特表 2023-523404 マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する防御のためのワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-05

(54)【発明の名称】マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する防御のためのワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20230529BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20230529BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20230529BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20230529BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230529BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230529BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20230529BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230529BHJP

   A61D 1/02 20060101ALN20230529BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 J

A61K9/51

A61K47/36

A61K47/24

A61P31/04

A61P11/00

A61K39/12

A61P43/00 121

A61D1/02 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022563160

(86)(22)【出願日】2021-04-19

(85)【翻訳文提出日】2022-12-09

(86)【国際出願番号】 EP2021060013

(87)【国際公開番号】W WO2021213948

(87)【国際公開日】2021-10-28

(31)【優先権主張番号】20170440.0

(32)【優先日】2020-04-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510000976

【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100172683

【弁理士】

【氏名又は名称】綾 聡平

(74)【代理人】

【識別番号】100219265

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 崇大

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】ビルスマ，ヨハンナ・ヤコバ・エリザベス

(72)【発明者】

【氏名】ウィトフリート，マールテン・ヘンドリク

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

【Ｆターム（参考）】

4C076AA65

4C076BB11

4C076BB16

4C076CC06

4C076CC15

4C076CC32

4C076DD63

4C076EE38

4C076FF70

4C085AA03

4C085AA04

4C085BA48

4C085BA51

4C085BB11

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG05

(57)【要約】

マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）バクテリンに結合したナノ粒子を含むワクチンであって、該ナノ粒子がカチオン性多糖およびアニオン性リン脂質を含む、前記ワクチン。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）バクテリンに結合したナノ粒子を含むワクチンであって、該ナノ粒子がカチオン性多糖およびアニオン性リン脂質を含む、前記ワクチン。

【請求項2】

カチオン性多糖が多孔性多糖である、請求項１記載のワクチン。

【請求項3】

アニオン性リン脂質が、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルセリンおよびジアシルホスファチジルイノシトールから選択される、請求項１または２記載のワクチン。

【請求項4】

カチオン性多糖が、架橋マルトデキストリンをグリシジル－トリメチルアンモニウムと反応させることにより得られうる、請求項１～３のいずれか１項記載のワクチン。

【請求項5】

薬学的に許容される溶媒を含む、請求項１～４のいずれか１項記載のワクチン。

【請求項6】

ワクチンが油および／または水酸化アルミニウムおよび／またはサポニンおよび／またはカルボポールを本質的に含有しない、請求項１～５のいずれか１項記載のワクチン。

【請求項7】

ブタにおけるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染の予防における使用のための、請求項１～６のいずれか１項記載のワクチン。

【請求項8】

ワクチンが全身投与される、請求項７記載の使用のためのワクチン。

【請求項9】

ワクチンが皮内投与される、請求項７または８記載の使用のためのワクチン。

【請求項10】

ワクチンが単回用量として投与される、請求項７～９のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。

【請求項11】

マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染による肺病変の低減における使用のための、請求項７～１０のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。

【請求項12】

第１ワクチン、第２ワクチンおよびリーフレットを含むパーツ・キットであって、ここで、第１ワクチンが請求項１～６のいずれか１項記載のワクチンであり、第２ワクチンが弱毒化生ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を含む、前記キット。

【請求項13】

請求項１～６のいずれか１項記載のワクチンの有効量を投与することを含む、ブタにおけるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染の予防方法。

【請求項14】

ブタにおけるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染の予防用の医薬の製造のための、請求項１～６のいずれか１項記載のワクチンの使用。

【請求項15】

第１ワクチンと第２ワクチンとの混合物を含む混合ワクチンであって、ここで、第１ワクチンが請求項１～６のいずれか１項記載のワクチンであり、第２ワクチンが弱毒化生ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を含む、前記混合ワクチン。

【請求項16】

請求項１～６のいずれか１項記載のワクチンまたは請求項１５記載の混合ワクチンを含むバイアル。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）バクテリンに結合したナノ粒子を含むワクチン、およびブタにおける感染の予防のためのこのワクチンの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（以下、Ｍｈｙｏとも称される）は細胞壁欠損細菌であり、ブタにおける伝染性慢性疾患であるブタ流行性肺炎の原因因子である。Ｍｈｙｏは、ブタの気道に感染し、気管、気管支および細気管支で増殖する。それは上皮肺細胞の繊毛に付着し、最終的にはこれを殺して、肺病変および二次感染［例えば、他のマイコプラズマ種、例えばマイコプラズマ・ハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）およびマイコプラズマ・フロクラーレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｌｏｃｃｕｌａｒｅ）による感染、ならびにＰＲＲＳＶ（ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス）およびＰＣＶ２（ブタウイルス２型）による感染］を引き起こす。

【0003】

この疾患は、感染したブタの肺から排出される空気伝染性Ｍｈｙｏ病原体により、ブタからブタへと伝染する。

【0004】

特に、Ｍｈｙｏによる感染は、体重増加の低減、飼料要求の悪化を引き起こし、したがって商業的養豚場における重大な経済的損失を招く。

【0005】

Ｍｈｙｏ細菌は細胞壁を欠いており、ほとんどの一般的な抗生物質は細胞壁の合成に焦点を合わせているため、そのような抗生物質は無効である。

【0006】

Ｍｈｙｏ病原体に対して使用されるワクチンは公知であり、商業的に入手可能であり、例えば、ＲｅｓｐｉＳｕｒｅ（登録商標）（Ｚｏｅｔｉｓ）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）Ｍ．ｈｙｏおよびＭｙｃｏＦＬＥＸ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｈｙｏｒｅｓｐ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌ）、Ｓｔｅｌｌａｍｕｎｅ（登録商標）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｅｌａｎｃｏ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）、Ｆｏｓｔｅｒａ（登録商標）ＰＣＶ ＭＨ（Ｚｏｅｔｉｓ）ならびにＭ＋Ｐａｃ（登録商標）およびＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍｈｙｏ（共にＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈから入手可能）が挙げられる。

【0007】

これらのワクチンは、全て免疫応答を増強するために、そしてまた、所望によりＭｈｙｏ抗原を安定化するために、古典的なアジュバントを含有し、例えば鉱油および植物油、非天然ポリマーならびに水酸化アルミニウムのような非自己化合物をアジュバントとして含有する。該非自己化合物は免疫応答を増強するが、望ましくない部位効果を引き起こしうる。特に、ブタは、鉱油、ミョウバン粒子および他の非自己化合物のような賦形剤に対して非常に感受性である。古典的なアジュバントに典型的に関連する部位効果を誘発しない有効なワクチンを提供することが本発明の目的であった。

【0008】

また、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染の予防に使用される簡便で安全で有効なワクチンを提供することが本発明の目的であった。

【0009】

また、市販ワクチンは、一般的に免疫化を確実に成功させるために、初回ワクチン接種と、それに続く該初回投与から２～３週間以内の追加（ブースト）ワクチン接種とによるツーショット（２回接種）方式で投与される。しかし、そのようなツーショット適用は、効率およびコストの点で不利である。

【0010】

したがって、ワンショット（１回接種）方式で有効であるワクチンを提供することがもう１つの目的であった。

【0011】

更に、混合ワクチン（組合せワクチン）の開発は厄介であり、なぜなら、全てのワクチン成分の安全性および安定性を確保する必要があり、そして、混合ワクチンの開発は単純ではないからである。特に、弱毒化生ワクチンとバクテリンワクチンとの組合せは、安定性を損ない、両方のタイプの抗原を安定化する賦形剤を選択することは困難である。

【0012】

したがって、安全に使用でき、および／または安定である混合ワクチンを提供することがもう１つの目的であった。

【発明の概要】

【0013】

発明の概括
これらの目的は、驚くべきことに、本発明の以下の態様により解決された。

【0014】

本発明による組成物は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）バクテリンに結合したナノ粒子を含み、ここで、ナノ粒子は、カチオン性多糖およびアニオン性リン脂質を含む。

【0015】

驚くべきことに、多糖（一般的な食事性化合物）およびリン脂質（対象自身の化合物、すなわち自己化合物）を含有する前記ナノ粒子とＭｈｙｏバクテリンとを含むワクチンが、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染の予防のための安定かつ有効なワクチンを提供する一方で、望ましくない部位効果を誘発しないことが見出された。

【0016】

したがって、本発明はまた、ブタにおけるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染の予防における使用のためのワクチンに関する。以下においては、このワクチンは、本発明によるワクチンとも称されうる。

【0017】

本発明はまた、第１ワクチン、第２ワクチンおよびリーフレットを含むパーツ・キット（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）に関するものであり、ここで、第１ワクチンは本発明によるワクチンであり、第２ワクチンは、弱毒化生ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を含む。

【0018】

もう１つの態様においては、本発明は、ワクチンの有効量を投与することを含む、ブタにおけるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染の予防方法に関する。

【0019】

更にもう１つの態様においては、本発明は、ブタにおけるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染の予防用の医薬の製造のための、本発明のワクチンの使用に関する。

【0020】

更にもう１つの態様においては、本発明は、第１ワクチンと第２ワクチンとの混合物をバイアル内に含む混合ワクチンに関するものであり、ここで、第１ワクチンは本発明によるワクチンであり、第２ワクチンは、弱毒化生ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を含む。該混合ワクチンは、いわゆるＲＴＵ（ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ；使用準備済）ワクチンであり、したがって、製造業者により製造された混合形態で末端使用者に送られ、あるいは、例えば、対象動物への投与の直前に、例えばＰＲＲＳウイルスをＭｈｙｏワクチン中に溶解することにより混合されるワクチンでありうる。

【0021】

詳細な説明
以下の定義は本発明の実施形態に関するものである。

【0022】

「ワクチン」なる語は薬学的組成物を指す。該組成物は、病原性微生物（「病原体」）に対する防御免疫を動物において誘導し得、すなわち、それは、病原体による感染および／またはこの感染の結果である障害もしくは疾患に対する有効な予防的治療を誘導しうる。

【0023】

抗原は、一般に、宿主動物において特異的免疫応答を誘導する任意の物質を意味し、死亡した若しくは弱毒化された若しくは生きている生物全体、生物のサブユニットもしくは一部分、免疫原をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテンまたはそれらの任意の組合せを含みうる。バクテリンは特異的抗原である。「バクテリン」なる語は、死亡細菌の懸濁液であって、例えば、細菌培養物を濃縮し、ついでそれを、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）、クロロクレゾール、ホルマリンのような化学物質で、または例えばＵＶ光、もしくは細胞溶解を招かない他のタイプの不活化で不活化することにより得られるものを意味する。バクテリンとは対照的に、ライセートは抗原であり、この場合、不活化細菌が、例えば、凍結－融解サイクル、超音波処理、フレンチプレス、ビーズビーティング（ｂｅａｄ ｂｅａｔｉｎｇ）などのような細胞溶解または破壊プロセスにおいて特別に処理される。

【0024】

「ナノ粒子」は、ｎｍ範囲の粒径（粒子サイズ）、すなわち、１～１０００ｎｍの平均体積粒子直径（Ｄ_５０）を有する粒子である。１つの実施形態においては、ナノ粒子は、１～５００ｎｍの平均体積粒径（Ｄ_５０）を有する。例えば、平均体積粒径は、１０～４００ｎｍ、例えば、２０～３００ｎｍおよび３０～２００ｎｍである。典型的には、平均体積粒径は、３５～１５０ｎｍである。平均体積粒径は、レーザー回折により決定されうる。好ましい実施形態においては、粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ａｕｔｏｓｉｚｅｒ（商標）４７００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｓ．Ａ．，ＵＫ）を使用する動的光散乱により測定される。９０°の固定角で４８８ｎｍのレーザービームを使用して測定を行うことが好ましい。好ましくは、１５ｍＭｏｌ ＮａＣｌの水溶液を分散剤として使用し、この場合、ナノ粒子を０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮する。好ましくは、測定を３回行う。

【0025】

「ゼータ電位」なる語は、分散媒と分散粒子の固定層との間の電荷を意味する。したがって、ゼータ電位は、粒子の表面電荷、界面における任意の吸着層ならびに周囲の懸濁媒体の性質および組成の関数である。好ましい実施形態において、ゼータ電位は、ゼータサイザーナノ（ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ）ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用する光子相関分光法により決定される。媒体としての水中で測定を行うことが好ましい。好ましくは、３回重複して測定を行う。

【0026】

感染（感染症）の「有効な予防的治療」または「予防」なる語は、治療後感染の、または治療後感染から生じる疾患もしくは障害の、予防、改善または軽減を含むと理解されるべきである。

【0027】

予防における使用のためのワクチンの「ワンショット」または「単回投与（単回用量、１回量）」なる語は、２回目のワクチン接種、すなわち「追加（ブースト）」ワクチン接種を必要とせず、防御免疫の付与に尚も有効であるワクチン接種を意味する。この用語は、同時に投与される２以上の別個の用量として単回用量が投与されることを除外しないことに注意すべきである。

【0028】

「含む」なる語の意味は、具体的に言及されている特徴の全て、および所望により含まれうるもの、追加的なもの、特定されていないものを含むと解釈されるべきであり、一方、「からなる」なる語は、特定されている特徴のみを含む。したがって、「含む」は、限定的な場合として、「からなる」により特定される構成を含む。

【0029】

本明細書中で用いる「ブタ」なる語は、子ブタ、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、豚（ｐｉｇ）、ポルシン（ｐｏｒｃｉｎｅ）、繁殖用雌ブタ（ｓｏｗ）、未経産ブタ（ｇｉｌｔ），去勢ブタ（ｂａｒｒｏｗ）、未去勢雄ブタ（ｂｏａｒ）、すなわち、イノシシ科（Ｓｕｉｄａｅ）の全てのメンバーを意味する。

【0030】

「重量％」なる語は、特に示されていない限り、ワクチンの総重量に対する特定の成分の重量を意味する。

【0031】

本発明による好ましい実施形態を以下に明確に記載する。好ましい実施形態は、単独の場合または組合された場合に好ましい。更に、以下の好ましい実施形態は、本発明の全態様、すなわち、ワクチン、使用のためのワクチン、パーツ・キット、治療方法、医薬の製造のための使用および混合ワクチンを意味すると理解されるべきである。

【0032】

１つの実施形態においては、本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）バクテリンに結合したナノ粒子を含むワクチンに関するものであり、ここで、ナノ粒子はカチオン性多糖およびアニオン性リン脂質を含む。

【0033】

本発明のナノ粒子は公知であり、該粒子を得るための方法は、とりわけ、Ｐａｉｌｌａｒｄら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０１０，ｖｏｌ．２７，ｐ．１２６－１３３、ＷＯ２０１４／０４１４２７およびＷＯ２０１８／１０４７６２ならびにそれらにおける参考文献に記載されている。

【0034】

好ましい実施形態においては、カチオン性多糖は、それぞれの多糖（例えば、２Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液中のマルトデキストリン）を溶解し、架橋剤（例えば、エピクロロヒドリン）を添加し、ついでカチオン性リガンド（例えば、グリシジル－トリメチルアンモニウムクロリド；ヒドロキシコリン）を添加することにより調製されうる。ついでｐＨ値を、好ましくは酢酸で中和し、混合物を、好ましくは圧力下で、剪断してカチオン性多糖ナノ粒子を得ることが可能である。

【0035】

ついで、得られたカチオン性多糖にアニオン性リン脂質をローディングし、これは、好ましくは、カチオン性バイオポリマーとアニオン性リン脂質（例えば、ジパルミトイル－ホスファチジルグリセロール）とを適切な溶媒中で（例えば、エタノール中で約１時間）混合することにより行う。

【0036】

１つの実施形態においては、カチオン性多糖は多孔性カチオン性多糖である。

【0037】

ナノ粒子は多孔性ナノ粒子であり、すなわち、それは、液体または空気が粒子内を通過しうるように粒子の「バルク」内に空隙を有するものでありうる。したがって、アニオン性リン脂質が孔を満たすことが可能となり、アニオン性リン脂質がナノ粒子のコア内に少なくとも部分的に存在するように、カチオン性多糖は多孔性でありうる。

【0038】

典型的には、（多孔性）粒子は、少なくとも０．１ｍ^２／ｇ、少なくとも０．５ｍ^２／ｇ、５ｍ^２／ｇ、少なくとも１０ｍ^２／ｇ、または少なくとも２０ｍ^２／ｇのＢＥＴ（比表面積）を有する。好ましくは、ナノ粒子のＢＥＴは少なくとも５ｍ^２／ｇである。比表面積の決定は、異なる圧力において窒素／ヘリウム雰囲気中にサンプルを配置することにより行われる。サンプルを冷却すると、粒子の表面上で窒素分子が凝縮する。凝縮窒素量は、窒素／ヘリウム混合物の熱伝導率の変化により決定され、サンプルの表面積は、窒素の面積要件を用いて決定される。この値およびサンプル重量を用いて比表面積が算出される。比表面積は、ＢＥＴソープメーター、例えばＭｏｎｏｓｏｒｂ（商標），Ｆａ．Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ［ＤＩＮ ＩＳＯ ９２７７（２０１４年１月公開）に準拠］を使用して得られうる。

【0039】

１つの実施形態においては、ナノ粒子は、カチオン性多糖とアニオン性リン脂質とを４０：１～１：２０、２０：１～１：１０、または１０：１～１：３の重量比で含む。好ましい実施形態においては、ナノ粒子は、カチオン性多糖とアニオン性リン脂質とを１０：１～１：３の重量比で含む。

【0040】

１つの実施形態においては、ナノ粒子は、０～７０ｍＶ、５～６５ｍＶ、または１０～５０ｍＶのゼータ電位を有する。ナノ粒子が１０～５０ｍＶのゼータ電位を有することが好ましい。

【0041】

ナノ粒子は、外側部分（すなわち、表面）および内側部分（すなわち、コア）を有する。特定の実施形態においては、ナノ粒子のゼータ電位から外側部分がアニオン性リン脂質を本質的に含有しないことが推論されうる。したがって、外側部分はカチオン性多糖から本質的になり、コアはアニオン性リン脂質を含有する。好ましい実施形態においては、カチオン性多糖は多孔性である。この実施形態においては、アニオン性リン脂質は、好ましくは孔を満たす。したがって、好ましい実施形態においては、アニオン性リン脂質はナノ粒子の内部、すなわちコアに存在する。好ましい実施形態においては、ナノ粒子はコアを形成し、ここで、アニオン性リン脂質はコア内に存在する。１つの実施形態においては、ナノ粒子は、コアを包囲するリン脂質層を含まない。リン脂質層は、リン脂質を含む層である。

【0042】

Ｍｈｙｏバクテリンは商業的に入手可能であり、バクテリンを得るための方法は当業者に公知であり、例えば、Ｍｈｙｏ細胞を培養し、ついで該細胞を不活化することによる方法が公知である。

【0043】

１つの実施形態において、ワクチンは、１：１０～１０：１、１：５～５：１、または１：２～２：１のナノ粒子対Ｍｈｙｏバクテリンの重量比を有する。好ましい実施形態において、ナノ粒子対Ｍｈｙｏバクテリンの重量比は、１：１～１：３、例えば１：１である。

【0044】

Ｍｈｙｏバクテリンとナノ粒子とは結合しており、すなわち、それらは組成物を形成しており、ここで、バクテリンは、ファンデルワールス力および静電力のような分子間力により粒子に結合している。Ｍｈｙｏバクテリンは、ナノ粒子の外側に結合していると考えられている。１つの実施形態において、Ｍｈｙｏバクテリンに結合しているナノ粒子は、２００～１５００ｎｍ、または３００～１２００ｎｍ、または４００～１１００ｎｍの実測Ｄ_５０値（レーザー回折法を用いた場合）を有する（観測値は測定方法に大きく左右される）。

【0045】

カチオン性多糖は、デンプン、デキストランおよびマルトデキストリンから選択される多糖から得られうることが好ましい。より好ましくは、カチオン性多糖コアは、デンプン、デキストランおよびマルトデキストリンから選択される多糖と、第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンならびに第四級アンモニウム塩から選択されるリガンドとを反応させることにより得られうる架橋ポリマーである。架橋剤は当業者に公知であり、好ましい架橋剤は、エピクロロヒドリン（１－クロロ－２，３－エポキシプロパン）である。

【0046】

１つの実施形態においては、アニオン性リン脂質は、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルセリンおよびジアシルホスファチジルイノシトールから選択され、ここで、各場合のアシルはカルボン酸に由来しうる。好ましい実施形態においては、アニオン性リン脂質は、ジパルミトイル－ホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）である。

【0047】

多糖コアとアニオン性リン脂質とを混合することにより、カチオン性多糖コアにアニオン性リン脂質をローディングすることが可能である。「ローディング」なる語は、アニオン性リン脂質とカチオン性多糖との混合物に関するものであると理解されるべきである。

【0048】

１つの実施形態において、カチオン性多糖は、架橋マルトデキストリンをグリシジル－トリメチル－アンモニウムと反応させることにより得られうるカチオン性ポリマルトデキストリンである。

【0049】

１つの実施形態において、ワクチンは、薬学的に許容される溶媒を含み、それにより、いわゆる使用準備済（ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）ワクチンとしてワクチンを提供する。好ましくは、溶媒は水を含み、バクテリンは、それがその有効性を保有するように希釈される。好ましい実施形態において、溶媒は生理食塩水および／またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。もう１つの実施形態において、ワクチンは、投与前に薬学的に許容される溶媒と混合される凍結乾燥物として提供されうる。

【0050】

１つの実施形態において、ワクチンは、古典的アジュバント、例えば油および／または水酸化アルミニウム、および／またはサポニンおよび／またはカルボポールを本質的に含有しない。

【0051】

「本質的に含有しない」は、ワクチンの全組成物に対して０．１％（ｖ／ｖ）未満の濃度を指す。

【0052】

アジュバントは、一般にそれが誘発する免疫学的事象に従って分類されうる。第１のクラスは、とりわけ、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）、サポニン（またはその画分および誘導体、例えばＱｕｉｌ Ａ）、水酸化アルミニウム、リポソーム、コクリエート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、ポリ乳酸／グリコール酸を含み、抗原の取り込み、輸送および提示［ＡＰＣ（抗原提示細胞）によるもの］を促進する。第２のクラスは、とりわけ、油エマルション、ゲル、ポリマーミクロスフェア、非イオン性ブロックコポリマー、そしておそらくはまた、水酸化アルミニウムを含み、デポー効果をもたらす。第３のクラスは、とりわけ、ＣｐＧリッチモチーフ、モノホスホリルリピドＡ、マイコバクテリア（ムラミルジペプチド）、酵母抽出物、コレラ毒素を含み、保存された微生物構造、いわゆる病原体関連微生物パターン（ＰＡＭＰ）（シグナル０として定義される）の認識に基づく。第４のクラスは、とりわけ、油エマルショ、界面活性剤、水酸化アルミニウム、低酸素状態を含み、危険および無害（自己および非自己と同じである必要はない）を免疫系が識別する能力を刺激することに基づく。第５のクラスは、とりわけ、サイトカインを含み、ＡＰＣ上の共刺激分子（シグナル２）のアップレギュレーションに基づく。アジュバントは、適切な免疫応答をもたらすのに役立つ。本ナノ粒子がこれらのクラスの１つに属すると明確には特定できないが、それでも、幾つかの特定の配置において、アジュバント効果が得られうるようである。

【0053】

ワクチンは、所望により、補助物質、例えば湿潤剤、ｐＨ緩衝剤、増粘添加剤および保存剤を含有しうる。適切な補助物質は、例えば、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ”（Ｍａｒｋ Ｇｉｂｓｏｎ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）に開示されている。

【0054】

ワクチンは、免疫学的に有効な量のＭｈｙｏバクテリンを含有すると理解されるべきである。そのような量は、一般的な知識に基づいて容易に確立可能であり、例えば、市販製品であるＰｏｒｃｌｉｓ ＭｈｙｏＩＤ ＯＮＣＥ（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）または商業的に入手可能な他のバクテリン製品のいずれかに存在するＭｈｙｏバクテリンの量でありうる。

【0055】

１つの実施形態において、ワクチンは、０．１～３ｍｌ／用量、好ましくは０．２～２ｍｌ／用量の体積で標的動物に投与される。１つの実施形態において、ワクチンはワクチンの１用量当たり２μｇ～１０ｍｇ、１０μｇ～５ｍｇ、２０μｇ～２０００μｇ、または２００μｇ～２０００μｇのナノ粒子を含有する。典型的には、ワクチンはワクチンの１用量当たり１～５ｍｇのナノ粒子を含有する。

【0056】

１つの実施形態において、ワクチンは、ブタにおけるマイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染の予防のために使用される。

【0057】

１つの実施形態において、使用されるワクチンは、ブタの生後（出生後）第１週～第５週、例えば第２週～第４週に投与される。もう１つの実施形態において、使用されるワクチンは生後第１週～第５週にワンショット方式として投与される。

【0058】

もう１つの実施形態において、ワクチンは全身投与される。局所投与（例えば、鼻腔内または胃内）とは対照的に、全身投与は、ワクチンが対象の循環系に送達されて、その全身に本質的な影響を及ぼすことを意味する。全身投与の例には、筋肉内（ＩＭ）、静脈内（ＩＶ）、皮内（ＩＤ）、経皮（ＴＤ）および皮下（ＳＣ）が含まれる。

【0059】

１つの実施形態において、ワクチンは皮内投与される。好ましくは、ワクチンは、ＩＤＡＬ（商標）（液体の皮内適用）注射システムを使用する無針注射により投与される。ＩＤＡＬは、圧力に基づく適用システムである（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈからのもの）。

【0060】

１つの実施形態において、使用されるワクチンは単回用量（１回量）として投与される。したがって、ワクチンは、複数回の投与（例えば、初回ワクチン接種および追加ワクチン接種を含むツーショット適用）ではなくワンショット投与として投与される。

【0061】

好ましい実施形態において、使用されるワクチンは、単回用量として標的動物に皮内投与される。

【0062】

典型的には、ワクチンは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染による肺病変の低減に使用される。偽ワクチン接種対照ブタと比較して、肺病変が１０～１００％、更には５０～１００％低減することが判明した。

【0063】

一般的なスコア化系を使用した肺病変スコア（ＬＬＳ）は、未処理対照ブタと比較して、１０～１００％、典型的には５０～１００％低減しうる。

【0064】

実施例１に更に詳細に記載されているとおり、ＬＬＳは３週間のチャレンジの後で測定される。肺病変およびＬＬＳの低減は、未処置のブタと比較した場合の本発明のワクチンで処置されたブタの比較を意味する。ＬＬＳは、ワクチンによる免疫化の有効性に関する有用な指標である。肺病変の比率を測定し、これをグッドウインおよびホイットルストーン（Ｇｏｏｄｗｉｎ＆Ｗｈｉｔｔｌｅｓｔｏｎｅ）のスコア（Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄ，“Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｏｏｔｉｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｎ ｐｉｇ ｈｅｒｄｓ．Ｉ．Ｅｉｇｈｔ ｙｅａｒｓ ｇｅｎｅｒａｌ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ａ ｐｉｌｏｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｃｈｅｍｅ”）に変換してＬＬＳを得ることにより、ＬＬＳが決定されうる。

【0065】

１つの実施形態において、本発明は、第１ワクチン、第２ワクチンおよびリーフレットを含むパーツ・キットに関するものであり、ここで、第１ワクチンは、本発明によるワクチンであり、第２ワクチンは、弱毒化生ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を含む。リーフレットは使用説明を含む。該パーツ・キットは、針および／またはシリンジを更に含みうる。

【0066】

生弱毒化病原体は、低下した病原性（ビルレンス）を有する病原体の生存可能で複製可能な形態である。弱毒化のプロセスは感染性病原体を使用し、それを、例えば、細胞系による病原体の複数回の継代により、または病原体を遺伝子的に修飾することにより無害または低病原性となるように変化させる。

【0067】

１つの実施形態において、本発明は、第１ワクチンと第２ワクチンとの混合物を含む混合ワクチンに関するものであり、ここで、第１ワクチンは、本発明によるワクチンであり、第２ワクチンは、弱毒化生ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を含む。

【0068】

第１ワクチンおよび第２ワクチンは、同時に投与される代わりに、併用投与のための随伴非混合ワクチンとして供与されることも可能である。したがって、ワクチンは、投与前に混合されずに、１時間以内、好ましくは３０分以内、２５分以内、２０分以内、１５分以内、１０分以内、９分以内、８分以内、７分以内、６分以内、５分以内、４分以内、３分以内、２分以内または１分以内に別々にブタに投与される。

【0069】

しかし、各ブタに投与される注射の量を最小限に抑え効率を更に高めるためには、２つのワクチンの組合せが一般に有利である。しかし、２以上のワクチンを混合する場合、ワクチンは、異なる賦形剤を要し、したがって、一方のワクチンの不安定性、活性低下および／または分解を招きうるので、安定性の問題がよく生じる。驚くべきことに、生弱毒化ＰＲＲＳＶの安定性は、本発明のナノ粒子の存在下で増強した。

【0070】

１つの実施形態において、本発明による混合ワクチンは、Ｍｈｙｏ感染の予防およびＰＲＲＳＶ感染の予防のために使用される。

【0071】

１つの実施形態において、本発明は、本発明によるワクチンまたは本発明による混合ワクチンを含むバイアルに関する。バイアルはＰＥＴバイアルであることが好ましい。バイアルは、２ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２００ｍｌまたは５００ｍｌのワクチンまたは混合ワクチンを含有することが好ましい。

【0072】

次に、以下の実施例を用いて、本発明を更に詳細に説明することとする。

【0073】

実施例
実施例１：肺病変スコア
チャレンジ材料：
１ｍｌのアリコート中で凍結され－５０℃未満で貯蔵されたバクテリン マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株９８を使用した。

【0074】

チャレンジ材料の調製：
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株９８を、ＦＲＩＩＳ＋２０％ ＳＰＦ血清中で２０００倍希釈した。この培養物を３７℃（５０ＲＰＭ）で４～５日間インキュベートした。４日間および５日間のインキュベーションの後、この培養物のサンプルをチャレンジのために採取した。４．５ｍｌのＦＲＩＩＳブロス＋２０％ ＳＰＦ（特定病原体非含有）血清に０．５ｍｌの培養物を接種し、混合し、０．５ｍｌの培養物を１つのチューブから次のチューブに移し、ついで１０^－１０ＣＣＵ（変色単位）のチューブを３７℃で３週間インキュベートすることにより、チャレンジの前および後で生存数の計数を行った。

【0075】

チャレンジ方法：
３週（±３日）齢の７２頭のＳＰＦブタを各群１２頭の６つの群に割り当てた。１群当たり４頭の動物を群１～４に加え、１群当たり合計１６頭の動物とした。カテーテルを使用して、２日間連続して、全ての動物を１０ｍｌの純粋培養物で気管内チャレンジした。

【0076】

投与量および投与：
ワクチンは、３７ｎｍのＤ_５０値および＋３７ｍＶのゼータ電位を有する、ジパルミトイル－ホスファチジルグリセロールがローディングされた多孔性カチオン性マルトデキストリンナノ粒子を、用量０．４ｍｌ当たり粒子２．９ｍｇの量で含有していた。試験ワクチンを、ＭｈｙｏバクテリンおよびＭｈｙｏライセートを使用して製造し、後者のタイプの抗原は、先行技術におけるナノ粒子と共に使用される場合、典型的に、より有効である。バクテリンワクチンを、粒子とバクテリン製剤（ＢＥＩ不活化Ｍｈｙｏ細菌）とを１：１（粒子：Ｍｈｙｏ抗原）の重量比で混合することにより製造し、該混合物を２４時間静置して沈殿させて、粒子と抗原との結合を達成した。ライセートワクチンは、細胞溶解のためにバクテリンが超音波処理に付されたという点で異なり、それに応じて製造した。Ｍｈｙｏ抗原に結合した後の粒子のゼータ電位は、バクテリンワクチンに関しては＋１４．９ｍＶ、ライセートワクチンに関しては＋１５．６ｍＶであった。

【0077】

３週齢および５週齢で、表１に従い、局所的（鼻腔内）に、または頸部において全身的［ＩＤＡＬ（登録商標）ワクチン接種器を使用し、ワクチンを、一部を真皮に、そして一部を筋肉組織に沈着させる］に、子ブタにワクチン接種を行った。陽性対照として、市販品Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍｈｙｏ ＩＤ ＯＮＣＥを製造業者の説明に従い使用した。

【0078】

新規ワクチンは、望ましくない部位効果を誘発せず、安全であると見なされた。肺炎による肺病変スコアを決定するために、チャレンジ後の第２１日にブタを安楽死させた。剖検中に肺病変の比率を決定し、スコアをグッドウィンおよびホイットルストーンのスコア（前記）に変換して肺病変スコアを得た。結果を表１に示す。

【表1】

【0079】

表１から推定されうるとおり、Ｍｈｙｏバクテリンとナノ粒子とを含むワクチンの全身投与においては、局所適用と比較して、肺病変スコアが有意に低減するする。また、バクテリンワクチンは、Ｍｈｙｏライセートよりも実質的に有効であった。これは、抗原としてライセートを使用する局所ワクチン接種に本ナノ粒子が典型的に適用される技術と比較して驚くべきことである。

【0080】

実施例２：単回投与と２回投与との比較
前記実施例１と同様にして、各群２０頭のブタを含む４群のブタに関してＬＬＳを決定した。

【0081】

群１（ワンショットＩＤ）においては、ブタに第４週に０．２ｍＬのワクチンの単回投与（ワンショット）ワクチン接種で皮内ワクチン接種した。群２（ツーショットＩＤ）においては、ブタに第１週に０．２ｍＬの初回ワクチン接種を皮内に行い、ついで第４週に０．２ｍＬの追加ワクチン接種を行った。群３においては、ブタに第４週に０．４ｍＬのワクチンの単回投与（ワンショット）で皮内ワクチン接種した。群４においては、ワクチン接種を行わなかった。群１～３におけるワクチンは同一であり、ナノ粒子およびＭｈｙｏバクテリン（重量比１：１）を含有し、ここで、０．２ｍｌの各用量は、２．１８ｍｇのナノ粒子を含有していた。製剤化された粒子のゼータ電位は＋１５．２ｍＶであった。

【0082】

結果を以下の表２に示す。

【表2】

【0083】

認められうるとおり、非常に驚くべきことに、単回投与は、２回投与と比較してＬＬＳの増加をもたらさない。更に強調すれば、ＬＬＳは更に減少したようであった。このことは、本ワクチンを使用すれば、Ｍｙｏに対する有効な防御を得るために単回ワクチン接種が用いられうることを意味する。

【0084】

実施例３：ＰＲＲＳＶワクチンの安定性
ナノ粒子の存在下および非存在下の弱毒生ＰＲＲＳＶワクチンの安定性を測定するために、ナノ粒子の存在下および非存在下でＰＲＲＳＶを一般的なワクチン希釈剤Ｄｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商標）（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）中で混合した。ＭＡＲＣ細胞上のＰＲＲＳＶのＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）を、０、４５、９０、および１５０分の時点で測定した。ＴＣＩＤ５０はＰＲＲＳＶ抗原の有効性に対応する。この実験のために、各場合において、１．６７ｍｇのナノ粒子（実施例１を参照された）をエッペンドルフチューブに加え、チューブ当たり約７．２^＊１０^∧５ ＴＣＩＤ５０が達成されるように、そのチューブに希釈剤中の生ＰＲＲＳウイルスの或る用量を加えた。以下の表３およびそれぞれの測定時間間隔におけるＴＣＩＤ５０値（^＊１０^∧５）から認められうるとおり、ＰＲＲＳＶの安定性は、ナノ粒子の存在下では、ナノ粒子の非存在下の製剤と比較して増強した。

【表3】

【0085】

表３に示された結果から認められうるとおり、希釈剤中のＰＲＲＳＶの安定性は、ナノ粒子の存在下で驚くほどに増加し、このことは、混合ワクチンの有効性がＰＲＲＳＶ成分に関しても増強することを意味する。

【国際調査報告】