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特表2023-524013家族性高コレステロール血症及び上昇した低密度リポタンパク質コレステロールの治療のための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-08
(54)【発明の名称】家族性高コレステロール血症及び上昇した低密度リポタンパク質コレステロールの治療のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20230601BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230601BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20230601BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230601BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20230601BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20230601BHJP
A61K 9/16 20060101ALI20230601BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20230601BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20230601BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20230601BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20230601BHJP
A61K 47/14 20170101ALI20230601BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20230601BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230601BHJP
A61K 31/197 20060101ALI20230601BHJP
A61K 31/397 20060101ALI20230601BHJP
A61K 31/40 20060101ALI20230601BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230601BHJP
A61K 31/445 20060101ALI20230601BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20230601BHJP
A61K 35/407 20150101ALI20230601BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230601BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088
C12N5/10
A61K31/711
A61P43/00 121
A61K31/7105
A61K9/127
A61K9/16
A61K9/51
A61K47/24
A61K47/18
A61K47/28
A61K47/14
A61K47/34
A61K47/26
A61K31/197
A61K31/397
A61K31/40
A61K39/395 N
A61K31/445
A61P3/06
A61K35/407
C12N15/12 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022565934
(86)(22)【出願日】2021-04-29
(85)【翻訳文提出日】2022-10-27
(86)【国際出願番号】 US2021030006
(87)【国際公開番号】W WO2021222653
(87)【国際公開日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】63/017,424
(32)【優先日】2020-04-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522418635
【氏名又は名称】サリオジェン セラピューティクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヒギンズ、ジョセフ、ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】マクミラン、スコット
(72)【発明者】
【氏名】タビビアザール、レイ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4C086
4C087
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA19
4C076AA31
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB13
4C076CC21
4C076DD46H
4C076DD49H
4C076DD63H
4C076DD67H
4C076DD70H
4C076EE24H
4C085AA14
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4C085DD62
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4C085GG02
4C086AA01
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4C086BC05
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4C086MA65
4C086MA66
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZC33
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB52
4C087BB65
4C087MA02
4C087MA17
4C087MA65
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZC33
4C087ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206FA47
4C206MA03
4C206MA05
4C206MA37
4C206MA85
4C206MA86
4C206NA05
4C206NA14
4C206ZC33
4C206ZC75
(57)【要約】
患者における総コレステロール及び／または低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）を低下させ、それによって家族性高コレステロール血症を治療または緩和するために、超低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＶＬＤＬＲ）及び低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＬＤＬＲ）を標的とするための遺伝子療法組成物及び方法が提供される。
【選択図】図１３Ｃ
【選択図】図１３Ｃ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子導入構築物を含む組成物であって、（ａ）超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）タンパク質もしくは低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質またはその機能的断片をコードする核酸と、
（ｂ）肝臓特異的プロモーターと、
（ｃ）１つ以上のトランスポザーゼ認識部位、及び１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）または端部配列を含む、非ウイルスベクターと、を含む、前記組成物。
【請求項2】
前記遺伝子導入構築物がＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記遺伝子導入構築物が、コドン最適化されている、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＶＬＤＬＲタンパク質が、ヒトＶＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記ヒトＶＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片をコードする前記核酸が、配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記ヒトＶＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片をコードする前記核酸が、配列番号４のヌクレオチド配列もしくは配列番号５のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＬＤＬＲタンパク質が、ヒトＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
前記ヒトＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片をコードする前記核酸が、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記ヒトＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片をコードする前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記ヒトＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片が、配列番号３のアミノ酸配列と比較して、Ｌ１８Ｆ、Ｋ８３０Ｒ、及びＣ８３９Ａから選択される１つ以上の変異を含む、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項11】
前記肝臓特異的プロモーターが、ＬＰ１プロモーター、任意選択的に、ヒトＬＰ１プロモーターであるか、または前記肝臓特異的プロモーターが、表１のプロモーターである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項12】
前記ＬＰ１プロモーターが、以下を含む、請求項１１に記載の組成物：（ａ）ヒトアンチトリプシンプロモーター、ヒトＡｐｏＥ／ＨＣＲ１エンハンサー、及び／またはＳＶ４０イントロン、及び／または
（ｂ）配列番号１５の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアント。
【請求項13】
前記非ウイルスベクターが、ＤＮＡプラスミドであり、任意選択的に、前記ＤＮＡプラスミドが、そばにある遺伝子の活性化または不活性化を防止または緩和する１つ以上のインスレーター配列を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項14】
前記ＩＴＲもしくは前記端部配列が、任意選択的に、ＴＴＡＡ反復性配列を含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンのものであり、及び／または前記ＩＴＲもしくは前記端部配列が、前記ＶＬＤＬＲタンパク質もしくはＬＤＬＲタンパク質をコードする前記核酸、もしくはその機能的断片に隣接する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項15】
プロタンパク質変換酵素サブチリシンケキシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｋｅｘｉｎ）９（ＰＣＳＫ９）を標的とするマイクロＲＮＡをコードする核酸構築物を更に含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項16】
前記トランスポザーゼをコードする核酸構築物、任意選択的に、前記トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡを更に含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項17】
前記トランスポザーゼが、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓに由来する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
トランスポザーゼをコードする核酸構築物、任意選択的に、前記トランスポザーゼをコードするＤＮＡを更に含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項19】
前記トランスポザーゼが、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来し、及び／またはその操作されたバージョンであり、及び／または前記トランスポザーゼが、前記ＩＴＲもしくは前記端部配列を特異的に認識する、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項20】
前記組成物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態にある、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項21】
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルアミノエタン－カルバモイルと混合されたカチオン性コレステロール誘導体（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、トリオレイン（トリオレイン酸グリセリル）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［カルボキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ ２Ｋ）、及び１，２－ジステアロール（ｄｉｓｔｅａｒｏｌ）－ｓｎ－グリセロール－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）から選択される１つ以上の脂質を含み、及び／または、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、及びポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、及びＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から選択される１つ以上の分子を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項22】
前記組成物が、追加の治療剤を含み、前記追加の治療剤が、任意選択的に、スタチン、エゼチミブ、胆汁酸結合樹脂、エボロクマブ、インクリシラン、ロミタピド、及びミポメルセンのうちの１つ以上から選択され、前記スタチンが、任意選択的に、アトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ）、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ）、ロバスタチン（ＡＬＴＯＣＯＲ、ＡＬＴＯＰＲＥＶ、ＭＥＶＡＣＯＲ）、ピタバスタチン（ＬＩＶＡＬＯ）、プラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ）、ロスバスタチンカルシウム（ＣＲＥＳＴＯＲ）、及びシンバスタチン（ＺＯＣＯＲ）のうちの１つ以上である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項23】
請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物を含む、単離された細胞。
【請求項24】
患者における総コレステロール及び／または低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）を低下させるための方法であって、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項25】
患者における総コレステロール及び／または低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）を低下させるための方法であって、（ａ）患者から得られた細胞を、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物と接触させることと、
（ｂ）前記細胞をそれを必要とする患者に投与することと、を含む、前記方法。
【請求項26】
前記方法が、前記患者の心血管の健康を改善する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項27】
前記方法が、前記投与を行わない総コレステロール及び／またはＬＤＬ－Ｃのレベルと比較して、総コレステロール及び／またはＬＤＬ－Ｃを約４０％超、または約５０％超、または約６０％超、または約７０％超、または約８０％超、または約９０％超低下させることを提供する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項28】
前記方法が、血清ＬＤＬ－Ｃレベルを約５００ｍｇ／ｄＬ未満（約１３ｍｍｏｌ／Ｌ未満）まで低下させる、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項29】
前記方法が、ステロイド治療の不在下で実施される、請求項２４～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記方法が、実質的に非免疫原性である、請求項２４～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
総コレステロール及び／またはＬＤＬ－Ｃを前記低下させることが、恒久的である、請求項２４～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記方法が、単回投与を必要とする、請求項２４～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記方法が、肝細胞におけるＬＤＬ代謝を刺激及び／または増加させる、請求項２４～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
任意選択的に、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物、及び／または、ＰＣＳＫ９を標的とするマイクロＲＮＡをコードする核酸構築物、を投与することを更に含む、請求項２４～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記細胞を、任意選択的に、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物、及び／または、
ＰＣＳＫ９を標的とするマイクロＲＮＡをコードする核酸構築物、と接触させることを更に含む、請求項２４～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記投与することが、静脈内である、請求項２４～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記方法が、家族性高コレステロール血症、一般的な高コレステロール血症、増加したトリグリセリド、インスリン抵抗性、または代謝症候群を治療する、請求項２４～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記投与することが、肝臓への、任意選択的に、門脈内血管または肝臓実質へのものである、請求項２４～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）もしくは前記低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＬＤＬＲ）、またはその機能的断片をコードする前記核酸対トランスポザーゼをコードする前記核酸構築物の比が、約５：１、または約４：１、または約３：１、または約２：１、または約１：１、または約１：２、または約１：３、または約１：４、または約１：５である、請求項３４～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）もしくは低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＬＤＬＲ）、またはその機能的断片をコードする前記核酸対トランスポザーゼをコードする前記核酸構築物の前記比が、約２：１である、請求項３４～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
ＰＣＳＫ９を標的とするｍｉＲＮＡをそれを必要とする前記患者に投与することを更に含む、請求項２４～４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
追加の治療剤をそれを必要とする前記患者に投与することを含み、前記追加の治療剤が、任意選択的に、スタチン、エゼチミブ、胆汁酸結合樹脂、エボロクマブ、インクリシラン、ロミタピド、及びミポメルセンのうちの１つ以上から選択される、請求項２４～４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
前記スタチンが、アトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ）、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ）、ロバスタチン（ＡＬＴＯＣＯＲ、ＡＬＴＯＰＲＥＶ、ＭＥＶＡＣＯＲ）、ピタバスタチン（ＬＩＶＡＬＯ）、プラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ）、ロスバスタチンカルシウム（ＣＲＥＳＴＯＲ）、及びシンバスタチン（ＺＯＣＯＲ）のうちの１つ以上である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
家族性高コレステロール血症（ＦＨ）を治療及び／または緩和するための方法であって、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項45】
家族性高コレステロール血症（ＦＨ）を治療及び／または緩和するための方法であって、（ａ）患者から得られた細胞を、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物と接触させることと、
（ｂ）前記細胞をそれを必要とする患者に投与することと、を含む、前記方法。
【請求項46】
前記ＦＨが、ホモ接合型ＦＨ（ＨｏＦＨ）またはヘテロ接合型ＦＨ（ＨｅＦＨ）である、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項47】
前記ＦＨが、ＡＰＯＢ、ＬＤＬＲ、及びＰＣＳＫ９のうちの１つ以上における１つ以上の変異を特徴とする、請求項４４～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
前記方法が、冠動脈疾患（ＣＡＤ）を治療及び／または緩和する、請求項４４～４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項49】
スタチン、エゼチミブ、胆汁酸結合樹脂、エボロクマブ、インクリシラン、ロミタピド、及びミポメルセンのうちの１つ以上を投与することを更に含む、請求項４４～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項50】
前記方法が、スタチン、エゼチミブ、胆汁酸結合樹脂、エボロクマブ、インクリシラン、ロミタピド、及びミポメルセンのうちの１つ以上での治療の必要性を排除する、請求項４４～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
前記方法が、ＬＤＬアフェレシスの必要性を排除する、請求項４４～５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記方法が、ステロイド治療の必要性を排除する、請求項４４～５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項53】
前記方法が、前記患者の心血管の健康を改善する、請求項４４～５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項54】
前記方法が、実質的に非免疫原性である、請求項４４～５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項55】
前記治療及び／または緩和が、恒久的である、請求項４４～５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項56】
前記方法が、単回投与を必要とする、請求項４４～５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項57】
前記方法が、肝細胞におけるＬＤＬ代謝を刺激及び／または増加させる、請求項４４～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
任意選択的に、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、もしくはＸｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物、及び／またはＰＣＳＫ９を標的とするマイクロＲＮＡをコードする核酸構築物、を投与することを更に含む、請求項４４～５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項59】
前記投与することが、静脈内である、請求項４４～５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
前記投与することが、肝臓への、任意選択的に、門脈内血管または肝臓実質へのものである、請求項４４～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
前記細胞を、任意選択的に、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物と接触させることを更に含む、請求項４４～５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項62】
前記超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）もしくは前記低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＬＤＬＲ）、またはその機能的断片をコードする前記核酸対トランスポザーゼをコードする前記核酸構築物の前記比が、約５：１、または約４：１、または約３：１、または約２：１、または約１：１、または約１：２、または約１：３、または約１：４、または約１：５である、請求項５８または６１に記載の方法。
【請求項63】
前記超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）もしくは低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＬＤＬＲ）、またはその機能的断片をコードする前記核酸対トランスポザーゼをコードする前記核酸構築物の前記比が、約２：１である、請求項５８または６１に記載の方法。
【請求項64】
ＰＣＳＫ９を標的とするｍｉＲＮＡを投与することを更に含む、請求項４４～６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項65】
追加の治療剤をそれを必要とする前記患者に投与することを含み、前記追加の治療剤が、任意選択的に、スタチン、エゼチミブ、胆汁酸結合樹脂、エボロクマブ、ロミタピド、及びミポメルセンのうちの１つ以上から選択される、請求項４４～６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項66】
前記スタチンが、アトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ）、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ）、ロバスタチン（ＡＬＴＯＣＯＲ、ＡＬＴＯＰＲＥＶ、ＭＥＶＡＣＯＲ）、ピタバスタチン（ＬＩＶＡＬＯ）、プラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ）、ロスバスタチンカルシウム（ＣＲＥＳＴＯＲ）、及びシンバスタチン（ＺＯＣＯＲ）のうちの１つ以上である、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
遺伝子導入構築物を含む組成物であって、（ａ）超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）もしくは低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＬＤＬＲ）またはその機能的断片をコードする核酸であって、前記ＶＬＤＬＲが、配列番号４のヌクレオチド配列もしくはそれに対して約９０％の同一性のバリアント、または配列番号５のヌクレオチド配列もしくはそれに対して約９０％の同一性のバリアントを含む、前記核酸と、
（ｂ）肝臓特異的プロモーターであって、前記肝臓特異的プロモーターが、配列番号１５の核酸配列を有するヒトＬＰ１プロモーター、またはそれに対して少なくとも約９０％の同一性を有するバリアントである、前記肝臓特異的プロモーターと、
（ｃ）１つ以上のトランスポザーゼ認識部位、及び１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）または端部配列を含む、非ウイルスベクターと、を含む、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、上昇した低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）に関連する疾患及び状態を治療及び／または緩和するための方法、組成物、及び製品に部分的に関連する。
【0002】
優先権
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０２０年４月２９日出願の米国仮特許出願第６３／０１７，４２４号の優先権及び利益を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０２０年４月２９日出願の米国仮特許出願第６３／０１７，４２４号の優先権及び利益を主張する。
【0003】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に本明細書とともに提出されたＡＳＣＩＩ形式の配列表を含む。２０２１年４月２８日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＳＡＬ－００１ＰＣ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、７５，５１５バイトのサイズである。配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に本明細書とともに提出されたＡＳＣＩＩ形式の配列表を含む。２０２１年４月２８日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＳＡＬ－００１ＰＣ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、７５，５１５バイトのサイズである。配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
家族性高コレステロール血症（ＦＨ）は、最も頻度の高い脂質異常症のうちの１つであり、出生以来の、高濃度の総リポタンパク質コレステロール及び低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）を特徴とする、常染色体優性疾患である。これは、１：２００～１：２５０人の頻度で、加速したアテローム性動脈硬化症及び若年性冠動脈性心臓疾患をもたらす生命を脅かす状態である。Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ ２０１１；５：Ｓ９－１７、Ｔａｌｍｕｄ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ ２０１４；２５：２７４－８１を参照されたい。
【0005】
コレステロールは、必須の細胞構成要素であり、コレステロール恒常性の維持は、正常な生理学的機能にとって重要である。血漿コレステロールの上昇したレベルは、様々な病理学的状態、最も顕著には、高コレステロールレベルが泡沫細胞形成及び動脈内のプラーク蓄積をもたらし、潜在的に心臓発作または脳卒中を生じる冠動脈性心臓疾患に関連する。細胞コレステロール代謝及び血漿コレステロールレベルの調節は、特定の細胞への、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体によって媒介されるＬＤＬ取り込みに依存する。ＬＤＬは、血液中のコレステロールの主要な担体であり、総血漿コレステロールのうちの６０％超を占める。ＬＤＬは、ａｐｏＢ－１００－ＬＤＬ受容体相互作用によって引き起こされる、受容体によって媒介されるエンドサイトーシスを通じて、肝組織及び肝外組織によって取り込まれる。取り込まれたＬＤＬ粒子は、リソソームに輸送され、リソソームにおいて遊離コレステロールとアミノ酸とに分解される。ヒトにおいて、肝臓は、ＬＤＬ異化及びＬＤＬ受容体活性のための最も重要な臓器である。肝臓における薬理学的介入によって、ＬＤＬを調節することができる。肝組織によるＬＤＬ取り込みの基礎となる機序は、明確には理解されていない。したがって、ＬＤＬ取り込み及びその調節は、アテローム性動脈硬化症及び関連疾患の重要な治療標的である。
【0006】
ＦＨは、最も深刻な一般的に遺伝性の代謝疾患のうちの１つに相当する。高い有病率にもかかわらず、ＦＨは、依然としてあまり診断が確定されておらず、治療されていない。ＦＨのうちの推定７０％～９５％は、３つの遺伝子（ＡＰＯＢ、ＬＤＬＲ、プロタンパク質変換酵素サブチリシンケキシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｋｅｘｉｎ）９（ＰＣＳＫ９））のうちの１つにおけるヘテロ接合型病原バリアントから生じる。低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＬＤＬＲ）における変異は、症例のうちの９０％超の原因である。ＬＤＬＲは、低密度リポタンパク質－コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）のエンドサイトーシスに関与する細胞表面タンパク質受容体である。ＬＤＬ－Ｃが細胞膜で結合した後、細胞によって取り込まれ、リソソームに輸送され、リソソームにおいてタンパク質部分が分解され、コレステロール分子がネガティブフィードバックを介して更なるコレステロール合成を抑制する。ＬＤＬＲ遺伝子における病原バリアントは、細胞内で産生されるＬＤＬ受容体の数を減少させるか、またはＬＤＬ－Ｃに結合する受容体の能力を妨害するかのいずれかである。ＬＤＬＲ遺伝子におけるホモ接合型ＦＨ（ＨｏＦＨ）及びヘテロ接合型ＦＨ（ＨｅＦＨ）病原バリアントは、高レベルの血漿ＬＤＬ－Ｃ及びアテローム性動脈硬化症を引き起こす。
【0007】
ホモ接合型ＦＨは、３つの遺伝子（ＡＰＯＢ、ＬＤＬＲ、ＰＣＳＫ９）のうちの１つにおける二対立遺伝子（ホモ接合型または複合ヘテロ接合型）病原バリアントから生じる。当初、１：１，０００，０００で影響を及ぼすと記載されていたＨｏＦＨは、現在では、１：１６０，０００～１：２５０，０００の有病率を有すると推定されている。Ｃｕｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ ２０１４；３５：２１４６－５７．ＨｏＦＨを有するほとんどの個人は、２０代半ばまでに重度の冠動脈疾患（ＣＡＤ）を経験する。１０代での死亡または冠動脈バイパス手術のいずれかの割合は高く、重度の大動脈弁狭窄も一般的である。
【0008】
ＦＨの従来の治療は、典型的には、複数の薬理学的薬剤を伴う。例えば、スタチン医薬品は、ＨｅＦＨ患者を助けることができるが、特に、ＨｏＦＨを有する個人にとっては、多くの場合応答が減衰し、不十分であり得る。スタチンの有効性は、肝臓における機能的ＬＤＬ受容体の上方制御に大きく依存するので、ＨｏＦＨの治療において比較的効果的ではない場合がある。また、一部の患者は、スタチン不耐症を有する。ＨｏＦＨを有する個体では、ＬＤＬ受容体の両方のコピーの活性が不在であるか、または著しく低減しており、ＨｏＦＨの療法は、多くの場合、複数の他の医薬品の使用に加えてＬＤＬアフェレシス（機械的濾過）を必要とする。ＬＤＬアフェレシスは、多くの場合、若い年齢から必要とされ、この手順を提供する施設の数が限定的なことによって、ＬＤＬアフェレシスの使用は深刻な問題である。いくつかの重症症例では、ＦＨ患者は、肝臓移植を受ける。
【0009】
ＦＨ及び上昇したＬＤＬ－Ｃを有する患者の治療のためのいくつかの医薬品が存在し、ロミタピド、ミポマーセン（Ｋｙｎａｍｒｏ）、及びプロタンパク質変換酵素サブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）阻害剤（例えば、インクリシラン、エボロクマブ（Ｒｅｐａｔｈａ）、アリロクマブ（Ｐｒａｌｕｅｎｔ））が挙げられる。しかしながら、現在の努力にもかかわらず、ＬＤＬ－Ｃレベル及び関連する心血管罹患率及び死亡率は、ＦＨ患者において高いままである。ＦＨは、多くの場合、脂質低下薬物療法を生涯にわたって必要とし、患者及び医療制度に負担となる。
【0010】
したがって、患者におけるＬＤＬ－Ｃを低下させ、それによって患者の心血管の健康を改善するための改善された組成物及び方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【0011】
本発明は、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）または上昇したＬＤＬ－Ｃを有する患者における心血管事象を治療及び／または緩和するための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物及び方法は、配列特異的または遺伝子座特異的転移（ＳＬＳＴ）を使用して、ＬＤＬＲ遺伝子変異または上昇したＬＤＬ－Ｃを有する患者における脂質代謝を補正する、トランスポゾン発現ベクターを含む遺伝子導入構築物を使用する。この方式では、本発明は、ホモ接合型ＦＨ（ＨｅＦＨ）、ヘテロ接合型ＦＨ（ＨｏＦＨ）患者、及び上昇したＬＤＬ－Ｃを有する患者における、肝細胞におけるＬＤＬ代謝を元に戻すための方式を提供する。本発明は、家族性高コレステロール血症、一般的な高コレステロール血症、増加したトリグリセリド、インスリン抵抗、代謝症候群、及び総コレステロールの上昇したレベルを特徴とする他の疾患を治療するために使用することができる。
【0012】
したがって、いくつかの態様では、（ａ）超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）タンパク質もしくは低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質またはその機能的断片をコードする核酸と、（ｂ）肝臓特異的プロモーターと、（ｃ）１つ以上のトランスポザーゼ認識部位及び１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）または端部配列を含む非ウイルスベクターと、を含む、遺伝子導入構築物を含む組成物が提供される。実施形態では、これらの構築物は、ＰＣＳＫ９ｍｉＲＮＡと組み合わせて、ＰＣＳＫ９の肝合成を低減し、ＬＤＬ及びＶＬＤＬ受容体の両方を上方制御することができる。遺伝子導入は、機能的ＶＬＤＬＲまたはＬＤＬＲの安定的な部位特異的ゲノム組み込みを可能にする。本発明の遺伝子導入構築物は、総コレステロールレベルを低下させて、それによってＦＨ及びその症状を治療及び／または緩和し、患者の全体的な心血管の健康を改善することを可能にする。
【0013】
本開示による遺伝子療法は、導入される遺伝子と同じベクター（シス）上、または異なるベクター（トランス）上に提供されるトランスポザーゼによる補助を用いる、トランスポゾンに基づくベクター系を使用して実施することができる。トランスポゾンに基づくベクター系は、肝臓特異的プロモーターの制御下で動作することができる。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ＬＰ１プロモーターである。ＬＰ１プロモーターは、ヒトＬＰ１プロモーターであり得、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＮａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ｖｏｌ．１０７（７）（２００６）：２６５３－６１に記載されているように構築することができる。実施形態では、ＬＰ１プロモーターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ｖｏｌ．１０７（７）（２００６）：２６５３－６１に記載されており、例えば、Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．の図Ｓ１を参照されたい。
【0014】
実施形態では、例えば、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンであるものが、遺伝子導入構築物のＰＣＳＫ９サイレンシングｍｉＲＮＡを含むかまたは含まないＶＬＤＬＲまたはＬＤＬＲ遺伝子を患者のゲノムに挿入するために使用される（したがって、本明細書では、ＰＣＳＫ９サイレンシングｍｉＲＮＡを含むかまたは含まないＶＬＤＬＲまたはＬＤＬＲ遺伝子構築物は、時折、トランスポゾンと称される）。
【0015】
実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアント、ならびにＬ５７３Ｘ、Ｅ５７４Ｘ、及びＳ２Ｘから選択される１つ以上の変異を含む、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓトランスポザーゼ（ＭＬＴ、またはＭＬＴトランスポザーゼ）であり、Ｘが、任意のアミノ酸または非アミノ酸であり、任意選択的に、Ｘが、Ａ、Ｇ、または欠失である。実施形態では、変異は、Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａである。
【0016】
実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｌ５７３Ｘ、Ｅ５７４Ｘ、及びＳ２Ｘから選択される１つ以上の変異を有する。いくつかの実施形態では、Ｘは、任意のアミノ酸または非アミノ酸である。
【0017】
実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、変異Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａ、加えて、高活性を付与する１つ以上の変異（または高活性変異）を有する、アミノ酸配列を含む。実施形態では、高活性変異は、Ｓ８Ｘ、Ｃ１３Ｘ、及びＮ１２５Ｘ変異のうちの１つ以上であり、Ｘが、任意選択的に、任意のアミノ酸または非アミノ酸であり、任意選択的に、Ｘが、Ｐ、Ｒ、またはＫである。実施形態では、変異は、Ｓ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋである。いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異を有する。いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｎ１２５Ｋ変異を有する。いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋ変異の３つ全てを有する。
【0018】
記載の組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用して宿主細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、中性または構造的脂質（例えばＤＳＰＣ）、カチオン性脂質（例えばＭＣ３）、コレステロール、ＰＥＧ共役脂質（ＣＤＭ－ＰＥＧ）、及び標的化リガンド［例えばＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）］から選択される１つ以上の分子を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、または他の脂質受容体が減少したかまたは不在の肝細胞への、アシアロ糖タンパク質（Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）受容体（ＡＳＧＰＲ）によって媒介される取り込みのためのＧａｌＮＡｃまたは別のリガンドを含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、インビボまたはエクスビボ方法であり得る、患者における総コレステロール及び／またはＬＤＬ－Ｃを低下させるための方法が提供される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の実施形態による組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、患者における総コレステロール及び／またはＬＤＬ－Ｃを低下させるためのエクスビボ方法は、（ａ）患者から得られた細胞を、記載の組成物と接触させることと、（ｂ）細胞をそれを必要とする患者に投与することと、を含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、インビボまたはエクスビボでも実施することができる、上昇したＬＤＬーＣを治療及び／または緩和するための方法が提供される。上昇したＬＤＬ－Ｃを治療及び／または緩和するための方法は、ＦＨを治療及び／または緩和することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、本開示の実施形態よる組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＦＨを治療及び／または緩和するための方法は、（ａ）患者から得られた細胞を、本開示の組成物と接触させることと、（ｂ）細胞をそれを必要とする患者に投与することと、を含む。
【0021】
本開示の実施形態による組成物及び方法は、実質的に非免疫原性であり、いかなる管理不能な副作用も引き起こさず、場合によっては、単回投与を介して効果的に送達され得る。ＦＨの治療及び／または緩和、または総コレステロール及び／またはＬＤＬ－Ｃを低下させることは、堅牢かつ恒久的であり得る。記載の組成物及び方法は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）またはアテローム性動脈硬化症を治療及び／または緩和することを可能にする。
【0022】
本開示のいくつかの態様では、本開示の実施形態による組成物を含む単離された細胞が提供される。
【0023】
本発明の詳細は、以下の添付の説明に記載される。本明細書に記載の方法及び材料と同様または等価なものが、本発明の実施または試験で使用され得るが、例示的な方法及び材料がここに記載される。本発明の他の特色、目的、及び利点は、説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲では、別段文脈が明示的に示さない限り、単数形はまた、複数形を含む。別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】ヒトＬＤＲＬ遺伝子の概略図を示す。
【図2】ヒトＬＤＲＬ遺伝子ｍＲＮＡの概略図を示す。
【図3】ヒトＬＤＲＬタンパク質の概略図を示す。
【図4】本開示のいくつかの実施形態で使用される遺伝子導入構築物の概略図である。
【図5】本開示のいくつかの実施形態で使用される脂質ナノ粒子構造を示す。
【図6】ヌクレオフェクションの２４時間後のＨｕｈ７細胞のＧＦＰ発現を示し、４つのパネル（左から右）は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液キット（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、プログラムＣＡ－１３７、ＣＭ－１５０、ＣＭ－１３８、及びＥＯ－１００で得られたデータを示す。各パネルの上段は、ＧＦＰ蛍光を示し、下段は、明視野顕微鏡データを示す。
【図7】ヌクレオフェクションの４日後のＨｕｈ７細胞のＧＦＰ発現の結果を示し、４つのパネル（左から右）は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液キット、プログラムＣＡ－１３７、ＣＭ－１５０、ＣＭ－１３８、及びＥＯ－１００で得られたデータを示す。各パネルの上段は、ＧＦＰ蛍光を示し、下段は、明視野顕微鏡データを示す。
【図8】ヌクレオフェクションの２４時間後のヌクレオフェクション効率の定量化の結果：Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液キット、プログラムＣＡ－１３７（Ａ）、ＣＭ－１５０（Ｂ）、ＣＭ－１３８（Ｃ）、及びＥＯ－１００（Ｄ）で得られたデータを示す。各図の上段は、ＧＦＰ蛍光を示し、下段は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）プロットを示す。
【図9-1】以下のように、トランスフェクションの７日後の異なる条件下でトランスフェクトされたＨｕｈ７細胞のＦＡＣＳプロットを示す。（Ａ）プログラム無し 陰性アッセイ対照、（Ｂ）ｐｍａｘＧＦＰ－陽性アッセイ対照、（Ｃ）ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰプラスミド（すなわち、ＬＰ１プロモーター、超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）遺伝子、及び向上されたＰＧＫプロモーターによって駆動された発現（ｅＧＦＰ）を含むプラスミド）。
【図9-2】（Ｄ）ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ＋ＭＬＴ１、（Ｅ）ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ＋ＭＬＴ２、（Ｆ）ＭＬＴ１、（Ｇ）ＭＬＴ２。
【図10】ＶＬＤＬＲプラスミド及びＭＬＴトランスポザーゼ２で治療されたＨｕｈ７細胞に対する治療されていないＨｕｈ７細胞のＬＤＬ－Ｃ取り込みを示す。
【図11】変動する条件下：治療されていないＨｕｈ７細胞；ＬＰ１－ｈＶＬＤＲＬドナー及びＭＬＴトランスポザーゼで治療されたＨｕｈ７細胞；ＬＰ１－ｈＶＬＤＲＬ＋ＰＧＫ－ＧＦＰドナー及びＭＬＴトランスポザーゼで治療されたＨｕｈ７細胞；Ｈｕｈ７細胞は、ドナーで治療されていない（「ドナーなし」）；ドナー（ＬＰ１－ｈＶＬＤＲＬ）のみで治療されたＨｕｈ７細胞「ドナーのみ」；ドナー（ＬＰ１－ｈＶＬＤＲＬ＋ＰＧＫ－ＧＦＰ）のみで治療されたＨｕｈ７細胞「ドナーのみ」；ＨＥＫ２９３細胞、でのＶＬＤＬＲ発現のＲＴ ｑＰＣＲ結果を示す。
【図12】本開示のいくつかの実施形態で使用される遺伝子導入構築物（ＤＮＡドナープラスミド）の概略図である。
【図13】図１２の遺伝子導入構築物を使用した、トランスポザーゼ（ＭＬＴ１及びＭＬＴ２）を用いた（「トランスポザーゼ＋」）、及び用いない（「トランスポザーゼ－」）アッセイでの、Ｈｕｈ７細胞におけるＧＦＰ発現の画像及びＦＡＣＳプロットである。Ａ、Ｂ、及びＣは、それぞれ、２４時間（Ａ）、７２時間（Ｂ）、及び７日（Ｃ）でのトランスポザーゼ－アッセイ（上）及びトランスポザーゼ＋アッセイ（下）のデータを示す。
【図14】ヌクレオフェクトされていない（治療されていない）ＨＥＫ２９３及びＨｕｈ７細胞におけるベースラインＬＤＬ取り込みを示す。Ａは、ＬＤＬ取り込みのみの治療されていないＨＥＫ２９３細胞を示し、Ｂは、ＬＤＬ取り込みのみの治療されていないＨｕｈ７細胞を示し、Ｃは、染色されていない治療されていないＨＥＫ２９３細胞を示し、Ｄは、染色されていない治療されていないＨｕｈ７細胞を示す。
【図15】転移されていないＨｕｈ７細胞に対する転移されたＨｕｈ７細胞におけるＬＤＬ取り込みを示す。比較のために、Ａは、転移されていない（トランスポザーゼ－）ＨＥＫ２９３細胞を示し、Ｂは、転移されていない（トランスポザーゼ－）Ｈｕｈ７細胞を示し、Ｃは、ヒトＬＰ１－ＶＬＤＬＲプラスミド（ｐＶＬＤＬＲ）でヌクレオフェクトされた転移されていない（トランスポザーゼ－）Ｈｕｈ７細胞を示し、Ｄは、ヒトＬＰ１－ＶＬＤＬＲプラスミド（ｐＶＬＤＬＲ）でヌクレオフェクトされた、ＭＬＴ１で転移されたＨｕｈ７細胞を示し、Ｅは、ヒトＬＰ１－ＶＬＤＬＲプラスミド（ｐＶＬＤＬＲ）でヌクレオフェクトされた、ＭＬＴトランスポザーゼ２で転移されたＨｕｈ７細胞を示す。
【図16】３日目（Ａ）及び５日目（Ｂ）の動物コホート１（表７に記載）の全身生物発光撮像（ＢＬＩ）を示す。
【図17A】３日目の動物コホート２（表８に記載）のＢＬＩを示す。
【図17B】５日目の動物コホート２（表８に記載）のＢＬＩを示す。
【図18A】３日目の動物コホート３（表９に記載）のＢＬＩを示す。
【図18B】５日目の動物コホート３（表９に記載）のＢＬＩを示す。
【図19】長期維持（それぞれ２６日及び３３日）後の動物群６及び動物群８に属する動物からのＢＬＩを示す。
【図20】左パネル－ＬＮＰ中用量（２５０ｕＬ）（ｌｄｌｒ－／－）を投与した２６日目の動物シリアル番号６００１（表８）からのＢＬＩ、右パネル－ＬＮＰ低用量（１２５ｕＬ）（ｌｄｌｒ－／－）を投与した２６日目の動物シリアル番号８００２（表９）からのＢＬＩを示す。
【図21A】本開示の肝臓特異的ＬＮＰ製剤の、ｌｄｌｒ－／－マウスにおける有効性評価の結果を示す。トリグリセリド（ｍｇ／ｄＬ）は、参照範囲、ならびに治療されていないマウス及び治療された（ｖｌｄｌｒ）マウスの７日目（Ｄ７）及び１５日目（Ｄ１５）で示される。
【図21B】試験動物の血液中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の（ｕ／Ｌでの）測定値として、安全性評価の結果を示す。各々、参照（「１」）範囲、ならびにＤ７（「２」）、及びＤ１５（「３」）のデータを含む、治療されていない群、治療された群（ｖＬｄｌｒ）、及びＰＢＳ群についてのデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
本発明は、非ウイルスのカプシドを含まない遺伝子療法方法及び組成物を使用して、総コレステロール及び低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）を低下させ、それによって、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）及びＬＤＬ－Ｃ上昇の心血管効果を治療及び緩和することができるという発見に部分的に基づいている。本開示による非ウイルス遺伝子療法方法は、低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＬＤＬＲ）、超低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＶＬＤＬＲ）における変異を補正するための、またはＬＤＬ－Ｃの血清上昇を緩和するための、肝臓指向性遺伝子療法での使用が見出される。記載の方法及び組成物は、ＬＤＬＲまたはＶＬＤＬＲの転移を用いる。記載の方法及び組成物は、患者の心血管の健康を改善し、それによって患者の全体的な予後及び健康を改善する。
【0026】
いくつかの実施形態では、記載の方法及び組成物は、１回用量または反復用量として投与され得る。投与経路は、いくつかの実施形態では、静脈内もしくは門脈内血管に、または直接肝臓実質にであり得る。
【0027】
ＦＨは、ＬＤＬＲ、ＡＰＯＢ、及びＰＣＳＫ９の主に３つの遺伝子における変異によって引き起こされるが、ＬＤＬＲにおける変異が最も一般的であり、報告されているＦＨを引き起こすバリアントのうちの９０％超がＬＤＬＲにおいてであり、ＡＰＯＢでは５％～１０％、ＰＣＳＫ９では１％未満である。Ｉａｃｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ ２０１７；１７：６４１－５１を参照されたい。
【0028】
ＬＤＬＲは、染色体１９に位置し、そのゲノム構造は、１８個のエクソン及び１７個のイントロンを含み、４５ｋｂに及ぶ。ＬＤＬＲ遺伝子、ｍＲＮＡ、及びタンパク質は、それぞれ、図１、２、及び３に概略的に示されている。ヒトＬＤＬＲ転写産物バリアント１ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ参照：ＮＭ＿０００５２７．５）は、以下である。
【化1-1】
【化1-2】
【0029】
病原バリアントは、ＬＤＬＲのプロモーター、イントロン、及びエクソンにおいて報告されており、病原バリアントの大部分は、リガンド結合ドメイン（４０％）または表皮成長因子前駆体様ドメイン（４７％）内にあり、病原バリアントの最も高い頻度は、エクソン４（２０％）において報告されている。ＬＤＬＲは、８３９アミノ酸の成熟タンパク質産生物をコードする。ＬＤＬＲは、互いに独立して機能することができる４つの異なる機能的ドメイン：ＬＤＬ受容体ドメインクラスＡ（ＬＤＬａ）、表皮成長因子様ドメイン（ＥＧＦ）、カルシウム結合ＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦ－ＣＡ）、及びＬＤＬ受容体反復クラスＢ（ＬＤＬｂ）を有する。ＬＤＬＲは、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）のエンドサイトーシスに関与する細胞表面タンパク質を含む。ＬＤＬ－Ｃが細胞膜で結合した後、細胞及びリソソームに取り込まれ、リソソームにおいてタンパク質部分が分解され、コレステロール分子がネガティブフィードバックを介してコレステロール合成を抑制する。
【0030】
ＬＤＬＲ遺伝子における病原バリアントは、通常、細胞内で産生されるＬＤＬ受容体の数を減少させるか、またはＬＤＬ－Ｃに結合する受容体の能力を妨害するかのいずれかである。特定の機序に関わらず、ＬＤＬＲにおけるヘテロ接合型病原バリアントは、高レベルの血漿ＬＤＬ－Ｃを引き起こす。
【0031】
肝ＬＤＬＲ発現は、ＰＣＳＫ９によって調節され、ＰＣＳＫ９によって媒介されるＬＤＬＲの分解を妨げる第２世代脂質低下薬は、ＰＣＳＫ９に集中する。別の機序は、ユビキチン－プロテアソーム経路による受容体の分解に基づく、ＬＤＬＲ発現の転写後調節に関与し、受容体発現を増加させる追加の標的として浮上している。ＬＤＬＲ発現を増加させるそのような戦略は、ＰＣＳＫ９における天然に存在する機能喪失変異、及びＬＤＬ－Ｃレベルを低下させるが疾患がこれらのバリアントに関連しないＬＤＬＲの誘導可能な分解因子（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒａｄｅｒ）（ＩＤＯＬ、ＭＹＬＩＰ）によって支持されている。ヒトＬＤＬＲバリアントＫ８３０Ｒ及びＣ８３９Ａは、ＩＤＯＬによって媒介されるＬＤＬＲの分解を防げることが以前に報告されている。Ｓｏｍａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２０１４；１１５：５９１－９．加えて、Ｌ３３９Ｄは、ヒトＰＣＳＫ９によって媒介される分解に対する耐性を付与する。Ｉｄ．３つ全てのバリアント（Ｌ３３９Ｄ、Ｋ８３０Ｒ、及びＣ８３９Ａ）を含有するＬＤＬＲを送達するＡＡＶベクターにおいて、ＬＤＲＬは、野生型ＬＤＬＲを使用するベクターと比較して、ＰＣＳＫ９及びＩＤＯＬ経路の両方による調節に耐性であった。Ｉｄ．
【0032】
いくつかの実施形態では、ヒトＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸は、ＮＭ＿０００５２７．５（配列番号１）のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む。
【0033】
実施形態では、ＬＤＬＲタンパク質は、ヒトＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片である。
【0034】
実施形態では、ヒトＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む。
【0035】
実施形態では、ヒトＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸は、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、ヒトＬＤＬＲタンパク質は、Ｌ３３９Ｄ、Ｋ８３０Ｒ、及びＣ８３９Ａから選択される１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＬＤＬＲは、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列番号２のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＬＤＬＲは、配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号２のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む。
【0037】
実施形態では、ヒトＬＤＬＲタンパク質またはその機能的断片は、配列番号３のアミノ酸配列と比較して、Ｌ１８Ｆ、Ｋ８３０Ｒ、及びＣ８３９Ａから選択される１つ以上の変異を含む。
【0038】
配列番号２のヌクレオチド配列（２５８３ｂｐ）は、以下に太字で下線が引かれているバリアントＬ３３９Ｄ、Ｋ８３０Ｌ、Ｃ８３９Ａを含む。配列番号３のアミノ酸配列（８６０個のアミノ酸）は、以下に太字で下線が引かれているバリアントＬ３３９Ｄ、Ｋ８３０Ｌ、Ｃ８３９Ａを含む。
【0039】
配列番号２は、以下である。
【化2】
【0040】
配列番号３は、以下である。
【化3】
【0041】
いくつかの実施形態では、ヒトＬＤＬＲをコードする核酸は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含み得る。
【0042】
ＶＬＤＬＲは、染色体９に位置し、ゲノムのおよそ４０ｋｂに及ぶ１９個のエクソンを含有する。遺伝子のエクソン－イントロン編成は、ＶＬＤＬ受容体のリガンド結合ドメインの追加の反復をコードする余分なエクソンを除いて、ＬＤＬＲ遺伝子のものとほぼ同一である。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＶＬＤＬＲ転写産物（ｍＲＮＡ）バリアント１は、９，２１３ｂｐ（ＮＣＢＩ参照：ＮＭ＿００３３８３．５）またはおよそ９．２ｋｂである：
【化4-1】
【化4-2】
【化4-3】
【化4-4】
【0043】
ＬＤＬＲのように、ＶＬＤＬＲは、５つのドメイン：ＬＤＬＲのリガンド結合ドメインに相同な８つのシステインが豊富な反復で構成されるＮ末端の３２８アミノ酸、ＬＤＬＲのリガンドにおける酸依存性解離を媒介する表皮成長因子前駆体に相同な３９６アミノ酸領域、ＬＤＬＲのクラスター化したＯ－結合型の糖に相同な４６アミノ酸ドメイン、２２アミノ酸の膜貫通ドメイン、及び被覆小窩内に受容体をクラスター化するために必要であるＮＰＸＹ配列を含む５４アミノ酸細胞質ドメインからなる。ＶＬＤＬ受容体の遺伝子は、脂肪酸代謝において活性である心臓、筋肉、及び脂肪組織において高度に発現し、本質的には、肝臓では発現が見出されない。
【0044】
本開示の組成物及び方法は、患者のゲノムにおける病原バリアントを補正し、したがって、総コレステロール及び／または低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）を低下させるために、ＬＤＬＲ及びＶＬＤＬＲを標的とする遺伝子導入構築物を提供する。したがって、本開示のいくつかの態様では、（ａ）ＶＬＤＬＲもしくはＬＤＬＲまたはその機能的断片と、（ｂ）肝臓特異的プロモーターと、（ｃ）１つ以上のトランスポザーゼ認識部位及び１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）または端部配列を含む非ウイルスベクターと、を含む、遺伝子導入構築物を含む組成物が提供される。
【0045】
いくつかの実施形態では、遺伝子導入構築物は、ＬＤＬＲの代わりに、ＶＬＤＬＲまたはその機能的断片を含む。ＶＬＤＬＲは、ＬＤＬＲと構造的及び機能的に密接に関連しており、内皮細胞へのａｐｏＥが豊富なリポタンパク質の直接取り込みによって、及びリパーゼによって媒介されるこれらのリポタンパク質の代謝の上方制御を通じて、ａｐｏＥが豊富なリポタンパク質の肝外代謝を主に調節する。ＬＤＬＲとは対照的に、ＶＬＤＬＲの発現は、細胞内遊離コレステロールによって調節されない。ＬＤＬＲが豊富である肝細胞では、ＶＬＤＬＲは、通常、微量のみ発現するが、ＬＤＬＲの不在を補うことができる。Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ ２００４；１１：２００－８、Ｔｕｒｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１６；２４：６２０－３５、Ｇｏ ＆ Ｍａｎｉ．Ｙａｌｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２０１２；８５：１９－２８を参照されたい。
【0046】
いくつかの実施形態では、ＶＬＤＬＲタンパク質は、ヒトＶＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片である。実施形態では、ヒトＶＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸は、配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む。
【0047】
いくつかの実施形態では、ヒトＶＬＤＬＲ、またはその機能的断片をコードする核酸は、配列番号５のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む：
【化5】
【0048】
いくつかの実施形態では、ヒトＶＬＤＬＲ、またはその機能的断片をコードする核酸は、配列番号６のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む：
【化6】
【0049】
いくつかの実施形態では、ＶＬＤＬＲ遺伝子またはその機能的断片は、マウス（ハツカネズミ）ＶＬＤＬＲである。マウスＶＬＤＬＲは、配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列番号７のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含み得る。
【0050】
実施形態では、ヒトＶＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸は、配列番号４のヌクレオチド配列もしくは配列番号５のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む。
【0051】
いくつかの実施形態では、マウスＶＬＤＬＲ、またはその機能的断片をコードする核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む：
【化7】
【0052】
いくつかの実施形態では、マウスＶＬＤＬＲまたはその機能的断片は、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む：
【化8】
【0053】
いくつかの実施形態では、本発明は、二重トランスポゾン及びトランスポザーゼ系を介した遺伝子導入のための組成物及び方法に関する。転移可能な因子は、天然に普遍的に見出される非ウイルス遺伝子送達ビヒクルである。トランスポゾンに基づくベクターは、細胞への導入遺伝子構築物の安定的なゲノム組み込み及び長期間の発現の能力を有する。総じて、二重トランスポゾン及びトランスポザーゼ系は、目的の導入遺伝子（複数可）を含有するトランスポゾンＤＮＡが、トランスポザーゼ酵素によって染色体ＤＮＡに組み込まれることによる、切断及び貼り付け機序を介して機能する。
【0054】
当該技術分野において理解されるであろうように、トランスポゾンは、多くの場合、トランスポゾンの中央の導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレームと、トランスポゾンの５’及び３’末端の末端反復配列と、を含む。翻訳されたトランスポザーゼは、トランスポゾンの５’及び３’配列に結合し、転移機能を実行する。
【0055】
実施形態では、トランスポゾンは、それら自体のコピーを他のポリヌクレオチドに挿入することが可能なポリヌクレオチドを指すために使用される、転移可能な因子と同義に使用される。トランスポゾンという用語は、当業者に周知であり、配列編成、例えば、各末端での短い逆位反復（ＩＴＲ）、及び／または末端での直接的に繰り返される長い末端反復（ＬＴＲ）に基づいて区別され得る部類のトランスポゾンを含む。実施形態では、本明細書に記載のトランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃ様因子、例えば、ＴＴＡＡ配列を認識し、トランスポゾンの除去後に挿入部位の配列を元のＴＴＡＡ配列に戻す、痕跡が残らない切除を特徴とするトランスポゾン因子として説明することができる。
【0056】
いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、トランスポザーゼによって認識されるＩＴＲに隣接する、トランスポゾンによって媒介される遺伝子導入系（例えば、ＤＮＡプラスミドトランスポゾン系）である。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ＶＬＤＬＲまたはＬＤＬＲ構築物に隣接する。非ウイルスベクターは、トランスポザーゼによって認識される２つの末端に隣接する異種ポリヌクレオチド（導入遺伝子とも称される）を含む、トランスポゾンに基づくベクター系として動作する。トランスポゾン末端は、正確または不正確な反復であってもよく、互いに対して方向が逆のＩＴＲを含む。トランスポザーゼは、トランスポゾン末端に作用して、それによって、トランスポゾンを（トランスポゾン末端とともに）ベクターから「切断」し、トランスポゾンを宿主ゲノムに「貼り付ける」かまたは組み込む。
【0057】
実施形態では、遺伝子導入系は、トランスポゾンをコードする核酸（ＤＮＡ）であり、「ドナーＤＮＡ」と称される。実施形態では、トランスポザーゼをコードする核酸は、ヘルパーＲＮＡ（すなわち、トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡ）であり、トランスポゾンをコードする核酸は、ドナーＤＮＡ（またはＤＮＡドナートランスポゾン）である。実施形態では、ドナーＤＮＡは、プラスミドに組み込まれる。実施形態では、ドナーＤＮＡは、プラスミドである。
【0058】
「切断及び貼り付け」機序を使用する移動性因子であるＤＮＡドナートランスポゾンとしては、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を含む哺乳類（例えば、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、及びＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）の場合では２つの端部配列に隣接するドナーＤＮＡ、または昆虫（例えば、Ｔｒｉｃｈｎｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）もしくは両生類（Ｘｅｎｏｐｕｓ種）等の他の生体では逆位末端反復（ＩＴＲ）が挙げられる。ゲノムＤＮＡは、宿主のドナー部位での二本鎖切断によって切除され、ドナーＤＮＡは、この部位に組み込まれる。生物工学的に操作されたトランスポゾン及びトランスポザーゼを使用する二重系は、（１）ＴＴＡＡ等の特定のヌクレオチド配列で「切断」する活性トランスポザーゼの供給源、及び（２）トランスポザーゼによって移動される認識端部配列またはＩＴＲに隣接するＤＮＡ配列（複数可）を含む。ＤＮＡ配列の移動によって、ＤＮＡフットプリントを用いずに特定のヌクレオチド配列（すなわち、ＴＴＡＡ）に介在核酸または導入遺伝子を挿入することが可能になる。
【0059】
実施形態では、トランスポザーゼは、ＤＮＡ発現ベクターとして、またはトランスポザーゼの長期発現がトランスジェニック細胞において生じないように、発現可能なＲＮＡもしくはタンパク質として提供され得る。
【0060】
実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含む、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓトランスポザーゼ（ＭＬＴ、またはＭＬＴトランスポザーゼ）である。実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアント、及びＳ２Ｘを含む、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓトランスポザーゼ（ＭＬＴ、またはＭＬＴトランスポザーゼ）であり、Ｘが、任意のアミノ酸または非アミノ酸であり、任意選択的に、Ｘが、ＡまたはＧである。実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアント、及びＳ２Ｘを含む、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓトランスポザーゼ（ＭＬＴ、またはＭＬＴトランスポザーゼ）であり、Ｘが、任意のアミノ酸または非アミノ酸であり、任意選択的に、Ｘが、ＡまたはＧであり、Ｃ末端欠損が、Ｌ５７３Ｘ及びＥ５７４Ｘから選択され、Ｘが、非アミノ酸である。実施形態では、変異は、Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａである。
【0061】
実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、変異Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａを含む配列番号９のアミノ酸配列：
ＭＡＱＨＳＤＹＳＤＤＥＦＣＡＤＫＬＳＮＹＳＣＤＳＤＬＥＮＡＳＴＳＤＥＤＳＳＤＤＥＶＭＶＲＰＲＴＬＲＲＲＲＩＳＳＳＳＳＤＳＥＳＤＩＥＧＧＲＥＥＷＳＨＶＤＮＰＰＶＬＥＤＦＬＧＨＱＧＬＮＴＤＡＶＩＮＮＩＥＤＡＶＫＬＦＩＧＤＤＦＦＥＦＬＶＥＥＳＮＲＹＹＮＱＮＲＮＮＦＫＬＳＫＫＳＬＫＷＫＤＩＴＰＱＥＭＫＫＦＬＧＬＩＶＬＭＧＱＶＲＫＤＲＲＤＤＹＷＴＴＥＰＷＴＥＴＰＹＦＧＫＴＭＴＲＤＲＦＲＱＩＷＫＡＷＨＦＮＮＮＡＤＩＶＮＥＳＤＲＬＣＫＶＲＰＶＬＤＹＦＶＰＫＦＩＮＩＹＫＰＨＱＱＬＳＬＤＥＧＩＶＰＷＲＧＲＬＦＦＲＶＹＮＡＧＫＩＶＫＹＧＩＬＶＲＬＬＣＥＳＤＴＧＹＩＣＮＭＥＩＹＣＧＥＧＫＲＬＬＥＴＩＱＴＶＶＳＰＹＴＤＳＷＹＨＩＹＭＤＮＹＹＮＳＶＡＮＣＥＡＬＭＫＮＫＦＲＩＣＧＴＩＲＫＮＲＧＩＰＫＤＦＱＴＩＳＬＫＫＧＥＴＫＦＩＲＫＮＤＩＬＬＱＶＷＱＳＫＫＰＶＹＬＩＳＳＩＨＳＡＥＭＥＥＳＱＮＩＤＲＴＳＫＫＫＩＶＫＰＮＡＬＩＤＹＮＫＨＭＫＧＶＤＲＡＤＱＹＬＳＹＹＳＩＬＲＲＴＶＫＷＴＫＲＬＡＭＹＭＩＮＣＡＬＦＮＳＹＡＶＹＫＳＶＲＱＲＫＭＧＦＫＭＦＬＫＱＴＡＩＨＷＬＴＤＤＩＰＥＤＭＤＩＶＰＤＬＱＰＶＰＳＴＳＧＭＲＡＫＰＰＴＳＤＰＰＣＲＬＳＭＤＭＲＫＨＴＬＱＡＩＶＧＳＧＫＫＫＮＩＬＲＲＣＲＶＣＳＶＨＫＬＲＳＥＴＲＹＭＣＫＦＣＮＩＰＬＨＫＧＡＣＦＥＫＹＨＴＬＫＮＹ（配列番号９）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＭＡＱＨＳＤＹＳＤＤＥＦＣＡＤＫＬＳＮＹＳＣＤＳＤＬＥＮＡＳＴＳＤＥＤＳＳＤＤＥＶＭＶＲＰＲＴＬＲＲＲＲＩＳＳＳＳＳＤＳＥＳＤＩＥＧＧＲＥＥＷＳＨＶＤＮＰＰＶＬＥＤＦＬＧＨＱＧＬＮＴＤＡＶＩＮＮＩＥＤＡＶＫＬＦＩＧＤＤＦＦＥＦＬＶＥＥＳＮＲＹＹＮＱＮＲＮＮＦＫＬＳＫＫＳＬＫＷＫＤＩＴＰＱＥＭＫＫＦＬＧＬＩＶＬＭＧＱＶＲＫＤＲＲＤＤＹＷＴＴＥＰＷＴＥＴＰＹＦＧＫＴＭＴＲＤＲＦＲＱＩＷＫＡＷＨＦＮＮＮＡＤＩＶＮＥＳＤＲＬＣＫＶＲＰＶＬＤＹＦＶＰＫＦＩＮＩＹＫＰＨＱＱＬＳＬＤＥＧＩＶＰＷＲＧＲＬＦＦＲＶＹＮＡＧＫＩＶＫＹＧＩＬＶＲＬＬＣＥＳＤＴＧＹＩＣＮＭＥＩＹＣＧＥＧＫＲＬＬＥＴＩＱＴＶＶＳＰＹＴＤＳＷＹＨＩＹＭＤＮＹＹＮＳＶＡＮＣＥＡＬＭＫＮＫＦＲＩＣＧＴＩＲＫＮＲＧＩＰＫＤＦＱＴＩＳＬＫＫＧＥＴＫＦＩＲＫＮＤＩＬＬＱＶＷＱＳＫＫＰＶＹＬＩＳＳＩＨＳＡＥＭＥＥＳＱＮＩＤＲＴＳＫＫＫＩＶＫＰＮＡＬＩＤＹＮＫＨＭＫＧＶＤＲＡＤＱＹＬＳＹＹＳＩＬＲＲＴＶＫＷＴＫＲＬＡＭＹＭＩＮＣＡＬＦＮＳＹＡＶＹＫＳＶＲＱＲＫＭＧＦＫＭＦＬＫＱＴＡＩＨＷＬＴＤＤＩＰＥＤＭＤＩＶＰＤＬＱＰＶＰＳＴＳＧＭＲＡＫＰＰＴＳＤＰＰＣＲＬＳＭＤＭＲＫＨＴＬＱＡＩＶＧＳＧＫＫＫＮＩＬＲＲＣＲＶＣＳＶＨＫＬＲＳＥＴＲＹＭＣＫＦＣＮＩＰＬＨＫＧＡＣＦＥＫＹＨＴＬＫＮＹ（配列番号９）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0062】
いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、以下のヌクレオチド配列によってコードされる：
ａｔｇｇｃｃｃａｇｃａｃａｇｃｇａｃｔａｃａｇｃｇａｃｇａｃｇａｇｔｔｃｔｇｔｇｃｃｇａｔａａｇｃｔｇａｇｔａａｃｔａｃａｇｃｔｇｃｇａｃａｇｃｇａｃｃｔｇｇａａａａｃｇｃｃａｇｃａｃａｔｃｃｇａｃｇａｇｇａｃａｇｃｔｃｔｇａｃｇａｃｇａｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｃｇｇｃｃｃａｇａａｃｃｃｔｇａｇａｃｇｇａｇａａｇａａｔｃａｇｃａｇｃｔｃｔａｇｃａｇｃｇａｃｔｃｔｇａａｔｃｃｇａｃａｔｃｇａｇｇｇｃｇｇｃｃｇｇｇａａｇａｇｔｇｇａｇｃｃａｃｇｔｇｇａｃａａｃｃｃｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｇａａｇａｔｔｔｔｃｔｇｇｇｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａａｃａｃｃｇａｃｇｃｃｇｔｇａｔｃａａｃａａｃａｔｃｇａｇｇａｔｇｃｃｇｔｇａａｇｃｔｇｔｔｃａｔａｇｇａｇａｔｇａｔｔｔｃｔｔｔｇａｇｔｔｃｃｔｇｇｔｃｇａｇｇａａｔｃｃａａｃｃｇｃｔａｔｔａｃａａｃｃａｇａａｔａｇａａａｃａａｃｔｔｃａａｇｃｔｇａｇｃａａｇａａａａｇｃｃｔｇａａｇｔｇｇａａｇｇａｃａｔｃａｃｃｃｃｔｃａｇｇａｇａｔｇａａａａａｇｔｔｃｃｔｇｇｇａｃｔｇａｔｃｇｔｔｃｔｇａｔｇｇｇａｃａｇｇｔｇｃｇｇａａｇｇａｃａｇａａｇｇｇａｔｇａｔｔａｃｔｇｇａｃａａｃｃｇａａｃｃｔｔｇｇａｃｃｇａｇａｃｃｃｃｔｔａｃｔｔｔｇｇｃａａｇａｃｃａｔｇａｃｃａｇａｇａｃａｇａｔｔｃａｇａｃａｇａｔｃｔｇｇａａａｇｃｃｔｇｇｃａｃｔｔｃａａｃａａｃａａｔｇｃｔｇａｔａｔｃｇｔｇａａｃｇａｇｔｃｔｇａｔａｇａｃｔｇｔｇｔａａａｇｔｇｃｇｇｃｃａｇｔｇｔｔｇｇａｔｔａｃｔｔｃｇｔｇｃｃｔａａｇｔｔｃａｔｃａａｃａｔｃｔａｔａａｇｃｃｔｃａｃｃａｇｃａｇｃｔｇａｇｃｃｔｇｇａｔｇａａｇｇｃａｔｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇｃｇｇｇｇｃａｇａｃｔｇｔｔｃｔｔｃａｇａｇｔｇｔａｃａａｔｇｃｔｇｇｃａａｇａｔｃｇｔｃａａａｔａｃｇｇｃａｔｃｃｔｇｇｔｇｃｇｃｃｔｔｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇｃｇａｔａｃａｇｇｃｔａｃａｔｃｔｇｔａａｔａｔｇｇａａａｔｃｔａｃｔｇｃｇｇｃｇａｇｇｇｃａａａａｇａｃｔｇｃｔｇｇａａａｃｃａｔｃｃａｇａｃｃｇｔｃｇｔｔｔｃｃｃｃｔｔａｔａｃｃｇａｃａｇｃｔｇｇｔａｃｃａｃａｔｃｔａｃａｔｇｇａｃａａｃｔａｃｔａｃａａｔｔｃｔｇｔｇｇｃｃａａｃｔｇｃｇａｇｇｃｃｃｔｇａｔｇａａｇａａｃａａｇｔｔｔａｇａａｔｃｔｇｃｇｇｃａｃａａｔｃａｇａａａａａａｃａｇａｇｇｃａｔｃｃｃｔａａｇｇａｃｔｔｃｃａｇａｃｃａｔｃｔｃｔｃｔｇａａｇａａｇｇｇｃｇａａａｃｃａａｇｔｔｃａｔｃａｇａａａｇａａｃｇａｃａｔｃｃｔｇｃｔｃｃａａｇｔｇｔｇｇｃａｇｔｃｃａａｇａａａｃｃｃｇｔｇｔａｃｃｔｇａｔｃａｇｃａｇｃａｔｃｃａｔａｇｃｇｃｃｇａｇａｔｇｇａａｇａａａｇｃｃａｇａａｃａｔｃｇａｃａｇａａｃａａｇｃａａｇａａｇａａｇａｔｃｇｔｇａａｇｃｃｃａａｔｇｃｔｃｔｇａｔｃｇａｃｔａｃａａｃａａｇｃａｃａｔｇａａａｇｇｃｇｔｇｇａｃｃｇｇｇｃｃｇａｃｃａｇｔａｃｃｔｇｔｃｔｔａｔｔａｃｔｃｔａｔｃｃｔｇａｇａａｇａａｃａｇｔｇａａａｔｇｇａｃｃａａｇａｇａｃｔｇｇｃｃａｔｇｔａｃａｔｇａｔｃａａｔｔｇｃｇｃｃｃｔｇｔｔｃａａｃａｇｃｔａｃｇｃｃｇｔｇｔａｃａａｇｔｃｃｇｔｇｃｇａｃａａａｇａａａａａｔｇｇｇａｔｔｃａａｇａｔｇｔｔｃｃｔｇａａｇｃａｇａｃａｇｃｃａｔｃｃａｃｔｇｇｃｔｇａｃａｇａｃｇａｃａｔｔｃｃｔｇａｇｇａｃａｔｇｇａｃａｔｔｇｔｇｃｃａｇａｔｃｔｇｃａａｃｃｔｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｃｔｇｇｔａｔｇａｇａｇｃｔａａｇｃｃｔｃｃｃａｃｃａｇｃｇａｔｃｃｔｃｃａｔｇｔａｇａｃｔｇａｇｃａｔｇｇａｃａｔｇｃｇｇａａｇｃａｃａｃｃｃｔｇｃａｇｇｃｃａｔｃｇｔｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａａｇａａｇａａｇａａｃａｔｃｃｔｔａｇａｃｇｇｔｇｃａｇｇｇｔｇｔｇｃａｇｃｇｔｇｃａｃａａｇｃｔｇｃｇｇａｇｃｇａｇａｃｔｃｇｇｔａｃａｔｇｔｇｃａａｇｔｔｔｔｇｃａａｃａｔｔｃｃｃｃｔｇｃａｃａａｇｇｇａｇｃｃｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｔａｃｃａｃａｃｃｃｔｇａａｇａａｔｔａｃｔａｇ
（配列番号１０）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
ａｔｇｇｃｃｃａｇｃａｃａｇｃｇａｃｔａｃａｇｃｇａｃｇａｃｇａｇｔｔｃｔｇｔｇｃｃｇａｔａａｇｃｔｇａｇｔａａｃｔａｃａｇｃｔｇｃｇａｃａｇｃｇａｃｃｔｇｇａａａａｃｇｃｃａｇｃａｃａｔｃｃｇａｃｇａｇｇａｃａｇｃｔｃｔｇａｃｇａｃｇａｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｃｇｇｃｃｃａｇａａｃｃｃｔｇａｇａｃｇｇａｇａａｇａａｔｃａｇｃａｇｃｔｃｔａｇｃａｇｃｇａｃｔｃｔｇａａｔｃｃｇａｃａｔｃｇａｇｇｇｃｇｇｃｃｇｇｇａａｇａｇｔｇｇａｇｃｃａｃｇｔｇｇａｃａａｃｃｃｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｇａａｇａｔｔｔｔｃｔｇｇｇｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａａｃａｃｃｇａｃｇｃｃｇｔｇａｔｃａａｃａａｃａｔｃｇａｇｇａｔｇｃｃｇｔｇａａｇｃｔｇｔｔｃａｔａｇｇａｇａｔｇａｔｔｔｃｔｔｔｇａｇｔｔｃｃｔｇｇｔｃｇａｇｇａａｔｃｃａａｃｃｇｃｔａｔｔａｃａａｃｃａｇａａｔａｇａａａｃａａｃｔｔｃａａｇｃｔｇａｇｃａａｇａａａａｇｃｃｔｇａａｇｔｇｇａａｇｇａｃａｔｃａｃｃｃｃｔｃａｇｇａｇａｔｇａａａａａｇｔｔｃｃｔｇｇｇａｃｔｇａｔｃｇｔｔｃｔｇａｔｇｇｇａｃａｇｇｔｇｃｇｇａａｇｇａｃａｇａａｇｇｇａｔｇａｔｔａｃｔｇｇａｃａａｃｃｇａａｃｃｔｔｇｇａｃｃｇａｇａｃｃｃｃｔｔａｃｔｔｔｇｇｃａａｇａｃｃａｔｇａｃｃａｇａｇａｃａｇａｔｔｃａｇａｃａｇａｔｃｔｇｇａａａｇｃｃｔｇｇｃａｃｔｔｃａａｃａａｃａａｔｇｃｔｇａｔａｔｃｇｔｇａａｃｇａｇｔｃｔｇａｔａｇａｃｔｇｔｇｔａａａｇｔｇｃｇｇｃｃａｇｔｇｔｔｇｇａｔｔａｃｔｔｃｇｔｇｃｃｔａａｇｔｔｃａｔｃａａｃａｔｃｔａｔａａｇｃｃｔｃａｃｃａｇｃａｇｃｔｇａｇｃｃｔｇｇａｔｇａａｇｇｃａｔｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇｃｇｇｇｇｃａｇａｃｔｇｔｔｃｔｔｃａｇａｇｔｇｔａｃａａｔｇｃｔｇｇｃａａｇａｔｃｇｔｃａａａｔａｃｇｇｃａｔｃｃｔｇｇｔｇｃｇｃｃｔｔｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇｃｇａｔａｃａｇｇｃｔａｃａｔｃｔｇｔａａｔａｔｇｇａａａｔｃｔａｃｔｇｃｇｇｃｇａｇｇｇｃａａａａｇａｃｔｇｃｔｇｇａａａｃｃａｔｃｃａｇａｃｃｇｔｃｇｔｔｔｃｃｃｃｔｔａｔａｃｃｇａｃａｇｃｔｇｇｔａｃｃａｃａｔｃｔａｃａｔｇｇａｃａａｃｔａｃｔａｃａａｔｔｃｔｇｔｇｇｃｃａａｃｔｇｃｇａｇｇｃｃｃｔｇａｔｇａａｇａａｃａａｇｔｔｔａｇａａｔｃｔｇｃｇｇｃａｃａａｔｃａｇａａａａａａｃａｇａｇｇｃａｔｃｃｃｔａａｇｇａｃｔｔｃｃａｇａｃｃａｔｃｔｃｔｃｔｇａａｇａａｇｇｇｃｇａａａｃｃａａｇｔｔｃａｔｃａｇａａａｇａａｃｇａｃａｔｃｃｔｇｃｔｃｃａａｇｔｇｔｇｇｃａｇｔｃｃａａｇａａａｃｃｃｇｔｇｔａｃｃｔｇａｔｃａｇｃａｇｃａｔｃｃａｔａｇｃｇｃｃｇａｇａｔｇｇａａｇａａａｇｃｃａｇａａｃａｔｃｇａｃａｇａａｃａａｇｃａａｇａａｇａａｇａｔｃｇｔｇａａｇｃｃｃａａｔｇｃｔｃｔｇａｔｃｇａｃｔａｃａａｃａａｇｃａｃａｔｇａａａｇｇｃｇｔｇｇａｃｃｇｇｇｃｃｇａｃｃａｇｔａｃｃｔｇｔｃｔｔａｔｔａｃｔｃｔａｔｃｃｔｇａｇａａｇａａｃａｇｔｇａａａｔｇｇａｃｃａａｇａｇａｃｔｇｇｃｃａｔｇｔａｃａｔｇａｔｃａａｔｔｇｃｇｃｃｃｔｇｔｔｃａａｃａｇｃｔａｃｇｃｃｇｔｇｔａｃａａｇｔｃｃｇｔｇｃｇａｃａａａｇａａａａａｔｇｇｇａｔｔｃａａｇａｔｇｔｔｃｃｔｇａａｇｃａｇａｃａｇｃｃａｔｃｃａｃｔｇｇｃｔｇａｃａｇａｃｇａｃａｔｔｃｃｔｇａｇｇａｃａｔｇｇａｃａｔｔｇｔｇｃｃａｇａｔｃｔｇｃａａｃｃｔｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｃｔｇｇｔａｔｇａｇａｇｃｔａａｇｃｃｔｃｃｃａｃｃａｇｃｇａｔｃｃｔｃｃａｔｇｔａｇａｃｔｇａｇｃａｔｇｇａｃａｔｇｃｇｇａａｇｃａｃａｃｃｃｔｇｃａｇｇｃｃａｔｃｇｔｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａａｇａａｇａａｇａａｃａｔｃｃｔｔａｇａｃｇｇｔｇｃａｇｇｇｔｇｔｇｃａｇｃｇｔｇｃａｃａａｇｃｔｇｃｇｇａｇｃｇａｇａｃｔｃｇｇｔａｃａｔｇｔｇｃａａｇｔｔｔｔｇｃａａｃａｔｔｃｃｃｃｔｇｃａｃａａｇｇｇａｇｃｃｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｔａｃｃａｃａｃｃｃｔｇａａｇａａｔｔａｃｔａｇ
（配列番号１０）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【0063】
いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼ（例えば、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＭＬＴトランスポザーゼ）は、ＭＬＴトランスポザーゼに高活性を付与する１つ以上の高活性変異を含む。実施形態では、高活性変異は、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的等価物と比較して、Ｓ８Ｘ、Ｃ１３Ｘ、及びＮ１２５Ｘ変異のうちの１つ以上であり、Ｘが、任意選択的に、任意のアミノ酸または非アミノ酸であり、任意選択的に、Ｘが、Ｐ、Ｒ、またはＫである。実施形態では、変異は、Ｓ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋである。いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異を有する。いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｎ１２５Ｋ変異を有する。いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋ変異の３つ全てを有する。
【0064】
いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的等価物と比較して、Ｎ１２５Ｋ変異を有するアミノ酸（配列番号１２）に対応するヌクレオチド配列（配列番号１１）によってコードされ、配列番号１１及び配列番号１２が、以下のとおりである：
【化9】
【0065】
【化10】
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列（Ｎ１２５Ｋ変異に対応するアミノ酸は下線が引かれ、太字である）によってコードされる。
【0066】
いくつかの実施形態では、配列番号１１のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＭＬＴトランスポザーゼは、ＭＬＴトランスポザーゼ１（またはＭＬＴ１）と称される。
【0067】
いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的等価物と比較して、Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異を有するアミノ酸（配列番号１４）に対応するヌクレオチド配列（配列番号１３）によってコードされ、配列番号１３及び配列番号１４が、以下のとおりである：
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列（Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異に対応するコドンは、下線が引かれ、太字である）。
【化11】
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列（Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異に対応するコドンは、下線が引かれ、太字である）。
【0068】
【化12】
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列（Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異に対応するアミノ酸は下線が引かれ、太字である）によってコードされる。
【0069】
いくつかの実施形態では、配列番号１３のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＭＬＴトランスポザーゼは、ＭＬＴトランスポザーゼ２（またはＭＬＴ２）と称される。
【0070】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｃ１／マリナートランスポゾン（ｍａｒｉｎｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）からのものである。
【0071】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系（例えば、Ｃｅｌｌ．１９９７；９１：５０１－５１０を参照されたい）またはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系（例えば、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ＳＥＰ；３３（９）：５２５－３３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｔｅｃｈ．２０１５．０６．００９．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｊｕｌ ２３を参照されたい）からのものである。
【0072】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＬＥＡＰ－ＩＮ１型またはＬＥＡＰ－ＩＮトランスポゾン系（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０１８ Ｏｃｔ；１３（１０）：ｅ１７００７４８．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｏｔ．２０１７００７４８．Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｊｕｎ １１）からのものである。
【0073】
いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、ＬＥＡＰ－ＩＮ１型のＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼ（ＡＴＵＭ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）を含む。ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼ系は、トランスポザーゼ（例えば、トランスポザーゼｍＲＮＡ）と、トランスポゾンの同族逆位末端反復（ＩＴＲ）及び転移認識モチーフ（ＴＴＡＴ）に隣接する、１つ以上の目的の遺伝子（トランスポゾン）、選択マーカー、調節因子等を含有するベクターと、を含む。ベクターＤＮＡ及びトランスポザーゼｍＲＮＡの共トランスフェクションの際に、一過性に発現した酵素は、宿主細胞のゲノム全体にわたる１つ以上の部位で、トランスポゾンカセットの単一コピー（ＩＴＲ間の全ての配列）の高効率かつ正確な組み込みを触媒する。Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｗｈｉｔｅ ＳＪ，Ｃａｎｔｓｉｌｉｅｒｉｓ Ｓ，ｅｄｓ：１８５－１９６．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）：２０１７．ｐｐ．１８５－１９６．ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼは、主にオープンクロマチンセグメントにおいて、複数のゲノム遺伝子座における単一コピーの組み込みを含む、様々な有利な特徴を有する安定的な導入遺伝子組み込み物を生成し、ペイロード制限がないので、複数の独立した転写単位を単一構築物から発現させることができ、組み込まれた導入遺伝子は、それらの構造的及び機能的完全性を維持し、導入遺伝子完全性の維持は、全ての組換え細胞における所望の鎖比を確保する。
【0074】
いくつかの実施形態では、ＶＬＤＬＲまたはＬＤＬＲタンパク質をコードする核酸は、導入遺伝子（例えば、ＶＬＤＬＲもしくはＬＤＬＲ、またはその機能的断片）の全体的な発現レベル及び細胞特異性に影響を及ぼすことができるプロモーターに作動可能に結合される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、組織特異的、すなわち、肝臓特異的プロモーターである。トランスポザーゼがＤＮＡ配列をコードするトランスポザーゼである実施形態では、そのようなＤＮＡ配列はまた、プロモーターに作動可能に連結される。組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター等を含む多様なプロモーターが使用され得る。
【0075】
いくつかの実施形態では、遺伝子導入構築物の肝臓特異的プロモーターは、いくつかの実施形態では、ヒトＬＰ１プロモーターであるＬＰ１プロモーターであり得る。ＬＰ１プロモーターは、例えば、Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ｖｏｌ．２００６；１０７（７）：２６５３－６１に記載されている。
【0076】
いくつかの実施形態では、ＬＰ１プロモーターは、配列番号１５の核酸配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントの機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、ＬＰ１プロモーターのヌクレオチド配列は、ヒトアポリポタンパク質Ｅ／Ｃ－Ｉ遺伝子座、肝制御領域ＨＣＲ－１（塩基対１３４～３２５、ＧｅｎｂａｎｋレコードＵ３２５１０．１）、ヒトアルファ－１－アンチトリプシン遺伝子（Ｓバリアント）（塩基対１７４７～２０１１、ＧｅｎｂａｎｋレコードＫ０２２１２．１）、及び小型ｔ－イントロンＳＶ４０（塩基対２４１～３３３、ＧｅｎｂａｎｋレコードＦＮ８２４６５６．１）（５４５ｂｐ）を含む。
【化13】
【0077】
いくつかの実施形態では、ＬＰ１プロモーターは、配列番号１５の核酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９１％、もしくは少なくとも約９２％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９４％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントを含む。
【0078】
いくつかの実施形態では、ＬＰ１プロモーターのヌクレオチド配列は、ヒトアポリポタンパク質Ｅ／Ｃ－Ｉ遺伝子座、肝制御領域ＨＣＲ－１（塩基対１３４～３２５、ＧｅｎｂａｎｋレコードＵ３２５１０．１）、ヒトアルファ－１－アンチトリプシン遺伝子（Ｓバリアント）（塩基対１７４７～２００１、ＧｅｎｂａｎｋレコードＫ０２２１２．１）、及び小型ｔ－イントロンＳＶ４０（塩基対２４１～３３３、ＧｅｎｂａｎｋレコードＦＮ８２４６５６．１）（５４５ｂｐ）、のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、以下の表１に含まれるプロモーターから選択される。
いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、以下の表１に含まれるプロモーターから選択される。
【0079】
いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、以下の表１に含まれるプロモーターから選択され、任意選択的に、表１に列挙される１つ以上のエンハンサー及び／または表１に列挙される１つ以上のイントロンを有する。
【表1】
【0080】
上の表１では、「Ｅ」は、エンハンサーを示し、「Ｐ」は、プロモーターを示し、「Ｍｍ」は、ハツカネズミを示し、「Ｈｓ」はＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓを示し、「ＨＢＶ」は、Ｂ型肝炎ウイルスを示す。
【0081】
いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、上の表１のプロモーターのうちのいずれかのプロモーターである。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３；７：３７５－８５に記載のプロモーターのうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３；７：３７５－８５に記載されるように構築することができる。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、Ｅ－ＡＬＢ（Ｍｍ）ｖ２＿Ｐ－ＡＡＴ（Ｈｓ）またはＥ－ＨＢＶ＿Ｐ－ＡＡＴ（Ｈｓ）であり、両方とも上の表１に列挙されている。
【0082】
実施形態では、本非ウイルスベクターは、トランスポゾンの５’及び３’末端に少なくとも１対の逆位末端反復（ＩＴＲ）を含み得る。実施形態では、ＩＴＲは、ベクターの対向する末端に位置する相補的配列と組み合わせて使用される場合、ヘアピン構造を形成することができる、ベクターの一端に位置する配列である。一対の逆位末端反復は、本開示の非ウイルスベクターのトランスポゾンの転移活性に関与し、具体的には、ＤＮＡ付加または除去及び目的のＤＮＡの切除に関与する。一実施形態では、少なくとも一対の逆位末端反復は、プラスミドにおける転移活性に必要な最小配列であると思われる。別の実施形態では、本開示のベクターは、少なくとも２、３、または４対の逆位末端反復を含み得る。当業者によって理解されるであろうように、クローニングの容易さを促進にするのに必要な末端配列は、可能な限り短くてもよく、したがって、逆位反復を可能な限り少なく含有してもよい。したがって、一実施形態では、本開示のベクターは、１対以下、２対以下、３対以下、または４対以下の逆位末端反復を含み得る。一実施形態では、本開示のベクターは、１つの逆位末端反復のみを含み得る。
【0083】
実施形態では、本発明の逆位末端反復は、完璧な逆位末端反復（または同義に「完璧な逆位反復」と称される）または不完全な逆位末端反復（または同義に「不完全な逆位反復」と称される）のいずれかを形成し得る。本明細書で使用される場合、「完璧な逆位反復」という用語は、反対方向に配置された２つの同一のＤＮＡ配列を指す。対照的に、「不完全な逆位反復」という用語は、それらがいくつかのミスマッチを含有することを除いて、互いに同様である２つのＤＮＡ配列を指す。これらの反復（すなわち、完璧な逆位反復及び不完全な逆位反復の両方）は、トランスポザーゼの結合部位である。
【0084】
いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターのＩＴＲ（または端部配列）は、「切断及び貼り付け」機序を通じて転移するｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンのものである。いくつかの実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＴＴＡＡ反復性配列を含む。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは、遺伝子組換えのために頻繁に使用されるトランスポゾン系であり、実際の転移事象中にＤＮＡ合成を必要としない。ｐｉｇｇｙＢａｃ因子は、トランスポザーゼによってドナー染色体から切断され得、継代ドナーＤＮＡは、ＤＮＡリガーゼと再結合することができる。Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６；５（１）：１２０－１２５．ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは、正確な切除、すなわち、配列を組み込み前の状態に戻すことを示す。Ｙｕｓａ．ｐｉｇｇｙＢａｃ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ．２０１５ Ａｐｒ；３（２）を参照されたい。いくつかの実施形態では、遺伝子導入構築物は、Ｓｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼを含む。Ｂａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１６；１２８（２２）：２１６７を参照されたい。
【0085】
いくつかの実施形態では、他の非ウイルス遺伝子導入ツール、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系等が使用され得る。例えば、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１１；２０（Ｒ１），Ｒ１４－Ｒ２０を参照されたい。
【0086】
いくつかの実施形態では、トランスポゾン系の配列は、哺乳類系において改善されたｍＲＮＡ安定性及びタンパク質発現を提供するようにコドン最適化され得る。
【0087】
様々な実施形態では、遺伝子導入構築物は、核酸構築物、プラスミド、またはベクター等の任意の好適な遺伝子構築物であり得る。様々な実施形態では、遺伝子導入構築物は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子導入構築物は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子導入構築物は、例えば、ｍｉＲＮＡ（例えばＰＣＳＫ９）等のＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を有し得る。
【0088】
実施形態では、本核酸は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの類似体もしくは誘導体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドの重合体形態を含む。実施形態では、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡ、ならびにＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドが提供される。実施形態では、メチル化またはキャップされたポリヌクレオチド等の転写活性化ポリヌクレオチドが提供される。実施形態では、本組成物は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡである。
【0089】
実施形態では、本非ウイルスベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、制御配列に作動可能に連結されている線状または環状のＤＮＡ分子であり、制御配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を提供する。実施形態では、非ウイルスベクターは、プロモーター配列、ならびに転写及び翻訳停止シグナル配列を含む。そのようなベクターとしては、とりわけ、染色体及びエピソームベクター、例えば、細菌プラスミド、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体エレメントに由来するベクター、ならびにそれらの組み合わせに由来するベクターを挙げることができる。本構築物は、発現を調節ならびに発生させる制御領域を含有し得る。
【0090】
いくつかの実施形態では、遺伝子導入構築物は、コドン最適化され得る。記載の実施形態では、ＶＬＤＬＲタンパク質及びＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸は、宿主ゲノム（例えば、ヒトゲノム）に組み込まれて所望の臨床転帰を提供する導入遺伝子として機能する。導入遺伝子コドン最適化は、導入遺伝子の療法的潜在性及び宿主生物におけるその発現を最適化するために使用され得る。導入遺伝子におけるコドン使用量を、宿主生物または細胞における各コドンのトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の存在量と一致させるために、コドン最適化が実施される。コドン最適化方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／１４２９５４に記載されている。最適化戦略としては、例えば、翻訳開始領域の修飾、ｍＲＮＡ構造的因子の改変、及び異なるコドンバイアスの使用を挙げることができる。
【0091】
遺伝子導入構築物は、構築物の安定的な発現を確実にするために選択されるいくつかの他の調節因子を含む。したがって、いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、そばにある遺伝子の活性化または不活性化を防止または緩和する１つ以上のインスレーター配列を含み得るＤＮＡプラスミドである。
【0092】
実施形態では、ＩＴＲもしくは端部配列は、任意選択的に、ＴＴＡＡ反復性配列を含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンのものであり、及び／またはＩＴＲもしくは端部配列は、ＶＬＤＬＲタンパク質もしくはＬＤＬＲタンパク質、もしくはその機能的断片をコードする核酸に隣接する。
【0093】
いくつかの実施形態では、１つ以上のインスレーター配列は、ＨＳ４インスレーター（１．２ｋｂ５′－ＨＳ４ニワトリβ－グロビン（ｃＨＳ４）インスレーター因子）及びＤ４Ｚ４インスレーター［顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）］に関連するタンデムマクロサテライト反復）を含む］。いくつかの実施形態では、ＨＳ４インスレーター及びＤ４Ｚ４インスレーターの配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＲｉｖａｌ－Ｇｅｒｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１３ Ａｕｇ；２１（８）：１５３６－５０に記載のとおりである。いくつかの実施形態では、遺伝子導入構築物の遺伝子は、トランスポザーゼの存在下で転移することが可能である。いくつかの実施形態では、本開示の実施形態による非ウイルスベクターは、トランスポザーゼをコードする核酸構築物を含む。トランスポザーゼは、トランスポザーゼＤＮＡプラスミドであり得る。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、インビトロで転写されたｍＲＮＡである。トランスポザーゼは、遺伝子導入構築物から遺伝子を切除し、及び／または部位特異的もしくは遺伝子座特異的ゲノム領域に遺伝子を転移することが可能である。
【0094】
本開示による遺伝子導入構築物を含む組成物は、１つ以上の非ウイルスベクターを含み得る。また、トランスポザーゼは、導入遺伝子を含むトランスポゾンと同じかまたは異なるベクター上に配置され得る。したがって、いくつかの実施形態では、トランスポザーゼと、導入遺伝子を包含するトランスポゾンとは、それらが同じベクターに含まれるような、シス構成にある。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼと、導入遺伝子を包含するトランスポゾンとは、それらが異なるベクターに含まれるような、トランス構成にある。ベクターは、本開示による任意の非ウイルスベクターである。
【0095】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来し、及び／またはその操作されたバージョンである。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＩＴＲを特異的に認識する。トランスポザーゼは、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含み得る。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，０４１，０７７号を参照されたい。
【0096】
しかしながら、いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、例えば、細胞透過性ペプチド（例えば、Ｒａｍｓｅｙ ａｎｄ Ｆｌｙｎｎ（２０１５）．Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５４：７８－８６に記載の）を使用して、塩及びプロパンベタインを含む低分子（例えば、Ａｓｔｏｌｆｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２０１５；１６１：６７４－６９０に記載の）、またはエレクトロポレーション（例えば、Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｄａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９５；４８：６３－７１に記載の）を使用して、タンパク質として細胞に直接導入され得る。
【0097】
いくつかの実施形態では、トランスポゾン系は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，４３５，６９６号に記載のように実施され得る。
【0098】
いくつかの実施形態では、記載の組成物は、導入遺伝子（例えば、ＶＬＤＬＲタンパク質もしくはＬＤＬＲタンパク質、またはその機能的断片）及びトランスポザーゼをある特定の比で含む。いくつかの実施形態では、転移活性の効率を改善する、導入遺伝子対トランスポザーゼ比が選択される。導入遺伝子対トランスポザーゼ比は、トランスフェクトされた遺伝子導入構築物の濃度に依存する。いくつかの実施形態では、超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）もしくは低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＬＤＬＲ）、またはその機能的断片をコードする核酸対トランスポザーゼをコードする核酸構築物の比は、約５：１、または約４：１、または約３：１、または約２：１、または約１：１、または約１：２、または約１：３、または約１：４、または約１：５である。
【0099】
いくつかの実施形態では、超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）もしくは低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＬＤＬＲ）、またはその機能的断片をコードする核酸対トランスポザーゼをコードする核酸構築物の比は、約２：１である。
【0100】
いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、例えば、脂質粒子を用いる方法等の様々なトランスフェクション方法によって細胞に導入される、共役ポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、遺伝子導入構築物を含む組成物は、送達粒子を含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質に基づく粒子（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））、カチオン性脂質、または生分解性ポリマー）を含む。遺伝子導入構築物の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達は、潜在的なオフターゲット事象及び免疫応答を制限するための一過性の非組み込み発現、ならびに大きなカーゴを輸送する能力を有する効率的な送達を含む、ある特定の利点を提供する。ＬＮＰは、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びｍＲＮＡの送達、ならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を肝細胞及び肝臓にインビトロ及びインビボで送達するために使用されてきた。例えば、米国特許第１０，１９５，２９１号は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）治療剤の送達のためのＬＮＰの使用について記載している。
【0101】
いくつかの実施形態では、本開示の実施形態による組成物は、ＬＮＰの形態にある。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ジメチルアミノエタン－カルバモイルと混合されたカチオン性コレステロール誘導体（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、トリオレイン（トリオレイン酸グリセリル）、ならびに１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［カルボキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ ２Ｋ）、及び１，２－ジステアロール（ｄｉｓｔｅａｒｏｌ）－ｓｎ－グリセロール－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）から選択される１つ以上の脂質を含む。
【0102】
いくつかの実施形態では、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１９；３０３：９１－１００から適応させたＬＮＰは、図５に示されるとおりである。図５に示されるように、ＬＮＰは、構造的脂質（例えば、ＤＳＰＣ）、ＰＥＧ共役脂質（ＣＤＭ－ＰＥＧ）、カチオン性脂質（ＭＣ３）、コレステロール、及び標的化リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ）のうちの１つ以上を含み得る。
【0103】
いくつかの実施形態では、組成物は、様々な比で脂質及びポリマーを有し得、脂質が、例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、ＰＣ、トリオレイン、ＤＳＰＥ－ＰＥＧから選択され得、ポリマーが、例えば、ＰＥＩまたはポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）であり得る。加えてまたは代替的に、任意の他の脂質及びポリマーが使用され得る。いくつかの実施形態では、脂質及びポリマーの比は、約０．５：１、または約１：１、または約１：１．５、または約１：２、または約１：２．５、または約１：３、または約３：１、または約２．５：１、または約２：１、または約１．５：１、または約１：１、または約１：０．５である。
【0104】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質を含み、その非限定的な例としては、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）もしくはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－’）アミノ）エチル）（２ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、またはそれらの混合物が挙げられる。
【0105】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、肝送達に好適である、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ならびにＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から選択される１つ以上の分子を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，９８５，８２６号に記載の肝指向性化合物を含む。ＧａｌＮＡｃは、哺乳類肝細胞で発現するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を標的とすることが知られている。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．２０１４；２１（１０）：１０２５－３０を参照されたい。
【0106】
いくつかの例では、本開示の遺伝子導入構築物は、ＰＥＩ、またはポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ＧＡＬ）もしくはポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－トリ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ｔｒｉＧＡＬ）誘導体等のそれらの誘導体と製剤化または複合化され得る。
【0107】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、共役脂質であり、その非限定的な例としては、限定されないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質が挙げられる。ＰＥＧ－ＤＡＡ共役物は、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）であり得る。
【0108】
実施形態では、ナノ粒子は、約１０００ｎｍ未満の直径を有する粒子である。いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子は、約５００ｎｍ以下、または約４００ｎｍ以下、または約３００ｎｍ以下、または約２００ｎｍ以下、または約１００ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、または約７０ｎｍ～約１３０ｎｍ、または約８０ｎｍ～約１２０ｎｍ、または約９０ｎｍ～約１１０ｎｍの範囲の最大寸法を有する。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約１００ｎｍの最大寸法（例えば、直径）を有する。
【0109】
いくつかの態様では、本開示による組成物は、インビボ遺伝子組換え方法を介して送達され得る。いくつかの実施形態では、本開示による遺伝子組換えは、エクスビボ方法を介して実施され得る。
【0110】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態または実施形態の組み合わせによる組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、患者における総コレステロール及び／または低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）を低下させるための方法が提供される。方法は、静脈内もしくは腹腔内投与、または肝臓、または任意選択的に、門脈内血管もしくは肝臓実質への投与を含む、好適な経路を介して組成物を送達することを含む。
【0111】
いくつかの態様では、本発明は、エクスビボ遺伝子療法アプローチを提供する。したがって、いくつかの態様では、（ａ）患者から得られた細胞を、本開示の実施形態による組成物と接触させることと、（ｂ）細胞をそれを必要とする患者に投与することとを含む、患者における総コレステロール及び／またはＬＤＬ－Ｃを低下させるための方法が提供される。
【0112】
実施形態では、方法は、細胞を、任意選択的に、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物、及び／またはＰＣＳＫ９を標的とするマイクロＲＮＡをコードする核酸構築物と接触させることを更に含む。
【0113】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のインビボ及びエクスビボ方法は、家族性高コレステロール血症、一般的な高コレステロール血症、増加したトリグリセリド、インスリン抵抗性、代謝症候群、及び上昇したレベルのコレステロールを特徴とする他の疾患を治療することができる。
【0114】
いくつかの実施形態では、（ａ）患者から得られた細胞を、本開示の実施形態による組成物と接触させることと、（ｂ）細胞をそれを必要とする患者に投与することと、を含む、ＦＨを治療及び／または緩和するためのエクスビボ方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＦＨは、ホモ接合型ＦＨ（ＨｏＦＨ）である。いくつかの実施形態では、ＦＨは、ヘテロ接合型ＦＨ（ＨｅＦＨ）である。いくつかの実施形態では、ＦＨは、ＡＰＯＢ、ＬＤＬＲ、及びＰＣＳＫ９のうちの１つ以上における１つ以上の変異を特徴とする。これらの病原変異は、血清中の高ＬＤＬ－Ｃレベルを治療及び／または緩和するための記載の方法を使用して補正され得る。
【0115】
いくつかの態様では、本開示の実施形態による組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＦＨを治療及び／または緩和するための方法が提供される。そのようなインビボ方法では、組成物は、本明細書に記載の技法のうちのいずれかを使用して投与される。
【0116】
実施形態では、ＦＨを治療及び／または緩和するための方法は、ＰＣＳＫ９を標的とするｍｉＲＮＡを投与することを更に含む。
【0117】
エクスビボ遺伝子療法の利点のうちの１つは、患者の投与前に形質導入された細胞を「サンプリング」する能力である。これによって、有効性が促進され、細胞（複数可）を患者に導入する前に安全性確認を実施することが可能になる。例えば、組み込みの形質導入効率及び／またはクローン性を、生成物の注入の前に評価することができる。肝臓は、独特の再生能力を有し、実質細胞及び非実質細胞の両方がこのプロセスに寄与する。肝臓損傷の際に、肝細胞は部分的に脱分化した前駆細胞に変化することができ、これによって肝細胞及び胆管上皮細胞が生じ、これが、臓器の元の大きさ及び正常な機能を元に戻すことができる。それにもかかわらず、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）は、インビトロでは自然に分裂しない。これは、肝臓に向けたエクスビボ疾患モデリング及び細胞に基づく療法にとっては、重要な制限である。遺伝子組換え細胞のエクスビボ移植は、肝臓移植の魅力的な代替手段ではあるが、この技術を用いる試みは、今のところ成功していない。外科的肝移植は、多くの遺伝性及び後天性肝疾患に対して治癒的／緩和的であるが、依然としてドナーの不足が足かせとなっている。例えば、ＭｃＤｉａｒｍｉｄ，Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌ ２００１；７：４８－５０を参照されたい。
【0118】
いくつかの実施形態では、単離された細胞は、修飾された肝細胞であり得る肝細胞である。いくつかの実施形態では、単離された細胞は、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）である。いくつかの実施形態では、単離された細胞は、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）である。
【0119】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、幹細胞移植の代理物として機能する潜在性を有する。ｉＰＳＣへの成体細胞のリプログラミングは、肝細胞への線維芽細胞のトランス分化を導き、多能性状態を回避する。例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３：３２８－４０、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ＆ Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）．Ｃｅｌｌ １２６：６６３－７６、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０８：９３－７を参照されたい。ｉＰＳＣは、３つの胚葉のうちのいずれかに分化する固有の自己更新能力及び潜在性を有し、先天性肝疾患の治療のために遺伝子補正された移植可能な肝細胞を大量に産生することが可能である。しかしながら、移植のためのｉＰＳＣの生成は、エピジェネティック異常及び染色体再配列の発生、ならびに奇形腫の形成によって制限される。例えば、Ｌｉａｎｇ ＆ Ｚｈａｎｇ（２０１３）．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３：１４９－５９、Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５１：２９７－３０５、Ｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５１１：１７７－８３を参照されたい。
【0120】
肝細胞は、一般に、肝臓損傷が不在場合、休止状態であることに起因して、エクスビボタイプの遺伝子操作の良好な候補ではないと見なされてきたが、ヒト遺伝子療法に必要な程度ではないが、インビトロでその増殖を誘導することができることが、最近の研究によって実証されている。Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１５；３３：１２６４－７１．しかしながら、最近、Ｕｎｚｕらは、成長因子ならびにＷｎｔ、ＥＧＦ、及びＦＧＦシグナル伝達を模倣する小分子のカクテルにヒト初代肝臓細胞をエクスビボ曝露させ、これによって、前駆体細胞へのＰＨＨの効率的なリプログラミングを生じる、増殖性ヒト肝前駆細胞（ＨＰＣ）を生成するための方法を開発した。Ｕｎｚｕ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１９；６９：２２１４－３１．本開示は、エクスビボ遺伝子組換えに効果的に使用することができる組成物及び方法を提供する。
【0121】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のインビボ及びエクスビボ方法のうちのいずれかは、患者の心血管の健康を改善する。いくつかの実施形態では、方法は、実質的に非免疫原性である。
【0122】
いくつかの実施形態では、方法は、単回投与を必要とする。したがって、本発明は、１回のみの治療薬を提供することができ、これは、多くの場合、生涯にわたり、複数の医薬品及び／または手順（例えば、ＬＤＬアフェレシス）を伴う現在の治療プロトコルを顕著に改善することができる。
【0123】
いくつかの実施形態では、方法は、肝細胞におけるＬＤＬ代謝を刺激及び／または増加させる。いくつかの実施形態では、総コレステロール及び／またはＬＤＬ－Ｃを低下させることは、恒久的である。
【0124】
いくつかの実施形態では、方法は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）を治療及び／または緩和することを可能にする。いくつかの実施形態では、方法は、アテローム性動脈硬化症を治療及び／または緩和することを可能にする。
【0125】
いくつかの実施形態では、方法は、投与を行わない総コレステロール及び／またはＬＤＬ－Ｃのレベルと比較して、総コレステロール及び／またはＬＤＬ－Ｃの約４０％超、または約５０％超、または約６０％超、または約７０％超、または約８０％超、または約９０％超低下させることを提供する。
【0126】
いくつかの実施形態では、方法は、血清中のＬＤＬ－Ｃレベルを約５００ｍｇ／ｄＬ未満（約１３ｍｍｏｌ／Ｌ未満）まで低下させる。いくつかの実施形態では、方法は、血清ＬＤＬ－Ｃレベルを、約４５０ｍｇ／ｄＬ未満、または約４００ｍｇ／ｄＬ未満、または約３５０ｍｇ／ｄＬ未満、または約３００ｍｇ／ｄＬ未満、または約２５０ｍｇ／ｄＬ未満、または約２００ｍｇ／ｄＬ未満、または約１５０ｍｇ／ｄＬ未満まで低下させる。いくつかの実施形態では、方法は、血清ＬＤＬ－Ｃレベルを約１３０ｍｇ／ｄＬ未満まで低下させる。
【0127】
いくつかの実施形態では、本組成物及び方法は、ＰＣＳＫ９を低下させることを可能にし、これは、ＰＣＳＫ９標的化マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を使用することによって行うことができる。
【0128】
実施形態では、本遺伝子標的化組成物は、ＰＣＳＫ９をノックダウンすることができる。実施形態では、本遺伝子標的化組成物は、ＬＤＬＲ及びＶＬＤＬＲの分解及びターンオーバーを防止することができる。
【0129】
実施形態では、本遺伝子標的化組成物は、ＰＣＳＫ９を標的とするマイクロＲＮＡを含む。実施形態では、ＰＣＳＫ９を標的とするマイクロＲＮＡ配列は、ＬＤＬＲまたはＶＬＤＬＲ遺伝子とは異なるプロモーターの制御下にある。実施形態では、ＰＣＳＫ９を標的とするマイクロＲＮＡ配列は、ＣＡＧプロモーターの制御下にある（例えば、Ｇｅｎｅ７９（２）：２６９－７７を参照されたい）。実施形態では、ＰＣＳＫ９を標的とするマイクロＲＮＡ配列は、ｍｉＲ－４５１骨格の状況下であり、理論に束縛されることを望むものではないが、これは、標準的ではないＤｉｃｅｒに依存しない経路を介してｍｉＲＮＡプロセッシングを強制し、パッセンジャー鎖活性に起因するオフターゲット効果の生成を回避することができる。Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｃａｒｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１７；４５：１０３６９－７９．
【0130】
実施形態では、本遺伝子標的化組成物は、ＰＣＳＫ９を標的とするマイクロＲＮＡを含む遺伝子標的化組成物を含む追加の組成物を含む方法での使用が見出される。実施形態では、ＰＣＳＫ９を標的とするマイクロＲＮＡ配列は、ＬＤＬＲまたはＶＬＤＬＲ遺伝子とは異なるプロモーターの制御下にある。実施形態では、ＰＣＳＫ９を標的とするマイクロＲＮＡ配列は、ＣＡＧプロモーターの制御下にある（例えば、Ｇｅｎｅ７９（２）：２６９－７７を参照されたい）。実施形態では、ＰＣＳＫ９を標的とするマイクロＲＮＡ配列は、ｍｉＲ－４５１骨格の状況下である。
【0131】
実施形態では、ＰＣＳＫ９を標的とするマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－１９１、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－２２２、及びｍｉＲ－２２４のうちの１つである。
【0132】
ＰＣＳＫ９は、主に肝臓において受容体と複合体を形成することによって、ＬＤＬ受容体の分解を促進する。細胞表面に局在するＬＤＬ受容体は、ＬＤＬと結合し、その後、複合体が、エンドサイトーシスを介してエンドソームに輸送され、酸性条件下でＬＤＬを放出する。ＬＤＬは、アミノ酸とコレステロールとに分解され、ＬＤＬ受容体が、細胞表面に輸送され、ＬＤＬと結合し、細胞内に取り込まれる。この細胞表面へのＬＤＬ受容体のリサイクルは、およそ１５０回行われる。ＰＣＳＫ９は、肝臓細胞における小胞体によって分泌され、細胞膜上でＬＤＬ受容体と結合し、細胞内に取り込まれる。ＰＣＳＫ９が結合したＬＤＬ受容体は、リサイクルされることなくリソソームにおいて分解される。ＰＣＳＫ９はまた、ＬＤＬＲパラログ、ＶＬＤＬＲを調節し、脂肪ＶＬＤＬＲレベルの調節を介して脂肪生成を制限する。
【0133】
ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬ受容体の分解を促進するので、ＰＣＳＫ９を標的とすることによって、血漿中のＬＤＬコレステロールレベルに影響を及ぼすことができる。ヒトにおける機能喪失変異は、低いＬＤＬ－Ｃレベル及び低い心血管疾患率に関連する。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５４：１２６４－７２、Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２００８；１９６：２９－３６を参照されたい。ＰＣＳＫ９機能の完全な喪失は、ヒトまたは哺乳類の生存率または健康に影響を及ぼすとは考えられない。Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２００６；７９：５１４－２３、Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００５；１０２：５３７４－９を参照されたい。ＰＣＳＫ９機能の喪失は、ＬＤＬ－Ｃの低下をもたらし、１５年以上の過去の結果の研究では、ＰＣＳＫ９の１コピーの喪失は、ＬＤＬ－Ｃを低下に移行させ、心血管疾患の発症からのリスク：利益保護の増加をもたらすことが示された。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５４：１２６４－７２．
【0134】
ＲＮＡ干渉及び関連するＲＮＡサイレンシング経路は、遺伝子発現を調節するための非常に特異的な内因性機序を利用する。小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、エフェクターＲＮＡによって誘導されるサイレンシング複合体の形成を通じて、配列特異的様式で相補的な標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳を選択的かつ触媒的にサイレンシングする。最近、ｓｉＲＮＡであるインクリシランが、上昇したＬＤＬコレステロールレベルを有する心血管リスクの高い患者間でＰＣＳＫ９及びＬＤＬコレステロールレベルを低下させることが示された。Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１７；３７６：１４３０－４０．ＰＣＳＫ９配列特異的ｍｉＲＮＡ構築物を使用するＰＣＳＫ９サイレンシングは、高い遺伝子サイレンシング活性で設計することができる。ｍｉＲＮＡ ｍｉＲ－４５１骨格を使用するアプローチは、非標準的なＤｉｃｅｒに依存しない経路を介してｍｉＲＮＡプロセッシングを強制し、パッセンジャー鎖活性に起因するオフターゲット効果の生成を回避することができる。Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｃａｒｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１７；４５：１０３６９－７９．
【0135】
いくつかの実施形態では、任意選択的に、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物が送達される。
【0136】
いくつかの実施形態では、細胞を、任意選択的に、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉに由来するトランスポザーゼ、及び／またはその操作されたバージョンをコードする核酸構築物と接触させる。
【0137】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、もしくはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、及び／またはその操作されたバージョンに由来する。
【0138】
いくつかの実施形態では、ＦＨを治療及び／または緩和する方法は、ステロイド治療の不在下で実施される。グルココルチコイドステロイド（例えば、プレドニゾン）等のステロイドを使用して、免疫応答を低減することによって、ＡＡＶに基づく遺伝子療法の有効性が改善されている。しかしながら、ステロイド治療は、副作用を伴わないわけではない。本開示の組成物及び方法は、実質的に非免疫原性であり得、したがって、ステロイド治療の必要性を排除することができる。
【0139】
いくつかの実施形態では、しかしながら、方法は、ステロイド治療と組み合わせて実施される。
【0140】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせた記載の組成物を投与するために、この方法が使用され得る。追加の治療剤の非限定的な例は、スタチン、エゼチミブ、胆汁酸結合樹脂、エボロクマブ、インクリシラン、ロミタピド、及びミポメルセンのうちの１つ以上を含む。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、スタチン、エゼチミブ、胆汁酸結合樹脂、エボロクマブ、インクリシラン、ロミタピド、及びミポメルセンのうちの１つ以上を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、スタチンは、アトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ）、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ）、ロバスタチン（ＡＬＴＯＣＯＲ、ＡＬＴＯＰＲＥＶ、ＭＥＶＡＣＯＲ）、ピタバスタチン（ＬＩＶＡＬＯ）、プラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ）、ロスバスタチンカルシウム（ＣＲＥＳＴＯＲ）、及びシンバスタチン（ＺＯＣＯＲ）のうちの１つ以上である。
【0141】
態様では、遺伝子導入構築物を含む組成物が提供される。実施形態では、組成物は、（ａ）超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）もしくは低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＬＤＬＲ）、またはその機能的断片をコードする核酸であって、ＶＬＤＬＲが、配列番号４のヌクレオチド配列もしくはそれに対して約９０％の同一性のバリアント、または配列番号５のヌクレオチド配列もしくはそれに対して約９０％の同一性のバリアントを含むヒトＶＬＤＬＲである、核酸と、（ｂ）肝臓特異的プロモーターであって、肝臓特異的プロモーターが、配列番号１５の核酸配列、またはそれに対して約９０％の同一性を有するバリアントを有する、ヒトＬＰ１プロモーターである、肝臓特異的プロモーターと、（ｃ）１つ以上のトランスポザーゼ認識部位及び１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）または端部配列を含む非ウイルスベクターと、を含む。
【0142】
いくつかの実施形態では、スタチン、エゼチミブ、胆汁酸結合樹脂、エボロクマブ、インクリシラン、ロミタピド、及びミポメルセンのうちの１つ以上での治療の必要性を排除する。本方法及び組成物は、総コレステロール及び／またはＬＤＬ－Ｃのレベルの恒久的な減少を提供することができ、したがって、追加の治療剤の必要性を減少または排除することができる。
【0143】
更に、いくつかの実施形態では、方法は、ＬＤＬアフェレシスの必要性を排除する。
【0144】
いくつかの実施形態では、本開示による非ウイルス遺伝子療法のための組成物は、静脈内、門脈内、流体力学的送達、及び直接注射を含む、様々な送達経路を介して投与される。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内である。いくつかの実施形態では、投与は、門脈内、または直接肝臓実質への注射である。例えば、一実施形態では、投与は、対流強化薬剤送達法（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（ＣＥＤ）を使用する実質内肝臓注射である。ＣＥＤは、マイクロステップインフュージョンカニューレの先端に圧力勾配を生成し、中枢神経系の細胞間空間を通じて治療剤を直接送達する技法である。Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＮｅｕｒｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１４（２），３５８－３７１．
【0145】
いくつかの実施形態では、患者への細胞の投与は、静脈内である。静脈内投与は、一般的なアプローチであるが、しかしながら、場合によっては増加した総用量を必要とし得、非標的臓器の形質導入をもたらし得る。また場合によっては、静脈内投与は、卵巣及び精巣において生殖細胞が形質導入される機会が増加し得る。これは、トランスポザーゼを使用する組み込み遺伝子療法では望ましくない。
【0146】
いくつかの実施形態では、細胞への投与は、動脈内、門脈内、及びまたは逆行性静脈内経路である。
【0147】
いくつかの実施形態では、患者への細胞の投与は、門脈内である。
【0148】
いくつかの実施形態では、患者への細胞の投与は、直接の実質内肝投与である。ヒトでは、経皮肝生検は、皮膚、皮下組織、肋間筋、及び腹膜を通じて長い針を肝臓まで導入して、肝臓組織の試験片を得る手順である。この手順は、通常、外来で実施される。いくつかの実施形態では、直接注射は、同様の手順に従うことができ、微小カニューレは、対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ）によって組成物を注射するために使用され得る。ＣＥＤは、圧力によって駆動される髄液流（ｂｕｌｋ ｆｌｏｗ）に依存する、直接注入技法である。これは、現在、遺伝子療法を中枢神経系（ＣＮＳ）に送達するために使用されている。髄液流は、ＣＮＳ内を標的としたカテーテルを通じて溶質を押し出すポンプからの小さな圧力勾配によって生成され、拡散を通じて達成可能なものよりもはるかに大量の薬物分布を提供する。従来の対流送達法と比較して、ＣＥＤは、より高濃度の治療剤、より長い注入時間、及び注入部位におけるより大きな分布体積を生成し、最小限の組織損傷を生じる。ＣＮＳにおける注入速度は、３～１５マイクロリットル／分の範囲である。いくつかの実施形態では、注入速度は、１５マイクロリットル／分よりも高い場合がある。
【0149】
いくつかの実施形態では、肝臓生検は、撮像誘導を用いて実施される。いくつかの実施形態では、肝臓生検は、超音波誘導、経頸静脈、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）、腹腔鏡検査、及び内視鏡超音波を含む画像診断技法を使用して誘導される。いくつかの実施形態では、肝臓の右葉の経皮ＣＥＤ注入（肝臓体積の５／６）が使用され得る。
【0150】
いくつかの実施形態では、本開示による組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む。
【0151】
好適な薬学的組成物を製剤化する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ ｅｄ．，２００５、及びＤｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓシリーズの本であるａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。例えば、注射可能な使用に好適な薬学的組成物は、滅菌注射溶液または分散液を即時調製するための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、及び滅菌粉末を含み得る。静脈内投与に好適な担体としては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌される必要があり、注射操作性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が容易な状態で存在する程度まで流体である必要がある。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定である必要があり、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対応して保存される必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、砂糖、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含むことによって、注射組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【0152】
滅菌注射溶液は、上に列挙された成分のうちの１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に、活性化合物を必要な量で組み込み、必要に応じて、その後濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒、及び上に列挙されたものとは異なる必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これらによって、予め滅菌濾過したその溶液から、活性成分及び任意の所望の追加成分の粉末が得られる。
【0153】
治療化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤等の、体内からの急速な放出に対して治療化合物を保護するであろう担体とともに調製され得る。コラーゲン、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物（例えば、ポリ［１，３－ビス（カルボキシフェノキシ）プロパン－コ－セバシン酸］（ＰＣＰＰ－ＳＡ）マトリックス、脂肪酸二量体－セバシン酸（ＦＡＤ－ＳＡ）コポリマー、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド））、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリエチレングリコールでコーティングされたリポソーム、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。そのような製剤は、標準的な技法を使用して調製することができるか、または例えば、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。また、リポソーム懸濁液は、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の、当業者に既知の方法に従って調製され得る。例えば、手術部位への投与が望ましい場合、半固体、ゲル化、軟質ゲル、または他の製剤（制御放出を含む）が使用され得る。そのような製剤を作製する方法は、当該技術分野において既知であり、生分解性、生体適合性ポリマーの使用を含み得る。例えば、Ｓａｗｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｙａｌｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２００６；７９（３－４）：１４１－１５２を参照されたい。
【0154】
実施形態では、トランスポザーゼの存在下で、本明細書に記載の遺伝子導入構築物を使用して細胞を形質転換して、目的の遺伝子の細胞への安定的な組み込みから生じる安定的にトランスフェクトされた細胞を生成する方法が提供される。実施形態では、安定的な組み込みは、細胞の染色体またはミニ染色体へのポリヌクレオチドの導入を含み、したがって、細胞ゲノムの比較的永続的な部分となる。
【0155】
実施形態では、本発明は、目的の遺伝子、例えば、ＶＬＤＬＲまたはＬＤＬＲが、宿主のゲノムにうまく導入されたかどうかを決定することに関する。一実施形態では、方法は、目的の遺伝子に隣接するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施することと、得られた増幅ポリメラーゼ連鎖反応生成物のサイズを決定することと、得られた生成物のサイズを参照サイズと比較することとを含み得、得られた生成物のサイズが予想されるサイズと一致する場合、目的の遺伝子が、うまく導入されている。
【0156】
実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、限定されないが、遺伝子導入構築物及び／またはトランスポザーゼを含む組成物）を含む宿主細胞が提供される。実施形態では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞、例えば、哺乳類細胞である。
【0157】
実施形態では、本開示の方法によって形質転換された細胞を含み得るトランスジェニック生物が提供される。一例では、生物は、哺乳類または昆虫であり得る。生物が哺乳類である場合、生物としては、限定されないが、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギ等を挙げることができる。生物が昆虫である場合、生物は、限定されないが、ミバエ、蚊、アメリカタバコガの幼虫等を挙げることができる。
【0158】
組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、キット、パック、またはディスペンサー内に含まれ得る。
【0159】
また、本明細書で提供されるのは、ｉ）本発明の先述の遺伝子導入構築物のうちのいずれか、及び／または本発明の先述の細胞のうちのいずれか、ならびにｉｉ）容器、を含むキットである。ある特定の実施形態では、キットは、キットを使用するための説明書を更に含む。ある特定の実施形態では、先述のキットのうちのいずれかは、トランスポザーゼをコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ構築物を更に含み得る。
【0160】
本発明は、以下の非限定的な実施例により更に説明される。
【実施例】
【0161】
実施例１：トランスポゾン発現ベクターの設計
非ウイルスのトランスポゾン発現ベクターを、ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼ技術（ＡＴＵＭ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）を使用して設計し、クローニングする。トランスポゾン発現ベクターは、ＬＰ１プロモーターに作動可能に連結され、ＬＰ１プロモーターによって駆動されるヒトＶＬＤＬＲを含む。マウスＬＰ１－ｖｌｄｌｒを含むトランスポゾン発現ベクターも作製する。ヒトＬＤＲＬ－／－の個々の多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）疾患細胞株または形質転換されたヒトもしくは胚性幹細胞（ＥＳＣ）を使用する。他の試験した細胞株としては、ヒト肝臓（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７）、及び非肝臓（ＣＨＯ、ＨＴ１０８０、及びＨＥＫ２９３）細胞株が挙げられる。Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｌｄｌｒｔｍ１Ｈｅｒ／Ｊ（ＪＡＸ）マウスモデル（ｌｄｌｒ－／－）を使用する。
非ウイルスのトランスポゾン発現ベクターを、ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼ技術（ＡＴＵＭ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）を使用して設計し、クローニングする。トランスポゾン発現ベクターは、ＬＰ１プロモーターに作動可能に連結され、ＬＰ１プロモーターによって駆動されるヒトＶＬＤＬＲを含む。マウスＬＰ１－ｖｌｄｌｒを含むトランスポゾン発現ベクターも作製する。ヒトＬＤＲＬ－／－の個々の多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）疾患細胞株または形質転換されたヒトもしくは胚性幹細胞（ＥＳＣ）を使用する。他の試験した細胞株としては、ヒト肝臓（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７）、及び非肝臓（ＣＨＯ、ＨＴ１０８０、及びＨＥＫ２９３）細胞株が挙げられる。Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｌｄｌｒｔｍ１Ｈｅｒ／Ｊ（ＪＡＸ）マウスモデル（ｌｄｌｒ－／－）を使用する。
【0162】
図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ、４Ｆ、４Ｇ、及び４Ｈは、インビトロトランスフェクション、及び転移有効性の評価、及びヒト幹細胞における発現研究、及びｌｄｌｒ－／－マウスにおけるＬＰ１－ルシフェラーゼ生体内分布で使用される構築物の概略図を示す。図４Ａは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含むトランスポゾン構築物を示す。図４Ｂ及び４Ｃは、設計された発現ベクターの転移有効性を決定するために使用されるＬＰ１－ＧＦＰトランスポゾン構築物を示す。図４Ｄは、肝細胞への分化後の、ＶＬＤＬＲでの幹細胞のトランスフェクションの表現型での結果を評価するために使用されるＬＰ１－ＶＬＤＲＬ構築物を示す。マウス、ブタ、カニクイザル、及びヒト配列を含むＬＰ１－ＶＬＤＲＬ構築物を調製する。図４Ｅは、異なる経路を使用して生体内分布を評価するために、肝臓への静脈内、門脈内、及び実質内経路によって投与されるＬＰ１向上ヒトＶＬＤＬＲ（ｅ－ＬＤＬＲ）構築物を示す。
【0163】
また、構築物は、ＰＣＳＫ９をノックダウンして、ＬＤＬＲ及びＶＬＤＬＲの分解及びターンオーバーを防止するためにｍｉＲＮＡを含むように設計する。図４Ｆは、ＬＰ１とは異なるプロモーターの制御下の、ＰＣＳＫ９標的化ｍｉＲＮＡを含む構築物を示し、構築物が、異なる経路を使用して生体内分布及び用量範囲を評価するために、肝臓への静脈内、門脈内、または実質内経路によって投与され得る。図４Ｇは、ＬＰ１とは異なるプロモーターの制御下の、ＬＰ１－ＶＬＤＲＬトランスポゾン及びＰＣＳＫ９標的化ｍｉＲＮＡを含む、トランスポゾンを含む構築物を示す。図４Ｈは、ＬＰ１とは異なるプロモーターの制御下の、ＬＰ１－ｅ－ＬＤＬＲトランスポゾン及びＰＣＳＫ９標的化ｍｉＲＮＡを含む、トランスポゾンを含む構築物を示す。
【0164】
実施例２：トランスジェニックマウスを使用したインビボ実験
この実施例の実験は、投薬、忍容性、生体内分布、安全性、及び有効性を決定するための、ｌｄｌｒ－／－マウスへのＬＰ１－ｖｌｄｌｒ及びＬＰ１－ルシフェラーゼ構築物の静脈内、門脈内、及び実質内肝臓注射を含む。ユカタンＬｄｌｒ－／－トランスジェニック小型ブタにおける同様の実験は、適切な構築物及び投与手順の安全性、忍容性、及び有効性を示すように設計しなければならない。生体内分布、用量応答、薬物動態、薬力学、安全性、及び病理学的研究は、ＧＬＰ環境のユカタンブタまたはカニクイザルのいずれかにおいて実施され得る。
この実施例の実験は、投薬、忍容性、生体内分布、安全性、及び有効性を決定するための、ｌｄｌｒ－／－マウスへのＬＰ１－ｖｌｄｌｒ及びＬＰ１－ルシフェラーゼ構築物の静脈内、門脈内、及び実質内肝臓注射を含む。ユカタンＬｄｌｒ－／－トランスジェニック小型ブタにおける同様の実験は、適切な構築物及び投与手順の安全性、忍容性、及び有効性を示すように設計しなければならない。生体内分布、用量応答、薬物動態、薬力学、安全性、及び病理学的研究は、ＧＬＰ環境のユカタンブタまたはカニクイザルのいずれかにおいて実施され得る。
【0165】
実施例３：肝臓及び非肝臓細胞株における、転移有効性及びトランスポザーゼ（Ｔｓ）：トランスポゾン（Ｔｎ）比の決定
構成的ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下でＧＦＰを発現するトランスポゾンの転移有効性は、ＰＧＫ１－ＧＦＰ Ｔｎでトランスフェクトされた後、肝臓及び非肝臓細胞株（すなわち、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、ＨＴ１８０１）の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析によって決定する。構築物は、ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼを含む。図４Ａは、この実施例で使用され得るベクターの一例を示す。上の表１に列挙されるものを含む、様々な肝臓特異的プロモーターを使用する。
構成的ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下でＧＦＰを発現するトランスポゾンの転移有効性は、ＰＧＫ１－ＧＦＰ Ｔｎでトランスフェクトされた後、肝臓及び非肝臓細胞株（すなわち、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、ＨＴ１８０１）の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析によって決定する。構築物は、ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼを含む。図４Ａは、この実施例で使用され得るベクターの一例を示す。上の表１に列挙されるものを含む、様々な肝臓特異的プロモーターを使用する。
【0166】
実施例４：肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）の選択
肝臓細胞株及び非肝臓細胞株を、上の実施例３で決定した転移有効性及びＴｓ：Ｔｎ比に基づいて選択する。異なる肝臓特異的プロモーター（表１）を使用する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現レベルは、細胞株をトランスポゾン（図４Ａ及び４Ｂ）及びトランスポザーゼと共トランスフェクトすることによって決定する。肝臓特異的プロモーターは、Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３；７：３７５－８５に記載されているように評価する。ＧＦＰ発現は、トランスフェクションの１日後、１週間後、２週間後、及び４週間後のＦＡＣＳ分析によって決定する。
肝臓細胞株及び非肝臓細胞株を、上の実施例３で決定した転移有効性及びＴｓ：Ｔｎ比に基づいて選択する。異なる肝臓特異的プロモーター（表１）を使用する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現レベルは、細胞株をトランスポゾン（図４Ａ及び４Ｂ）及びトランスポザーゼと共トランスフェクトすることによって決定する。肝臓特異的プロモーターは、Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３；７：３７５－８５に記載されているように評価する。ＧＦＰ発現は、トランスフェクションの１日後、１週間後、２週間後、及び４週間後のＦＡＣＳ分析によって決定する。
【0167】
実施例５：ヒトＶＬＤＬＲ、向上させたＬＤＬＲ（Ｌ３３９Ｄ、Ｋ８３０Ｒ、Ｃ８３９Ａ）、及びＰＣＳＫ９のノックダウンを含むトランスポゾン構築物の評価
肝臓及び非肝臓細胞株においてトランスフェクション実験を実施して、ＬＤＬＲ変異によって引き起こされたＦＨを改善するように設計された構築物の発現を評価する。２つのトランスポゾン（Ｔｎ）構築物の設計は、ヒトＶＬＤＬＲを含む構築物、ならびにプロタンパク質変換酵素サブチリシンケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）及びＬＤＬＲの誘導性分解物（ＩＤＯＬ）との相互作用を低減するためにヒトＬＤＬＲ ｃＤＮＡのコード配列に導入されるアミノ酸置換（Ｌ３３９Ｄ、Ｋ８３０Ｒ、及びＣ８３９Ａ）を有する、向上させたヒトＶＬＤＬＲ（ｅ－ＬＤＬＲ）を含む構築物を含む。加えて、構築物は、ＰＣＳＫ９をノックダウンして、ＬＤＬＲ及びＶＬＤＬＲの分解及びターンオーバーを防止するためにｍｉＲＮＡを含むように設計する、図４Ｆ～４Ｈを参照されたい。
肝臓及び非肝臓細胞株においてトランスフェクション実験を実施して、ＬＤＬＲ変異によって引き起こされたＦＨを改善するように設計された構築物の発現を評価する。２つのトランスポゾン（Ｔｎ）構築物の設計は、ヒトＶＬＤＬＲを含む構築物、ならびにプロタンパク質変換酵素サブチリシンケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）及びＬＤＬＲの誘導性分解物（ＩＤＯＬ）との相互作用を低減するためにヒトＬＤＬＲ ｃＤＮＡのコード配列に導入されるアミノ酸置換（Ｌ３３９Ｄ、Ｋ８３０Ｒ、及びＣ８３９Ａ）を有する、向上させたヒトＶＬＤＬＲ（ｅ－ＬＤＬＲ）を含む構築物を含む。加えて、構築物は、ＰＣＳＫ９をノックダウンして、ＬＤＬＲ及びＶＬＤＬＲの分解及びターンオーバーを防止するためにｍｉＲＮＡを含むように設計する、図４Ｆ～４Ｈを参照されたい。
【0168】
特定の細胞株、Ｔｓ：Ｔｎ比、強力な構成的ＬＳＰ、及び最も安全なＴｓ構築物（すなわち、規定された部位特異的組み込み）を、上の実施例３及び４に記載されるように選択する。ＬＤＬＲ及びＶＬＤＬＲを評価するために、トランスフェクトされていない細胞及びトランスフェクトされた細胞において、ＦＡＣＳ分析を前述の方法によって実施する。Ｓｏｍａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２０１４；１１５：５９１－９、Ｋｏｚａｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３：５４－６２、Ｔｕｒｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１６；２４：６２０－３５を参照されたい。
【0169】
実施例６：ＦＨ患者ｉＰＳＣ、及びトランスジェニック－／－マウス、及び大型動物モデルにおけるインビボ研究のためのトランスポゾン（Ｔｎ）及びトランスポザーゼ（Ｔｓ）構築物の生成
患者のＬＤＲＬ－／－幹細胞（ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）におけるインビトロ試験、及びトランスジェニックｌｄｌｒ－／－マウスにおけるインビボ試験（ルシフェラーゼ生体内分布を含む）のためのトランスポゾン（Ｔｎ）及びトランスポザーゼ（Ｔｓ）構築物を同定する。使用する構築物は、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、及び図４Ｆに概略的に示される。研究のうちのいくつかを、大型動物、例えば、ユカタンミニブタＬＤＲＬ－／－（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）、及び非ヒト霊長類（カニクイザル、ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において行う。
患者のＬＤＲＬ－／－幹細胞（ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）におけるインビトロ試験、及びトランスジェニックｌｄｌｒ－／－マウスにおけるインビボ試験（ルシフェラーゼ生体内分布を含む）のためのトランスポゾン（Ｔｎ）及びトランスポザーゼ（Ｔｓ）構築物を同定する。使用する構築物は、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、及び図４Ｆに概略的に示される。研究のうちのいくつかを、大型動物、例えば、ユカタンミニブタＬＤＲＬ－／－（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）、及び非ヒト霊長類（カニクイザル、ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において行う。
【0170】
実施例７：ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ（Ｈｓ）／ＭＬＴトランスポザーゼでトランスフェクトされたＨｕｈ－７細胞におけるｍＲＮＡ発現
この研究の目的は、ＨＵＨ７細胞における２つのトランスジェニック細胞株－ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ及びＬＰ１－ＶＬＤＬＲの生成による、ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２の組み込み効率を実証することであった。
この研究の目的は、ＨＵＨ７細胞における２つのトランスジェニック細胞株－ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ及びＬＰ１－ＶＬＤＬＲの生成による、ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２の組み込み効率を実証することであった。
【0171】
細胞株生成
本開示のＭＬＴトランスポザーゼ（配列番号９）と組み合わせた２つの異なるプラスミド（ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ及びＬＰ１－ＶＬＤＬＲ単独）を使用する、ある特定のヌクレオフェクション条件（１５個の異なるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プログラムと組み合わせた３つの異なる４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液、及び１つの対照（ヌクレオフェクションなし））を使用して、ＨＵＨ７細胞をトランスフェクションした。７２時間後、抗生物質治療（Ｋａｎ＋）を適用して、陽性にトランスフェクトされたクローンを選択した。選択抗生物質を含む細胞培地を２～３日ごとに変更し、細胞毒性について１４日間毎日、目視で細胞を検査した。ＭＬＴトランスポザーゼのゲノム編集能力を、１４日後のＧＦＰシグナルの免疫蛍光検出を使用して定量化した。
本開示のＭＬＴトランスポザーゼ（配列番号９）と組み合わせた２つの異なるプラスミド（ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ及びＬＰ１－ＶＬＤＬＲ単独）を使用する、ある特定のヌクレオフェクション条件（１５個の異なるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プログラムと組み合わせた３つの異なる４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液、及び１つの対照（ヌクレオフェクションなし））を使用して、ＨＵＨ７細胞をトランスフェクションした。７２時間後、抗生物質治療（Ｋａｎ＋）を適用して、陽性にトランスフェクトされたクローンを選択した。選択抗生物質を含む細胞培地を２～３日ごとに変更し、細胞毒性について１４日間毎日、目視で細胞を検査した。ＭＬＴトランスポザーゼのゲノム編集能力を、１４日後のＧＦＰシグナルの免疫蛍光検出を使用して定量化した。
【0172】
細胞株検証
細胞株の生成及び増殖中に、陽性（ＨＥＫ２９３）及び陰性対照（ＨＵＨ７）細胞株を使用した。Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＴ（ｄｄＰＣＲ）を実施して、細胞当たりのＬＰ１－ＶＬＤＬＲ導入遺伝子のコピー数を定量化した。２つの陽性対照は、（１）ＬＰ１－ＶＬＤＬＲプラスミド単独、及び（２）ヒトゲノムＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡの業界標準である、ｇＢｌｏｃｋｓ（商標）Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、長さ１２５～３０００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片）であった。陰性対照は、（１）ＨＥＫ２９３細胞、（２）治療されていないＨＵＨ７細胞、（３）ＨＵＨ７細胞＋ＭＬＴトランスポザーゼ、及び（４）Ｈ２Ｏ対照であった。
細胞株の生成及び増殖中に、陽性（ＨＥＫ２９３）及び陰性対照（ＨＵＨ７）細胞株を使用した。Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＴ（ｄｄＰＣＲ）を実施して、細胞当たりのＬＰ１－ＶＬＤＬＲ導入遺伝子のコピー数を定量化した。２つの陽性対照は、（１）ＬＰ１－ＶＬＤＬＲプラスミド単独、及び（２）ヒトゲノムＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡの業界標準である、ｇＢｌｏｃｋｓ（商標）Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、長さ１２５～３０００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片）であった。陰性対照は、（１）ＨＥＫ２９３細胞、（２）治療されていないＨＵＨ７細胞、（３）ＨＵＨ７細胞＋ＭＬＴトランスポザーゼ、及び（４）Ｈ２Ｏ対照であった。
【0173】
ｑＰＣＲを実施して、全ての細胞株における導入遺伝子の発現レベルを定量化した。以下の３つの陽性対照を使用した：（１）ＨＥＫ２９３細胞、（２）プラスミド単独、及び（３）ｇＢｌｏｃｋｓ（商標）Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ。以下の３つの陰性対照を使用した：（１）ＨＵＨ７細胞、（２）ＨＵＨ７細胞＋ＭＬＴトランスポザーゼ、（３）Ｈ２Ｏ対照。ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ単独を、ランダム導入の対照として使用した。
【0174】
ＬＤＬ－Ｃ取り込みプロトコル
Ａｂｃａｍ ＬＤＬ取り込みキット（カタログ番号ａｂ１３３１２７）を供給元の指示に従って使用した。ヌクレオフェクトされたＨＵＨ７細胞を７０～８０％の密集度で使用した。ヌクレオフェクトされた細胞へのＬＤＬ取り込みの検出のために、ＨＵＨ７細胞をＬＤＬ－Ｄｙｌｉｇｈｔ（商標）５４９で染色した。核の数の定量化のために、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を使用してハイコンテンツ撮像を実施して、読み取りを実施した。
Ａｂｃａｍ ＬＤＬ取り込みキット（カタログ番号ａｂ１３３１２７）を供給元の指示に従って使用した。ヌクレオフェクトされたＨＵＨ７細胞を７０～８０％の密集度で使用した。ヌクレオフェクトされた細胞へのＬＤＬ取り込みの検出のために、ＨＵＨ７細胞をＬＤＬ－Ｄｙｌｉｇｈｔ（商標）５４９で染色した。核の数の定量化のために、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を使用してハイコンテンツ撮像を実施して、読み取りを実施した。
【0175】
使用した試薬
本実験で使用した試薬を表２に示す。
本実験で使用した試薬を表２に示す。
【表2】
【0176】
結果
図６は、ヌクレオフェクションの２４時間後のＨｕｈ７細胞のＧＦＰ発現を示し、４つのパネル（左から右）は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液キット（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、プログラムＣＡ－１３７、ＣＭ－１５０、ＣＭ－１３８、及びＥＯ－１００で得られたデータを示す。各パネルの上段は、ＧＦＰ蛍光を示し、下段は、明視野顕微鏡データを示す。図７は、ヌクレオフェクションの４時間後のＨｕｈ７細胞のＧＦＰ発現の結果を示し、４つのパネル（左から右）は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液キット、プログラムＣＡ－１３７、ＣＭ－１５０、ＣＭ－１３８、及びＥＯ－１００で得られたデータを示す。各パネルの上段は、ＧＦＰ蛍光を示し、下段は、明視野顕微鏡データを示す。図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、及び８Ｄは、ヌクレオフェクションの２４時間後のヌクレオフェクション効率の定量化の結果：Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液キット、プログラムＣＡ－１３７（図８Ａ）、ＣＭ－１５０（図８Ｂ）、ＣＭ－１３８（１０，７００個の生細胞、Ｑ２％ＧＦＰ：５１％）（図８Ｃ）、及びＥＯ－１００（図８Ｄ）で得られたデータを示す。各図の上段は、ＧＦＰ蛍光を示し、下段は、ＦＡＣＳプロットを示す：（１）１０，７００個の生細胞、Ｑ２％ＧＦＰ：５１％、（２）１３，３００個の生細胞、Ｑ２％ＧＦＰ：３９％、（３）１３，８００個の生細胞、Ｑ２％ＧＦＰ：４５％、及び（４）１０，８００個の生細胞、Ｑ２％ＧＦＰ：７１％。
図６は、ヌクレオフェクションの２４時間後のＨｕｈ７細胞のＧＦＰ発現を示し、４つのパネル（左から右）は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液キット（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、プログラムＣＡ－１３７、ＣＭ－１５０、ＣＭ－１３８、及びＥＯ－１００で得られたデータを示す。各パネルの上段は、ＧＦＰ蛍光を示し、下段は、明視野顕微鏡データを示す。図７は、ヌクレオフェクションの４時間後のＨｕｈ７細胞のＧＦＰ発現の結果を示し、４つのパネル（左から右）は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液キット、プログラムＣＡ－１３７、ＣＭ－１５０、ＣＭ－１３８、及びＥＯ－１００で得られたデータを示す。各パネルの上段は、ＧＦＰ蛍光を示し、下段は、明視野顕微鏡データを示す。図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、及び８Ｄは、ヌクレオフェクションの２４時間後のヌクレオフェクション効率の定量化の結果：Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液キット、プログラムＣＡ－１３７（図８Ａ）、ＣＭ－１５０（図８Ｂ）、ＣＭ－１３８（１０，７００個の生細胞、Ｑ２％ＧＦＰ：５１％）（図８Ｃ）、及びＥＯ－１００（図８Ｄ）で得られたデータを示す。各図の上段は、ＧＦＰ蛍光を示し、下段は、ＦＡＣＳプロットを示す：（１）１０，７００個の生細胞、Ｑ２％ＧＦＰ：５１％、（２）１３，３００個の生細胞、Ｑ２％ＧＦＰ：３９％、（３）１３，８００個の生細胞、Ｑ２％ＧＦＰ：４５％、及び（４）１０，８００個の生細胞、Ｑ２％ＧＦＰ：７１％。
【0177】
図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、及び９Ｇは、以下のように、トランスフェクションの７日後の異なる条件下でトランスフェクトされたＨｕｈ７細胞のＦＡＣＳプロットを示す：（図９Ａ）プログラムなし－陰性アッセイ対照、（図９Ｂ）ｐｍａｘＧＦＰ－陽性アッセイ対照、（図９Ｃ）ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰプラスミド（すなわち、ＬＰ１プロモーター、超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）遺伝子、及び向上されたＰＧＫプロモーターによって駆動された発現（ｅＧＦＰ）を含むプラスミド）、（図９Ｄ）ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ＋ＭＬＴ１、（図９Ｅ）ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ＋ＭＬＴ２、（図９Ｆ）ＭＬＴ１、及び（図９Ｇ）ＭＬＴ２。以下の表３は、図９Ａ～９Ｇについての、トランスフェクションの各々に関する情報を提供する。
【表3】
【0178】
図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄ、図９Ｅ、図９Ｆ、及び図９ＧのＦＡＣＳプロットは、ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ＋ＭＬＴ１及びＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ＋ＭＬＴ２（パネル４及び５）の両方が、この研究における陰性対照（パネル１、６、及び７）と比較した場合、Ｈｕｈ７細胞を効果的にトランスフェクトすることが可能であったことを示す。トランスポザーゼを含まないＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰは、ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰとトランスポザーゼ（ＭＬＴ１またはＭＬＴ２）との組み合わせの発現と同様の発現を有することが観察された。これは、トランスポザーゼの存在が、Ｈｕｈ７細胞の生存率に悪影響を及ぼさないことを示す。
【0179】
ＶＬＤＬＲプラスミド及びＭＬＴトランスポザーゼ２で治療されたＨｕｈ７細胞に対する、治療されていないＨｕｈ７細胞のＬＤＬ－Ｃ取り込みを示す図１０は、Ｈｕｈ７細胞をＶＬＤＬＲプラスミド及びＭＬＴトランスポザーゼ２で治療した場合、Ｈｕｈ７細胞のＬＤＬ－Ｃ取り込みが約３０～５０％増加したことを示す。
【0180】
変動する条件下でのＶＬＤＬＲ発現のｑＰＣＲ結果を示す図１１は、試料１（ＬＰ１－ｈＶＬＤＬＲ）及び試料２（ＬＰ１－ｈＶＬＤＬＲ＋ＰＧＫ－ＧＦＰ）におけるＭＬＴトランスポザーゼ２の存在が、ＶＬＤＬＲ発現を増加させることを示す。これは、対照と比較した場合、ヒト肝細胞（Ｈｕｈ７細胞）におけるＬＰ１－ｈＶＬＤＬＲの発現の劇的な１０倍超の増加を示す。
【0181】
結論として、この研究は、とりわけ、Ｈｕｈ７細胞をＬＰ１－ｈＶＬＤＬＲで治療した場合の、ＶＬＤＬＲ ｍＲＮＡ発現の発現における増加を実証した。この研究はまた、治療されていない細胞株と比較して、ＶＬＤＬＲプラスミド及びＭＬＴトランスポザーゼ２で治療された場合、ＬＤＬ－Ｃ取り込みが約３０％～５０％増加することを実証した（図１０）。
【0182】
実施例８：転移活性を決定するために使用されるフローサイトメトリー分析
この研究は、トランスフェクトされた細胞株のインビトロ転移を決定するためのフローサイトメトリーの使用を評価した。この研究では、フローサイトメトリーを使用して、変動する肝細胞及び非肝細胞株におけるＧＦＰの存在を測定した。
この研究は、トランスフェクトされた細胞株のインビトロ転移を決定するためのフローサイトメトリーの使用を評価した。この研究では、フローサイトメトリーを使用して、変動する肝細胞及び非肝細胞株におけるＧＦＰの存在を測定した。
【0183】
１５ｍＷの空冷４８８アルゴンイオンレーザーを備えたフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＢＤＩＳ）で試料を分析した。５３０／３０ｎｍバンドパス（ＢＰ）除去後に、緑色ＧＦＰ蛍光を収集した。蛍光チャネル間で電子補正を使用して、残留スペクトル重複を除去した。４ディケード対数スケールでＧＦＰ蛍光データを表示した。低流量設定（１２μＬ／分）を試料採取に使用して、ヒストグラムの変動係数を改善した。シングレットゲート内で、各試料の最小１０，０００の事象を収集した。ＣＥＬＬ Ｑｕｅｓｔｙソフトウェア（ＢＤＩＳ）で多変量データの分析を実施し、ＭｏｄＦｉｔ ＬＴｙソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｔｏｐｓｈａｍ，ＭＥ）でヒストグラムの細胞周期分析を実施した。本実験で使用した試薬を表４に示す。
【表4】
【0184】
この研究では、ＤＮＡドナー（プラスミド）候補（図１２）を試験し、細胞株におけるフローサイトメトリーによって、それらのＧＦＰ発現を測定した。
【0185】
これらのインビトロ臨床前発見研究の結果は、ヒト疾患を治療するためにトランスポゾン構築物を使用する概念の証明を提供する。また、この研究で得られたデータは、ドナーＧＦＰを測定することによって、転移した細胞の数を定量化するためのフローサイトメトリーの使用を支持する。
【0186】
実施例９：Ｈｕｈ－７ヒト肝細胞におけるＰＧＫ－ＧＦＰ及びＬＰ１－ＶＬＤＬＲの共トランスフェクション
この研究の目的は、ＰＧＫ－ＧＦＰ及びＬＰ１－ＶＬＤＬＲで共トランスフェクトされた、本開示によるＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２を含む及び含まないＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ及びＶＬＤＬＲ導入遺伝子の組み込みを評価することであった。
この研究の目的は、ＰＧＫ－ＧＦＰ及びＬＰ１－ＶＬＤＬＲで共トランスフェクトされた、本開示によるＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２を含む及び含まないＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ及びＶＬＤＬＲ導入遺伝子の組み込みを評価することであった。
【0187】
ＨＵＨ７細胞株調製
ＨＵＨ７細胞株を、１５個の異なるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プログラムと組み合わせた４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液Ｖ、及び１つの対照（ヌクレオフェクションなし）で試験した。２４時間後に、その後の全ての実験に対して最も高い効率及び最も低い死亡率を有するＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）条件を選択した。
ＨＵＨ７細胞株を、１５個の異なるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プログラムと組み合わせた４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液Ｖ、及び１つの対照（ヌクレオフェクションなし）で試験した。２４時間後に、その後の全ての実験に対して最も高い効率及び最も低い死亡率を有するＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）条件を選択した。
【0188】
２つの異なるトランスポザーゼ－ＭＬＴトランスポザーゼ１及びＭＬＴトランスポザーゼ２と組み合わせた、２つの異なるプラスミド（ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ及びＬＰ１－ＶＬＤＬＲ単独）を使用して、以前に事前決定したヌクレオフェクション条件を使用して、ＨＵＨ７細胞をトランスフェクトした。７２時間後、抗生物質治療（Ｋａｎ＋）を適用して、陽性にトランスフェクトされたクローンを選択した。選択抗生物質を含有する細胞培地を２～３日ごとに変更し、細胞毒性について１４日間毎日、目視で細胞を検査した。２つのトランスポザーゼ（ＭＬＴ１及びＭＬＴ２）のゲノム編集能力を定量化し、１４日後のＧＦＰシグナルの免疫蛍光検出を使用して比較した。
【0189】
アッセイ最適化
最適化の目的のために、細胞株の生成及び増殖中に、陽性（ＨＥＫ２９３）及び陰性対照（ＨＵＨ７）細胞株を使用した。ｄｄＰＣＲアッセイのための特異的Ｔａｑｍａｎプローブを設計して、ＶＬＤＬＲ導入遺伝子を検出して、ＬＰ１ ＶＬＤＬＲ導入遺伝子コピー数を定量化した。コピー数決定アッセイのための参照遺伝子。安定的な組み込みのためＧｂｌｏｃｋ（陽性対照）及びプラスミド特異的プローブ（陰性対照）を用いたＶｌＤＬＲ発現レベル。
最適化の目的のために、細胞株の生成及び増殖中に、陽性（ＨＥＫ２９３）及び陰性対照（ＨＵＨ７）細胞株を使用した。ｄｄＰＣＲアッセイのための特異的Ｔａｑｍａｎプローブを設計して、ＶＬＤＬＲ導入遺伝子を検出して、ＬＰ１ ＶＬＤＬＲ導入遺伝子コピー数を定量化した。コピー数決定アッセイのための参照遺伝子。安定的な組み込みのためＧｂｌｏｃｋ（陽性対照）及びプラスミド特異的プローブ（陰性対照）を用いたＶｌＤＬＲ発現レベル。
【0190】
ウエスタンブロッティング及び免疫細胞染色（ＩＣＣ）実験では、最大２つの抗体を２つの希釈で試験した。同じ２つの抗体を使用して、２つの細胞株においてＩＣＣを実施した。更なる実験のために、特定の希釈の単一抗体を選択した。
【0191】
ＬＤＬ取り込みアッセイキット（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１３３１２７）を使用して、ＬＤＬ取り込みを評価した。修正せずに、製造業者によって提供されたプロトコルに従った。細胞を最大４つの異なる密度で播種した。実験は、技術的に３回実施した。ハイコンテンツ撮像及び画像分析を実施した。細胞内の蛍光ＬＤＬの強度を計算した。
【0192】
新しく生成したＶＬＤＬＲ／ＰＧＫ－ＧＦＰ及びＶＬＤＬＲ細胞株におけるＶＬＤＬＲ発現の評価を、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プログラムＣＡ－１３７（Ｌｏｎｚａ）を使用して実施した。ＨＥＫ２９３細胞を陽性対照に使用し、ＨＵＨ７細胞を陰性対照に使用した。ｄｄＰＣＲを実施して、細胞当たりのＬＰ１－ＶＬＤＬＲ導入遺伝子のコピー数を定量化し、全ての細胞株における導入遺伝子の発現レベルを定量化した。ウエスタンブロットによって、タンパク質レベルでのＶＬＤＬＲの定量化を実施した。
【0193】
核の数の定量化のために、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を使用してハイコンテンツ撮像及び画像分析を実施し、選択された抗体を用いてヒトＶＬＤＬＲに対して免疫細胞染色を実施した。
【0194】
試薬
本実験で使用した試薬を表５に要約する。
本実験で使用した試薬を表５に要約する。
【表5】
【0195】
結果
図１３Ａ、１３Ｂ、及び１３Ｃは、図１２の遺伝子導入構築物を使用した、トランスポザーゼ（ＭＬＴ１及びＭＬＴ２）を用いた（「トランスポザーゼ＋」）、及び用いない（「トランスポザーゼ－」）アッセイでの、Ｈｕｈ７細胞におけるＧＦＰ発現の画像及びＦＡＣＳプロットである。図１３Ａ、１３Ｂ、及び１３Ｃは、それぞれ、２４時間（図１３Ａ）、７２時間（図１３Ｂ）、及び７日（図１３Ｃ）でのトランスポザーゼ－アッセイ（上）及びトランスポザーゼ＋アッセイ（下）のデータを示す。
図１３Ａ、１３Ｂ、及び１３Ｃは、図１２の遺伝子導入構築物を使用した、トランスポザーゼ（ＭＬＴ１及びＭＬＴ２）を用いた（「トランスポザーゼ＋」）、及び用いない（「トランスポザーゼ－」）アッセイでの、Ｈｕｈ７細胞におけるＧＦＰ発現の画像及びＦＡＣＳプロットである。図１３Ａ、１３Ｂ、及び１３Ｃは、それぞれ、２４時間（図１３Ａ）、７２時間（図１３Ｂ）、及び７日（図１３Ｃ）でのトランスポザーゼ－アッセイ（上）及びトランスポザーゼ＋アッセイ（下）のデータを示す。
【0196】
図１２のドナーＤＮＡ構築物を使用して、図１３Ａ、１３Ｂ、及び１３Ｃに示されるＦＡＣＳ分析の結果を生成した。２４時間後、トランスポザーゼを含む（トランスポザーゼ＋）及びトランスポザーゼを含まない（トランスポザーゼ－）の両方のアッセイでは、ＧＦＰ発現は両方で約２％で定量化され、ほとんど～全くなかった（図１３Ａ）。トランスポザーゼ－でトランスフェクトされた細胞では、７２時間でのＧＦＰ発現は、０％であった一方で、トランスポザーゼ＋細胞（トランスポザーゼ＋ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ及びＰＧＫ－ＧＦＰ）では、７２時間で２３％のＧＦＰ発現が観察された（図１３Ｂ）。７日目でのトランスポザーゼ－細胞では７％のＧＦＰ発現があった一方で、７２時間でのトランスポザーゼ＋細胞では２１％の発現があった（図１３Ｃ）。このデータは、ｄｄＰＣＲ及びＦＡＣＳの両方によって定量化した。
【0197】
したがって、これらの実験で得られたデータは、図１３Ａ、１３Ｂ、及び１３Ｃに示されるように、トランスポザーゼ＋ＰＧＫ－ＧＦＰ及びＬＰ１－ＶＬＤＬＲがＨｕｈ７細胞を転移することができることを示す。これらのトランスフェクトされた細胞の比較は、トランスポザーゼ－細胞とトランスポザーゼ＋細胞との間の顕著な差を示す。７２時間でのトランスポザーゼ＋ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ及びＰＧＫ－ＧＦＰでトランスフェクトされたＨｕｈ７細胞は、２３％のＧＦＰ発現を示した。これは、７２時間でのトランスポザーゼ＋ＬＰ１－ＶＬＤＬＲ及びＰＧＫ－ＧＦＰが、有害な細胞死を引き起こすことなく、Ｈｕｈ７細胞をトランスフェクトすることができることを示す。７日目でのトランスポザーゼ＋でトランスフェクトされた細胞は依然として２１％のＧＦＰ発現を示した一方で、トランスポザーゼ－でトランスフェクトされた（すなわち、転移にトランスポザーゼを使用しなかった）細胞は、７日目に７％のＧＦＰ発現を示した。このデータを比較する場合、実験結果からの対照ＧＦＰ％陽性細胞を考慮すると、依然として７日後に顕著である１４％のＧＦＰ発現を示すことを見ることができる。
【0198】
実施例１０：ＬＰ１－ＶＬＤＬＲで転移されたＨｕｈ－７細胞におけるＬＤＬ取り込み
この研究の目的は、本開示のＭＬＴトランスポザーゼ（ヘルパーＲＮＡ）及び肝臓特異的プロモーターＬＰ１によって駆動されるヒトＶＬＤＬＲ（コドン最適化）を用いて細胞をトランスフェクトするドナーＤＮＡ構築物を使用して転移した、Ｈｕｈ７細胞における細胞レベルでのＬＤＬ取り込み及び調節を評価することであった。目標は、２週間の増殖後のＨｕｈ７細胞におけるＶＬＤＬＲ導入遺伝子の組み込みの成功を示すことであった。キットは、ヒトＬＤＬを用いる。Ｈｕｈ７細胞は通常、ヒトＶＬＤＬＲを発現しないが、ＬＤＬＲを発現する。ＬＤＬＲに加えてＶＬＤＬＲを発現する転移されたＨｕｈ７細胞におけるＬＤＬ取り込みの増加が見られることが予想された。培養されたＨｕ－７細胞へのＬＤＬ取り込みの検出のための蛍光プローブとして、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５５０を使用した。
この研究の目的は、本開示のＭＬＴトランスポザーゼ（ヘルパーＲＮＡ）及び肝臓特異的プロモーターＬＰ１によって駆動されるヒトＶＬＤＬＲ（コドン最適化）を用いて細胞をトランスフェクトするドナーＤＮＡ構築物を使用して転移した、Ｈｕｈ７細胞における細胞レベルでのＬＤＬ取り込み及び調節を評価することであった。目標は、２週間の増殖後のＨｕｈ７細胞におけるＶＬＤＬＲ導入遺伝子の組み込みの成功を示すことであった。キットは、ヒトＬＤＬを用いる。Ｈｕｈ７細胞は通常、ヒトＶＬＤＬＲを発現しないが、ＬＤＬＲを発現する。ＬＤＬＲに加えてＶＬＤＬＲを発現する転移されたＨｕｈ７細胞におけるＬＤＬ取り込みの増加が見られることが予想された。培養されたＨｕ－７細胞へのＬＤＬ取り込みの検出のための蛍光プローブとして、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５５０を使用した。
【0199】
方法論
本研究で使用したプロトコルは、９６ウェルプレートのために設計した（他のサイズのプレートについては、各ウェルに適用する培地／溶液の体積を適宜調整した）。
１．９６ウェルプレートに３×１０４個の細胞を播種し、細胞を一晩増殖させる。ＨｅｐＧ２細胞については、治療前に２日間細胞を増殖させる。
２．翌日または３日目に、細胞を実験化合物またはビヒクルで２４時間治療する。
３．治療期間の終了時に、培養培地を７５－１００μｌ／ウェルのＬＤＬ－ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５５０作業溶液に置き換える。
４．３７℃のインキュベーター内で、更に３～４時間または実験プロトコルで使用する期間の間、細胞をインキュベートする。
５．ＬＤＬ取り込みインキュベーションの終了時に、培養培地を吸引し、新鮮な培養培地またはＰＢＳと置き換える。
６．励起波長５４０ｎｍ及び発光波長５７０ｎｍをそれぞれ測定することが可能なフィルタを備えた顕微鏡下で、ＬＤＬ取り込みの程度を調べる。
本研究で使用したプロトコルは、９６ウェルプレートのために設計した（他のサイズのプレートについては、各ウェルに適用する培地／溶液の体積を適宜調整した）。
１．９６ウェルプレートに３×１０４個の細胞を播種し、細胞を一晩増殖させる。ＨｅｐＧ２細胞については、治療前に２日間細胞を増殖させる。
２．翌日または３日目に、細胞を実験化合物またはビヒクルで２４時間治療する。
３．治療期間の終了時に、培養培地を７５－１００μｌ／ウェルのＬＤＬ－ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５５０作業溶液に置き換える。
４．３７℃のインキュベーター内で、更に３～４時間または実験プロトコルで使用する期間の間、細胞をインキュベートする。
５．ＬＤＬ取り込みインキュベーションの終了時に、培養培地を吸引し、新鮮な培養培地またはＰＢＳと置き換える。
６．励起波長５４０ｎｍ及び発光波長５７０ｎｍをそれぞれ測定することが可能なフィルタを備えた顕微鏡下で、ＬＤＬ取り込みの程度を調べる。
【0200】
試薬
本実験で使用した試薬を表６に要約する。
本実験で使用した試薬を表６に要約する。
【表6】
【0201】
結果
Ａｂｃａｍ ＬＤＬ取り込みアッセイキット（カタログ番号ａｂ１３３１２７）を供給元の指示に従って使用して、本開示のトランスポザーゼ（ＲＮＡヘルパー）及びＬＰＩ－ＶＬＤＬＲドナーで転移し、培養物中で１４日間維持したＨｕｈ７細胞におけるＬＤＬ取り込みを決定した。ＬＰ１－ＶＬＤＬＲでヌクレオフェクトされた、ヌクレオフェクトされたＨＵＨ７細胞を、７０％～８０％の密集度まで１４日間増殖させた。ＬＤＬ取り込みの検出のために、ヌクレオフェクトされた細胞をＬＤＬ－Ｄｙｌｉｇｈｔ（商標）５４９で染色した。ハイコンテンツ撮像を用いて、読み取りを実施した。
Ａｂｃａｍ ＬＤＬ取り込みアッセイキット（カタログ番号ａｂ１３３１２７）を供給元の指示に従って使用して、本開示のトランスポザーゼ（ＲＮＡヘルパー）及びＬＰＩ－ＶＬＤＬＲドナーで転移し、培養物中で１４日間維持したＨｕｈ７細胞におけるＬＤＬ取り込みを決定した。ＬＰ１－ＶＬＤＬＲでヌクレオフェクトされた、ヌクレオフェクトされたＨＵＨ７細胞を、７０％～８０％の密集度まで１４日間増殖させた。ＬＤＬ取り込みの検出のために、ヌクレオフェクトされた細胞をＬＤＬ－Ｄｙｌｉｇｈｔ（商標）５４９で染色した。ハイコンテンツ撮像を用いて、読み取りを実施した。
【0202】
図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、及び１４Ｄは、ヌクレオフェクトされていない（治療されていない）ＨＥＫ２９３及びＨｕｈ７細胞におけるベースラインＬＤＬ取り込みを示す。図１４Ａは、ＬＤＬ取り込みのみの治療されていないＨＥＫ２９３細胞を示し、図１４Ｂは、ＬＤＬ取り込みのみの治療されていないＨｕｈ７細胞を示し、図１４Ｃは、染色されていない治療されていないＨＥＫ２９３細胞を示し、図１４Ｄは、染色されていない治療されていないＨｕｈ７細胞を示す。図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、及び１４Ｄに示されるように、治療されていない染色されていない細胞（０％）と比較して、ＬＤＬ－Ｄｙｌｉｇｈｔ（商標）５４９で染色されたヌクレオフェクトされていない（治療されていない）ＨＥＫ２９３及びＨｕｈ７細胞（３０％～５０％）の両方で、ＬＤＬ取り込みシグナルが検出された。ＨＥＫ２９３及びＨｕｈ７細胞型の両方は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）を有する。正常酸素圧条件下のＨｕｈ７細胞は、超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）を発現しないが、ＨＥＫ２９３は、ＬＤＬＲ及びＶＬＤＬＲの両方を発現する。
【0203】
図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ、及び１５Ｅは、転移されていないＨｕｈ７細胞に対する転移されたＨｕｈ７細胞におけるＬＤＬ取り込みを示す。比較のために、図１５Ａは、転移されていない（トランスポザーゼ－）ＨＥＫ２９３細胞を示し、図１５Ｂは、転移されていない（トランスポザーゼ－）Ｈｕｈ７細胞を示し、図１５Ｃは、ヒトＬＰ１－ＶＬＤＬＲプラスミド（ｐＶＬＤＬＲ）でヌクレオフェクトされた転移されていない（トランスポザーゼ－）Ｈｕｈ７細胞を示し、図１５Ｄは、ヒトＬＰ１－ＶＬＤＬＲプラスミド（ｐＶＬＤＬＲ）でヌクレオフェクトされた、ＭＬＴ１で転移されたＨｕｈ７細胞を示し、図１５Ｅは、ヒトＬＰ１－ＶＬＤＬＲプラスミド（ｐＶＬＤＬＲ）でヌクレオフェクトされた、ＭＬＴトランスポザーゼ２で転移されたＨｕｈ７細胞を示す。示されるように、ＬＤＬ取り込みシグナルは、ＭＬＴ１またはＭＬＴトランスポザーゼ２（７０％～９０％）のいずれかで転移されたＨｕｈ７細胞と比較して、ＬＤＬ－Ｄｙｌｉｇｈｔ（商標）５４９で染色された、ヌクレオフェクトされていないＨＥＫ２９３及びＨｕｈ７細胞、ならびに転移されていないＨｕｈ７細胞（３０％～５０％）において小さかった。
【0204】
結果は、転移されたＨｕｈ７細胞の表面上のＶＬＤＬＲの増加が、ＬＤＬ取り込みの増加を引き起こしたことを示唆する。
【0205】
実施例１１：ｌｄｌｒ－／－マウスにおけるＬＮＰ ＬＰ１－ルシフェラーゼ／トランスポザーゼＢＬＩの薬力学的用量範囲
この研究の目的は、同じ背景染色の株の野生型（ｌｄｌｒ＋／＋及びｌｄｌｒ－／－）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、インビボでの蛍光標識された脂質ナノ粒子の肝取り込みを比較することであった。試験物品の肝内注射後の２つの時点（３日目及び５日目）で全身生物発光撮像（ＢＬＩ）によって、ルシフェラーゼの発現を記録した。
この研究の目的は、同じ背景染色の株の野生型（ｌｄｌｒ＋／＋及びｌｄｌｒ－／－）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、インビボでの蛍光標識された脂質ナノ粒子の肝取り込みを比較することであった。試験物品の肝内注射後の２つの時点（３日目及び５日目）で全身生物発光撮像（ＢＬＩ）によって、ルシフェラーゼの発現を記録した。
【0206】
この研究は、以下の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤：イオン化可能なリピドイド、コレステロール、リン脂質、及びＰＥＧ脂質を使用した。
【0207】
動物群
本研究は、目的に基づいて交配されたナイーブマウス、株：ｌｄｌｒ－／－及び野生型（ｌｄｌｒ＋／＋）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を使用した。オスの数：１６匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型（ｌｄｌｒ＋／＋）（及び２つの代替物）／１６匹のｌｄｌｒ－／－ノックアウト（及び２つの代替物）。投薬開始時の標的年齢：約１０週齢；及び到着時の標的重量：２６．９＋１．７ ｇ．
本研究は、目的に基づいて交配されたナイーブマウス、株：ｌｄｌｒ－／－及び野生型（ｌｄｌｒ＋／＋）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を使用した。オスの数：１６匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型（ｌｄｌｒ＋／＋）（及び２つの代替物）／１６匹のｌｄｌｒ－／－ノックアウト（及び２つの代替物）。投薬開始時の標的年齢：約１０週齢；及び到着時の標的重量：２６．９＋１．７ ｇ．
【0208】
この研究で使用した３つのマウスコホートを表７、表８、及び表９に記載する。
【表7】
【表8】
【表9】
【0209】
試薬及び試験物品
本実験で使用した試薬を表１０に要約する。
本実験で使用した試薬を表１０に要約する。
【表10】
【0210】
本研究で使用したビヒクルは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４、ＮＯ Ｃａ２＋、またはＭｇ２＋（約４℃で保存）であった。
【0211】
本研究で使用した試験物品は、以下であった：
・ＰＢＳ：ＣａまたはＭｇを含まない１ＸＰＢＳ緩衝液、注射用滅菌溶液（２７Ｇ～３１Ｇ注射針を使用した）。
・試験物品１：空のＬＮＰ。
・試験物品２：ＬＮＰ ＬＰ１－ルシフェラーゼ２／ＭＬＴトランスポザーゼ２（７５０μｇの核酸／ｍＬ）（ストック）。
・ＰＢＳ：ＣａまたはＭｇを含まない１ＸＰＢＳ緩衝液、注射用滅菌溶液（２７Ｇ～３１Ｇ注射針を使用した）。
・試験物品１：空のＬＮＰ。
・試験物品２：ＬＮＰ ＬＰ１－ルシフェラーゼ２／ＭＬＴトランスポザーゼ２（７５０μｇの核酸／ｍＬ）（ストック）。
【0212】
表１１は、本実験で使用した試験物品の用量を要約する。
【表11】
【0213】
結果
マウスの合計８つの群に、異なる用量の試験物品（ＬＰ１－ｖｌｄｌｒ＋ＭＬＴトランスポザーゼ）または空のＬＮＰ（シャム手術）のいずれかを注入した。図１６Ａ及び１６Ｂは、３日目（図１６Ａ）及び５日目（図１６Ｂ）のコホート１のＢＬＩを示す。図１７Ａ及び１７Ｂは、３日目（図１７Ａ）及び５日目（図１７Ｂ）のコホート２のＢＬＩを示す。図１８Ａ及び１８Ｂは、３日目（図１８Ａ）及び５日目（図１８Ｂ）のコホート３のＢＬＩを示す。図１９は、長期維持（それぞれ２６日及び３３日）後の群６及び群８に属する動物からのＢＬＩを示す。
マウスの合計８つの群に、異なる用量の試験物品（ＬＰ１－ｖｌｄｌｒ＋ＭＬＴトランスポザーゼ）または空のＬＮＰ（シャム手術）のいずれかを注入した。図１６Ａ及び１６Ｂは、３日目（図１６Ａ）及び５日目（図１６Ｂ）のコホート１のＢＬＩを示す。図１７Ａ及び１７Ｂは、３日目（図１７Ａ）及び５日目（図１７Ｂ）のコホート２のＢＬＩを示す。図１８Ａ及び１８Ｂは、３日目（図１８Ａ）及び５日目（図１８Ｂ）のコホート３のＢＬＩを示す。図１９は、長期維持（それぞれ２６日及び３３日）後の群６及び群８に属する動物からのＢＬＩを示す。
【0214】
興味深いことに、野生型マウスだけでなくまた、ｌｄｌｒ－／－マウス（群５、６、７、８）は、図１６Ａ、１６Ｂ、１７Ａ、１７Ｂ、１８Ａ、１８Ｂ、及び１９に示されるように、ドナーＤＮＡの顕著な取り込みを示した。空のＬＮＰは、ｗｔまたはｌｄｌｒ－／－マウスのいずれにも致死効果を有さなかった（図１６Ａ、１６Ｂ、１７Ａ、１７Ｂ）。
【0215】
高用量のＬＮＰは、３日及び５日間で両方のｗｔマウスにおいてドナーＤＮＡの転移に成功したことを示したが、ｌｄｌｒ－／－マウスにおいては、いかなる有望な効果も示さなかった（図１７Ａ及び１７Ｂ）。しかしながら、高用量のＬＮＰは、ｗｔマウス（群２）においても、５日目に発光パターンの減少を示した（図１７Ｂ）。一方、中用量は、両日の野生型（群３）において有効なままであったが、５日目にはｌｄｌｒ－／－（群６）マウスにおいて有効性を示さなかった（図１７Ｂ）。興味深いことに、低用量は、ｗｔ及びｌｄｌｒ－／－マウスの両方に顕著な効果を示した（図１８Ａ及び１８Ｂ）。中用量及び低用量の試験物品を投与した２つの群の動物（群６及び８）を、長期間－２６及び３３日間にわたって保持した場合、低用量の動物（群８）は、安定的に組み込まれたルシフェラーゼＤＮＡから生じる発光の継続的な発現を示した（図２０）。群２からの１匹の動物、群５からの２匹の動物、及び群６からの１匹の動物は、外科的手順に起因して死亡した。
【0216】
結論として、低用量（０．３５ｍｇ／ｋｇ）の試験物品は、最良の発光結果を示した。低用量は、比較的長期間にわたって、最良の組み込みまたは転移効率を呈した。
【0217】
実施例１１：安定的な局所的肝臓組み込み
図２０の左パネルは、肝臓の左側葉に６．２５ｕｇのＤＮＡの肝臓総用量で注射され、注射後２６日目に撮像した、ドナーＤＮＡ単独を含有する５０ｕＬのＬＮＰを投与した、ｌｄｌｒ－／－動物を示す。図２０の右パネルは、肝臓の左側葉に９．３７５ｕｇの核酸（ＤＮＡ６．２５ｕｇ、３．１２５ｕｇのＲＮＡ）の肝臓総用量で注入され、注入後２６日目に撮像した、ドナーＤＮＡ及びヘルパーＲＮＡの両方を含有する５０ｕＬのＬＮＰを投与したｌｄｌｒ－／－動物を示す。図２０の結果は、ＬＰ１－ルシフェラーゼ２／ＭＬＴトランスポザーゼを含有する肝臓特異的ＬＮＰ製剤が、ｌｄｌｒ－／－動物において肝臓の左側葉に局所的かつ標的化された注射によって投与される場合、試験物品の単回用量の後に、ドナーＤＮＡの安定的な局所的肝臓組み込みが生じることを示す。加えて、肝外組み込みの証拠はなく、本アプローチによって送達される標的化療法を実証する。
図２０の左パネルは、肝臓の左側葉に６．２５ｕｇのＤＮＡの肝臓総用量で注射され、注射後２６日目に撮像した、ドナーＤＮＡ単独を含有する５０ｕＬのＬＮＰを投与した、ｌｄｌｒ－／－動物を示す。図２０の右パネルは、肝臓の左側葉に９．３７５ｕｇの核酸（ＤＮＡ６．２５ｕｇ、３．１２５ｕｇのＲＮＡ）の肝臓総用量で注入され、注入後２６日目に撮像した、ドナーＤＮＡ及びヘルパーＲＮＡの両方を含有する５０ｕＬのＬＮＰを投与したｌｄｌｒ－／－動物を示す。図２０の結果は、ＬＰ１－ルシフェラーゼ２／ＭＬＴトランスポザーゼを含有する肝臓特異的ＬＮＰ製剤が、ｌｄｌｒ－／－動物において肝臓の左側葉に局所的かつ標的化された注射によって投与される場合、試験物品の単回用量の後に、ドナーＤＮＡの安定的な局所的肝臓組み込みが生じることを示す。加えて、肝外組み込みの証拠はなく、本アプローチによって送達される標的化療法を実証する。
【0218】
実施例１２：ｌｄｌｒ－／－マウスにおける肝臓特異的ＬＮＰ製剤の安全性及び有効性の評価
本研究では、ＬＰ１－ｖｌｄｌｒ／ＭＬＴトランスポザーゼを使用する肝臓特異的ＬＮＰ製剤を肝臓の左側葉に直接注射することによって、ｌｄｌｒ－／－マウスに投与した。図２１Ａは、有効性評価の結果を示し、治療されていない（ドナー単独）マウスと比較した、治療されたｌｄｌｒ－／－マウスにおける、７日目（Ｄ７）及び１５日目（Ｄ１５）での参照範囲と比較したトリグリセリド（ｍｇ／ｄＬ）の低下を示す。図２１Ｂは、肝臓機能の指標である、試験動物の血液中の（ｕ／Ｌでの）肝臓酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を測定した、安全性評価の結果を示す。図２１Ｂは、各々、参照（「１」）範囲、ならびにＤ７（「２」）、及びＤ１５（「３」）のデータを含む、治療されていない群、治療された群、及びＰＢＳ群についてのデータを示す。
本研究では、ＬＰ１－ｖｌｄｌｒ／ＭＬＴトランスポザーゼを使用する肝臓特異的ＬＮＰ製剤を肝臓の左側葉に直接注射することによって、ｌｄｌｒ－／－マウスに投与した。図２１Ａは、有効性評価の結果を示し、治療されていない（ドナー単独）マウスと比較した、治療されたｌｄｌｒ－／－マウスにおける、７日目（Ｄ７）及び１５日目（Ｄ１５）での参照範囲と比較したトリグリセリド（ｍｇ／ｄＬ）の低下を示す。図２１Ｂは、肝臓機能の指標である、試験動物の血液中の（ｕ／Ｌでの）肝臓酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を測定した、安全性評価の結果を示す。図２１Ｂは、各々、参照（「１」）範囲、ならびにＤ７（「２」）、及びＤ１５（「３」）のデータを含む、治療されていない群、治療された群、及びＰＢＳ群についてのデータを示す。
【0219】
これらの結果は、トリグリセリドが、正常参照範囲と比較して約４０％の低下を示すことを実証する。ＬＤＬ－Ｃに短期的な変化は観察されなかった。また、直接肝臓注射に起因するＡＬＴの初期上昇（図２１Ａ、７日目）は、その後、正常参照範囲に戻る（図２１Ａ、１５日目）。
【0220】
定義
以下の定義は、本明細書に開示の発明に関連して使用される。別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
以下の定義は、本明細書に開示の発明に関連して使用される。別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【0221】
「インビボ」という用語は、対象の体内で起こる事象を指す。
【0222】
「エクスビボ」という用語は、対象の体から除去された細胞、組織、及び／または臓器に対する治療または手順の実施に関与する事象を指す。適切な場合、細胞、組織、及び／または臓器は、治療または手術の方法で対象の体に戻され得る。
【0223】
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、ある特定の位置での１つ以上の置換、欠失、及び／または付加の方式によって参照の核酸またはアミノ酸配列とは異なる核酸またはアミノ酸配列を含む核酸またはタンパク質を包含するが、これらに限定されない。バリアントは、１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電されたまたは荷電されていないアミノ酸の置換を含み得る。
【0224】
本明細書で使用される場合、「担体」または「ビヒクル」は、薬物投与に好適な担体材料を指す。本明細書で有用な担体及びビヒクルとしては、当該技術分野において既知の任意のそのような材料、例えば、無毒であり、かつ有害な様式で組成物の他の構成要素と相互作用しない任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤、界面活性剤等が挙げられる。
【0225】
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または妥当な利益／リスク比に見合った他の問題もしくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適な、化合物、材料、組成物、及び／または投薬形態を指す。
【0226】
「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、ならびに不活性成分を含むことが意図される。活性薬学的成分へのそのような薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤の使用は、当業者に周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤が活性薬学的成分と不適合でない限り、本発明の療法組成物におけるその使用が企図される。他の薬物等の追加の活性薬学的成分も、記載の組成物及び方法に組み込まれ得る。
【0227】
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、１つ、または２つ以上を意味し得る。
【0228】
更に、参照された数値表示に関連して使用される場合の「約」という用語は、その参照された数値表示に、その参照された数値表示の最大１０％を加算または減算することを意味する。例えば、「約５０」という言葉は、４５から５５の範囲を包含する。
【0229】
本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という単語及びその変形は、リスト内のアイテムの列挙が、本技術の組成物及び方法でも有用であり得る他の同様のアイテムを除外するものではないように、非限定的であることを意図する。同様に、「し得る（ｃａｎ）」及び「し得る（ｍａｙ）」という用語、ならびにそれらの変形は、一実施形態が、ある特定の要素または特色を含み得る（ｃａｎ）かまたは含み得る（ｍａｙ）列挙が、それらの要素または特色を含まない本技術の他の実施形態を除外しないように、非限定的であることを意図する。
【0230】
含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含有すること、または有すること等の同義語としての「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という開放的な用語は、発明、本発明、または本発明の実施形態について記載及び特許請求するために本明細書で使用され、代替的に、「からなること」または「から本質的になること」等の代替的な用語を使用して記載され得る。
本明細書で使用される場合、「好ましい」及び「好ましくは」という単語は、ある特定の状況下である特定の利益をもたらす技術の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態も、同じかまたは他の状況下で好ましい場合がある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用でないことを意味せず、本技術の範囲から他の実施形態を除外することを意図しない。
本明細書で使用される場合、「好ましい」及び「好ましくは」という単語は、ある特定の状況下である特定の利益をもたらす技術の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態も、同じかまたは他の状況下で好ましい場合がある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用でないことを意味せず、本技術の範囲から他の実施形態を除外することを意図しない。
【0231】
等価物
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載したが、更なる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明の任意の変型、使用、または適応を網羅するものであり、本発明が属する技術分野において知られているか、または慣行に含まれるような本開示からの逸脱、及び前述される本質的な特徴に適用され得るもの、ならびに添付の請求項の範囲に含まれるような本開示からの逸脱を含むことを理解されたい。
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載したが、更なる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明の任意の変型、使用、または適応を網羅するものであり、本発明が属する技術分野において知られているか、または慣行に含まれるような本開示からの逸脱、及び前述される本質的な特徴に適用され得るもの、ならびに添付の請求項の範囲に含まれるような本開示からの逸脱を含むことを理解されたい。
【0232】
当業者であれば、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に具体的に記載される特定の実施形態の多数の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図される。
【0233】
参照による組み込み
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0234】
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前に単独でそれらの開示が提供されている。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【0235】
本明細書で使用される場合、全ての見出しは単に本明細書の構成のためのものであり、いかなる様式においても開示を制限することを意図したものではない。いかなる個々のセクションの内容も、全てのセクションに等しく適用可能であり得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図19】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【配列表】
【国際調査報告】