特表 2023-523931 ＧＰＥＲタンパク質分解ターゲティングキメラ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-08

(54)【発明の名称】ＧＰＥＲタンパク質分解ターゲティングキメラ

(51)【国際特許分類】

   C07J 41/00 20060101AFI20230601BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20230601BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230601BHJP

   C07K 5/00 20060101ALN20230601BHJP

【ＦＩ】

C07J41/00 CSP

A61K47/54

A61P35/00

C07K5/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022564329

(86)(22)【出願日】2021-04-23

(85)【翻訳文提出日】2022-12-07

(86)【国際出願番号】 US2021028900

(87)【国際公開番号】W WO2021217036

(87)【国際公開日】2021-10-28

(31)【優先権主張番号】63/014,410

(32)【優先日】2020-04-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/144,783

(32)【優先日】2021-02-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515346639

【氏名又は名称】ユニヴァーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】サレム、エイリアスガー ケイ．

(72)【発明者】

【氏名】フィラルド、エドワード ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ルー、アン エス．

(72)【発明者】

【氏名】ロウヒモガダム、ミラド

【テーマコード（参考）】

4C076

4C091

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076BB01

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C076FF31

4C091AA01

4C091BB03

4C091BB04

4C091BB07

4C091CC01

4C091DD01

4C091EE04

4C091FF01

4C091GG01

4C091HH01

4C091JJ01

4C091KK01

4C091LL01

4C091MM03

4C091NN01

4C091PA03

4C091PA06

4C091PA07

4C091PA09

4C091PB05

4C091QQ01

4C091RR08

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA12

4H045EA20

4H045FA10

(57)【要約】

Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンドに連結されたリンカーに連結されたＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む分子、及びその分子を使用する方法が提供される。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドはエストラジオールであり、Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンドは（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンドに結合したリンカーに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む分子。

【請求項2】

前記ＧＰＥＲリガンドは、１７β－エストラジオール、エストロン、フィトエストロゲン、キセノエストロゲン、エストリオール、エストリオール３－硫酸、エストリオール１７－硫酸、Ｇ－１、Ｇ－１５、Ｇ－３６、ゲニステイン、ダジン、又はケルセチンを含む、請求項１に記載の分子。

【請求項3】

前記フィトエストロゲンは、フラボン、イソフラボン、リグニン、サポニン、クメスチン、又はスチルベンを含む、請求項２に記載の分子。

【請求項4】

前記ＧＰＥＲリガンドはＧＰＥＲアンタゴニストである、請求項１～３のいずれか一項に記載の分子。

【請求項5】

前記Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンドはフォン・ヒッペルリガーゼ（ＶＨＬ）リガンドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の分子。

【請求項6】

前記Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンドは、セレブロン、レナリドマイド、ポマリドマイド、イベルドマイド、（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ、サリドマイド、ＶＨ－２９８、ＣＣ－１２２、ＣＣ－８８５、Ｅ３リガーゼリガンド８、ＴＤ－１０６、ＶＬ２８５、ＶＨ０３２、ＶＨ１０１、ＶＨ２９８、ＶＨＬリガンド４、ＶＨＬリガンド７、ＶＨＬ－２リガンド３、Ｅ３リガーゼリガンド３、Ｅ３リガーゼリガンド２、又はＢＣ－１２１５を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の分子。

【請求項7】

前記リンカーは、原子１０～５０個を有する鎖を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の分子。

【請求項8】

前記リンカーはアルキルリンカーである、請求項７に記載の分子。

【請求項9】

前記リンカーはヘテロアルキルリンカーである、請求項７に記載の分子。

【請求項10】

前記リンカーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の分子。

【請求項11】

前記リンカーは３～１５個のＰＥＧ単位を含む、請求項１０に記載の分子。

【請求項12】

前記リンカーは（ＰＥＧ）_ｍＮＨ（ＣＯ）（ＰＥＧ）_ｎを含み、ｎ及びｍは独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５である、請求項１０に記載の分子。

【請求項13】

ｎは３、４、５、又は６である、請求項１２に記載の分子。

【請求項14】

ｍは７、８、９、又は１０である、請求項１２に記載の分子。

【請求項15】

特定量の請求項１～１４のいずれか一項に記載の分子を含む、医薬組成物。

【請求項16】

前記ＧＰＥＲリガンドが１７β－エストラジオールを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンドはフォン・ヒッペルリガーゼ（ＶＨＬ）リガンドである、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記リンカーはＰＥＧを含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記リンカーは３～１２個のＰＥＧ単位を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

哺乳動物においてがんを予防、阻害、又は治療する方法であって、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリガンドに結合したリンカーに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む有効量の分子を有する組成物を前記哺乳動物に投与することを含む、方法。

【請求項21】

哺乳動物においてＧＰＥＲ陽性がんを予防、阻害、又は治療する方法であって、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリガンドに結合したリンカーに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む有効量の分子を有する組成物を前記哺乳動物に投与することを含む、方法。

【請求項22】

前記がんが内分泌抵抗性がんである、請求項２０又は２１に記載の方法。

【請求項23】

前記がんがホルモン療法抵抗性がんである、請求項２０又は２１に記載の方法。

【請求項24】

前記がんがトリプルネガティブ乳がんである、請求項２０又は２１に記載の方法。

【請求項25】

前記がんが婦人科がんである、請求項２０又は２１に記載の方法。

【請求項26】

前記がんが卵巣がんである、請求項２０又は２１に記載の方法。

【請求項27】

前記がんが子宮内膜がんである、請求項２０又は２１に記載の方法。

【請求項28】

前記哺乳動物がヒトである、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記投与が全身性である、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記投与が経口である、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記組成物は持続放出剤形である、請求項２０～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記分子は請求項１～１４のいずれか一項に記載の分子である、請求項２０～３１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

疫学的、臨床的及び前臨床的証拠は、乳がんがエストロゲン駆動型の悪性腫瘍であることを示唆している（Ｇｅｒｍａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｐａｒｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｒｕｇｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｙｕｅ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。これは、抗エストロゲン剤が早期ＥＲ（＋）乳がんの効果的な補助療法として広く成功していることを説明している（ＤｅＰｌａｃｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｔｒｅｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。エストロゲン作用に拮抗するために、２つのクラスの薬剤が使用され、それらは１）アロマターゼを阻害する化合物（アロマターゼ阻害剤、ＡＩ）、アンドロゲンをエストロゲンに変換する酵素、及び２）エストロゲンとＥＲの相互作用を競合的にブロックするエストロゲン模倣薬（ＥＲアンタゴニスト）である。効果をもたらすためには、ＡＩ又はＥＲアンタゴニストを３～５年又はそれ以上の長期にわたる投薬スケジュールで投与する必要がある。最終的に、抗エストロゲン療法の長期使用は、更年期症状、骨粗鬆症、骨痛、関節痛などの望ましくない、時には耐え難い副作用を伴う（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。さらに、ＥＲアンタゴニストの長期使用は、子宮内膜がん（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）及び血栓症（Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）のリスクの増加に関連する。

【0002】

ｄｅ ｎｏｖｏの又は獲得した薬剤耐性は、抗エストロゲン療法の使用をさらに制限し、治療を受けた患者の２０％以上で耐性が発生する（Ａｕｇｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｈａｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ｄｅ ｎｏｖｏ耐性は、診断時のＥＲ発現における腫瘍内不均一性に起因し（Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、獲得耐性は、治療中に抗エストロゲン剤によって加えられる選択圧によって進化する腫瘍の不均一性を反映している。例としては：ａ）薬物－受容体相互作用の喪失（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）又はエストロゲン非依存性ＥＲ媒介遺伝子トランス活性化の促進（Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０；ＧＲＣＩＡ－Ｂｅｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ，２０１２）をもたらす突然変異の選択を促進する突然変異の選択、ｂ）ＥＲプロモーターのエピジェネティックなサイレンシング（Ａｃｈｉｎｇｅｒ－Ｋａｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０）、及びｃ）細胞周期活性（Ｔｈｎｇａｖｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１）又は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の下流のシグナル伝達活性（Ｇｕｉｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を調節することによってエストロゲン非依存性の成長を促進する代償性遺伝子（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｇｅｎｅｓ）の転写アップレギュレーションが挙げられる。抗エストロゲン耐性のさらに別のメカニズムは、Ｇタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）によって提供される。この最近評価されたエストロゲン受容体は、乳がんの生物学と治療にとって明らかに重要である（Ｒｏｕｈｉｍｏｇｈａｄｍ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。主に細胞内に存在し、リガンド誘導性転写因子として機能する核内エストロゲン受容体とは異なり、ＧＰＥＲは原形質膜及び細胞内膜に位置し、アデニル酸シクラーゼの活性化（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０００２）及びＥＧＦＲのトランス活性化（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）を含む迅速なプレゲノム作用を促進するＧｓ共役７回膜貫通型受容体である。ＧＰＥＲの刺激は、Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、及びＥｒｋ１／２などのＥＧＦＲの下流にあるシグナル伝達エフェクターの活性化に寄与し、細胞増殖、生存、浸潤、及び内分泌療法に対する抵抗性に関与している（Ｐｅｐｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。原発性乳房腫瘍におけるＧＰＥＲ発現の分析は、その存在が疾患の進行（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）、乳がん幹細胞の生存（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）、及びタモキシフェン耐性（Ｉｇｎａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｒｏｕｈｉｍｏｇｈａｄａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）と関連していることを示している。さらに、その発現は、ＥＲ、ＰＲ、及びｈｅｒ－２／ｎｅｕを欠くトリプルネガティブ乳がんにおいて一般的に保持される（Ｓｔｅｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。したがって、ＧＰＥＲは、エストロゲン応答性のＥＲ中心の見方を広げ（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、乳がんの補助療法の合理的な割付けを導くバイナリルーブリックを混乱させる。「部分的な」（タモキシフェン）及び「純粋な」（フルベストラント及びラロキシフェン）ＥＲアンタゴニストがＧＰＥＲアゴニストとして機能するため（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、これは内分泌療法を受けている患者にとって特に重要である。

【0003】

現在の臨床ガイドラインでは、内分泌抵抗性乳がんの二次治療としてフルベストラントの使用が推奨されている（Ｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｓａｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。フルベストラントは、ＥＲの競合的阻害剤として機能するだけでなく、選択的ＥＲ分解薬（ＳＥＲＤ）としても機能するエストロゲン模倣薬である（Ｐｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。フルベストラントは、このクラスで唯一のＦＤＡ承認薬であり、ＥＲに結合すると、関連する熱ショックシャペロンタンパク質との相互作用が不安定になり、２６ＳプロテアソームでＥＲが分解される（Ｃａｌｌｉｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。このように、フルベストラントは薬剤標的のバイオアベイラビリティを低下させるように作用することで、二次薬剤耐性のリスクを低減する。しかし、フルベストラントの主な制限は、経口投与後のバイオアベイラビリティが低いため、痛みを伴う毎月の筋肉内注射が必要なことである（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0004】

ＥＲを選択的に分解する方法は、ユビキチン－プロテアソーム経路を利用するタンパク質分解ターゲティングキメラ（ＰＲＯｔｅｏｌｙｔｉｃ ＴＡｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒａｓ：ＰＲＯＴＡＣ）の使用によって達成された（Ｃｙｒｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。通常、ＰＲＯＴＡＣは、目的のタンパク質をユビキチン化機構に直接結合するように作用する２つの機能的結合ドメインからなるヘテロ二機能性化合物である。それらは、化学的スペーサーを介してＥ３ユビキチンリガーゼ認識モチーフに結合された標的ドメインで構成されている。結合すると、ＰＲＯＴＡＣはその標的をポリユビキチン化し、分解のために２６Ｓプロテアソームに向ける。ＰＲＯＴＡＣは、広範囲の細胞質、核、及び原形質膜タンパク質を標的とするために使用されてきたという利点を提供する（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。効率的なＰＲＯＴＡＣ分解ではあるが、標的化及びＥ３リガーゼ動員ドメインの空間的配置を最適化するための体系的なアプローチが必要である（Ｂｏｎｄｅｓｏｎｅｔａｌ．，２０１８）。ＰＲＯＴＡＣは、目的の標的タンパク質に対して高い特異性と処理能力を提供するという追加の利点を提供する。したがって、標的分子の濃度を効果的に減らし、薬剤耐性変異体が進化する可能性を低下させる。この戦略は、ＥＲのダウンモジュレートに成功裏に使用されており、ＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、それぞれ異なる化学的スペーサーでタンパク質又は小分子Ｅ３リガーゼ動員モチーフに結合された１７β－エストラジオール（１７ｂ－Ｅ２）（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）、エンドキシフェン（Ｄｒａｇｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０２０）、ラロキシフェン（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、及びタモキシフェン（Ｆａｎ，２０２０）を含む様々なエストロゲン誘導体からなる標的ドメインと共に開発されている。ＥＲα、ＥＲβ、及びＧＰＥＲは、天然及び合成エストロゲンに対する結合親和性が異なるが（Ｐｒｉｓｓｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、低ナノモル範囲での解離定数の測定ではそれぞれ１７β－エストラジオール（Ｅ２）に対して高い結合親和性を示す。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、Ｇタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）を不活性化することができるＰＲＯＴＡＣを提供する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＥＲを不活性化することができる、又は活性化しない、経口送達される小分子ＰＲＯＴＡＣを提供し、これは、例えば、最も治療が困難な乳がんの１つであるトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）などのがんを治療するのに有用である。ＴＮＢＣは、有効な治療標的がなく、一般的に（ＴＮＢＣの８０％超で）ＧＰＥＲを発現するタイプの乳がんである。本明細書に開示されるＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、例えばＴＮＢＣにおけるＧＰＥＲのタンパク質分解を増強することで、がんの進行を遅延又は阻害し、したがって内分泌療法をＴＮＢＣに使用できることを証明する。ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、例えば、現在内分泌療法に不適格であると判断されている患者における他のタイプの乳がん又は婦人科がんなどの他のがんにも有用であり得る。ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、既存の治療法（例えば、アロマターゼ阻害剤）と組み合わせて使用することもできる。一実施形態では、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは経口送達される。一実施形態では、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、ＥＲα、ＥＲβ及びＧＰＥＲと相互作用し、それらを分解するＥ２ベースのＰＲＯＴＡＣ、例えばＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２）であり、例えばそれは総エストロゲン受容体阻害剤である。一実施形態では、二重特異性ＰＲＯＴＡＣは原形質膜及び細胞内エストロゲン受容体と相互作用し、ユビキチン－プロテアソーム依存性分解を促進する。

【0006】

ＧＰＥＲを不活性化するためのＰＲＯＴＡＣは、例えば、［３Ｈ］－１７β－エストラジオール（１７β－Ｅ２）をトレーサーとして使用した競合的放射性受容体結合アッセイを使用して評価され、標的細胞、例えば乳がん細胞の原形質膜におけるＧＰＥＲ特異的結合を決定する。ＧＰＥＲを不活性化するためのＰＲＯＴＡＣは、乳がん細胞株などのがん細胞株でＧＰＥＲのプロテアソーム分解を促進する能力、及び小さな原発性ＴＮＢＣ腫瘍を使用した自然発生がんモデルなどの動物モデルでの抗発がん効果についても評価される。本明細書に開示されるように、ＧＰＥＲを不活性化するための例示的なＰＲＯＴＡＣであるＵＩＥＰ００１は、天然及び組換えＧＰＥＲ原形質膜タンパク質を減少させ、ＨＡ－ＧＰＥＲの定常状態発現を減少させるが、ＨＡ－β１ＡＲは減少させないことが示された。

【0007】

一実施形態では、本開示は、Ｅ３リガーゼのリガンドに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを提供する。一実施形態では、本開示は、リンカーに結合した、例えば共有結合を介して化学的に連結されたＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを提供し、これはさらに、例えば共有結合を介してＥ３リガーゼのリガンドに結合される。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドは、１７β－エストラジオール、エストロン、フィトエストロゲン、キセノエストロゲン、エストリオール、エストリオール３－硫酸、エストリオール１７－硫酸、Ｇ－１、Ｇ－１５、Ｇ－３６、ゲニステイン又はケルセチンを含む。一実施形態では、フィトエストロゲンは、フラボン、イソフラボン、リグニン サポニン、クメスチン、又はスチルベンを含む。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドは、ビスフェノール、アルキルフェノール、メトキシフェノール、ポリ塩化ビフェニル、又はダイオキシンを含む。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドはＧＰＥＲアンタゴニストである。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドはＧＰＥＲアゴニストである。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドは、２－シクロヘキシル－４－イソロピル－Ｎ－（４－メトキシベンジル）アニリンではない。一実施形態では、ＧＰＥＲ ＰＲＯＴＡＣは式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）を有しない。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドは２－シクロヘキシル－４－イソプロピル－Ｎ－（４－メトキシベンジル）アニリンを含む。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドはＥＲに結合しない。一実施形態では、Ｅ３リガーゼリガンドはフォン・ヒッペルリガーゼ（ＶＨＬ）リガンドである。一実施形態では、Ｅ３リガーゼリガンドは、レナリドマイド、ポマリドマイド、イベルドマイド、（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ、サリドマイド、ＶＨ－２９８、ＣＣ－８８５、Ｅ３リガーゼリガンド８、ＴＤ－１０６、ＶＬ２８５、ＶＨ０３２、ＶＨ１０１、ＶＨ２９８、ＶＨＬリガンド４、ＶＨＬリガンド７（Ｓｃｈｅｅｐｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｏｕｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．，１７：１６０（２０１９）参照、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）、ＶＨＬ－２リガンド３、Ｅ３リガーゼリガンド３、Ｅ３リガーゼリガンド２、セレブロン、ＣＣ－１２２、又はＢＣ－１２１５を含む。一実施形態において、リンカーは、２～２００個の原子を有する鎖を有する。一実施形態において、リンカーは、５～２５個の原子を有する鎖を有する。一実施形態では、リンカーは、２５～５０個の原子を有する鎖を有する。一実施形態では、リンカーは、３０～５０個の原子を有する鎖を有する。一実施形態では、リンカーは、５０～１００個の原子を有する鎖を有する。一実施形態では、リンカーはアルキルリンカーである。一実施形態では、リンカーはヘテロアルキルリンカーである。一実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、２、３、４、又は５個のＰＥＧ単位、及び任意選択で、アミド基などの１つ以上の他の基を含む。一実施形態では、リンカーは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のＰＥＧ単位、及び任意選択でアミド基などの１つ以上の他の基を含む。一実施形態では、リンカーは、切断可能なＰＥＧリンカー、例えば、ジスルフィド結合を有するものを含む。一実施形態では、リンカーは、脊椎動物細胞の膜にまたがることができる長さのものであり、例えば、少なくとも５～１０ｎｍの長さである。一実施形態では、リンカーは、少なくとも３個のＰＥＧ単位、例えば（ＯＣＣ）_３を含む。一実施形態では、リンカーは、少なくとも４個のＰＥＧ単位、例えば（ＯＣＣ）_４を含む。一実施形態では、リンカーは、少なくとも５個のＰＥＧ単位を有する。一実施形態では、リンカーはＣ_１～Ｃ_１０アルキル（ＰＥＧ）ｎ．少なくとも４個のＰＥＧ単位、例えば（ＯＣＣ）_４を含む。一実施形態では、リンカーは（ＰＥＧ）_ｎＮＨ（ＣＯ）（ＰＥＧ）_ｍを含み、ｎ及びｍは独立して１～１５である。一実施形態では、ｎ及びｍは独立して３～１０である。一実施形態では、ｎは５～１０であり、ｍは３～６である。

【0008】

一実施形態では、リンカーは、ＧＰＥＲリガンドとＥ３ユビキチンリガーゼリガンドとの間の直線経路で数えて５～２００個の原子の鎖長を有する主鎖を有する。一実施形態では、リンカーは、ＧＰＥＲリガンドとＥ３ユビキチンリガーゼリガンドとの間の直線経路で数えて、１５～５０個の原子の鎖長を有する主鎖を有する。一実施形態では、リンカーは、ＧＰＥＲリガンドとＥ３ユビキチンリガーゼリガンドとの間の直線経路で数えて２０～５０個の原子の鎖長を有する主鎖を有する。一実施形態において、リンカーは、ＧＰＥＲリガンドとＥ３ユビキチンリガーゼリガンドとの間の直線経路における結合長を合計することにより決定された計算長で８～３００オングストロームの長さを有する主鎖を有する。

【0009】

一実施形態では、リンカーは、ＧＰＥＲリガンドとＥ３ユビキチンリガーゼリガンドとの間の直線経路における結合長を合計することにより決定された計算長で２５～７５オングストロームの長さを有する主鎖を有する。一実施形態では、リンカーは

【0010】

【化1】

【0011】

の構造を有し、Ｑは、結合又はＧＰＥＲリガンドへの共有結合を形成する二価の基であり；Ｚは、１つ以上のアルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アルキルアミノ、アルキルグリコール、カルボニル、チオカルボニル、アシル、カルバマート、尿素、チオカルバマート、チオ尿素、ジチオカルバマート、アミノカルボニル、アミド、エステル、チオエステル、チオアミド、アミン、酸素、硫黄、スルホン、又はスルホキシドを、二価の形態で含む直鎖であり；Ｇは、結合又はＥ３ユビキチンリガーゼリガンドへの共有結合を形成する二価の基である。一実施形態では、リンカーは

【0012】

【化2】

【0013】

の構造を有し、Ｑは、結合又はＧＰＥＲリガンドへの結合を形成する二価の基であり；
Ｒは、二価の形態のアルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アルキルアミノ、アルキルグリコール、カルボニル、チオカルボニル、アシル、カルバマート、尿素、チオカルバマート、チオ尿素、ジチオカルバマート、アミノカルボニル、アミド、エステル、チオエステル、チオアミド、アミン、酸素、硫黄、スルホン、又はスルホキシドであり；Ｇは、結合又はＥ３ユビキチンリガーゼリガンドへの結合を形成する二価の基であり；ｍ、ｎ、ｐ、及びｑは、存在する場合、ｍ、ｎ、ｐ、及びｑのうちの少なくとも１つが０より大きい整数であることを条件として、それぞれ独立して０～５０の整数である。一実施形態では、Ｑ及びＧは、独立して、二価の形態のカルボニル、チオカルボニル、アシル、カルバマート、尿素、チオカルバマート、チオ尿素、ジチオカルバマート、アミノカルボニル、アミド、エステル、チオエステル、チオアミド、スルホン、又はスルホキシドである。一実施形態では、Ｑ及びＧは、独立して、カルボニル、又は、アセチル、２－ヒドロキシアセチル、２－アミノアセチル、プロピオニル、３－ヒドロキシプロパノイル、３－アミノプロパノイル、ブタノイル、４－ヒドロキシブタノイル、及び４－アミノブタノイルからなる群から選択されるアシルであり、これらはそれぞれ二価の形態である。

【0014】

一実施形態では、ｍ及びｎは、存在する場合、それぞれ独立して、０～２の整数であり、Ｑ及びＧは、それぞれ独立して、カルボニル、チオカルボニル、アセチル、２－ヒドロキシアセチル、２－アミノアセチル、プロピオニル、３－ヒドロキシプロパノイル、３－アミノプロパノイル、ブタノイル、４－ヒドロキシブタノイル、４－アミノブタノイル、カルバマート、尿素、チオカルバマート、チオ尿素、ジチオカルバマート、アミノカルボニル、アミド、エステル、チオエステル、チオアミド、スルホン、又はスルホキシドであり、これらはそれぞれ二価の形態である。一実施形態では、Ｚは親水性である。一実施形態では、リンカーは

【0015】

【化3】

【0016】

の構造を有し、これは直線経路で数えて原子１３個の長さを有する主鎖を提供する。一実施形態では、リンカーは

【0017】

【化4】

【0018】

の構造を有し、ｐ及びｑは、それぞれ独立して、０～５０の整数である。一実施形態では、リンカーは、二価アルキル基、二価のヘテロアルキル基、又は二価のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のうちの１つ以上、又はそれぞれを１つ以上含む。一実施形態では、リンカーは、５個以上の二価のエトキシ（－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－）基を含む。一実施形態では、リンカーは、炭素２個ごとに１個以上のヘテロ原子を含み、ブチルより長いアルキル鎖を含まない。一実施形態では、リンカーは、ＧＰＥＲリガンドの酸素、窒素、硫黄、カルボニル、又はエチニルを介してＧＰＥＲリガンドに結合し、リンカーは、Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンドの酸素、窒素、硫黄、カルボニル、又はエチニルを介してＥ３ユビキチンリガーゼリガンドに結合する。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドはエストロゲンステロイドであり、エストロゲンステロイドのＣ６又はＣ１７に位置する酸素、アミン、硫黄、ビニル、エチン、及びカルボニルから選択される二価の基を含み、Ｃ６又はＣ１７の上記二価の基はリンカーに結合される。一実施形態において、Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンドは、（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣであり、これは（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣのアミンを介してリンカーに結合される。

【0019】

また、上記分子を使用する方法も提供される。一実施形態では、哺乳動物において内分泌抵抗性がん又はホルモン療法抵抗性がんを予防、阻害、又は治療する方法が提供される。この方法は、Ｅ３リガーゼのリガンドに結合したリンカーに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む有効量の分子を有する組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。一実施形態では、投与は全身性である。一実施形態では、投与は経口である。一実施形態では、組成物は錠剤である。一実施形態では、組成物は液体である。一実施形態では、組成物は注射される。一実施形態では、哺乳動物は、アロマターゼ阻害剤療法に耐性のあるヒトである。

【0020】

また、哺乳動物におけるトリプルネガティブ乳がんを予防、阻害、又は治療する方法が提供され、この方法は、Ｅ３リガーゼのリガンドに結合したリンカーに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む有効量の分子を有する組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。一実施形態では、投与は全身性である。一実施形態では、投与は経口である。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドはＧＰＥＲアンタゴニストである。

【0021】

雌性哺乳動物における婦人科がん、例えば、子宮頸がん、卵巣がん又は子宮内膜がんを予防、阻害、又は治療する方法がさらに提供され、この方法は、Ｅ３リガーゼのリガンドに結合したリンカーに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む有効量の分子を有する組成物を上記哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。一実施形態では、投与は全身性である。一実施形態では、投与は経口である。

【0022】

哺乳動物において、前立腺がん又は結腸がんを含むがん、又はホルモン依存性でない任意のがんを予防、阻害、又は治療する方法もまた提供され、この方法は、Ｅ３リガーゼのリガンドに結合したリンカーに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む有効量の分子を有する組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。一実施形態では、投与は全身性である。一実施形態では、投与は経口である。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドはＧＰＥＲアンタゴニストである。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】例示的なＰＲＯＴＡＣによるＧＰＥＲのタンパク質分解ターゲティング。

【図2】Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣ、ＵＩ－ＥＰ００１の構造確定。

【図3】ＰＲＯＴＡＣプロトタイプＵＩ－ＥＰ００１は表面ＧＰＥＲを低減する。ＵＩ－ＥＰ００１（１００ｕＭ、１６時間）は、表面組換えＧＰＥＲのダウンモジュレーションを引き起こす。右は、３つの顕微鏡視野から測定された補正された全赤色蛍光によって定量化された結果。

【図4】ＰＲＯＴＡＣプロトタイプＵＩ－ＥＰ００１は表面ＧＰＥＲを低減する。ｈｅｒ２＋及びＴＮＢＣ乳がん細胞の天然ＧＰＥＲについても同様の結果が得られた。

【図5】トリプルネガティブ乳がん治療のためのＧＲＥＲ ＰＲＯＴＡＣ。

【図6】Ｅ２β－ＰＲＯＴＡＣ（１００ｕＭ）は、表面のＧＰＥＲを低減することができる。

【図7】Ｅ２β－ＰＲＯＴＡＣ（１００ｕＭ）は、表面のＧＰＥＲを低減することができる。

【図8】Ｅ２β－ＰＲＯＴＡＣ（１００ｕＭ）は、表面のＧＰＥＲを低減することができる。

【図9】Ｅ２β－ＰＲＯＴＡＣ（１００ｕＭ）は、表面のＧＰＥＲを低減することができる。

【図10】ＵＩ－ＥＰ００１ダウンモジュレーションの特異性の評価。

【図11】レストブルー（ｒｅｓｔｏｂｌｕｅ）アッセイ。

【図12】Ｅ_２－ＰＲＯＴＡＣ及び部分的ＰＲＯＴＡＣで処理したＨＣＣ１８０６及びＳＫＢＲ３の生存率の比較（処理の１２時間後）。

【図13】Ｅ_２－ＰＲＯＴＡＣ及び部分的ＰＲＯＴＡＣで処理したＨＣＣ１８０６及びＳＫＢＲ３の生存率の比較（処理の２４時間後）。

【図14】エストラジオール飽和で前処理したＨＣＣ１８０６細胞株の生存率の比較（２４時間の処理）。

【図15】エストラジオール飽和で前処理したＳＫＢＲ３細胞株の生存率の比較（２４時間の処理）。

【図16】ＩＣ５０値。

【図17】ＰＲＯＴＡＣ作用のメカニズム。ＰＲＯＴＡＣは、標的タンパク質をＥ３リガーゼに結合させ、そのポリユビキチン化とプロテアソーム分解を引き起こす。

【図18】Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣ（ＵＩ－ＥＰ００１）は、ヒト乳がん細胞においてＧＰＥＲをダウンモジュレーションする。ＵＩ－ＥＰ００１の構造（Ａ）とＮＭＲスペクトル（Ｂ）。ヒトＳＫＢＲ３（Ｈｅｒ２＋）及びＨＣＣ－１８０６（ＴＮＢＣ）乳がん細胞を、ビヒクル（未処理）又は１００μＭの部分的ＰＲＯＴＡＣ又はＥ２β－ＰＲＯＴＡＣ、ＵＩ－ＥＰ００１に１６時間曝露した。細胞をＧＰＥＲ抗体で３０分間免疫染色し、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ５９４ＩｇＧ（赤）を使用して表面ＧＰＥＲを検出した。核をＤＡＰＩ（青）で対比させた。（Ｃ）ＨＡ－ＧＰＥＲ又はＨＡ－β１ＡＲ細胞を指定された時間ＵＩ－ＥＰ００１で処理し、ＨＡ抗体（Ｄ）でイムノブロッティングするか、表面受容体を免疫染色した（Ｅ）。処理した及び未処理のＨＡ－ＧＰＥＲ又はＨＡ－β１ＡＲ細胞の全補正赤色蛍光（赤）（ＴＣＲＦ）を、細胞のバックグラウンドを差し引くことにより測定した。Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣ、ＵＩ－ＥＰ００１、ＨＡ－ＧＰＥＲの存在下でＧＰＥＲの有意な分解が観察されたが、ΗＡ－β１ＡＲ細胞では観察されなかった（Ｆ）。データは示していないが、遊離１７β－Ｅ２で同様に処理した細胞では、表面ＧＰＥＲ発現に違いは測定されない。

【図19】低分子ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの設計。１７β－エストラジオールは、そのエストラン環のＣ６又はＣ－１７を介して、ＶＨＬ由来のユビキチンＥ３リガーゼリガンド（Ｓ，Ｒ，Ｓ）ＡＨＰＣに対する様々なサブユニット長の化学リンカーに結合する。

【図20】Ｃ－１７結合ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの合成。（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ－ＰＥＧ２－ＣＯＯＨからなる部分的ＰＲＯＴＡＣ；（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣＰＥＧ４－ＣＯＯＨ又は（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ－ＰＥＧ６－ＣＯＯＨは、ＥＤＣカップリングによって１７β－エストラジオールの１７β－ＯＨ基を介して結合される。

【図21】Ｃ－６結合ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの合成。（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ－ＰＥＧ２－ＣＯＯＨからなる部分的ＰＲＯＴＡＣ；（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ－ＰＥＧ４－ＣＯＯＨ又は（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ－ＰＥＧ６－ＣＯＯＨは、上図のいくつかのステップでＣ－６炭素原子に結合される。

【図22】ＮａｎｏＢｉＴ発光アッセイによる原形質膜及び細胞内ＧＰＥＲの検出、インタクト又は界面活性剤透過処理。ＨＥＫ２９３細胞又はＨｉＢｉＴ－ＧＰＥＲ－ＨＥＫ２９３細胞を、周囲温度で４分間、可溶性ＬｇＢｉＴタンパク質及び発光基質で標識した。発光を、４連（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）のサンプルから測定した。細胞を含まない空のウェルのバックグラウンドを差し引いて、相対発光単位（ＲＬＵ）として報告した。

【図23】ＧＰＥＲ及びＥＲαにおけるＰＲＯＴＡＣのモデリング。Ａ）ＵＩ－ＥＰ００１（青）とＵＩ－ＥＰ００２（緑）はＧＰＥＲ相同性モデル内で結合し、２つの異なる長さで結合ポケットを出るリンカーを有するように設計されている。Ｂ）ＴＭ１とＴＭ７の間からのＵＩ－ＥＰ００１（青）とＵＩ－ＥＰ００２（緑）の出口を示すＧＰＥＲ結合ポケット（灰色の表面）。Ｃ）ＥＲαホモ二量体（ＰＤＢ：１Ａ５２）のＥＲαリガンドドメイン内に結合したＵＩ－ＥＰ００１（青）及びＵＩ－ＥＰ００２（緑）。Ｄ）ＵＩ－ＥＰ００１（青）とＵＩ－ＥＰ００２（緑）の出口を示すＥＲα結合ポケット（灰色の表面）。

【図24】ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２の合成。スキーム１：部分的ＰＲＯＴＡＣ（化合物７）の合成、試薬及び条件：（ｉ）ＮａＨ、ジオキサン、ｒｔ、一晩；（ｉｉ）ＴＦＡ／ＤＣＭ、ｒｔ、２時間；（ｉｉｉ）Ｐｄ（ＯＡｃ）_２、ＫＯＡｃ、ＤＭＡｃ、１２０℃、２４時間；（ｉｖ）ＣｏＣｌ_２、ＮａＢＨ_４、無水メタノール、０℃からｒｔ、２時間；（ｖ）ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、無水ＤＭＦ、ｒｔ、一晩；（ｖｉ）１．ＴＦＡ／ＤＣＭ、ｒｔ、３０分；２．Ｂｏｃ－Ｔｌｅ－ＯＨ、ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、無水ＤＭＦ、ｒｔ、一晩；（ｖｉｉ）化合物２、ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ｒｔ、一晩。スキーム２：ＵＩ－ＥＰ００１（化合物８）の合成。試薬及び条件：（ｖｉｉｉ）ＤＭＡＰ、ＥＤＣ、無水ＤＭＦ、ｒｔ、４８時間。スキーム３：ＵＩ－ＥＰ００２（化合物１０）の合成。試薬及び条件：（ｉｘ）Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ_８－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ、ＤＭＡＰ、ＥＤＣ、無水ＤＭＦ、ｒｔ、７２ｈ；（ｘ）１．Ｅｔ_３Ｎ、無水ＤＭＦ；２．化合物７、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、無水ＤＭＦ、ｒｔ、４８時間。

【図25】Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣは、ＧＰＥＲ及びＥＲへの高親和性結合を介して作用する。Ａ）インタクトＨＥＫ－２９３（ＥＲ^－、ＧＰＥＲ^－）、ＨＡ－ＧＰＥＲ（ＥＲ^－、ＧＰＥＲ^＋）、ＳＫＢＲ３（ＥＲ^－、ＧＰＥＲ^＋）及びＭＣＦ－７（ＥＲ^＋、ＧＰＥＲ^＋）細胞をウサギＧＰＥＲ抗体で４℃で標識した。次に、表面ＧＰＥＲをＡｌｅｘａ５９４結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（赤）で可視化した。Ｂ）Ｅ２－ＦＩＴＣ濃度の関数として計算された、インタクトＳＫＢＲ３細胞における特異的結合。Ｃ）フルオロトレーサーとしてＥ２－ＦＩＴＣを用いた競合結合アッセイによって測定された、インタクトＳＫＢＲ３細胞における１７ｂ－Ｅ２、ＵＩ－ＥＰ００１、ＵＩ－ＥＰ００２、及び部分的ＰＲＯＴＡＣの特異的結合。Ｄ）ＭＣＦ－７細胞から調製されたサイトゾルタンパク質の濃度を増加させながら、１０ｎＭのＥ２－ＦＩＴＣを用いたＥ２－ＦＩＴＣ総結合の決定。Ｅ）ＭＣＦ－７細胞から調製されたサイトゾル画分におけるＥ２、ＵＩ－ＥＰ００１、ＵＩ－ＥＰ００２、及び部分的ＰＲＯＴＡＣの特異的結合を評価するためのＥ２－ＦＩＴＣを用いた蛍光偏光アッセイ。平均値及びＳＤは、３回の独立した実験から得た。

【図26】Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣは、組換え膜及び細胞内エストロゲン受容体の急速な喪失を促進する。ＨＥＫ－２９３細胞（ＥＲα、ＧＰＥＲ）に５０ｎｇのＨｉＢｉＴ－ＧＰＥＲ又はＨｉＢｉＴ－ＥＲとｐｃＤＮＡ３．１（＋）ゼオキャリアプラスミドを一過性にトランスフェクトした。（Ａ）ＨｉＢｉＴ－ＧＰＥＲ及び（Ｂ）ＨｉＢｉＴ－ＥＲαの濃度応答曲線を、用量漸増ＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２のいずれかで１時間処理した後、細胞外ＬｇＢｉＴ及び界面活性剤で透過処理した細胞で発光基質を使用して測定した。（Ｃ）１００ｍＭの薬物又は対照で１時間処理した後の全ＨｉＢｉＴ－ＧＰＥＲ及びＨｉＢｉＴ－ＥＲを示すヒストグラム。細胞を１００μＭのＵＩ－ＥＰ００１、ＵＩ－ＥＰ００２、及び部分的ＰＲＯＴＡＣと共に１～８時間の様々なインキュベーション期間でインキュベーションした後の（Ｄ）ＨｉＢｉＴ－ＧＰＥＲ及び（Ｅ）ＨｉＢｉＴ－ＥＲαの動態。示されている結果は、３回の独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．を表している。（^＊＊＊、Ｐ＜０．０００４；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；一元配置分散分析）。

【図27】Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣＳは、天然及び組換えＧＰＥＲの発現を選択的に減少させる。（Ａ）ＨＡ－ＧＰＥＲ、ＨＡ－β１ＡＲ、又はＨＡ－ＣＸＣＲ４を安定して発現するＨＥＫ－２９３細胞を、１００μＭのＵＩ－ＥＰ００１、ＵＩ－ＥＰ００２、及び部分的ＰＲＯＴＡＣで１時間処理した。固定した細胞を透過処理してからウサギＨＡ抗体で標識し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４抗ウサギ二次抗体（赤）を使用して全受容体を可視化した。（Ｂ）ビヒクル、ＵＩ－ＥＰ００１、ＵＩ－ＥＰ００２、及び部分的ＰＲＯＴＡＣのいずれかで処理したＨＡ－ＧＰＥＲ、ΗＡ－β１ＡＲ、及びＨＡ－ＣＸＣＲ４細胞の画像からの補正全赤色蛍光（Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ Ｔｏｔａｌ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＣＴＲＦ）を、３つの異なる顕微鏡視野からＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して測定した（^＊＊＊、Ｐ＜０．０００４；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；一元配置分散分析）。（Ｃ）ＭＣＦ－７（ＥＲａ^＋、ＥＲｂ^＋、ＰＲ^＋、ＧＰＥＲ^＋）細胞を、ビヒクル、ＵＩ－ＥＰ００１、ＵＩ－ＥＰ００２、又は部分的ＰＲＯＴＡＣとともに３７℃で１時間インキュベートした後、マウスＥＲα、ウサギＥＲβ、マウスＰＲ、及びウサギＧＰＥＲ抗体で免疫染色し、Ａｌｅｘａ４８８結合抗マウスＩｇＧ又はＡｌｅｘａ４８８結合抗ウサギＩｇＧ（緑）で検出した。（Ｄ）ＣＴＲＦとして測定された（Ｃ）の画像からの結果の定量化。（Ｅ）ＳＫＢＲ３（ＥＲα^＋、ＥＲｂ^－、ＧＰＥＲ^＋）細胞をビヒクル（１％ＤＭＳＯ）、１００ｕＭのＵＩ－ＥＰ００１、ＵＩ－ＥＰ００２、又は部分的ＰＲＯＴＡＣと共に１時間インキュベートした。表面及び細胞内ＧＰＥＲを、インタクト又は界面活性剤透過処理細胞において、それぞれウサギＧＰＥＲ抗体及びＡｌｅｘａ５９４結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（赤）を使用して可視化した。

【図28】Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣは、ＧＰＥＲ及びＥＲαのプロテアソーム依存性分解を誘導する。（Ａ）ＨｉＢｉＴ－ＧＰＥＲ及び（Ｂ）ＨｉＢｉＴ－ＥＲαを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３細胞を、漸増濃度のＥ２β又はアルドステロンの存在下で１００μＭのＵＩ－ＥＰ００１で処理した。その後、全受容体を界面活性剤透過処理細胞におけるバイナリ発光相補性（ｂｉｎａｒｙ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって測定した。（Ｃ）一過性にトランスフェクトした細胞における、１００μＭのＵＩ－ＥＰ００１単独又は１００μＭのＥ２又はアルドステロンと組み合わせた効果。^＊＊＊＊は統計的有意性、Ｐ＜０．０００１以下を示す。（Ｄ）１００μＭのＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２の存在下又は非存在下で、（Ｄ）１０μＭのＭＧ１３２又は（Ｅ）１００μＭのクロロキンのいずれかで細胞を１時間処理した。次に、全受容体をバイナリ発光相補性によって定量化した。３回の独立した実験から得られた代表的な発光データと、平均値と、ＳＤが表示されている。（^＊＊＊、ｐ＜０．０００４；^＊＊、Ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意差なし；一元配置分散分析）。

【図29】Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣは、ヒト乳がん細胞でエストロゲン受容体特異的な細胞毒性を誘発する。ＳＫＢＲ３、ＨＣＣ－１８０６、ＭＣＦ－７、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞の細胞生存率を、ＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２又は部分的ＰＲＯＴＡＣの濃度を漸増させて２４時間処理した後に測定した。示されている結果は、３回の独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．を表している。

【図30】Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣＳは、エストロゲン受容体依存的Ｇ２／Ｍ停止を促進する。Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣは、膜及び／又は細胞内エストロゲン受容体を発現するヒト乳がん細胞株でＧ２／Ｍ停止を誘発した。１０％ＦＢＳで増殖中のＳＫＢＲ３、ＨＣＣ－１８０６、ＭＣＦ－７、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、１０μＭのＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２又は部分的ＰＲＯＴＡＣで２４時間処理した。固定した細胞を透過処理し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。フローサイトメーターで細胞周期データを取得し、Ｆｌｏｗ－Ｊｏソフトウェアを使用して分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表される。Ｐｒｉｓｍ８．０を使用して、各フェーズの細胞の割合をプロットした。

【図31】Ｅ２－ＦＩＴＣ合成スキーム。

【図32】例示的な構造。

【図33-1】ＮＭＲデータ。

【図33-2】ＮＭＲデータ。

【図33-3】ＮＭＲデータ。

【図33-4】ＮＭＲデータ。

【図33-5】ＮＭＲデータ。

【図33-6】ＮＭＲデータ。

【図34】細胞周期解析のためのゲーティング法。最初のゲートを散布図（Ａ）に適用することで、デブリをゲートアウトした。細胞が識別されたので、２番目のゲートを、パルス処理（パルス幅対パルス面積）（Ｂ）を使用して単一細胞集団に適用することで、分析から細胞ダブレットを除外した。この細胞集団から、各フェーズの各亜集団の割合をヒストグラムプロット（Ｃ）によって決定した。

【図35】ＭＣＦ７で攻撃したヌードマウス（２日ごとに１００μｌのＩＴ処理（７×）。

【図36】ＭＣＦ７で攻撃したヌードマウス（２日ごとに１００μｌのＩＴ処理（７×）。

【図37】ＳＫＢ３で攻撃したヌードマウス（２日ごとに１００μｌのＩＴ処理（７×）。

【図38】ＣＩＭＢＡ－ＰＲＯＴＡＣは組換えＧＰＥＲを分解する。組換えＨＡタグ付きＧＰＥＲを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞を、様々な濃度のＣＩＭＢＡ－ＰＲＯＴＡＣ－００１又は部分的ＰＲＯＴＡＣで１６時間処理した後、界面活性剤で溶解させた。等量のタンパク質溶解物をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで分離し、次いでＰＶＤＦナイロンメンブレンにエレクトロトランスファーした。膜をウサギＨＡ抗体で調査した。ＨＡ－抗体を低ｐＨで膜から剥がし、次いで膜を特異性及びローディング対照としてトランスフェリン受容体（ＴＦＮＲ）抗体で調査し、剥がした。

【図39】ＧＰＥＲ結合剤として２－シクロヘキシル－４－イソプロピル－Ｎ－（４－メトキシベンジル）アニリンを有するＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの例示的な構造（式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ））。

【図40】例示的なＥ３リガーゼのリガンド。

【発明を実施するための形態】

【0024】

詳細な説明
乳がんはエストロゲンによって引き起こされる悪性腫瘍であり、エストロゲン作用の遮断は乳がんに対して非常に効果的であり、他の形態のがん治療よりもはるかに毒性が低い。しかし、ＥＲ機能及びエストロゲン生合成を阻害する戦略は、閉経後の、初期のＥＲ陽性（ＥＲ＋）乳がんの女性にのみ使用するのに適している。さらに、薬剤耐性が発生すること、及び副作用が深刻になる可能性がある（Ｒｕｇｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。フルベストラントなどの選択的エストロゲン受容体分解剤（ＳＥＲＤ）は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんの治療、特に内分泌抵抗性疾患を発症する患者の治療に有効な薬剤である。ＳＥＲＤは、ＥＲに結合し、２６Ｓ－プロテアソームでのそれの破壊をもたらすアロステリック変化を誘発することによって機能する。ＥＲ分解剤であるフルベストラントは、内分泌抵抗性乳がんの二次治療として使用されるが、バイオアベイラビリティが低いため、痛みを伴う毎月の筋肉内注射が必要である（Ｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。

【0025】

エストロゲンは、オーファンＧＰＣＲホモログであるＧＰＲ３０（別名ＧＰＥＲ）を介して作用し、Ｇｂｇサブユニットタンパク質依存性ＨＢ－ＥＧＦオートクリンループをトリガーする。この発見は、エストロゲンのＥＧＦ様効果の最初のメカニズム説明を提供した。ＧＰＲ３０は、特異的なエストロゲン結合を有し、アデニリルシクラーゼに結合しているＧｓ共役受容体である。ＧＰＥＲトラフィッキングに関する研究は、それが原形質膜でユビキチン化され、プロテアソーム分解の前にトランスゴルジネットワークへのクラスリン媒介、ｂ－アレスチン非依存性逆行性輸送を使用することを示した。

【0026】

インテグリンａ５ｂ１は、ＧＰＥＲを介したＥＧＦＲトランス活性化における膜貫通シグナル伝達を仲介する。ＧＰＥＲを介したエストロゲン作用は、フィブロネクチンマトリックスアセンブリ及びＥＧＦ放出、細胞生存に関連する細胞作用を協調的に促進する。例えば、Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ．ａｌ．（２０００）；Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ．ａｌ．（２００２）；Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）を参照されたい。

【0027】

ＧＰＥＲは、乳房腫瘍標本のＥＲとは独立して発現される。さらに、ＧＰＥＲは進行性乳がんのマーカーと直接関連しており、これらの同じ予後変数を持つＥＲとは正反対の関係である。ＧＰＥＲはまた、女性生殖器がんの予後不良とも関連している。ＧＰＥＲは発情期に皮質上皮でアップレギュレートされ、視床下部内及び黄体形成ホルモン放出の神経機能におけるＧＰＥＲの役割に関していくつかのグループと協調している。例えば、Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｎｏｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００９）；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）；及びＷａｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。

【0028】

したがって、ＧＰＥＲの発現はＥＲ＋乳がんに限定されないため（Ｐｒｉｓｓｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｎｅｋｌｅｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、ＧＰＥＲは乳がんがエストロゲンに応答する代替メカニズムを提供する（Ｉｇｎａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0029】

ＴＮＢＣ患者１２１人を対象とした最近の調査では、これらの腫瘍の８０％以上でこの受容体が発現していることが示唆されている。ＴＮＢＣの大部分におけるＧＰＥＲの発現は、他の小規模な研究によって裏付けられており、ＧＰＥＲがＴＮＢＣにおける腫瘍抑制因子であることを示唆する腫瘍及び細胞株のかなり限定的な研究からのデータとは対照的である。進行性乳がんの臨床的予測因子と逆相関するＥＲの発現とは異なり、ＧＰＥＲの発現はこれらの同じ変数と直接関連しており、転移に関与していることを示唆している。したがって、ＧＰＥＲを選択的に分解するこのタイプの治療薬の開発は、ＴＮＢＣの治療に有望であり、内分泌抵抗性乳がんにも有用である可能性がある。最後に、ＧＰＥＲは婦人科がんの進行性疾患及び予後不良に関連しており、このことは、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣがこれらの患者にも利益をもたらす可能性があることを示唆している。

【0030】

例示的なＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣ
乳がんの治療アルゴリズムはＥＲが中心であり、ＧＰＥＲは国際基礎臨床薬理学連合（ＩＵＰＨＡＲ）によって認識されているにもかかわらず、エストロゲン標的療法の割付けにはまだＧＰＥＲを考慮していない（Ｉｇｎａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＰＲＯＴＡＣは標的を排除し、それによって薬剤耐性の選択を回避するため、治療薬の開発における新しい技術である（Ｎｅｋｌｅｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．２０１８）。ＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、優れた有効性と向上したバイオアベイラビリティを示すため、ＥＲ標的療法に有望である（Ｆｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、ＥＲを標的とする目的で開発されており、合成ＥＲα特異的リガンドで構成されている（Ｆｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｔｒｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。したがって、これらはＧＰＥＲの標的化には効果的ではない。ＧＰＥＲの合成アンタゴニストが存在し（Ｐｒｉｓｓｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、動物モデルで抗腫瘍活性を示すが（Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、それらは腹腔内及び慢性的に送達され、耐性の潜在的な発生を克服しない。ＧＰＥＲを標的とするＰＲＯＴＡＣアプローチは、原形質膜からのＧＰＥＲのダウンモジュレーションがユビキチン－プロテアソーム分解経路を介して起こるため、特に魅力的である（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0031】

ＥＲ及びＧＰＥＲは、内因性エストロゲン、食物由来のエストロゲン、環境エストロゲンの多様なグループに結合する（Ｐｒｉｓｓｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。個々のエストロゲンに対するこれらの受容体の相対的な親和性は異なり、各受容体は異なる物理化学的環境に存在するため、これらの親和性を比較することはできない（Ｐｒｉｓｓｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＥＲ及びＧＰＥＲはどちらも１７α－Ｅ２に高い親和性で結合する。そのため、ＧＰＥＲターゲティングリガンドとして１７α－Ｅ２を有するＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを調製した。ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、標的（ＧＰＥＲリガンド）をＥ３リガーゼに結合させることで、ＧＰＥＲポリユビキチン化及びプロテアソーム分解を引き起こす。

【0032】

Ｇタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）は、ＧＰＣＲスーパーファミリーのメンバーである。刺激に続いて、ＧＰＥＲはその脱感作とエンドサイトーシスにつながる適応変化を受ける。２６Ｓプロテアソームは、内分泌されたＧＰＥＲの自然な行き先であり、それをＰＲＯＴＡＣを介したターゲティングに適したものにしている。ＧＰＥＲは、侵襲性疾患及び乳がん、子宮内膜がん、卵巣がんの予後不良に直接関連している。ＧＰＥＲは１２１例中９７例（＞８０％）のトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）で発現しているため、既知の治療標的がないこの乳がんサブタイプは、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣ療法に最適ながんである。利用可能なＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、ＥＲα特異的リガンドに結合するように最適化されているため、ＧＰＥＲを標的にしていない。本明細書に記載されるように、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣ ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００は、ヒト乳がん細胞におけるＧＰＥＲのダウンモジュレーションを促進した。化学的スペーサーの組成及び長さを変更したＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、ＧＰＥＲ特異的結合について［^３Ｈ］－１７β－エストラジオール（１７－β－Ｅ２）を用いた競合的放射性受容体結合アッセイを使用して試験できる。

【0033】

１７β－Ｅ２に対する相対結合親和性（ＲＢＡ）が最も高いＰＲＯＴＡＣを、定量的免疫蛍光アッセイ及び免疫化学アッセイを使用して、乳がん細胞におけるＧＰＥＲ分解を促進する能力についてアッセイした。ＧＰＥＲ除去の確認には、非常に高感度のバイナリ生物発光相補性アッセイであるＮａｎｏｂｉｔ（商標）を使用してもよい。ＧＰＥＲのポリユビキチン化は、タンデムユビキチン結合エレメント（ＴＵＢＥ）アッセイによって確認され、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を使用してプロテアソーム特異的分解が決定される。ｅｒｂＢ１からｅｒｋへのシグナル伝達軸をトランス活性化するＧＰＥＲの能力も評価される。

【0034】

ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの抗発がん効果、体内分布、及び毒性は、ＴＮＢＣ発がんモデルとして広く使用されているＢＲＣＡ－１変異マウスを使用して、ＴＮＢＣの再発及び転移を遅らせる能力に基づいて試験される。乳がんにおいてＧＰＥＲを不活化することができる、経口送達される低分子ＰＲＯＴＡＣが同定される。これらの小分子は、ＧＰＥＲの不活性化が望まれる他のがん、例えば、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、前立腺がん、又は結腸がんの治療に有用である。

【0035】

例示的な製剤
開示されたＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、生分解性ポリマー分子を含み得るか、又は生分解性ポリマー分子から形成され得る生分解性粒子に含めて送達され得る。生分解性ポリマー分子は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ＰＬＡ及びＰＧＡのコポリマー（すなわち、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＬＧＡ））、ポリ－ε－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（３－ヒドロキシブチラート）、ポリ（ｐ－ジオキサノン）、ポリプロピレンフマラート、ポリ（オルトエステル）、ポリオール／ジケテンアセタール付加ポリマー、ポリ－アルキル－シアノ－アクリラート（ＰＡＣ）、ポリ（セバシン酸無水物）（ＰＳＡ）、ポリ（カルボキシビスカルボキシフェノキシフェノキシヘキソン（ＰＣＰＰ）ポリ［ビス（ｐ－カルボキシフェノキシ）メタン］（ＰＣＰＭ）、ＰＳＡ、ＰＣＰＰ及びＰＣＰＭのコポリマー、ポリ（アミノ酸）、ポリ（擬似アミノ酸）、ポリホスファゼン、ポリ［（ジクロロ）ホスファゼン］及びポリ［（オルガノ）ホスファゼン］の誘導体、ポリヒドロキシ酪酸、又はＳ－カプロン酸、エラスチン、又はゼラチンを含み得るがこれらに限定されない。（例えば、Ｋｕｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ７５（２０１０）１－１８；及び米国特許第６，９１３，７６７号；６，８８４，４３５号；６，５６５，７７７号；６，５３４，０９２号；６，５２８，０８７号；６，３７９，７０４号；６，３０９，５６９号；６，２６４，９８７号；６，２１０，７０７号；６，０９０，９２５号；６，０２２，５６４号；５，９８１，７１９号；５，８７１，７４７号；５，７２３，２６９号；５，６０３，９６０号；及び５，５７８，７０９号；及び米国特許出願公開第２００７／００８１９７２号；及び国際公開第２０１２／１１５８０６号；及び国際公開第２０１２／０５４４２５号を参照されたい。これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0036】

粒子は、当技術分野で知られている方法によって調製することができる。（例えば、Ｎａｇａｖａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｉａｎ Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａ．Ａｎｄ Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ ５，Ｓｕｐｐｌ ３，２０１２，１６～２３頁；Ｃｉｓｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖ．Ｒｏｕｍ．Ｃｈｉｍ．，２０１０，５５（８），４３３－４４２；及び国際公開第２０１２／１１５８０６号；及び国際公開第２０１２／０５４４２５号を参照されたい。これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。粒子を調製するための適切な方法は、予備成形されたポリマーの分散物を利用する方法を含み得、溶媒蒸発、ナノ沈殿、乳化／溶媒拡散、塩析、透析、及び超臨界流体技術を含み得るがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、粒子は、二重エマルション（例えば、水中油中水型）を形成し、続いて溶媒蒸発を行うことによって調製することができる。この方法によって得られた粒子は、必要に応じて、洗浄及び凍結乾燥などのさらなる処理工程に供され得る。任意選択で、粒子は防腐剤（例えば、トレハロース）と組み合わせることができる。

【0037】

典型的には、粒子は、１ミクロン未満の平均有効直径を有し、例えば、粒子は、約２５ｎｍ～約５００ｎｍ、例えば、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、又は約４５０ｎｍ～６５０ｎｍの平均有効直径、又は約２５μｍ～約５００μｍ、例えば、約５０μｍ～約２５０μｍ、約１００μｍ～約１５０μｍ、又は約４５０μｍ～約６５０μｍの平均有効直径を有する。粒子のサイズ（例えば、平均有効直径）は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、光子相関分光法（ＰＣＳ）、ナノ粒子表面積モニター（ＮＳＡＭ）、凝縮粒子カウンター（ＣＰＣ）、微分移動度分析装置（ＤＭＡ）、走査移動度粒子測定装置（ＳＭＰＳ）、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）、Ｘ線回折（ＸＲＤ）、エアロゾル飛行時間型質量分析（ＡＴＦＭＳ）、及びエアロゾル粒子質量分析器（ＡＰＭ）を含むがこれらに限定されない、当技術分野で既知の方法によって評価することができる。

【0038】

一実施形態では、送達ビヒクルは、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、異なる分子量（例えば、２、２２及び２５ｋＤａ）の直鎖及び／又は分岐ＰＥＩなどを含むがこれらに限定されないポリマー、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）やポリメタクリラートなどのデンドリマー；リポソーム、エマルション、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ＤＯＰＥ、又はＤＣ－コレステロールを含むがこれらに限定されない脂質；ポリ－Ｌ－リジン又はプロタミンを含むがこれらに限定されないペプチドベースのベクター；又はポリ（β－アミノエステル）、キトサン、ＰＥＩ－ポリエチレングリコール、ＰＥＩ－マンノース－デキストロース、又はＤＯＴＡＰ－コレステロールを含む。

【0039】

一実施形態では、送達ビヒクルは、グリコポリマーベースの送達ビヒクル、ポリ（グリコアミドアミン）（ＰＧＡＡ）である。これらの材料は、様々な炭水化物のメチルエステル又はラクトン誘導体（Ｄ－グルカル酸塩（Ｄ）、メソガラクタル酸塩（Ｇ）、Ｄ－マンナル酸塩（Ｍ）、及びＬ－酒石酸塩（Ｔ））を一連のオリゴエチレンアミンモノマーと重合することによって作成される。（１～４個のエチレンアミンを含む（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００６）。これらの炭水化物及びポリマー反復単位中の４つのエチレンアミンから構成されるサブセットを使用することができる。

【0040】

一実施形態では、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの送達ビヒクルは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ＰＥＩ－ＰＥＧ、ＰＥＩ－ＰＥＧ－マンノース、デキストラン－ＰＥＩ、ＯＶＡコンジュゲート、ＰＬＧＡマイクロ粒子、又はＰＡＭＡＭでコーティングされたＰＬＧＡマイクロ粒子、又はそれらの任意の組み合わせを含む。ポリマーには、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーが含まれ得るが、これに限定されない。本開示のナノ粒子を調製するのに適したポリアミドアミンデンドリマーには、第３世代、第４世代、第５世代、又は少なくとも第６世代のデンドリマーが含まれ得る。

【0041】

一実施形態では、送達ビヒクルは、脂質、例えば、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロペル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－スペルミンカルボキサミド］エチル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアンモニウムトリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ、リポフェクタミン）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ－［１－（２，３－ジミリストロキシ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｌｏｘｙ））プロピル］；Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３－β－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）；ジオクタデシルアミドグリセリルスペルミン（ＤＯＧＳ、トランスフェクタム）；又はイメチルジオクタデクリアンモニウムブロミド（ｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｌｙａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）（ＤＤＡＢ）を含む。カチオン性脂質の正に荷電した親水性頭部基は、通常、第三級及び第四級アミン、ポリアミン、アミジニウム、又はグアニジニウム基などのモノアミンからなる。一連のピリジニウム脂質が開発された（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００８；ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｉｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ピリジニウムカチオン性脂質に加えて、他のタイプの複素環頭部基には、イミダゾール、ピペリジン、及びアミノ酸が含まれる。カチオン性頭部基の主な機能は、負に荷電した核酸を静電相互作用によってわずかに正に荷電したナノ粒子に凝縮し、細胞取り込みとエンドソーム脱出を促進することである。

【0042】

ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ及びＳＡＩＮＴ－２などの２つの直鎖脂肪酸鎖を有する脂質、又はＤＯＤＡＣを、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－塩化ジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＣ）の二量体であるテトラアルキル脂質鎖界面活性剤と同様に、送達ビヒクルとして使用することができる。すべてのトランス配向脂質は、その疎水性鎖長（Ｃ_１６：１、Ｃ_１８：１、及びＣ_２０：１）にかかわらず、シス配向の対応物と比較してトランスフェクション効率を高めるように見える。

【0043】

送達ビヒクルとして有用なポリマーの構造には、キトサン及び直鎖ポリ（エチレンイミン）などの直鎖ポリマー、分岐ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）などの分岐ポリマー、シクロデキストリンなどの環状ポリマー、架橋ポリ（アミノ酸）（ＰＡＡ）などのネットワーク（架橋）型ポリマー、及びデンドリマーが含まれるが、これらに限定されない。デンドリマーは、中心のコア分子からいくつかの高度に枝分かれしたアームが「成長」して、対称又は非対称に樹木状の構造を形成したもので構成される。デンドリマーの例には、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）及びポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマーが含まれる。

【0044】

ＤＯＰＥ及びコレステロールは、リポソームの調製に一般的に使用される中性共脂質（ｃｏ－ｌｉｐｉｄ）である。分岐ＰＥＩ－コレステロール水溶性リポポリマー複合体は、カチオン性ミセルに自己集合する。非イオン性ポリマーであるプルロニック（登録商標）（ポロキサマー）、及びプルロニック（登録商標）Ｌ６１及びＦ１２７の組み合わせであるＳＰ１０１７も使用することができる。

【0045】

一実施形態では、ＰＬＧＡ粒子はカプセル化頻度を高めるために使用されるが、ＰＬＬとの複合体形成もカプセル化効率を向上させ得る。他の材料、例えば、ＰＥＩ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、又はＣＴＡＢを使用することができる。

【0046】

一実施形態では、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、ポロキサマー、ポリアクリルアミド、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリラート）、カルボキシビニルポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９３４、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、セルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、セルロースアセタート及びヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコール、又はそれらの組み合わせのヒドロゲルを含むがこれらに限定されない材料に埋め込まれるか、又は適用される。

【0047】

いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマー材料は、コラーゲン、例えばヒドロキシル化コラーゲン、フィブリン、ポリ乳酸－ポリグリコール酸、又はポリ無水物などの生分解性ポリマーに由来する。他の例としては、親水性、疎水性、両親媒性のいずれであってもよい、エチレン酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）、ポリメチルメタクリラート、ポリアミド、ポリカルボナート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドコポリマー、ポリ（エチレンオキシド）／ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー、ポリ（エチレングリコール）／ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）ブロックコポリマー、ポリグリコリド、ポリラクチド（ＰＬＬＡ又はＰＤＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、又はポリ（ジオキサノン）（ＰＰＳ）などの任意の生体適合性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0048】

別の実施形態では、生体適合性材料には、ポリエチレンテレフタラート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドのコポリマー、ポリグリコール酸とポリヒドロキシアルカノアートの組み合わせ、ゼラチン、アルギナート、ポリ－３－ヒドロキシブチラート、ポリ－４－ヒドロキシブチラート、及びポリヒドロキシオクタノアート、及びポリアクリロニトリルポリ塩化ビニルが含まれる。

【0049】

一実施形態では、以下のポリマー、例えば、天然ポリマーのデンプン、キチン、グリコサミノグリカン、例えばヒアルロン酸、デルマタン硫酸及びコンドロチン硫酸など、及び微生物ポリエステル、例えばヒドロキシバレラート及びヒドロキシブチラートコポリマーなどのヒドロキシアルカノアート、及び合成ポリマー、例えば、ポリ（オルトエステル）及びポリ無水物、及びグリコリド及びラクチドのホモ及びコポリマーを含む（例えば、ポリ（Ｌ－ラクチド、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド、ポリグリコリド及びポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コグリコリド）、ポリ（乳酸コリジン）及びポリカプロラクトンを使用することができる。

【0050】

一実施形態では、生体適合性材料は、単離された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に由来する。ＥＣＭは、温血脊椎動物の皮膚、肝臓、消化器、呼吸器、腸、泌尿器又は生殖器管の真皮を含む任意の器官又は組織源など、様々な細胞集団、組織及び／又は器官の内皮層から単離することができる。本発明で使用されるＥＣＭは、複数の供給源の組み合わせに由来し得る。単離されたＥＣＭは、シート、粒子形態、ゲル形態などに調製することができる。

【0051】

生体適合性ポリマーは、シルク、エラスチン、キチン、キトサン、ポリ（ｄ－ヒドロキシ酸）、ポリ（無水物）、又はポリ（オルトエステル）を含み得る。より具体的には、生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマー、乳酸とグリコール酸とポリエチレングリコールとのコポリマー、ポリ（Ｅ－カプロラクトン）、ポリ（３－ヒドロキシブチラート）、ポリ（ｐ－ジオキサノン）、ポリプロピレンフマラート、ポリ（オルトエステル）、ポリオール／ジケテンアセタール付加ポリマー、ポリ（セバシン酸無水物）（ＰＳＡ）、ポリ（カルボキシビスカルボキシフェノキシフェノキシヘキソン（ＰＣＰＰ） ポリ［ビス（ｐ－カルボキシフェノキシ）メタン］（ＰＣＰＭ）、ＳＡ、ＣＰＰ及びＣＰＭのコポリマー、ポリ（アミノ酸）、ポリ（擬似アミノ酸）、ポリホスファゼン、ポリ［（ジクロロ）ホスファゼン］又はポリ［（オルガノ）ホスファゼン］の誘導体、ポリ－ヒドロキシ酪酸、又はＳ－カプロン酸、ポリラクチド－ｃｏ－グリコリド、ポリ乳酸、ポリエチレングリコール、セルロース、酸化セルロース、アルギナート、ゼラチン又はそれらの誘導体から形成され得る。

【0052】

したがって、ポリマーは、天然に存在するポリマー、合成ポリマー、又はそれらの組み合わせを含む、ポリマーを含む広範囲の材料の任意のものから形成され得る。一実施形態では、足場は生分解性ポリマーを含む。一実施形態では、天然に存在する生分解性ポリマーを改変して、天然に存在するポリマーに由来する合成生分解性ポリマーを提供することができる。一実施形態では、ポリマーは、ポリ（乳酸）（「ＰＬＡ」）又はポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（「ＰＬＧＡ」）である。一実施形態では、足場ポリマーには、これらに限定するものではないが、アルギナート、キトサン、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリラート）、キシログルカン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、シリコーン、疎水性ポリエステル及び親水性ポリエステル、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドコポリマー、ポリ（エチレンオキシド）／ポリ（プロピレンオキシド）、ポリ乳酸、ポリ（オルトエステル）、ポリ無水物、ポリウレタン、２－ヒドロキシエチルメタクリラートとナトリウムメタクリラートのコポリマー、ホスホリルコリン、シクロデキストリン、ポリスルホン及びポリビニルピロリジン、デンプン、ポリ－Ｄ，Ｌ－乳酸－パラ－ジオキサノン－ポリエチレングリコールブロックコポリマー、ポリプロピレン、ポリ（エチレンテレフタラート）、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ－ε－カプロラクトン、又は架橋キトサンヒドロゲルが含まれる。

【0053】

ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを有する製剤において、多数のリポソーム送達システムを使用することができる。リポソームを形成するために、実質的に任意の脂質を使用することができる。使用のための例示的な脂質には、例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホル－Ｌ－セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１８：１ ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（１８：１ ＰＥＧ－２０００ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（１６：０ ＰＥＧ－２０００ＰＥ）、１－オレオイル－２－［１２－［（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾキサジアゾール－４－イル）アミノ］ラウロイル｝－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１～１２：０ ＮＢＤ ＰＣ）、１－パルミトイル－２－｛１２－［（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル）アミノ］ラウロイル｝－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０～１２：０ ＮＢＤ ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせが含まれる。コレステロールは、技術的には脂質ではないが、ある実施形態によれば、コレステロールがプロトセルの脂質二重層の重要な成分であり得るという事実を考慮して、ある実施形態の目的については脂質として提示される。多くの場合、二重層の構造的完全性を高めるためにコレステロールが組み込まれる。これらの脂質はすべて、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社（米国アラバマ州アラバスター）から商業的に容易に入手できる。

【0054】

医薬組成物
本開示は、少なくとも１つのＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣ及び薬学的に許容される（例えば、生理学的に許容される）担体を含む、それらから本質的になる、又はそれらからなる組成物を提供する。一実施形態では、組成物が本質的に少なくとも１つのＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣ及び任意選択の薬学的に許容される担体からなる場合、組成物に実質的に影響を及ぼさない追加の成分（例えば、アジュバント、緩衝剤、安定剤、抗炎症剤、可溶化剤、防腐剤など）を含めることができる。一実施形態では、組成物が、粒子に封入された少なくとも１つのＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣと、薬学的に許容される担体とからなる場合、組成物は追加の成分を含まない。本発明の一環として、任意の適切な担体を使用することができ、そのような担体は当技術分野で周知である。担体の選択は、部分的には、組成物が投与され得る特定の部位及び組成物の投与に使用される特定の方法によって決定される。組成物は、保存のために凍結又は凍結乾燥させ、使用前に適切な無菌担体で再構成することができる。組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ（２００１）に記載されている従来の技法に従って生成することができる。

【0055】

組成物に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、及び静菌剤を含むことができる水性及び非水性溶液、等張無菌溶液、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含むことができる水性及び非水性無菌懸濁液が含まれる。製剤は、アンプルやバイアルなどの単位用量又は複数用量の密閉容器で提供でき、使用直前に滅菌液体担体、例えば水を追加するだけでよいフリーズドライの（凍結乾燥）状態で保存できる。前述の種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から、即席の溶液及び懸濁液を調製することができる。一実施形態では、担体は緩衝生理食塩水である。一実施形態では、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、投与前にＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを損傷から保護するように調合された組成物で投与される。例えば、組成物は、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを調製、保存、又は投与するために使用される器具、例えばガラス製品、注射器、又は針でのＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの損失を低減するように調合することができる。組成物は、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの光感受性及び／又は温度感受性を低下させるように調合することができる。この目的のために、組成物は、例えば、上記のものなどの薬学的に許容される液体担体と、ポリソルベート８０、Ｌ－アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される安定化剤とを含み得る。

【0056】

組成物は、形質導入効率を高めるように調合することもできる。さらに、当業者は、少なくとも１つのＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣが、他の治療剤又は生物活性剤と共に組成物中に存在し得ることを理解するであろう。例えば、イブプロフェンやステロイドなどの炎症を制御する因子は、腫れや炎症を軽減するための組成物の一部であり得る。免疫系刺激剤又はアジュバント、例えば、インターロイキン、リポ多糖、及び二本鎖ＲＮＡも投与することができる。既存の感染を治療し、及び／又は将来の感染のリスクを低減するために、抗生物質、すなわち殺菌剤や抗真菌剤が存在してもよい。

【0057】

注射可能なデポ剤は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマーで少なくとも１つのＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを形成することによって作られる。ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣのポリマーに対する比率、及び使用される特定のポリマーの性質に応じて、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が含まれる。デポ注射剤は、任意選択で、体組織と適合するリポソーム又はマイクロエマルション中のポリマーとの複合体にＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを封入することによっても調製される。

【0058】

特定の実施形態では、製剤は、ポリアミド、ポリカルボナート、ポリアルキレン、アクリル及びメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びそれらのコポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸及びグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、多糖類、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリラート、及びそれらのブレンド、混合物、又はコポリマーからなる群から選択される生体適合性ポリマーを含む。

【0059】

組成物は、スポンジ、生体適合性の網状物、機械的リザーバ、又は機械的インプラントなどの、制御放出又は持続放出を可能にするデバイスに含めて又は付けて投与することができる。インプラント（例えば、米国特許第５，４４３，５０５号を参照）、デバイス（例えば、米国特許第４，８６３，４５７号を参照）、例えば、ポリマー組成物から構成される機械的リザーバ又はインプラント又はデバイスなどの植込み可能なデバイスは、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの投与に特に有用である。組成物はまた、例えばゲルフォーム、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ポリリン酸エステル、例えばビス－２－ヒドロキシエチルテレフタラート（ＢＨＥＴ）、及び／又はポリ乳酸グリコール酸を含む持続放出製剤（例えば、米国特許第５，３７８，４７５号参照）の形態で投与することができる。

【0060】

哺乳動物に投与される組成物中のＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの用量は、哺乳動物のサイズ（質量）、副作用の程度、特定の投与経路などを含む多くの要因に依存する。一実施形態では、この方法は、本明細書に記載のＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを含む組成物の「治療有効量」を投与することを含む。「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに必要な用量及び期間で有効な量を指す。治療有効量は、疾患又は障害の程度、個人の年齢、性別、及び体重、ならびに個人においてＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣが所望の反応を誘発する能力などの要因によって異なり得る。

【0061】

一実施形態では、組成物は哺乳動物に１回投与される。組成物の単回投与は、最小限の副作用で哺乳動物における持続的発現をもたらし得ると考えられる。しかしながら、場合によっては、治療期間中に組成物を複数回投与して、組成物への細胞の十分な曝露を確実にすることが適切であり得る。例えば、組成物は、治療期間中に哺乳動物に２回以上（例えば、２、３、４、５、６、６、８、９、又は１０回以上）投与され得る。

【0062】

本開示は、治療有効量の少なくとも１つのＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを含む薬学的に許容される組成物を提供する。
投与経路、用量及び投与形態
ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの投与は、例えばレシピエントの生理学的状態、及び当業者に知られている他の要因に応じて、連続的又は断続的であり得る。ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であり得るか、又は一連の間隔をあけた用量であり得る。例えば、鼻腔内又は髄腔内などの局所投与、及び全身投与の両方が企図される。任意の投与経路、例えば、静脈内、鼻腔内又は経口、又は局所投与を使用することができる。

【0063】

ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを含む１つ以上の適切な単位剤形は、任意選択で徐放用に製剤化することができ、局所、例えば髄腔内、経口、あるいは、直腸、口腔、膣及び舌下、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、又は肺内経路を介するものを含む非経口を含む、様々な経路で投与することができる。製剤は、必要に応じて、便宜上別個の単位剤形で提供されてもよく、これは薬局に周知の任意の方法によって調製され得る。そのような方法は、ベクターを液体担体、固体マトリックス、半固体担体、微粉固体担体又はそれらの組み合わせと結合させ、その後、必要に応じて、生成物を所望の送達システムに導入又は成形するステップを含み得る。

【0064】

特定の結果を達成するために投与されるＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの量は、状態、患者固有のパラメータ、例えば、身長、体重、年齢、及び達成目的が予防か治療かを含むがこれらに限定されない様々な要因によって異なる。

【0065】

ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、便宜上、投与に適した製剤の形態で提供され得る。適切な投与形式は、標準的な手順に従って、個々の患者ごとに医師が決定するのが最善であろう。適切な薬学的に許容される担体及びそれらの製剤は、標準的な製剤の論文、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。「薬学的に許容される」とは、製剤の他の成分と混和でき、そのレシピエントに有害でない担体、希釈剤、賦形剤、及び／又は塩を意味する。

【0066】

ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、中性ｐＨ、例えば、約ｐＨ６．５～約ｐＨ８．５、又は約ｐＨ７～８の溶液に調合されてもよく、その溶液をほぼ等張にするための賦形剤、例えば、４．５％のマンニトール又は０．９％の塩化ナトリウムを伴ってもよく、一般に安全とみなされるリン酸ナトリウムなどの当技術分野で知られている緩衝液でｐＨ緩衝を行ってもよく、０．１％～０．７５％のメタクレゾール、又は０．１５％～０．４％のメタクレゾールなどの容認された防腐剤を伴ってもよい。所望の等張性を得ることは、塩化ナトリウム、又はデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、ポリオール（マンニトール及びソルビトールなど）、又は他の無機又は有機溶質などの他の薬学的に許容される作用物質を使用して達成することができる。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含む緩衝液に有用である。必要に応じて、貯蔵寿命及び安定性を高めるために、上記組成物の溶液を調製することもできる。治療上有用な組成物は、一般に受け入れられている手順に従って成分を混合することによって調製することができる。例えば、選択された成分を混合して濃縮混合物を生成し、その後水及び／又はｐＨを制御するための緩衝液又は張度を制御するための追加の溶質を加えることによって最終濃度及び粘度に調整することができる。

【0067】

ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、１回又は複数回の投与で有効な量を含む剤形で提供することができる。ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、少なくとも約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することができるが、他の用量でも有益な結果が得られる可能性がある。投与量は、哺乳動物の疾患、体重、体調、健康、及び／又は年齢を含むがこれらに限定されない様々な要因に応じて変化するであろう。そのような要因は、動物モデル又は当技術分野で利用可能な他の試験系を使用する臨床医によって容易に決定することができる。前述のように、投与する正確な用量は主治医によって決定されるが、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に含ませることができる。一実施形態では、個別又は分割用量で０．０００１～１ｍｇ以上、例えば１ｇまで、例えば０．００１～０．５ｍｇ、又は０．０１～０．１ｍｇのＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを投与することができる。

【0068】

例として、リポソーム及び他の脂質含有複合体を使用して、１つ以上のＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを送達することができる。
ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを含有する医薬製剤は、周知の容易に入手可能な成分を使用して、当技術分野で知られている手順によって調製することができる。例えば、薬剤は、一般的な賦形剤、希釈剤、又は担体と共に調合され、錠剤、カプセル、懸濁液、粉末などに形成され得る。ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣはまた、例えば筋肉内、皮下又は静脈内経路による非経口投与に適したエリキシル又は溶液として調合することもできる。

【0069】

医薬製剤はまた、水溶液又は無水溶液、例えば凍結乾燥製剤又は分散液の形態、あるいはエマルション又は懸濁液の形態をとることができる。
一実施形態では、ベクターは、例えば注射、例えばボーラス注射又はカテーテルを介した持続注入による投与のために製剤化されてもよく、アンプル、充填済み注射器、少量の輸液容器、又は防腐剤が添加された複数回投与容器に入った単位用量形態で提供されてもよい。有効成分は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又はエマルションなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの調合剤を含むことができる。あるいは、有効成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば無菌のパイロジェンフリー水で構成するために、無菌固体の無菌分離又は溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態であってもよい。

【0070】

これらの製剤は、従来技術で周知の薬学的に許容されるビヒクル及びアジュバントを含むことができる。例えば、生理学的観点から許容される１つ以上の有機溶媒を使用して溶液を調製することが可能である。

【0071】

吸入による上（鼻）又は下気道への投与のために、ベクターは便宜上、吸入器、ネブライザー又は加圧パック、又はエアロゾルスプレーを送達する他の都合の良い手段から送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切なガスなどの適切な噴射剤を含み得る。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。

【0072】

あるいは、吸入又は吹送による投与のために、組成物は、乾燥粉末、例えば、治療薬とラクトース又はデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物の形態を取り得る。粉末組成物は、例えば、カプセル又はカートリッジ、又は例えば、ゼラチン又はブリスターパック中の単位剤形で提供されてもよく、そこから粉末が吸入器、送気器又は定量吸入器を用いて投与され得る。

【0073】

鼻腔内投与の場合、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、点鼻薬、液体スプレー、例えばプラスチックボトルアトマイザー又は定量吸入器を介して投与することができる。アトマイザーの代表的なものは、ミストメーター（Ｗｉｎｔｒｏｐ）及びメジヘラー（Ｒｉｋｅｒ）である。

【0074】

局所送達はまた、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを疾患部位又はその近くに投与する様々な技術、例えば、カテーテル又は針を使用することによってもあり得る。部位特異的又は標的局所送達技術の例は、限定を意図するものではなく、利用可能な技術を例示するものである。例としては、注入又は留置カテーテル、例えば針注入カテーテルなどの局所送達カテーテル、シャント及びステント又は他の植込み型デバイス、部位特異的担体、直接注射、又は直接塗布が挙げられる。

【0075】

本明細書に記載の製剤及び組成物は、抗菌剤又は防腐剤などの他の成分も含み得る。
対象
対象は、ヒト及び非ヒト動物を含む任意の動物であり得る。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例えば哺乳類及び非哺乳類、具体的には非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類などが含まれる。対象はまた、ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽、及びウマなどの家畜、又はイヌ及びネコなどのペットであってもよい。

【0076】

対象には、酸化的損傷を受けているか、又はそのリスクがあるヒト対象が含まれる。対象は、一般に、医師などの当業者によって本発明の状態であると診断される。
本明細書に記載の方法は、任意の種、性別、年齢、民族集団、又は遺伝子型の対象に使用することができる。したがって、対象という用語には、男性及び女性が含まれ、高齢者、高齢者から成人までの移行年齢の対象、成人、成人から未成年者までの移行年齢の対象、及び若者、子供、幼児を含む未成年者が含まれる。

【0077】

ヒトの民族集団の例には、コーカサス人、アジア人、ヒスパニック、アフリカ人、アフリカ系アメリカ人、ネイティブアメリカン、セム人、及び太平洋諸島人が含まれる。本発明の方法は、コーカサス人などのいくつかの民族集団、特に北ヨーロッパ人種、及びアジア人種により適している可能性がある。

【0078】

対象という用語はまた、上記のように、本発明を必要とする限り、任意の遺伝子型又は表現型の対象を含む。さらに、対象は、任意の髪の色、目の色、肌の色、又はそれらの任意の組み合わせの遺伝子型又は表現型を有することができる。

【0079】

対象という用語は、任意の身長、体重、又は任意の臓器又は身体部位のサイズ又は形状の対象を含む。
例示的なリンカー
本明細書において、用語「連結基」、「リンカー分子」、「リンカー」などは、少なくとも２つの別個の化学物質を連結するのに有用な任意の分子群を指す。化学物質間の結合を行うためには、反応物のそれぞれが化学的に相補的な反応基を含むことが必要である。相補的な反応性基の例は、アミド結合を形成するためのアミノ基及びカルボキシル基、エステル結合を形成するためのカルボキシ基及びヒドロキシ基、アルキルアミノ結合を形成するためのアミノ及びハロゲン化アルキル、ジスルフィドを形成するためのチオール及びチオール、又はチオエーテルを形成するためのチオール及びマレイミド又はハロゲン化アルキルである。ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、及び他の官能基がまだ存在しない場合、既知の方法によって導入することができる。必要に応じて、反応性相補基の１つ以上を「保護」することができ、この場合、特定の結合化学を行うために必要な化学反応を行う前に、保護された反応基を「脱保護」する必要がある。特定の状況では、任意の適切な保護／脱保護スキームを使用することができる。当業者が理解するように、任意の適切な分子群をリンカーとして使用することができ、どの分子群が特定の状況に適しているかはまちまちであり得るが、所望の結合を行うために適切な化学的に相補的な反応性基を有する適切な分子群を選択又は調製することは当業者の技術の範囲内で容易である。特定の環境で選択される分子群に関係なく、異なる化学物質間の安定な共有結合を提供して、本発明による結合体を形成することができる。具体的には、共有結合は、リンカー及び連結基がさらされる溶液条件に対して安定でなければならない。通常、任意の適切な長さ又は配置のリンカーを使用することができるが、約４～８０個の炭素、好ましくは約１０～７０個の炭素、約１０～５０個の炭素、又は約１０～３０個の炭素、又は約１０～２０個の炭素を含むリンカーが想定される。リンカーはまた、分子連結基に１つ以上のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＰ）、特に０～１０個のヘテロ原子を含み得る。様々な実施形態において、リンカーは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のヘテロ原子を含むことができる。なおさらなる実施形態では、リンカーは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の二価酸素（－Ｏ－）、二価窒素（－ＮＨ－）、又はそれらの両方を含む。分子連結基は、分枝鎖又は直鎖であり得る。場合によっては、プリンアナログと標的化部分又は特異的結合分子との間でコンジュゲートを直接形成することができることも理解されよう。この場合、リンカーは使用されない。そのような場合、プリンアナログの置換基及び特異的結合分子の置換基は、典型的には誘導体化されて、異なる化学物質を連結する適切な化学反応を行うのに必要な相補的反応基（適切であれば、１つ以上が保護されてもよい）を提供する。

【0080】

リンカー鎖の原子数での長さは、Ｇタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドからＥ３ユビキチンリガーゼリガンドまでのリンカーの直線骨格に沿った原子の計数に基づいて決定できるが、連結されていないＧＰＥＲリガンド又はＥ３ユビキチンリガーゼリガンドの原子に対応する原子は含まない。例えば、β－エストラジオールがＧＰＥＲリガンドである場合、リンカー鎖の原子を計数するとき、β－エストラジオールの酸素はどれも計数しない。さらに別の実施形態では、リンカーは骨格内に、ＧＰＥＲリガンドとＥ３ユビキチンリガーゼリガンドの間の（ただしそれらを含まない）直線経路で計数した時、凡そ以下の数であるか、それに等しいか、又はそれを超える数：５、６、７、８、９、１９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０、２００までの原子数を有する鎖長を有する。さらなる実施形態では、鎖長は原子数で６、７、８、９、１９、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個以下である。リンカーの長さは、ＧＰＥＲリガンドとＥ３ユビキチンリガーゼリガンドとの間の、リンカーとそれらのリガンドの各々とを連結する結合を含めた直線経路における結合長の計算に基づいて、オングストロームで表すこともできる。様々なさらなる実施形態において、リンカーは、ＧＰＥＲリガンドとＥ３ユビキチンリガーゼリガンドとの間の直線経路での結合長の追加に基づいて計算した時、凡そ以下の数値であるか、それに等しいか、又はそれを超える数値：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０オングストローム、最大３００オングストロームの上記の計算長を有することができる。さらなる実施形態では、リンカーは、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００オングストローム以下の計算長を有する。

【0081】

ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣに有用なリンカーの非限定的な例には、酸素原子、硫黄原子、窒素原子及び／又は炭素原子（及び原子価を満たすために必要な場合は適切に付加された水素原子）が含まれるだけでなく、溶解度を高める側鎖、例えば、モルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノ、又はピペラジノ環などを含む基を有するリンカー；アミノ酸、アミノ酸のポリマー（タンパク質又はペプチド）、例えば、ジペプチド又はトリペプチドなど；炭水化物（多糖類）、ヌクレオチド、例えばＰＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡなど；有機材料のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリラクチドなども含まれる。一実施形態では、リンカーは、二価のアリール又はヘテロアリール、ビス－アミドアリール、ビス－アミドヘテロアリール、ビス－ヒドラジドアリール、ビス－ヒドラジドヘテロアリールなどであり得る。一実施形態では、リンカーは、約２４～５０個までの原子を有する鎖を有する。ここで、原子は、炭素、窒素、硫黄、非過酸化物酸素、及びリンからなる群から選択される。一実施形態では、リンカーは、約４から約１２から２０個の原子、又は約１６から約４８個の原子を有する鎖を有する。

【0082】

一実施形態では、リンカーは、アルキレンリンカー、フェニレンリンカー、又はアルキルリンカーである。リンカーは、Ｃ_４～Ｃ_４８アルキル又はそのヘテロ形態であり得る。これらのリンカーは、カルボニル基を含み得る。特定の実施形態では、リンカーは、－Ｃ（Ｙ’）（Ｚ’）－Ｃ（Ｙ”）（Ｚ”）－リンカーである場合があり、Ｙ’、Ｙ”、Ｚ’及びＺ”はそれぞれ独立して水素 Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０アルコキシ、置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_３～Ｃ_９シクロアルキル、置換Ｃ_３～Ｃ_９シクロアルキル、Ｃ_５～Ｃ_１０アリール、置換Ｃ_５～Ｃ_１０アリール、Ｃ_５～Ｃ_９複素環、置換Ｃ_５～Ｃ_９複素環、Ｃ_１～Ｃ_６アルカノイル、Ｈｅｔ、ＨｅｔＣ_１～Ｃ_６アルキル、又はＣ_１～Ｃ_６アルコキシカルボニルであり、上記アルキル、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、Ｈｅｔ、アリール又は複素環基における置換基は、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、ヒドロキシルＣ_１～Ｃ_１０アルキレン、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_３～Ｃ_９シクロアルキル、Ｃ_５～Ｃ_９複素環、Ｃ１～６アルコキシ Ｃ_１～６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン又はアリールである。一実施形態では、リンカーは、鎖の原子が炭素、窒素、硫黄、及び酸素からなる群から選択される鎖であり、任意の炭素原子は、例えば、オキソで置換することができ、任意の硫黄原子は、１つ又は２つのオキソ基で置換することができる。鎖には、１つ以上のシクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール環が散在していてもよい。一実施形態では、リンカーは、鎖内に約４個から約５０個の原子を有する鎖を含み、鎖の原子は、炭素、窒素、硫黄、及び酸素からなる群から選択され、任意の炭素原子はオキソで置換することができ、任意の硫黄原子は１つ又は２つのオキソ基で置換することができる。

【0083】

一実施形態では、リンカーは、－（Ｙ）_ｙ－、－（Ｙ）_ｙ－Ｃ（Ｏ）Ｎ－（Ｚ）_ｚ－、－（ＣＨ_２）_ｙ－Ｃ（Ｏ）Ｎ－（ＣＨ_２）_ｚ－、－（Ｙ）_ｙ－ＮＣ（Ｏ）－（Ｚ）_ｚ－、－（ＣＨ_２）_ｙ－ＮＣ（Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｚ－を含み、各ｙ（下付き文字）及びｚ（下付き文字）は独立して０～２０であり、各Ｙ及びＺは独立して、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０アルコキシ、置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_３～Ｃ_９シクロアルキル、置換Ｃ_３～Ｃ_９シクロアルキル、Ｃ_５～Ｃ_１０アリール、置換Ｃ_５～Ｃ_１０アリール、Ｃ_５～Ｃ_９複素環、置換Ｃ_５～Ｃ_９複素環、Ｃ_１～Ｃ_６アルカノイル、Ｈｅｔ、ＨｅｔＣ_１～Ｃ_６アルキル、又はＣ_１～Ｃ_６アルコキシカルボニルであり、上記アルキル、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、Ｈｅｔ、アリール又は複素環基における置換基は、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、ヒドロキシルＣ_１～Ｃ_１０アルキレン、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_３～Ｃ_９シクロアルキル、Ｃ_５～Ｃ_９複素環、Ｃ_１～６アルコキシ Ｃ_１～６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン又はアリールである。特定の実施形態では、リンカーは－Ｃ（Ｙ’）（Ｚ’）－Ｃ（Ｙ”）（Ｚ”）－リンカーである場合があり、Ｙ’、Ｙ”、Ｚ’及びＺ”はそれぞれ独立して水素 Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０アルコキシ、置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_３～Ｃ_９シクロアルキル、置換Ｃ_３～Ｃ_９シクロアルキル、Ｃ_５～Ｃ_１０アリール、置換Ｃ_５～Ｃ_１０アリール、Ｃ_５～Ｃ_９複素環、置換Ｃ_５～Ｃ_９複素環、Ｃ_１～Ｃ_６アルカノイル、Ｈｅｔ、ＨｅｔＣ_１～Ｃ_６アルキル、又はＣ_１～Ｃ_６アルコキシカルボニルであり、上記アルキル、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、Ｈｅｔ、アリール又は複素環基における置換基は、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、ヒドロキシルＣ_１～Ｃ_１０アルキレン、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_３～Ｃ_９シクロアルキル、Ｃ_５～Ｃ_９複素環、Ｃ１～６アルコキシ Ｃ_１～６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン又はアリールである。

【0084】

一実施形態では、リンカーはアミド連結基（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－又は－ＮＨ（Ｏ）Ｃ－）；アルキルアミノ連結基（例えば、－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル－ＮＨ（Ｏ）Ｃ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－、－ＮＨ（Ｏ）Ｃ－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－、－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－－ＮＨ（Ｏ）Ｃ－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－、－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｔ－、ここで、ｔは１、２、３、又は４である）；置換５～６員環（例えば、アリール環、ヘテロアリール環（例えば、テトラゾール、ピリジル、２，５－ピロリジンジオン（例えば、置換フェニル部分で置換された２，５－ピロリジンジオン））、炭素環、又は複素環）又は酸素含有部分（例えば、－Ｏ－、－Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ）を含む。

【0085】

一実施形態では、リンカーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分（Ｒ^３）_ｒを含み、Ｒ^３はＰＥＧ単位であり、ｒは約１～約１０（例えば、ｒは約２～約６）である。特定の実施形態において、Ｒ^３は、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－又は－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－である。いくつかの実施形態において、Ｒ^３は、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－又は－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－であり、ｒは、約１～約１００（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００である。特定の関連する実施形態では、ｒは、約５～約２５、約１０～約５０、約５～約１５、約１２～約３５、約２５～約５５、又は約６５～約９５である。いくつかの実施形態では、（Ｒ^３）_ｒ置換基は直鎖であり、特定の実施形態では、（Ｒ^３）_ｒ置換基は分岐している。直鎖部分の場合、ｓはｒよりも小さい場合があり（例えば、Ｒ^３が－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－又は－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－の場合）、ｓが１の場合もある。いくつかの実施形態では、Ｒ^３は直鎖ＰＥＧ部分である（例えば、約１～約３０個のＰＥＧ単位を有する）。

【0086】

他のリンカーには、国際公開第１９／１２３３６７及びＳｕｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒ．，４：６４（２０１９））のものが含まれるがこれらに限定されず、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0087】

本明細書で使用される「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」という用語は、直鎖、分岐鎖および環状の一価ヒドロカルビルラジカル、およびこれらの組み合わせを含み得、これらは置換されていない場合はＣとＨのみを含む。例には、メチル、エチル、イソブチル、シクロヘキシル、シクロペンチルエチル、２－プロペニル、３－ブチニルなどが挙げられる。このような各基の炭素原子の総数は、本明細書に記載されることがあり、例えば、上記基が最大１０個の炭素原子を含むことができる場合、１～１０Ｃ又はＣ_１～Ｃ_１０又はＣ_１～１０のように表される。ヘテロ原子（典型的にはＮ、Ｏ、及びＳ）がヘテロアルキル基のように炭素原子を置き換えることができる場合、例えば、例としてまだＣ_１～Ｃ_６と記載されていても、その基を説明する数字は、その基の炭素原子数と、記載されている環又は鎖の主鎖中の炭素原子の置換として含まれるヘテロ原子の数との合計を表す。

【0088】

典型的には、本発明のアルキル、アルケニル及びアルキニル置換基は、１つの１０Ｃ（アルキル）又は２つの１０Ｃ（アルケニル又はアルキニル）を含む。例えば、１つの８Ｃ（アルキル）又は２つの８Ｃ（アルケニル又はアルキニル）を含む。場合によっては、１つの４Ｃ（アルキル）又は２つの４Ｃ（アルケニル又はアルキニル）が含まれる。単一の基は、複数の種類の多重結合、又は複数の多重結合を含むことができる。そのような基は、それらが少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を含む場合、用語「アルケニル」の定義内に含まれ、それらが少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を含む場合、用語「アルキニル」の範囲に含まれる。

【0089】

アルキル、アルケニル及びアルキニル基は、多くの場合、化学的に理にかなっている程度まで任意に置換される。典型的な置換基には、限定するものではないが、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ－ＣＮ、＝Ｎ－ＯＲ、＝ＮＲ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＮＲＳＯ_２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ_２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ_２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、及びＮＯ_２が含まれ、各Ｒは独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_８アルキル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_８アシル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアシル、Ｃ_２～Ｃ_８アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアルケニル、Ｃ_２～Ｃ_８アルキニル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアルキニル、Ｃ_６～Ｃ_１０アリール、又はＣ_５～Ｃ_１０ヘテロアリールであり、各Ｒは、任意選択で、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ－ＣＮ、＝Ｎ－ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’_２、ＳＲ’、ＳＯ_２Ｒ’、ＳＯ_２ＮＲ’_２、ＮＲ’ＳＯ_２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’_２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’_２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、及びＮＯ_２で置換されてもよく、各Ｒ’は独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_８アルキル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_８アシル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアシル、Ｃ_６～Ｃ_１０アリール又はＣ_５～Ｃ_１０ヘテロアリールである。アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基は、Ｃ_１～Ｃ_８アシル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアシル、Ｃ_６～Ｃ_１０アリール又はＣ_５～Ｃ_１０ヘテロアリールで置換することもでき、その各々はその特定の基に適した置換基で置換することができる。

【0090】

「アセチレン」置換基は、任意選択で置換される、式－Ｃ≡Ｃ－Ｒｉの２～１０Ｃアルキニル基を含むことができ、式中、ＲｉはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアルキル、Ｃ_２～Ｃ_８アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアルケニル、Ｃ_２～Ｃ_８アルキニル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアルキニル、Ｃ_１～Ｃ_８アシル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアシル、Ｃ_６～Ｃ_１０アリール、Ｃ_５～Ｃ_１０ヘテロアリール、Ｃ_７～Ｃ_１２アリールアルキル、又はＣ_６～Ｃ_１２ヘテロアリールアルキルであり、各Ｒｉ基は任意選択で、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ－ＣＮ、＝Ｎ－ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ_２Ｒ’、ＳＯ_２ＮＲ’_２、ＮＲ’ＳＯ_２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’_２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’_２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、及びＮＯ_２から選択される１つ以上の置換基で置換され、ここで、各Ｒ’は独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６ヘテロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アシル、Ｃ_２～Ｃ_６ヘテロアシル、Ｃ_６～Ｃ_１０アリール、Ｃ_５～Ｃ_１０ヘテロアリール、Ｃ_７～１２アリールアルキル、又はＣ_６～１２ヘテロアリールアルキルであり、これらのそれぞれは、任意選択で、ハロ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、Ｃ_１～Ｃ_４ヘテロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アシル、Ｃ_１～Ｃ_６ヘテロアシル、ヒドロキシ、アミノ、及び＝Ｏから選択される１つ以上の基で置換され；２つのＲ’は、結合して、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される３個までのヘテロ原子を任意に含む３～７員環を形成することができる。いくつかの実施形態では、－Ｃ≡Ｃ－ＲｉのＲｉは、Ｈ又はＭｅである。

【0091】

「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、及び「ヘテロアルキニル」などは、対応するヒドロカルビル（アルキル、アルケニル、及びアルキニル）基と同様に定義されるが、「ヘテロ」という用語は、１～３個のＯ、Ｓ又はＮヘテロ原子又は骨格残基内のそれらの組み合わせを含む基を指す。したがって、対応するアルキル、アルケニル、又はアルキニル基の少なくとも１つの炭素原子が特定のヘテロ原子のうちの１つに置き換えられて、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、又はヘテロアルキニル基を形成する。アルキル、アルケニル及びアルキニル基のヘテロ形態の典型的なサイズは、通常、対応するヒドロカルビル基と同じであり、ヘテロ形態に存在し得る置換基は、ヒドロカルビル基について上述したものと同じである。化学的安定性の理由から、別段の指定がない限り、そのような基は、ニトロ基又はスルホニル基のようにＮ又はＳ上にオキソ基が存在する場合を除いて、３つ以上の連続したヘテロ原子を含まないことも理解される。

【0092】

本明細書で使用される「アルキル」には、シクロアルキル及びシクロアルキルアルキル基が含まれ、用語「シクロアルキル」は、本明細書では、環炭素原子を介して結合された炭素環式非芳香族基を表すために使用することができ、「シクロアルキルアルキル」は、アルキルリンカーを介して分子に結合している炭素環式非芳香族基を表すために使用することができる。同様に、「ヘテロシクリル」は、環員として少なくとも１個のヘテロ原子を含み、Ｃ又はＮであり得る環原子を介して分子に結合している非芳香族環状基を表すために使用され得る。「ヘテロシクリルアルキル」は、リンカーを介して別の分子に結合された基を表すために使用され得る。シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロシクリルアルキル基に適したサイズ及び置換基は、アルキル基について上述したものと同じである。本明細書で使用される場合、これらの用語には、環が芳香族でない限り、二重結合を１つ又は２つ含む環も含まれる。

【0093】

本明細書で使用される場合、「アシル」は、カルボニル炭素原子の利用可能な２つの原子価位置のうちの１つに結合したアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアリールアルキルラジカルを含む基を包含し、ヘテロアシルは、カルボニル炭素以外の少なくとも１つの炭素が、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択されるヘテロ原子によって置換されている対応する基を指す。したがって、ヘテロアシルには、例えば、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ及び－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ_２、ならびに－Ｃ（＝Ｏ）－ヘテロアリールが含まれる。

【0094】

アシル及びヘテロアシル基は、カルボニル炭素原子の空いている結合手を介して、任意の基又は分子に結合している。典型的には、それらは、ホルミル、アセチル、ピバロイル、及びベンゾイルを含むＣ_１～Ｃ_８アシル基、及びメトキシアセチル、エトキシカルボニル、及び４－ピリジノイルを含むＣ_２～Ｃ_８ヘテロアシル基である。アシル基又はヘテロアシル基を含むヒドロカルビル基、アリール基、及びそのような基のヘテロ形態は、アシル基又はヘテロアシル基の対応する構成要素のそれぞれについて一般に適した置換基として本明細書に記載の置換基で置換することができる。

【0095】

「芳香族」部分又は「アリール」部分は、芳香族性の周知の特徴を有する単環式又は縮合二環式部分を指し、例としてフェニル及びナフチルが挙げられる。同様に、「ヘテロ芳香族」及び「ヘテロアリール」は、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１つ以上のヘテロ原子を環メンバーとして含有するそのような単環式又は縮合二環式環系を指す。ヘテロ原子を含むことにより、５員環にも６員環にも芳香族性が付与される。典型的なヘテロ芳香族系には、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、チエニル、フラニル、ピロリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、及びイミダゾリルなどの単環式Ｃ_５～Ｃ_６芳香族基、及び、これらの単環式基の１つをフェニル環又はヘテロ芳香族単環式基のいずれかと縮合して、インドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、イソキノリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、ピラゾロピリジル、キナゾリニル、キノキサリニル、シンノリニルなどのＣ_８～Ｃ_１０二環式基を形成することによって形成される縮合二環式部分が含まれる。環系全体の電子分布に関して芳香族性の特徴を有する単環式又は縮合環二環式系はいずれも、この定義に含まれる。また、これは少なくとも環がその分子の残りの部分に直接結合している芳香族性の特徴を有する二環式基も含む。通常、環系は５～１２個の環員原子を含む。例えば、単環式ヘテロアリールは５～６個の環員を含み得、二環式ヘテロアリールは８～１０個の環員を含む。

【0096】

アリール及びヘテロアリール部分は、Ｃ_１～Ｃ_８アルキル、Ｃ_２～Ｃ_８アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_８アルキニル、Ｃ_５～Ｃ_１２アリール、Ｃ_１～Ｃ_８アシル、及びこれらのヘテロ形態を含む様々な置換基で置換されてもよく、これらのそれぞれ自体がさらに置換されてもよい。アリール及びヘテロアリール部分の他の置換基には、ハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＮＲＳＯ_２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ_２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ_２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、及びＮＯ_２が含まれ、各Ｒは独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_８アルキル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアルキル、Ｃ_２～Ｃ_８アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアルケニル、Ｃ_２～Ｃ_８アルキニル、Ｃ_２～Ｃ_８ヘテロアルキニル、Ｃ_６～Ｃ_１０アリール、Ｃ_５～Ｃ_１０ヘテロアリール、Ｃ_７～Ｃ_１２アリールアルキル、又はＣ_６～Ｃ_１２ヘテロアリールアルキルであり、各Ｒは、任意選択でアルキル基について上述したように置換されてもよい。アリール又はヘテロアリール基における置換基は、当然、そのような置換基の各種類又は置換基の各成分に適したものとして本明細書に記載されている基でさらに置換され得る。したがって、例えば、アリールアルキル置換基は、アリール基に典型的なものとして本明細書に記載される置換基でアリール部分において置換されてもよく、アルキル基に典型的又は適切なものとして本明細書に記載される置換基でアルキル部分においてさらに置換されてもよい。

【0097】

同様に、「アリールアルキル」及び「ヘテロアリールアルキル」は、置換又は非置換、飽和又は不飽和、環式又は非環式リンカーを含む、アルキレンなどの連結基を介してそれらの結合点に結合している芳香族及びヘテロ芳香環系を指す。通常、リンカーはＣ_１～Ｃ_８アルキル又はそのヘテロ形態である。これらのリンカーは、カルボニル基を含むこともできるため、アシル又はヘテロアシル部分として置換基を提供することができる。アリールアルキル又はヘテロアリールアルキル基中のアリール又はヘテロアリール環は、アリール基について上述したものと同じ置換基で置換されてもよい。例えば、アリールアルキル基は、アリール基について上記で定義した基で任意に置換されたフェニル環、及び非置換であるか、又は１つ又は２つのＣ_１～Ｃ_４アルキル又はヘテロアルキル基で置換されているＣ_１～Ｃ_４アルキレンを含み、上記アルキル又はヘテロアルキル基は、任意選択で、シクロプロパン、ジオキソラン、又はオキサシクロペンタンなどの環を形成するように環化してもよい。同様に、ヘテロアリールアルキル基は、アリール基に典型的な置換基として上述した基で任意に置換されたＣ_５～Ｃ_６単環式ヘテロアリール基、及び非置換であるか、又は１つ又は２つのＣ_１～Ｃ_４アルキル又はヘテロアルキル基で置換されているＣ_１～Ｃ_４アルキレンを含み得、又は、任意に置換されたフェニル環又はＣ_５～Ｃ_６単環式ヘテロアリール、及び非置換であるか、１つ又は２つのＣ_１～Ｃ_４アルキル又はヘテロアルキル基で置換されているＣ_１～Ｃ_４ヘテロアルキレンを含み、上記アルキル又はヘテロアルキル基は、任意選択で、シクロプロパン、ジオキソラン、又はオキサシクロペンタンなどの環を形成するように環化してもよい。

【0098】

アリールアルキル又はヘテロアリールアルキル基が任意に置換されると記載されている場合、置換基は、その基のアルキル又はヘテロアルキル部分又はアリール又はヘテロアリール部分のいずれかにあり得る。アルキル又はヘテロアルキル部分に任意に存在する置換基は、アルキル基について上述したものと概して同じである。アリール又はヘテロアリール部分に任意に存在する置換基は、アリール基について上述したものと概して同じである。

【0099】

本明細書で使用される「アリールアルキル」基は、置換されていない場合、ヒドロカルビル基であり、環及びアルキレン又は同様のリンカー中の炭素原子の総数によって記述される。したがって、ベンジル基はＣ_７－アリールアルキル基であり、フェニルエチルはＣ_８－アリールアルキルである。

【0100】

上記の「ヘテロアリールアルキル」は、連結基を介して結合したアリール基を含む部分を指し、アリール部分の少なくとも１個の環原子又は連結基中の１個の原子が、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択されたヘテロ原子であるという点で「アリールアルキル」とは異なる。ヘテロアリールアルキル基は、結合した環及びリンカー中の原子の総数に従って本明細書に記載され、ヘテロアルキルリンカーを介して連結されたアリール基；アルキレンなどのヒドロカルビルリンカーを介して連結されたヘテロアリール基；及びヘテロアルキルリンカーを介して連結されたヘテロアリール基を含む。したがって、例えば、Ｃ_７－ヘテロアリールアルキルには、ピリジルメチル、フェノキシ、及びＮ－ピロリルメトキシが含まれる。

【0101】

本明細書で使用される「アルキレン」は、二価のヒドロカルビル基を指す。二価であるため、これは他の２つの基を連結できる。通常、これは－（ＣＨ_２）_ｎ－を指し、ｎは１～８であり、例えばｎは１～４であるが、指定されている場合、アルキレンは他の基で置換することもでき、他の長さ、及び鎖の両端にある必要のない空いている結合手にすることもできる。したがって、－ＣＨ（Ｍｅ）－及び－Ｃ（Ｍｅ）_２－もシクロプロパン－１，１－ジイルなどの環状基と同様に、アルキレンと呼ばれる。アルキレン基が置換されている場合、置換基には、本明細書に記載のアルキル基上に典型的に存在するものが含まれる。

【0102】

総じて、置換基に含まれる任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、又はアリールもしくはアリールアルキル基、又はこれらの基のうちの１つの任意のヘテロ形態は、それ自体任意に追加の置換基によって置換され得る。これらの置換基の性質は、置換基が他に記載されていない限り、一次置換基自体に関して記載されたものと同様である。したがって、リンカーＲ^２の実施形態がアルキルである場合、このアルキルは、化学的に意味があり、これがアルキル自体に提供されるサイズ制限を損なわない場合、Ｒ^２の実施形態として列挙された残りの置換基によって任意に置換されてもよく、例えば、アルキル又はアルケニルで置換されたアルキルは、これらの実施形態の炭素原子の上限を単純に拡張するが、含まれない。しかし、アリール、アミノ、アルコキシ、＝Ｏなどで置換されたアルキルは、本発明の範囲内に含まれ、これらの置換基の原子は、記載されているアルキル、アルケニルなどの基を説明するために使用される数に数えられない。置換基の数が指定されていない場合、そのようなアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、又はアリール基のそれぞれは、その利用可能な原子価に応じて、いくつかの置換基で置換されてもよい。特に、これらの基のいずれも、例えば、その利用可能な原子価のいずれか又はすべてにおいてフッ素原子で置換されていてもよい。

【0103】

一実施形態では、リンカーは、（Ｒ^３）_ｒ－（Ｒ^４）を含むか、又はＲ^３であるか、又は（（Ｒ^３）_ｒ－（Ｒ^４）－（Ｒ^３）_ｔである。一実施形態では、Ｒ^３はＰＥＧ部分又はＰＥＧ部分の誘導体である。特定の実施形態において、Ｒ^３は、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－又は－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－である。一実施形態では、ＰＥＧ部分は、１つ以上のＰＥＧ単位を含むことができる。ＰＥＧ部分は約１～約１，０００個のＰＥＧ単位を含むことができ、いくつかの実施形態では、限定するものではないが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、又は９００個の単位が含まれる。特定の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～５及び最大約２５ＰＥＧ単位、約１～５、最大約１０ＰＥＧ単位、約１０～最大約５０ＰＥＧ単位、約１８～最大約５０ＰＥＧ単位、約４７～約１５０ＰＥＧ単位、約１１４～最大約３５０ＰＥＧ単位、約２７１～最大約５５０ＰＥＧ単位、約４７２～最大約９５０ＰＥＧ単位、約５０～最大約１５０ＰＥＧ単位、約１２０～最大約３５０ＰＥＧ単位、約２５０～最大約５５０ＰＥＧ単位、又は約６５０～最大約９５０ＰＥＧ単位を含むことができる。特定の実施形態では、ＰＥＧ単位は、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－又は－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－である。一実施形態において、Ｒ^４は、ＮＨ（ＣＯ）、－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、－Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ、－ＮＲ^ａＲ^ｂ、－Ｎ_３、－ＯＨ、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯＲ^１、－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－ＮＲ^ａＲ^ｂ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－ＯＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－ＣＮ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－ＣＯＯＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－ＣＯＯＲ^１、５～６員環、置換５～６員環、－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－５～６員環、－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－置換５～６員環 Ｃ_２～Ｃ_９複素環、又は置換Ｃ_２～Ｃ_９複素環である。

【0104】

いくつかの実施形態では、Ｒ^３は－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－又は－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－であり、ｒ又はｔは、独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０である。特定の実施形態では、ｒ又はｔは約４～約１５であり、時にｒは約４又は１１である。いくつかの実施形態では、Ｒ^３はＰＥＧ単位（ＰＥＧ）_ｒであり、ｒは約２～約４であり、ｔは約８～１４である。

【0105】

特定の実施形態では、Ｒ_４はアミド連結基（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－又は－ＮＨ（Ｏ）Ｃ－）；アルキルアミド連結基（例えば、－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－ＮＨ（Ｏ）Ｃ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－、－ＮＨ（Ｏ）Ｃ－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－、－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－－ＮＨ（Ｏ）Ｃ－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－、－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｃ_１～Ｃ_６アルキル－、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｔ－、ｔは１、２、３、又は４である）；置換５～６員環（例えば、アリール環、ヘテロアリール環（例えば、テトラゾール、ピリジル、２，５－ピロリジンジオン（例えば、置換フェニル部分で置換された２，５－ピロリジンジオン））、炭素環、又は複素環）又は酸素含有部分（例えば、－Ｏ－、－Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ）である。

【0106】

例示的な実施形態
一実施形態では、Ｅ３リガーゼのリガンドに結合したリンカーに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む分子が提供される。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドは、１７β－エストラジオール、エストロン、フィトエストロゲン、キセノエストロゲン、エストリオール、エストリオール３－硫酸、エストリオール１７－硫酸、Ｇ－１、Ｇ－１５、Ｇ－３６、ゲニステイン又はケルセチンを含む。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドは１７β－エストラジオールを含む。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンドはＧＰＥＲアンタゴニストである。一実施形態では、Ｅ３リガーゼリガンドはフォン・ヒッペルリガーゼ（ＶＨＬ）リガンドである。一実施形態では、Ｅ３リガーゼリガンドは、レナリドマイド、ポマリドマイド、イベルドマイド、（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ、サリドマイド、ＶＨ－２９８、ＣＣ－８８５、Ｅ３リガーゼリガンド８、ＴＤ－１０６、ＶＬ２８５、ＶＨ０３２、ＶＨ１０１、ＶＨ２９８、ＶＨＬリガンド４、ＶＨＬ－２リガンド３、Ｅ３リガーゼリガンド３、Ｅ３リガーゼリガンド２、又はＢＣ－１２１５を含む。一実施形態では、リンカーは、５～５０個の原子、例えば、約８～約３５個の原子を有する鎖を有する。一実施形態では、リンカーはアルキルリンカーである。一実施形態では、リンカーは、１つ以上のＯ、Ｎ又はＳを有するヘテロアルキルリンカーである。一実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。一実施形態では、リンカーは、４～１５個のＰＥＧ単位を含む。一実施形態では、リンカーは（ＰＥＧ）_ｍＮＨ（ＣＯ）（ＰＥＧ）_ｎを含み、ｎ及びｍは独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５である。一実施形態では、ｎは３、４、５、又は６である。一実施形態では、ｍは７、８、９、又は１０である。一実施形態では、ＧＰＥＲリガンド、リンカー又はＥ３リガンドは、アミン基、カルボキシル基、カルボニル基、スルフヒドリル基、例えばマレイミド、アルデヒド基、例えばヒドラジド、又は別の分子と共有結合を形成するのに有用なヒドロキシル基を含む。一実施形態では、リンカーは、カルボジイミド、例えばＥＤＣ、ＮＨＳ、ＡＢＨ、ＡＮＢ－ＮＯＳ、ＡＰＤＰ、ＥＭＣＨ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＭＢＳ、又はＳＩＡＢを含む。

【0107】

一実施形態では、ヒトにおける内分泌抵抗性がん又はホルモン療法抵抗性がんを予防、阻害、又は治療する方法が提供される。一実施形態では、この方法は、Ｅ３リガーゼのリガンドに結合したリンカーに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む有効量の分子を有する組成物をヒトに投与することを含む。

【0108】

一実施形態では、ヒトのトリプルネガティブ乳がんを予防、阻害、又は治療する方法が提供され、この方法は、哺乳動物に、Ｅ３リガーゼのリガンドに結合したリンカーに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む有効量の分子を有する組成物を投与することを含む。

【0109】

一実施形態では、ヒトの子宮頸がん、卵巣がん、又は子宮内膜がんを予防、阻害、又は治療する方法が提供され、この方法は、哺乳動物に、Ｅ３リガーゼのリガンドに結合したリンカーに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む有効量の分子を有する組成物を投与することを含む。

【0110】

一実施形態では、ヒトの前立腺がん又は卵巣がんを予防、阻害、又は治療する方法が提供され、この方法は、哺乳動物に、Ｅ３リガーゼのリガンドに結合したリンカーに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む有効量の分子を有する組成物を投与することを含む。

【0111】

例示的なキメラ
式Ｉの構造を有する化合物又はその塩が提供され、
Ｘ－Ｌ－Ｙ
式Ｉ
式中、Ｘは、Ｇタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドであり；
ＹはＥ３ユビキチンリガーゼリガンドであり；
Ｌはリンカーである。

【0112】

一例では、Ｘは、１７β－エストラジオール、エストロン、フィトエストロゲン、キセノエストロゲン、エストリオール、エストリオール３－硫酸、エストリオール１７－硫酸、Ｇ－１、Ｇ－１５、Ｇ－３６、ゲニステイン、ダジン、ケルセチン、又はそれらの誘導体である。一例では、ＸはＧＰＥＲアンタゴニストである。一例では、Ｙはフォン・ヒッペルリガーゼ（ＶＨＬ）リガンドである。一例では、Ｙは、セレブロン、レナリドマイド、ポマリドマイド、イベルドマイド、（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ、サリドマイド、ＶＨ－２９８、ＣＣ－１２２、ＣＣ－８８５、Ｅ３リガーゼリガンド８、ＴＤ－１０６、ＶＬ２８５、ＶＨ０３２、ＶＨ１０１、ＶＨ２９８、ＶＨＬリガンド４、ＶＨＬリガンド７、ＶＨＬ－２リガンド３、Ｅ３リガーゼリガンド３、Ｅ３リガーゼリガンド２、ＢＣ－１２１５、又はそれらの誘導体である。一例では、Ｌは、ＸとＹとの間の直線経路で数えて原子５～２００個の鎖長を有する主鎖を有する。一例では、Ｌは、ＸとＹとの間の直線経路で数えて原子１５～５０個の鎖長を有する主鎖を有する。一例では、Ｌは、ＸとＹとの間の直線経路で数えて原子２０～５０個の鎖長を有する主鎖を有する。一例では、Ｌは、ＸとＹとの間の直線経路における結合長を合計することにより決定された計算長で８～３００オングストロームの長さを有する主鎖を有する。一例では、Ｌは、ＸとＹとの間の直線経路における結合長を合計することにより決定された計算長で２５～７５オングストロームの長さを有する主鎖を有する。例えば、Ｌの構造は

【0113】

【化5】

【0114】

の構造を有し、
Ｑは、結合又はＸへの共有結合を形成する二価の基であり；
Ｚは、１つ以上のアルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アルキルアミノ、アルキルグリコール、カルボニル、チオカルボニル、アシル、カルバマート、尿素、チオカルバマート、チオ尿素、ジチオカルバマート、アミノカルボニル、アミド、エステル、チオエステル、チオアミド、アミン、酸素、硫黄、スルホン、又はスルホキシドを、二価の形態で含む直鎖であり；
Ｇは、結合又はＹへの共有結合を形成する二価の基である。

【0115】

一例では、Ｌは、

【0116】

【化6】

【0117】

の構造を有し、
Ｑは、結合又はＸへの結合を形成する二価の基であり；
Ｒは、二価の形態のアルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アルキルアミノ、アルキルグリコール、カルボニル、チオカルボニル、アシル、カルバマート、尿素、チオカルバマート、チオ尿素、ジチオカルバマート、アミノカルボニル、アミド、エステル、チオエステル、チオアミド、アミン、酸素、硫黄、スルホン、又はスルホキシドであり；
Ｇは、結合又はＹへの結合を形成する二価の基であり；
ｍ、ｎ、ｐ、及びｑは、存在する場合、ｍ、ｎ、ｐ、及びｑのうちの少なくとも１つが０より大きい整数であることを条件として、それぞれ独立して０～５０の整数である。

【0118】

一例では、Ｑ及びＧは、独立して、二価の形態のカルボニル、チオカルボニル、アシル、カルバマート、尿素、チオカルバマート、チオ尿素、ジチオカルバマート、アミノカルボニル、アミド、エステル、チオエステル、チオアミド、スルホン、又はスルホキシドである。

【0119】

一例では、Ｑ及びＧは、独立して、カルボニル、又は、アセチル、２－ヒドロキシアセチル、２－アミノアセチル、プロピオニル、３－ヒドロキシプロパノイル、３－アミノプロパノイル、ブタノイル、４－ヒドロキシブタノイル、及び４－アミノブタノイルからなる群から選択されるアシルであり、これらはそれぞれ二価の形態である。

【0120】

一例では、ｍ及びｎは、存在する場合、それぞれ独立して、０～２の整数であり、Ｑ及びＧは、それぞれ独立して、カルボニル、チオカルボニル、アセチル、２－ヒドロキシアセチル、２－アミノアセチル、プロピオニル、３－ヒドロキシプロパノイル、３－アミノプロパノイル、ブタノイル、４－ヒドロキシブタノイル、４－アミノブタノイル、カルバマート、尿素、チオカルバマート、チオ尿素、ジチオカルバマート、アミノカルボニル、アミド、エステル、チオエステル、チオアミド、スルホン、又はスルホキシドであり、これらはそれぞれ二価の形態である。

【0121】

一例では、Ｚは親水性である。
一例では、Ｌは

【0122】

【化7】

【0123】

の構造を有し、これは直線経路で数えて原子１３個の長さを有する主鎖を提供する。
一例では、Ｌは

【0124】

【化8】

【0125】

の構造を有し、ｐ及びｑは、それぞれ独立して、０～５０の整数である。
一例では、Ｌは、二価アルキル基、二価のヘテロアルキル基、又は二価のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のうちの１つ以上、又はそれぞれを１つ以上含む。

【0126】

一例では、Ｌは、５個以上の二価のエトキシ（－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－）基を含む。一例では、Ｌは、炭素２個ごとに１個以上のヘテロ原子を含み、ブチルより長いアルキル鎖を含まない。

【0127】

一例では、Ｌは、Ｘの酸素、窒素、硫黄、カルボニル、又はエチニルを介してＸに結合し、Ｌは、Ｙの酸素、窒素、硫黄、カルボニル、又はエチニルを介してＹに結合する。
一例では、Ｘはエストロゲンステロイドであり、エストロゲンステロイドのＣ６又はＣ１７に位置する酸素、アミン、硫黄、ビニル、エチン、及びカルボニルから選択される二価の基を含み、Ｃ６又はＣ１７の上記二価の基はＬに結合される。

【0128】

一例では、Ｙは、（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣであり、これは（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣのアミンを介してＬに結合される。
一例では、化合物は

【0129】

【化9】

【0130】

の構造を有し、Ｌはリンカーである。
一例では、化合物は

【0131】

【化10】

【0132】

の構造を有し、Ｌはリンカーである。
一例では、化合物は

【0133】

【化11】

【0134】

の構造を有する。
一例では、化合物は

【0135】

【化12】

【0136】

の構造を有する。
一例では、化合物は

【0137】

【化13】

【0138】

の構造を有する。
一例では、化合物は

【0139】

【化14】

【0140】

の構造を有する。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって説明される。
実施例１
ＧＰＥＲは、乳がん（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓｊｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、卵巣がん（ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００９）及び子宮内膜がん（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００７）の低生存率及び疾患の進行に関連している。重要なことに、ＧＰＥＲはＴＮＢＣの８０％超で発現しており、ＴＮＢＣは、利用可能な薬剤が標的とするタンパク質の発現が欠如しているために全生存率が低い乳がんのサブタイプである。このエストロゲン受容体は、エストロゲン作用の独立した尺度であり、ドラッガブルターゲットである。このプロジェクトの目標は、ＧＰＥＲをターゲティング及び分解するためのＰＲＯＴＡＣの開発において重要な一歩を踏み出すことである。

【0141】

ＴＮＢＣ患者１２１人を対象とした調査では、この受容体がこれらの腫瘍の８０％以上で発現していることが示唆されている。ＴＮＢＣの大部分におけるＧＰＥＲの発現は、他の小規模な研究によって裏付けられており、ＧＰＥＲがＴＮＢＣにおける腫瘍抑制因子であることを示唆する６つの腫瘍と２つの細胞株のかなり限定的な研究からのデータとは対照的である。進行性乳がんの臨床的予測因子と逆相関するＥＲの発現とは異なり、ＧＰＥＲの発現はこれらの同じ変数と直接関連しており（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｉｇｎａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、転移に関与していることを示唆している。この観察結果と、ＧＰＣＲが製薬業界の標的であるという事実により、ＧＰＥＲは乳がんの有望なドラッガブルターゲットとなる。したがって、ＧＰＥＲを選択的に分解するこのタイプの治療薬は、ＴＮＢＣの治療に有用である可能性があり、他の内分泌抵抗性乳がんにも有用である可能性がある。最後に、ＧＰＥＲは婦人科がんの進行性疾患及び予後不良に関連しており、このことは、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣがこれらの患者に利益をもたらす可能性があることを示唆している。

【0142】

エストロゲン標的療法は、閉経後の女性に有効である。腫瘍形成が閉経後に起こるＴＮＢＣ発がんの自発的モデルが使用される。ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、早期ＴＮＢＣ（腫瘍≦０．５ｃｍ）のマウスに送達される。ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは内因性エストロゲンの非存在下で最も効果的に機能する可能性があるが、乳がんの全症例の１％に満たないものの男性でも検査が実施される（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0143】

ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣプロトタイプであるＵＩ－ＥＰ００１は、組換えＧＰＥＲを選択的に分解し、ヒト乳がん細胞における天然ＧＰＥＲの発現をダウンモジュレートする（図２及び３）。ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣをスクリーニングするために、ＧＰＥＲを発現するが核ＥＲを欠くヒトＳＫＢＲ３乳がん細胞の原形質膜におけるエストロゲンに特異的な高親和性（Ｋｄ＝２．７ｎｍ）、限られた能力、置換可能な単一結合部位を測定するＧＰＥＲ結合アッセイを使用することができる（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＧＰＥＲは、受容体のリン酸化、β－アレスチンとの相互作用、リソソーム活性のいずれも必要としないエンドサイトーシスの通常とは異なるメカニズムを経る。代わりに、ＧＰＥＲは原形質膜でポリユビキチン化され、プロテアソーム分解の前に、ｒａｂ１１陽性リサイクルエンドソームを介してトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）に逆行的に輸送される（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。最後に、ＧＰＥＲ分解の程度を定量化するために、ＧＰＥＲをタンパク質分解するＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの相対的な有効性を測定するための高感度Ｎａｎｏｂｉｔバイナリ発光アッセイが使用される（図１１）。

【0144】

ＧＰＥＲに対する結合親和性及び特異性の高いＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの特定
原理．ＥＲのタンパク質分解ターゲティングは、内分泌抵抗性乳がんを治療する効果的な手段である。ＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、経口投与された場合、ＥＲ＋乳がんの前臨床モデルで腫瘍退縮を促進する（Ｆｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＥＲ陰性（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｉｇｎａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１１）及びトリプルネガティブ腫瘍（９７／１２１＝８０．２％）の大部分で発現される別個のエストロゲン受容体であるＧＰＥＲを標的とするＰＲＯＴＡＣは、開発されているが（Ｐｒｉｓｓｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、臨床使用はまだ承認されていない選択的ＧＰＥＲアンタゴニストを補完すると考えられ、より効果的である可能性がある。

【0145】

ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの設計．一実施形態では、ＰＲＯＴＡＣ設計は、ターゲティングリガンドとしての１７β－Ｅ２、及びフォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）由来のユビキチンＥ３リガーゼ・リガンド、（Ｓ，Ｒ，Ｓ）ＡＨＰＣ［２４］として知られている（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２－アミノ－３，３－ジメチル－ブタノイル）－４ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアソール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミドの使用に基づいている。ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、２、４、又は６単位のペグ化化学的リンカーのアレイにコンジュゲートされたＡＨＰＣからなる部分的ＰＲＯＴＡＣを使用して組み立てられる（図１９）。構造活性相関（ＳＡＲ）データは、化学的リンカーのエストラン環のＣ６及びＣ１７原子への結合が、ＧＰＥＲのエストロゲン結合機能を維持する可能性が最も高いことを示唆している。Ｃ６側鎖を含むフルベストラント（ＩＣＩ１８２，７８０）は、５％の相対結合活性を有し、５００ｎＭでＧＰＥＲアゴニストとして機能し（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）、細胞内ｃＡＭＰ産生の刺激に関して１７β－Ｅ２と類似する１７β－Ｅ２－ヘミスクシナート－１７－ＢＳＡの効力を有する（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0146】

ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの合成、精製、及び構造確認．Ｃ－１７結合ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、室温でＤＭＦの存在下でＥＤＣ．ＨＣｌ及びＨＯＢｔを使用した、１７β－Ｅ２の１７β－ヒドロキシル基と（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ－ＰＥＧ_２－ＣＯＯＨ；（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ－ＰＥＧ_４－ＣＯＯＨ又は（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ－ＰＥＧ_６－ＣＯＯＨとのＥＤＣカップリングによって合成される。目的の化合物の合成は、ＮＭＲ分析と高分解能質量分析によって確認される。Ｃ－６結合ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは多段階反応で合成可能である。第１に、還流メタノール中、酢酸アンモニウムの存在下でシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用した、１３－メチル－６－オキソ－７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３，１７－ジイルジアセタート（１）の６カルボニル基の還元的アミノ化。第２に、ＤＭＦの存在下でＥＤＣ．ＨＣｌ及びＨＯＢｔを使用した、６－アミノ－１３－メチル－７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３，１７－ジイルジアセテート（２）と（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ－ＰＥＧ_２－ＣＯＯＨ；（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ－ＰＥＧ_４－ＣＯＯＨ又は（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ－ＰＥＧ_６－ＣＯＯＨのカップリング。化合物の精製は、Ｃ１８逆相分取ＨＰＬＣカラムにより達成される。目的の化合物の合成及び純度は、ＮＭＲ分析及びＬＣ－ＭＳを使用して確認される。この合成に使用される化学物質はすべて市販されている。

【0147】

ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣ結合の評価．ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、競合的放射性受容体アッセイを使用して結合活性について試験される［２２］。簡潔に述べると、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣをエタノールに溶解させ、最終濃度１ｎＭ～１０ｕＭになるようにガラス製反応チューブに加える。エタノールを窒素下で蒸発させる。膜タンパク質（１００ｕｇ）と４ｎＭ（８９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）^３Ｈ－１７β－エストラジオール（Ｅ２）をチューブに加え、４℃で３０分間インキュベートする。事前に浸したガラス繊維フィルターで急速にろ過することによって結合を停止させることで、フリー^３Ｈ－Ｅ２から結合を分離する。フィルターを洗浄し、液体シンチレーションカウンターを使用して放射線を測定する。最大特異的結合を、総結合（競合相手の不在）と１，０００倍モル過剰の１７β－Ｅ２又はＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの存在下での非特異的結合の差として計算する。５０％の最大特異的結合を置換するために必要な競合物の濃度（ＥＣ_５０）を、１サイト競合結合曲線から計算する。この曲線の頂部と底部がそれぞれ１００％と０％として定義される。相対結合親和性（ＲＢＡ）は、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣのＥＣ_５０に対する１７β－Ｅ２のＥＣ_５０の比として計算され、パーセンテージとして表される。一実施形態では、１７β－Ｅ２に対する１つ以上のＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣのＲＢＡは＞１０％である。

【0148】

ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣ候補の、ＧＰＥＲを分解し、そのシグナル伝達活性を低下させる能力の試験
原理．これは、Ｅ３ユビキチンリガーゼをリクルートし、ＧＰＥＲをユビキチン化し、プロテアソームによる破壊をもたらすＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの能力に向けられている。ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの分解能力を、最初に定量的免疫蛍光及び免疫化学分析によって評価する。強力な分解能力を示す薬剤候補を、次にハイスループットで感度の高い発光アッセイを使用してさらに評価する。最後に、活性ＧＰＥＲの減少における各試験済みＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの有効性を、ＧＰＥＲ依存性ｅｒｂＢ１チロシルリン酸化及びｅｒｋ－１／２のリン酸化を測定することによって評価する（Ｐｒｉｓｓｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。総合すると、ＧＰＥＲダウンモジュレーションのこれらの測定値は、ＧＰＥＲ活性を効果的に低減するＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを特定する。

【0149】

乳がん細胞では、ＧＰＥＲの大部分はそのヘテロ三量体Ｇタンパク質から切り離されて低親和性状態にあり、小胞体に保持されている。高親和性のＧタンパク質結合状態のものは、原形質膜でわずかな割合しか発現していない（Ｐｒｉｓｓｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００７）。インタクト細胞で高濃度で使用すると、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは低親和性受容体と高親和性受容体の両方を分解する可能性がある。細胞表面関連及び全ＧＰＥＲに対するＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの影響が測定される。上述したように、また以下で詳述するように、いくつかの定量的モダリティを使用して、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣ候補で処理された乳がん細胞において、例えば、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣ候補で処理されたルミナールＡ、ルミナールＢ、ｈｅｒ２過剰発現かつ基底免疫表現型の乳がん細胞において、ＧＰＥＲ分解とそのシグナル伝達活性を測定する。最後に、既存のＧＰＥＲアンタゴニストであるＧ１５又はＧ３６の、ＧＰＥＲシグナル伝達活性の低下における相対的有効性を比較する。

【0150】

ＧＰＥＲ分解の評価．最も高いＲＢＡを有するＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを、ＧＰＥＲをユビキチン化して分解する能力について試験する。ＧＰＥＲを発現する乳がん細胞を様々な用量のＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣ又はビヒクルで５分から８時間処理し、ＧＰＥＲダウンモジュレーションを免疫蛍光分析及び免疫化学分析の両方によって評価する。固定されたインタクトな又は界面活性剤で透過処理された乳がん細胞において、天然ＧＰＥＲの存在を、Ｎ末端又はＣ末端抗体のいずれかを使用して検出する。免疫蛍光によって検出されたＧＰＥＲを、総補正細胞蛍光（Ｊ－Ｉｍａｇｅ）及びＥＬＩＳＡによって定量化する。ＧＰＥＲタンパク質の未成熟又は成熟形態の定常状態レベルを、ＧＰＥＲ特異的抗体を用いたイムノブロッティングにより決定する。これらの実験では、ＧＰＥＲ分解の程度は、バンドピクセル強度を測定し（ＩｍａｇｅＪ）、ＧＡＰＤＨに対して正規化することによって決定される。ＧＰＥＲ作用の特異性を、過剰な遊離１７β－Ｅ２又は対照ステロイド（測定可能なＧＰＥＲへの結合を示さない１７β－エストラジオール）の存在下で確認する（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）。１７β－Ｅ２を欠く、又は１７β－Ｅ２に結合した部分的ＰＲＯＴＡＣは、薬物コントロールとして機能する。標的特異性を、ＨＡ－ＧＰＥＲ、ＨＡ－ＣＸＣＲ４、又はＨＡ－β－１ＡＲを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞において評価する（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。

【0151】

ＧＰＥＲポリユビキチン化の評価．ユビキチン化状態を、タンデムユビキチン結合要素（ＴＵＢＥ）プルダウンアッセイで、ＧＰＥＲ特異的抗体によりブロッティングして確認する。この場合も、未処理、ＰＲＯＴＡＣ処理、及び部分的ＰＲＯＴＡＣ処理細胞からの溶解物のピクセルバンド強度を測定することにより、未成熟及び表面形態の両方におけるＧＰＥＲユビキチン化の程度を定量化する。プロテアソーム分解は、細胞をプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２で処理することによって評価されるが、対照細胞にはリソソーム加水分解酵素を阻害するクロロキンが与えられる。ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣ分解に対する感受性についてユビキチン化できないＧＰＥＲのリジンレスバージョン（Ｌｙｓ３３３Ａｒｇ、Ｌｙｓ３４１Ａｒｇ、Ｌｙｓ３５１Ａｒｇ）も試験する。

【0152】

表面及び全ＧＰＥＲの分解を評価するためのＮａｎｏｂｉｔ相補アッセイ．細胞表面からのＧＰＥＲの除去とその全体的な分解を定量化するために、Ｎａｎｏｂｉｔ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）バイナリ発光相補性アッセイを行う。このアッセイは、６ｌｏｇ以上のダイナミックレンジを有する発光シグナルを記録する。ルシフェリン基質の存在下で、ＨｉＢｉｔ及びＬｇＢｉｔと呼ばれるエビルシフェラーゼの２つの分割成分の相互作用により、発光シグナルが生成される。これらの実験では、可溶性ＬｇＢｉｔをルシフェリンと共に、Ｎ末端ＨｉＢｉｔタグを付されたＧＰＥＲを発現するインタクト又は界面活性剤で透過処理した細胞に送達する。

【0153】

ＧＰＥＲシグナル伝達の評価．ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣによる様々な期間での処理後、細胞を１７β－Ｅ２で刺激し、ｅｒｂＢ１チロシルリン酸化又はｅｒｋ－１／２リン酸化をモニタリングすることによりＧＰＥＲ活性を測定する。ＥＧＦで刺激したｅｒｂＢ１又はｅｒｋ－１／２の測定は、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの特異性の対照として機能する。ｅｒｂＢ１又はｅｒｋ－１／２刺激を測定する追加の対照実験を、１７β－Ｅ２に結合させた部分的ＰＲＯＴＡＣを用いて行う。データをピクセルバンド強度によって定量化し、未処理の細胞に対して正規化する。

【0154】

リードＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の決定
原理．有効性、体内分布、及び毒性を早期に検討することは、合理的に設計された医薬品の初期評価及びその後の構造の変更において重要である。これらの生物学的反応は、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの経口投与後に測定される。

【0155】

ＧＰＥＲはがん細胞で作用し、その生存を促進するほか、腫瘍の微小環境の決定及びがんの進行の促進を行う細胞にも影響を与える（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。したがって、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの抗発がん活性又は抗腫瘍活性は、ヒトＴＮＢＣ発がんをシミュレートするマウスモデルを使用して、例えば、腫瘍増殖の阻害又は動物の生存率を測定することによって決定される。毒性及び体内分布の研究は、野生型とＧＰＥＲヌルマウスの両方で行われる。実験は、卵巣インタクトマウス及び卵巣切除（ＯＶＸ）マウスで行われる。

【0156】

統計分析．１群１２匹のマウスは、群固有の標準偏差の１．２倍の平均差を検出する８０％の検出力を達成する。検出力は、ある時点で有意水準５％の両側２サンプルｔ検定を使用して控えめに推定される。混合効果回帰を使用して、時間及び処理群の関数として腫瘍増殖率を推定及び比較する。ランダム効果モデルを使用して、繰り返される腫瘍測定の縦方向の相関性を説明する。時間の経過に伴うすべての腫瘍測定値が利用されるため、この形式的分析はより高い検出力を有することが期待される。全生存率については、カプラン・マイヤー法を使用して各処理群の曲線を作成し、ログランク検定を使用して比較する。

【0157】

抗がん剤としてのＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ効果が最も高いことが判明したＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを、その抗発がん効果について調査する。オスのｐ５３^{ｆｌ／ｆｌ}Ｂｒｃａ１^{ｆｌ／ｆｌ}マウスを、メスのＫ１４－ｃｒｅと交配したｐ５３^{ｆｌ／ｆｌ}Ｂｒｃａ１^{ｆｌ／ｆｌ}マウスは、通常の同腹仔サイズをもたらし、生まれるトランスジェニック幼仔が胚致死性でないことが示されている。メスのマウスの約８５％が乳腺腫瘍を発症し、生存期間の中央値は２４８日である。デジタルキャリパーを使用して腫瘍形成を注意深く監視し、腫瘍が一次元で５ｍｍに達したら、マウスを無作為に対照群と処理群に分ける。最初の実験は、毒性試験に基づいたＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの用量（１００～４，０００ｍｇ／ｋｇ）を使用して、腫瘍の増殖（退行）への影響が観察される用量及び処理スケジュールを特定することを目的とする。マウスは強制経口投与によってビヒクル又はＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの単回投与を受ける。キャリパーを使用してマウスの腫瘍増殖を監視する。腫瘍増殖及び全生存期間（ＯＳ）を、治療に対する反応性の尺度として使用する。

【0158】

生体分布研究．ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを、野生型及びＧＰＥＲヌルマウスに強制経口投与により与える。投与スケジュールと投与濃度は様々であり得る。乳房、回腸、十二指腸、脾臓、心臓、肺、及び肝臓から腫瘍及び組織を摘出し、ＬＣ－ＭＳにより薬物濃度を測定する。接種後１時間、４時間、２４時間、７日、１４日、２１日及び２８日で腫瘍及び組織を採取する。

【0159】

毒性研究．ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣを使用した治療に関連する毒性を特定するために、上記で概説した実験と組み合わせて、処理マウスと未処理マウスの両方（５匹／群）において、肝機能（ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨ、ビリルビン）、腎機能（クレアチニン、ＢＵＮ）、及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（下痢、血便）を毎週監視する。毒性を示す客観的基準には、肝機能及び腎機能の値が３倍以上上昇していること、ならびに下痢及び／又は血便が衰えていないことが含まれる。

【0160】

図１１に示すように、処理の２４時間後、ＨＣＣ１８０６及びＳＫＢＲ３細胞は、部分的ＰＲＯＴＡＣと比較して、Ｅ_２－ＰＲＯＴＡＣで処理した場合に低い生存率を示した。ＨＣＣ１８０６は、ＳＫＢＲ３よりもＥ２－ＰＲＯＴＡＣに対して高い応答を示した。ＩＣ５０は、約１０～約５０ｕＭの範囲であった。細胞をエストラジオールで前処理すると、ＨＣＣ１８０６とＳＫＢＲ３の両方で細胞死が大幅に減少した。ＧＰＥＲの分解は、細胞死又は細胞増殖の減少をもたらす可能性がある。又は、膜から核へのＧＰＥＲの非局在化により、リガーゼが動員されて細胞質／核内のタンパク質が分解される可能性がある。

【0161】

実施例２
乳がんに対するホルモン療法の割付けに関する決定は、生検された腫瘍組織における核エストロゲン受容体（ＥＲ）の存在のみに基づいている。これは、Ｇタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）が進行性乳がんに関連しており、乳がん幹細胞の生存に必要であるという事実に反している。観察結果は、効果的な内分泌療法もこの受容体を標的とするべきであることを示唆している。ここでは、ＥＲａ、ＥＲｂ、及びＧＰＥＲを効果的に分解する２つのＥＲ／ＧＰＥＲターゲティングタンパク質分解キメラ（ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２）について説明する。これらのキメラは、ＧＰＥＲ及びＥＲとの高親和性相互作用を形成し、結合解離定数はそれぞれ約３０ｎＭ及び１０～２０ｎＭである。原形質膜及び細胞内ＧＰＥＲ及び核ＥＲは、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２によって分解されたが、エストロゲンターゲティングドメインを欠く部分的ＰＲＯＴＡＣでは分解されなかった。プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２による細胞の前処理は、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２のタンパク質分解をブロックしたが、リソソーム栄養阻害剤であるクロロキンは効果がなかった。組換えｂ１－アドレナリン受容体又はＣＸＣＲ４に対してオフターゲット活性は観察されなかった。標的特異性は、両方の薬剤が効果的にＥＲａ、ＥＲβ、及びＧＰＥＲを分解したがプロゲステロン受容体（ＰＲ）を使用しなかったヒトＭＣＦ－７細胞でさらに実証された。ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２は、ＭＣＦ－７乳がん及びヒトＳＫＢＲ３（ＥＲａ－ＥＲｂ－ＧＰＥＲ＋）乳がん細胞において細胞毒性及びＧ２／Ｍ細胞周期停止を誘導したが、機能的ＧＰＥＲ／ＥＲを発現しないヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞では誘導しなかった。これらの結果は、原形質膜及び細胞内のエストロゲン受容体の両方を標的とする乳がんの抗エストロゲン治療の受容体ベースの戦略を提供する。

【0162】

材料及び方法
ＥＲａ又はＧＰＥＲへのＥ２－ＰＲＯＴＡＣの分子ドッキング．以前に確立されたＧＰＥＲ相同性モデルを、ＧＬＩＤＥ（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）ドッキング研究で使用した（Ａｍａｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ａｍａｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。これらの研究では、ＧＬＩＤＥ内のＲｅｃｅｐｔｏｒ Ｇｒｉｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎを使用して、以前に確立されたＥ２の結合部位の周りに最初にグリッドを構築した。ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２をＭａｅｓｔｒｏ１１．３（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）に描画し、Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ内のＬｉｇＰｒｅｐ関数を使用するドッキングの準備をした。ＯＰＬＳ３力場を使用し、Ｅｐｉｋを用いてｐＨ７±２で可能なイオン化状態を生成した。他のすべての設定はデフォルト設定のままにした。その後、ＵＩ－ＥＰ００１とＵＩ－ＥＰ００２のＧＬＩＤＥドッキングが行われた。ファンデルワールス半径を、０．１５の部分電荷カットオフで０．８のスケーリング係数に設定した。ＸＰ（超精密）ドッキングを、フレキシブルリガンドサンプリングを使用して実行し、サンプル窒素反転とサンプル環構造の両方をオンにした。アミドのバイアスサンプリングは、非平面コンフォメーションにペナルティーになるように設定した。エピック状態のペナルティをドッキングスコアに追加した。ドッキングでは、ドッキングの初期段階でリガンドあたり１０，０００のポーズを保持し、ＯＰＬＳ３力場を使用したエネルギー最小化のために、リガンドあたり最適な１，０００のポーズを保持した。ドッキング後の最小化を実行し、リガンドあたり１００ポーズを保持した。他のすべての設定はデフォルト設定のままにした。ＵＩ－ＥＰ００１とＵＩ－ＥＰ００２の両方も、同様の方法でＥＲα内にドッキングした。ＥＲαホモ二量体結晶構造を使用し（ＰＤＢ：１Ａ５２、Ｔａｎｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、結合したＥ２分子を除去し、次いでＧＬＩＤＥ内でＲｅｃｅｐｔｏｒ Ｇｒｉｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎを使用してドッキングの準備をした後、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２を用いてドッキング研究を行った。

【0163】

Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣ及びＥ２－ＦＩＴＣの合成．
ＵＩ－ＥＰ００１、ＵＩ－ＥＰ００２、及びＥ２－ＦＩＴＣの化学合成を、それぞれ図２４及び図３１の概略図に従って行った。^１Ｈ及び^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、３００ＫでＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＡＶ－３００及びＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＡＶ－５００装置で記録した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）からの１００万分の１（ｐｐｍ）ダウンフィールドで報告される。すべての^１３ＣＮＭＲスペクトルはｐｐｍで報告され、１Ｈデカップリングで取得される。報告されたスペクトルデータでは、フォーマット（δ）化学シフト（多重度、Ｈｚ単位のＪ値、積分）が次の略語と共に使用された：ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｍ＝多重項。Ｗａｔｅｒｓ Ｑ－Ｔｏｆ Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計を用いてＭＳ分析を行った。ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２を、溶媒Ａ（Ｈ_２Ｏ中の０．１％ＴＦＡ）及び溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ中の０．１％ＴＦＡ）を溶離液として、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２ ＵＨＰＬＣシステムを備えたＣ１８逆相分取ＨＰＬＣカラムによって精製した。

【0164】

細胞及び培養条件．ヒトＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＣＣ－１８０６、及びＳＫＢＲ３乳がん細胞及びヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ－２９３）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナッサス）から購入した。ヘマグルチニンタグ付きＧＰＥＲ（ＨＡ－ＧＰＥＲ）、β１－アドレナリン受容体（ΗＡ－β１ＡＲ）、及びＣＸＣＲ４（ＨＡ－ＣＸＣＲ４）を安定して発現するＨＥＫ－２９３細胞は、以前に説明されている（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。すべての細胞株を、３７℃、５％ＣＯ_２を含む加湿チャンバー内で、フェノールレッドを含まない（１：１）ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地（ＰＲＦ－ＤＦ１２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）に１０％ウシ胎仔血清及びペニシリン－ストレプトマイシンを添加したもので培養した。

【0165】

ステロイド及び阻害剤．１７β－エストラジオール（１７ｂ－Ｅ２）及びアルドステロンを、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。２６Ｓ－プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２をＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（ペンシルベニア州ピッツバーグ）から購入し、リソソーム栄養剤である二リン酸クロロキンをＢｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。

【0166】

抗体．ＧＰＥＲ特異的抗体を、ヒトＧＰＥＲポリペプチド（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州ラモナ）のＮ末端からのアミノ酸１～６２に由来する合成ペプチドに対して、ニュージーランドホワイトウサギで生成した。含まれる市販の抗体：ウサギ抗ＨＡエピトープ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マサチューセッツ州ビバリー）、マウスモノクローナルＥＲ－α（２Ｑ４１８）、ＰＲ（Ｆ－４）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カルフォルニア州サンタクルズ）から購入し、ウサギモノクローナルＥＲ－β抗体、クローン６８－４は、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（マサチューセッツ州ビレリカ）から購入した。ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ５９４、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８、及びヤギ抗マウスＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８二次抗体は、Ａｂｃａｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から、ヤギ抗ウサギＩｇＧ及びヤギ抗マウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（アラバマ州バーミンガム）から購入した。

【0167】

プラスミド．ＣＭＶプロモーターの転写制御下で全長ヒトＧＰＥＲ（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）及びＥｒａ（ｄｅＣｏｎｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９９５）をコードする分子クローンが報告されている。フォワード５’－ＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＧＣＧＡＴＧＴＧＡＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＣ－３’（配列番号１）及びリバース５’－ＡＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＡ－ＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＣＣＧＴＧＣ－３’（配列番号２）オリゴヌクレオチドプライマー及びＱ５突然変異誘発キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州セイラム）を用いたインバースＰＣＲによって、ＨｉＢｉＴタグ（ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ）をＧＰＥＲのアミノ末端にインフレームで挿入した。フォワード５’－ＴＧＧＣＧＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＧＣＴＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＣＧＧＡ－３’（配列番号３）及びリバース５’－ＧＣＣＧＣＴＣＡＣＡＧ－ＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＣ－３’（配列番号４）オリゴヌクレオチドプライマーを用いた同様のインバースＰＣＲ戦略を使用して、ＥＲ－αのカルボキシル末端にＨｉＢｉＴタグを挿入した。

【0168】

一過性トランスフェクション及びバイナリＮａｎｏ－Ｂｉｔ（商標）発光アッセイ．Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ ＨｉＢｉＴ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、組み換えＬｇＢｉｔ及び基質を用いたバイナリ発光相補性により、界面活性剤で透過処理した細胞内の全ＨｉＢｉＴタグ付きＧＰＥＲ又はＥＲエストロゲン受容体を検出した。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞（０．７５×１０^６）を３５ｍｍ組織培養皿に播種し、２４時間後に５０ｎｇのＨｉＢｉＴ－ＧＰＥＲ又はＨｉＢｉＴ－ＥＲａ及び９５０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｚｅｏキャリアプラスミドを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて一過性にトランスフェクトした。翌日、トランスフェクトした細胞をトリプシン処理によって回収し、９６ウェルのポリ－Ｌ－リジンでコーティングされたＧｒｅｉｎｅｒ白底マイクロプレートに１０^４細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、細胞培養培地を吸引し、様々な濃度のＥ２－ＰＲＯＴＡＣ、部分的ＰＲＯＴＡＣ、又はビヒクルを含む１００μＬの無血清ＰＲＦ－ＤＦ１２に、示された時間間隔で３７℃で交換した。いくつかの実験では、クロロキン（１００ｍＭ）又はプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（１０ｍＭ）を含めた。処理後、ＬｇＢｉＴタンパク質及びＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴ基質からなるＨｉＢｉＴ相補試薬を使用して、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００で透過処理した細胞において全ＨｉＢｉＴタグ付き受容体を測定した。Ｔｅｃａｎ（ノースカロライナ州ローリー）のＩｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯマルチモードマイクロプレートリーダーを使用して発光を測定し、相対発光単位（ＲＬＵ）として報告した。すべてのサンプルをトリプリケートで測定し、平均値プラス又はマイナス標準偏差として表した。

【0169】

免疫細胞蛍光．細胞を、１２ウェルクラスタープレート（ＣｏＳｔａｒ、ニューヨーク州コーニング）において、ポリ－Ｌ－リジンでコーティングされた１８ｍｍガラス製カバースリップ上に、５％ＦＢＳを含むＰＲＦ－ＤＦ１２中１２，５００～２５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種した。翌日、細胞を未処理のままにするか、クロロキン（１００ｍＭ）又はプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（１０ｍＭ）の存在下又は非存在下、１００ｍＭのＵＩ－ＥＰ００１、ＵＩ－ＥＰ００２、又は部分的ＰＲＯＴＡＣで３７℃で１時間処理した。処理後、プレートを氷上で１０分間冷却してからＧＰＥＲ Ｎ末端ペプチド抗体で４℃で３０分間標識した。冷ＰＢＳで洗浄することにより過剰の抗体を除去し、次いで細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで５分間固定した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び５％正常ヤギ血清を含むＰＢＳ中で非特異的抗体結合部位を１時間ブロッキングした。全受容体を、免疫染色の前に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００で１０分間透過処理した細胞において測定した。固定され、透過処理された細胞をＰＢＳで２回洗浄し、一次抗体で１時間インキュベートした。過剰な一次抗体をＰＢＳで洗浄して除去してから、細胞をヤギ抗ウサギ又は抗マウス二次抗体にさらに１時間曝露した。この２回目のインキュベーションに続いて、細胞をＰＢＳで１回、トリス緩衝生理食塩水で１回洗浄した後、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）を含むＶｅｃｔａ－Ｓｈｉｅｌｄアンチクエンチ培地にカバースリップを載置した。免疫蛍光画像を、Ｑｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｔｉｇａ ２０００Ｒデジタルカメラ及びＮｉｋｏｎイメージングソフトウェア（ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ－ＢＲ３．０）を使用して、微分干渉コントラストと落射蛍光機能を備えたＮｉｋｏｎ Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ １００×０．５～１．３オイルアイリスを装備したＥｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州メルビル）で可視化した。キャプチャ後、ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ（登録商標）ＣＳ２（Ａｄｏｂｅ）を使用して明るさ／コントラストを調整して画像を処理した。

【0170】

競合結合アッセイ．ＧＰＥＲ結合を、フルオレセイン標識エストラジオール（Ｅ２－ＦＩＴＣ）を説明されたものにわずかな変更を加えて（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）トレーサーとして使用して、インタクト細胞ベースの競合結合アッセイで測定した。ＳＫＢＲ３細胞を１７５ｃｍ^２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国ニューヨーク州）中でほぼコンフルエンスまで増殖させ、次いで無血清培地中に一晩置いた。細胞を５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＨＢＳＳ中で剥がし、１５０ｇで５分間の遠心分離により回収した。細胞ペレットを２ｍＭのＣａＣｌ_２及び２ｍＭびＭｇＣｌ_２を含む氷冷ＨＢＳＳで２回洗浄し、細胞を同じ緩衝液中１０^６／ｍｌの最終濃度に調整した。細胞（１００μＬ）を１００ｎＭのＥ２－ＦＩＴＣと混合し、等量のＨＢＳＳ又は様々な濃度の１７ｂ－Ｅ２、部分的ＰＲＯＴＡＣ、又はＥ２－ＰＲＯＴＡＣを含む氷上の９６ウェル円錐Ｖ字型底マイクロタイタープレートに播種した。次に、サンプルを氷上で３０分間インキュベートした。細胞を４℃での遠心分離によりペレット化し、陽イオンを含むＨＢＳＳで１回洗浄し、Ａｕｒｏｒａ ＦＣＭ機器（Ｃｙｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）で分析した。サンプルあたり少なくとも１０，０００のイベントを、前方散乱対側方散乱ドットプロットゲーティングを使用して分析し、一次細胞集団を分解した。各サンプルについてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）チャネル内の細胞の蛍光強度をログモードで記録した。各条件をトリプリケートで実行し、蛍光強度の中央値プラス又はマイナス標準偏差として報告した。

【0171】

ＥＲ結合を、蛍光偏光によってＭＣＦ－７細胞から調製されたサイトゾル画分を使用して測定した。ＭＣＦ－７（１０^６細胞）をＥＤＴＡで分離し、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して細胞ホモジネートを調製し、細胞内画分を既に説明されているように分画遠心法で分離した（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ，２００２）。各フラクションのタンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって決定した。プローブの飽和結合アッセイのために、異なる濃度のサイトゾル画分をアッセイバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４；５０ｍＭのＫＣｌ、１０％グリセロール、０．１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｕｇ／ｍＬのＢＧＧ、１０ｎＭプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）、１０ｎＭのＥ_２－ＦＩＴＣを含む２００ｕＬの最終体積に希釈した。混合物を周囲温度で１時間インキュベートし、プローブとサイトゾルタンパク質との相互作用を蛍光偏光（ＦＰ）によって決定した。競合結合アッセイのために、サイトゾル分画のアリコートとＥ_２－ＦＩＴＣ（最終濃度１０ｎＭ）を混合し、４℃で１時間インキュベートした。次に、様々な濃度の薬物と対照を混合物に加えた。混合物をさらに１時間インキュベートし、次いでＦＰにかけた。すべてのサンプルをトリプリケートで測定した。陰性対照（サイトゾル分画のみ又はＥ_２－ＦＩＴＣのみ）及び陽性対照（処理なしで１００％結合したＥ２－ＦＩＴＣ及びサイトゾル分画）を含めた。相対的な結合親和性を、陽性対照と比較した処理ウェルから記録されたＦＰのパーセンテージとして表した。ミリ偏光単位（ｍＰ）でのＦＰ値を、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ｐｌｕｓ ３８４マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使用して、９６ウェルの黒色平底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州モンロー）において４８５ｎｍ／５３０ｎｍのｅｘ／ｅｍ波長で測定した。プローブのＫ_ｄ値を、飽和曲線の非線形回帰フィッティングによって決定し、処理のＩＣ５０値を、競合曲線の非線形回帰フィッティングによって決定した。

【0172】

細胞毒性アッセイ．Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣ処理後、Ｐｒｅｓｔｏ－Ｂｌｕｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキットを製造元の推奨プロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って使用して、細胞生存率を測定した。簡潔に述べると、乳がん細胞を増殖培地中１０^４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。翌日、９６ウェルプレートの内容物を吸引し、様々な濃度（１０^－９～１０^－３Ｍの範囲）の処理に交換し、続いて培地を加えて全量を２００μＬ／ウェルにした。未処理の対照群は、２００μＬ／ウェルの新鮮な培地でインキュベートした。１日後、培地を吸引し、９０μＬの培地＋１０μＬのＰｒｅｓｔｏｂｌｕｅ試薬と交換した後、３７℃で１時間インキュベートした。５６０ｎｍで蛍光を励起し、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ｐｌｕｓ ３８４マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を用いて５９０ｎｍで発光を記録した。相対細胞生存率の値を、未処理細胞を含む対照ウェルと比較した処理細胞を含むウェルから記録された蛍光のパーセンテージとして表した。

【0173】

細胞周期分析．細胞を２．５×１０^５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、未処理のままにするか、部分的ＰＲＯＴＡＣ、ＵＩ－ＥＰ００１、又はＵＩ－ＥＰ００２に２４時間曝露した。処理後、トリプシン処理によって細胞を回収し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞を７０％エタノール中、４℃で３０分間固定した。固定した細胞を２３０ｇで５分間遠心分離してペレット化し、細胞ペレットをクリシャン（Ｋｒｉｓｈａｎ’ｓ）溶液（３．８ｍＭクエン酸ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．０１４ｍＭヨウ化プロピジウム（ＡｎａＳｐｅｃ、カナダ国フェルモン）、１％ＮＰ－４０（Ｓｉｇｍａ）及び２．０ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））中で３７℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄してから、ＦａｃＳｃａｌｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して分析した。フローサイトメトリーからのデータを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアバージョン３．３によるさらなる分析にかけた。生成されたＤＮＡヒストグラムは、細胞周期のサブＧ１期、Ｇ０－Ｇ１期、Ｓ期、又はＧ２／Ｍ期の細胞集団の割合を示す。

【0174】

統計分析．すべてのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して分析した。すべてのデータの分散の正規性と均一性を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。各実験はトリプリケートで行われ、Ｐ＜０．０５の場合、差が有意であると見なした。

【0175】

結果
ＥＲａ又はＧＰＥＲ１のＥ２－ＰＲＯＴＡＣとの相互作用の分子ドッキング分析
ＧＰＥＲ結合ポケットとそのＥ２との相互作用に関する以前の研究は、ＰＲＯＴＡＣ戦略を使用してＥ２を修飾することができ、依然としてその結合効果を維持できることを示している（Ａｍａｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ａｍａｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。これらの相同性モデリング研究に基づいて、１７Ｃ－ヒドロキシル基は、ＴＭ１とＴＭ７の間のＧＰＥＲ結合ポケットの外側を指し、Ｎ１１８^２．６２及びＨ３０７^７．３７と相互作用すると仮定される。以前の研究では、１７Ｃでのフルオロフォアの結合がＧＰＥＲ活性に悪影響を及ぼさないことが示されている（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。したがって、２つの異なるＰＲＯＴＡＣ分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを介して１７－ヒドロキシル基に結合したフォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）、Ｅ３リガンド（ＶＨＬ１／ＶＨＬ０３２）を有するようにｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計された。合成を容易にするために１７－ヒドロキシル基へのエステル結合を選択し、ＧＰＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの可能な空間的制約を調査するために２つの異なる長さのリンカーを選択した。第１の分子であるＵＩ－ＥＰ００１を、Ｅ２とＶＨＬ１との間に１４個の原子のリンカーを有するように設計し、第２の分子であるＵＩ－ＥＰ００２を、Ｅ２とＶＨＬ１との間に３２個の原子のリンカーを有するように設計した。ＵＩ－ＥＰ００１のリンカーの長さは、報告された文献に基づいており、１３～１４個の原子のリンカーは標的受容体の高い分解率及び選択性をもたらしたのに対し、ＵＩ－ＥＰ００２のより長いリンカーは、この化合物の全体的な親水性及び柔軟性の向上に寄与した。ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２とＧＰＥＲ１とのドッキング研究では、元のＥ２結合ポケットが維持され、リンカーがＴＭ１とＴＭ７との間の結合ポケットから出ていることが示されている（図２３）。既知のＰＲＯＴＡＣとそのタンパク質標的の結晶構造に基づいて、両方のリンカーの長さにより、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２がＧＰＥＲ１に結合しながらＶＨＬ Ｅ３リガーゼと相互作用できるようになる（Ｆａｍａｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｇａｄｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。

【0176】

Ｅ２の１７Ｃ位置の修飾がＧＰＥＲ結合に耐えられることは知られているが（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）、設計されたＰＲＯＴＡＣ分子がＥＲαと良好に結合するかどうかは不明である。したがって、ＥＲαと共に、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２について、ＥＲαリガンド結合ドメイン（ＰＤＢ：１Ａ５２）に結合したＥ２の結晶構造を用いて、追加のドッキング研究を行った。Ｅ２とＥＲαとの間のすべての既知の相互作用は、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２の両方で維持される。さらに、両方の分子のリンカーの長さは、ＶＨＬ１部分がＶＨＬ Ｅ３リガーゼと相互作用するのに十分に長い。

【0177】

部分的ＰＲＯＴＡＣ（化合物７）の合成の詳細を図２４（スキーム１）に図式化する。リンカー２を、２段階スキーム１Ａに従ってトリエチレングリコールから調製した。ＶＨＬ Ｅ３リガーゼリガンド（ＶＨ０３２）を、以前に公開された文献（スキーム１Ｂ）（Ｓｔｅｉｎｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｍａｄａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７）に従って合成した。４－ブロモベンゾニトリルと４－メチルチアゾールの間のパラジウム触媒クロスカップリングを行ってシアニド３を得、続いてこれを塩化コバルト（ＩＩ）と水素化ホウ素ナトリウムで処理して、第一級アミン４を得た。続いて、Ｂｏｃ－Ｈｙｐ－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｔｌｅ－ＯＨ及びリンカー２とのアミドカップリングの後、４から化合物７が得られた。シュテークリヒ（Ｓｔｅｇｌｉｃｈ）条件下でＥ２と化合物７との間のコンジュゲーションを行って、ＵＩ－ＥＰ００１又は化合物８を得た（スキーム２）。ＵＩ－ＥＰ００２（化合物１０）を、Ｅ２と化合物７との間にＰＥＧＳ８リンカーを導入することによって調製した。まず、Ｅ２とＦｍｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ８－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨをシュテークリヒエステル化した後、トリメチルアミンで処理してＦｍｏｃ基を除去し、化合物９を得た。最後に、化合物１０は、化合物９と化合物７との間のコンジュゲーションから、ＨＰＬＣによる７２時間の注意深い監視により得られた（スキーム３）。

【0178】

Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣは、原形質膜及び細胞内エストロゲン受容体への高親和性特異的結合を示した
ＧＰＥＲ及びＥＲはそれぞれ、高い親和性でＥ２に結合する（Ｐｒｉｓｓｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。しかし、各エストロゲン受容体は異なる細胞内コンパートメントに存在し、これは、Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣと相互作用する相対的な能力に関して重要な意味を持つ。ＧＰＥＲは、受容体の大部分が細胞内膜で発現されるという事実にもかかわらず、原形質膜受容体のすべての特徴を示す（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。原形質膜受容体としてのその役割の裏付けとして、先行研究は、原形質膜結合部位を示唆するスクロース密度勾配濃縮膜ホモジネートにおける^３Ｈ－Ｅ２の特異的結合を測定した（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＵＩ－ＥＰ０００１及びＵＩ－ＥＰ００２の原形質膜上のＧＰＥＲへの結合を直接評価するために、ＧＰＥＲを発現するがＥＲａもＥＲｂも発現しないインタクトＳＫＢＲ３細胞を使用して、蛍光トレーサーとして細胞非透過性Ｅ２－ＦＩＴＣを使用して、競合結合アッセイを実施した（図２５）。Ｅ２－ＦＩＴＣのＧＰＥＲ特異的結合活性を、細胞表面でＧＰＥＲを発現する細胞又は発現しない細胞の結合活性を差し引いて、示差飽和分析によって測定した（図２５Ａ）。最大ＧＰＥＲ特異的結合は１００ｎＭ Ｅ２－ＦＩＴＣ近くに達し（図２５Ｂ）、競合的結合実験のためにこの濃度を選択した（図２５Ｃ）。Ｅ２－ＦＩＴＣの５０％を置換するのに必要なＥ２の濃度（ＩＣ_５０）は、１７ｂ－Ｅ２の１００±１．５ｎＭでのＥ２の解離定数（Ｋｄ）として計算された。これは、以前に報告されたＥ２のＩＣ_５０値３００ｎＭと同程度である（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。比較すると、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２のＩＣ_５０値は、Ｅ２で測定された値（それぞれ３０．２±０．９ｎＭ及び３０．２±２．３ｎＭ）のほぼ３倍（ＲＢＡ＝３３０％）であった（表１）。これは、部分的には、それぞれ１７Ｃ置換ヒドロキシルを含むＥ２－ＦＩＴＣとＥ２－ＰＲＯＴＡＣの間で共有される構造的相同性によって説明され得る。対照的に、ＶＨＬ Ｅ３ユビキチンリガーゼ認識モチーフにリンクされたＵＩ－ＥＰ００１の化学的スペーサーからなるがＥ２ターゲティングドメインを欠く部分的ＰＲＯＴＡＣは、１０ｍＭの高濃度でもＥ２－ＦＩＴＣ結合に関して競合できなかった（図２５Ｃ）。

【0179】

【表1】

【0180】

【表2】

【0181】

略語：ＩＣ５０、５０％阻害の濃度；すべてのＩＣ５０値はトリプリケートのサンプルから測定され、平均値±ＳＤとして報告されている。
ＧＰＥＲとは対照的に、ＥＲａ及びＥＲｂは細胞質と核に集中している細胞内受容体である。したがって、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２ＥＲの結合活性は、ＭＣＦ－７乳がん細胞から分離されたサイトゾル画分で蛍光偏光（ＦＰ）を使用して評価した。飽和分析を、１０ｎＭ Ｅ２－ＦＩＴＣを使用し、サイトゾルタンパク質の濃度を増加させて行った（図２５Ｄ）。ほぼ飽和（８０％）のＦＰ値に基づいて、６００ｍｇ／ｍＬのサイトゾルタンパク質を使用して競合結合アッセイを実施したところ、Ｅ２は最大変位の半分、ＩＣ_５０＝５．６±１．４ｎＭ）を示した（図２５Ｅ）。比較すると、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２のＩＣ_５０値は、それぞれ１７．２±８．２ｎＭ及び１１．４±３．３ｎＭと計算された。これらの結果は、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２がＥ２と比較してわずかに弱い結合親和性を示し、ＲＢＡがそれぞれ３２％及び４９％であることを示している（表１）。まとめると、これらの競合結合アッセイは、インタクト細胞及びサイトゾル画分に対して行われ、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２が原形質膜及び細胞内エストロゲン受容体ＧＰＥＲに、低ナノモル濃度範囲において高い親和性で結合することを示している。

【0182】

Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣは天然及び／又は組換えエストロエン受容体の発現レベルを低下させる
ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２が原形質膜及び細胞内エストロゲン受容体を分解する有効性を評価するために、ＨｉＢｉＴタグ付きタンパク質と可溶性Ｌｇ－ＢｉＴタンパク質との間の相互作用を測定する高感度Ｎａｎｏ－ＢｉＴバイナリ発光相補性アッセイを採用した。ＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２で処理した細胞は、ＨｉＢｉＴ－ＧＰＥＲ又はＨｉＢｉＴ－ＥＲαの用量依存的な減少を示したが（図２６Ａ及びＢ）、１００μＭの部分的ＰＲＯＴＡＣは、試験した濃度内ではいずれの組換え受容体についても有意な減少を示さなかった（図２６Ｃ）。これらのアッセイから、ＧＰＥＲ（１００μＭ）及びＥＲα（１０～１００μＭ）についてそれぞれＤＣ_５０値（５０％のタンパク質分解に必要な濃度）を計算した。これらのＤＣ_５０濃度を使用して、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２によるＨｉＢｉＴ－ＧＰＥＲ及びＨｉＢｉＴ－ＥＲの分解速度を測定した。ＵＩ－ＥＰ００１とＵＩ－ＥＰ００２の両方が、組換えＧＰＥＲ又はＥＲのいずれかの発現レベルの時間依存的な減少を誘発し、５０％の減少は１時間という早い時期に測定された（図２６Ｄ及びＥ）。対照的に、細胞を部分的ＰＲＯＴＡＣで８時間処理した後では受容体の８３％が存在した。

【0183】

ＧＰＥＲに対するＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２の特異性を、ｂ１－アドレナリン受容体、ｂ１ＡＲ及びケモカインＣ－Ｘ－Ｃケモカイン４型受容体、ＣＸＣＲ４を含む他のＧＰＣＲを分解するそれらの能力を調べることによって決定した（図２７Ａ）。この目的のために、ＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２又は部分的ＰＲＯＴＡＣの相対的有効性を、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞株でＨＡ－ＧＰＥＲ、－ｂ１ＡＲ、又は－ＣＸＣＲ４を分解する有効性について評価した。ＨＡ特異的抗体を用いた免疫蛍光分析により、ＨＡ－ｂ１ＡＲ及びＨＡ－ＣＸＣＲ４の検出可能なオフターゲット分解のない、ＨＡ－ＧＰＥＲの特異的分解が測定された（図２７Ａ及びＢ）。次に、ＥＲａ、ＥＲｂ、及びＧＰＥＲを発現するヒトＭＣＦ－７乳がん細胞を使用して、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２の内因性原形質膜及び細胞内エストロゲン受容体を分解する特異性を評価した（図２７Ｃ及びＤ）。ＭＣＦ－７細胞をＵＩ－ＥＰ００１、ＵＩ－ＥＰ００２、部分的ＰＲＯＴＡＣに１時間曝露するか、未処理のままにして固定し、透過処理し、ＧＰＥＲ、ＥＲａ、ＥＲｂ又はプロゲステロン受容体、ＰＲに対する特異的抗体で免疫染色した。核ＥＲα及びＥＲβならびに細胞内ＧＰＥＲについて、明確な部位特異的減少が観察された（図２７Ｃ及びＤ）。対照的に、部分的ＰＲＯＴＡＣによるＭＣＦ－７細胞の処理は、ＥＲａ、ＥＲｂ、及びＧＰＥＲの発現に影響を与えなかった。ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２のどちらも、ＭＣＦ－７細胞において検出可能なＰＲの分解を示さず、これはエストロゲン受容体に対するＥ２－ＰＲＯＴＡＣの特異性をさらに示している（図５Ｄ）。その上、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２は、ＥＲａ及びＥＲｂについて陰性であるヒトＳＫＢＲ３乳がん細胞において原形質膜及び全ＧＰＥＲを減少させ、部分的ＰＲＯＴＡＣは減少させなかった（図２７Ｅ）。同様に、Ｅ２特異的ＰＲＯＴＡＣを介した分解がＭＣＦ－７細胞の表面で観察された。ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２の、その意図された標的に対する特異性を、外因性Ｅ２がＥ２－ＰＲＯＴＡＣ媒介ＥＲ／ＧＰＥＲ分解を阻害する能力を調べることによってさらに評価した（図２８Ａ及びＢ）。ＥＲ－ＨｉＢｉＴ又はＧＰＥＲ－ＨｉＢｉＴをトランスフェクトした細胞を、１００μＭのＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２単独で、又は漸増用量のＥ２β又はアルドステロン（１００ｎＭ～１００μＭ）と組み合わせて１時間処理した（図２８Ａ及びＢ）。Ｅ２はＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２の分解を効果的に阻害したが、いずれのエストロゲン受容体標的の分解も対照ステロイド、アルドステロンの存在下では測定されなかった（図２８Ｃ）。

【0184】

総合すると、これらの発見は、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２が原形質膜及び細胞内エストロゲン受容体を選択的に分解できるエストロゲン受容体分解剤（ＳＥＲＤ）として機能することを示唆している。

【0185】

ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２のＥＲ及びＧＰＥＲの分解は２６Ｓ－プロテアソームを介して発生する．最後に、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２がユビキチン－プロテアソーム経路を介して標的受容体の分解を促進できるかどうかを評価した。これらの実験を実施するために、ＨｉＢｉＴタグ付きエストロゲン受容体を一時的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２に曝露する前に、プロテアソーム阻害剤、ＭＧ１３２、リソソーム栄養剤、クロロキン、又はビヒクルで前処理し、その後、全受容体発現を上記のように評価した。ＭＧ１３２はＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２のＧＰＥＲ又はＥＲαの分解を逆転させたが、クロロキンにはそのような効果はなかった（図２８Ｄ及びＥ）。この結果は、受容体のポリユビキチン化及び２６Ｓ－プロテアソームでのタンパク質分解の結果として、ＰＲＯＴＡＣ誘導性タンパク質分解が起こるという事実と一致している。重要なことに、これらの結果は、我々の第１世代のＥ２－ＰＲＯＴＡＣ、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２が、原形質膜及び細胞内コンパートメントに存在するエストロゲン受容体と相互作用して、２６Ｓ－プロテアソームでの膜（ＧＰＥＲ）及び核（ＥＲ）エストロゲン受容体の分解を急速に促進することを示唆している。

【0186】

総合すると、これらの研究は、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２によるエストロゲン受容体（ＥＲα及びＧＰＥＲ）とＶＨＬ Ｅ３ユビキチンリガーゼの同時関与が効果的な分解に重要であることを示唆している。

【0187】

Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣは細胞周期停止を誘導することにより乳がん細胞の増殖を阻害する
Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣの細胞毒性の可能性を評価するために、ＵＩ－ＥＰ００１、ＵＩ－ＥＰ００２、又は部分的ＰＲＯＴＡＣでの処理後に、異なるエストロゲン受容体プロファイルを有する４つの異なるヒト乳がん細胞株の生存率を測定した（図２９）。この研究には以下が含まれた：ｉ）３つすべてのエストロゲン受容体を発現するＭＣＦ－７細胞（ＥＲａ^＋、ＥＲｂ^＋、ＧＰＥＲ^＋）、ｉｉ）ｈｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現するＳＫＢＲ３細胞（ＥＲａ^－、ＥＲｂ^－、ＧＰＥＲ^＋）、ｉｉｉ）トリプルネガティブ及びＧＰＥＲポジティブであるＨＣＣ１８０６細胞（ＥＲａ^－、ＥＲｂ^－、ＧＰＥＲ^＋）及びｉｖ）ＥＲａネガティブであり、低レベルのＥＲｂ及びＧＰＥＲを発現し、ＥＲ（Ａｌ－Ｂａｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）及びＧＰＥＲ（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）依存性シグナル伝達活性のいずれも誘発しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ＥＲａ^－、ＥＲｂ^ｌｏｗ、ＧＰＥＲ^ｌｏｗ）。各乳がん細胞株を、様々な濃度のＥ２－ＰＲＯＴＡＣ又は部分的ＰＲＯＴＡＣで２４時間処理した後、テトラゾリウム塩をホルマザン色素に変換できるミトコンドリア酸化還元酵素を測定するＭＴＳアッセイを使用して細胞の生存率を評価した（表２にまとめる）。ＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２のいずれかで処理されたすべての乳がん細胞株で、用量依存的な細胞生存率の低下が測定された。ＵＩ－ＥＰ００１については、ＧＰＥＲを発現するＭＣＦ－７、ＳＫＢＲ３及びＨＣＣ１８０６乳がん細胞株においてそれぞれ９．０、１０．９及び３４．９ｍＭのＩＣ_５０値が測定された。同様のＩＣ_５０値が、これら３つの細胞株でＵＩ－ＥＰ００２についてそれぞれ測定された（１７．０、１１．１、及び７．４ｍＭ）。対照的に、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２のＩＣ５０値は、低濃度の機能的ＥＲｂ又はＧＰＥＲを発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で約１００倍高く（＞１００ｍＭ）、＞８０％の細胞生存率を示した。これらのＩＣ_５０値は部分的ＰＲＯＡＴＡＣで処理された細胞について測定されたものに類似していた。これらのデータは、膜及び細胞内エストロゲン受容体の除去が、乳がん細胞の生存率を決定する重要な要因であることを示唆している。

【0188】

細胞生存率の低下に関連する生物学的効果を調査するために、ヨウ化プロピジウム染色を使用して同じ４つの細胞株に対して細胞周期分析を実施し、１０μＭのＥ２－ＰＲＯＴＡＣ又は部分的ＰＲＯＴＡＣで細胞を処理してから２４時間後にフローサイトメトリーで測定した（図３０）。４つの細胞株すべてからの未処理細胞は、大部分の細胞がＧ１にあり、わずかな割合の細胞がＳ又はＧ２／Ｍにある典型的な細胞周期分布パターンを示した。ＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２のいずれかによる処理後、ＭＣＦ－７、ＳＫＢＲ３、及びＨＣＣ１８０６乳がん細胞において、Ｇ１の有意な減少と共にＧ２／Ｍピークの劇的な増加が観察された。このシフトは、ＥＲａを発現せず、機能的ＥＲｂ又はＧＰＥＲを少量しか発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では観察されず、これは、Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣＳが片方又は両方のエストロゲン受容体を減少させることにより、Ｇ２／Ｍ期で細胞周期停止を誘導することを示唆している。予想通り、部分的ＰＲＯＴＡＣで処理した細胞は、Ｇ１とＧ２／Ｍの間で総細胞集団のパーセンテージの大幅な変化を示さなかった。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏの結果は、ＥＲα及び／又はＧＰＥＲの分解が、ＥＲ＋だけでなくＥＲ－乳がんの治療にもｉｎ ｖｉｖｏで有効である可能性があることを強く示唆している。

【0189】

考察
エストロゲンの発がん作用は、核ステロイドホルモン及びＧタンパク質共役受容体スーパーファミリーに属する細胞受容体を介して現れる（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＥＲを標的としたＰＲＯＴＡＣが多数開発されているが、ＧＰＥＲを分解する能力についてはまだ試験されていない。ここでは、単一のエストラジオールベースのＰＲＯＴＡＣが両方の受容体クラスを標的にできるという原理証明の証拠が提供されている。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデリング及び構造活性相関データに基づいて、１７Ｃがエステル結合した１４又は３２原子長のＰＥＧスペーサーであって、小分子ＶＨＬ Ｅ３ユビキチンリガーゼ動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）モチーフ（Ｓ，Ｒ，Ｓ）ＡＨＰＣに結合したＰＥＧスペーサーで置換されたエストラジオールベースのターゲティングドメインを含む２つの第一世代ＰＲＯＴＡＣ（ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２）を設計した。各ＰＲＯＴＡＣは、核ＥＲ及びＧＰＥＲに対して高い結合親和性を示し、ＧＰＥＲ及びＥＲに対して、測定可能な検出可能なオフターゲット活性を伴わない選択的なプロテアソーム依存性分解活性を示した。最も重要なことは、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２が標的特異的な細胞毒性及びＧ２／Ｍ停止を示したことであり、これは第一世代の総エストロゲン受容体ＰＲＯＴＡＣにとって望ましいｉｎ ｖｉｔｒｏ特性である。

【0190】

ＰＲＯＴＡＣプラットフォームは、ヒト疾患を治療する可能性がある幅広いタンパク質を選択的に分解するために採用されている。これらには、限定するものではないが、ステロイドホルモン受容体（ＡＲ、ＥＲａ、ＥＲＲａ、ＲＡＲ）（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｓｃｈｎｅｅｋｌｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００８）、ブロモ－及びエキストラ－ターミナル（ＢＥＴ）ファミリータンパク質（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、キナーゼ（Ｂｏｎｄｅｓｏｎｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、及び微小管関連タンパク質（Ｔａｕ、ＴＡＣＣ３）（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）が含まれる。このグループは最近、ＧＰＣＲを含むように拡張された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。ＰＲＯＴＡＣが、異なる細胞内コンパートメントに局在する特有の構造特性を有するタンパク質を効率的に標的にできるという単なる事実は、その興味深い有望性を示している。しかし、単一のタンパク質を標的とするＰＲＯＴＡＣの開発は簡単なことではない。最終的に、標的の最適化は、様々なターゲティングドメイン及び／又は反応基（ｗａｒｈｅａｄ）ドメインを評価し、化学的スペーサーの長さ及び組成、ならびにヘテロ二官能性分子全体の全体的な立体化学を変更する多数の微調整を行うことによって達成される。理論的には、異なる物理化学的環境に存在する特有の構造を有する、構造的及び機能的に異なる２つのエストロゲン受容体を標的とすることができる単一のＰＲＯＴＡＣを設計することは、より困難な課題となり得るが、ＥＲ＋乳がんの治療には、これらの腫瘍の大多数もＧＰＥＲを発現するため、必要なことである。過去１０年間に様々なＥＲａ－ＰＲＯＴＡＣが開発されたが、これらの化合物が非常に関連性の高いエストロゲン受容体であるＥＲｂや、より最近報告された原形質膜エストロゲン受容体であるＧＰＥＲも標的とすることができるかどうかを示した研究は一つも発表されていない。

【0191】

先駆的なＥＲ－ＰＲＯＴＡＣはペプチド反応基ドメインを含んでおり、その結果、Ｅ３ユビキチンリガーゼＳＣＦ^{ｂ－ＴＣＲＰ}を効果的に動員するために、低い細胞透過性及び細胞酵素活性への依存性を示した（Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。より最近の第２世代ＥＲ－ＰＲＯＴＡＣは、そのターゲティングドメインにＥＲアンタゴニストを使用し、低いナノモル濃度で高い細胞透過性と分解能力を示す（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９：Ｄｅｎｉｚｕ ２０１２；Ｏｋｈｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。これらの後者のＰＲＯＴＡＣは、ＥＲと同様にＧＰＥＲも標的とする可能性があるが、いずれかの受容体のＥＲアンタゴニストと比較して予想されるＥ２のＲＢＡの減少により、おそらく程度は低くなる。実験的方法論による薬物－標的相互作用の評価は、標的の特異性及び選択性を評価するための重要なステップである。しかし、通常、ＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの結合特性は測定されておらず、多くの場合、標的選択性は評価されていない。ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２の両方が、低いナノモル濃度範囲で計算されたＫ_ｄ値で両方の標的エストロゲン受容体に対して高い親和性を示し、これは、１７Ｃ置換Ｅ２ターゲティングドメインがＧＰＥＲ及びＥＲの両方のリガンド接触部位とよく相互作用することを示唆している。１７Ｃ置換Ｅ２－ＦＩＴＣ、及び、ＧＰＥＲを発現し、ＲＴ－ＰＣＲによってＥＲａもＥＲｂも検出されないインタクトＳＫＢＲ３乳がん細胞を使用して（Ｖｌａｄｕｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２について３０．２ｎＭのＫ_ｄ値が測定された。これは、１，３，５（１０）－エストラトリエン－３，１７β－ジオール１７－ヘミスクシナート：ＢＳＡ（Ｅ２－ＢＳＡ）が細胞内ｃＡＭＰのＧＰＥＲ依存性活性化を刺激できるという過去の証拠と一致している（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．２００７）。しかし、これらの発見は、遊離Ｅ２は組換えＥＲａ又はＥＲｂに結合した^１２５Ｉ－１６ａ－ヨード－Ｅ２を置換するか、又は電気泳動移動度アッセイでゲルシフトを誘発することができたが、Ｅ２－ＢＳＡはできなかったことを示した公開済みの研究と矛盾している（Ｓｔｅｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。遊離１７ｂ－Ｅ２、ＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２は、内因性ＥＲａ及びＥＲｂを含むＭＣＦ－７細胞ホモジネートから調製されたサイトゾル画分に結合したＥ２－ＦＩＴＣを置換し、測定されたＫ_ｄ値はそれぞれ５．６ｎＭ、１７．２ｎＭ及び１１．４ｎＭであった。本願の調査結果とＳｔｅｖｉｓ及び同僚の調査結果との不一致の理由は明確ではないが、結合プローブの違いと、Ｅ２及びＦＩＴＣの１：１の化学量論に対してＢＳＡに対するＥ２の多価性の違いの両方に関連している可能性がある。１つの可能性は、ＧＰＥＲに対するＥ２－ＦＩＴＣの結合動態が^１２５Ｉ－１６ａ－ヨード－Ｅ２と比較して異なり、これがプローブの変位に影響を与えているということである。とはいえ、これらのデータは、我々の第１世代のＥ２－ＰＲＯＴＡＣが新薬の最も重要な特徴である、意図した標的に対して特異的かつ高い親和性で相互作用する能力を備えていることを示唆している。

【0192】

その設計により、ＰＲＯＴＡＣは選択的タンパク質標的分解のがん治療薬として有望である。所与のＰＲＯＴＡＣに対する標的特異性を実証する目的でのゴールドスタンダードアッセイは、質量分析分析を使用することで、処理細胞と未処理細胞のプロテオームの全体的な読み取り値を比較するものである（Ｂｅｖｅｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。実際的な観点から、標的特異性は、がん治療標的を発現するか又は欠くがん細胞の生存率の差を評価することによって最もよく評価することができる。これは、ＥＲ及びＧＰＥＲを選択的に分解するように設計された二重特異性ＰＲＯＴＡＣを評価するために特に重要である。本研究では、免疫蛍光法、生化学的及び生物学的方法を用いて標的選択性を評価した。免疫蛍光分析により、細胞表面と細胞内の両方で、核内の、及びＧＰＥＲについてのＥＲａ及びＥＲｂの選択的な部位特異的減少を示すことができた。ＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２による細胞内ＧＰＥＲの分解は、粗膜画分及びスクロース密度遠心分離によって濃縮された原形質膜画分からの^３Ｈ－１７ｂ－Ｅ２のＧＰＥＲ依存性の特異的置換を示した我々の以前の発見と一致している（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）。選択性は、Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣ処理細胞においてＰＲ、ＣＸＣＲ４、及びｂ１ＡＲの減少が測定されなかったという事実によって実証された。同様に、バイナリ発光相補性により、外因性Ｅ２がＥ２－ＰＲＯＴＡＣを介したＨｉＢｉＴ－ＧＰＥＲ又はＨｉＢｉＴ－ＥＲの分解をブロックでき、アルドステロンはできないことを示すことにより、標的選択性も実証された。最後に、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２の標的選択性が生物学的アッセイで示され、エストロゲン受容体の異なる補体を発現する様々な乳がん細胞株において生存率及び細胞周期分布に対する相対的な影響を比較した。生存率の低下及びＧ２／Ｍ停止は、３つのエストロゲン受容体すべてを発現するＭＣＦ－７細胞で観察されたが、ＥＲａを欠き低レベルの機能的ＥＲｂ及びＧＰＥＲを発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では観察されなかった。これが、ＥＲ又はＧＰＥＲ、又はそれらの両方の減少によるものかどうかは、これらの細胞では明らかではない。他の研究者がＥＲ陽性ＭＣＦ－７、ＢＴ－４７４及びＣＡＭＡ－１乳がん細胞株においてＥＲ－ＰＲＯＴＡＣの細胞毒性を評価したこと、及びこれらの細胞もＧＰＥＲを発現していることは注目に値する（Ｋａｒｇｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。この研究のいずれかのＥ２－ＰＲＯＴＡＣは、ｈｅｒ－２／ｎｅｕ過剰発現及びＴＮＢＣ腫瘍免疫表現型を表すＥＲ陰性、ＧＰＥＲ陽性ＳＫＢＲ３及びＨＣＣ－１８０６乳がん細胞株の処理後に、細胞毒性及びＧ２／Ｍ停止を誘発した。様々な化学療法剤が細胞周期の様々な段階で細胞周期停止を示す一方で、Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣがＧ２／Ｍ停止を誘導するという観察結果は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）－ＰＲＯＴＡＣ、ＡＲＤ－６１もＧ２／Ｍ停止を誘導するという以前の報告と一致している（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。いくつかの点で、ＵＩ－ＥＰ００１又はＵＩ－ＥＰ００２が、細胞毒性効果及び細胞周期停止を誘発することは、ＥＲ又はＧＰＥＲのいずれかの完全な損失が観察されなかったという事実から、やや予想外のように見えるかもしれない。これらの結果の考えられる説明の１つは、ＧＰＣＲが概して、リガンド占有率と受容体応答との間で双曲線関係を示すという事実に関連している可能性があるということである。この関係は「部分占有率」と呼ばれ、受容体活性の有意な低下を観察するために原形質膜でＧＰＥＲの総量を排除する必要がない理由を示唆している。さらに重要なことに、本願のｉｎ ｖｉｔｒｏでの発見は、Ｅ２－ＰＲＯＴＡＣがＧＰＥＲを発現する乳がんだけでなく、エストロゲン標的療法では治療できないと考えられている一部のＥＲ陰性乳がんに対しても治療効果を有する可能性があることを示している。

【0193】

Ａｒｖｉｎａｓ，ＬＬＣは、ＥＲ（ＡＲＶ－４７１）又はＡＲ（ＡＲＶ－１１０）のいずれかを標的とするＰＲＯＴＡＣを開発し、がんの前臨床マウスモデルで有望な成功を収めている。両方のＰＲＯＴＡＣは、それぞれ前立腺がんと乳がんのフェーズＩの治験（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｉｓ．ｇｏｖのＮＣＴ０３８８８６１２及びＮＣＴ０４０７２９５２）に入っている（Ｆｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｎｅｋｌｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＰＲＯＴＡＣには、乳がんの治療において現在のＳＥＲＤよりも魅力的ないくつかの利点がある（Ｎｅｋｌｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＰＲＯＴＡＣは本質的に触媒性であるため、内分泌療法の主な制限の１つである、過剰発現又は変異による獲得薬剤耐性を克服するのに理想的に適している（ただし、ユビキチン化アクセプター部位が変更されていない場合である）。実際、ＡＲＶ－４７１は、細胞株及びＰＤＸモデルで臨床的に関連するＥＲα変異体（Ｙ５３７Ｓ及びＤ５３８Ｇ）を効率的に分解することが実証されている（Ｆｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＡＲＶ－４７１のターゲティングドメインは非公開かつ独占所有物であるため、ＧＰＥＲも標的にできるかどうかは明らかではない。同様に、他の多くのＥＲ－ＰＲＯＴＡＣが開発されており、これらのＰＲＯＴＡＣも、ＧＰＥＲを標的にしているかどうか明らかではない。ＧＰＥＲは、ＥＲ陽性乳がんの６０％で発現し（Ｆｉｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）、進行がんを予測する臨床変数と関連し、ＥＲ陰性乳がん及びＴＮＢＣで一般的に発現し、抗エストロゲン療法に対する耐性と関連しているため、ＧＰＥＲを標的とするがん治療薬の開発は極めて重要である。総エストロゲン受容体ＰＲＯＴＡＣ、例えばＥ２－ＰＲＯＴＡＣＳ、ＵＩ－ＥＰ００１及びＵＩ－ＥＰ００２は、この目的に最適であり得、既存の抗エストロゲン療法を補完するであろう。

【0194】

実施例３
スキーム

【0195】

【化15】

【0196】

合成手順
ＵＩ－ＥＰ００１（８）の合成

【0197】

【化16】

【0198】

ジ－ｔｅｒｔ－ブチル３，６，９，１２－テトラオキサテトラデカンジオアート（１）。トリエチレングリコール（１．５０ｇ、１．３６ｍｌ、１０ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）、鉱油中６０％のＮａＨ（８００ｍｇ、２０ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）及びブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（４．５０ｇ、３．４ｍｌ、２０ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）の混合物を、１０ｍＬのジオキサンに溶解させた。反応混合物を一晩撹拌し、続いて飽和ＮＨ_４Ｃｌでクエンチした。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、次いで真空中で濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝８：２）にかけ、化合物１を無色油状物として得た。収率：３．２５ｇ、８．６０ｍｍｏｌ（９２％）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ３．９９（ｓ，４Ｈ），３．７２－３．６６（ｍ，１６Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ）。Ｃ_１８Ｈ_３４Ｏ_８［Ｍ＋１］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：３７９．２３、検出値３７９．４６。

【0199】

【化17】

【0200】

ジ－ｔｅｒｔ－ブチル３，６，９，１２－テトラオキサテトラデカン二酸（２）。ＤＣＭ中５０％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を溶媒とする化合物１（１．７４ｇ、４．６２ｍｍｏｌ）の溶液（１ｍｍｏｌ当たり６ｍＬ）を室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ分析（ＤＣＭ中１０％メタノール）は、出発物質の完全な変換を示した。次に、反応混合物を真空下で濃縮し、粗生成物を凍結乾燥して、目的の生成物２を得た（定量的収率）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ４．０３（ｓ，４Ｈ），３．８５－３．４２（ｍ，１６Ｈ）。Ｃ_１０Ｈ_１８Ｏ_８［Ｍ＋１］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：２６７．１０、検出値２６７．５６。

【0201】

【化18】

【0202】

４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンゾニトリル（３）。４－ブロモベンゾニトリル（５．００ｇ、２７．５ｍｍｏｌ）、４－メチルチアゾール（４．９８ｍＬ、５４．７ｍｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（５．４０ｇ、５５．０ｍｍｏｌ）、及び酢酸パラジウム（６２．０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の混合物を、２０ｍＬのＤＭＡｃに溶解させた。混合物を一晩１２０℃に加熱し、冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈した。溶液をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。得られた油をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝９：１→１：１→１：９）にかけた。化合物３が黄色の固体（４．４９ｇ、２２．５ｍｍｏｌ、８２％）として得られた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ８．７６（ｓ，１Ｈ），７．７５－７．７１（ｍ，２Ｈ），７．６０－７．５５（ｍ，２Ｈ），２．５８－２．５６（ｍ，３Ｈ）。Ｃ_１１Ｈ_８Ｎ_２Ｓ［Ｍ＋１］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：２０１．０４、検出値２０１．３６。

【0203】

【化19】

【0204】

（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）フェニル）メタンアミン（４）。化合物３（４．４９ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）を３００ｍＬの無水ＭｅＯＨに溶解させた。塩化コバルト（ＣｏＣｌ_２）（４．３９ｇ、３３．７５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を氷浴で３０分間冷却した。ＮａＢＨ_４（５．２２ｇ、１３８ｍｍｏｌ）を２０分かけて分割して添加した。混合物をさらに９０分間撹拌し、冷Ｈ_２Ｏでクエンチした。混合物を濾過し、Ｈ_２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝９９：１→９０：１０、０．５ＭのＥｔ_３Ｎを使用）により精製した。化合物４を白色粉末（３．４４ｇ、１６．８８ｍｍｏｌ、７５％）として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ８．９４（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｍ，４Ｈ），３．７７（ｓ，２Ｈ）、２．４５（ｓ，３Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ１５２．２３，１４７．９８，１４５．０１，１３１．８９，１２９．９５，１２９．０１，１２７．３５，４５．２３，１５．９８。Ｃ_１１Ｈ_１２Ｎ_２Ｓ［Ｍ＋１］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：２０５．０７、検出値２０５．７７。

【0205】

【化20】

【0206】

（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）－Ｂｏｃ－ピロリジン－２－カルボキサミド（５）。化合物４（２．０４ｇ、１０．００ｍｍｏｌ）、Ｂｏｏ－Ｈｙｐ－ＯＨ（２．３１ｇ、１０．００ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（６．９５ｍＬ、４０．００ｍｍｏｌ）、及びＨＢＴＵ（４．１６ｇ、１１．００ｍｍｏｌ）の混合物を、５０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解させた。混合物を室温で一晩撹拌し、次いでＨ_２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝９９：１→９０：１０）で精製した。化合物５を無色油状物として得た（２．７９ｇ，６．７ｍｍｏｌ，６７％）^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ８．６９（ｓ，１Ｈ），８．２８－８．０４（ｍ，１Ｈ），７．４５－７．３２（ｍ，４Ｈ），４．５２－４．４４（ｍ，３Ｈ），４．１０（ｔ，１Ｈ），３．１０－３．００（ｍ，１Ｈ），２．８８－２．７７（ｍ，１Ｈ），２．５４（ｓ，３Ｈ），２．４１－２．３２（ｍ，１Ｈ），２．０７－１．９３（ｍ，１Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１７２．１５，１５３．８８，１５２．１２，１４８．０２，１３９．７５，１３１．５２，１３０．６６，１２９．０５，１２８．０５，７７．２５，６５．４８，５５．９８，５３．９５，４２．１６，２８．９６，１４．８６。Ｃ_２１Ｈ_２７Ｎ_３Ｏ_４Ｓ［Ｍ＋１］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：４１８．１７、検出値４１８．０３。

【0207】

【化21】

【0208】

（４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２－Ｂｏｃ－アミノ－３，３－ジメチルブタノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（６）。化合物５（２．７９、６．７ｍｍｏｌ）を５０％ｖ／ｖのＴＦＡ／ＤＣＭ（１ｍｍｏｌ当たり６ｍＬ）に溶解させ、室温で２時間撹拌した。混合物を濃縮し、さらに精製することなく次のステップに使用した。最後のステップの生成物であるＢｏｃ－Ｌ－ｔｅｒｔ－ロイシン（１．５４ｇ、６．７ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２．７９ｇ、７．３７ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（４．６６ｍＬ、２６．８ｍｍｏｌ）の混合物を５０ｍＬのＤＭＦに溶解させた。混合物を室温で一晩撹拌し、Ｈ_２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３溶液、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝９９：１→９０：１０）で精製し、化合物６を白色の粉末として得た（２．０９ｇ、３．９５ｍｍｏｌ、２ステップ後の収率５９％）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．９８（ｓ，１Ｈ），７．５６－７．５０（ｍ，４Ｈ），４．９１－４．８６（ｍ，４Ｈ），４．０８（ｓ，１Ｈ），３．３６－３．３１（ｍ，１Ｈ），２．５８（ｓ，３Ｈ），２．３４－２．３０（ｍ，１Ｈ），２．１３－２．０７（ｍ，１Ｈ），１．２０－１．０２（ｍ，１８Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７３．１２，１７０．１５，１５７．２３，１５３．４８，１４８．１６，１３９．６８，１３２．３６，１３０．１２，１２８．７９，１２５．５６，７５．６９，６５．２６，５８．５６，５５．２３，５３．２９，４２．５６，３８．２６，３６．１８，２７．４８，２５．４２，１５．９９。Ｃ_２７Ｈ_３８Ｎ_４Ｏ_５Ｓ［Ｍ＋１］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：５３１．２６、検出値５３１．４９。

【0209】

【化22】

【0210】

部分的ＰＲＯＴＡＣ（７）。化合物５（２．０９、３．９５ｍｍｏｌ）を５０％ｖ／ｖのＴＦＡ／ＤＣＭ（１ｍｍｏｌ当たり６ｍＬ）に溶解させ、室温で２時間撹拌した。混合物を濃縮し、さらに精製することなく次のステップに使用した。最後のステップの生成物（１ｅｑ）、化合物２（２．１ｇ、７．９ｍｍｏｌ、２ｅｑ）、ＨＢＴＵ（１．６５ｇ、４．３０ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（２．７５ｍＬ、１５．８ｍｍｏｌ）の混合物を５０ｍＬのＤＭＦに溶解させた。混合物を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣが出発物質の完全な反応を示したので、混合物をＤＣＭで希釈し、ブラインで洗浄し、乾燥させ、濃縮した。生成物をＨＰＬＣ逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ－Ｃ１８、２１．２×１５０ｍｍ、５ｕＣｒｔ）で精製して、所望の生成物７を得た。収率：（１．２１ｇ、２工程後４６％）。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ－ｄ_４）δ９．６８（ｓ，１Ｈ），７．５６－７．５０（ｍ，４Ｈ），４．６７．－４．６９（ｔ，１Ｈ），４．５８－４．５５（ｍ，２Ｈ），４．４３－４．４０（ｄ，１Ｈ），４．１５－４．１１（ｍ，４Ｈ），４．０８－４．０５（ｍ，１７Ｈ），３．７８－３．８０（ｍ，１Ｈ），３．８５－３．７１（ｍ，１Ｈ），３．３６－３．３１（ｍ，１Ｈ），２．５８（ｓ，３Ｈ），２．３４－２．３０（ｍ，１Ｈ），２．１３－２．０７（ｍ，１Ｈ），１．２０－１．０２（ｍ，９Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ－ｄ_４）δ１７２．９７，１７０．７３，１７０．３１，１５１．４３，１４７．６９，１３８．８７，１３２．０１，１３０．１５，１２９．００，１２７．５８，７０．９３，７０．３７，７０．２４，７０．２０，６９．７７，６９．７３，６９．６６，５９．４１，５６．７５，５６．６９，５０．３９，４２．３３，３７．５３，３７．７０，２９．２６，２５．５６，１４．４０。Ｃ_３１Ｈ_４４Ｎ_４Ｏ_１０Ｓ［Ｍ＋１］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：６７９．２９、検出値６７９．８９。

【0211】

【化23】

【0212】

ＵＩ－ＥＰ００１（８）。化合物７（３００ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ５ｍＬ中のＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５３ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）によって３時間活性化し、続いて１７β－エストラジオール（１２５ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（７１．３ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４８時間撹拌し、逆相ＨＰＬＣでモニタリングした。粗生成物をＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９０：１０）で希釈し、ブラインで洗浄し、乾燥させ、濃縮した。生成物８がＨＰＬＣ逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ－Ｃ１８、２１．２×１５０ｍｍ、５ｕＣｒｔ）によって得られた。収率（１１９ｍｇ、２８％）。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ－ｄ_４）δ９．６４（ｓ，１Ｈ），７．５６－７．４９（ｍ，４Ｈ），７．０９－７．０７（ｄ，１Ｈ），６．５５－６．５３（ｍ，１Ｈ），６．４８－６．４９（ｄ，１Ｈ），４．７１－４．６７（ｔ，１Ｈ），４．５８－４．５５（ｍ，２Ｈ），４．１２－３．９５（ｍ，１７Ｈ），３．８６－３．８４（ｄ，１Ｈ），３．７４－３．７１（ｍ，１Ｈ），３．６８－３．６５（ｔ，１Ｈ），２．７８－２．７７（ｍ，２Ｈ），２．５７（ｓ，３Ｈ），２．３２－２．３０（ｍ，２Ｈ），２．１４－１．９５（ｍ，４Ｈ），１．７４－１．６７（ｍ，１Ｈ），１．５４－１．１８（ｍ，７Ｈ），１．１５（ｓ，９Ｈ），０．７８（ｍ，３Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ－ｄ_４）δ１７３．１２，１７０．１５，１５７．２３，１５３．４８，１４８．１６，１３９．６８，１３２．３６，１３０．１２，１２８．７９，１２５．５６，７５．６９，６５．２６，５８．５６，５５．２３，５３．２９，４２．５６，３８．２６，３６．１８，２７．４８，２５．４２，１５．９９。Ｃ_５０Ｈ_６８Ｎ_４Ｏ_１１Ｓ［Ｍ＋１］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：９３３．４６、検出値９３３．２３。

【0213】

ＵＩ－ＥＰ００２（１０）の合成

【0214】

【化24】

【0215】

化合物（９）。Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ８－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ（３００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を、１ｍＬのＤＭＦ中のＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（３４．５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）によって３時間活性化し、続いて１７β－エストラジオール（８１．６ｍｇ，０．３ミリモル）及びＥＤＣ（４６．６ｍｇ、０．３ミリモル）を添加した。反応混合物を室温で７２時間撹拌し、逆相ＨＰＬＣでモニタリングした。粗生成物をＨＰＬＣ逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ－Ｃ１８、２１．２×１５０ｍｍ、５ｕＣｒｔ）によって精製して、化合物９を得た。収率（４１ｍｇ、１６％）。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ－ｄ_４）δ７．１２－７．１１（ｄ，１Ｈ），６．５９－６．５７（ｍ，１Ｈ），６．５２－６．５１（ｄ，１Ｈ），４．２６－４．２４（ｍ，１Ｈ），３．７７－３．７４（ｔ，２Ｈ），３．７１－３．５６（ｍ，３１Ｈ），３．３４－３．３２（ｍ，２Ｈ），２．８３－２．８０（ｍ，２Ｈ），２．５９－２．５６（ｔ，２Ｈ），２．３６－２．３１（ｍ，１Ｈ），２．１７－２．１４（ｍ，１Ｈ），２．０９－２．０５（ｍ，１Ｈ），２．０１－１．９７（ｍ，１Ｈ），１．９２－１．８８（ｍ，１Ｈ），１．５９－１．１９（ｍ，８Ｈ），０．８１（ｓ，３Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ－ｄ_４）δ１７１．６２，１５２．１２，１４１．５８，１３８．８５，１３５．０４，１２８．８５，１２５．００，１２３．４２，１２２．３８，１１７．１７，１１２．２７，１０９．９５，７８．７３，６７．７６，６７．７４，６７．６７，６７．５９，６７．５３，６７．１４，６４．０７，６３．８１，４７．５４，４０．５９，３８．０２，３６．７６，３４．２６，３２．１３，２６．９４，２６．９３，２６．８８，２４．７５，２３．８３，２０．２５，７．９０ Ｃ_５１Ｈ_６９ＮＯ_１３［Ｍ＋１］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：９０５．１１、検出値９０５．１９。

【0216】

【化25】

【0217】

ＵＩ－ＥＰ００２（１０）。化合物９（３５．０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＥｔ_３Ｎ（１ｍＬ）によって除去した。Ｅｔ_３Ｎをロータリーエバポレーターによって反応混合物から除去し、続いて部分的ＰＲＯＴＡＣ７（２６４．４ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１７８．６ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．２７１ｍＬ、１．５６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４８時間撹拌し、逆相ＨＰＬＣでモニタリングした。生成物１０が、ＨＰＬＣ逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ－Ｃ１８、２１．２×１５０ｍｍ、５ｕＣｒｔ）によって得られた。収率（２６ｍｇ、５２％）。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ－ｄ_４）δ９．６９（ｓ，１Ｈ），７．５７－７．５１（ｍ，４Ｈ），７．１２－７．１１（ｄ，１Ｈ），６．５９－６．５７（ｍ，１Ｈ），６．５２－６．５１（ｄ，１Ｈ），４．７１－４．６８（ｍ，１Ｈ）， ４．５９－４．５６（ｄ，１Ｈ），４．４４－４．４０（ｄ，１Ｈ），４．２６－４．２４（ｍ，１Ｈ），４．０９（ｓ，１Ｈ），３．８８－３．８６（ｍ，１Ｈ），３．７７－３．７４（ｔ，２Ｈ），３．７１－３．５６（ｍ，４７Ｈ），３．３６－３．３２（ｍ，６Ｈ），２．８３－２．２３（ｍ，２Ｈ），２．５９－２．５６（ｍ，５Ｈ），２．３６－２．３１（ｍ，１Ｈ），２．２１－２．１４（ｍ，１Ｈ），２．１０－２．０３（ｍ，１Ｈ），２．０１－１．９７（ｍ，１Ｈ），１．９２－１．８８（ｍ，１Ｈ），１．７６－１．７０（ｍ，１Ｈ），１．４３－１．３０（ｍ，８Ｈ），１．１５（ｓ，９Ｈ），０．８１（ｓ，３Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ－ｄ_４）δ１７４．０１，１６７．１５，１５４．５２，１４３．９７，１４１．２５，１３７．４３，１３１．２５，１２７．３９，１２６．７７，１２５．８１，１２４．８１，１２４．７８，１１９．５６，１１４．６７，１１２．３４，８１．１２，７０．１６，７０．１３，６９．９８，６９．９３，６９．５４，６６．４７，６６．２１，４９．９４，４２．９８，４０．４１，３９．１６，３４．５２，２９．３３，２９．３２，２９．１７，２７．１４，２６．２２，２２．６４，１０．３０。Ｃ_６８Ｈ_１０３Ｎ_５Ｏ_２０Ｓ［Ｍ＋１］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：１３４２．６９、検出値１３４２．１５。

【0218】

Ｅ _２ －ＦＩＴＣ（１２）の合成

【0219】

【化26】

【0220】

化合物（１１）。１７α－エチニルエストラジオール（５９２ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を、Ｅｔ_３Ｎ（２０ｍｌ）中の４－（ｔ－ブチルオキシカルボニルアミノメチル）ヨードベンゼン（７７８ｍｇ、２．３３ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムＰｄ（Ｐｈ_３）_４（５モル％）、及びＣｕｌ（５モル％）の混合物にアルゴン雰囲気下で添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いで溶媒を真空下で減少させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝２０：８０→ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝９０：１０）により精製して、黄色の粉末生成物を得た。収率（７５６ｍｇ，７８％）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ－ｄ_４）δ７．４３－７．４１（ｍ，２Ｈ），７．２８－７．１６（ｍ，２Ｈ），６．６７－６．６４（ｍ，１Ｈ），６．５９－６．５８（ｄ，１Ｈ），４．７１－４．６７（ｔ，１Ｈ），４．３３－４．３１（ｄ，１Ｈ），２．８３（ｍ，２Ｈ），２．４３－１．７２（ｍ，１５Ｈ），１．５７－１．３８（ｓ，９Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ－ｄ_４）δ１５５．１２，１４３．２５，１３１．５９，１３０．９８，１２５．１６，１２４．３３，１１３．２５，１１３．２１，９５．２３，８４．０３，７７．６９，６２．２２，４９．９６，４５．１１，４２．６８，３５．６６，３３．２２，２７．２２，２６．４５，２５．５６，２４．２１，１３．５６。Ｃ_３２Ｈ_３９ＮＯ_３［Ｍ＋１］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：４８６．２９、検出値４８６．８５。

【0221】

【化27】

【0222】

Ｅ２－ＦＩＴＣ（１２）。５０％ｖ／ｖのＴＦＡ／ＤＣＭ中の化合物１１（４８５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２時間撹拌した。ＴＬＣが完全な変換を示した後、混合物をＤＣＭと５～６回共蒸発させてＴＦＡを除去した。残留物をＤＭＦ（５ｍＬ）に再溶解させ、続いてＦＩＴＣ（４２９ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）及びピリジン（０．２５ｍＬ）を添加した。反応混合物を暗所で室温で一晩撹拌した。乾燥後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ＝９５：５→９０：１０）により精製して、化合物１２を黄色の油状物（３５５ｍｇ、４５％）として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ－ｄ_４）δ１０．２３（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｍ，１Ｈ），７．８３－７．７９（ｍ，１Ｈ），７．４３－７．４１（ｍ，２Ｈ），７．２７（ｍ，２Ｈ），６．６８－６．５３（ｍ，８Ｈ），４．７０（ｔ，１Ｈ），４．３２（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），２．４０－１．５３（ｍ，１５Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ）。Ｃ_４８Ｈ_４２Ｎ_２Ｏ_７Ｓ［Ｍ＋１］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：７９１．２７、検出値７９１．２８。

【0223】

参考文献

【0224】

【表3-1】

【0225】

【表3-2】

【0226】

【表3-3】

【0227】

すべての出版物、特許、及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。上記の明細書では、本発明をその特定の好ましい実施形態に関して説明し、多くの詳細を説明のために記載したが、当業者には、本発明が追加の実施形態を受け入れることができること、及び、本明細書の特定の詳細は、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更することができることは明らかであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33-1】

【図33-2】

【図33-3】

【図33-4】

【図33-5】

【図33-6】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40-1】

【図40-2】

【図40-3】

【手続補正書】

【提出日】2022-12-07

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンドに結合したリンカーに結合したＧタンパク質共役エストロゲン受容体（ＧＰＥＲ）リガンドを含む分子。

【請求項2】

前記ＧＰＥＲリガンドは、１７β－エストラジオール、エストロン、フィトエストロゲン、キセノエストロゲン、エストリオール、エストリオール３－硫酸、エストリオール１７－硫酸、Ｇ－１、Ｇ－１５、Ｇ－３６、ゲニステイン、ダジン、又はケルセチンを含む、請求項１に記載の分子。

【請求項3】

前記フィトエストロゲンは、フラボン、イソフラボン、リグニン、サポニン、クメスチン、又はスチルベンを含む、請求項２に記載の分子。

【請求項4】

前記ＧＰＥＲリガンドはＧＰＥＲアンタゴニストである、請求項１～３のいずれか一項に記載の分子。

【請求項5】

前記Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンドはフォン・ヒッペルリガーゼ（ＶＨＬ）リガンドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の分子。

【請求項6】

前記Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンドは、セレブロン、レナリドマイド、ポマリドマイド、イベルドマイド、（Ｓ，Ｒ，Ｓ）－ＡＨＰＣ、サリドマイド、ＶＨ－２９８、ＣＣ－１２２、ＣＣ－８８５、Ｅ３リガーゼリガンド８、ＴＤ－１０６、ＶＬ２８５、ＶＨ０３２、ＶＨ１０１、ＶＨ２９８、ＶＨＬリガンド４、ＶＨＬリガンド７、ＶＨＬ－２リガンド３、Ｅ３リガーゼリガンド３、Ｅ３リガーゼリガンド２、又はＢＣ－１２１５を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の分子。

【請求項7】

前記リンカーは、原子１０～５０個を有する鎖を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の分子。

【請求項8】

前記リンカーはアルキルリンカーである、請求項７に記載の分子。

【請求項9】

前記リンカーはヘテロアルキルリンカーである、請求項７に記載の分子。

【請求項10】

前記リンカーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の分子。

【請求項11】

前記リンカーは３～１５個のＰＥＧ単位を含む、請求項１０に記載の分子。

【請求項12】

前記リンカーは（ＰＥＧ）_ｍＮＨ（ＣＯ）（ＰＥＧ）_ｎを含み、ｎ及びｍは独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５である、請求項１０に記載の分子。

【請求項13】

ｎは３、４、５、又は６である、請求項１２に記載の分子。

【請求項14】

ｍは７、８、９、又は１０である、請求項１２に記載の分子。

【請求項15】

特定量の請求項１～１４のいずれか一項に記載の分子を含む、医薬組成物。

【請求項16】

前記ＧＰＥＲリガンドが１７β－エストラジオールを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンドはフォン・ヒッペルリガーゼ（ＶＨＬ）リガンドである、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記リンカーはＰＥＧを含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記リンカーは３～１２個のＰＥＧ単位を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

哺乳動物においてがんを予防、阻害、又は治療するための、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項21】

哺乳動物においてＧＰＥＲ陽性がんを予防、阻害、又は治療するための、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記がんが内分泌抵抗性がんである、請求項２０又は２１に記載の医薬組成物。

【請求項23】

前記がんがホルモン療法抵抗性がんである、請求項２０又は２１に記載の医薬組成物。

【請求項24】

前記がんがトリプルネガティブ乳がんである、請求項２０又は２１に記載の医薬組成物。

【請求項25】

前記がんが婦人科がんである、請求項２０又は２１に記載の医薬組成物。

【請求項26】

前記がんが卵巣がんである、請求項２０又は２１に記載の医薬組成物。

【請求項27】

前記がんが子宮内膜がんである、請求項２０又は２１に記載の医薬組成物。

【請求項28】

前記哺乳動物がヒトである、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項29】

前記医薬組成物は全身投与されるものである、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項30】

前記医薬組成物は経口投与されるものである、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項31】

前記医薬組成物は持続放出剤形である、請求項２０～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【国際調査報告】