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特表2023-523995３次元培養された幹細胞から細胞外小胞体を製造する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-08
(54)【発明の名称】３次元培養された幹細胞から細胞外小胞体を製造する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/00 20060101AFI20230601BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20230601BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230601BHJP
A61K 35/51 20150101ALI20230601BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230601BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230601BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230601BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230601BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230601BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230601BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230601BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230601BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230601BHJP
【ＦＩ】
C12N5/00
C12N5/0775
A61K35/12
A61K35/51
A61P29/00
A61P37/06
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P3/10
A61P17/00
A61P25/00
A61P11/00
A61P1/04
A61P1/16
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022565884
(86)(22)【出願日】2021-04-28
(85)【翻訳文提出日】2022-11-22
(86)【国際出願番号】 KR2021005408
(87)【国際公開番号】W WO2021221471
(87)【国際公開日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】10-2020-0051640
(32)【優先日】2020-04-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518056140
【氏名又は名称】コングク ユニバーシティ インダストリアル コーオペレーション コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】110000800
【氏名又は名称】弁理士法人創成国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チョ，サング
(72)【発明者】
【氏名】キム，セヒ
(72)【発明者】
【氏名】イム，ギョンミン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BB19
4B065BB23
4B065BC26
4B065BD15
4B065BD39
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087DA32
4C087ZA02
4C087ZA59
4C087ZA68
4C087ZA75
4C087ZA89
4C087ZA94
4C087ZA96
4C087ZB08
4C087ZB11
4C087ZB15
4C087ZC35
(57)【要約】
本発明は、３次元培養された幹細胞から細胞外小胞体を製造する方法に関し、本発明の方法は、ＴＧＦ－βの存在下で幹細胞凝集体を回転振盪培養（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって、幹細胞由来の細胞外小胞体を高い収率で収得できるので、細胞治療剤を代替する薬理成分として活用可能なエキソソームを産業的規模で大量生産する工程に有用に用いることができる。併せて、本発明の方法により収得されたエキソソームは、従来の方法で生産されたエキソソームに比べて免疫調節機能も著しく改善され、様々な炎症又は自己免疫疾患に対する優れた治療組成物としても適用することができる。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
次のステップを含む、幹細胞由来の細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法：（ａ）対象体から分離された幹細胞を培養して細胞凝集体（ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成するステップ、及び
（ｂ）前記細胞凝集体を、ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）を含む培養液で３次元培養するステップ。
【請求項2】
前記幹細胞は間葉幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ステップ（ａ）は、多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器で幹細胞を浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器は、ウェル当たり３００～５００μｍの大きさを有するマイクロウェルプレートであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記浮遊培養は、前記多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器内にウェル当たり３００～５００個の細胞を分注することによって行われることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記ＴＧＦ－βはＴＧＦ－β３であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記ステップ（ｂ）は、前記細胞凝集体を浮遊状態で回転振盪培養（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記回転振盪培養は、５０～７０ｒｐｍの回転速度で行われることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記方法は、前記ステップ（ｂ）で収得した培養液から複数回の遠心分離を介して細胞外小胞体を分離するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞外小胞体は、３０～１５０ｎｍの平均直径を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法により製造された幹細胞由来の細胞外小胞体。
【請求項12】
請求項１１に記載の幹細胞由来の細胞外小胞体を有効成分として含む炎症もしくは自己免疫疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項13】
前記自己免疫疾患又は炎症性疾患は、リウマチ性関節炎、反応性関節炎、１型糖尿病、２型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、特発性線維性肺胞炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、限局性強皮症、全身性強皮症、大腸炎、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｄ’ｓ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、ベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、川崎病（Ｋａｗａｓａｋｉ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、原発性胆汁性硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）またはクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）であることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
ペルオキシレドキシン－４（Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ－４）、チオレドキシン還元酵素１（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ １）及びプロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｇ／Ｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２）で構成された群から選択される１つ以上のタンパク質を高発現する、幹細胞由来の細胞外小胞体。
【請求項15】
前記細胞外小胞体は、ＨＳＰ９０－β（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０－β）、ネプリリシン（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ）、Ｔ－複合体タンパク質１（ＴＣＰ１）サブユニット－α、フィラミンＡ（Ｆｉｌａｍｉｎ－Ａ）、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ３、ミオシン－９、トランスアルドラーゼ、ファシン（Ｆａｓｃｉｎ）、チオレドキシン還元酵素１、及びＲＵＶＢＬ２（ＲｕｖＢ－ｌｉｋｅ ２）で構成された群から選択される１つ以上のタンパク質をさらに高発現することを特徴とする、請求項１４に記載の幹細胞由来の細胞外小胞体。
【請求項16】
前記細胞外小胞体は、コロニン－１Ａ（Ｃｏｒｏｎｉｎ－１Ａ）、プロリル４－ヒドロキシラーゼサブユニットα－２（Ｐｒｏｌｙｌ ４－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ α－２）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）で構成された群から選択される１つ以上のタンパク質に対して陽性であることを特徴とする、請求項１４に記載の幹細胞由来の細胞外小胞体。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、幹細胞の３次元培養を通じて、幹細胞由来の細胞外小胞体を高収率で収得する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞外小胞体は、ヒトや動物はもちろんのこと、昆虫、植物、微生物などの様々な真核細胞から分泌される様々な大きさの脂質二重膜構造の小胞体であって、その中でナノレベルの粒径を有する微細小胞体をエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）という。エキソソームは、細胞が含有しているタンパク質、核酸、脂質、炭水化物などの特定の分子を含むと共に、脂質二重層でこれらの分子を安定的に保護し、分泌後に他の細胞にこれらを伝達する情報伝達の役割を果たす。
【0003】
一方、幹細胞を用いた再生医学又は免疫疾患の治療において、生きている幹細胞を病変部に直接移植する細胞治療法を代替する、幹細胞に由来した細胞外小胞体を用いた治療法が前臨床試験で効能を示しており、いくつかの疾病治療において臨床段階に入った事例も報告されている。幹細胞から分泌されるエキソソームは、幹細胞が有している抗炎症活性及び再生（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）活性に関連する核心因子を含有していると知られている。したがって、細胞を利用しないので、治療的有効量の細胞の確保及び維持などの問題がある既存の細胞治療剤の欠点を克服できる新たなアプローチとして脚光を浴びている。しかし、一般に有核細胞が分泌するエキソソームの個数は細胞当たり１０００個程度に過ぎない。そのため、エキソソームを用いた治療剤の技術において、細胞から分離されたエキソソームの収率を向上させることは非常に重要な問題である。
【0004】
一般に、エキソソームは、細胞培養液から分離される方式で収得する。一般の幹細胞の培養時に２次元培養を行うが、この場合、多量のエキソソームを得るためには、多くの量の細胞を培養しなければならないため、結果的にコストの増加をもたらす。また、多数の細胞を培養した大量の細胞培養液からエキソソームを分離することは、かなりの労働を必要とする。エキソソームの分離及び精製には遠心分離及びＴＦＦ（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を主に用いるが、遠心分離の場合、適用できる容量が限定されているため、大量の細胞培養液からエキソソームを分離するのに不適であり、ＴＦＦは、遠心分離に比べて大量工程に適するという利点があるが、Ｔ濾過工程中に発生するせん断ストレス（ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ）及びエキソソームの損失など解決しなければならない問題点が多い。このような問題点を解決するために、少ない数の細胞及び少量の培養液で多量のエキソソームを収得できる効率的な抽出方法の開発が求められている。
【0005】
本明細書全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として組み込まれ、本発明の属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明者らは、様々な有益成分を含有しながらも、脂質二重膜で構成されることで、それ自体で安定した薬物伝達システムとしても機能する幹細胞由来の細胞外小胞体、具体的には間葉幹細胞由来のエキソソームの効率的な収得方法を開発するために鋭意研究努力した。その結果、幹細胞凝集体を３次元培養することによってインビボの条件と類似の物理的、生物学的、空間的環境を提供し、同時に、ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）スーパーファミリー（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）サイトカインを添加する場合、エキソソームの収率だけでなく、炎症性疾患などに対する治療効果のような幹細胞固有の免疫調節効果も著しく向上することを見出すことによって、本発明を完成するようになった。
【0007】
したがって、本発明の目的は、幹細胞由来の細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法を提供することにある。
【0008】
本発明の他の目的は、前記方法により製造された幹細胞由来の細胞外小胞体を有効成分として含む炎症もしくは自己免疫疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。
【0009】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってさらに明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の一態様によれば、本発明は、次のステップを含む幹細胞由来の細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法を提供する：
（ａ）対象体から分離された幹細胞を培養して細胞凝集体（ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成するステップ；及び
（ｂ）前記細胞凝集体を、ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）を含む培養液で３次元培養するステップ。
（ａ）対象体から分離された幹細胞を培養して細胞凝集体（ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成するステップ；及び
（ｂ）前記細胞凝集体を、ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）を含む培養液で３次元培養するステップ。
【0011】
本発明者らは、様々な有益成分を含有しながらも、脂質二重膜で構成されることで、それ自体で安定した薬物伝達システムとしても機能する幹細胞由来の細胞外小胞体、具体的には間葉幹細胞由来のエキソソームの効率的な収得方法を開発するために鋭意研究努力した。その結果、幹細胞凝集体を３次元培養することによってインビボの条件と類似の物理的、生物学的、空間的環境を提供し、同時に、ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）スーパーファミリー（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）サイトカインを添加する場合、エキソソームの収率だけでなく、炎症性疾患などに対する治療効果のような幹細胞固有の免疫調節効果も著しく向上することを見出した。
【0012】
本明細書において、用語「細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）」は、様々な細胞から多胞体と原形質膜との融合を通じて細胞外環境に分泌される３０～１，０００ｎｍの範囲の直径の脂質二重膜構造の小胞を意味する。
【0013】
本発明の具体的な具現例によれば、本発明の方法により製造される細胞外小胞体は、３０～１５０ｎｍの平均直径を有し、より具体的には５０～１２０ｎｍの平均直径を有する。このような範囲の微細直径を有する細胞外小胞体をエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）という。
【0014】
本明細書において、用語「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、組織を構成する各細胞に分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）する前の段階の未分化細胞であって、特定の分化刺激（環境）下で特定の細胞に分化し得る能力を有する細胞を総称する。幹細胞は、細胞分裂が停止した分化された細胞とは異なって、細胞分裂によって自分と同じ細胞を生産（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）することができ、分化刺激が加えられると、刺激の性格に応じて様々な細胞に分化し得る、分化の柔軟性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有していることが特徴である。
【0015】
本発明で用いられる幹細胞は、幹細胞の特性、すなわち未分化、無限定増殖及び特定の細胞への分化能を有することで、再生しようとする組織に分化誘導が可能な細胞であれば、制限なしに利用可能である。
【0016】
本発明の具体的な具現例によれば、本発明で用いられる幹細胞は間葉幹細胞である。
【0017】
本明細書において、用語「間葉幹細胞」は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、神経細胞、心筋細胞への分化が可能な多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有した幹細胞を意味する。間葉幹細胞は、渦巻き状の形態と基本的な細胞表面マーカーＣＤ７３（＋）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤ３４（－）、ＣＤ４５（－）の発現の程度を通じて識別され得、多分化能と共に免疫反応を調節する機能も有する。
【0018】
本発明の具体的な具現例によれば、前記ステップ（ａ）は、多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器で幹細胞を浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって行われる。
【0019】
本明細書において、用語「浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）」は、培養対象細胞を基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）などに固定させないまま、培養液中で浮遊（ｆｌｏａｔｉｎｇ）している状態で培養することをいう。これによって、用語「浮遊培養」は、「３次元培養（３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）」と同じ意味で使用される。付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）依存性である幹細胞は、浮遊培養時に細胞凝集を起こし、このような凝集に含まれることができずに単独で浮遊する細胞は、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発して死滅するようになるので、細胞は、その付着特性に合った環境が造成されなければならない。本発明によれば、複数のウェルを有する多重ウェルで幹細胞を浮遊培養することによって、ウェルの大きさによる大きさの細胞凝集体が形成される。これによって、本発明は、同じ大きさ及び形状を有する規格化された幹細胞凝集体を大量に収得することができる。
【0020】
本明細書において、用語「細胞凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）」は、単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）ではない、３次元的な成長が許容された浮遊培養などの環境で培養された細胞が自己集合（ｓｅｌｆ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）をしながら形成された３次元構造の細胞凝集塊を意味する。３次元培養の結果として作られた細胞凝集体は、幹細胞が由来した生体内組織と類似の環境を提供し、大きさ及び自己集合された細胞の数によって球状（ｓｐｈｅｒｅ）であってもよく、球状以外の形状であってもよい。球状の細胞凝集体は、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）と呼ばれるが、スフェロイドは、幾何学的に完全な球状である必要はない。
【0021】
本明細書において、用語「細胞培養液」は、糖、アミノ酸、各種栄養物質、無機質などのように細胞の成長及び増殖に必須の要素を含む、インビトロで細胞の成長及び増殖のための混合物を意味する。
【0022】
細胞培養用培地に追加的に含まれ得る成分は、例えば、グリセリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン塩酸塩、Ｌ－システイン塩酸塩一水和物、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩一水和物、Ｌ－リジン塩酸塩、Ｌ－メチオニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－アスパラギン一水和物、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シスチン２ＨＣｌ、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン二ナトリウム塩二水和物、ｉ－イノシトール、チアミン塩酸塩、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、ビオチン、Ｄ－パントテン酸カルシウム、葉酸、リボフラビン、ビタミンＢ１２、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、リン酸水素ナトリウム一水和物（ＮａＨ２ＰＯ４－Ｈ２Ｏ）、硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ４－５Ｈ２Ｏ）、硫酸第二鉄七水和物（ＦｅＳＯ４－７Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４－７Ｈ２Ｏ）、Ｄ－グルコース（デキストロース）、ピルビン酸ナトリウム、ヒポキサンチンＮａ、リノレン酸、リポ酸、プトレシン２ＨＣｌ及びチミジンを含むが、これに制限されるものではない。
【0023】
本発明に係る細胞培養用培地は、人為的に製造して使用するか、あるいは商業的に市販中のものを購入して使用してもよい。商業的に市販している培養用培地の例は、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、α－ＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｆ１２（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２）を含むが、これに制限されるものではない。
【0024】
本発明の具体的な具現例によれば、前記多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器は、ウェル当たり３００～５００μｍの大きさを有する。より具体的には３５０～４５０の大きさを有し、最も具体的には約４００μｍの大きさを有する。
【0025】
本発明の具体的な具現例によれば、前記浮遊培養は、前記多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器内にウェル当たり３００～５００個の細胞を分注して行われる。より具体的には３５０～４５０個、最も具体的には約４００個の細胞を分注する。
【0026】
本発明の具体的な具現例によれば、本発明で用いられるＴＧＦ－βは、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、またはＴＧＦ－β３であり、より具体的にはＴＧＦ－β３である。
【0027】
本発明の具体的な具現例によれば、前記ステップ（ｂ）は、前記細胞凝集体を浮遊状態で回転振盪培養（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって行われる。
【0028】
より具体的には、前記回転振盪培養は５０～７０ｒｐｍの回転速度で行われる。より具体的には５３～６７ｒｐｍ、さらに具体的には５５～６５ｒｐｍ、最も具体的には５７～６３ｒｐｍの回転速度で行われる。
【0029】
本発明の具体的な具現例によれば、本発明の方法は、前記ステップ（ｂ）で収得した培養液から複数回の遠心分離を介して細胞外小胞体を分離するステップをさらに含む。
【0030】
従来の方法により培養された幹細胞から遠心分離を介して細胞外小胞体を収得する場合、遠心分離の容量の限界により、十分な量の細胞外小胞体を確保することが難しかったが、本発明の方法により培養された幹細胞は、細胞当たりの細胞外小胞体の分泌量が著しく増加することによって、遠心分離だけでも治療的有効量の細胞外小胞体を容易に収得することができる。
【0031】
本発明の他の態様によれば、本発明は、上述した本発明の方法により製造された幹細胞由来の細胞外小胞体を提供する。
【0032】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は、上述した本発明の方法により製造された幹細胞由来の細胞外小胞体を有効成分として含む炎症もしくは自己免疫疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
【0033】
本発明で用いられる幹細胞由来の細胞外小胞体については既に詳述したので、過度の重複を避けるために、その記載を省略する。
【0034】
本明細書において、用語「予防」は、疾患又は疾病を保有していると診断されたことはないが、このような疾患又は疾病にかかる可能性がある対象体において疾患又は疾病の発生を抑制することを意味する。
【0035】
本明細書において、用語「治療」は、（ａ）疾患、疾病又は症状の発展の抑制；（ｂ）疾患、疾病又は症状の軽減；または（ｃ）疾患、疾病又は症状を除去することを意味する。本発明の組成物は、Ｔ細胞媒介免疫活性を効率的に抑制することによって、過度のまたは望まない免疫反応を原因とする様々な炎症又は自己免疫疾患の症状の発展を抑制するか、これを除去するか、または軽減させる役割を果たす。したがって、本発明の組成物は、それ自体でこれらの疾患治療の組成物となってもよく、あるいは炎症又は自己免疫疾患に対する治療効果を有する他の薬理成分と共に投与され、前記疾患に対する治療補助剤として適用されてもよい。これによって、本明細書において、用語「治療」又は「治療剤」は、「治療補助」又は「治療補助剤」の意味を含む。
【0036】
本明細書において、用語「投与」は、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接的に投与することによって、対象体の体内で同じ量が形成されるようにすることをいい、「移植」又は「注入」と同じ意味を有する。
【0037】
本発明において、用語「治療的有効量」は、本発明の組成物を投与しようとする個体に治療的又は予防的効果を提供するのに十分な程度で含有された組成物の含量を意味し、これによって、「予防的有効量」を含む意味である。
【0038】
本明細書において、用語「対象体」は、制限なしに、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒヒまたはアカゲザルを含む。具体的には、本発明の対象体はヒトである。
【0039】
本発明の具体的な具現例によれば、本発明の組成物で予防又は治療される自己免疫疾患又は炎症性疾患は、例えば、リウマチ性関節炎、反応性関節炎、１型糖尿病、２型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、特発性線維性肺胞炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、限局性強皮症、全身性強皮症、大腸炎、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｄ’ｓ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、ベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、川崎病（Ｋａｗａｓａｋｉ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、原発性胆汁性硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）及びクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）を含むが、これに制限されるものではない。
【0040】
本発明の組成物が薬剤学的組成物として製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。
【0041】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【0042】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与することができ、具体的には、経口、静脈、皮下または腹腔投与されてもよい。
【0043】
本発明の薬剤学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方することができる。本発明の薬剤学的組成物の好ましい投与量は、成人を基準として０．００１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【0044】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位用量形態で製造されるか、または多用量容器内に入れて製造されてもよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液の形態であるか、またはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【0045】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は、本発明の幹細胞由来の細胞外小胞体を有効成分として含む組成物を対象体に投与するステップを含む炎症もしくは自己免疫疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0046】
本発明の更に他の態様によれば、ペルオキシレドキシン－４（Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ－４）、チオレドキシン還元酵素１（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ １）及びプロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｇ／Ｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２）で構成された群から選択される１つ以上のタンパク質を高発現する幹細胞由来の細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を提供する。
【0047】
本発明によれば、本発明の方法により培養された間葉幹細胞から分離した細胞外小胞体、例えばエキソソームは、従来の方法により収得したエキソソームと比較して、タンパク質発現プロファイルにおいても明確な差を示す。下記実施例に示されたように、前記３つのタンパク質は、２次元培養、またはＴＧＦ－β３の処理なしに３次元培養のみを適用した間葉幹細胞由来のエキソソームに比べて有意に高発現されるタンパク質であって、本発明の方法により収得されたエキソソームの組成自体も、従来に存在しなかった新規な組成を有することが分かる。
【0048】
本明細書において、用語「高発現」は、本発明の方法によらずに従来の方法により収得した間葉幹細胞由来のエキソソームと比較して、特定のタンパク質などのエキソソーム内の含量、分泌量または発現量が測定可能な程度に有意に増加したことを意味し、具体的には、含量、分泌量または発現量が４０％以上増加したことを意味し、より具体的には６０％以上増加したことを意味し、より一層具体的には８０％以上増加したことを意味し、最も具体的には１００％以上増加したことを意味する。
【0049】
本発明の具体的な具現例によれば、前記細胞外小胞体は、ＨＳＰ９０－β（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０－β）、ネプリリシン（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ）、Ｔ－複合体タンパク質１（ＴＣＰ１）サブユニット－α、フィラミンＡ（Ｆｉｌａｍｉｎ－Ａ）、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ３、ミオシン－９、トランスアルドラーゼ、ファシン（Ｆａｓｃｉｎ）、チオレドキシン還元酵素１、及びＲＵＶＢＬ２（ＲｕｖＢ－ｌｉｋｅ ２）で構成された群から選択される１つ以上のタンパク質をさらに高発現する。
【0050】
本発明の具体的な具現例によれば、前記細胞外小胞体は、コロニン－１Ａ（Ｃｏｒｏｎｉｎ－１Ａ）、プロリル４－ヒドロキシラーゼサブユニットα－２（Ｐｒｏｌｙｌ ４－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ α－２）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）で構成された群から選択される１つ以上のタンパク質に対して陽性である。本発明によれば、前記３つのタンパク質は、２次元培養、またはＴＧＦ－β３の処理なしに３次元培養のみを適用した間葉幹細胞由来のエキソソームでは検出されないタンパク質であって、本発明の方法により収得されたエキソソームは、全く新しいタンパク質発現プロファイルを有することが分かる。
【発明の効果】
【0051】
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ａ）本発明は、３次元培養された幹細胞から細胞外小胞体を製造する方法を提供する。
（ａ）本発明は、３次元培養された幹細胞から細胞外小胞体を製造する方法を提供する。
【0052】
（ｂ）本発明の方法は、ＴＧＦ－βの存在下で幹細胞凝集体を回転振盪培養（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって、幹細胞由来の細胞外小胞体を高い収率で収得できるので、細胞治療剤を代替する薬理成分として活用可能なエキソソームを産業的規模で大量生産する工程に有用に用いることができる。
【0053】
（ｃ）併せて、本発明の方法により収得されたエキソソームは、従来の方法で生産されたエキソソームに比べて免疫調節機能も著しく改善され、様々な炎症又は自己免疫疾患に対する優れた治療組成物としても適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0054】
【図2】各培養条件によるエキソソームの収率を示した図である。
【図3】ＴＧＦ－βの処理によるＰＤＩ値の変化を示す図であって、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養の条件では単一のピーク（ｏｎｅ ｐｅａｋ）が現れることを示す。
【図4A】ＴＧＦ－βがＴ細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。それぞれ、ＰＨＡを用いてＰＢＭＣの増殖を誘発した後、陰性対照群（無処理群）、陽性対照群（ＭＳＣ処理群）、３Ｄ振盪培養の条件のみを適用したエキソソーム（３Ｄ－ＥＶ）、３Ｄ振盪培養の条件下でＴＧＦ－β３を培養液に添加して得られたエキソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）のＴ細胞抑制効果を確認した（図４Ａ）。その結果、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養の条件を通じて収得したエキソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）が最も著しいＴ細胞抑制効果を有することが確認されて（図４Ｂ及び図４Ｃ）、本発明の方法により収得されたエキソソームは、収率だけでなく機能も強化されたことを示す。
【図4B】ＴＧＦ－βがＴ細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。それぞれ、ＰＨＡを用いてＰＢＭＣの増殖を誘発した後、陰性対照群（無処理群）、陽性対照群（ＭＳＣ処理群）、３Ｄ振盪培養の条件のみを適用したエキソソーム（３Ｄ－ＥＶ）、３Ｄ振盪培養の条件下でＴＧＦ－β３を培養液に添加して得られたエキソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）のＴ細胞抑制効果を確認した（図４Ａ）。その結果、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養の条件を通じて収得したエキソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）が最も著しいＴ細胞抑制効果を有することが確認されて（図４Ｂ及び図４Ｃ）、本発明の方法により収得されたエキソソームは、収率だけでなく機能も強化されたことを示す。
【図4C】ＴＧＦ－βがＴ細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。それぞれ、ＰＨＡを用いてＰＢＭＣの増殖を誘発した後、陰性対照群（無処理群）、陽性対照群（ＭＳＣ処理群）、３Ｄ振盪培養の条件のみを適用したエキソソーム（３Ｄ－ＥＶ）、３Ｄ振盪培養の条件下でＴＧＦ－β３を培養液に添加して得られたエキソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）のＴ細胞抑制効果を確認した（図４Ａ）。その結果、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養の条件を通じて収得したエキソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）が最も著しいＴ細胞抑制効果を有することが確認されて（図４Ｂ及び図４Ｃ）、本発明の方法により収得されたエキソソームは、収率だけでなく機能も強化されたことを示す。
【図5A】動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）分析を通じてエキソソームの大きさを調査した結果を示す図である。
【図5B】エキソソームの形態及び構造を透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した結果である。
【図5C】ＣＤ９、ＣＤ６３、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１及びＡｌｉｘの発現を確認するためのウエスタンブロッティング分析の結果を示す。
【図5D】流細胞分析を通じてエキソソームの表面の免疫表現型分析を行った結果を示す。
【図6A】本発明のエキソソームによる皮膚上皮細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＨａＣａＴ）での創傷治癒能力を調査した結果を示す。
【図6B】本発明のエキソソームによる皮膚上皮細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＨａＣａＴ）での創傷治癒能力を調査した結果を示す。
【図7】クラスタリング分析を通じて導出された４個のクラスターのうち、本発明の方法により収得したエキソソームであるＴ－３Ｄ－ＥＶ試料において特異的に変化するタンパク質を示す図である。
【図8】本発明のエキソソームで特徴的な発現様相を示すタンパク質の生物学的特徴を比較分析した結果を示す。
【図9】導出された３つのクラスターのタンパク質の生物学的機能及びその免疫関連の特徴を示す図である。
【図10】主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を通じて各グループ間の分離の程度をＤｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘを用いて示した結果を示す。
【図11】遺伝子セット濃縮分析の結果であって、濃縮された遺伝子セット、標準化された濃縮点数（ＮＥＳ）及びｐ－値をそれぞれ示す。
【図12】本発明で濃縮された遺伝子グループを示した図である。
【図13】本発明の方法により収得したエキソソームにおいて３Ｄ培養群に比べて２倍以上増加または減少したタンパク質（図１３）、及び本発明の方法により収得したエキソソームでのみ発現されたタンパク質（図１４）をそれぞれ並べた図である。
【図14】本発明の方法により収得したエキソソームにおいて３Ｄ培養群に比べて２倍以上増加または減少したタンパク質（図１３）、及び本発明の方法により収得したエキソソームでのみ発現されたタンパク質（図１４）をそれぞれ並べた図である。
【図15】本発明の方法により収得したエキソソームにおいて炎症関連タンパク質の発現様相を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0055】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【0056】
実施例
実施例１：間葉幹細胞の３次元細胞培養
幹細胞の３次元細胞培養のために、ウェル当たり４００μｍの大きさのマイクロウェルを約７０００個含むＡｇｇｒｅＷｅｌｌＴＭ４００（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；＃３４４２５）にＦ１２７溶液を処理し、ウェル当たり約４００個の臍帯由来の間葉幹細胞（ソウル大病院、建国大学校生命倫理委員会承認番号：００１３５５－２０１７０５－ＢＲ－１８１）をシーディングして、１２０～２００μｍの直径範囲の均一なスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を生産した。非吸着培養皿にＴＧＦ－β３が含まれた培養液にスフェロイドをシーディングした後、３日間、回転振盪機（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ、ＩＮＦＯＲＳ ＨＴ Ｃｅｌｔｒｏｎ；＃６９４５５）で６０ｒｐｍ、３７℃で振盪培養（ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）した。３日後、得られた培養液からエキソソームを分離した。
実施例１：間葉幹細胞の３次元細胞培養
幹細胞の３次元細胞培養のために、ウェル当たり４００μｍの大きさのマイクロウェルを約７０００個含むＡｇｇｒｅＷｅｌｌＴＭ４００（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；＃３４４２５）にＦ１２７溶液を処理し、ウェル当たり約４００個の臍帯由来の間葉幹細胞（ソウル大病院、建国大学校生命倫理委員会承認番号：００１３５５－２０１７０５－ＢＲ－１８１）をシーディングして、１２０～２００μｍの直径範囲の均一なスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を生産した。非吸着培養皿にＴＧＦ－β３が含まれた培養液にスフェロイドをシーディングした後、３日間、回転振盪機（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ、ＩＮＦＯＲＳ ＨＴ Ｃｅｌｔｒｏｎ；＃６９４５５）で６０ｒｐｍ、３７℃で振盪培養（ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）した。３日後、得られた培養液からエキソソームを分離した。
【0057】
実施例２：エキソソームの分離及び定量
培養液を３００ｇで１０分間遠心分離して細胞デブリを除去し、２０００ｇで１０分間遠心分離した後、上澄液を新しいチューブに移してから再び１０，０００ｇで３０分間遠心分離して、再度上澄液を１８７，０００ｇで２時間遠心分離してペレットからエキソソームを収得した。培養液からエキソソームを分離した後、ＮＴＡ装備（ＮＳ３００、ＮＡＮＯＳＩＧＨＴ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、製造者の指示に従ってＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行うことによって、エキソソームの数及びピーク（ｐｅａｋ）を確認した。その結果、振盪（ｓｈａｋｉｎｇ，６０ｒｐｍ）なしに３Ｄ培養のみを適用した場合、一般の２Ｄ培養の環境と収率に大きな差がなく、３次元培養自体による効果は有意でないものと示された。併せて、振盪（６０ｒｐｍ）なしに３Ｄ培養でＴＧＦ－β３のみを添加するか、またはＴＧＦ－β３なしに３Ｄ振盪培養条件のみを適用した場合に比べて、３Ｄ、振盪（６０ｒｐｍ）及びＴＧＦ－β３を全て適用した群で著しい収率の増加が確認できた（図２）。かつ、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養の条件では、単一のピーク（ｏｎｅ ｐｅａｋ）が現れることによって、均質のエキソソームが生産されることが確認された（図３）。
培養液を３００ｇで１０分間遠心分離して細胞デブリを除去し、２０００ｇで１０分間遠心分離した後、上澄液を新しいチューブに移してから再び１０，０００ｇで３０分間遠心分離して、再度上澄液を１８７，０００ｇで２時間遠心分離してペレットからエキソソームを収得した。培養液からエキソソームを分離した後、ＮＴＡ装備（ＮＳ３００、ＮＡＮＯＳＩＧＨＴ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、製造者の指示に従ってＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行うことによって、エキソソームの数及びピーク（ｐｅａｋ）を確認した。その結果、振盪（ｓｈａｋｉｎｇ，６０ｒｐｍ）なしに３Ｄ培養のみを適用した場合、一般の２Ｄ培養の環境と収率に大きな差がなく、３次元培養自体による効果は有意でないものと示された。併せて、振盪（６０ｒｐｍ）なしに３Ｄ培養でＴＧＦ－β３のみを添加するか、またはＴＧＦ－β３なしに３Ｄ振盪培養条件のみを適用した場合に比べて、３Ｄ、振盪（６０ｒｐｍ）及びＴＧＦ－β３を全て適用した群で著しい収率の増加が確認できた（図２）。かつ、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養の条件では、単一のピーク（ｏｎｅ ｐｅａｋ）が現れることによって、均質のエキソソームが生産されることが確認された（図３）。
【0058】
実施例３：ＰＢＭＣ増殖アッセイ
実施例２の方法により収得したエキソソームに対して、従来に報告された方法によって（Ｈｓｕ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．（１０６），ｅ５３２６５，ｄｏｉ：１０．３７９１／５３２６５（２０１５））ＰＢＭＣ増殖アッセイを行うことによって、ＴＧＦ－βを処理した培養液から得られたエキソソームが、対照群（一般の細胞培養液）に比べてＴ細胞抑制効果があるかを確認した。血液（建国大学校病院、建国大学校生命倫理委員会承認番号：７００１３５５－２０１７０５－ＢＲ－１８１）からフィコール（ｆｉｃｏｌｌ）を用いてＰＢＭＣを分離した後、培養５日後、ＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃Ｃ３４５５４）でＰＢＭＣを染色し、流細胞分析を通じてＰＢＭＣの増殖を確認した。ＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｓｉｇｍａ；＃Ｌ１６６８）を処理して、Ｔ細胞の増殖が伴う炎症環境を誘導した後、間葉幹細胞自体のＰＢＭＣ抑制効果を陽性対照群として設定した後、一般の細胞培養液から得られたエキソソーム（ＥＶ）；３Ｄ振盪培養の条件のみを適用したエキソソーム（３Ｄ－ＥＶ）、３Ｄ振盪培養の条件下でＴＧＦ－β３を培養液に添加して得られたエキソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）のＰＢＭＣ抑制効果を確認した（図４Ａ）。その結果、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養の条件を通じて収得した本発明のエキソソームが、４３．１％に達していたＭＳＣ処理群の増殖性Ｔ細胞を９．６％まで減少させ、陽性対照群に比べても８０％に近い著しい減少率を示しながら、最も優れたＴ細胞抑制効果を示した（図４Ｂ及び図４Ｃ）。これによって、本発明の方法を通じて収得されたエキソソームは、収率だけでなく機能も大きく強化されたことが分かった。
実施例２の方法により収得したエキソソームに対して、従来に報告された方法によって（Ｈｓｕ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．（１０６），ｅ５３２６５，ｄｏｉ：１０．３７９１／５３２６５（２０１５））ＰＢＭＣ増殖アッセイを行うことによって、ＴＧＦ－βを処理した培養液から得られたエキソソームが、対照群（一般の細胞培養液）に比べてＴ細胞抑制効果があるかを確認した。血液（建国大学校病院、建国大学校生命倫理委員会承認番号：７００１３５５－２０１７０５－ＢＲ－１８１）からフィコール（ｆｉｃｏｌｌ）を用いてＰＢＭＣを分離した後、培養５日後、ＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃Ｃ３４５５４）でＰＢＭＣを染色し、流細胞分析を通じてＰＢＭＣの増殖を確認した。ＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｓｉｇｍａ；＃Ｌ１６６８）を処理して、Ｔ細胞の増殖が伴う炎症環境を誘導した後、間葉幹細胞自体のＰＢＭＣ抑制効果を陽性対照群として設定した後、一般の細胞培養液から得られたエキソソーム（ＥＶ）；３Ｄ振盪培養の条件のみを適用したエキソソーム（３Ｄ－ＥＶ）、３Ｄ振盪培養の条件下でＴＧＦ－β３を培養液に添加して得られたエキソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）のＰＢＭＣ抑制効果を確認した（図４Ａ）。その結果、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養の条件を通じて収得した本発明のエキソソームが、４３．１％に達していたＭＳＣ処理群の増殖性Ｔ細胞を９．６％まで減少させ、陽性対照群に比べても８０％に近い著しい減少率を示しながら、最も優れたＴ細胞抑制効果を示した（図４Ｂ及び図４Ｃ）。これによって、本発明の方法を通じて収得されたエキソソームは、収率だけでなく機能も大きく強化されたことが分かった。
【0059】
実施例４：各エキソソームの特性の分析
エキソソームの大きさは、Ｎａｎｏ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を用いた動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）分析を通じて調査し、ＥＶの数は、ナノ粒子追跡分析機ＮＳ３００（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ，Ａｍｅｓｂｅｒｙ，ＵＫ）を用いて測定した。エキソソームの形態及び構造は、８０ｋＶで透過電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＪＥＭ－１０１０，Ｎｉｐｐｏｎ Ｄｅｎｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて分析し、観察の結果、エキソソームの形態は、カップ状または球状であった（図５Ｂ）。
エキソソームの大きさは、Ｎａｎｏ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を用いた動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）分析を通じて調査し、ＥＶの数は、ナノ粒子追跡分析機ＮＳ３００（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ，Ａｍｅｓｂｅｒｙ，ＵＫ）を用いて測定した。エキソソームの形態及び構造は、８０ｋＶで透過電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＪＥＭ－１０１０，Ｎｉｐｐｏｎ Ｄｅｎｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて分析し、観察の結果、エキソソームの形態は、カップ状または球状であった（図５Ｂ）。
【0060】
Ｇｒｉｄ（Ｆｏｒｍｖａｒ／Ｃａｒｂｏｎ ３００ Ｍｅｓｈ，Ｃｏｐｐｅｒ＿ＦＣＦ３００－ＣＵ ５０／ｐｋ）上にエキソソームを付着し、１％リンタングステン酸水和物（ｓｉｇｍａ，Ｐ４００６）を用いて陰性染色を行った。エキソソーム関連陽性マーカーを確認するために、免疫ブロッティングでＣＤ９（ａｂ２６３０２３，ａｂｃａｍ）、ＣＤ６３（ａｂ１３４０４５，ａｂｃａｍ）、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１（＃１８６３４，ＣＳＴ）、Ａｌｉｘ（＃２１７１，ＣＳＴ）タンパク質の発現を調査した。ウエスタンブロッティングの結果、エキソソームの陽性マーカーは発現され、エキソソームの陰性マーカーであるＧＭ１３０（＃１２４８０，ＣＳＴ）タンパク質の発現は観察されなかった。
【0061】
流細胞分析を通じてエキソソームの表面の免疫表現型分析を行った。まず、エキソソームのサイズは、流細胞分析機を用いて分析できない大きさであるため、エキソソームの陽性マーカーであるＣＤ９抗体が結合されている２．７ｕｍのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ）（１０６２０Ｄ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｘｏｓｏｍｅ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ９ Ｆｌｏｗ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ））をエキソソームに付着してサイズを大きくした後、ＣＤ９－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，７４３０４７）、ＣＤ６３－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，５５６０２０）、ＣＤ８１－ＡＰＣ（ｍａｃｓ ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ，Ｍ１３０－１１９－７８７）抗体で標識した。その後、流細胞分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、標識された抗体で生成される蛍光強度を測定した。その結果、エキソソームでＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１の蛍光発現量が９６％以上発現されることを確認した。分離されたエキソソームが、エキソソームの陽性マーカーが９６～９８％発現されることからみて、均質なエキソソームが分離されたことを確認できる。
【0062】
実施例５：各エキソソームの創傷治癒能の分析（Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ）
エキソソームの皮膚上皮細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ，ＨａＣａＴ）での治癒能力を評価するために、ＨａＣａＴ細胞を培養皿に接種して９０％まで育てた後、１０００μlのチップ先端を用いて長く傷をつけた。その後、エキソソーム（１Ｅ＋１０ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ）が含まれた細胞培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｄ６４２９，ｓｉｇｍａ）に交換した後、一定の時間毎に創傷部位を撮影し、創傷が治癒される能力を分析した。
エキソソームの皮膚上皮細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ，ＨａＣａＴ）での治癒能力を評価するために、ＨａＣａＴ細胞を培養皿に接種して９０％まで育てた後、１０００μlのチップ先端を用いて長く傷をつけた。その後、エキソソーム（１Ｅ＋１０ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ）が含まれた細胞培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｄ６４２９，ｓｉｇｍａ）に交換した後、一定の時間毎に創傷部位を撮影し、創傷が治癒される能力を分析した。
【0063】
その結果、エキソソームを処理した群の全てにおいて、陰性対照群よりも早く創傷部位が閉鎖されることを確認し、３Ｄ振盪培養のみを適用した群（３Ｄ－ＥＶ）よりも、ＴＧＦ－β３及び３Ｄ振盪培養の両方を適用した群（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）でさらに早く創傷部位が閉鎖されることを確認した（図６）。
【0064】
実施例６：エキソソーム発現タンパク質の分析
タンパク質の抽出及び定量分析
各ゲルで染色されたタンパク質は、ゲル内消化（ｉｎ－ｇｅｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）方法を通じてペプチドを製造し、抽出した。詳細には、タンパク質の脱染色のために、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムと５０％のアセトニトリルで構成された溶液、及び１００％のアセトニトリル溶液を用いて行った後、５０ｍＭのジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を用いて３７℃でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を還元させ、５５ｍＭのヨードアセトアミド（ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）を用いて光遮断条件でアルキル化反応を行った後、１００％のアセトニトリル溶液を用いて脱水化過程を行った。５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムに溶解されているＬｙｓＳ／トリプシン混合プロテアーゼを使用してペプチドを製造した。抽出されたペプチドは、０．１％のギ酸で溶かし、液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＬＣ）と結合された質量分析を行った。質量分析装備はＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）を、液体クロマトグラフィーはＵｌｔｉＭａｔｅＴＭ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）を使用し、ペプチド試料は５μｌずつ注入して２５０μｌ／ｍｉｎの流速で、ＮａｎｏＬＣと連動するイオントラップ質量分析機（Ｉｏｎ ｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて分析を行った。ＬＣは、溶液Ａ（５％ジメチルスルホキシド、０．１％ギ酸）と溶液Ｂ（９５％アセトニトリル、０．１％ギ酸、５％ジメチルスルホキシド）の濃度勾配１５０分を含めて総２００分間分離し、使用する分析カラムは、Ｃ１８（２μｍ、１００Å）を充填した内径７５μｍ、外径３６０μｍ、長さ５０ｃｍの融合シリカ毛細管カラムを使用して、ペプチド混合体を分離した。分離されたペプチドは、質量分析器に注入してスペクトルデータを獲得した。オービトラップ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）ＭＳ分析は、３５０～１８００ｍ／ｚの範囲に対してイオントラップＭＳで１回のサーベイスキャン（ｓｕｒｖｅｙ ｓｃａｎ、解像度７０，０００）後に、ＨＣＤ（Ｈｉｇｈｅｒ ｅｎｅｒｇｙ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２７％ ｅｎｅｒｇｙ ｌｅｖｅｌ）方式を用いてオービトラップＭＳを用いて、２０回のＭＳ／ＭＳ（解像度１７，５００）分析を行った。２０秒の動的排除オプション（ｄｙｎａｍｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｏｐｔｉｏｎ）を通じて、重複するペプチドイオン検出を最小化した。イオントラップのＡｕｔｏ ｇａｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｔｔｉｎｇは、Ｆｕｌｌ ＭＳに対しては３Ｅ０６を、ＦＴ ＭＳ／ＭＳに対しては１Ｅ５を使用した。獲得したＲＡＷファイルを、Ａｎｄｒｏｍｅｄａアルゴリズムベースのデータベース分析ソフトウェアであるＭａｘＱｕａｎｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．６．１０．４３，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍａｘｑｕａｎｔ．ｏｒｇ／）を用いて、定性分析及び非標識定量分析を行った。システイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）にはシステインカルバミドメチル化を固定値（Ｆｉｘｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）として処理し、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）に酸化を変動値（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）として行った。タンパク質配列のデータベースは、２０１９年１０月に発表されたヒトＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅを使用し、非標識定量のために、ＭａｘＬＦＱアルゴリズムを用いてタンパク質の定量値を導出した。同定されたタンパク体を、Ｐｅｒｓｅｕｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｒｓｅｕｓ－ｆｒａｍｅｗｏｒｋ．ｏｒｇ）を用いてヒートマップ（ｈｅａｔ ｍａｐ）、クラスタリング分析及び主成分分析を行った。各クラスターのタンパク質の特徴を確認するために、ＣｌｕｅＧＯ、ＳｈｉｎｙＧＯ ｖ０．６０、ＧＳＥＡプログラムを使用した。
タンパク質の抽出及び定量分析
各ゲルで染色されたタンパク質は、ゲル内消化（ｉｎ－ｇｅｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）方法を通じてペプチドを製造し、抽出した。詳細には、タンパク質の脱染色のために、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムと５０％のアセトニトリルで構成された溶液、及び１００％のアセトニトリル溶液を用いて行った後、５０ｍＭのジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を用いて３７℃でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を還元させ、５５ｍＭのヨードアセトアミド（ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）を用いて光遮断条件でアルキル化反応を行った後、１００％のアセトニトリル溶液を用いて脱水化過程を行った。５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムに溶解されているＬｙｓＳ／トリプシン混合プロテアーゼを使用してペプチドを製造した。抽出されたペプチドは、０．１％のギ酸で溶かし、液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＬＣ）と結合された質量分析を行った。質量分析装備はＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）を、液体クロマトグラフィーはＵｌｔｉＭａｔｅＴＭ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）を使用し、ペプチド試料は５μｌずつ注入して２５０μｌ／ｍｉｎの流速で、ＮａｎｏＬＣと連動するイオントラップ質量分析機（Ｉｏｎ ｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて分析を行った。ＬＣは、溶液Ａ（５％ジメチルスルホキシド、０．１％ギ酸）と溶液Ｂ（９５％アセトニトリル、０．１％ギ酸、５％ジメチルスルホキシド）の濃度勾配１５０分を含めて総２００分間分離し、使用する分析カラムは、Ｃ１８（２μｍ、１００Å）を充填した内径７５μｍ、外径３６０μｍ、長さ５０ｃｍの融合シリカ毛細管カラムを使用して、ペプチド混合体を分離した。分離されたペプチドは、質量分析器に注入してスペクトルデータを獲得した。オービトラップ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）ＭＳ分析は、３５０～１８００ｍ／ｚの範囲に対してイオントラップＭＳで１回のサーベイスキャン（ｓｕｒｖｅｙ ｓｃａｎ、解像度７０，０００）後に、ＨＣＤ（Ｈｉｇｈｅｒ ｅｎｅｒｇｙ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２７％ ｅｎｅｒｇｙ ｌｅｖｅｌ）方式を用いてオービトラップＭＳを用いて、２０回のＭＳ／ＭＳ（解像度１７，５００）分析を行った。２０秒の動的排除オプション（ｄｙｎａｍｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｏｐｔｉｏｎ）を通じて、重複するペプチドイオン検出を最小化した。イオントラップのＡｕｔｏ ｇａｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｔｔｉｎｇは、Ｆｕｌｌ ＭＳに対しては３Ｅ０６を、ＦＴ ＭＳ／ＭＳに対しては１Ｅ５を使用した。獲得したＲＡＷファイルを、Ａｎｄｒｏｍｅｄａアルゴリズムベースのデータベース分析ソフトウェアであるＭａｘＱｕａｎｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．６．１０．４３，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍａｘｑｕａｎｔ．ｏｒｇ／）を用いて、定性分析及び非標識定量分析を行った。システイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）にはシステインカルバミドメチル化を固定値（Ｆｉｘｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）として処理し、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）に酸化を変動値（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）として行った。タンパク質配列のデータベースは、２０１９年１０月に発表されたヒトＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅを使用し、非標識定量のために、ＭａｘＬＦＱアルゴリズムを用いてタンパク質の定量値を導出した。同定されたタンパク体を、Ｐｅｒｓｅｕｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｒｓｅｕｓ－ｆｒａｍｅｗｏｒｋ．ｏｒｇ）を用いてヒートマップ（ｈｅａｔ ｍａｐ）、クラスタリング分析及び主成分分析を行った。各クラスターのタンパク質の特徴を確認するために、ＣｌｕｅＧＯ、ＳｈｉｎｙＧＯ ｖ０．６０、ＧＳＥＡプログラムを使用した。
【0065】
定量分析を行って得たデータから、各試料に応じてタンパク質発現パターンの変化を非標識定量法を通じてタンパク質体を定量し、試料間のパターンの変化によって、タンパク質の群を４個のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）に分類した。４個のクラスターのうち、本発明の方法により収得したエキソソームであるＴ－３Ｄ－ＥＶ試料で特異的に変化するタンパク質を選別し、これを図７に示した。
【0066】
タンパク質の生物学的特徴の比較分析
本実験は、Ｔ－３Ｄ－ＥＶで特異的な特徴を有するタンパク質を発掘するために、比較群としてＴＧＦ－β３の処理なしに３Ｄ振盪培養のみを適用した群（３Ｄ－ＥＶ）及び２Ｄ培養群（２Ｄ－ＥＶ）でのタンパク質発現様相を比較分析した。図８に示したように、Ｔ－３Ｄ－ＥＶで特異的に変化するタンパク質グループは、解糖（ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ）過程、創傷治癒炎症反応関連連結組織代替、血小板形成、五炭糖リン酸経路、酸化地点などの特徴が確認され、他の比較群と明確な差が観察された。図９に示したように、更に他の生物学的特徴の比較分析も、Ｔ－３Ｄで免疫関連の特徴が観察された。
本実験は、Ｔ－３Ｄ－ＥＶで特異的な特徴を有するタンパク質を発掘するために、比較群としてＴＧＦ－β３の処理なしに３Ｄ振盪培養のみを適用した群（３Ｄ－ＥＶ）及び２Ｄ培養群（２Ｄ－ＥＶ）でのタンパク質発現様相を比較分析した。図８に示したように、Ｔ－３Ｄ－ＥＶで特異的に変化するタンパク質グループは、解糖（ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ）過程、創傷治癒炎症反応関連連結組織代替、血小板形成、五炭糖リン酸経路、酸化地点などの特徴が確認され、他の比較群と明確な差が観察された。図９に示したように、更に他の生物学的特徴の比較分析も、Ｔ－３Ｄで免疫関連の特徴が観察された。
【0067】
主成分分析
主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、各試料グループ間にどれくらい明確に分離されたかをＤｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘを用いて示す。図１０に示したデータは、試料処理方法に応じて、３回繰り返して質量分析を行った結果であって、第１主成分値の寄与率は６０．２％であり、第２主成分値の寄与率は２８．９％であった。その結果、試料処理方法に応じて、観察されたタンパク質の定性及び定量的特徴間に大きなパターンの差を確認した。また、３Ｄ－ＥＶとＴ－３Ｄ－ＥＶとの間のパターンの距離に比べて、これらと２Ｄ－ＥＶとの間の距離がさらに遠いことから見て、２Ｄ方法と３Ｄ方法との差によりタンパク質の変化が観察されるものと推測できる。
主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、各試料グループ間にどれくらい明確に分離されたかをＤｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘを用いて示す。図１０に示したデータは、試料処理方法に応じて、３回繰り返して質量分析を行った結果であって、第１主成分値の寄与率は６０．２％であり、第２主成分値の寄与率は２８．９％であった。その結果、試料処理方法に応じて、観察されたタンパク質の定性及び定量的特徴間に大きなパターンの差を確認した。また、３Ｄ－ＥＶとＴ－３Ｄ－ＥＶとの間のパターンの距離に比べて、これらと２Ｄ－ＥＶとの間の距離がさらに遠いことから見て、２Ｄ方法と３Ｄ方法との差によりタンパク質の変化が観察されるものと推測できる。
【0068】
遺伝子セット濃縮分析
遺伝子セット濃縮分析は、ＧＳＥＡモジュールを用いて行った。濃縮点数（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ）は、該当セットに含まれた遺伝子が表現型で一致する方式で有意に差別的に発現されるとき、遺伝子の予備特定化されたクラスを付与する。標準化された濃縮点数は、濃縮点数を遺伝子セット内の遺伝子の数に対して調整することによって計算した。名目上、ｐ－値は、感受性及び耐性標識を置換し、ゼロ（ｎｕｌｌ）分布を生成するために標準化された濃縮点数を再計算することによって決定される。図１１は、本分析での遺伝子セット濃縮分析の結果であって、濃縮された遺伝子セット、標準化された濃縮点数（ＮＥＳ）及びｐ－値が提示され、ＮＥＳが高く、ｐ－値が低いほど、発見が有意である可能性がさらに大きい。本分析における濃縮された遺伝子グループは、図１２に示した。
遺伝子セット濃縮分析は、ＧＳＥＡモジュールを用いて行った。濃縮点数（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ）は、該当セットに含まれた遺伝子が表現型で一致する方式で有意に差別的に発現されるとき、遺伝子の予備特定化されたクラスを付与する。標準化された濃縮点数は、濃縮点数を遺伝子セット内の遺伝子の数に対して調整することによって計算した。名目上、ｐ－値は、感受性及び耐性標識を置換し、ゼロ（ｎｕｌｌ）分布を生成するために標準化された濃縮点数を再計算することによって決定される。図１１は、本分析での遺伝子セット濃縮分析の結果であって、濃縮された遺伝子セット、標準化された濃縮点数（ＮＥＳ）及びｐ－値が提示され、ＮＥＳが高く、ｐ－値が低いほど、発見が有意である可能性がさらに大きい。本分析における濃縮された遺伝子グループは、図１２に示した。
【0069】
Ｔ－３Ｄ－ＥＶ特異的タンパク質の同定
ＴＧＦｂを添加したグループで有意に変化するタンパク質グループを見つけるために、試料間の対比較を行った。観察されたタンパク質は、３Ｄ－ＥＶと比較してＴ－３Ｄ－ＥＶで２倍以上増加又は減少し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲが０．０５以下という２つの基準下で選別した。また、Ｔ－３Ｄ試料でのみ発見されたタンパク質も含めた。選別されたタンパク質は、図１３及び図１４に示した。
ＴＧＦｂを添加したグループで有意に変化するタンパク質グループを見つけるために、試料間の対比較を行った。観察されたタンパク質は、３Ｄ－ＥＶと比較してＴ－３Ｄ－ＥＶで２倍以上増加又は減少し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲが０．０５以下という２つの基準下で選別した。また、Ｔ－３Ｄ試料でのみ発見されたタンパク質も含めた。選別されたタンパク質は、図１３及び図１４に示した。
【0070】
ＥＶ内に存在するタンパク質の分析時に、図１５に示されたように、抗酸化タンパク質及び炎症関連因子が発現されていることを確認できる。
【0071】
細胞のストレス反応の中で代表的なものが、ＲＯＳ生成及びこれによる細胞酸化還元調節ネットワークの活性化である。ＲＯＳは、フリーラジカルであって、細胞内の高分子物質であるタンパク質とＤＮＡを攻撃して構造及び活性の変化を誘導し、これによって、ＤＮＡ修理、細胞周期の調節、及び細胞の成長／死滅に関与する。
【0072】
哺乳動物には６種類の類型のペルオキシレドキシンが存在し、これらは、各種細胞及び組織に広く分布し、組織で発生するＨ２Ｏ２を除去するのに主要な抗酸化タンパク質として作用する。チオレドキシンシステムは、このようにＲＯＳなどによって誘発されたストレスを解消するために作動する代表的な細胞内防御体系であって、活性酸素によって酸化したタンパク質を可逆的酸化還元反応で復旧させるＲＯＳスカベンジャーとしての機能と共に、様々な細胞防御システムに広範囲に関与するところ、細胞の生存誘導因子としてだけでなく、抗アポトーシス（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）、抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）及び免疫調節（ｉｍｍｕｎｏ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）因子としても作用して、細胞の防御体系を管掌する核心タンパク質として知られている。このような抗酸化タンパク質であるペルオキシレドキシン－４（Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ－４）とチオレドキシン還元酵素（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）が、本発明の方法により収得したエキソソームであるＴ－３Ｄ－ＥＶにおいて高いレベルで発現されることを確認した（図１５）。
【0073】
また、Ｔ－３Ｄ－ＥＶにおいてＣＯＸ－２の発現も高いものと示された（図１５）。一般に、炎症反応は、外部から物理的、化学的刺激や細菌の感染に対する生体組織の防御反応の一つであり、損傷した組織を修復又は再生しようとするメカニズムである。体内で炎症反応が起こると、大食細胞のような炎症細胞は、一酸化窒素（ＮＯ）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α，ＴＮＦ－α）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）など炎症媒介物質を分泌する。ＰＧＥ２の合成は、ホスホリパーゼＡ２によって膜リン脂質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）からアラキドン酸が作られることから始まる。アラキドン酸は、酵素作用によってプロスタグランジンＧ２となり、再び不安定な代謝産物であるプロスタグランジンＨ２となるが、これらの２つの過程は、ＣＯＸ（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）によって促進される。ＣＯＸは、２種類以上の同位酵素（ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ）が存在するが、これらのうちＣＯＸ－１は、持続的に発現して血小板の凝集、胃粘膜の保護、腎機能の調節などの生理的機能を担当し、ＣＯＸ－２は、炎症などの刺激によって発現し、ＣＯＸ－２によって生成されたプロスタグランジンが炎症反応及び細胞増殖に関与すると知られている。したがって、ＣＯＸ－２がＴ－３Ｄ－ＥＶで高く発現されることは、本発明のエキソソームを免疫関連細胞に処理したときに、炎症反応の調節に関与するためであると判断される。
【0074】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は、単に好ましい具現例に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲及びその等価物によって定義されるといえる。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【手続補正書】
【提出日】2022-12-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0054】
【図2】各培養条件によるエキソソームの収率を示した図である。
【図3】ＴＧＦ－βの処理によるＰＤＩ値の変化を示す図であって、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養の条件では単一のピーク（ｏｎｅ ｐｅａｋ）が現れることを示す。
【図4A】ＴＧＦ－βがＴ細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。それぞれ、ＰＨＡを用いてＰＢＭＣの増殖を誘発した後、陰性対照群（無処理群）、陽性対照群（ＭＳＣ処理群）、３Ｄ振盪培養の条件のみを適用したエキソソーム（３Ｄ－ＥＶ）、３Ｄ振盪培養の条件下でＴＧＦ－β３を培養液に添加して得られたエキソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）のＴ細胞抑制効果を確認した（図４Ａ）。
【図4B】ＴＧＦ－βがＴ細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。それぞれ、ＰＨＡを用いてＰＢＭＣの増殖を誘発した後、陰性対照群（無処理群）、陽性対照群（ＭＳＣ処理群）、３Ｄ振盪培養の条件のみを適用したエキソソーム（３Ｄ－ＥＶ）、３Ｄ振盪培養の条件下でＴＧＦ－β３を培養液に添加して得られたエキソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）のＴ細胞抑制効果を確認した。その結果、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養の条件を通じて収得したエキソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）が最も著しいＴ細胞抑制効果を有することが確認されて、本発明の方法により収得されたエキソソームは、収率だけでなく機能も強化されたことを示す（図４Ｂ）。
【図4C】ＴＧＦ－βがＴ細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。それぞれ、ＰＨＡを用いてＰＢＭＣの増殖を誘発した後、陰性対照群（無処理群）、陽性対照群（ＭＳＣ処理群）、３Ｄ振盪培養の条件のみを適用したエキソソーム（３Ｄ－ＥＶ）、３Ｄ振盪培養の条件下でＴＧＦ－β３を培養液に添加して得られたエキソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）のＴ細胞抑制効果を確認した。その結果、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養の条件を通じて収得したエキソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）が最も著しいＴ細胞抑制効果を有することが確認されて、本発明の方法により収得されたエキソソームは、収率だけでなく機能も強化されたことを示す（図４Ｃ）。
【図5A】動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）分析を通じてエキソソームの大きさを調査した結果を示す図である。
【図5B】エキソソームの形態及び構造を透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した結果である。
【図5C】ＣＤ９、ＣＤ６３、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１及びＡｌｉｘの発現を確認するためのウエスタンブロッティング分析の結果を示す。
【図5D】流細胞分析を通じてエキソソームの表面の免疫表現型分析を行った結果を示す。
【図7】クラスタリング分析を通じて導出された４個のクラスターのうち、本発明の方法により収得したエキソソームであるＴ－３Ｄ－ＥＶ試料において特異的に変化するタンパク質を示す図である。
【図8】本発明のエキソソームで特徴的な発現様相を示すタンパク質の生物学的特徴を比較分析した結果を示す。
【図9】導出された３つのクラスターのタンパク質の生物学的機能及びその免疫関連の特徴を示す図である。
【図10】主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を通じて各グループ間の分離の程度をＤｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘを用いて示した結果を示す。
【図11】遺伝子セット濃縮分析の結果であって、濃縮された遺伝子セット、標準化された濃縮点数（ＮＥＳ）及びｐ－値をそれぞれ示す。
【図12】本発明で濃縮された遺伝子グループを示した図である。
【図15】本発明の方法により収得したエキソソームにおいて炎症関連タンパク質の発現様相を示す図である。
【国際調査報告】