特表 2023-523782 ３Ｄ筋肉組織用のオールインワンマイクロチャンバ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-07

(54)【発明の名称】３Ｄ筋肉組織用のオールインワンマイクロチャンバ

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20230531BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20230531BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20230531BHJP

   C12M 1/42 20060101ALN20230531BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00 A

C12Q1/02

C12N5/077

C12M1/42

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2022566126

(86)(22)【出願日】2021-03-25

(85)【翻訳文提出日】2022-12-06

(86)【国際出願番号】 NL2021050201

(87)【国際公開番号】W WO2021221495

(87)【国際公開日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】2025441

(32)【優先日】2020-04-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522422193

【氏名又は名称】ビオンド・ソリューションズ・ビー．ブイ．

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＮＤ ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ Ｂ．Ｖ．

【住所又は居所原語表記】Ｍｏｌｅｎｇｒａａｆｆｓｉｎｇｅｌ １０， ２６２９ ＪＤ Ｄｅｌｆｔ， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ

(74)【代理人】

【識別番号】110003708

【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100108855

【弁理士】

【氏名又は名称】蔵田 昌俊

(74)【代理人】

【識別番号】100179062

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 正

(74)【代理人】

【識別番号】100199565

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 茂

(74)【代理人】

【識別番号】100212705

【弁理士】

【氏名又は名称】矢頭 尚之

(74)【代理人】

【識別番号】100219542

【弁理士】

【氏名又は名称】大宅 郁治

(74)【代理人】

【識別番号】100153051

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 直樹

(74)【代理人】

【識別番号】100162570

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 早苗

(72)【発明者】

【氏名】ガイオ、ニコラス

(72)【発明者】

【氏名】キロス・ソラノ、ウィリアム・ファウスト

(72)【発明者】

【氏名】オスマン、アムル・アブデルハメード・モハメド

(72)【発明者】

【氏名】シルベストリ、シンツィア

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029AA07

4B029AA08

4B029AA21

4B029BB11

4B029CC01

4B029CC02

4B029CC10

4B029FA15

4B029GB09

4B063QA01

4B063QA05

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QS39

4B063QS40

4B063QX04

4B065AA90X

4B065BC42

4B065BC43

4B065CA46

(57)【要約】

本発明は、少なくとも１つの３Ｄ微小環境が存在する３Ｄ筋肉組織用のオールインワンマイクロチャンバ、シリコンベースの技術を使用して前記デバイスを製作する方法、さまざまな用途、代表的には細胞又は臓器オンチップ実験及びラブオンチップ実験といった生物学的細胞実験における前記デバイスの使用、並びに微小反応器としての前記デバイスの使用、の分野にある。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

底（１１）と少なくとも１つの壁（１２）を有する第１のマイクロチャンバ（１０ａ）であって、好ましくは外部から直接アクセスできる開口を含む、第１のマイクロチャンバ（１０ａ）を少なくとも１つ、
前記第１のマイクロチャンバ（１０ａ）内で、前記底（１１）から上方へ延びる、細胞又は組織を支持するためのピラー（２０）であって、好ましくは高さが１～５０００μｍで、好ましくは幅が１～２０００μｍである、ピラー（２０）を少なくとも１つ、及び
前記底（１１）に埋め込まれ、前記少なくとも１つのマイクロチャンバ（１０ａ）と流体接触する第１のチャネル（３０）であって、前記少なくとも１つの第１のチャネル（３０）と前記少なくとも１つのマイクロチャンバ（１０ａ）との間の流体接触を提供する選択的バリアを具体化するように、前記底（１１）が多孔膜（１３）を含むことを特徴とする第１のチャネル（３０）を少なくとも１つ、
有する、マイクロ流体デバイス（１００）。

【請求項2】

少なくとも１つの、刺激装置（４０）、例えば、電気的刺激装置（４１）（例．電極）、化学的刺激装置、光学的刺激装置及び機械的刺激装置（４２）（例．ポンプ）、並びに／又は組織モニター（例．電極）、を更に有する、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項3】

前記多孔膜（１３）は、少なくとも１つの開口（穴）（１１ａ）、好ましくは開口（１１ａ）のアレイ、例えば１～１００開口／μｍ^２を有する、並びに／又は、
前記アレイはｎ×ｍ（ｎ＞１０かつｍ＞１０）の開口を有する、
開口の密度が０．００１～２５０／１００μｍ^２である、並びに／又は、
平均開口面積が０．０５～５００μｍ^２である、並びに／又は、
前記少なくとも１つのピラーは、好ましくは前記少なくとも１つの開口の近傍及び／若しくは上に設けられる、
請求項１～２のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項4】

前記多孔膜（１３）が、０．０５～１００μｍの薄いポリマー上層（１３ａ）を含み、好ましくは前記ポリマー上層はその中に穴（１１ａ）のマトリックスを有し、
前記ポリマー上層（１３ａ）と接触する５０～５０００μｍの薄いポリマー下層（１３ｂ）であり、場合によっては、前記ポリマー下層（１３ｂ）に少なくとも部分的に埋め込まれた、少なくとも１つの第２のマイクロチャネル（３１）及び／若しくは少なくとも１つの第２のマイクロチャンバ（１０ｂ）を含み、
好ましくは、前記少なくとも１つのピラー（２０）は、前記少なくとも１つの第１若しくは第２のマイクロチャンバ（１０ａ、１０ｂ）の近傍及び／若しくは上に設けられており、好ましくは、前記少なくとも１つのピラー（２０）は、前記少なくとも１つの第１若しくは第２のマイクロチャネル（３０、３１）の近傍及び／若しくは上に設けられており、並びに／又は、
ポリマーフィルム（１３）のポリマーが、ガラス、酸化ケイ素、窒化ケイ素、若しくは、生体適合性ポリマー、例えば、ポリシロキサン（例．ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ））、ポリイミド、ポリウレタン、ブチルゴム、スチレン－エチレン－ブチレン－スチレン（ＳＥＢＳ）、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリプロピレン、及び、生分解性ポリマー（例．バイオラバー（ポリ（セバシン酸グリセロール）（ＰＧＳ）及びポリ(1,8-オクタンジオール-co-シトレート)（ＰＯＣ））、並びにこれらの組合せから独立して選択されたものであり、並びに／又は、
前記薄いポリマー上層（１３ａ）は、その少なくとも１つの側に、少なくとも１つの、凹み、溝、トポグラフィカル構造体のような微小特徴、好ましくは少なくとも１つの配向した微小溝、好ましくはｘ×ｙ方向の微小溝のアレイを含み、ここで微小溝の密度は１～２５個／１００μｍ^２であり、並びに／又は、
平均溝面積が０．１～１０^６μｍ^２であり、並びに／又は、
前記少なくとも１つの微小特徴が前記デバイスに対して整列しており、並びに／又は、
前記ポリマー層（１３ａ、１３ｂ）が少なくとも１つのアクセスを提供し、前記少なくとも１つのアクセスは、金属パッド、ＩＣ、センサー（例．光学センサー）及びヒーターの少なくとも１つへのアクセスであり、並びに／又は、
堅い基板（例．シリコン基板）が前記マイクロチャンバ壁（１２）を形成し、並びに／又は、
前記少なくとも１つの第１のマイクロチャンバ（１０ａ）の形状は受容される生体組織又は器官と似ている、
請求項１～３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項5】

前記底（１１）内に少なくとも１つの電極（４１）を含み、好ましくは前記電極（４１）は底の上層（１１ａ）に設けられ、
電極の一端は少なくとも１つのピラー（２０）と電気的に接触し、前記電極はその別の端にパッドのようなコンタクト（４１ａ）を有し、場合によっては前記電極（４１）は絶縁材料（４１ｂ）中に組み込まれており、
場合によっては、前記コンタクト（４１ａ）は別の絶縁材料（４１ｃ）によって前記壁（１２）から電気的に分離されている、
請求項１～４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項6】

前記多孔膜（１３）及び／又は前記少なくとも１つのピラー（２）が、堅い構造体と柔軟な構造体から選択されたものである、請求項１～５のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項7】

前記底は、金属層（１３ｃ）を、好ましくは上層（１３ａ）と下層（１３ｂ）の間に有し、好ましくは前記金属層にパターンが形成されており、前記金属層は前記少なくとも１つのピラーの変形を検出するように適合されている、請求項１～６のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項8】

前記少なくとも１つのピラー（２０）の断面は、正方形、長方形、長円形、楕円形、円形、三角形、多角形及びこれらの組合せから選択され、並びに／又は、
断面は、前記底（１１）から上方に実質的に一定であるか、前記底（１１）から上方に徐々に面積が増大し、並びに／又は、
少なくとも１つのピラーが、その頂部に、ポインタ（例．三角形のポインタ）のような光学ガイダ（２３）を有し、場合によっては、向かい合ったピラーの光学ガイダは同じ方向若しくは反対方向を指してもよく、及びこれらの組合せであってもよく、並びに／又は、
少なくとも１つのピラー（２０）は中空で、好ましくは、前記ピラー（２０）の前記中空部分が、第１のチャネル（３０）、第２のチャネル（３１）、又は、第１若しくは第２のマイクロチャンバ（１０ａ、１０ｂ）とマイクロ流体接続している、
請求項１～７のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項9】

前記デバイスに埋め込まれたポンプの少なくとも１つを更に含み、又は、前記デバイスは、前記底（１１）のその堅い部分などに埋め込まれた、ポンプ、弁、歪ゲージ、アクチュエータ、ヒーター、クーラー、フローセンサー、温度センサー、ｐＨセンサー、ＩＣ回路、増幅器、アクチュエータ、ホットプレート、微小電極アレイ、イオンセンサー、圧力調整器、さらなるマイクロ流体要素、マイクロチップの少なくとも１つ、集積センサー及び出力（１８）から、流体を受け取るように適合されており、並びに／又は、前記デバイスの濡れた／湿ったセクションと乾いたセクションと物理的に分離されており、前記乾いたセクションが電子部品を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項10】

前記底（１１）が、１ＭＰａを超える引張強さ（ISO 527）を有する伸張可能な、及び／若しくは、３ＧＰａ未満のヤング率（ISO 527）を有する柔軟な、ポリマーフィルム（１３）を有し、又は、前記ポリマーフィルムは堅く、１０ＧＰａを超えるヤング率（ISO 527）を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項11】

プレートのような支持体（６０）を更に含み、好ましくは前記マイクロ流体デバイスは前記支持体（６０）に脱着可能に取り付けられている、請求項１～１０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項12】

少なくとも１つの生きている生物又はその生きている部分を含み、前記少なくとも１つの生きている生物は、未分化細胞、分化細胞、成熟細胞、付着又は浮遊初代細胞のような幹細胞、内皮細胞、トランスフェクション又は非トランスフェクション細胞系、成人細胞、胚性又は人工多能性幹細胞、組織、組織インサート、及び、筋肉や心臓の微小組織などの３Ｄ微小組織、スフェロイドやオルガノイドなどの３Ｄ培養物、並びにこれらの組合せから選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項13】

前記第１のマイクロチャンバ（１０ａ）に、必要に応じて、筋芽細胞／線維芽細胞／内皮細胞とともに、初代又は人工多能性幹細胞の骨格筋細胞又は心筋細胞を播種し、前記ピラーに固定された筋束の成長を可能にすること、並びに、前記チャネル（３０）に、初代、トランスフェクション又は人工多能性幹細胞に由来する内皮細胞を播種し、３Ｄ灌流可能な培養物を生み出す、及び／又は前記多孔膜を介して前記筋束を血管化することを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のデバイスの使用方法。

【請求項14】

少なくとも１つの生きている生物又はその生きている部分に刺激を与える方法であって、
請求項１～１２のいずれか一項に記載された少なくとも１つのマイクロ流体デバイス（１００）を提供すること、
それぞれが個別に少なくとも１つの細胞を含む、前記少なくとも１つの生きている生物又はその生きている部分を提供すること、
少なくとも１つの刺激を提供すること、及び
試験結果を得ること
を含む方法。

【請求項15】

前記刺激は、例えば、薬物及び生体異物の毒性試験のため、有効性試験のため、in vitroでバリア組織をモデル化するため、完全性の評価及び薬物輸送アッセイのため、薬物代謝研究のため、薬物の薬物動態学及び毒物動態学の研究のため、臓器の代謝及び薬理学的器官の標的化のため、疾病のモデル化のため、疾病の診断のため、疾病の機序を研究するため、予測のため、個別化された正確な医療のため、ドーピングのため、宇宙飛行士のため、薬物相互作用のため、細胞成熟のため、並びに細胞分化のための、化学的刺激、機械的刺激、電気的刺激又は光学的刺激である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記少なくとも１つの生きている生物又はその生きている部分が、未分化細胞、分化細胞、成熟細胞、付着又は浮遊初代細胞のような幹細胞、内皮細胞、トランスフェクション又は非トランスフェクション細胞系、成人細胞、胚性及び人工多能性幹細胞、組織、組織インサート、クラスタ化された細胞、印刷された細胞、オルガノイド、組織生検、腫瘍組織、切除された組織材料、器官外植片、胚様体、及び、筋肉や心臓の微小組織などの３Ｄ微小組織、スフェロイドやオルガノイドなどの３Ｄ培養物、並びにこれらの組合せから選択される、請求項１４～１５のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の分野は、少なくとも１つの３Ｄ微小環境が存在する３Ｄ筋肉組織用のオールインワンマイクロチャンバ、シリコンベースの技術を使用して前記デバイスを製作する方法、さまざまな用途、代表的には細胞又は臓器オンチップ実験及びラボオンチップ（lab-on-a-chip）実験といった生物学的細胞実験における前記デバイスの使用、並びに微小反応器としての前記デバイスの使用、である。

【背景技術】

【0002】

マイクロ流体デバイスは、人間によって製作されたマイクロシステム内で少なくとも１つの小さな流体（液体又は気体）を操作することを目的とする技術に関する。このデバイス内には細胞培養物又は個別の細胞などが存在することがある。前記細胞培養物に対する実験は、よく制御された環境内での細胞の維持及び成長に関する。この環境は、自然界で生じる状況に似ていることがある。そのため、自然界で生じる細胞の周囲微小環境内に存在しうる多数の信号のうちの少なくとも１つの信号の適用下で、その細胞を同様に研究できる。

【0003】

マイクロ流体細胞培養は、例えばマイクロ流体中で細胞を培養し、維持し、成長させ、定性的及び定量的に実験及び分析することによって、細胞の操作を試みることである。このようなマイクロ流体細胞培養は、幹細胞培養のような細胞培養、分裂しない細胞又はゆっくりと分裂する細胞を、例えば細胞培養パラメータとマイクロ流体デバイスによって生み出された微小環境条件との間の相互作用に関して、理解する試みに関係している可能性がある。マイクロ流体要素（microfluidics）例えばチャンバ及びチャネルの寸法は、生物学的細胞の物理スケール及び他の用途によく適していると考えられる。

【0004】

一般に、マイクロ流体要素は、良好な程度の制御、例えば細胞培養条件の良好な程度の制御を提供すると考えられる。通常、マイクロ流体要素内の流体の移動は層状であると考えられ；流体の体積は通常１０^－６～１０^－１２Ｌ程度であり、この体積は１０～６０秒で流れることがあり；例えばチップ内に弁を提供することによって、流量が、体積及びタイミングに関して正確に制御されることがあり；さらに、微小環境の正確な化学的及び物理的制御が可能であり；代表的な先行技術は、制御が不十分になると考えられる手動の手順に依拠しているにもかかわらず、個別に制御可能な複数の細胞培養チャンバを単一のデバイス上に製作することが考えられている。

【0005】

いくつかの先行技術がマイクロ流体デバイスを記載している。国際公開第2016/049363号、国際公開第2016/049365号、国際公開第2016/010861号、国際公開第2016/004394号及び米国特許出願公開第2015/2955534号明細書は比較的に単純な臓器オンチップを記載しており、これらのデバイスは複雑な感知／刺激要素を含むことができず；したがって、これらのデバイスは大部分の用途に対して不適切ではない。

【0006】

本発明の発明者は、このようなマイクロ流体デバイスの基礎的発想を含む、国際出願である国際公開第2018/021906号を出願した。

【0007】

さらなる開発は、先進の機能を有するマイクロチャンバのある複数の側面を目的としているが、通常は１度に１つの側面を目的とする。例えば、ゲルマトリックス用の支持体を提供できる。又は、細胞などを捕獲することを目的とする、流れの経路を提供する先進のマイクロ流体チャネルを有する反応チャンバが提供される。又は細胞を支持するためのカンチレバーが、又は細胞成熟を支援するための培地が提供される。

【0008】

本発明は、機能及び利点を危うくすることなく上記の欠点又はさらなる欠点のうちの１つ以上を解決する汎用性の高い先進のデバイスを製作するデバイス及び方法に関する。

【発明の概要】

【0009】

本発明は、第１の側面において、底１１と少なくとも１つの壁１２を有する少なくとも１つの第１のマイクロチャンバ１０ａであり、好ましくは、第１のマイクロチャンバが、第１のマイクロチャンバに外部から直接アクセスできる開口を含む、第１のマイクロチャンバ１０ａ、マイクロチャンバ内で、底１１から上方へ延びる、細胞又は組織を支持するための少なくとも１つのピラー２０であり、すなわちピラーは底に載っており、好ましくは、少なくとも１つのピラーの高さは１～２０００μｍで、好ましくは、少なくとも１つのピラーの幅は１～２０００μｍの幅である、少なくとも１つのピラー２０、及び、底１１に埋め込まれ、少なくとも１つのマイクロチャンバ１０ａと流体接触する少なくとも１つの第１のチャネル３０であり、少なくとも１つの第１のチャネル３０と少なくとも１つのマイクロチャンバ１０ａとの間の流体接触を提供する選択的バリアを具現化するように、底１１が多孔膜１３を含む、少なくとも１つの第１のチャネル３０、を有するマイクロ流体デバイス１００に関する。多孔膜は、マイクロ流体チャネルを選択的に分離して、（細胞がマイクロチャンバに入ることなく）チャネルの内側に細胞を注入することを可能にし、チャネルの４つの壁をカバーして、組織に非常に近い血管に似た構造体をマイクロチャンバ内に生み出すことを可能にする。膜の孔は、いくつかの細胞は孔を通り抜けないが、栄養分は通り抜けるように設計できる。さらに、それらの孔を、マイクロ流体チャネルから始まる脈管形成及び血管新生を可能にするように設計することもできる。

【0010】

さらに、請求項１に記載のデバイスは、スループットが高く、安価に製作でき、信頼性及び汎用性が高く、良好なハンドリング、例えば細胞の良好なハンドリングを提供し、はるかに幅広い機能を提供するという利点を有する。

【0011】

第１及び第２のマイクロチャンバは、通常５～１０００μｍ程度、好ましくは１０～５００μｍ程度、例えば１００～３００μｍ程度の寸法（例．断面）を有する。第１及び第２のマイクロチャネルは、通常５０～１０００μｍ程度、好ましくは１００～７００μｍ程度、例えば４００～５００μｍ程度の寸法（例．断面）を有する。

【0012】

本発明のデバイスは、マイクロ流体及びナノ／マイクロスケール要素などがその中に提供される少なくとも２つの別個の層を含む。２つの層は、通常ポリマーでできているが、通常は両者の層とも同じポリマーである必要はなく；第１のポリマー層１３ａは、基板上、通常はシリコン又はガラスウェーハ上に提供されており、相対的に薄く；本発明の目的上、用語「基板」、「シリコン」及び「ガラス」は相互に交換可能であるとみなされ；上層は、膜に関係しているとみなしてもよく、膜は、選択的バリアに関係しているとみなされ；上層は、好ましくは、その中に開口（又は穴）１１ａのマトリックスを有し、少なくとも１つの穴は、通過、例えば特定の用途に適合したものとすることができる流体、気体、種（species）、微小粒子、イオンなどの通過を可能にし；上層は、薄く、０．０５～３０μｍ、好ましくは０．１～２５μｍ、より好ましくは０．２～２０μｍ、さらにより好ましくは０．５～１０μｍ、例えば１～８μｍ又は２～６μｍの厚さで；相対的に薄いポリマー層１３ａと接触してより厚いポリマー下層１３ｂがあり；下層は、ポリマー下層に少なくとも部分的に埋め込まれた、少なくとも１つの第２のマイクロチャネル３１及び／又は少なくとも１つの第２のマイクロチャンバ１０ｂを含んでいてもよく；これらのマイクロ流体要素の、数、レイアウト、サイズ及びさらなる特性を特定の用途に適合でき；マイクロ流体要素は、例えばウェルの場合に、下層１３ｂに完全に埋め込まれていてもよく、及び／又は部分的に埋め込まれていてもよく；ポリマー下層は上層よりも厚く、好ましくは５０～２０００μｍの厚さで、したがって上層よりも少なくとも１桁厚く、通常は２～３桁厚く；厚さは、好ましくは１５０～１０００μｍ、より好ましくは２００～５００μｍ、さらにより好ましくは２５０～４００μｍであり；デバイスは、ポリマーベースのマイクロ流体要素である上層１３ａとマイクロ流体接触したシリコンベースのマイクロ流体要素を更に含み、シリコンベースのマイクロ流体要素は、デバイスの使用のためにアクセス可能であり、及び／又はアクセス可能にでき；基板、例えばシリコンベースのマイクロ流体要素は、少なくとも部分的にシリコンに埋め込まれた（上を参照されたい）、少なくとも１つの第１のマイクロチャネル３０及び／又は少なくとも１つの第１のマイクロチャンバ１０ａを含み、少なくとも１つの入力１６を含んでいてもよく、入力１６は、例えば機能上定義されたとき又は必要なときに、ポリマー下層に埋め込まれた、少なくとも１つの第２のマイクロチャネル３１及び／又は少なくとも１つの第２のマイクロチャンバ１０ｂとマイクロ流体接触し；支持体又は基板１０は、シリコン半導体プロセスで通常使用されるウェーハ、例えばケイ素又はガラスに関連するウェーハであってもよく；この点に関してシリコンに言及されている場合にはいつでも、支持体又は基板１０は他の適当な基板に関係するものであってもよく；ポリマー上層１３ａは、ポリマー上層１３ａの穴１１ａのマトリックスによって、基板（シリコン）に埋め込まれた、第１のマイクロチャネル３０の少なくとも１つ及び／又は第１のマイクロチャンバ１０ａの少なくとも１つ（の中の流体要素（fluidic））を、ポリマー下層に埋め込まれた、第２のマイクロチャネル３１の少なくとも１つ及び／又は第２のマイクロチャンバ１０ｂの少なくとも１つ（の中の流体要素）から、好ましくは少なくとも部分的に分離するためのものであり；ポリマー及びシリコンのマイクロ流体要素は直接に又は間接的に互いにマイクロ流体接触している。本発明のポリマーは、生体適合性ポリマー、例えば、ポリシロキサン（例．ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ））、ポリイミド、ポリウレタン、スチレン－エチレン－ブチレン－スチレン（ＳＥＢＳ）、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリプロピレン、及び、ブチルゴム、並びに生分解性ポリマー（例．バイオラバー（ポリ（セバシン酸グリセロールＰＧＳ）及びポリ(1,8-オクタンジオール-co-シトレート)（ＰＯＣ））、並びにこれらの組合せから独立して選択される。

【0013】

用語「流体要素」は、気体、液体；及びこれらの組合せに関係していることがあり；「マイクロ流体要素」は、デバイスの境界条件下の流体に関係しているとみなされる。

【0014】

通常はポリマーフィルムを形成するポリマー層、少なくとも１つのマイクロチャネル、例えば２～１０個のマイクロチャネル、少なくとも１つのマイクロチャンバ、例えば２～１０個のマイクロチャンバ、及び第１のマイクロチャンバ（「マクロチャンバ」とも呼ばれる）によって構成された構成体を、顕微鏡及び／又はカメラ、例えばデバイスの背面／前面に配置された顕微鏡及び／又はカメラを用いて、オフラインで光学的にモニターできる。これらの例の多くで、１つのマクロチャンバ１０ａだけが存在する。微小環境及び／又はマクロチャンバ内に配置された、微小電極アレイ及び／又は微小製造されたセンサー（例．フロー／温度／ｐＨセンサー）によって、この構成体をオンラインでモニターできる。さらに、マイクロチャンバ／チャネル及びマクロチャンバを通って流れる液体フローによって；同様に、マイクロチャンバ／チャネル及びマクロチャンバを通って流れる気体フローによって；マイクロチャンバ内、マイクロチャネル内及びポリマーフィルムの背面及び前面に与えられた圧力差によって；微小電極アレイによって提供された電気的刺激によって；デバイスの背面／前面に配置された光学システムによって提供された光学的刺激によって；膜に配置された液体フロー又は液体リザーバによって提供された化学的刺激によって；マイクロチャネル／チャンバの内側に配置された他の微小製造されたアクチュエータによって；並びにこれらの組合せによって、この構成体を改変／刺激できる。したがって、このデバイスは汎用性が高いと考えられる。

【0015】

第２の側面において、本発明は、少なくとも１つの生きている生物又はその生きている部分に刺激を与える方法であって、本発明による少なくとも１つのマイクロ流体デバイス（１００）を提供すること、それぞれが個別に少なくとも１つの細胞を含む、少なくとも１つの生きている生物又はその生きている部分を、例えばマイクロチャンバ１０ａ内又はチャネル３０内に提供すること、少なくとも１つの生きている生物又はその生きている部分に少なくとも１つの刺激を提供すること、及び試験結果を得ることを含む方法に関する。

【0016】

用語「少なくとも１つの生きている生物又はその生きている部分」は、例えば本出願及び請求項の全体を通して識別される、実際の生物、その部分、例えば細胞系、組織など、生きている生物又はその部分に似た生物学的材料、及び他の同様の形態の生物学的材料に関係しているとみなされる。

【0017】

それによって、本発明は、上述の課題の１つ以上に対する解決策を提供する。

【0018】

本発明の利点は、本明細書の全体で詳細に説明される。

【発明を実施するための形態】

【0019】

発明の詳細な説明
本発明は、第１の側面において、請求項１に記載のデバイスに関する。

【0020】

代表的な態様では、本発明のデバイスが、刺激装置（stimulator）４０、例えば電気的刺激装置４１（例．電極）、化学的刺激装置、光学的刺激装置及び機械的刺激装置４２（例．ポンプ、空気圧／力）、並びに／又は組織モニター（例．電極）、を少なくとも１つ、更に有していてもよい。前記刺激装置を用いることによって、その効果を、生きている生物又はその部分でモニター又は研究できる。

【0021】

本発明のデバイスの代表的な態様では、底１１が、少なくとも１つの開口１１ａ、好ましくは開口１１ａのアレイ、例えば１～１００開口／μｍ^２を有していてもよい。

【0022】

本発明のデバイスの代表的な態様では、アレイはｎ×ｍ（ｎ＞１０かつｍ＞１０）の開口を有する。

【0023】

本発明のデバイスの代表的な態様では、穴の密度は０．００１～２５０／１００μｍ^２であってもよい。

【0024】

本発明のデバイスの代表的な態様では、平均穴面積は０．０５～５００μｍ^２であってもよい。

【0025】

本発明のデバイスの代表的な態様では、少なくとも１つのピラーが、好ましくは、少なくとも１つの開口の近傍及び／又は上に設けられてもよい。

【0026】

本発明のデバイスの代表的な態様では、底１１が、ポリマーフィルム１３を含んでいてもよく、好ましくは、ポリマーフィルムが、０．０５～１００μｍの薄いポリマー上層１３ａを含み、ポリマー上層は、好ましくは、穴１１ａのマトリックスをその中に有する。

【0027】

本発明のデバイスの代表的な態様では、底１１は、ポリマー上層と接触する５０～５０００μｍのポリマー下層１３ｂ、場合によっては、ポリマー下層に少なくとも部分的に埋め込まれた、少なくとも１つの第２のマイクロチャネル３１及び／又は少なくとも１つの第２のマイクロチャンバ１０ｂを含んでいてもよい。

【0028】

本発明のデバイスの代表的な態様では、少なくとも１つのピラーが、好ましくは、少なくとも１つの第１又は第２のマイクロチャンバの近傍及び／又は上に設けられる。

【0029】

本発明のデバイスの代表的な態様では、少なくとも１つのピラーが、好ましくは、少なくとも１つの第１又は第２のマイクロチャネルの近傍及び／又は上に設けられる。

【0030】

代表的な態様では、少なくとも１つのピラーが、堅い構造のもの又は柔軟な構造のものであるように選択可能である。この側面の利点は、（例えば３Ｄ電極として使用することによって）ピラーの機能を増大できることである。さらに、柔軟なものと堅いもののいずれにもすることができるピラーを用いることによって、２つのピラーに固定された組織が受ける力を調整できる。

【0031】

本発明のデバイスの代表的な態様では、ポリマーが、生体適合性ポリマー、例えば、ポリシロキサン（例．ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ））、ポリイミド、ポリウレタン、ブチルゴム、スチレン－エチレン－ブチレン－スチレン（ＳＥＢＳ）、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリプロピレン、及び、生分解性ポリマー（例．バイオラバー（ＰＧＳ）及びポリ1,8-オクタンジオール-co-シトレート（ＰＯＣ））、並びにこれらの組合せから独立して選択されたものであってもよい。

【0032】

本発明のデバイスの代表的な態様では、薄いポリマー上層１３ａは、その少なくとも１つの側に、少なくとも１つの、凹み、溝、トポグラフィカル構造体（topographical structure）、のような微小特徴（micro-feature）、好ましくは少なくとも１つの配向した微小溝、好ましくはｘ×ｙ方向の微小溝のアレイを含んでいてもよく、微小溝の密度は１～２５個／１００μｍ^２である。

【0033】

本発明のデバイスの代表的な態様では、平均溝面積は０．１～１０^６μｍ^２であってもよい。

【0034】

本発明のデバイスの代表的な態様では、少なくとも１つの微小特徴がデバイスに対して整列していてもよい。

【0035】

本発明のデバイスの代表的な態様では、ポリマー層１３ａ、１３ｂが少なくとも１つのアクセスを提供し、少なくとも１つのアクセスが、金属パッド、ＩＣ、センサー（例．光学センサー）及びヒーターのうちの少なくとも１つへのアクセスを提供する。

【0036】

本発明のデバイスの代表的な態様では、堅い基板、例えばシリコン基板がマイクロチャンバ壁１２を形成していてもよい。

【0037】

本発明のデバイスの代表的な態様では、少なくとも１つの第１のマイクロチャンバ１０ａは、受容される生物学的組織又は生物に似た形状を有していてもよい。

【0038】

代表的な態様では、本発明のデバイスは、底内に少なくとも１つの電極４１を含んでいてもよい。

【0039】

本発明のデバイスの代表的な態様では、電極が、好ましくは、底の上層１１ａに設けられている。

【0040】

本発明のデバイスの代表的な態様では、電極がマイクロチャネル３０内に提供されている。

【0041】

本発明のデバイスの代表的な態様では、電極が層１３ａ上に提供されている。

【0042】

本発明のデバイスの代表的な態様では、電極の一端が、少なくとも１つのピラー２０と電気的に接触していてもよい。

【0043】

本発明のデバイスの代表的な態様では、電極が、その別の端部にコンタクト４１ａ、例えばパッドを含んでいてもよく、場合によっては、電極は絶縁材料４１ｂに組み込まれており、場合によっては、コンタクト４１ａがさらなる絶縁材料４１ｃによって壁１２から電気的に分離されている。中間金属線によって電極をコンタクト４１ａと接触させることが可能であり、中間金属線は、まっすぐなものでも、曲がりくねったものでもよく、又は他の適当な経路をたどるものであってもよい。

【0044】

本発明のデバイスの代表的な態様では、底が金属層１３ｃを、好ましくは上層１３ａと下層１３ｂとの間に有していてもよく、金属層に、好ましくはパターンが形成されており、金属層が少なくとも１つのピラーの変形を検出するように適合されており、例えば、ピラーの曲りを測定する歪ゲージが、ピラーに取り付けられた細胞束の収縮を検出するように適合されている。

【0045】

本発明のデバイスの代表的な態様では、少なくとも１つのピラー２０の断面は、正方形、長方形、長円形、楕円形、円形、三角形、多角形及びこれらの組合せから選択されてもよい。

【0046】

第１のマイクロチャンバの形状を調整して、電極及び中間金属線に加わる応力を低減できる。可能な選択肢は、例えば、図１０ｂ及び１０ｃに示した断面形状を適用することであり、この断面形状は、楕円の相対的に長い仮想の軸の両端に３つの突出部が配置された本質的に楕円の形状である。

【0047】

本発明のデバイスの代表的な態様では、断面は、底から上方へ実質的に一定であってもよく、又は、断面の面積が、底から上方へ徐々に増大していてもよい。

【0048】

本発明のデバイスの代表的な態様では、少なくとも１つのピラーが、その頂部に、光学ガイダ２３、例えばポインタ、例えば三角形のポインタを備えていてもよく、向かい合ったピラーの光学ガイダが、同じ方向又は反対方向を指してもよく、及びこれらの組合せであってもよい。

【0049】

本発明のデバイスの代表的な態様では、少なくとも１つのピラーが中空であってもよく、好ましくは、ピラーの中空部分が、チャネル３０、チャネル３１又はマイクロチャンバ１０ａ若しくは１０ｂとマイクロ流体接続している。

【0050】

代表的な態様では、本発明のデバイスが、デバイスに埋め込まれたポンプの少なくとも１つを更に含んでいてもよく、又はポンプ、弁、歪ゲージ、アクチュエータ、ヒーター、クーラー、フローセンサー、温度センサー、ｐＨセンサー、ＩＣ回路、増幅器、アクチュエータ、ホットプレート、微小電極アレイ、イオンセンサー、圧力調整器、さらなるマイクロ流体要素から、並びに、マイクロチップ、集積センサー及び出力１８、好ましくは、底１１例えばその堅い部分に埋め込まれたマイクロチップ、集積センサー及び出力１８から、流体を受け取るように適合されていてもよい。

【0051】

本発明のデバイスの代表的な態様では、デバイスの、濡れた／湿ったセクションと乾いたセクションとが物理的に分離されていてもよく、乾いたセクションは電子部品を含む。

【0052】

本発明のデバイスの代表的な態様では、底は、１ＭＰａを超える引張強さ（ISO 527）を有する伸張可能な、及び／又は、３ＧＰａ未満のヤング率（ISO 527）を有する柔軟なポリマーフィルムを含んでいてもよい。

【0053】

本発明のデバイスの代表的な態様では、ポリマーフィルムが堅くてもよく、１０ＧＰａを超えるヤング率（ISO 527）を有していてもよい。

【0054】

代表的な態様では、本発明のデバイスが、支持体６０、例えばプレートを更に含んでいてもよく、マイクロ流体デバイスが、好ましくは、前記支持体に脱着可能に取り付けられている。

【0055】

代表的な態様では、本発明のデバイスが、少なくとも１つの生きている生物又はその生きている部分を含んでいてもよく、少なくとも１つの生きている生物が、未分化細胞、分化細胞、成熟細胞、幹細胞例えば付着又は浮遊初代細胞、トランスフェクション又は非トランスフェクション細胞系、成人、胚性又は人工多能性幹細胞、組織、組織インサート、及び、３Ｄ微小組織、例えば筋肉及び心臓微小組織、３Ｄ培養物、例えばスフェロイド及びオルガノイド、並びにこれらの組合せから選択される。

【0056】

本発明の方法の代表的な態様では、刺激が、例えば、薬物及び生体異物の毒性試験のため、有効性試験のため、in vitroでバリア組織をモデル化するため、完全性の評価及び薬物輸送アッセイのため、薬物代謝研究のため、薬物の薬物動態学及び毒物動態学の研究のため、臓器の代謝及び薬理学的器官の標的化のため、疾病のモデル化のため、疾病の診断のため、疾病の機序を研究するため、予測のため、個別化された正確な医療のため、ドーピングのため、微小重力研究のため、薬物相互作用のため、細胞成熟のため、並びに細胞分化のための、化学的刺激、機械的刺激、電気的刺激又は光学的刺激であってもよい。

【0057】

本発明の方法の代表的な態様では、方法はin vitroで実行される。

【0058】

本発明の方法の代表的な態様では、少なくとも１つの生きている生物が、未分化細胞、分化細胞、成熟細胞、幹細胞例えば付着又は浮遊初代細胞、トランスフェクション又は非トランスフェクション細胞系、成人細胞、胚性及び人工多能性幹細胞、組織、組織インサート、クラスタ化された細胞、印刷された細胞、オルガノイド、組織生検、腫瘍組織、切除された組織材料、器官外植片、胚様体、及び３Ｄ微小組織（例．筋肉及び心臓の微小組織）、３Ｄ培養物（例．スフェロイド及びオルガノイド）、並びにこれらの組合せから選択されてもよい。

【0059】

添付した図及び実施例によって本発明を更に詳細に説明する。添付した図及び実施例は、性質を例示及び説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の請求項によって定義された保護の範囲に含まれる明らかな又は明らかでない多くの変形態様を想像できることが当業者には明白である。

【図面の簡単な説明】

【0060】

図１ａ～ｄ、２ａ～ｃ、３ａ～ｆ、４ａ～ｄ、５ａ～ｅ、６ａ～ｄ、７～８及び９ａ～ｄは、本発明のデバイス及び方法の代表的な態様の詳細を示す。
図１０は、デバイスのマイクロチャンバの可能な形状を示す。

【0061】

【図1】図１ａ～ｄは、２つのピラーと、入口及び出口を通してアクセス可能な１つのチャネルと、チャネル内の貫通穴マトリックスとを含む１つのデバイスの代表的な態様の詳細を示す。図１ａ：側面図。図１ｂ：上面図。

【図2】図２ａ～ｃは、長円形のウェルを有し、２つのピラー及びマイクロ流体チャネルを備える１つのデバイスの代表的な態様の詳細を示す。図２ａは、筋束の収縮によって生じたピラーの変位を識別するための光学ガイダとして使用できるポインタを有する１つのデバイスの代表的な態様の詳細を示す。図２ｃは、デバイスに存在する開口のアレイの拡大図を示す。

【図3】図３ａ～ｆは、チップの内側のマイクロ流体チャネルの詳細を示す。図３ｂ～ｃは図３ａの断面図であり、図３ｅ～ｆは図３ｄの断面図である。

【図4】図４ａ～ｄは、デバイスに存在する２つのピラーによって支持された筋束を含む本発明のデバイス（図４ａ、ｂ）、及び筋束を含まない本発明のデバイス（図４ｃ、ｄ）の詳細の画像を示す。矢印は流れの経路を示す。

【図5】図５ａ～ｅは、本発明の断面の詳細を示す。図５ａ～ｅは、筋束あり及びなしで弛緩した状態にあるとき、マイクロチャンバと厚いポリマー層の背面との間に圧力差を与えることによってポリマー層が伸張しているときの、１つのデバイスの代表的な態様の詳細を示す。図５ｅは、チップに挿入された組織及び細胞を刺激及びモニターするためにコンタクトパッドを介して電気的にアクセス可能なピラーを有する１つのデバイスの代表的な態様の詳細を示す。この図は、底内に少なくとも１つの電極（４１）を更に含むマイクロ流体デバイスを示し、電極は、好ましくは、底の上層（１１ａ）に提供されており、電極の一端は、少なくとも１つのピラー（２０）と電気的に接触しており、電極は、その別の端部にコンタクト（４１ａ）、例えばパッドを含み、場合によっては、電極は絶縁材料（４１ｂ）に組み込まれており、場合によっては、コンタクト（４１ａ）はさらなる絶縁材料（４１ｃ）によって壁（１２）から電気的に分離されている。図５ｅは、コンタクトパッド４１ａ、及びコンタクトパッド４１ａを介して電気的にアクセス可能なピラー２０を示す。

【図6】図６ａ～ｂは、ピラーの断面の面積が底から上方へ徐々に増大している１つのデバイスの代表的な態様の詳細を示す。図６ｃ～ｄは、筋束の収縮によって生じたピラーの変位を識別するための光学ガイダとして使用できるポインタを備えた１つのデバイスの代表的な態様の詳細を示す。

【図7】図７は、少なくとも１つのピラー（２０）が中空であり、好ましくは、ピラー（２０）の中空部分が、第１のチャネル（３０）、又は第２のチャネル（３１）、又は第１若しくは第２のマイクロチャンバ（１０ａ、１０ｂ）とマイクロ流体接続している、１つのデバイスの代表的な態様のさらなる断面を示す。矢印は流れの経路を示す。

【図8】図８は、支持体（６０）、例えばプレートを含み、マイクロ流体デバイスが、好ましくは、前記支持体（６０）に脱着可能に取り付けられている、デバイスを示す。

【図9】図９は、デバイスの内側で培養されている細胞を含まない（ａ）及び含む（ｂ、ｃ、ｄ）、１つのデバイスの代表的な態様のさらなる断面を示す。ピラー（２０）を使用して筋束（５０）を支持できる（図９ｂ）。細胞は、マイクロ流体チャネルの内側で（図９ｃ）、又はマクロチャンバの底で（図９ｄ）培養することもできる。図９ｂ、ｃ、ｄに示した細胞培養を組み合わせることができる。

【図10】図１０は、本発明のデバイスのマイクロチャンバのいくつかの可能な形状を示す。

【0062】

実施例／実験
詳細な説明の文脈で説明したが、本発明は、添付の例及び図とともに検討することで最もよく理解されることがある。

【符号の説明】

【0063】

図では、以下の数字が、数字の後に記載された特徴を示す。
１００ マイクロ流体デバイス
１０ａ 第１のマイクロチャンバ
１０ｂ 第２のマイクロチャンバ
１１ 第１のマイクロチャンバの底
１１ａ 開口
１２ 第１のマイクロチャンバの壁
１３ ポリマーフィルム
１３ａ 薄いポリマー上層
１３ｂ ポリマー下層
１３ｃ 金属下層
１８ 出力
２０ ピラー
２３ 光学ガイダ
３０ 第１のマイクロチャネル
３１ 第２のマイクロチャネル
４０ 刺激装置
４１ 電気的刺激装置
４１ａ 電極コンタクト
４１ｂ 電極絶縁体材料
４１ｃ 電極／壁絶縁体
４２ 機械的刺激装置
４３ シリコン
５０ 組織（例．筋束）
６０ 支持体

【図1a-1d】

【図2a-2c】

【図3a-3h】

【図4a-4d】

【図5a-5e】

【図6a-6d】

【図7】

【図8】

【図9a-9d】

【図10a】

【図10b】

【図10c】

【国際調査報告】