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特表2023-523719表皮水疱症の治療で使用するためのホーミングペプチド誘導デコリン複合体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-07
(54)【発明の名称】表皮水疱症の治療で使用するためのホーミングペプチド誘導デコリン複合体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230531BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230531BHJP
C07K 14/78 20060101ALI20230531BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230531BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20230531BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230531BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230531BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230531BHJP
A61K 47/62 20170101ALI20230531BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C07K14/78
C12N15/12
A61K38/17
A61K45/00
A61P17/02
A61P43/00 105
A61K47/62
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022563981
(86)(22)【出願日】2021-04-28
(85)【翻訳文提出日】2022-12-19
(86)【国際出願番号】 FI2021050318
(87)【国際公開番号】W WO2021219940
(87)【国際公開日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】20205431
(32)【優先日】2020-04-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI
(31)【優先権主張番号】63/016,359
(32)【優先日】2020-04-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519107124
【氏名又は名称】タンペレ ユニバーシティー ファウンデーション エスアール
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】ヤルヴィネン テロ
(72)【発明者】
【氏名】ペンマリ トイニ
(72)【発明者】
【氏名】マイ ウルリケ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA94
4C076BB31
4C076CC19
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA44
4C084CA18
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZB112
4C084ZB212
4C084ZB352
4C084ZC412
4C084ZC752
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、表皮水疱症の治療で使用するためのホーミングペプチド誘導デコリン複合体、及び対応する治療方法に関する。新規なホーミングペプチドの使用により、全身投与によりこの複合体をインビボで皮膚及び皮膚創傷へ標的特異的にホーミングすることができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
表皮水疱症の治療で使用するためのホーミングペプチド誘導デコリン複合体であって、前記複合体はデコリン断片及びホーミングペプチドを含み、前記ホーミングペプチドのＣ末端は、アミノ酸配列ＲＫＤＫ（配列番号１）又はＣＲＫＤＫ（配列番号２）からなる、使用するための複合体。
【請求項2】
皮膚及び皮膚創傷に選択的にホーミングする、請求項１に記載の使用するための複合体。
【請求項3】
前記デコリン断片は、前記ホーミングペプチドのＮ末端に結合する、請求項１又は２に記載の使用するための複合体。
【請求項4】
前記デコリン断片は、デコリンの生物学的特性が保持されるという条件で、配列番号６～２０のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含むか、又は前記デコリン断片の保存配列変異体又はペプチド模倣物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用するための複合体。
【請求項5】
融合タンパク質又はそのペプチド模倣物である、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用するための複合体。
【請求項6】
前記融合タンパク質は、配列番号２１又は２２を含むか、又はそれらからなる、請求項５に記載の使用するための複合体。
【請求項7】
前記複合体に結合した１つ以上の追加部分を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用するための複合体。
【請求項8】
前記１つ以上の追加部分は治療剤を含む、請求項７に記載の使用するための複合体。
【請求項9】
前記治療剤は、抗炎症剤、血管新生阻害剤、再生剤、血管新生促進剤、細胞毒性剤、アポトーシス促進剤、抗菌剤、抗線維化剤、抗しわ剤、抗掻痒剤、伝達物質阻害剤、伝達物質促進剤、サイトカイン又はサイトカイン阻害剤である、請求項８に記載の使用するための複合体。
【請求項10】
前記治療剤は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質又は小分子である、請求項９に記載の使用するための複合体。
【請求項11】
前記１つ以上の追加部分は、検出可能な剤を含む、請求項７に記載の使用するための複合体。
【請求項12】
前記複合体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物において提供される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用するための複合体。
【請求項13】
表皮水疱症は、後天性表皮水疱症、接合型表皮水疱症、単純型表皮水疱症、栄養障害型表皮水疱症、優性栄養障害型表皮水疱症、劣性栄養障害型表皮水疱症、劣性反対型栄養障害型表皮水疱症、キンドラー症候群又はそれらの亜型である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の使用するための複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、分子医学の分野に関連する。より具体的には、本発明は、表皮水疱症の治療で使用するためのホーミングペプチド誘導デコリン複合体、及び対応する治療方法に関連する。
【背景技術】
【0002】
人体の最大の器官として、皮膚は、効率的な薬物送達に、特有の課題をもたらす。局所薬物送達、すなわち経皮薬物送達に関連する主な課題は、高分子の皮膚貫通不良である。細胞間脂質を介した拡散は、経皮送達の選択肢を提供するが、小さな親油性分子のみに限定される。したがって、全身投与されるが、皮膚特異的である治療薬は、皮膚疾患、特に表皮水疱症と、脆い皮膚、水疱形成性皮膚を引き起こす一群の希な遺伝性疾患などとの、皮膚全体に影響を与える皮膚疾患の治療に対して、実質的な治療法の進歩となろう。
【0003】
劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）は、７型コラーゲン（Ｃ７）をコードするＣＯＬ７Ａ１遺伝子の変異により引き起こされる。臨床症状は、皮膚の糜爛及び水疱形成、切断瘢痕、偽合指症、迅速に転移する悪性の皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）を発症する高いリスクを含む。一部の遺伝子、細胞及びタンパク質に基づく治療は、皮膚への７型コラーゲンの送達に有望な結果を示すが課題は残っており、ＲＤＥＢに対する治癒法はまだない。
【0004】
形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達は、線維化の発症とＲＤＥＢの悪性腫瘍への進行に必要不可欠な役割を果たすことが示された。以前、ＴＧＦβシグナル伝達がｃｏｌ７ａ１－／－マウスの出生の１週間後に早くも活性化されることが示された（Ｌｉａｏら、２０１８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３６：１８３９－１８５０）。したがって、ＴＧＦβシグナル伝達の活性化への早期介入は、ＲＤＥＢの疾患負担を軽減することに有益である可能性がある。また、ＴＧＦβシグナル伝達が同じＣＯＬ７Ａ１変異を有する一卵性双生児の表現型モジュレーターであることが示唆された（Ｏｄｏｒｉｓｉｏら、２０１４、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２３：３９０７－３９２２）。更に、天然ＴＧＦβ阻害剤であるプロテオグリカンデコリン（ＤＣＮ）の発現レベルは、影響の少ない双生児ほど有意に高くなった。ＤＣＮは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構造成分であり、Ｄｃｎ－／－マウスは、不規則なコラーゲン線維形成を示し、皮膚の引張強度が著しく低下した（Ｒｅｅｄ及びＩｏｚｚｏ、２００２、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ １９：２４９－２５５）。更に、ＤＣＮは、複数の成長因子の活性、とりわけＴＧＦβに対する阻害作用を調節することにより、抗線維化機能及び抗腫瘍機能を有する（Ｊａｒｖｉｎｅｎ及びＰｒｉｎｃｅ、２０１５、Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ２０１５：６５４７６５、Ｊａｒｖｉｎｅｎ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、２０１９、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １７６：１６－２５）。また、最近では、ＤＣＮ発現のアップレギュレーションは、ｃｏｌ７ａ１－／－マウスの臍帯血に由来する無制限の体幹細胞（ＵＳＳＣ）の効果に対する作用機序の１つとして示された（Ｌｉａｏら、２０１８、前出）。ＲＤＥＢの潜在的な治療的疾患修飾分子としてのＤＣＮの役割をサポートするために、Ｃｉａｎｆａｒａｎｉら（２０１９、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ ８１：３－１６）は、最近、ヒトＤＣＮの発現を促進するレンチウイルスの全身投与が、７型コラーゲンの残留レベルを発現するＣ７低形質ＲＤＥＢマウスモデル（Ｃ７低形質マウス）において、ＴＧＦβ誘発性線維化を軽減したことを報告した。
【0005】
更に、ＤＣＮは、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２）に結合し、それを中和し、該結合組織成長因子は、ＴＧＦβの線維化シグナル伝達の下流メディエーターであり、かつ瘢痕の予防における治療標的であることが提案された（Ｖｉａｌら、２０１１、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６：２４２４２－２４２５２、Ｄａｎｉｅｌｓら、２００３、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６３：２０４３－２０５２）。ＴＧＦβとＣＴＧＦ／ＣＣＮ２用の結合部位がＤＣＮの異なる部分に存在するため、理論的に、ＤＣＮは、線維化の両方のメディエーターを同時にブロックすることができる。実際に、ＴＧＦβ促進の瘢痕形成を抑制するＤＣＮの役割は、ＲＤＥＢに加えて、腎臓、肺、肝臓の線維化などの多くの疾患モデル及び皮膚創傷の治癒において、よく知られている（Ｏｄｏｒｉｓｉｏら、２０１４、前出、Ｌｉａｏら、２０１８、前出、Ｃｉａｎｆａｒａｎｉら、２０１９、前出）。しかしながら、前臨床試験で多くの肯定的な抗がん及び抗線維化の結果が得られるにもかかわらず、ＤＣＮは、全身治療として臨床に到達していない。これまでに、穿孔性眼損傷を有する１２人の患者へのＤＣＮの臨床応用のみが報告され、２００μｇ又は４００μｇのヒト組換えＤＣＮの硝子体内注射の単回投与量は、眼の有害事象がなく、十分に許容されるようであった（Ａｂｄｕｌｌａｔｉｆら、２０１８、Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２５６：２４７３－２４８１）。
【0006】
全身薬物送達の一般的な制限は、薬物のごく一部のみしか所望の部位に到達せず、全身の副作用が他の臓器で生じることである。したがって、現代の薬物開発の重要な目標は、身体の他の部分への有害作用が最小限であり、標的臓器に特異的な薬物を生成することである。この目標は、罹患臓器で発現する特異的エピトープを認識する薬物を開発することにより達成することができよう。或いは、薬物は、特定の臓器の血管内の組織又は標的特異的な分子特徴を認識する血管ホーミングペプチドなどの親和性リガンドと共役（複合化）することにより、標的特異的であるように変換することができる。
【0007】
ファージ・ペプチド・ライブラリーのインビボスクリーニンでは、これらの血管内の組織又は疾患に特異的な分子特徴（血管ジップコード（郵便番号））が、血管ホーミングペプチドなどの全身投与された親和性リガンドにより標的とすることができることが確認された。これらの試験によると、異なる組織の血管系内の臓器又は疾患に特異的な分子シグネチャ（特性）が存在することにより、全身投与された治療薬の標的特異的な送達のための郵便番号システム（血管ジップコード）が可能となることが本質的に確立されている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら、２０１０、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８８：７５９－７６８、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２０１７、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ １１０－１１１：３－１２、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２００４、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３２：３９７－４０２、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ ３８０（６５７２）：３６４－３６６）。腫瘍特異的ホーミング及び細胞／組織貫通用の最も効率的な血管ホーミングペプチドは、Ｃ末端にアルギニン（又はまれにリジン）残基を有するため、Ｃ－ｅｎｄ Ｒｕｌｅ（ＣｅｎｄＲ、Ｃ末端ルール）配列と呼ばれるコンセンサスモチーフＲ／ＫＸＸＲ／Ｋ（配列番号３）を含む（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２０１７、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２７：１６２２－１６２４、Ｔｅｅｓａｌｕら、２００９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：１６１５７－１６１６２、Ｓｕｇａｈａｒａら、２００９、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １６：５１０－５２０、Ｓｕｇａｈａｒａら、２０１０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８：１０３１－１０３５）。ＣｅｎｄＲ配列は、ニューロピリン－１（ＮＲＰ－１）に結合し、血管外漏出と、そのペイロードとともにペプチドを腫瘍組織の実質に送達する組織貫通経路とを活性化する（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２０１７、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ １１０－１１１：３－１２、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２０１７、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２７：１６２２－１６２４、Ｔｅｅｓａｌｕら、２００９、ＰＮＡＳ １０６（３８）：１６１５７－１６１６２）。潜在的なＣｅｎｄＲを含むペプチドは、腫瘍特異的発現パターンを有する一次受容体への結合の組み合わせ、及び腫瘍内のタンパク質分解活性化による標的臓器内のＣｅｎｄＲ配列の露出のため、標的選択性を持っている。ＮＲＰ－１は、全ての組織の内皮細胞により発現される（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２０１７、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ １１０－１１１：３－１２）ため、ＮＲＰ－１を介した血管外漏出及び組織貫通は、癌組織に限定される可能性は低く、他の病変組織又は健康組織にも発生する。
【0008】
インビボファージディスプレイスクリーニングにより、皮膚創傷の血管新生血管にホーミングするペプチドのパネルも同定されている（Ｊａｒｖｉｎｅｎ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、２００７、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７１：７０２－７１１）。最も有望な２つのペプチド、すなわち、ＣＡＲ（ＣＡＲＳＫＮＫＤＣ、配列番号５）及びＣＲＫ（ＣＲＫＤＫＣ、配列番号３）と呼ばれる環状ペプチドは、異なる治療分子を標的選択的方法で送達するために利用されている（Ｊａｒｖｉｎｅｎら、２０１７、ＡＣＳ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３：１２７３－１２８２）。興味深いことに、ＣＲＫペプチドは、潜在的なＣｅｎｄＲ配列であるＲＫＤＫ（配列番号１）を含むが、それは、血管ホーミングＣｅｎｄＲペプチドのうちの唯一の、細胞及び組織を貫通できないペプチドである（Ｊａｒｖｉｎｅｎ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、２００７、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７１：７０２－７１１、Ａｇｅｍｙら、２０１０、Ｂｌｏｏｄ １１６：２８４７－２８５６）。
【0009】
国際公開第２００８／１３６８６９号パンフレットには、皮膚創傷へのデコリンの標的送達用の特異的ホーミング要素としてのＣＲＫペプチドが開示されている。開示されているＣＲＫ－デコリン融合体は、創傷のない皮膚にホーミングしない。
【0010】
したがって、全身投与されるが、皮膚に特異的である治療薬は、表皮水疱症などの皮膚疾患の治療に対して、実質的な治療薬の進歩となろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】国際公開第２００８／１３６８６９号パンフレット
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Ｌｉａｏら、２０１８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３６：１８３９－１８５０
【非特許文献2】Ｏｄｏｒｉｓｉｏら、２０１４、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２３：３９０７－３９２２
【非特許文献3】Ｒｅｅｄ及びＩｏｚｚｏ、２００２、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ １９：２４９－２５５
【非特許文献4】Ｊａｒｖｉｎｅｎ及びＰｒｉｎｃｅ、２０１５、Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ２０１５：６５４７６５
【非特許文献5】Ｊａｒｖｉｎｅｎ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、２０１９、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １７６：１６－２５
【非特許文献6】Ｃｉａｎｆａｒａｎｉら、２０１９、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ ８１：３－１６
【非特許文献7】Ｖｉａｌら、２０１１、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６：２４２４２－２４２５２
【非特許文献8】Ｄａｎｉｅｌｓら、２００３、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６３：２０４３－２０５２
【非特許文献9】Ａｂｄｕｌｌａｔｉｆら、２０１８、Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２５６：２４７３－２４８１
【非特許文献10】Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら、２０１０、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８８：７５９－７６８
【非特許文献11】Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２０１７、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ １１０－１１１：３－１２
【非特許文献12】Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２００４、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３２：３９７－４０２
【非特許文献13】Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ ３８０（６５７２）：３６４－３６６
【非特許文献14】Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２０１７、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２７：１６２２－１６２４
【非特許文献15】Ｔｅｅｓａｌｕら、２００９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：１６１５７－１６１６２
【非特許文献16】Ｓｕｇａｈａｒａら、２００９、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １６：５１０－５２０
【非特許文献17】Ｓｕｇａｈａｒａら、２０１０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８：１０３１－１０３５
【非特許文献18】Ｊａｒｖｉｎｅｎ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、２００７、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７１：７０２－７１１
【非特許文献19】Ｊａｒｖｉｎｅｎら、２０１７、ＡＣＳ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３：１２７３－１２８２
【非特許文献20】Ａｇｅｍｙら、２０１０、Ｂｌｏｏｄ １１６：２８４７－２８５６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0013】
本明細書は、表皮水疱症の治療で使用するためのホーミングペプチド誘導デコリン複合体を提供する。該複合体は、デコリン断片及びホーミングペプチドを含み、このホーミングペプチドのＣ末端は、アミノ酸配列ＲＫＤＫ（配列番号１）又はＣＲＫＤＫ（配列番号２）からなる。
【0014】
また、デコリン断片及びホーミングペプチドを含むホーミングペプチド誘導デコリン複合体を有効量投与することにより、必要とする対象の表皮水疱症を治療する方法であって、このホーミングペプチドのＣ末端は、アミノ酸配列ＲＫＤＫ（配列番号１）又はＣＲＫＤＫ（配列番号２）からなる方法が提供される。
【0015】
上記ホーミングペプチドにより、当該複合体は、インビボで皮膚及び皮膚創傷に対して、選択的にホーミングし、貫通する。
【0016】
上記態様の実施形態及び詳細は、以下の図、詳細な説明、実施例及び従属請求項に示される。
【図面の簡単な説明】
【0017】
添付の図面は、開示される主題のいくつかの実施形態を示し、説明とともに、開示される組成物及び方法の原理を説明するのに役立つ。
【0018】
【図1A】図１Ａ～図１Ｃは、例示的な組換えＤＣＮ－ｔＣＲＫタンパク質の構造及びそのニューロピリン－１への結合を示す。図１Ａは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫの構造の概略図である。天然ＤＣＮのシグナルペプチド及びプロペプチドは、精製のために、６×Ｈｉｓタグ（Ｉ）に置き換えられた。Ｈｉｓタグの後には、成熟ＤＣＮプロテオグリカンのアミノ末端（ＩＩ）、コアタンパク質（ＩＩＩ）及びカルボキシル末端（ＩＶ）が続く。ｔＣＲＫペプチド（Ｖ）は、タンパク質のカルボキシル末端にクローニングされた。
【図1B】図１Ａ～図１Ｃは、例示的な組換えＤＣＮ－ｔＣＲＫタンパク質の構造及びそのニューロピリン－１への結合を示す。図１Ｂは、インビトロでのＤＣＮ－ｔＣＲＫのニューロピリン－１（ＮＲＰ－１）へのインビトロ結合を示す。ＤＣＮ－ｔＣＲＫ（左パネル）及びペプチド対照（右パネル、陽性ペプチド：ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２５）及び陰性ペプチド：ＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号２６））は、ＥＬＩＳＡプレートに固定化された。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びペプチドの非特異的タンパク質対照として含まれた。ＷＴ及び変異体ＮＲＰ１は、ＦＡＭで標識され、固定化プレートに加えられた。ＮＲＰ１の結合は、蛍光強度に基づいて測定された。エラーバーは、ＳＥＭを表す。実験は、３連作成されたサンプルで繰り返された。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、スチューデントの対応のないｔ－検定。
【図1C】図１Ａ～図１Ｃは、例示的な組換えＤＣＮ－ｔＣＲＫタンパク質の構造及びそのニューロピリン－１への結合を示す。図１Ｃは、ＮＲＰ－１陽性細胞におけるＤＣＮ－ｔＣＲＫの内在化を示す。ＦＡＭで標識されたＤＣＮ－ｔＣＲＫは、それぞれＮＲＰ－１発現陽性及び陰性のＰＣ３及びＭ２１細胞とともにインキュベートされた。ＤＣＮ－ｔＣＲＫは、抗ＦＡＭ免疫染色により検出された。核は、ＤＡＰＩを用いて対比染色された。代表的な画像は、独立して試験された３つの実験からのものである。スケールバーは２０μｍである。
【図2A】図２Ａ～図２Ｄは、例示的なＤＣＮ－ｔＣＲＫの組換えタンパク質の産生及び特徴付けを示す。図２Ａは、Ａｅｋｔａ ＳｔａｒｔでのＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムステップの後の精製クロマトグラムの例を示し、１つの大きなピークがあり、その全てのピーク画分が更なる処理に使用された。
【図2B】図２Ａ～図２Ｄは、例示的なＤＣＮ－ｔＣＲＫの組換えタンパク質の産生及び特徴付けを示す。図２Ｂは、精製されたＤＣＮ－ｔＣＲＫのクーマシー染色還元ＳＤＳ－Ｐａｇｅゲル（上パネル）及びウェスタンブロット（下パネル）を、従来技術のＤＣＮと並べて示す。ＳＤＳゲルに２μｇ及び１μｇのタンパク質がロードされ、ウェスタンブロット分析のために、１μｇ及び０．５μｇのタンパク質が使用された。タンパク質の単量体形態と、ＧＡＧ側鎖を含む形態とが見られる。
【図3】図３は、ＤＣＮと比較したＤＣＮ－ｔＣＲＫの薬物動態を示す。５ｍｇ／ｋｇのＤＣＮ－ｔＣＲＫ又はＤＣＮを健康なＢａｌｂ／ｃマウスに静脈注射した。８つの時間点で血液サンプルを収集し、ヒトＤＣＮについて標準ＥＬＩＳＡで分析した。群ごとにｎ＝４。
【図4A】図４Ａ～図４Ｄは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫがｃｏｌ７ａ１－／－マウスの生存率を向上させ、皮膚にホーミングすることを示す。図４Ａは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫが投与されたｃｏｌ７ａ１－／－マウス（メジアン生存期間：１１日間、ｎ＝２１）、ＤＣＮが投与されたｃｏｌ７ａ１－／－マウス（メジアン生存期間：７日間、ｎ＝１７）及びＰＢＳが投与されたｃｏｌ７ａ１－／－マウス（メジアン生存期間：２日間、ｎ＝２４）のカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ）生存率分析を示す。
【図4B】図４Ａ～図４Ｄは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫがｃｏｌ７ａ１－／－マウスの生存率を向上させ、皮膚にホーミングすることを示す。図４Ｂは、Ｈｕｍａｎ Ｄｅｃｏｒｉｎ ＥＬＩＳＡキットを使用して決定された、肝内投与の１週間、２週間及び３週間後の被投与ｃｏｌ７ａ１－／－マウスの皮膚におけるＤＣＮ及びＤＣＮ－ｔＣＲＫのレベルの定量化を示す（時間点ごとにｎ＝３）。ＤＣＮ投与の３週間後の時点で生存しているマウスがなかったため、該時点でＤＣＮのレベルの定量化がなかった。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図4C】図４Ａ～図４Ｄは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫがｃｏｌ７ａ１－／－マウスの生存率を向上させ、皮膚にホーミングすることを示す。図４Ｃは、ｃｏｌ７ａ１－／－マウスの足と背部の皮膚の両方に対する、抗ヒスチジン抗体（抗ｈｉｓ）を用いた免疫組織化学染色を示す。核は、ＤＡＰＩを用いて対比染色された。スケールバーは２０μｍである。
【図4D】図４Ａ～図４Ｄは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫがｃｏｌ７ａ１－／－マウスの生存率を向上させ、皮膚にホーミングすることを示す。図４Ｄは、抗ヒスチジンタグと抗ＮＲＰ－１の代表的な二重染色、並びにＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療されたＲＤＥＢ皮膚、ＤＣＮで治療されたＲＤＥＢ皮膚及び未治療のＲＤＥＢ皮膚の（ＤＡＰＩ対比染色による）合併画像を示す。スケールバーは２５μｍである。
【図5】図５は、ｃｏｌ７ａ１－／－マウスのカプラン・マイヤー生存率分析を示し、デキストラン／ヒト血清アルブミン投与後の過去の生存率（Ｄ／ＨＳＡ、メジアン生存期間：３日間、ｎ＝２９、過去のデータ、Ｌｉａｏら、２０１８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、７：５３０－５４２）と、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ投与後の生存率（メジアン生存期間：１１日間、ｎ＝２１）、ＤＣＮ投与後の生存率（メジアン生存期間：７日間、ｎ＝１７）及びＰＢＳ投与後の生存率（メジアン生存期間：２日間、ｎ＝２４）とが比較される。
【図6A】図６は、ＤＣＮ－ｔＣＲＫがＲＤＥＢの線維化遺伝子シグネチャを正常化することを示す。図６Ａは、遺伝子のクラスターグラムにおける、ＷＴと比較して、未治療のＲＤＥＢ皮膚で発現が１．５倍超増加した相対的な遺伝子発現を示す。
【図6B】図６は、ＤＣＮ－ｔＣＲＫがＲＤＥＢの線維化遺伝子シグネチャを正常化することを示す。図６Ｂは、ＷＴに対する、それぞれビヒクル、ＤＣＮ及びＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療されたｃｏｌ７ａ１－／－マウスの皮膚における遺伝子発現のｌｏｇ２倍数変化及び－ｌｏｇ１０ｐ値のボルケーノプロットを示す。
【図7A】図７は、ＤＣＮ－ｔＣＲＫの投与がｃｏｌ７ａ１－／－マウスの線維化の発症を抑制したことを示す。図７Ａは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療された場合及びＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療されない場合の、１週齢及び２週齢のＷＴ及びｃｏｌ７ａ１－／－マウスにおけるＣＴＧＦ／ＣＣＮ２の代表的な免疫組織化学染色を示す。スケールバーは、上部パネルでは５０μｍであり、下部パネルでは２５μｍである。
【図7B】図７は、ＤＣＮ－ｔＣＲＫの投与がｃｏｌ７ａ１－／－マウスの線維化の発症を抑制したことを示す。図７Ｂは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療された場合及びＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療されない場合の、１週齢及び２週齢のＷＴ及びｃｏｌ７ａ１－／－マウスからの足の皮膚のピクロシリウスレッド染色を示す。ピクロシリウスレッドの画像は、偏光を使用して取得された。スケールバーは２５μｍである。
【図7C】図７は、ＤＣＮ－ｔＣＲＫの投与がｃｏｌ７ａ１－／－マウスの線維化の発症を抑制したことを示す。図７Ｃは、２０×対物レンズで取得したフィールド当たりのピクロシリウスレッド平均強度の定量化を示す。各切片に対して８つ以上のフィールドの定量化が取得され、生検ごとに少なくとも４つの切片が分析された。スケールバーは２５μｍである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図7D】図７は、ＤＣＮ－ｔＣＲＫの投与がｃｏｌ７ａ１－／－マウスの線維化の発症を抑制したことを示す。図７Ｄは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療された場合及びＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療されない場合の、２週齢のＷＴ及びｃｏｌ７ａ１－／－マウスの２週間のＲＤＥＢ皮膚及びＷＴ皮膚における１型コラーゲン（ＣＯＬ１）発現（第１列のＣＯＬ１）と、α－平滑筋アクチンの二重免疫蛍光染色（第２列のαＳＭＡ）と、血管（第３列のＣＤ３１）との代表的な写真を示す。核は、ＤＡＰＩを用いて対比染色された。合併画像は、第４列に示される。スケールバーは２５μｍである。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、試薬及び製剤などに限定されないため、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のために過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【0020】
本明細書で使用される場合、単数表現「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、１つ以上を意味する。したがって、単数形の名詞は、特に明記しない限り、対応する複数形の名詞の意味も持つ。
【0021】
本発明は、ホーミングペプチド誘導デコリン複合体の治療的使用に関する。より具体的には、本発明は、表皮水疱症の治療で使用するためのホーミングペプチド誘導デコリン複合体と、必要とする対象の表皮水疱症を治療する方法であって、有効量のホーミングペプチド誘導デコリン複合体を該対象に投与することによる方法とを提供する。
【0022】
表皮水疱症は、脆い皮膚、水疱形成性皮膚を引き起こす一群の希な疾患である。水疱は、熱、摩擦、引っかき又は粘着テープなどによる軽傷に反応して現れる可能性がある。重症の場合では、水疱は、口又は胃の粘膜などの体内で生じる可能性がある。表皮水疱症は、後天性及び先天性の形態を含む様々な形態で存在し、先天性が劣性又は優性である可能性がある。表皮水疱症の非限定的な例は、後天性表皮水疱症、接合型表皮水疱症、単純型表皮水疱症、キンドラー症候群、及び栄養障害型表皮水疱症を含み、栄養障害型表皮水疱症は、優性栄養障害型表皮水疱症と、劣性反対型栄養障害型表皮水疱症などの劣性栄養障害型表皮水疱症とを含む。また、上記例の任意の亜型も含まれる。
【0023】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、動物対象、好ましくは哺乳類対象、より好ましくはヒト対象を指す。本明細書において、用語「患者」は、ヒト対象を指す。
【0024】
本明細書で使用される場合、用語「治療」又は「治療する（こと）」は、表皮水疱症を改善し、軽減し、阻害するか又は癒すことを含んでもよい目的で、当該複合体又はそれを含む医薬組成物の対象への投与を指す。
【0025】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、表皮水疱症の悪影響が最低でも改善される量を指す。
【0026】
本明細書で使用される場合、用語「デコリン」（ＤＣＮ）は、小さなロイシンリッチコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの任意のアイソフォームを指す。デコリンは、例えば、コラーゲン線維形成を調節し、組織線維化を防止し、組織再生を促進し、ＴＧＦ－βの拮抗薬として作用する多機能プロテオグリカンである。いくつかの実施形態では、デコリンは、Ｎ末端シグナル配列及び／若しくはプロペプチドを有するか又は有さない、デコリンアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥのアミノ酸配列を含むか又はそれからなるヒトデコリンである。いくつかの実施形態では、デコリンは、配列番号６～２０のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。上記デコリン種の保存配列変異体及びペプチド模倣物も含まれる。本明細書で使用される場合、用語「デコリン断片」は、デコリンを含むか又はそれからなる本複合体の一部を指す。
【0027】
いくつかの実施形態では、デコリン断片は、デコリンの生物学的特性が有意に変化しないという条件で、配列番号６～２０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％若しくは６０％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。このようなデコリン変異体は、１つ以上のアミノ酸の追加、欠失及び／又は置換から生じてもよい。デコリンの生物学的特性が保持されているか否かを決定する手段及び方法は、該技術分野に容易に利用可能である。
【0028】
本明細書で使用される場合、２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、２つの配列の最適なアライメントのために導入されるべきギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列の配列比較及び同一性のパーセンテージの決定は、該技術分野に利用可能な数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
【0029】
本明細書で使用される場合、用語「ホーミングペプチド」は、他の細胞又は組織に優先して標的、特定の細胞又は組織にインビボで選択的にホーミングする任意のペプチドを広く指す。したがって、ホーミングペプチドは、標的送達ビヒクルとして利用することができる。
【0030】
本発明に使用されるホーミングペプチド誘導デコリン複合体は、国際公開第２００８／１３６８６９号パンフレットに開示されている公知のデコリン融合タンパク質とは、少なくとも使用されるホーミングペプチドという点で相違する。従来技術のデコリン融合タンパク質は、公知のＣＲＫペプチド（ＣＲＫＤＫＣ、配列番号３）を含むのに対して、本発明に利用される新規なホーミングペプチドのＣ末端は、アミノ酸配列ＲＫＤＫ（配列番号１）からなる。いくつかの実施形態では、本発明に利用される新規なホーミングペプチドのＣ末端は、ＣＲＫＤＫ（配列番号２）からなる。
【0031】
驚くべきことに、公知のＣＲＫペプチド（ＣＲＫＤＫＣ、配列番号３）のＣ末端システインの切断がこのペプチドのホーミング特異性を変化させることが今回発見された。ＣＲＫペプチドは皮膚創傷に選択的にホーミングするが、以下、ｔＣＲＫと表記される、切断されたＣＫＲ（ＲＫＤＫ、配列番号１、又はＣＲＫＤＫ、配列番号２）は、皮膚創傷にホーミングする能力を保持しながら、創傷のない皮膚に対して、ホーミングし貫通する能力をペプチドに付与する。言い換えれば、ＣＲＫペプチドは、皮膚創傷のみに選択的にホーミングするのに対して、ｔＣＲＫペプチドは、皮膚創傷と創傷のない皮膚の両方に対して、選択的にホーミングし、貫通する。
【0032】
ＣＲＫペプチドのＣ末端システインの切断により、本ｔＣＲＫペプチドの潜在的なＣｅｎｄＲ（Ｃ－ｅｎｄ Ｒｕｌｅ）配列Ｒ／ＫＸＸＲ／Ｋ（配列番号４）、すなわちＲＫＤＫ（配列番号１）が露出する。理論に限定されることなく、ｔＣＲＫペプチドは、細胞表面にＮＲＰ－１を発現する真皮微小血管内皮細胞による内在化により皮膚組織を貫通することができる。興味深いことに、潜在的なＣｅｎｄＲモチーフを含むＣＲＫペプチドは、細胞及び組織を貫通することができない（Ｊａｒｖｉｎｅｎ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、２００７、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７１：７０２－７１１、Ａｇｅｍｙら、２０１０、Ｂｌｏｏｄ １１６：２８４７－２８５６）。
【0033】
したがって、本複合体に使用されるホーミングペプチドは、ホーミングペプチドのＣ末端にｔＣＲＫ要素を含む。
【0034】
本明細書で使用される場合、用語「Ｃ末端（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ）」（カルボキシル末端、カルボキシ末端、Ｃ末端（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ）又はＣＯＯＨ末端としても知られる）は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）で終わるアミノ酸鎖の末端を指す。本明細書において、用語「Ｃ末端（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ）」と「Ｃ末端（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）」は、交換可能である。
【0035】
本明細書で使用される場合、用語「Ｎ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ）」（アミノ末端、アミン末端、Ｎ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ）又はＮＨ２末端としても知られる）は、アミノ酸鎖の開始点を指す。アミノ酸鎖の１番目のアミノ酸は、遊離アミン基（－ＮＨ２）を含む。本明細書において、用語「Ｎ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ）」及び「Ｎ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）」は交換可能である。ペプチド配列は、Ｎ末端からＣ末端へと記述される。
【0036】
本明細書で使用される場合、用語「ｔＣＲＫ要素」は、インビボで皮膚及び皮膚創傷に選択的にホーミングし、かつ皮膚組織を貫通できるＲＫＤＫ（配列番号１）又はＣＲＫＤＫ（配列番号２）のアミノ酸配列を有するペプチドを指す。用語「ｔＣＲＫ要素」と「ｔＣＲＫペプチド」は、交換可能である。
【0037】
本発明において、ｔＣＲＫ要素は、本明細書で使用されるホーミングペプチドのＣ末端に位置する。より具体的には、ｔＣＲＫ要素は、ホーミングペプチドのＣ末端先端部に位置し、末端カルボキシル基を含む。言い換えれば、ホーミングペプチドのＣ末端は、ＲＫＤＫ（配列番号１）又はＣＲＫＤＫ（配列番号２）のアミノ酸配列からなる。したがって、ｔＣＲＫ要素を含むホーミングペプチドは、ＲＫＤＫ（配列番号１）又はＣＲＫＤＫ（配列番号２）のアミノ酸配列で終わる。
【0038】
いくつかの実施形態では、本発明において使用されるホーミングペプチドは、配列番号１又は配列番号２からなる。いくつかの他の実施形態では、このホーミングペプチドは、配列番号１又は配列番号２を含む。後者の場合、ホーミングペプチドは、ｔＣＲＫ要素のＮ末端に結合した追加のアミノ酸を含む。しかしながら、このようなより長いホーミングペプチドのＣ末端は、依然としてｔＣＲＫ要素からなる。いくつかの実施形態では、ホーミングペプチドは、最大１００個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、ホーミングペプチドは、最大５０個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、ホーミングペプチドは、最大２０個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドホーミングは、最大１０個のアミノ酸を含み得る。
【0039】
いくつかの実施形態では、ホーミングペプチドは、環状構造の一部であってもよく、ジスルフィド結合などを介して環化されてから、ｔＣＲＫ配列をホーミングペプチドのＣ末端のＣｅｎｄＲペプチドとして露出するようにプロテアーゼによって切断されてもよい。
【0040】
本明細書で使用される場合、表現「ｔＣＲＫ誘導デコリン」は、標的送達又はホーミングが、本明細書に開示されている実施形態のいずれか１つに係るｔＣＲＫホーミングペプチドによって達成される任意のデコリン複合体を指す。そのような複合体の非限定的な例は、デコリン断片が、配列番号６～２０のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、かつ配列番号２３又は２４の介在リンカーなどの介在リンカーを有するか若しくは有さずに、該デコリン断片のＣ末端から配列番号１又は２のｔＣＲＫ要素のＮ末端に結合される複合体を含む。更なる例は、配列番号２１又は２２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる複合体を含む。また更なる例は、ｔＣＲＫ要素のホーミング特異性、貫通能力とデコリンの生物学的活性が本質的に変化しないという条件で、上記配列に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％又は６０％の配列同一性を有する配列変異体と、それらの保存配列変異体及びペプチド模倣物とを含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、ｔＣＲＫ誘導デコリン複合体は、融合タンパク質の形態で使用に提供されてもよいが、それに限定されない。したがって、いくつかの実施形態では、当該複合体は、天然若しくは非天然のアミノ酸若しくはペプチド模倣物からなってもよく若しくはそれらを含んでもよいペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質断片などの１つ以上の追加のアミノ断片を有して、又はそれらを有さずに、好ましくはデコリン断片のＣ末端から、本明細書に開示されているホーミングペプチドのＮ末端に融合又は連結されたデコリン断片を含む「融合タンパク質」である。そのような１つ以上の追加のアミノ酸断片は、デコリン断片のＮ末端に融合又は連結されてもよく、及び／又は、デコリン断片のＣ末端とホーミングペプチドのＮ末端との間に融合又は連結されてもよい。上記追加のアミノ酸断片は、治療活性を有してもよく、又は、診断、イメージング又は可視化などの目的で使用されてもよい。
【0042】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」は、典型的に隣接するアミノ酸のアルファアミノ基とカルボニル基との間のペプチド（アミド）結合により互いに接続されて、アミノ酸配列を形成する一連のアミノ酸残基を指す。従来、ペプチドは、２個～１００個、例えば２個～５０個のアミノ酸からなる分子として定義される。しかしながら、ペプチドは、少ないアミノ酸（例えば、２個～２０個）を有するオリゴペプチドと、多くのアミノ酸（例えば、２０個～１００個又は２０個～５０個）を有するポリペプチドとに細分され得る。タンパク質は、本質的に大きなペプチドであり、典型的に５０個超又は１００個超のアミノ酸からなる。したがって、表現を簡単にするために、本明細書で使用される用語「ペプチド」は、天然（Ｌ－）及び／又は非天然（Ｄ－）のアミノ酸残基の任意のペプチド結合系を包含し、特に断りのない限り、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」及びそれらのフラグメントと交換可能である。ペプチドのペプチド模倣物の形態も包含される。
【0043】
本発明において使用される融合タンパク質は、任意の適切な長さ、例えば、最大３００個、３５０個、４００個、５００個、１０００個又は２０００個の残基を有することができ、或いは、上記整数を含むか又はそれらの間の任意の数の残基を有してもよい。本明細書で使用される場合、用語「残基」は、アミノ酸又はアミノ酸類似体を指す。
【0044】
いくつかの実施形態では、本発明において使用される融合タンパク質は、精製、単離及び／又は検出などを容易にする小さなペプチドタグを含んでもよい。精製の目的のための適切な親和性タグの非限定的な例は、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ヘマグルチニンタグ（ＨＡタグ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ（ＧＳＴタグ）、ビオチンタグ、アビジンタグ及びストレプトアビジンタグを含む。適切な検出タグは、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質を含むが、これに限定されない。
【0045】
本発明において使用される融合タンパク質は、それらの長さに応じて、該技術分野に利用可能な任意の適切な手段、方法若しくは技術、例えば、自動ペプチド合成機により作成されてもよく、遺伝子工学技術により産生されてもよい。例えば、デコリンとｔＣＲＫホーミングペプチドとをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、遺伝子工学により作成されてから、宿主細胞にトランスフェクトされて融合タンパク質が発現されてもよい。適切な宿主細胞の非限定的な例は、細菌（例えば、大腸菌、桿菌）、酵母（例えば、ピキア・ポストリス、サッカロミセス・セレビシエ）及び真菌（例えば、糸状菌）などの原核生物宿主と、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）及び哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＲ細胞）などの真核生物宿主とを含む。発現ベクターは、原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞への外来性ＤＮＡの導入に一般的に使用される様々な技術により宿主細胞にトランスフェクトされてもよく、該技術は、電気穿孔法、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、マグネトフェクション、熱ショック、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを含むが、これらに限定されない。様々な発現ベクターが、該技術分野で容易に利用可能であり、当業者は、使用される宿主細胞などの異なる変動因子に応じて、適切な発現ベクターを容易に選択することができる。本発明において使用される融合タンパク質は、また、インビトロ翻訳、無細胞タンパク質発現、無細胞翻訳又は無細胞タンパク質合成としても知られるインビトロタンパク質発現により生成することができる。細菌、ウサギ網状赤血球、ＣＨＯ又はヒト溶解物などに基づくいくつかの無細胞発現系が、該技術分野に商業的に利用可能である。インビトロタンパク質発現は、バッチ反応又は透析モードのいずれかで実行されてもよい。
【0046】
本発明において使用される融合タンパク質の融合パートナーは、互いに直接的に連結されてもよく、リンカーを介して連結されてもよい。リンカーは、ペプチドリンカーであってもよく、非ペプチドリンカーであってもよい。リンカーは、ペプチドリンカーである場合、１つ以上のアミノ酸で構成されてもよい。ペプチドリンカーの非限定的な例は、配列番号２３又は２４で表されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【0047】
更に、ホーミングペプチドは、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのような系を介して、本複合体又は組成物に含まれるデコリン又は任意の他の治療タンパク質に結合されてもよい。
【0048】
以上より、本発明において使用される融合タンパク質は、いくつかの実施形態では、その融合タンパク質をコードする核酸分子を使用して産生されてもよい。このような核酸分子は、それらがコードする融合タンパク質の組換え産生だけでなく、該技術分野に利用可能な手段及び方法による遺伝子治療にも使用されてもよい。
【0049】
上記融合タンパク質の、天然（Ｌ－）及び／若しくは非天然（Ｄ－）のアミノ酸並びに／又はペプチド模倣物を含む保存配列変異体は、表皮水疱症の治療に使用されることも想定される。
【0050】
本明細書で使用される場合、用語「保存配列変異体」は、論じられているタンパク質又はペプチドの生物学的特性を有意に変化させないアミノ酸配列修飾体を指す。保存配列変異体は、該技術分野に周知の類似のアミノ酸（例えば、類似のサイズのアミノ酸又は類似の電荷特性を有するアミノ酸）との１つ以上のアミノ酸置換から生じる変異体を含む。
【0051】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド模倣物」は、所与のタンパク質又はペプチドを、その活性、例えば、ホーミング特異性を変化させずに模倣するように設計されたペプチド様分子を指す。ペプチド模倣物の非限定的な例は、化学修飾ペプチド、Ｄ－ペプチドのペプチド模倣物、非天然アミノ酸を含むペプチド様分子、ペプトイド及びβ－ペプチドを含む。また、ペプチドに似ているが、天然のペプチド連結を介して接続されない分子も、この用語に含まれる。ペプチド模倣物を産生する手段及び方法は、該技術分野に容易に利用可能である。
【0052】
表皮水疱症の治療用のｔＣＲＫ誘導デコリン複合体は、複合体の治療活性が保持されるという条件で、必要に応じて共有結合（直接的若しくはリンカーを介して間接的に）又は非共有結合で連結された１つ以上の追加の部分を更に含んでもよい。
【0053】
いくつかの実施形態では、追加の部分は、それ自体の治療活性、例えば、抗炎症活性、血管新生阻害活性、再生活性、血管新生促進活性、細胞毒性活性、アポトーシス促進活性、抗菌活性（例えば、抗細菌活性、抗ウイルス活性、抗真菌活性又は抗原虫活性）、抗線維化活性、抗しわ活性、抗掻痒活性、伝達物質（例えば、ヒスタミン）阻害活性、伝達物質促進活性又はサイトカイン活性を有してもよく、或いは、追加の部分は、治療部分の潜在的な生物学的活性又は治療効果のいくつかの非限定的な例を挙げると、サイトカイン阻害剤（例えば、拮抗薬、可溶性受容体、サイトカイン結合分子、又は他のサイトカインをブロックするサイトカイン）であってもよい。
【0054】
したがって、いくつかの実施形態では、追加の部分は、小分子、例えば、抗ヒスタミン剤、抗生物質、レチノイド、過酸化ベンゾイル、ポドフィロトキシン、細胞毒性薬物、並びにコルチコステロイド誘導体、カルシニューリン阻害剤及びイミキモドなどの免疫モジュレーターから選択される小分子であってもよい。更に、追加の部分は、タンパク質部分、例えば、抗線維化ＴＧＦ－β３、任意の再生若しくは抗炎症成長因子若しくはインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）などのサイトカイン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの任意の血管新生成長因子、ｂｉｔ１などの任意の抗アポトーシスタンパク質、ＣＤ７３などの任意の炎症抑制酵素、又は７型コラーゲンなどの任意のコラーゲンであってもよい。
【0055】
いくつかの実施形態では、追加の部分は、ｔＣＲＫ誘導デコリン複合体の検出を容易にするために使用されてもよい。したがって、当該複合体は、検出可能な剤を含んでもよい。本明細書で使用される場合、用語「検出可能な剤」は、直接的又は間接的に、好ましくは非侵襲的技術及び／又はインビボ可視化技術により、検出できる任意の分子を指す。開示されている複合体における使用に適した検出可能な剤の非限定的な例は、様々な有機及び／又は無機の小分子、様々な蛍光タンパク質及びその誘導体を含む蛍光剤、リン光発光剤、発光剤（例えば、化学発光剤、発色剤）などの光学剤と、ガンマ線、陽電子、ベータ若しくはアルファ粒子又はＸ線を放出する放射性核種などの放射性標識と、カドリニウム（Ｇｄ）などの非放射性同位体と、ヨウ素系造影剤などのイオン性及び非イオン性造影剤と、磁性剤、強磁性剤、常磁性剤及び／又は超常磁性剤などの電磁剤と、アップコンバージョンナノ粒子（ＵＣＮＰ）と、共鳴粒子と、量子ドットと、金粒子とを含む。更なる適切な検出可能な剤が、該技術分野に利用可能である。当業者は、当該複合体に使用される検出可能な剤の種類及び種に応じて、適切なイメージング技術を容易に選択することができる。そのような技術は、放射線技術と、陽電子放出断層撮影法などの同位体法と、超音波イメージングと、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）とを含むが、これらに限定されない。
【0056】
検出可能な剤は、デコリン複合体に、共有結合などで直接的に結合してもよく、結合剤、リンカー、又はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸（ＤＯＴＡ）及び／又はメタロチオネインなどのキレート剤などを介して間接的に会合してもよい。検出可能な剤をペプチド又はタンパク質複合体に複合体化するか又は他の方法で結合させる技術は、該技術分野に周知である。例えば、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）などの検出可能なタンパク質を含む複合体は、組換え技術により融合タンパク質として産生することができる。
【0057】
開示されているホーミングペプチド誘導デコリン複合体、より具体的にはｔＣＲＫ誘導デコリン複合体は、いずれも天然に存在しない。
【0058】
いくつかの実施形態では、表皮水疱症の治療で使用するためのｔＣＲＫ誘導デコリン複合体は、この複合体と、インビボでの投与を可能にする薬学的又は生理学的に許容される担体とを含む医薬組成物の形態で提供される。
【0059】
本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、１つ以上の活性成分と、担体、補助剤及び／又は賦形剤などの生理学的に適した成分との製剤を広く指す。医薬組成物の目的は、対象又は生物への化合物の投与を容易にすることである。本明細書で使用される場合、用語「活性成分」は、生物学的効果を果たす物質を広く指し、該生物学的効果は、抗炎症効果、血管新生阻害効果、再生効果、血管新生促進効果、細胞毒性効果、アポトーシス促進効果、抗菌効果（例えば、抗細菌効果、抗ウイルス効果、抗真菌効果又は抗原虫効果）、抗線維化効果、抗掻痒効果、伝達物質阻害効果、伝達物質（例えばヒスタミン）促進効果、サイトカイン誘発効果又はサイトカイン阻害を含むが、これらに限定されない。本開示の文脈において、用語「活性成分」は、特にｔＣＲＫ誘導デコリンを指すが、上記組成物及び／又は複合体が上記更なる活性剤を含んでもよい。
【0060】
医薬組成物は、該技術分野に容易に利用可能な手段及び方法、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖剤製造、微粒子化、乳化、カプセル化、封入、凍結乾燥又は同様のプロセスを使用して、必要に応じて、例えば、半固体若しくは固体の製剤、溶液、分散液又は懸濁液として製剤化されてもよい。
【0061】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」及び「生理学的に許容される」は、交換可能であり、毒性、著しい刺激及び／又はアレルギー反応などの過度の有害な副作用なしに対象又は生物に投与するのに適した物質を指す。言い換えれば、利益／リスク比は妥当でなければならない。
【0062】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、活性成分が組み合わせされて投与を容易にし、かつ投与を受ける対象に生理学的に許容される担体物質又は希釈剤を指す。薬学的に許容される担体は、該技術分野に容易に利用可能であり、意図される投与経路に応じて、経皮担体、経粘膜担体、経腸担体、非経口担体、徐放性製剤用担体からなるがこれらに限定されない群から選択されてもよい。選択された担体は、活性成分の生物学的な活性及び特性を無効にすべきではなく、活性成分の分解を最小限に抑え、投与を受ける対象に対する有害な副作用を最小限に抑えるべきである。
【0063】
本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、好ましくは、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。様々な種類の賦形剤の典型的な例は、安定剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、充填剤、増粘剤、粘度調整剤、滑剤、可溶化剤、界面活性剤、甘味料、矯味剤などを含むが、これらに限定されない。
【0064】
有用な安定化賦形剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０及びポロキサマー４０７などの界面活性剤と、ポリエチレングリコール及びポビドンなどのポリマーと、スクロース、マンニトール、グルコース、ラクトースなどの炭水化物と、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール及びエチレングリコールなどの糖アルコールと、アルブミンなどのタンパク質と、グリシン及びグルタミン酸などのアミノ酸と、エタノールアミンなどの脂肪酸と、アスコルビン酸などの抗酸化物質と、ＥＤＴＡ塩などのキレート剤と、Ｃａ、Ｎｉ、Ｍｇ及びＭｎなどの金属イオンとを含むが、これらに限定されない。有用な防腐剤の中には、限定されないが、ベンジルアルコール、クロルブタノール、塩化ベンザルコニウム、及び場合によってはパラベンが含まれる。有用な緩衝賦形剤の中には、限定されないが、目標ｐＨ範囲に応じて、ナトリウム及びカリウムのリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、及び炭酸塩又はグリシンの緩衝液が含まれる。また、等張性調整剤としての塩化ナトリウムの使用も有用である。更なる賦形剤材料の非限定的な例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類及び各種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油及びポリエチレングリコールを含む。当業者によって容易に理解されるように、所与の賦形剤は、複数の機能を果たしてもよい。
【0065】
当該医薬組成物は、局所又は全身治療の何れが望まれるかに応じて、そして治療される箇所に応じて、多くの方法で投与することができる。投与は、例えば、非経口的、経腸的又は局所的であり得る。
【0066】
当該組成物の非経口投与は、使用される場合、一般に、注射により、例えば、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内の注射により行われる。非経口投与のための製剤は、典型的に、滅菌した水溶液又は非水性溶液、懸濁液又は乳濁液であるが、製剤は、また、必要に応じて濃縮形態又は再構成される粉末の形態で提供されてもよい。持続放出製剤又は徐放性製剤も考えられる。非経口投与のための製剤を製剤化する手段及び方法は、該技術分野に容易に利用可能であり、当業者は、製剤の所望の特質に応じて、適切な、生理学的に適した担体、補助剤及び／又は賦形剤を容易に選択することができる。
【0067】
非経口及び他の薬学的製剤用の水性担体の非限定的な例は、滅菌水、水－アルコール溶液、生理食塩水及び生理学的ｐＨの緩衝溶液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース溶液、デキストロース及び塩化ナトリウム溶液、ラクトース含有リンゲル溶液、又は不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、流体及び栄養補給剤、電解質補給剤、例えば、リンゲルのデキストロース溶液に基づくものなどを含む。
【0068】
非経口及び他の薬学的製剤用の非水性担体の非限定的な例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの溶媒と、オリーブ油などの植物油と、魚油と、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルとを含む。
【0069】
非経口製剤が濃縮溶液又は分散物として提供されるか又は粉末として提供される場合、上記水性担体又は非水性担体は、再構成のために使用されてもよい。再構成のための溶液は、濃縮物又は粉末と同じパッケージで提供されてもよい。粉末を調製するために凍結乾燥を用いる場合、ポリマー（例えば、ポビドン、ポリエチレングリコール、デキストラン）、糖類（例えば、スクロース、グルコース、ラクトース）、アミノ酸（例えば、グリシン、アルギニン、グルタミン酸）及びアルブミンを含むがこれらに限定されない抗凍結剤を使用することが有益である場合がある。
【0070】
当該組成物の経腸投与は、使用される場合、経口投与又は経皮的内視鏡下胃瘻造設術（ＰＥＧ）による投与などにより行われてもよい。経口投与のための組成物は、粉末、顆粒、カプセル、サッシェ、錠剤、水溶液若しくは非水性溶液及び懸濁液を含むが、これらに限定されない。経腸投与のための製剤を製剤化する手段及び方法は、該技術分野に容易に利用可能であり、当業者は、製剤の所望の特質に応じて、適切な、生理学的に適した担体、補助剤及び／又は賦形剤を容易に選択することができる。
【0071】
当該組成物の局所投与は、使用される場合、経皮投与、経粘膜投与、皮膚上投与、鼻腔内投与、直腸投与、経膣投与、及び吸入剤による投与などにより行われてもよい。投与経路に応じて、局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、座薬、噴霧剤、液剤、粉末剤、持続放出製剤若しくは徐放性製剤、又は固形物を含むことができる。局所投与のための製剤を製剤化する手段及び方法は、該技術分野に容易に利用可能であり、当業者は、製剤の所望の特質に応じて、適切な、生理学的に適した担体、補助剤及び／又は賦形剤を容易に選択することができる。
【0072】
いくつかの当該組成物は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸及びリン酸などの無機酸との、及びギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸などの有機酸との反応によって、又は、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基との、及びモノ、ジ、トリアルキル、アリールアミン及び置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される、薬学的に許容される酸付加塩又は塩基付加塩として投与することができる。
【0073】
本明細書に開示されている複合体又は医薬組成物の投与量及び投与計画は、皮膚疾患及び皮膚の病気、特に表皮水疱症を治療する臨床分野の当業者によって容易に決定することができる。一般的に、投与量は、治療対象の年齢、性別及び全般的な健康状態と、もしあれば併用療法の種類と、治療の頻度及び所望の効果の性質と、問題になっている表皮水疱症の重症度及び種類と、個々の医師によって調整される他の変動因子との考慮事項によって決まる。所望の結果を得るために、所望の投与量を１回以上の適用で投与することができる。例えば、当該医薬組成物は、１日１回の投与量で投与されてもよく、１日の総投与量を、例えば、１日に２回、３回若しくは４回の分割投与量で投与されてもよい。当該医薬組成物は、例えば、単位剤形又は徐放性製剤で提供されてもよい。
【実施例】
【0074】
実験部
材料及び方法
デコリン融合タンパク質のクローニング
天然シグナル及びプロペプチド配列を含まないヒトデコリン（ＤＣＮ）ｃＤＮＡ（Ｋｒｕｓｉｕｓ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９８６、ＰＮＡＳ ８３：７６８３－７８７）を、哺乳類発現ベクターｐＥＦＩＲＥＳ－Ｐ（Ｈｏｂｂｓら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２５２：３６８－３７２）にクローニングした。ｔＣＲＫ創傷ホーミングペプチドｃＤＮＡを終止コドンに隣接するデコリンのＣ末端にクローニングした。６×Ｈｉｓタグをデコリンの前のＮ末端にクローニングした。この構築物をＰＩＰＥ方法（Ｋｌｏｃｋ及びＬｅｓｌｅｙ、２００９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４９８：９１－１０３）で組み立てた。形質転換のために、ＮＥＢ ５－アルファコンピテント大腸菌（高効率）細胞を製造元の指示に従って使用した（Ｃ２９８７Ｈ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ニュー・イングランド・バイオラボ）、イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ）、マサチューセッツ州）。プラスミド精製（Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐ）、ＰＣＲ精製及びアガロースゲル精製のために、Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン）（ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）からのキットを使用した。ＤＣＮは、二量体を天然に形成する（Ｓｃｏｔｔら、２００４、ＰＮＡＳ １０１：１５６３３－１５６３８）。単量体６×Ｈｉｓタグ－ＤＣＮ－ｔＣＲＫ融合タンパク質のタンパク質配列は、ＧＨＨＨＨＨＨＤＥＡＳＧＩＧＰＥＶＰＤＤＲＤＦＥＰＳＬＧＰＶＣＰＦＲＣＱＣＨＬＲＶＶＱＣＳＤＬＧＬＤＫＶＰＫＤＬＰＰＤＴＴＬＬＤＬＱＮＮＫＩＴＥＩＫＤＧＤＦＫＮＬＫＮＬＨＡＬＩＬＶＮＮＫＩＳＫＶＳＰＧＡＦＴＰＬＶＫＬＥＲＬＹＬＳＫＮＱＬＫＥＬＰＥＫＭｅｔＰＫＴＬＱＥＬＲＡＨＥＮＥＩＴＫＶＲＫＶＴＦＮＧＬＮＱＭｅｔＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭｅｔＫＫＬＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＳＩＰＱＧＬＰＰＳＬＴＥＬＨＬＤＧＮＫＩＳＲＶＤＡＡＳＬＫＧＬＮＮＬＡＫＬＧＬＳＦＮＳＩＳＡＶＤＮＧＳＬＡＮＴＰＨＬＲＥＬＨＬＤＮＮＫＬＴＲＶＰＧＧＬＡＥＨＫＹＩＱＶＶＹＬＨＮＮＮＩＳＶＶＧＳＳＤＦＣＰＰＧＨＮＴＫＫＡＳＹＳＧＶＳＬＦＳＮＰＶＱＹＷＥＩＱＰＳＴＦＲＣＶＹＶＲＳＡＩＱＬＧＮＹＫＧＳＥＦＣＲＫＤＫ終止（配列番号２１）である。
材料及び方法
デコリン融合タンパク質のクローニング
天然シグナル及びプロペプチド配列を含まないヒトデコリン（ＤＣＮ）ｃＤＮＡ（Ｋｒｕｓｉｕｓ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９８６、ＰＮＡＳ ８３：７６８３－７８７）を、哺乳類発現ベクターｐＥＦＩＲＥＳ－Ｐ（Ｈｏｂｂｓら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２５２：３６８－３７２）にクローニングした。ｔＣＲＫ創傷ホーミングペプチドｃＤＮＡを終止コドンに隣接するデコリンのＣ末端にクローニングした。６×Ｈｉｓタグをデコリンの前のＮ末端にクローニングした。この構築物をＰＩＰＥ方法（Ｋｌｏｃｋ及びＬｅｓｌｅｙ、２００９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４９８：９１－１０３）で組み立てた。形質転換のために、ＮＥＢ ５－アルファコンピテント大腸菌（高効率）細胞を製造元の指示に従って使用した（Ｃ２９８７Ｈ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ニュー・イングランド・バイオラボ）、イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ）、マサチューセッツ州）。プラスミド精製（Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐ）、ＰＣＲ精製及びアガロースゲル精製のために、Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン）（ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）からのキットを使用した。ＤＣＮは、二量体を天然に形成する（Ｓｃｏｔｔら、２００４、ＰＮＡＳ １０１：１５６３３－１５６３８）。単量体６×Ｈｉｓタグ－ＤＣＮ－ｔＣＲＫ融合タンパク質のタンパク質配列は、ＧＨＨＨＨＨＨＤＥＡＳＧＩＧＰＥＶＰＤＤＲＤＦＥＰＳＬＧＰＶＣＰＦＲＣＱＣＨＬＲＶＶＱＣＳＤＬＧＬＤＫＶＰＫＤＬＰＰＤＴＴＬＬＤＬＱＮＮＫＩＴＥＩＫＤＧＤＦＫＮＬＫＮＬＨＡＬＩＬＶＮＮＫＩＳＫＶＳＰＧＡＦＴＰＬＶＫＬＥＲＬＹＬＳＫＮＱＬＫＥＬＰＥＫＭｅｔＰＫＴＬＱＥＬＲＡＨＥＮＥＩＴＫＶＲＫＶＴＦＮＧＬＮＱＭｅｔＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭｅｔＫＫＬＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴＳＩＰＱＧＬＰＰＳＬＴＥＬＨＬＤＧＮＫＩＳＲＶＤＡＡＳＬＫＧＬＮＮＬＡＫＬＧＬＳＦＮＳＩＳＡＶＤＮＧＳＬＡＮＴＰＨＬＲＥＬＨＬＤＮＮＫＬＴＲＶＰＧＧＬＡＥＨＫＹＩＱＶＶＹＬＨＮＮＮＩＳＶＶＧＳＳＤＦＣＰＰＧＨＮＴＫＫＡＳＹＳＧＶＳＬＦＳＮＰＶＱＹＷＥＩＱＰＳＴＦＲＣＶＹＶＲＳＡＩＱＬＧＮＹＫＧＳＥＦＣＲＫＤＫ終止（配列番号２１）である。
【0075】
実験部に使用したＤＣＮ－ｔＣＲＫ融合タンパク質の概略図を図１Ａに示す。発明を実施するための形態のところで明確に示すように、図１ＡのＤＣＮ－ｔＣＲＫ融合タンパク質は、本発明における使用に適したｔＣＲＫ誘導デコリン複合体の非限定的な例である。
【0076】
組換えタンパク質の産生
ｐＥＦＩＲＥＳ－Ｐ発現ベクターの構築物を、リポフェクション（ＦｕＧｅｎｅ ６、Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ワイオミング州）によりＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。５～１６０μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＨｙＣｌｏｎｅ（ハイクローン）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック））の存在下で、ＤＭＥＭ高グルコース（４．５ｇ／ｌ）＋２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン（全てがＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマアルドリッチ）、セントルイス、ミズーリ州からのものである）、及び１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（ギブコ）、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州）で構成される培地で陽性クローンを選択した。樹立した細胞株を、１０μｇ／ｍｌピューロマイシンを含む培地において維持した。
ｐＥＦＩＲＥＳ－Ｐ発現ベクターの構築物を、リポフェクション（ＦｕＧｅｎｅ ６、Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ワイオミング州）によりＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。５～１６０μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＨｙＣｌｏｎｅ（ハイクローン）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック））の存在下で、ＤＭＥＭ高グルコース（４．５ｇ／ｌ）＋２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン（全てがＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマアルドリッチ）、セントルイス、ミズーリ州からのものである）、及び１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（ギブコ）、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州）で構成される培地で陽性クローンを選択した。樹立した細胞株を、１０μｇ／ｍｌピューロマイシンを含む培地において維持した。
【0077】
そして、確認済みの細胞を、２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ（シグマ））を補充した無血清ＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、回転振盪機に搭載された正方形のガラス瓶で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。細胞が１～２×１０６個の細胞／ｍｌの密度に達した後、組換えタンパク質の発現と培地への分泌のために、細胞を３３℃で更に４日間培養した。Ａｅｋｔａ Ｓｔａｒｔクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ジーイー・ヘルスケア）、ミュンヘン、ドイツ）で、二段階ＨｉｓＴｒａｐ精製プロトコルにより、上記タンパク質を培地から精製した。
【0078】
組換えタンパク質の精製
細胞培養上清を濾過し、０．４５μｍのフィルターユニット（Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング） ＃４３０５１４、コーニング、ニューヨーク州）を通して氷上で脱気した。４℃のコールドキャビネットで、製造元の指示に従って、Ａｅｋｔａ Ｓｔａｒｔクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ミュンヘン、ドイツ）で最初にＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラムを使用し、続いてＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムを使用して、６×Ｈｉｓタグ付きタンパク質をＮｉ－ＮＴＡ－ＩＭＡＣで二段階精製プロトコルにより精製した。緩衝液をＨｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／ＶＷＲ（１１－００３４－００））により調製した。全ての緩衝液を濾過し、脱気した。
細胞培養上清を濾過し、０．４５μｍのフィルターユニット（Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング） ＃４３０５１４、コーニング、ニューヨーク州）を通して氷上で脱気した。４℃のコールドキャビネットで、製造元の指示に従って、Ａｅｋｔａ Ｓｔａｒｔクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ミュンヘン、ドイツ）で最初にＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラムを使用し、続いてＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムを使用して、６×Ｈｉｓタグ付きタンパク質をＮｉ－ＮＴＡ－ＩＭＡＣで二段階精製プロトコルにより精製した。緩衝液をＨｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／ＶＷＲ（１１－００３４－００））により調製した。全ての緩衝液を濾過し、脱気した。
【0079】
最終イミダゾール濃度が３０ｍＭとなるように、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム溶出液を希釈し、次に、３５ｍＭイミダゾール洗浄及び３００ｍＭまでのイミダゾール勾配溶出により、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムで更に精製した（図２Ａは、そのような精製クロマトグラムの例を含む）。ピーク画分をＳＤＳ ＮｕＰＡＧＥ４～１２％勾配ゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ライフ・テクノロジーズ）／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）、マサチューセッツ州）で分析し、ＰａｇｅＢｌｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）により可視化した。
【0080】
選択したピーク画分を、プールし、５０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（フィッシャーサイエンティフィック）／Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ（スペクトラム・ラボ））を使用して冷ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．６）に対して透析した後、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ ＶｉｖａＳｐｉｎ ６チューブ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で濃縮した。サンプルをフィルター滅菌し（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ ＧＶ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア）、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ（バーリントン）、マサチューセッツ州）、タンパク質濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）によりＡ２８０ｎｍで測定した。全てのステップを４℃又は氷上で実行した。凝集を防止するために、最終濃度０．０５％になるように滅菌Ｔｗｅｅｎ－２０を添加した後、－８０℃でアリコートを急速に凍結した。
【0081】
組換えタンパク質をＳＤＳ Ｐａｇｅ及びウェスタンブロッティングにより確認した。ＢｉｏＲａｄ（バイオ・ラッド）の湿式タンクＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｃｅｌｌシステムを（製造元の指示に従って）使用した。製造元のプロトコルに従って、ＰＶＤＦ膜をヒトデコリンに対する一次マウス抗体（ＭＡＢ１４３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（アールアンドディー・システムズ）、ミネアポリス、ミネソタ州）でプローブした。Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（セルシグナリング・テクノロジー）の二次西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体を使用した。化学発光ブロット画像をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ ｍｉｎｉ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でキャプチャした。
【0082】
タンパク質の生物物理学的分析
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ機器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ（マルバーン・インスツルメンツ）、ウスターシャー（Ｗｏｒｃｈｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ）、英国）を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）により流体力学直径を測定した。ＤＣＮ－ｔＣＲＫタンパク質サンプルをＴＢＳ緩衝液で１：５に希釈した。３回の１０×１０ｓ測定を２５℃で実行した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアｖ７．１１（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）を使用して、タンパク質分析モデル（非負最小二乗分析とそれに続くＬ－ｃｕｖｅ）及び体積サイズ分布によりデータを分析した。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ機器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ（マルバーン・インスツルメンツ）、ウスターシャー（Ｗｏｒｃｈｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ）、英国）を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）により流体力学直径を測定した。ＤＣＮ－ｔＣＲＫタンパク質サンプルをＴＢＳ緩衝液で１：５に希釈した。３回の１０×１０ｓ測定を２５℃で実行した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアｖ７．１１（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）を使用して、タンパク質分析モデル（非負最小二乗分析とそれに続くＬ－ｃｕｖｅ）及び体積サイズ分布によりデータを分析した。
【0083】
ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ（示差走査熱量測定）機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｉｎｃ．（ミクロカル）／Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）を使用して、タンパク質濃度が０．２ｍｇ／ｍｌのＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で、ＤＣＮ－ｔＣＲＫのアンフォールディング温度を決定した。全ての溶液を脱気した。サンプルを２℃／分の走査速度で２０℃から１３０℃まで加熱した。フィードバックモードを「低」に設定し、フィルター期間を５秒とした。Ｏｒｉｇｉｎ ７．０ ＤＳＣソフトウェアスイート（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｉｎｃ．）を使用して、Ｎｏｎ－２－ｓｔａｔｅフィッティングモデルにより融解温度Ｔｍ（遷移中間点）を計算した。
【0084】
Ｓｃｉｅｘ高速ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ（商標）５６００＋質量分析計と併用してＥｋｓｉｇｅｎｔ ４２５ ＮａｎｏＬＣを使用して、発現された組換えＤＣＮ－ｔＣＲＫタンパク質を単量体ゲルバンドから同定した。ゲルバンドの単離及びクーマシー染色除去の後、Ｖａｅｈａｅｔｕｐａら、２０１８に詳細に説明されているように、タンパク質を還元（ＴＣＥＰ、２５ｍＭ）、アルキル化（ヨードアセトアミド、０．５Ｍ）及びトリプシン消化にかけた。トリプシン消化の後、ペプチドを１４μｌのサンプル緩衝液（２％アセトニトリル、０．１％ギ酸）に希釈し、１μｌのサンプルをｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ質量分析計に注入した。
【0085】
インビトロ結合分析
ＥＬＩＳＡ分析を使用して、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びペプチドのＮＲＰ－１へのインビトロ結合を分析した。９６ウェルの、黒色のＦＬＵＯＴＲＡＣ（商標）６００高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ（グライナー・バイオワン）、クレムスミュンスター（Ｋｒｅｍｓｍｕｅｎｓｔｅｒ）、オーストリア）にＰＢＳ中で１００μｇ／ｍｌ ＤＣＮ－ｔＣＲＫを１００μＬ／ウェルでコーティングして、４℃で一晩置いた。１０μｇ／ウェルのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２５）及びＲＰＡＰＲＡＲＡ（配列番号２６）ペプチドを、それぞれ陽性対照及び陰性対照として並行してコーティングした。ＢＳＡを固定化対照として使用した。プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、３００μｌのブロッキング溶液（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）で３７℃で１時間ブロックした。Ｈｉｓタグ付きニューロピリン－１のｂ１ｂ２ドメイン（ＮＲＰ－１ ＷＴ）及び三重変異体ＮＳ３４６Ａ－Ｅ３４８Ａ－Ｔ３４９Ａニューロピリン－１のｂ１ｂ２ドメイン（ＮＲＰ－１変異体）を、以前に記載されたように（Ｔｅｅｓａｌｕら、２００９、ＰＮＡＳ １０６：１６１５７－１６１６２）Ｓａｎｆｏｒｄ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｐｒｅｂｙｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（サンフォード・バーナム・プレビス・メディカル・ディスカバリー・インスティテュート）（ラホヤ、カリフォルニア州）のＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（タンパク質産生及び分析施設）で発現し、精製した。アミン反応性ＦＡＭ色素（ＤＭＳＯで最終濃度０．２％に希釈したもの）とタンパク質を１：１０の比率で混合することにより、組換えタンパク質ＮＲＰ１ ＷＴ、ＮＲＰ１変異体及びＤＣＮ－ｔＣＲＫを、ＦＡＭ（５－（及び－６）－カルボキシフルオレセイン、＃９００２４、Ｂｉｏｔｉｕｍ（バイオチウム）、カリフォルニア州、米国）標識した。混合反応物を室温で暗所で２時間インキュベートし、続いてＰＢＳで限外濾過／透析して、タンパク質から遊離色素を分離した。ブロッキング溶液中の１００μｌのＦＡＭで標識したＮＲＰ１ ＷＴ又はＮＲＰ１変異タンパク質を各ウェルに添加し（２０μｇ／ウェル）、室温で４～６時間又は４℃で一晩インキュベートし、ブロッキング溶液で３回洗浄した。各ウェルに１００μｌのＰＢＳを添加した後、プレートを蛍光リーダー（Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ ＩＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（モレキュラーデバイス）、ピーク励起＝４８５ｎｍ、ピーク発光＝５３０ｎｍ、カットオフ＝５１５）を使用してトップリードモードで直ちに読み取った。
ＥＬＩＳＡ分析を使用して、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びペプチドのＮＲＰ－１へのインビトロ結合を分析した。９６ウェルの、黒色のＦＬＵＯＴＲＡＣ（商標）６００高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ（グライナー・バイオワン）、クレムスミュンスター（Ｋｒｅｍｓｍｕｅｎｓｔｅｒ）、オーストリア）にＰＢＳ中で１００μｇ／ｍｌ ＤＣＮ－ｔＣＲＫを１００μＬ／ウェルでコーティングして、４℃で一晩置いた。１０μｇ／ウェルのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２５）及びＲＰＡＰＲＡＲＡ（配列番号２６）ペプチドを、それぞれ陽性対照及び陰性対照として並行してコーティングした。ＢＳＡを固定化対照として使用した。プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、３００μｌのブロッキング溶液（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）で３７℃で１時間ブロックした。Ｈｉｓタグ付きニューロピリン－１のｂ１ｂ２ドメイン（ＮＲＰ－１ ＷＴ）及び三重変異体ＮＳ３４６Ａ－Ｅ３４８Ａ－Ｔ３４９Ａニューロピリン－１のｂ１ｂ２ドメイン（ＮＲＰ－１変異体）を、以前に記載されたように（Ｔｅｅｓａｌｕら、２００９、ＰＮＡＳ １０６：１６１５７－１６１６２）Ｓａｎｆｏｒｄ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｐｒｅｂｙｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（サンフォード・バーナム・プレビス・メディカル・ディスカバリー・インスティテュート）（ラホヤ、カリフォルニア州）のＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（タンパク質産生及び分析施設）で発現し、精製した。アミン反応性ＦＡＭ色素（ＤＭＳＯで最終濃度０．２％に希釈したもの）とタンパク質を１：１０の比率で混合することにより、組換えタンパク質ＮＲＰ１ ＷＴ、ＮＲＰ１変異体及びＤＣＮ－ｔＣＲＫを、ＦＡＭ（５－（及び－６）－カルボキシフルオレセイン、＃９００２４、Ｂｉｏｔｉｕｍ（バイオチウム）、カリフォルニア州、米国）標識した。混合反応物を室温で暗所で２時間インキュベートし、続いてＰＢＳで限外濾過／透析して、タンパク質から遊離色素を分離した。ブロッキング溶液中の１００μｌのＦＡＭで標識したＮＲＰ１ ＷＴ又はＮＲＰ１変異タンパク質を各ウェルに添加し（２０μｇ／ウェル）、室温で４～６時間又は４℃で一晩インキュベートし、ブロッキング溶液で３回洗浄した。各ウェルに１００μｌのＰＢＳを添加した後、プレートを蛍光リーダー（Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ ＩＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（モレキュラーデバイス）、ピーク励起＝４８５ｎｍ、ピーク発光＝５３０ｎｍ、カットオフ＝５１５）を使用してトップリードモードで直ちに読み取った。
【0086】
ＦＡＭ－ＤＣＮ－ｔＣＲＫをＮＲＰ－１陽性前立腺癌３（ＰＣ－３）細胞（Ｓａｎｆｏｒｄ－Ｂｕｒｎｈａｍ－Ｐｒｅｂｙｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ラホヤ、カリフォルニア州）のＲｕｏｓｌａｈｔｉ研究室から贈与された）及び陰性黒色腫（Ｍ２１）細胞（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（カリフォルニア大学サンディエゴ校）、ラホヤ、カリフォルニア州）のＤａｖｉｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ研究室から贈与された）にインビトロで結合するために、まず、ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ高グルコース培地中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）からなる増殖培地で上記細胞を培養した。実験のために、培地を吸引し、細胞を温かい培地で２回洗浄し、１０μｇのＦＡＭで標識されたＤＣＮ－ｔＣＲＫ組換えタンパク質とともに新鮮な培地を添加した。製造元のプロトコルに従って、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋフルオレセインキット（Ｅｘｐｅｄｏｎ Ｌｔｄ（エクスペドン）、英国）を使用して、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ組換えタンパク質をフルオレセインに直接的に結合することにより、標識を行った。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、培地を吸引し、細胞を洗浄し、－２０℃のメタノールで固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で３０分間ブロック（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、１％ＦＢＳ、１％ヤギ血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）し、続いて一次抗ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン）、カリフォルニア州、米国、カタログ番号Ａ－８８９）で室温で１時間ブロックした。細胞を洗浄し、二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を添加して室温で暗所で１時間置いた。細胞の核をＤＡＰＩで染色した。カバースリップをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（エレクトロン・マイクロスコピー・サイエンス）、ペンシルベニア州、米国）でスライドガラスに載せて、共焦点顕微鏡（オリンパスＦＶ１２００ＭＰＥ、東京、日本）で画像化し、ＦＶ１０－ＡＳＷ４．２ビューアーで分析した。
【0087】
マウス及び研究承認
ＢＡＬＢ／ｃＪＲｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（ジャンヴィエ・ラボ）、ル・ジュネスト・サン・ティスル（Ｌｅ－Ｇｅｎｅｓｔ－Ｓａｉｎｔ－Ｉｓｌｅ）、フランス）を薬物動態研究に使用した。マウスに標準的な実験用ペレット及び水を自由に摂食させた。Ｂａｌｂ／ｃＪＲｊマウスを使用した全ての動物実験を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｆｉｎｌａｎｄ（フィンランド国立動物実験委員会）によって承認（ＥＳＡＶＩ／６４２２／０４．１０．０７／２０１７）されたプロトコルに従って実行した。
ＢＡＬＢ／ｃＪＲｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（ジャンヴィエ・ラボ）、ル・ジュネスト・サン・ティスル（Ｌｅ－Ｇｅｎｅｓｔ－Ｓａｉｎｔ－Ｉｓｌｅ）、フランス）を薬物動態研究に使用した。マウスに標準的な実験用ペレット及び水を自由に摂食させた。Ｂａｌｂ／ｃＪＲｊマウスを使用した全ての動物実験を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｆｉｎｌａｎｄ（フィンランド国立動物実験委員会）によって承認（ＥＳＡＶＩ／６４２２／０４．１０．０７／２０１７）されたプロトコルに従って実行した。
【0088】
ＤＣＮ－ｔＣＲＫの皮膚ホーミング及び治療機能を研究するために、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）の動物モデル、すなわちｃｏｌ７ａ１－／－ＲＤＥＢマウスを使用した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって決定された遺伝子型を有するＣ５７ＢＬ６／Ｊ ｃｏｌ７ａ１＋／－マウスを繁殖させることにより、ｃｏｌ７ａ１－／－ＲＤＥＢマウスを生成した。Ｔｈｏｍａｓ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（トーマス・ジェファーソン大学）のＪｏｕｎｉ Ｕｉｔｔｏ博士から親切にも提供されたＣ５７ＢＬ６／Ｊ ｃｏｌ７ａ１＋／－マウスを、フレーム外欠失によるｃｏｌ７ａ１遺伝子の標的アブレーションにより開発した。ｃｏｌ７ａ１－／－ ＲＤＥＢを使用した全ての動物試験を、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ（ニューヨーク医科大学）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ＆ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ、動物実験委員会）によって承認されたプロトコルを使用して実施した。
【0089】
組換えタンパク質の薬物動態
組換えタンパク質のＤＣＮ－ｔＣＲＫ又はＤＣＮを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で希釈した。８週齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスを用いてＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びＤＣＮの薬物動態を研究した。５ｍｇ／ｋｇのＤＣＮ－ｔＣＲＫ又はＤＣＮのいずれかをイソフルラン麻酔下で尾静脈に注射した。注射の１５分、３０分、６０分、２時間、４時間及び１６時間後に別個の尾静脈からの血液サンプルを収集した。注射の８時間又は２４時間後に、マウスをメデトミジン－ケタミン麻酔下で殺処分し、鎖骨下静脈から血液サンプルを収集した。このサンプルを１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と混合し、２０００ｇで室温で１０分間遠心分離し、血漿を分析のために保存した。製造元によって提供された指示に従って、Ｈｕｍａｎ Ｄｅｃｏｒｉｎ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（＃ＤＹ１４３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、血漿サンプル中のヒト由来のデコリンの濃度を測定した。注射しなかったマウスからの静脈血サンプルを各プレートに使用して、一次抗体の特異性を確保した。
組換えタンパク質のＤＣＮ－ｔＣＲＫ又はＤＣＮを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で希釈した。８週齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスを用いてＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びＤＣＮの薬物動態を研究した。５ｍｇ／ｋｇのＤＣＮ－ｔＣＲＫ又はＤＣＮのいずれかをイソフルラン麻酔下で尾静脈に注射した。注射の１５分、３０分、６０分、２時間、４時間及び１６時間後に別個の尾静脈からの血液サンプルを収集した。注射の８時間又は２４時間後に、マウスをメデトミジン－ケタミン麻酔下で殺処分し、鎖骨下静脈から血液サンプルを収集した。このサンプルを１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と混合し、２０００ｇで室温で１０分間遠心分離し、血漿を分析のために保存した。製造元によって提供された指示に従って、Ｈｕｍａｎ Ｄｅｃｏｒｉｎ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（＃ＤＹ１４３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、血漿サンプル中のヒト由来のデコリンの濃度を測定した。注射しなかったマウスからの静脈血サンプルを各プレートに使用して、一次抗体の特異性を確保した。
【0090】
ｃｏｌ７ａ１－／－マウスにおけるＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びＤＣＮの投与
妊娠中のｃｏｌ７ａ１＋／－マウスを個別に飼育し、出産まで毎日監視した。新生マウスの静脈内注射が技術的に困難であり、一貫性のない結果を得ることが多いため、本発明者らは、出生後の２４時間以内に初回投与量のＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びＤＣＮ（１５μｌのＰＢＳ中に５μｇであり、約５ｍｇ／ｋｇに対応する）をｃｏｌ７ａ１－／－マウスの肝臓に注射することを選択した。その理由は、肝臓が胎仔マウス及び新生マウスの造血の主要な部位であり、かつヒト細胞が肝内注射後に急速に循環に入ることが示されているからである（Ｌｉａｏら、２０１５、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３３：１８０７－１８１７、Ｌｉａｏら、２０１８、Ｓｔｅｍｌ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ７：５３０－５４２）。この初回投与量に続いて、マウスが１４日齢に達するまで１日おきに上記タンパク質の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を繰り返し（最大７回投与する）、マウスが１週齢になったときに投与量を１０μｇに増加した。マウスを毎日監視した。全ての実験的なｃｏｌ７ａ１－／－マウスの遺伝子型をサンプル収集時に決定した。
妊娠中のｃｏｌ７ａ１＋／－マウスを個別に飼育し、出産まで毎日監視した。新生マウスの静脈内注射が技術的に困難であり、一貫性のない結果を得ることが多いため、本発明者らは、出生後の２４時間以内に初回投与量のＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びＤＣＮ（１５μｌのＰＢＳ中に５μｇであり、約５ｍｇ／ｋｇに対応する）をｃｏｌ７ａ１－／－マウスの肝臓に注射することを選択した。その理由は、肝臓が胎仔マウス及び新生マウスの造血の主要な部位であり、かつヒト細胞が肝内注射後に急速に循環に入ることが示されているからである（Ｌｉａｏら、２０１５、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３３：１８０７－１８１７、Ｌｉａｏら、２０１８、Ｓｔｅｍｌ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ７：５３０－５４２）。この初回投与量に続いて、マウスが１４日齢に達するまで１日おきに上記タンパク質の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を繰り返し（最大７回投与する）、マウスが１週齢になったときに投与量を１０μｇに増加した。マウスを毎日監視した。全ての実験的なｃｏｌ７ａ１－／－マウスの遺伝子型をサンプル収集時に決定した。
【0091】
ｃｏｌ７ａ１－／－マウスにおける組織学的及び免疫組織化学染色並びにｈＤＣＮ定量化
選択したマウスの背部皮膚及び足（前足及び後足）を切除し、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｃ ＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ（サクラ・ファインテック）、トーランス（Ｔｏｒｒａｎｃｅ）、カリフォルニア州）に埋め込み、－８０℃の冷凍庫で保存した。各試験片について、６μｍの連続切片を切り出した。ピクロシリウスレッド染色及びＣＴＧＦ（＃ａｂ６９９２、Ａｂｃａｍ（アブカム）、ケンブリッジ、英国）免疫組織化学染色を、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｏｌｌｅｇｅのＣｏｒｅ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｌａｂ（コア組織学研究室）で実行した。Ｈｉｓタグの免疫化学染色のために、切片を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｍ．Ｏ．Ｍ．ブロッキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ベクター・ラボラトリーズ）、バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）、カリフォルニア州）（マウスで産生された抗体用）、又は０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）を含む１０％ウマ血清（ＧＩＢＣＯ、グランドアイランド、ニューヨーク州）でブロックした。次に、スライドを、それぞれ、抗Ｃｏｌ１Ａ（＃Ｒ１０３８、Ａｃｒｉｓ（アクリス）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州）、抗αＳＭＡ（＃１４９６８、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダンバース（Ｄａｎｖｅｒｓ）、マサチューセッツ州）、抗６ｘ－Ｈｉｓタグ（＃Ｒ９３０－２５、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州）及び抗ＮＲＰ－１（＃ＡＦ５６６－ＳＰ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を含む一次抗体、続いて対応するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）でインキュベートした。そして、スライドを、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤で封入した。Ｎｉｋｏｎ ９０ｉ Ｅｃｌｉｐｓｅ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．（ニコン・インスツルメント）、ニューヨーク州）を使用して、各組の実験の異なる群間で同じ設定で画像を取得した。ユーザーガイドに従って、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェアを使用して、フィールドごとの免疫染色の強度を測定した。ＲＧＢ画像をピクロシリウスレッド染色の定量化に使用し、画像内の基準点を選択することにより閾値を定義した。
選択したマウスの背部皮膚及び足（前足及び後足）を切除し、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｃ ＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ（サクラ・ファインテック）、トーランス（Ｔｏｒｒａｎｃｅ）、カリフォルニア州）に埋め込み、－８０℃の冷凍庫で保存した。各試験片について、６μｍの連続切片を切り出した。ピクロシリウスレッド染色及びＣＴＧＦ（＃ａｂ６９９２、Ａｂｃａｍ（アブカム）、ケンブリッジ、英国）免疫組織化学染色を、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｏｌｌｅｇｅのＣｏｒｅ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｌａｂ（コア組織学研究室）で実行した。Ｈｉｓタグの免疫化学染色のために、切片を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｍ．Ｏ．Ｍ．ブロッキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ベクター・ラボラトリーズ）、バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）、カリフォルニア州）（マウスで産生された抗体用）、又は０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）を含む１０％ウマ血清（ＧＩＢＣＯ、グランドアイランド、ニューヨーク州）でブロックした。次に、スライドを、それぞれ、抗Ｃｏｌ１Ａ（＃Ｒ１０３８、Ａｃｒｉｓ（アクリス）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州）、抗αＳＭＡ（＃１４９６８、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダンバース（Ｄａｎｖｅｒｓ）、マサチューセッツ州）、抗６ｘ－Ｈｉｓタグ（＃Ｒ９３０－２５、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州）及び抗ＮＲＰ－１（＃ＡＦ５６６－ＳＰ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を含む一次抗体、続いて対応するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）でインキュベートした。そして、スライドを、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤で封入した。Ｎｉｋｏｎ ９０ｉ Ｅｃｌｉｐｓｅ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．（ニコン・インスツルメント）、ニューヨーク州）を使用して、各組の実験の異なる群間で同じ設定で画像を取得した。ユーザーガイドに従って、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェアを使用して、フィールドごとの免疫染色の強度を測定した。ＲＧＢ画像をピクロシリウスレッド染色の定量化に使用し、画像内の基準点を選択することにより閾値を定義した。
【0092】
製造元の推奨に従って、ヒトデコリンＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（＃ＤＹ１４３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を使用して、ｃｏｌ７ａ１－／－マウスの皮膚へのＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びＤＣＮのホーミングを測定した。組織生検材料を液体窒素で瞬間凍結し、予冷した乳棒で粉砕し、溶解緩衝液（ＰＢＳ中の１％Ｔｗｅｅｎ２０、プロテアーゼ阻害剤カクテル、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ）で均質化した。１２０００ｇで４℃で１０分間遠心分離した後、上清を収集し、Ｂｉｏ Ｒａｄ ＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ、ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅ）、カリフォルニア州）を用いて総タンパク質濃度を定量化した。ＤＣＮ－ｔＣＲＫ又はＤＣＮが投与された場合及び投与されない場合のｃｏｌ７ａ１－／－マウスからの血清を、アッセイに適用する前にサンプル希釈剤で１：２０に希釈した。
【0093】
ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲによる創傷治癒経路の分析
ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン、ドイツ）を使用してマウスの創傷治癒経路に関与する遺伝子の発現を研究した。ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｒｒａｙは、９６ウェルプレートに８４個の創傷治癒遺伝子、５つのハウスキーピング遺伝子、ゲノムＤＮＡ、逆転写対照及びＰＣＲ陽性対照のプライマーを含む。７日目に、ＷＴマウス、ＲＤＥＢマウス、及びＤＣＮ又はＤＣＮ－ｔＣＲＫを注射したｃｏｌ７ａ１－／－マウス（各群に３匹）の前足全体から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの品質及び濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ ２００Ｃ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）で測定した。ＲＮＡをゲノムＤＮＡ除去ミックス（ＱＩＡＧＥＮ）で処理した。ＲＴ２ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、各サンプルの５００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写に適用した。ｃＤＮＡ合成反応物を２ｘ ＲＴ２ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒミックスと混合し、２５μｌの該カクテルを９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。Ｑ－ＰＣＲをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アプライドバイオシステムズ）、フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州）で実行した。ＣＴ値をＥｘｃｅｌファイルにエクスポートした。ＧｅｎｅＧｌｏｂｅ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｇｅｎｅｇｌｏｂｅ）にあるＰＣＲ Ａｒｒａｙ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（ＰＣＲ配列データ分析テンプレート）を使用して、得られた生データを分析した。ΔΔＣＴ法で遺伝子発現を計算した。倍数変化遺伝子発現値の閾値１．５及びｐ値の閾値０．０５を使用して、ＷＴ仔マウスと未治療の仔マウス／治療した仔マウスとの間のデータを分析した。
ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン、ドイツ）を使用してマウスの創傷治癒経路に関与する遺伝子の発現を研究した。ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｒｒａｙは、９６ウェルプレートに８４個の創傷治癒遺伝子、５つのハウスキーピング遺伝子、ゲノムＤＮＡ、逆転写対照及びＰＣＲ陽性対照のプライマーを含む。７日目に、ＷＴマウス、ＲＤＥＢマウス、及びＤＣＮ又はＤＣＮ－ｔＣＲＫを注射したｃｏｌ７ａ１－／－マウス（各群に３匹）の前足全体から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの品質及び濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ ２００Ｃ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）で測定した。ＲＮＡをゲノムＤＮＡ除去ミックス（ＱＩＡＧＥＮ）で処理した。ＲＴ２ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、各サンプルの５００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写に適用した。ｃＤＮＡ合成反応物を２ｘ ＲＴ２ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒミックスと混合し、２５μｌの該カクテルを９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。Ｑ－ＰＣＲをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アプライドバイオシステムズ）、フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州）で実行した。ＣＴ値をＥｘｃｅｌファイルにエクスポートした。ＧｅｎｅＧｌｏｂｅ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｇｅｎｅｇｌｏｂｅ）にあるＰＣＲ Ａｒｒａｙ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（ＰＣＲ配列データ分析テンプレート）を使用して、得られた生データを分析した。ΔΔＣＴ法で遺伝子発現を計算した。倍数変化遺伝子発現値の閾値１．５及びｐ値の閾値０．０５を使用して、ＷＴ仔マウスと未治療の仔マウス／治療した仔マウスとの間のデータを分析した。
【0094】
コラーゲン格子収縮アッセイ
ヒト正常線維芽細胞及びＲＤＥＢ患者由来の線維芽細胞を、以前に記載されたように（Ｌｉａｏら、２０１８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３６：１８３９－１８５０）、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで培養した。細胞懸濁液を中和されたラット尾部Ｉ型コラーゲン（Ａｄｖａｎｃｅ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ（アドバンス・バイオマトリックス）、カールスバッド、カリフォルニア州）と混合することにより、コラーゲン格子を作った。コラーゲンの最終濃度を２．４ｍｇ／ｍｌとし、細胞密度を２．１×１０５個細胞／ｍｌとした。５００μｌの細胞／コラーゲン懸濁液を２４ウェルプレートの単一ウェルに分注し、室温で３０分間固化させた。コラーゲン重合後、５％ＦＢＳを補充した０．５ｍｌのＤＭＥＭを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で、５％ＣＯ２で培養した。１２時間のインキュベーション後、各ウェルからのゲルを細いピペットチップにより穏やかに放出し、最終濃度が７５μＭになるようにＤＣＮ又はＤＣＮ－ＣＲＫをそれぞれ添加した（条件当たりｎ＝３）。それぞれ１２時間（初期領域）及び４８時間（収縮領域）で画像を取得し、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用してゲルの領域を定量化した。
ヒト正常線維芽細胞及びＲＤＥＢ患者由来の線維芽細胞を、以前に記載されたように（Ｌｉａｏら、２０１８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３６：１８３９－１８５０）、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで培養した。細胞懸濁液を中和されたラット尾部Ｉ型コラーゲン（Ａｄｖａｎｃｅ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ（アドバンス・バイオマトリックス）、カールスバッド、カリフォルニア州）と混合することにより、コラーゲン格子を作った。コラーゲンの最終濃度を２．４ｍｇ／ｍｌとし、細胞密度を２．１×１０５個細胞／ｍｌとした。５００μｌの細胞／コラーゲン懸濁液を２４ウェルプレートの単一ウェルに分注し、室温で３０分間固化させた。コラーゲン重合後、５％ＦＢＳを補充した０．５ｍｌのＤＭＥＭを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で、５％ＣＯ２で培養した。１２時間のインキュベーション後、各ウェルからのゲルを細いピペットチップにより穏やかに放出し、最終濃度が７５μＭになるようにＤＣＮ又はＤＣＮ－ＣＲＫをそれぞれ添加した（条件当たりｎ＝３）。それぞれ１２時間（初期領域）及び４８時間（収縮領域）で画像を取得し、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用してゲルの領域を定量化した。
【0095】
統計
カプラン・マイヤー分析を用いてメジアン生存期間を測定し、ログランク（マンテル－コックス（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ））検定を使用して異なる実験群間の生存率を比較した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６）。スチューデントの対応のないｔ検定を使用して、ＤＣＮ－ｔＣＲＫのＮＲＰ－１への結合を研究した。０．０５未満のｐ値を有意であると考えた。
カプラン・マイヤー分析を用いてメジアン生存期間を測定し、ログランク（マンテル－コックス（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ））検定を使用して異なる実験群間の生存率を比較した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６）。スチューデントの対応のないｔ検定を使用して、ＤＣＮ－ｔＣＲＫのＮＲＰ－１への結合を研究した。０．０５未満のｐ値を有意であると考えた。
【0096】
結果
多機能組換えＤＣＮ－ｔＣＲＫ融合タンパク質の生成
本発明者らは、ＤＣＮのＣ末端にｔＣＲＫペプチドを配置することにより、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ融合タンパク質を操作した（図１Ａ）。ＤＣＮ－ｔＣＲＫと天然のＤＣＮの両方を哺乳類細胞に発現し、クロマトグラフィーを使用して精製した（図２Ａ）。両方の組換えタンパク質は、ＳＤＳゲル電気泳動で約５５ｋＤａの鋭いバンドとして泳動し、該バンドの上にスミアがあり、ウェスタンブロット分析によりＤＣＮとして検出された（図２Ｂ）。この鋭いバンドは、コアタンパク質に対応し、スミアは、ＤＣＮコアに結合したグリコサミノグリカン硫酸鎖（主にコンドロイチン）の不均一性により引き起こされる。質量分析計により、ＤＣＮとＣ末端のｔＣＲＫ配列の同一性を確認した（表１）。流体力学サイズは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫが、報告されたＤＣＮの二量体（Ｓｃｏｔｔら、２００３年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：１８３５３）と一致する直径を有する、均一で凝集しない高分子として存在することを示す（図２Ｃ）。示差走査熱量測定では、融解温度（Ｔｍ）４９℃で鋭いピークが生成され、これは、ｔＣＲＫ－ＤＣＮが生理学的条件で安定した三次構造を維持することを示唆する（図２Ｄ）。
多機能組換えＤＣＮ－ｔＣＲＫ融合タンパク質の生成
本発明者らは、ＤＣＮのＣ末端にｔＣＲＫペプチドを配置することにより、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ融合タンパク質を操作した（図１Ａ）。ＤＣＮ－ｔＣＲＫと天然のＤＣＮの両方を哺乳類細胞に発現し、クロマトグラフィーを使用して精製した（図２Ａ）。両方の組換えタンパク質は、ＳＤＳゲル電気泳動で約５５ｋＤａの鋭いバンドとして泳動し、該バンドの上にスミアがあり、ウェスタンブロット分析によりＤＣＮとして検出された（図２Ｂ）。この鋭いバンドは、コアタンパク質に対応し、スミアは、ＤＣＮコアに結合したグリコサミノグリカン硫酸鎖（主にコンドロイチン）の不均一性により引き起こされる。質量分析計により、ＤＣＮとＣ末端のｔＣＲＫ配列の同一性を確認した（表１）。流体力学サイズは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫが、報告されたＤＣＮの二量体（Ｓｃｏｔｔら、２００３年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：１８３５３）と一致する直径を有する、均一で凝集しない高分子として存在することを示す（図２Ｃ）。示差走査熱量測定では、融解温度（Ｔｍ）４９℃で鋭いピークが生成され、これは、ｔＣＲＫ－ＤＣＮが生理学的条件で安定した三次構造を維持することを示唆する（図２Ｄ）。
【0097】
【表1】
【0098】
ＤＣＮ－ｔＣＲＫはＮＲＰ－１とインビトロで相互作用する
次に、本発明者らは、ＤＣＮに融合したｔＣＲＫペプチドがＮＲＰ－１と相互作用する能力を保持するか否かを研究した。ＤＣＮ－ｔＣＲＫをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、野生型（ＷＴ）、又はＣｅｎｄＲ結合ポケットが三重変異により無効になった変異体ＮＲＰ－１（Ｔｅｅｓａｌｕら、２００９、ＰＮＡＳ １０６：１６１５７－１６１６２）への結合をテストした。ＤＣＮ－ｔＣＲＫは、対照のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）よりも有意に高いレベルでＷＴ ＮＲＰ－１に効果的に結合する（ｐ＜０．０１）のに対して、変異体ＮＲＰ－１への有意な結合は見られなかった（ｐ＞０．０５）（図１Ｂ）。更に、合成ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２５）ペプチドと、原型ＣｅｎｄＲペプチドと、ＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号２６）と、Ｃ末端キャップしたＣｅｎｄＲ配列を有し、ＮＲＰ－１と相互作用できない対照ペプチドとを用いた並行研究を使用して、結合がＣｅｎｄＲ配列に依存することを補強した（図１Ｂ）。更に、本発明者らは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫがＮＲＰー１を発現する細胞、すなわちヒトＰＣ３前立腺癌細胞に結合するか否かを判定した。ＮＲＰ－１を発現しないＭ２１黒色腫細胞もこのアッセイに含まれた。ＤＣＮ－ｔＣＲＫの内在化がＮＲＰ－１陽性ＰＣ３細胞でのみ見られ、ＮＲＰ－１陰性Ｍ２１細胞で見られず（図１Ｃ）、これは、ＮＲＰ－１依存性細胞結合及び貫通特性を裏付ける。
次に、本発明者らは、ＤＣＮに融合したｔＣＲＫペプチドがＮＲＰ－１と相互作用する能力を保持するか否かを研究した。ＤＣＮ－ｔＣＲＫをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、野生型（ＷＴ）、又はＣｅｎｄＲ結合ポケットが三重変異により無効になった変異体ＮＲＰ－１（Ｔｅｅｓａｌｕら、２００９、ＰＮＡＳ １０６：１６１５７－１６１６２）への結合をテストした。ＤＣＮ－ｔＣＲＫは、対照のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）よりも有意に高いレベルでＷＴ ＮＲＰ－１に効果的に結合する（ｐ＜０．０１）のに対して、変異体ＮＲＰ－１への有意な結合は見られなかった（ｐ＞０．０５）（図１Ｂ）。更に、合成ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２５）ペプチドと、原型ＣｅｎｄＲペプチドと、ＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号２６）と、Ｃ末端キャップしたＣｅｎｄＲ配列を有し、ＮＲＰ－１と相互作用できない対照ペプチドとを用いた並行研究を使用して、結合がＣｅｎｄＲ配列に依存することを補強した（図１Ｂ）。更に、本発明者らは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫがＮＲＰー１を発現する細胞、すなわちヒトＰＣ３前立腺癌細胞に結合するか否かを判定した。ＮＲＰ－１を発現しないＭ２１黒色腫細胞もこのアッセイに含まれた。ＤＣＮ－ｔＣＲＫの内在化がＮＲＰ－１陽性ＰＣ３細胞でのみ見られ、ＮＲＰ－１陰性Ｍ２１細胞で見られず（図１Ｃ）、これは、ＮＲＰ－１依存性細胞結合及び貫通特性を裏付ける。
【0099】
ＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びＤＣＮは同様のインビボ薬物動態を呈した
ｔＣＲＫペプチドの添加がＤＣＮの循環半減期に影響を与えたかどうかを判定するために、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びＤＣＮを健康なＢａｌｂ／ｃマウスに並行して静脈内注射し、投与後の２４時間（ｈ）内の異なる時間点での末梢血中のＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びＤＣＮの量をＥＬＩＳＡで定量化した。ＤＣＮ－ｔＣＲＫの血中半減期は、３０分であり、ＤＣＮの血中半減期と有意には異なるものではなかった（図３）。この薬物動態研究は、小さな血管ホーミングペプチドによるＤＣＮの修飾がＤＣＮの薬物動態に影響を与えないことを示唆する。
ｔＣＲＫペプチドの添加がＤＣＮの循環半減期に影響を与えたかどうかを判定するために、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びＤＣＮを健康なＢａｌｂ／ｃマウスに並行して静脈内注射し、投与後の２４時間（ｈ）内の異なる時間点での末梢血中のＤＣＮ－ｔＣＲＫ及びＤＣＮの量をＥＬＩＳＡで定量化した。ＤＣＮ－ｔＣＲＫの血中半減期は、３０分であり、ＤＣＮの血中半減期と有意には異なるものではなかった（図３）。この薬物動態研究は、小さな血管ホーミングペプチドによるＤＣＮの修飾がＤＣＮの薬物動態に影響を与えないことを示唆する。
【0100】
ＤＣＮ－ｔＣＲＫ投与はｃｏｌ７ａ１－／－マウスの生存率を向上させる
ＤＣＮ及びＤＣＮ－ｔＣＲＫの治療機能と皮膚ホーミング特性をＲＤＥＢの動物モデルであるｃｏｌ７ａ１－／－マウスで評価した。これらのマウスは、ヘテロ接合同腹の子の繁殖により生成され、ｃｏｌ７ａ１－／－マウスは、皮膚の出血性水疱の症状に基づいて出生時に識別することができる。新生ｃｏｌ７ａ１－／－マウスをランダムに分けて、ＤＣＮ、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ又はＰＢＳ（陰性対照）の肝内投与を与えた。初回投与後、１４日目まで各群の生存マウスに１日おきに腹腔内投与を繰り返し実行した。ｃｏｌ７ａ１－／－マウスのメジアン生存期間は、ＰＢＳ注射後に２日間であり、ＤＣＮ投与後に７日間まで有意に延長された（ｐ＜０．０００１）（図４Ａ）。しかしながら、ＤＣＮ投与後のｃｏｌ７ａ１－／－マウスの生存率は、デキストラン／ヒト血清アルブミン（Ｄ／ＨＳＡ）の過去の投与と比較して、統計的に有意ではなかった。このデキストラン／ヒト血清アルブミン（Ｄ／ＨＳＡ）は、幹細胞投与のビヒクルとして使用され、おそらく体液平衡を調整することにより、一部のｃｏｌ７ａ１－／－被投与マウスの生存率を散発的に向上させた（図５）。更に、ＤＣＮ注射は、生後２週間を超えた被投与マウスの生存を延長させなかった。重要なことに、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ治療を受けた後のマウスのメジアン生存期間は、更に１１日間に延長し、ＰＢＳ投与（ｐ＜０．０００１）又は過去のＤ／ＨＳＡ投与（ｐ＜０．００１）後のメジアン生存期間よりも有意に優れた（図４Ａ及び図５）。更に、ＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療したマウスの８５％は、７日間生存し、これらのマウスの２０％は、生後３週間を超えて生存し、その後に皮膚分析のために殺処分された。
ＤＣＮ及びＤＣＮ－ｔＣＲＫの治療機能と皮膚ホーミング特性をＲＤＥＢの動物モデルであるｃｏｌ７ａ１－／－マウスで評価した。これらのマウスは、ヘテロ接合同腹の子の繁殖により生成され、ｃｏｌ７ａ１－／－マウスは、皮膚の出血性水疱の症状に基づいて出生時に識別することができる。新生ｃｏｌ７ａ１－／－マウスをランダムに分けて、ＤＣＮ、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ又はＰＢＳ（陰性対照）の肝内投与を与えた。初回投与後、１４日目まで各群の生存マウスに１日おきに腹腔内投与を繰り返し実行した。ｃｏｌ７ａ１－／－マウスのメジアン生存期間は、ＰＢＳ注射後に２日間であり、ＤＣＮ投与後に７日間まで有意に延長された（ｐ＜０．０００１）（図４Ａ）。しかしながら、ＤＣＮ投与後のｃｏｌ７ａ１－／－マウスの生存率は、デキストラン／ヒト血清アルブミン（Ｄ／ＨＳＡ）の過去の投与と比較して、統計的に有意ではなかった。このデキストラン／ヒト血清アルブミン（Ｄ／ＨＳＡ）は、幹細胞投与のビヒクルとして使用され、おそらく体液平衡を調整することにより、一部のｃｏｌ７ａ１－／－被投与マウスの生存率を散発的に向上させた（図５）。更に、ＤＣＮ注射は、生後２週間を超えた被投与マウスの生存を延長させなかった。重要なことに、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ治療を受けた後のマウスのメジアン生存期間は、更に１１日間に延長し、ＰＢＳ投与（ｐ＜０．０００１）又は過去のＤ／ＨＳＡ投与（ｐ＜０．００１）後のメジアン生存期間よりも有意に優れた（図４Ａ及び図５）。更に、ＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療したマウスの８５％は、７日間生存し、これらのマウスの２０％は、生後３週間を超えて生存し、その後に皮膚分析のために殺処分された。
【0101】
ＤＣＮ－ｔＣＲＫはｃｏｌ７ａ１－／－マウスの皮膚へホーミングする
ＥＬＩＳＡアッセイを利用して、被投与ＲＤＥＢマウスの皮膚におけるヒトＤＣＮ及びＤＣＮ－ｔＣＲＫを１週間（ｗｋ）、２週間及び３週間で定量化した（ｎ＝３、全ての時間点）（図４Ｂ）。１週間の時点で、ＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療した皮膚とＤＣＮで治療した皮膚との間に統計的に有意な差がなかった。しかしながら、２週間の時点で、ＤＣＮ－ｔＣＲＫのレベルは、ＤＣＮのレベルよりも有意に高かった（３．６倍、ｐ＜０．０５）（図４Ｂ）。更に、１４日目に最後回のＤＣＮ－ｔＣＲＫのｉ．ｐ．投与を行った場合、３週間の時点での皮膚におけるＤＣＮ－ｔＣＲＫの同定（１９．４７±１２．８０ｐｇ／ｍｌ）は、インビボで少なくとも７日間安定していることを強く示唆する。
ＥＬＩＳＡアッセイを利用して、被投与ＲＤＥＢマウスの皮膚におけるヒトＤＣＮ及びＤＣＮ－ｔＣＲＫを１週間（ｗｋ）、２週間及び３週間で定量化した（ｎ＝３、全ての時間点）（図４Ｂ）。１週間の時点で、ＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療した皮膚とＤＣＮで治療した皮膚との間に統計的に有意な差がなかった。しかしながら、２週間の時点で、ＤＣＮ－ｔＣＲＫのレベルは、ＤＣＮのレベルよりも有意に高かった（３．６倍、ｐ＜０．０５）（図４Ｂ）。更に、１４日目に最後回のＤＣＮ－ｔＣＲＫのｉ．ｐ．投与を行った場合、３週間の時点での皮膚におけるＤＣＮ－ｔＣＲＫの同定（１９．４７±１２．８０ｐｇ／ｍｌ）は、インビボで少なくとも７日間安定していることを強く示唆する。
【0102】
また、ＲＤＥＢ皮膚におけるＤＣＮ－ｔＣＲＫ又はＤＣＮの解剖学的分布を分析するために、ヒスチジンタグの発現に基づく免疫組織化学染色を実行した。ＤＣＮ－ｔＣＲＫは、１週間、２週間、３週間でＲＤＥＢマウスの足と背部の皮膚の両方の真皮に検出された（図４Ｃ）。更に、被投与ＲＤＥＢマウスの消化管（ＧＩ）の染色は、抗ｈｉｓ抗体との反応性を示さず（データが示さず）、ＤＣＮ－ｔＣＲＫが皮膚を特異的に標的とすることを示唆する。対照的に、ＥＬＩＳＡは、皮膚溶解物におけるＤＣＮの存在を示しているが、１週間の時点で表される、ＤＣＮで治療したＲＤＥＢ皮膚の抗ｈｉｓ免疫染色は、非特異的（広範性）であるようにしか見えなかった（図４Ｃ）。抗ｈｉｓ及び抗ＮＲＰ－１二重染色は、ＤＣＮ－ｔＣＲＫからのシグナルがＲＤＥＢ皮膚におけるＮＲＰ－１陽性の細胞内又はその近くにあることを示し（図４Ｄ）、これは、ＤＣＮ－ｔＣＲＫのホーミングがＮＲＰ－１依存性細胞及び組織貫通によるものであるという本発明者らの非限定的仮説を更に裏付ける。
【0103】
ＤＣＮ－ｔＣＲＫ治療はＲＤＥＢマウスにおける線維化反応を抑制する
本発明者による最近の研究によれば、ｃｏｌ７ａ１－／－マウスにおいて早くも生後１週間に足の趾間ひだで始まるＴＧＦβシグナル伝達の有意な上昇が示されている。したがって、この試験では、ＷＴ皮膚とビヒクル（Ｄ／ＨＳＡ）、ＤＣＮ又はＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療したＲＤＥＢ皮膚との間の創傷治癒反応及び線維症形成の中心となる８４個の遺伝子の発現を比較するために、この時点の皮膚生検材料を選択した（群当たりｎ＝３）。（表２）。図６Ａのクラスターグラムに示すように、ＷＴに対して、ビヒクルが注入されたＲＤＥＢ皮膚における半分以上の遺伝子が＞１．５倍の発現増加を示した。また、遺伝子発現の相対的倍数変化（ｌｏｇ２）とｐ値（－ｌｏｇ１０）は、ボルケーノプロットとして示され、有意に（ｐ＜０．０５）調節不全の遺伝子は、各プロットで白色でマークされる（図６Ｂ）。ビヒクルＲＤＥＢ皮膚で有意にアップレギュレートされた遺伝子は、ＴＧＦβシグナル伝達（すなわち、Ｔｇｆｂ１、Ｔｇｆｂｒ３、Ｃｔｇｆ）、ＷＮＴシグナル伝達（Ｃｔｎｎｂ１）、ＭＡＰＫ１／ＭＡＰＫ３シグナル伝達（Ｍａｐｋ３）、上皮成長因子受容体シグナル伝達（Ｅｇｆｒ）、ＥＣＭリモデリング（Ｃｔｓｇ、Ｐｌａｕｒ）、細胞接着（Ｉｔｇｂ３、Ｉｔｇｂ５）及び炎症（Ｉｌ４、Ｃｘｃｌ３、Ｔｎｆα）に関与する。ＷＴと比較して、ビヒクルＲＤＥＢ皮膚で有意にダウンレギュレートされた遺伝子はなかった。ＤＣＮで治療したＲＤＥＢマウスの皮膚において、全体的な遺伝子発現プロファイルは、ビヒクルＲＤＥＢ皮膚の場合に類似した（図６Ｂ）。ＤＣＮで治療したＲＤＥＢ皮膚において、Ｔｇｆｂ１の発現がもはや有意に異常ではなかったが、Ｔｇｆｂｒ３及びＣｔｇｆの発現は、依然として有意にアップレギュレートされた。Ｉｌ４、Ｃｘｃｌ３、Ｔｎｆαなどのいくつかの遺伝子は、ＤＣＮで治療したＲＤＥＢ皮膚において、ビヒクル対照よりも有意にアップレギュレートされた（図６Ｂ及び表２）。
本発明者による最近の研究によれば、ｃｏｌ７ａ１－／－マウスにおいて早くも生後１週間に足の趾間ひだで始まるＴＧＦβシグナル伝達の有意な上昇が示されている。したがって、この試験では、ＷＴ皮膚とビヒクル（Ｄ／ＨＳＡ）、ＤＣＮ又はＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療したＲＤＥＢ皮膚との間の創傷治癒反応及び線維症形成の中心となる８４個の遺伝子の発現を比較するために、この時点の皮膚生検材料を選択した（群当たりｎ＝３）。（表２）。図６Ａのクラスターグラムに示すように、ＷＴに対して、ビヒクルが注入されたＲＤＥＢ皮膚における半分以上の遺伝子が＞１．５倍の発現増加を示した。また、遺伝子発現の相対的倍数変化（ｌｏｇ２）とｐ値（－ｌｏｇ１０）は、ボルケーノプロットとして示され、有意に（ｐ＜０．０５）調節不全の遺伝子は、各プロットで白色でマークされる（図６Ｂ）。ビヒクルＲＤＥＢ皮膚で有意にアップレギュレートされた遺伝子は、ＴＧＦβシグナル伝達（すなわち、Ｔｇｆｂ１、Ｔｇｆｂｒ３、Ｃｔｇｆ）、ＷＮＴシグナル伝達（Ｃｔｎｎｂ１）、ＭＡＰＫ１／ＭＡＰＫ３シグナル伝達（Ｍａｐｋ３）、上皮成長因子受容体シグナル伝達（Ｅｇｆｒ）、ＥＣＭリモデリング（Ｃｔｓｇ、Ｐｌａｕｒ）、細胞接着（Ｉｔｇｂ３、Ｉｔｇｂ５）及び炎症（Ｉｌ４、Ｃｘｃｌ３、Ｔｎｆα）に関与する。ＷＴと比較して、ビヒクルＲＤＥＢ皮膚で有意にダウンレギュレートされた遺伝子はなかった。ＤＣＮで治療したＲＤＥＢマウスの皮膚において、全体的な遺伝子発現プロファイルは、ビヒクルＲＤＥＢ皮膚の場合に類似した（図６Ｂ）。ＤＣＮで治療したＲＤＥＢ皮膚において、Ｔｇｆｂ１の発現がもはや有意に異常ではなかったが、Ｔｇｆｂｒ３及びＣｔｇｆの発現は、依然として有意にアップレギュレートされた。Ｉｌ４、Ｃｘｃｌ３、Ｔｎｆαなどのいくつかの遺伝子は、ＤＣＮで治療したＲＤＥＢ皮膚において、ビヒクル対照よりも有意にアップレギュレートされた（図６Ｂ及び表２）。
【0104】
重要なことに、ＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療したＲＤＥＢ皮膚における発現プロファイルは、ビヒクル及びＤＣＮで治療したＲＤＥＢ皮膚における発現プロファイルとは著しく異なり、ＷＴ皮膚における発現プロファイルに似ていた（図６Ａ）。いくつかの遺伝子の発現は、個体差を示したが、アレイ中の全ての遺伝子は、ＷＴと比較して、ＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療したＲＤＥＢ皮膚において有意にアップレギュレートされなかった（図６及び表２）。
【0105】
【表2(1)】
【表2(2)】
【表2(3)】
【0106】
ビヒクルを注射したＲＤＥＢ皮膚においてＣＴＧＦ／ＣＣＮ２の強い発現が見られ、ＤＣＮ－ｔＣＲＫによる治療後にその発現レベルが著しく減少し（図７Ａ）、これは、未治療のＲＤＥＢ皮膚におけるＴＧＦβ１媒介性線維化の発症とＤＣＮ－ｔＣＲＫ治療によるその抑制を裏付ける。更に、ピクロシリウスレッド染色により示されるように、ビヒクルを注射したＲＤＥＢ皮膚において全体的なコラーゲン沈着が時間とともに増加したが、ＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療したマウスの皮膚において有意に減少した（図７Ｂ及び図７Ｃ）。免疫染色は、２週間（ｗ）の時点で、ビヒクルで治療した皮膚においてＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１）の発現が大幅に増加し、ＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療した皮膚において発現が減少することを示した（図７Ｄ及び図７Ｅ）。筋線維芽細胞、すなわちα－平滑筋アクチン（αＳＭＡ、図７Ｄ及び図７Ｅ）の免疫染色でも同様の結果が得られた。更に、ＷＴ及びＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療したＲＤＥＢ皮膚におけるαＳＭＡ＋細胞のほとんどは、血管と共局在し（ＣＤ３１染色）、これは、それらの血管平滑筋細胞及び周皮細胞との同一性を示すのに対して、ビヒクルで治療したＲＤＥＢ皮膚におけるαＳＭＡ＋細胞は、血管の外側にあり、すなわち、筋線維芽細胞であることを示した（図７Ｄ）。
【0107】
ＤＣＮ－ｔＣＲＫの抗線維化機能を直接的に示すために、インビトロでのコラーゲンゲル収縮に対するＤＣＮの抑制能力とＤＣＮ－ｔＣＲＫの抑制能力とを、正常線維芽細胞とＲＤＥＢ由来の線維芽細胞の両方を使用して比較した。ＤＣＮがコラーゲン収縮に有意な影響を与えない低濃度（７５μＭ）で、ＤＣＮ－ｔＣＲＫは、正常線維芽細胞（ｐ＜０．０５）及びＲＤＥＢ由来の線維芽細胞（ｐ＜０．０１）の両方においてコラーゲンゲル収縮を抑制した（図８）。
【0108】
考察
本明細書では、創傷ホーミングペプチドにおけるＣｅｎｄＲ配列のＣ末端露出により、正常皮膚及び創傷皮膚におけるそのペプチドの新規な組織貫通機能を表現することが示される。ＤＣＮへのｔＣＲＫペプチドの結合（複合化）は、ＲＤＥＢのマウスモデルの抗線維化効果を発揮し、かつ生存率を向上させる治療的融合タンパク質が皮膚に選択的に標的されることを容易にする。
本明細書では、創傷ホーミングペプチドにおけるＣｅｎｄＲ配列のＣ末端露出により、正常皮膚及び創傷皮膚におけるそのペプチドの新規な組織貫通機能を表現することが示される。ＤＣＮへのｔＣＲＫペプチドの結合（複合化）は、ＲＤＥＢのマウスモデルの抗線維化効果を発揮し、かつ生存率を向上させる治療的融合タンパク質が皮膚に選択的に標的されることを容易にする。
【0109】
上記実験は、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ組換えタンパク質の全身投与が、ｃｏｌ７ａ１－／－マウスの生存率の向上において、未修飾ＤＣＮよりも効果的であることを示した。正確な分子機序はわかっていないが、理論に限定されず、複数の異なる機序がその生存率の向上に寄与する可能性があると考えられる。ＤＣＮは、抗炎症及び抗線維化分子である。ＴＧＦβシグナル伝達の活性化が早くとも生後１週間であることに関する本発明者らの以前の発見と一致して、線維形成に関連する遺伝子のうち半分を超える遺伝子の発現は、未治療ＲＤＥＢマウスの皮膚において１週間の時点でアップレギュレートされた。理論に限定されず、ＤＣＮ－ｔＣＲＫ投与によるＲＤＥＢマウスの生存率の向上は、当該治療タンパク質の抗線維化効果及び抗炎症効果に関連する可能性が高い。
【0110】
ＴＧＦβシグナル伝達に直接的に関与する遺伝子が（ＤＣＮではなく）ＤＣＮ－ｔＣＲＫで治療したＲＤＥＢ皮膚において正常化されただけでなく、β－カテニン及びＥＧＦＲなどの他のシグナル伝達経路に関連する遺伝子もＤＣＮ－ｔＣＲＫ投与によって正常化された。Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達とＥＧＦＲシグナル伝達の両方が、独立した線維化促進機序を通して、又はＴＧＦβシグナル伝達とのクロストークにより、複数の線維化疾患における線維形成に寄与することが示されている。例えば、ＥＧＦＲ活性化は、ＴＧＦβの線維化促進機能並びにＣＣＮ２媒介性線維芽細胞増殖及び筋線維芽細胞分化転換に必要である。ＤＣＮは、（β－カテニンの発現を抑制するために）ＥＧＦＲ及びＨＧＦ受容体Ｍｅｔに結合し、それらをダウンレギュレートすることができる。ＤＣＮ－ｔＣＲＫの投与後のｃｏｌ７ａ１－／－マウス皮膚におけるこれらの正常化された遺伝子の発現は、ＲＤＥＢにおけるＤＣＮ－ｔＣＲＫの複数の治療機能を示唆する。これによると、ＤＣＮで治療したＲＤＥＢ皮膚における炎症誘発性遺伝子のアップレギュレーションは、天然のＤＣＮの投与によって持続されなかった治療効果を示す可能性がある。
【0111】
まとめると、本明細書において、潜在的なＣｅｎｄＲ配列の露出により、創傷皮膚に加えて正常皮膚にホーミングする創傷標的ペプチドの新規な特徴を表現し、また、真皮組織貫通性を提供することが示される。このペプチド（ｔＣＲＫ）が、全身性真皮疾患、特に表皮水疱症の治療において、デコリン及び他の治療分子を送達するためのビヒクルとして機能できることも示される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】