特表 2023-523944 トランスフェクションおよび形質導入システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-08

(54)【発明の名称】トランスフェクションおよび形質導入システム

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/87 20060101AFI20230601BHJP

   C12N 7/00 20060101ALI20230601BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230601BHJP

   C12N 15/867 20060101ALN20230601BHJP

   C12N 15/861 20060101ALN20230601BHJP

   C12N 15/86 20060101ALN20230601BHJP

【ＦＩ】

C12N15/87 Z

C12N7/00

C12N15/63 Z

C12N15/867 Z

C12N15/861 Z

C12N15/86 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022564491

(86)(22)【出願日】2021-04-21

(85)【翻訳文提出日】2022-12-21

(86)【国際出願番号】 GB2021050960

(87)【国際公開番号】W WO2021214462

(87)【国際公開日】2021-10-28

(31)【優先権主張番号】2005957.2

(32)【優先日】2020-04-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520167232

【氏名又は名称】エヌフォー ファーマ ユーケー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】テミス，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】テンプルトン，デイビッド

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BA05

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、ウイルスおよびウイルス様種（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｓｐｅｃｉｅｓ）のための、身体への送達媒体としてのシリカ有機ナノ粒子の作成および使用に関する。本ナノ粒子は典型的には中空コアを有し、身体への送達のために表面に効果的に種を付着させることのできる表面形態を有する。特に、本発明は、トランスフェクションおよび形質導入を行うのに有用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

無機ナノ粒子；および
１種以上の送達成分；
を含む組成物であって、
前記ナノ粒子が表面に突起を有し；
前記ナノ粒子が５０ｎｍ～３０００ｎｍの範囲の直径を有し；
前記無機ナノ粒子が少なくとも部分的にトランスフェクション剤によって被覆されており；
前記１種以上の送達成分が、ベクター、ウイルス、ウイロイド、プリオン、ウイルス様粒子、ウイルス由来成分、およびこれらの混合物から選択される；
組成物。

【請求項2】

前記ナノ粒子がシリカを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ナノ粒子が、
無機化合物を含んだシェル；
前記シェルの内面によって定義される容量を有する中空コア；および
前記シェルの外部に配置された前記無機化合物を含む複数の突起；を含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ナノ粒子がメソポーラスである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記ナノ粒子が中空である、前記いずれかの請求項に記載の組成物。

【請求項6】

前記ナノ粒子がランブータン様またはモーニングスター様である、前記いずれかの請求項に記載の組成物。

【請求項7】

前記突起がフィンガーまたはスパイクを含む、前記いずれかの請求項に記載の組成物。

【請求項8】

前記トランスフェクション剤がカチオン性ポリマーである、前記いずれかの請求項に記載の組成物。

【請求項9】

前記トランスフェクション剤がポリアルキルイミン、キトサン、ポリリジン、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレン、またはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーであり、好ましくは前記トランスフェクション剤がポリアルキルイミンであり、より好ましくは前記トランスフェクション剤がポリエチルイミン（ＰＥＩ）である、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記ナノ粒子が前記１種以上の送達成分によって少なくとも部分的に被覆されている、前記いずれかの請求項に記載の組成物。

【請求項11】

前記ナノ粒子が少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種の送達成分を含む、前記いずれかの請求項に記載の組成物。

【請求項12】

前記１種以上の送達成分がウイルスベクター、プラスミド、またはそれらの混合物を含む、前記いずれかの請求項に記載の組成物。

【請求項13】

前記１種以上の送達成分がウイルス由来成分を含み、前記ウイルス由来成分がビリオン、キャプシド、ウイルス核酸、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ウイルスタンパク質、
およびウイルスベクターから選択される、前記いずれかの請求項に記載の組成物。

【請求項14】

前記ウイルス由来成分がレンチウイルス由来である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項15】

さらに細胞を含む、前記いずれかの請求項に記載の組成物。

【請求項16】

前記細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ－Ｔ細胞である、請求項１３に記載の組成物。

【請求項17】

治療における使用のための、前記いずれかの請求項に記載の組成物。

【請求項18】

前記治療が遺伝子治療である、請求項１５に記載の使用のための組成物。

【請求項19】

癌、感染症、または自己免疫疾患の治療または予防における使用のための、請求項１５に記載の使用のための組成物。

【請求項20】

遺伝性疾患、癌、感染症、または自己免疫疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項21】

請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物を患者に投与することを含む、患者における疾患を治療する方法。

【請求項22】

請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、
ｉ）突起を表面に有する無機ナノ粒子を１種以上の送達成分と混合する工程であって、
前記ナノ粒子が５０ｎｍ～３０００ｎｍの範囲の直径を有し、
前記送達成分が、ベクター、ウイルスベクター、プラスミド、ウイルス、ウイロイド、プリオン、ウイルス様粒子、ウイルス由来成分、およびこれらの混合物から選択される、
前記工程；を含む、
方法。

【請求項23】

細胞のトランスフェクションまたは形質導入の方法であって、
ｉ）請求項１～１４のいずれかに記載の組成物を提供する工程；および
ｉｉ）前記組成物を細胞とともにインキュベートする工程；を含む、
方法。

【請求項24】

前記１種以上の送達成分がウイルスベクターを含む、請求項２１に記載の細胞の形質導入の方法。

【請求項25】

前記１種以上の送達成分がプラスミドを含む、請求項２１に記載の細胞のトランスフェクションの方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ナノ粒子と１種以上の送達成分とを含む組成物、および該送達成分の細胞への導入方法に関する。本発明はまた、治療における該組成物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子治療は医薬への多大な投資の末に臨床で使われるようになった。臨床試験の申請も増加しており、２０１５年と２０１７年の間には、ヒトにおける遺伝性疾患の治療のための治療遺伝子を送達する、例えばストリムベリス（Ｓｔｒｅｍｖｅｌｌｉｓ（ＧＳＫ））、グリベラ（登録商標）（Ｇｌｙｂｅｒａ（登録商標）（Ｕｎｉｑｕｒｅ））、およびキムリア（登録商標）（Ｋｙｍｒｉａｈ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））等の、ウイルスを基盤とした製品を使用した申請が１８００件超認可された。遺伝子治療は治療遺伝子の機能的なコピーを送達するためにこれらのベクターに依存している。しかし、これらのベクターを臨床上妥当な予算内で大量生産する必要があることが遺伝子治療を成功させる上で大きな制約となっている。この制約の例として、リポタンパク質リパーゼ欠損症の治療を目的とした療法であるグリベラ（登録商標）の中止が挙げられる。この療法は、希少適応症（ｏｒｐｈａｎ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）、研究開発コスト、および製造コスト等の多くの要因のため、全体コストが高額すぎると決定された。

【0003】

過去４０年以上にわたり、ウイルスベクターの製造のためのいくつかのプロトコルが遺伝子治療向けに開発され、コストは減少してきている。ベクターは通常、安全上の理由で、複製能を持たないウイルスとして生成される。これらのベクターを作成するため、野生型ウイルスゲノムが通常有する、製造に必要な遺伝子が取り出された。ウイルス構造やエンベロープ（細胞付着に必要）のための遺伝子を含むこれらの遺伝子を、プラスミドベクター上に配置する。これらプラスミドベクターを特別な産生細胞（ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌ）へトランスフェクトし、該細胞が、感染可能だが複製できない組換型の前記ウイルスを生成できるようにする。従って、産生細胞は、選択のための特別なパッケージングシグナルを有する、前記治療組換ウイルスゲノムのためのプラスミドにコードされる産物のみをパッケージングすることができる。一例として、レトロウイルスベクターであって、自身のゲノムから取り出されて２個のプラスミドベクター上に配置された構造ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を有するものが挙げられる。第３のプラスミドは前記治療ゲノムを有する。全３種のプラスミドをヒト細胞にトランスフェクトすることで、治療用の、感染性のある、複製欠損のレトロウイルスベクターが作成される。

【0004】

主な欠点としては、一部のエンベロープが産生細胞に対して毒性を示し、そのためウイルスの産生が一過性であることが挙げられる。この一過性トランスフェクションは現在、レトロウイルスおよびアデノウイルスのみならず、アデノ関連ウイルスの作成においても用いられる「ゴールド・スタンダード」の手法となっている。数年にわたり、複数の研究グループが、細胞をトランスフェクトするための最適なトランスフェクション剤を探索してきた。よく用いられるトランスフェクション剤のいくつかの例として、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標））、およびトランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）がある。

【0005】

理想的には、３種全てのプラスミドを一度に結合しうるトランスフェクション剤であれば、それら３種のプラスミドが全て同一の細胞に到達し、良好なウイルス産生をもたらす可能性が最も高いと思われる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第２０１９／０９７２２６号

【発明の概要】

【0007】

本発明の第１の態様において、無機ナノ粒子；および１種以上の送達成分；を含む組成物であって、前記ナノ粒子が表面に突起を有し；前記ナノ粒子が５０ｎｍ～３０００ｎｍの範囲の直径を有し；前記無機ナノ粒子が少なくとも部分的にトランスフェクション剤によって被覆されており；前記１種以上の送達成分が、ベクター、ウイルスベクター、プラスミド、ウイルス、ウイロイド、プリオン、ウイルス様粒子、ウイルス由来成分、およびこれらの混合物から選択される；組成物が提供される。

【0008】

前記組成物はトランスフェクションおよび形質導入を行うのに適している。

【0009】

「ナノ粒子」という語は、当該分野における通常の意味で解釈されることを意図している。従って、これには、粒子を球体に近似した場合に、ナノスケール、すなわち１ｎｍ～１０００ｎｍの範囲の平均直径を有する粒子が包含される。

【0010】

本明細書で用いられる「直径」という語は、ナノ粒子表面上に提供された突起を含めてナノ粒子を球体に近似した場合の、前記ナノ粒子の直径を記述することを意図している。

【0011】

疑義を回避するため、「無機」という語は、炭素を含まない材料を指すことを意図している。

【0012】

典型的には、前記ナノ粒子は、シリカ、チタニア、アルミナ、またはそれらの組み合わせから選択される無機材料を含む。しかし、多くの例において、前記ナノ粒子はシリカを含むであろう。シリカは多数の異なる種で必要に応じて十分に機能性を持たせうることから、本発明におけるナノ粒子として良好に機能することが分かっている。該ナノ粒子は前記無機材料からなっていてもよく、または前記無機材料から本質的になっていてもよい。特定の成分から本質的になる組成物は該特定の成分を含み、存在している任意の他の成分は本質的に無視しうる量（例えば０．５重量％未満）で提供される。すなわち、いずれの単数または複数の添加成分も前記特定の成分の機能に実質的に影響しない。

【0013】

前記ナノ粒子は典型的には中空である。多くの送達システムでは、ベシクルまたはミセル構造を用いて送達成分を内在化し、その後、標的部位への到達の際に該成分を放出させるが、前記中空ナノ粒子は、典型的には送達成分をその中空構造内に含まない。しかし、一部の実施形態においては、前記ナノ粒子の中空構造内に、送達成分、またはトランスフェクションを引き起こすのに有用な他の材料を有していてよい。トランスフェクションを引き起こすのに有用というわけでない他の成分、例えば医薬活性薬剤などを、単独で、または他の成分もしくは送達成分とともに、前記ナノ粒子の中空構造内に有していてもよい。前記成分はトランスフェクションによって生ずる効果とは別に、または該効果とともに、作用するように放出されてよい。

【0014】

一部の実施形態において、前記ナノ粒子は、無機化合物を含んだシェル；前記シェルの内面によって定義される容量を有する中空コア；および、前記シェルの外部に配置された前記無機化合物を含む複数の突起；を含んでいてよい。典型的には、前記突起は前記シェルと一体化している。

【0015】

「メソポーラス」という語は、当該分野における通常の意味で解釈されることを意図している。特に、それはメソポア、すなわち、２ｎｍ～５０ｎｍ、より典型的には５ｎｍ～４０ｎｍ、一部の例においては１０ｎｍ～３０ｎｍの幅（すなわち孔径）を有する細孔、
を有した材料のことを指す。前記細孔は典型的には前記粒子のシェルに位置しており、典型的には前記シェルの厚さ全体にわたって伸びる。一部の実施形態においては、前記細孔を介して材料を前記ナノ粒子の中空コアに装填することができる。しかし、多くの例において、前記コアは空のままである。すなわち、前記コアには特に何の材料も導入されない。

【0016】

典型的には、前記ナノ粒子は前記１種以上の送達成分によって少なくとも部分的に被覆されている。前記送達成分により、典型的には、前記ナノ粒子の外部表面が被覆される。しかし、前記ナノ粒子は、送達剤の結合を促進するために１種以上の官能基で官能化されてよい。

【0017】

前記無機ナノ粒子は、少なくとも部分的にトランスフェクション剤でその外部表面が被覆されている。「トランスフェクション剤」という語は、当該分野における通常の意味で解釈されることを意図している。特にそれは、トランスフェクトされる活性薬剤の能力を高める化合物または物質のことを指す。これは、送達システム自身（この場合、無機ナノ粒子）もしくは活性材料が細胞膜を透過する能力を高めること、および／または、活性成分の能力を改善して標的細胞の遺伝物質へと組み込まれるようにすることによるものでありうる。この場合、典型的には、前記トランスフェクション剤は、前記無機材料上の電荷をマスクし、送達剤のナノ粒子への結合を促すように提供される。

【0018】

トランスフェクション剤と本明細書に記載の無機ナノ粒子との組み合わせは、トランスフェクションを促進するのに特に効果的であることが明らかになっている。

【0019】

しばしば、前記トランスフェクション剤は、実質的に前記ナノ粒子表面の少なくとも半分、より典型的には前記粒子表面の少なくとも７５％、最も典型的には前記ナノ粒子表面の実質的に全てを被覆する。本明細書で用いられる「実質的に全て」という語は、典型的には前記ナノ粒子表面の９５％以上のことを意味する。

【0020】

前記トランスフェクション剤はポリマーであることが多い。ポリマー材料は前記粒子を良好に被覆する。さらに、トランスフェクション剤のメカニズムは、効果を最大化するためにポリマー構造を利用することが多い。前記ポリマーは共重合体であってよい。例えば、該共重合体は、ブロック共重合体、交互共重合体、統計的共重合体（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、またはそれらの組み合わせであってよい。

【0021】

トランスフェクション剤の選択は特に限定されない。典型的には、トランスフェクション剤はカチオン性である。カチオン性化合物、および特にカチオン性ポリマーは、核酸等の負に荷電した種の結合を促進するため、有利である。前記カチオン性ポリマーは、典型的にはポリアミンを含む。前記カチオン性ポリマーはポリペプチド、例えばポリアルギニン、ポリリジン、またはポリヒスチジンであってよい。

【0022】

一部の実施形態において、前記カチオン性化合物はキトサンまたはその誘導体である。一部の例において、前記キトサンのアミノ基のうち、ある割合はアルキル化されており、多くの場合トリアルキル化されている（すなわち、３個のアルキル基、例えば３個のメチル基によってアルキル化されている）。あるいは、前記カチオン性ポリマーはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ポリリジン、ＤＥＡＲ－デキストラン、またはポリブレンであってよい。ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）、リポフェクタミン、およびトランスフェクタム等の市販のトランスフェクション剤を使用してもよい。

【0023】

前記トランスフェクション剤はポリアルクリルイミン（ｐｏｌｙａｌｋｌｙｌｉｍｉｎｅ）を含む場合がある。当業者が理解するように、一部の状況においては、トランスフェ
クション剤は一連のアミン結合（－ＮＨ－）を含むことが有利である。このような基は細胞への送達を強化する様式で核酸と反応することが示されている。また、本発明で用いるためのトランスフェクション剤は、上記２種以上の組み合わせであってもよい。

【0024】

用いるポリアルキルイミンの種類は特に限定されず、直鎖、分岐鎖、または樹状ポリアルキルイミンであってよく、それらの組み合わせであってもよい。分岐鎖または樹状ポリアルキルイミンが用いられる場合が多い。前記ポリアルキルイミンは、２０００ｄａ～４０，０００ｄａの範囲、より典型的には１０，０００ｄａ～２５，０００ｄａの範囲の重量平均分子量を有していてよい。一部の実施形態において、前記ポリアルキルイミンは、３０００ｄａ～７０００ｄａの範囲、より典型的には約５０００ｄａの重量平均分子量を有する。

【0025】

典型的には、前記ナノ粒子は、少なくとも１．０重量％のトランスフェクション剤を含む。より典型的には、前記ナノ粒子は、少なくとも２．０重量％、一部の例においては少なくとも５．０重量％のトランスフェクション剤を含む。典型的には、前記ナノ粒子は、６．０～１５重量％の範囲のトランスフェクション剤を含む。

【0026】

典型的には、前記ポリアルキルイミンはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩはトランスフェクション剤として良好に作用することが示されている。ＰＥＩは直鎖状あってでも分岐鎖状であってもよい。また、前記ＰＥＩは一般的には分岐鎖ＰＥＩである。

【0027】

また典型的には、前記ナノ粒子は、さらに、前記トランスフェクション剤をそこに結合するための１つ以上の部分を有する。当業者が理解するであろうように、異なるトランスフェクション剤は、異なる無機材料から構築されたナノ粒子に異なる結合を示す。従って、各種の部分を用いて、前記ナノ粒子と前記トランスフェクション剤との間の良好な結合を確保することができる。しかし、典型的には、前記ナノ粒子の外部表面は、少なくとも部分的に１つ以上の酸性基によって被覆されている。酸性基の典型的な例としては、ホスホネート、ホスフェート、サルフェート、カルボキシレート、アルファ・ケトカルボキシレート、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。これらの基のうち、ホスフェート、ホスホネート、およびサルフェートが最も頻繁に用いられる。典型的には前記酸性基はホスホネートであり、例としてメチルホスホネート（例えば３－（トリヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホネート）が挙げられる。前記ナノ粒子の表面上に酸性基を提供することは、これらの基が典型的には負に荷電していることから有利である。これにより、前記ナノ粒子の荷電表面上の負電荷を増加させ、ひいては前記ナノ粒子表面への前記トランスフェクション剤の結合が改善される。

【0028】

コア、すなわち前記シェル内の空間は、典型的には５０ｎｍ～５００ｎｍ、例えば７５～３００ｎｍの範囲の直径を有する。また、前記シェルは、典型的には１０ｎｍ～２００ｎｍの範囲の厚さを有する。

【0029】

前記ナノ粒子の粒径は、典型的には５０ｎｍ～３０００ｎｍ、より典型的には７５ｎｍ～２０００ｎｍ、さらに典型的には１００ｎｍ～１０００ｎｍ、多くは１００ｎｍ～５００ｎｍの範囲である。一部の例において、前記ナノ粒子は１００ｎｍ～３００ｎｍの範囲である。疑義を回避するため、本明細書における「粒径」という語は、球体に近似した場合のナノ粒子の直径を記載することを意図している。また、複数のナノ粒子の平均粒径は、典型的には５０ｎｍ～３０００ｎｍ、より典型的には７５ｎｍ～２０００ｎｍ、さらに典型的には１００ｎｍ～１０００ｎｍ、多くは１００ｎｍ～５００ｎｍの範囲である。一部の例において、前記ナノ粒子は１００ｎｍ～３００ｎｍの範囲である。「平均」という語は平均値を指すことを意図している。本明細書で言及する粒径は、典型的には、動的光散乱を利用して、またはＳＥＭ画像の参照によって、測定されたものである。

【0030】

前記ナノ粒子は典型的には、粗い、または「スパイキー（ｓｐｉｋｙ）な」表面形態を有する。例えば、前記ナノ粒子はランブータン様またはモーニングスター様であってよい。特に、前記粒子の表面上の突起は、複数のスパイクまたはフィンガー様構造を該表面上に形成し、それらの間に物質をからめとることができることが多い。

【0031】

前記突起は、一般的に前記シェルから放射状に外向きに伸長しており、典型的にはシェルと同じ無機材料である。前記突起は、典型的には、前記中空ナノ粒子の表面積を増加させる。典型的には、前記突起は、前記コアの直径以下の長さを有する。多くの場合、前記突起の長さは５ｎｍ～１０００ｎｍの範囲、より典型的には１０ｎｍ～２００ｎｍの範囲、さらに多くの場合に５０ｎｍ～１５０ｎｍの範囲である。前記突起の長さは典型的には実質的に均一であるが、突起の長さにばらつきがあってもよい。本明細書で用いられる「実質的に均一」という語は、典型的には平均突起長から±１５％を意味する。

【0032】

前記突起は、典型的には２ｎｍ～５０ｎｍ、より典型的には５ｎｍ～２５ｎｍ、さらに典型的にはおよそ１０ｎｍ～２０ｎｍの範囲の直径を有する。本明細書で言及される直径とは、前記突起の基部、すなわち前記突起がシェルと隣接する部分における直径のことを指す。

【0033】

前記ナノ粒子は高度に単分散していてよい。典型的には、前記ナノ粒子の多分散性指数（ＰＤＩ；分散指数としても知られる）は０．３以下であり、より典型的には０．１５以下であり、さらに典型的には０．１以下であり、一部の例では０．０５以下である。分散指数は、二次平均（ｑｕａｄｒａｔｉｃ ａｖｅｒａｇｅ）（すなわち、測定された直径の二乗の平均値ｄ）と、測定された直径の算術平均の二乗との比として算出することができる。前記分散指数の算出は、ＩＳＯ規格文書１３３２１：１９９６ＥおよびＩＳＯ２２４１２：２００８に定義される通りであってよい。

【0034】

前記ナノ粒子は、典型的には大きな表面積を有する。例えば、前記ナノ粒子は、少なくとも１２０ｃｍ^２／ｇ、より典型的には例えば少なくとも１５０ｃｍ^２／ｇのＢＥＴ表面積を有していてよい。一部の実施形態において、前記ナノ粒子は少なくとも１４０ｃｍ^２／ｇのＢＥＴ表面積を有する。前記複数の中空ナノ粒子は、１６０～２５０ｎｍの範囲の平均粒径と、少なくとも１２０ｃｍ^２／ｇのＢＥＴ表面積とを有していてよい。前記ＢＥＴ表面積は、例えばＩＳＯ９２７７規格を用いて測定してよい。前記ＢＥＴ表面積は、窒素の吸着および脱離に基づき測定してもよい。

【0035】

前記ナノ粒子は、典型的には、前記ナノ粒子の総重量に対して少なくとも７０重量％の前記無機材料を含む。一部の例においては、前記無機材料は、少なくとも９０重量％の前記ナノ粒子、より典型的には少なくとも９５重量％の前記ナノ粒子を構成していてよい。

【0036】

理論に拘束されるものではないが、本願発明者らは、突起を有するナノ粒子、すなわち「スパイキーな」ナノ粒子が、トランスフェクションおよび形質導入の効率を改善することを見いだした。

【0037】

「送達成分」という語は、トランスフェクションまたは形質導入を引き起こす、または補助するために細胞に導入される種を指すことを意図するものである。

【0038】

前記１種以上の送達成分は、典型的には、前記ナノ粒子の外部表面に付着する。理論に拘束されるものではないが、「スパイキーな」構造は送達成分を効果的にからめとり、その標的細胞への輸送を促進して、トランスフェクションまたは形質導入を引き起こすことができると信じられている。

【0039】

多くの場合、前記組成物は少なくとも２種、時には少なくとも３種の送達成分を含む。本発明のナノ粒子は、複数の異なる送達成分を単一ナノ粒子上で運ぶことができることが明らかになっている。これは併用療法において同時送達を可能にすることから、特に有用である。例えば、本願発明者らは、複数の送達成分を前記スパイキーなナノ粒子に結合し、細胞に送達できることを示した。

【0040】

一部の実施形態において、前記ナノ粒子は前記１種以上の送達成分によって少なくとも部分的に被覆されていてよい。前記ナノ粒子は、前記１種以上の送達成分によって、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％被覆されていてよい。前記ナノ粒子は、前記１種以上の送達成分によって完全に被覆されて（すなわち９５％以上被覆されて）いてもよい。

【0041】

前記ナノ粒子に対する送達成分の量は、送達成分の選択や所定の適用に必要な用量によって変化しうる。しかし典型的には、前記ナノ粒子に対する送達成分の重量比は１：１００～１００：１、より典型的には１：５０～５：１、さらに典型的には１：３０～１：１、最も典型的には１：２０～１：２の範囲である。

【0042】

典型的には、前記１種以上の送達成分は、ベクター、ウイルス、ウイロイド、プリオン、ウイルス様粒子、ウイルス由来成分、およびこれらの混合物から独立に選択される。典型的なベクターとして、ウイルスベクターおよびプラスミドが挙げられる。

【0043】

本明細書で用いられる「ベクター」という語は、それに結合した他の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことを意図している。ベクターは当該分野で周知であり、任意の種類のベクターを使用してよい。「プラスミド」はベクターの１種であり、内部にさらなる核酸断片を連結することができる環状二本鎖ＤＮＡのことを表す。別の種類のベクターであるウイルスベクターでは、追加する核酸断片をウイルスゲノムに連結することができる。他の種類のベクターとして、コスミドが挙げられる。他の種類のベクターとして人工染色体が挙げられ、イースト人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、およびヒト人工染色体（ＨＡＣｓ）がそれに含まれる。

【0044】

ある種のベクターは、それが導入された宿主細胞中で自律的に複製することができる（細菌複製起点を有する細菌ベクター、および哺乳類エピソーマルベクター等）。別のベクター（哺乳類非エピソーマルベクター等）は、宿主細胞への導入時に該宿主細胞のゲノムへと組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それが機能的に連結した遺伝子の発現を制御することができる。一般に、組換ＤＮＡ技術で利用される発現ベクターはプラスミドの形態の場合が多い。本明細書に記載される発明の実施に従って用いられる一部ベクターは当該分野で使用される周知のベクターであってよく、例としてｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＣＭＶ、ｐＭＤＧ、もしくはｐＨＲに由来するプラスミドやこれらの混合物、またはレトロウイルス、アデノウイルス、もしくはアデノ関連ウイルスに由来するウイルスベクターやこれらの混合物が挙げられる。

【0045】

本発明の実施に適しうるベクターに対する修飾の種類の非限定的な例としては、１つ以上のエンハンサー、１つ以上のプロモーター、１つ以上のリボソーム結合部位、または１つ以上の複製起点等の付加などの修飾が挙げられるが、これらに限定されない。一部の非限定的な実施形態において、本発明の実施に用いられる発現ベクターは、本一過性発現システムにおいて目的のタンパク質の発現を改善するために選択される１つ以上のエンハンサーエレメントを含みうる。前記選択されるエンハンサーエレメントは、目的のタンパク質の発現に用いられる発現可能な核酸配列に対して、５’または３’に位置していてよい
。

【0046】

好ましくは、前記１種以上の送達成分はベクターを含む。より好ましくは、前記１種以上の送達成分は、ウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクター；プラスミド、好ましくはｐＣＭＶ、ｐＭＤＧ、もしくはｐＨＲに由来するプラスミド；またはそれらの混合物；を含む。

【0047】

前記ベクターは空であってもよく、インサートもしくは導入遺伝子を含んでいてもよい。前記インサートまたは導入遺伝子は外来ＤＮＡ、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、または小型ヘアピンＲＮＡを含んでいてよい。好ましくは、前記インサートまたは導入遺伝子はＤＮＡを含む。

【0048】

前記送達成分はウイルスであってよい。典型的なウイルスの例として、レンチウイルス等のレトロウイルス；アデノウイルス；アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）；単純ヘルペスウイルス；およびそれらの組み合わせ；が挙げられるが、これらに限定されない。前記ウイルスは好ましくはレンチウイルスである。

【0049】

あるいは、前記送達成分はウイロイドであってよい。典型的なウイロイドとしては、ＰｏｓｐｉｖｉｒｏｉｄａｅおよびＡｖｓｕｎｖｉｒｏｉｄａｅに属するものが挙げられる。

【0050】

一部実施形態において、前記送達成分はプリオンである。典型的なプリオンとしては、ＰｒＰに由来するものが挙げられる。

【0051】

一部の実施形態において、前記１種以上の送達成分はウイルス由来成分を含んでいてよく、該ウイルス由来成分はビリオン、キャプシド、ウイルス核酸、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、またはウイルスタンパク質から選択されうる。

【0052】

各種実施形態において、前記ウイルス由来成分は、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスから作成されてよい。前記ウイルス由来成分は、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス等のレトロウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポックスウイルス、またはピコルナウイルスに由来してよい。前記ウイルス由来成分は好ましくはレンチウイルス由来である。

【0053】

一部の実施形態において、前記１種以上の送達成分は、ウイルスに極めて類似するがウイルスの遺伝物質を含まない、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含んでいてもよい。ＶＬＰは、パルボウイルス科（アデノ関連ウイルス等）、レトロウイルス科（ＨＩＶ等）、フラビウイルス科（Ｃ型肝炎ウイルス等）、パラミクソウイルス科（ニパ等）、およびバクテリオファージ（ＱβおよびＡＰ２０５等）などの広範な種類のウイルス科の成分から製造してよい。

【0054】

一部の実施形態において、前記組成物はさらに細胞を含む。前記細胞は真核細胞または原核細胞であってよい。好ましくは、前記細胞は真核細胞である。前記細胞は初代細胞、または、不死化細胞株もしくは形質転換細胞株等の細胞株に由来する細胞であってよい。前記細胞は植物細胞または動物細胞であってよい。好ましくは、前記細胞は哺乳類細胞である。より好ましくは、前記細胞はヒト細胞である。

【0055】

前記細胞は任意の種類の細胞でありうる。好ましくは、前記細胞は白血球である。より好ましくは、前記細胞は抗原提示細胞、またはＢ細胞もしくはＴ細胞等のリンパ球である
。さらに好ましくは、前記細胞はＴ細胞である。前記細胞はＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞であってよい。前記細胞はヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、または制御性Ｔ細胞であってよい。あるいは、前記細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等の幹細胞であってよい。

【0056】

前記細胞は遺伝子組換細胞または遺伝子導入細胞であってよい。例えば、前記細胞はキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）改変Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ細胞）であってよい。前記細胞は公知の任意の手法によって遺伝的に改変されたものであってよく、該手法としてはウイルスベクター、リポソーム、およびエレクトロポレーション等が挙げられるが、それらに限定されない。前記細胞は下記の手法によって遺伝的に改変されたものであってよい。

【0057】

前記組成物はさらに１種以上の薬理学的に許容される賦形剤を含んでいてよい。前記１種以上の賦形剤としては、担体、希釈剤、および／もしくは他の薬剤、医薬品、またはアジュバント等が挙げられる。

【0058】

本明細書で用いられる「トランスフェクション」という語は、外来核酸、タンパク質、または他の高分子が細胞中で発現するかまたは生物学的な機能を有するように、該外来核酸、タンパク質、または他の高分子を標的細胞に非ウイルス的な手段によって送達することを意味する。外来核酸の非限定的な例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびこれらの混合物が挙げられる。典型的には前記外来核酸はＤＮＡであり、より典型的にはスーパーコイルプラスミドＤＮＡである。前記細胞のトランスフェクションは一過性であってよい。すなわち、前記外来核酸は前記細胞中に限られた時間存在するものであって、標的細胞ゲノム中に組み込まれないものであってよい。あるいは、前記細胞のトランスフェクションは安定的なものであってよい。すなわち、前記外来核酸が標的細胞ゲノム中に組み込まれるか、またはエピソーマルプラスミドとして維持され、標的細胞とその子孫の中に前記外来核酸が長期的に維持される結果をもたらすものであってよい。

【0059】

本明細書で用いられる「形質導入」という語は、外来核酸が細胞中で発現するかまたは生物学的な機能を有するように、該外来核酸を標的細胞にウイルスまたはウイルスベクターによって送達することを意味する。外来核酸の非限定的な例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびこれらの混合物が挙げられる。典型的には前記外来核酸はＤＮＡであり、より典型的にはスーパーコイルプラスミドＤＮＡである。前記細胞のトランスフェクションは一過性であってよい。すなわち、前記外来核酸は前記細胞中に限られた時間存在するものであって、標的細胞ゲノム中に組み込まれないものであってよい。あるいは、前記細胞のトランスフェクションは安定的なものであってよい。すなわち、前記外来核酸が標的細胞ゲノム中に組み込まれるか、またはエピソーマルプラスミドとして維持され、標的細胞とその子孫の中に前記外来核酸が長期的に維持される結果をもたらすものであってよい。

【0060】

前記トランスフェクションまたは形質導入は、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で行われてもよい。例えば、培養下の細胞株細胞または単離された初代細胞に対してトランスフェクションまたは形質導入を行ってもよい。好ましくは、トランスフェクションまたは形質導入は、患者から単離された細胞に対して行われる。

【0061】

本発明の第２の態様として、治療における使用のための本発明の第１の態様による組成物も提供される。本願発明者らは、本発明の第１の態様の組成物が、細胞のトランスフェクションまたは形質導入において極めて効果的であることを見いだした。従って、トランスフェクションまたは形質導入を行う細胞については特に限定されない。細胞の遺伝子構
造の変化を引き起こすために、様々な異なる送達成分で様々な異なる細胞を処理しうるであろうことが想定される。従って、前記治療は典型的には遺伝子治療である。本発明に従って処理した細胞の投与、または本発明の第１の態様の組成物を用いた生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）トランスフェクションもしくは形質導入は、両者とも、広範な疾患を治療または予防するために使用することができる。とは言え、治療または予防しうる典型的な疾患の限定されない例として、遺伝性疾患、癌、感染症、および自己免疫疾患が挙げられる。典型的な遺伝性疾患の例としては、嚢胞性線維症、心疾患、糖尿病、血友病、および網膜色素変性症が挙げられる。

【0062】

前記癌はいずれの癌であってもよく、例として、血液癌、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫、ならびに固形腫瘍および他の非血液および非血液学的癌が挙げられる。前記感染症は病原体によって引き起こされるいずれの感染症であってもよく、例として、ウイルス、細菌、真菌、寄生体、およびプリオンによって引き起こされる感染症が挙げられる。前記自己免疫疾患はいずれの自己免疫疾患であってもよく、例として、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、アジソン病、バセドウ病、シェーグレン症候群、橋本病、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、悪性貧血、尋常性天疱瘡、およびセリアック病が挙げられる。

【0063】

典型的には、前記疾患は癌、感染症、または自己免疫疾患である。

【0064】

前記疾患が前記使用または方法において「治療される」場合、それは前記疾患の１つ以上の症状が緩和されることを意味する。症状が完全に治療され、前記患者にもはやその症状が存在しないようになることを意味するわけではないが、一部の方法ではそれもありうる。前記疾患の治療の結果、その疾患の１つ以上の症状の重症度が治療前よりも減少する。治療の結果、その疾患の複数の症状の重症度が治療前より減少してもよい。また、予防用途によって疾患の発症を予防するために本発明を用いることができる。

【0065】

本発明の第３の態様として、本発明の第１の態様による組成物の、治療のための薬剤の製造における使用も提供される。前記治療は典型的には本発明の第２の態様に対して記述された通りである。繰り返し述べると、本発明の第２の態様の通り、前記方法は、本発明の第１の態様による組成物を用いた、生体内トランスフェクションまたは形質導入、およびトランスフェクションまたは形質導入を行った細胞の送達を含む。

【0066】

本発明の第４の態様として、本発明の第１の態様による組成物を患者に投与することを含む、患者における疾患を治療する方法も提供される。好ましくは、前記患者はヒトである。好ましくは、治療に有効な量の前記組成物が前記患者に投与される。「治療に有効な量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な用量と期間において効果的な量のことを指す。また、前記治療は、本発明の第１の態様による組成物を用いてトランスフェクションまたは形質導入された細胞を、患者へと送達することを包含することも意図される。

【0067】

本発明の第５の態様として、本発明の第１の態様による組成物の製造方法も提供される。本方法は、本発明の第１の態様に記載のナノ粒子を、本発明の第１の態様に記載の１種以上の送達成分と混合する工程を含む。

【0068】

本発明のナノ粒子は、特許文献１の２４～２８ページに記載の方法等を使用し、ストーバー法の類似法（Ｓｔｏｂｅｒ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｃｅｓｓ）を用いて作成することができる。トランスフェクション剤を適用する場合、ナノ粒子を被覆するために、無機ナノ粒子の準備に続いてさらなる工程が行われる。この場合、前記無機ナノ粒子は、典型的には、トランスフェクション剤によるナノ粒子の被覆を促進するために、まずリンカー部分によって官能化される。上記説明の通り、前記リンカーは特に限定されないが、ホスホネー
トであることが多い。典型的には、前記無機ナノ粒子は前記リンカーと混合され、少なくとも５分間（通常３０分間～１０時間、最も多くは１時間～４時間）、多くの場合は室温よりも高い温度、典型的には２０℃～７０℃の範囲で、撹拌される。

【0069】

一部の実施形態において、前記混合工程は６０分間未満継続してよい。典型的には、前記混合工程は１０分間～４５分間の範囲、より典型的には１０分間～３０分間の範囲で継続される。この過程は、典型的には室温、すなわち１５℃～３５℃の範囲で、最も典型的には極性溶媒中、通常は水中で行われる。多くの場合、緩衝溶液を用いてもよく、その例としてリン酸緩衝食塩水が挙げられる。

【0070】

本発明の第６の態様として、本発明の第１の態様による組成物を用いた形質導入またはトランスフェクションの方法も提供される。該方法は、（ｉ）請求項１～１４のいずれかに記載の組成物を提供する工程；および（ｉｉ）前記組成物を細胞とともにインキュベートする工程；を含む。

【0071】

一実施形態において、細胞の形質導入の方法が提供され、該方法においては１種以上の送達成分がウイルスベクターを含む。特に、細胞の形質導入の方法であって、（ｉ）突起を表面に有するナノ粒子を提供し、前記ナノ粒子の直径が１００ｎｍ～３０００ｎｍの範囲であること；（ｉｉ）１種以上の送達成分を提供し、前記送達成分がウイルスベクターであること；および（ｉｉｉ）前記ナノ粒子と前記１種以上の送達成分とを細胞とともにインキュベートすること；を含む方法が提供される。

【0072】

さらなる一実施形態において、細胞のトランスフェクションの方法が提供され、該方法においては１種以上の送達成分がプラスミドを含む。特に、細胞のトランスフェクションの方法であって、（ｉ）突起を表面に有するナノ粒子を提供し、前記ナノ粒子の直径が１００ｎｍ～３０００ｎｍの範囲であること；（ｉｉ）１種以上の送達成分を提供し、前記送達成分がプラスミドであること；および（ｉｉｉ）前記ナノ粒子と前記１種以上の送達成分とを細胞とともにインキュベートすること；を含む方法が提供される。

【0073】

上記トランスフェクションおよび形質導入の実施形態では、前記インキュベーション工程を典型的には４８時間未満、より典型的には２４時間未満、さらに典型的には５時間未満継続する。多くの場合、前記インキュベーション工程を３時間未満、さらに典型的には２時間未満継続する。多くの場合、前記インキュベーション工程を５分間～１時間、通常１０分間～３０分間継続する。

【0074】

上記説明の通り、前記ナノ粒子は、形質導入過程のトランスフェクションを補助するトランスフェクション剤を含んでいてよい。

【0075】

両方法は生体内または生体外で行うことができる。典型的には、前記方法は生体外で行われる。

【0076】

当業者は、本発明のあらゆる態様が、例えばそれが前記組成物、その使用、または治療方法などと関連するかどうかにかかわらず、本発明の全ての他の態様に等しく適用可能であることを理解するであろう。特に、例えば前記組成物の態様は、本発明の他の態様、例えば前記使用、におけるよりも詳細に記載されている場合がある。しかし、より詳細な情報が本発明の特定の態様に対して与えられていても、この情報は一般的に等しく本発明の他の態様に適用可能であるということを当業者は理解するであろう。

【0077】

本明細書に引用された全ての特許および参考文献は、その全体が参照により本明細書に取り込まれたものとする。

【0078】

以下、本発明を、実施例に基づき、以下の図面のみ参照して詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0079】

【図1】Ｎｕｖｅｃによって４時間処理した後の細胞生存率。各種濃度のＮｕｖｅｃ（陰性対照（ＮＣ）、１μｇ、１０μｇ、４０μｇ、６０μｇ、８０μｇ）で４時間処理された細胞の生存率。４時間後、培地を交換した。細胞生存率および回収率を、培地交換後７２時間にわたり、図中に示す各時点で記録した。

【図2】Ｎｕｖｅｃによって４時間処理した後の細胞生存率。（Ａ、Ｂ）特定範囲の各種濃度のＮｕｖｅｃによって４時間処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞生存率の推移（２４時間ごと）（ｎ＝１）。後述の表３を参照のこと。

【図3】Ｎｕｖｅｃによって２４時間処理した後の細胞生存率。各種濃度のＮｕｖｅｃ（陰性対照（ＮＣ）、１μｇ、１０μｇ、４０μｇ、６０μｇ、８０μｇ）で２４時間処理された細胞の生存率。２４時間後、培地を交換した。細胞生存率および回収率を、培地交換後７２時間にわたり、図中に示す各時点で記録した。

【図4】Ｎｕｖｅｃによって２４時間処理した後の細胞生存率。（Ａ、Ｂ）特定範囲の各種濃度のＮｕｖｅｃによって２４時間処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞生存率の推移。表４を参照のこと。

【図5】Ｎｕｖｅｃによって４８時間処理した後の細胞生存率。各種濃度のＮｕｖｅｃ（陰性対照（ＮＣ）、１μｇ、１０μｇ、４０μｇ、６０μｇ、８０μｇ）で４８時間処理された細胞の生存率。４８時間後、培地を交換した。細胞生存率および回収率を、培地交換後７２時間にわたり、図中に示す各時点で記録した。

【図6】Ｎｕｖｅｃによって４８時間処理した後の細胞生存率。（Ａ、Ｂ）特定範囲の各種濃度のＮｕｖｅｃによって４８時間処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞生存率の推移。

【図7】１μｇのＮｕｖｅｃおよび５μｇのＧＦＰベクターのみで４時間、２４時間、および４８時間トランスフェクションした後の細胞生存率およびＧＦＰ発現。トランスフェクションの７２時間後の分析。

【図8】１０μｇのＮｕｖｅｃおよび５μｇのＧＦＰベクターのみで４時間、２４時間、および４８時間トランスフェクションした後の細胞生存率およびＧＦＰ発現。トランスフェクションの７２時間後の分析。

【図9】４０μｇのＮｕｖｅｃおよび５μｇのＧＦＰベクターのみで４時間、２４時間、および４８時間トランスフェクションした後の細胞生存率およびＧＦＰ発現。トランスフェクションの７２時間後の分析。

【図10】６０μｇのＮｕｖｅｃおよび５μｇのＧＦＰベクターのみで４時間、２４時間、および４８時間トランスフェクションした後の細胞生存率およびＧＦＰ発現。トランスフェクションの７２時間後の分析。

【図11】８０μｇのＮｕｖｅｃおよび５μｇのＧＦＰベクターのみで４時間、２４時間、および４８時間トランスフェクションした後の細胞生存率およびＧＦＰ発現。トランスフェクションの７２時間後の分析。

【図12】Ｎｕｖｅｃとの結合を試験する目的で後で使用するために製造され、指標細胞に対して力価測定されたウイルス。伝統的な製造方法で高力価ＬＶを製造し、ＬＶの各種希釈物を用いて力価測定した。フローサイトメトリーによる分析によって各種希釈物のＧＦＰ発現率を測定し、これを用いて１．１８×１０^９ＴＵ／ｍｌの力価を算出した。製造したＬＶは、後でＮｕｖｅｃとともに形質導入アッセイに使用した。

【図13】ＨＥＫ２９３Ｔ指標細胞のトランスフェクションを、ＮＶ００１０００２８、ＮＶ００１０００２６－２８、ＮＶ００１００３２、およびＮＶ００１００３３を用いて、５μｇのプラスミドＤＮＡ、ならびに４：３：１の割合のＧＦＰ、ＧＡＧ－ＰＯＬ、およびＶＳＶ－Ｇとともに、４時間または２４時間行った。ウイルス上清を２４時間ごとに７２時間にわたり採取した。写真はトランスフェクションの７２時間後のトランスフェクション済細胞を示す。

【図14】各種濃度およびトランスフェクション時間でＮｕｖｅｃを用いてトランスフェクションを行った細胞から採取されたウイルス上清で形質導入を行ったＨＥＫ２９３Ｔ細胞。形質導入の７２時間後、フローサイトメトリーを用いてＧＦＰ陽性細胞の割合を分析した結果を、各画像の下に示す。当初、どれだけのレンチウイルスＮｕｖｅｃが実際に生成するか不明であり、５００μｌおよび２００μｌのウイルス上清を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入を行った。より正確なウイルス力価の代表値を得るため、レンチウイルス力価の算出では１～３０％の間のＧＦＰ陽性割合を用いる。上記で示したように、使用した最低希釈（ｌｏｗｅｓｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（２００μｇ）においても細胞が３０％超でＧＦＰ＋であったため、より少ない量を用いて反復を行った。

【図15】反復力価測定を、各種濃度のＮｕｖｅｃでトランスフェクションを行った細胞から採取された、より少ない量のウイルス上清を用いて行った。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１００μｌおよび１０μｌのウイルス上清で形質導入し、形質導入の７２時間後にフローサイトメトリーを用いて陽性の緑色の細胞の割合を測定した。

【図16】指標細胞に対するレンチウイルス形質導入効率の分析。レンチウイルス（ＭＯＩ２０）の、各種濃度のＮＶ００１０００２８との結合。各種インキュベーション時間で結合を行った後、レンチウイルスをＨＥＫ２９３Ｔ指標細胞に加えた。Ｎ＝４

【図17】指標細胞に対するレンチウイルス形質導入効率の分析。レンチウイルス（ＭＯＩ２０）の、各種濃度のＮＶ００１０００２６－２８への結合。各種インキュベーション時間で結合を行った後、レンチウイルスをＨＥＫ２９３Ｔ指標細胞に加えた。Ｎ＝４

【図18】指標細胞に対するレンチウイルス形質導入効率の分析。レンチウイルス（ＭＯＩ２０）の、各種濃度のＮＶ００１００３２への結合。各種インキュベーション時間で結合を行った後、レンチウイルスをＨＥＫ２９３Ｔ指標細胞に加えた。Ｎ＝４

【図19】指標細胞に対するレンチウイルス形質導入効率の分析。レンチウイルス（ＭＯＩ２０）の、各種濃度のＮＶ００１００３３への結合。各種インキュベーション時間で結合を行った後、レンチウイルスをＨＥＫ２９３Ｔ指標細胞に加えた。Ｎ＝４

【図20】レンチウイルス（ＭＯＩ２０）の、指標細胞に対する形質導入効率。レンチウイルスを各種バッチのＮｕｖｅｃと各種濃度で１０分間結合させた後、ＨＥＫ２９３Ｔ指標細胞に加えた。ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによって測定した。Ｎ＝４

【図21】レンチウイルス（ＭＯＩ２０）の、指標細胞に対する形質導入効率。レンチウイルスを各種バッチのＮｕｖｅｃと各種濃度で２０分間結合させた後、ＨＥＫ２９３Ｔ指標細胞に加えた。ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによって測定した。Ｎ＝４

【図22】レンチウイルス（ＭＯＩ２０）の、指標細胞に対する形質導入効率。レンチウイルスを、各種バッチのＮｕｖｅｃと各種濃度で３０分間結合させた後、ＨＥＫ２９３Ｔ指標細胞に加えた。ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによって測定した。Ｎ＝４

【図23】各種濃度のＮｕｖｅｃおよび各種インキュベーション時間を用いたレンチウイルス（ＭＯＩ２０）の形質導入後の平均細胞生存率。Ｎ＝２。

【図24】指標細胞のウイルス形質導入；＋／－ポリブレン。各種限界希釈における、レンチウイルスを用いた形質導入細胞。５μｇ／ｍｌのポリブレンを用いた場合または用いない場合。表７を参照のこと。

【図25】図２５はナノ粒子のＳＥＭ画像を示す。

【発明を実施するための形態】

【実施例】

【0080】

実施例１ － Ｒａｍ－ＳＮＰｓの合成。

【0081】

レゾルシノール（０．４ｇ）およびホルムアルデヒド（３７重量％、０．５６ｍｌ）を、アンモニア水溶液（２８重量％、１２ｍｌ）、脱イオン水（４０ｍｌ）、およびエタノール（２８０ｍｌ）からなる溶液に加えた。前記混合物を室温（約２５℃）で８時間撹拌し、次いで２．４ｍｌのオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）を前記溶液に加え、８分
間撹拌した後、再度レゾルシノール（１．６ｇ）およびホルムアルデヒド（３７重量％、２．２４ｍｌ）を加えた。前記混合物を２時間室温で撹拌し、次いで４７００ｒｐｍ（３８７７ｒｃｆ）で５分間遠心分離を行うことによって回収し、エタノールで洗浄後に５０℃で一晩乾燥した。最後に、空気中で５５０℃で５時間焼成することによってＲａｍ－ＳＮＰｓを回収した。

【0082】

実施例２ － ＰＥＩ修飾ＲＮＰｓの合成

【0083】

上記で作成した０．０３グラムのＲａｍ－ＳＮＰｓを、１０ｍｌの水に超音波処理のもとで分散させた（溶液中に明らかな粒子のかたまりが沈殿しないように確認した）。０．２１３ｍｌの３－（トリヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホネート（ＨＴＰＭＰ、５０重量％、水中）を別の１０ｍｌの水に加え、前記１０ｍｌのナノ粒子溶液をＨＴＰＭＰ溶液と混合し、４０℃で２時間撹拌した。ホスホネート修飾シリカナノ粒子を、１２，０００ｒｐｍ（１７，４２０ｒｃｆ）の遠心分離を５分間行うことで回収し、水で一度洗浄した。その後、これらのナノ粒子を、５ｍｌの炭酸塩－重炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝９．６）中に超音波処理により直接再分散した。

【0084】

ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；分岐；平均ＭＷ １０ｋ；Ａｌｆａｒ Ａｅｓａｒ）を１０ｍｌの炭酸塩－重炭酸塩緩衝液中に超音波処理により溶解した。その後、前記粒子溶液をＰＥＩ溶液と混合し、室温で４時間撹拌した。ＰＥＩをロードしたナノ粒子を、１２，０００ｒｐｍの遠心分離を５分間行うことで回収し、水で一度洗浄した。その後、前記ナノ粒子を３ｍｌの水中に再懸濁し、液体窒素下で３０分間凍結させ、次いで凍結乾燥機で２日間乾燥させた。前記の十分に乾燥させた粒子を冷蔵庫内でデシケーターに保管した。以下、これら粒子を「Ｎｕｖｅｃ」と呼ぶ。

【0085】

実施例３ － 細胞生存率

【0086】

６×１０^５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と１％ペニシリンストレプトマイシンとを加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（以下、「完全培地」と呼ぶ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のもとで一晩インキュベートした。

【0087】

細胞を、１μｇ～８０μｇ／０．５ｍｌの範囲の各種濃度のＮｕｖｅｃで処理した。処理した細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のもとで４時間、２４時間、または４８時間インキュベートし、その後、新鮮な完全培地への交換を行った。培地交換後、トリパンブルー排除法によって、細胞生存率を２４時間ごとに７２時間にわたって測定した。Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動細胞計数機を使用説明書に従って用いた。

【0088】

Ｎｕｖｅｃとともに４時間インキュベートした後の細胞生存率分析を図１および図２に提供する。Ｎｕｖｅｃとともに２４時間インキュベートした後の細胞生存率分析を図３および図４に提供する。Ｎｕｖｅｃとともに４８時間処理した後の細胞生存率分析を図５および図６に提供する。

【0089】

実施例４ － Ｎｕｖｅｃを用いた単一プラスミドトランスフェクション

【0090】

緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ－ＥＧＦＰ）の送達効率を評価することにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＮｕｖｅｃのトランスフェクション効率を評価した。

【0091】

新鮮なＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２穴プレート内の完全培地中に、ウェルあたり１．２×１０^５細胞の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のもとで一晩インキュベートして７０
～９０％コンフルエントにした。

【0092】

ウェルあたり１～８０μｇの範囲の各種の量のＮｕｖｅｃに対して、粒子を少なくとも５倍量の７０％エタノール中に再懸濁し、混合し、短時間遠心分離を行って粒子を回収し、清澄な上清を除去することによってバイオバーデンを最小限にする処理を行った。５０μｌの滅菌ＰＢＳを各ウェルに加え、少なくとも１２０Ｗの出力で超音波洗浄器を用い、均一な懸濁液が得られるまで（３０分間まで）超音波処理することにより、ＮｕｖｅｃのＰＢＳ懸濁液を調製した。超音波処理の過程で速く沈降した塊は、全てピペッティングにより分散させた。

【0093】

前記ＰＢＳ中の１μｇ～８０μｇ／０．５ｍｌの範囲の各種濃度のＮｕｖｅｃを、総量１μｇのプラスミドＤＮＡと室温で３０分間結合させた。結合後、ｐＤＮＡをロードしたＮｕｖｅｃを１ｍｌの完全培地に懸濁し、それを用いて細胞培養培地の置き換えを行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のもとで４時間、２４時間、または４８時間インキュベートし、その後、新鮮な完全培地への交換を行った。培地交換の７２時間後、細胞をフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡観察によって分析し、細胞内の緑色蛍光タンパク質の発現を測定した。実験は各群で３回行った。結果を図７～１１に提供する。

【0094】

実施例５ － レンチウイルスの製造

【0095】

１．５×１０^７個の新鮮なＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｔ１７５フラスコ内の完全培地中に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のもとで一晩インキュベートしてコンフルエントにした。

【0096】

総量５μｇのプラスミドＤＮＡ（ｅＧＦＰ、ｐＣＭＶＲ８．７４、およびｐＭＤ２．Ｇ）（比率４：３：１）を、無血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）中でポリブレンと２０分間結合させた。結合後、ｐＤＮＡをロードしたトランスフェクション試薬を１ｍｌの完全培地に懸濁し、それを用いて細胞培養培地の置き換えを行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のもとで２４時間インキュベートし、その後、新鮮な完全培地への交換を行った。交換後、上清を２４時間毎に７２時間にわたって採取した。馴化培地を０．４５μＭのフィルターを通して濾過することで細胞残渣を取り除き、後で使用するために４℃で保管した。

【0097】

馴化培地を２３，０００ｒｐｍ、４℃にて超遠心分離することで濃縮した。上清を捨て、ペレットを１０分間風乾した。ペレットを２００μｌの無血清培地中に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。再懸濁したウイルスペレットを分注し、後で使用するために－８０℃で保管した。

【0098】

実施例６ － レンチウイルスの力価測定

【0099】

新鮮なＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２穴プレート内の完全培地中に２×１０^５細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のもとで一晩インキュベートした。

【0100】

ウイルスの段階希釈液を調製し、完全培地中で５μｇ／ｍｌのポリブレンとともに２０分間室温でインキュベートした。このウイルスポリブレン混合液を１ｍｌの完全培地に懸濁し、それを用いて細胞培養培地の置き換えを行った。１ウェルの細胞を未処理のまま残し、１ウェルの細胞を計数して、感染のために存在する細胞数を決定した。

【0101】

細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のもとで２４時間インキュベートし、その後、新鮮な完全培地への交換を行った。培地交換の４８時間後、ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析によって細胞を分析した。１～３０％のＧＦＰ発現を示す試料のみを、ウイルス力価を正確に代表するものとして分析した。ウイルス力価は以下に示すように各希釈点（ｄｉｌｕｔ
ｉｏｎ ｐｏｉｎｔ）で算出し、平均して全体の平均力価を求めた。

【0102】

力価（ＴＵ／ｍｌ）＝（（細胞数×（ＧＦＰ発現のパーセンテージ／１００））／容量）×ＤＦ

【0103】

ＴＵ／ｍｌはｍｌあたりの形質導入単位である。ＤＦは希釈倍率である。図１２に、限界希釈におけるＧＦＰ発現の画像を示す。力価は１．１８×１０^９ＴＵ／ｍｌと算出された。

【0104】

実施例７ － 細胞の三重プラスミドトランスフェクション

【0105】

新鮮なＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６穴プレート内の完全培地中に、ウェルあたり６×１０^５細胞の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のもとで一晩インキュベートしてコンフルエントにした。

【0106】

１μｇ～８０μｇ／０．５ｍｌの範囲の各種濃度のＮｕｖｅｃを、総量５μｇのプラスミドＤＮＡ（ｅＧＦＰ、ｐＣＭＶＲ８．７４、およびｐＭＤ２．Ｇ）と比率４：３：１で、無血清培地中で３０分間結合させた。異なるバッチのＮｕｖｅｃも試験した。結合後、ｐＤＮＡをロードしたＮｕｖｅｃを１ｍｌの完全培地に懸濁し、それを用いて細胞培養培地の置き換えを行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のもとで４時間または２４時間インキュベートし、その後、新鮮な完全培地への交換を行った。培地交換後、上清を２４時間毎に７２時間にわたって採取した。トランスフェクションの７２時間後、蛍光顕微鏡観察により、細胞のＧＦＰ発現を分析した。馴化培地を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、回収した上清を後で使用するために４℃で保管した。図１３に、トランスフェクションの７２時間後のトランスフェクション済細胞を示す。

【0107】

トランスフェクション実験は、ＮＶ００１０００２８、ＮＶ００１０００２６－２８、ＮＶ００１００３２、およびＮＶ００１００３３に対して全部で３回反復し、４時間および２４時間のトランスフェクションも行った。得られた力価（ＴＵ／ｍｌ）を算出したものを次の表に示す。

【0108】

【表1】

【0109】

実施例８ － 馴化培地を用いた細胞の形質導入

【0110】

新鮮なＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２穴プレート内に２×１０^５細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のもとで一晩インキュベートしてコンフルエントにした。

【0111】

実施例７でトランスフェクションを行った細胞から採取した５００μｌまたは２００μｌの馴化培地を用いて細胞の形質導入を行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のもとで２４時間インキュベートし、その後、新鮮な完全培地への交換を行った。形質導入の７２時間後、蛍光顕微鏡観察およびフローサイトメトリーにより、細胞のＧＦＰ発現を分析した。結果を図１４に提供する。

【0112】

実施例７でトランスフェクションを行った細胞から採取した１００μｌまたは１０μｌの馴化培地を用いて、新鮮なＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入を行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のもとで２４時間インキュベートし、その後、新鮮な完全培地への交換を行った。形質導入の７２時間後、蛍光顕微鏡観察およびフローサイトメトリーにより、細胞のＧＦＰ発現を分析した。結果を図１５に提供する。

【0113】

実施例９ － レンチウイルスを用いた形質導入

【0114】

新鮮なＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２穴プレート内の完全培地に２×１０^５細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のもとで一晩インキュベートしてコンフルエントにした。

【0115】

１μｇ～８０μｇ／０．５ｍｌの範囲の各種濃度のＮｕｖｅｃを、室温にて１０分間、２０分間、または３０分間、ＧＦＰ導入遺伝子（ＭＯＩ２０）を有するレンチウイルスに結合させた。前記レンチウイルスは実施例５に従って作成した。異なるバッチのＮｕｖｅｃを試験した。

【0116】

結合後、前記レンチウイルスとＮｕｖｅｃとの混合物を１ｍｌの完全培地に懸濁し、それを用いて細胞培養培地の置き換えを行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のもとで２４時間インキュベートし、その後、新鮮な完全培地への交換を行った。形質導入の７２時間後、蛍光顕微鏡観察およびフローサイトメトリーにより、細胞のＧＦＰ発現を分析した。図１６～２２に、各種バッチのＮｕｖｅｃを用いた形質導入細胞のＧＦＰ発現を示す。

【0117】

形質導入細胞の生存率を、トリパンブルー排除法を用いて分析した。結果を図２３に提供する。

【0118】

実施例１０ － 標準的形質導入プロトコルとの比較

【0119】

新鮮なＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２穴プレート内の完全培地に２×１０^５細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のもとで一晩インキュベートしてコンフルエントにした。

【0120】

ＧＦＰ導入遺伝子（ＭＯＩ２０）を有するレンチウイルスの各種限界希釈物を、５μｇ／ｍｌのポリブレンと室温にて２０分間結合した。ポリブレン無しでインキュベートしたレンチウイルスを対照として使用した。

【0121】

結合後、前記レンチウイルスとポリブレンとの混合物を１ｍｌの完全培地に懸濁し、それを用いて細胞培養培地の置き換えを行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のもとで２４時間インキュベートし、その後、新鮮な完全培地への交換を行った。形質導入の７２時間後、蛍光顕微鏡観察およびフローサイトメトリーにより、細胞のＧＦＰ発現を分析した。図２４に形質導入細胞のＧＦＰ発現を示す。

【0122】

形質導入効率の要約を以下の表に提供する。

【0123】

【表2】

【0124】

【表3】

【0125】

【表4】

【0126】

【表5】

【0127】

【表6】

【0128】

【表7】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【手続補正書】

【提出日】2022-12-27

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

シリカを含む無機メソポーラスナノ粒子；および
１種以上の送達成分；
を含む組成物であって、
前記ナノ粒子が表面に突起を有し；
前記ナノ粒子が５０ｎｍ～３０００ｎｍの範囲の直径を有し；
前記無機ナノ粒子が少なくとも部分的にトランスフェクション剤によって被覆されており；
前記１種以上の送達成分がウイルスベクターを含む；
組成物。

【請求項2】

前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター等のレトロウイルスベクターである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ナノ粒子が、
シリカを含んだシェル；
前記シェルの内面によって定義される容量を有する中空コア；および
前記シェルの外部に配置されたシリカを含む複数の突起；を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記突起が前記シェルと一体化している、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記突起が前記シェルから放射状に外向きに伸長している、請求項４または５に記載の組成物。

【請求項7】

前記突起が５ｎｍ～１０００ｎｍ、任意選択で１０ｎｍ～２００ｎｍ、任意選択で５０
ｎｍ～１５０ｎｍの長さを有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記ナノ粒子が中空である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記ナノ粒子がランブータン様またはモーニングスター様である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

前記突起がフィンガーまたはスパイクを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記トランスフェクション剤がカチオン性ポリマーである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

前記トランスフェクション剤がポリアルキルイミン、キトサン、ポリリジン、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレン、またはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーである、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記トランスフェクション剤がポリアルキルイミンである、請求項１１に記載の組成物。

【請求項14】

前記トランスフェクション剤がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項15】

前記ナノ粒子が前記１種以上の送達成分によって少なくとも部分的に被覆されている、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記ナノ粒子が少なくとも２種の送達成分を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記ナノ粒子が少なくとも３種の送達成分を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

さらに細胞を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

前記細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ－Ｔ細胞である、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

治療における使用のための、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

前記治療が遺伝子治療である、請求項２０に記載の使用のための組成物。

【請求項22】

癌、感染症、または自己免疫疾患の治療または予防における使用のための、請求項２０に記載の使用のための組成物。

【請求項23】

遺伝性疾患、癌、感染症、または自己免疫疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項24】

請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、
ｉ）シリカを含む、及び突起を表面に有する無機メソポーラスナノ粒子を１種以上の送達成分と混合する工程であって、
前記ナノ粒子が５０ｎｍ～３０００ｎｍの範囲の直径を有し、
前記１種以上の送達成分がウイルスベクターを含む、
前記工程；を含む、
方法。

【請求項25】

細胞のトランスフェクションまたは形質導入の方法であって、
ｉ）請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物を提供する工程；および
ｉｉ）前記組成物を細胞とともにインキュベートする工程；を含む、
方法。

【国際調査報告】