特表 2023-523714 新規なイントロン断片

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-07

(54)【発明の名称】新規なイントロン断片

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20230531BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230531BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230531BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230531BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230531BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230531BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230531BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230531BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230531BHJP

   C12N 7/02 20060101ALI20230531BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230531BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230531BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20230531BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230531BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20230531BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230531BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230531BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/864 100Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N7/01

C12N7/02

C12N15/12

A61K48/00

A61K35/761

A61K35/76

A61P27/02

A61P3/10

A61K31/7088

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022563904

(86)(22)【出願日】2021-07-08

(85)【翻訳文提出日】2022-10-20

(86)【国際出願番号】 KR2021008693

(87)【国際公開番号】W WO2022010277

(87)【国際公開日】2022-01-13

(31)【優先権主張番号】10-2020-0084038

(32)【優先日】2020-07-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】17/365,884

(32)【優先日】2021-07-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520288331

【氏名又は名称】ニューラクル ジェネティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】コン，フン ヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジョン－ムク

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】シン，ソンファ

(72)【発明者】

【氏名】イ，キョンウォン

(72)【発明者】

【氏名】ハン，ジュ ソク

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA33

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA14

4C086ZA33

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA33

(57)【要約】

新規なイントロン断片を提供する。前記イントロン断片は、様々な種類のプロモーター及びスプライシングドナーと組み合わせた場合でも、遺伝子発現を増加させる能力を維持しながら、全長イントロンによって達成されるレベルと同等又はそれより高いレベルで遺伝子発現を増加させることができる。特に、前記イントロン断片は、サイズが制限された遺伝情報伝達システム、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びラブドウイルスで使用される場合、より大きな外来遺伝子の担持を可能にする。したがって、前記イントロン断片の使用は治療用遺伝子の範囲を広げることが期待される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列リストの第１配列の８７４～９２４番目のヌクレオチドと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する非翻訳核酸配列を含み、前記非翻訳核酸配列が配列リストの第１配列を含まない単離されたポリヌクレオチド。

【請求項2】

前記非翻訳核酸配列が配列リストの第５７配列に示したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記非翻訳核酸配列が配列リストの第５７配列に示したヌクレオチド配列からなることを特徴とする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチドと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する非翻訳核酸配列を含み、前記非翻訳核酸配列が配列リストの第１配列を含まない単離されたポリヌクレオチド。

【請求項5】

前記非翻訳核酸配列が配列リストの第３配列に示したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

前記非翻訳核酸配列が配列リストの第３配列に示したヌクレオチド配列からなることを特徴とする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチドと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する非翻訳核酸配列を含み、前記非翻訳核酸配列が配列リストの第１配列を含まない単離されたポリヌクレオチド。

【請求項8】

前記非翻訳核酸配列が配列リストの第２配列に示したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】

前記非翻訳核酸配列が配列リストの第２配列に示したヌクレオチド配列からなることを特徴とする、請求項７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】

前記非翻訳核酸配列の５’末端（「５’領域」）に少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個又は少なくとも約１００個のヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】

前記非翻訳核酸配列の５’領域に、配列リストの第１配列内の１～８７３番目の位置に該当する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

前記非翻訳核酸配列の３’末端（「３’領域」）に少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個又は少なくとも約１００個のヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項13】

前記非翻訳核酸配列が、（ｉ）配列リストの第１配列の８７１～９２４番目（すなわち、配列リストの第５８配列）、（ｉｉ）配列リストの第１配列の８６１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第５９配列）、（ｉｉｉ）配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６０配列）、（ｉｖ）配列リストの第１配列の８５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６１配列）、（ｖ）配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第２配列）、（ｖｉ）配列リストの第１配列の８２１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６３配列）、（ｖｉｉ）配列リストの第１配列８１１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６４配列）、（ｖｉｉｉ）配列リストの第１配列の８０８～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６５配列）、（ｉｘ）配列リストの第１配列の８０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６６配列）、（ｘ）配列リストの第１配列の７５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６７配列）、（ｘｉ）配列リストの第１配列の７２１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６８配列）、（ｘｉｉ）配列リストの第１配列の７０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６９配列）、（ｘｉｉｉ）配列番号１配列の６５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７０配列）、（ｘｉｖ）配列リストの第１配列の６０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７１配列）、（ｘｖ）配列リストの第１配列の５７０～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７２配列）、（ｘｖｉ）配列リストの第１配列の５５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７３配列）又は（ｘｖｉｉ）配列リストの第１配列の５０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７４配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。

【請求項14】

外来遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項15】

前記外来遺伝子がポリペプチドとして翻訳され得ることを特徴とする、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項16】

前記非翻訳核酸配列は、翻訳時の基準発現と比較して前記外来遺伝子の発現を増加させることができるものであって、前記基準発現は非翻訳核酸配列のない状態及び／又は配列リストの第１配列に示したヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列が存在する状態で、翻訳時に該当外来遺伝子の発現を含むことを特徴とする、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項17】

前記非翻訳核酸配列が前記外来遺伝子の発現を前記基準発現より少なくとも約１倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍又は少なくとも約１０倍増加させることができることを特徴とする、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項18】

プロモーターをさらに含むことを特徴とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項19】

前記プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、β－アクチンプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＨＳＰ７０プロモーター、ＧＲＰ７８プロモーター、ｅＩＦ４ａプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＴＴＲプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＧＲＫプロモーター、Ｒｈｏプロモーター又はそれらの任意の組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項20】

前記プロモーターがＥＦ－１αプロモーターであることを特徴とする、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項21】

前記ＥＦ－１αプロモーターが配列リストの第７配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項22】

前記プロモーターがＣＭＶプロモーターを含むことを特徴とする、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項23】

前記ＣＭＶプロモーターが配列リストの第５配列又は第６配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項24】

前記プロモーターがβ－アクチンプロモーターを含むことを特徴とする、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項25】

前記β－アクチンプロモーターが配列リストの第８配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％。、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項26】

エンハンサーをさらに含むことを特徴とする、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項27】

前記エンハンサーがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ＳＶ４０初期エンハンサー、アデノウイルス５ Ｅ１Ａエンハンサー、ＨＢＶエンハンサー－１調節領域（Ｅｈ－１）、ＨＰＶ－１６又は－１８Ｅ６／７長い調節領域（ＬＣＲ）、ＨＩＶ－１長い反復末端（ＬＴＲ）又はそれらの任意の組み合わせを含むことを特徴とする、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項28】

前記ＣＭＶエンハンサーが配列リストの第４配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項29】

スプライシングドナー配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項30】

前記スプライシングドナー配列が前記非翻訳核酸配列の上流に連結されていることを特徴とする、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項31】

前記スプライシングドナー配列が配列リストの第９配列又は第１０配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％。、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項２９又は３０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項32】

ＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）ヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１～３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項33】

前記ＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）ヌクレオチド配列が配列リストの第１１配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項34】

サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エクソン１（Ｅ１）配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列、β－アクチンＥ１配列、又はそれらの任意の組み合わせをさらに含むことを特徴とする、請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項35】

前記ＣＭＶ Ｅ１配列が配列リストの第１２配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項36】

前記ＥＦ－１α Ｅ１配列が配列リストの第１３配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項37】

前記β－アクチンＥ１配列が配列リストの第１４配列又は第１５配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％。、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項38】

免疫細胞に特異的なｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に対する少なくとも１つのターゲット配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１～３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項39】

前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ１４２－３ｐ、ｍｉＲ１４２－５ｐ又はその両方を含むことを特徴とする、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項40】

前記ｍｉＲＮＡに対するターゲット配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴミア、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、リボザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせを含むことを特徴とする、請求項３８又は請求項３９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項41】

前記ｍｉＲＮＡのターゲット配列がｍｉＲ１４２－３ｐ又はｍｉＲ１４２－５ｐの全長又は一部の配列に相補的であることを特徴とする、請求項４１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項42】

前記ｍｉＲＮＡのターゲット配列は、配列リストの第１６配列又は配列リストの第１７配列に示したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項43】

少なくとも２つのターゲット配列、少なくとも３つのターゲット配列、少なくとも４つのターゲット配列、少なくとも５つのターゲット配列、少なくとも６つのターゲット配列、少なくとも７つのターゲット配列、少なくとも８つのターゲット配列、少なくとも９つのターゲット配列又は少なくとも１０個のターゲット配列を含むことを特徴とする、請求項３８～４２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項44】

前記ターゲット配列のうち２つ以上が同じでいることを特徴とする、請求項４３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項45】

前記ターゲット配列は相異なることを特徴とする、請求項４３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項46】

ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１～４５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項47】

前記ＷＰＲＥ配列が配列リストの第１８配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項４６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項48】

１つ以上のポリアデニル化（ｐＡ）配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１～４７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項49】

前記ｐＡ配列が配列リストの第１９配列～第２２配列のいずれかに示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％。、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項４８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項50】

前記外来遺伝子が野生型ポリペプチド又はその任意の変異体、融合タンパク質、抗体又はその抗原結合断片、ＲＮＡベースの分子又はそれらの任意の組み合わせをコーディングすることを特徴とする、請求項１４～４９のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

【請求項51】

前記外来遺伝子が配列リストの第２３配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項５０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項52】

前記外来遺伝子が融合タンパク質をコーディングすることを特徴とする、請求項５０又は５１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項53】

前記融合タンパク質が血管内皮細胞成長因子（「ＶＥＧＦ」）の阻害剤を含むことを特徴とする、請求項５０～５２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

【請求項54】

前記ＶＥＧＦの阻害剤がアプリバセプトを含むことを特徴とする、請求項５３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項55】

前記ＲＮＡベースの分子が、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム又はそれらの任意の組み合わせを含むことを特徴とする、 請求項５０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項56】

組換え発現構築物であることを特徴とする、請求項１～５５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

【請求項57】

（ｉ）外来遺伝子及び（ｉｉ）前記外来遺伝子に作動可能に連結された調節要素を含むポリヌクレオチドであって、前記調節要素が（５’から３’方向に）：
（１）配列リストの第４配列に示したＣＭＶエンハンサー；
（２）配列リストの第５配列又は第６配列に示したＣＭＶプロモーター配列、配列リストの第７配列に示したＥＦ－１αプロモーター配列又は配列リストの第８配列に示したチキンβ－アクチンプロモーター配列から選択されるプロモーター；
（３）配列リストの第１２配列に示したＣＭＶ Ｅ１配列、配列リストの第１３配列に示したＥＦ－１α Ｅ１配列又は配列リストの第１４配列又は第１５配列に示したチキンβ－アクチンＥ１配列から選択されるエクソン１（Ｅ１）配列；
（４）配列リストの第９配列又は第１０配列に示したスプライシングドナー配列；
（５）配列リストの第２配列（ＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧ）、配列リストの第３配列（ＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧ）又は配列リストの第５７配列（ＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧ）に示したヌクレオチド配列を含むか、前記ヌクレオチド配列から必須になるか、又は前記ヌクレオチド配列からなる非翻訳核酸配列；及び
（６）配列リストの第１１配列に示したＥＦ－１α Ｅ２配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項58】

請求項１～５７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項59】

ウイルスベクターであることを特徴とする、請求項５８に記載のベクター。

【請求項60】

前記ウイルスベクターは、アデノウイルス（例えば、遺伝子操作されたアデノウイルス）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、ＳＶ４０型ウイルス、ポリオマウイルス、エプスタインバーウイルス、乳頭腫ウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス、ボックスウイルス、又はそれらの任意の組み合わせを含むことを特徴する、請求項５９に記載のベクター。

【請求項61】

前記ウイルスベクターがＡＡＶであることを特徴とする、請求項６０に記載のベクター。

【請求項62】

遺伝子治療に使用するためのことを特徴とする、請求項５８～６１のいずれかに記載のベクター。

【請求項63】

前記遺伝子によってコーディングされるポリペプチドの発現に使用するためのことを特徴とする、請求項５８～６２のいずれかに記載のベクター。

【請求項64】

前記外来遺伝子が配列リストの第２３配列に示したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項５８～６３のいずれかに記載のベクター。

【請求項65】

請求項１～５７のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は請求項５８～６４のいずれかに記載のベクターを含む細胞。

【請求項66】

請求項５８～６４のいずれかに記載のベクター及びｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含む構築物に細胞を形質導入することを含む組換えウイルス粒子を産生するための方法。

【請求項67】

産生された組換えウイルス粒子を分離することをさらに含むことを特徴とする、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

請求項６６又は６７に記載の方法によって産生された組換えウイルス粒子。

【請求項69】

（ａ）キャプシドタンパク質及び（ｂ）請求項５８～６４のいずれかに記載のベクターを含む組換えウイルス粒子。

【請求項70】

アデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）であることを特徴とする、請求項６９に記載の組換えウイルス粒子。

【請求項71】

前記ＡＡＶの血清型がＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ１０であることを特徴とする、請求項７０に記載の組換えウイルス粒子。

【請求項72】

前記ＡＡＶの血清型がＡＡＶ２であることを特徴とする、請求項７１に記載の組換えウイルス粒子。

【請求項73】

前記ＡＡＶの血清型がＡＡＶ８であることを特徴とする、請求項７１に記載の組換えウイルス粒子。

【請求項74】

前記ＡＡＶの血清型がＡＡＶ５であることを特徴とする、請求項７１に記載の組換えウイルス粒子。

【請求項75】

前記ＡＡＶの血清型がＡＡＶ９であることを特徴とする、請求項７１に記載の組換えウイルス粒子。

【請求項76】

（ａ）請求項１～５７のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項５８～６４のいずれかに記載のベクター、請求項６５に記載の細胞又は請求項６８～７５のいずれかに記載の組換えウイルス粒子；及び
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項77】

組換えアデノ随伴ウイルス粒子と薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、
前記組換えアデノ随伴ウイルス粒子が、（ａ）ＡＡＶ８型キャプシドタンパク質及び（ｂ）（ｉ）配列リストの第２３配列に示したヌクレオチド配列を含む外来遺伝子及び（ｉｉ）前記外来遺伝子に作動可能に連結され（５’から３’方向に）：
（１）配列リストの第４配列に示したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー配列；
（２）配列リストの第８配列に示したチキンβ－アクチンプロモーター配列；
（３）配列リストの第１５配列に示したチキンβ－アクチンエクソン１（Ｅ１）配列；
（４）配列リストの第１０配列に示したチキンβ－アクチンイントロンのスプライシングドナー配列；
（５）配列リストの第２配列（ＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧ）、配列リストの第３配列（ＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧ）又は配列リストの第５７配列（ＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧ）に示したヌクレオチド配列を含むか、前記ヌクレオチド配列から必須になるか、又は前記ヌクレオチド配列からなる非翻訳核酸配列；及び
（６）配列リストの第１１配列に示したＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列；を含む調節要素を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物。

【請求項78】

組換えアデノ随伴ウイルス粒子及び薬学的に許容される担体を含む眼科疾患を予防又は治療するための医薬組成物であって、
前記組換えアデノ随伴ウイルス粒子が、（ａ）ＡＡＶ８型キャプシドタンパク質及び（ｂ）（ｉ）配列リストの第２３配列に示したヌクレオチド配列を含む外来遺伝子及び（ｉｉ）前記外来遺伝子に作動可能に連結され（５’から３’方向に）：
（１）配列リストの第４配列に示したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー配列；
（２）配列リストの第８配列に示したチキンβ－アクチンプロモーター配列；
（３）配列リストの第１５配列に示したチキンβ－アクチンエクソン１（Ｅ１）配列；
（４）配列リストの第１０配列に示したチキンβ－アクチンイントロンのスプライシングドナー配列；
（５） 配列リストの第２配列 （ＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧ）、 配列リストの第３配列 （ＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧ）又は配列リストの第５７配列 （ＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧ）に示したヌクレオチド配列を含むか、前記ヌクレオチド配列から必須になるか、又は前記ヌクレオチド配列からなる非翻訳核酸配列；及び
（６）配列リストの第１１配列に示したＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列；を含む調節要素を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物。

【請求項79】

前記眼科疾患は、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管形成、黄斑変性、網膜変性、黄斑浮腫、網膜浮腫、黄斑腫脹、又はそれらの組み合わせを含む用途であることを特徴とする、請求項７８に記載の医薬組成物。

【請求項80】

前記黄斑変性が年齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）を含む用途であることを特徴とする、請求項７９に記載の医薬組成物。

【請求項81】

細胞における外来遺伝子の発現を増加させる方法であって、
前記細胞を、請求項１～５７のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項５８～６４のいずれかに記載のベクター又は請求項６８～７５のいずれかに記載の組換えウイルス粒子と接触させることを含む方法。

【請求項82】

前記接触を生体内で行うことを特徴とする、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記接触前に、前記ポリヌクレオチド、ベクター又は組換えウイルス粒子を前記対象に投与することを含むことを特徴とする、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記接触を生体外で行うことを特徴とする、請求項８１に記載の方法。

【請求項85】

前記外来遺伝子の発現は、基準細胞における該当発現と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍又は少なくとも約１０倍増加し、前記基準細胞は、前記非翻訳核酸配列が欠けているか、配列リストの第１配列に示したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ベクター又は組換えウイルス粒子と接触することを特徴とする、請求項８１～８４のいずれかに記載の方法。

【請求項86】

必要な対象において疾患又は障害を治療する方法であって、請求項１～５７のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項５８～６４のいずれかに記載のベクター又は請求項６８～７５のいずれかに記載の組換えウイルス粒子を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項87】

前記疾患又は障害が眼科疾患を含むことを特徴とする請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記眼科疾患が、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管形成、黄斑変性、網膜変性、黄斑浮腫、網膜浮腫、黄斑腫脹、又はそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記黄斑変性が年齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）を含むことを特徴とする請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

追加の治療薬を前記対象に投与することを含むことを特徴とする、請求項８６～８９のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

〔技術分野〕
本開示内容は、外来遺伝子の発現量を増加させることができる新規なイントロン断片（すなわち、非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）核酸配列）に関する。

【0002】

〔背景技術〕
真核生物のｐｒｅ－ｍＲＮＡは、実際の遺伝情報を含むエクソン（ｅｘｏｎ）とエクソンとの間に存在するイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）から構成され、３’－末端にはポリＡ配列が存在する。イントロンは、ｍＲＮＡ代替スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇ）に影響を及ぼし、タンパク質生産量を調節する（Ｈｕｈ，ＧＳ，ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｒｅｐｅａｔｅｄ Ｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ，”Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ８（１３）：１５６１－７４（Ｊｕｌ．１９９４）；Ｐａｒｅｎｔｅａｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｒｏｎｓ Ｗｉｔｈｉｎ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｎｅｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ，”Ｃｅｌｌ １４７（２）：３２０－３１（Ｏｃｔ．２０１１））。また、イントロンを含む外来遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ）は、マウスにおいてイントロンがない場合に比べて１０倍～１００倍より効率的に転写され、さらに生存に影響を与えると報告されている（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，ＲＬ，ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｒｏｎｓ Ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５（３）：８３６－４０（Ｆｅｂ．１９８８）；Ｐａｒｅｎｔｅａｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｒｏｎｓ Ａｒｅ Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ ５６５（７７４１）：６１２－６１７（Ｊａｎ．２０１９））。このうち、イントロンによるタンパク質産生量の増加は、イントロン媒介増強（ＩＭＥ：ｉｎｔｒｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）と呼ばれるが、このようなＩＭＥ効果のために使用されるイントロンはほとんどかなり長いため、実際の使用において制約がある。一例として、最近、遺伝子治療用の伝達体として注目されているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）の場合、最大４．７ｋｂｐ長の遺伝情報のみを挿入できるので、長い長さのイントロンを使用すれば、伝達できる遺伝子の範囲が非常に限られる。したがって、タンパク質発現増加能力は維持しながら、短いイントロン断片を発掘してＡＡＶベクターに適用することができれば、非常に好ましいかもしれない。

【0003】

〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
〔関連出願についての相互参照事項〕
本出願は、２０２０年７月８日に出願された韓国特許出願第１０－２０２０－００８４０３８号及び２０２１年７月１日に出願された米国特許出願第１７／３６５，８８４号の優先権を主張し、その全文が本明細書に参照として含まれる。

【0004】

本明細書は、配列リストの第１配列の８７４～９２４番目のヌクレオチドと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する非翻訳核酸配列を含み、前記非翻訳核酸配列が配列リストの第１配列を含まない単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第５７配列に示したヌクレオチド配列を含む。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第５７配列に示したヌクレオチド配列からなる。

【0005】

本明細書は、配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチドと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する非翻訳核酸配列を含み、前記非翻訳核酸配列が配列リストの第１配列を含まない単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第３配列に示したヌクレオチド配列を含む。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第３配列に示したヌクレオチド配列からなる。

【0006】

本明細書は、配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチドと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する非翻訳核酸配列を含み、前記非翻訳核酸配列が配列リストの第１配列を含まない単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第２配列に示したヌクレオチド配列を含む。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第２配列に示したヌクレオチド配列からなる。

【0007】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、前記非翻訳核酸配列の５’末端（「５’領域」）に少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個又は少なくとも約１００個のヌクレオチドをさらに含む。一部の様態において、前記ポリヌクレオチドは、前記非翻訳核酸配列の５’領域で配列リストの第１配列内の１～８７３番目の位置に該当する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含む。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、前記非翻訳核酸配列の３’末端（「３’領域」）に少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個又は少なくとも約１００個のヌクレオチドをさらに含む。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドの非翻訳核酸配列は、（ｉ）配列リストの第１配列の８７１～９２４番目（すなわち、配列リストの第５８配列）、（ｉｉ）配列リストの第１配列の８６１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第５９配列）、（ｉｉｉ）配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６０配列）、（ｉｖ）配列リストの第１配列の８５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６１配列）、（ｖ）配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第２配列）、（ｖｉ）配列リストの第１配列の８２１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６３配列）、（ｖｉｉ）配列リストの第１配列の８１１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６４配列）、（ｖｉｉｉ）配列のリストの第１配列の８０８～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６５配列）、（ｉｘ）配列リストの第１配列の８０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６６配列）、（ｘ）配列リストの第１配列の７５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６７配列）、（ｘｉ）配列リストの第１配列の７２１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６８配列）、（ｘｉｉ）配列リストの第１配列の７０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６９配列）、（ｘｉｉｉ）配列リストの第１配列の６５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７０配列）、（ｘｉｖ）配列リストの第１配列の６０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７１配列）、（ｘｖ）配列リストの第１配列の５７０～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７２配列）、（ｘｖｉ）配列リストの第１配列の５５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７３配列）又は（ｘｖｉｉ）配列リストの第１配列の５０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７４配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。

【0008】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは外来遺伝子をさらに含む。一部の様態において、前記外来遺伝子はポリペプチドとして翻訳され得る。

【0009】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドの非翻訳核酸配列は、翻訳時に基準発現と比較して前記外来遺伝子の発現を増加させることができ、前記基準発現は非翻訳核酸配列のない状態及び／又は配列リストの第１配列に示したヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列が存在する状態で、翻訳時に該当外来遺伝子の発現を含む。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、外来遺伝子の発現を基準発現より少なくとも約１倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍又は少なくとも約１０倍、増加させることができる。

【0010】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドはプロモーターをさらに含む。一部の様態において、前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、β－アクチンプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＨＳＰ７０プロモーター、ＧＲＰ７８プロモーター、ｅＩＦ４ａプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＴＴＲプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＧＲＫプロモーター、Ｒｈｏプロモーター又はそれらの任意の組み合わせを含む。

【0011】

いくつかの様態において、前記プロモーターはＥＦ－１αプロモーターである。一部の様態において、前記ＥＦ－１αプロモーターは、配列リストの第７配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の様態において、前記プロモーターはＣＭＶプロモーターを含む。一部の様態において、前記ＣＭＶプロモーターは、配列リストの第５配列又は第６配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の様態において、前記プロモーターはβ－アクチンプロモーターを含む。一部の様態において、前記β－アクチンプロモーターは、配列リストの第８配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0012】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドはエンハンサーをさらに含む。一部の様態において、前記エンハンサーはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ＳＶ４０初期エンハンサー、アデノウイルス５ Ｅ１Ａエンハンサー、ＨＢＶエンハンサー－１調節領域（Ｅｈ－１）、ＨＰＶ－１６又は－１８Ｅ６／７長い調節領域（ＬＣＲ：ｌｏｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ）、ＨＩＶ－１長い反復末端（ＬＴＲ：ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）又はそれらの任意の組み合わせを含む。一部の様態において、前記ヱンハンサーはＣＭＶエンハンサーである。一部の様態において、前記ＣＭＶエンハンサーは、配列リストの第４配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0013】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、スプライシングドナー（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｏｎｏｒ）配列をさらに含む。一部の様態において、前記スプライシングドナー配列は、前記非翻訳核酸配列の上流に連結される。一部の様態において、前記スプライシングドナー配列は、配列リストの第９配列又は第１０配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0014】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の様態において、前記ＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）ヌクレオチド配列は、配列リストの第１１配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。

【0015】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エクソン１（Ｅ１）配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列、β－アクチンＥ１配列、又はそれらの任意の組み合わせをさらに含む。一部の様態において、前記ＣＭＶ Ｅ１配列は、配列リストの第１２配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記ＥＦ－１α Ｅ１配列は、配列リストの第１３配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記β－アクチンＥ１配列は、配列リストの第１４配列又は第１５配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。

【0016】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、免疫細胞に特異的なｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の少なくとも１つのターゲット配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をさらに含む。一部の様態において、前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ１４２－３ｐ、ｍｉＲ１４２－５ｐ、又はその両方を含む。一部の様態において、前記ｍｉＲＮＡのターゲット配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）分子、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）分子、リボザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）オリゴヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせを含む。一部の様態において、前記ｍｉＲＮＡのターゲット配列は、ｍｉＲ１４２－３ｐ又はｍｉＲ１４２－５ｐの全長又は一部の配列に相補的である。一部の様態において、前記ｍｉＲＮＡのターゲット配列は、配列リストの第１６配列又は配列リストの第１７配列に示したヌクレオチド配列を含む。

【0017】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、少なくとも２つのターゲット配列、少なくとも３つのターゲット配列、少なくとも４つのターゲット配列、少なくとも５つのターゲット配列、少なくとも６つのターゲット配列、少なくとも７つのターゲット配列、少なくとも８つのターゲット配列、ターゲット配列、少なくとも９個のターゲット配列又は少なくとも１０個のターゲット配列を含む。一部の様態において、前記ターゲット配列のうち２つ以上は同じである。一部の様態において、前記ターゲット配列は互いに異なる。

【0018】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ：Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）配列をさらに含む。一部の様態において、前記ＷＰＲＥ配列は、配列リストの第１８配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。

【0019】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、１つ以上のポリアデニル化（ｐＡ）配列をさらに含む。一部の様態において、前記ｐＡ配列は、配列リストの第１９～２２配列のいずれかに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。

【0020】

前記ポリヌクレオチドが外来遺伝子を含む場合、一部の様態において、前記外来遺伝子は野生型ポリペプチド又はその任意の変異体、融合タンパク質、抗体又はその抗原結合断片、ＲＮＡベースの分子、又はそれらの任意の組み合わせを含むコーディングする。一部の様態において、前記外来遺伝子は、配列リストの第２３配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の様態において、前記外来遺伝子は融合タンパク質をコーディングする。一部の様態において、前記融合タンパク質は血管内皮細胞成長因子（「ＶＥＧＦ」）の阻害剤を含む。一部の様態において、前記ＶＥＧＦの阻害剤はアフリバーセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）を含む。前記外来遺伝子がＲＮＡベースの分子である場合、一部の様態において、前記ＲＮＡベースの分子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、又はそれらの任意の組み合わせを含む。

【0021】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは組換え発現構築物である。

【0022】

本明細書では、また、（ｉ）外来遺伝子及び（ｉｉ）前記外来遺伝子に作動可能に連結された調節要素を含むポリヌクレオチドであって、前記調節要素が（５’から３’方向に）：（１）配列リストの第４配列に示したＣＭＶエンハンサー；（２）配列リストの第５配列又は第６配列に示したＣＭＶプロモーター配列、配列リストの第７配列に示したＥＦ－１αプロモーター配列、又は配列リストの第８配列に示したチキンβ－アクチンプロモーター配列から選択されるプロモーター；（３）配列リストの第１２配列に示したＣＭＶ Ｅ１配列、配列リストの第１３配列に示したＥＦ－１α Ｅ１配列又は配列リストの第１４配列又は第１５配列に示したチキンβ－アクチンＥ１配列から選択されるエクソン１（Ｅ１）配列；（４）配列リストの第９配列又は第１０配列に示したスプライシングドナー配列；（５）配列リストの第２配列、配列リストの第３配列又は配列リストの第５７配列に示したヌクレオチド配列を含むか、前記ヌクレオチド配列から必須になるか、又は前記ヌクレオチド配列からなる非翻訳核酸配列；及び（６）配列リストの第１１配列に示したＥＦ－１α Ｅ２配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

【0023】

本明細書は、本開示内容のポリヌクレオチドのうち任意のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一部の様態において、前記ベクターはウイルスベクターである。一部の様態において、前記ウイルスベクターは、アデノウイルス（例えば、遺伝子操作されたアデノウイルス）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、ＳＶ４０型ウイルス、ポリオマウイルス、エプスタインバーウイルス、乳頭腫ウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス、ボックスウイルス、又はそれらの任意の組み合わせを含む。一部の様態において、前記ウイルスベクターはＡＡＶである。

【0024】

一部の様態において、本明細書に記載のウイルスベクターは遺伝子治療に使用するためのものである。一部の様態において、ウイルスベクターは、本明細書に記載のポリヌクレオチドの外来遺伝子によってコーディングされるポリペプチドの発現に使用するためのものである。一部の様態において、前記外来遺伝子は、配列リストの第２３配列に示したヌクレオチド配列を含む。

【0025】

本明細書は、本明細書に記載のポリヌクレオチド又はベクターのうち任意のポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞を提供する。

【0026】

本明細書は、また、本明細書に記載のベクターのうち任意のベクター及びｒｅｐとｃａｐ遺伝子を含む構築物に細胞を形質導入することを含む組換えウイルス粒子を産生するための方法を提供する。一部の様態において、前記方法は、産生された組換えウイルス粒子を分離することをさらに含む。

【0027】

本明細書は、前記方法によって産生された組換えウイルス粒子を提供する。本明細書は、また、（ａ）キャプシドタンパク質及び（ｂ）本明細書に記載のベクターのうち任意のベクターを含む組換えウイルス粒子を提供する。一部の様態において、前記組換えウイルス粒子はアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）である。一部の様態において、前記ＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ１０である。一部の様態において、前記ＡＡＶの血清型はＡＡＶ２である。一部の様態において、前記ＡＡＶの血清型はＡＡＶ８である。一部の様態において、ＡＡＶの血清型はＡＡＶ５である。一部の様態において、前記ＡＡＶの血清型はＡＡＶ９である。

【0028】

本開示内容は、さらに、（ａ）本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組換えウイルス粒子のうち任意のポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組換えウイルス粒子；及び（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

【0029】

本明細書は、さらに、組換えアデノ随伴ウイルス粒子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記組換えアデノ随伴ウイルス粒子が（ａ）ＡＡＶ８型キャプシドタンパク質及び（ｂ）（ｉ）配列リストの第２３配列に示したヌクレオチド配列を含む外来遺伝子及び（ｉｉ）前記外来遺伝子に作動可能に連結され（５’から３’方向に）：（１）配列リストの第４配列に示したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー配列；（２）配列リストの第８配列に示したチキンβ－アクチンプロモーター配列；（３）配列リストの第１５配列に示したチキンβ－アクチンエクソン１（Ｅ１）配列；（４）配列リストの第１０配列に示したチキンβ－アクチンイントロンのスプライシングドナー配列；（５）配列リストの第２配列、配列リストの第３配列又は配列リストの第５７配列に示したヌクレオチド配列を含むか、前記ヌクレオチド配列から必須になるか、又は前記ヌクレオチド配列からなる非翻訳核酸配列；及び（６）配列リストの第１１配列に示したＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列；を含む調節要素を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。

【0030】

本明細書は、組換えアデノ随伴ウイルス粒子及び薬学的に許容される担体を含む眼科疾患を予防又は治療するための医薬組成物であって、前記組換えアデノ随伴ウイルス粒子が（ａ）ＡＡＶ８型キャプシドタンパク質及び（ｂ）（ｉ）配列リストの第２３配列に示したヌクレオチド配列を含む外来遺伝子及び（ｉｉ）前記外来遺伝子に作動可能に連結され（５’から３’方向に）：（１）配列リストの第４配列に示したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー配列；（２）配列リストの第８配列に示したチキンβ－アクチンプロモーター配列；（３）配列リストの第１５配列に示したチキンβ－アクチンエクソン１（Ｅ１）配列；（４）配列リストの第１０配列に示したチキンβ－アクチンイントロンのスプライシングドナー配列；（５）配列リストの第２配列、配列リストの第３配列又は配列リストの第５７配列に示したヌクレオチド配列を含むか、前記ヌクレオチド配列から必須になるか、又は前記ヌクレオチド配列からなる非翻訳核酸配列；及び（６）配列表第１１配列に示したＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列；を含む調節要素を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。

【0031】

一部の様態において、前記眼科疾患は、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管形成、黄斑変性、網膜変性、黄斑浮腫、網膜浮腫、黄斑腫脹、又はそれらの組み合わせを含む。一部の様態において、前記黄斑変性は年齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）を含む。

【0032】

本明細書は、細胞における外来遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記細胞を本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、又は組換えウイルス粒子のうち任意のポリヌクレオチド、ベクター、又は組換えウイルス粒子と接触させることを含む方法を提供する。一部の様態において、前記接触は生体内で進行する。一部の様態において、前記方法は、接触前に前記ポリヌクレオチド、ベクター又は組換えウイルス粒子を対象に投与することを含む。一部の様態において、前記接触はエクスビボで進行する。一部の様態において、前記外来遺伝子の発現は、基準細胞における該当発現と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍又は少なくとも約１０倍増加し、前記基準細胞は、前記非翻訳核酸配列が欠けているか、配列リストの第１配列に示したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ベクター、又は組換えウイルス粒子と接触する。

【0033】

本明細書は、必要な対象において疾患又は障害を治療する方法であって、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター又は組換えウイルス粒子のうち任意のポリヌクレオチド、ベクター又は組換えウイルス粒子を前記対象に投与することを含む方法を提供する。一部の様態において、前記疾患又は障害は眼科疾患を含む。一部の様態において、前記眼科疾患は、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管形成、黄斑変性、網膜変性、黄斑浮腫、網膜浮腫、黄斑腫脹又はそれらの組み合わせを含む。一部の様態において、前記黄斑変性は年齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）を含む。一部の様態において、前記方法は、追加の治療薬を前記対象に投与することを含む。

【0034】

〔様態〕
第１様態
配列リストの第１配列に示したＥＦ－１αイントロン配列内のヌクレオチドのうち連続又は非連続ヌクレオチドが欠失した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）配列を含む外来遺伝子発現用の伸長因子－１α（ＥＦ－１α）イントロン断片であって、（ａ）前記ＥＦ－１αイントロン断片が配列リストの第１配列に示した配列内の８７４～９２４番目の位置のヌクレオチドを必須に含み、（ｂ）前記ＥＦ－１αイントロン断片が発現構築物中に存在する場合の配列リストの第１配列に示した配列内の８７４～９２４番目の位置のヌクレオチドのみからなるイントロン断片と比較して外来遺伝子発現を増加させるＥＦ－１αイントロン断片。

【0035】

第２様態
第１様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８７３番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0036】

第３様態
第２様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８７０番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0037】

第４様態
第３様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８６０番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0038】

第５様態
第４様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８５１番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0039】

第６様態
第５様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８５０番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0040】

第７様態
第６様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８２９番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0041】

第８様態
第７様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８２０番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0042】

第９様態
第８様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８１０番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0043】

第１０様態
第９様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８００番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0044】

第１１様態
第１０様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～７５０番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0045】

第１２様態
第１１様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～７２０番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0046】

第１３様態
第１２様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～７００番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0047】

第１４様態
第１３様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～６５０番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0048】

第１５様態
第１４様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～６００番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0049】

第１６様態
第１５様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～５６９番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0050】

第１７様態
第１６様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～５５０番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0051】

第１８様態
第１７様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第１配列に示した配列内の１～５００番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0052】

第１９様態
第７様態において、前記ＥＦ－１αイントロン断片が、配列リストの第２配列に示したヌクレオチド配列を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0053】

第２０様態
第５様態において、前記ＥＦ－１αイントロン断片が、配列リストの第３配列に示したヌクレオチド配列を含む、ＥＦ－１αイントロン断片。

【0054】

第２１様態
（ａ）外来遺伝子及び（ｂ）前記外来遺伝子に作動可能に連結され、エンハンサー、プロモーター及び第１様態によるＥＦ－１αイントロン断片を含む調節要素を含む外来遺伝子発現用の組換え発現構築物であって、前記外来遺伝子が宿主細胞から転写及び翻訳される組換え発現構築物。

【0055】

第２２様態
第２１様態において、前記エンハンサーはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーである、組換え発現構築物。

【0056】

第２３様態
第２２様態において、前記サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーが配列リストの第４配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。

【0057】

第２４様態
第２１様態において、前記プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及びβ－アクチンプロモーターからなる群から選択される、組換え発現構築物。

【0058】

第２５様態
第２４様態において、前記ＣＭＶプロモーターが、配列リストの第５配列又は第６配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。

【0059】

第２６様態
第２４様態において、前記ＥＦ－１αプロモーターが配列リストの第７配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。

【0060】

配列番号７の配列
第２７様態
第２４様態において、前記β－アクチンプロモーターが配列リストの第８配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。

【0061】

第２８様態
第２１様態において、前記ＥＦ－１αイントロン断片の上流にスプライシングドナー配列が連結されている、組換え発現構築物。

【0062】

第２９様態
第２８様態において、前記スプライシングドナー配列が、配列リストの第９配列又は第１０配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。

【0063】

第３０様態
第２１様態において、前記組換え発現構築物がＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列を含む、組換え発現構築物。

【0064】

第３１様態
第３０様態において、前記ＥＦ－１α Ｅ２配列が配列リストの第１１配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。

【0065】

第３２様態
第２１様態において、前記組換え発現構築物がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＦ－１α又はβ－アクチンエクソン１（Ｅ１）配列を含む、組換え発現構築物。

【0066】

第３３様態
第３２様態において、前記ＣＭＶ Ｅ１配列が配列リストの第１２配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。

【0067】

第３４様態
第３２様態において、前記ＥＦ－１α Ｅ１配列が配列リストの第１３配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。

【0068】

第３５様態
第３２様態において、前記β－アクチンＥ１配列が、配列リストの第１４配列又は第１５配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。

【0069】

第３６様態
第２１様態において、免疫細胞に特異的なｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に対する１つ以上のターゲット配列をさらに含む、組換え発現構築物。

【0070】

第３７様態
第３６様態において、前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ１４２－３ｐ又はｍｉＲ１４２－５である、組換え発現構築物。

【0071】

第３８様態
第３６様態において、前記ｍｉＲＮＡに対するターゲット配列が、ｍｉＲ１４２－３ｐ又はｍｉＲ１４２－５ｐの全長又は一部の配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴミア、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、リボザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチド及びロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドからなる群から選択される組換え発現構築物。

【0072】

第３９様態
第３８様態において、前記ｍｉＲ１４２－３ｐに対するターゲット配列が配列リストの第１６配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。

【0073】

第４０様態
第３８様態において、前記ｍｉＲＮＡのターゲット配列の数が２～６個である、組換え発現構築物。

【0074】

第４１様態
第４０様態において、前記ｍｉＲ１４２－３ｐに対するターゲット配列が配列リストの第１７配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。

【0075】

第４２様態
第２１様態において、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）配列をさらに含む、組換え発現構築物。

【0076】

第４３様態
第４２様態において、前記ＷＰＲＥ配列が配列リストの第１８配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。

【0077】

第４４様態
第２１様態において、１つ以上のポリアデニル化（ｐＡ）配列をさらに含む、組換え発現構築物。

【0078】

第４５様態
第４４様態において、前記ポリアデニル化配列が、配列リストの第１９～２２配列に示したヌクレオチド配列からなる群から選択される、組換え発現構築物。

【0079】

第４６様態
第２１様態において、前記調節要素が、（１）配列リストの第４配列に示したＣＭＶエンハンサー配列；（２）配列リストの第５配列又は第６配列に示したＣＭＶプロモーター配列、配列リストの第７配列に示したＥＦ－１αプロモーター配列又は配列リストの第８配列に示したチキンβ－アクチンプロモーター配列から選択されるプロモーター配列；（３）配列リストの第１２配列に示したＣＭＶ Ｅ１配列、配列リストの第１３配列に示したＥＦ－１α Ｅ１配列又は配列リストの第１４配列又は第１５配列に示したチキンβ－アクチンＥ１配列；（４）配列リストの第９配列又は第１０配列に示したスプライシングドナー配列；（５）請求項１に記載のＥＦ－１αイントロン断片配列；及び（６）配列リストの第１１配列に示したＥＦ－１α Ｅ２配列を含む組換え発現構築物。

【0080】

第４７様態
第２１様態において、前記外来遺伝子が配列リストの第２３配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。

【0081】

第４８様態
第２１様態による組換え発現構築物に形質導入された宿主細胞。

【0082】

第４９様態
第２１様態による組換え発現構築物及びｒｅｐとｃａｐ遺伝子を含む構築物に宿主細胞を形質導入することを含む組換えウイルスを産生するための方法。

【0083】

第５０様態
（ａ）キャプシドタンパク質及び（ｂ）第２１様態による組換え発現構築物を含む組換えウイルス。

【0084】

第５１様態
第５０様態において、前記組換えウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）である、組換えウイルス。

【0085】

第５２様態
第５１様態において、前記アデノ随伴ウイルスの血清型がＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ１０である、 組換えウイルス。

【0086】

第５３様態
第２１様態による組換え発現構築物又は第５０様態による組換えウイルスを含む医薬組成物。

【0087】

第５４様態
第５３様態において、前記組成物が眼科疾患を予防又は治療するために使用される、医薬組成物。

【0088】

第５５様態
第５４様態において、前記眼科疾患が、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管形成、黄斑変性、網膜変性、黄斑浮腫、網膜浮腫及び黄斑腫脹からなる群から選択される、医薬組成物。

【0089】

第５６様態
第２１様態による組換え発現構築物又は第５０様態による組換えウイルスの治療用の用途。

【0090】

第５７様態
組換えアデノ随伴ウイルス及び薬学的に許容される担体を含む眼科疾患を予防又は治療するための医薬組成物であって、前記組換えアデノ随伴ウイルスが（ａ）ＡＡＶ８型キャプシドタンパク質及び（ｂ）配列リストの第２３配列に示したヌクレオチド配列を含む外来遺伝子及び前記外来遺伝子に作動可能に連結され：（１）配列リストの第４配列に示したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー配列；（２）配列リストの第８配列に示したチキンβ－アクチンプロモーター配列；（３）配列リストの第１５配列に示したチキンβ－アクチンエクソン１（Ｅ１）配列；（４）配列リストの第１０配列に示したチキンβ－アクチンイントロンのスプライシングドナー配列；（５）配列リストの第１配列に示した配列内の１～８２９番目の位置のヌクレオチドのうち、連続又は非連続ヌクレオチドが欠失しており、配列リストの第１配列に示した配列内の８３０～９２４番目のヌクレオチドが必須に存在するＥＦ－１αイントロン断片；及び（６）配列リストの第１１配列に示したＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列；を含む調節要素を含む外来遺伝子発現用の組換え発現構築物を含む医薬組成物。

【0091】

〔課題を解決するための手段〕
本開示内容は、一般に、非翻訳核酸配列（本明細書では「イントロン」とも呼ばれる）及び外来遺伝子発現のためのそのような配列の用途に関する。本明細書に記載されているように、出願人は、ＥＦ－１αイントロン配列の特定の断片が外来遺伝子発現を増加させる優れた能力を示すことを確認した。本明細書に示されているように、一部の様態において、これらのＥＦ－１αイントロン断片は、外来遺伝子発現を増加させることにおいて全長ＥＦ－１αイントロンと同等のレベル又はそれ以上である。本開示内容のさらなる様態は、本出願の全体を通して提供されている。

【0092】

本明細書に開示された開示内容の理解を容易にするために多数の用語及び句を定義する。さらなる定義は詳細な説明を通して説明されている。

【0093】

Ｉ．定義
本開示内容の全体を通して、用語「１つ」又は「任意の」実体は、その実体の１つ以上を指すものである。例えば、「１つのポリペプチド」は、１つ以上のポリペプチドを表すと理解される。このように、用語「１つ」（又は「任意の」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」は、本明細書で混用されることができる。

【0094】

さらに、本明細書で使用される「及び／又は」は、２つの特定の特徴又は構成要素のそれぞれを、残りの他の特徴又は構成要素と共に又は単独で具体的な開示と見なすべきである。したがって、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」などの語句で使用される用語「及び／又は」は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図されている。同様に、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」などの語句で使用される用語「及び／又は」は、以下の様態のそれぞれを含むことが意図される：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。

【0095】

１つの数字又は一連の数字の前の用語「少なくとも」は、用語「少なくとも」の後に続く数字及び文脈上明らかに論理的に含めることができるすべての後続の数字又は整数を含むことと理解される。例えば、核酸分子内のヌクレオチドの数は整数でなければならない。例えば、「２１個のヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８個のヌクレオチド」は、１８個、１９個、２０個又は２１個のヌクレオチドが所定の特性を有することを意味する。一連の数字又は範囲の前に「少なくとも」がある場合、「少なくとも」が前記一連の又は範囲の数字のそれぞれを修飾することができることと理解される。「少なくとも」は整数に限定されない（例えば、「少なくとも５％」は有効数字の数を考慮することなく、５．０％、５．１％、５．１８％を含む）。

【0096】

本明細書において様態を用語「含む」と記載すると、「なる」及び／又は「必須になる」という観点で記載された他の同様の様態も提供されることと理解される。

【0097】

他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術及び科学用語は、本開示内容に関連する技術分野の通常の技術者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、当業者に本開示内容で使用されている用語の多くの一般的な辞書を提供する。

【0098】

単位、接頭辞及び記号は、それらのＳｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で認められた形式で表示される。数値範囲は、その範囲を定義する数値を含む。特に明記しない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシル方向に左から右に書かれる。本明細書で提供される見出しは開示内容の様々な様態の制限ではなく、それらは全体として明細書を参照したものであり得る。したがって、直下に定義された用語は、明細書を全体的に参照してより完全に定義される。

【0099】

本明細書において、「約」という用語は、ほぼ、おおよ、ほど、又はその領域内を意味するものとして使用される。用語「約」が数値範囲と共に使用される場合に記載されている数値の上と下に境界を拡張して該当範囲を変更する。一般に、用語「約」は、指定された値の上と下の数値を、例えば、上又は下（より高い又はより低い）の１０％の変化量だけ変更することができる。

【0100】

本明細書で使用される「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）という用語は、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ＡＡＶｒｈ．７４、ヘビＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、牛ＡＡＶ、犬ＡＡＶ、馬ＡＡＶ、羊ＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、Ｇａｏなど（Ｊ. Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１（２００４））及びＭｏｒｉｓなど（Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５（２００４））が開示しているＡＡＶ血清型及び系統分岐、及び他の現在知られているか後に発見された他のＡＡＶを含むが、これらに限定されない。例えば、ＦＩＥＬＤＳなど、ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ２，ｃｈａｐｔｏｒ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。一部の様態において、「ＡＡＶ」は公知のＡＡＶの派生物を含む。一部の様態において、「ＡＡＶ」は、変形又は人工ＡＡＶを含む。

【0101】

用語「投与」、「投与する」、及びそれらの文法的変形形態は、薬学的に許容される経路を介して対象に組成物（例えば、本明細書に記載の外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含むポリヌクレオチド）を導入することを指す。組成物は、腫瘍内、経口、肺内、鼻腔内、非経口（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内又は皮下）、直腸、リンパ内、脊椎腔内、眼球の周囲又は局所投与を含む任意の適切な経路によって対象に導入される。投与には、自己投与及び他人による投与が含まれる。組成物又は製剤は適切な投与経路を介してその意図された機能を発揮する。例えば、適切な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物又は製剤を対象の静脈に導入することによって投与される。

【0102】

本明細書で使用される「ＣＥＥ」構築物は、ＣＭＶエンハンサー、ＥＦ－１αプロモーター及びＥＦ－１αイントロン断片を含む。「ＣＥ」構築物は、ＣＭＶエンハンサー及びＥＦ－１αプロモーターを含むが、イントロン断片を含まない（例えば、ＥＦ－１αイントロン断片を含まない）。「ＣＡＥ」構築物は、ＣＭＶエンハンサー、チキンβ－アクチンプロモーター及びＥＦ－１αイントロン断片を含む。本明細書で使用される「ＣＡＧ」構築物は、ＣＭＶエンハンサー、チキンβ－アクチンプロモーター及びチキンβ－アクチン／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロン断片を含む。「ＣＡ」構築物は、ＣＭＶエンハンサー及びチキンβ－アクチンプロモーターを含むが、イントロン断片を含まない（例えば、ＥＦ－１αイントロン断片を含まない）。図４Ａ、５Ａ及び５Ｃを参照する。

【0103】

本明細書で使用される「保存された」という用語は、比較される２つ以上の配列の同じ位置で変わらずに現れるものであるポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のそれぞれのヌクレオチド又はアミノ酸残基を指す。相対的に保存されるヌクレオチド又はアミノ酸は、配列内の他の位置に現れるヌクレオチド又はアミノ酸よりも関連する配列の中で保存されるものである。

【0104】

一部の様態において、２つ以上の配列が互いに１００％同一である場合、「完全に保存された」又は「同じ」ものであると言う。一部の様態において、２つ以上の配列が互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存された」ものと言う。一部の様態において、２つ以上の配列が互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％又は約９９％同一である場合に「高度に保存された」ものと言う。一部の様態において、２つ以上の配列が互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一又は少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％同一である場合に「保存された」ものと言う。一部の様態において、２つ以上の配列が互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一又は約９９％同一の場合に「保存された」ものと言う。配列の保存は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの全長に適用されるか、その一部、領域又は特徴部に適用されることができる。

【0105】

「相補的」及び「相補性」という用語は、ワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対規則によって互いに関連する２つ以上のオリゴマー（すなわち、それぞれ核塩基配列を含む）又はオリゴマーとターゲット遺伝子との間を指す。例えば、核塩基配列「ＴＧＡ（５’→３’）」は核塩基配列「ＡＣＴ（３’→５’）」に相補的である。塩基対の規則に従って、所定の核塩基配列の全ての核塩基より少ない数が他の核塩基配列と一致する場合、相補性は「部分的」であり得る。例えば、一部の様態において、所定の核塩基配列と他の核塩基配列との間の相補性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％であり得る。したがって、特定の様態では、用語「相補的」は、ターゲット核酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の一致又は相補性を指す。あるいは、例示を続けるために、所定の核塩基配列と他の核塩基配列との間の「完全な」又は「１００％」の相補性があり得る。一部の様態において、核塩基配列間の相補性の程度は、配列間ハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しい影響を及ぼす。

【0106】

本明細書で使用される表現「連続又は非連続ヌクレオチドが欠失する」は、野生型（又は元の）配列と比較して欠失の結果として残る連続又は非連続ヌクレオチド配列を含むことを意図するが、任意の欠失プロセスを含むことを意図するものではない。前記用語は、「連続ヌクレオチドの欠失」、「欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失」、及び「欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入」を含むことができる。例えば、ヌクレオチド配列「Ａ－Ｔ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｔ－Ｃ」の場合、連続ヌクレオチドの欠失は、「Ａ－＿－＿－＿－Ｃ－Ｇ－Ｔ－Ｃ」のように１つ以上の連続ヌクレオチドの欠失を含み、非連続ヌクレオチドの欠失は「Ａ－＿－Ｇ－＿－Ｃ－Ｇ－Ｔ－＿」のように、１つ以上のヌクレオチドが欠失したヌクレオチド間に欠失していないまま残っていることを意味し、欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入は、「Ａ－Ａ－Ｇ－＿－Ｃ－Ｇ－Ｔ－Ｇ」のように元のヌクレオチドとは相異なる１つ以上のヌクレオチドが欠失したヌクレオチドの位置に挿入されることを意味する。

【0107】

「下流」という用語は、基準ヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を指す。特定の様態では、下流のヌクレオチド配列は転写の開始点以降の配列と関連している。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写開始部位の下流に位置している。

【0108】

本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、増強された転写を提供することができる配列を含み、場合によっては他の調節配列に対するその配向とは無関係に作用することができるＤＮＡの部分を指す。エンハンサーは、プロモーター及び／又は他のエンハンサー要素と協働して又は追加に作用することができる。

【0109】

「賦形剤」及び「担体」という用語は互換的に使用され、医薬組成物に添加されて、複合体、例えば、本明細書に記載の外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含むポリヌクレオチドの投与をさらに容易にする不活性物質を指す。

【0110】

「エクソン」という用語は、タンパク質をコーディングする核酸の所定の部分又は前処理された（又は前駆体）ＲＮＡのいずれかの部分をスプライシングによって除去した後にＲＮＡ分子の成熟形態で現れる核酸配列を指す。前記成熟ＲＮＡ分子はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であってもよく、ｒＲＮＡ又はｔＲＮＡなどの非コーディングＲＮＡの機能的形態であってもよい。

【0111】

本明細書で使用される「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ又はポリペプチドを生成するプロセスを指す。これは、ポリヌクレオチドをメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写し、ｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することを含むが、これらに限定されない。発現は「遺伝子産物」を生成する。本明細書で使用される遺伝子産物は、例えば、遺伝子の転写によって産生されたＲＮＡのような核酸であり得る。本明細書で使用される遺伝子産物は、転写物から翻訳される核酸又はポリペプチドであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物は、転写後変形、例えば、ポリアデニル化又はスプライシングによる核酸又は翻訳後変形、例えば、リン酸化、メチル化、グリコシル化、脂質追加、他のタンパク質小単位体との会合、又はタンパク質加水分解切断によるポリペプチドをさらに含む。

【0112】

本明細書で使用される「同一性」という用語は、ポリマー分子、例えば、ポリヌクレオチド分子の間における全モノマーの保存を指す。いかなる追加の修飾語も使用しない用語「同一」、例えば、ポリヌクレオチドＡは、ポリヌクレオチドＢと同一であるということは、ポリヌクレオチド配列が１００％同一（１００％の配列同一性）であることを意味する。２つの配列が、例えば、「７０％同一」であると記載することは、それらを例えば「７０％の配列同一性」を有すると記載するのと同じである。

【0113】

例えば、２つのポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の同一性（パーセント）計算は、最適な比較目的のために前記２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、最適な整列のために第１及び第２ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列のうち１つ又は２つの両方にギャップを導入することができ、比較目的で同一でない配列は無視することができる）。特定の様態では、比較目的で整列した配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％である。その後、対応するアミノ酸位置のアミノ酸を、又はポリヌクレオチドの場合には塩基を比較する。

【0114】

第１配列内の特定の位置を第２配列内の該当位置と同じアミノ酸又はヌクレオチドが占める場合、前記分子はその位置で同じである。２つの配列間の同一性（パーセント）は、前記２つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップの数及び前記ギャップのそれぞれの長さを考慮して前記配列が共有する同じ位置の数の関数である。配列比較及び２つの配列間同一性（パーセント）の決定は、数学アルゴリズムを用いて行うことができる。

【0115】

相異なる配列（例えば、ポリヌクレオチド配列）を整列させるために使用することができる適切なソフトウェアプログラムは、いくつかの供給元から得ることができる。配列同一性（パーセント）を決定するのに適した１つのプログラムは、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から得ることのできるＢＬＡＳＴプログラム製品群の一部であるｂｌ２ｓｅｑである。ｂｌ２ｓｅｑはＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用されるのに対し、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。他の適切なプログラムは、例えば、生物情報学プログラムＥＭＢＯＳＳ製品群の一部であり、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａから欧州生物情報学研究所（ＥＢＩ）から得ることができるＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ又はＭａｔｃｈｅｒを含む。

【0116】

配列整列は、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどのように当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。

【0117】

ポリヌクレオチド又はポリペプチド基準配列と整列している単一のポリヌクレオチド又はポリペプチドターゲット配列内の相異なる領域は、それぞれそれら自体の配列同一性（パーセント）を有することができる。配列同一性（パーセント）値は、最も近い小数点の最初の桁に丸め／切り捨てすることに注意すべきである。たとえば、８０．１１、８０．１２、８０．１３及び８０．１４は８０．１に切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８及び８０．１９は８０．２に丸められる。また、長さの値は常に整数であることに注意すべきである。

【0118】

特定の様態では、第１アミノ酸配列（又は核酸配列）の第２アミノ酸配列（又は核酸配列）に対する同一性（％、％ＩＤ）は、％ＩＤ＝１００×（Ｙ／Ｚ）として計算される。ここで、 Ｙは前記第１及び第２配列の整列において（目視検査又は特定配列整列プログラムにより整列したとき）、同じ一致としてスコア化したアミノ酸残基（又は核塩基）の数であり、Ｚは前記第２配列内の残基の総数である。第１配列の長さが第２配列よりも長い場合、前記第２配列に対する第１配列の同一性（パーセント）は、第１配列に対する第２配列の同一性（パーセント）よりも高いであろう。

【0119】

当業者であれば、配列同一性（パーセント）を計算するための配列整列の生成が、一次配列データによって完全に処理される二元（ｂｉｎａｒｙ）配列－配列比較に限定されないことを理解する。さらに、配列データを構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば、突然変異の位置）又は系統発生データなどの異種ソースからのデータと統合することによって配列整列が行われることができることが理解されるであろう。異種のデータを 統合して多重配列整列を達成するための適切なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで利用可能であり、それとは対照的に、例えばＥＢＩからも利用可能なＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。さらに、配列同一性（パーセント）を計算するために使用される最終整列は、自動又は手動で体系化され得ることが理解される。

【0120】

本明細書で使用される「イントロン」という用語は、遺伝子が産生するタンパク質の一部をコーディングすることなく、細胞核からエクスポートする前に遺伝子から転写されるｍＲＮＡからスプライシングされる遺伝子内ＤＮＡの部分（介在配列）を指す。「イントロン配列」は、イントロンの核酸配列を指す。そのような配列は、本明細書では「非翻訳核酸配列」とも呼ばれる。これにより、イントロンは、コーディング配列（エクソン）と共に転写されるが、成熟ｍＲＮＡの形成中に除去されるＤＮＡ配列の領域である。

【0121】

本明細書で使用される「イントロン断片」という用語は、全長ＥＦ－１αイントロンＡ配列に由来する断片（すなわち、例えば配列リストの第１配列に示したようなＥＦ－１αの第１イントロン）を指す。前記断片は、全長ＥＦ－１αイントロンを除く意味である。一部の様態において、前記「イントロン断片」は、ＥＦ－１αイントロンＡのすべてのヌクレオチドが欠けている対応する構築物で達成される発現レベルを超える発現レベルを達成するのに必要な最小数のヌクレオチド又は構成を含む。したがって、本開示内容のイントロン断片（本明細書では「非翻訳核酸配列」とも呼ばれる）は、ＥＦ－１αイントロンの断片を含み、外来遺伝子の発現を増加させることができる限り特に限定されない。本明細書で証明していることのように、一部の様態において、イントロン断片（すなわち、非翻訳核酸配列）は外来遺伝子の転写を増加させて前記外来遺伝子の発現を増加させることができる。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のイントロン断片は非翻訳調節要素であり得る。

【0122】

本明細書で使用する用語「単離された」、「精製された」、「抽出された」及びそれらの文法的変形形態は互換的に使用され、１つ以上の精製手順を経た本開示内容の所望の組成物、例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含むポリヌクレオチドの製剤の状態をいう。一部の様態において、本明細書で使用する単離又は精製は、汚染物質を含む試料から本開示内容の組成物、例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドを除去又は一部除去する（例えば、画分）プロセスである。

【0123】

一部の様態において、単離された組成物は、検出可能な望ましくない活性を有さないか、又はそれとは異なり、望ましくない活性のレベル又は量が許容されるレベル又は量以下である。他の様態では、単離された組成物は、許容される量及び／又は濃度及び／又は活性以上に本開示内容の所望の組成物の量及び／又は濃度を有する。他の様態では、前記単離された組成物は、前記組成物が得られる出発材料と比較して濃縮されたものである。この濃縮は、出発物質と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、少なくとも約９９．９９９９％又は９９．９９９９％より大きいことがある。

【0124】

一部の様態において、単離された製剤には実質的に残留生物学的生成物がない。一部の様態において、前記単離された製剤には、任意の生物学的汚染物質が１００％、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％又は少なくとも約９０％ない。残留生物学的生成物は、非生物学的（ａｂｉｏｔｉｃ）物質（化学物質を含む）又は望ましくない核酸、タンパク質、脂質又は代謝産物を含み得る。

【0125】

本明細書で使用される「連結された」という用語は、第２アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列にそれぞれ共有又は非共有結合された第１アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を指す。第１アミノ酸又はポリヌクレオチド配列は、第２アミノ酸又はポリヌクレオチド配列に直接結合又は並置されてもよく、あるいは、介在配列が第１配列を第２配列に共有結合してもよい。「連結された」という用語は、５’－末端又は３’－末端で第２ポリヌクレオチド配列への第１ポリヌクレオチド配列の融合を意味するだけでなく、第１ポリヌクレオチド全配列（又は第２ポリヌクレオチド配列）を第２ポリヌクレオチド配列（又は第１ポリヌクレオチド配列）内の任意の２つのヌクレオチドにそれぞれ挿入することを含む。前記第１ポリヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合又はリンカーによって第２ポリヌクレオチド配列に連結することができる。前記リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドであり得る。

【0126】

本明細書で使用される「黄斑変性」という用語は、黄斑が変性したり機能的活性を失ったりする任意の数の障害及び病態を指す。前記変性又は機能的活性の喪失は、例えば、アポトーシス、細胞増殖の減少、正常な生物学的機能の喪失、又はそれらの組み合わせの結果として起こり得る。黄斑変性は、細胞及び／又は黄斑の細胞外の基質の構造的完全性の変化、正常細胞及び／又は細胞外の基質構成の変化及び／又は黄斑細胞の機能喪失につながることがあり／又はそれらとして発現され得る。前記細胞は、ＲＰＥ細胞、光受容体及び／又は毛細血管内皮細胞を含む黄斑内又は近傍に通常存在する任意の細胞型であり得る。年齢関連黄斑変性は黄斑変性の中で最も一般的ですが、「黄斑変性」という用語は高齢者ではない患者の黄斑変性を必ずしも排除するわけではない。黄斑変性の非限定的な例は：年齢関連黄斑変性（湿性又は乾性）；ベスト（Ｂｅｓｔ）黄斑異栄養症、ソルスビー（Ｓｏｒｓｂｙ）眼底異栄養症、マラティアレベンチネス（Ｍａｌａｔｔｉａ Ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ）、ドイン（Ｄｏｙｎｅ）ハニカム網膜異栄養症、スターガルト病（Ｓｔａｒｇａｒｄｔ ｄｉｓｅａｓｅ）（スターガルト黄斑異栄養症、青少年黄斑変性又は黄色点眼底（ｆｕｎｄｕｓ ｆｌａｖｉｍａｃｕｌａｔｕｓ）とも呼ばれる）及び色素上皮剥離関連黄斑変性を含む。

【0127】

本明細書で使用される「年齢関連黄斑変性」（ＡＭＤ）という用語は、一般に、高齢者に影響を及ぼし、網膜の中央部（すなわち、黄斑）損傷による中心視の喪失に関連する網膜症を意味する。ＡＭＤは、一般に、黄斑（主に網膜色素上皮（ＲＰＥ）とその下にある脈絡膜との間）内のドルーゼン（アミロイドベータのような細胞外タンパク質及び脂質の蓄積）という黄色を示す不溶性細胞外の沈着物の漸進的な蓄積又は凝集を特徴とする。黄斑内のこれらの沈着物の蓄積又は凝集は、黄斑を徐々に悪化させて、中心視に損傷を与える可能性がある。本明細書で使用する「黄斑」という用語は、中央の高解像度色覚を担う網膜の中心部を意味する。

【0128】

酸化ストレス、ミトコンドリア機能障害及び炎症過程を含むいくつかの理論が提案されているが、年齢関連黄斑変性症の病因はよく知られていない。損傷した細胞成分の生成と分解との間の不均衡は、例えば、細胞内のリポフシン及び細胞外のドルーゼンのような有害生成物の蓄積につながる。初期萎縮は、ＡＭＤの初期段階で地図状萎縮に先行する網膜色素上皮（ＲＰＥ）薄層化又は脱色の領域によって区別される。ＡＭＤの進行段階においてＲＰＥの萎縮（地図状萎縮）及び／又は新しい血管の発達（血管新生）は、光受容体の死及び中心視の喪失をもたらす。乾性（非滲出性）ＡＭＤでドルーゼンという細胞破片が網膜と脈絡膜との間に蓄積し、網膜に萎縮と傷跡が生じる。より重症である湿性（滲出性）ＡＭＤでは、血管が網膜の後ろの脈絡膜で成長して（血管新生）、滲出物と体液が漏液して出血を引き起こす可能性がある。

【0129】

存在するドルーゼンの程度に応じて、ＡＭＤは３つの主要な段階に分類することができる：（ｉ）初期、（ｉｉ）中期及び（ｉｉｉ）進行期又は後期。初期のＡＭＤは、いくつかの小さな（例えば、直径が約６３ミクロン未満の）ドルーゼン又はいくつかの中間サイズの（例えば、直径が約６３～１２４ミクロンの）ドルーゼンが存在することを特徴とする。初期段階で、患者は視力喪失がなく、明らかな症状がない。中期は、多くの中間サイズのドルーゼン又は１つ以上の大きい（例えば、直径が約１２５ミクロンを超える）ドルーゼンが存在することを特徴とする。この段階で、いくつかの患者は視野の中央にぼやけた斑点を経験し始めることがある。進行期又は後期のＡＭＤは、網膜組織の広い面積の損傷により、中央の死角地帯と結局には中心視の喪失を引き起こすことを特徴とする。損傷の種類（例えば、血管新生の有無）に基づいて、進行期又は後期のＡＭＤは、以下の２つのサブタイプにさらに分けることができる：（ｉ）地図状萎縮（萎縮性ＡＭＤともいう）及び（ｉｉ）湿性ＡＭＤ（新生血管性又は滲出性ＡＭＤともいう）。

【0130】

ＡＭＤには２つの主要な形態である（ｉ）乾燥性ＡＭＤ及び（ｉｉ）湿性ＡＭＤがある。特に明記しない限り、「年齢関連黄斑変性」という用語は、乾性ＡＭＤと湿性ＡＭＤの両方を含む。本明細書で使用される「年齢関連黄斑変性」という用語は、原因にかかわらず、あらゆる種類の年齢関連黄斑変性及び年齢関連黄斑変性の任意及びすべての症状を含む。黄斑変性（例えば、年齢関連黄斑変性）に関連する症状の非限定的な例は：中心視の喪失、歪み、造影剤の感度の低下、霧視、低照度の適応の難しさ、突然の発症及び症状の急速な悪化及び色覚の減少を含む。一部の様態において、黄斑変性（例えば、年齢関連黄斑変性）は、黄斑浮腫（すなわち、黄斑の上又は下に体液とタンパク質沈着物の捕集による黄斑腫脹）を引き起こす可能性がある。

【0131】

本明細書で使用される「乾性ＡＭＤ」という用語（萎縮性年齢関連黄斑変性又は非滲出性ＡＭＤとも呼ばれる）は、湿性（血管新生性）ＡＭＤではない、あらゆる形態のＡＭＤを指す。これは、初期及び中期形態のＡＭＤだけでなく、地図形状の萎縮として知られる進行期形態の乾性ＡＭＤを含む。乾性ＡＭＤ患者は、初期に最小症状を有する傾向があり、視覚機能の喪失は徴候が地図状の萎縮に進行する場合、より頻繁に起こる。

【0132】

本明細書で使用される用語「湿性ＡＭＤ」（血管新生年齢関連黄斑変性又は滲出性ＡＭＤとも呼ばれる）は、網膜血管新生の存在を特徴とする網膜症状を指すものであり、最も進行した形態のＡＭＤである。湿性ＡＭＤで、血管は、ブルッフ膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の欠陥を介して脈絡膜毛細血管及び一部の場合には下部の網膜色素上皮（脈絡膜新生血管の形成又は血管新生）から成長する。これらの血管から出る腸液性又は出血性滲出物の組織化は、神経網膜の付随的変性、網膜色素上皮の剥離及び破裂、硝子体の出血及び中心視の永久損傷と共に黄斑部位の線維血管瘢痕の生成を引き起こす可能性がある。

【0133】

「ｍｉＲＮＡ」、「ｍｉＲ」及び「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」という用語は互換的に使用され、ＲＮＡベースの遺伝子調節に関与する真核生物で見られるｍｉｃｒｏＲＮＡ分子を指す。この用語は、前駆体から処理された一本鎖ＲＮＡ分子を指すために使用される。一部の様態において、「アンチセンスオリゴマー」という用語は、本開示内容のｍｉｃｒｏＲＮＡ分子を説明するために使用され得る。本開示内容に関連するｍｉＲＮＡ及びその配列の名称は本明細書に提供されている。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、不完全な塩基対を介してターゲットｍＲＮＡを認識し、ターゲットｍＲＮＡに結合して、前記ターゲットｍＲＮＡの不安定化又は翻訳阻害をもたらすことによって、ターゲット遺伝子の発現を下向き制御する。逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む分子（通常、ｍｉＲＮＡのシード領域（ｓｅｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）に相補的な配列を含む分子）を介したｍｉＲＮＡターゲット化は、ｍｉＲＮＡ誘導翻訳阻害を減少又は阻害して、ターゲット遺伝子の上向き制御として現れることがある。

【0134】

「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」及びそれらの文法的変形形態は互換的に使用され、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチドの配列を指す。ポリヌクレオチドは、本明細書において５’から３’方向に示されている。本開示内容のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子又はリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得る。ヌクレオチド塩基は、本明細書では、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）及びウラシル（Ｕ）などの単一文字コーディングで表される。

【0135】

本明細書で使用する「作動的に連結された」又は「作動可能に連結された」という用語は、連結されるＤＮＡ配列が所望の機能を果たすように隣接して位置することを意味する。例えば、特定のプロモーターがコーディング配列（例えば、外来遺伝子）の転写を開始するのを助ける場合、そのようなプロモーターはコーディング領域と作動的に連結され得る。このような機能的関係が維持される限り、プロモーターとコーディング領域が必ずしも隣接して位置する必要はない。

【0136】

用語「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される賦形剤」及びそれらの文法的変形形態は、米国連邦政府の規制当局によって承認されるか、ヒトを含む動物で使用するための米国薬局方に記載されているすべての製剤に加えて、対象への組成物の投与を妨げるほど望ましくない生理学的効果の発生を引き起こすことなく、投与された複合体の生物学的活性及び特性を排除しないすべての担体又は希釈剤を含む。医薬組成物の製造に有用であり、一般に安全で無毒性であり、好ましい賦形剤及び担体が含まれる。

【0137】

本明細書で使用する「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容される担体及び賦形剤のような１つ以上の他の化学成分と混合するか、その化学成分に懸濁した本明細書に記載の組成物（例えば、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞及び／又は組換えウイルス）のうち１つ以上を指す。

【0138】

本明細書で使用される「プロモーター」及び「プロモーター配列」という用語は、互換的であり、コーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を調節することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コーディング配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、全体が天然遺伝子に由来するか、天然に発見される相異なるプロモーターから由来する相異なる要素から構成されてもよく、又は合成ＤＮＡ部分を含んでもよい。当業者は、相異なるプロモーターが、相異なる組織又は細胞型で、又は相異なる発生段階で、又は相異なる環境又は生理的条件に応答して遺伝子の発現を導くことができることを理解する。ほとんどの宿主細胞型で遺伝子の大部分を発現させるプロモーターは、通常、「構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーター」と呼ばれる。特定の細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「細胞特異的プロモーター」又は「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。特定の発生又は細胞分化段階で遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「発生特異的プロモーター」又は「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する作用剤、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などで細胞を露出又は処理した後に誘導されて遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「誘導性プロモーター」又は「調節性プロモーター」と呼ばれる。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に定義されていないので、相異なる長さのＤＮＡ断片は同じプロモーター活性を有し得ることと認識されている。

【0139】

前記プロモーター配列は、典型的に、その３’末端で転写開始部位と境界を形成し、背景以上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又は要素を含むように上流方向（５’方向）に延びている。前記プロモーター配列内には、ＲＮＡ重合酵素の結合を担うタンパク質結合ドメイン（共通配列）だけでなく、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１とのマッピングによって都合よく定義される）も見出されるであろう。一部の様態において、本開示内容で使用することができるプロモーターは組織特異的プロモーターを含む。

【0140】

本明細書で使用される「遺伝子調節領域」又は「調節領域」という用語は、コーディング領域の上流（５’非コーディング配列）内又は下流（３’非コーディング配列）に位置して関連コーディング領域の転写、ＲＮＡ処理、安定性又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡ処理部位、エフェクター結合部位又はステムループ（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ）構造を含み得る。コーディング領域が真核細胞で発現用として意図されている場合、ポリアデニル化信号及び転写終結配列は、通常、コーディング配列に対して３’に位置するであろう。

【0141】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む）は、プロモーター及び／又は１つ以上のコーディング領域に作動可能に関連する他の発現（例えば、転写）調節要素を含むことができる。作動可能な関連において、遺伝子産物のためのコーディング領域は、前記遺伝子産物の発現が調節領域（群）の影響又は制御下に置かれるように１つ以上の調節領域に関連する。例えば、コーディング領域とプロモーターは、プロモーター機能の誘導が前記コーディング領域によってコーディングされる遺伝子産物をコーディングするｍＲＮＡの転写を引き起こし、前記プロモーターとコーディング領域間の連結特性が遺伝子産物の発現を指示するプロモーターの能力を妨害しないか、転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨害しない場合、「作動可能に関連する」。プロモーター外の他の発現調節要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結信号も、遺伝子産物の発現を指示するコーディング領域と作動可能に関連することができる。

【0142】

本明細書で使用される「対象」、「患者」、「個体」及び「宿主」という用語、及びそれらの変異体は互換性があり、本明細書に記載の組成物（例えば、ポリヌクレオチド、組換え発現構築物、細胞、医薬組成物又は組換えウイルス）のうち任意の組成物が投与される任意の哺乳類対象を指す。非限定的な例としては、診断、処置又は治療を必要とするヒト、家畜（例えば、犬、猫など）、農場動物（例えば、牛、羊、豚、馬など）及び実験室動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）、特にヒトを含む。本明細書に記載の方法は、ヒトの治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。

【0143】

本明細書で使用される用語「必要とする対象」は、本明細書に記載の組成物の投与利益を有する哺乳類対象のような対象を含む。

【0144】

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、必要とする対象に対して所望の治療効果、薬理学的及び／又は生理学的効果を得るのに十分な本開示内容の組成物（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含むポリヌクレオチド）を含む試薬又は薬学的複合体の量である。治療有効量は、予防を治療と見なすことができるので、「予防有効量」であり得る。

【0145】

本明細書で使用される「外来遺伝子」という用語は、組換え発現構築物でコーディングされる少なくとも１つのポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域又は前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域の発現産物、ポリペプチド又はマルチポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチド又は促進又は調節核酸を指す。一部の様態において、前記外来遺伝子は、挿入（又は形質導入）される細胞に対して異種（すなわち、細胞において自然に発現されない）であり得る。

【0146】

本明細書で使用される「治療する」、「治療」又は「治療している」という用語は、例えば、疾患又は病態の重症度の減少、疾患の経過期間の減少、疾患又は病態に関連する１つ以上の症状の改善又は排除、疾患又は病態を必ずしも治癒せずに疾患又は病態のある対象に有益な効果を提供することを指す。前記用語は、また、疾患、病態又はその症状を予防又は防止することを含む。

【0147】

「上流」という用語は、基準ヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列を意味する。

【0148】

本明細書で使用される「ベクター」又は「構築物」という用語は、核酸又は遺伝子が挿入され得る任意のビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）、例えば、核酸配列が挿入され複製され得る細胞内に導入され得る送達ビヒクルをいう。ベクターに挿入され得る前記核酸配列は外生又は異種であり得る。前記核酸配列は外来遺伝子であり得る。構築物の例には、プラスミド、コスミド、及びウイルス（例えば、ＡＡＶ）を含むが、これらに限定されない。当業者は、標準的な組換え技術によって前記ベクター又は構築物を作製することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４など）。本明細書で使用する「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、転写される遺伝子産物のうち少なくとも一部をコーディングするヌクレオチド配列を含むベクター又は構築物を意味する。一部の場合には、その後にＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに翻訳される。発現構築物には様々な調節要素を含み得る。転写及び翻訳を調節する調節配列と共に、ベクター及び発現ベクターには、他の機能も提供するヌクレオチド配列も含まれることができる。

【0149】

ベクターは、前記ベクターを混入した細胞を選択又は識別するために提供される選択性マーカー又はレポーターをコーディングするように操作されることができる。選択性マーカー又はレポーターの発現は、ベクターに含まれる他のコーディング領域を統合及び発現する宿主細胞の識別及び／又は選択を可能にする。当技術分野で公知で使用されている選択性マーカー遺伝子の例は、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、バイアラフォス除草剤、スルホンアミドなどに対する耐性を提供する遺伝子；及び表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などを含む。当技術分野で公知で使用されているレポーターの例は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などを含む。選択性マーカーはレポーターであると見なすことができる。

【0150】

ＩＩ．ポリヌクレオチド
ＩＩ．Ａ．非翻訳核酸配列
本開示内容は、非翻訳核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記非翻訳核酸配列が翻訳時に外来遺伝子の発現を増加させ得るポリヌクレオチドに関する。具体的には、本明細書は、全長ＥＦ－１αイントロンより短い伸長因子－１α（ＥＦ－１α）イントロン配列を提供する。

【0151】

伸長因子１α（ＥＦ－１α）は、６番染色体に位置する遺伝子である（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００６．１２の７３，４８９，３０８～７３，５２５，５８７番目のヌクレオチド；陰性鎖方向）。ＥＦ－１α遺伝子は、８個のエクソンと７個のイントロンを含み、ｍＲＮＡ翻訳において重要な役割を果たす（例えば、アミノアシル－ｔＲＮＡを三元複合体ｅＥＦ１Ａ１－ＧＴＰ－ａａ－ｔＲＮＡとしてリボソームのＡ部位に運ぶ）真核生物伸長因子１Ａ（ｅＥＦ１Ａ１及びｅＥＦ１Ａとも呼ばれる）タンパク質をコーディングする。Ｓｃａｇｇｉａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｌａｓ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｏｎｃｏｌ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９（４）：２５６－２６５（２０１５年３月）を参照。前記全長ＥＦ－１αイントロンのヌクレオチド配列は、配列リストの第１配列（９２４個のヌクレオチド長）に記載されている。本明細書に記載されているように、本開示内容の非翻訳核酸配列（すなわち、ＥＦ－１αイントロン断片配列）は、全長ＥＦ－１αイントロン（又は当技術分野で知られている他のイントロン）と比較して明らかな利点を提供する。例えば、一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、全長ＥＦ－１αイントロンよりも外来遺伝子の発現を大幅に増加させることができる。さらに、本開示内容の非翻訳核酸配列が全長の対応物よりも短いので、一部の様態において、それらをより大きな外来遺伝子と組み合わせて使用することができる。例えば、ＡＡＶキャプシド（本明細書に記載のものなど）は、最大約４．７ｋｂの核酸を収容することができる。したがって、一部の様態において、遺伝子発現をさらに増加させるために、より大きな外来遺伝子及び／又は追加のシス要素（ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を本明細書に記載のＥＦ－１αイントロン断片（すなわち、非翻訳核酸配列）と統合することができる。

【0152】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列（すなわち、ＥＦ－１αイントロン断片）は、配列リストの第１配列に示した配列の８７４～９２４番目の位置のヌクレオチドを含むが、配列リストの第１配列は含まない。一部の様態において、非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８７４～９２４番目のヌクレオチドから必須になる。一部の様態において、非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８７４～９２４番目のヌクレオチドからなる。このようなＥＦ－１αイントロン断片は、本明細書では「Ｔ３．２断片」とも呼ばれ、配列リストの第５７配列に示されている。一部の様態において、非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８７４～９２４番目のヌクレオチドと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有するが、前記非翻訳核酸配列は配列リストの第１配列を含まない。

【0153】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列（すなわち、ＥＦー１αイントロン断片）は、配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチドを含むが、配列リストの第１配列を含まない。一部の様態において、本開示内容の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチドから必須になる。一部の様態において、非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチドからなる。このようなＥＦ－１αイントロン断片は、本明細書では「Ｔ３．１．２断片」とも呼ばれ、配列リストの第３配列に記載されている。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチドと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有するが、前記非翻訳核酸配列は配列リストの第１配列を含まない。

【0154】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列（すなわち、ＥＦ－１αイントロン断片）は、配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチドを含むが、配列リストの第１配列を含まない。一部の様態において、本開示内容の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチドから必須になる。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチドからなる。このようなＥＦ－１αイントロン断片は、本明細書では「Ｔ３．１．１断片」とも呼ばれ、配列リストの第２配列に記載されている。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチドと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有するが、前記非翻訳核酸配列は配列リストの第１配列を含まない。

【0155】

本開示内容から明らかなように、上述したヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の８７４～９２４番目、８５２～９２４番目及び８３０～９２４番目の位置、すなわち、それぞれ配列リストの第５７配列、配列リストの第３配列及び配列リストの第２配列）に加えて、一部の様態において、本開示内容の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示したように、５’領域にＥＦ－１αイントロン配列の連続又は非連続ヌクレオチドをさらに含むことができる。例えば、一部の様態において、５’領域に追加された連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の８７４～９２４番目、８５２～９２４番目又は８３０～９２４番目のヌクレオチドの上流のどこにも追加されることができる。一部の様態において、前記５’領域に追加された連続又は非連続ヌクレオチドは、全長ＥＦ－１αイントロン配列、すなわち、配列リストの第１配列から由来する。一部の様態において、前記５’領域及び／又は３’領域に追加された連続又は非連続ヌクレオチドは、全長ＥＦ－１αイントロン配列、すなわち、配列リストの第１配列に異種である任意の配列から由来する。

【0156】

したがって、一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８７３番目のヌクレオチド位置から由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドをさらに含まない（結果的に配列リストの第１配列の８７４～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；「Ｔ３．２断片」；配列リストの第５７配列）。

【0157】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８７０番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の８７１～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第５８配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～８７０番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記一つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～８７０番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～８７０番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～８７０番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0158】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８６０番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の８６１～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第５９配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～８６０番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含むことができるが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～８６０番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～８６０番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～８６０番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0159】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８５１番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第６０配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～８５１番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～８５１番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～８５１番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～８５１番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0160】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８５０番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の８５１～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第６１配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～８５０番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～８５０番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～８５０番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～８５０番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0161】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８２９番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチドを含むか、又は前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第２配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～８２９番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～８２９番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～８２９番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～８２９番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0162】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８２０番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の８２１～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片：すなわち、配列リストの第６３配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～８２０番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～８２０番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～８２０番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～８２０番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0163】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８１０番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の８１１～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第６４配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～８１０番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～８１０番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～８１０番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～８１０番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0164】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８０７番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の８０８～９２４番目のヌクレオチドを含むか、ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第６５配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～８０７番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～８０７番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～８０７番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～８０７番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0165】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～８００番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の８０１～９２４番目のヌクレオチドを含むか、又は前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第６６配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～８００番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～８００番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～８００番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～８００番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0166】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～７５０番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の７５１～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第６７配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～７５０番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～７５０番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの１番目の配列の１～７５０番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～７５０番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0167】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～７２０番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の７２１～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第６８配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～７２０番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～７２０番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～７２０番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～７２０番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0168】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～７００番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の７０１～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第６９配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～７００番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～７００番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～７００番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～７００番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0169】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～６５０番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の６５１～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第７０配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～６５０番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～６５０番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～６５０番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～６５０番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0170】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～６００番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の６０１～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第７１配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～６００番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含むことができるが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～６００番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～６００番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～６００番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0171】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～５６９番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の５７０～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第７２配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～５６９番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～５６９番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～５６９番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～５６９番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0172】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～５５０番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の５５１～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第７３配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～５５０番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～５５０番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～５５０番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～５５０番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0173】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列に示した配列内の１～５００番目の位置のヌクレオチドから由来する任意の連続又は非連続ヌクレオチドを含まない（結果的に配列リストの第１配列の５０１～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるＥＦ－１αイントロン断片；すなわち、配列リストの第７４配列）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の１～５００番目のヌクレオチド位置内から由来する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含み得るが、前記１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドは、配列リストの第１配列の１～５００番目のヌクレオチド位置の全長ではない（例えば、配列リストの第１配列の１～５００番目のヌクレオチドよりも短い）。一部の様態において、そのような非翻訳核酸配列は、前記非翻訳核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の相異なる種類のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第１配列の１～５００番目のヌクレオチド位置から由来しないヌクレオチド）を含み得る。

【0174】

一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列は、（ｉ）配列リストの第１配列の８７１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第５８配列）、（ｉｉ）配列リストの第１配列の８６１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第５９配列）、（ｉｉｉ）配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６０配列）、（ｉｖ）配列リストの第１配列の８５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６１配列）、（ｖ）配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第２配列）、（ｖｉ）配列リストの第１配列の８２１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６３配列）、（ｖｉｉ）配列リストの第１配列の８１１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６４配列）、（ｖｉｉｉ）配列リストの第１配列の８０８～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６５配列）、（ｉｘ）配列リストの第１配列の８０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６６配列）、（ｘ）配列リストの第１配列の７５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６７配列）、（ｘｉ）配列リストの第１配列の７２１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６８配列）、（ｘｉｉ）配列リストの第１配列の７０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６９配列）、（ｘｉｉｉ）配列リストの第１配列の６５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７０配列）、（ｘｉｖ）配列リストの第１配列の６０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７１配列）、（ｘｖ）配列リストの第１配列の５７０～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７２配列）、（ｘｖｉ）配列リストの第１配列の５５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７３配列）又は（ｘｖｉｉ）配列リストの第１配列の５０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７４配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。

【0175】

一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８７１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第５８配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８６１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第５９配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６０配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６１配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第２配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８２１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６３配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８１１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６４配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８０８～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６５配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の８０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６６配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の７５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６７配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の７２１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列番号６８の配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の７０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第６９配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の６５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７０配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の６０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７１配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の５７０～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７２配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の５５１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７３配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記非翻訳核酸配列は、配列リストの第１配列の５０１～９２４番目のヌクレオチド（すなわち、配列リストの第７４配列）と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。

【0176】

前記開示内容から明らかなように、一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列を含むポリヌクレオチドは、前記非翻訳核酸配列の５’末端（「５’領域」）に少なくとも約1つ、少なくとも約２つ、少なくとも約３つ、少なくとも約４つ、少なくとも約５つ、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個 、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個又は少なくとも約１００個のヌクレオチドをさらに含む。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、前記非翻訳核酸配列の３’末端（「３’領域」）に少なくとも約１つ、少なくとも約２つ、少なくとも約３つ、少なくとも約４つ、少なくとも約５つ、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個又は少なくとも約１００個のヌクレオチドをさらに含む。一部の様態において、非翻訳核酸配列を含むポリヌクレオチドは、前記非翻訳核酸配列の５’末端（「５’領域」）及び３’末端（「３’領域」）の両方に少なくとも約１つ、少なくとも約２つ、少なくとも約３つ、少なくとも約４つ、少なくとも約５つ、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個又は少なくとも約１００個のヌクレオチドをさらに含む。

【0177】

一部の様態において、ポリヌクレオチドは、前記非翻訳核酸配列の５’領域内の配列リストの第１配列内の１～８７３番目の位置に該当する１つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含む。

【0178】

ＩＩ．Ｂ．外来遺伝子
一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列を含むポリヌクレオチドは、外来遺伝子をさらに含む。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含むものであって、前記非翻訳核酸配列は配列リストの第１配列の８７４～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるが、又は前記ヌクレオチドからなるが、配列リストの第１配列は含まない（例えば、配列リストの第５７配列）。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含み、前記非翻訳核酸配列は配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるが、配列リストの第１配列は含まない（例えば、配列リストの第３配列）。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含み、前記非翻訳核酸配列は配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるが、配列リストの第１配列は含まない（例えば、配列リストの第２配列）。

【0179】

本開示内容に有用な外来遺伝子は、前記外来遺伝子が細胞に形質導入時にポリペプチドに翻訳され得る限り、特に限定されない。したがって、任意の適切な目的の外来遺伝子を本開示内容の非翻訳核酸配列で使用することができる。一部の様態において、外来遺伝子は、ポリペプチド（又はその任意の変異体）、融合タンパク質、抗体又はその抗原結合断片、ＲＮＡベースの分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ）又はそれらの任意の組み合わせをコーディングする。

【0180】

一部の様態において、外来遺伝子は、本明細書に記載されるものなどの疾患又は障害の治療に有用なタンパク質をコーディングする。一部の様態において、前記外来遺伝子は、対象又は患者の体内で持続的な発現を目的とする特定の疾患の治療用ペプチドをコーディングする。一部の様態において、外来遺伝子は、配列リストの第２３配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記外来遺伝子は融合タンパク質をコーディングするが、前記融合タンパク質は血管内皮細胞成長因子（「ＶＥＧＦ」）の阻害剤である。一部の様態において、ＶＥＧＦの阻害剤は、アップリバーセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標）及びＺＡＬＴＲＡＰ（登録商標））を含む。

【0181】

ＩＩ．Ｃ．調整要素
一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは調節要素をさらに含む。したがって、一部の様態において、ポリヌクレオチドは、（１）調節要素、（２）本明細書に記載の非翻訳核酸配列、及び（３）外来遺伝子を含む。

【0182】

本明細書で使用される「調節要素」という用語は、作動可能に連結された核酸の発現を調節する（例えば、増加又は減少させる）核酸配列を指す。本開示内容に有用な調節要素は、エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター又はβ－アクチンプロモーター）、エクソン（例えば、エクソン１又はエクソン２）、スプライシンドナー配列、受容体配列、又はそれらの組み合わせを含む。一部の様態において、前記調節要素は、転写終結のための配列（例えば、ポリＡ）、外来遺伝子を安定的に発現させるための配列（例えば、ＷＰＲＥ配列）、外来遺伝子特異的免疫の発生を減少させるための配列（例えば、ｍｉＲＮＡターゲット配列）又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0183】

ＩＩ．Ｃ．１．エンハンサー
一部の様態において、前記調節要素はエンハンサーである。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（特定の順序なし）（１）エンハンサー、（２）非翻訳核酸配列、及び（３）外来遺伝子を含む。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（５’から３’方向に）：（１）エンハンサー、（２）非翻訳核酸配列、及び（３）外来遺伝子を含む。

【0184】

当技術分野で知られている任意の適切なエンハンサーを本開示内容で使用することができる。適切なエンハンサーの非限定的な例は：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ＳＶ４０初期エンハンサー、アデノウイルス５ Ｅ１Ａエンハンサー、ＨＢＶエンハンサー－１調節領域（Ｅｈ－１）、ＨＰＶ－１６又は－１８Ｅ６／７長い調節領域（ＬＣＲ）、ＨＩＶ－１長い反復末端（ＬＴＲ）又はそれらの任意の組み合わせを含む。一部の様態において、前記エンハンサーはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーである。一部の様態において、前記ＣＭＶエンハンサーは、配列リストの第４配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の様態において、前記サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーは、配列リストの第４配列に示したヌクレオチド配列を含む。

【0185】

ＩＩ．Ｃ．２．プロモーター
一部の様態において、前記調節要素はプロモーターである。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（特定の順序なし）（１）プロモーター、（２）非翻訳核酸配列、及び（３）外来遺伝子を含む。一部の様態において、ポリヌクレオチドは（５’から３’方向に）：（１）プロモーター、（２）非翻訳核酸配列、及び（３）外来遺伝子を含む。一部の様態において、前記調節要素はエンハンサー及びプロモーターの両方を含む。そのような様態では、ポリヌクレオチドは、（特定の順序なし）（１）エンハンサー、（２）プロモーター、（３）非翻訳核酸配列、及び（４）外来遺伝子を含み得る。一部の様態において、ポリヌクレオチドは（５から３’方向に）：（１）エンハンサー、（２）プロモーター、（３）非翻訳核酸配列、及び（４）外来遺伝子を含む。当技術分野で知られている任意の適切なプロモーターを本開示内容で使用することができる。

【0186】

一部の様態において、前記プロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、β－アクチンプロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、７０－ｋＤａ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０）プロモーター、７８－ｋＤａグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）プロモーター、真核生物開始因子－４Ａ（ｅＩＦ４ａ）プロモーター、α－１－抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、トランススチレチン（ＴＴＲ）プロモーター、神経膠線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、サルホラーウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターの初期プロモーター、シナプシンＩ（ＳＹＮ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体キナーゼ（ＧＲＫ）プロモーター、ロドプシン（Ｒｈｏ）プロモーター又はそれらの組み合わせを含む。

【0187】

一部の様態において、本開示内容に有用なプロモーターはＣＭＶプロモーターである。したがって、一部の様態において、ポリヌクレオチドは、（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）ＣＭＶプロモーター、（３）非翻訳核酸配列、及び（４）外来遺伝子を含む。一部の様態において、前記ＣＭＶプロモーターは、配列リストの第５配列又は第６配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の様態において、前記ＣＭＶプロモーターは、配列リストの第５配列又は第６配列に示したヌクレオチド配列を含む。

【0188】

一部の様態において、本開示内容で使用することができるプロモーターはＥＦ－１αプロモーターである。一部の様態において、ポリヌクレオチドは、（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）ＥＦ－１αプロモーター、（３）非翻訳核酸配列、及び（４）外来遺伝子を含む。一部の様態において、前記ＥＦ－１αプロモーターは、配列リストの第７配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の様態において、前記ＥＦ－１αプロモーターは、配列リストの第７配列に示したヌクレオチド配列を含む。

【0189】

一部の様態において、前記プロモーターはβ－アクチンプロモーターである。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）β－アクチンプロモーター、（３）非翻訳核酸配列、及び（４）外来遺伝子を含む。一部の様態において、前記β－アクチンプロモーターは、配列番号８配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の様態において、前記β－アクチンプロモーターは、配列リストの第８配列に示したようなチキンβ－アクチンプロモーターである。

【0190】

本明細書に示されているように（図４Ａを参照）、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む）は多重プロモーターを含み得る。例えば、一部の様態において、ポリヌクレオチドは、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及び／又はβ－アクチンプロモーターの組み合わせを含む。一部の様態において、ポリヌクレオチドはＣＭＶプロモーター及びＥＦ－１αプロモーターの両方を含む。このような様態では、前記ＣＭＶプロモーターは、配列リストの第５配列に示した配列（すなわち、配列リストの第６配列の５’末端からの最初の３１個のヌクレオチド）のように全長ＣＭＶプロモーターの一部であり得る。

【0191】

ＩＩ．Ｃ．３．スプライシングドナー配列
一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド（すなわち、非翻訳核酸配列を含む）はスプライシングドナー配列を含む。本明細書で使用する「スプライシングドナー配列」又は「スプライシングドナー部位」という用語は、イントロン（例えば、ＥＦ－１αイントロン）の５’末端に存在するグアニン－チミン（ＧＴ）が豊富なドメインを指す（イントロンとエクソンとの境界を暗示する）。本明細書に示されているように、そのような配列は、本開示内容の非翻訳核酸配列を生成するようにターゲット化され得る。一部の様態において、スプライシングドナー配列は、ＥＦ－１αイントロン断片（すなわち、非翻訳核酸配列）の上流に連結される。例えば、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（特定の順序なし）（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及び／又はβ－アクチンプロモーター）、（３）スプライシングドナー配列、（４）非翻訳核酸配列、及び（５）外来遺伝子を含む。一部の様態において、ポリヌクレオチドは（５’から３’方向に）：（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及び／又はβ－アクチンプロモーター）、（３）スプライシングドナー配列、（４）非翻訳核酸配列及び（５）外来遺伝子を含む。

【0192】

一部の様態において、本開示に有用なスプライシングドナー配列は、配列リストの第９配列又は第１０配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記スプライシングドナー配列は、配列リストの第９配列又は第１０配列に示したヌクレオチド配列を含む。

【0193】

ＩＩ．Ｃ．４．エクソン配列
本明細書に示されているように、一部の様態において、本開示内容のポリヌクレオチドは１つ以上のエクソン配列をさらに含む。例えば、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドはＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列を含む。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、以下の特徴部を含む（特定の順序なし）：（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及び／又はβ－アクチンプロモーター）、（３）スプライシングドナー配列、（４）非翻訳核酸配列、（５）ＥＦ－１α Ｅ２配列、及び（６）外来遺伝子。一部の様態において、そのようなポリヌクレオチドは（５’から３’方向に）：（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及び／又はβ－アクチンプロモーター）、（３）スプライシングドナー配列、（４）非翻訳核酸配列、（５）ＥＦ－１α Ｅ２配列、及び（６）外来遺伝子を含む。一部の様態において、前記ＥＦ－１α Ｅ２配列は、配列リストの第１１配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記ＥＦ－１α Ｅ２配列は、配列リストの第１１配列に示したヌクレオチド配列を含む。

【0194】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドに含まれ得る１つ以上のエクソン配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＦ－１α又はβ－アクチンエクソン１（Ｅ１）配列を含む。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、Ｅ１及びＥ２配列の両方を含み得る。例えば、一部の様態において、ポリヌクレオチドは（特定の順序なし）：（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及び／又はβ－アクチンプロモーター）、（３）Ｅ１配列（例えば、ＣＭＶ Ｅ１配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列及び／又はβ－アクチンＥ１配列）、（４）スプライシングドナー配列、（５）非翻訳核酸配列、（６）ＥＦ－１α Ｅ２配列、及び（７）外来遺伝子を含む。一部の様態において、ポリヌクレオチドは（５’から３’方向に）：（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及び／又はβ－アクチン）、（３）Ｅ１配列（例えば、ＣＭＶ Ｅ１配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列及び／又はβ－アクチンＥ１配列）、（４）スプライシングドナー配列、（５）非翻訳核酸配列、（６）ＥＦ－１α Ｅ２配列、及び（７）外来遺伝子を含む。

【0195】

一部の様態において、本開示内容で使用することができるＥ１配列はＣＭＶ Ｅ１配列である。一部の様態において、ＣＭＶ Ｅ１配列は、配列リストの第１２配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、ＣＭＶ Ｅ１配列は、配列リストの第１２配列に示したヌクレオチド配列を含む。

【0196】

一部の様態において、前記Ｅ１配列はＥＦ－１α Ｅ１配列である。一部の様態において、前記ＥＦ－１α Ｅ１配列は、配列リストの第１３配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記ＥＦ－１α Ｅ１配列は、配列リストの第１３配列に示したヌクレオチド配列を含む。一部の様態において、前記Ｅ１配列はβ－アクチンＥ１配列である。一部の様態において、前記β－アクチンＥ１配列は、配列リストの第１４配列又は第１５配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記β－アクチンＥ１配列は、配列リストの第１４配列又は第１５配列に示したヌクレオチド配列を含む。

【0197】

ＩＩ．Ｃ．５。ｍｉＲＮＡターゲット配列
本明細書に記載されているように、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドの調節要素は、免疫細胞に特異的なｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に対する１つ以上のターゲット配列（「ｍｉＲＮＡターゲット配列」）を含む。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、以下の特徴部を含む（特定の順序なし）：（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及び／又はβ－アクチンプロモーター）、（３）Ｅ１配列（例えば、ＣＭＶ Ｅ１配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列及び／又はβ－アクチンＥ１配列）、（４）スプライシングドナー配列、（５）非翻訳核酸配列、（６）ＥＦ－１α Ｅ２配列、（７）外来遺伝子、及び（８）以上のｍｉＲＮＡターゲット配列を含む。一部の様態において、ポリヌクレオチドは（５’から３’方向に）：（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及び／又はβ－アクチンプロモーター）、（３）Ｅ１配列（例えば、ＣＭＶ Ｅ１配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列及び／又はβ－アクチンＥ１配列）、（４）スプライシングドナー配列、（５）非翻訳核酸配列、（６）ＥＦ－１α Ｅ２配列、（７）外来遺伝子、及び（８）１つ以上のｍｉＲＮＡターゲット配列を含む。

【0198】

一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上のｍｉＲＮＡターゲット配列を含む。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドに含まれ得るｍｉＲＮＡに対する前記ターゲット配列の数は、約２～約６個（例えば、２～６個）である。一部の様態において、前記多重ｍｉＲＮＡターゲット配列は同じである。一部の様態において、前記多重ｍｉＲＮＡターゲット配列のうち１つ以上は互いに異なる。

【0199】

本開示から明らかなように、１つ以上のｍｉＲＮＡターゲット配列を含むと、本明細書に記載のポリヌクレオチドの特異性を向上させることができる。例えば、特定の細胞型（例えば、免疫細胞）において前記外来遺伝子の阻害が望まれる場合、免疫細胞に特異的なｍｉＲＮＡに対するターゲット配列を用いて、免疫細胞内で外来遺伝子の発現を抑制することができる。その結果、免疫細胞による外来遺伝子特異的免疫の発生を遮断することができる。したがって、相異なるｍｉＲＮＡターゲット配列を使用することによって、相異なる細胞／組織における外来遺伝子の発現を調節することができる。

【0200】

当技術分野で知られている任意の適切なｍｉＲＮＡターゲット配列を本開示内容で使用することができる。一部の様態において、前記ｍｉＲＮＡターゲット配列は、ｍｉＲ１４２－３ｐ又はｍｉＲ１４２－５ｐに特異的である。一部の様態において、前記ｍｉＲＮＡに対するターゲット配列は、ｍｉＲ１４２－３ｐ又はｍｉＲ１４２－５ｐの全長又は一部の配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴミア、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子 、リボザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから選択される。

【0201】

一部の様態において、前記ｍｉＲＮＡターゲット配列は、配列リストの第１６配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記ｍｉＲＮＡターゲット配列は、配列リストの第１７配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記ｍｉＲＮＡターゲット配列は、配列リストの第１６配列又は配列番号１７配列に示したヌクレオチド配列を含む。

【0202】

ＩＩ．Ｃ．６．ＷＰＲＥ配列
一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド（すなわち、非翻訳核酸配列を含む）は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）配列をさらに含む。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは（特定の順序なし）（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及び／又はβ－アクチンプロモーター）、（３）Ｅ１配列（例えば、ＣＭＶ Ｅ１配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列及び／又はβ－アクチンＥ１配列）、（４）スプライシングドナー配列、（５）非翻訳核酸配列、（６）ＥＦ－１α Ｅ２配列、（７）外来遺伝子、（８）１つ以上のｍｉＲＮＡターゲット配列、及び（９）ＷＰＲＥ配列を含む。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（５’から３’方向に）：（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及び／又はβ－アクチンプロモーター）、（３）Ｅ１配列（例えば、ＣＭＶ Ｅ１配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列及び／又はβ－アクチンＥ１配列）、（４）スプライシングドナー配列、（５）非翻訳核酸配列、（６）ＥＦ－１α Ｅ２配列、（７）外来遺伝子、（８）１つ以上のｍｉＲＮＡターゲット配列、及び（９）ＷＰＲＥ配列を含む。

【0203】

一部の様態において、前記ＷＰＲＥ配列は、配列リストの第１８配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記ＷＰＲＥ配列は、配列リストの第１８配列に示したヌクレオチド配列を含む。

【0204】

ＩＩ．Ｃ．７．ポリアデニル化配列
一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド（すなわち、非翻訳核酸配列を含む）は、１つ以上のポリアデニル化（ｐＡ）配列をさらに含む。したがって、一部の様態において、ポリヌクレオチドは（特定の順序なし）（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及び／又はβ－アクチンプロモーター）、（３）Ｅ１配列（例えば、ＣＭＶ Ｅ１配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列及び／又はβ－アクチンＥ１配列）、（４）スプライシングドナー配列、（５）非翻訳核酸配列、（６）ＥＦ－１α Ｅ２配列、（７）外来遺伝子、（８）１つ以上のｍｉＲＮＡターゲット配列、（９）ＷＰＲＥ配列、及び（１０）１つ以上のｐＡ配列を含む。一部の様態において、ポリヌクレオチドは（５’から３’方向に）：（１）エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、（２）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター及び／又はβ－アクチン）、（３）Ｅ１配列（例えば、ＣＭＶ Ｅ１配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列及び／又はβ－アクチンＥ１配列）、（４）スプライシングドナー配列、（５）非翻訳核酸配列、（６）ＥＦ－１α Ｅ２配列、（７）外来遺伝子、（８）１つ以上のｍｉＲＮＡターゲット配列、（９）ＷＰＲＥ配列、及び（１０）１つ以上のｐＡ配列を含む。

【0205】

当技術分野で知られている任意の適切なｐＡ配列を本開示内容で使用することができる。一部の様態において、ポリアデニル化配列の例は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ｐＡ配列、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ｐＡ配列、サルホラーウイルス４０（ＳＶ４０）初期ｐＡ配列、及びＳＶ４０後期ｐＡ配列を含むが、これらに限定されない。

【0206】

一部の様態において、前記ｐＡ配列は、配列リストの第１９配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記ｐＡ配列は、配列リストの第２０配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記ｐＡ配列は、配列リストの第２１配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記ｐＡ配列は、配列リストの第２２配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。一部の様態において、前記ポリアデニル化配列は、配列リストの第１９～２２配列に示したヌクレオチド配列からなる群から選択される。

【0207】

上述したように、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（ｉ）外来遺伝子（例えば、配列リストの第２３配列）及び（ｉｉ）外来遺伝子に作動可能に連結された調節要素を含むが、前記調整要素は（５’から３’方向に）：（１）配列リストの第４配列に示したＣＭＶエンハンサー配列、（２）配列リストの第５配列又は第６配列に示したＣＭＶプロモーター配列、配列リストの第７配列に示したＥＦ－１αプロモーター配列又は配列リストの第８配列に示したチキンβ－アクチンプロモーター配列、（３）配列リストの第１２配列に示したＣＭＶ Ｅ１配列、配列リストの第１３配列に示したＥＦ－１α Ｅ１配列又は配列リストの第１４配列又は第１５配列に示したチキンβ－アクチンＥ１配列、（４）配列リストの第９配列又は第１０配列に示したスプライシングドナー配列、（５）配列リストの第２配列、配列リストの第３配列又は配列リストの第５７配列に示したヌクレオチド配列を含むか、前記ヌクレオチド配列から必須になるか、又は前記ヌクレオチド配列からなるＥＦ－１αイントロン断片配列（すなわち、非翻訳核酸配列）、及び（６）配列リストの第１１配列に示したＥＦ－１α Ｅ２配列を含む。

【0208】

ＩＩＩ．ベクター
一部の様態において、本明細書は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む）のうち任意のポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。本明細書に記載されているように、そのようなベクターは、宿主細胞及び治療的介入をターゲットとする細胞における組換え発現に有用である。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドの送達に有用なベクター（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む）はウイルスベクターを含む。本開示内容でベクターとして使用することができるウイルスの例には、レトロウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、レンチウイルス、ボックスウイルス、ワクシニアウイルス、ラブドウイルス、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））、バキュロウイルス、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。一部の様態において、本開示内容で使用することができるベクターは非ウイルスベクターを含む。そのようなベクターの非限定的な例には、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリオファージ、及びそれらの組み合わせが含まれる。

【0209】

ＩＩＩ．Ａ．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む）は、ＡＡＶを用いて、例えば、細胞に送達される。一本鎖ＤＮＡウイルスとしてのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はヘルパー依存性ヒトパルボウイルスである。ＡＡＶゲノムは約４．７ｋｂｐの大きさを有し、ウイルス複製及びウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子をコーディングするＮ末端、前記ウイルスのキャプシドタンパク質をコーディングするｃａｐ遺伝子をコーディングするＣ末端及び各末端に約１４５個の塩基が挿入された逆反復末端（ＩＴＲ）からなる。前記１４５ｂｐの逆反復末端（ＩＴＲ）はＴ字状の構造を有し、ウイルス誘電体の複製時の複製原点の機能を果たし、一次的なパッケージング信号として作用する。前記ＩＴＲは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物を作製する際に唯一必要なシス作用（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ）塩基配列である。前記ＩＲＴは、Ｒｅｐタンパク質の存在下ではエンハンサー活性を有するが、Ｒｅｐタンパク質が存在しない場合には非常に弱い活性を有する。組換えＡＡＶ構築物に外来遺伝子をクローニングする際に、これらの特徴を考慮してエンハンサー、プロモーター、ｐＡ等を適切に構成して発現構築物を作製する（ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ ａｎｄ Ｎ Ｍｕｚｙｃｋａ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｖｉｒｏｌｏ．２０１４．１：４２７－４５１）。４つのタンパク質がｒｅｐ遺伝子から翻訳される。これらのタンパク質は、その分子量に応じてｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２及びｒｅｐ４０に分けられ、ＡＡＶ ＤＮＡ複製に重要な機能を果たす。ｃａｐ遺伝子からは４つのタンパク質が翻訳される。このうち、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３タンパク質はＡＡＶ粒子を構成する構造タンパク質であり、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ、ａｓｓｅｍｂｌｙ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は前記構造タンパク質によるＡＡＶ粒子の形成を促進する。アデノ随伴ウイルスの効率的な複製のために、アデノウイルス又はヘルペスシンプレックスウイルスなどのヘルパーウイルスから由来する一部のタンパク質及びＲＮＡを必要とする（Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８、９７－１２９、１９９２）。

【0210】

ＡＡＶは細胞に外来ＤＮＡを伝達するためのベクターとして魅力的にする独特の特徴を持っている。培養物中の細胞のＡＡＶ感染は一般に非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は無症候性で無症状である。さらに、ＡＡＶはさまざまな種類の多くの哺乳類細胞に感染し、ｉｎｖｉｖｏでさまざまな多くの組織を標的にする可能性がある。ＡＡＶは、また、他の形態の遺伝子送達と比較して弱い免疫応答を促進し、分裂と静止細胞の両方で非統合エピソームベクターＤＮＡ（ｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ，ｅｐｉｓｏｍａｌ ｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡ） に基づいて持続的に発現することを含んで遺伝子送達のために特に魅力的なウイルスシステムにする追加の利点がある。さらに、ＡＡＶはアデノウイルスを不活化するために使用される条件（数時間の間５６℃～６５℃）に耐えるので、ｒＡＡＶベースのワクチンの低温保存はそれほど重要ではなくなる。

【0211】

本開示内容で使用することのできるアデノ随伴ウイルスの種類又は血清型は、ＡＡＶｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ１０）、ＡＡＶ－ＤＪ（ＡＡＶＤＪ）、ＡＡＶ－ＤＪ８（ＡＡＶＤＪ８）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶｈＥｒ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、 ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶ ＳＭ１０－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－１、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－７、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－６、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－８、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－２、ＡＡＶ ＳＭ１０－１、ＡＡＶ ＳＭ１０－８、ＡＡＶ ＳＭ１００－３、ＡＡＶ ＳＭ１００－１０、ＢＰ６１ ＡＡＶ、ＢＰ６２ ＡＡＶ、ＢＰ６３ ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、ｔｒｕｅ ｔｙｐｅ ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ １０及び日本ＡＡＶ１０血清型を含むが、これらに限定されない。

【0212】

一部の様態において、前記アデノ随伴ウイルスの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ１０である。一部の様態において、前記ＡＡＶの血清型はＡＡＶ２である。一部の様態において、前記ＡＡＶの血清型はＡＡＶ５である。一部の様態において、前記ＡＡＶの血清型はＡＡＶ８である。一部の様態において、前記ＡＡＶの血清型はＡＡＶ９である。

【0213】

ＩＩＩ．Ｂ．非ＡＡＶベクター
本明細書は、また、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む）を含む非ＡＡＶベクターを提供する。

【0214】

一部の様態において、前記ベクターは、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリオファージ又は真核生物ウイルスＤＮＡであり得る。前記ＡＡＶベクターに加えて、タンパク質の発現に有用であり、当技術分野で知られている多数の他のベクターバックボーン（ｖｅｃｔｏｒ ｂａｃｋｂｏｎｅ）を使用することができる。これらのベクターには、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ボックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、及びモロニーラット白血病ウイルスを含むが、これに限定されない。さらに、１つのクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオマウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス又はセムリキ森林ウイルスのようなウイルスから由来するＤＮＡ要素を含む。そのようなベクターは市販されているか、又は当技術分野で周知の方法によって記載された配列から組み立てられることができる。

【0215】

本明細書に記載のＡＡＶベクターに関する特定の開示内容を非ＡＡＶベクターに等しく適用できることは当業者には明らかであろう。したがって、特に明記しない限り、「ベクター」という用語は、ＡＡＶ及び非ＡＡＶベクターの両方を含む。

【0216】

ＩＶ．セル
一部の様態において、本明細書は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、非翻訳核酸配列を含む）のうち任意のポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。例えば、一部の様態において、本明細書に記載の細胞は、外来遺伝子及び外来遺伝子発現用の非翻訳核酸配列を含む組換え発現構築物に形質導入、形質感染又は形質転換される。

【0217】

いかなる理論に拘束されることではないが、一部の様態において、本明細書に記載の細胞（例えば、非翻訳核酸配列を含むポリヌクレオチドに形質導入される）は、本明細書に記載の外来遺伝子によってコーディングされるもの（例えば、ＶＥＧＦ阻害剤）のようなタンパク質を産生するのに有用である。本明細書に記載されているように、一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列（すなわち、ＥＦ－１αイントロン断片）は、細胞における前記外来遺伝子によってコーディングされるタンパク質（「コーディングされたタンパク質」）の発現を向上させることができる。したがって、一部の様態において、本明細書に記載の細胞（例えば、外来遺伝子及び本開示内容の非翻訳核酸配列を含むポリヌクレオチドに形質導入される）は、基準細胞と比較して前記コーディングされたタンパク質のより大きな発現を引き起こす。一部の様態において、前記基準細胞は該当ポリヌクレオチドに形質導入されるが、非翻訳核酸配列が欠けている。

【0218】

一部の様態において、本明細書に記載の細胞は、試験管内で前記外来遺伝子によってコーディングされたタンパク質を産生することができる。特定の様態において、本明細書に記載の細胞は、生体内で（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドを投与された対象において）コーディングされたタンパク質を産生することができる。一部の様態において、本明細書に記載の細胞は、試験管内及び生体内の両方でコーディングされたタンパク質を生産することができる。

【0219】

一部の様態において、（例えば、試験管内で）外来遺伝子によってコーディングされるタンパク質を産生するために使用することができる細胞は宿主細胞を含む。本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、前記発現構築物（例えば、ベクター）に形質導入されて、発現構築物を複製するか、発現構築物によってコーディングされる遺伝子を発現することができる任意の生物の細胞を含むことが意図される。そのような細胞は真核細胞及び原核細胞を含む。本明細書で使用される「形質導入」という用語は、形質感染及び形質転換を含むことが意図される。前記宿主細胞は、前記発現構築物によって形質導入、形質感染又は形質転換されることができる。このプロセスは、外生の核酸分子が宿主細胞内に送達又は導入されることを意味する。一部の様態において、前記宿主細胞は真核細胞である。一部の様態において、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、トランスジェニック哺乳動物細胞及び植物細胞からなる群から選択される。一部の様態において、前記宿主細胞は原核細胞である。一部の様態において、前記原核細胞は細菌細胞である。

【0220】

一部の様態において、前記宿主細胞は昆虫細胞である。一部の様態において、前記昆虫細胞はＳｆ９である。一部の様態において、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。本開示内容で使用できる哺乳動物細胞の非限定的な例は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ－７、Ｃ８Ｄ１ａ、Ｎｅｕｒｏ２Ａ、ＣＨＯ、ＭＥＳ１３、ＢＨＫ－２１、ＣＯＳ７、ＣＯＰ５，Ａ５４９，ＭＣＦ－７，ＨＣ７０，ＨＣＣ１４２８，ＢＴ－５４９，ＰＣ３，ＬＮＣａＰ，Ｃａｐａｎ－１，Ｐａｎｃ－１，ＭＩＡＰａＣａ－２，ＳＷ４８０，ＨＣＴ１６６，ＬｏＶｏ，Ａ１７２，ＭＫＮ－４５，ＭＫＮ－７４，Ｋａｔｏ－ＩＩＩ、ＮＣＩ－Ｎ８７、ＨＴ－１４４、ＳＫ－ＭＥＬ－２、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ、Ｃ６、ＨＴ－２２、ＰＣ－１２、ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びそれらの組み合わせを含む。

【0221】

一部の様態において、（例えば、生体内で）本明細書に記載の外来遺伝子によってコーディングされるタンパク質を産生するために使用することができる細胞はヒト細胞を含む。一部の様態において、前記ヒト細胞は、本明細書に記載の核酸分子を投与された対象の細胞である。特定の実施形態では、前記ヒト細胞はドナー（例えば、健康なヒト対象）から由来する。

【0222】

Ｖ．医薬組成物
本明細書に開示されている様々な核酸分子、細胞及びベクター（本明細書では「活性複合体（ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」とも呼ばれる）は、投与に適した医薬組成物に混入されることができる。したがって、一部の様態において、本開示内容は、そのような医薬組成物に関する。

【0223】

一部の様態において、本明細書は、（ａ）本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む）のうち任意のポリヌクレオチド及び（ｂ）１つ以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を開示する。一部の様態において、本明細書は、（ａ）本明細書に記載のベクター（例えば、ｒＡＡＶ）及び（ｂ）１つ以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を開示する。一部の様態において、本明細書は、（ａ）本明細書に記載の細胞及び（ｂ）１つ以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を開示する。

【0224】

一部の様態において、本明細書に記載の医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス及び薬学的に許容される担体を含むが、前記組換えアデノ随伴ウイルスが（ａ）ＡＡＶ８型キャプシドタンパク質及び（ｂ）（ｉ）配列リストの第２３配列に示したヌクレオチド配列を含む外来遺伝子と、（ｉｉ）前記外来遺伝子に作動可能に連結された調節要素を含むポリヌクレオチドとを含み、前記調節要素が（５’から３’方向に）：（１）配列リストの第４配列に示したＣＭＶエンハンサー配列；（２）配列リストの第８配列に示したチキンβ－アクチンプロモーター配列；（３）配列リストの第１５配列に示したチキンβ－アクチンエクソン１（Ｅ１）配列；（４）配列リストの第１０配列に示したチキンβ－アクチンイントロンのスプライシングドナー配列；（５）配列リストの第２配列、配列リストの第３配列又は配列リストの第５７配列に示したヌクレオチド配列を含むか、前記ヌクレオチド配列から必須になるか、又は前記ヌクレオチド配列からなる非翻訳核酸配列；及び（６）配列リストの第１１配列に示したＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列を含む。

【0225】

本開示内容で使用することができる薬学的に許容される担体は、製剤中に通常使用されるものである。前記薬学的に許容される担体の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩、プロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油などを含むが、これらに限定されない。本開示内容の医薬組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤及び保存剤からなる群から選択される１つ以上の添加剤をさらに含み得る。適切な薬学的に許容される担体及び製剤の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．、１９９５）で見出すことができる。

【0226】

本開示内容の医薬組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤化される。適切な非経口投与経路の例は、静脈内注入、経皮投与、皮下注入、筋肉内注入、硝子体内注入、網膜下注入、脈絡膜空間注入、点眼投与、脳室内注入、脊椎腔内注入、羊膜内注入、動脈内注入、関節腔内注入、心臓内注入、陰茎海綿体内注入、脳内注入、大槽内注入、冠状内注入、頭蓋内注入、硬膜内注入、硬膜外注入、海馬内注入、鼻腔内注入、骨腔内注入、腹腔内注入、胸腔内注入、脊髄内注入、胸腔内注入、胸腺内注入、子宮内注入、膣内注入、心室内注入、膀胱内注入、結膜下注入、腫瘍内注入、局所注入、腹腔注入及びそれらの組み合わせを含む。

【0227】

一部の様態において、前記医薬組成物は、０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇの１日用量で投与される。

【0228】

本開示内容の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と共に製剤化することができる。前記医薬組成物は単位投与形態で提供されてもよく、又は多用量容器に分配されてもよい。前記製剤は、油又は水性媒体中の溶液、懸濁液又は乳化剤の形態、又はＸ剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であり得る。前記製剤は分散剤又は安定剤をさらに含み得る。

【0229】

ＶＩ．キット
本明細書は、また、本明細書に開示された１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む）、本明細書に開示された１つ以上のベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、本明細書に開示された１つ以上の細胞、本明細書に開示される任意の医薬組成物又はそれらの任意の組み合わせを含むキットを開示する。一部の様態において、前記キットは、また、上述したもののうち任意のもの又はそれらの組み合わせを必要とする対象に投与するための説明書を含む。

【0230】

本明細書で使用する「キット」及び「システム」という用語は、一部の様態において、１つ以上の他の種類の要素又は成分（例えば、他の種類の生化学的試薬、容器、市販のパッケージングのようなパッケージ、使用説明書など）と組み合わせる本明細書に開示される少なくとも１つ以上のポリヌクレオチド、本明細書に開示された１つ以上のベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、本明細書に開示された１つ以上の宿主細胞、本明細書に開示された任意の医薬組成物、又はそれらの任意の組み合わせを指すように意図される。

【0231】

ＶＩＩ．用途及び方法
ＶＩＩ．Ａ．生産方法
本明細書は、また、外来遺伝子によってコーディングされるポリペプチドを産生する方法を開示する。一部の様態において、そのような方法は、適切な条件下で本明細書に記載の細胞（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸分子を含むポリヌクレオチドに形質導入される）を培養し、コーディングされたタンパク質を回収することを含む。特定の様態では、外来遺伝子によってコーディングされるポリペプチドを産生する方法は、本開示内容のポリヌクレオチド（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸分子を含む）を必要とする対象に投与して前記対象においてコーディングされたポリペプチドを生産することを含む。ポリペプチドを産生するそのような生体内方法に関するさらなる開示内容は、本開示内容の他のところに提供されている（例えば、治療的用途を参照）。

【0232】

一部の様態において、本開示内容は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む）を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法を提供する。一部の様態において、そのような組換えＡＡＶを産生する方法は、本明細書に記載のＡＡＶベクターに形質感染された細胞を組換えＡＡＶを産生する条件で培養することを含む。一部の様態において、前記方法は、細胞培養物の上清から組換えＡＡＶを回収することをさらに含む。

【0233】

一部の様態において、前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、（ｉ）前記外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含むＡＡＶ構築物（例えば、図６Ｃ参照）、（ｉｉ）ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含む構築物、及び（ｉｉｉ）外来遺伝子を宿主細胞に形質導入するためのヘルパー構築物を使用して製作することができる。この様態では、前記ヘルパー構築物は、ＡＡＶゲノム複製及び遺伝子転写を促進するＥ２Ａ遺伝子、ＡＡＶｍＲＮＡが核から細胞質に移動することを可能にするＥ４遺伝子、及び翻訳を調節する役割を果たす２つのＶＡ ＲＮＡを生成するＶＡ領域を含むことができる。

【0234】

一部の様態において、上述した３つの構築物は、宿主細胞に形質導入のための２つの構築物によって置き換えることができる。このような様態では、ＡＡＶ構築物は外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含み、別個の構築物は前記ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、Ｅ２Ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ領域を含む。本明細書に記載のＡＡＶ粒子を生産するためのさらなる方法は一般に当技術分野で知られている。例えば、それぞれその全文が本明細書に参照として組み込まれる、Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ３：１６００２（２０１６年３月）；Ｃｌａｒｋ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．６１：Ｓ９－１５（２００２年１月）；及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（３）：２２２４－３２（１９９８年３月）を参照。

【0235】

ＶＩＩ．Ｂ．治療的用途
本明細書に記載の核酸分子（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む）、そのような核酸分子を有するベクター及び組換えウイルス（例えばｒＡＡＶ）、及び本明細書に記載の方法は、多くの試験管内及び生体内での有用性を有する。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、例えば、ベクター、例えば、ＡＡＶベクターは、培養物、試験管内又は生体外で細胞に又はヒト対象、例えば、生体内に投与されて疾患を治療することができる。したがって、一部の様態において、本開示内容は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む）のうち任意のポリヌクレオチド、本明細書に記載の組換え発現構築物、本明細書に記載の細胞、本明細書に記載の医薬組成物又は本明細書に記載の組換えウイルスの治療のための使用を提供する。

【0236】

一部の様態において、本明細書は、必要な対象において外来遺伝子を発現する方法であって、前記対象に本明細書に開示されたポリヌクレオチド（例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む）、本明細書に開示されたベクター、本明細書に開示された組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）、本明細書に開示された細胞又は本明細書に開示された医薬組成物を投与することを含むが、前記投与後の対象における外来遺伝子の発現が増加する方法を開示する。

【0237】

本明細書に記載されているように、本開示内容の非翻訳核酸配列は、前記外来遺伝子が翻訳されるときに外来遺伝子の発現を増加させることができる。したがって、一部の様態において、本開示内容は、細胞における外来遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記細胞を本明細書に開示されたポリヌクレオチド、ベクター又は組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）のうち任意のポリヌクレオチド、ベクター又は組換えウイルスと接触させることを含む方法に関する。前記接触を生体外又は生体内で行うことができる。前記接触を生体内で進行させる場合、前記方法は、接触前に対象に前記ポリヌクレオチド、ベクター又は組換えウイルスのうち任意のポリヌクレオチド、ベクター又は組換えウイルスを投与することをさらに含み得る。

【0238】

一部の様態において、前記接触後の外来遺伝子の発現は、基準発現と比較して少なくとも約１倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍又は少なくとも約１０倍以上増加する。一部の様態において、前記基準発現は、接触前の細胞内の外来遺伝子の発現である。一部の様態において、前記基準発現は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター又は組換えウイルス（例えば、非翻訳核酸配列が欠けているか、配列リストの第１配列に示したヌクレオチド配列を含む）と接触しない該当細胞内の外来遺伝子の発現である。

【0239】

本開示内容のさらに他の様態は、必要な対象における疾患を治療するための方法であって、前記対象に前記ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組換えウイルス又は医薬組成物のうち任意のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組換えウイルス又は医薬組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。本開示内容から明らかなように、本明細書に記載の組成物（例えば、ポリヌクレオチド、組換え発現構築物、細胞、医薬組成物又は組換えウイルス）は、例えば、外来遺伝子を変形させることによって、任意の対象疾患を治療するために使用されることができる。

【0240】

本開示内容によって予防、改善又は治療することができる疾患は限定されず、薬物の投与回数を減らす必要があるすべての疾患を含む。そのような疾患の非限定的な例は、眼科疾患を含む。一部の様態において、前記眼科疾患は、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管形成、黄斑変性、網膜変性、黄斑浮腫、網膜浮腫、黄斑腫脹、又はそれらの組み合わせから選択される。

【0241】

一部の様態において、本開示内容によって治療することができる眼科疾患は黄斑変性を含む。一部の様態において、前記黄斑変性は年齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）を含む。年齢関連黄斑変性は、乾性（萎縮性）黄斑変性と湿性（新生血管性又は滲出性）黄斑変性に分けることができる。年齢関連黄斑変性は、初期ＡＭＤ、中期ＡＭＤ、及び後期又は進行性ＡＭＤ（マップ状萎縮）に分けることができる。一部の様態において、本開示内容によって治療することができる眼科疾患は、糖尿病性網膜症を含む。一部の様態において、糖尿病性網膜症は非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）である。一部の様態において、糖尿病性網膜症は増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）である。一部の様態において、糖尿病性網膜症は糖尿病性黄斑病である。一部の様態において、糖尿病性網膜症は糖尿病性黄斑浮腫である。一部の様態において、糖尿病性網膜症は、網膜内の虚血性損傷に関連する任意の網膜症である。特に明記しない限り、本開示内容は、あらゆる形態のＡＭＤ及び／又は糖尿病性網膜症を治療するために使用することができる。

【0242】

本開示内容のさらに他の様態は、持続的な外来遺伝子の発現を達成することができる遺伝子治療剤又は疾患治療用の方法を提供する。

【0243】

本明細書に記載のウイルス送達システムを使用すると、約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、又は約１年以上の間隔で本明細書に記載の組成物を投与することが可能である。一部の様態において、前記間隔は約２～約３ヶ月である。一部の様態において、前記間隔は約６ヶ月である。一部の様態において、前記間隔は約１年である。一部の様態において、前記間隔は少なくとも約１年である。すなわち、本明細書に記載のウイルス送達システムを使用すると、組成物の投与回数を大幅に減少させて、医師、患者又は対象が前記組成物の繰り返し投与によって引き起こされる不快感を回避することができる。患者の症状又は必要に応じて、前記組成物を最初に１～２週間の間隔で少なくとも２～３回投与することができ、その後、２～３ヶ月ごと、６ヶ月ごと、又は１年以上毎に１回投与することができる。

【0244】

以下、実施例を参照して本開示内容をより具体的に説明する。本開示内容の要旨によって、本開示内容の範囲がこれらの実施例によって限定されないことは当業者には明らかであろう。
〔図面の簡単な説明〕
本開示内容のこれら及び/又は他の様態及び利点は、添付図面を参照して前記様態の以下の説明から明らかでありより容易に理解される：
図１は、本明細書に記載のｐＡＡＶ－ｅＧＦＰ発現構築物の開裂マップを示す。

【0245】

図２Ａ及び２Ｂは、ＥＦ－１αプロモーター（「ＣＥＥ－ＦＬ」）と共に全長ＥＦ－１αイントロンを含む発現構築物に形質導入された細胞におけるｅＧＦＰの発現増加を示す。対照群細胞は、ＥＦ－１αイントロン（「ＣＥ」）が欠けている当該発現構築物に形質導入された。図２Ａでは、ＩＴＲ欠失動物細胞発現構築物を使用した。図２Ｂでは、ＩＴＲ含有ｐＡＡＶ発現構築物を使用した。図２Ａ及び２Ｂの両方において、次のように形質導入された細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１、Ｈｕｈ－７及びＨｅｐ３Ｂ）内のｅＧＦＰ発現が示されている。

【0246】

図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、様々なプロモーター（「ＣＣＥ－ＦＬ」）と共に、全長ＥＦ－１αイントロンを含む発現構築物に形質導入された細胞におけるｅＧＦＰの発現を示す。対照群細胞は、ＥＦ－１αイントロンが欠けている当該発現構築物に形質導入された。図３Ａでは、ＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターの組み合わせを動物細胞発現構築物（すなわち、ＩＴＲ欠失）に挿入して前記細胞を形質導入するために使用した。図３Ｂでは、ＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターの組み合わせをｐＡＡＶ発現構築物に挿入して細胞を形質導入するために使用した。図３Ｃでは、前記細胞をＣＭＶエンハンサー及びチキン－βアクチンプロモーターの組み合わせを含む動物細胞発現構築物に形質導入した。図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃのそれぞれにおいて、次のように形質導入された細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１、Ｈｕｈ－７及びＨｅｐ３Ｂ）内のｅＧＦＰ発現が示されている。

【0247】

図４Ａ及び４Ｂは、遺伝子発現に対する様々なＥＦ－１αイントロン断片配列（すなわち、本明細書に記載の非翻訳核酸配列）の増加又は減少の効果を示す。図４Ａは、ＥＦ－１αイントロン配列を順次に欠失することによって製造された一連のＣＥＥ構築物を概略的に示す。示された各構築物は以下を含んでいた：（１）ＣＭＶエンハンサー（３８０個の塩基対）；（２）ＣＭＶプロモーターの一部（５’末端から最初の３１個の塩基対）及びＥＦ－１αプロモーター（２０１個の塩基対）を含むプロモーター；（３）ＥＦ－１αエクソン１（Ｅ１）配列（２９塩基対）。対照群「ＣＥ」構築物は、ＥＦ－１アルファイントロン配列を含んでいかなる追加の成分も含まなかった。他の構築物は、以下の追加成分をさらに含んでいた：（４）全長ＥＦ－１アルファイントロン配列（すなわち、配列リストの第１配列）の５’末端から最初の１９個の塩基対からなるスプライスドナー配列；（５）ＥＦ－１αイントロン配列；及び（６）ＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列（９個の塩基対）。前記ＥＦ－１αイントロン配列は、全長配列（９２４個の塩基対）（「ＣＥＥ－ＦＬ」）又は；（ｉｉ）配列リストの第１配列の５７０～９２４番目のヌクレオチド（３５５個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ２」）；（ｉｉｉ）配列リストの第１配列の７２１～９２４番目のヌクレオチド（２０４個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３」）；（ｉｖ）配列リストの第１配列の８０８～９２４番目のヌクレオチド（１１７塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３．１」）；（ｖ）配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチド（９５個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３．１．１」）；（ｖｉ）配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチド（７３個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３．１．２」）；（ｖｉｉ）配列リストの第１配列の８７４～９２４番目のヌクレオチド（５１個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３．２」）；及び（ｖｉｉｉ）配列リストの第１配列の８９６～９２４番目のヌクレオチド（２９個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ４」）を含んでいた。前記構築物の各々の全長は右側に提供されている。図４Ｂは、５つの相異なる細胞株（ＨｅＬａ、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ－７、ＡＲＰＥ－１９及びＲＰＥ－１）におけるｅＧＦＰ（すなわち、外来遺伝子）発現に対する相異なるＥＦ－１αイントロン配列（全長又は欠失）の効果を見せている。ＡＲＰＥ－１９及びＲＰＥ－１細胞は網膜から由来した。Ｈｕｈ－７及びＨｅｐ３Ｂ細胞は肝臓から由来した。ＨｅＬａ細胞は子宮頸部から由来した。ｅＧＦＰ発現は、ＣＥＥ－ＦＬ構築物を使用して外来遺伝子に形質導入された細胞において観察された発現速度（％）として示された。“ｎｓ”＝有意性なし。“＊＊”＝ｐ＜０．０１及び“＊＊＊”＝ｐ＜０．００１。

【0248】

図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ及び５Ｄは、外来遺伝子の発現を増加させるＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１（すなわち、配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチド（９５個の塩基対）及びＴ３．１．２（すなわち、配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチド（７３個の塩基対）の能力を示している。図５Ａは、以下の追加の成分と共に、ＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２を含む一連のＣＡＥ構築物を概略的に示している：（１）ＣＭＶエンハンサー（３８０個の塩基対）；（２）チキンβ－アクチンプロモーター（２７９個の塩基対）；（３）チキンβ－アクチンエクソン１（Ｅ１）配列（３２個の塩基対）；（４）ＥＦ－１αエクソン１（Ｅ１）配列（２９個の塩基対）；（５）全長ＥＦ－１αイントロン配列（すなわち、配列リストの第１配列）の５’末端から最初の１９個の塩基対からなるスプライシングドナー配列；（６）ＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列（９個の塩基対）。対照群「ＣＡ」構築物は、ＣＭＶエンハンサー、チキンβ－アクチンプロモーター及びチキンβ－アクチンＥ１配列のみを含んでいた。対照群「ＣＡＥ－ＦＬ」構築物は全長ＥＦ－１αイントロン配列を含んでいた。前記構築物の全長は左側に提供されている。図５Ｂは、ＣＡＥ－Ｔ３．１．１及びＣＡＥ－Ｔ３．１．２構築物を用いて形質導入されたＨｅＬａ（左グラフ）及びＡＲＰＥ－１９（右グラフ）細胞におけるｅＧＦＰ（すなわち、外来遺伝子）発現を示している。遺伝子発現は、ＣＡ構築物（すなわち、ＥＦ－１αイントロン配列の欠失）を用いて形質導入された該当細胞における発現速度（％）として示した。図５Ｃは、ＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１又はＴ３．１．２及びチキンβ－アクチンイントロン断片の両方を含む一連のハイブリッドイントロンＣＡ構築物（すなわち、ＣＡ－Ｔ３．１．１及びＣＡ－Ｔ３．１．２構築物）を概略的に示している。前記２つの構築物は：（１）ＣＭＶエンハンサー；（２）チキンβ－アクチンプロモーター；（３）チキンβ－アクチンＥ１配列；（４）ＥＦ－１α Ｅ２配列をさらに含んている。対照群「ＣＡＧ－ＦＬ」構築物は以下を含んでいる：（１）ＣＭＶエンハンサー（３８０個の塩基対）；（２）チキンβ－アクチンプロモーター（２７９個の塩基対）；（３）チキンβ－アクチンＥ１配列（９３個の塩基対）；（４）キメライントロン（チキンβ－アクチン及びウサギβ－グロビンのイントロンを含む）（９２４個の塩基対）；（５）ウサギβ－グロビンエクソン３（Ｅ３）配列（４８個の塩基対）。「ＣＡ」構築物は、図５Ａに記載されたものと同じである。図５Ｄは、構築物ＣＡ－Ｔ３．１．１及びＣＡ－Ｔ３．１．２を用いて形質導入されたＨｅＬａ（左グラフ）及びＨｅｐ３Ｂ（右グラフ）細胞におけるｅＧＦＰの発現を示している。遺伝子発現は、ＣＡ構築物（すなわち、ＥＦ－１αイントロン配列の欠失）を用いて形質導入された該当細胞における発現速度（％）として示した。

【0249】

図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、ＡＡＶを用いて遺伝子を送達する場合のＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２の外来遺伝子（すなわち、アップリバーセプト）発現増加効果を示している。図６Ａは、試験管内の遺伝子伝達においてＴ３．１．１及びＴ３．１．２断片による遺伝子発現増加効果を示している。図６Ｂは、生体内の遺伝子伝達においてＴ３．１．１及びＴ３．１．２断片による遺伝子発現増加効果を示している。図６Ｃは、外来遺伝子としてアプリバーセプトを挿入したｐＡＡＶ－ＣＡ－Ｔ３．１．１ベクターの開裂マップである。
〔発明を実施するための形態〕
材料及び方法
実施例１．エンハンサー－プロモーター－イントロン配列を含まないｐＡＡＶ－ｅＧＦＰ構築物の製造
実施例１－１．ｂＧＨポリアデニル化信号配列の挿入
ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ構築物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｖ６５２０－２０）を鋳型とし、オリゴ＃００１、＃００２を用いて重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化信号Ａ配列（ポリＡ）断片を確保した。次に、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ－ムプロモータープラスミド（Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＶＰＫ－４１１）のＢｇｌＩＩ／ＢｓｔＥＩＩ部位を用いてヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡを除去し、ｂＧＨ ｐｏｌｙ Ａを挿入した。

【0250】

実施例１－２．ｅＧＦＰの挿入
ｐＵＣＩＤＴ－ＫＡＮ－ｅＧＦＰ構築物（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）由来のヒトコドン最適化ｅＧＦＰ遺伝子を確保し、これを実施例１－１で製造したｐＡＡＶ－ｂＧＨ構築物のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。

【0251】

実施例１－３．ＷＰＲＥ配列の挿入
ｐＵＣ５７－ＷＰＲＥ構築物（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）からウッドチャック肝炎ウイルス後転写調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列を確保し、これを実施例１－２で製造したｐＡＡＶ－ｅＧＦＰ－ｂＧＨ構築物のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。

【0252】

実施例１－４．４コピー（ｃｏｐｙ）のｍｉＲＮＡ１４２－３ｐターゲット配列の挿入
ｏｌｉｇｏ＃００３と＃００４を、また、＃００５と＃００６をそれぞれアニーリングして、それぞれ２コピーのｍｉＲＮＡ１４２－３ｐターゲット配列を含む２つのＤＮＡ断片を用意した。２つの短いＤＮＡ断片を実施例１－３で製造したｐＡＡＶ－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｂＧＨ構築物のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングして、合計４回のコピーのｍｉＲＮＡ１４２－３ｐターゲット配列が挿入されるようにした。これにより、エンハンサー－プロモーター－イントロン配列を含まないｐＡＡＶ－ｅＧＦＰ構築物を製造した（図１）。

【0253】

実施例２．様々な種類のエンハンサー－プロモーター－イントロン配列を含む構築物の製造
実施例２－１．ＣＥＥシリーズ（ＣＥＥ－ＦＬ、ＣＥＥ－Ｔ２、－Ｔ３、－Ｔ３、－Ｔ３．１、－Ｔ３．１．１、－Ｔ３．１．２、－Ｔ３．２、－Ｔ４）及びＣＥ配列を含む構築物の製造
実施例２－１－１．ＣＥＥ－ＦＬ（全長）塩基配列を含む構築物の製造
ｐＭＫ－ＲＱ３＿ＰＥＭ構築物（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からＣＥＥ－ＦＬ（ＣＭＶエンハンサー（配列リストの第４配列）－ＣＭＶプロモーターの３１ｂｐ（配列リストの第５配列）－ＥＦ－１αプロモーター（配列リストの第７配列）－ＥＦ－１αエクソン１の２９ｂｐ（配列リストの第１３配列）－ＥＦ－１αイントロン（配列リストの第１配列）－ＥＦ－１αエクソン２の９ｂｐ（配列リストの第１１配列）ＤＮＡ断片を確保し、これを実施例１で製造した構築物のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0254】

実施例２－１－２．ＣＥＥ－Ｔ２塩基配列を含む構築物の製造
ｏｌｉｇｏ＃００７／００８の組み合わせと＃００９／０１０の組み合わせを用いて実施例２－１－１で製造した構築物を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（ＮＥＢ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ２６１１）を介して２つのＤＮＡ断片を連結して、ＣＥＥ－Ｔ２配列を有する構築物を製造した。

【0255】

実施例２－１－３．ＣＥＥ－Ｔ３塩基配列を含む構築物の製造
ｏｌｉｇｏ＃０１１／００８の組合せと＃０１２／０１０の組合せを用いて実施例２－１－１で製造した構築物を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙを介して二つのＤＮＡ断片を連結してＣＥＥ－Ｔ３配列を有する構築物を製造した。

【0256】

実施例２－１－４．ＣＥＥ－Ｔ３．１塩基配列を含む構築物の製造
ｏｌｉｇｏ＃０１３／００８、＃０１４／０１０の組み合わせを用いて実施例２－１－１で製造した構築物を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙを介して二つのＤＮＡ断片を連結してＣＥＥ－Ｔ３．１配列を有する構築物を製造した。

【0257】

実施例２－１－５．ＣＥＥ－Ｔ３．２塩基配列を含む構築物の製造
ｏｌｉｇｏ＃０１５／００８、＃０１６／０１０の組み合わせを用いて実施例２－１－１で製造した構築物を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙを介して二つのＤＮＡ断片を連結してＣＥＥ－Ｔ３．２配列を有する構築物を製造した。

【0258】

実施例２－１－６．ＣＥＥ－Ｔ４塩基配列を含む構築物の製造
ｏｌｉｇｏ＃０１７／００８、＃０１８／０１０の組み合わせを用いて実施例２－１－１で製造した構築物を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙを介して二つのＤＮＡ断片を連結してＣＥＥ－Ｔ４配列を有する構築物を製造した。

【0259】

実施例２－１－７．ＣＥＥ－Ｔ３．１．１塩基配列を含む構築物の製造
ｐＵＣ５７－Ｔ３．１．１構築物（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）からのＣＥＥ－Ｔ３．１．１塩基配列を確保して、実施例２－１－１で製造した構築物のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0260】

実施例２－１－８．ＣＥＥ－Ｔ３．１．２塩基配列を含む構築物の製造
ｐＵＣ５７－Ｔ３．１．２構築物（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）からのＣＥＥ－Ｔ３．１．２塩基配列を確保して、実施例２－１－１で製造した構築物のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0261】

実施例２－１－９．ＣＥ塩基配列を含む構築物の製造
ｏｌｉｇｏ＃０１９、＃０２０を用いて実施例２－１－１で製造した構築物からＰＣＲによりＣＥ断片を確保し、これを実施例２－１－１で製造した構築物のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0262】

実施例２－２．ＣＣＥ－ＦＬ、ＣＣ配列を含む構築物の製造
実施例２－２－１．ＣＣＥ－ＦＬ配列を含む構築物の製造
ｐＭＫ－ＲＱ４＿ＰＭＥ構築物（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からＣＣＥ－ＦＬ（ＣＭＶエンハンサー（配列リストの第４配列）－ＣＭＶプロモーター（配列リストの第６配列）－ＣＭＶエクソン１の３０ｂｐ（配列リストの第１２配列）－ＥＦ－１αエクソン１の２９ｂｐ（配列リストの第１３配列）－ＥＦ－１αイントロン（配列リストの第１配列）－ＥＦ－１αエクソン２の９ｂｐ（配列リストの第１１配列）配列のＤＮＡ断片を確保して実施例１で確保したｐＡＡＶ－ｅＧＦＰ構築物のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0263】

実施例２－２－２．ＣＣ配列を含む構築物の製造
ｏｌｉｇｏ＃０１９、＃０２１を用いて実施例２－２－１で製造した構築物からＰＣＲによりＣＣ断片を確保し、これを実施例２－２－１で製造した構築物のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0264】

実施例２－３．ＣＡＧ－ＦＬ、ＣＡ－Ｔ３．１．１、ＣＡ－Ｔ３．１．２、ＣＡ配列を含む構築物の製造
実施例２－３－１．ＣＡＧ－ＦＬ配列を含む構築物の製造
ｐＣＡＧ－Ｎｅｏ構築物（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．１６３－２５６０１）からＣＡＧ断片を確保し、実施例２－１で確保した構築物のＳｎａＢＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0265】

実施例２－３－２．ＣＡ配列を含む構築物の製造
ｐＵＣ５７－ＣＡ構築物（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）からＣＡ断片を確保し、実施例２－３－１から製造した構築物のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0266】

実施例２－３－３．ＣＡ－Ｔ３．１．１配列を含む構築物の製造
ｏｌｉｇｏ＃０２２、＃０２３を用いて実施例２－１－７で確保した構築物からＰＣＲによりＴ３．１．１断片を確保し、これを実施例２－３－１から製造した構築物のＡｆｅＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0267】

実施例２－３－４．ＣＡ－Ｔ３．１．２配列を含む構築物の製造
オリゴ＃０２４と＃０２５をアニールして確保したＴ３．１．２断片を確保し、これを実施例２－３－１から製造した構築物のＡｆｅＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0268】

実施例２－４．ＣＡＥ－ＦＬ、ＣＡＥ－Ｔ３．１．１、ＣＡＥ－Ｔ３．１．２配列を含む構築物の製造
実施例２－４－１．ＣＡＥ－ＦＬ配列を含む構築物の製造
ｐＵＣ５７－ＣＡＥ構築物（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）からＣＡＥ（ＣＭＶエンハンサー（配列リストの第４配列）－チキンβ－アクチンプロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）－チキンβ－アクチンエクソン１の３２ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）－ＥＦ－１αエクソン１の２９ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）－ＥＦ－１αイントロン９２４ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）－ＥＦ－１αエクソン２の９ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１））断片を確保し、実施例１から製造した構築物のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0269】

実施例２－４－２．ＣＡＥ－Ｔ３．１．１配列を含む構築物の製造
ｏｌｉｇｏ＃０２６、＃０２７を用いて実施例２－１－７で製造した構築物からＣＡＥ－Ｔ３．１．１断片を確保し、実施例２－１－７で製造した構築物のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0270】

実施例２－４－３．ＣＡＥ－Ｔ３．１．２配列を含む構築物の製造
ｏｌｉｇｏ＃０２６、＃０２７を用いて実施例２－１－８で製造した構築物からＣＡＥ－Ｔ３．１．２断片を確保し、実施例２－１－８で製造した構築物のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0271】

実施例２－５．アップリバーセプト遺伝子を含むｐＡＡＶ構築物の製造
ｏｌｉｇｏ＃０２８、＃０２９を用いてｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＩｇＧ－アップリバーセプト構築物（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）からＰＣＲで確保したアプリバーセプト遺伝子ＤＮＡ断片を実施例２－３－１、実施例２－３－３、実施例２－３－４、実施例２－４－１、実施例２－４－２、実施例２－４－３から製造した構築物のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトにそれぞれクローニングした。

【0272】

実施例２－６．ＩＴＲ配列が存在しない動物細胞発現構築物の製造
実施例２－６－１．ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｅＧＦＰ構築物の製造
実施例１で製造した構築物をＢａｍＨＩ／ＡｆｅＩで切断して、ｅＧＦＰ遺伝子断片を確保し、これをｐｃＤＮＡ３．１（＋）構築物のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。

【0273】

実施例２－６－２．ＣＥＥ配列を含む動物細胞発現構築物の製造
実施例２－１－１から製造した構築物をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで切断して確保し、これを実施例２－６－１で製造した構築物のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0274】

実施例２－６－３．ＣＥ配列を含む動物細胞発現構築物の製造
実施例２－１－９から製造した構築物をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで切断してＣＥ断片を確保し、これを実施例２－６－１で製造した構築物のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0275】

実施例２－６－４．ＣＣＥ配列を含む動物細胞発現構築物の製造
実施例２－２－１から製造した構築物をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで切断してＣＣＥ断片を確保し、これを実施例２－６－１で製造した構築物のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0276】

実施例２－６－５．ＣＣ配列を含む動物細胞発現構築物の製造
実施例２－２－２から製造した構築物をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで切断してＣＣ断片を確保し、これを実施例２－６－１で製造した構築物のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0277】

実施例２－６－６．ＣＡＥ配列を含む動物細胞発現構築物の製造
実施例２－４－１から製造した構築物をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで切断してＣＡＥ断片を確保し、これを実施例２－６－１で製造した構築物のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0278】

実施例２－６－７．ＣＡ配列を含む動物細胞発現構築物の製造
実施例２－３－２から製造した構築物をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで切断してＣＡ断片を確保し、これを実施例２－６－１で製造した構築物のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。

【0279】

実施例２－７．塩基配列の確認
クローニングを用いて確保した全ての構築物は、塩基配列分析（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＡＣＲＯＧＥＮ、韓国、または、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を通じて塩基配列を確認した。

【0280】

実施例３．細胞培養
ＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞株はＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．４２３６０－０３２）、ＡＲＰＥ－１９細胞株はＤＭＥＲＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．１１３３０－０３２）、ＲＰＥ－１及びＨｅｐ３Ｂ細胞株はＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０５６９－０１０）を用いて５％ ＣＯ_２、３７℃の条件で湿潤培養し、すべての培地に１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１６０００－０４４）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｏｃｏ，ＵＳＡ，ＣａｔＮｏ．１５１４０－１６３）を加えた。Ｅｘｐｉ２９３細胞株は、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＥｘｐｉ２９３培地（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５１－０１）を用いて８％ ＣＯ_２、３７℃条件で２５０ｒｐｍで振って湿潤培養した。

【0281】

実施例４．形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）
実施例４－１．付着細胞の形質導入
形質導入のために、各細胞株をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．１４１９０－２５０）を用いて２回洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．２５２００－１１４）を処理して培養皿から取り出して確保した後、１２ウェルプレートに８０％飽和度で接種した。２４時間培養後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ３０００７５）を用いて各プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡを用いて形質導入した。

【0282】

実施例４－２．ＡＡＶ生産のための浮遊細胞の形質導入
ＡＡＶ産生のために、１Ｌ エレンマイヤ培養フラスコに６×１０^８細胞を２２０ｍｌのｅｘｐｉ２９３培地に接種した。安定化のために約３～４時間培養した後、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅのｐＨｅｌｐｅｒプラスミドＤＮＡ、ｐＵＣ－ＲＣ２プラスミドＤＮＡ又はｐＵＣ－ＲＣ８プラスミドＤＮＡ、外部遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドＤＮＡを１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）にそれぞれ溶かした。そして、ＤＮＡ総量の二倍に該当するポリエチレンアミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．２３９６６－１）を１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈した後、直ちに２つの溶液を混合して形質導入溶液を製造する。室温で３０分間反応させた後、培養フラスコに合計２０ｍｌの形質導入溶液を入れた。

【0283】

実施例５．ＡＡＶの精製
実施例５－１．ＡＡＶ２の精製
実施例４－２の形質導入７２時間後、細胞培養液を回収して遠心分離で培地を除去し、細胞を確保した。ＤＰＢＳで細胞沈殿物を洗浄し、１６ｍｌのＤＰＢＳで細胞を再懸濁した。これを３回にわたって凍結／解凍サイクル（ｆｒｅｅｚｉｎｇ／ｔｈａｗｉｎｇ ｃｙｃｌｅ）を行い、細胞を溶解し、これを遠心分離してＡＡＶ２を含む上清を確保した。上清とＡＡＶａｎｃｅｄ^ＴＭＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＡＶ１１０Ａ－１）を４：１で混合した後、４℃で１６時間混合してから遠心分離して上清を除去し、ＡＡＶ２を含む沈殿物を確保した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ５００μｌで沈殿物を洗浄し、全ての上清を除去した後、最終的に氷冷ＤＰＢＳ４００μｌで再懸濁してＡＡＶを得た。

【0284】

実施例５－２．ＡＡＶ８の精製
実施例４－２の形質導入７２時間後、細胞培養液を回収した。０．４５μｍのフィルターで細胞の残骸（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、アニオン交換法（ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ）及びアフィニティークロマトグラフィー法（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いてＡＡＶを得た。

【0285】

実施例６．ＡＡＶの力価決定
実施例５で精製したＡＡＶ２の力価を決定するためにｑＰＣＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ、ＣＦＸ９６）を行った。ＤＮａｓｅＩ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、ＵＳＡ、Ｍ０３０３Ｓ）で１時間３７℃でＡＮＡＶにＤＮａｓｅＩを処理した。その後、ＤＮａｓｅＩが処理された試料にプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＭ２５４８）を５５℃で３０分間処理し、９５℃で１５分間反応させてプロテイナーゼＫを不活性化した。製造した試料をｑＰＣＲの鋳型として使用し、標準曲線を求めるためにＡＡＶ構築物を使用し（７．４×１０^８－７．４×１０^４、１０倍希釈）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ２ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｔｏｃｋ（ｒＡＡＶ２－ＲＳＳ、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＶＲ－１６１６）又はＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ８ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｔｏｃｋ（ｒＡＡＶ８－ＲＳＳ、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＶＲ－１８１６）を陽性対照群として使用した。力価決定のためのｑＰＣＲは２×ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．１７２－５２８２）とＡＡＶ２－ＩＴＲ特異的プライマー（＃０３０、＃０３１）及びプローブ（＃０３２、ＦＡＭ－ＣＡＣＴ ＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ－ＢＨＱ１）を使用した。９５℃で１０分間変性、９５℃で３０秒間反応、６０℃で１分間反応からなる各ｑＰＣＲサイクルを４０回繰り返した。標準曲線と定量は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏ １．１ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて分析した。

【0286】

実施例７．試験管内でＡＡＶ２を用いた形質導入
ＡＡＶ２形質導入のために、ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェル培養プレートにウェル当たり４×１０^５細胞を接種した。２４時間後、各ウェルにＭＧ１３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｍ７４４９）を５μＭの濃度で８時間処理した。ＡＡＶ２を２５，０００ ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で処理し、７２時間培養して形質導入した。

【0287】

実施例８．生体内でＡＡＶ８を用いた形質導入
眼球の下部に３１Ｇ注射針で穿孔後、ＩＯキットの注射針を刺入して、針先端が眼球の壁面に当たる点で刺入を止めて投与を行った。網膜下注射が成功したかどうかは、投与直後にＯＣＴ上で網膜水泡（ｒｅｔｉｎａｌ ｂｌｅｂ）が形成されたかどうかを確認する方法によって判断した。４週間後に眼球を摘出して、Ｈａｌｔ^ＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ １００×（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ、ＣａｔＮｏ．７８４２９）を添加したＲＩＰＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．８９９００）２００μｌを添加して、Ａｘｙｇｅｎ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｉｎｄｅｒ（Ａｘｙｇｅｎ、ｃａｔ＃１４－２２２－３５８）で眼球を潰して交換した。４℃で１時間反応した後、４℃で１３，０００ｇで１５分間遠心分離で上清を確保した試料を分析した。

【0288】

実施例９．流動細胞分析によるＧＦＰ遺伝子の発現強度の測定
ｅＧＦＰの発現は流動細胞分析（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ、ＣｙｔｏＦｌｅｘ）によって測定した。ｅＧＦＰの測定値は、一緒に形質導入したｐＣＭＶ－ｄｓＲｅｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｊａｐａｎ、Ｃａｔ Ｎｏ．６３２４１６）構築物による赤色蛍光の測定に形質導入の効率を補正して計算した。形質導入７２時間後、ＤＰＢＳで細胞を洗浄し、トリプシンで分離した。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を確保し、２％ＦＢＳを添加したＤＰＢＳを５００μｌ添加して細胞を再懸濁した。流動細胞分析においては、ＦＳＣ ｖｓ ＳＳＣプロットを通じて単一細胞領域を区別し、その中でＦＬ１－Ａ（緑色）及びＦＬ２－Ａ（赤色）を測定した。単一の蛍光ベクターがそれぞれ形質導入された試料を用いて（ｐＥＧＦＰ－Ｃ１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｊａｐａｎ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＰＴ３２８６－１及びｐＣＭＶ－ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ２）補完を進行した後、測定結果に反映した。すべての流動細胞分析の結果は、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ １０．５．３（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）を用いて分析した。

【0289】

実施例１０．ＥＬＩＳＡによるアプリバーセプトの発現量の測定
分泌されるタンパク質の濃度を定量するためにＥＬＩＳＡを行った。ＡＡＶを用いた形質導入４８時間後、細胞培養液を確保して、１５００ｒｐｍで５分間４℃で遠心分離した後、上清を取り、ＥＬＩＳＡの試料として使用する。アップリバーセプトのＥＬＩＳＡ（Ｅａｇｌｅ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＩＧ－ＡＡ１１５）は製造社から提供されたプロトコルに従って行った。ＥＬＩＳＡ結果は、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｓｋｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で測定し、ＳｋａｎＩｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で分析した。細胞株を用いた実験は２つを１セットとして２回繰り返し、動物を用いた実験は眼球当たり１回行った。

【0290】

実施例１１．統計分析方法
ＥＬＩＳＡを除く細胞株を用いた全ての実験は３回繰り返し実験を行った。結果はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ８．１．１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を用いて、２つのグループ間の比較はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ－ｔ－ｔｅｓｔで、３つのグループ以上の比較はＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡで分析した。動物実験の場合、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｍａｔｃｈｅｄ－ｐａｉｒｓ ｓｉｇｎｅｄ ｒａｎｋ ｔｅｓｔで分析した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を意味する。

【0291】

【表1】

【0292】

本開示内容で使用したオリゴヌクレオチド配列
実験結果
１．ＥＦ－１αプロモーターとの組み合わせにおけるＥＦ－１αイントロンによるｅＧＦＰ遺伝子の発現増加
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーとヒト伸長因子１α（ＥＦ－１α）プロモーターの組み合わせによって調節されるｅＧＦＰ遺伝子発現に対するＥＦ－１αイントロンの効果をテストした。まず、ＩＴＲを含まない動物細胞発現構築物で比較した結果、使用したすべての細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１、Ｈｕｈ－７及びＨｅｐ３Ｂ）でＥＦ－１αイントロンによりｅＧＦＰの発現が増加した（４５９．６％、２７６．３％、１８１．８％、１６３．４％、４７１．１％、４９４．３％）（図２Ａ）。同様に、ＩＴＲを含むｐＡＡＶ構築物においてもＥＦ－１αイントロンによりｅＧＦＰの発現が増加した（２２４．０％、１６７．７％、２１８．７％、２２９．５％、２０２．５％、２６０．５％）（図２Ｂ）。この結果は、ＥＦ－１αプロモーターと組み合わせたＥＦ－１αイントロンが、様々な形態の外部遺伝子発現構築物における遺伝子発現を増加させることができることを提示している。

【0293】

２．様々なプロモーターとの組み合わせにおけるＥＦ－１αイントロンによるｅＧＦＰ遺伝子の発現増加
ＥＦ－１αプロモーターに加えて、他のプロモーターとの組み合わせによっても、ＥＦ－１αイントロンによる遺伝子発現の増加が観察されるかどうかを試験した。まず、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーとＣＭＶプロモーターの組み合わせによって誘導されるｅＧＦＰ遺伝子の発現におけるＥＦ－１αイントロンの効果を試験した。まず、ＩＴＲを含まない動物細胞発現構築物で比較した結果、ｅＧＦＰの発現は、使用したすべての細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１、Ｈｕｈ－７及びＨｅｐ３Ｂ）でＥＦ－１αイントロンによって増加する（２８４．３％、４６４．０％、２１７．５％、１８０．４％、４０５．７％、３７０．６％）ことを確認した（図３Ａ）。

【0294】

同様に、ＩＴＲを含むｐＡＡＶ構築物においても、ＥＦ－１αイントロンは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーとＣＭＶプロモーターの組み合わせによって調節されるｅＧＦＰの発現を増加させる（２４１．４％、４９４．８％、２６６．８％、１８５．５％、４１５．５％、３６７．８％）を確認した（図３Ｂ）。

【0295】

次に、ＣＭＶエンハンサーとチキンβ－アクチンプロモーターの組み合わせによって調節されるｅＧＦＰ遺伝子の発現に対するＥＦ－１αイントロンの効果を確認した。動物細胞発現構築物で比較した結果、使用した全ての細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１、Ｈｕｈ－７及びＨｅｐ３Ｂ）において、ＥＦ－１αイントロンがｅＧＦＰの発現を増加させる（４１５．２％、３９６．７％、２３３．９％、２１７．９％、３５３．７％、２９７．７％）ことを確認した（図３Ｃ）。これらの結果は、ＥＦ－１αプロモーターに加えて、様々なプロモーターと組み合わせた状態でも、ＥＦ－１αイントロンによって遺伝子発現が増加することを提示している。

【0296】

３．遺伝子発現増加効果を示す最小長のＥＦ－１αイントロン断片の決定
３－Ａ．ＥＦ－１αイントロンの配列が順次に欠失した一連のＣＥＥ構築物の製作
ＣＥＥ－ＦＬ構築物は、ＣＭＶエンハンサー及びＣＭＶプロモーターの一部（５’末端３１ｂｐ）とＥＦ－１αプロモーター、ＥＦ－１αエクソン１の２９ｂｐ、ＥＦ－１αイントロン９２４ｂｐ、ＥＦ－１αエクソン２の９ｂｐを含むように設計されている。イントロンのスプライシング機能に関連する核心配列には、５’末端側のスプライシングドナーと分岐点部位（ＢＰＳ：ｂｒａｎｃｈ ｐｏｉｎｔ ｓｉｔｅ）を含む３’末端側のスプライシング受容体が位置していた。遺伝子発現を増加させることができる最小長のＥＦ－１αイントロン配列を見つけるために、イントロン５’末端側のスプライシングドナー配列を保存し、その後、順番にイントロン配列を欠失させた。すなわち、ＥＦ－１αイントロンのスプライシングドナー共通（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列と推定されるＥＦ－１αイントロン５’末端の１９ｂｐまでを共通に含むが、その後、６５９ｂｐ（Ｔ２）、７２０ｂｐ（Ｔ３）、８０７ｂｐ（Ｔ３．１）、８２９ｂｐ（Ｔ３．１．１）、８５１ｂｐ（Ｔ３．１．２）、８７３ｂｐ（Ｔ３．２）、８９５ｂｐ（Ｔ４）が欠失したＣＥＥ構築物を実施例２－１と同様に製造した（図４Ａ）。

【0297】

３－Ｂ．ＥＦ－１αイントロン配列の逐次欠失による遺伝子発現の増加又は減少の効果
５種類の動物細胞株において、ＥＦ－１αイントロン配列が全長であるもの（ＣＥＥ－ＦＬ）と順次欠失したものまで、合計８種類の構築物からのｅＧＦＰ発現を比較した。まず、ＨｅＬａ、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ－７細胞株では、全長ＥＦ－１αイントロンＡと比較して、ＣＥＥ－Ｔ２からＣＥＥ－Ｔ３．１．２まではｅＧＦＰ遺伝子発現が維持されることを確認した。しかしながら、ＣＥＥ－Ｔ３．２及びＣＥＥ－Ｔ４の場合、遺伝子発現は急激に減少した。次に、ＡＲＰＥ－１９及びＲＰＥ－１細胞株では、ＣＥＥ－Ｔ２の場合、ＣＥＥ－ＦＬに比べてｅＧＦＰ発現が約５０％レベルに減少したが、ＣＥＥ－Ｔ３からＣＥＥ－Ｔ３．１．２まではＣＥＥ－ＦＬに類似又は少しより高いｅＧＦＰの発現を示した。しかしながら、前記細胞株と同様に、ＣＥＥ－Ｔ３．２及びＣＥＥ－Ｔ４では発現が急激に減少した。以上の結果は、ＥＦ－１αイントロンＡにおいて遺伝子発現増加機能を保有するイントロンＡ断片はＴ２からＴ３．１．２までであり、そのうち最も短いものがＴ３．１．２である（又はＴ３．２より長い断片を意味する）（図４Ｂ）。

【0298】

４．ＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２による遺伝子発現の増加
４－Ａ．チキンβ－アクチンプロモーターと組み合わせたＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２の製作
ＣＡＥ－ＦＬ構築物は、ＣＭＶエンハンサー及びチキンβ－アクチンプロモーター、チキンβ－アクチンエクソン１の３２ｂｐ、ＥＦ－１αエクソン１の２９ｂｐ、ＥＦ－１αイントロンＡ９２４ｂｐ、ＥＦ－１αエクソン２の９ｂｐを含むように設計されている。ＣＡは、ＥＦ－１αイントロン全体が欠失した構築物である。ＣＡＥ－Ｔ３．１．１構築物は、ＥＦ－１αイントロン５’末端の１９ｂｐと３’末端のＴ３．１．１配列を含み、その間の８２９ｂｐが欠失している点以外はＣＡＥ－ＦＬと同じである。ＣＡＥ－Ｔ３．１．２構築物は、ＥＦ－１αイントロンＡ５’末端の１９ｂｐと３’末端のＴ３．１．２配列を含み、その間の８５１ｂｐが欠失している点以外はＣＡＥ－ＦＬと同一である（図５Ａ）。

【0299】

４－Ｂ．チキンβ－アクチンプロモーターと組み合わせたＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１又はＴ３．１．２による遺伝子発現の増加
ＥＦ－１αイントロンのすべてのヌクレオチドが完全欠失したＣＡと、部分的に欠失したＥＦ－１αイントロンを含むＣＡＥ－Ｔ３．１．１とＣＡＥ－Ｔ３．１．２などの３種類の構築物を用いて、２種類の動物細胞株（ＨｅＬａ、ＡＲＰＥ－１９）でｅＧＦＰ発現を比較した。ＣＡＥ－Ｔ３．１．１及びＣＡＥ－Ｔ３．１．２群では、ＣＡ構築物群と比較して、ＨｅＬａでは３３０．５％、２４３．９％、ＡＲＰＥ－１９では１７０．８％、１６５．９％レベルのｅＧＦＰ発現が観察された（図５Ｂ）。このような結果は、ＥＦ－１αイントロンの断片であるＴ３．１．１とＴ３．１．２がチキンβ－アクチンプロモーターとの組み合わせでも遺伝子発現を増加させることができることを提示する。

【0300】

４－Ｃ．ＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２とチキンβ－アクチンのスプライシングドナーを組み合わせた構築物の製作
ＣＭＶエンハンサー、チキンβ－アクチンプロモーター、チキンβ－アクチンエクソン１の９３ｂｐとイントロン４３ｂｐを維持した状態で、ＥＦ－１αイントロンの３’末端断片９５ｂｐ（Ｔ３．１．１）もしくは７３ｂｐ（Ｔ３．１．２）とＥＦ－１αエクソン２の９ｂｐを含むハイブリッドイントロン構造を有するＣＡ－Ｔ３．１．１、ＣＡ－Ｔ３．１．２構築物を製作した。チキンβ－アクチンエクソン１及びチキンβ－アクチンイントロンの一部はスプライシングドナーの機能を提供し、ＥＦ－１αイントロンＡ断片はスプライシング受容体の機能を有すると予想した。対照群として、イントロン配列を含まないＣＡ構築物を一緒に試験した（図５Ｃ）。

【0301】

４－Ｄ．チキンβ－アクチンのスプライシングドナー断片とＥＦ－１αイントロンＡの３’末端断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２がハイブリダイズされたイントロンによる遺伝子発現の増加
ＣＡ、ＣＡ－Ｔ３．１．１、ＣＡ－Ｔ３．１．２構築物をそれぞれＨｅＬａ及びＨｅｐ３Ｂ細胞株に形質導入した後、遺伝子発現精度を比較した結果、イントロンのないＣＡに比べてＣＡ－Ｔ３．１．１、ＣＡ－Ｔ３．１．２における遺伝子発現の増加（ＨｅＬａ：２１５．７％，２１１．０％，Ｈｅｐ３Ｂ：１５５．０％、１６７．５％）であることを確認した。この結果は、ＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２が他の遺伝子のスプライシングドナーと一緒に組み合わされた場合でも、遺伝子発現を増加させることができることを提示する（図５Ｄ）。

【0302】

５．ＡＡＶを用いて遺伝子を送達する場合のＴ３．１．１及びＴ３．１．２断片による遺伝子発現の増加
５－Ａ．ＡＡＶ２を用いた試験管内の遺伝子送達におけるＴ３．１．１及びＴ３．１．２断片による遺伝子発現の増加
ＡＡＶを用いて遺伝子を送達する場合でも、ＥＦ－１αイントロンの断片であるＴ３．１．１又はＴ３．１．２が遺伝子発現を効率的に誘導することができるかを確認するために、前記断片を含むＡＡＶ２（ＣＡ－Ｔ３．１．１、ＣＡ－Ｔ３．１．２、ＣＡＥ－Ｔ３．１．１、ＣＡＥ－Ｔ３．１．２）を産生した後、遺伝子発現調節部位でＣＡＧ－ＦＬ又はＣＡＥ－ＦＬを含むＡＡＶ２と比較した。製作されたＡＡＶ２は、細胞外分泌能を有するアプリバーセプトタンパク質を発現するように設計された（シグナルペプチド配列は、ｈＩｇＧシグナルペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を使用した：配列リストの第２６配列）。ＭＧ１３２を処理したＨＥＫ２９３細胞株に２５，０００ＭＯＩ条件でＡＡＶ２を感染させ、４８時間後、ＥＬＩＳＡを進行して細胞培養液中のアプリバーセプトの濃度を測定した。その結果、ＣＡＧ－ＦＬと比較したとき、ＣＡ－Ｔ３．１．１あるいはＣＡ－Ｔ３．１．２を含むＡＡＶ２で感染させた場合、それぞれ２００．１％及び２１３．１％のレベルにアプリバーセプトの発現が増加することを確認した。さらに、ＣＡＥ－ＦＬと比較した場合、ＣＡＥ－Ｔ３．１．１及びＣＡＥ－Ｔ３．１．２のＡＡＶ２グループにおいて、それぞれ１１８．２％、１６６．５％のレベルでアプリバーセプトの発現が増加することを確認した（図６Ａ）。以上の結果は、プラスミドＤＮＡを用いて遺伝子を送達した場合と同様に、ＡＡＶ２を用いて遺伝子を送達した場合でも、ＥＦ－１αイントロンＡ断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２が遺伝子発現を効率的に増加させることができることを提示する。

【0303】

５－Ｂ．ＡＡＶ８を用いた生体内の遺伝子伝達におけるＴ３．１．１及びＴ３．１．２断片による遺伝子発現の増加
ＡＡＶを用いて生体内に遺伝子を送達する場合でも、ＥＦ－１αイントロンの断片であるＴ３．１．１が遺伝子発現を効率的に誘導できるかを確認するために、前記断片を含むＡＡＶ８（ＣＡ－Ｔ３．１．１、ＣＡＥ－Ｔ３．１．１）を産生した後、遺伝子発現調節部位でＣＡＧ－ＦＬ又はＣＡＥ－ＦＬを含むＡＡＶ８と比較した。製作されたＡＡＶ８は、細胞外分泌能を有するアプリバーセプトタンパク質を発現するように設計された（シグナルペプチド配列は、ｈＩｇＧシグナルペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を使用した：配列リストの第２６配列）。ウイルスを産生した後、グループ別にマウス８匹の両眼に網膜下注射を通じてそれぞれ１×１０^９ｖｇのＡＡＶ８を送達し、２８日後に各眼におけるアプリバーセプトの発現をＥＬＩＳＡを通じて確認した。その結果、ＣＡＥ－Ｔ３．１．１投与群では、ＣＡＥ－ＦＬグループに比べて１４７．６％レベルのアプリバーセプトの発現が観察され、ＣＡ－Ｔ３．１．１投与群では、ＣＡＧ－ＦＬグループに比べて１１８．７％レベルのアプリバーセプトの発現が観察された（図６Ｂ）。この結果は、生体内でもＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１が遺伝子発現を効率的に誘導できることを提示する。

【0304】

前記外来遺伝子としてアプリバセプトを挿入したｐＡＡＶ－ＣＡ－Ｔ３．１．１ベクターの開裂マップは、図６Ｃと同じである。

【0305】

本出願で引用された全ての公報、特許、特許出願及びその他の文献は、それぞれの個別公報、特許、特許出願又は他の文献がすべての目的のために個別に参照として組み込まれると示されていても、同様にすべて目的のために、その全文が本明細書に参照として組み込まれる。

【0306】

以上、上述した様態を参照して本開示内容を説明したが、当該技術分野で通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された本開示内容の趣旨から逸脱しない範囲内で、構成要素の付加、変更、削除又は挿入によって様々な修正及び変更が可能であることを理解するであろう。このような修正及び変更は、本開示内容の範囲内にあることを理解するであろう。

【図面の簡単な説明】

【0307】

【図1】本明細書に記載のｐＡＡＶ－ｅＧＦＰ発現構築物の開裂マップを示す。

【図2A】ＥＦ－１αプロモーター（「ＣＥＥ－ＦＬ」）と共に全長ＥＦ－１αイントロンを含む発現構築物に形質導入された細胞におけるｅＧＦＰの発現増加を示す。対照群細胞は、ＥＦ－１αイントロン（「ＣＥ」）が欠けている当該発現構築物に形質導入された。図２Ａでは、ＩＴＲ欠失動物細胞発現構築物を使用した。図２Ｂでは、ＩＴＲ含有ｐＡＡＶ発現構築物を使用した。図２Ａ及び２Ｂの両方において、次のように形質導入された細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１、Ｈｕｈ－７及びＨｅｐ３Ｂ）内のｅＧＦＰ発現が示されている。

【図2B】ＥＦ－１αプロモーター（「ＣＥＥ－ＦＬ」）と共に全長ＥＦ－１αイントロンを含む発現構築物に形質導入された細胞におけるｅＧＦＰの発現増加を示す。対照群細胞は、ＥＦ－１αイントロン（「ＣＥ」）が欠けている当該発現構築物に形質導入された。図２Ａでは、ＩＴＲ欠失動物細胞発現構築物を使用した。図２Ｂでは、ＩＴＲ含有ｐＡＡＶ発現構築物を使用した。図２Ａ及び２Ｂの両方において、次のように形質導入された細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１、Ｈｕｈ－７及びＨｅｐ３Ｂ）内のｅＧＦＰ発現が示されている。

【図3A】様々なプロモーター（「ＣＣＥ－ＦＬ」）と共に、全長ＥＦ－１αイントロンを含む発現構築物に形質導入された細胞におけるｅＧＦＰの発現を示す。対照群細胞は、ＥＦ－１αイントロンが欠けている当該発現構築物に形質導入された。図３Ａでは、ＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターの組み合わせを動物細胞発現構築物（すなわち、ＩＴＲ欠失）に挿入して前記細胞を形質導入するために使用した。図３Ｂでは、ＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターの組み合わせをｐＡＡＶ発現構築物に挿入して細胞を形質導入するために使用した。図３Ｃでは、前記細胞をＣＭＶエンハンサー及びチキン－βアクチンプロモーターの組み合わせを含む動物細胞発現構築物に形質導入した。図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃのそれぞれにおいて、次のように形質導入された細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１、Ｈｕｈ－７及びＨｅｐ３Ｂ）内のｅＧＦＰ発現が示されている。

【図3B】様々なプロモーター（「ＣＣＥ－ＦＬ」）と共に、全長ＥＦ－１αイントロンを含む発現構築物に形質導入された細胞におけるｅＧＦＰの発現を示す。対照群細胞は、ＥＦ－１αイントロンが欠けている当該発現構築物に形質導入された。図３Ａでは、ＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターの組み合わせを動物細胞発現構築物（すなわち、ＩＴＲ欠失）に挿入して前記細胞を形質導入するために使用した。図３Ｂでは、ＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターの組み合わせをｐＡＡＶ発現構築物に挿入して細胞を形質導入するために使用した。図３Ｃでは、前記細胞をＣＭＶエンハンサー及びチキン－βアクチンプロモーターの組み合わせを含む動物細胞発現構築物に形質導入した。図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃのそれぞれにおいて、次のように形質導入された細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１、Ｈｕｈ－７及びＨｅｐ３Ｂ）内のｅＧＦＰ発現が示されている。

【図3C】様々なプロモーター（「ＣＣＥ－ＦＬ」）と共に、全長ＥＦ－１αイントロンを含む発現構築物に形質導入された細胞におけるｅＧＦＰの発現を示す。対照群細胞は、ＥＦ－１αイントロンが欠けている当該発現構築物に形質導入された。図３Ａでは、ＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターの組み合わせを動物細胞発現構築物（すなわち、ＩＴＲ欠失）に挿入して前記細胞を形質導入するために使用した。図３Ｂでは、ＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターの組み合わせをｐＡＡＶ発現構築物に挿入して細胞を形質導入するために使用した。図３Ｃでは、前記細胞をＣＭＶエンハンサー及びチキン－βアクチンプロモーターの組み合わせを含む動物細胞発現構築物に形質導入した。図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃのそれぞれにおいて、次のように形質導入された細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＡＲＰＥ－１９、ＲＰＥ－１、Ｈｕｈ－７及びＨｅｐ３Ｂ）内のｅＧＦＰ発現が示されている。

【図4A】遺伝子発現に対する様々なＥＦ－１αイントロン断片配列（すなわち、本明細書に記載の非翻訳核酸配列）の増加又は減少の効果を示す。図４Ａは、ＥＦ－１αイントロン配列を順次に欠失することによって製造された一連のＣＥＥ構築物を概略的に示す。示された各構築物は以下を含んでいた：（１）ＣＭＶエンハンサー（３８０個の塩基対）；（２）ＣＭＶプロモーターの一部（５’末端から最初の３１個の塩基対）及びＥＦ－１αプロモーター（２０１個の塩基対）を含むプロモーター；（３）ＥＦ－１αエクソン１（Ｅ１）配列（２９塩基対）。対照群「ＣＥ」構築物は、ＥＦ－１アルファイントロン配列を含んでいかなる追加の成分も含まなかった。他の構築物は、以下の追加成分をさらに含んでいた：（４）全長ＥＦ－１アルファイントロン配列（すなわち、配列リストの第１配列）の５’末端から最初の１９個の塩基対からなるスプライスドナー配列；（５）ＥＦ－１αイントロン配列；及び（６）ＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列（９個の塩基対）。前記ＥＦ－１αイントロン配列は、全長配列（９２４個の塩基対）（「ＣＥＥ－ＦＬ」）又は；（ｉｉ）配列リストの第１配列の５７０～９２４番目のヌクレオチド（３５５個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ２」）；（ｉｉｉ）配列リストの第１配列の７２１～９２４番目のヌクレオチド（２０４個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３」）；（ｉｖ）配列リストの第１配列の８０８～９２４番目のヌクレオチド（１１７塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３．１」）；（ｖ）配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチド（９５個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３．１．１」）；（ｖｉ）配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチド（７３個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３．１．２」）；（ｖｉｉ）配列リストの第１配列の８７４～９２４番目のヌクレオチド（５１個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３．２」）；及び（ｖｉｉｉ）配列リストの第１配列の８９６～９２４番目のヌクレオチド（２９個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ４」）を含んでいた。前記構築物の各々の全長は右側に提供されている。図４Ｂは、５つの相異なる細胞株（ＨｅＬａ、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ－７、ＡＲＰＥ－１９及びＲＰＥ－１）におけるｅＧＦＰ（すなわち、外来遺伝子）発現に対する相異なるＥＦ－１αイントロン配列（全長又は欠失）の効果を見せている。ＡＲＰＥ－１９及びＲＰＥ－１細胞は網膜から由来した。Ｈｕｈ－７及びＨｅｐ３Ｂ細胞は肝臓から由来した。ＨｅＬａ細胞は子宮頸部から由来した。ｅＧＦＰ発現は、ＣＥＥ－ＦＬ構築物を使用して外来遺伝子に形質導入された細胞において観察された発現速度（％）として示された。“ｎｓ”＝有意性なし。“＊＊”＝ｐ＜０．０１及び“＊＊＊”＝ｐ＜０．００１。

【図4B】遺伝子発現に対する様々なＥＦ－１αイントロン断片配列（すなわち、本明細書に記載の非翻訳核酸配列）の増加又は減少の効果を示す。図４Ａは、ＥＦ－１αイントロン配列を順次に欠失することによって製造された一連のＣＥＥ構築物を概略的に示す。示された各構築物は以下を含んでいた：（１）ＣＭＶエンハンサー（３８０個の塩基対）；（２）ＣＭＶプロモーターの一部（５’末端から最初の３１個の塩基対）及びＥＦ－１αプロモーター（２０１個の塩基対）を含むプロモーター；（３）ＥＦ－１αエクソン１（Ｅ１）配列（２９塩基対）。対照群「ＣＥ」構築物は、ＥＦ－１アルファイントロン配列を含んでいかなる追加の成分も含まなかった。他の構築物は、以下の追加成分をさらに含んでいた：（４）全長ＥＦ－１アルファイントロン配列（すなわち、配列リストの第１配列）の５’末端から最初の１９個の塩基対からなるスプライスドナー配列；（５）ＥＦ－１αイントロン配列；及び（６）ＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列（９個の塩基対）。前記ＥＦ－１αイントロン配列は、全長配列（９２４個の塩基対）（「ＣＥＥ－ＦＬ」）又は；（ｉｉ）配列リストの第１配列の５７０～９２４番目のヌクレオチド（３５５個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ２」）；（ｉｉｉ）配列リストの第１配列の７２１～９２４番目のヌクレオチド（２０４個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３」）；（ｉｖ）配列リストの第１配列の８０８～９２４番目のヌクレオチド（１１７塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３．１」）；（ｖ）配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチド（９５個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３．１．１」）；（ｖｉ）配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチド（７３個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３．１．２」）；（ｖｉｉ）配列リストの第１配列の８７４～９２４番目のヌクレオチド（５１個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ３．２」）；及び（ｖｉｉｉ）配列リストの第１配列の８９６～９２４番目のヌクレオチド（２９個の塩基対）（「ＣＥＥ－Ｔ４」）を含んでいた。前記構築物の各々の全長は右側に提供されている。図４Ｂは、５つの相異なる細胞株（ＨｅＬａ、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ－７、ＡＲＰＥ－１９及びＲＰＥ－１）におけるｅＧＦＰ（すなわち、外来遺伝子）発現に対する相異なるＥＦ－１αイントロン配列（全長又は欠失）の効果を見せている。ＡＲＰＥ－１９及びＲＰＥ－１細胞は網膜から由来した。Ｈｕｈ－７及びＨｅｐ３Ｂ細胞は肝臓から由来した。ＨｅＬａ細胞は子宮頸部から由来した。ｅＧＦＰ発現は、ＣＥＥ－ＦＬ構築物を使用して外来遺伝子に形質導入された細胞において観察された発現速度（％）として示された。“ｎｓ”＝有意性なし。“＊＊”＝ｐ＜０．０１及び“＊＊＊”＝ｐ＜０．００１。

【図5A】外来遺伝子の発現を増加させるＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１（すなわち、配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチド（９５個の塩基対）及びＴ３．１．２（すなわち、配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチド（７３個の塩基対）の能力を示している。図５Ａは、以下の追加の成分と共に、ＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２を含む一連のＣＡＥ構築物を概略的に示している：（１）ＣＭＶエンハンサー（３８０個の塩基対）；（２）チキンβ－アクチンプロモーター（２７９個の塩基対）；（３）チキンβ－アクチンエクソン１（Ｅ１）配列（３２個の塩基対）；（４）ＥＦ－１αエクソン１（Ｅ１）配列（２９個の塩基対）；（５）全長ＥＦ－１αイントロン配列（すなわち、配列リストの第１配列）の５’末端から最初の１９個の塩基対からなるスプライシングドナー配列；（６）ＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列（９個の塩基対）。対照群「ＣＡ」構築物は、ＣＭＶエンハンサー、チキンβ－アクチンプロモーター及びチキンβ－アクチンＥ１配列のみを含んでいた。対照群「ＣＡＥ－ＦＬ」構築物は全長ＥＦ－１αイントロン配列を含んでいた。前記構築物の全長は左側に提供されている。図５Ｂは、ＣＡＥ－Ｔ３．１．１及びＣＡＥ－Ｔ３．１．２構築物を用いて形質導入されたＨｅＬａ（左グラフ）及びＡＲＰＥ－１９（右グラフ）細胞におけるｅＧＦＰ（すなわち、外来遺伝子）発現を示している。遺伝子発現は、ＣＡ構築物（すなわち、ＥＦ－１αイントロン配列の欠失）を用いて形質導入された該当細胞における発現速度（％）として示した。図５Ｃは、ＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１又はＴ３．１．２及びチキンβ－アクチンイントロン断片の両方を含む一連のハイブリッドイントロンＣＡ構築物（すなわち、ＣＡ－Ｔ３．１．１及びＣＡ－Ｔ３．１．２構築物）を概略的に示している。前記２つの構築物は：（１）ＣＭＶエンハンサー；（２）チキンβ－アクチンプロモーター；（３）チキンβ－アクチンＥ１配列；（４）ＥＦ－１α Ｅ２配列をさらに含んている。対照群「ＣＡＧ－ＦＬ」構築物は以下を含んでいる：（１）ＣＭＶエンハンサー（３８０個の塩基対）；（２）チキンβ－アクチンプロモーター（２７９個の塩基対）；（３）チキンβ－アクチンＥ１配列（９３個の塩基対）；（４）キメライントロン（チキンβ－アクチン及びウサギβ－グロビンのイントロンを含む）（９２４個の塩基対）；（５）ウサギβ－グロビンエクソン３（Ｅ３）配列（４８個の塩基対）。「ＣＡ」構築物は、図５Ａに記載されたものと同じである。図５Ｄは、構築物ＣＡ－Ｔ３．１．１及びＣＡ－Ｔ３．１．２を用いて形質導入されたＨｅＬａ（左グラフ）及びＨｅｐ３Ｂ（右グラフ）細胞におけるｅＧＦＰの発現を示している。遺伝子発現は、ＣＡ構築物（すなわち、ＥＦ－１αイントロン配列の欠失）を用いて形質導入された該当細胞における発現速度（％）として示した。

【図5B】外来遺伝子の発現を増加させるＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１（すなわち、配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチド（９５個の塩基対）及びＴ３．１．２（すなわち、配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチド（７３個の塩基対）の能力を示している。図５Ａは、以下の追加の成分と共に、ＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２を含む一連のＣＡＥ構築物を概略的に示している：（１）ＣＭＶエンハンサー（３８０個の塩基対）；（２）チキンβ－アクチンプロモーター（２７９個の塩基対）；（３）チキンβ－アクチンエクソン１（Ｅ１）配列（３２個の塩基対）；（４）ＥＦ－１αエクソン１（Ｅ１）配列（２９個の塩基対）；（５）全長ＥＦ－１αイントロン配列（すなわち、配列リストの第１配列）の５’末端から最初の１９個の塩基対からなるスプライシングドナー配列；（６）ＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列（９個の塩基対）。対照群「ＣＡ」構築物は、ＣＭＶエンハンサー、チキンβ－アクチンプロモーター及びチキンβ－アクチンＥ１配列のみを含んでいた。対照群「ＣＡＥ－ＦＬ」構築物は全長ＥＦ－１αイントロン配列を含んでいた。前記構築物の全長は左側に提供されている。図５Ｂは、ＣＡＥ－Ｔ３．１．１及びＣＡＥ－Ｔ３．１．２構築物を用いて形質導入されたＨｅＬａ（左グラフ）及びＡＲＰＥ－１９（右グラフ）細胞におけるｅＧＦＰ（すなわち、外来遺伝子）発現を示している。遺伝子発現は、ＣＡ構築物（すなわち、ＥＦ－１αイントロン配列の欠失）を用いて形質導入された該当細胞における発現速度（％）として示した。図５Ｃは、ＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１又はＴ３．１．２及びチキンβ－アクチンイントロン断片の両方を含む一連のハイブリッドイントロンＣＡ構築物（すなわち、ＣＡ－Ｔ３．１．１及びＣＡ－Ｔ３．１．２構築物）を概略的に示している。前記２つの構築物は：（１）ＣＭＶエンハンサー；（２）チキンβ－アクチンプロモーター；（３）チキンβ－アクチンＥ１配列；（４）ＥＦ－１α Ｅ２配列をさらに含んている。対照群「ＣＡＧ－ＦＬ」構築物は以下を含んでいる：（１）ＣＭＶエンハンサー（３８０個の塩基対）；（２）チキンβ－アクチンプロモーター（２７９個の塩基対）；（３）チキンβ－アクチンＥ１配列（９３個の塩基対）；（４）キメライントロン（チキンβ－アクチン及びウサギβ－グロビンのイントロンを含む）（９２４個の塩基対）；（５）ウサギβ－グロビンエクソン３（Ｅ３）配列（４８個の塩基対）。「ＣＡ」構築物は、図５Ａに記載されたものと同じである。図５Ｄは、構築物ＣＡ－Ｔ３．１．１及びＣＡ－Ｔ３．１．２を用いて形質導入されたＨｅＬａ（左グラフ）及びＨｅｐ３Ｂ（右グラフ）細胞におけるｅＧＦＰの発現を示している。遺伝子発現は、ＣＡ構築物（すなわち、ＥＦ－１αイントロン配列の欠失）を用いて形質導入された該当細胞における発現速度（％）として示した。

【図5C】外来遺伝子の発現を増加させるＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１（すなわち、配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチド（９５個の塩基対）及びＴ３．１．２（すなわち、配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチド（７３個の塩基対）の能力を示している。図５Ａは、以下の追加の成分と共に、ＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２を含む一連のＣＡＥ構築物を概略的に示している：（１）ＣＭＶエンハンサー（３８０個の塩基対）；（２）チキンβ－アクチンプロモーター（２７９個の塩基対）；（３）チキンβ－アクチンエクソン１（Ｅ１）配列（３２個の塩基対）；（４）ＥＦ－１αエクソン１（Ｅ１）配列（２９個の塩基対）；（５）全長ＥＦ－１αイントロン配列（すなわち、配列リストの第１配列）の５’末端から最初の１９個の塩基対からなるスプライシングドナー配列；（６）ＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列（９個の塩基対）。対照群「ＣＡ」構築物は、ＣＭＶエンハンサー、チキンβ－アクチンプロモーター及びチキンβ－アクチンＥ１配列のみを含んでいた。対照群「ＣＡＥ－ＦＬ」構築物は全長ＥＦ－１αイントロン配列を含んでいた。前記構築物の全長は左側に提供されている。図５Ｂは、ＣＡＥ－Ｔ３．１．１及びＣＡＥ－Ｔ３．１．２構築物を用いて形質導入されたＨｅＬａ（左グラフ）及びＡＲＰＥ－１９（右グラフ）細胞におけるｅＧＦＰ（すなわち、外来遺伝子）発現を示している。遺伝子発現は、ＣＡ構築物（すなわち、ＥＦ－１αイントロン配列の欠失）を用いて形質導入された該当細胞における発現速度（％）として示した。図５Ｃは、ＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１又はＴ３．１．２及びチキンβ－アクチンイントロン断片の両方を含む一連のハイブリッドイントロンＣＡ構築物（すなわち、ＣＡ－Ｔ３．１．１及びＣＡ－Ｔ３．１．２構築物）を概略的に示している。前記２つの構築物は：（１）ＣＭＶエンハンサー；（２）チキンβ－アクチンプロモーター；（３）チキンβ－アクチンＥ１配列；（４）ＥＦ－１α Ｅ２配列をさらに含んている。対照群「ＣＡＧ－ＦＬ」構築物は以下を含んでいる：（１）ＣＭＶエンハンサー（３８０個の塩基対）；（２）チキンβ－アクチンプロモーター（２７９個の塩基対）；（３）チキンβ－アクチンＥ１配列（９３個の塩基対）；（４）キメライントロン（チキンβ－アクチン及びウサギβ－グロビンのイントロンを含む）（９２４個の塩基対）；（５）ウサギβ－グロビンエクソン３（Ｅ３）配列（４８個の塩基対）。「ＣＡ」構築物は、図５Ａに記載されたものと同じである。図５Ｄは、構築物ＣＡ－Ｔ３．１．１及びＣＡ－Ｔ３．１．２を用いて形質導入されたＨｅＬａ（左グラフ）及びＨｅｐ３Ｂ（右グラフ）細胞におけるｅＧＦＰの発現を示している。遺伝子発現は、ＣＡ構築物（すなわち、ＥＦ－１αイントロン配列の欠失）を用いて形質導入された該当細胞における発現速度（％）として示した。

【図5D】外来遺伝子の発現を増加させるＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１（すなわち、配列リストの第１配列の８３０～９２４番目のヌクレオチド（９５個の塩基対）及びＴ３．１．２（すなわち、配列リストの第１配列の８５２～９２４番目のヌクレオチド（７３個の塩基対）の能力を示している。図５Ａは、以下の追加の成分と共に、ＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２を含む一連のＣＡＥ構築物を概略的に示している：（１）ＣＭＶエンハンサー（３８０個の塩基対）；（２）チキンβ－アクチンプロモーター（２７９個の塩基対）；（３）チキンβ－アクチンエクソン１（Ｅ１）配列（３２個の塩基対）；（４）ＥＦ－１αエクソン１（Ｅ１）配列（２９個の塩基対）；（５）全長ＥＦ－１αイントロン配列（すなわち、配列リストの第１配列）の５’末端から最初の１９個の塩基対からなるスプライシングドナー配列；（６）ＥＦ－１αエクソン２（Ｅ２）配列（９個の塩基対）。対照群「ＣＡ」構築物は、ＣＭＶエンハンサー、チキンβ－アクチンプロモーター及びチキンβ－アクチンＥ１配列のみを含んでいた。対照群「ＣＡＥ－ＦＬ」構築物は全長ＥＦ－１αイントロン配列を含んでいた。前記構築物の全長は左側に提供されている。図５Ｂは、ＣＡＥ－Ｔ３．１．１及びＣＡＥ－Ｔ３．１．２構築物を用いて形質導入されたＨｅＬａ（左グラフ）及びＡＲＰＥ－１９（右グラフ）細胞におけるｅＧＦＰ（すなわち、外来遺伝子）発現を示している。遺伝子発現は、ＣＡ構築物（すなわち、ＥＦ－１αイントロン配列の欠失）を用いて形質導入された該当細胞における発現速度（％）として示した。図５Ｃは、ＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１又はＴ３．１．２及びチキンβ－アクチンイントロン断片の両方を含む一連のハイブリッドイントロンＣＡ構築物（すなわち、ＣＡ－Ｔ３．１．１及びＣＡ－Ｔ３．１．２構築物）を概略的に示している。前記２つの構築物は：（１）ＣＭＶエンハンサー；（２）チキンβ－アクチンプロモーター；（３）チキンβ－アクチンＥ１配列；（４）ＥＦ－１α Ｅ２配列をさらに含んている。対照群「ＣＡＧ－ＦＬ」構築物は以下を含んでいる：（１）ＣＭＶエンハンサー（３８０個の塩基対）；（２）チキンβ－アクチンプロモーター（２７９個の塩基対）；（３）チキンβ－アクチンＥ１配列（９３個の塩基対）；（４）キメライントロン（チキンβ－アクチン及びウサギβ－グロビンのイントロンを含む）（９２４個の塩基対）；（５）ウサギβ－グロビンエクソン３（Ｅ３）配列（４８個の塩基対）。「ＣＡ」構築物は、図５Ａに記載されたものと同じである。図５Ｄは、構築物ＣＡ－Ｔ３．１．１及びＣＡ－Ｔ３．１．２を用いて形質導入されたＨｅＬａ（左グラフ）及びＨｅｐ３Ｂ（右グラフ）細胞におけるｅＧＦＰの発現を示している。遺伝子発現は、ＣＡ構築物（すなわち、ＥＦ－１αイントロン配列の欠失）を用いて形質導入された該当細胞における発現速度（％）として示した。

【図6A】ＡＡＶを用いて遺伝子を送達する場合のＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２の外来遺伝子（すなわち、アップリバーセプト）発現増加効果を示している。図６Ａは、試験管内の遺伝子伝達においてＴ３．１．１及びＴ３．１．２断片による遺伝子発現増加効果を示している。図６Ｂは、生体内の遺伝子伝達においてＴ３．１．１及びＴ３．１．２断片による遺伝子発現増加効果を示している。図６Ｃは、外来遺伝子としてアプリバーセプトを挿入したｐＡＡＶ－ＣＡ－Ｔ３．１．１ベクターの開裂マップである。

【図6B】ＡＡＶを用いて遺伝子を送達する場合のＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２の外来遺伝子（すなわち、アップリバーセプト）発現増加効果を示している。図６Ａは、試験管内の遺伝子伝達においてＴ３．１．１及びＴ３．１．２断片による遺伝子発現増加効果を示している。図６Ｂは、生体内の遺伝子伝達においてＴ３．１．１及びＴ３．１．２断片による遺伝子発現増加効果を示している。図６Ｃは、外来遺伝子としてアプリバーセプトを挿入したｐＡＡＶ－ＣＡ－Ｔ３．１．１ベクターの開裂マップである。

【図6C】ＡＡＶを用いて遺伝子を送達する場合のＥＦ－１αイントロン断片Ｔ３．１．１及びＴ３．１．２の外来遺伝子（すなわち、アップリバーセプト）発現増加効果を示している。図６Ａは、試験管内の遺伝子伝達においてＴ３．１．１及びＴ３．１．２断片による遺伝子発現増加効果を示している。図６Ｂは、生体内の遺伝子伝達においてＴ３．１．１及びＴ３．１．２断片による遺伝子発現増加効果を示している。図６Ｃは、外来遺伝子としてアプリバーセプトを挿入したｐＡＡＶ－ＣＡ－Ｔ３．１．１ベクターの開裂マップである。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【配列表】

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【国際調査報告】