特表 2023-523600 ヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を標的とする単一可変ドメイン抗体およびその誘導体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-06

(54)【発明の名称】ヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を標的とする単一可変ドメイン抗体およびその誘導体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230530BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230530BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230530BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230530BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230530BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230530BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230530BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230530BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20230530BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20230530BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230530BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230530BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230530BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230530BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20230530BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20230530BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230530BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/28

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C12N15/63 Z

A61K9/08

A61K9/14

A61P35/00

A61K39/395 T

A61K39/395 E

A61P17/00

A61P11/00

A61P13/12

A61P1/00

A61K48/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022564470

(86)(22)【出願日】2021-04-21

(85)【翻訳文提出日】2022-12-21

(86)【国際出願番号】 CN2021088674

(87)【国際公開番号】W WO2021213435

(87)【国際公開日】2021-10-28

(31)【優先権主張番号】202010324761.8

(32)【優先日】2020-04-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519187241

【氏名又は名称】マブウェル （シャンハイ） バイオサイエンス カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】ワン、ショアン

(72)【発明者】

【氏名】ツォン、ターティー

(72)【発明者】

【氏名】チアオ、シャーシャー

(72)【発明者】

【氏名】チャン、チャン

(72)【発明者】

【氏名】ワン、ロンチュアン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA26X

4B065AA98X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA11

4C076AA29

4C076BB11

4C076CC27

4C076FF11

4C084AA13

4C084MA16

4C084MA43

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA591

4C084ZA592

4C084ZA661

4C084ZA662

4C084ZA811

4C084ZA812

4C084ZA891

4C084ZA892

4C084ZB261

4C084ZB262

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB36

4C085BB42

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA42

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

ヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）およびその誘導体を標的とする単一可変ドメイン抗体が提供される。ヒトＰＤ－Ｌ１で免疫したラクダからＰＢＭＣを抽出し、ファージ表面ディスプレーＶＨＨ抗体ライブラリーを構築し、前記ＶＨＨ抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的な単一可変ドメイン抗体２－２Ｆ２が同定および取得され、これをもとにキメラ抗体ｃｈＦ２およびヒト化改変抗体ｈｚＦ２変異体が作製される。ｈｚＦ２変異体は、元の単一可変ドメイン抗体２－２Ｆ２の親和性と同等またはさらにはそれより優れた親和性を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏではＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合をブロックし、担癌マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ試験では腫瘍成長を阻害することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単一可変ドメイン抗体の可変領域のＣＤＲ１～ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４３～４５として示されることを特徴とする、抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体。

【請求項2】

単一可変ドメイン抗体が定常領域を有さないかまたは１～３の重鎖定常領域を有する、請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体。

【請求項3】

単一可変ドメイン抗体の可変領域のアミノ酸配列が配列番号１として示される、請求項１または２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体。

【請求項4】

単一可変ドメイン抗体が請求項１～３のいずれか一項に記載の単一可変ドメイン抗体の可変領域およびヒト重鎖定常領域を含んでなる、ヒト－ラクダキメラ単一可変ドメイン抗体である、抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体。

【請求項5】

キメラ単一可変ドメイン抗体が配列番号３として示されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体。

【請求項6】

単一可変ドメイン抗体がヒト化され、単一可変ドメイン抗体の可変領域が、請求項１～３のいずれか一項に記載の単一可変ドメインの可変領域をヒト化することによって得られる、抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体。

【請求項7】

単一可変ドメイン抗体の可変領域が配列番号７として示されるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体。

【請求項8】

単一可変ドメイン抗体が配列番号９として示されるアミノ酸配列を有する、請求項６または７に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体。

【請求項9】

単一可変ドメイン抗体が、請求項６～８のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体の可変領域のＣＤＲを１、２、３または４個のアミノ酸残基で変異させることにより作出される変異型抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化単一可変ドメイン抗体であり、前記変異型抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化単一可変ドメイン抗体はＰＤ－Ｌ１への特異的結合能を少なくとも部分的に保持する、抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体。

【請求項10】

単一可変ドメイン抗体の可変領域が配列番号１１～２６からなる群から選択される、請求項９に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体からなる群から選択される１以上の抗ＰＤ－Ｌ１を含んでなる組成物。

【請求項12】

薬学上許容可能な担体をさらに含んでなり、医薬組成物として使用され、好ましくは、前記医薬組成物は液体製剤、注射製剤、または粉末注射製剤の形態である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

異常増殖性疾患の治療のための薬剤の製造のための抗体またはそのフラグメントの使用であって、前記抗体が請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体からなる群から選択される、使用。

【請求項14】

異常増殖性疾患が腫瘍、好ましくは、黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌などを含んでなる、請求項１３に記載の使用。

【請求項15】

多重特異性抗体または標的化抗体－薬物の製造のための抗体またはそのフラグメントの使用であって、前記抗体が請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体からなる群から選択される、使用。

【請求項16】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項17】

請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。

【請求項18】

請求項１６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１７に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。

【請求項19】

抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体を作製するための方法であって、
（１）請求項１８に記載の宿主細胞を、組換え抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体を発現するために適した条件下で培養する工程；および
（２）細胞培養物から抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体を単離および精製する工程
を含んでなる、方法。

【請求項20】

異常増殖性疾患を予防または治療するための方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体、請求項１１または１２に記載の組成物、請求項１５に記載の多重特異性抗体または標的化抗体－薬物を投与することを特徴とする、方法。

【請求項21】

対象において異常増殖性疾患の発症および進行を診断または評価するための方法であって、被検出対象由来のサンプルを請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体、請求項１１または１２に記載の組成物、請求項１５に記載の多重特異性抗体または標的化抗体－薬物と接触させることを特徴とする、方法。

【請求項22】

異常増殖性疾患に罹患している対象に対するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストの治療効果を予測または評価するための方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体、請求項１１または１２に記載の組成物、請求項１５に記載の多重特異性抗体または標的化抗体－薬物からなる群から選択される薬剤を使用することにより、前記対象のＰＤ－Ｌ１の発現状態を検出することを特徴とする、方法。

【請求項23】

異常増殖性疾患が腫瘍、特に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路に関連する腫瘍を含んでなる、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記腫瘍が黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌などを含んでなる、請求項２４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０２０年４月２２日に出願された中国発明特許出願第ＣＮ２０２０１０３２４７６１．８号の優先権を主張するものであり、その全内容が参照により本願の一部とされる。

【0002】

技術分野
本発明は、抗体薬の分野に関する。特に、本発明は、ヒトプログラム細胞死リガンド１(human programmed death ligand 1)（ＰＤ－Ｌ１）を標的とする単一可変ドメイン抗体、それに由来するタンパク質および薬剤を調製するためのその使用、特に腫瘍などのＰＤ－Ｌ１関連疾患の治療および／または予防、または診断のための使用に関する。

【背景技術】

【0003】

背景技術
ＰＤ－１およびそのリガンドＰＤ－Ｌ１は、腫瘍免疫の重要な標的である。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１は、１対の免疫抑制分子であり、自己免疫応答の過剰反応を防ぐための免疫系の重要な成分である。ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１経路の活性化は、腫瘍特異的Ｔ細胞アポトーシスを誘導する腫瘍免疫応答を阻害する機能を有し、これは腫瘍の発生に密接に関連する。ＰＤ－１（ＣＤ２７９）は、主として活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢ細胞およびその他の免疫細胞で発現される免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるＩ型膜貫通タンパク質である。そのリガンドＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１、ＣＤ２７４としても知られる）はＢ７ファミリーのメンバーに属し、腫瘍浸潤免疫細胞（ＴＩＣ）ならびに悪性黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌などの多様な悪性腫瘍細胞で発現が高い。腫瘍の治療におけるＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１経路のブロックのためのモノクローナル抗体の使用は、良好な臨床的有効性および安全性が示されている。多くの抗体薬が承認を受けて上市され、適応症には、黒色腫、非小細胞肺癌、進行性腎細胞癌などの多くの悪性腫瘍が含まれる。また、多くの進行中の臨床試験で、さらに新しい適応の開発が試みられている。

【0004】

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、様々な悪性腫瘍の臨床治療において良好な治療効果を示しているが、投与量が多い、および全奏功率が低いなどの問題がある。その主な原因として、ＰＤ－Ｌ１の発現が低い、および腫瘍微小環境におけるＴ細胞の枯渇等が挙げられる。従って、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１標的をさらに深く開発し、より良い臨床効果を有する治療薬を開発することがなお必要である。標的に対する薬剤開発に関しては、以下のような方法で、臨床患者の利益を高めることができる。（１）より親和性が高く、より活性の高い抗体分子をさらに開発すること、（２）標的に基づいて二重特異性抗体または類似体を提供すること、（３）予備的研究により、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍患者のＰＤ－Ｌ１阻害剤への応答率はＰＤ－Ｌ１陰性腫瘍患者の応答率よりもはるかに高いことが示されており、治療費および重篤な副作用の可能性を低減するために、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍患者の予測または患者の事前スクリーニングに有効なバイオマーカーが必要である、（４）応答率を向上させるために、他の腫瘍免疫薬との併用、標的薬との併用、化学療法または放射線療法など、薬物の併用が腫瘍免疫療法のトレンドとなっている。

【0005】

単一可変ドメイン抗体は、現在最も小さい抗体分子であり、その分子量は従来の抗体の１／１０である。この抗体は、ベルギーの科学者Ｈａｍｅｒｓ，Ｒがラクダの血中で初めて発見した。この抗体は、操作された抗体製品の中でも最も注目される種である。単一可変ドメイン抗体は、モノクローナル抗体の抗原反応性を備えていることに加え、低分子量、強い安定性、良好な溶解度、発現の容易さ、強い標的化活性、およびヒト化の容易さなどのユニークな機能特性も有している。特に、単一可変ドメイン抗体は、二重特異性／多重特異性治療抗体の開発またはＣａｒ－Ｔ／Ｍ／ＮＫなどの療法の開発に適している。現在、単一可変ドメイン抗体および／または単一可変ドメイン抗体に基づく二重特異性／多重特異性抗体の開発が研究開発のホットスポットとなっている。国際的には、Ａｂｌｙｎｘが単一可変ドメイン抗体の分野で大規模なレイアウトを行っている。同社が開発したカプラシズマブは、後天性血栓性血小板減少性紫斑病（ａＴＴＰ）という希少疾患の治療薬として、２０１９年２月にＦＤＡが承認したものである。後天性血栓性血小板減少性紫斑病は、細い血管で血液が過剰に凝固することが特徴で、カプラシズマブは同疾患で初めて承認された薬剤である。また、カプラシズマブはフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）を標的とする最初の薬剤であり、ｖＷＦは、血液凝固カスケードにおける重要なタンパク質である。同時に、カプラシズマブは、ＦＤＡが承認した最初の単一可変ドメイン抗体でもある。カプラシズマブの承認は、単一可変ドメイン抗体薬の分野が、正式にヒト疾患治療のステージに入るための画期的な出来事である。また、中国には、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｇｕｏｃｈｕａｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｐｒｅｋｉｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｂｏｓｈｅｎｇｊｉ （Ａｎｋｅ） Ｃｏｍｐａｎｙ、およびＳｕｚｈｏｕ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｊｅｒｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙなどをはじめ、単一可変ドメイン抗体の開発を活発に行う企業が存在する。中でも、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｊｅｒｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙは、国内で初めて単一可変ドメイン抗体の分野に参入している。Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｊｅｒｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙが開発したＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体（ＫＮ０３５、皮下投与）は、２０１６年にＣＦＤＡおよびＦＤＡから臨床試験開始の承認を受け、２０１７年６月末に日本医薬品医療機器総合機構（ＰＭＤＡ）から臨床承認を得た。ＫＮ０３５は、世界初のＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体である。

【0006】

現在、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、様々な悪性腫瘍の臨床治療において良好な治療効果を示しているが、投与量が多い、および全奏功率が低いなどの問題点がある。その主な原因として、ＰＤ－Ｌ１の発現の低さおよび腫瘍微小環境におけるＴ細胞の枯渇などが挙げられる。そのため、新たな抗ＰＤ－Ｌ１抗体薬の開発が必要とされている。候補分子の開発に関しては、以下のような方法で、より良好な治療効果を備えた抗体分子を得ることができる：（１）より親和性が高く、より活性の高い抗体分子をさらに開発すること、（２）標的に基づいて二重特異性抗体または類似体を提供すること、（３）治療費および重篤副作用の可能性を低減するための、より有効な診断用抗体の開発によるＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍患者の予測またはＰＤ－Ｌ１発現の検出による患者の事前スクリーニング。ラクダ由来単一可変ドメイン抗体は、そのユニークな特性から、上記の課題を効率的に解決するために使用されることが期待される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

発明の概要
上記の問題を解決するために、本開示は、ヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を標的とする単一可変ドメイン抗体、およびその誘導体を提供する。ファージ表面ディスプレーＶＨＨ抗体ライブラリーは、ヒトＰＤ－Ｌ１で免疫されたラクダからＰＢＭＣを抽出することにより構築され、抗ヒトＰＤ－Ｌ１特異的単一可変ドメイン抗体２－２Ｆ２は、スクリーニングおよび同定により得られる。これをもとに、キメラ抗体ｃｈＦ２およびヒト化改変抗体ｈｚＦ２変異体が作製される。ｈｚＦ２変異体は、元の単一可変ドメイン抗体２－２Ｆ２の親和性と同等またはさらにはより優れた親和性を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏではＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合をブロックし、担癌マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ試験では腫瘍成長を阻害することができる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

特に、第１の側面において、本発明は、単一可変ドメイン抗体の可変領域のＣＤＲ１－ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４３～４５として示されることを特徴とする抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体を提供する。

【0009】

さらに、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体は、単一可変ドメイン抗体が定常領域を有さないか、または１～３の重鎖定常領域を有することを特徴とする。

【0010】

さらに、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体は、単一可変ドメイン抗体の可変領域のアミノ酸配列が配列番号１として示されることを特徴とする。

【0011】

第２の側面において、本発明は、単一可変ドメイン抗体が本発明の第１の側面に記載の単一可変ドメイン抗体の可変領域とヒト重鎖定常領域を含んでなるヒト－ラクダキメラ単一可変ドメイン抗体であることを特徴とする抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体を提供する。

【0012】

さらに、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体は、キメラ単一可変ドメイン抗体が配列番号３として示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする。

【0013】

第３の側面において、本発明は、単一可変ドメイン抗体がヒト化され、単一可変ドメイン抗体の可変領域が、本発明の第１の側面に記載の単一可変ドメインの可変領域をヒト化することにより得られることを特徴とする抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体を提供する。

【0014】

さらに、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体は、単一可変ドメイン抗体の可変領域が配列番号７として示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする。

【0015】

さらに、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体は、単一可変ドメイン抗体が配列番号９として示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする。

【0016】

第４の側面において、本発明は、単一可変ドメイン抗体が変異型抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化単一可変ドメイン抗体であり、これは本発明の第３の側面に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体の可変領域のＣＤＲを１、２、３または４つのアミノ酸残基で変異させることによって作製され、変異型抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化単一可変ドメイン抗体は、ＰＤ－Ｌ１に対する特異的結合能を少なくとも部分的に保持することを特徴とする抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体を提供する。

【0017】

さらに、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体は、その可変領域が配列番号１１～２６からなる群から選択されることを特徴とする。

【0018】

第５の側面において、本発明は、本発明の第１～第４の側面のいずれかに記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体からなる群から選択される１以上の抗ＰＤ－Ｌ１を含んでなる組成物を提供する。

【0019】

さらに、本発明の組成物は、薬学上許容可能な担体をさらに含んでなり、医薬組成物として使用されることを特徴とし、好ましくは、医薬組成物は液体製剤、注射製剤、または粉末注射製剤の形態である。

【0020】

第６の側面において、本発明は、異常増殖性疾患の治療のための薬剤の製造のための抗体またはそのフラグメントの使用であって、抗体が本発明の第１～第４の側面のいずれかに記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体からなる群から選択されることを特徴とする使用を提供する。

【0021】

さらに、本発明の使用は、異常増殖性疾患が腫瘍、好ましくは、黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌などを含んでなることを特徴とする。

【0022】

第７の側面において、本発明は、多重特異性抗体または標的化抗体－薬物の製造のための抗体またはそのフラグメントの使用であって、の抗体が本発明の第１～第４の側面のいずれかに記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体からなる群から選択されることを特徴とする使用を提供する。

【0023】

第８の側面において、本発明は、本発明の第１～第４の側面のいずれかに記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0024】

第９の側面において、本発明は、本発明の第８の側面に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。

【0025】

第１０の側面において、本発明は、本発明の第７の側面に記載のポリヌクレオチドまたは本発明の第８の側面に記載のベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。

【0026】

第１１の側面において、本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体を作製するための方法であって、
（１）本発明の第１０の側面に記載の主細胞を、組換え抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体を発現するために適した条件下で培養する工程；および
（２）細胞培養物から抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体を単離および精製する工程
を含んでなる方法を提供する。

【0027】

第１２の側面において、本発明は、異常増殖性疾患を予防または治療するための方法であって、それを必要とする対象に有効量の、以上のいずれか１つに記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体、以上のいずれか１つに記載の組成物、前述の第６の側面に記載の使用における多重特異性抗体または標的化抗体－薬物を投与することを特徴とする方法を提供する。

【0028】

さらに、本発明の方法は、異常増殖性疾患が腫瘍、特に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路に関連する腫瘍を含んでなることを特徴とする。

【0029】

さらに、本発明の方法は、腫瘍が黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌などを含んでなることを特徴とする。

【0030】

第１３の側面において、本発明は、対象において異常増殖性疾患の発症および進行を診断または評価するための方法であって、被検出対象由来のサンプルを上記のいずれか１つに記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体、上記のいずれか１つに記載の組成物、前述の第６の側面に記載の使用における多重特異性抗体または標的化抗体－薬物と接触させることを特徴とする方法を提供する。

【0031】

さらに、本発明の方法は、異常増殖性疾患が腫瘍、特に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路に関連する腫瘍を含んでなることを特徴とする。

【0032】

さらに、本発明の方法は、腫瘍が黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌などを含んでなることを特徴とする。

【0033】

第１４の側面において、本発明は、異常増殖性疾患に罹患している対象に対するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストの治療効果を予測または評価するための方法であって、上記のいずれか１つに記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体、上記のいずれか１つに記載の組成物、前述の第６の側面に記載の使用における多重特異性抗体または標的化抗体－薬物からなる群から選択される薬剤を使用することにより、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現状態を検出することを特徴とする方法を提供する。

【0034】

さらに、本発明の方法は、異常増殖性疾患が腫瘍、特に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路に関連する腫瘍を含んでなることを特徴とする。

【0035】

さらに、本発明の方法は、腫瘍が黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌などを含んでなることを特徴とする。

【0036】

特に断りのない限り、本明細書において重鎖抗体を指すために使用されるか従来の４鎖抗体を指すために使用されるかにかかわらず、「免疫グロブリン配列」という用語は、フルサイズの抗体、その個々の鎖、およびその総ての部分、ドメインまたはフラグメント（限定するものではないが、それぞれＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインなどの抗原結合ドメインまたはフラグメントが含まれる）を含む一般用語として使用される。さらに、「配列」という用語は、本明細書で使用される場合（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」などの用語で使用）は、文脈がより制限的な解釈を必要としない限り、関連するアミノ酸配列およびそれをコードする核酸またはヌクレオチド配列の両方を含んでなると一般的に理解されるべきである。

【0037】

免疫グロブリン単一可変ドメインは、ポリペプチドの「結合単位」、「結合ドメイン」または「構築単位」（これらの用語は互換的に使用することができる）として働くことができ、結合単位（すなわち、同じ標的上の同じもしくは異なるエピトープに対するおよび／または１以上の異なる標的に対する）として１以上の付加的な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるポリペプチドを作製するために使用することができる。

【0038】

「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ＩＳＶＤ」）という用語は、「単一可変ドメイン」（「ＳＶＤ」）と互換的に使用することができ、抗原結合部位が単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、単一の免疫グロブリンドメインからなる分子を定義する。このために免疫グロブリン単一可変ドメインは、２つのドメイン、特に「従来の」免疫グロブリンの２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する、「従来の」免疫グロブリンまたはそのフラグメントとは異なっている。一般に、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して、抗原結合部位を形成する。この場合、ＶＨとＶＬの両方から相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に好都合である、すなわち、合計６つのＣＤＲが抗原結合部位の形成に関与することになる。

【0039】

これに対して、免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインにより形成される。よって、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、３つ以下のＣＤＲにより形成される。

【0040】

よって、相互作用して抗原結合部位を形成するために少なくとも２つの可変ドメインを必要とする従来の免疫グロブリンまたはそのフラグメントには、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」および「単一可変ドメイン」は含まれない。しかしながら、これらの用語は、抗原結合部位が単一可変ドメインにより形成される従来の免疫グロブリンのフラグメントには含まれる。

【0041】

一般に、単一可変ドメインは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１～ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）から実質的になるアミノ酸配列である。このような単一可変ドメインおよびフラグメントは、免疫グロブリンフォールドを含んでなるか、または適した条件下で免疫グロブリンフォールドを形成し得るものが最も好ましい。よって、単一可変ドメインは、例えば、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）もしくはその好適なフラグメント；または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列もしくはＶＨＨ配列、例えば、ＶＨ／ＶＬ相互作用を必要とする、従って、別の可変ドメインと相互作用して機能的抗原結合ドメインを形成する例えば従来の抗体およびｓｃＦｖフラグメントに見られる可変ドメインがそうである）またはその好適なフラグメントを含んでなり得るが、ただし、それらが単一の抗原結合単位（すなわち、単一の抗原結合単位が、機能的抗原結合単位を形成するために別の可変ドメインと相互作用する必要のないように、単一の可変ドメインから本質的になる機能的抗原結合単位）を形成できることが条件である。

【0042】

本発明の１つの実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）であり；より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。

【0043】

例えば、単一可変ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメイン（または免疫グロブリン単一可変ドメインとして使用するのに適したアミノ酸）は、（単一）ドメイン抗体（または（単一）ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸）、「ｄＡｂ」またはｄＡｂ（またはｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸）またはナノボディー（本明細書で定義される通り、限定するものではないがＶＨＨを含む）；その他の単一可変ドメイン、またはそれらのいずれかの任意の好適なフラグメントであり得る。

【0044】

（単一）ドメイン抗体の一般的な説明としては、本明細書に引用される従来技術およびＥＰ０３６８６８４も参照のこと。「ｄＡｂ」という用語については、例えば、Ward et al., 1989 (Nature 341: 544-546)、Holt et al., 2003 (Trends Biotechnol., 21: 484-490)；および例えば、ＷＯ０４／０６８８２０、ＷＯ０６／０３０２２０、ＷＯ０６／００３３８８、ＷＯ０６／０５９１０８、ＷＯ０７／０４９０１７、ＷＯ０７／０８５８１５、およびＤｏｍａｎｔｉｓ Ｌｔｄのその他の公開特許出願を参照のこと。単一可変ドメインはある種のサメに由来し得るが（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば、ＷＯ０５／１８６２９参照）、哺乳類起源ではないので本発明の文脈ではあまり好ましくないことにも留意されたい。

【0045】

特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）（本明細書に定義される通り）またはその好適なフラグメント［注：ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）、ＮＡＮＯＢＯＤＩＥＳ（登録商標）、ＮＡＮＯＣＫＯＮＥ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の登録商標である］。ナノボディーの一般的な説明については、以下のさらなる説明ならびに本明細書に引用されている従来技術、例えば、ＷＯ０８／０２００７９（第１６頁）などの記載を参照されたい。

【0046】

ＶＨＨおよびナノボディーのさらなる説明については、Muyldermans 2001 (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302)による総説ならびに一般的背景技術として述べられている以下の特許出願：ＶｒｉｊｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ ＢｒｕｓｓｅｌのＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９、およびＷＯ９６／３４１０３；ＵｎｉｌｅｖｅｒのＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ０／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ１１３４２３１、およびＷＯ０２／４８１９３；Ｖｌａａｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔｖｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＶＩＢ）のＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６、およびＷＯ０３／０５５５２７；Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ Ｎ．Ｖ．およびＥｂｏｌｉｎｘ，Ｉｎｃ．のＷＯ０３／０５０５３１；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ ＣａｎａｄａのＷＯ０１／９０１９０；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓのＷＯ０３／０２５０２０；ならびにＥｂｏｌｉｎｘ，Ｉｎｃ．のＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７、およびＷＯ０６／１２２８２５；ならびにＥｂｏｌｉｎｘ，Ｉｎｃ．のその他の公開特許出願を参照されたい。また、これらの出願に述べられているその他の従来技術、特に、その一覧および参照文献が参照により本明細書の一部とされる国際出願ＷＯ０６／０４０１５３の第４１～４３頁も参照のこと。これらの参照文献に記載されるように、ナノボディー（特に、ＶＨＨ配列およびヒト化ナノボディーの一部）は、とりわけ、１以上のフレームワーク配列における１以上の「マーカー残基」の存在により特徴付けることができる。ヒト化および／またはラクダ化ナノボディー、ならびに他のその改変、一部もしくはフラグメント、誘導体、または「ナノボディー融合物」、多価構築物（いくつかの限定されない例はリンカー配列を含んでなる）およびナノボディーの半減期を延長するための異なる改変を含むナノボディーならびにそれらの製造の説明は、例えば、ＷＯ０８／１０１９８５およびＷＯ０８／１４２１６４に見出すことができる。

【0047】

よって、本発明の意味において、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「単一可変ドメイン」は、非ヒト供給源に由来するポリペプチド、好ましくは、ラクダ科、好ましくは、ラクダ科重鎖抗体を含んでなる。上記のように、それらはヒト化することができる。さらに、この用語は、例えばDavies and Riechmann 1994 (FEBS 339: 285-290), 1995 (Biotechnol. 13: 475- 479), 1996 (Prot. Eng. 9:531-537)、およびRiechmann and Muyldermans 1999 (J. Immunol. Methods 231: 25-38)に記載の「ラクダ化」されたものなど、マウスまたはヒトなどの非ラクダ科供給源に由来するポリペプチドを含んでなる。

【0048】

「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒトおよびラクダ科免疫グロブリン配列を含む異なる起源の免疫グロブリン配列を含んでなる。この用語はまた、完全ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリン配列を含んでなる。例えば、この用語は、ラクダ科免疫グロブリン配列およびヒト化ラクダ科免疫グロブリン配列、またはラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば、Ward et al., 1989（例えば、ＷＯ９４／０４６７８およびDavies and Riechmann 1994, 1995および1996参照)に記載されているラクダ化ｄＡｂおよびラクダ化ＶＨを含んでなる。

【0049】

同様に、このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、任意の好適な供給源から任意の好適な様式で誘導されてよく、例えば、天然に存在するＶＨＨ配列（すなわち、好適なラクダ科の種に由来）または合成もしくは半合成アミノ酸配列であり得、限定されるものではないが、部分的または完全「ヒト化」ＶＨＨ、「ラクダ化」免疫グロブリン配列（特に、ラクダ化ＶＨ）、ならびに以下の技術：例えば、親和性成熟（例えば、合成、ランダムまたは天然免疫グロブリン配列、例えば、ＶＨＨ配列から出発する）、ＣＤＲグラフティング、ベニヤリング、異なる免疫グロブリン配列に由来するフラグメントの組合せ、オーバーラッピングプライマーを用いたＰＣＲアセンブリ、および免疫グロブリン配列を操作するために当業者に公知の類似の技術によって得られるナノボディーおよび／もしくは ＶＨＨ；または以上のいずれかの任意の好適な組合せが含まれる。

【0050】

免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列および構造は、限定されるものではないが、当技術分野でおよび本明細書でそれぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と呼ばれる４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」からなり、それぞれ当技術分野で「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」；および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と呼ばれる３つの相補性決定領域または「ＣＤＲ」が挿入されていると考えることができる。

【0051】

免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸残基総数は、１１０～１２０、好ましくは１１２～１１５の範囲、最も好ましくは１１３であり得る。

【0052】

ＷＯ０８／０２００７９（参照により本明細書の一部とされる）の段落ｑ）第５８および５９頁にさらに記載されているように、免疫グロブリン単一可変ドメイン中のアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔら（「Ｋａｂａｔナンバリング」("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)により示されるＶＨドメインの一般ナンバリングに従う。Riechmann and Muyldermans 2000 (J. Immunol. Methods 240: 185-195;例えばこの刊行物の図２参照)の文献に開示されているようなアミノ酸残基のナンバリングは、ラクダ科動物のＶＨＨドメインに適用され、それに対応して、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ１は、１～３０番のアミノ酸残基を含んでなり、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１は、３１～３５番のアミノ酸残基を含んでなり、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ２は、３６～４９番のアミノ酸残基を含んでなり、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ２は、５０～６５番のアミノ酸残基を含んでなり、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ３は、６６～９４番のアミノ酸残基を含んでなり、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ３は、９５～１０２番のアミノ酸残基を含んでなり、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ４は、１０３～１１３番のアミノ酸残基を含んでなる。

【0053】

本明細書およびＷＯ０８／０２００７９、ＷＯ０６／０４０１５３および免疫グロブリン単一可変ドメインに関してそこに引用されている他の参照文献に示されている免疫グロブリン単一可変ドメイン配列の例に基づいて、アミノ酸残基の正確な数はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン中に存在する特定のＣＤＲの長さによって異なることは明らかである。ＣＤＲに関して、当技術分野でよく知られているように、ＶＨまたはＶＨＨフラグメントにおけるＣＤＲを記述するための様々な定義および慣例、例えばＫａｂａｔ定義（これは配列変動に基づいており、最もよく用いられる）およびＣｈｏｔｈｉａ定義（これは構造リング領域の位置に基づいている）が存在する。例えば、ウェブサイト(http://www.bioinf.org.uk/abs/)を参照することができる。本明細書および特許請求の範囲の目的のために、Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲへの言及があっても、Ａｂｍ定義がＫａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の最良の妥協点であると考えられるので、Ａｂｍ定義（ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアに基づく）に従ってＣＤＲを定義することが最も好ましい。ここでもウェブサイトhttp://www.bioinf.org.uk/abs/を参照することができる。

【0054】

１つの実施形態では、ＦＲ４は、Ｃ末端アミノ酸配列ＶＴＶＳＳ（すなわち、１０９、１１０、１１１、１１２および１１３番の残基に相当する）を含んでなる。本発明はまた、１０９、１１０、１１１または１１２番で終わるＩＳＶＤを含んでなる。本発明の１つの側面において、ＦＲ４はＣ末端アミノ酸配列ＶＴＶＳ（１０９～１１２番）で終わるか、ＦＲ４はＣ末端アミノ酸配列ＶＴＶ（１０９～１１１番）で終わるか、ＦＲ４はＣ末端アミノ酸配列ＶＴ（１０９～１１０番）で終わるか、またはＦＲ４はＣ末端アミノ酸Ｖ（１０９番）で終わる。ＩＳＶＤのＦＲ４の最後のアミノ酸残基のＣ末端（最もＣ末端）、例えば、ＦＲ４のＶ１０９、Ｔ１１０、Ｖ１１１、Ｓ１１２またはＳ１１３などの最後のアミノ酸残基のＣ末端にはＣ末端延長が存在してもよく、本発明のシステイン部分は、好ましくは、Ｃ末端延長のＣ末端に存在する、または位置する。１つの実施形態では、ＦＲ４はＣ末端アミノ酸配列ＶＴＶＳＳを含んでなり、Ｃ末端延長はシステインである（例えば、本発明のポリペプチドはＶＴＶＳＳＣで終わる）。１つの実施形態では、ＦＲ４はＣ末端アミノ酸配列ＶＴＶＳを含んでなり、Ｃ末端延長はシステイン（例えば、本発明のポリペプチドはＶＴＶＳＣで終わる）。１つの実施形態では、ＦＲ４はＣ末端アミノ酸配列ＶＴＶを含んでなり、Ｃ末端延長はシステインである（例えば、本発明のポリペプチドはＶＴＶＣで終わる）。１つの実施形態では、ＦＲ４はＣ末端アミノ酸配列ＶＴを含んでなり、Ｃ末端延長はシステインである（例えば、本発明のポリペプチドはＶＴＣで終わる）。１つの実施形態では、ＦＲ４はＣ末端アミノ酸Ｖを含んでなり、Ｃ末端延長はシステインである（例えば、本発明のポリペプチドはＶＣで終わる）。

【0055】

１つの実施形態では、本発明は、ＩＳＶＤが軽鎖可変ドメイン配列（ＶＬ）、重鎖可変ドメイン配列（ＶＨ）、従来の４鎖抗体に由来するまたは重鎖抗体に由来する配列である本明細書に記載されるような二量体に関する。

【0056】

１つの実施形態では、本発明は、ＩＳＶＤがシングルドメイン抗体、ドメイン抗体、シングルドメイン抗体として使用するために好適なアミノ酸配列、ドメイン抗体として使用するために好適なアミノ酸配列、ｄＡｂ、ｄＡｂとして使用するために好適なアミノ酸配列、ナノボディー、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、およびラクダ化ＶＨからなる群から選択される本明細書に記載されるような二量体に関する。好ましくは、ＩＳＶＤは、１００～１４０のアミノ酸残基、例えば、１１０～１３０のアミノ酸残基を含んでなる。

【0057】

従来技術に比べて、本発明の技術的解決策は以下の利点を有する。
第１に、本発明の抗体は、高い親和性を有するヒト化抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体である。ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２は、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質と高い親和性で特異的に結合し、親和性（ＫＤ）は、対照抗体ＫＮ０３５に匹敵する１．１ｎＭである。高い親和性および良好な特異性の基本特性は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路に対するｈｚＦ２の阻害効果の理論的基礎を与え；単一可変ドメイン抗体は、従来のモノクローナル抗体に比べて、より柔軟な適用パターンを有し、二重特異性／多重特異性治療抗体の開発により好適である。

【0058】

第２に、本発明の抗体は、良好な生物活性を有する。ｈｚＦ２は、細胞表面に組換え的に発現されるヒトＰＤ－Ｌ１に効果的に結合し、ＣＨＯ細胞上に組換え的に発現されるヒトＰＤ－Ｌ１（ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１）との結合に関するＥＣ５０は１．０１ｎＭであり；ｈｚＦ２は、組換えヒトＰＤ－Ｌ１のその受容体ＰＤ－１への結合をＩＣ５０ ４．３ｎＭで効果的にブロックすることができ；ｈｚＦ２は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路をブロックすることができ、ＥＣ５０の活性は、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ１－ＮＦＡＴ細胞およびＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞リポーター遺伝子アッセイを用いて検出した場合に５．４５ｎＭであり；ｈｚＦ２は良好なｉｎ ｖｉｖｏ安定性を有し、免疫系ヒト化および黒色腫Ａ３７５皮下異種移植モデルにおける腫瘍成長を効果的に阻害することができる。

【0059】

第３に、本発明は、ｈｚＦ２に基づく複数の変異体を提供する。いくつかの変異体は、特異性、親和性などの性能パラメーターにおいて元の抗体ｈｚＦ２よりも良好な性能を示す。これらの異なる単一可変ドメイン抗体変異体は、ＰＤ－Ｌ１に基づく腫瘍検出、標的化療法、薬物送達などに関してより多くの選択肢を提供し、さらにｈｚＦ２の適用能を豊富にし、拡大する。

【0060】

図面の説明
様々な他の利点および利益は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明を読めば当業者には明らかとなる。これらの図面は単に好ましい実施形態を説明するためのものであり、本発明の限定と見なされるべきではない。また、これらの図面では、同じ成分は同じ参照記号で示される。

【図面の簡単な説明】

【0061】

【図1】図１：ＥＬＩＳＡアッセイによるヒトＰＤ－Ｌ１のその受容体ＰＤ－１への結合に対する単一可変ドメイン抗体の阻害効果

【図2】図２：ｃｈＦ２の細胞表面抗原への結合活性のＦＡＣＳ分析

【図3】図３：組換えＰＤ－Ｌ１対するｃｈＦ２の結合特異性のＥＬＩＳＡ分析

【図4】図４：細胞表面のＰＤ－Ｌ１に対するｃｈＦ２の結合特異性の分析

【図5】図５：ヒトＰＤ－Ｌ１のその受容体ＰＤ－１への結合に対するｈｚＦ２の阻害効果の分析結果

【図6】図６：リポーター遺伝子系を使用することによる抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨ抗体－Ｆｃ融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏブロック活性の評価

【図7】図７：単一用量でのＢａｌｂ／ＣマウスにおけるｈｚＦ２の薬物－時間曲線

【図8】図８：ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１を皮下に同種移植したヒトＰＤ－Ｌ１トランスジェニックマウスを用いたマウス大腸癌モデルにおけるｈｚＦ２の抗腫瘍有効性の試験結果（腫瘍体積）

【図9】図９：ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１を皮下に同種移植したヒトＰＤ－Ｌ１トランスジェニックマウスを用いたマウス大腸癌モデルにおけるｈｚＦ２の抗腫瘍有効性の試験結果（腫瘍重量）

【発明を実施するための形態】

【0062】

実施形態の詳細な説明
以下、本開示の例示的な実施形態を、添付の図面を参照しながら、より詳細に説明する。本開示の例示的な実施形態が図面に示されているが、本開示は様々な形態で達成することができ、本明細書に示される実施形態によって限定されるべきでないことを理解されたい。むしろ、これらの実施形態は、本開示をより深く理解し、本開示の範囲を当業者に十分に伝えるために提供される。

【実施例】

【0063】

実施例１ ファージディスプレーによる免疫ラクダ単一可変ドメイン抗体ライブラリーの構築
抗原を用いてラクダを免疫した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、逆転写のために全ＲＮＡを抽出した。逆転写からの産物を鋳型として用いて、重鎖抗体（ＶＨＨ）の重鎖可変ドメインを増幅した。重鎖可変ドメインをファージディスプレーベクターに連結し、得られたベクターを大腸菌ＴＧ１コンピテント細胞にエレクトロトランスフェクトしてラクダ免疫化ライブラリーを構築した。特に、ラクダを２週間に１回、計４回免疫した。免疫はフロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．：Ｆ５５０６－１０ｍｌ）をアジュバントとする０．８ｍｇ ＰＤ－Ｌ１細胞外領域組換えタンパク質（所内発現および精製、遺伝子配列ＩＤ番号：ＮＰ＿０５４８６２．１、１９ａａ－２３８ａａ）の注射によって行った。各注射は、複数点方式で皮下に行った。各免疫の２週間後、血清を分離するために１ｍＬの血液を採取した。血清中の完全抗体（ＩｇＧ）および重鎖抗体（ＨｃＡｂ）の力価をＥＬＩＳＡにより測定するために免疫原を検出抗原として使用した。血清力価がライブラリー構築の要件を満たす場合、１００ｍＬのラクダ末梢血を採取し、単離キット（Ｔｉａｎｊｉｎ Ｈａｏｙａｎｇ、Ｃａｔ．：ＴＢＤ２０１１ＣＭ）を用いてＰＢＭＣを単離し、ＰＢＭＣの全ＲＮＡを抽出し、逆転写してｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを続いてのＶＨＨフラグメントの増幅のための鋳型として使用した。ＶＨＨ抗体ライブラリー構築のためのプライマーは、関連の文献およびデータベースから取得したラクダ由来ＶＨＨ抗体の遺伝子に基づいて設計し、合成した。抗体可変領域の遺伝子配列は、ＰＣＲによって増幅した。次に、ファージディスプレーベクターおよび増幅した抗体フラグメントをそれぞれエンドヌクレアーゼで消化し、Ｔ４リガーゼを用いて連結し、連結産物を構築した。これらの連結産物をエレクトロトランスフェクション技術によってＴＧ１株に導入した。最後に、濃度１．８×１０^８／ミリリットルの免疫ラクダ抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨ抗体ライブラリーを特異的抗ヒトＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体のスクリーニングのために構築した。ライブラリーの正当性を検出するために、コロニーＰＣＲのために５０のクローンを無作為に選択し、それらの結果は、挿入パーセンテージが１００％に達したことを示した。

【0064】

実施例２ 特異的抗ヒトＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体のスクリーニング
構築したラクダ免疫ライブラリーを固相スクリーニング法によりスクリーニングして、ファージによりディスプレーされる特異的単一可変ドメイン抗体を得た。

【0065】

（１）オリジナルライブラリーのディスプレー。ラクダ免疫ライブラリーを、アンピシリンおよびテトラサイクリンを含有する２ＹＴ培地に植え込み、対数増殖期まで増殖させ、次いで、そこにＭ１３ヘルパーファージを加えた後にカナマイシンを加え、より低温条件に一晩置き、オリジナルライブラリーをディスプレーさせた。翌日、培養上清を回収し、ＰＥＧ沈降によりファージを濃縮して、続いてのスクリーニングのための高力価抗体ライブラリーを含むディスプレー産物を得た。

【0066】

（２）スクリーニング。特異的抗体を固相法によりスクリーニングした。特異的抗原を免疫チューブの表面にコーティングした。この免疫チューブと抗体ライブラリーをそれぞれブロッキング剤でブロックし、次いで、抗体ライブラリーを免疫チューブに加え、インキュベートした後、繰り返し洗浄し、最後にｐＨ２．２の酸を用いて溶出した。溶出液を中性まで中和し、次いで、感染のために対数増殖期においてＸＬ－Ｂｌｕｅとともにインキュベートし、さらなるファージディスプレーを行った。特異的ファージ粒子を回収した。スクリーニング２～３回目の後、モノクローンを同定することとなった。

【0067】

（３）同定。回収した特異的ファージ粒子に感染させたＸＬ－Ｂｌｕｅをプレートに植え込み、個々のクローンをコロニーに増殖させた後に同定した。個々のクローンを採取し、対数増殖期まで培養し、次いで、Ｍ１３ヘルパーファージを加えて感染させた後、カナマイシンを添加し、その後、３０℃で一晩置いた。翌日、培養上清を回収し、ＰＤ－Ｌ１でコーティングした酵素結合プレートに加えてＥＬＩＳＡ反応を行った。ファージミド（抗体遺伝子を含んでなるファージディスプレーベクター）を反応陽性クローンから抽出し、配列決定を行ってＶＨＨ抗体遺伝子配列を決定した。ヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質に結合することができる、ファージによりディスプレーされた５つの単一可変ドメイン抗体（ＶＨＨｓ）、すなわち、１－４Ｇ１、１－６Ｃ４、２－３Ｄ６、２－５Ｂ７、２－２Ｆ２をスクリーニングにより取得した。

【0068】

実施例３ 特異的抗ヒトＰＤ－Ｌ１単一可変ドメイン抗体の予備的同定
得られた５つのシングルドメインＶＨＨ抗体を大腸菌ＴＧ１誘導により発現させた。なお、この誘導条件は１ｍＭ ＩＰＴＧ、３０℃、１５０ｒｐｍで一晩の培養であった。誘導発現の際に細菌サンプルを音波処理により破砕し、濾過し、次いで、ニッケルカラムを用いて親和性により精製し、限外濾過を行ってシングルドメインＶＨＨ抗体を得た。次に、ヒトＰＤ－Ｌ１のその受容体ＰＤ－１への結合に対するシングルドメインＶＨＨ抗体の阻害効果をＥＬＩＳＡにより試験した。特に、ヒトＰＤ－１細胞外領域とヒトＦｃ（ＰＤ－１－ｈＦｃの融合タンパク質、ＰＤ－１配列ＩＤ番号：ＮＰ＿００５００９．２、２１ａａ－１６７ａａ）をＥＬＩＳＡプレートに０．５μｇ／ｍＬの濃度でコーティングした。次に、このプレートを４℃で一晩置き、恒温インキュベーターにて３７℃で６０分間、５％ＢＳＡでブロックした。シングルドメインＶＨＨ抗体（濃度５０、１０、２ｎＭ）および１μｇ／ｍＬ ＰＤ－Ｌ１－ｍＦｃを共インキュベートし、恒温インキュベーターにて３７℃で６０分間反応させた。このプレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、その後、１：５０００希釈したＨＲＰ－抗マウスＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ．：１１５－０３５－０７１）を加え、４５分間反応させ、ＴＭＢ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔａｉｔｉａｎｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．：ＭＥ１４２）基質を加えて１５分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌを加えて反応を停止させた後、このプレートについて、６３０ｎｍを参照波長とし、４５０ｎｍを検出波長としてリーダーでウェルプレートのＡ４５０ｎｍ－６３０ｎｍの吸光度値を読み取って記録した。これらの結果は、２－２Ｆ２が組換えヒトＰＤ－Ｌ１のその受容体ＰＤ－１への結合を効果的にブロックし得ることを示し、２－２Ｆ２は良好なブロック活性を有することが示唆された（図１）。ＶＨＨ－Ｆ２と略されるこの分子を、以降の開発のための原型分子として選択した。単一可変ドメイン抗体の可変領域のアミノ酸配列を配列番号１として示し、可変領域のヌクレオチド配列を配列番号２として示した。

【0069】

特異的プライマーを設計し、陽性クローンファージミドを鋳型として用い、ラクダ由来抗体ＶＨＨ－Ｆ２の可変領域遺伝子をＰＣＲによって取得した。次に、可変領域遺伝子を酵素消化および連結により、ヒトＦｃ（ＩｇＧ１、ｈＦｃ）コード遺伝子を含んでなる真核生物発現ベクターにクローニングした。適正な配列を有する発現プラスミドを得た後、それを一過性発現のために２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、その後、発現産物をプロテインＡにより精製し、最後にヒト－ラクダキメラ単一可変ドメイン抗体の融合タンパク質（ＶＨＨ－Ｆ２－ヒト－Ｆｃキメラ抗体、「ｃｈＦ２」と略される）を得た。ｃｈＦ２抗体分子の全長アミノ酸配列を配列番号３として示し、ヌクレオチド配列を配列番号４として示した。

【0070】

ＷＨＯが公開しているＥｎｖａｆｏｌｉｍａｂ抗体配列(WHO Drug Information, Vol. 33, No. 3, 2019, Page634-635, Envafolimab)を参照して、ＫＮ０３５可変領域遺伝子を完全に合成し、ＫＮ０３５可変領域のアミノ酸配列を配列番号５として示し、ヌクレオチド配列を配列番号６として示した。ｃｈＦ２の構築に関して上記と同じ戦略を用いてＫＮ０３５可変領域およびＦｃを有する融合タンパク質を得、ＫＮ０３５と略した。

【0071】

実施例４ 抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラ単一可変ドメイン抗体の結合活性分析
方法１ 結合活性に関するＢＬＩアッセイ
Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社のＯｃｔｅｔ ＱＫｅシステム装置を用い、ヒト抗体のＦｃフラグメントに対する捕捉抗体（ＡＨＣ）生体プローブを用いて、ｃｈＦ２の対応する組換え抗原への結合能を測定した。測定時には，ｃｈＦ２をＰＢＳバッファーで４μｇ／ｍＬに希釈し，ＡＨＣプローブ（Ｃａｔ．：１８－００１５，ＰＡＬＬ）表面に１２０秒間流した。移動相としてヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質を用いてチップ表面に捕捉した抗体と相互作用させた。組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質濃度は６０ｎＭとした。各抗原に対する結合時間は３００秒であり、最終解離時間は３００秒であった。その結果（表１）、本実験条件下では、ｃｈＦ２が組換えトＰＤ－Ｌ１タンパク質と高い親和性で結合したことを示し、これは対照抗体ＫＮ０３５と同等であった。

【0072】

【表1】

【0073】

方法２ ＦＡＣＳによる結合活性分析
細胞（ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞）を遠心分離後に採取し、５×１０^５細胞／サンプル／１００μＬに分割した。勾配希釈した単一可変ドメイン抗体を最高濃度として終濃度６６ｎＭで細胞に加え、３倍連続希釈を行って１０勾配を作製し、次いで、氷上で２時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有）で２回洗浄した。ＦＩＴＣ標識抗ヒトＦｃ二次抗体（Ｃａｔ．：Ｆ９５１２、Ｓｉｇｍａ）を加え、氷上で１時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有）で２回洗浄し、２００μＬのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁させ、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメーター（モデルＢ４９００７ＡＤ、ＳＮＡＷ３１２１１、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）により検出した。検出結果は、ｃｈＦ２およびＫＮ０３５は細胞表面に発現するＰＤ－Ｌ１に対して同等の結合活性を有することを示し、５０％有効結合濃度（ＥＣ５０）値はそれぞれ１．０４ｎＭおよび１．２７ｎＭであった（図２）。

【0074】

実施例５ 抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラ単一可変ドメイン抗体の特異性の分析
方法１ ＥＬＩＳＡによる組換え抗原に対するキメラ抗体の特異性の同定
組換えヒトタンパク質（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＩＣＯＳなど）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した後、１００μＬ／ウェルを用いて酵素結合プレートを℃で一晩コーティングした。このプレートを恒温インキュベーターにて３７℃で６０分、５％ＢＳＡブロッキング溶液でブロックした後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、１μｇ／ｍＬに希釈したｃｈＦ２を加え、３７℃で６０分間反応させ、ＰＢＳＴで４回洗浄し、１：５０００希釈したＨＲＰ－抗ヒトＩｇＧを加えて４５分間反応させ、ＰＢＳＴで４回洗浄し、最後に、ＴＭＢ基質を加えて発色させた。恒温インキュベーターにて３７℃で１５分間、反応を行い、２Ｍ ＨＣｌで停止させた。このプレートについて、６３０ｎｍを参照波長とし、４５０ｎｍを検出波長としてリーダーでウェルプレートのＡ４５０ｎｍ－６３０ｎｍの吸光度値を読み取って記録した。これらの結果（図３）は、ｃｈＦ２はＰＤ－Ｌ１に特異的に結合するが、他の組換えタンパク質には結合しないことを示した。

【0075】

方法２ 種特異性を同定するためのＢＬＩアッセイ
Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社のＯｃｔｅｔ ＱＫｅシステム装置を用い、抗ヒト抗体Ｆｃセグメントの捕捉抗体（ＡＨＣ）生体プローブを用いて抗体のＦｃセグメントを捕捉することにより、ｃｈＦ２が組換えサルＰＤ－Ｌ１および組換えマウスＰＤ－Ｌ１に結合できるかどうかを決定した。測定時には，ｃｈＦ２をＰＢＳバッファーで４μｇ／ｍＬに希釈し，ＡＨＣプローブ（ＰＡＬＬ、Ｃａｔ．：１８－００１５）表面に１２０秒間流した。移動相としてサルＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質およびマウスＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質を用いてチップ表面に捕捉した抗体と相互作用させた。ＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質濃度は６０ｎＭとした。各抗原の結合時間は３００秒であり、最終解離時間は３００秒であった。これらの結果は、ｃｈＦ２およびＫＮ０３５の両方が組換えサルＰＤ－Ｌ１タンパク質に同等の親和性で結合したが、組換えマウスＰＤ－Ｌ１タンパク質には結合しなかったことを示した（表２）。

【0076】

【表2】

【0077】

方法３ ＦＡＣＳによるキメラ抗体特異性の同定
細胞を遠心分離の後に回収し、３×１０^５細胞／サンプル／１００μＬに分割し、２０μｇ／ｍｌの単一可変ドメイン抗体を細胞に加えた。細胞を氷上で２時間インキュベートし、氷冷ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有）で２回洗浄した。ＦＩＴＣ標識抗ヒトＦｃ二次抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．：Ｆ９５１２）を加え、氷上で１時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有）で２回洗浄し、２００μＬのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁させ、フローサイトメーターにより検出した。検出結果（図４）は、腫瘍細胞種のそれぞれに対するｃｈＦ２の反応性は、対照抗体ＫＮ０３５の反応性と全く同じであり、両方ともヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞株には特異的に結合したが、非ＰＤ－Ｌ１発現細胞株には結合しなかったことを示した。

【0078】

実施例６ ｃｈＦ２のヒト化
ラクダ由来抗体ＶＨＨ－Ｆ２の可変領域と最高の相同性を有するヒト重鎖可変領域を、ヒト重鎖可変領域のフレームワークのために選択した。ＶＨＨ－Ｆ２の可変領域は、ＣＤＲグラフィティングおよび部分的アミノ酸保持による支持構造の提供によってヒト化した。配列番号７として示される可変領域アミノ酸配列および配列番号９として示される全長アミノ酸配列を有するヒト化単一可変ドメイン抗体の融合タンパク質（ＶＨＨ－Ｆ２－ヒト－Ｆｃヒト化抗体、ｈｚＦ２と略される）を設計した。配列番号８として示されるｈｚＦ２可変領域のヌクレオチド配列を合成し、ｈｚＦ２の組換え発現ベクターを構築した。構築した全長ｈｚＦ２可変領域ヌクレオチド配列を配列番号１０として示した。真核生物発現の後、ｈｚＦ２の親和性をＢＬＩ法により決定し、相関分析を行った。

【0079】

抗体クローンｈｚＦ２をさらに変異させて多数の変異体抗体を得た。これらの変異体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を表３に示し、変異体の可変領域のアミノ酸配列を表４（配列番号１１～配列番号２６）に示し、変異体の可変領域のヌクレオチド配列を配列番号２７～配列番号４２として示し、いくつかの変異体の結合定数および解離定数の変化を表５に示した。

【0080】

【表3】

【0081】

【表4-1】

【表4-2】

【0082】

【表5】

【0083】

実施例７ ＥＬＩＳＡアッセイによるヒトＰＤ－Ｌ１のその受容体ＰＤ－１への結合に対するｈｚＦ２の阻害効果
ヒトＰＤ－１－ｈＦｃ（ＰＤ－１配列番号ＮＰ＿００５００９．２、２１ａａ－１６７ａａ）をＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートにて４℃で一晩コーティングした。次に、プレートを恒温インキュベーターにて３７℃で６０分間、５％ＢＳＡでブロックした。ｈｚＦ２および対照抗体ＫＮ０３５、およびアイソタイプ対照ＮＣ－ｈＩｇＧ１の勾配希釈（初期実施濃度５０ｎＭ、１．５倍希釈で１０濃度勾配）を加え、次いで、ＰＤ－Ｌ１－ｍＦｃ（ＰＤ－Ｌ１配列番号ＮＰ＿０５４８６２．１、１９ａａ－２３８ａａ）を実施濃度０．５μｇ／ｍＬで加え、恒温インキュベーターにて３７℃で６０分間、共インキュベートし、反応させた。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、次いで、そこに１：５０００希釈したＨＲＰ－抗マウスＦｃ（Ｃａｔ．：１１５－０３５－０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を加え、４５分間反応させ、ＴＭＢ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔａｉｔｉａｎｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．：ＭＥ１４２）基質を加えて１５分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌを加えて反応を停止させた後、このプレートについて、６３０ｎｍを参照波長とし、４５０ｎｍを検出波長としてリーダーでウェルプレートのＡ４５０ｎｍ－６３０ｎｍの吸光度値を読み取って記録した。これらの結果（図５）は、ｈｚＦ２が組換えヒトＰＤ－Ｌ１のその受容体ＰＤ－１への結合を効果的にブロックできることを示し、５０％有効結合濃度（ＥＣ５０）値は４．３ｎＭであった。

【0084】

実施例８ ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１リポーター遺伝子法による細胞ブロック活性の評価
ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１経路に対するｈｚＦ２のブロック効果を、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ１－ＮＦＡＴ細胞およびＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞を用いるリポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）によってアッセイした。詳細を以下に示した：対数増殖期のＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞を５×１０^５細胞／ｍｌの細胞密度に調整し、１００μｌ／ウェルで播種し、一晩置いた。抗体サンプルを培養培地で２０μｇ／ｍｌまで段階的に予備希釈し、次いで、２倍勾配で合計１０点として希釈した。希釈サンプルを一晩培養した細胞に５０μｌ／ウェルで添加した。同時に、２×１０^６細胞／ｍｌ濃度のＪｕｒｋａｔ－ＰＤ１－ＮＦＡＴ細胞を５０μｌ／ウェルで加えた。このプレートを細胞インキュベーターにて６時間インキュベートした。１～２時間前に適切な量のＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ基質を取り出して解凍した後、暗所、室温に置いた。インキュベーターから細胞プレートを取り出し、室温に平衡化し（約１０～１５分）、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ基質を１００μｌ／ウェルで加えた。細胞プレートをマイクロプレート恒温シェーカーに入れ、暗所、８００ｒｐｍで２０分間インキュベートした。多機能マイクロプレートリーダーを発光モードに設定し、組込みおよびＲＬＵの読み取りのために５００（この装置の規定値）を選択した。ＳｏｆｔＭａｘソフトウエアを用い、サンプル濃度をＸ軸とし、ＲＬＵ平均検出値をＹ軸とし、標準曲線を作成するために４パラメーター方程式を選択してデータを解析した。参照サンプルおよび試験サンプルの曲線フィッティング結果のＥＣ_５０値によれば、試験サンプルの相対生物活性を計算した。結果を図６に示した。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１に対するｈｚＦ２のブロック活性は、ＫＮ０３５のブロック活性と実質的に同等であり、それぞれｈｚＦ２のＥＣ５０は５．４５ｎＭであり、ＫＮ０３５のＥＣ５０は４．９０ｎＭであった。

【0085】

実施例９：マウスにおけるｈｚＦ２の半減期の決定
１群３匹に分けた健常な雌５週齢ヌードマウスに尾静脈から単回用量１５ｍｇ／ｋｇの抗体を注射した。投与２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、９６時間、１４４時間、１９６時間後に、それぞれ尾静脈血液サンプルを採取し、遠心分離して血清を分離し、抗体の薬物動態特性を試験するために－２０℃で保存した。総ての血液サンプルの採取が完了した後、以下の手順を行った。９６ウェル酵素結合プレートを０．５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルとしてＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ（配列番号ＮＰ＿０５４８６２．１、１９ａａ－２３８ａａ）でコーティングし、一晩４℃で置いた後、ＰＢＳで３回洗浄した。このプレートに５％ＢＳＡ ＰＢＳを加え、３７℃で６０分間ブロックし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、供試血清サンプル（１０，０００倍希釈、２０，０００倍希釈）と標準品を加えてｈｚＦ２標準曲線ウェル（初期濃度０．０５μｇ／ｍＬ、２倍連続希釈、１２希釈勾配）とし、３７℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、１：５０００希釈したＨＲＰ－ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃｒ）（Ｃａｔ．：１０９－０３５－０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を加え、３７℃で４０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｃａｔ．：ＭＥ１４２、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔａｉｔｉａｎｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を加えて発色させた。３７℃で１０分間インキュベートした後、プレートに２Ｍ ＨＣｌを加えて反応を停止させ、次いで、６３０ｎｍを参照波長として、４５０ｎｍを検出波長としてリーダーでウェルプレートのＡ４５０ｎｍ－６３０ｎｍの吸光度値を読み取って記録した。標準抗体の濃度をＹ軸とし、ＯＤ値をＸ軸として時間－抗体濃度曲線をプロットし、直線フィッティングを行った。薬物半減期Ｔ_１／２はＴ_１／２＝０．６９３／ｋ｜であり、式に従って計算した。

【0086】

最終結果（図７）は、本条件下でマウスにおけるｈｚＦ２のｉｎ ｖｉｖｏ半減期は８３．１時間であることを示し、ｈｚＦ２は良好なｉｎ－ｖｉｖｏ半減期および安定性を有していたことが示唆された。

【0087】

実施例１０：ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１を皮下に同種移植したヒトＰＤ－Ｌ１トランスジェニックマウスを用いてマウス大腸癌モデルでのｈｚＦ２の抗腫瘍有効性の検出
ヒトＰＤＬ１を高発現するマウス大腸癌細胞株ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１を雌Ｂ６－ｈＰＤＬ１マウス（Ｃ５７の遺伝子背景を有するＰＤ－Ｌ１ヒト化マウス）の右前肋骨皮下部位に接種した。腫瘍が約１００ｍｍ^３に成長した際に、マウスをｈｚＦ２群、ＫＮ０３５群またはアイソタイプ対照ＩｇＧ群に群分けし、前記薬剤を１０ｍｇ／ｋｇの用量で週２回、計６回投与した。投与の度に腫瘍体積および体重を測定し、担癌マウスの体重および腫瘍体積の変化と投与時間の間の関係を記録した。試験終了時に、担癌マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、重量を測定し、写真撮影を行った。対照群に対する処置群の腫瘍体積比（Ｔ／Ｃ）および腫瘍増殖阻害率（１－Ｔ／Ｃ）を算出し、統計学的に解析した。これらの結果は、被験薬であるｈｚＦ２が腫瘍の増殖を効果的に阻害したことを示した（図８、図９）。

【0088】

［配列表］
本願に関連するアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は以下の通りである。
配列番号１：ラクダ由来単一可変ドメイン抗体ＶＨＨ－Ｆ２の可変領域アミノ酸配列

【化1】

配列中；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸（配列番号４３）：

【化2】

重鎖ＣＤＲ２アミノ酸（配列番号４４）：

【化3】

重鎖ＣＤＲ３アミノ酸（配列番号４５）：

【化4】

配列番号２：ラクダ由来単一可変ドメイン抗体ＶＨＨ－Ｆ２の可変領域ヌクレオチド配列

【化5】

配列中：
重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド：

【化6】

重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド：

【化7】

重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド：

【化8】

配列番号３：キメラ単一可変ドメイン抗体ｃｈＦ２の全長アミノ酸配列

【化9】

配列中：
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸：

【化10】

重鎖ＣＤＲ２アミノ酸：

【化11】

重鎖ＣＤＲ３アミノ酸：

【化12】

配列番号４：キメラ単一可変ドメイン抗体ｃｈＦ２の全長ヌクレオチド配列

【化13】

配列中：
重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド：

【化14】

重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド：

【化15】

重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド：

【化16】

配列番号５：ＫＮ０３５可変領域のアミノ酸配列

【化17】

配列中：
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸：

【化18】

重鎖ＣＤＲ２アミノ酸：

【化19】

重鎖ＣＤＲ３アミノ酸：

【化20】

配列番号６：ＫＮ０３５可変領域のヌクレオチド配列

【化21】

配列中：
重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド：

【化22】

重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド：

【化23】

重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド：

【化24】

配列番号７：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２の可変領域アミノ酸配列

【化25】

配列中：
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸：

【化26】

重鎖ＣＤＲ２アミノ酸：

【化27】

重鎖ＣＤＲ３アミノ酸：

【化28】

配列番号８：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２の可変領域ヌクレオチド配列

【化29】

配列中：
重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド：

【化30】

重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド：

【化31】

重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド：

【化32】

配列番号９：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２の全長アミノ酸配列

【化33】

配列中：
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸：

【化34】

重鎖ＣＤＲ２アミノ酸：

【化35】

重鎖ＣＤＲ３アミノ酸：

【化36】

配列番号１０：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２の全長ヌクレオチド配列

【化37】

配列中：
重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド：

【化38】

重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド：

【化39】

重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド：

【化40】

配列番号１１：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１の可変領域アミノ酸配列

【化41】

配列番号１２：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ２の可変領域アミノ酸配列

【化42】

配列番号１３：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ３の可変領域アミノ酸配列

【化43】

配列番号１４：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ４の可変領域アミノ酸配列

【化44】

配列番号１５：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ５の可変領域アミノ酸配列

【化45】

配列番号１６：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ６の可変領域アミノ酸配列

【化46】

配列番号１７：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ７の可変領域アミノ酸配列

【化47】

配列番号１８：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ８の可変領域アミノ酸配列

【化48】

配列番号１９：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ９の可変領域アミノ酸配列

【化49】

配列番号２０：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１０の可変領域アミノ酸配列

【化50】

配列番号２１：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１１の可変領域アミノ酸配列

【化51】

配列番号２２：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１２の可変領域アミノ酸配列

【化52】

配列番号２３：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１３の可変領域アミノ酸配列

【化53】

配列番号２４：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１４の可変領域アミノ酸配列

【化54】

配列番号２５：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１５の可変領域アミノ酸配列

【化55】

配列番号２６：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１６の可変領域アミノ酸配列

【化56】

配列番号２７：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１の可変領域ヌクレオチド配列

【化57】

配列番号２８：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ２の可変領域ヌクレオチド配列

【化58】

配列番号２９：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ３の可変領域ヌクレオチド配列

【化59】

配列番号３０：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ４の可変領域ヌクレオチド配列

【化60】

配列番号３１：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ５の可変領域ヌクレオチド配列

【化61】

配列番号３２：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ６の可変領域ヌクレオチド配列

【化62】

配列番号３３：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ７の可変領域ヌクレオチド配列

【化63】

配列番号３４：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ８の可変領域ヌクレオチド配列

【化64】

配列番号３５：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ９の可変領域ヌクレオチド配列

【化65】

配列番号３６：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１０の可変領域ヌクレオチド配列

【化66】

配列番号３７：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１１の可変領域ヌクレオチド配列

【化67】

配列番号３８：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１２の可変領域ヌクレオチド配列

【化68】

配列番号３９：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１３の可変領域ヌクレオチド配列

【化69】

配列番号４０：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１４の可変領域ヌクレオチド配列

【化70】

配列番号４１：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１５の可変領域ヌクレオチド配列

【化71】

配列番号４２：ヒト化単一可変ドメイン抗体ｈｚＦ２－ｍ１６の可変領域ヌクレオチド配列

【化72】

以上の説明は、本発明の好ましい実施形態に過ぎないが、本発明の保護範囲はこれらに限定されるものではない。当業者が容易に想到し得る、本発明が開示する技術的範囲内の変更または変形は、本発明の保護範囲に含まれるものとする。従って、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲で主張されるものであるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

2023523600000001.app

【国際調査報告】