▶ サリオジェン セラピューティクス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-06
(54)【発明の名称】遺伝性黄斑変性症の治療のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20230530BHJP
C12N 15/90 20060101ALI20230530BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20230530BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230530BHJP
C12N 15/79 20060101ALI20230530BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230530BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230530BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230530BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230530BHJP
A61K 45/06 20060101ALI20230530BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20230530BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20230530BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20230530BHJP
A61K 47/14 20170101ALI20230530BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20230530BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54
C12N15/90 Z ZNA
C12N15/88 Z
C12N15/63 Z
C12N15/79 Z
C12N5/10
A61P27/02
A61K31/7088
A61K48/00
A61K45/06
A61K9/51
A61K47/18
A61K47/28
A61K47/14
A61K47/24
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022565707
(86)(22)【出願日】2021-04-29
(85)【翻訳文提出日】2022-10-25
(86)【国際出願番号】 US2021030007
(87)【国際公開番号】W WO2021222654
(87)【国際公開日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】63/017,442
(32)【優先日】2020-04-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522418635
【氏名又は名称】サリオジェン セラピューティクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヒギンズ、ジョセフ、ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】マクミラン、スコット
(72)【発明者】
【氏名】タビビアザール、レイ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA27
4B065CA44
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC10
4C076DD46
4C076DD49
4C076DD63
4C084AA13
4C084AA23
4C084MA02
4C084MA41
4C084MA66
4C084NA13
4C084ZA33
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA04
4C086MA41
4C086MA66
4C086NA13
4C086ZA33
(57)【要約】
患者において、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）またはその機能的断片を標的化するための遺伝子療法組成物及び方法であって、それによって、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患または網膜変性症を含む他の疾患を含む遺伝性黄斑変性症を治療または緩和する、方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子導入構築物を含む組成物であって、（ａ）ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣ）トランスポーター（ＡＢＣＡ４）タンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸と、
（ｂ）網膜特異的プロモーターと、
（ｃ）１つ以上のトランスポザーゼ認識部位、及び１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）または端部配列を含む、非ウイルスベクターと、を含む、前記組成物。
【請求項2】
前記遺伝子導入構築物が、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記遺伝子導入構築物が、コドン最適化されている、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＡＢＣＡ４タンパク質が、ヒトＡＢＣＡ４タンパク質、またはその機能的断片である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記ヒトＡＢＣＡ４タンパク質、またはその機能的断片をコードする前記核酸が、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記ヒトＡＢＣＡ４タンパク質、またはその機能的断片をコードする前記核酸が、配列番号２のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項7】
前記網膜特異的プロモーターが、ヒトプロモーターである、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
前記網膜特異的プロモーターが、任意選択的に、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）プロモーター、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）プロモーター、及び卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーターから選択される網膜色素上皮（ＲＰＥ）プロモーター、または任意選択的に、ＰＤＥ、ロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）、ＣＡＲ（錐体アレスチン）、ＲＰ１、及びＬ－オプシンから選択される光受容体プロモーター、またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントの機能的断片である、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
前記プロモーターが、任意選択的に、配列番号１６の核酸配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントの機能的断片を含む、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、及びウサギベータ－グロビンスプライスアクセプター部位（ＣＡＧ）である、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項10】
前記ＲＰＥプロモーターが、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５の核酸配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントの機能的断片を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項11】
前記光受容体プロモーターが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９の核酸配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントの機能的断片を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項12】
前記非ウイルスベクターが、ＤＮＡプラスミドである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＤＮＡプラスミドが、そばにある遺伝子の活性化または不活性化を防止または緩和する１つ以上のインスレーター配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記ＩＴＲもしくは前記端部配列が、任意選択的に、ＴＴＡＡ反復性配列を含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンのものであり、及び／または前記ＩＴＲもしくは前記端部配列が、前記ＡＢＣＡ４タンパク質をコードする前記核酸に隣接する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項15】
前記非ウイルスベクターが、トランスポザーゼ、任意選択的に、ＲＮＡトランスポザーゼプラスミドをコードする核酸構築物を更に含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項16】
ＤＮＡトランスポザーゼプラスミドまたはインビトロ転写ｍＲＮＡトランスポザーゼをコードする核酸構築物を更に含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項17】
前記トランスポザーゼが、前記遺伝子導入構築物から前記遺伝子を切除及び／または転移することが可能である、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記トランスポザーゼが、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来し、及び／またはその操作されたバージョンであり、及び／または前記トランスポザーゼが、前記ＩＴＲもしくは前記端部配列を特異的に認識する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
前記遺伝子が、トランスポザーゼの存在下での転移が可能である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項20】
前記組成物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態にある、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項21】
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルアミノエタン－カルバモイルと混合されたカチオン性コレステロール誘導体（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、トリオレイン（トリオレイン酸グリセリル）、ならびに１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［カルボキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ ２Ｋ）、及び１，２－ジステアロール（ｄｉｓｔｅａｒｏｌ）－ｓｎ－グリセロール－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）から選択される１つ以上の脂質を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項22】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ならびにＮ－アセチルガラクトサミン（Ｇａｌ－Ｎａｃ）から選択される、１つ以上の分子を含む、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項23】
請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物を含む、単離された細胞。
【請求項24】
患者における光受容体喪失を防止するか、またはその速度を減少させるための方法であって、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項25】
患者における光受容体喪失を防止するか、またはその速度を減少させるための方法であって、（ａ）患者または別の個体から得られた細胞を、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物と接触させることと、
（ｂ）前記細胞をそれを必要とする患者に投与することと、を含む、前記方法。
【請求項26】
前記方法が、前記患者の遠見視力（ｄｉｓｔａｎｃｅ ｖｉｓｕａｌ ａｃｕｉｔｙ）を改善する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項27】
前記方法が、投与を行わないレチンアルデヒド、Ｎ－レチニリデン－Ｎ－レチニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）、及びイソ－Ａ２Ｅのうちの１つ以上のレベルと比較して、レチンアルデヒド、Ａ２Ｅ、及びイソ－Ａ２Ｅのうちの１つ以上を、任意選択的に、約４０％超、または約５０％超、または約６０％超、または約７０％超、または約８０％超、または約９０％超低下させることを提供する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項28】
前記方法が、網膜における、任意選択的に、前記ＲＰＥ及び／またはＢｒｕｃｈ膜におけるリポフスチン蓄積を低下または防止する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項29】
前記方法が、ステロイド治療の不在下で実施される、請求項２４～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記方法が、実質的に非免疫原性である、請求項２４～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
光受容体喪失の前記防止またはその前記速度の減少が、恒久的である、請求項２４～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記方法が、単回投与を必要とする、請求項２４～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記方法が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）破片の形成を低減または防止する、請求項２４～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
任意選択的に、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物を投与することを更に含む、請求項２４～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記細胞を、任意選択的に、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物と接触させることを更に含む、請求項２４～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記投与することが、硝子体内、または網膜内、または硝子体下、または網膜下である、請求項２４～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記投与することが、ＲＰＥ細胞及び／または光受容体へのものである、請求項２４～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記投与することが、注射による、請求項２４～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記ＡＢＣＡ４タンパク質、またはその機能的断片をコードする前記核酸対前記トランスポザーゼをコードする核酸構築物の比が、約５：１、または約４：１、または約３：１、または約２：１、または約１：１、または約１：２、または約１：３、または約１：４、または約１：５である、請求項３４～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記ＡＢＣＡ４タンパク質、またはその機能的断片をコードする前記核酸対前記トランスポザーゼをコードする核酸構築物の前記比が、約２：１である、請求項３４～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
遺伝性黄斑変性症（ＩＭＤ）を治療及び／または緩和するための方法であって、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項42】
遺伝性黄斑変性症（ＩＭＤ）を治療及び／または緩和するための方法であって、（ａ）患者または別の個体から得られた細胞を、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物と接触させることと、
（ｂ）前記細胞をそれを必要とする患者に投与することと、を含む、前記方法。
【請求項43】
前記ＩＭＤが、ＳＴＧＤであり、前記ＳＴＧＤ疾患が、任意選択的に、ＳＴＧＤタイプ１（ＳＴＧＤ１）である、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項44】
前記ＩＭＤが、ＡＢＣＡ４、ＥＬＯＶＬ４、ＰＲＯＭ１、ＢＥＳＴ１、及びＰＲＰＨ２のうちの１つ以上における１つ以上の変異を特徴とし、前記ＡＢＣＡ４変異が、任意選択的に、常染色体劣性変異である、請求項４１～４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
前記方法が、治療の欠如と比較して、遠見視力の改善及び／または光受容体喪失の前記速度の減少を提供する、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記方法が、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の約２０／２００超までの改善をもたらす、請求項４１～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
前記方法が、眼底自発蛍光（ＦＡＦ）またはスペクトルドメイン光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）によって測定した、網膜または中心窩の形状の改善をもたらす、請求項４１～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
前記方法が、前記患者における、変視症（ｗａｖｙ ｖｉｓｉｏｎ）、盲点、かすみ、奥行き知覚の喪失、まぶしさへの感受性、色覚障害、及び薄暗い照明への適応困難（暗所適応の遅延）のうちの１つ以上の低減または防止をもたらす、請求項４１～４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項49】
前記方法が、ステロイド治療の必要性を排除する、請求項４１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項50】
前記方法が、前記患者の遠見視力を改善する、請求項４１～４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
前記方法が、実質的に非免疫原性である、請求項４１～５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記治療及び／または緩和が、恒久的である、請求項４１～５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項53】
前記方法が、単回投与を必要とする、請求項４１～５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項54】
前記方法が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）破片の形成を低減または防止する、請求項４１～５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項55】
任意選択的に、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物を投与することを更に含む、請求項４１～５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項56】
前記投与することが、硝子体内または網膜内である、請求項４１～５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項57】
前記投与することが、ＲＰＥ細胞及び／または光受容体へのものである、請求項４１～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
前記投与することが、注射による、請求項４１～５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項59】
前記細胞を、任意選択的に、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物と接触させることを更に含む、請求項４２～５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
前記ＡＢＣＡ４タンパク質またはその機能的断片をコードする前記核酸対前記トランスポザーゼをコードする前記核酸構築物の前記比が、約５：１、または約４：１、または約３：１、または約２：１、または約１：１、または約１：２、または約１：３、または約１：４、または約１：５である、請求項５５～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
前記ＡＢＣＡ４、またはその機能的断片をコードする前記核酸対前記トランスポザーゼをコードする前記核酸構築物の前記比が、約２：１である、請求項５５～６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項62】
遺伝子導入構築物を含む組成物であって、（ａ）ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣ）トランスポーター（ＡＢＣＡ４）タンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸と、
（ｂ）ＣＡＧプロモーターと、
（ｃ）１つ以上のトランスポザーゼ認識部位、及び１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）または端部配列を含む、非ウイルスベクターと、を含み、
前記ＡＢＣＡ４タンパク質が、配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされるヒトＡＢＣＡ４もしくはその機能的断片、またはそれに対して少なくとも約９５％の同一性を有するバリアントである、前記組成物。
【請求項63】
遺伝性黄斑変性症（ＩＭＤ）を治療及び／または緩和するための方法であって、（ａ）患者または別の個体から得られた細胞を、請求項６２に記載の組成物と接触させることと、
前記細胞を、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物と接触させることであって、ＡＢＣＡ４またはその機能的断片対トランスポザーゼの前記比が、約２：１である、前記接触させることと、
（ｃ）前記細胞をそれを必要とする患者に投与することと、を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、療法、例えば、遺伝性黄斑変性症（ＩＭＤ）を治療及び／または緩和するための方法、組成物、及び製品に部分的に関連する。
【0002】
優先権
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０２０年４月２９日出願の米国仮特許出願第６３／０１７，４４２号の優先権及び利益を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０２０年４月２９日出願の米国仮特許出願第６３／０１７，４４２号の優先権及び利益を主張する。
【0003】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に本明細書とともに提出されたＡＳＣＩＩ形式の配列表を含有する。２０２１年４月２８日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＳＡＬ－００２ＰＲ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、６４，４９８バイトのサイズである。配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に本明細書とともに提出されたＡＳＣＩＩ形式の配列表を含有する。２０２１年４月２８日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＳＡＬ－００２ＰＲ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、６４，４９８バイトのサイズである。配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
黄斑変性症は、網膜の中心部に見られる黄斑の細胞－光を感知する眼の後部の組織－が損傷を受けた状態である。通常、視力喪失が徐々に発生し、典型的には異なる速度で両眼に影響を及ぼす。黄斑ジストロフィー（ＭＤ）とも呼ばれる遺伝性黄斑変性症（ＩＭＤ）は、検眼鏡によって目視可能な異常を網膜に引き起こす遺伝性傷害の群を指す。
【0005】
１９０９年にドイツ人眼科医Ｋａｒｌ Ｓｔａｒｇａｒｄｔによって初めて記載されたＳｔａｒｇａｒｄｔ疾患（ＳＴＧＤ）は、ＩＭＤの最も一般的な形態である。これは、通常、網膜の劣性遺伝障害である。疾患の別名としては、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ黄斑ジストロフィー（ＳＭＤ）、若年性黄斑変性症、または黄色斑眼底が挙げられる。ＳＴＧＤは、典型的には、小児期または青年期に視力喪失を引き起こすが、時折成人期の後半まで、視力喪失が気付かれない場合がある。ＳＴＧＤは、まっすぐ前方の視力を担う網膜の中心部の小さな領域にある、黄斑の進行性損傷、または変性を引き起こす。ＳＴＧＤの世界的な発生率は、８，０００～１０，０００人に１人と推定されている。
【0006】
ＳＴＧＤは、黄斑変性症を引き起こすいくつかの遺伝子障害のうちの１つであり、網膜における光を感知する光受容体細胞の喪失に起因する進行性の視力の悪化を特徴とする。中心視力の喪失は、読み書き、周囲環境で安全に歩行する能力を劇的に低減し、その人の生活の質を顕著に低減する。劣性Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患（ＳＴＧＤ１）は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）における変異によって引き起こされる、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患の群を抜いて最も一般的な形態である。ＡＢＣＡ４遺伝子／タンパク質は、光受容（ＰＲ）細胞において発現する。ＳＴＧＤ１は、部分的に消化されたタンパク質及び脂質の蛍光混合物であるリポフスチンが、網膜色素上皮（ＲＰＥ）のリソソーム区画に堆積することによって現れ、これによって、光受容体変性が生じる。ＲＰＥは、先天性免疫の重要な構成要素である免疫系の補体部分に会合するｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を通じて、免疫応答を制御する役割を果たす。加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、ＳＴＧＤ１と顕著な類似性を有する疾患であり、ＲＰＥリポフスチン蓄積及び補体調節異常とも関連する。Ｌｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１７ Ａｐｒ １１；１１４（１５）：３９８７－３９９２．
【0007】
ＳＴＧＤの別の形態は、ＰＲＯＭ１遺伝子における稀な優性欠損であるＳＴＧＤ４である。Ｋｎｉａｚｅｖａ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９９９；６４：１３９４－１３９９．Ｓｔａｒｇａｒｄｔ様ジストロフィーとしても知られているＳＴＧＤ３は、ＳＴＧＤの別の稀な優性形態であり、超長鎖脂肪酸様４遺伝子の伸長（ＥＬＯＶＬ４）における変異によって引き起こされる。Ａｇｂａｇａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１４；５５：３６６９－３６８０．
【0008】
ＩＭＤの既存の療法としては、重水素化ビタミンＡ、微小電流刺激（ＭＣＳ）、ＲＰＥ移植、栄養補助食品、幹細胞療法、及び補体系の調節が挙げられる。しかしながら、これらの努力にもかかわらず、現在、一般的なＩＭＤ、特にＳＴＧＤの治療に有効な療法は存在しない。一般的に使用されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、他の網膜障害の中でも、ＳＴＧＤの原因となる遺伝子であるＡＢＣＡ４（６．８ｋｂ）を含む、５ｋｂ超のコード配列を有する遺伝子の容量を有さないので、ＩＭＤ疾患のための遺伝子療法開発は困難である。
【0009】
したがって、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患等のＩＭＤ、ならびに他の黄斑ジストロフィーを効率的に防止及び治療するための組成物及び方法が必要である。
【発明の概要】
【0010】
様々な態様では、本発明は、世界的に失明の主要な原因である遺伝性黄斑変性症（ＩＭＤ）障害を治療及び／または緩和するための組成物及び方法を提供する。ＩＭＤとしては、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患、ならびにＢｅｓｔ疾患、Ｘ連鎖性網膜分離症、パターンジストロフィー、Ｓｏｒｓｂｙ眼底ジストロフィー、及び常染色体優性ドルーゼンを含む他の黄斑ジストロフィー（ＭＤ）が挙げられる。本発明の組成物及び方法は、これらの疾患に関連する遺伝子欠損を補正するために配列特異的または遺伝子座特異的転移（ＳＬＳＴ）を使用するトランスポゾン発現ベクターを含む遺伝子導入構築物を使用する。記載の組成物及び方法は、遺伝子導入の非ウイルスモードを用いる。したがって、ウイルスベクターの使用に関連する欠点が克服される。
【0011】
いくつかの態様では、（ａ）ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸と、（ｂ）網膜特異的プロモーターと、（ｃ）１つ以上のトランスポザーゼ認識部位及び１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）または端部配列を含む非ウイルスベクターと、を含む、遺伝子導入構築物を含む組成物が提供される。
【0012】
本開示による遺伝子療法は、導入される遺伝子（シス）と同じベクター上、または異なるベクター（トランス）上、またはＲＮＡとして提供されるトランスポザーゼによる補助を用いる、トランスポゾンに基づくベクター系を使用して実施することができる。トランスポゾンに基づくベクター系は、網膜特異的プロモーターの制御下で動作することができる。
【0013】
実施形態では、例えば、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンが、ＡＢＣＡ４遺伝子またはその機能的断片を患者のゲノムに挿入するために使用される。
【0014】
実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアント、ならびにＬ５７３Ｘ、Ｅ５７４Ｘ、及びＳ２Ｘから選択される１つ以上の変異を含む、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓトランスポザーゼ（ＭＬＴ、またはＭＬＴトランスポザーゼ）であり、Ｘが、任意のアミノ酸または非アミノ酸であり、任意選択的に、Ｘが、Ａ、Ｇ、または欠失である。実施形態では、変異は、Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａである。
【0015】
実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、変異Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａ（配列番号１０）、加えて、高活性（または高活性変異）を付与する１つ以上の変異を有する、アミノ酸配列を含む。実施形態では、高活性変異は、Ｓ８Ｘ、Ｃ１３Ｘ、及びＮ１２５Ｘ変異のうちの１つ以上であり、Ｘが、任意選択的に、任意のアミノ酸または非アミノ酸であり、任意選択的に、Ｘが、Ｐ、Ｒ、またはＫである。実施形態では、変異は、Ｓ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋである。いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異を有する。いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｎ１２５Ｋ変異を有する。いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋ変異の３つ全てを有する。
【0016】
記載の組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用して宿主細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、中性または構造的脂質（例えばＤＳＰＣ）、カチオン性脂質（例えばＭＣ３）、コレステロール、ＰＥＧ共役脂質（ＣＤＭ－ＰＥＧ）、及び標的化リガンド（例えばＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））から選択される１つ以上の分子を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、変異したＡＢＣＡ４または他の遺伝子（例えば、ＥＬＯＶＬ４、ＰＲＯＭ１、ＢＥＳＴ１、またはＰＲＰＨ２）を有する細胞への、アシアロ糖タンパク質（Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）受容体（ＡＳＧＰＲ）によって媒介される取り込みのためのＧａｌＮＡｃまたは別のリガンドを含む。
【0017】
いくつかの態様では、インビボまたはエクスビボ方法であり得る、患者における光受容体喪失を防止するか、またはその速度を減少させるための方法が提供される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の実施形態による組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）患者（自己）または他の個体（同種異系）から得られた細胞を、記載の組成物と接触させることと、（ｂ）細胞をそれを必要とする患者に投与することとを含む、患者における光受容体喪失を防止するか、またはその速度を減少させるためのエクスビボ方法が提供される。
【0018】
いくつかの実施形態では、ＳＴＧＤ、Ｂｅｓｔ疾患、Ｘ関連性網膜分離症、パターンジストロフィー、Ｓｏｒｓｂｙ眼底ジストロフィー、及び常染色体優性ドルーゼンを含む部類のＩＭＤ（黄斑ジストロフィー（ＭＤ）とも称される）を治療及び／または緩和するための方法が提供される。
【0019】
いくつかの実施形態では、インビボまたはエクスビボでも実施することができる、ＩＭＤを治療及び／または緩和するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、本開示の実施形態よる組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＩＭＤを治療及び／または緩和するための方法は、（ａ）患者または別の個体から得られた細胞を、本開示の組成物と接触させることと、（ｂ）細胞をそれを必要とする患者に投与することと、を含む。
【0020】
ＩＭＤは、ＳＴＧＤであり得、いくつかの実施形態では、ＳＴＧＤは、ＳＴＧＤタイプ１（ＳＴＧＤ１）であり得る。いくつかの実施形態では、ＳＴＧＤは、ＳＴＧＤタイプ３（ＳＴＧＤ３）またはＳＴＧＤタイプ４（ＳＴＧＤ４）疾患であり得る。ＩＭＤは、ＡＢＣＡ４、ＥＬＯＶＬ４、ＰＲＯＭ１、ＢＥＳＴ１、及びＰＲＰＨ２のうちの１つ以上における変異を特徴とし得る。ＡＢＣＡ４変異は、常染色体劣性または優性変異であり得る。本開示よる方法は、治療の欠如と比較して、遠見視力（ｄｉｓｔａｎｃｅ ｖｉｓｕａｌ ａｃｕｉｔｙ）の改善、及び／または光受容体喪失の速度の減少を含む、例えば、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患等のＩＭＤの症状を低減、減少、または緩和することを可能にする。いくつかの実施形態では、方法は、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の約２０／２００超までの改善をもたらす。
【0021】
本開示の実施形態による組成物及び方法は、実質的に非免疫原性であり、いかなる管理不能な副作用も引き起こさず、場合によっては、単回投与を介して効果的に送達され得る。光受容体喪失の防止またはその速度の減少は、堅牢かつ恒久的であり得る。記載の組成物及び方法は、網膜（例えば、ＲＰＥ及び／またはＢｒｕｃｈ膜）におけるリポフスチン蓄積を低下または防止し、網膜色素上皮（ＲＰＥ）破片の形成を低減または防止し、患者の遠見視力を改善する。
【0022】
本開示のいくつかの態様では、本開示の実施形態による組成物を含む単離された細胞が提供される。
【0023】
いくつかの実施形態では、方法は、治療の欠如と比較して、遠見視力の改善及び／または光受容体喪失の速度の減少を提供する。方法はまた、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の約２０／２００超までの改善をもたらし得る。いくつかの実施形態では、方法は、眼底自発蛍光（ＦＡＦ）またはスペクトルドメイン光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）によって測定した、網膜または中心窩の形状の改善をもたらす。同様に、他の撮像技術も使用され得る。
【0024】
記載の方法は、患者の視力を改善する。いくつかの実施形態では、方法は、患者における、変視症（ｗａｖｙ ｖｉｓｉｏｎ）、盲点、かすみ、奥行き知覚の喪失、まぶしさへの感受性、色覚障害、及び薄暗い照明への適応困難（暗所適応の遅延）のうちの１つ以上の低減または防止をもたらす。
【0025】
いくつかの実施形態では、本開示による方法は、ステロイド治療の必要性を排除する。加えてまたはあるいは、方法は、ソラプラザン、イソトレチノイン、ドベシラート、４－メチルピラゾール、ＡＬＫ－００１９（Ｃ２０重水素化ビタミンＡ）、フェンレチニド（ビタミンＡの合成形態）、ＬＢＳ－５００、Ａ１１２０、エミクススタット、フェノフィブラート、アバシンカプタドペゴル、及び他の治療剤の必要性を排除し得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、本組成物及び方法はソラプラザン、イソトレチノイン、ドベシラート、４－メチルピラゾール、ＡＬＫ－００１９（Ｃ２０重水素化ビタミンＡ）、フェンレチニド（ビタミンＡの合成形態）、ＬＢＳ－５００、Ａ１１２０、エミクススタット、フェノフィブラート、アバシンカプタドペゴル、及び他の治療剤から選択される１つ以上の追加の治療剤の使用を伴う。
【0026】
本発明の他の態様及びある特定の実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】網膜細胞株におけるトランスフェクション、転移有効性、及び発現研究で使用することができるベクターの概略図である。
【図2】本開示のいくつかの実施形態で使用される脂質ナノ粒子構造を示す。
【図3】変動するリポフェクション試薬、ならびに本開示のＭＬＴトランスポザーゼ１（Ｎ１２５Ｋ変異を有するＭＬＴ）またはＭＬＴトランスポザーゼ２（Ｓ８Ｐ／Ｃ１３Ｒ変異を有するＭＬＴ）のいずれかとのトランスフェクションの２４時間後の６６１Ｗマウス光受容体細胞の、トランスフェクトされていない細胞と比較した、ＧＦＰ発現を示す。上段は、トランスフェクトされていない６６１Ｗマウス光受容体細胞、Ｌ３（リポフェクタミン３０００）及びＭＬＴ１を含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞、ならびにＬ３及びＭＬＴ２を含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞を示し、中段は、トランスフェクトされていない６６１Ｗマウス光受容体細胞、ＬＴＸ（リポフェクタミンＬＴＸ＆ＰＬＵＳ）及びＭＬＴ１を含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞、ならびにＬＴＸ及びＭＬＴ２を含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞を示し、下段は、トランスフェクトされていない６６１Ｗマウス光受容体細胞、ＭＡＸ（リポフェクタミンメッセンジャーＭＡＸ）及びＭＬＴ１を含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞、ならびにＭＡＸ及びＭＬＴ２を含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞を示す。
【図4】１５日間にわたる４回の継代後のマウス光受容体細胞株６６１Ｗにおける転移によるドナーＤＮＡ（ＧＦＰ）の安定的な組み込みを示す。段は、３、６、９、１２、及び１５日目の結果を示し、列は、トランスフェクトされていない細胞、ドナーＤＮＡのみでトランスフェクトされた細胞、ドナーＤＮＡ及びＭＬＴ１でトランスフェクトされた細胞、ならびにドナーＤＮＡ及びＭＬＴ２でトランスフェクトされた細胞の結果を示す。
【図5】１５日目のマウス光受容体細胞株６６１Ｗにおける転移によるドナーＤＮＡ（ＧＦＰ）の安定的な組み込みのＦＡＣＳ分析の結果を示す棒グラフである。ＧＦＰ発現のパーセント（％）は、トランスフェクトされていない細胞、ドナーＤＮＡのみでトランスフェクトされた細胞（「＋ＧＦＰのみ」）、ドナーＤＮＡ及びＭＬＴ１でトランスフェクトされた細胞（「ＭＬＴ１＋ＧＦＰ」）、ならびにドナーＤＮＡ及びＭＬＴ２でトランスフェクトされた細胞（「ＭＬＴ２＋ＧＦＰ」）について示されている。
【図6】トランスフェクションの２４時間後のＡＲＰＥ－１９細胞におけるＧＦＰの発現を示す。上段は、トランスフェクトされていないＡＲＰＥ－１９細胞、Ｌ３のみを含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞、Ｌ３及びＭＬＴ１を含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞、ならびにＬ３及びＭＬＴ２を含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞を示し、中段は、トランスフェクトされていないＡＲＰＥ－１９細胞、ＬＴＸのみを含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞、ＬＴＸ及びＭＬＴ１を含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞、ならびにＬＴＸ及びＭＬＴ２を含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞を示し、下段は、トランスフェクトされていないＡＲＰＥ－１９細胞、ＭＡＸのみを含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞、ＭＡＸ及びＭＬＴ１を含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞、ならびにＭＡＸ及びＭＬＴ２を含むトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞を示す。
【図7】トランスフェクションの２４時間後の、ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２の目視可能なＧＦＰ発現のより高い解像度画像を示す。
【図8】ＭＬＴトランスポザーゼ２（ＭＬＴ２）を用いた、光受容体細胞株ＡＲＰＥ１９におけるドナーＤＮＡ（ＧＦＰ）の安定的な組み込みを示す。段は、４、８、１２、及び１５日目の結果を示し、列は、ドナーＤＮＡのみでトランスフェクトされた細胞、ならびにドナーＤＮＡ及びＭＬＴ２でトランスフェクトされた細胞の結果を示す。
【図9】４世代の細胞分裂後のＡＲＰＥ１９細胞株における転移によるドナーＤＮＡ（ＧＦＰ）の安定的な組み込みのＦＡＣＳ分析の結果を示す棒グラフである。ＧＦＰ発現のパーセント（％）は、トランスフェクトされていない細胞、ドナーＤＮＡのみでトランスフェクトされた細胞（「＋ＧＦＰのみ」）、ドナーＤＮＡ及びＭＬＴ１でトランスフェクトされた細胞（「ＭＬＴ１＋ＧＦＰ」）、ならびにドナーＤＮＡ及びＭＬＴ２でトランスフェクトされた細胞（「ＭＬＴ２＋ＧＦＰ」）について示されている。
【図16】本開示のいくつかの実施形態による、ＤＮＡドナー及びＲＮＡヘルパーを使用した、６６１Ｗマウス光受容体細胞及び網膜上皮（ＡＲＰＥ１９）細胞の転移の有効性を評価する実験の設計を示す。
【図17】トランスフェクションで使用したＭＬＴトランスポザーゼを含む（「＋ＭＬＴ」）かまたは含まない（「－ＭＬＴ」）、網膜下注射の２１日後に撮影した、マウスの左眼及び右眼（それぞれ上段及び下段）の画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【0028】
本発明は、患者における光受容体喪失を防止するか、またはその速度を減少させるために、非ウイルス性の、カプシドを含まない遺伝子療法方法及び組成物を使用することができるという発見に部分的に基づいている。本開示による非ウイルス遺伝子療法方法は、遺伝性黄斑変性症（ＩＭＤ）に対する網膜指向性遺伝子療法での使用を見出す。いくつかの実施形態では、本方法及び組成物は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）における変異によって引き起こされるＳｔａｒｇａｒｄｔ疾患（ＳＴＧＤ）の網膜指向性遺伝子療法での使用を見出す。記載の方法及び組成物は、遺伝子導入構築物からのＡＢＣＡ４もしくは別の遺伝子またはそれらの機能的断片の、宿主ゲノムへの転移を用いる。記載の方法及び組成物は、網膜（例えば、ＲＰＥ及び／またはＢｒｕｃｈ膜、及び光受容体）におけるリポフスチン蓄積を低下または防止し、患者の遠見視力を改善する。
【0029】
ＳＴＧＤは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）における黄斑萎縮及び周辺の斑点を特徴とする。ＡＢＣＡ４遺伝子は、杆体及び錐体光受容体に見られる、具体的にはＮ－レチニリジン－ホスファチジルエタノール－アミン（Ｎ－ＲＰＥ）等のビタミンＡ中間体のＲＰＥへの輸送に関与する膜貫通タンパク質であるタンパク質（ＡＢＣＡ４タンパク質）をコードする。ＡＢＣＡ４は、光受容体細胞からのａｌｌ－トランス－レチナール（反応性ビタミンＡアルデヒド）のクリアランスを担い、ＡＢＣＡ４機能の喪失は、光受容体細胞の外側セグメント膜へのビス－レチノイド（Ｎ－ＲＰＥ等）の蓄積をもたらし、ひいてはリポフスチンの形成を引き起こす。これは、最終的には、ＲＰＥにおける高レベルのリポフスチンの蓄積（したがって、網膜の自発蛍光を増加させる）、ならびに進行するＲＰＥ喪失及び光受容体細胞喪失をもたらす。
【0030】
ＡＢＣＡ４の変異は、杆体－錐体ジストロフィー（ＳＴＧＤ疾患では錐体及び杆体が死滅する）及び網膜色素変性症（網膜における細胞の分解及び喪失）を含む、広範な表現型に関連する。例えば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１５；１３３（１０）：１１９８－１２０３を参照されたい。同様に、ＭＤの原因となる他の遺伝子における変異も同様に、患者間で異なる様々な表現型を呈する。
【0031】
上述のように、ＡＢＣＡ４を伴う遺伝子療法のためにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用することは、ＡＡＶの４．５ｋｂ～５．０ｋｂの容量を超えるＡＢＣＡ４（６．８ｋｂ）のサイズによって妨げられる。したがって、ウマ伝染性貧血レンチウイルス（ＥＩＡＶ）が、網膜下注射による遺伝子導入に使用されている。Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８；１５（１９）：１３１１－１３２０．ＡＢＣＡ４の比較的大きなサイズに対処した別のアプローチは、２つの導入遺伝子断片が宿主細胞内で組み合わさるように、遺伝子を２つのＡＡＶベクターにわたって分割することであった。Ｄｙｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１９；Ｎｏｖ；３０（１１）：１３６１－１３７０．
【0032】
本開示の組成物及び方法は、ＡＢＣＡ４または他の標的遺伝子（複数可）の変異コピーを置き換える導入遺伝子の非ウイルス送達を提供する。したがって、本開示の組成物及び方法は、患者のゲノムにおける病原性バリアントを補正し、したがって、患者における光受容体喪失を防止するか、またはその速度を減少させるための、ＡＢＣＡ４またはその機能的断片を標的とする遺伝子導入構築物を提供する。したがって、本開示のいくつかの態様では、（ａ）ＡＢＣＡ４タンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸と、（ｂ）網膜特異的プロモーターと、（ｃ）１つ以上のトランスポザーゼ認識部位及び１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）または端部配列を含む非ウイルスベクターと、を含む、遺伝子導入構築物を含む組成物が提供される。
【0033】
いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４タンパク質は、ヒトＡＢＣＡ４タンパク質、またはその機能的断片である。実施形態では、ヒトＡＢＣＡ４をコードする遺伝子は、ヒトＡＢＣＡ４である（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０００３５０）。ヒトＡＢＣＡ４をコードする核酸は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含み得る。いくつかの実施形態では、ヒトＡＢＣＡ４をコードする核酸は、配列番号２のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、ヒトＡＢＣＡ４をコードする核酸は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＡＢＣＡ４をコードする核酸は、配列番号２のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む。
【0035】
配列番号１は、以下である。
【0036】
【化1】
【0037】
実施形態では、ヒトＡＢＣＡ４は、配列番号２のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有する、コドン最適化バージョンを含むバリアントによってコードされる。配列番号２は、以下である。
【0038】
【化2-1】
【0039】
【化2-2】
【0040】
【化2-3】
【0041】
いくつかの実施形態では、本開示は、二重トランスポゾン及びトランスポザーゼ系を介した遺伝子導入のための組成物及び方法に関する。転移可能な因子は、天然に普遍的に見出される非ウイルス遺伝子送達ビヒクルである。トランスポゾンに基づくベクターは、細胞への導入遺伝子構築物の安定的なゲノム組み込み及び長期間の発現の能力を有する。総じて、二重トランスポゾン及びトランスポザーゼ系は、目的の導入遺伝子（複数可）を含有するトランスポゾンＤＮＡが、反復性配列部位でトランスポザーゼ酵素によって染色体ＤＮＡに組み込まれることによる、切断及び貼り付け機序を介して機能する。
【0042】
当該技術分野において理解されるであろうように、トランスポゾンは、多くの場合、トランスポゾンの中央の導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレームと、トランスポゾンの５’及び３’末端の末端反復配列と、を含む。翻訳されたトランスポザーゼは、トランスポゾンの５’及び３’配列に結合し、転移機能を実行する。
【0043】
実施形態では、トランスポゾンは、それら自体のコピーを他のポリヌクレオチドに挿入することが可能なポリヌクレオチドを指すために使用される、転移可能な因子と同義に使用される。トランスポゾンという用語は、当業者に周知であり、配列編成、例えば、各末端での短い逆位反復（ＩＴＲ）、及び／または末端での直接的に繰り返される長い末端反復（ＬＴＲ）に基づいて区別され得る部類のトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のトランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃ様因子、例えば、ＴＴＡＡ配列を認識し、トランスポゾンの除去後に挿入部位の配列を元のＴＴＡＡ配列に戻す、痕跡が残らない切除を特徴とするトランスポゾン因子として説明することができる。
【0044】
いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、トランスポザーゼによって認識されるＩＴＲに隣接する、トランスポゾン媒介性遺伝子導入系（例えば、ＤＮＡプラスミドトランスポゾン系）である。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ＡＢＣＡ４遺伝子をコードする核酸に隣接する。非ウイルスベクターは、トランスポザーゼによって認識される２つの末端に隣接する異種ポリヌクレオチド（導入遺伝子とも称される）を含む、トランスポゾンに基づくベクター系として動作する。トランスポゾン末端は、正確または不正確な反復であってもよく、互いに対して方向が逆のＩＴＲを含む。トランスポザーゼは、トランスポゾン末端に作用して、それによって、トランスポゾンを（トランスポゾン末端とともに）ベクターから「切断」し、トランスポゾンを宿主ゲノムに「貼り付ける」かまたは組み込む。実施形態では、トランスポザーゼは、ＤＮＡ発現ベクターとして、またはトランスポザーゼの長期発現がトランスジェニック細胞において生じないように、発現可能なＲＮＡもしくはタンパク質として提供される。
【0045】
実施形態では、遺伝子導入系は、トランスポゾンをコードする核酸（ＤＮＡ）であり、「ドナーＤＮＡ」と称される。実施形態では、トランスポザーゼをコードする核酸は、ヘルパーＲＮＡ（すなわち、トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡ）であり、トランスポゾンをコードする核酸は、ドナーＤＮＡ（またはＤＮＡドナートランスポゾン）である。実施形態では、ドナーＤＮＡは、プラスミドに組み込まれる。実施形態では、ドナーＤＮＡは、プラスミドである。
【0046】
「切断及び貼り付け」機序を使用する移動性因子であるＤＮＡドナートランスポゾンとしては、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を含む哺乳類（例えば、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、及びＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）の場合では２つの端部配列に隣接するドナーＤＮＡ、または昆虫（例えば、Ｔｒｉｃｈｎｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）もしくは両生類（Ｘｅｎｏｐｕｓ種）等の他の生体では逆位末端反復（ＩＴＲ）が挙げられる。ゲノムＤＮＡは、宿主のドナー部位での二本鎖切断によって切除され、ドナーＤＮＡは、この部位に組み込まれる。生物工学的に操作されたトランスポゾン及びトランスポザーゼを使用する二重系は、（１）ＴＴＡＡ等の特定のヌクレオチド配列で「切断」する活性トランスポザーゼの供給源、及び（２）トランスポザーゼによって移動される認識端部配列またはＩＴＲに隣接するＤＮＡ配列（複数可）を含む。ＤＮＡ配列の移動によって、ＤＮＡフットプリントを用いずに特定のヌクレオチド配列（すなわち、ＴＴＡＡ）に介在核酸または導入遺伝子を挿入することが可能になる。
【0047】
実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含む、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓトランスポザーゼ（ＭＬＴ、またはＭＬＴトランスポザーゼ）である。実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアント、及びＳ２Ｘを含む、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓトランスポザーゼ（ＭＬＴ、またはＭＬＴトランスポザーゼ）であり、Ｘが、任意のアミノ酸または非アミノ酸であり、任意選択的に、Ｘが、Ａ、Ｇ、または欠失である。
【0048】
実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアント、及びＳ２Ｘを含む、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓトランスポザーゼ（ＭＬＴ、またはＭＬＴトランスポザーゼ）であり、Ｘが、任意のアミノ酸または非アミノ酸であり、任意選択的に、Ｘが、ＡまたはＧであり、Ｃ末端欠失が、Ｌ５７３Ｘ及びＥ５７４Ｘから選択され、Ｘが、非アミノ酸である。実施形態では、変異は、Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａである。
【0049】
実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、変異Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａを含む配列番号１０のアミノ酸配列：
ＭＡＱＨＳＤＹＳＤＤＥＦＣＡＤＫＬＳＮＹＳＣＤＳＤＬＥＮＡＳＴＳＤＥＤＳＳＤＤＥＶＭＶＲＰＲＴＬＲＲＲＲＩＳＳＳＳＳＤＳＥＳＤＩＥＧＧＲＥＥＷＳＨＶＤＮＰＰＶＬＥＤＦＬＧＨＱＧＬＮＴＤＡＶＩＮＮＩＥＤＡＶＫＬＦＩＧＤＤＦＦＥＦＬＶＥＥＳＮＲＹＹＮＱＮＲＮＮＦＫＬＳＫＫＳＬＫＷＫＤＩＴＰＱＥＭＫＫＦＬＧＬＩＶＬＭＧＱＶＲＫＤＲＲＤＤＹＷＴＴＥＰＷＴＥＴＰＹＦＧＫＴＭＴＲＤＲＦＲＱＩＷＫＡＷＨＦＮＮＮＡＤＩＶＮＥＳＤＲＬＣＫＶＲＰＶＬＤＹＦＶＰＫＦＩＮＩＹＫＰＨＱＱＬＳＬＤＥＧＩＶＰＷＲＧＲＬＦＦＲＶＹＮＡＧＫＩＶＫＹＧＩＬＶＲＬＬＣＥＳＤＴＧＹＩＣＮＭＥＩＹＣＧＥＧＫＲＬＬＥＴＩＱＴＶＶＳＰＹＴＤＳＷＹＨＩＹＭＤＮＹＹＮＳＶＡＮＣＥＡＬＭＫＮＫＦＲＩＣＧＴＩＲＫＮＲＧＩＰＫＤＦＱＴＩＳＬＫＫＧＥＴＫＦＩＲＫＮＤＩＬＬＱＶＷＱＳＫＫＰＶＹＬＩＳＳＩＨＳＡＥＭＥＥＳＱＮＩＤＲＴＳＫＫＫＩＶＫＰＮＡＬＩＤＹＮＫＨＭＫＧＶＤＲＡＤＱＹＬＳＹＹＳＩＬＲＲＴＶＫＷＴＫＲＬＡＭＹＭＩＮＣＡＬＦＮＳＹＡＶＹＫＳＶＲＱＲＫＭＧＦＫＭＦＬＫＱＴＡＩＨＷＬＴＤＤＩＰＥＤＭＤＩＶＰＤＬＱＰＶＰＳＴＳＧＭＲＡＫＰＰＴＳＤＰＰＣＲＬＳＭＤＭＲＫＨＴＬＱＡＩＶＧＳＧＫＫＫＮＩＬＲＲＣＲＶＣＳＶＨＫＬＲＳＥＴＲＹＭＣＫＦＣＮＩＰＬＨＫＧＡＣＦＥＫＹＨＴＬＫＮＹ（配列番号１０）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＭＡＱＨＳＤＹＳＤＤＥＦＣＡＤＫＬＳＮＹＳＣＤＳＤＬＥＮＡＳＴＳＤＥＤＳＳＤＤＥＶＭＶＲＰＲＴＬＲＲＲＲＩＳＳＳＳＳＤＳＥＳＤＩＥＧＧＲＥＥＷＳＨＶＤＮＰＰＶＬＥＤＦＬＧＨＱＧＬＮＴＤＡＶＩＮＮＩＥＤＡＶＫＬＦＩＧＤＤＦＦＥＦＬＶＥＥＳＮＲＹＹＮＱＮＲＮＮＦＫＬＳＫＫＳＬＫＷＫＤＩＴＰＱＥＭＫＫＦＬＧＬＩＶＬＭＧＱＶＲＫＤＲＲＤＤＹＷＴＴＥＰＷＴＥＴＰＹＦＧＫＴＭＴＲＤＲＦＲＱＩＷＫＡＷＨＦＮＮＮＡＤＩＶＮＥＳＤＲＬＣＫＶＲＰＶＬＤＹＦＶＰＫＦＩＮＩＹＫＰＨＱＱＬＳＬＤＥＧＩＶＰＷＲＧＲＬＦＦＲＶＹＮＡＧＫＩＶＫＹＧＩＬＶＲＬＬＣＥＳＤＴＧＹＩＣＮＭＥＩＹＣＧＥＧＫＲＬＬＥＴＩＱＴＶＶＳＰＹＴＤＳＷＹＨＩＹＭＤＮＹＹＮＳＶＡＮＣＥＡＬＭＫＮＫＦＲＩＣＧＴＩＲＫＮＲＧＩＰＫＤＦＱＴＩＳＬＫＫＧＥＴＫＦＩＲＫＮＤＩＬＬＱＶＷＱＳＫＫＰＶＹＬＩＳＳＩＨＳＡＥＭＥＥＳＱＮＩＤＲＴＳＫＫＫＩＶＫＰＮＡＬＩＤＹＮＫＨＭＫＧＶＤＲＡＤＱＹＬＳＹＹＳＩＬＲＲＴＶＫＷＴＫＲＬＡＭＹＭＩＮＣＡＬＦＮＳＹＡＶＹＫＳＶＲＱＲＫＭＧＦＫＭＦＬＫＱＴＡＩＨＷＬＴＤＤＩＰＥＤＭＤＩＶＰＤＬＱＰＶＰＳＴＳＧＭＲＡＫＰＰＴＳＤＰＰＣＲＬＳＭＤＭＲＫＨＴＬＱＡＩＶＧＳＧＫＫＫＮＩＬＲＲＣＲＶＣＳＶＨＫＬＲＳＥＴＲＹＭＣＫＦＣＮＩＰＬＨＫＧＡＣＦＥＫＹＨＴＬＫＮＹ（配列番号１０）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＭＬＴトランスポザーゼは、以下のヌクレオチド配列：
ａｔｇｇｃｃｃａｇｃａｃａｇｃｇａｃｔａｃａｇｃｇａｃｇａｃｇａｇｔｔｃｔｇｔｇｃｃｇａｔａａｇｃｔｇａｇｔａａｃｔａｃａｇｃｔｇｃｇａｃａｇｃｇａｃｃｔｇｇａａａａｃｇｃｃａｇｃａｃａｔｃｃｇａｃｇａｇｇａｃａｇｃｔｃｔｇａｃｇａｃｇａｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｃｇｇｃｃｃａｇａａｃｃｃｔｇａｇａｃｇｇａｇａａｇａａｔｃａｇｃａｇｃｔｃｔａｇｃａｇｃｇａｃｔｃｔｇａａｔｃｃｇａｃａｔｃｇａｇｇｇｃｇｇｃｃｇｇｇａａｇａｇｔｇｇａｇｃｃａｃｇｔｇｇａｃａａｃｃｃｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｇａａｇａｔｔｔｔｃｔｇｇｇｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａａｃａｃｃｇａｃｇｃｃｇｔｇａｔｃａａｃａａｃａｔｃｇａｇｇａｔｇｃｃｇｔｇａａｇｃｔｇｔｔｃａｔａｇｇａｇａｔｇａｔｔｔｃｔｔｔｇａｇｔｔｃｃｔｇｇｔｃｇａｇｇａａｔｃｃａａｃｃｇｃｔａｔｔａｃａａｃｃａｇａａｔａｇａａａｃａａｃｔｔｃａａｇｃｔｇａｇｃａａｇａａａａｇｃｃｔｇａａｇｔｇｇａａｇｇａｃａｔｃａｃｃｃｃｔｃａｇｇａｇａｔｇａａａａａｇｔｔｃｃｔｇｇｇａｃｔｇａｔｃｇｔｔｃｔｇａｔｇｇｇａｃａｇｇｔｇｃｇｇａａｇｇａｃａｇａａｇｇｇａｔｇａｔｔａｃｔｇｇａｃａａｃｃｇａａｃｃｔｔｇｇａｃｃｇａｇａｃｃｃｃｔｔａｃｔｔｔｇｇｃａａｇａｃｃａｔｇａｃｃａｇａｇａｃａｇａｔｔｃａｇａｃａｇａｔｃｔｇｇａａａｇｃｃｔｇｇｃａｃｔｔｃａａｃａａｃａａｔｇｃｔｇａｔａｔｃｇｔｇａａｃｇａｇｔｃｔｇａｔａｇａｃｔｇｔｇｔａａａｇｔｇｃｇｇｃｃａｇｔｇｔｔｇｇａｔｔａｃｔｔｃｇｔｇｃｃｔａａｇｔｔｃａｔｃａａｃａｔｃｔａｔａａｇｃｃｔｃａｃｃａｇｃａｇｃｔｇａｇｃｃｔｇｇａｔｇａａｇｇｃａｔｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇｃｇｇｇｇｃａｇａｃｔｇｔｔｃｔｔｃａｇａｇｔｇｔａｃａａｔｇｃｔｇｇｃａａｇａｔｃｇｔｃａａａｔａｃｇｇｃａｔｃｃｔｇｇｔｇｃｇｃｃｔｔｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇｃｇａｔａｃａｇｇｃｔａｃａｔｃｔｇｔａａｔａｔｇｇａａａｔｃｔａｃｔｇｃｇｇｃｇａｇｇｇｃａａａａｇａｃｔｇｃｔｇｇａａａｃｃａｔｃｃａｇａｃｃｇｔｃｇｔｔｔｃｃｃｃｔｔａｔａｃｃｇａｃａｇｃｔｇｇｔａｃｃａｃａｔｃｔａｃａｔｇｇａｃａａｃｔａｃｔａｃａａｔｔｃｔｇｔｇｇｃｃａａｃｔｇｃｇａｇｇｃｃｃｔｇａｔｇａａｇａａｃａａｇｔｔｔａｇａａｔｃｔｇｃｇｇｃａｃａａｔｃａｇａａａａａａｃａｇａｇｇｃａｔｃｃｃｔａａｇｇａｃｔｔｃｃａｇａｃｃａｔｃｔｃｔｃｔｇａａｇａａｇｇｇｃｇａａａｃｃａａｇｔｔｃａｔｃａｇａａａｇａａｃｇａｃａｔｃｃｔｇｃｔｃｃａａｇｔｇｔｇｇｃａｇｔｃｃａａｇａａａｃｃｃｇｔｇｔａｃｃｔｇａｔｃａｇｃａｇｃａｔｃｃａｔａｇｃｇｃｃｇａｇａｔｇｇａａｇａａａｇｃｃａｇａａｃａｔｃｇａｃａｇａａｃａａｇｃａａｇａａｇａａｇａｔｃｇｔｇａａｇｃｃｃａａｔｇｃｔｃｔｇａｔｃｇａｃｔａｃａａｃａａｇｃａｃａｔｇａａａｇｇｃｇｔｇｇａｃｃｇｇｇｃｃｇａｃｃａｇｔａｃｃｔｇｔｃｔｔａｔｔａｃｔｃｔａｔｃｃｔｇａｇａａｇａａｃａｇｔｇａａａｔｇｇａｃｃａａｇａｇａｃｔｇｇｃｃａｔｇｔａｃａｔｇａｔｃａａｔｔｇｃｇｃｃｃｔｇｔｔｃａａｃａｇｃｔａｃｇｃｃｇｔｇｔａｃａａｇｔｃｃｇｔｇｃｇａｃａａａｇａａａａａｔｇｇｇａｔｔｃａａｇａｔｇｔｔｃｃｔｇａａｇｃａｇａｃａｇｃｃａｔｃｃａｃｔｇｇｃｔｇａｃａｇａｃｇａｃａｔｔｃｃｔｇａｇｇａｃａｔｇｇａｃａｔｔｇｔｇｃｃａｇａｔｃｔｇｃａａｃｃｔｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｃｔｇｇｔａｔｇａｇａｇｃｔａａｇｃｃｔｃｃｃａｃｃａｇｃｇａｔｃｃｔｃｃａｔｇｔａｇａｃｔｇａｇｃａｔｇｇａｃａｔｇｃｇｇａａｇｃａｃａｃｃｃｔｇｃａｇｇｃｃａｔｃｇｔｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａａｇａａｇａａｇａａｃａｔｃｃｔｔａｇａｃｇｇｔｇｃａｇｇｇｔｇｔｇｃａｇｃｇｔｇｃａｃａａｇｃｔｇｃｇｇａｇｃｇａｇａｃｔｃｇｇｔａｃａｔｇｔｇｃａａｇｔｔｔｔｇｃａａｃａｔｔｃｃｃｃｔｇｃａｃａａｇｇｇａｇｃｃｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｔａｃｃａｃａｃｃｃｔｇａａｇａａｔｔａｃｔａｇ（配列番号１１）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
ａｔｇｇｃｃｃａｇｃａｃａｇｃｇａｃｔａｃａｇｃｇａｃｇａｃｇａｇｔｔｃｔｇｔｇｃｃｇａｔａａｇｃｔｇａｇｔａａｃｔａｃａｇｃｔｇｃｇａｃａｇｃｇａｃｃｔｇｇａａａａｃｇｃｃａｇｃａｃａｔｃｃｇａｃｇａｇｇａｃａｇｃｔｃｔｇａｃｇａｃｇａｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｃｇｇｃｃｃａｇａａｃｃｃｔｇａｇａｃｇｇａｇａａｇａａｔｃａｇｃａｇｃｔｃｔａｇｃａｇｃｇａｃｔｃｔｇａａｔｃｃｇａｃａｔｃｇａｇｇｇｃｇｇｃｃｇｇｇａａｇａｇｔｇｇａｇｃｃａｃｇｔｇｇａｃａａｃｃｃｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｇａａｇａｔｔｔｔｃｔｇｇｇｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａａｃａｃｃｇａｃｇｃｃｇｔｇａｔｃａａｃａａｃａｔｃｇａｇｇａｔｇｃｃｇｔｇａａｇｃｔｇｔｔｃａｔａｇｇａｇａｔｇａｔｔｔｃｔｔｔｇａｇｔｔｃｃｔｇｇｔｃｇａｇｇａａｔｃｃａａｃｃｇｃｔａｔｔａｃａａｃｃａｇａａｔａｇａａａｃａａｃｔｔｃａａｇｃｔｇａｇｃａａｇａａａａｇｃｃｔｇａａｇｔｇｇａａｇｇａｃａｔｃａｃｃｃｃｔｃａｇｇａｇａｔｇａａａａａｇｔｔｃｃｔｇｇｇａｃｔｇａｔｃｇｔｔｃｔｇａｔｇｇｇａｃａｇｇｔｇｃｇｇａａｇｇａｃａｇａａｇｇｇａｔｇａｔｔａｃｔｇｇａｃａａｃｃｇａａｃｃｔｔｇｇａｃｃｇａｇａｃｃｃｃｔｔａｃｔｔｔｇｇｃａａｇａｃｃａｔｇａｃｃａｇａｇａｃａｇａｔｔｃａｇａｃａｇａｔｃｔｇｇａａａｇｃｃｔｇｇｃａｃｔｔｃａａｃａａｃａａｔｇｃｔｇａｔａｔｃｇｔｇａａｃｇａｇｔｃｔｇａｔａｇａｃｔｇｔｇｔａａａｇｔｇｃｇｇｃｃａｇｔｇｔｔｇｇａｔｔａｃｔｔｃｇｔｇｃｃｔａａｇｔｔｃａｔｃａａｃａｔｃｔａｔａａｇｃｃｔｃａｃｃａｇｃａｇｃｔｇａｇｃｃｔｇｇａｔｇａａｇｇｃａｔｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇｃｇｇｇｇｃａｇａｃｔｇｔｔｃｔｔｃａｇａｇｔｇｔａｃａａｔｇｃｔｇｇｃａａｇａｔｃｇｔｃａａａｔａｃｇｇｃａｔｃｃｔｇｇｔｇｃｇｃｃｔｔｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇｃｇａｔａｃａｇｇｃｔａｃａｔｃｔｇｔａａｔａｔｇｇａａａｔｃｔａｃｔｇｃｇｇｃｇａｇｇｇｃａａａａｇａｃｔｇｃｔｇｇａａａｃｃａｔｃｃａｇａｃｃｇｔｃｇｔｔｔｃｃｃｃｔｔａｔａｃｃｇａｃａｇｃｔｇｇｔａｃｃａｃａｔｃｔａｃａｔｇｇａｃａａｃｔａｃｔａｃａａｔｔｃｔｇｔｇｇｃｃａａｃｔｇｃｇａｇｇｃｃｃｔｇａｔｇａａｇａａｃａａｇｔｔｔａｇａａｔｃｔｇｃｇｇｃａｃａａｔｃａｇａａａａａａｃａｇａｇｇｃａｔｃｃｃｔａａｇｇａｃｔｔｃｃａｇａｃｃａｔｃｔｃｔｃｔｇａａｇａａｇｇｇｃｇａａａｃｃａａｇｔｔｃａｔｃａｇａａａｇａａｃｇａｃａｔｃｃｔｇｃｔｃｃａａｇｔｇｔｇｇｃａｇｔｃｃａａｇａａａｃｃｃｇｔｇｔａｃｃｔｇａｔｃａｇｃａｇｃａｔｃｃａｔａｇｃｇｃｃｇａｇａｔｇｇａａｇａａａｇｃｃａｇａａｃａｔｃｇａｃａｇａａｃａａｇｃａａｇａａｇａａｇａｔｃｇｔｇａａｇｃｃｃａａｔｇｃｔｃｔｇａｔｃｇａｃｔａｃａａｃａａｇｃａｃａｔｇａａａｇｇｃｇｔｇｇａｃｃｇｇｇｃｃｇａｃｃａｇｔａｃｃｔｇｔｃｔｔａｔｔａｃｔｃｔａｔｃｃｔｇａｇａａｇａａｃａｇｔｇａａａｔｇｇａｃｃａａｇａｇａｃｔｇｇｃｃａｔｇｔａｃａｔｇａｔｃａａｔｔｇｃｇｃｃｃｔｇｔｔｃａａｃａｇｃｔａｃｇｃｃｇｔｇｔａｃａａｇｔｃｃｇｔｇｃｇａｃａａａｇａａａａａｔｇｇｇａｔｔｃａａｇａｔｇｔｔｃｃｔｇａａｇｃａｇａｃａｇｃｃａｔｃｃａｃｔｇｇｃｔｇａｃａｇａｃｇａｃａｔｔｃｃｔｇａｇｇａｃａｔｇｇａｃａｔｔｇｔｇｃｃａｇａｔｃｔｇｃａａｃｃｔｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｃｔｇｇｔａｔｇａｇａｇｃｔａａｇｃｃｔｃｃｃａｃｃａｇｃｇａｔｃｃｔｃｃａｔｇｔａｇａｃｔｇａｇｃａｔｇｇａｃａｔｇｃｇｇａａｇｃａｃａｃｃｃｔｇｃａｇｇｃｃａｔｃｇｔｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａａｇａａｇａａｇａａｃａｔｃｃｔｔａｇａｃｇｇｔｇｃａｇｇｇｔｇｔｇｃａｇｃｇｔｇｃａｃａａｇｃｔｇｃｇｇａｇｃｇａｇａｃｔｃｇｇｔａｃａｔｇｔｇｃａａｇｔｔｔｔｇｃａａｃａｔｔｃｃｃｃｔｇｃａｃａａｇｇｇａｇｃｃｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｔａｃｃａｃａｃｃｃｔｇａａｇａａｔｔａｃｔａｇ（配列番号１１）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【0051】
いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼ（例えば、配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＭＬＴトランスポザーゼ）は、ＭＬＴトランスポザーゼに高活性を付与する１つ以上の高活性変異を含む。実施形態では、高活性変異は、配列番号１０のアミノ酸配列またはその機能的等価物と比較して、Ｓ８Ｘ、Ｃ１３Ｘ、及びＮ１２５Ｘ変異のうちの１つ以上であり、Ｘが、任意選択的に、任意のアミノ酸または非アミノ酸であり、任意選択的に、Ｘが、Ｐ、Ｒ、またはＫである。実施形態では、変異は、Ｓ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋである。いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異を有する。いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｎ１２５Ｋ変異を有する。いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋ変異の３つ全てを有する。
【0052】
いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号１０のアミノ酸配列と比較して、Ｎ１２５Ｋの変異を有するアミノ酸（配列番号１３）に対応するヌクレオチド配列（配列番号１２）
【0053】
【化3】
【0054】
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列（Ｎ１２５Ｋ変異に対応するコドンは下線が引かれ、太字である）。
【0055】
【化4】
【0056】
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列（Ｎ１２５Ｋ変異に対応するアミノ酸は下線が引かれ、太字である）によってコードされる。
【0057】
いくつかの実施形態では、配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＭＬＴトランスポザーゼは、ＭＬＴトランスポザーゼ１（またはＭＬＴ１）と称される。
【0058】
いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号１０のアミノ酸配列またはその機能的等価物と比較して、Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒの変異を有するアミノ酸（配列番号１５）に対応するヌクレオチド配列（配列番号１４）（配列番号１４及び配列番号１５が、以下のとおりである）：
【0059】
【化5】
【0060】
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列（Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異に対応するコドンは、下線が引かれ、太字である）。
【0061】
【化6】
【0062】
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列（Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異に対応するアミノ酸は下線が引かれ、太字である）によってコードされる。
【0063】
いくつかの実施形態では、配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＭＬＴトランスポザーゼは、ＭＬＴトランスポザーゼ２（またはＭＬＴ２）と称される。
【0064】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｃ１／マリナートランスポゾン（ｍａｒｉｎｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）からのものである。例えば、Ｐｌａｓｔｅｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９９；１５（８）：３２６－３２を参照されたい。
【0065】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系（例えば、Ｃｅｌｌ．１９９７；９１：５０１－５１０を参照されたい）またはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系（例えば、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５Ｓｅｐ；３３（９）：５２５－３３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｔｅｃｈ．２０１５．０６．００９．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｊｕｌ ２３を参照されたい）からのものである。
【0066】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＬＥＡＰ－ＩＮ１型またはＬＥＡＰ－ＩＮトランスポゾン系（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０１８ Ｏｃｔ；１３（１０）：ｅ１７００７４８．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｏｔ．２０１７００７４８．Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｊｕｎ １１）からのものである。
【0067】
いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、ＬＥＡＰ－ＩＮ１型のＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼ（ＡＴＵＭ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）を含む。ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼ系は、トランスポザーゼ（例えば、トランスポザーゼｍＲＮＡ）と、トランスポゾンの同族逆位末端反復（ＩＴＲ）及び転移認識モチーフ（ＴＴＡＴ）に隣接する、１つ以上の目的の遺伝子（トランスポゾン）、選択マーカー、調節因子等を含有するベクターと、を含む。ベクターＤＮＡ及びトランスポザーゼｍＲＮＡの共トランスフェクションの際に、一過性に発現した酵素は、宿主細胞のゲノム全体にわたる１つ以上の部位で、トランスポゾンカセットの単一コピー（ＩＴＲ間の全ての配列）の高効率かつ正確な組み込みを触媒する。Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｗｈｉｔｅ ＳＪ，Ｃａｎｔｓｉｌｉｅｒｉｓ Ｓ，ｅｄｓ：１８５－１９６．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）：２０１７．ｐｐ．１８５－１９６．ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼは、主にオープンクロマチンセグメントにおいて、複数のゲノム遺伝子座における単一コピーの組み込みを含む、様々な有利な特徴を有する安定的な導入遺伝子組み込み物を生成し、ペイロード制限がないので、複数の独立した転写単位を単一構築物から発現させることができ、組み込まれた導入遺伝子は、それらの構造的及び機能的完全性を維持し、導入遺伝子完全性の維持は、全ての組換え細胞における所望の鎖比を確保する。
【0068】
いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４は、導入遺伝子（例えば、ＡＢＣＡ４またはその機能的断片）の全体的な発現レベル及び細胞特異性に影響を及ぼすことができるプロモーターに動作可能に結合される。
【0069】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（ニワトリβ－アクチンプロモーター及びウサギベータ－グロビンスプライスアクセプターに融合されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー）（１７３２ｂｐ）であり、これは、インビボ及びインビトロでＲＰＥ及び視覚受容体レベルの両方で発現する。いくつかの実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、以下のヌクレオチド配列（配列番号１６）：
【0070】
【化7】
【0071】
またはそれに対して少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、任意選択的に、配列番号１６の核酸配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、及びウサギベータ－グロビンスプライスアクセプター部位（ＣＡＧ）である。
【0073】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、組織特異的、すなわち、網膜特異的プロモーターである。トランスポザーゼがＤＮＡ配列をコードするトランスポザーゼである実施形態では、そのようなＤＮＡ配列はまた、プロモーターに動作可能に連結される。組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター等を含む多様なプロモーターが使用され得る。
【0074】
いくつかの実施形態では、網膜特異的プロモーターは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）プロモーターであり、ＲＰＥ６５（網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質遺伝子）、ＩＲＢＰ（光受容体間レチノイド結合タンパク質）、またはＶＭＤ２（卵黄様黄斑ジストロフィー２）プロモーターであり得る。
【0075】
ＲＰＥ６５、ＩＲＢＰ、及びＶＭＤ２プロモーターは、例えば、Ａｇｕｉｒｒｅ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１７；５８（１２）：５３９９－５４１１．ｄｏｉ：１０．１１６７／ｉｏｖｓ．１７－２２９７８に記載されている。いくつかの実施形態で使用され得るＲＰＥ６５プロモーターの例は、以下：
【0076】
【化8】
【0077】
またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントの機能的断片である。
【0078】
ヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）プロモーターは、進行性変性症から光受容体を救出することが実証されている。ａｌ－Ｕｂａｉｄｉ＆Ｂａｅｈｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２；１１９：１６８１－１６８７．いくつかの実施形態で使用され得る（Ｂｏｂｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：１２８９－１２９４から適応させた）ＩＲＢＰプロモーター（１３２５ｂｐ）の例は、以下：
【0079】
【化9】
【0080】
またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントの機能的断片である。
【0081】
ヒトＶＭＤ２プロモーターは、（イヌにおいて）単回網膜下注射後、インビボでＲＰＥ細胞への導入遺伝子発現を特異的かつ排他的に標的とすることが示された。Ｇｕｚｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ｖｏｌ．８，１０ ｅ７５６６６．１５ Ｏｃｔ．２０１３，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７５６６６を参照されたい。いくつかの実施形態で使用され得る、ＢＥＳＴ１遺伝子の上流領域であるＶＭＤ２プロモーター配列（６２４ｂｐ）の例（Ｅｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（１８）：１９０６４－１９０７３を参照されたい）は、以下：
【0082】
【化10】
【0083】
またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントの機能的断片である。
【0084】
いくつかの実施形態では、網膜特異的プロモーターは、任意選択的に、β－ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、ロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）、ＣＡＲ（錐体アレスチン）、網膜色素変性症１（ＲＰ１）、及びＬ－オプシンから選択される、光受容体プロモーターである。ＰＤＥ及びＲＰ１プロモーター、ならびにロドプシン（Ｒｈｏ）プロモーターは、インビトロで光受容体特異的発現を駆動することが示された。Ｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１５，Ｓｕｐｐｌ．１，Ｓ２５８，Ｍａｙ ０１，２００７．いくつかの実施形態で使用され得るＰＤＥプロモーター（２００ｂｐ）の例（例えば、Ｄｉ Ｐｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７；２５（１９）：３８６３－３８６７に記載の）は、以下：
【0085】
【化11】
【0086】
またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントの機能的断片である。
【0087】
ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）遺伝子プロモーターは、杆体及び錐体光受容体に対して活性かつ特異的であることが示され、その小さなサイズ及び錐体における実証された活性の理由によって、杆体及び錐体を標的とする体細胞遺伝子導入及び遺伝子療法のためのプロモーターの選択肢である。Ｋｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００７；ｖｏｌ．４８：３９５４－３９６１．いくつかの実施形態で使用され得るＧＲＫ１プロモーター（２９５ｂｐ）の例（Ｋｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００７、ＭｃＤｏｕｇａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１９；１３：３８０－３８９．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１９ Ｍａｒ ２８を参照されたい）は、以下：
【0088】
【化12】
【0089】
またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントの機能的断片である。
【0090】
ＣＡＲプロモーターはまた、網膜における強い発現を駆動することが示された。Ｄｙｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２０１４；８０１：６９５－７０１．いくつかの実施形態では、ＣＡＲプロモーター（２０２６ｂｐ）（ＭｃＤｏｕｇａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１９；１３：３８０－３８９．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１９ Ｍａｒ ２８を参照されたい）は、以下：
【0091】
【化13】
【0092】
またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントの機能的断片である。
【0093】
ヒトＬ－オプシンプロモーターは、マウス光受容体における高レベルのＧＦＰ発現を導くことが示された。Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１６；２７（１）：７２－８２．いくつかの実施形態では、Ｌ－オプシンプロモーター（１７２６ｂｐ）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ．２００８ Ｆｅｂ；４８（３）：３３２－８を参照されたい）は、以下：
【0094】
【化14】
【0095】
またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントの機能的断片である。
【0096】
実施形態では、網膜特異的プロモーターは、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５の核酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含むＲＰＥプロモーターである。
【0097】
実施形態では、網膜特異的プロモーターは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９の核酸配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントの機能的断片を含む、光受容体プロモーターである。
【0098】
実施形態では、本非ウイルスベクターは、トランスポゾンの５’及び３’末端に少なくとも１対の逆位末端反復を含み得る。実施形態では、逆位末端反復は、ベクターの対向する末端に位置する相補的配列と組み合わせて使用される場合、ヘアピン構造を形成することができる、ベクターの一端に位置する配列である。一対の逆位末端反復は、本開示の非ウイルスベクターのトランスポゾンの転移活性に関与し、具体的には、ＤＮＡ付加または除去及び目的のＤＮＡの切除に関与する。一実施形態では、少なくとも一対の逆位末端反復は、プラスミドにおける転移活性に必要な最小配列であると思われる。別の実施形態では、本開示のベクターは、少なくとも２、３、または４対の逆位末端反復を含み得る。当業者によって理解されるであろうように、クローニングの容易さを促進にするのに必要な末端配列は、可能な限り短くてもよく、したがって、逆位反復を可能な限り少なく含有してもよい。したがって、一実施形態では、本開示のベクターは、１対以下、２対以下、３対以下、または４対以下の逆位末端反復を含み得る。一実施形態では、本開示のベクターは、１つの逆位末端反復のみを含み得る。
【0099】
実施形態では、本発明の逆位末端反復は、完璧な逆位末端反復（または同義に「完璧な逆位反復」と称される）または不完全な逆位末端反復（または同義に「不完全な逆位反復」と称される）のいずれかを形成し得る。本明細書で使用される場合、「完璧な逆位反復」という用語は、反対方向に配置された２つの同一のＤＮＡ配列を指す。対照的に、「不完全な逆位反復」という用語は、それらがいくつかのミスマッチを含有することを除いて、互いに同様である２つのＤＮＡ配列を指す。これらの反復（すなわち、完璧な逆位反復及び不完全な逆位反復の両方）は、トランスポザーゼの結合部位である。
【0100】
いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターのＩＴＲは、任意選択的に、ＴＴＡＡ反復性配列を含むｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンのものであり、及び／またはＩＴＲは、ＡＢＣＡ４に隣接する。ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、「切断及び貼り付け」機序を通じて転移し、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＴＴＡＡ反復性配列を含み得る。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは、遺伝子組換えのために頻繁に使用されるトランスポゾン系であり、実際の転移事象中にＤＮＡ合成を必要としない。ｐｉｇｇｙＢａｃ因子は、トランスポザーゼによってドナー染色体から切断され得、継代ドナーＤＮＡは、ＤＮＡリガーゼと再結合することができる。Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６；５（１）：１２０－１２５．ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは、正確な切除、すなわち、配列を組み込み前の状態に戻すことを示す。Ｙｕｓａ．ｐｉｇｇｙＢａｃ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ．２０１５ Ａｐｒ；３（２）．いくつかの実施形態では、遺伝子導入構築物は、Ｓｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼを含む。Ｂａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ２０１６；１２８（２２）：２１６７を参照されたい。
【0101】
いくつかの実施形態では、他の非ウイルス遺伝子導入ツール、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系等が使用され得る。例えば、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１１；２０（Ｒ１），Ｒ１４－Ｒ２０を参照されたい。
【0102】
いくつかの実施形態では、トランスポゾン系の配列は、哺乳類系において改善されたｍＲＮＡ安定性及びタンパク質発現を提供するようにコドン最適化され得る。
【0103】
様々な実施形態では、遺伝子導入構築物は、核酸構築物、プラスミド、またはベクター等の任意の好適な遺伝子構築物であり得る。様々な実施形態では、遺伝子導入構築物は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子導入構築物は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子導入は、ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を有し得る。
【0104】
実施形態では、本核酸は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの類似体もしくは誘導体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドの重合体形態を含む。実施形態では、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡ、ならびにＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドが提供される。実施形態では、メチル化またはキャップされたポリヌクレオチド等の転写活性化ポリヌクレオチドが提供される。実施形態では、本組成物は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡである。
【0105】
実施形態では、本非ウイルスベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、制御配列に操作可能に連結されている線状または環状のＤＮＡ分子であり、制御配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を提供する。実施形態では、非ウイルスベクターは、プロモーター配列、ならびに転写及び翻訳停止シグナル配列を含む。そのようなベクターとしては、とりわけ、染色体及びエピソームベクター、例えば、細菌プラスミド、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体エレメントに由来するベクター、ならびにそれらの組み合わせに由来するベクターを挙げることができる。本構築物は、発現を調節ならびに発生させる制御領域を含有し得る。
【0106】
いくつかの実施形態では、遺伝子導入構築物は、コドン最適化され得る。記載の実施形態では、ＡＢＣＡ４、またはその機能的断片をコードする核酸は、宿主ゲノム（例えば、ヒトゲノム）に組み込まれて所望の臨床転帰を提供する導入遺伝子として機能する。導入遺伝子コドン最適化は、導入遺伝子の療法的潜在性及び宿主生物におけるその発現を最適化するために使用され得る。導入遺伝子におけるコドン使用量を、宿主生物または細胞における各コドンのトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の存在量と一致させるために、コドン最適化が実施される。コドン最適化方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／１４２９５４に記載されている。最適化戦略としては、例えば、翻訳開始領域の修飾、ｍＲＮＡ構造的因子の改変、及び異なるコドンバイアスの使用を挙げることができる。
【0107】
遺伝子導入構築物は、構築物の安定的な発現を確実にするために選択されるいくつかの他の調節因子を含む。したがって、いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、そばにある遺伝子の活性化または不活性化を防止または緩和する１つ以上のインスレーター配列を含み得るＤＮＡプラスミドである。いくつかの実施形態では、１つ以上のインスレーター配列は、ＨＳ４インスレーター（１．２－ｋｂ５′－ＨＳ４ニワトリβ－グロビン（ｃＨＳ４）インスレーター因子）及びＤ４Ｚ４インスレーター（顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）に関連するタンデムマクロサテライト反復）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳ４インスレーター及びＤ４Ｚ４インスレーターの配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＲｉｖａｌ－Ｇｅｒｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１３ Ａｕｇ；２１（８）：１５３６－５０に記載のとおりである。いくつかの実施形態では、遺伝子導入構築物の遺伝子は、トランスポザーゼの存在下で転移することが可能である。いくつかの実施形態では、本開示の実施形態による非ウイルスベクターは、トランスポザーゼをコードする核酸構築物を含む。トランスポザーゼは、ＲＮＡトランスポザーゼプラスミドであり得る。いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、ＤＮＡトランスポザーゼプラスミドをコードする核酸構築物を更に含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、インビトロで転写されたｍＲＮＡトランスポザーゼである。トランスポザーゼは、遺伝子導入構築物から遺伝子を切除し、及び／または部位特異的もしくは遺伝子座特異的ゲノム領域に遺伝子を転移することが可能である。
【0108】
本開示による遺伝子導入構築物を含む組成物は、１つ以上の非ウイルスベクターを含み得る。また、トランスポザーゼは、導入遺伝子を含むトランスポゾンと同じ（シス）かまたは異なる（トランス）ベクター上に配置され得る。したがって、いくつかの実施形態では、トランスポザーゼと、導入遺伝子を包含するトランスポゾンとは、それらが同じベクターに含まれるような、シス構成にある。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼと、導入遺伝子を包含するトランスポゾンとは、それらが異なるベクターに含まれるような、トランス構成にある。ベクターは、本開示による任意の非ウイルスベクターである。
【0109】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来し、及び／またはその操作されたバージョンである。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＩＴＲを特異的に認識する。トランスポザーゼは、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含み得る。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，０４１，０７７号を参照されたい。
【0110】
しかしながら、いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、例えば、細胞透過性ペプチド（例えば、Ｒａｍｓｅｙ ａｎｄ Ｆｌｙｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２９１５；１５４：７８－８６に記載の）を使用して、塩及びプロパンベタインを含む低分子（例えば、Ａｓｔｏｌｆｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２０１５；１６１：６７４－６９０に記載の）、またはエレクトロポレーション（例えば、Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｄａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９５；４８：６３－７１に記載の）を使用して、タンパク質として細胞に直接導入され得る。
【0111】
いくつかの実施形態では、トランスポゾン系は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，４３５，６９６号に記載のように実施され得る。
【0112】
いくつかの実施形態では、記載の組成物は、導入遺伝子（例えば、ＡＢＣＡ４またはその機能的断片）及びトランスポザーゼをある特定の比で含む。いくつかの実施形態では、転移活性の効率を改善する、導入遺伝子対トランスポザーゼ比が選択される。導入遺伝子対トランスポザーゼ比は、トランスフェクトされた遺伝子導入構築物の濃度、及び他の要因に依存し得る。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４を、またはその機能的断片をコードする核酸対トランスポザーゼをコードする核酸構築物の比は、約５：１、または約４：１、または約３：１、または約２：１、または約１：１、または約１：２、または約１：３、または約１：４、または約１：５である。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４タンパク質をコードする核酸対トランスポザーゼをコードする核酸構築物の比は、約２：１である。いくつかの態様では、遺伝子導入構築物を含む組成物が提供される。実施形態では、組成物は、（ａ）ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣ）トランスポーター（ＡＢＣＡ４）タンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸と、（ｂ）ＣＡＧプロモーターと、（ｃ）１つ以上のトランスポザーゼ認識部位及び１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）または端部配列を含む非ウイルスベクターと、を含み、ＡＢＣＡ４タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９５％の同一性を有するバリアントを含む、ヒトＡＢＣＡ４タンパク質、またはその機能的断片である。
【0113】
いくつかの態様では、遺伝子導入構築物を含む組成物が提供される。実施形態では、組成物は、（ａ）ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣ）トランスポーター（ＡＢＣＡ４）タンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸と、（ｂ）ＣＡＧプロモーターと、（ｃ）１つ以上のトランスポザーゼ認識部位及び１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）または端部配列を含む非ウイルスベクターと、を含み、ＡＢＣＡ４タンパク質が、配列番号２のヌクレオチド酸配列、またはそれに対して少なくとも約９５％の同一性を有するバリアントによってコードされる、ヒトＡＢＣＡ４、またはその機能的断片である。
【0114】
いくつかの態様では、遺伝性黄斑変性症（ＩＭＤ）を治療及び／または緩和するための方法であって、（ａ）患者または別の個体から得られた細胞を、請求項６２に記載の組成物と接触させることと、（ｂ）細胞を、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物と接触させることであって、ＡＢＣＡ４タンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸対トランスポザーゼをコードする核酸構築物の比が、約２：１である、核酸構築物と接触させることと、（ｃ）細胞をそれを必要とする患者に投与することと、を含む、方法が提供される。
【0115】
いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、例えば、脂質粒子を用いる方法等の様々なトランスフェクション方法によって細胞に導入される、共役ポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、遺伝子導入構築物を含む組成物は、送達粒子を含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質に基づく粒子（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））、カチオン性脂質、または生分解性ポリマー）を含む。遺伝子導入構築物の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達は、潜在的なオフターゲット事象及び免疫応答を制限するための一過性の非組み込み発現、ならびに大きなカーゴを輸送する能力を有する効率的な送達を含む、ある特定の利点を提供する。ＬＮＰは、ｍＲＮＡを網膜に送達するために使用されている。Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１９ Ｊｕｎ １０；３０３：９１－１００．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ．２０１９．０４．０１５．Ｅｐｕｂ ２０１９ Ａｐｒ １２を参照されたい。また、例えば、米国特許第１０，１９５，２９１号は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）治療剤の送達のためのＬＮＰの使用について記載している。
【0116】
いくつかの実施形態では、本開示の実施形態による組成物は、ＬＮＰの形態にある。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ジメチルアミノエタン－カルバモイルと混合されたカチオン性コレステロール誘導体（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、トリオレイン（トリオレイン酸グリセリル）、ならびに１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［カルボキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ ２Ｋ）、及び１，２－ジステアロール（ｄｉｓｔｅａｒｏｌ）－ｓｎ－グリセロール－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）から選択される１つ以上の脂質を含む。
【0117】
いくつかの実施形態では、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１９；３０３：９１－１００から適応させたＬＮＰは、図２に示されるとおりである。図２に示されるように、ＬＮＰは、構造的脂質（例えば、ＤＳＰＣ）、ＰＥＧ共役脂質（ＣＤＭ－ＰＥＧ）、カチオン性脂質（ＭＣ３）、コレステロール、及び標的化リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ）のうちの１つ以上を含み得る。
【0118】
いくつかの実施形態では、組成物は、様々な比で脂質及びポリマーを有し得、脂質が、例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、ＰＣ、トリオレイン、ＤＳＰＥ－ＰＥＧから選択され得、ポリマーが、例えば、ＰＥＩまたはポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）であり得る。加えてまたはあるいは、任意の他の脂質及びポリマーが使用され得る。いくつかの実施形態では、脂質及びポリマーの比は、約０．５：１、または約１：１、または約１：１．５、または約１：２、または約１：２．５、または約１：３、または約３：１、または約２．５：１、または約２：１、または約１．５：１、または約１：１、または約１：０．５である。
【0119】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質を含み、その非限定的な例としては、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）もしくはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－’）アミノ）エチル）（２ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはそれらの混合物が挙げられる。
【0120】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、肝送達に好適である、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ならびにＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から選択される１つ以上の分子を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，９８５，８２６号に記載の肝指向性化合物を含む。ＧａｌＮＡｃは、哺乳類肝細胞で発現するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を標的とすることが知られている。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．２０１４；２１（１０）：１０２５－３０を参照されたい。
【0121】
いくつかの例では、本開示の遺伝子導入構築物は、ＰＥＩ、またはポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ＧＡＬ）もしくはポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－トリ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ｔｒｉＧＡＬ）誘導体等のそれらの誘導体と製剤化または複合化され得る。
【0122】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、共役脂質であり、その非限定的な例としては、限定されないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質が挙げられる。ＰＥＧ－ＤＡＡ共役物は、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）であり得る。
【0123】
実施形態では、ナノ粒子は、約１０００ｎｍ未満の直径を有する粒子である。いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子は、約５００ｎｍ以下、または約４００ｎｍ以下、または約３００ｎｍ以下、または約２００ｎｍ以下、または約１００ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、または約７０ｎｍ～約１３０ｎｍ、または約８０ｎｍ～約１２０ｎｍ、または約９０ｎｍ～約１１０ｎｍの範囲の最大寸法を有する。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約１００ｎｍの最大寸法（例えば、直径）を有する。
【0124】
いくつかの態様では、本開示による組成物は、インビボ遺伝子組換え方法を介して送達され得る。いくつかの実施形態では、本開示による遺伝子組換えは、エクスビボ方法を介して実施され得る。
【0125】
したがって、いくつかの実施形態では、患者における光受容体喪失を防止するか、またはその速度を減少させるための方法であって、本開示の任意の実施形態または実施形態の組み合わせによる組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、方法が提供される。方法は、注射による投与を含む、好適な経路を介して組成物を送達することを含む。
【0126】
いくつかの実施形態では、本方法及び組成物は、光受容体喪失の恒久的な防止またはその速度の減少を提供することができ、したがって、追加の治療剤の必要性を減少または排除することができる。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、ステロイド治療の不在下で実施される。方法は、実質的に非免疫原性であり得る。
【0127】
いくつかの態様では、本発明は、エクスビボ遺伝子療法アプローチを提供する。したがって、いくつかの態様では、（ａ）患者（自己）または別の個体（同種異系）から得られた細胞を、本開示の実施形態による組成物と接触させることと、（ｂ）細胞をそれを必要とする患者に投与することとを含む、患者における光受容体喪失を防止するか、またはその速度を減少させるための方法が提供される。
【0128】
いくつかの態様では、遺伝性黄斑変性症（ＩＭＤ）を治療及び／または緩和するための方法であって、本開示の実施形態による組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、方法が提供される。そのようなインビボ方法では、組成物は、本明細書に記載の技法のうちのいずれかを使用して投与される。
【0129】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のインビボ及びエクスビボ方法は、両側で対称的な中心視力喪失を特徴とする、疾患の異種群である様々なＭＤを治療し、進行を遅らせることができる。ＭＤとしては、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患、Ｂｅｓｔ疾患、Ｘ連鎖性網膜分離症、パターンジストロフィー、Ｓｏｒｓｂｙ眼底ジストロフィー、及び常染色体優性ドルーゼンが挙げられる。ＢＥＳＴ疾患は、ＢＥＳＴ１における疾患を引き起こすバリアントに関連する常染色体優性状態であり、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）は、青年期の男性における若年発症性網膜変性症の最も一般的な形態であり、パターンジストロフィー（ＰＤ）は、ＲＰＥレベルでの色素堆積の可変分布を特徴とする障害の群であり、Ｓｏｒｓｂｙ眼底ジストロフィー（ＳＦＤ）は、多くの場合５０代に両側の中心視力喪失をもたらす稀な黄斑ジストロフィーであり、常染色体優性ドルーゼン（ＡＤＤ）は、黄斑におけるドルーゼン様堆積物を特徴とする常染色体優性状態であり、これは、放射状またはハニカム様の外観を有し得る。Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０２０；１０４（４）：４５１－４６０を参照されたい。
【0130】
いくつかの実施形態では、（ａ）患者または別の個体から得られた細胞を、本開示の実施形態による組成物と接触させることと、（ｂ）細胞をそれを必要とする患者に投与することと、を含む、ＩＭＤを治療及び／または緩和するためのエクスビボ方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＩＭＤは、ＳＴＧＤである。いくつかの実施形態では、ＳＴＧＤは、ＳＴＧＤタイプ１（ＳＴＧＤ１）である。いくつかの実施形態では、ＳＴＧＤ疾患は、ＳＴＧＤタイプ３（ＳＴＧＤ３）またはＳＴＧＤタイプ４（ＳＴＧＤ４）疾患であり得る。
【0131】
いくつかの実施形態では、ＩＭＤは、ＡＢＣＡ４、ＥＬＯＶＬ４、ＰＲＯＭ１、ＢＥＳＴ１、及びＰＲＰＨ２のうちの１つ以上における変異を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４変異は、常染色体劣性変異である。
【0132】
ＥＬＯＶＬ４（プロテイン４の超長鎖脂肪酸の伸長）における変異は、網膜変性を特徴とするＳＴＧＤ３を引き起こすことが示された。Ａｇｂａｇａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２，２００８；１０５（３５）１２８４３－１２８４８、また、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００１；Ｊａｎ；２７（１）：８９－９３を参照されたい。ＳＴＧＤ３の臨床プロファイルは、ＳＴＧＤ１と非常に類似している。
【0133】
ＰＲＯＭ１（プロミニン１遺伝子）は、膜突起に局在化したタンパク質であるペンタスパン膜貫通糖タンパク質をコードする。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００８；１１８（８）：２９０８－２９１６．ＰＲＯＭ１遺伝子における変異は、網膜色素変性症及びＳｔａｒｇａｒｄｔ疾患をもたらすことが示されており、この遺伝子は、組織依存的様式で発現する少なくとも５つの代替プロモーターから発現する。例えば、Ｌｏｎｎｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．２０１４；４５（６）：２２０８－２２２０を参照されたい。
【0134】
ＢＥＳＴ１遺伝子は、正常な視力において重要な役割を果たすように思われる、ベストロフィン－１と呼ばれるタンパク質を作製するための指示を提供する。ＢＥＳＴ１遺伝子における変異は、隣接するＲＰＥ細胞における原発性チャネロパシーに起因して、網膜の剥離及び光受容体細胞（ＰＲ）の変性を引き起こす。Ｇｕｚｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｍａｒｃｈ ２０，２０１８ １１５（１２）Ｅ２８３９－Ｅ２８４８、また、Ｐｅｔｒｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９８；ｖｏｌ．１９：２４１－２４７を参照されたい。ＢＥＳＴ１における疾患を引き起こすバリアントは、Ｂｅｓｔ疾患（ＢＤ）に関連し、これは、およそ１００００人に１人に影響を及ぼす、２番目に一般的なＭＤである。Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０２０ Ａｐｒ；１０４（４）：４５１－４６０．ＢＥＳＴ１配列バリアントはまた、成人の卵黄様ＭＤ、常染色体優性硝子体脈絡膜症、常染色体劣性ベストロフィノパチー、及び網膜色素変性症等の少なくとも４つの他の表現型の原因となる。Ｉｄ．
【0135】
ＰＲＰＨ２（ペリフェリン－２）遺伝子は、ペリフェリン－２／網膜変性症低速（ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｌｏｗ、ＲＤＳ）と呼ばれるＰＲ特異的テトラスパニンタンパク質をコードし、ＰＲＰＨ２における変異は、網膜色素変性症及び黄斑変性症の形態を引き起こすことが示されている。Ｃｏｎｌｅｙ＆Ｎａａｓｈ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ．２０１４ Ａｕｇ ２８；４（１１）：ａ０１７３７６．ＰＲＰＨ２における変異は、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ黄斑変性症を有する患者において同定されている。
【0136】
ＡＢＣＡ４、ＥＬＯＶＬ４、ＰＲＯＭ１、ＢＥＳＴ１、及びＰＲＰＨ２のうちの１つ以上における病原性変異は、関連する黄斑ジストロフィー状態を治療及び／または緩和するための記載の方法を使用して補正することができる。
【0137】
エクスビボ遺伝子療法の利点のうちの１つは、患者の投与前に形質導入された細胞を「サンプリング」する能力である。これによって、有効性が促進され、細胞（複数可）を患者に導入する前に安全性確認を実施することが可能になる。例えば、組み込みの形質導入効率及び／またはクローン性を、生成物の注入の前に評価することができる。本開示は、エクスビボ遺伝子組換えに効果的に使用することができる組成物及び方法を提供する。
【0138】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のインビボ及びエクスビボ方法のうちのいずれかは、患者の遠見視力を改善する。いくつかの実施形態では、方法は、実質的に非免疫原性である。
【0139】
いくつかの実施形態では、方法は、単回投与を必要とし、これは、本組成物の送達を簡略化し、全体的な患者経験を改善する。様々なＩＭＤ障害によって影響を受けている多くの患者は、子供であり、本開示のいくつかの実施形態による恒久的な、実質的に非免疫原性の治療を、１度の投与として送達することによって、療法送達プロセスが容易になり、患者の負担が減少される。
【0140】
上述のように、ＲＰＥにおけるリポフスチンの蓄積は、ＳＴＧＤ、加齢黄斑変性症、及び他の網膜疾患の発症に関連している。斑点を形成する黄色の物質であるリポフスチンの塊は、黄斑の中及び周辺に蓄積し、中心視力を損わせる。リポフスチンの主な構成要素は、ビス－レチノイドＮ－レチニリデン－Ｎ－レチニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）であるが、リポフスチンは他のビス－レチノイドを含む。Ａ２Ｅは、年齢とともに、またはＳＴＧＤ等のいくつかの網膜障害において、眼のＲＰＥのリソソームに蓄積する蛍光物質である。ＲＰＥリポフスチンは、Ａ２Ｅと、追加のフルオロフォア－Ａ２Ｅの二重結合異性体、イソ－Ａ２Ｅとを含む。Ａ２Ｅ及びイソ－Ａ２Ｅの光化学に関する研究は、それらが４４（Ａ２Ｅ）：１（イソ－Ａ２Ｅ）の光平衡状態で存在することを示した。Ｐａｒｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９８；９５（２５）：１４６０９－１３を参照されたい。Ａ２Ｅは、ＲＰＥにおけるリポフスチン様破片の蓄積を引き起こすことが示された。Ｍｉｈａｉ＆Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ＆Ｄｉｓｅａｓｅ ５，ｅ１３４８（２０１４）．Ａ２Ｅは、リポフスチン様体、後期リソソーム、異常なグリコーゲン及び脂質堆積物、ならびに不均一な電子密度を示す包含物を包含する、ヒトの眼に見出されるＲＰＥ破片の原因となり得る。Ｉｄ．したがって、Ａ２Ｅは、網膜老化及び関連する変性症を駆動する。Ａ２Ｅの化学的前駆体であるビタミンＡアルデヒド（レチンアルデヒド）も、変性過程においてある役割を果たす。Ｉｄ．
【0141】
したがって、レチンアルデヒド、Ａ２Ｅ、及びイソ－Ａ２Ｅのうちの１つ以上のレベルを低下させることによって、網膜、例えばＲＰＥ及び／またはその下のＢｒｕｃｈ膜におけるリポフスチン蓄積を治療または緩和することができる。いくつかの実施形態では、方法は、ＲＰＥ破片の形成を低減または防止する。いくつかの実施形態では、レチンアルデヒド、Ａ２Ｅ、及びイソ－Ａ２Ｅのうちの１つ以上のレベルを低下させることによって、ＲＰＥ及びＢｒｕｃｈ膜（ＢＭ）におけるビタミンＡ二量体の蓄積を治療または緩和することができる。
【0142】
したがって、いくつかの実施形態では、方法は、本組成物の投与を行わないレチンアルデヒド、Ｎ－レチニリデン－Ｎ－レチニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）、及びイソ－Ａ２Ｅのうちの１つ以上のレベルと比較して、レチンアルデヒド、Ａ２Ｅ、及びイソ－Ａ２Ｅのうちの１つ以上を低下させることを提供する。いくつかの実施形態では、レチンアルデヒド、Ａ２Ｅ、及びイソ－Ａ２Ｅのうちの１つ以上のレベルが（本組成物の投与を行わないレチンアルデヒド、Ａ２Ｅ、及びイソ－Ａ２Ｅのうちの１つ以上のレベルと比較して）低下され、少なくとも約４０％超低下される。いくつかの実施形態では、方法は、約４０％超、または約５０％超、または約６０％超、または約７０％超、または約８０％超、または約９０％超の低下を提供する。
【0143】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼをコードする核酸構築物が、患者に投与される。トランスポザーゼは、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、及び／またはその操作されたバージョンに由来し得る。
【0144】
いくつかの実施形態では、患者における光受容体喪失を防止するか、またはその速度を減少させるためのエクスビボ方法は、細胞を、任意選択的に、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物と接触させることを含む。
【0145】
いくつかの実施形態では、患者における光受容体喪失を防止するか、またはその速度を減少させるための方法は、ステロイド治療の不在下で実施される。グルココルチコイドステロイド（例えば、プレドニゾン）等のステロイドを使用して、免疫応答を低減することによって、ＡＡＶに基づく遺伝子療法の有効性が改善されている。しかしながら、ステロイド治療は、副作用を伴わないわけではない。本開示の組成物及び方法は、実質的に非免疫原性であり得、したがって、ステロイド治療の必要性を排除することができる。
【0146】
いくつかの実施形態では、しかしながら、方法は、ステロイド治療と組み合わせて実施される。
【0147】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせた記載の組成物を投与するために、方法が使用され得る。追加の治療剤の非限定的な例は、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ）、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、及びベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）を含む抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）治療剤のうちの１つ以上を含む。追加の治療剤は、重水素化ビタミンＡ、及び／または他のビタミン、または栄養補助剤（例えば、ベータカロテン、ルテイン、及びゼアキサンチン）を含み得る。
【0148】
投与は、硝子体内または網膜内であり得る。いくつかの実施形態では、投与することが、ＲＰＥ細胞及び／または光受容体へのものである。本開示による非ウイルス遺伝子療法のための組成物は、注射による投与を含む、様々な送達経路を介して投与され得る。いくつかの実施形態では、注射は、硝子体内または網膜内である。いくつかの実施形態では、注射は、硝子体下または網膜下である。いくつかの実施形態では、注射は、ＲＰＥ下である。
【0149】
いくつかの実施形態では、ＩＭＤを治療及び／または緩和するためのインビトロまたはエクスビボ方法は、治療の欠如と比較して、遠見視力の改善及び／または光受容体喪失の速度の減少を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の約２０／２００超までの改善をもたらす。
【0150】
いくつかの実施形態では、ＩＭＤを治療及び／または緩和するための方法は、眼底自発蛍光（ＦＡＦ）またはスペクトルドメイン光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）によって測定した、網膜または中心窩の形状の改善をもたらす。ＦＡＦは、網膜色素上皮におけるリポフスチンの密度マップを提供するために使用される非侵襲性網膜撮像診断法である。Ｍａｄｅｌｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｒｅｔｉｎ Ｖｉｔｒ ２，１２（２０１６）、Ｓｅｐａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｕｄｉ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１４；２８（２）：１１１－１１６、Ｓｐａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１０；ｖｏｌ．５１：４３５１－４３５７を参照されたい。
【0151】
ＳＤ－ＯＣＴは、干渉縞パターンのスペクトル分析による後方散乱光の大きさ及び遅延で符号化された、深さによって解析した組織構造情報を提供する、干渉測定技法である。Ｙａｑｏｏｂ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．６Ｓ；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ：３０ Ｍａｙ ２０１８．例えば、走査型レーザー検眼鏡検査法（ＳＬＯ）、蛍光寿命撮像検眼鏡検査法（ＦＬＩＯ）、及び２光子顕微鏡撮像（ＴＰＭ）を含む、他の撮像技術も同様に使用することができる。好適な技術を使用して取得された（片目または両目の）画像を分析して、蛍光強度を含む患者のパラメータを評価することができる。例えば、自発蛍光強度の全般的な増加を特徴とするＦＡＦは、疾患の初期段階でのＳｔａｒｇａｒｄｔ疾患の指標である。Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１４；５５：２８４１－２８５２．
【0152】
いくつかの実施形態では、方法は、患者における、変視症、盲点、かすみ、奥行き知覚の喪失、まぶしさへの感受性、色覚障害、及び薄暗い照明への適応困難（暗所適応の遅延）のうちの１つ以上の低減または防止をもたらす。
【0153】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせた記載の組成物を投与するために、方法が使用され得る。追加の治療剤の非限定的な例は、ソラプラザン、イソトレチノイン、ドベシラート、４－メチルピラゾール、ＡＬＫ－００１ ９（Ｃ２０重水素化ビタミンＡ）、フェンレチニド（ビタミンＡの合成形態）、ＬＢＳ－５００、Ａ１１２０、エミクススタット、フェノフィブラート、及びアバシンカプタドペゴルのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、方法は、上の治療剤のうちのいずれかであり得る追加の治療剤の必要性を排除する。
【0154】
いくつかの実施形態では、方法は、ステロイド治療の必要性を排除する。
【0155】
いくつかの実施形態では、本開示による組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む。
【0156】
好適な薬学的組成物を製剤化する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ ｅｄ．，２００５、及びＤｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓシリーズの本であるａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。例えば、注射可能な使用に好適な薬学的組成物は、滅菌注射溶液または分散液を即時調製するための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、及び滅菌粉末を含み得る。静脈内投与に好適な担体としては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌される必要があり、流体は、シリンジによって容易に吸い上げられる必要がある。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定である必要があり、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対応して保存される必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、砂糖、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含むことによって、注射組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【0157】
滅菌注射溶液は、上に列挙された成分のうちの１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に、活性化合物を必要な量で組み込み、必要に応じて、その後濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒、及び上に列挙されたものとは異なる必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これらによって、予め滅菌濾過したその溶液から、活性成分及び任意の所望の追加成分の粉末が得られる。
【0158】
治療化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤等の、体内からの急速な放出に対して治療化合物を保護するであろう担体とともに調製され得る。コラーゲン、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物（例えば、ポリ［１，３－ビス（カルボキシフェノキシ）プロパン－コ－セバシン酸］（ＰＣＰＰ－ＳＡ）マトリックス、脂肪酸二量体－セバシン酸（ＦＡＤ－ＳＡ）コポリマー、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド））、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリエチレングリコールでコーティングされたリポソーム、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。そのような製剤は、標準的な技法を使用して調製することができるか、または例えば、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。また、リポソーム懸濁液は、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の、当業者に既知の方法に従って調製され得る。例えば、手術部位への投与が望ましい場合、半固体、ゲル化、軟質ゲル、または他の製剤（制御放出を含む）が使用され得る。そのような製剤を作製する方法は、当該技術分野において既知であり、生分解性、生体適合性ポリマーの使用を含み得る。例えば、Ｓａｗｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｙａｌｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２００６；７９（３－４）：１４１－１５２を参照されたい。
【0159】
実施形態では、トランスポザーゼの存在下で、本明細書に記載の遺伝子導入構築物を使用して細胞を形質転換して、目的の遺伝子の細胞への安定的な組み込みから生じる安定的にトランスフェクトされた細胞を生成する方法が提供される。実施形態では、安定的な組み込みは、細胞の染色体またはミニ染色体へのポリヌクレオチドの導入を含み、したがって、細胞ゲノムの比較的永続的な部分となる。
【0160】
実施形態では、本発明は、目的の遺伝子、例えば、ＡＢＣＡ４が宿主のゲノムに導入されたかどうかを決定することに関する。一実施形態では、方法は、目的の遺伝子に隣接するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施することと、得られた増幅ポリメラーゼ連鎖反応生成物のサイズを決定することと、得られた生成物のサイズを参照サイズと比較することとを含み得、得られた生成物のサイズが予想されるサイズと一致する場合、目的の遺伝子が、うまく導入されている。
【0161】
実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、限定されないが、遺伝子導入構築物及び／またはトランスポザーゼを含む組成物）を含む宿主細胞が提供される。実施形態では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞、例えば、哺乳類細胞である。
【0162】
実施形態では、本開示の方法によって形質転換された細胞を含み得るトランスジェニック生物が提供される。一例では、生物は、哺乳類または昆虫であり得る。生物が哺乳類である場合、生物としては、限定されないが、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギ等を挙げることができる。生物が昆虫である場合、生物は、限定されないが、ミバエ、蚊、アメリカタバコガの幼虫等を挙げることができる。
【0163】
組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、キット、パック、またはディスペンサー内に含まれ得る。
【0164】
また、本明細書で提供されるのは、ｉ）本発明の先述の遺伝子導入構築物のうちのいずれか、及び／または本発明の先述の細胞のうちのいずれか、ならびにｉｉ）容器、を含むキットである。ある特定の実施形態では、キットは、キットを使用するための説明書を更に含む。ある特定の実施形態では、先述のキットのうちのいずれかは、トランスポザーゼをコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ構築物を更に含み得る。
【0165】
本発明は、以下の非限定的な実施例により更に説明される。
【0166】
定義
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、１つ、または２つ以上を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、１つ、または２つ以上を意味し得る。
【0167】
更に、参照された数値表示に関連して使用される場合の「約」という用語は、その参照された数値表示に、その参照された数値表示の最大１０％を加算または減算することを意味する。例えば、「約５０」という言葉は、４５から５５の範囲を包含する。
【0168】
医療用途に関連して使用される場合の「有効量」は、対象とする疾患の測定可能な治療、予防、または発病速度の低減をもたらすのに有効な量である。
【0169】
本明細書で言及される場合、全ての組成パーセンテージは、別段の指定がない限り、組成物の総重量によるものである。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という単語及びその変形は、リスト内のアイテムの列挙が、本技術の組成物及び方法でも有用であり得る他の同様のアイテムを除外するものではないように、非限定的であることを意図する。同様に、「し得る（ｃａｎ）」及び「し得る（ｍａｙ）」という用語、ならびにそれらの変形は、一実施形態が、ある特定の要素または特色を含み得る（ｃａｎ）かまたは含み得る（ｍａｙ）列挙が、それらの要素または特色を含有しない本技術の他の実施形態を除外しないように、非限定的であることを意図する。
【0170】
含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含有すること、または有すること等の同義語としての「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という開放的な用語は、発明、本発明、または本発明の実施形態について記載及び特許請求するために本明細書で使用され、代替的に、「からなること」または「から本質的になること」等の代替的な用語を使用して記載され得る。
【0171】
本明細書で使用される場合、「好ましい」及び「好ましくは」という単語は、ある特定の状況下である特定の利益をもたらす技術の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態も、同じかまたは他の状況下で好ましい場合がある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用でないことを意味せず、本技術の範囲から他の実施形態を除外することを意図しない。
【0172】
治療効果を達成するために必要な本明細書に記載の組成物の量は、特定の目的のための従来の手順に従って経験的に決定され得る。一般に、治療目的で治療剤を投与するために、治療剤は薬理学的有効用量で投与される。「薬理学的有効量」、「薬理学的有効用量」、「治療有効量」、または「有効量」は、特に障害または疾患の治療のために、所望の生理学的作用を生じさせるのに十分な量または所望の結果を達成することができる量を指す。本明細書で使用される場合、有効量としては、例えば、障害または疾患の症状の発生を遅延させるため、障害または疾患の症状の経過を改変するため（例えば、疾患の症状の進行を遅らせるため）、障害または疾患の１つ以上の症状または徴候を低減または排除するため、及び障害または疾患の症状を元に戻すために十分な量が挙げられるであろう。治療的利益には、改善が実現されているか否かにかかわらず、基礎疾患または障害の進行を停止させるかまたは遅らせることも含まれる。
【0173】
有効量、毒性、及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の約５０％に対する致死用量）、及びＥＤ５０（集団の約５０％における治療有効用量）を決定するための細胞培養物または実験動物における、標準的な薬学的手順によって決定され得る。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて変動する場合がある。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。いくつかの実施形態では、大きな治療指数を呈する組成物及び方法が好ましい。治療的有効用量は、例えば、細胞培養アッセイを含む、インビトロアッセイから最初に推定され得る。また、用量は、細胞培養物において、または適切な動物モデルにおいて決定したＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化され得る。血漿中の記載の組成物のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。任意の特定の投与量の効果は、好適なバイオアッセイによって監視され得る。投与量は、医師によって決定され、必要に応じて、治療の観察された効果に適合するように調整され得る。
【0174】
本明細書で使用される場合、「治療方法」は、本明細書に記載の疾患もしくは障害を治療するための組成物の使用、及び／または本明細書に記載の疾患もしくは障害を治療するための薬剤の製造における、使用のための組成物及び／またはその使用に等しく適用可能である。
【実施例】
【0175】
以下、実施例を参照して、本発明について更に詳細に説明する。これらの実施例が、例示目的に過ぎず、本発明の範囲を限定すると解釈されるものではないことは、当業者には明らかであろう。加えて、本発明の技術範囲から逸脱することなく、様々な修正及び変形が行われ得ることが、当業者には明らかであろう。
【0176】
実施例１－トランスポゾン発現ベクターの設計
図１Ａ～１Ｉに概略的に示される非ウイルスのトランスポゾン発現ベクターは、網膜細胞株におけるトランスフェクション、転移有効性、及び発現研究のインビトロ、インビボ、及びエクスビボ研究のために設計され、クローニングされる。
図１Ａ～１Ｉに概略的に示される非ウイルスのトランスポゾン発現ベクターは、網膜細胞株におけるトランスフェクション、転移有効性、及び発現研究のインビトロ、インビボ、及びエクスビボ研究のために設計され、クローニングされる。
【0177】
図１Ａは、ＧＦＰ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるトランスポゾン（Ｔｎ）：トランスポザーゼ（Ｔｓ）比及び転移有効性を決定するために使用される、ＰＧＫプロモーターを含むホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）－ＧＦＰトランスポゾン構築物を示す。図１Ｂ及び１Ｃは、網膜色素上皮プロモーター（ＲＰＥＰ）（図１Ｂ）及び光受容体プロモーター（ＰＲＰ）（図１Ｃ）が、（ＦＡＣＳによって決定される）ＧＦＰ発現及び［ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）または定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）技術を使用して決定される］コピー数を選択的に最大化する場合の有効性を評価するために使用されるトランスポゾン構築物を示す。
【0178】
図１Ｄは、フローサイトメトリー及びＡＢＣＡ４コピー数（例えば、ｄｄＰＣＲまたはｑＰＣＲを使用する）によって、ＡＢＣＡ４の発現を評価するために使用することができるＢＥＳＴ－ＲＰＥＰ構築物を示す。図１Ｅは、同様に、フローサイトメトリー及びＡＢＣＡ４コピー数（例えば、ｄｄＰＣＲまたはｑＰＣＲを使用する）によって、ＡＢＣＡ４の発現を評価するために使用することができるＢＥＳＴ－ＰＲＰ構築物を示す。
【0179】
図１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、及び１Ｉに示されるトランスポゾン構築物は、以下で考察されるヒトｉＰＳＣ及びトランスジェニックａｂｃａ４－／－マウス研究において使用される。図１Ｆ及び１Ｈの構築物は、ＢＥＳＴ－ＲＰＥＰプロモーターを含み、図１Ｇ及び１Ｉの構築物は、ＢＥＳＴ－ＰＲＰプロモーターを含む。
【0180】
実施例２－異なるトランスポゾン（Ｔｎ）：トランスポザーゼ（Ｔｓ）比の効果の決定
異なるトランスポゾン（Ｔｎ）：トランスポザーゼ（Ｔｓ）比の効果は、網膜及び非網膜起源の細胞株における安定的な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現（＞１４日）で評価する。研究は、ヒト網膜由来接着細胞株（ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１）及びマウス由来光受容体細胞株（６６１Ｗ）の培養物を確立することを含む。ＨＥＫ２９３（ＡＢＣＡ４陰性）及びＨｅＬａ（ＡＢＣＡ４陽性）細胞の培養物を対照として使用する。この実施例では、図１Ａに示されるトランスポゾンベクターが使用され得る。ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼ技術（ＡＴＵＭ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）を使用してもよい。
異なるトランスポゾン（Ｔｎ）：トランスポザーゼ（Ｔｓ）比の効果は、網膜及び非網膜起源の細胞株における安定的な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現（＞１４日）で評価する。研究は、ヒト網膜由来接着細胞株（ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１）及びマウス由来光受容体細胞株（６６１Ｗ）の培養物を確立することを含む。ＨＥＫ２９３（ＡＢＣＡ４陰性）及びＨｅＬａ（ＡＢＣＡ４陽性）細胞の培養物を対照として使用する。この実施例では、図１Ａに示されるトランスポゾンベクターが使用され得る。ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼ技術（ＡＴＵＭ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）を使用してもよい。
【0181】
確立された細胞株のエレクトロポレーションについての異なる条件は、構成的プロモーターによって駆動されるＧＦＰを発現するトランスポゾンベクター、例えば、図１Ａに示されるように設計されたベクターを使用して研究することができる。２つ、３つ、または３つ超の異なるＴｎ：Ｔｓ比を有する遺伝子導入構築物で、細胞をトランスフェクトすることができる。比較的多くの数のＧＦＰ陽性細胞を含む培養物をもたらす条件が、１４日間継代して培養物において維持され得る。これらの研究では、１４日間は、ＧＦＰの一過性発現を喪失させるのに十分な期間であると予想される。トランスフェクトされた培養物を、フローサイトメトリーによって１４日後に分析して、安定的な発現の尺度として、ＧＦＰ発現を保持した細胞のパーセンテージを決定する。４０％超のＧＦＰ発現を有する培養物を、ｄｄＰＣＲまたはｑＰＣＲによって分析して、コピー数を決定することができる。
【0182】
実施例３－ＲＰＥ特異的プロモーター及び光受容体プロモーターの選択
この研究では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）または光受容体に由来する網膜細胞株において特異的かつ高レベルのＧＦＰ発現を引き起こすそれらの能力に基づいて、プロモーターを評価及び選択する。この実施例では、図１Ｂ及び１Ｃに示されるトランスポゾンベクターが使用され得る。ＲＰＥ（ＶＭＤ２、ＩＲＢＰ、ＲＰＥ６５）、光受容体［ＰＤＥ、ロドプシンキナーゼ（ＲｋまたはＧＲＫ１）、ＣＡＲ（錐体アレスチン）、ＲＰ１、Ｌ－オプシン］、及び非特異的プロモーター（ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＣＭＶ）をトランスポゾンベクターにクローニングし、ＧＦＰの発現を駆動する。ある特定の条件（実施例２に記載されるように同定することができる）を使用して、生成された構築物を、２つのヒトＲＰＥ細胞株（ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１）、マウス由来光受容体細胞株（６６１Ｗ）、及び２つの対照細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ）にトランスフェクトする。定性的に（目よって視覚的にまたはフローサイトメトリーによって）相対的な発現レベルを決定し、ＲＰＥまたは光受容体細胞株において強く発現し、対照細胞において相対的に低く発現したプロモーターを、このアッセイの目的の網膜特異的と見なすものとする。
この研究では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）または光受容体に由来する網膜細胞株において特異的かつ高レベルのＧＦＰ発現を引き起こすそれらの能力に基づいて、プロモーターを評価及び選択する。この実施例では、図１Ｂ及び１Ｃに示されるトランスポゾンベクターが使用され得る。ＲＰＥ（ＶＭＤ２、ＩＲＢＰ、ＲＰＥ６５）、光受容体［ＰＤＥ、ロドプシンキナーゼ（ＲｋまたはＧＲＫ１）、ＣＡＲ（錐体アレスチン）、ＲＰ１、Ｌ－オプシン］、及び非特異的プロモーター（ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＣＭＶ）をトランスポゾンベクターにクローニングし、ＧＦＰの発現を駆動する。ある特定の条件（実施例２に記載されるように同定することができる）を使用して、生成された構築物を、２つのヒトＲＰＥ細胞株（ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１）、マウス由来光受容体細胞株（６６１Ｗ）、及び２つの対照細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ）にトランスフェクトする。定性的に（目よって視覚的にまたはフローサイトメトリーによって）相対的な発現レベルを決定し、ＲＰＥまたは光受容体細胞株において強く発現し、対照細胞において相対的に低く発現したプロモーターを、このアッセイの目的の網膜特異的と見なすものとする。
【0183】
また、この研究では、ＲＰＥ特異的及び光受容体特異的と見なされるプロモーターを用いた、ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１、及び６６１Ｗトランスフェクションを、約１４日間継代して培養し、この期間後にフローサイトメトリーによって分析する。ＧＦＰ発現の異なるレベルを、研究した細胞株におけるこれらのプロモーターの相対的な強度の尺度として捉える。
【0184】
実施例４－網膜及び非網膜起源の細胞株における、網膜特異的プロモーターによって駆動されるヒトＡＢＣＡ４の安定的な発現の実証
ＨＥＫ２９３細胞を使用して、内因性ＡＢＣＡ４陽性対照及び陰性対照を確認する。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において、ＡＢＣＡ４が、光受容体細胞内と同様の輸送機能を有することが示されており（Ｓａｂｉｒｚｈａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１５；２９０：１９７４３－５５、Ｑｕａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１２；３：９２５）、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３（タンパク質アトラス）において、ＲＴ－ＰＣＲが、内因性ＡＢＣＡ４発現を示さないので、ＨＥＫ２９３細胞を使用する。Ｂａｕｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ ２０１９；２１：１７６１－７１を参照されたい。加えて、ＨｅＬａ細胞は、内因性ＡＢＣＡ４（タンパク質アトラス）を発現する。ＨＥＫ２９３細胞を陰性対照として使用することができ、ＨｅＬａ細胞を陽性対照として使用することができることを確認するために、標準的な方法を使用して、ヒトＡＢＣＡ４に対する抗体で細胞を標識する。標識された細胞を、フローサイトメトリーによって定量化し、免疫細胞化学技法によって可視化する。加えて、内因性ＡＢＣＡ４のｍＲＮＡレベルを、ｄｄＰＣＲまたはＲＴｑＰＣＲによって定量する。
ＨＥＫ２９３細胞を使用して、内因性ＡＢＣＡ４陽性対照及び陰性対照を確認する。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において、ＡＢＣＡ４が、光受容体細胞内と同様の輸送機能を有することが示されており（Ｓａｂｉｒｚｈａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１５；２９０：１９７４３－５５、Ｑｕａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１２；３：９２５）、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３（タンパク質アトラス）において、ＲＴ－ＰＣＲが、内因性ＡＢＣＡ４発現を示さないので、ＨＥＫ２９３細胞を使用する。Ｂａｕｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ ２０１９；２１：１７６１－７１を参照されたい。加えて、ＨｅＬａ細胞は、内因性ＡＢＣＡ４（タンパク質アトラス）を発現する。ＨＥＫ２９３細胞を陰性対照として使用することができ、ＨｅＬａ細胞を陽性対照として使用することができることを確認するために、標準的な方法を使用して、ヒトＡＢＣＡ４に対する抗体で細胞を標識する。標識された細胞を、フローサイトメトリーによって定量化し、免疫細胞化学技法によって可視化する。加えて、内因性ＡＢＣＡ４のｍＲＮＡレベルを、ｄｄＰＣＲまたはＲＴｑＰＣＲによって定量する。
【0185】
この研究では、実施例３に記載されるように選択されるＲＰＥ特異的プロモーター及び光受容体プロモーターが使用され得る。選択されたプロモーターを、例えば、図１Ｄ及び１Ｅに示されるトランスポゾンベクター等のトランスポゾンベクターにクローニングし、ヒト及びマウスＡＢＣＡ４の両方の発現を駆動する。例えば、実施例２に記載されるように決定した、ヒト網膜由来接着細胞株（ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１）及び光受容体細胞株（６６１Ｗ）へのトランスフェクション条件を使用して、トランスポゾン構築物をトランスフェクトする。ＨＥＫ２９３（ＡＢＣＡ４陰性）及びＨｅＬａ（ＡＢＣＡ４陽性）細胞を、トランスフェクトされていない対照として使用する。約１４日間継代して、細胞を培養する。この期間後に、培養した細胞を、抗ＡＢＣＡ４抗体を使用して標識し、ＡＢＣＡ４を発現している細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって定量化した。フローサイトメトリーによって分析した蛍光細胞のパーセンテージは、トランスフェクション効率を監視するために使用する。
【0186】
加えて、既知の方法を使用するｄｄＰＣＲまたはＲＴ ｑＰＣＲによって、ＡＢＣＡ４転写産物の存在を定量化する。
【0187】
実施例５－ＳＴＧＤ患者ｉＰＳＣ、トランスジェニックａｂｃａ４－／－マウス、及び大型動物モデルにおける研究のためのトランスポゾン（Ｔｎ）及びトランスポザーゼ（Ｔｓ）構築物の生成
この研究の目的は、患者の個々の多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、トランスジェニックａｂｃａ４－／－マウス、及び大型動物モデル（例えば、ａｂｃｄ４変異型ラブラドールレトリバー）におけるインビボ、インビトロ、及びエクスビボ試験のためのリードトランスポゾン（Ｔｎ）及びトランスポザーゼ（Ｔｓ）構築物を同定することである。図１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、及び１Ｉに示されるベクター構築物が、使用され得る。構築物は、ルシフェラーゼ（ｐＬｕｃ）またはＧＦＰ遺伝子、ならびに光受容体及びＲＰＥ特異的プロモーターを含み得る。
この研究の目的は、患者の個々の多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、トランスジェニックａｂｃａ４－／－マウス、及び大型動物モデル（例えば、ａｂｃｄ４変異型ラブラドールレトリバー）におけるインビボ、インビトロ、及びエクスビボ試験のためのリードトランスポゾン（Ｔｎ）及びトランスポザーゼ（Ｔｓ）構築物を同定することである。図１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、及び１Ｉに示されるベクター構築物が、使用され得る。構築物は、ルシフェラーゼ（ｐＬｕｃ）またはＧＦＰ遺伝子、ならびに光受容体及びＲＰＥ特異的プロモーターを含み得る。
【0188】
この研究では、形質導入された細胞の網膜内送達を使用する、Ａｂｃａ４－／－トランスジェニックマウスまたは他の動物におけるインビボ試験を実施して、転移有効性を示す。したがって、Ａｂｃａ４ａ－／－マウスへの（マウスＡｂｃ４ａ遺伝子を使用する）構築物の網膜内注射を実施して、表現型の補正を示す。適切な構築物及び投与手順の安全性、忍容性、及び有効性を示すために、天然に存在するＡｂｃａ４－／－ラブラドールレトリバーイヌにおいて同様の実験（Ｍａｋｅｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ２０１９；１５：ｅ１００７８７３を参照されたい）を設計する。生体分布、用量応答、薬物動態、薬力学、安全性、及び病理学的研究を、ＧＬＰ環境においてＡｂｃａ４－／－ラブラドールレトリバーイヌ（または他のイヌ科動物モデル）または非ヒト霊長類（カニクイザル、ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で実施して、網膜病状を元に戻す。
【0189】
実施例６－６６１Ｗマウス光受容体細胞を転移するためのＭＬＴトランスポザーゼの使用
この研究の目的は、ＣＡＧ－ＧＦＰドナー構築物によって駆動される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用して、６６１Ｗ光受容体細胞を、本開示のＭＬＴトランスポザーゼ（ＲＮＡヘルパー）を使用して転移するためのリポフェクション条件を決定することであった。
この研究の目的は、ＣＡＧ－ＧＦＰドナー構築物によって駆動される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用して、６６１Ｗ光受容体細胞を、本開示のＭＬＴトランスポザーゼ（ＲＮＡヘルパー）を使用して転移するためのリポフェクション条件を決定することであった。
【0190】
６６１Ｗ細胞を、１０ｕｇ：５ｕｇの、ドナートランスポゾンＤＮＡ（ＣＡＧ－ＧＦＰ）：ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２ｍＲＮＡ（ドナーＤＮＡ：ヘルパーＲＮＡ）の比でトランスフェクトした。比較的多くの数のＧＦＰ陽性細胞を含む培養物をもたらす条件を、７～１４日間継代して培養物において維持した。１４日間は、ＧＦＰの一過性発現を喪失させるのに十分な期間であると予想される。トランスフェクション後の異なる時点で細胞を撮像して、発現を監視し、１４日以内にＧＦＰ発現を無くす条件を決定した。最適なトランスフェクトされた培養物を撮像し、フローサイトメトリーによって分析して、ＧＦＰ発現を保持している細胞のパーセンテージを決定する。４０％超のＧＦＰ発現を有する培養物を、ｑＰＣＲによって分析して、コピー数を決定する。
【0191】
本研究では、以下の薬剤：ドナーＤＮＡ（＞１ｕｇ／ｕｌ、３００ｕｌ、１ｘＴＥ緩衝液、エンドトキシン非含有、滅菌）、ヘルパーＲＮＡ ＭＬＴトランスポザーゼ１（＞５００ｎｇ／ｕｌ、１００ｕｌ、ヌクレアーゼ非含有水、滅菌）、及びヘルパーＲＮＡ ＭＬＴトランスポザーゼ２（＞５００ｎｇ／ｕｌ、１００ｕｌ、ヌクレアーゼ非含有水、滅菌）を使用した。本研究で使用した試薬を表１に示す。
【0192】
【表1】
【0193】
結果
図３は、変動するリポフェクション試薬、ならびに本開示のＭＬＴトランスポザーゼ１もしくはＭＬＴ１（配列番号１３のアミノ酸配列を含む）、またはＭＬＴトランスポザーゼ２もしくはＭＬＴ２（配列番号１５のアミノ酸配列を含む）のいずれかを用いたトランスフェクションの２４時間後の、６６１Ｗマウス光受容体細胞のＧＦＰ発現を、トランスフェクトされていない細胞と比較して示す。
図３は、変動するリポフェクション試薬、ならびに本開示のＭＬＴトランスポザーゼ１もしくはＭＬＴ１（配列番号１３のアミノ酸配列を含む）、またはＭＬＴトランスポザーゼ２もしくはＭＬＴ２（配列番号１５のアミノ酸配列を含む）のいずれかを用いたトランスフェクションの２４時間後の、６６１Ｗマウス光受容体細胞のＧＦＰ発現を、トランスフェクトされていない細胞と比較して示す。
【0194】
図４は、１５日間にわたる４回の継代後のマウス光受容体細胞株６６１Ｗにおける転移によるドナーＤＮＡ（ＧＦＰ）の安定的な組み込みを示す。
【0195】
図５は、１５日目のマウス光受容体細胞株６６１Ｗにおける転移によるドナーＤＮＡ（ＧＦＰ）の安定的な組み込みのＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【0196】
図３に示されるように、全てのトランスフェクトされていない細胞は、いかなるＧＦＰ発現も示さなかった。トランスフェクションのためにＭＬＴトランスポザーゼ１を使用することによって、２４時間後に６６１Ｗ細胞に存在するＧＦＰ発現がもたらされた。ＭＬＴトランスポザーゼ２についても同じことが観察された（図３）。ＭＡＸ＋ＣＡＧ－ＧＦＰは、ＭＬＴトランスポザーゼ１またはＭＬＴトランスポザーゼ２のいずれのトランスフェクションにおいても、あまりＧＦＰを発現しなかった。Ｌ３＋ＣＡＧ－ＧＦＰは、トランスフェクションの２４時間後に少量のＧＦＰを発現した。ＬＴＸ＋ＣＡＧ－ＧＦＰは、トランスフェクションの２４時間後に適度な量のＧＦＰを発現した。ＬＴＸは、トランスフェクションの２４時間後に、４０～５０％の細胞がＧＦＰを発現していた。
【0197】
ヘルパーＲＮＡ（ＭＬＴトランスポザーゼ１またはＭＬＴトランスポザーゼ１）がＧＦＰドナーＤＮＡと長期間にわたって共発現した条件でのみ、トランスフェクトされた細胞でＧＦＰは発現し続けた（図４）。１５日の期間をかけて細胞を４回継代し、ドナーのみのＤＮＡ状態はその発現を喪失した一方で、ＭＬＴトランスポザーゼ１またはＭＬＴトランスポザーゼ２のいずれかを含むドナーＤＮＡ（ＧＦＰ）は、ＧＦＰを発現し続けた。
【0198】
４つの条件全てについて、１５日目にＦＡＣＳ分析を実行した（図５）。ＦＡＣＳデータは、ＭＬＴトランスポザーゼ１が、ＭＬＴトランスポザーゼ２とともにＧＦＰドナーＤＮＡで共トランスフェクトされた細胞と比較して、より多くのＧＦＰ発現を示すことを示唆している。ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２の両方は、ドナーＤＮＡ単独またはトランスフェクトされていない条件と比較して、ＧＦＰの発現が顕著に高いことを示した。
【0199】
要約すると、このデータは、リポフェクタミンでは、ＬＴＸ（ＰＬＵＳ試薬を含むリポフェクタミン）が、ＣＡＧ－ＧＦＰ、及びＭＬＴトランスポザーゼ１またはＭＬＴトランスポザーゼ２のいずれかを含む６６１Ｗ細胞を転移するための有効な試薬であることを示す。ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２の両方は、トランスフェクションの２４時間後に同様のＧＦＰ発現を有し、したがって、転移によってドナーＤＮＡの安定的な組み込みが得られた。６６１Ｗ細胞型では、ＭＬＴトランスポザーゼ１は、ＭＬＴトランスポザーゼ２と比較して、より効果的な転移を示した。
【0200】
実施例７－ＭＬＴトランスポザーゼを用いたＡＲＰＥ－１９ヒト網膜色素上皮細胞トランスフェクション
この研究の目的は、ＣＡＧ－ＧＦＰドナー構築物を使用して、網膜細胞株における安定的な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現についての、２つの異なるヘルパーＲＮＡトランスポザーゼ（ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２）対ドナーＤＮＡトランスポゾンに対するヘルパーＲＮＡトランスポザーゼ（Ｔｓ）の効果を評価することであった。
この研究の目的は、ＣＡＧ－ＧＦＰドナー構築物を使用して、網膜細胞株における安定的な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現についての、２つの異なるヘルパーＲＮＡトランスポザーゼ（ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２）対ドナーＤＮＡトランスポゾンに対するヘルパーＲＮＡトランスポザーゼ（Ｔｓ）の効果を評価することであった。
【0201】
ＡＲＰＥ－１９細胞を、１０μｇ：５μｇのドナートランスポゾンＤＮＡ（ＣＡＧ－ＧＦＰ）：ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２ｍＲＮＡ（ドナーＤＮＡ：ヘルパーＲＮＡ）の比でトランスフェクトした。比較的多くの数のＧＦＰ陽性細胞を含む培養物をもたらす条件を、７～１４日間継代して培養物において維持した。１４日間は、ＧＦＰの一過性発現を喪失させるのに十分な期間であると予想される。トランスフェクション後の異なる時点で細胞を撮像して、発現を監視し、１４日以内にＧＦＰ発現を無くす条件を決定した。最適なトランスフェクトされた培養物を撮像し、フローサイトメトリーによって分析して、ＧＦＰ発現を保持している細胞のパーセンテージを決定した。
【0202】
本研究では、以下の薬剤：ドナーＤＮＡ（＞１ｕｇ／ｕｌ、３００ｕｌ、１ｘＴＥ緩衝液、エンドトキシン非含有、滅菌）、ヘルパーＲＮＡ ＭＬＴトランスポザーゼ１（＞５００ｎｇ／ｕｌ、１００ｕｌ、ヌクレアーゼ非含有水、滅菌）、ヘルパーＲＮＡ ＭＬＴトランスポザーゼ２（＞５００ｎｇ／ｕｌ、１００ｕｌ、ヌクレアーゼ非含有水、滅菌）を使用した。本研究で使用した試薬を表２に示す。
【0203】
【表2】
【0204】
図６は、トランスフェクションの２４時間後のＡＲＰＥ－１９細胞におけるＧＦＰの発現を示す。この実験では、ＡＲＰＥ－１９細胞を２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を３つの異なるトランスフェクション系：Ｌ３（リポフェクタミン３０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ｌ３０００－００１）、ＬＴＸ（リポフェクタミンＬＴＸ＆ＰＬＵＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ１２６２１）、及びＭＡＸ（リポフェクタミンメッセンジャーＭＡＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＬＭＲＮＡ００１）でトランスフェクトした。次いで、トランスフェクションの２４時間後、細胞をＧＦＰのために撮像した。
【0205】
図７は、トランスフェクションの２４時間後の、ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２の目視可能なＧＦＰ発現のより高い解像度画像を示す。
【0206】
図８は、ＭＬＴトランスポザーゼ２を用いた、光受容体細胞株ＡＲＰＥ１９におけるドナーＤＮＡ（ＧＦＰ）の安定的な組み込みを示す。
【0207】
図９は、ＦＡＣＳ分析が、４世代の細胞分裂後のＡＲＰＥ１９細胞株からの安定的なＧＦＰ発現を示すことを示す。
【0208】
本研究の結果に示されるように、全てのトランスフェクトされていない細胞は、図６に見ることができるように、いかなるＧＦＰ発現も示さなかった。Ｌ３及びＣＡＧ－ＧＦＰのみが、トランスフェクションの２４時間後にＧＦＰの存在を発現した。ＬＴＸ及びＣＡＧ－ＧＦＰのみが、トランスフェクション後２４時間後に最も多くのＧＦＰの存在を発現した。ＭＡＸ及びＣＡＧ－ＧＦＰも同様に、トランスフェクションの２４時間後に中程度のＧＦＰ発現を示した。ＭＬＴトランスポザーゼ１をリポフェクション試薬及びＣＡＧ－ＧＦＰに添加した場合、依然として２４時間後に細胞にＧＦＰ発現が存在したが、それはリポフェクション試薬及びＣＡＧ－ＧＦＰのみほど多くはなかった。ＭＬＴトランスポザーゼ２についても同じことが当てはまった（図６を参照されたい）。ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２は、ＭＬＴトランスポザーゼ１（左の欄）及びＭＬＴトランスポザーゼ２（右の欄）の両方を含むリポフェクション試薬＋ＤＮＡを並べて比較すると、ＧＦＰ発現効率において同様であり、これは図７に見ることができる。
【0209】
ドナーＤＮＡ、ＧＦＰは、ＭＬＴトランスポザーゼ１またはＭＬＴトランスポザーゼ２のいずれかのヘルパーと共過剰発現した場合にのみ、ＡＲＰＥ１９細胞株において安定的に組み込まれていることが見出された。目視可能なシグナルが一過性でないことを確認するために、ＧＦＰの発現を１５日間及び４回の継代の間に調査した。ドナーのみの条件は、２回目の継代後にＧＦＰ発現を喪失した（図８を参照されたい）。
【0210】
フローサイトメトリー分析は、ＭＬＴトランスポザーゼ２が、トランスフェクトされていないかまたはドナーのみ等の他の条件と比較して、ドナー（ＧＦＰ）の安定的な転移において顕著により有効であることを明らかにした。ＭＬＴトランスポザーゼ１もまた、ＧＦＰの安定的な組み込みに有効であるように思われた（図９）。
【0211】
リポフェクタミン＆ＰＬＵＳは、ＣＡＧ－ＧＦＰのみを使用する場合、ならびにＣＡＧ－ＧＦＰとＭＬＴトランスポザーゼ１またはＭＬＴトランスポザーゼ２のいずれかとの両方を使用する場合、効率的なリポフェクション試薬であった。ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２の両方は、これらのＡＲＰＥ－１９細胞では同様のＧＦＰ発現率を有した。これらのデータは、ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２の両方が、ゲノムへのドナーＤＮＡの安定的な転移において効率的であることを示す。しかしながら、ＭＬＴトランスポザーゼ２は、ＭＬＴトランスポザーゼ１よりも、ＡＲＰＥ１９細胞株におけるドナーＤＮＡの安定的な組み込みにおいてより効果的である。
【0212】
実施例８－ドナーＤＮＡ（ＣＡＧ－ＧＦＰ）／ＭＬＴトランスポザーゼを使用するマウスインビボ網膜下ＬＮＰ用量薬力学
この研究の目的は、ドナーＤＮＡ（ＣＡＧ－ＧＦＰ）をコードする核酸及びヘルパーＲＮＡ（ＭＬＴトランスポザーゼ２またはＭＬＴ２）をコードする核酸を含む、２つの用量（高及び低）の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の網膜下注射後のマウス網膜におけるＧＦＰ発現レベルを分析することであった。
この研究の目的は、ドナーＤＮＡ（ＣＡＧ－ＧＦＰ）をコードする核酸及びヘルパーＲＮＡ（ＭＬＴトランスポザーゼ２またはＭＬＴ２）をコードする核酸を含む、２つの用量（高及び低）の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の網膜下注射後のマウス網膜におけるＧＦＰ発現レベルを分析することであった。
【0213】
本研究では、ドナーＤＮＡ（ＣＡＧ－ＧＦＰ）及びヘルパーＲＮＡ（ＭＬＴトランスポザーゼ２またはＭＬＴ２）を２：１の比で含む、２つの用量の脂質ナノ粒子製剤の網膜下注射後に、マウス網膜におけるＧＦＰ発現を測定した。「高」用量は、５００ｎｇ／ｕＬ（３３３ｎｇのドナーＤＮＡ／１６６ｎｇヘルパーＲＮＡ）であり、「低」用量は、２５０ｎｇ／ｕＬ（１６６ｎｇのドナーＤＮＡ／８３ｎｇヘルパーＲＮＡ）であった。
【0214】
光受容体層及びＲＰＥ細胞層における網膜ＧＦＰ発現の結果を、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定した。
【0215】
脂質ナノ粒子にともにカプセル化されたドナーＤＮＡ（ＣＡＧ－ＧＦＰ）及びＭＬＴトランスポザーゼ２（Ｓ８Ｐ／Ｃ１３Ｒ変異を有するＭＬＴ）を、左眼に注射した。脂質ナノ粒子によってカプセル化されたドナーＤＮＡのみを、右眼に注入した。目標は、ＭＬＴトランスポザーゼ２が、細胞損傷を引き起こすことなく、網膜にＡＲＰＥ－１９細胞をトランスフェクトすることができることを実証することであった。
【0216】
本研究では、ＣＡＧ－ＧＦＰをコードするＤＮＡ（ＶＢ２００８１９－１０２４ｇｚｍ）を使用し、ＭＬＴトランスポザーゼ２をコードするＲＮＡ（ＶＢ２００９２６－１０５５ｑｋｑ）を使用した。ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、コレステロール、リン脂質、及びＰＥＧ脂質を有した。表２は、本実験で使用したマウスに関する情報を含む。
【0217】
【表3】
【0218】
結果
マウスの眼の画像を、眼底撮像であるＰｈｏｅｎｉｘ ＭＩＣＲＯＮ ＩＶ（商標）Ｒｅｔｉｎａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して捉えた。
マウスの眼の画像を、眼底撮像であるＰｈｏｅｎｉｘ ＭＩＣＲＯＮ ＩＶ（商標）Ｒｅｔｉｎａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して捉えた。
【0219】
【0220】
図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、及び１１Ｄは、ＤＮＡのみを注射したマウス３－１Ｌ及び３－１Ｒ右眼（図１１Ａ及び図１１Ｃ）ならびにドナーＤＮＡ及びＭＬＴ２を注射したマウス３－１Ｌ及び３－１Ｒ左眼（図１１Ｂ及び図１１Ｄ）の画像を示す。
【0221】
【0222】
【0223】
【0224】
【0225】
図１６は、本研究の一般的な設定を示し、加えて、画像が網膜下注射の２１日後に撮影されたことを示す。図１７は、トランスフェクションで使用したＭＬＴトランスポザーゼを含む（「＋ＭＬＴ」）かまたは含まない（「－ＭＬＴ」）、網膜下注射の２１日後に撮影した、マウスの左眼及び右眼（それぞれ上段及び下段）の画像を示す。図１７では、右眼は対照（ドナーＤＮＡのみ）であり、左眼は治療した眼（ドナーＤＮＡ＋ＭＬＴ２トランスポザーゼ）である。
【0226】
図１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ－１１Ｄ、１２Ａ、１２Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａ、１５Ｂ、及び１７は、５００ｎｇ／ｕＬの高用量で治療したマウスの眼の画像を示す。
【0227】
この研究の結果は、ドナーＤＮＡ（この実施例ではＣＡＧ－ＧＦＰ）とともにカプセル化したＭＬＴトランスポザーゼ２を網膜下注射した場合、マウスの眼に悪影響を及ぼさないことを示す。図１４Ａ及び１４Ｂに示されるように、網膜下注射の７日後の両眼は、目視可能な損傷を受けず、ＧＦＰ発現を呈した。動物間、及びまた同じ動物の左右の眼間で、いくらかの外科的効率の変動が認められた。
【0228】
本研究では、ドナーＤＮＡからの遺伝子の転移の成功をもたらすＭＬＴトランスポザーゼ用量が、５００ｎｇ／ｕＬ（３３３ｎｇのＤＮＡ／１６６ｎｇのＲＮＡ）であると決定した。
【0229】
結論として、本研究は、眼の網膜下へのＬＮＰの注射の際に、導入遺伝子（導入遺伝子の実施例として使用した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））の陽性発現を示す。導入遺伝子の発現は２１日まで続き（図１７を参照されたい）、療法的使用のための本アプローチの実現可能性を実証した。
【0230】
等価物
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載したが、更なる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明の任意の変形、使用、または適応を網羅するものであり、本発明が属する技術分野において知られているか、または慣行に含まれるような本開示からの逸脱、及び前述される本質的な特徴に適用され得るもの、ならびに添付の請求項の範囲に含まれるような本開示からの逸脱を含むことを理解されたい。
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載したが、更なる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明の任意の変形、使用、または適応を網羅するものであり、本発明が属する技術分野において知られているか、または慣行に含まれるような本開示からの逸脱、及び前述される本質的な特徴に適用され得るもの、ならびに添付の請求項の範囲に含まれるような本開示からの逸脱を含むことを理解されたい。
【0231】
当業者であれば、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に具体的に記載される特定の実施形態の多数の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図される。
【0232】
参照による組み込み
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0233】
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前に単独でそれらの開示が提供されている。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【0234】
本明細書で使用される場合、全ての見出しは単に本明細書の構成のためのものであり、いかなる様式においても開示を制限することを意図したものではない。いかなる個々のセクションの内容も、全てのセクションに等しく適用可能であり得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】