）イミダゾール、４（５）－（ヒドロキシメチル）イミダゾール、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（（２－アミノエチル）（メチル）アミノ）プロパンアミド、２－（２－エトキシエトキシ）エタン－１－アミン、ビス（３－アミノプロピル）アミン、［Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシ］エチル、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（（２－アミノエチル）（エチル）アミノ）プロパンアミド、（Ｎ－（アミノエチル）カルバモイル）メチル、Ｎ－（２－（（２－アミノエチル）アミノ）エチル）アセトアミド３，３’－（（２－アミノエチル）アザンジイル）ビス（Ｎ－（２－アミノエチル）プロパンアミド）、グアニジルベンジルアミド、［３－（グアニジニウム）プロピル］、ジメチルエタノールアミン、１－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルメタンアミン、２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン、Ｎ－（２－（（２－（２－アミノエトキシ）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）アセトアミド、アミノブチル、アミノエチル、１－（２－アミノエチル）－３－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）－２－エチルグアニジン、１－（３－アミノ－３－オキソプロピル）－２，４，６－トリメチルピリジン－１－イウム、１－（１，３－ビス（カルボキシオキシ）プロパン－２－イル）－２，４，６－トリメチルピリジン－１－イウム、グアニジニルエチルアミン、エーテルヒドロキシルトリアゾール、またはβ－アミノエステルであり得る。

【0077】

ヌクレオチド結合部分はシステインであり得る。

【0078】

核酸ナノ粒子は、受容体に依存しない方法でカーゴ分子の細胞侵入を促進し得る。核酸ナノ粒子は、受容体に依存する方法でカーゴ分子のエンドソーム脱出を促進し得る。核酸ナノ粒子は、細胞内の受容体に結合する成分を含有し得る。受容体に結合する成分は、葉酸、ＴｆＲ－Ｔ_１２、またはヘマグルチニンペプチドであり得る。

【0079】

組成物は、上記のリンカーのいずれかを含有し得る。

【0080】

いくつかの実施形態では、核酸ナノ粒子が、アジドメチル－メチルマレイン酸無水物リンカーを介して細胞取り込みを増加させることができる部分に結合され得る（図１３）（Ｋ．Ｍａｉｅｒら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４（２０１２）１０１６９－１０１７３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｊａ３０２７０５ｖ．）。

【0081】

組成物は、上記の核酸ナノ粒子のいずれかを含有し得る。核酸ナノ粒子は、上記の修飾ヌクレオチド（およびその誘導体）のいずれかを含有し得る。誘導体は、２’位に様々なリンカー長、または塩基上で置換された様々な基を含み得る。

【0082】

上記の修飾に加えて、以下の部分（およびその誘導体）をヌクレオチド骨格に直接結合させることができる：

【化6】

【0083】

誘導体は、２’位に様々なリンカー長、または塩基上で置換された様々な基を含み得る。

【0084】

エンドソーム脱出に加えて、核酸ナノ粒子は、脂質二重層と動的に相互作用することができる分子で装飾され得る。ＤＮＡナノポアは、脂質二重層を穿孔し、水溶性分子の細胞内への直接輸送を促進することができることが示されている（Ｊ．Ｒ．Ｂｕｒｎｓら、Ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｓｐａｎｎｉｎｇ ＤＮＡ ｎａｎｏｐｏｒｅｓ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．５３（２０１４）１２４６６－１２４７０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１４０５７１９．）。これらのナノポアは、アンカーコレステロール基を利用する；２つのＤＮＡ二本鎖当たり１つのコレステロール基が、高い穿孔活性を生じる（Ｏ．Ｂｉｒｋｈｏｌｚら、Ｍｕｌｔｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｔｈａｔ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｒｅｍｏｄｅｌ ｌｉｐｉｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｉｎｔｏ ｈｙｂｒｉｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９（２０１８）１５２１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０２９０５－ｗ．）。上記のコレステロール部分は、核酸ナノ粒子にコンジュゲートされ、ナノ粒子取り込みを媒介するのを助けることができる。

【0085】

細胞傷害性ヌクレオシド
細胞傷害性カーゴの直接結合に加えて、本発明の組成物は、オリゴヌクレオチド鎖または核酸ナノ粒子に埋め込まれた細胞傷害性ヌクレオシドを含み得る。これらのヌクレオシドには、それだけに限らないが、アリストマイシン（ａｒｉｓｔｏｍｙｃｉｎ）、ネオプラノシンＡ、リバビリン、ピラゾフリン、シタラビンアラビノシド（ａｒａ－Ｃ）、ゲムシタビン、２－ＣｄＡ、ショードマイシンおよびチアゾフリンならびにその組み合わせが含まれ得る（図１４）。現在使用されている治療用ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体は、内因性ヌクレオシドまたはヌクレオチドと同じ代謝経路を利用し、代謝拮抗薬として作用する。細胞に侵入すると、化合物は、ヌクレオシドキナーゼおよび／またはヌクレオシド一リン酸キナーゼによって、次いで、さらなる細胞キナーゼまたはホスホリボシルトランスフェラーゼによってリン酸化される。これはしばしば化合物活性化をもたらす。診療所における多くの現在の細胞傷害性ヌクレオシドおよびヌクレオチドは耐性になりやすいため、核酸ナノ粒子送達システム内の組み合わせアプローチは、この問題を回避するのに役立ち得る。これらのプロヌクレオチド修飾は当技術分野で記載されており、参照により本明細書に組み込まれる；Ｂ．Ｃｏｌｉｎら Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒｉｅｓｔｅｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ＡｒａＣ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７（１８）（１９８９）７１９５－７２０１．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／１７．１５．６０６５；Ｃ．ＭｃＧｕｉｇａｎら Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒｉｅｓｔｅｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ ｄｒｕｇ ＡｒａＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７（１５）（１９８９）６０６５－６０７５．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／１７．１５．６０６５；Ｃ．ＭｃＧｕｉｇａｎら Ａｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ＡＺＴ ｒｅｔａｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ１ ｉｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＺＴ、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．１７（４）（１９９２）３１１－３２１．ｄｏｉ：１０．１０１６／０１６６－３５４２（９２）９００２６－２；Ｊ．Ｂａｌｚａｒｉｎｉら Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｔｉ－ＨＩＶ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｓｋｅｄ ａｌａｎｉｎｙｌ ｄ４Ｔ－ＭＰ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３（１４）（１９９６）７２９５－７２９９．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．９３．１４．７２９５；Ｔ．－Ｆ．Ｃｈｏｕら Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ ｐｒｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉａｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４（２）（２００７）２０８－２１７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ０６００７０ｙ；Ｔ．Ｗ．Ａｂｒａｈａｍら Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅｓ ｏｆ ５－ｆｌｕｏｒｏ－２ ’－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ １－β－ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９（２３）（１９９６）４５６９－４５７５．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｍ９６０３６８０；Ｊ．Ｋｉｍら Ｄｉｒｅｃｔ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ａ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ Ｐｒｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｙ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ＬＣ－ＥＳＩ－－ＭＳ／ＭＳ、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１（２）（２００４）１０２－１１１．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ０３４０３３８；Ｃ．Ｃｏｎｇｉａｔｕら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｓｏｍｅ ｐｒｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｓｅ Ｈｉｎｔ１、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２６（８－９）（２００７）１１２１－１１２４．ｄｏｉ：１０．１０８０／１５２５７７７０７０１５２１６５６；Ｐ．Ｗｉｐｆら Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｈｅｍｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｏｆ ａｒａ－Ｃ ｗｉｔｈ ｖａｒｉａｂｌｅ ｔｉｍｅ－ｒｅｌｅａｓｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１０）（１９９６）１５８５－１５９６．ｄｏｉ：１０．１０１６／０９６８－０８９６（９６）００１５３－８；Ｓ．Ｃ．Ｔｏｂｉａｓら Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ ｐｒｏｄｒｕｇ、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１（２）（２００４）１１２－１１６．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ０３４０１９ｖ．。

【0086】

上記修飾は、核酸ナノ粒子を形成するオリゴヌクレオチド内に直接埋め込まれ得る。

【0087】

デオキシシチジン類似体、ａｒａ－Ｃは、その有効性を低下させる耐性機序を起こしやすい。これに対抗するために、エラシタラビンとして知られる、ａｒａ－Ｃのエライジン酸エステルが開発されている（Ａ．Ｃ．Ｂｕｒｋｅら Ｅｌａｃｙｔａｒａｂｉｎｅ－ｌｉｐｉｄ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ２０（１２）（２０１１）１７０７－１７１５．ｄｏｉ：１０．１５１７／１３５４３７８４．２０１１．６２５００９；Ｓ．Ｏ’ｂｒｉｅｎ、Ｅｌａｃｙｔａｒａｂｉｎｅ ｈａｓ ｓｉｎｇｌｅ－ａｇｅｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋａｅｍｉａ、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１５８（５）（２０１２）５８１－５８８．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５－２１４１．２０１２．０９１８６．ｘ）。本発明は、５’末端の、３’末端の、またはオリゴヌクレオチド鎖内に埋め込まれたこの修飾を含み得る。

【0088】

多くのヌクレオシド化合物の細胞傷害性の欠如の一般的な理由は、それらがヌクレオシドキナーゼまたは他の活性化酵素によって一リン酸レベルに活性化され得ないことである（Ｊ．Ｄ．Ｒｏｓｅら、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（２００２）４５０５－４５１２．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｍ０２０１０７ｓ．）。したがって、これらのヌクレオシドは、一リン酸プロドラッグとしてペンダント部分として結合され得る。

【0089】

細胞傷害性ヌクレオシドは、グルタチオン応答性ジスルフィド結合などの刺激応答性リンカーに結合され得る。２－（（３－（（２－シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル（phosphaneyl））プロピル）ジスルファニル）エチルメチルカーボネートなどのジスルフィド含有ホスホロアミダイトは、５’末端、３’末端に組み込まれ得る、またはオリゴヌクレオチド鎖内に埋め込まれ得る。このジスルフィドにコンジュゲートした細胞傷害性プロドラッグの例は、５－フルオロウラシルである（図１４）。

【0090】

クリックケミストリーを使用して細胞傷害性化合物を生成することもできる。フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｃ－Ｔ）は、多くの重要な糖類の生合成および発現における最終グリコシル化ステップを触媒する酵素である。これらは、がん転移を含むいくつかの病態に関連しており、ヌクレオチド様化合物によるそれらの阻害が広く研究されている（Ｌ．Ｖ．Ｌｅｅら Ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ α－１，３－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｖｉａ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５（２００３）９５８８－９５８９．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ０３０２８３６．）。本発明は、トリアゾール連結核酸を含み得る。トリアゾール連結を介して生成される細胞傷害性化合物の例としては、Ｎ－（［１，１’－ビフェニル］－４－イルメチル）－５－（４－（（（３－（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）－１，１，３，３－テトラオキソ－１λ^６，３λ^６－ジホスホキサニル（diphosphoxaneyl））オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ペンタンアミドが挙げられる（図１５）。

【0091】

ナノ粒子は、５’または３’末端に組み込まれたハイブリッドを含有し得る。これらには、Ｗａｎｇによって記載されたボロン酸担体（図１６）（Ｎ．Ｌｉｎら Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｏｒｏｎｉｃ－ａｃｉｄ－ｌａｂｅｌｅｄ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ＤＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５（４）（２００７）１２２２－１２２９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｌ１０９１；Ｍ．Ｌｉら Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｐｔａｍｅｒｓ ｆｏｒ ａ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｉｅｔｙ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０（３８）（２００８）１２６３６－１２６３８．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ８０１５１０ｄ）および鎖カルボランまたは金属－カルボラン錯体（図１７）（Ａ．Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋら ２’－ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｂｅａｒｉｎｇ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃａｒｂｏｒａｎｅ ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２６（１０－１２）（２００７）１６１１－１６１３．ｄｏｉ：１０．１０８０／１５２５７７７０７０１５４８７３３；Ｂ．Ａ．Ｗｏｊｔｃｚａｋら ’’Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ’’：Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｏｒｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｓ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４（３４）（２００８）１０６７５－１０６８２．ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｈｅｍ．２００８０１０５３）が含まれ得る。

【0092】

核酸ナノ粒子はまた、５’末端に、３’末端に組み込まれた、またはオリゴヌクレオチド鎖内に埋め込まれた、またはクリックケミストリーを介して合成後に組み込まれた任意のリン酸プロドラッグを保有し得る。このような修飾には、９－［２－（ホスホノメトキシ）エチル］アデニン（ＰＭＥＡ）のビス（Ｓ－アシル－２－チオエチル）エステル誘導体（図１８）（Ｓ．Ｂｅｎｚａｒｉａら Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｂｉｓ（Ｓ－ａｃｙｌ－２－ｔｈｉｏｅｔｈｙｌ）ｅｓｔｅｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ９－［２－（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ］ａｄｅｎｉｎｅ（ＰＭＥＡ）ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ＰＭＥＡ ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｒａｌ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９（２５）（１９９６）４９５８－４９６５．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｍ９６０２８９ｏ）、シクロＳａｌプロヌクレオチド（Ｃ．Ｍｅｉｅｒら Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｃｌｏＳａｌ－ｐｒｏｄｒｕｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．７１（２－３）（２００６）２８２－２９２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｎｔｉｖｉｒａｌ．２００６．０４．０１１；Ｃ．Ｍｅｉｅｒら Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏ Ｓａｌ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｆ ａｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ、Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．９（５）（１９９８）３８９－４０２．ｄｏｉ：１０．１１７７／０９５６３２０２９８００９００５０３；Ｏ．Ｒ．Ｌｕｄｅｋら Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｃ α－，ｉｓｏ－ａｎｄ ３’－ｅｐｉ－ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ２００６（０８）（２００６）１３１３－１３２４．ｄｏｉ：１０．１０５５／ｓ－２００６－９２６４１１）、ＨｅｐＤｉｒｅｃｔプロドラッグ；肝細胞におけるシトクロムＰ４５０触媒酸化的開裂反応後に直接肝臓標的化送達をもたらすリン酸およびホスホン酸プロドラッグ（図１９）（Ｍ．Ｄ．Ｅｒｉｏｎ、Ｌｉｖｅｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ＨｅｐＤｉｒｅｃｔ ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３１２（２）（２００５）５５４－５６０．ｄｏｉ：１０．１１２４／ｊｐｅｔ．１０４．０７５９０３；Ｓ．Ｈ．Ｂｏｙｅｒ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｌｉｖｅｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｄｒｕｇ ｏｆ ｃｙｔｏｓｉｎｅ－１－β－Ｄ－ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９（２６）（２００６）７７１１－７７２０．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｍ０６０７４４９；Ｍ．Ｄ．Ｅｒｉｏｎら Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ３Ａ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｄｒｕｇｓ（ｈｅｐｄｉｒｅｃｔ ｐｒｏｄｒｕｇｓ）ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈ（ｏｎ）ａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇｓ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６（１６）（２００４）５１５４－５１６３．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ０３１８１８ｙ；Ｋ．Ｙ．Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ、Ａｌｋｏｘｙａｌｋｙｌ ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｏｆ ａｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｏｒａｌ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．８２（２）（２００９）Ａ８４－Ａ９８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｎｔｉｖｉｒａｌ．２００９．０１．００５）、オクタデシルオキシエチル－シドホビル（ＯＤＥ－ＣＤＶ）（図２０）（Ｇ．Ｒ．Ｐａｉｎｔｅｒら Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｏｒａｌ ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｍａｌｌｐｏｘ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（８）（２００４）４２３－４２７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｔｅｃｈ．２００４．０６．００８）が含まれる。

【0093】

この節で言及される治療用部分の全ては、核酸ナノ粒子を形成するオリゴヌクレオチド内に直接埋め込まれ得る。

【0094】

コンビナトリアル鎖
ナノ粒子上の各結合点における特異なカーゴ分子の直接結合に加えて、本発明の組成物はまた、他のカーゴ分子に連結されているカーゴ分子を含み得る（図２１）。カーゴ分子はまた、ナノ粒子の非存在下で他のカーゴ分子に連結され得る。

【0095】

「コンビナトリアル鎖」とも呼ばれるこれらの連結されたカーゴ分子（図２１）には、それだけに限らないが、細胞の内部または外部で機能および／または生物学的効果を促進する分子（例えば、ＩＲＥＳ、リボソーム動員、サイトカイン刺激）、細胞への侵入を促進する分子（例えば、ペプチド、エンドソーム脱出化合物）、標的細胞に結合する分子（例えば、アプタマー、抗体、リガンド）、細胞傷害性化合物（例えば、細胞傷害性ヌクレオシド）、細胞内で遺伝子産物を発現する分子（例えばｍＲＮＡ）、化学療法化合物（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤）、細胞内で遺伝子をサイレンシングするか、または変化させる分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス治療、ｌｎｃＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ分子（例えば、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）、低分子治療（例えば、タンパク質－チロシンキナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤）、タンパク質、ペプチド、および診断薬が含まれ得る。

【0096】

コンビナトリアル鎖は、カーゴ分子の任意の組み合わせであり得、任意の長さであり得る。一実施形態では、これらが、ナノ構造体に連結されていてもいなくてもよいｓｉＲＮＡ、ペプチド、およびアプタマーコンビナトリアル鎖を含むことができる。別の実施形態では、コンビナトリアル鎖が、異なるまたは同じ標的遺伝子をサイレンシングするように設計された複数のｓｉＲＮＡ治療であり得る。さらなる実施形態は、同じコンビナトリアル鎖の一部を形成する化学療法薬およびｓｉＲＮＡなどの複数の治療を含み得る。別の実施形態では、カーゴ分子が、直線的に配置されて、または分岐した配置で連結されてコンビナトリアル鎖を形成し得る。

【0097】

コンビナトリアル鎖はナノ粒子に連結されていてもされていなくてもよい。複数の鎖が同じナノ粒子に連結されていてもよい。コンビナトリアル鎖は、核酸ナノ粒子および核酸から構築されていないナノ粒子（例えば、脂質およびポリマーナノ粒子ならびに抗体－薬物コンジュゲート）に連結することができる。

【0098】

コンビナトリアル鎖は、クリックケミストリーによってナノ粒子に結合することができる。手短に言えば、これらには、それだけに限らないが、ＣｕＡＡＣ、ＳＰＡＡＣ、ＲｕＡＡＣ、ＩＥＤＤＡ、ＳｕＦＥｘ、ＳＰＡＮＣ、ヒドラゾン／オキシムエーテル形成、チオール－エンラジカル反応、チオール－インラジカル反応、チオール－マイケル付加反応、チオール－イソシアネート反応、チオール－エポキシドクリック反応、求核開環反応（バネ荷重反応）、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションが含まれる。

【0099】

コンビナトリアル鎖は、足がかり相互作用によって核酸ナノ粒子に結合することもできる（Ｋ．Ａ．Ａｆｏｎｉｎら Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｉｎｉｍａｌ ＲＮＡ Ｔｏｅｈｏｌｄｓ ｔｏ Ｔｒｉｇｇｅｒ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．１６（２０１６）１７４６－１７５３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．５ｂ０４６７６．）。

【0100】

コンビナトリアル鎖を形成するカーゴ分子は、リンカー分子を介して互いに連結され得る。リンカー分子には、それだけに限らないが、チオール切断可能リンカー、例えばジチオビスマレイミドエタン、１，４－ビス［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタンおよび３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド、塩基切断可能リンカー、例えばビス［２－（Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニルオキシ）エチル］スルホンまたはヒドロキシルアミン切断可能リンカー、例えば（エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート））が含まれる。可逆性クリック部分、すなわち、メルドラム酸誘導体である５－（ビス（メチルチオ）メチレン）－２，２－ジメチル－１，３－ジオキサン－４，６－ジオンを使用して、カーゴ分子を架橋することもできる（Ｋ．Ｌ．Ｄｉｅｈｌら Ｃｌｉｃｋ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｄｅｃｌｉｃｋ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｍｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｉｏｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｖｉａ ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｃｃｅｐｔｏｒ、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．８（２０１６）９６８－９７３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｈｅｍ．２６０１．）。ダイサー基質を、それ自身で、または上記と組み合わせて使用してもよい。治療薬がサイトゾル放出を必要としない場合、非切断可能リンカーも使用され得る；これらには、それだけに限らないが、チオール反応性マレイミド（例えば、１，８－ビスマレイミド－ジエチレングリコール、１，１１－ビスマレイミド－トリエチレングリコール、１，４－ビスマレイミドブタン、ビスマレイミドヘキサン、ビスマレイミドエタン、トリス（２－マレイミドエチル）アミン）、チオール／アミン反応性リンカー（例えば、Ｎ－α－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、Ｎ－β－マレイミドプロピルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸、Ｎ－γ－マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）、スクシンイミジル６－（３（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジルヨードアセテート、スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート、ＰＥＧ化された長鎖ＳＭＣＣ架橋剤、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレートおよびスルホ－ＮＨＳ等価物）、ヒドロキシル／チオール反応性リンカー（例えば、ｐ－マレイミドフェニルイソシアネート）が含まれる。

【0101】

実施形態
実施形態では、本発明は、１またはそれを超えるカーゴ分子に共有結合的に連結したオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。

【0102】

実施形態では、組成物が、コンジュゲーションを可能にする反応性部位で官能化されており、核酸ナノ粒子に組み立てられているオリゴヌクレオチドを含む。

【0103】

実施形態では、核酸ナノ粒子がカーゴ分子に結合しており、核酸ナノ粒子が、対象におけるカーゴ分子の生物学的活性を促進するように官能化されている。

【0104】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、三量体、四量体、五量体または六量体である。

【0105】

実施形態では、本発明は、以下の特徴の少なくとも１つを含む少なくとも１つの反応を介して、核酸ナノ粒子を少なくとも１つのカーゴ分子に結合させるステップを含む方法を提供する：反応が１つのポットで行われる、反応が水によって妨害されない、反応が最小限の副産物を生成する、および反応が単一反応生成物を与える高い熱力学的駆動力を含む。

【0106】

実施形態では、本方法が、特徴の少なくとも１つを含む第１の反応を介して第１のカーゴ分子を結合させるステップと、特徴の少なくとも１つを含む第２の反応を介して第２のカーゴ分子を結合させるステップとを含み、第１の反応と第２の反応とが直交性である。

【0107】

実施形態では、第１の反応が、核酸ナノ粒子中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの鎖に対する修飾を含む。

【0108】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、銅（Ｉ）アジド－アルキン付加環化を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0109】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、歪み促進型アジド－アルキン付加環化を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0110】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、逆電子要請型ディールスアルダー反応を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0111】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、ジスルフィド結合を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0112】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、硫黄（ＶＩ）フッ化物交換を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0113】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、ヒドラゾン形成を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0114】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、チオール－エンラジカル付加を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0115】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、チオール－イン反応を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0116】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、チオール－マイケル付加を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0117】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、チオール－イソシアネートケミストリーを介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0118】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、チオール－エポキシドケミストリーを介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0119】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、求核開環反応を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0120】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションを介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0121】

実施形態では、１つの反応性官能基が、スペーサーまたはリンカーを介して別の反応性官能基に結合される。

【0122】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、刺激に応答性のリンカーを介して第１のカーゴに結合される。

【0123】

実施形態では、刺激が、ｐＨ、光、温度、還元電位または酸素濃度からなる群から選択される。

【0124】

実施形態では、核酸ナノ粒子が共有結合的に安定化される。

【0125】

実施形態では、本発明は、ｏ－フタルアルデヒドと複合体化してイソインドールを生成する核酸を含む組成物を提供する。

【0126】

実施形態では、本発明は、アミンおよびチオール反応性部位で官能化されたオリゴヌクレオチドと、これらの官能化オリゴヌクレオチドを自己組織化した核酸ナノ粒子とを含む組成物を提供する。

【0127】

実施形態では、アミンおよびチオールが、オルト－フタルアルデヒドと同時に反応して、蛍光イソインドールを生成する。

【0128】

実施形態では、蛍光部分がさらなるフルオロフォアにコンジュゲートされている。

【0129】

実施形態では、核酸ナノ粒子が直交型クリックケミストリーを介してカーゴにコンジュゲートされている。

【0130】

実施形態では、本発明は、外部作用剤と複合体化してフルオロフォアを形成する反応性部分を含む核酸二本鎖を含む核酸ナノ粒子を含む組成物を提供する。

【0131】

実施形態では、アミンおよびチオールが、オルト－フタルアルデヒドと同時に反応し、フルオロフォアが蛍光イソインドールである。

【0132】

実施形態では、フルオロフォアがさらなるフルオロフォアにコンジュゲートされている。

【0133】

実施形態では、核酸ナノ粒子が直交型クリックケミストリーを介してカーゴ分子にコンジュゲートされている。

【0134】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、疎水性部分と、親水性部分と、ヌクレオチド結合部分とを含む成分を含む。

【0135】

実施形態では、疎水性部分および親水性部分が、核酸ナノ粒子に共有結合的に付着している。

【0136】

実施形態では、疎水性部分および親水性部分が、アミド、アミン、またはエーテル結合を介して核酸に共有結合的に付着している。

【0137】

いくつかの実施形態では、親水性部分がアミンを含む。

【0138】

実施形態では、親水性部分が、スペルミン、エチレンジアミン、メチルエチレンジアミン、エチルエチレンジアミン、イミダゾール、スペルミン－イミダゾール－４－イミン、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－グアニジニルエチレンイミン、ジメチルアミノエチルアクリレート、アミノビニルエーテル、４－イミダゾール酢酸、ジエチルアミノプロピルアミド、スルホンアミド（例えば、スルファジメトキシン スルファメトキサゾール、スルファジアジン、スルファメタジン）、アミノケタール、Ｎ－２－ヒドロキシルプロピルチメチルアンモニウムクロリド、イミダゾール－４－イミン、メチル－イミダゾール、２－（アミノメチル）イミダゾール、４－（アミノメチル）イミダゾール、４（５）－（ヒドロキシメチル）イミダゾール、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（（２－アミノエチル）（メチル）アミノ）プロパンアミド、２－（２－エトキシエトキシ）エタン－１－アミン、ビス（３－アミノプロピル）アミン、［Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシ］エチル、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（（２－アミノエチル）（エチル）アミノ）プロパンアミド、（Ｎ－（アミノエチル）カルバモイル）メチル、Ｎ－（２－（（２－アミノエチル）アミノ）エチル）アセトアミド３，３’－（（２－アミノエチル）アザンジイル）ビス（Ｎ－（２－アミノエチル）プロパンアミド）、グアニジルベンジルアミド、［３－（グアニジニウム）プロピル］、ジメチルエタノールアミン、１－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルメタンアミン、２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン、Ｎ－（２－（（２－（２－アミノエトキシ）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）アセトアミド、アミノブチル、アミノエチル、１－（２－アミノエチル）－３－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）－２－エチルグアニジン、１－（３－アミノ－３－オキソプロピル）－２，４，６－トリメチルピリジン－１－イウム、１－（１，３－ビス（カルボキシオキシ）プロパン－２－イル）－２，４，６－トリメチルピリジン－１－イウム、グアニジニルエチルアミン、エーテルヒドロキシルトリアゾール、およびβ－アミノエステルからなる群から選択される。

【0139】

実施形態では、ヌクレオチドが、２－（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）エタン－１－オール、Ｎ－ブチル－２－ヒドロキシアセトアミド、（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）メタノール、アミノ（（２－（２－ヒドロキシアセトアミド）エチル）アミノ）メタンイミニウムおよび１－（２－（２－ヒドロキシアセトアミド）エチル）－２，４，６－トリメチルピリジン－１－イウムからなる群から選択される部分で官能化されている。

【0140】

実施形態では、ヌクレオチド結合部分がシステインである。

【0141】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、受容体に依存しない方法でカーゴ分子のエンドソーム脱出を促進する。

【0142】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、細胞内の受容体に結合する成分を含む。

【0143】

実施形態では、成分が、葉酸、ＴｆＲ－Ｔ１２、およびヘマグルチニンペプチドからなる群から選択される成分を含む。

【0144】

実施形態では、カーゴ分子が、リソソーム内で切断され得るリンカーを介して核酸ナノ粒子に結合している。

【0145】

実施形態では、カーゴ分子がカテプシンＢ切断可能リンカーに結合している。

【0146】

実施形態では、カーゴ分子がプロテアーゼ切断可能リンカーに結合している。

【0147】

実施形態では、カーゴ分子がピロリン酸ジエステルに結合している。

【0148】

実施形態では、本発明は、アルコール系求核試薬によるアンヒドロウリジンの処理を含む、２’－Ｏ置換ヌクレオシドを合成するための方法を提供する。

【0149】

実施形態では、処理が、バリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド、２－ｔｅｒｔ－ブチルイミノ－２－ジエチルアミノ－１，３－ジメチル－ペルヒドロ－１，３，２－ジアザホスホリン、ｎ－ブチルリチウム、ｓｅｃ－ブチルリチウム、ｔｅｒｔ－ブチルリチウム、ｄａｂｃｏ（登録商標）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルメチルアミン、ジメチルアミン、４－（ジメチルアミノ）ピリジン、エチルアミン、Ｎ－エチルジイソプロピルアミン、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド、リチウムｔｅｒｔ－ブトキシド、リチウムジシクロヘキシルアミド、リチウムジエチルアミド、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムジメチルアミド、リチウムエトキシド、リチウムイソプロポキシド、リチウムメトキシド、リチウム２，２，６，６－テトラメチルピペリジド、マグネシウムビス（ヘキサメチルジシラジド）、メチルアミン、メチルリチウム、モルホリン、ピペリジン、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、カリウムエトキシド、カリウムメトキシド、トリエチルアミンからなる群から選択される塩基を含む。

【0150】

実施形態では、処理が、臭化アルミニウム、塩化アルミニウム、アルミニウムイソプロポキシド、三塩化ホウ素（およびその様々な錯体）、三フッ化ホウ素（およびその様々な錯体）、ジシクロヘキシルボロン、臭化鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、モンモリロナイトＫ１０＆Ｋ３０、塩化スズ（ＩＶ）、塩化チタン（ＩＶ）、チタン（ＩＶ）イソプロポキシド、四塩化チタンからなる群から選択される塩基を含む。

【0151】

実施形態では、本発明は、カーゴ分子と、カーゴ分子に結合した核酸ナノ粒子であって、対象におけるカーゴ分子の生物学的活性を促進するように官能化されている核酸ナノ粒子とを含む、組成物を提供する。

【0152】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、細胞への内部移行を促進するように官能化されている。

【0153】

実施形態では、カーゴ分子が、細胞への内部移行を促進するように官能化されている。

【0154】

実施形態では、カーゴ分子が、細胞の脂質二重層を通した浸透を促進するアンカーコレステロール分子である。

【0155】

実施形態では、官能化が、クラスリン媒介エンドサイトーシス、非クラスリン／非カベオラエンドサイトーシス、カベオラ媒介エンドサイトーシス、受動拡散、単純拡散、促進拡散、トランスサイトーシス、マクロピノサイトーシス、食作用、受容体媒介エンドサイトーシス、受容体拡散、小胞媒介輸送、能動輸送を介して細胞への内部移行を促進する。

【0156】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、エンドソーム、リソソーム、ピノソーム、またはファゴソームを介して細胞に侵入するか、またはプロセシングされ得る。

【0157】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、生体膜を横切って細胞に侵入し得る。

【0158】

実施形態では、官能化が、細胞の細胞質、核、ミトコンドリアまたは他の細胞区画において効果を発揮し得る。

【0159】

実施形態では、カーゴ分子が、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ペプチド、タンパク質、抗体および治療用低分子からなる群から選択される。

【0160】

実施形態では、細胞傷害性ヌクレオチドがオリゴヌクレオチド骨格に組み込まれている。

【0161】

実施形態では、細胞傷害性ヌクレオチドが、アリストマイシン、ネオプラノシンＡ、リバビリン、ピラゾフリン、シタラビンアラビノシド（ａｒａ－Ｃ）、ゲムシタビン、クラドリビン（２－ＣｄＡ）、ショードマイシン、エラシタラビンからなる群から選択される。

【0162】

実施形態では、リン酸プロドラッグが核酸骨格に組み込まれている。

【0163】

実施形態では、リン酸プロドラッグが、９－［２－（ホスホノメトキシ）エチル］アデニンのビス（Ｓ－アシル－２－チオエチル）エステル誘導体、シクロＳａｌプロヌクレオチド、ＨｅｐＤｉｒｅｃｔプロドラッグまたはオクタデシルオキシエチル－シドホビルである。

【0164】

実施形態では、オリゴヌクレオチドが核酸ナノ粒子に組み立てられている。

【0165】

実施形態では、本発明は、第１のカーゴ分子と、第１のカーゴ分子に連結された第２のカーゴ分子とを含む組成物を提供する。

【0166】

いくつかの実施形態では、第１のカーゴ分子が生物学的機能を有する。

【0167】

実施形態では、第１のカーゴ分子が、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ペプチド、タンパク質、抗体および治療用低分子からなる群から選択される。

【0168】

実施形態では、第１のカーゴ分子が、アプタマー、レクチン、糖タンパク質、脂質、抗体、ナノボディ、またはＤＡＲＰＩＮを含む細胞または組織標的化リガンドである。

【0169】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが、一価、二価、または三価分岐リンカーを介して連結されているＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。

【0170】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つがコレステロールまたはその誘導体を含む。

【0171】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つがリン脂質を含む。

【0172】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが、必要に応じて第四級アンモニウムイオンを含むカチオン性脂質を含む。

【0173】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが、必要に応じてリン酸基を含むアニオン性脂質を含む。

【0174】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つがイオン化可能な脂質を含む。

【0175】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが分岐脂質を含む。

【0176】

実施形態では、第１のカーゴ分子が切断可能リンカーによって第２のカーゴ分子に連結されている。

【0177】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子がｓｉＲＮＡである。

【0178】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子が、（ｄＴ）ｎ、（ｄＡ）ｎ、ｄ（Ｃ）ｎ、ｄ（Ｇ）ｎ、（ｒＵ）ｎ、（ｒＡ）ｎ、（ｒＣ）ｎ、（ｒＧ）ｎ、およびその組み合わせ（式中、ｎは１～１６である）からなる群のオリゴヌクレオチドスペーサーを介して連結されている。

【0179】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが第３のカーゴ分子に連結されている。

【0180】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが、ジチオビスマレイミドエタンおよび１，４－ビス［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタンを含むチオール切断可能リンカーによって第３のカーゴ分子に連結されている。

【0181】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）を含むヒドロキシルアミン切断可能リンカーによって第３のカーゴ分子に連結されている。

【0182】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが、ビス［２－（Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニルオキシ）エチル］スルホンを含む塩基切断可能リンカーによって第３のカーゴ分子に連結されている。

【0183】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが、５－（ビス（メチルチオ）メチレン）－２，２－ジメチル－１，３－ジオキサン－４，６－ジオンを含むメルドラム酸誘導体によって第３のカーゴ分子に連結されている。

【0184】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが共有結合を介して第３のカーゴ分子に連結されている。

【0185】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つがダイサー基質によって第３のカーゴ分子に連結されている。

【0186】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが、１，８－ビスマレイミド－ジエチレングリコール、１，１１－ビスマレイミド－トリエチレングリコール、１，４－ビスマレイミドブタン、ビスマレイミドヘキサン、ビスマレイミドエタン、トリス（２－マレイミドエチル）アミン）、Ｎ－α－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、Ｎ－β－マレイミドプロピルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸、Ｎ－γ－マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）、スクシンイミジル６－（３（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジルヨードアセテート、スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート、ＰＥＧ化された長鎖ＳＭＣＣ架橋剤、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレートおよびスルホ－ＮＨＳ等価物）、ｐ－マレイミドフェニルイソシアネートからなる群から選択されるリンカーによって第３のカーゴ分子に連結されている。

【0187】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つがナノ粒子に連結されている。

【0188】

実施形態では、本発明は、少なくとも２つのカーゴ分子と、少なくとも２つのカーゴ分子の各々に結合した核酸ナノ粒子とを含む組成物を提供する。

【0189】

実施形態では、少なくとも２つのカーゴ分子の各々が生物学的機能を有する。

【0190】

実施形態では、少なくとも２つのカーゴ分子の各々が、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ペプチド、タンパク質、抗体および治療用低分子からなる群から選択される。

【0191】

実施形態では、少なくとも２つのカーゴ分子の２つ以上が同じ核酸ナノ粒子にコンジュゲートされている。

【0192】

実施形態では、少なくとも２つのカーゴ分子の２つ以上が異なる。

【0193】

実施形態では、２つ以上のカーゴ分子が同じである。

【0194】

実施形態では、異なるカーゴ分子が等しくない量で前記ナノ粒子にコンジュゲートされている。

【0195】

実施形態では、少なくとも２つのカーゴ分子が安定な共有結合を介してコンジュゲートされている。

【0196】

実施形態では、少なくとも２つの分子が安定な共有結合を介して刺激応答性リンカーにコンジュゲートされている。

【0197】

実施形態では、本発明は、１またはそれを超えるカーゴ分子に共有結合的に連結したオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。

【0198】

実施形態では、オリゴヌクレオチドが、コンジュゲーションを可能にする反応性部位で官能化されており、核酸ナノ粒子にコンジュゲートされている。

【0199】

実施形態では、核酸ナノ粒子が３つまたはそれより多くのジャンクションの三次構造であり、前記ジャンクションが３～２００ヌクレオチド長の少なくとも２つのオリゴヌクレオチド鎖によって形成され、各オリゴヌクレオチド鎖が、水素結合もしくは塩基スタッキング相互作用のいずれかまたはその両方を通して少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチド鎖と部分的に相互作用する。

【0200】

実施形態では、各ヌクレオチドが、必要に応じて、それだけに限らないが、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－Ｆ－アラビノ核酸、２’－Ｏ－メトキシエチル、ロック核酸、アンロック核酸、４’－チオリボヌクレオシド、４’－Ｃ－アミノメチル－２’－Ｏ－メチル、シクロヘキセニル核酸、ヘキシトール核酸、グリコール核酸、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、５’－Ｃ－メチル、５’（Ｅ）－ビニルホスホネート、および２’チオウリジンを含む修飾を含む。

【0201】

実施形態では、核酸ナノ粒子がカーゴ分子に結合しており、カーゴ分子が対象におけるカーゴ分子の生物学的活性を促進する。

【0202】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、（ｉ）血液中の血清タンパク質、または細胞中もしくは細胞表面の受容体に結合すること、（ｉｉ）受容体に依存しない方法でのカーゴ分子のエンドソーム脱出を促進すること、（ｉｉｉ）動物または対象の組織を標的とすること、（ｉｖ）体内分布をモジュレートすること、（ｖ）免疫学的応答を誘導または防止すること、（ｖｉ）細胞取り込みを増強すること、（ｖｉｉ）遺伝子発現をモジュレートすること、（ｖｉｉｉ）細胞傷害性を誘導すること、および（ｉｘ）治療効果を有すること、またはその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの生物学的活性を行う。

【0203】

実施形態では、１またはそれを超えるカーゴ分子が、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＡＳＯ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、抗体、抗体断片、抗体模倣物、レクチン、ビタミン、脂質、炭水化物、ベンズアミドおよび治療用低分子、またはその組み合わせのうちの少なくとも１つで構成される。

【0204】

実施形態では、官能化が細胞への内部移行を促進し、内部移行機序が、クラスリン媒介エンドサイトーシス、非クラスリン／非カベオラエンドサイトーシス、カベオラ媒介エンドサイトーシス、受動拡散、単純拡散、促進拡散、トランスサイトーシス、マクロピノサイトーシス、食作用、受容体媒介エンドサイトーシス、受容体拡散、小胞媒介輸送、および能動輸送のうちの少なくとも１つを含む。

【0205】

実施形態では、核酸ナノ粒子の少なくとも１つのカーゴ分子への結合が、以下の特徴の少なくとも１つを含む少なくとも１つの反応を含む方法によって得ることができる：（ｉ）反応が１つのポットで行われる、（ｉｉ）反応が水によって妨害されない、（ｉｉｉ）反応が最小限の副産物を生成する、および（ｉｖ）反応が単一反応生成物を与える高い熱力学的駆動力を含む。

【0206】

実施形態では、結合反応が、（ｉ）上記特徴の少なくとも１つを含む第１の反応を介して第１のカーゴ分子を結合させるステップと、（ｉｉ）上記特徴の少なくとも１つを含む第２の反応を介して第２のカーゴ分子を結合させるステップとを含み、第１の反応と第２の反応とが直交性である。

【0207】

実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’、３’、または内部位置（ヌクレオチド上の任意の所与の位置）が、ＣｕＡＡＣ、ＳＰＡＡＣ、ＲｕＡＡＣ、ＩＥＤＤＡ、ＳｕＦＥｘ、ＳＰＡＮＣ、ヒドラゾン／オキシムエーテル形成、チオール－エンラジカル反応、チオール－インラジカル反応、チオール－マイケル付加反応、チオール－イソシアネート反応、チオール－エポキシドクリック反応、求核開環反応（バネ荷重反応）、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションからなる群から選択される反応を介して共有結合の形成を可能にする官能基で修飾される。これらの結合は、それだけに限らないが、ＡＤＩＢＯ－ＰＥＧ４、Ｎ－［（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルオキシカルボニル］－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）４－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）１２－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）２４－アミド－ＤＢＣＯ、ジベンゾシクロオクチン－酸、ジベンゾシクロオクチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－酸、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－アルコール、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）メタンアミン塩酸塩、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エノール、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エニル２，５－ジオキソ－１－ピロリジニルカーボネート、２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタノエート、５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタン酸、５－ノルボルネン－２－酢酸スクシンイミジルエステル、５－ノルボルネン－２－エンド－酢酸、メチルテトラジン－ＮＨＳエステル、メチルテトラジン－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル、ＴＣＯ ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル、ＴＣＯ－アミン、テトラジン－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステル、
アルキン－ＰＥＧ５－酸、（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－（ｂｏｃ－アミノ）－５－ヘキシン酸、Ｎ－ｂｏｃ－４－ペンチン－１－アミン、ｂｏｃ－プロパルギル－Ｇｌｙ－ＯＨ、３－エチニルアニリン、４－エチニルアニリン、プロパルギルアミン塩酸塩、プロパルギルクロロホルメート、プロパルギル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、プロパルギル－ＰＥＧ２－酸、３－（４－アジドフェニル）プロピオン酸、３－アジド－１－プロパンアミン、３－アジド－１－プロパノール、４－カルボキシベンゼンスルホンアジド、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ペンタエチレングリコール、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）酸（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－アミン（式中、ｎは７、１１、２３、３５であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）ＮＨＳエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－ＴＦＰエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４、３６であり得る）、２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エタノール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ－［２－（ジグリコリル－アミノ）エチル］ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－トリエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－ウンデカエチレングリコール、１７－アジド－３，６，９，１２，１５－ペンタオキサヘプタデカン－１－アミン、１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデカン酸、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）アジド（式中、ｎは３、１１、２３であり得る）およびその組み合わせからなる群の化学部分で修飾された任意のオリゴヌクレオチドまたはカーゴ分子とカップリング反応を行うことによって形成され得る。

【0208】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、第１のカーゴ分子、第１のカーゴ分子に連結された第２のカーゴ分子、および必要に応じて、第２または第１のカーゴ分子に連結されたさらなるカーゴ分子に結合される。

【0209】

実施形態では、第１のカーゴ分子が、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＡＳＯ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、抗体、抗体断片、抗体模倣物、レクチン、ビタミン、脂質、炭水化物、ベンズアミドおよび治療用低分子、またはその組み合わせのうちの少なくとも１つからなる群から選択される。

【0210】

実施形態では、第１のカーゴ分子が切断可能リンカーによって第２のカーゴ分子に連結されている。

【0211】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが、ジチオビスマレイミドエタンおよび１，４－ビス［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタンを含むチオール切断可能リンカー、エチレングリコールビス（スクシンイミジル）スクシネートを含むヒドロキシルアミン切断可能リンカー、ビス［２－（Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニルオキシ）エチル］スルホンを含む塩基切断可能リンカー、または５－（ビス（メチルチオ）メチレン）－２，２－ジメチル－１，３－ジオキサン－４，６－ジオンを含むメルドラム酸誘導体のいずれかによって第３のカーゴ分子に連結されている。

【0212】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが、それだけに限らないが、配列（Ｔ）ｋ、（Ａ）ｌ、（Ｇ）ｍ、（Ｃ）ｎ、およびその組み合わせ（式中、ｋ、ｌ、ｍ、およびｎは正の整数である）を含む切断を受けることができるダイサー基質または伸長核酸スペーサー領域によって第３のカーゴ分子に連結されている。

【0213】

実施形態では、第１のカーゴ分子および第２のカーゴ分子の少なくとも１つが、１，８－ビスマレイミド－ジエチレングリコール、１，１１－ビスマレイミド－トリエチレングリコール、１，４－ビスマレイミドブタン、ビスマレイミドヘキサン、ビスマレイミドエタン、トリス（２－マレイミドエチル）アミン）、Ｎ－α－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、Ｎ－β－マレイミドプロピルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸、Ｎ－γ－マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）、スクシンイミジル６－（３（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジルヨードアセテート、スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート、ＰＥＧ化された長鎖ＳＭＣＣ架橋剤、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレートおよびスルホ－ＮＨＳ等価物）、およびｐ－マレイミドフェニルイソシアネートからなる群から選択されるリンカーによって第３のカーゴ分子に連結されている。

【0214】

実施形態では、第２のカーゴ分子が、ポリマー様式で任意の所与の数のカーゴ分子に連結されている。

【0215】

実施形態では、第１のカーゴ分子が、ＣｕＡＡＣ、ＳＰＡＡＣ、ＲｕＡＡＣ、ＩＥＤＤＡ、ＳｕＦＥｘ、ＳＰＡＮＣ、ヒドラゾン／オキシムエーテル形成、チオール－エンラジカル反応、チオール－インラジカル反応、チオール－マイケル付加反応、チオール－イソシアネート反応、チオール－エポキシドクリック反応、求核開環反応（バネ荷重反応）、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションからなる群から選択される反応を介して核酸ナノ粒子に連結されている。これらの結合は、それだけに限らないが、ＡＤＩＢＯ－ＰＥＧ４、Ｎ－［（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルオキシカルボニル］－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）４－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）１２－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）２４－アミド－ＤＢＣＯ、ジベンゾシクロオクチン－酸、ジベンゾシクロオクチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－酸、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－アルコール、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）メタンアミン塩酸塩、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エノール、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エニル２，５－ジオキソ－１－ピロリジニルカーボネート、２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタノエート、５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタン酸、５－ノルボルネン－２－酢酸スクシンイミジルエステル、５－ノルボルネン－２－エンド－酢酸、メチルテトラジン－ＮＨＳエステル、メチルテトラジン－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル、ＴＣＯ ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル、ＴＣＯ－アミン、テトラジン－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステル、
アルキン－ＰＥＧ５－酸、（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－（ｂｏｃ－アミノ）－５－ヘキシン酸、Ｎ－ｂｏｃ－４－ペンチン－１－アミン、ｂｏｃ－プロパルギル－Ｇｌｙ－ＯＨ、３－エチニルアニリン、４－エチニルアニリン、プロパルギルアミン塩酸塩、プロパルギルクロロホルメート、プロパルギル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、プロパルギル－ＰＥＧ２－酸、３－（４－アジドフェニル）プロピオン酸、３－アジド－１－プロパンアミン、３－アジド－１－プロパノール、４－カルボキシベンゼンスルホンアジド、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ペンタエチレングリコール、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）酸（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－アミン（式中、ｎは７、１１、２３、３５であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）ＮＨＳエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－ＴＦＰエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４、３６であり得る）、２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エタノール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ－［２－（ジグリコリル－アミノ）エチル］ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－トリエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－ウンデカエチレングリコール、１７－アジド－３，６，９，１２，１５－ペンタオキサヘプタデカン－１－アミン、１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデカン酸、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）アジド（式中、ｎは３、１１、２３であり得る）およびその組み合わせからなる群の化学部分で修飾された任意のオリゴヌクレオチドまたはカーゴ分子とカップリング反応を行うことによって形成され得る。

【0216】

実施形態では、少なくとも２つのカーゴ分子の各々が生物学的機能を有する。

【0217】

実施形態では、本発明は、１またはそれを超えるカーゴ分子に共有結合的に連結したオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。

【0218】

実施形態では、組成物が、コンジュゲーションを可能にする反応性部位で官能化されており、核酸ナノ粒子に組み立てられているオリゴヌクレオチドを含む。

【0219】

実施形態では、核酸ナノ粒子がカーゴ分子に結合しており、核酸ナノ粒子が、対象におけるカーゴ分子の生物学的活性を促進するように官能化されている。

【0220】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、三量体、四量体、五量体または六量体である。

【0221】

実施形態では、本発明は、以下の特徴の少なくとも１つを含む少なくとも１つの反応を介して、核酸ナノ粒子を少なくとも１つのカーゴ分子に結合させるステップを含む方法を提供する：反応が１つのポットで行われる、反応が水によって妨害されない、反応が最小限の副産物を生成する、および反応が単一反応生成物を与える高い熱力学的駆動力を含む。

【0222】

実施形態では、本方法が、特徴の少なくとも１つを含む第１の反応を介して第１のカーゴ分子を結合させるステップと、特徴の少なくとも１つを含む第２の反応を介して第２のカーゴ分子を結合させるステップとを含み、第１の反応と第２の反応とが直交性である。

【0223】

実施形態では、第１の反応が、核酸ナノ粒子中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの鎖に対する修飾を含む。

【0224】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、銅（Ｉ）アジド－アルキン付加環化を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0225】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、歪み促進型アジド－アルキン付加環化を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0226】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、逆電子要請型ディールスアルダー反応を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0227】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、ジスルフィド結合を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0228】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、硫黄（ＶＩ）フッ化物交換を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0229】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、ヒドラゾン形成を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0230】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、チオール－エンラジカル付加を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0231】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、チオール－イン反応を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0232】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、チオール－マイケル付加を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0233】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、チオール－イソシアネートケミストリーを介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0234】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、チオール－エポキシドケミストリーを介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0235】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、求核開環反応を介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0236】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションを介して第１のカーゴ分子に結合される。

【0237】

実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’、３’または内部位置（ヌクレオチド上の任意の所与の位置）が、これらの方法を介して概説される共有結合の形成を可能にする官能基で修飾される。これらの結合は、それだけに限らないが、ＡＤＩＢＯ－ＰＥＧ４、Ｎ－［（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルオキシカルボニル］－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）_４－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）_１２－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）_２４－アミド－ＤＢＣＯ、ジベンゾシクロオクチン－酸、ジベンゾシクロオクチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－酸、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－アルコール、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）メタンアミン塩酸塩、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エノール、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エニル２，５－ジオキソ－１－ピロリジニルカーボネート、２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタノエート、５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタン酸、５－ノルボルネン－２－酢酸スクシンイミジルエステル、５－ノルボルネン－２－エンド－酢酸、メチルテトラジン－ＮＨＳエステル、メチルテトラジン－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル、ＴＣＯ ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル、ＴＣＯ－アミン、テトラジン－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステル、
アルキン－ＰＥＧ５－酸、（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－（ｂｏｃ－アミノ）－５－ヘキシン酸、Ｎ－ｂｏｃ－４－ペンチン－１－アミン、ｂｏｃ－プロパルギル－Ｇｌｙ－ＯＨ、３－エチニルアニリン、４－エチニルアニリン、プロパルギルアミン塩酸塩、プロパルギルクロロホルメート、プロパルギル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、プロパルギル－ＰＥＧ２－酸、３－（４－アジドフェニル）プロピオン酸、３－アジド－１－プロパンアミン、３－アジド－１－プロパノール、４－カルボキシベンゼンスルホンアジド、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ペンタエチレングリコール、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）酸（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－アミン（式中、ｎは７、１１、２３、３５であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）ＮＨＳエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－ＴＦＰエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４、３６であり得る）、２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エタノール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ－［２－（ジグリコリル－アミノ）エチル］ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－トリエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－ウンデカエチレングリコール、１７－アジド－３，６，９，１２，１５－ペンタオキサヘプタデカン－１－アミン、１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデカン酸、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）アジド（式中、ｎは３、１１、２３であり得る）およびその組み合わせからなる群の化学部分で修飾された任意のオリゴヌクレオチドまたはカーゴ分子とカップリング反応を行うことによって形成され得る。

【0238】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、刺激に応答性のリンカーを介して第１のカーゴに結合される。

【0239】

実施形態では、刺激が、ｐＨ、光、温度、還元電位または酸素濃度からなる群から選択される。

【0240】

実施形態では、核酸ナノ粒子が共有結合的に安定化される。

【0241】

実施形態では、本発明は、ｏ－フタルアルデヒドと複合体化してイソインドールを生成する核酸を含む組成物を提供する。

【0242】

実施形態では、本発明は、アミンおよびチオール反応性部位で官能化されたオリゴヌクレオチドと、これらの官能化オリゴヌクレオチドを自己組織化した核酸ナノ粒子とを含む組成物を提供する。

【0243】

実施形態では、アミンおよびチオールが、オルト－フタルアルデヒドと同時に反応して、蛍光イソインドールを生成する。

【0244】

実施形態では、蛍光部分がさらなるフルオロフォアにコンジュゲートされている。

【0245】

実施形態では、請求項７に概説されるように、核酸ナノ粒子が直交型クリックケミストリーを介してカーゴにコンジュゲートされている。

【0246】

実施形態では、本発明は、外部作用剤と複合体化してフルオロフォアを形成する反応性部分を含む核酸二本鎖を含む核酸ナノ粒子を含む組成物を提供する。

【0247】

実施形態では、アミンおよびチオールが、オルト－フタルアルデヒドと同時に反応し、フルオロフォアが蛍光イソインドールである。

【0248】

実施形態では、フルオロフォアがさらなるフルオロフォアにコンジュゲートされている。

【0249】

実施形態では、核酸ナノ粒子が直交型クリックケミストリーを介してカーゴ分子にコンジュゲートされている。

【0250】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、疎水性部分と、親水性部分と、ヌクレオチド結合部分とを含む成分を含む。

【0251】

実施形態では、疎水性部分および親水性部分が、核酸ナノ粒子に共有結合的に付着している。

【0252】

実施形態では、疎水性部分および親水性部分が、アミド、アミン、またはエーテル結合を介して核酸に共有結合的に付着している。

【0253】

いくつかの実施形態では、親水性部分がアミンを含む。

【0254】

実施形態では、親水性部分が、スペルミン、エチレンジアミン、メチルエチレンジアミン、エチルエチレンジアミン、イミダゾール、スペルミン－イミダゾール－４－イミン、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－グアニジニルエチレンイミン、ジメチルアミノエチルアクリレート、アミノビニルエーテル、４－イミダゾール酢酸、ジエチルアミノプロピルアミド、スルホンアミド（例えば、スルファジメトキシン スルファメトキサゾール、スルファジアジン、スルファメタジン）、アミノケタール、Ｎ－２－ヒドロキシルプロピルチメチルアンモニウムクロリド、イミダゾール－４－イミン、メチル－イミダゾール、２－（アミノメチル）イミダゾール、４－（アミノメチル）イミダゾール、４（５）－（ヒドロキシメチル）イミダゾール、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（（２－アミノエチル）（メチル）アミノ）プロパンアミド、２－（２－エトキシエトキシ）エタン－１－アミン、ビス（３－アミノプロピル）アミン、［Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシ］エチル、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（（２－アミノエチル）（エチル）アミノ）プロパンアミド、（Ｎ－（アミノエチル）カルバモイル）メチル、Ｎ－（２－（（２－アミノエチル）アミノ）エチル）アセトアミド３，３’－（（２－アミノエチル）アザンジイル）ビス（Ｎ－（２－アミノエチル）プロパンアミド）、グアニジルベンジルアミド、［３－（グアニジニウム）プロピル］、ジメチルエタノールアミン、１－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルメタンアミン、２－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン、Ｎ－（２－（（２－（２－アミノエトキシ）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）アセトアミド、アミノブチル、アミノエチル、１－（２－アミノエチル）－３－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）－２－エチルグアニジン、１－（３－アミノ－３－オキソプロピル）－２，４，６－トリメチルピリジン－１－イウム、１－（１，３－ビス（カルボキシオキシ）プロパン－２－イル）－２，４，６－トリメチルピリジン－１－イウム、グアニジニルエチルアミン、エーテルヒドロキシルトリアゾール、およびβ－アミノエステルからなる群から選択される。

【0255】

実施形態では、ヌクレオチドが、２－（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）エタン－１－オール、Ｎ－ブチル－２－ヒドロキシアセトアミド、（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）メタノール、アミノ（（２－（２－ヒドロキシアセトアミド）エチル）アミノ）メタンイミニウムおよび１－（２－（２－ヒドロキシアセトアミド）エチル）－２，４，６－トリメチルピリジン－１－イウムからなる群から選択される部分で官能化されている。

【0256】

実施形態では、ヌクレオチド結合部分がシステインである。

【0257】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、受容体に依存しない方法でカーゴ分子のエンドソーム脱出を促進する。

【0258】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、細胞内の受容体に結合する成分を含む。

【0259】

実施形態では、成分が、葉酸、ＴｆＲ－Ｔ１２、およびヘマグルチニンペプチドからなる群から選択される成分を含む。

【0260】

実施形態では、カーゴ分子が、リソソーム内で切断され得るリンカーを介して核酸ナノ粒子に結合している。

【0261】

実施形態では、カーゴ分子がカテプシンＢ切断可能リンカーに結合している。

【0262】

実施形態では、カーゴ分子がプロテアーゼ切断可能リンカーに結合している。

【0263】

実施形態では、カーゴ分子がピロリン酸ジエステルに結合している。

【0264】

実施形態では、本発明は、アルコール系求核試薬によるアンヒドロウリジンの処理を含む、２’－Ｏ置換ヌクレオシドを合成するための方法を提供する。

【0265】

実施形態では、処理が、バリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド、２－ｔｅｒｔ－ブチルイミノ－２－ジエチルアミノ－１，３－ジメチル－ペルヒドロ－１，３，２－ジアザホスホリン、ｎ－ブチルリチウム、ｓｅｃ－ブチルリチウム、ｔｅｒｔ－ブチルリチウム、ｄａｂｃｏ（登録商標）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルメチルアミン、ジメチルアミン、４－（ジメチルアミノ）ピリジン、エチルアミン、Ｎ－エチルジイソプロピルアミン、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド、リチウムｔｅｒｔ－ブトキシド、リチウムジシクロヘキシルアミド、リチウムジエチルアミド、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムジメチルアミド、リチウムエトキシド、リチウムイソプロポキシド、リチウムメトキシド、リチウム２，２，６，６－テトラメチルピペリジド、マグネシウムビス（ヘキサメチルジシラジド）、メチルアミン、メチルリチウム、モルホリン、ピペリジン、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、カリウムエトキシド、カリウムメトキシド、トリエチルアミンからなる群から選択される塩基を含む。

【0266】

実施形態では、処理が、臭化アルミニウム、塩化アルミニウム、アルミニウムイソプロポキシド、三塩化ホウ素（およびその様々な錯体）、三フッ化ホウ素（およびその様々な錯体）、ジシクロヘキシルボロン、臭化鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、モンモリロナイトＫ１０＆Ｋ３０、塩化スズ（ＩＶ）、塩化チタン（ＩＶ）、チタン（ＩＶ）イソプロポキシド、四塩化チタンからなる群から選択される塩基を含む。

【0267】

実施形態では、本発明は、カーゴ分子と、カーゴ分子に結合した核酸ナノ粒子であって、対象におけるカーゴ分子の生物学的活性を促進するように官能化されている核酸ナノ粒子とを含む、組成物を提供する。

【0268】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、細胞への内部移行を促進するように官能化されている。

【0269】

実施形態では、カーゴ分子が、細胞への内部移行を促進するように官能化されている。

【0270】

実施形態では、カーゴ分子が、細胞の脂質二重層を通した浸透を促進するアンカーコレステロール分子である。

【0271】

実施形態では、官能化が、クラスリン媒介エンドサイトーシス、非クラスリン／非カベオラエンドサイトーシス、カベオラ媒介エンドサイトーシス、受動拡散、単純拡散、促進拡散、トランスサイトーシス、マクロピノサイトーシス、食作用、受容体媒介エンドサイトーシス、受容体拡散、小胞媒介輸送、能動輸送を介して細胞への内部移行を促進する。

【0272】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、エンドソーム、リソソーム、ピノソーム、またはファゴソームを介して細胞に侵入するか、またはプロセシングされ得る。

【0273】

実施形態では、核酸ナノ粒子が、生体膜を横切って細胞に侵入し得る。

【0274】

実施形態では、官能化が、細胞の細胞質、核、ミトコンドリアまたは他の細胞区画において効果を発揮し得る。

【0275】

実施形態では、カーゴ分子が、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ペプチド、タンパク質、抗体および治療用低分子からなる群から選択される。

【0276】

実施形態では、細胞傷害性ヌクレオチドがオリゴヌクレオチド骨格に組み込まれている。

【0277】

実施形態では、細胞傷害性ヌクレオチドが、アリストマイシン、ネオプラノシンＡ、リバビリン、ピラゾフリン、シタラビンアラビノシド（ａｒａ－Ｃ）、ゲムシタビン、クラドリビン（２－ＣｄＡ）、ショードマイシン、エラシタラビンからなる群から選択される。

【0278】

実施形態では、リン酸プロドラッグが核酸骨格に組み込まれている。

【0279】

実施形態では、リン酸プロドラッグが、９－［２－（ホスホノメトキシ）エチル］アデニンのビス（Ｓ－アシル－２－チオエチル）エステル誘導体、シクロＳａｌプロヌクレオチド、ＨｅｐＤｉｒｅｃｔプロドラッグまたはオクタデシルオキシエチル－シドホビルである。

【0280】

実施形態では、オリゴヌクレオチドが核酸ナノ粒子に組み立てられている。

【0281】

実施形態では、本発明は、共有結合的に連結している２またはそれを超えるカーゴ分子を含む組成物を提供する。

【0282】

実施形態では、カーゴ分子の鎖が一般式

【化7】

（式中、Ｃ１およびＣ２はカーゴ分子であり、ｒは生体直交型反応の生成物として形成されるバイオコンジュゲーション結合であり、Ｌは直鎖リンカーまたは分岐リンカーのいずれかであり、ｋは０または１であり、ｍは１または１より大きい任意の正の整数であり、ｎは１または１より大きい任意の正の整数であり、ｍ＞１、またはｎ＞１、またはｍ＞１とｎ＞１の両方の場合、以下が適用される：（ｉ）各ｒは、同じであるか、または少なくとも２つの異なるバイオコンジュゲーション結合の混合物であり、（ｉｉ）各Ｌは、同じであるか、または少なくとも２つの異なるリンカー分子の混合物であり、（ｉｉｉ）各Ｃ２は、同じであるか、または少なくとも２つの異なるカーゴ分子の混合物である）
を有する。

【0283】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも１つが生物学的機能を有する。

【0284】

実施形態では、１またはそれを超えるカーゴ分子が、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、アルカロイド、ポリケチド、テトラピロール、テルペン／テルペノイド、フェニルプロパノイド、医薬化合物またはその組み合わせである。

【0285】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも１つが、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、抗体、抗体断片、抗体模倣物、レクチン、脂質、ビタミン、ベンズアミド、低分子、またはその組み合わせである。

【0286】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも２つが、（ｄＴ）ｎ、（ｄＡ）ｎ、ｄ（Ｃ）ｎ、ｄ（Ｇ）ｎ、（ｒＵ）ｎ、（ｒＡ）ｎ、（ｒＣ）ｎ、（ｒＧ）ｎ、またはその組み合わせ（式中、ｎは１～５０の任意の正の整数である）からなる群のオリゴヌクレオチドスペーサーを介して連結されたｓｉＲＮＡである。

【0287】

実施形態では、２またはそれを超えるｓｉＲＮＡが、５’→５’、３’→３’または５’→３’方向に互いに結合している。

【0288】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも１つが、肝細胞によって発現されるアシアロ糖タンパク質受容体を標的とし、１またはそれを超える標的化部分が、一価、二価、または三価分岐リンカーを介して連結されているＮ－アセチルガラクトサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン誘導体を含む。

【0289】

実施形態では、少なくとも１つのＮ－アセチルガラクトサミン部分が、固相合成中または合成後にオリゴヌクレオチドカーゴ分子に結合され、結合が、前記オリゴヌクレオチドカーゴ分子の５’末端、３’末端または１またはそれを超える連続する内部位置で起こる。

【0290】

実施形態では、カーゴ分子の１またはそれより多くが、以下の脂質の少なくとも１つを含む：（ｉ）コレステロールまたはその誘導体、（ｉｉ）リン脂質、（ｉｉｉ）必要に応じて第四級アンモニウムイオンを含むカチオン性脂質、（ｉｖ）必要に応じてリン酸基を含むアニオン性脂質、（ｖ）イオン化可能な脂質、および（ｖｉ）分岐脂質。

【0291】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも１つが、切断可能リンカーによってさらなるカーゴ分子に連結されている。

【0292】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも１つが、ジチオビスマレイミドエタンおよび１，４－ビス［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタンを含むチオール切断可能リンカーによってさらなるカーゴ分子に連結されている。

【0293】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも１つが、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）を含むヒドロキシルアミン切断可能リンカーによってさらなるカーゴ分子に連結されている。

【0294】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも１つが、ビス［２－（Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニルオキシ）エチル］スルホンを含む塩基切断可能リンカーによってさらなるカーゴ分子に連結されている。

【0295】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも１つが、５－（ビス（メチルチオ）メチレン）－２，２－ジメチル－１，３－ジオキサン－４，６－ジオンを含むメルドラム酸誘導体によってさらなるカーゴ分子に連結されている。

【0296】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも１つが、共有結合を介してさらなるカーゴ分子に連結されている。

【0297】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも１つが、ダイサー基質によってさらなるカーゴ分子に連結されている。

【0298】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも１つが、１，８－ビスマレイミド－ジエチレングリコール、１，１１－ビスマレイミド－トリエチレングリコール、１，４－ビスマレイミドブタン、ビスマレイミドヘキサン、ビスマレイミドエタン、トリス（２－マレイミドエチル）アミン）、Ｎ－α－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、Ｎ－β－マレイミドプロピルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸、Ｎ－γ－マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）、スクシンイミジル６－（３（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジルヨードアセテート、スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート、ＰＥＧ化された長鎖ＳＭＣＣ架橋剤、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレートおよびスルホ－ＮＨＳ等価物）、ｐ－マレイミドフェニルイソシアネートからなる群から選択されるリンカーによってさらなるカーゴ分子に連結されている。

【0299】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも１つが、ＣｕＡＡＣ、ＳＰＡＡＣ、ＲｕＡＡＣ、ＩＥＤＤＡ、ＳｕＦＥｘ、ＳＰＡＮＣ、ヒドラゾン／オキシムエーテル形成、チオール－エンラジカル反応、チオール－インラジカル反応、チオール－マイケル付加反応、チオール－イソシアネート反応、チオール－エポキシドクリック反応、求核開環反応（バネ荷重反応）、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションからなる群から選択される反応を介してさらなるカーゴ分子に連結されている。これらの結合は、それだけに限らないが、ＡＤＩＢＯ－ＰＥＧ４、Ｎ－［（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルオキシカルボニル］－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）_４－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）_１２－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）_２４－アミド－ＤＢＣＯ、ジベンゾシクロオクチン－酸、ジベンゾシクロオクチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－酸、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－アルコール、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）メタンアミン塩酸塩、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エノール、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エニル２，５－ジオキソ－１－ピロリジニルカーボネート、２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタノエート、５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタン酸、５－ノルボルネン－２－酢酸スクシンイミジルエステル、５－ノルボルネン－２－エンド－酢酸、メチルテトラジン－ＮＨＳエステル、メチルテトラジン－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル、ＴＣＯ ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル、ＴＣＯ－アミン、テトラジン－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステル、
アルキン－ＰＥＧ５－酸、（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－（ｂｏｃ－アミノ）－５－ヘキシン酸、Ｎ－ｂｏｃ－４－ペンチン－１－アミン、ｂｏｃ－プロパルギル－Ｇｌｙ－ＯＨ、３－エチニルアニリン、４－エチニルアニリン、プロパルギルアミン塩酸塩、プロパルギルクロロホルメート、プロパルギル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、プロパルギル－ＰＥＧ２－酸、３－（４－アジドフェニル）プロピオン酸、３－アジド－１－プロパンアミン、３－アジド－１－プロパノール、４－カルボキシベンゼンスルホンアジド、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ペンタエチレングリコール、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）酸（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－アミン（式中、ｎは７、１１、２３、３５であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）ＮＨＳエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－ＴＦＰエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４、３６であり得る）、２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エタノール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ－［２－（ジグリコリル－アミノ）エチル］ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－トリエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－ウンデカエチレングリコール、１７－アジド－３，６，９，１２，１５－ペンタオキサヘプタデカン－１－アミン、１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデカン酸、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）アジド（式中、ｎは３、１１、２３であり得る）およびその組み合わせからなる群の化学部分で修飾された任意のカーゴ分子とカップリング反応を行うことによって形成され得る。

【0300】

実施形態では、カーゴ分子の鎖が核酸ナノ粒子にコンジュゲートしており、コンジュゲートが

【化8】

（式中、ＰはＲＮＡナノ粒子であり、ｒは生体直交型コンジュゲーション反応の生成物として形成されるバイオコンジュゲーション結合であり、Ｌ１およびＬ２は直鎖または分岐リンカー分子のいずれかであり、ｊは０または１であり、Ｃ１およびＣ２はカーゴ分子であり、ｋは１または１より大きい任意の正の整数であり、ｌは０または１であり、ｍは１または１より大きい任意の正の整数であり、ｎは１または１より大きい任意の正の整数であり、ｑは１または１より大きい任意の正の整数であり、ｋ＞１またはｍ＞１またはｎ＞１またはｑ＞１またはその組み合わせである場合、以下が適用される：（ｉ）ｒは、同じであるか、または少なくとも２つの異なるバイオコンジュゲーション結合の混合物であり、（ｉｉ）Ｌ１は、同じであるか、または少なくとも２つの異なるリンカー分子の混合物であり、（ｉｉｉ）Ｌ２は、同じであるか、または少なくとも２つの異なるリンカー分子の混合物であり、（ｉｖ）Ｌ１およびＬ２は、同じまたは異なるリンカー分子であり、（ｖ）Ｃ１は、同じであるか、または少なくとも２つの異なるカーゴ分子の混合物であり、（ｖｉ）Ｃ２は、同じであるか、または少なくとも２つの異なるカーゴ分子の混合物であり、（ｖｉｉ）Ｃ１およびＣ２は、同じまたは異なるリンカー分子である）
の一般式構造を有する。

【0301】

実施形態では、本発明は、少なくとも２つのカーゴ分子と、少なくとも２つのカーゴ分子の各々に結合した核酸ナノ粒子とを含む組成物を提供する。

【0302】

実施形態では、少なくとも２つのカーゴ分子の各々が生物学的機能を有する。

【0303】

実施形態では、少なくとも２つのカーゴ分子の各々が、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ペプチド、タンパク質、抗体および治療用低分子からなる群から選択される。

【0304】

実施形態では、少なくとも２つのカーゴ分子の２つ以上が同じ核酸ナノ粒子にコンジュゲートされている。

【0305】

実施形態では、少なくとも２つのカーゴ分子の２つ以上が異なる。

【0306】

実施形態では、２つ以上のカーゴ分子が同じである。

【0307】

実施形態では、異なるカーゴ分子が等しくない量で前記ナノ粒子にコンジュゲートされている。

【0308】

実施形態では、少なくとも２つのカーゴ分子が安定な共有結合を介してコンジュゲートされている。

【0309】

実施形態では、少なくとも２つの分子が安定な共有結合を介して刺激応答性リンカーにコンジュゲートされている。

【0310】

実施形態では、カーゴ分子の少なくとも１つが、ＣｕＡＡＣ、ＳＰＡＡＣ、ＲｕＡＡＣ、ＩＥＤＤＡ、ＳｕＦＥｘ、ＳＰＡＮＣ、ヒドラゾン／オキシムエーテル形成、チオール－エンラジカル反応、チオール－インラジカル反応、チオール－マイケル付加反応、チオール－イソシアネート反応、チオール－エポキシドクリック反応、求核開環反応（バネ荷重反応）、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションからなる群から選択される反応を介してさらなるカーゴ分子に連結されている。これらの結合は、それだけに限らないが、ＡＤＩＢＯ－ＰＥＧ４、Ｎ－［（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルオキシカルボニル］－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）_４－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）_１２－アミド－ＤＢＣＯ、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）_２４－アミド－ＤＢＣＯ、ジベンゾシクロオクチン－酸、ジベンゾシクロオクチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－酸、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－アルコール、ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）メタンアミン塩酸塩、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エノール、（Ｅ）－シクロオクタ－４－エニル２，５－ジオキソ－１－ピロリジニルカーボネート、２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタノエート、５－［４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジルアミノ］－５－オキソペンタン酸、５－ノルボルネン－２－酢酸スクシンイミジルエステル、５－ノルボルネン－２－エンド－酢酸、メチルテトラジン－ＮＨＳエステル、メチルテトラジン－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル、ＴＣＯ ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル、ＴＣＯ－アミン、テトラジン－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステル、
アルキン－ＰＥＧ５－酸、（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸塩酸塩、（Ｓ）－３－（ｂｏｃ－アミノ）－５－ヘキシン酸、Ｎ－ｂｏｃ－４－ペンチン－１－アミン、ｂｏｃ－プロパルギル－Ｇｌｙ－ＯＨ、３－エチニルアニリン、４－エチニルアニリン、プロパルギルアミン塩酸塩、プロパルギルクロロホルメート、プロパルギル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、プロパルギル－ＰＥＧ２－酸、３－（４－アジドフェニル）プロピオン酸、３－アジド－１－プロパンアミン、３－アジド－１－プロパノール、４－カルボキシベンゼンスルホンアジド、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコール、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ペンタエチレングリコール、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）酸（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－アミン（式中、ｎは７、１１、２３、３５であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）４（ｎ）ＮＨＳエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４であり得る）、アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）－ＴＦＰエステル（式中、ｎは４、８、１２、２４、３６であり得る）、２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エタノール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ－［２－（ジグリコリル－アミノ）エチル］ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－トリエチレングリコール、Ｏ－（２－アジドエチル）－Ｏ’－メチル－ウンデカエチレングリコール、１７－アジド－３，６，９，１２，１５－ペンタオキサヘプタデカン－１－アミン、１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデカン酸、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）（ｎ）アジド（式中、ｎは３、１１、２３であり得る）およびその組み合わせからなる群の化学部分で修飾された任意のカーゴ分子とカップリング反応を行うことによって形成され得る。

【実施例】

【0311】

実施例１－分子の命名法
表２は、本発明で使用される構築物の命名フォーマットを提供する。表４および表５は、ＲＮＡナノ粒子を形成するために使用される例示的なＲＮＡモノマーの配列および各ＲＮＡモノマーの官能基を提供する。表６は、本発明で使用されるペプチドを概説する。

【表2】

【0312】

本発明で網羅されるＲＮＡ鎖を表３に記載する。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【0313】

本発明で網羅されるｓｉＲＮＡ鎖を表４に記載する。

【表4-1】

【表4-2】

【表5-1】

【表5-2】

【0314】

本明細書で使用されるペプチドを表６に記載する。

【表6-1】

【表6-2】

【0315】

実施例２－ＲＮＡ合成
Ｈ－１６合成装置（Ｋ＆Ａ）を使用してＲＮＡ鎖を合成した。合成は、標準的なＲＮＡカップリングプロトコル（２’－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＳＭ）保護アミダイトおよび他の全ての修飾について７２０秒間）を使用して、ＤＭＴ－ＯＦＦモードで１μｍｏｌカラムで実施した。アミダイト、テトラゾールおよびアセトニトリルの溶液を活性化モレキュラーシーブ（４Å）上で一晩乾燥させた。合成後、ＲＮＡをｒｔで３時間、１：１メチルアミン／水酸化アンモニウム（ＡＭＡ）で脱保護した。次いで、固体支持体を濾過し、ＥｔＯＨ：水（１：１）で２回洗浄した。次いで、結果として生じるＲＮＡ溶液を蒸発乾固し、２００μｌの脱水ＤＭＳＯに溶解した。次いで、２７５μｌのＴＥＡ^＊３ＨＦ（ＴＲＥＡＴ－ＨＦ）を添加し、６５℃で３時間インキュベートした。次いで、ＲＮＡをＥｔＯＨ沈殿に供した。

【0316】

粗ＲＮＡ鎖を、ＩＥＸ－ＨＰＬＣまたはＩＰ－ＲＰ ＨＰＬＣのいずれかによって精製した。
ＩＥＸは、半分取ＤＮＡＰａｃ ＰＡ１００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２２×２５０ｍｍカラム、７５℃、流量４．５ｍＬ／分および２６０ｎｍでのＵＶ検出を用いて行った。通常、１実行当たり１００～２５０μＬの粗ＲＮＡ溶液を注入した。開始濃度をオリゴヌクレオチドの長さに調整して、２～２．５カラム体積にわたっておよそΔ１０％Ｂの線形勾配で溶出を実施した。緩衝液Ａ：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％アセトニトリル、１０ｍＭ過塩素酸ナトリウム；緩衝液Ｂ：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％アセトニトリル、６００ｍＭ過塩素酸ナトリウム。

【0317】

ＲＰ－ＨＰＬＣは、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）Ｃ１８カラム（１０×１５０ｍｍ）を用い、６０℃、流量５ｍＬ／分および２６０ｎｍでのＵＶ検出を用いて行った。通常、１実行当たり１００～２５０μＬの粗ＲＮＡ溶液を注入した。緩衝液Ａ：ＴＥＡＡ（０．１Ｍ、ｐＨ＝７）；緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮ。
ＲＮＡを含有する画分をプールし、アセトニトリルを真空中で除去した。次いで、精製したオリゴをＧｅｌ－Ｐａｋ脱塩カラム（Ｇｌｅｎ）で脱塩した。溶液を蒸発させ、ＲＮＡをヌクレアーゼフリー水に溶解して、ＵＶ吸光度による濃度決定および変性ＰＡＧＥによる品質評価を行った。

【0318】

修飾鎖のための合成手順への適合
ＭｅＣＮ中５’アミノ－１０％ＤＥＡ溶液を、まだＣＰＧ上にある間にオリゴヌクレオチドに適用した。５分間の処理後、カラムをＭｅＣＮですすぎ、さらに処理した。

【0319】

Ｃｙ３含有配列の５’末端の５’Ｃｙ３－ＭＭＴｒ基をＲＰＣ ＭＭＴ－ＯＮ精製中に除去した。

【0320】

実施例３－最適化された組み立てプロトコル
この作業の重要な足場である四角形ＳＱ１を標準的なプロトコルに従って組み立てた。等モル量の５つの異なる鎖（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ－図２２；これらは、Ｃ－１．０、Ｃ－２．０、Ｃ－３．０、Ｃ－４．０およびＣ－５．０ならびにサブバリアントに対応する）を、最終濃度１０μＭで、ＰＢＳ＋ＭｇＣｌ_２（２ｍＭ）緩衝液中で合わせた。５つの鎖を９５℃で５分間互いにアニーリングし、次いで、１５℃までゆっくり冷却した。次いで、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）および動的光散乱（ＤＬＳ）によって足場を分析した（以下参照）。

【0321】

図２２は、本発明の一実施形態の組成物のコア足場（ＳＱ－００００－００１）を概説する概略図である。

【0322】

ＰＡＧＥの場合、組み立てた足場を、１００Ｖの定電圧で１×ＴＢＭｇ（８９０ｍＭ Ｔｒｉｓホウ酸＋２０ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）_２、ｐＨ＝８．３）中ネイティブＰＡＧＥ（６％）で電気泳動した。ＧｅｌＲｅｄ（商標）を使用してゲルバンドを可視化した。１０ ｐｍｏｌの構造物を搭載した。搭載前に２μＬのグリセリン（Ｈ_２Ｏ中７０％）を試料に添加した。

【0323】

ＤＬＳの場合、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ ＺＥＮ １６００ Ｎａｎｏ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ Ａｎａｌｙｓｉｓを使用して、組み立てられた足場を分析した－２０μＬの試料を使用し、強度を記録した。３回の試行の平均を計算した。全ての測定は２５℃で行った。塵およびデブリを除去するために、分析前に試料を１２０００ ｒｐｍで５分間遠心分離した。

【0324】

実施例４－コンジュゲーションケミストリーを可能にするための修飾子の合成
一般的な実験
^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを４００ＭＨｚで記録した。^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを１００ＭＨｚで記録した。化学シフト（δ）は、テトラメチルシランから低磁場側の百万分率（ｐｐｍ）の単位で引用され、残留溶媒ピークが基準とされる。（ＣＤＣｌ_３（δ_Ｈ：７．２６、δ_Ｃ：７７．０））。結合定数（Ｊ）は、ヘルツ（Ｈｚ）の単位で引用される。以下の略語を^１Ｈ ＮＭＲ分析内で使用する：ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｐｅｎｔ＝五重項、ｍ＝多重項、ｄｄ＝二重項の二重項、ｄｔ＝三重項の二重項。４００（^１Ｈ ＮＭＲ）および１００（^１３Ｃ ＮＭＲ）で記録されたスペクトルは、Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＮＭＲ Ｓｅｒｖｉｃｅが行った。

【0325】

低分解能および高分解能質量分析（ＥＩ、ＣＩ、ＦＡＢ）は、Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎで記録された。Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅによって行われた測定は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＩＩおよびＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＡｕｔｏＳｐｅｃ－Ｑ分光計を使用した。

【0326】

フラッシュカラムクロマトグラフィーは、ＢＤＨシリカゲル６０、粒径０．０４０～０．０６３ｍｍで行った。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、予めコーティングされたアルミニウムを裏打ちプレートまたはガラス裏打ちプレート（Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４）で実施し、紫外光（２５４ｎｍ）または過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ_４）、バニリンもしくはリンモリブデン酸（ＰＭＡ）染色で可視化した。

【0327】

５’Ｃ６ Ｓ－Ｓノルボルネン修飾子
図２３は、本発明の一実施形態によるジスルフィド－ノルボルネン５’修飾子の合成の概略図である。

【0328】

６，６’－ジスルファンジイルビス（ヘキサン－１－オール）

【化9】

Ｖａｒｅｎｉｋｏｖおよび共同研究者らによって概説された手順に従って合成した（Ａ．Ｖａｒｅｎｉｋｏｖ、Ｍ．Ｇａｎｄｅｌｍａｎ、Ｏｒｇａｎｏｔｉｔａｎｉｕｍ Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ ｉｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｃｒｏｓｓ－Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：Ｓｔｅｒｅｏｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｈｉｒａｌ α－ＣＦ ３ Ｔｈｉｏｅｔｈｅｒｓ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１４１（２０１９）１０９９４－１０９９９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｊａｃｓ．９ｂ０５６７１．）。無色油が得られた（１８．２ｇ、９２％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ３．６５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．７０（ｄｄ，Ｊ＝７．９，６．８Ｈｚ，４Ｈ），１．８１－１．７７（ｍ，２Ｈ），１．７６－１．６５（ｍ，４Ｈ），１．５９（ｄｑ，Ｊ＝７．９，６．６Ｈｚ，４Ｈ），１．５１－１．３２（ｍ，８Ｈ）。

【0329】

６－（（６－ヒドロキシヘキシル）ジスルファニル）ヘキシルビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－カルボキシレート

【化10】

当技術分野で見出される修正された手順に従って合成した（米国特許出願公開第２０１１／２６３５２６号）。ＤＣＣの溶液（５ｍＬの無水ＤＣＭ中１．１５ｇ、５．６１ｍｍｏｌ）を、５－ノルボルネン－２－カルボン酸（５００ｍｇ、３．６２ｍｍｏｌ）、６，６’－ジスルファンジイルビス（ヘキサン－１－オール）（１．９３ｇ、７．２５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（８９ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（２０ｍＬ）中攪拌溶液に０℃で５分間にわたって滴下添加した。次いで、反応混合物を０℃で３時間撹拌した。完了したら（ＴＬＣ：２５％ ＥｔＯＡｃ／ペンタン）、反応混合物を濾過した。次いで、濾液を水（３×２０ｍＬ）およびブライン（３×２０ｍＬ）で洗浄した。次いで、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、真空中で濃縮した。次いで、粗残渣をカラムクロマトグラフィー（２０～３０％ＥｔＯＡｃ／ペンタン）によって精製すると、標記化合物が無色油（４６９ｍｇ、３４％）として得られた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ６．２２（ｄｄ，Ｊ＝５．７，３．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｄｄ，Ｊ＝５．７，２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．０４（ｔｄ，Ｊ＝６．６，４．２Ｈｚ，２Ｈ），３．２３（ｄｑ，Ｊ＝３．４，１．８Ｈｚ，１Ｈ），２．９５（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．６，４．７，３．０Ｈｚ，２Ｈ），２．７１（ｔｄ，Ｊ＝７．３，２．２Ｈｚ，５Ｈ），１．９３（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．６，９．３，３．７Ｈｚ，１Ｈ），１．７２（ｄｔ，Ｊ＝７．２，４．０Ｈｚ，４Ｈ），１．５１－１．３７（ｍ，１４Ｈ），１．３６－１．２６（ｍ，１Ｈ）；ＨＲＭＳ ＥＳ＋（ｍ／ｚ）：Ｃ_２０Ｈ_３４Ｏ_３について計算された［Ｍ］^＋：３８６．６０９０；実測値：３８６．６０９７。

【0330】

６－（（６－（（（２－シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル）オキシ）ヘキシル）ジスルファニル）ヘキシルビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－カルボキシレート

【化11】

６－（（６－ヒドロキシヘキシル）ジスルファニル）ヘキシルビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－カルボキシレート（４９６ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４５１ｍｇ、６０９μＬ、３．４９ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解し、活性化モレキュラーシーブ上で、０℃で１時間撹拌した。２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（４１３ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で３０分間攪拌し、次いで、１．５時間にわたってゆっくりｒｔに加温した。完了したら（ＴＬＣ：２５％ ＥｔＯＡｃ／ペンタン）、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３（３×２０ｍＬ）で洗浄した。次いで、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、真空中で濃縮し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ／ペンタン＋１％ Ｅｔ_３Ｎ）によって精製すると、標記化合物が無色油（３４１ｍｇ、６７％）として得られた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ６．２１（ｄｄ，Ｊ＝５．７，３．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｄｄ，Ｊ＝５．７，２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．０４（ｔｄ，Ｊ＝６．６，４．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９２－３．７８（ｍ，２Ｈ），３．７５－３．５４（ｍ，４Ｈ），３．２３（ｄｄ，Ｊ＝４．１，２．３Ｈｚ，１Ｈ），３．０３－２．８８（ｍ，２Ｈ），２．７３－２．６７（ｍ，６Ｈ），２．０７（ｓ，１Ｈ），１．９２（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．８，９．３，３．７Ｈｚ，１Ｈ），１．７０（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．６６－１．６１（ｍ，４Ｈ），１．４５－１．３９（ｍ，８Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），１．２１（ｄｄ，Ｊ＝６．８，４．１Ｈｚ，１４Ｈ）；^３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ １４７．２６；ＨＲＭＳ ＥＳ＋（ｍ／ｚ）：Ｃ_２９Ｈ_５１Ｏ_４ＰＳ_２について計算された［Ｍ］^＋：５８６．３０２８；実測値：５８６．８３０４。

【0331】

５’ノルボルネン修飾子
ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－イルメチル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト

【化12】

Ｓｃｈｏｃｈおよび共同研究者らによって概説された手順に従って合成した。（Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈ、Ｍ．Ｗｉｅｓｓｌｅｒ、Ａ．Ｊａｅｓｃｈｋｅ、Ｐｏｓｔ－Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ Ｉｎｖｅｒｓｅ－Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２（２０１０）８８４６－８８４７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｊａ１０２８７１ｐ．）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ６．１６（ｄｄ，Ｊ＝５．７，３．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９８（ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，５．８，２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９４－３．７６（ｍ，３Ｈ），３．６２（ｄｐｄ，Ｊ＝１０．１，６．８，１．４Ｈｚ，２Ｈ），３．４０（ｄｄｔ，Ｊ＝３８．５，１０．１，７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３０－３．１４（ｍ，１Ｈ），２．９６－２．９２（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｑ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），２．７２－２．６２（ｍ，２Ｈ），１．８２（ｄｄｄｄ，Ｊ＝１１．７，９．２，３．８，１．１Ｈｚ，１Ｈ），１．５０－１．４３（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄｄ，Ｊ＝６．８，５．６Ｈｚ，１５Ｈ），０．５９－０．４９（ｍ，１Ｈ）；^３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ１４７．１８（ｄｄ，Ｊ＝３７．８，１０．４Ｈｚ）。

【0332】

４－（２－アジドエチル）－１Ｈ－イミダゾール

【化13】

Ｙａｎｇおよび共同研究者らによって概説された手順に従って合成した。（Ａ Ｌｕｏ．ｎｇ、Ｔ．Ｉｓｓａｒａｐａｎｉｃｈｋｉｔ、Ｓ．Ｄ．Ｋｏｎｇ、Ｒ．ＦｏｎｇおよびＪ．Ｙａｎｇ ｐＨ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ、Ｎ－ｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ＮＥＢＩ）ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒｓ ｅｎａｂｌｅ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｒｏｍ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｃａｒｒｉｅｒｓ，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０１０、８、５１０５－５１０９、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／Ｃ０ＯＢ００２２８Ｃ）。淡褐色油が得られた（３６０ｍｇ、９５％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ７．６４（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｓ，１Ｈ），３．６１（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．９７－２．８８（ｍ，２Ｈ）；ＬＲＭＳ ＥＳ＋（ｍ／ｚ）：Ｃ_５Ｈ_７Ｎ_５について計算された［Ｍ］^＋；１３７．１ 実測値：１３８．１［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0333】

グアニジンアジド
ｔｅｒｔ－ブチル（４－アジドブチル）カルバメート

【化14】

Ｒａｍｏｓおよび共同研究者らによって概説された手順に従って合成した。（Ｒ．Ｓｗｉｄｅｒ、Ｍ．Ｍａｓｌｙｋ、Ｊ．Ｍ．Ｚａｐｉｃｏ、Ｃ．Ｃｏｄｅｒｃｈ、Ｒ．Ｐａｎｃｈｕｋ、Ｎ．Ｓｋｏｒｏｋｈｙｄ、Ａ．Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ、Ｋ．Ｎｉｅｆｉｎｄ、Ｂ．ｄｅ Ｐａｓｃｕａｌ－ＴｅｒｅｓａおよびＡ．Ｒａｍｏｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｎｅｗ ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、ＲＳＣ Ａｄｖ．、２０１５、５、７２４８２、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／Ｃ５ＲＡ１２１１４Ｋ）。無色粘着性固体が得られた（３６１ｍｇ、８８％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ４．５９（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），３．３３（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），３．１８－３．１５（ｍ，２Ｈ），１．６７－１．５６（ｍ，４Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ）。

【0334】

１－（４－アジドブチル）グアニジン

【化15】

ｔｅｒｔ－ブチル（４－アジドブチル）カルバメート（３６０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＴＦＡ（９：１、１６．６ｍＬ）に溶解し、室温で一晩撹拌した。有機溶媒を蒸発させ、ＤＣＭ（１０ｍＬ）に再溶解し、Ｋ_２ＣＯ_３（ｓ）でクエンチし、濾過し、蒸発させた。得られた油性生成物を続くステップに直接使用した。

【0335】

半分の量の粗混合物（１８６ｍｇ、１．０当量、１．６１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１５．５ｍＬ）に溶解し、引き続いてＮ，Ｎ’－ビス（ベンジルオキシカルボニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン（５６１ｍｇ、１．１当量、１．７ｎｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．６ｍＬ）を添加した。反応混合物をｒｔで一晩撹拌した。ＤＣＭ（１５ｍＬ）を反応混合物に添加し、次いで、その後、水（２×１５ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３（１０ｍＬ）、ブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。次いで、有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、真空中で濃縮した。得られた油をＤＣＭ／ＴＦＡ（２：８、５ｍＬ）に溶解し、ｒｔで一晩撹拌した。反応物を固体Ｋ_２ＣＯ_３でクエンチし、濾過し、Ｈ_２Ｏ（２×１０ｍＬ）で洗浄した。水相を蒸発させ、Ｃ１８カラムで脱塩すると、標記化合物が得られた。ＬＲＭＳ ＥＳ＋（ｍ／ｚ）：Ｃ_５Ｈ_１２Ｎ_６について計算された［Ｍ］^＋；１５６．１ 実測値：１５７．１［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0336】

実施例５－ＮＨＳエステル系リンカーによるアミン修飾鎖の５’修飾
コンジュゲーションケミストリーを可能にする適切な反応性基を導入するために、５’アミノ修飾ＲＮＡ鎖を、これを含有するヘテロ二官能性ＮＨＳリンカーで処理した。

【0337】

図２４は、ＮＨＳ－エステルリンカーによる５’アミノ修飾ＲＮＡの修飾に使用される手順を概説する概略図である。修飾には、テトラジン、アジドおよびジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）が含まれる。

【0338】

一般的なカップリング手順
アミノ修飾オリゴヌクレオチドをストック溶液または脱水アリコートとして調製した。ヘテロ二官能性ＮＨＳ－エステル（ＮＨＳ－ＳＭ）を無水ＤＭＳＯに１００ｍＭの濃度で溶解した。

【0339】

アミノ修飾オリゴヌクレオチドを１００～２００μＭの最終濃度に希釈し、引き続いてＤＭＳＯ（総体積の５０％）、重炭酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ＝８．４、総体積の２０％）およびＮＨＳ－ＳＭ（５～２０当量）を添加した。反応混合物を３０℃で１～３時間撹拌し、次いで、ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。より高い体積では、ＥｔＯＨ沈殿およびＨ_２Ｏへの再懸濁が推奨される。

【0340】

テトラジンＮＨＳの修飾カップリング手順
アミノ修飾オリゴヌクレオチドをストック溶液または脱水アリコートとして調製した。ヘテロ二官能性ＮＨＳ－エステル（ＮＨＳ－ＳＭ）を無水ＤＭＦに１００ｍＭの濃度で溶解した。

【0341】

アミノ修飾オリゴヌクレオチドを１００～２００μＭの最終濃度に希釈し、引き続いて塩化ナトリウム／重炭酸塩緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ、ｐＨ＝８．４）およびＮＨＳ－テトラジン（５～２０当量）を添加した。反応混合物を３０℃で１時間撹拌し、次いで、ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。より高い体積では、ＥｔＯＨ沈殿およびＨ_２Ｏへの再懸濁が推奨される。

【0342】

図２５は、５’アミノ修飾ＲＮＡとＮＨＳ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯの反応のＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。上のパネルはトレースＣ－４．２全体を示し、下のパネルは１３分でのピークを示し、これは生成物Ｃ－４．３を含有する。

【0343】

図２６は、５’アミノ修飾ｓｉＲＮＡの分取ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。上のパネルは出発物質Ｓ－１．２を示し、第２のパネルはＮＨＳ－ＰＥＧ５－テトラジンで処理した物質を示し、第３のパネルはＮＨＳ－ＰＥＧ４－アジドで処理した物質を示し、下のパネルはＮＨＳ－Ｃｙ７で処理した物質を示す。

【0344】

実施例６－ｓｉＲＮＡおよびアプタマーのＲＮＡへのＩＥＤＤＡおよびＳＰＡＡＣコンジュゲーション
ＩＥＤＤＡクリック手順の例
ノルボルネン修飾コア鎖Ｃ－４．４（５ｎｍｏｌ、１．０当量、５０ｕＭ最終濃度）を、ＰＢＳ緩衝液中でテトラジン－ＮＨＳ（Ｓ－１．５、１５ｎｍｏｌ、３．０当量）を介して官能化されたｓｉＲＮＡと混合した。反応混合物をｒｔで１２時間撹拌し、引き続いてＨｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ｃ１８作業前カラムを使用し、５ｍＬ／分の流量で、２０分で５％～２５％ Ｂの逆相ＨＰＬＣ（Ａ：０．１Ｍ ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７、Ｂ：ＭｅＣＮ）で精製し、生成物を含有する画分を濃縮し、脱塩すると、４４％の単離収率が得られた。

【0345】

ＳＰＡＡＣクリック手順の例
ＤＢＣＯ修飾コア鎖（Ｃ－４．３、１ｎｍｏｌ、１．０当量、５０ｕＭ最終濃度）を、ＰＢＳ緩衝液中でアジド官能化ｓｉＲＮＡ Ｓ－１．６（２ｎｍｏｌ、２．０当量）と混合した。反応混合物をｒｔで２４時間撹拌した、引き続いて直接ＰＡＧＥ分析を行った。

【0346】

組み立てられたＮＡナノ粒子でのＩＥＤＤＡ
ＮＡナノ粒子（ＳＱ１－００００－００５）を標準的な組み立てプロトコルに従って組み立てて、１つの鎖（Ｃ－４．４）が５’位に反応性ノルボルネン部分を有する、１０μＭの濃度の構築物を得た。次いで、これをＰＢＳ中、それぞれ１、２および４モル当量のテトラジン標識ｓｉＲＮＡ Ｓ－１．５で処理した。結果として生じる溶液を３０℃で撹拌し、引き続いて８％ネイティブＰＡＧＥによって直接分析した（図３５）。

【0347】

図２７は、ＲＮＡ鎖の分析用ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。上のパネルは未修飾鎖Ｃ－４．０を示し、中央のパネルはノルボルネンＣ－４．４で修飾された類似鎖を示し、下のパネルはテトラジンＣ－４．３で修飾された類似鎖を示す。

【0348】

図２８は、５’ノルボルネン修飾Ｃ－４．４ ＲＮＡと５’テトラジン修飾ｓｉＲＮＡ Ｓ－１．５のカップリング（１：１モル当量）後の経時的実験の重ね合わせた分析用ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。

【0349】

図２９は、５’ノルボルネン修飾ＲＮＡ Ｃ－４．４と５’テトラジン修飾ｓｉＲＮＡ Ｓ－１．５のカップリング（１：２モル当量）後の経時的実験の重ね合わせた分析用ＲＰ－ＨＰＬＣを示す。

【0350】

図３０は、５’ノルボルネン修飾ＲＮＡ Ｃ－４．４と５’テトラジン修飾ｓｉＲＮＡ Ｓ－１．５のカップリング（１：４モル当量）後の経時的実験の重ね合わせた分析用ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。

【0351】

図３１は、５’ノルボルネン修飾ＲＮＡ Ｃ－４．４と５’テトラジン修飾アプタマーＡ－１．３のカップリングの分析用ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。上のパネルはテトラジン修飾アプタマーの１４．２分までのトレースを示し、中央のパネルは、ＩＥＤＤＡコンジュゲートの１２．２分までのトレースを示し、下のパネルは５’ノルボルネン修飾ＲＮＡの１１．５分までのトレースを示す。

【0352】

図３２は、精製された画分を示す、対応するＰＡＧＥ（１５％変性、２５０Ｖ）を用いたＩＥＤＤＡカップリング鎖（ＮＡナノ粒子コア鎖Ｃ－４．４＋ｓｉＲＮＡ Ｓ－１．５）の精製を示すＨＰＬＣトレースを示す。

【0353】

図３３は、アニーリングされたｓｉＲＮＡセンス鎖およびアンチセンス鎖を示す１８％ ＭＯＰＳ ＰＡＧＥ（１５０Ｖ、２．５時間、ｇｅｌ ｒｅｄ染色）を示す。センス鎖は、ＩＥＤＤＡ（Ｃ－４．４＋Ｓ－１．５）を介してコアＮＡナノ粒子鎖にコンジュゲートされる。レーン１、コア鎖－ＩＥＤＤＡセンス鎖（Ｃ－４．４＋Ｓ－１．５）；レーン２、アンチセンス鎖（Ｓ－２．１）；レーン３、アニーリング産物（Ｃ－４．４＋Ｓ－１．５＋Ｓ－２．１）；レーン４、低分子領域ｓｓＲＮＡラダー。

【0354】

図３４は、３０°Ｃで１：１モル当量のコア：アプタマーを使用したＩＥＤＤＡを介したアプタマーＡ－１．３へのコアＮＡナノ粒子鎖Ｃ－４．４のコンジュゲーションを示す１５％変性ＰＡＧＥ（２５０Ｖ、１時間、ｇｅｌ ｒｅｄ染色）を示す。左パネルは６時間の反応時間後のＰＡＧＥを示し、右パネルは１２時間の反応時間後のＰＡＧＥを示す。レーン１、コアＮＡナノ粒子鎖Ｃ－４．４；レーン２、アプタマーＡ－１．３；レーン３、ＩＥＤＤＡ反応混合物；レーンＬ、低分子領域ｓｓＲＮＡラダー。

【0355】

図３５は、完全組み立てＮＡナノ粒子（ＳＱ１－００００－００５）との代表的なＩＥＤＤＡコンジュゲーションを示すネイティブＰＡＧＥ（８％、１５０Ｖ、１時間）を示す。レーン１、出発物質；レーン２、１モル当量のｓｉＲＮＡ（Ｓ－１．５）；レーン３、２モル当量のｓｉＲＮＡ（Ｓ－１．５）；レーン４、４モル当量のｓｉＲＮＡ（Ｓ－１．５）。

【0356】

図３６は、アジド官能化ｓｉＲＮＡ Ｓ－１．６を有するコア鎖Ｃ－４．３とのＳＰＡＡＣコンジュゲーションの変性ＰＡＧＥ（１５％、２５０Ｖ、１時間）を示す。

【0357】

図３７は、Ｃ－５．２を形成するためのＣ－５．３のＣｙ７－ＮＨＳ標識（３０２ｎｍ ＧｅｌＲｅｄ／Ｃｙ７チャネル）の変性ＰＡＧＥ（１５％、２５０Ｖ、１時間）を示す。

【0358】

実施例７－５’修飾ＲＮＡに対するＣｕＡＡＣ
アジ化銅－アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）を２つのプロトコルに従って行った；（１）２０μｌ反応のために予めＮ_２を流した０．６ｍｌのエッペンドルフに、アジド含有ＲＮＡ（３μＭ）、アルキン含有ＲＮＡ（９μＭ）、ＰＢＳ（１０ｘ、２ｕｌ）、０．６μＬの２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水溶液を添加した。反応混合物を脱気した後、０．３μＬの脱気した１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム溶液（新たに調製した）を添加し、引き続いて新たに調製した硫酸銅（０．１μｌ、５ｍＭストック溶液）を添加した。反応混合物を再び脱気し、ｒｔまたは４０℃のヒートブロックで１時間インキュベートした。次いで、さらに０．１μｌの脱気したアスコルビン酸ナトリウム溶液を反応混合物に添加した。反応混合物を再び脱気し、ｒｔまたは４０℃のヒートブロックで１時間インキュベートした。クリックされた生成物を変性ＰＡＧＥによって分析した。（２）予めＮ_２を流した０．６ｍｌのエッペンドルフに、アジド含有ＲＮＡ（１ｎｍｏｌ、１μｌ）、アルキン含有ＲＮＡ（１．５ｎｍｏｌ、１μｌ）、ＭｇＣｌ_２（２０ｍＭ、０．５μｌ）、ＴＥＡＡ（０．４Ｍ、１μｌ、ｐＨ＝７）、ＤＭＳＯ（５μｌ）および新鮮なアスコルビン酸（２５ｍＭ、１μｌ）を添加した。反応混合物を脱気した後、新たに調製したＣｕＢｒ－ＴＢＴＡ溶液（ＤＭＳＯ／ｔ－ＢｕＯＨ ３：１（ｖ／ｖ）中５０ｍＭ ＣｕＢｒ／５０ｍＭ ＴＢＴＡ １：２（ｖ／ｖ）、０．５μｌ）を添加した。反応混合物を再び脱気し、ｒｔのシェーカー上で１～２時間放置した。クリックされた生成物を変性ＰＡＧＥによって分析した。約１０～５０％のＲＮＡ－ＲＮＡカップリング効率が観察された。

【0359】

実施例８－内部修飾ＲＮＡに対するＣｕＡＡＣ
内部位置（Ｃ－５．４、Ｃ－５．５）がプロパルギル基で修飾されたＲＮＡに対してＣｕＡＡＣを試みた。

【0360】

内部クリック修飾のための一般的な手順
２０μＬのアルキン修飾ＲＮＡ（ＴＥＡＡ ２Ｍ中１００μＭ、ｐＨ＝７．０）、４μＬのヘプタエチレングリコール（ＤＭＳＯ中５ｍＭ）、２０μＬのアスコルビン酸ナトリウム１０ｍＭ（ＴＥＡＡ中 ２Ｍ、ｐＨ＝７．０）ならびに２０μＬのＣｕ_２ＳＯ_４（ＤＭＳＯ中）およびＴＨＰＴＡ（ＴＥＡＡ中 ２Ｍ、ｐＨ＝７．０）の１０ｍＭ １：１溶液を用いて１００μＬ溶液を調製した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。この時間の後、混合物を、１．５ｍＬの２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１０ｍＭ過塩素酸ナトリウム、２０％ ＭｅＣＮで予めコンディショニングしたＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＤＳＣ－ＳＡＸ ＳＰＥ Ｔｕｂｅ（Ｍｅｒｃｋ）を通して濾過した。０．７５ｍＬの２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、６００ｍＭ過塩素酸ナトリウム、２０％ ＭｅＣＮを使用して溶出した。ＬＣＭＳ分析前に、Ｇｅｌ－Ｐａｋ（商標）１．０Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｇｌｅｎ）を使用して試料を脱塩した。

【0361】

図３８は、クリックされた鎖（１つの位置（鎖Ｃ－５．４）、または８つの位置（鎖Ｃ－５．５）でＰＥＧおよびコレステロール）の変性ゲル（１５％、２５０Ｖ、１時間）を示す。シフトにより、生成物が１またはそれを超えるコレステロール単位にカップリングしていることが明らかになった。レーン１、鎖Ｃ－５．４（非コンジュゲート、出発物質）；レーン２、鎖Ｃ－５．４^＊コレステロールクリック（Ｃ１８精製）；レーン３、鎖Ｃ－５．４^＊コレステロールクリック（ＥｔＯＨ沈殿）；レーン４、鎖Ｃ－５．４^＊ＰＥＧ７クリック（Ｃ１８精製）；レーン５、鎖Ｃ－５．４^＊ＰＥＧ７クリック（ＥｔＯＨ沈殿）；レーン６、鎖Ｃ－５．５（非コンジュゲート出発物質）；レーン７、鎖Ｃ－５．５^＊コレステロールクリック（Ｃ１８精製）；レーン８、鎖Ｃ－５．５^＊コレステロールクリック（ＥｔＯＨ沈殿）；レーン９、鎖Ｃ－５．５^＊ＰＥＧ７クリック（Ｃ１８精製）；およびレーン１０、鎖Ｃ－５．５^＊ＰＥＧ７クリック（ＥｔＯＨ沈殿）。

【0362】

図３９は、可逆的ジスルフィド架橋を介した５’－チオール修飾ｓｉＲＮＡセンス鎖Ｓ－１．１によるナノ粒子コア鎖Ｃ－１．１の官能化を示す変性ＰＡＧＥ（１５％、２５０Ｖ、１時間）を示す。レーンＭ、低分子領域ｓｓＲＮＡラダー（ＮＥＢ、番号Ｎ０３６４Ｓ）；レーンｃｒ、粗カップリング混合物；レーン１～６、粗カップリング混合物のＩＥＸ－ＨＰＬＣ精製後に得られた画分１～６。

【0363】

実施例９－ジスルフィド形成を介したチオール含有ＲＮＡの溶液相コンジュゲーション
ｓｉＲＮＡ分子を、ジスルフィド結合形成を介してコア構築物に結合させた。チオール含有ＲＮＡセンス鎖（Ｓ－１．１）およびコア鎖（Ｃ－１．１またはＣ－４．１）をＤＴＴ（総体積２５０μＬの２０ Ａ２６０単位／ｍＬのＲＮＡ当たり４ｍｇのＤＴＴ）と混合し、溶液のｐＨをトリエチルアミンでｐＨ８超に調整し、還元を室温で３０分間～２．５時間行った。還元ＲＮＡをＧｅｌ－Ｐａｋ脱塩カラム（Ｇｌｅｎ）による脱塩に供し、脱塩画分中のＲＮＡ濃度をｎａｎｏｄｒｏｐでＵＶ吸光度によって決定した。その後、カップリングパートナー（ｓｉＲＮＡセンス鎖およびコア鎖）を、鎖の一方、好ましくはｓｉＲＮＡセンス鎖が２～５倍モル過剰で使用されるように一緒に混合した。最終体積の１０％に相当する体積の１Ｍ ＫＣＯ_３／Ｋ（ＣＯ_３）_２緩衝液（ｐＨ１０）および最終体積の２０％に相当する体積のホルムアミドを鎖混合物に添加し、混合物をサーモシェーカー上室温で一晩インキュベートした。次いで、カップリング生成物をＩＥＸ－ＨＰＬＣによって精製し、精製した生成物を２５０Ｖの定電圧で１×ＴＢＥ中の変性ＰＡＧＥ（１５％）にローディングした。ＧｅｌＲｅｄ（商標）を使用してゲルバンドを可視化した（図３９）。

【0364】

実施例１０－ペプチド合成および結合
固相ペプチド合成－実施例手順
以下の溶液を調製した：脱保護溶液：ＤＭＦ中２０％ピペリジン；活性剤溶液：ＤＭＦ中０．２５Ｍ ＨＡＴＵ；塩基性溶液：ＤＭＦ（５．５４ｍＬ）中２，６－ルチジン（２．０５ｍＬ）＋ＤＩＰＥＡ（１．９６ｍＬ）；キャッピング溶液：ＤＭＦ（１８ｍＬ）中Ａｃ_２Ｏ（０．９２ｍＬ）＋２，６－ルチジン（１．３ｍＬ）；アミノ酸溶液：ＤＭＦ中０．２Ｍ。

【0365】

予めローディングしたアミノ系樹脂（上記の通り）（５０ｍｇ）を室温で３０分間ＤＭＦ（３ｍＬ）中で膨潤させた。次いで、ＤＭＦを排出し、樹脂をＤＭＦ中２０％ピペリジンに浸漬した（このステップを繰り返した）。次いで、樹脂をＤＭＦ（３×３ｍＬ）、ＤＣＭ（３×３ｍＬ）で洗浄し、再びＤＭＦ（３×３ｍＬ）で洗浄した。別の容器で、所望のアミノ酸溶液（１．２９ｍＬ）、ＨＡＴＵ（４５２μＬ、４．５当量）および塩基溶液（１１０μＬ）を混合し、次いで、樹脂に添加した。次いで、結果として生じる懸濁液をｒｔで３０分間撹拌し、シリンジをフラッシュし、カップリングステップを繰り返した。カップリングの成功をカイザーテストで監視した。カップリングが成功した後、樹脂をＤＭＦ（３×３ｍＬ）、ＤＣＭ（３×３ｍＬ）およびＤＭＦ（３×３ｍＬ）で洗浄した。次いで、樹脂をキャッピング溶液（上記参照）に５分間浸漬した。シリンジをフラッシュし、樹脂をＤＭＦ（３×３ｍＬ）、ＤＣＭ（３×３ｍＬ）およびＤＭＦ（３×３ｍＬ）で洗浄した。次いで、所望の配列が得られるまで、（脱保護ステップから）プロセスを繰り返した。

【0366】

樹脂をＴＦＡ／フェノール／水／ＴＩＰＳ（８８／５／５／２）の混合物に浸漬し、３時間撹拌し、引き続いて氷冷ジエチルエーテル中に滴下沈殿させることによって、樹脂からの切断を達成した。次いで、結果として生じる沈殿を酢酸に溶解し、凍結乾燥すると、所望のペプチドが酢酸塩として得られた。

【0367】

精製
ペプチドおよびペプチドコンジュゲートのＨＰＬＣ分析および精製を、ＲＥＳＯＵＲＣＥ（商標）ＲＰＣ３カラム（３ｍＬ、６．４ｍｍ×１００ｍｍ）を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｖａｎｑｕｉｓｈ Ｃｏｒｅで実施した。試料をＤＭＳＯに溶解し、注入した。流量３ｍＬ／分；溶離液Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．１％ ＴＦＡ）；溶離液Ｂ：ＭｅＣＮ（０．１％ ＴＦＡ）。

【0368】

１５分で０～１００％Ｂの勾配、引き続いて５分間１００％Ｂを利用した。

【0369】

合成ペプチドの質量分析
本明細書で使用されるペプチドを表７に記載する。

【表7】

【0370】

図４０は、マレイミド修飾ＧＦＷＦＧのＲＰ ＨＰＬＣトレースを示す。１５分で０～１００％ Ｂ（Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ ＴＦＡ；Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ ＴＦＡ）。

【0371】

図４１は、左パネルにおいて、同じ鎖のチオール－ＲＮＡ Ｃ－２．１対ペプチドコンジュゲートＲＮＡの変性ＰＡＧＥおよび右パネルにおいて、コンジュゲーション反応混合物の粗ＲＰ ＨＰＬＣトレースを示す。３０分のピークはチオール－ＲＮＡに対応する。５０分のピークは、ペプチド－ＲＮＡ産物である。

【0372】

実施例１１－マレイミド官能化ペプチドのチオール含有ＲＮＡへの溶液相コンジュゲーション
実施例手順
凍結乾燥オリゴヌクレオチドＣ－２．１（２３４ｎｍｏｌ）を水（１ｍＬ）に溶解し、２つの別々のバイアルに分割した。各バイアルに、Ｅｔ_３Ｎ（１０μＬ）および５０μＬのＤＴＴの１Ｍ溶液を添加した。次いで、結果として生じる溶液をｒｔで２．５時間撹拌した。次いで、過剰のＤＴＴをＧｅｌＰａｋ脱塩カラム（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で除去し、ＲＮＡ濃度を測定した。９６ｎｍｏｌの完全脱塩ＲＮＡを回収した。２つの脱塩オリゴを合わせてプールして、Ｈ_２Ｏ中総体積を３．６ｍＬとした。これに、ＴＥＡＡ（１００ｍＭ、ｐＨ＝７、０．８ｍＬ）を添加した。ペプチド（ＲＮＡに対して１０当量）を、別のバイアルにおいて、ＭｅＣＮ中２０％ホルムアミドに溶解して、５０ｍＭの濃度を得た。これを新たに脱塩したオリゴ溶液に添加すると、顕著な沈殿が生じた。ＤＭＳＯ（４．４ｍＬ）を添加して、ＴＥＡＡ／ＤＭＳＯの１：１（ｖ／ｖ）混合物を得て、ペプチドを可溶化し、オリゴの変性を補助した。反応混合物をｒｔで１６時間撹拌した。ＲＮＡ－ペプチドコンジュゲートに対するＲＮＡの保持時間の差はおよそ２０分であるので、これはＲＰ ＨＰＬＣによって直接精製することができる。

【0373】

実施例１２－ＦｌＩＣｋケミストリー
ＦｌＩＣｋケミストリーを介したＲＮＡ－カーゴコンジュゲーションの成功を可能にするためには、２つの重要な官能基：オルト－フタルアルデヒドならびに末端アミンおよびチオールを有する「ピンサー」配置が必要である。オリゴヌクレオチドの５’末端は、それだけに限らないが、以下に示されるＣｙｓ－Ｌｙｓジペプチドを含む任意のＣｙｓ－Ｌｙｓ含有ペプチドで修飾され得る。この修飾は、オルト－フタルアルデヒド保有分子でステープリング反応が起こることを可能にする。

【化16】

【0374】

オルト－フタルアルデヒド修飾オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡをタンパク質にカップリングさせるために文献で使用されている（Ｙ．Ｍａ、Ｚ．Ｌｖ、Ｔ．Ｌｉ、Ｔ．Ｔｉａｎ、Ｌ．Ｌｕ、Ｗ．Ｌｉｕ、Ｚ．Ｚｈｕ、Ｃ．Ｙａｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏ－ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ，ｒａｐｉｄ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｎｄｅｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５４（２０１８）９４３４－９４３７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ８ｃｃ０５０３７ｆ．）。この方法論は、ＦｌＩＣｋケミストリーを誘発するために所望の官能基を有するＲＮＡカーゴを官能化するためにここで適用され得る。この合成で使用される中間体（以下）はまた、それだけに限らないが、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質および治療用低分子を含む代替カーゴを官能化するために使用され得る。

【化17】

【0375】

図４２は、ＦｌＩＣｋケミストリーで使用するためのオルト－フタルアルデヒド含有ホスホロアミダイトの合成スキームを示す。Ｍａおよび共同研究者らによって概説された文献方法に基づく（Ｙ．Ｍａ、Ｚ．Ｌｖ、Ｔ．Ｌｉ、Ｔ．Ｔｉａｎ、Ｌ．Ｌｕ、Ｗ．Ｌｉｕ、Ｚ．Ｚｈｕ、Ｃ．Ｙａｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏ－ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ，ｒａｐｉｄ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｎｄｅｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５４（２０１８）９４３４－９４３７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ８ｃｃ０５０３７ｆ）。

【0376】

実施例１３－細胞傷害性ヌクレオチド
それだけに限らないが、アリストマイシン、ネオプラノシンＡ、リバビリン、ピラゾフリン、シタラビンアラビノシド（ａｒａ－Ｃ）、ゲムシタビン、クラドリビン（２－ＣｄＡ）、ショードマイシン、エラシタラビンを含む細胞傷害性ヌクレオシドは、オキシムなどの刺激応答性リンカーを介して核酸ナノ粒子に結合され得る。これらは、ヌクレオシド上の任意の所与のＯＨに連結され得、Ｍｅｙｅｒおよび共同研究者らによって概説された方法論を利用して、フタルイミドオキシ修飾オリゴヌクレオチドを介して結合されよう（以下に示される構造）。（Ｙ．Ｍａ、Ｚ．Ｌｖ、Ｔ．Ｌｉ、Ｔ．Ｔｉａｎ、Ｌ．Ｌｕ、Ｗ．Ｌｉｕ、Ｚ．Ｚｈｕ、Ｃ．Ｙａｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏ－ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ，ｒａｐｉｄ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｎｄｅｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５４（２０１８）９４３４－９４３７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ８ｃｃ０５０３７ｆ．）。

【化18】

【0377】

あるいは、これらの化合物は、ホスホロアミダイトケミストリーを介して核酸骨格に組み込まれてもよく、切断されやすい配列に囲まれてもよく、または自己犠牲リンカーに直接結合されてもよい（Ｃ．Ａ．Ｂｌｅｎｃｏｗｅ、Ａ．Ｔ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｆ．Ｇｒｅｃｏ、Ｗ．Ｈａｙｅｓ、Ｄ．Ｗ．Ｔｈｏｒｎｔｈｗａｉｔｅ，Ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２（２０１１）７７３－７９０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ０ｐｙ００３２４ｇ．）。例えば、リバビリンは、このケミストリーを利用してオリゴ内の任意の内部に組み込まれ得る。この化合物（以下）は当技術分野で公知である（．Ｉ．Ｄａｗｓｏｎ、Ａ．Ｎ．Ｊｉｎａ、Ｓ．Ｔｏｒｋｅｌｓｏｎ、Ｓ．Ｒｈｅｅ、Ｍ．Ｍｏｏｒｅ、Ｄ．Ａ．Ｚａｒｌｉｎｇ、Ｐ．Ｄ．Ｈｏｂｂｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ－３’，５’－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｅｎｔａｄｅｃａｍｅｒ ｈｏｍｏｒｉｂｏｐｏｌｙｍｅｒ ｂｅａｒｉｎｇ ａ ５’－ａｍｉｎｏ ｔｅｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ａ ３’－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（１９９０）１０９９－１１０２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／１８．５．１０９９．）。

【化19】

【0378】

この一般式を有する化合物は、成分オリゴヌクレオチド鎖全体に組み込まれ得る：

【化20】

【0379】

犠牲リンカーを有するリバビリンホスホロアミダイトの例を以下に示す。カーボネートに隣接するジスルフィドは、長い間、高分子プロドラッグとして使用されてきた（Ａ．Ｋｏｃｋ、Ｋ．Ｚｕｗａｌａ、Ａ．Ａ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ、Ｐ．Ｒｕｉｚ－Ｓａｎｃｈｉｓ、Ｂ．Ｍ．Ｗｏｈｌ、Ｍ．Ｔｏｌｓｔｒｕｐ、Ａ．Ｎ．Ｚｅｌｉｋｉｎ、Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｒｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｔｈｉｏｌ－ｆｒｅｅ ａｎｔｉ－ＨＩＶ ａｇｅｎｔ ｔｏ ｍａｋｅ ｕｐ ｆａｓｔ－ａｃｔｉｎｇ，ｐｏｔｅｎｔ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５０（２０１４）１４４９８－１４５００．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ４ｃｃ０４２８０ｈ．；Ｘ．Ｈｕ、Ｊ．Ｈｕ、Ｊ．Ｔｉａｎ、Ｚ．Ｇｅ、Ｇ．Ｚｈａｎｇ、Ｋ．Ｌｕｏ、Ｓ．Ｌｉｕ、Ｐｏｌｙｐｒｏｄｒｕｇ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ：Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｆｏｒ ｓｈａｐｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３５（２０１３）１７６１７－１７６２９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｊａ４０９６８６ｘ．；Ｓ．Ｂｈｕｎｉｙａ、Ｓ．Ｍａｉｔｉ、Ｅ．Ｊ．Ｋｉｍ、Ｈ．Ｌｅｅ、Ｊ．Ｌ．Ｓｅｓｓｌｅｒ、Ｋ．Ｓ．Ｈｏｎｇ、Ｊ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ａｎ ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．５３（２０１４）４４６９－４４７４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１３１１１３３．）。この化合物の提案される合成を図４９に概説する。

【化21】

【0380】

図４９は、自己犠牲リバビリンホスホロアミダイトの合成スキームを示す。（ｉ）ＤＭＴｒＣｌ、ピリジン（ｉｉ）ＴＢＤＭＳＣｌ、ＡｇＮＯ_３、ピリジン（ｉｉｉ）２－（（２－（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）エチル）ジスルファニル）エチルアセテート、ＴＥＡ、ＤＣＭ、（ｉｖ）ＡｃＯＨ（ｖ）２－（（２－（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エチル）ジスルファニル）エチル（４－ニトロフェニル）カーボネート、ＴＥＡ、ＤＣＭ（ｖｉ）Ｋ_２ＣＯ_３、ＭｅＯＨ（ｖｉｉ）ＣＥＰ－Ｃｌ、ピリジン、ＤＣＭ。

【0381】

実施例１４－コンジュゲートｓｉＲＮＡの生物学的活性
アンチセンス鎖のアニールメント
等モル量の（ｉ）ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖（Ｓ－２．１）および（ｉｉ）センス鎖またはセンス鎖コンジュゲートをそれぞれ、ヌクレアーゼフリー水中２０μＭの最終濃度で混合した。混合物を５分間９５℃に加熱し、引き続いてサーモサイクラー中０．１℃／秒の速度で２０℃まで温度を降下させた。アニーリングをＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ、５ｍＭ ＮａＯＡｃ、２．２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ ７．０）中のネイティブＰＡＧＥによって確認した（図３３－１８％ＭＯＰＳ ＰＡＧＥ）。

【0382】

トランスフェクション、逆転写およびｑＰＣＲ
ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞を分割し、計数し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した）に希釈し、７×１０^４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに蒔いた。蒔いた２４時間後、３０～５０％のコンフルエンスで、細胞を、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）に対する２０ｎＭのｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡコンジュゲートでトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、非標的化ｓｉＲＮＡによる対照トランスフェクション（ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＲＩＳＣ－Ｆｒｅｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ番号Ｄ－００１２２０－０１－２０）と非トランスフェクト細胞の両方と比較した。トランスフェクション混合物を以下のように調製した：ｓｉＲＮＡをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）中１２０ ｎＭの濃度に希釈した。次いで、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００トランスフェクション試薬の１：１００希釈液をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）中で調製し、室温で５分間インキュベートした。等体積の希釈ｓｉＲＮＡおよび希釈リポフェクタミンを穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートし、その間に細胞の成長培地を吸引し、２００μｌの完全成長培地で置き換えた。その後、１００μｌ／ウェルのｓｉＲＮＡ－リポフェクタミン混合物を細胞に添加して、２０ｎＭのｓｉＲＮＡの最終濃度を得た。プレートを穏やかに揺動させ、ＣＯ２インキュベーター内に３７℃で置いた。２４時間後、成長培地を５００μｌの完全培地で置き換えた。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、プレートを－７０℃で凍結した。
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用して、凍結トランスフェクト細胞からＲＮＡを単離した。供給業者のプロトコルに従って、２００ ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および０．５μｌのランダムプライマーを含有する２０μｌの反応液中で２００ ｎｇのＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成した。目的の各遺伝子について、７．５μＬのＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５μＭの組み合わせた順方向プライマーおよび逆方向プライマー１μＬならびに１．５μＬのＲＮＡｓｅフリー水（単一反応用）と合わせることによって、ｑＰＣＲマスターミックスを調製した。次いで、１０μＬのマスターミックスを９６ウェルプレートのウェルに等分し、５μＬの１：３０希釈ｃＤＮＡを添加した。各条件を３連でピペッティングした。プレートを光学接着カバーで密封し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器にローディングした。サイクリング条件は、５０℃で２分（１サイクル）；９５℃で２分、９５℃で１秒および６０℃で３０秒（４０サイクル）；引き続いて、融解曲線分析（連続蛍光測定により９５℃で１秒、６０℃で３０秒、および６０℃から９０℃への増加）とした。

【0383】

図４３は、ｑＰＣＲによって得られた、ジスルフィドまたはＩＥＤＤＡカップリングを介してＰＬＫ１標的化ｓｉＲＮＡにコンジュゲートした２０ｎＭのＲＮＡ鎖によるトランスフェクションの４８時間後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞におけるＰＬＫ１ｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。１列、ＲＮＡ対照なし（リポフェクタミン２０００のみで処理した細胞）；２列、リポフェクタミン対照なし（ｓｉＲＮＡで処理した細胞）；３列、センス鎖のみの対照（５’→５’ジスルフィド結合形成を介してセンス鎖Ｓ－１．１にコンジュゲートされたコア鎖Ｃ－４．１でトランスフェクトした細胞、アンチセンス鎖は付加されていない）；４列、コア鎖とｓｉＲＮＡ二本鎖の５’→５’へのジスルフィド架橋コンジュゲート（Ｃ－４．１＋Ｓ－１．１＋Ｓ－２．１）；５列、ｓｉＲＮＡ二本鎖（５’チオールを使用、Ｓ－１．１＋Ｓ－２．１）；６列、コア鎖とｓｉＲＮＡ二本鎖の５’→５’ ＩＥＤＤＡカップリングコンジュゲート（Ｃ－４．４＋Ｓ－１．５＋Ｓ－２．１）；７列、ｓｉＲＮＡ二本鎖（３’チオールを使用、Ｓ－１．７＋Ｓ－２．１）；８列、コア鎖とｓｉＲＮＡ二本鎖の５’→３’ジスルフィド架橋コンジュゲート（Ｃ－４．１＋Ｓ－１．７＋Ｓ－２．１）。

【0384】

図４３に示されるように、この研究で試験した全てのｓｉＲＮＡコンジュゲートは、生物学的に活性のままであり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞におけるＰＬＫ１ｍＲＮＡレベルの６０～９０％の減少をもたらした。

【0385】

実施例１５－コンビナトリアルカーゴ－ｓｉＲＮＡ
核酸ナノ粒子の搭載能力を増加させるために、２つのＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ（センス鎖）を、コンビナトリアルリンカー設計を使用して互いに直接コンジュゲートした。ＴＴＴＴスペーサーおよびジスルフィドの２つのコンジュゲーション戦略を使用した。配列を表８に示す。

【表8-1】

【表8-2】

【0386】

コンビナトリアルｓｉＲＮＡの合成を、実施例２に概説される慣用的な固相技術を使用して行った。ジスルフィド連結鎖の場合、５’チオールＣ６修飾子（Ｇｌｅｎ）を第１のｓｉＲＮＡ配列の５’末端に付加した。次いで、ＤＭＴ基を除去し、鎖を通常通り伸長させた。

【0387】

実施例１４に概説されるプロトコルに従ってコンビナトリアルｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞のＲＴ－ｑＰＣＲ分析は、両コンビナトリアル設計戦略（４．および５．）が、古典的な単一ｓｉＲＮＡ設計（３）と比較してＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞においてより高いノックダウン活性をもたらすことを示した。

【0388】

図４４は、ＩＥＤＤＡカップリング反応混合物の分析変性ＰＡＧＥ（２５０Ｖ、１時間、ｇｅｌｒｅｄ染色）を示す。レーン１、ＲＮＡ Ｓ－１．５（出発物質）；レーン２、Ｓ－３．１（出発物質）；レーン３、Ｃ－４．４（出発物質）；レーン４、Ｓ－１．５にコンジュゲートしたＣ－４．４（ＩＥＤＤＡ）、脱塩；レーン５、Ｓ－１．５にコンジュゲートしたＣ－４．４（ＩＥＤＤＡ）、ＥｔＯＨ沈殿；レーン６、Ｓ－３．１とコンジュゲートしたＣ－４．４、脱塩；およびレーン７、Ｓ－３．１にコンジュゲートしたＣ－４．４、ＥｔＯＨ沈殿。

【0389】

図４５は、ｑＰＣＲによって得られた、２０ ｎＭの示されたｓｉＲＮＡによるトランスフェクションの４８時間後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞におけるＰＬＫ１ ｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。示されるデータは、２回の生物学的反復実験から得た。スクランブルｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ相互作用についての能力が損なわれた市販の非標的化ｓｉＲＮＡを示す（ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＲＩＳＣ－Ｆｒｅｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｄ－００１２２０－０１－２０）。

【0390】

図５０は、非変性ＰＡＧＥを介して組立体の３つの異なるバージョンを示す。組立体の増加した搭載の特性評価を、７５分間の実行時間を用いて１００Ｖにおいて６％非変性ＰＡＧＥで行った。形成された構築物は、（ｉ）アプタマーを含まないＳ－Ａ０構築物（ＳＱ１－００００－００１とも呼ばれ、鎖Ｃ－１．０、Ｃ－２．０、Ｃ－３．０、Ｃ－４．０、Ｃ－５．０で構成される）、（ｉｉ）１つのｓｉＲＮＡを含むＳＱ－０１００－００１構築物（ＳＱ１６とも呼ばれ、鎖Ｃ－１．０、Ｃ－２．０、Ｃ－３．０、Ｃ－４．４、Ｃ－５．０、Ｓ－１．５、Ｓ－２．０で構成される）、（ｉｉｉ）２つのｓｉＲＮＡを含むＳＱ－０２００－００１構築物（ＳＱ－１７とも呼ばれ、Ｃ－１．０、Ｃ－２．０、Ｃ－３．０、Ｃ－４．４、Ｃ－５．０、Ｓ－３．１、Ｓ－２．０鎖で構成される）を、１０μＭの最終濃度で、２ｍＭ ＭｇＣｌ２を補充したＰＢＳ中で等モル量で合わせた。鎖を５分間９５℃に加熱し、室温までゆっくり冷却した。組立体の各バージョンについて、１ ｐｍｏｌをゲルにローディングした。ゲルの実行後染色を、ＧｅｌＲｅｄ染色を用いて行った。組立体上のｓｉＲＮＡの数が増加するにつれて、ゲルシフトがあることが分かる。

【0391】

実施例１６－コンビナトリアルカーゴ－ＧａｌＮＡｃ／ｓｉＲＮＡ
Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、裸のｓｉＲＮＡ送達に関連する課題を克服するために広く研究されてきた。原型ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合するＧａｌＮＡｃの三量体である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｄ．；Ｄｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．ＧａｌＮＡｃ－ＳｉＲＮＡ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｗａｙ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．２０１８，２８（３），１０９－１１８．）。このモチーフは、コンビナトリアルカーゴ設計の一部として使用され得る。これは、ホスホロアミダイトケミストリーを介して、例えば５’末端でＳ－３．０からＳ－４．１への伸長として結合され得る。この修飾は、（４－（トリメトキシトリチルオキシメチル）－１－（６－（４－（３，４，６－Ｏ－トリアセチル－２－アセチルアミノ－２－デオキシ－β－Ｄ－ガラクトピラノシル）ブタンアミド）ヘキサノイル）ピペリジン－４－イル）メチル－Ｏ－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた標準的な固相合成によって組み込まれるであろう。

【0392】

図５１は、ＧａｌＮＡｃ Ｃ３ ５’ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ）を介して一価および三価ＧａｌＮＡｃにカップリングしたコンビナトリアルカーゴ（ｓｉＲＮＡ）の概略図である。

【0393】

図５２は、合成後ＩＥＤＤＡコンジュゲーションのための５’ＧａｌＮＡｃ修飾子の合成の概略図である。ＧａｌＮＡｃ Ｃ３ ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ）をＧａｌＮＡｃ Ｃ３ ５’ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ）および５’ノルボルネンホスホロアミダイトで鎖伸長し、引き続いて標準的なＲＮＡ脱保護条件（ＡＭＡ／ＨＦ）を適用する。

【0394】

合成後アプローチをとることもできる。三価ＧａｌＮＡｃは、固相合成とそれに続くビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－イルメチル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイトによる直接伸長を介して、安価かつ容易に合成され得る。

【0395】

実施例１７－コンビナトリアルカーゴ－コレステロールおよびＧａｌＮＡｃへの二重コンジュゲーション
ｓｉＲＮＡコンジュゲートの有効性を改善するためのほとんどの戦略は、例えば、リガンド結合価、間隔、電荷、リンカー長およびリンカー疎水性を最適化することによって、コンジュゲートされたリガンドの効力を増強することに焦点を当てるか、または治療用ｓｉＲＮＡの化学的安定性を増強することを目的とする。異なるアプローチは、複数のリガンドおよび複数のｓｉＲＮＡ分子を組み合わせて単一コンジュゲートにすることであろう。

【0396】

図５３は、修飾ホスホロアミダイトを介してコレステロールおよび三価ＧａｌＮＡｃに二重コンジュゲートしたコンビナトリアルカーゴ（ｓｉＲＮＡ）の概略図である。

【0397】

このような戦略は、治療ペイロードを増加させ、多重遺伝子サイレンシングを可能にし、同時に、コンジュゲートの薬物動態特性を微調整することを可能にするであろう。オリゴヌクレオチドの固相合成中の二本鎖ｓｉＲＮＡへのコレステロールおよび三価または四価ＧａｌＮＡｃ部分の結合は、２つのｍＲＮＡを標的とするために使用することができ、それによりコンジュゲートの送達が、ＧａｌＮＡｃのおかげで肝細胞に制限され、潜在的な腎毒性が、腎蓄積を減少させるコレステロールのために制限され得る（Ｆ．Ｗａｄａ、Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｔ．Ｕｅｄａ、Ｍ．Ｓａｗａｍｕｒａ、Ｓ．Ｗａｄａ、Ｍ．Ｈａｒａｄａ－Ｓｈｉｂａ、Ｓ．Ｏｂｉｋａ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ＧａｌＮＡｃ Ｄｕａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｒｅｎａｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．２８（２０１８）５０－５７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８９／ｎａｔ．２０１７．０６９８）。コレステロールおよびＧａｌＮＡｃリガンドは、以前に記載されたような単一ＧａｌＮＡｃ部分を有するホスホロアミダイト（Ｋ．Ｇ．Ｒａｊｅｅｖ、Ｊ．Ｋ．Ｎａｉｒ、Ｍ．Ｊａｙａｒａｍａｎ、Ｋ．Ｃｈａｒｉｓｓｅ、Ｎ．Ｔａｎｅｊａ、Ｊ．Ｏ’Ｓｈｅａ、Ｊ．Ｌ．Ｓ．Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ、Ｋ．Ｙｕｃｉｕｓ、Ｔ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｓ．Ｓｈｕｌｇａ－Ｍｏｒｓｋａｙａ、Ｓ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ａ．Ｌｉｅｂｏｗ、Ｗ．Ｑｕｅｒｂｅｓ、Ａ．Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ、Ｋ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｍ．Ａ．Ｍａｉｅｒ、Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ Ｎｏｖｅｌ Ｎｏｎ－ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ Ｅｌｉｃｉｔｓ Ｒｏｂｕｓｔ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｖｉｖｏ、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．１６（２０１５）９０３－９０８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｃｂｉｃ．２０１５０００２３）および５’－コレステロール－ＴＥＧ－ＣＥホスホロアミダイトからの標準的な固相合成を介して組み込まれるであろう。二重リガンド二重ｓｉＲＮＡは、合成後クリック反応で、例えば鎖Ｃ－４．４へのＩＥＤＤＡ媒介コンジュゲーションを介して、ＲＮＡナノ粒子足場鎖にさらに結合され得る。

【0398】

実施例１８－アプタマー結合の評価
ハイブリダイゼーションによるアプタマーの結合
（ｉ）アプタマーを含まないＣｙ３標識Ｓ－Ａ０構築物（ＳＱ１－００００－００１とも呼ばれ、鎖Ｃ－１．０、Ｃ－２．０、Ｃ－３．０、Ｃ－４．０、Ｃ－５．１で構成される）、（ｉｉ）１つのアプタマーを含むＳ－Ａ１構築物（ＳＱ１－１０００－００１とも呼ばれ、鎖Ｃ－１．３、Ｃ－２．０、Ｃ－３．０、Ｃ－４．０、Ｃ－５．１で構成される）、（ｉｉｉ）２つのアプタマーを含むＳ－Ａ２構築物（ＳＱ－２０００－００１とも呼ばれ、鎖Ｃ－１．３、Ｃ－２．０、Ｃ－３．２、Ｃ－４．０、Ｃ－５．１で構成される）、および（ｉｖ）４つのアプタマーを含むＳ－Ａ４構築物（Ｓ－４０００－００１とも呼ばれ、Ｃ－１．３、Ｃ－２．３、Ｃ－３．２、Ｃ－４．５、Ｃ－５．１で構成される）に組み立てられるように設計された５つの四角形足場ＲＮＡ鎖を、１０μＭの最終濃度で、２ｍＭ ＭｇＣｌ２を補充したＰＢＳ中で等モル量で合わせた。５つの鎖を５分間９５℃に加熱し、室温までゆっくり冷却した。アプタマー（Ａ－１．１）を３分間７５℃に加熱し、次いで、それぞれ０、等モル、２倍モルまたは４倍モル当量でコア鎖組立体に混合した。次に、混合物を５５℃で１０分間インキュベートして、アプタマー鎖を構築物にハイブリダイズさせた。ナノ粒子の品質をネイティブＰＡＧＥによって評価した。

【0399】

アプタマー結合アッセイ
高レベルの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現する細胞株であるＡ４３１類表皮癌細胞を、アプタマー構築物による処理の４８時間前に、０．７５×１０^５細胞の濃度で２４ウェルプレートに蒔いた。培地を２４時間後に一回更新した。蒔いた後２日目に、細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで洗浄し、１０％ ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中２００μＬの２００ ｎＭ構築物（Ｓ－Ａ０／ＳＱ１－００００－００１、Ｓ－Ａ１／ＳＱ－１０００－００１、ＳＱ－Ａ２／Ｓ－２０００－００１、ＳＱ－Ａ４／Ｓ－４０００－００１）で処理した。細胞を３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を吸引し、細胞を、３７℃で５分間、２００μＬの０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンでトリプシン処理した。完全成長培地で中和した後、細胞をエッペンドルフチューブに等分し、４℃４分間、３００×ｇで遠心分離した。培地を吸引し、細胞を１ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、次いで、メッシュＦＡＣＳチューブを通して移した。この洗浄手順を２回繰り返した。細胞を最終的に２００μＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー分析前に氷上に保った。

【0400】

フローサイトメトリー
細胞へのアプタマー結合を、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを用いてＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで試験した。フローサイトメトリー測定の約５分前に、細胞を２μＬの１：１０希釈ＤＡＰＩ溶液で染色して、生細胞と死細胞との識別を可能にした。ＤＡＰＩシグナルを４０５ｎｍレーザーおよび４５０／５０ ｎｍフィルタで検出し、Ｃｙ３蛍光を５６１ｎｍレーザーおよび５８６／１５ｎｍフィルタで収集した。ゲーティング、データ分析およびプロットは、ｍａｃＯＳ用ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアｖ．１０．７．１を用いて実施した。Ｃｙ３＋細胞の量および蛍光強度の幾何平均を列挙するヒストグラムを抽出し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍのＴｕｋｅｙ一元配置分散分析を使用して統計分析を実施した。

【0401】

図４６は、２００ｎＭの濃度の１０％熱不活性化ＦＢＳを含む細胞培養培地中で２時間インキュベートした後の、０、１、２または４個のＥＧＦＲ標的化アプタマー（Ａ－１．１）を保有するＣｙ３標識構築物のＥＧＦＲ過剰発現Ａ４３１がん細胞への結合を示すグラフを示す。Ａ、アプタマーＡ－１．１；（★）、Ｃｙ３
標識；（^＊＊）、ｐ≦０．０１；（^＊＊＊）、ｐ≦０．００１；（^＊＊＊＊）、ｐ≦０．０００１；示されていない場合は有意ではない。

【0402】

実施例１９－ＲＮＡナノ粒子取り込みの評価
２００ｎＭのＣｙ５標識Ｅ０７ｍｉｎ Ａ－１．０アプタマー（Ａ－１．０）または２００ｎＭのＣｙ５標識構築物（ＳＱ１－１０００－００１）で処理した後、共焦点顕微鏡法によって細胞を画像化した。アプタマー取り込み実験のために、１０％ ｖ／ｖのＦＢＳを含有する３００μＬのＤＭＥＭ中のμ－Ｓｌｉｄｅ ８ウェルｉｂｉｄｉ処理チャンバー（ＩＢＩＤＩ）の各ウェルに１×１０^４細胞を蒔いた。取り込み実験のために、３．４×１０^３細胞（ＨｅＬａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＡ５４９細胞）または６．８×１０^３細胞（Ｍｃｆ－７）を、１０％ ｖ／ｖのＦＢＳを含有する１００μＬのＤＭＥＭ中のμ－Ｓｌｉｄｅ １８ウェルｉｂｉｄｉ処理チャンバー（ＩＢＩＤＩ）の各ウェルに蒔いた。細胞が接着した５時間後および画像化の４８時間前に、３７℃の一晩のインキュベーションのために、培地を５０粒子／細胞（ＰＰＣ）ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ初期エンドソーム－ＧＦＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で置き換えた。さらに、２００ ｎＭアプタマーを含有する２００μＬのＤＭＥＭアリコートを、対応するインキュベーション時点で細胞に添加した。その後、培地を除去し、１００～２００μＬのＤＭＥＭ中の６０ｎＭ ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＤＮＤ－９９（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と３７℃で１時間交換した。次いで、細胞をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ）で１回洗浄した。最後に、１００～２００μＬの画像化培地（ｐＨ７．４に調整した、２０ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）で緩衝したＨＢＳＳ）を細胞に添加した。共焦点画像を、６０倍油浸対物レンズを使用してＥＶＯＳ顕微鏡またはＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０レーザー走査顕微鏡で捕捉した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像を生成した。

【0403】

図４７は、アプタマーが内部移行後にリソソームに蓄積することを示す顕微鏡像を示す。Ｅ０７ｍｉｎアプタマー（Ａ－１．０）で処理した後の生ＨｅＬａ細胞の代表的な共焦点蛍光顕微鏡による画像（時間の長さを増加させて、倍率６０倍）。Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒおよび初期エンドソームＧＦＰ染色を使用して、各区画を同定した。スケールバー、５０μｍ。

【0404】

共焦点データは、Ｅ０Ｏ７ｍｉｎアプタマーを有するＣｙ５標識構築物（ＳＱ１－１０００－００１）が、ＥＧＦＲを発現するがん細胞によって特異的に取り込まれることを実証した（図４７）。

【0405】

さらなる取り込み実験のために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を計数し、１８ウェルＩＢＩＤＩチャンバーにおいて３．４×１０^３細胞／ウェルの細胞密度で播種した。２４時間後、細胞を洗浄し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）中の単一ＥＧＦＲ標的化Ｅ０７ｍｉｎアプタマーを保有する２００ｎＭ Ｃｙ５標識構築物（ＳＱ１－１０００－００１）で４、８および２４時間処理した。画像化前に、核二本鎖ＤＮＡをＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。蛍光顕微鏡による画像を、６０倍油浸対物レンズ（ＮＡ１．３５）を使用してＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１顕微鏡で捕捉した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像を分析した。

【0406】

図４８は、ＲＮＡナノ粒子が細胞への内部移行後に核周囲空間に蓄積することを示し、エンドソーム取り込みを示唆する顕微鏡像を示す。倍率６０倍の、単一アプタマーを保有する２００ｎＭのＣｙ３標識構築物（Ｓ－Ａ１／Ｓ－１０００－００１）で４時間、８時間および２４時間処理した後の生ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の代表的な蛍光顕微鏡による画像。核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、構築物をＣｙ５で標識した（明るい白色スポットとして現れる）。スケールバー、２０μｍ。

【0407】

図４８に示される顕微鏡によるデータは、Ｅ０Ｏ７ｍｉｎアプタマー（ＳＱ１－１０００－００１）を有するＣｙ５標識構築物ががん細胞によって取り込まれ、核周囲領域に濃縮されることを実証している。当業者であれば、核周囲空間がエンドソーム小胞およびリソソームに富むことが知られている領域であり、共局在アッセイなどの方法を使用してエンドソームおよびリソソームへの取り込みを実証することができることを認識する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

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【図21】

【図22】

【図23】

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【図26】

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【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【配列表】

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【国際調査報告】