特表 2023-524024 アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸及び遺伝子治療のためのベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-08

(54)【発明の名称】アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸及び遺伝子治療のためのベクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20230601BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230601BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230601BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230601BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20230601BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20230601BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230601BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230601BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230601BHJP

   A61K 38/45 20060101ALI20230601BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230601BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20230601BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20230601BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230601BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54 ZNA

C12N15/864 100Z

C12N5/10

C12N7/01

C12Q1/68

C12Q1/6851 Z

A61K35/76

A61P25/00

A61K48/00

A61K38/45

A61K31/7088

G01N33/50 Z

G01N33/48 M

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022566010

(86)(22)【出願日】2021-04-22

(85)【翻訳文提出日】2022-12-26

(86)【国際出願番号】 US2021028658

(87)【国際公開番号】W WO2021221995

(87)【国際公開日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】63/077,144

(32)【優先日】2020-09-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/016,507

(32)【優先日】2020-04-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510069249

【氏名又は名称】ファイザー・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】レオネ， パオラ

(72)【発明者】

【氏名】フランシス， ジェレミー

(72)【発明者】

【氏名】アサフ， バセル タリク

(72)【発明者】

【氏名】アサノ， ショー

(72)【発明者】

【氏名】ヘールズ， キャサリン

(72)【発明者】

【氏名】バーグ， アリソン ピー．

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

2G045AA24

2G045BA14

2G045BB22

2G045CB01

2G045DA36

2G045FA16

2G045FB12

2G045JA01

4B063QA01

4B063QA05

4B063QQ02

4B063QQ53

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR59

4B063QR62

4B063QR66

4B063QS05

4B063QS16

4B063QS25

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4B063QS36

4B063QX02

4B065AA90X

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4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

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4B065BC50

4B065CA27

4B065CA44

4C084AA13

4C084DC25

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZC411

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4C086MA01

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4C086NA14

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4C086ZC41

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA65

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZC51

(57)【要約】

本開示は、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、特にカナバン病の欠乏又は機能不全に関連する疾患及び障害の治療における使用のための、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸、及びその変異体を含む組換え核酸及び遺伝子治療ベクターに関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２の核酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする単離核酸。

【請求項2】

配列番号２の核酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸。

【請求項3】

配列番号２の核酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸を含むベクターゲノム。

【請求項4】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムである、請求項３に記載のベクターゲノム。

【請求項5】

自己相補的である、請求項３又は４に記載のベクターゲノム。

【請求項6】

配列番号２の核酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％同一の核酸配列を含む修飾核酸を含むベクターゲノムと、Ｏｌｉｇ００１、Ｏｌｉｇ００２、Ｏｌｉｇ００３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－ＤＪ／９及びＡＡＶ－ＬＫ０３のカプシドからなる群から選択されるカプシドと、を含む、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。

【請求項7】

前記カプシドが、Ｏｌｉｇ００１、Ｏｌｉｇ００２、又はＯｌｉｇ００３カプシドである、請求項６に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項8】

前記カプシドが、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）を含むＯｌｉｇ００１カプシドであり、前記ＶＰ１が、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項６又は７に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項9】

前記カプシドが、ＶＰ１を含むオリゴ００１カプシドであり、前記ＶＰ１が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項６～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項10】

前記ベクターゲノムが自己相補的である、請求項６～９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項11】

前記ベクターゲノムが、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、エンハンサー、プロモーター、エクソン、イントロン、及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル配列からなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを更に含む、請求項６～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項12】

前記ベクターゲノムは、少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ＣＢＡプロモーターのハイブリッド形態（ＣＢｈプロモーター）、ニワトリＢ－アクチン（ＣＢＡ）エクソン、ＣＢＡイントロン、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ｐｏｌｙＡからなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを更に含む、請求項６～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項13】

前記ベクターゲノムが、配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９の核酸配列を含む少なくとも１つのＩＴＲ、配列番号６又は配列番号１７の核酸配列を含むエンハンサー、配列番号７の核酸配列を含むプロモーター、配列番号８又は配列番号１８の核酸配列を含むエクソン、配列番号９の核酸配列を含むイントロン、配列番号１０の核酸配列を含むイントロン、及び配列番号１１の核酸配列を含むｐｏｌｙＡからなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを更に含む、請求項６～１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項14】

５’から３’に、
ａ）配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９の核酸配列を含む、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）、
ｂ）配列番号６又は配列番号１７の核酸配列を含むエンハンサー、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含むプロモーター、
ｄ）配列番号８又は配列番号１８の核酸配列を含むエクソン、
ｅ）配列番号９の核酸配列を含むイントロン、
ｆ）配列番号１０の核酸配列を含むイントロン、
ｇ）配列番号２の核酸配列を含むアスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸、
ｈ）配列番号１１の核酸配列を含むｐｏｌｙＡ、及び
ｉ）配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９の核酸配列を含むＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶベクター。

【請求項15】

前記核酸が自己相補的である、請求項１４に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項16】

前記ベクターが、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）を含むＯｌｉｇ００１カプシドを含み、前記ＶＰ１が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項１４又は１５に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項17】

ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）を含むＯｌｉｇ００１カプシドを含むｒＡＡＶベクターであって、前記ＶＰ１は、配列番号１４のアミノ酸配列と、５’から３’に、
ａ）配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９の核酸配列を含む、ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）、
ｂ）配列番号６又は配列番号１７の核酸配列を含むＣＭＶエンハンサー、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、
ｄ）配列番号８又は配列番号１８の核酸配列を含むＣＢＡエクソン１、
ｅ）配列番号９の核酸配列を含むＣＢＡイントロン１、
ｆ）配列番号１０の核酸配列を含むＭＭＶイントロン、
ｇ）配列番号２の核酸配列を含むアスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸、
ｈ）配列番号１１の核酸配列を含むＢＧＨ ｐｏｌｙＡ、及び
ｉ）配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９の核酸配列を含むＡＡＶ２ ＩＴＲ、を含む自己相補性核酸と、を含む、ｒＡＡＶベクター。

【請求項18】

請求項６～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターを含む、医薬組成物。

【請求項19】

ＡＳＰＡの欠乏又は機能障害に関連する疾患、障害又は状態を治療及び／又は予防する方法であって、治療有効量の請求項６～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、又は請求項１７に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

【請求項20】

前記ＡＳＰＡの欠乏又は機能障害に関連する疾患、障害又は状態が、カナバン病である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ｒＡＡＶベクターが、脳及び／又は中枢神経系に直接投与される、請求項１９又は２０に記載の方法。

【請求項22】

前記ｒＡＡＶベクターが、脳実質、脊柱管、くも膜下腔、脳の脳室、大槽、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される中枢神経系の領域に投与される、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記ｒＡＡＶベクターが、実質内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、大槽内投与、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって投与される、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

請求項１に記載の単離核酸、請求項２に記載の修飾核酸、請求項３～５のいずれか一項に記載のベクターゲノム、又は請求項６～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターを含む、宿主細胞。

【請求項25】

ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｂ－５０、又は任意の他のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、及びＨＴ１０８０からなる群から選択される、請求項２４に記載の宿主細胞。

【請求項26】

浮遊培養における増殖に適応したＨＥＫ２９３細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。

【請求項27】

アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）番号ＰＴＡ１３２７４を有するＨＥＫ２９３細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。

【請求項28】

ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶカプシド（Ｃａｐ）タンパク質、アデノウイルス（Ａｄ）早期領域１Ａ（Ｅ１ａ）タンパク質、Ａｄ Ｅ１ｂタンパク質、Ａｄ Ｅ２ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質、及びウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項29】

治療有効量の請求項１に記載の単離核酸、請求項２に記載の修飾核酸、請求項３～５のいずれか一項に記載のベクターゲノム、請求項６～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、又は請求項１８に記載の医薬組成物を含む、カナバン病（ＣＤ）の治療のためのキット。

【請求項30】

キット構成要素のうちの１つ以上を使用するための説明書を含むラベル又は添付文書を更に含む、請求項２９に記載のキット。

【請求項31】

ＡＳＰＡの欠乏又は機能障害に関連する疾患、障害又は状態の治療又は予防における使用のための、請求項１に記載の単離核酸、請求項２に記載の修飾核酸、請求項３～５のいずれか一項に記載のベクター、請求項６～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、又は請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項32】

前記疾患、障害又は状態が、カナバン病である、請求項３１に記載の使用のための単離核酸、修飾核酸、ベクターゲノム、ｒＡＡＶベクター、又は医薬組成物。

【請求項33】

ＡＳＰＡの欠乏又は機能障害に関連する疾患、状態の障害を治療及び／又は予防するための医薬の製造における、請求項１に記載の単離核酸、請求項２に記載の修飾核酸、請求項３～５のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項６～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターの使用。

【請求項34】

前記疾患、障害又は状態が、カナバン病である、請求項３３に記載の使用。

【請求項35】

対象の脳における導入遺伝子の生物学的分布を決定する方法であって、前記導入遺伝子は、Ｏｌｉｇ００１カプシドを含むｒＡＡＶベクターから発現され、前記方法は、
ａ）脳室内（ＩＣＶ）注射又は実質内（ＩＰ）注射による、ｒＡＡＶベクターの前記対象への投与と、
ｂ）脳の固定と、
ｃ）脳の電気泳動クリアリングと、
ｄ）脳組織切片の３Ｄ顕微鏡撮像と、
ｅ）導入遺伝子発現の定量化と、を含む、方法。

【請求項36】

前記導入遺伝子が、マーカーをコードし、前記マーカーは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記導入遺伝子が、ＡＳＰＡをコードする、請求項３５に記載の方法。

【請求項38】

前記導入遺伝子発現が、ｒＡＡＶベクター形質導入効率と相関する、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

細胞形態の評価及び空間的位置決定による細胞型指向性の評価を含むステップ（ｆ）を更に含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

導入遺伝子発現の体積レンダリングを更に含む、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／０１６，５０７号、及び２０２０年９月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／０７７，１４４号の優先権を主張する。これらの出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を使用する方法、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むベクター、並びにＮ－アセチル－Ｌ－アスパラギン酸の細胞異化の減少に関連する疾患、障害及び状態、例えば、カナバン病を含む、機能的ＡＳＰＡのレベルの減少に関連する疾患、障害及び状態の治療におけるベクターの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

カナバン病（ＣＤ）は、酵素アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）（アミノアシラーゼ２としても知られる）をコードするＡＳＰＡ遺伝子からの発現の低下及び／又は変異と関連付けられる。アスパルトアシラーゼ活性の低下は、ＮＡＡのアスパルテート及びアセテートへの変換の低下によるＮ－アセチルアスパルテート（ＮＡＡ）（Ｎ－アセチル－Ｌ－アスパラギン酸としても知られる）の蓄積をもたらす。ＡＳＰＡ酵素は、髄鞘形成細胞の代謝完全性の維持に関与している。脳では、ＡＳＰＡ遺伝子発現は主に白質産生乏突起膠細胞に制限される。脳内のＮＡＡの蓄積は、乏突起膠細胞機能不全、及びミエリン鞘の発達への干渉、及びニューロンに関連する既存のミエリン鞘の破壊に関連する。

【0004】

ＣＤは常染色体劣性遺伝疾患であり、主に新生児／乳児形態で現れる。この形態に影響を受ける子供は、脳及び脊髄におけるミエリンの変性に関連する症状を乳児期に示す。症状には、知的障害、過去に獲得した運動能力の喪失、摂食困難、異常な筋肉の緊張、巨頭症、麻痺及び発作が含まれる。寿命は、一般に、ＣＤの新生児／乳児の子供の最初の１０年間に限定される。ＣＤの軽度／若年型を有する個体は、発話及び運動能力の発達の遅れを示し、平均寿命を有する可能性がある。

【0005】

これまでのところ、ＣＤの神経変性効果を停止又は遅延させるための治療は存在しない。臨床使用又は評価中の現在の治療アプローチは、症状を緩和し、生活の質を最大化することを目的としている。いくつかの症状を治療し、生活の質を改善するために、理学療法、栄養チューブ、及び抗発作医薬が使用され得る。したがって、ＣＤを治療するための新規の治療的アプローチの重要な必要性が存在する。

【発明の概要】

【0006】

本明細書に開示及び例示されるのは、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸及び修飾核酸を含むベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）、並びに修飾核酸又は修飾核酸を含むベクターを、それを必要とする患者に投与することによって、ＡＳＰＡタンパク質のレベルの低下によって媒介される疾患、障害又は状態を治療する方法である。

【0007】

当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を、日常的な実験のみを使用して認識するか、又は確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されることが意図される。
Ｅ１．配列番号２の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする単離核酸。
Ｅ２．配列番号２の配列を含むか又はそれからなる核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする単離核酸。
Ｅ３．配列番号１の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする単離核酸。
Ｅ４．配列番号１の配列を含むか又はそれからなる核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする単離核酸。
Ｅ５．配列番号３の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする単離核酸。
Ｅ６．配列番号３の配列を含むか又はそれからなる核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする単離核酸。
Ｅ７．配列番号２の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸。
Ｅ８．配列番号２の配列を含むか又はそれからなる核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸。
Ｅ９．配列番号１の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸。
Ｅ１０．配列番号１の配列を含むか又はそれからなる核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸。
Ｅ１１．配列番号３の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸。
Ｅ１２．配列番号３の配列を含むか又はそれからなる核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸。
Ｅ１３．配列番号２の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸を含む、組換え核酸。
Ｅ１４．配列番号２の核酸配列を含むか又はそれからなる、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸を含む、組換え核酸。
Ｅ１５．配列番号１の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸を含む、組換え核酸。
Ｅ１６．配列番号１の核酸配列を含むか又はそれからなる、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸を含む、組換え核酸。
Ｅ１７．配列番号３の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸を含む、組換え核酸。
Ｅ１８．配列番号３の核酸配列を含むか又はそれからなる、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸を含む、組換え核酸。
Ｅ１９．エンハンサー、プロモーター、エクソン、イントロン、及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル配列からなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを更に含む、Ｅ１３～Ｅ１８のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ２０．エンハンサーが、配列番号６、配列番号１７、又はその両方と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％同一の核酸配列を含む、Ｅ１９の組換え核酸。
Ｅ２１．エンハンサーが、配列番号６、配列番号１７又はその両方の核酸配列を含むか又はそれからなる、Ｅ１９又はＥ２０の組換え核酸。
Ｅ２２．プロモーターが、構成的又は調節されている、Ｅ１９～Ｅ２１のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ２３．プロモーターが、誘導性又は抑制性である、Ｅ１９～Ｅ２２のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ２４．プロモーターが、配列番号７の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、Ｅ１９～Ｅ２３のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ２５．プロモーターが、配列番号７の核酸配列を含むか又はそれからなる、Ｅ１９～Ｅ２４のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ２６．エクソンが、配列番号８、配列番号１８又はその両方の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、Ｅ１９～Ｅ２５のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ２７．エクソンが、配列番号８、配列番号１８又はその両方の核酸配列を含むか又はそれからなる、Ｅ１９～Ｅ２６のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ２８．イントロンが、配列番号９、配列番号１０、又はその両方の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％同一の核酸配列を含む、Ｅ１９～Ｅ２７のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ２９．イントロンが、配列番号９、配列番号１０又はその両方の核酸配列を含むか又はそれからなる、Ｅ１９～Ｅ２８のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ３０．ｐｏｌｙＡ配列が、配列番号１１の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、Ｅ１９～Ｅ２９のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ３１．ｐｏｌｙＡ配列が、配列番号１１の核酸配列を含むか又はそれからなる、Ｅ１９～Ｅ３０のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ３２．エンハンサーが修飾核酸に作動可能に連結されている、Ｅ１９～Ｅ３１のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ３３．プロモーターが修飾核酸に作動可能に連結している、Ｅ１９～Ｅ３２のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ３４．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ＣＢＡプロモーターのハイブリッド形態（ＣＢｈプロモーター）、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）エクソン、ＣＢＡイントロン、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ｐｏｌｙＡからなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを更に含む、Ｅ１３～Ｅ１８のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ３５．配列番号６又は配列番号１７の核酸配列を含むＣＭＶエンハンサー、配列番号７の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、配列番号８又は配列番号１８の核酸配列を含むＣＢＡエクソン、配列番号９の核酸配列を含むＣＢＡイントロン、配列番号１０の核酸配列を含むＭＭＶイントロン、及び配列番号１１の核酸配列を含むＢＧＨ ｐｏｌｙＡからなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを更に含む、Ｅ１３～Ｅ１８のいずれか１つの組換え核酸。
Ｅ３６．Ｅ７～Ｅ１２のいずれか１つの修飾核酸、又はＥ１３～Ｅ３５のいずれか１つの組換え核酸を含むベクターゲノムであって、配列番号５、配列番号１２又はその両方の核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％同一の核酸配列を含む、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ反復配列を更に含む、ベクターゲノム。
Ｅ３７．少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ反復配列が、配列番号５、配列番号１２、配列番号１９又はそれらの組み合わせの核酸配列を含むか又はそれからなる、Ｅ３６のベクターゲノム。
Ｅ３８．ＡＳＰＡをコードする核酸配列に隣接する２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、及びＡＳＰＡをコードする配列の上流のＣＢｈプロモーターを含む、Ｅ３６又はＥ３７のベクターゲノム。
Ｅ３９．ＡＳＰＡ配列が、配列番号２の核酸配列を含む、Ｅ３６～Ｅ３８のいずれか１つのベクターゲノム。
Ｅ４０．少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列が、配列番号５、配列番号１２、配列番号１９、又はそれらの組み合わせの核酸配列を含む、Ｅ３６～Ｅ３９のいずれか１つのベクターゲノム。
Ｅ４１．ＣＢｈプロモーターが、配列番号７の核酸配列を含む、Ｅ３６～Ｅ４０のいずれか１つのベクターゲノム。
Ｅ４２．核酸を含むベクターゲノムであって、核酸は、５’から３’に、
ａ）配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９の核酸配列を含むＡＡＶ２ ＩＴＲ、
ｂ）配列番号６又は配列番号１７、好ましくは配列番号６の核酸配列を含むＣＭＶエンハンサー、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、
ｄ）配列番号８、配列番号１８、好ましくは配列番号１８の核酸配列を含むＣＢＡエクソン、
ｅ）配列番号９の核酸配列を含むＣＢＡイントロン、
ｆ）配列番号１０の核酸配列を含むＭＭＶイントロン、
ｇ）配列番号１～３のいずれか１つの核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸、
ｈ）配列番号１１の核酸配列を含むＢＧＨ ｐｏｌｙＡ、及び
ｉ）配列番号５、配列番号１２、配列番号１９の核酸配列を含むＡＡＶ２ ＩＴＲ、を含む、ベクターゲノム。
Ｅ４３．核酸を含むベクターゲノムであって、核酸は、５’から３’に、
ａ）配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９の核酸配列を含むＡＡＶ ＩＴＲ、
ｂ）配列番号６又は配列番号１７、好ましくは配列番号６の核酸配列を含むエンハンサー、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含むプロモーター、
ｄ）配列番号８又は配列番号１８、好ましくは配列番号１８の核酸配列を含むエクソン、
ｅ）配列番号９の核酸配列を含むイントロン、
ｆ）配列番号１０の核酸配列を含むイントロン、
ｇ）配列番号１～３のいずれか１つの核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸、
ｈ）配列番号１１の核酸配列を含むＰｏｌｙＡ、及び
ｉ）配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９の核酸配列を含む、ＡＡＶ末端反復を含む、ベクターゲノム。
Ｅ４４．自己相補的である、Ｅ３６～４３のいずれか１つのベクターゲノム。
Ｅ４５．Ｅ３６～Ｅ４４のいずれか１つのベクターゲノムと、カプシドと、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。
Ｅ４６．配列番号２の核酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、ベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶベクター。
Ｅ４７．Ｏｌｉｇ００１、Ｏｌｉｇ００２、Ｏｌｉｇ００３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶＨｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、及びＡＡＶ－ＬＫ０３のカプシドからなる群から選択されるカプシドを含む、Ｅ４６のｒＡＡＶベクター。
Ｅ４８．配列番号１の核酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、ベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶベクター。
Ｅ４９．Ｏｌｉｇ００１、Ｏｌｉｇ００２、Ｏｌｉｇ００３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶＨｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、及びＡＡＶ－ＬＫ０３のカプシドからなる群から選択されるカプシドを含む、Ｅ４８のｒＡＡＶベクター。
Ｅ５０．配列番号３の核酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、ベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶベクター。
Ｅ５１．Ｏｌｉｇ００１、Ｏｌｉｇ００２、Ｏｌｉｇ００３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶＨｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、及びＡＡＶ－ＬＫ０３のカプシドからなる群から選択されるカプシドを含む、Ｅ５０のｒＡＡＶベクター。
Ｅ５２．カプシドが、Ｏｌｉｇ００１、Ｏｌｉｇ００２及びＯｌｉｇ００３カプシドから選択される、Ｅ４５～Ｅ５１のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ５３．カプシドが、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）を含むＯｌｉｇ００１カプシドであり、ＶＰ１が、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ４５～Ｅ５２のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ５４．カプシドが、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）を含むオリゴ００１カプシドであり、ＶＰ１が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、Ｅ４５～Ｅ５３のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ５５．カプシドが、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）を含むＯｌｉｇ００２カプシドであり、ＶＰ１が、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ４５～Ｅ５２のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ５６．カプシドが、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）を含むオリゴ００２カプシドであり、ＶＰ１が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、Ｅ４５～Ｅ５２及びＥ５５のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ５７．カプシドが、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）を含むＯｌｉｇ００３カプシドであり、ＶＰ１が、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ４５～Ｅ５２のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ５８．カプシドが、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）を含むオリゴ００３カプシドであり、ＶＰ１が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、Ｅ４６～Ｅ５２及びＥ５７のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ５９．ベクターゲノムが自己相補的である、Ｅ４５～Ｅ５８のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ６０．ベクターゲノムが、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、エンハンサー、プロモーター、エクソン、イントロン、及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル配列からなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを含む、Ｅ４６～Ｅ５９のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ６１．エンハンサーが、配列番号６又は配列番号１７の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、Ｅ６０のｒＡＡＶベクター。
Ｅ６２．エンハンサーが、配列番号６又は配列番号１７の核酸配列を含むか又はそれからなる、Ｅ６０又はＥ６１のｒＡＡＶベクター。
Ｅ６３．プロモーターが、構成的又は調節されている、Ｅ６０又はＥ６２のｒＡＡＶベクター。
Ｅ６４．プロモーターが、誘導性又は抑制性である、Ｅ６０～Ｅ６３のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ６５．プロモーターが、配列番号７の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、Ｅ６０～Ｅ６４のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ６６．プロモーターが、配列番号７の核酸配列を含むか又はそれからなる、Ｅ６０～Ｅ６５のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ６７．エクソンが、配列番号８又は配列番号１８の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、Ｅ６０～Ｅ６６のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ６８．エクソンが、配列番号８又は配列番号１８の核酸配列を含むか又はそれからなる、Ｅ６０～Ｅ６７のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ６９．イントロンが、配列番号９、配列番号１０又はその両方の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の核酸配列を含む、Ｅ６０～Ｅ６８のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ７０．イントロンが、配列番号９、配列番号１０又はその両方の核酸配列を含むか又はそれからなる、Ｅ６０～Ｅ６９のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ７１．ｐｏｌｙＡ配列が、配列番号１１の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の核酸配列を含む、Ｅ６０～Ｅ７０のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ７２．ｐｏｌｙＡ配列が、配列番号１１の核酸配列を含むか又はそれからなる、Ｅ６０～Ｅ７１のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ７３．少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ反復配列が、配列番号５、配列番号１２、配列番号１９又はそれらの組み合わせの核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の核酸配列を含む、Ｅ６０～Ｅ７２のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ７４．少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ反復配列が、配列番号５、配列番号１２、配列番号１９又はそれらの組み合わせの核酸配列を含むか又はそれからなる、Ｅ６０～Ｅ７３のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ７５．ベクターゲノムが、少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢｈプロモーター、ＣＢＡエクソン１、ＣＢＡイントロン１、ＭＶＭイントロン、及びＢＧＨ ｐｏｌｙＡからなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを更に含む、Ｅ４６～Ｅ５９のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ７６．ベクターゲノムが、配列番号５、配列番号１２、配列番号１９又はそれらの組み合わせの核酸配列を含む少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、配列番号６又は配列番号１７の核酸配列を含むＣＭＶエンハンサー、配列番号７の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、配列番号８又は配列番号１８の核酸配列を含むＣＢＡエクソン１、配列番号９の核酸配列を含むＣＢＡイントロン１、配列番号１０の核酸配列を含むＭＭＶイントロン、及び配列番号１１の核酸配列を含むＢＧＨ ｐｏｌｙＡからなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを更に含む、Ｅ４６～Ｅ５９のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ７７．ベクターゲノムが、ＡＳＰＡをコードする配列に隣接する２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、及びＡＳＰＡをコードする配列の上流のＣＢｈプロモーターを含む、Ｅ４６～Ｅ５９のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ７８．ＡＳＰＡ配列が、配列番号２の核酸配列を含む、Ｅ７７のｒＡＡＶベクター。
Ｅ７９．ＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号５、配列番号１２、配列番号１９又はそれらの組み合わせの核酸配列を含む、Ｅ７７又はＥ７８のｒＡＡＶベクター。
Ｅ８０．ＣＢｈプロモーターが、配列番号７の核酸配列を含む、Ｅ７７～Ｅ７９のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ８１．５’から３’に、
ａ）配列番号５、配列番号１２、配列番号１９、又はそれらの組み合わせの核酸配列を含むＡＡＶ２ ＩＴＲ、
ｂ）配列番号６又は配列番号１６の核酸配列を含むＣＭＶエンハンサー、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、
ｄ）配列番号８又は配列番号１８の核酸配列を含むＣＢＡエクソン１、
ｅ）配列番号９の核酸配列を含むＣＢＡイントロン１、
ｆ）配列番号１０の核酸配列を含むＭＭＶイントロン、
ｇ）配列番号１～３のいずれか１つの核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸、
ｈ）配列番号１１の核酸配列を含むＢＧＨ ｐｏｌｙＡ、及び
ｉ）配列番号５、配列番号１２、配列番号１９又はそれらの組み合わせの核酸配列を含むＡＡＶ２ ＩＴＲ、を含むベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶベクター。
Ｅ８２．５’から３’に、
ａ）配列番号５、配列番号１２、配列番号１９又はそれらの組み合わせの核酸配列を含むＡＡＶ ＩＴＲ、
ｂ）配列番号６又は配列番号１７の核酸配列を含むエンハンサー、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含むプロモーター、
ｄ）配列番号８又は配列番号１８の核酸配列を含むエクソン、
ｅ）配列番号９の核酸配列を含むイントロン、
ｆ）配列番号１０の核酸配列を含むイントロン、
ｇ）配列番号１～３のいずれか１つの核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸、
ｈ）配列番号１１の核酸配列を含むＰｏｌｙＡ、及び
ｉ）配列番号５、配列番号１２、配列番号１９又はそれらの組み合わせの核酸配列を含むＡＡＶ末端反復、を含む、ｒＡＡＶベクター。
Ｅ８３．ベクターゲノムが自己相補的である、Ｅ８１又はＥ８２のｒＡＡＶベクター。
Ｅ８４．ベクターが、ＶＰ１タンパク質を含むＯｌｉｇ００１カプシドを含み、ＶＰ１は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ８１～Ｅ８３のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ８５．ベクターが、ＶＰ１タンパク質を含むＯｌｉｇ００２カプシドを含み、ＶＰ１は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ８１～Ｅ８３のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ８６．ベクターが、ＶＰ１タンパク質を含むＯｌｉｇ００３カプシドを含み、ＶＰ１は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ８１～Ｅ８３のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ８７．ｉ）ＶＰ１タンパク質を含むＯｌｉｇ００１カプシドであって、ＶＰ１は配列番号１４のアミノ酸配列を含むＯｌｉｇ００１カプシドと、ｉｉ）５’から３’に、
ａ）配列番号５、配列番号１２、配列番号１９、又はそれらの組み合わせの核酸配列を含むＡＡＶ２ ＩＴＲ、
ｂ）配列番号６又は配列番号１７の核酸配列を含むＣＭＶエンハンサー、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、
ｄ）配列番号８又は配列番号１８の核酸配列を含むＣＢＡエクソン１、
ｅ）配列番号９の核酸配列を含むＣＢＡイントロン１、
ｆ）配列番号１０の核酸配列を含むＭＭＶイントロン、
ｇ）配列番号１～３のいずれか１つの核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸、
ｈ）配列番号１１の核酸配列を含むＢＧＨ ｐｏｌｙＡ、及び
ｉ）配列番号５又は配列番号１２の核酸配列を含むＡＡＶ２ ＩＴＲ、を含む自己相補的ベクターゲノムと、を含む、ｒＡＡＶベクター。
Ｅ８８．ｉ）ＶＰ１タンパク質を含むＯｌｉｇ００１カプシドであって、ＶＰ１は配列番号１４のアミノ酸配列を含むＯｌｉｇ００１カプシドと、ｉｉ）５’から３’に、
ａ）配列番号５、配列番号１２、配列番号１９又はそれらの組み合わせの核酸配列を含むＡＡＶ ＩＴＲ、
ｂ）配列番号６又は配列番号１７の核酸配列を含むエンハンサー、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含むプロモーター、
ｄ）配列番号８又は配列番号１８の核酸配列を含むエクソン、
ｅ）配列番号９の核酸配列を含むイントロン、
ｆ）配列番号１０の核酸配列を含むイントロン、
ｇ）配列番号１～３のいずれか１つの核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸、
ｈ）配列番号１１の核酸配列を含むＰｏｌｙＡ、及び
ｉ）配列番号５、配列番号１２、配列番号１９の核酸配列、又はこれらの組み合わせを含むＡＡＶ ＩＴＲ、を含む自己相補的ベクターゲノムと、を含む、ｒＡＡＶベクター。
Ｅ８９．細胞に導入されると、細胞におけるＮＡＡのレベルを低下させる、Ｅ４５～Ｅ８８のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ９０．細胞が脳細胞である、Ｅ８９のｒＡＡＶベクター。
Ｅ９１．細胞が乏突起膠細胞である、Ｅ８９又はＥ９０のｒＡＡＶベクター。
Ｅ９２．ＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象へのベクターの投与が、ベクターの投与前の対象におけるバランス、グリップ強度及び／又は運動協調と比較して、対象におけるバランス、グリップ強度及び／又は運動協調を増加させる、Ｅ４５～Ｅ９１のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ９３．ＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象へのベクターの投与が、ベクターの投与前の対象における全身的運動機能と比較して、対象における全身的運動機能を増加させる、Ｅ４５～Ｅ９２のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ９４．ＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象へのベクターの投与が、ベクターの投与前の対象におけるＮＡＡレベルと比較して、対象におけるＮＡＡレベルを低下させる、Ｅ４５～Ｅ９３のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ９５．ＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象へのベクターの投与が、ベクターの投与前の対象の視床における空胞体積割合と比較して、対象の視床における空胞体積割合を減少させる、Ｅ４５～Ｅ９４のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ９６．ＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象へのベクターの投与が、ベクターの投与前の対象の小脳白質／橋の空胞体積割合と比較して、対象の小脳白質／橋の空胞体積割合を減少させる、Ｅ４５～Ｅ９５のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ９７．ＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象へのベクターの投与が、ベクターの投与前の対象の視床における乏突起膠細胞の数と比較して、対象の視床における乏突起膠細胞の数を増加させる、Ｅ４５～Ｅ９６のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ９８．ＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象へのベクターの投与が、ベクターの投与前の対象の脳皮質中の乏突起膠細胞の数と比較して、対象の脳皮質中の乏突起膠細胞の数を増加させる、Ｅ４５～Ｅ９７のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ９９．ＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象へのベクターの投与が、ベクターの投与前の対象の視床におけるニューロンの数と比較して、対象の視床におけるニューロンの数を増加させる、Ｅ４５～Ｅ９８のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ１００．ＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象へのベクターの投与が、ベクターの投与前の対象の脳皮質におけるニューロンの数と比較して、対象の脳皮質におけるニューロンの数を増加させる、Ｅ４５～Ｅ９９のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ１０１．ＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象へのベクターの投与が、ベクターの投与前の対象における皮質髄鞘形成と比較して、対象における皮質髄鞘形成を増加させる、Ｅ４５～Ｅ１００のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ１０２．対象がヒト患者である、Ｅ９２～Ｅ１０１のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ１０３．対象が、カナバン病を有する、又はカナバン病を発症するリスクのあるヒト患者である、Ｅ９２～Ｅ１０２のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ１０４．対象が、少なくとも１つのＡＳＰＡ遺伝子変異を有する、Ｅ９２～Ｅ１０３のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
Ｅ１０５．Ｅ７～Ｅ１２のいずれか１つの修飾核酸、Ｅ１３～Ｅ３５のいずれか１つの組換え核酸、Ｅ３６～Ｅ４４のいずれか１つに記載のベクターゲノム、又はＥ４５～Ｅ１０４のいずれか１つのｒＡＡＶベクターを含む、医薬組成物。
Ｅ１０６．Ｅ７～Ｅ１２のいずれか１つの修飾核酸、Ｅ１３～Ｅ３５のいずれか１つの組換え核酸、Ｅ３６～Ｅ４４のいずれか１つのベクターゲノム、又はＥ４５～Ｅ１０４のいずれか１つのｒＡＡＶベクター、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
Ｅ１０７．ＡＳＰＡの欠乏又は機能不全に関連する疾患、障害又は状態を治療及び／又は予防する方法であって、治療有効量のＥ７～Ｅ１２のいずれか１つの修飾核酸、Ｅ１３～Ｅ３５のいずれか１つの組換え核酸、Ｅ３６～Ｅ４４のいずれか１つのベクターゲノム、Ｅ４５～Ｅ１０４のいずれか１つのｒＡＡＶベクター、又はＥ１０５若しくはＥ１０６の医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、方法。
Ｅ１０８．ＡＳＰＡの欠乏又は機能不全に関連する疾患、障害又は状態が、カナバン病である、Ｅ１０７の方法。
Ｅ１０９．修飾核酸、組換え核酸、ベクターゲノム、ｒＡＡＶベクター又は医薬組成物が、治療を必要とする対象の脳に直接投与される、Ｅ１０７又はＥ１０８の方法。
Ｅ１１０．修飾核酸、組換え核酸、ベクターゲノム、ｒＡＡＶベクター又は医薬組成物が、治療を必要とする対象の中枢神経系に直接投与される、Ｅ１０７～Ｅ１０９のいずれか１つの方法。
Ｅ１１１．修飾核酸、組換え核酸、ベクターゲノム、ｒＡＡＶベクター又は医薬組成物が、脳実質、脊柱管、くも膜下腔、脳の脳室、大槽、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される中枢神経系の少なくとも１つの領域に投与される、Ｅ１０７～Ｅ１１０のいずれか１つの方法。
Ｅ１１２．修飾核酸、組換え核酸ベクターゲノム、ｒＡＡＶベクター又は医薬組成物が、実質内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、大槽内投与、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの方法方法によって投与される、Ｅ１０７～Ｅ１１１のいずれか１つの方法。
Ｅ１１３．対象がヒト患者である、Ｅ１０７～Ｅ１１２のいずれか１つの方法。
Ｅ１１４．対象が、カナバン病を有する、又はカナバン病を発症するリスクのあるヒト患者である、Ｅ１０７～Ｅ１１３のいずれか１つの方法。
Ｅ１１５．対象が、ＡＳＰＡ遺伝子に少なくとも１つの変異を有する、Ｅ１０７～Ｅ１１４のいずれか１つの方法。
Ｅ１１６．カナバン病を治療又は予防する方法であって、ｉ）対象が少なくとも１つのＡＳＰＡ遺伝子変異を含むかどうかを評価するステップと、ｉｉ）治療有効量のＥ７～Ｅ１２のいずれか１つの修飾核酸、Ｅ１３～Ｅ３５のいずれか１つの組換え核酸、Ｅ３６～Ｅ４４のいずれか１つのベクターゲノム、Ｅ４５～Ｅ１０４のいずれか１つのｒＡＡＶベクター、又はＥ１０５若しくはＥ１０６の医薬組成物を対象に投与し、それによって対象のカナバン病を治療又は予防するステップと、を含む、方法。
Ｅ１１７．対象が、カナバン病と診断されるか、又はカナバン病を発症するリスクがあると診断される、ＥＥ１１６に記載の方法。
Ｅ１１８．ＡＳＰＡ欠乏に関連する疾患の治療又は予防を必要とする対象においてＡＳＰＡ欠乏に関連する疾患を治療又は予防する方法であって、治療有効量のＡＳＰＡをコードする修飾核酸を対象に投与することを含み、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸はコドン最適化されている、方法。
Ｅ１１９．ＡＳＰＡをコードする修飾核酸が、配列番号２の核酸配列を含む、Ｅ１１８の方法。
Ｅ１２０．ＡＳＰＡをコードする修飾核酸が、配列番号４のアミノ酸配列を有するＡＳＰＡタンパク質をコードする、Ｅ１１８又はＥ１１９の方法。
Ｅ１２１．ＡＳＰＡをコードする修飾修飾核酸が、標的細胞において発現され、標的細胞が、乏突起膠細胞である、Ｅ１１８～Ｅ１２０のいずれか１つの方法。
Ｅ１２２．ＡＳＰＡをコードする修飾核酸が、ベクターで標的細胞に送達される、Ｅ１１８～Ｅ１２１のいずれか１つの方法。
Ｅ１２３．ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、Ｅ１２２に記載の方法。
Ｅ１２４．ベクターが、全身注射によって、直接頭蓋内注射によって、又は直接脊柱管注射によって対象に投与される、Ｅ１１８～Ｅ１２３のいずれか１つの方法。
Ｅ１２５．Ｅ７～Ｅ１２のいずれか１つの修飾核酸、Ｅ１３～Ｅ３５のいずれか１つの組換え核酸、Ｅ３６～Ｅ４４のいずれか１つのベクターゲノム、又はＥ４５～Ｅ１０４のいずれか１つのｒＡＡＶベクターのうちのいずれか１つの修飾核酸を含む、宿主細胞。
Ｅ１２６．ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｂ－５０、又は任意の他のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、及びＨＴ１０８０からなる群から選択される、Ｅ１２５の宿主細胞。
Ｅ１２７．浮遊培養における増殖に適応したＨＥＫ２９３細胞である、Ｅ１２５～Ｅ１２６の宿主細胞。
Ｅ１２８．アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）番号ＰＴＡ１３２７４を有するＨＥＫ２９３細胞である、Ｅ１２５～Ｅ１２７のいずれか１つの宿主細胞。
Ｅ１２９．ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶカプシド（Ｃａｐ）タンパク質、アデノウイルス早期領域１Ａ（Ｅ１ａ）タンパク質、Ｅ１ｂタンパク質、Ｅ２ａタンパク質、Ｅ４タンパク質、及びウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む、Ｅ１２５～Ｅ１２８のいずれか１つの宿主細胞。
Ｅ１３０．治療有効量のｉ）Ｅ４５～Ｅ１０４のいずれか１つのｒＡＡＶベクター又はｉｉ）Ｅ１０５若しくはＥ１０６の医薬組成物を含む、カナバン病（ＣＤ）の治療のためのキット。
Ｅ１３１．キット構成要素のうちの１つ以上を使用するための説明書を含むラベル又は添付文書を更に含む、Ｅ１３０のキット。
Ｅ１３２．ＡＳＰＡの欠損又は機能不全に関連する疾患、障害又は状態の治療又は予防における使用のための、Ｅ７～Ｅ１２のいずれか１つの修飾核酸、Ｅ１３～Ｅ３５のいずれか１つの組換え核酸、Ｅ３６－Ｅ４４のいずれか１つのベクターゲノム、Ｅ４５－Ｅ１０４のいずれか１つのｒＡＡＶベクター、又はＥ１０５若しくはＥ１０６の医薬組成物。
Ｅ１３３．疾患、障害又は状態が、カナバン病である、Ｅ１３２の使用のための修飾核酸、組換え核酸、ベクターゲノム、ｒＡＡＶベクター、又は医薬組成物。
Ｅ１３４．ＡＳＰＡの欠乏又は機能不全に関連する疾患、状態の障害を治療及び／又は予防するための医薬の製造における、Ｅ７～Ｅ１２のいずれか１つの修飾核酸、Ｅ１３～Ｅ３５のいずれか１つの組換え核酸、Ｅ３６～Ｅ４４のいずれか１つのベクターゲノム、Ｅ４５～Ｅ１０４のいずれか１つのｒＡＡＶベクター、又はＥ１０５若しくはＥ１０６の医薬組成物の使用。
Ｅ１３５．疾患、障害又は状態が、カナバン病である、Ｅ１３４の使用。
Ｅ１３６．Ｏｌｉｇ００１カプシドを含むｒＡＡＶベクターによって対象の脳に送達される導入遺伝子の生体分布を決定する方法であって、導入遺伝子によってコードされるタンパク質が発現され、方法は、
ａ）ｒＡＡＶベクターの対象への投与と、
ｂ）脳組織の固定と、
ｃ）脳の電気泳動クリアリングと、
ｄ）脳組織切片の３Ｄ顕微鏡撮像と、
ｅ）タンパク質の検出と、
ｆ）任意選択で、脳組織中に存在するタンパク質の量の定量化と、を含む、方法。
Ｅ１３７．投与が、脳室内（ＩＣＶ）注射、実質内（ＩＰ）注射、くも膜下腔内（ＩＴ）投与、大槽内（ＩＣＭ）注射、又はそれらの組み合わせによる、Ｅ１３６の方法。
Ｅ１３８．脳組織が、例えば、パラホルムアルデヒド又はホルマリンを使用して固定される、Ｅ１３６又は１３７の方法。
Ｅ１３９．定量化が、体積レンダリングを含む、Ｅ１３６～Ｅ１３８のいずれか１つの方法。
Ｅ１４０．導入遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする、Ｅ１３６～Ｅ１３９のいずれか１つの方法。
Ｅ１４１．組織において検出される導入遺伝子発現のレベルが、ｒＡＡＶベクター形質導入効率と相関する、Ｅ１３６～Ｅ１４０のいずれか１つの方法。
Ｅ１４２．（ｇ）細胞形態の評価及びＧＦＰ発現の空間的位置決定による細胞型ベクター指向性の評価ステップを更に含む、Ｅ１３６～Ｅ１４１のいずれか１つの方法。
Ｅ１４３．配列番号１～３及びプロモーターのいずれか１つの核酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸。
Ｅ１４４．配列番号２及びプロモーターの配列を含むか又はそれからなる核酸を含む、アスパルトアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸。
Ｅ１４５．プロモーターをコードする核酸配列を含み、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸配列を更に含む核酸であって、修飾核酸配列は、配列番号２の配列を含むか又はそれからなる核酸。
Ｅ１４６．プロモーターを特定する核酸配列を含み、配列番号２の核酸配列を含むか又はそれからなる核酸配列を更に含む、単離核酸。
Ｅ１４７．ＰＢＳ中３５０ｍＭのＮａＣｌ及び５％のＤ－ソルビトールを更に含む、Ｅ１０５の医薬組成物。
Ｅ１４８．薬学的に許容される担体が、ＰＢＳ中３５０ｍＭのＮａＣｌ及び５％のＤ－ソルビトールを含む、Ｅ１０６の医薬組成物。

【0008】

本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面、例示的な実施形態及び特許請求の範囲から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】１．０μｇのＮＡＡシンターゼ（Ｎａｔ８Ｌ）を発現するプラスミドでトランスフェクトし、野生型ヒトＡＳＰＡ配列（配列番号３）又は修飾された、例えばコドン最適化ＡＳＰＡ配列の元（バージョン１）（配列番号１）若しくはコドン最適化ＡＳＰＡ配列の新規（バージョン２）（配列番号２）を含む１．０μｇ、０．５μｇ、０．２μｇ又は０．１μｇのプラスミドで同時トランスフェクトした細胞における、ＨＰＬＣを使用して決定されるＮＡＡの例示的な用量応答低減を示す。

【図2】実質内（ＩＰ）投与経路（ＲＯＡ）を介して投与されるｒＡＡＶベクターによって形質導入されたＧＦＰ陽性細胞の例示的なサンプリングを示す。ＧＦＰ陽性体細胞（矢印）を各関心領域でスコアリングし、形質導入細胞の数（Ｎ）の推定値を生成した。

【図3】ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰの実質内（ＩＰ）投与後の６週齢ｎｕｒ７マウスの皮質、脳梁及び外嚢の皮質下白質、線条体並びに小脳のＧＦＰ陽性細胞の例示的な数（Ｎ）を示し、また注射部位に隣接する濃縮ＧＦＰ発現を示すＩＰ ＲＯＡを介して１×１０^１１のＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰベクターゲノムを投与したマウスからの脳の矢状切片における天然ＧＦＰ蛍光の代表的な画像を示す。Ｎの推定値は、光学分割器（ｋ＝４）を使用して１４４の切片で生成された。各群の平均＋／－標準誤差が提示されている（ｎ＝５匹の動物）。各関心領域内の用量コホート間のＧＦＰ陽性細胞の数の有意な差は、アスタリスクによって示される。

【図4】ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰの髄腔内（ＩＴ）投与後の６週齢ｎｕｒ７マウスの皮質、皮質下白質、線条体及び小脳内のＧＦＰ陽性細胞（Ｎ）の例示的な数、並びに１×１０^１１のＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰベクターゲノムが髄腔内（ＩＴ）ＲＯＡを介して投与されたマウスからの脳の矢状切片における天然ＧＦＰ蛍光の代表的な画像を示し、ベクターによる形質導入を示すびまん性皮質マーカー発現、及びその領域内の細胞の形質導入も示す適度な白質路細胞発現を示す。各群の平均＋／－標準誤差が提示されている（ｎ＝５匹の動物）。各関心領域内の用量コホート間のＧＦＰ陽性細胞の数の有意な差は、アスタリスクによって示される。

【図5】ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰの脳室内（ＩＣＶ）投与後の６週齢ｎｕｒ７マウスの皮質、皮質下白質、線条体及び小脳内のＧＦＰ陽性細胞（Ｎ）の例示的な数、並びに１×１０^１１のＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰベクターゲノムがＩＣＶ ＲＯＡを介して投与されたマウスの脳の矢状切片における天然ＧＦＰ蛍光の代表的な画像を示し、その領域内の細胞のベクターによる形質導入を示す激しい白質路ＧＦＰ発現を示す。各群の平均＋／－標準誤差が提示されている（ｎ＝５匹の動物）。各関心領域内の用量コホート間のＧＦＰ陽性細胞の数の有意な差は、アスタリスクによって示される。

【図6】ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰの大槽内（ＩＣＭ）投与後の６週齢ｎｕｒ７マウスの皮質、皮質下白質、線条体及び小脳内のＧＦＰ陽性細胞（Ｎ）の例示的な数、並びに１×１０^１１のＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰベクターゲノがＩＣＭ ＲＯＡを介して投与されたマウスからの脳の矢状切片における天然ＧＦＰ蛍光の代表的な画像を示し、その領域内の細胞の形質導入を示す適度な白質路ＧＦＰマーカー発現を示す。各群の平均＋／－標準誤差が提示されている（ｎ＝５匹の動物）。各関心領域内の用量コホート間のＧＦＰ陽性細胞の数の有意な差は、アスタリスクによって示される。

【図7】４つの異なる投与経路（ＩＰ、ＩＴ、ＩＣＶ及びＩＣＭ）によって各動物に投与される１×１０^１１ｖｇ用量の皮質、皮質下白質、線条体及び小脳の４つの関心領域における例示的なＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰ形質導入効率の直接比較、並びに実質内及び脳室内の注射部位の外側の切片における天然ＧＦＰ蛍光の代表的な画像を示す。皮質及び皮質下白質路導入遺伝子陽性細胞の両方が、ＩＣＶ脳の外側切片においてより多数であった。各群について、ｎ＝５匹の動物であり、平均＋／－標準誤差が示されている。個々の関心領域間のＧＦＰ陽性細胞の数の有意な差は、アスタリスクによって示される（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、及び＊＊＊ｐ≦０．００１）。

【図8】実質内（ＩＰ）、髄腔内（ＩＴ）、脳室内（ＩＣＶ）及び大槽内（ＩＣＭ）ベクター投与後の６週齢ｎｕｒ７マウスの皮質におけるＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰの例示的なオリゴ指向性を示す。皮質切片を、Ｏｌｉｇ２及びＮｅｕＮ抗体を使用してＩＨＣにより分析した。各群について、ｎ＝５匹の動物であり、各示された抗原による同時標識の平均パーセンテージ＋／－標準誤差が示されている。アスタリスクは群間の有意差を示す。

【図9】実質内（ＩＰ）、髄腔内（ＩＴ）、脳室内（ＩＣＶ）及び大槽内（ＩＣＭ）ベクター投与後の６週齢ｎｕｒ７マウスの皮質下白質におけるＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰの例示的なオリゴ指向性を示す。皮質下白質の切片を、Ｏｌｉｇ２及びＮｅｕＮ抗体を使用してＩＨＣにより分析した。各群について、ｎ＝５匹の動物であり、各示された抗原による同時標識の平均パーセンテージ＋／－標準誤差が示されている。

【図10】実質内（ＩＰ）、髄腔内（ＩＴ）、脳室内（ＩＣＶ）及び大槽内（ＩＣＭ）ベクター投与後の６週齢ｎｕｒ７マウスの線条体質におけるＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰの例示的なオリゴ指向性を示し、マーカー検出がベクターによる細胞の形質導入を示す。線条体質の切片を、Ｏｌｉｇ２及びＮｅｕＮ抗体を使用してＩＨＣにより分析した。各群について、ｎ＝５匹の動物であり、各示された抗原による同時標識の平均パーセンテージ＋／－標準誤差が示されている。

【図11】実質内（ＩＰ）、髄腔内（ＩＴ）、脳室内（ＩＣＶ）及び大槽内（ＩＣＭ）ベクター投与後の６週齢ｎｕｒ７マウスの小脳におけるＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰの例示的なオリゴ指向性を示し、マーカー検出がベクターによる形質導入を示す。小脳切片を、Ｏｌｉｇ２及びＮｅｕＮ抗体を使用してＩＨＣにより分析した。各群について、ｎ＝５匹の動物であり、各示された抗原による同時標識の平均パーセンテージ＋／－標準誤差が示されている。

【図12】１×１０^１１ベクターゲノムのＩＣＶ投与から２週間後の週齢適合野生型（ＷＴ）及びｎｕｒ７マウス脳の皮質及び皮質下白質におけるＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰ形質導入の例示的な効率、並びにＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰの投与後の野生型脳における天然ＧＦＰ蛍光の代表的な画像を示し、比較的制限された発現を示し、それによって、ベクターによる形質導入、特に皮質下白質における形質導入を示す。各群について、ｎ＝５匹の動物であり、群当たりの平均ＧＦＰ陽性細胞数＋／－標準誤差が示され、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１である。

【図13】コドン最適化されたＡＳＰＡコード配列及び調節エレメントをコードする発現プラスミドを示す。

【図14】ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置（３回用量レベルで）、野生型及びｎｕｒ７偽処置マウスの生体内研究期間にわたるロータロッド落下潜時を示す。データは、群当たりｎ＝１２匹の動物で、平均＋／－標準誤差として提示されている。

【図15】野生型（ＷＴ）マウス、（３つの用量レベルで）処置されたＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ、及び偽処置ｎｕｒ７マウスの生体内研究期間にわたる例示的なオープンフィールド活動性を示す。データは、群当たりｎ＝１２匹の動物で、平均＋／－標準誤差として提示されている。

【図16】野生型（ＷＴ）、ｎｕｒ７偽処置及びＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置（３つの用量レベル）マウス脳の例示的なＮＡＡ含有量を示す。データは、平均＋／－標準誤差として表される。ＮＡＡは、湿潤組織重量のグラム当たりのミリモル（群当たりｎ＝６匹の動物）として表される。ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡの用量は、ｘ軸に示されている。

【図17】２２週齢で評価されたＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡで３つの異なる用量レベルで処置されたｎｕｒ７マウスの脳組織１ｍｇ当たりの例示的な平均ベクターゲノムコピー数（ｖｇ／ｍｇ）を示す。平均ｖｇ／ｍｇ値は、＋／－標準誤差（用量コホート当たりｎ＝６匹の動物）として提示されている。

【図18】空胞化領域を示す、ｎｕｒ７偽処置、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置ｎｕｒ７及び野生型マウスからの代表的なＨ＆Ｅ染色脳切片を示す。

【図19】２２週齢の偽処置及びＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置ｎｕｒ７マウスからの視床及び脳白質／橋の関心領域（ＲＯＩ）の割合としての例示的な空胞体積割合を示す。アスタリスクは群間の有意差を示す。

【図20】乏突起膠細胞を示すＯｌｉｇ２について染色された偽処置及びＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置（２．５×１０^１１ｖｇ用量）ｎｕｒ７マウスの視床及び皮質の代表的な画像を示す。

【図21】２２週齢野生型、偽処置及びＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置ｎｕｒ７マウスの視床及び皮質におけるＯｌｉｇ２陽性細胞の例示的な数を示す。データは、平均Ｏｌｉｇ２陽性細胞＋／－標準誤差（群当たりｎ＝６匹の動物）として表される。アスタリスクは群間の有意差を示す。

【図22】ＮｅｕＮについて染色された偽処置及びＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置（２．５×１０^１１ｖｇ用量）ｎｕｒ７マウスの視床及び皮質の代表的な画像を示す。

【図23】２２週齢野生型、偽処置及びＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置ｎｕｒ７マウスの視床及び皮質におけるＮｅｕＮ陽性細胞の例示的な数を示す。データは、平均ＮｅｕＮ陽性細胞＋／－標準誤差（群当たりｎ＝６匹の動物）として表される。アスタリスクは群間の有意差を示す。

【図24】ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）について染色された偽処置及びＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置（２．５×１０^１１ｖｇ用量）ｎｕｒ７マウスの皮質の代表的な画像を示す。

【図25】野生型、偽処置及びＡＡＶ／００１－ＡＳＰＡ処置ｎｕｒ７マウスの皮質における例示的なミエリン塩基性タンパク質陽性線維長密度（ＭＢＰ－ＬＤ）（μｍ／ｍｍ^３）を示す。データは、平均ＭＢＰ－ＬＤ＋／－標準誤差（群当たりｎ＝６匹の動物）として表される。アスタリスクは群間の有意差を示す。

【図26】初期固定された事前にクリアされた試料、組織クリア後の試料、３Ｄ ＧＦＰ蛍光画像、半脳体積セグメンテーション分析、及び強度ヒートマップ（左から右）からのＩＣＶ注射マウスからの例示的な脳画像を示す。

【図27】４つ全てのＩＣＶ注射半脳からの強度ヒートマップを示す。全半脳体積が計算され、灰色領域として表される。計算された「低い」ＧＦＰ強度は灰色領域で示され、「高い」ＧＦＰ強度は白色領域で示される。

【図28】ＩＣＶ投与経路対ＩＰ投与経路を介して投与されたＡＡＶ／Ｏｌｉｇｏ００１－ＧＦＰ投与された動物のクリアした脳からの３ＤライトシートＧＦＰ蛍光顕微鏡画像を示す。

【図29A】Ｏｌｉｇ２又はＮｅｕＮと同時標識されたＧＦＰ陽性細胞のスコアリングを示す代表的な高倍率画像を示す。総ＧＦＰ細胞を各視野内でスコアリングし、Ｏｌｉｇ２及びＮｅｕＮ同時標識のパーセンテージを同じ視野内でスコアリングした。

【図29B】ＩＣＶ ＲＯＡを介して与えられたＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰを有する動物の脳内のＳＣＷＭ路細胞におけるＧＦＰとＯｌｉｇ２とのＧＦＰの同時標識の代表的な画像を示し、ほぼ１００％のオリゴ指向性及びほぼ完全な神経向上症の不在を示す。

【図29C】白質（矢印）中のまばらなＯｌｉｇ２同時標識を有する、大プルキンエニューロンにおける小脳ＧＦＰ導入遺伝子発現の代表的な画像を示す。

【図29D】ＩＣＶ ＲＯＡ脳の線条体におけるＯｌｉｇ２とのＧＦＰ同時標識の代表的な画像を示し、小脳指向性との対比を示す。

【図29E】ＢｒｄＵ標識及びＯｌｉｇ２の処理後の８週ｎｕｒ７及び週齢適合野生型ナイーブ脳における白質路の代表的な画像を示す。

【図29F】２週間及び８週間の野生型並びにｎｕｒ７白質路におけるＢｒｄＵ細胞の例示的な数を示す。群当たりの平均ＢｒｄＵ陽性細胞＋／－標準誤差が提示されている。各群（各週齢における遺伝子型）について、ｎ＝６である。

【図29G】ＩＣＶ ＲＯＡを介してＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰで処置されたｎｕｒ７脳の皮質下白質中のＢｒｄＵ／ＧＦＰ同時標識細胞の代表的な画像を示す。

【図30A-30C】生体分布体積分析を示す。（Ａ）ＩＣＶ及びＩＰの両方にわたって画像化された組織の体積。（Ｂ）２つのＲＯＡにわたる平均及び中央ＧＦＰ蛍光強度。（Ｃ）ＲＯＡにわたる低及び高強度を表す体積ＧＦＰ陽性の割合。

【図31A-31C】薬力学的効果評価のための明瞭度及びスイッチワークフローを示す。（Ａ）組織のクリアリング及び標識アプローチ。左から右：無傷のマウス脳、クリアリング前の右半脳の中央２ｍｍの切片、パッシブクリアリングの１日後及びパッシブクリアリングの３日後の同じ組織、並びに以前に標識したタンパク質からの蛍光シグナル（緑：核、赤：ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ））を示す３Ｄ画像。（Ｂ）Ｎｕｒ７、ＷＴ及びＯｌｉｇ１－ＡＳＰＡ処置組織の代表的な２ｍｍ切片。各画像の赤い矢印は視床領域を示している。（Ｃ）パッシブクリアリングの１日後の組織の透明度。

【図32A-32C】組織の２Ｄ領域ベースの細胞計数を示す。（Ａ）類似の解剖学的方向を有する３つの群全てからの３Ｄ画像の、抽出された２Ｄ単一スライス。赤いボックスは、細胞計数が行われた視床及び皮質領域のエリアをマークしている。（Ｂ）（Ａ）の赤いボックスから拡大された画像データ、及びそれぞれの細胞セグメンテーション。（Ｃ）平均核密度（セグメンテーション領域によって正常化されたカウント）。

【図33A-33I】薬力学的処置効果の３Ｄ体積分析を示す。（Ａ）２ｍｍの組織スライスの完全３Ｄ体積が測定される。（Ｂ）３Ｄ体積内で計算された平均蛍光強度。（Ｃ）２０００超の蛍光値で設定されたより制限的な閾値（左パネル）又は１０００でのより包括的な閾値（左パネル）を介したＭＢＰ特性評価。（Ｄ）どちらの場合もＮｕｒ７のＭＢＰ欠乏が観察され得る。Ｏｌｉｇ１－ＡＳＰＡ群の効果はより低い閾値で見ることができ、全体的な値がＷＴレベルに近づく。（Ｅ）視床領域における領域ベース３Ｄ分析であり、領域の一部の手動セグメンテーションが黄色で示されている。（Ｆ）核（ＳＹＴＯ）及びミエリン（ＭＢＰ）マーカーの両方についてのこの領域内の平均蛍光。（Ｇ）皮質の一部の領域ベース分析であり、手動セグメンテーションが黄色で示されている。（Ｈ）核（ＳＹＴＯ）及びミエリン（ＭＢＰ）マーカーの両方についてのこの皮質領域内の平均蛍光。（Ｉ）３Ｄ細胞濃度（１００μｍ^２当たりの核）。

【発明を実施するための形態】

【0010】

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の説明及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の形態も同様に含むことが意図される。以下の用語は以下のような意味を有する。

【0011】

本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、生物学的活性の量、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の長さ、Ｇ及びＣヌクレオチドの含有量、コドン適応指数、ＣｐＧジヌクレオチドの数、用量、時間、温度等の測定可能な値を指し、別段に指定されない限り、文脈から明らかでない限り、又はそのような数が可能な値の１００％を超える場合を除いて、指定された量のいずれかの方向（超又はそれ未満）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は更に０．１％の変動を包含することを意図する。

【0012】

本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせ、及び代替（「又は」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、包含する。

【0013】

本明細書で使用される場合、「アデノ関連ウイルス」及び／又は「ＡＡＶ」という用語は、直鎖一本鎖ＤＮＡゲノムを有するパルボウイルス及びその変異体を指す。この用語は、別様に必要とされる場合を除いて、全ての亜型、並びに天然に存在する形態及び組換え形態の両方を包含する。野生型ゲノムは、４６８１塩基を含み（Ｂｅｒｎｓ ａｎｄ Ｂｏｈｅｎｚｋｙ（１９８７）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：２４３－３０７）、各末端に末端反復配列（例えば、逆方向末端反復（ＩＴＲ））を含み、これは、ｃｉｓにおいてＤＮＡ複製の起点として、及びウイルスのパッケージングシグナルとして機能する。ゲノムは、それぞれＡＡＶ複製（「ＡＡＶ ｒｅｐ」又は「ｒｅｐ」）及びカプシド（「ＡＡＶ ｃａｐ」又は「ｃａｐ」）遺伝子として知られる２つの大きなオープンリーディングフレームを含む。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐは、本明細書においてＡＡＶ「パッケージング遺伝子」とも称され得る。これらの遺伝子は、ウイルスゲノムの複製及びパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。

【0014】

野生型ＡＡＶウイルスにおいて、３つのカプシド遺伝子ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、単一のオープンリーディングフレーム内で互いに重複し、代替スプライシングは、ＶＰＩ、ＶＰ２、及びＶＰ３の産生をもたらす。Ｇｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１５）：９９３３－９９４４。）単一のＰ４０プロモーターは、３つ全てのカプシドタンパク質を、それぞれ、ＡＡＶカプシド産生を補完するＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３について約１：１：１０の割合で発現させることを可能にする。より具体的には、ＶＰ１は全長タンパク質であり、ＶＰ２及びＶＰ３は、Ｎ末端の切断の増加によりますます短縮される。周知の例は、米国特許第７，９０６，１１１号に記載のＡＡＶ９のカプシドであり、ここで、ＶＰ１は、配列番号１２３のアミノ酸残基１～７３６を含み、ＶＰ２は、配列番号１２３のアミノ酸残基１３８～７３６を含み、ＶＰ３は、配列番号１２３のアミノ酸残基２０３～７３６を含む。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶキャップ」又は「キャップ」という用語は、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３、並びにその変異体及び類似体を指す。

【0015】

少なくとも４つのウイルスタンパク質が、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子Ｒｅｐ ７８、Ｒｅｐ ６８、Ｒｅｐ ５２及びＲｅｐ ４０から合成され、それらの見かけの分子量に従って命名される。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ ｒｅｐ」又は「ｒｅｐ」は、ＡＡＶ複製タンパク質Ｒｅｐ ７８、Ｒｅｐ ６８、Ｒｅｐ ５２、及び／又はＲｅｐ ４０、並びにそれらの変異体及び類似体を意味する。本明細書で使用される場合、ｒｅｐ及びｃａｐは、野生型及び組換え（例えば、修飾キメラ等）ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにそれらがコードするポリペプチドの両方を指す。いくつかの実施形態では、ｒｅｐをコードする核酸は、２つ以上のＡＡＶ血清型からのヌクレオチドを含む。例えば、ｒｅｐをコードする核酸は、ＡＡＶ２血清型からのヌクレオチドと、ＡＡ３血清型からのヌクレオチドと、を含んでもよい（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（２）：７９１－８０１）。

【0016】

本明細書で使用される場合、「組換えアデノ関連ウイルスベクター」、「ｒＡＡＶ」及び／又は「ｒＡＡＶベクター」は、ベクターゲノムを含むＡＡＶを指し、ここで、ポリヌクレオチド配列はＡＡＶ起源ではないか、又は完全にはＡＡＶ起源ではなく（例えば、ＡＡＶとは異種のポリヌクレオチド）、野生型ＡＡＶウイルスゲノムのｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子は、ウイルスゲノムから除去されている。典型的なＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が除去されているか、又は存在しない場合（及び隣接するＩＴＲが、典型的には、異なる血清型、例えば、限定されないが、カプシドがＡＡＶ２ではないＡＡＶ２ ＩＴＲに由来する場合）、ＡＡＶ内の核酸（任意のＩＴＲとそれらとの間の任意の核酸を含む）は、「ベクターゲノム」と称される。したがって、ｒＡＡＶベクターという用語は、カプシド及び異種核酸、すなわち、天然においてカプシドに元々存在しない核酸を含むｒＡＡＶウイルス粒子を包含し、以下「ベクターゲノム」と称する。したがって、「ｒＡＡＶベクターゲノム」（又は「ベクターゲノム」）は、ＡＡＶカプシド内に含有され得るが、必ずしもそうではない異種ポリヌクレオチド配列（典型的には、元のＡＡＶ内に存在する元の核酸と関連しない少なくとも１つのＩＴＲを含むが、必ずしもそうではない）を指す。ｒＡＡＶベクターゲノムは、二本鎖（ｄｓＡＡＶ）、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）及び／又は自己相補的（ｓｃＡＡＶ）であってもよい。

【0017】

本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶベクター」、「ｒＡＡＶウイルス粒子」及び／又は「ｒＡＡＶベクター粒子」という用語は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（ただし、典型的には、ＡＡＶのカプシドタンパク質、例えば、ＶＰＩ、ＶＰＳ及びＶＰ３、又はそれらの変異体の全てが存在する）を含み、元のＡＡＶカプシドに元々存在しない異種核酸配列を含むベクターゲノムを含有するＡＡＶカプシドを指す。これらの用語は、組換えではない「ＡＡＶウイルス粒子」又は「ＡＡＶウイルス」から区別されるべきであり、カプシドはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするウイルスゲノムを含有し、ＡＡＶウイルスは、アデノウイルス及び／若しくは単純ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルス、並びに／又はそれらからの必要なヘルパー遺伝子も含む細胞に存在する場合、複製することができる。したがって、ｒＡＡＶベクター粒子の産生は、組換えＤＮＡ技術を使用した組換えベクターゲノムの産生を必然的に含み、したがってこのベクターゲノムはカプシド内に含有され、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルス粒子、又はｒＡＡＶベクター粒子を形成する。

【0018】

様々な血清型のＡＡＶのゲノム配列、並びに逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ｒｅｐタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列が、自然界に存在する及び／又はそれらの変異及び変異体の両方であることが、当該技術分野で既知である。そのような配列は、文献中に、又はＧｅｎＢａｎｋ等の公的データベース中に見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ－００２０７７（ＡＡＶ－１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ－１）、ＮＣ－００１４０１（ＡＡＶ－２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ－２）、ＮＣ－００１７２９（ＡＡＶ－３）、ＮＣ＿００１８６３（ＡＡＶ－３Ｂ）、ＮＣ－００１８２９（ＡＡＶ－４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ－４）、ＮＣ－００６１５２（ＡＡＶ－５）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ－７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ－８）、及びＮＣ－００６２６１（ＡＡＶ－８）を参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５－３８３；国際特許公開第００／２８０６１号、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；ＷＯ２０１３／０６３３７９、ＷＯ２０１４／１９４１３２、ＷＯ２０１５／１２１５０１；及び米国特許第６，１５６，３０３号及び米国特許第７，９０６，１１１号を参照されたい。

【0019】

本明細書で使用される場合、「寛解」という用語は、対象の疾患、障害若しくは状態、又はその症状、又は基礎となる細胞応答の検出可能又は測定可能な改善を意味する。検出可能又は測定可能な改善には、疾患、障害又は状態の発生、頻度、重症度、進行若しくは持続時間、それらによる若しくはそれらに関連する合併症の原因の主観的若しくは客観的な減少、低減、阻害、抑制、制限若しくは制御、それらの症状の改善、又はそれらの逆転が含まれる。

【0020】

本明細書で使用される場合、「に関連する」という用語は、一方の存在、レベル及び／又は形態が他方の存在、レベル及び／又は形態と相関している場合、互いに関連付けられていることを指す。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝子サイン、代謝産物、微生物など）は、その存在、レベル及び／又は形態が（例えば、関連する集団全体にわたって）疾患、障害、又は状態の発生率及び／又は感受性と相関する場合、特定の疾患、障害、又は状態と関連すると考えられる。いくつかの実施形態では、２つ以上のエンティティは、それらが直接的又は間接的に相互作用する場合、互いに物理的に「関連する」ため、それらは互いに物理的に近接している及び／又は互いに物理的に近接したままである。いくつかの実施形態では、互いに物理的に関連した２つ以上のエンティティは互いに共有結合しており、いくつかの実施形態では、互いに物理的に関連付した２つ以上のエンティティは互いに共有結合していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気、及びそれらの組み合わせによって非共有結合的に関連している。

【0021】

本明細書で使用される場合、「ｃｉｓ－モチーフ」又は「ｃｉｓ－エレメント」という用語は、ゲノム配列の末端に見出されるか、又はそれに近接しており、複製の開始のために認識される配列、転写開始、スプライシング又は終結に使用される可能性が高い内部位置での暗号プロモーター又は配列等の保存配列を含む。ｃｉｓ－モチーフ又はｃｉｓ－エレメントは、それが相互作用するそれらの配列と同じ核酸分子上に存在する。これは、同じ核酸分子上に位置しない他の配列と「ｔｒａｎｓで」作用する「ｔｒａｎｓ－モチーフ」配列と区別されるべきである。

【0022】

本明細書で使用される場合、「コード配列」又は「コード核酸」という用語は、タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列を指し、適切な調節配列の制御下に置かれた（作動可能に連結される）場合に、（ＤＮＡの場合）転写され、（ｍＲＮＡの場合）インビトロ又はインビボでポリペプチドに翻訳される配列を示す。コード配列の境界は、一般に、５’（アミノ）末端にある開始コドン及び３’（カルボキシ）末端にある翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物又は真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、更には合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0023】

本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，４９１，９０７号に記載されているように、異なるパルボウイルス、好ましくは異なるＡＡＶ血清型からのカプシド配列を有するウイルスカプシドを指す。また、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８（９）：４４２１－４４３２を参照されたい。いくつかの実施形態では、キメラウイルスカプシドは、以下の変異を有するＡＡＶ２カプシドの配列を有するＡＡＶ２．５カプシドである：２６３Ｑ～Ａ、２６５挿入Ｔ、７０５Ｎ～Ａ、７０８Ｖ～Ａ、及び７１６Ｔ～Ｎ。そのようなカプシドをコードするヌクレオチド配列は、ＷＯ２００６／０６６０６６に記載されるような配列番号１５として定義される。他の好ましいキメラＡＡＶカプシドとしては、限定されないが、ＷＯ２０１０／０９３７８４に記載のＡＡＶ２ｉ８、ＷＯ２０１４／１４４２２９に記載のＡＡＶ２Ｇ９及びＡＡＶ８Ｇ９、並びにＡＡＶ９．４５（Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９（６）：１０７０－１０７８）、ＷＯ２１０３／０２９０３０に記載のＡＡＶ－ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶ－ＬＫ０１～ＡＡＶ－ＬＫ０１９、ＷＯ２０５／０１３３１３に記載のＲＨＭ４－１及びＲＨＭ１５－１～ＲＨＭ５－６、ＷＯ２００７／１２０５４２に記載のＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－ＤＪ／９が挙げられる。

【0024】

本明細書で使用される場合、「保存的置換」という用語は、生物学的、化学的又は構造的に類似した残基による１つのアミノ酸の置換を指す。生物学的に類似しているとは、置換が生物活性を破壊しないことを意味する。構造的に類似しているとは、アミノ酸が、アラニン、グリシン及びセリン等の長さが類似している側鎖を有するか、又は類似のサイズを有することを意味する。化学的類似性は、残基が同じ電荷を有するか、又は親水性若しくは疎水性の両方であることを意味する。具体的な例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニン等の疎水性残基の別の残基との置換、又は１つの極性残基の別の残基との置換、例えば、アルギニンのリジンとの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸との置換、グルタミンのアスパラギンとの置換、セリンのトレオニンとの置換等が挙げられる。保存的置換の具体的な例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン等の疎水性残基の互いの置換、アルギニンのリジンとの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸との置換、又はグルタミンのアスパラギンとの置換等の極性残基の別の残基との置換が挙げられる。保存的アミノ酸置換は、典型的には、例えば、以下の群内：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン内での置換を含む。「保存的置換」はまた、非置換親アミノ酸に代わる置換アミノ酸の使用を含む。

【0025】

本明細書で使用される場合、「隣接する」という用語は、他のエレメントに隣接する配列を指し、配列に対して上流及び／又は下流、すなわち５’及び／又は３’の１つ以上の隣接エレメントの存在を示す。「隣接する」という用語は、配列が必ずしも連続していることを示すことを意図するものではない。例えば、導入遺伝子をコードする核酸と隣接エレメントとの間に介在配列が存在してもよい。他の２つの要素（例えば、ＩＴＲ）に「隣接する」配列（例えば、導入遺伝子）は、１つのエレメントが配列に対して５’に位置し、他のエレメントが配列に対して３’に位置することを示すが、その間に介在する配列が存在してもよい。

【0026】

本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、全体の別個の部分を含むが、全体に見出される１つ以上の部分を欠く構造を有する材料又は実体を指す。いくつかの実施形態では、断片は、別個の部分からなる。いくつかの実施形態では、断片は、全体に見出される特徴的な構造エレメント又は部分からなるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、ポリマー断片は、ポリマー全体に見出される、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００個又はそれ以上のモノマー単位（例えば、アミノ酸残基、ヌクレオチド）を含むか、又はそれからなる。

【0027】

本明細書で使用される場合、「機能性」という用語は、それが特徴付けられる性質及び／又は活性を示す形態の生体分子を指す。生体分子は、２つの機能（すなわち、二機能性）又は多くの機能（すなわち、多機能性）を有し得る。

【0028】

本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、転写及び翻訳された後に、特定のポリペプチド又はタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。「遺伝子移入」又は「遺伝子送達」は、宿主細胞に外来ＤＮＡを確実に挿入するための方法又はシステムを指す。そのような方法は、非組み込みの移入ＤＮＡの一過性発現、移入レプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外複製及び発現、並びに／又は移入遺伝物質の宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みをもたらし得る。

【0029】

本明細書で使用される場合、「異種」又は「外因性」核酸という用語は、核酸の細胞内へのベクター媒介性移入／送達を目的として、ベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）内に挿入された核酸を指す。異種核酸は、典型的には、ベクター（例えば、ＡＡＶ）核酸とは異なる、すなわち、異種核酸は、天然のＡＡＶに見られるウイルス（例えば、ＡＡＶ）核酸に対して非天然である。細胞内に移入（例えば、形質導入）又は送達されると、ベクター内に含まれる異種核酸が発現され得る（例えば、適切であれば転写及び翻訳され得る）。代替的に、ベクター内に含まれる細胞内の移入（形質導入）又は送達された異種核酸は、発現される必要はない。「異種」という用語は、必ずしも核酸に関して本明細書で使用されるわけではないが、修飾語「異種」が存在しない場合でも、核酸に関して言及することは、異種核酸を含むことを意図する。例えば、異種核酸は、ＡＳＰＡポリペプチドをコードする核酸、例えば、カナバン病の治療に使用されるＡＳＰＡをコードするコドン最適化核酸であろう。

【0030】

本明細書で使用される場合、「相同」又は「相同性」という用語は、所与の領域又は部分にわたって少なくとも部分的同一性を共有する２つ以上の参照エンティティ（例えば、核酸又はポリペプチド配列）を指す。例えば、２つのペプチドにおけるアミノ酸位置が同一のアミノ酸によって占められている場合、ペプチドはその位置で相同である。特に、相同ペプチドは、非修飾ペプチド又は参照ペプチドに関連する活性又は機能を保持し、修飾ペプチドは、一般に、非修飾配列のアミノ酸配列と「実質的に相同」であるアミノ酸配列を有する。ポリペプチド、核酸又はその断片を指す場合、「実質的な相同性」又は「実質的な類似性」とは、別のポリペプチド、核酸（又はその相補鎖）又はその断片と適切な挿入又は欠失に関して最適に整列した場合、配列の少なくとも約９５％～９９％に配列同一性が存在することを意味する。２つの配列間の相同性（同一性）の程度は、コンピュータプログラム又は数学アルゴリズムを使用して確認することができる。パーセント配列相同性（又は同一性）を計算するそのようなアルゴリズムは、概して、比較領域又はエリアにわたる配列ギャップ及びミスマッチを説明する。例示的なプログラム及びアルゴリズムを以下に提供する。

【0031】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「トランスフェクタント」、「トランスフォーマント」、「形質転換細胞」、及び「形質導入細胞」を含み、これには、一次トランスフェクト、形質転換又は形質導入された細胞、及びそれに由来する子孫が、継代の数に関係なく含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ｒＡＡＶベクターの産生のためのパッケージング細胞である。

【0032】

本明細書で使用される場合、「同一性」又は「同一の」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／若しくはＲＮＡ分子）間、並びに／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上に同一である場合、互いに「実質的に同一」であるとみなされる。

【0033】

２つの核酸又はポリペプチド配列のパーセント同一性の計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、ギャップは、最適な整列のために第１及び第２の配列の一方又は両方に導入することができ、非同一の配列は、比較目的のために無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較のために整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％である。次いで、対応する位置のヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸）によって占有される場合、分子は、その位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列のために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置数の関数である。配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。

【0034】

パーセント同一性又は相同性を決定するために、ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で利用可能なＢＬＡＳＴを含む方法及びコンピュータプログラムを用いて配列を整列させることができる。別の整列アルゴリズムは、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡからのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージにおいて入手可能なＦＡＳＴＡである。整列のための他の技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。特に興味深いのは、配列内のギャップを許容する整列プログラムである。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列整列におけるギャップを許容するアルゴリズムの一種である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３－１８７（１９９７）を参照されたい。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ整列法を用いたＧＡＰプログラムを利用して配列を整列させることもできる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０）を参照されたい。

【0035】

配列同一性を決定するためのＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（１９８１，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９）を使用したＢｅｓｔＦｉｔプログラムも興味深い。ギャップ生成ペナルティは、概して、１～５、通常２～４の範囲であり、いくつかの実施形態では３である。ギャップ伸長ペナルティは、概して、約０．０１～０．２０の範囲であり、いくつかの場合では０．１０である。このプログラムは、比較されるべく入力された配列によって決定されるデフォルトパラメータを有する。好ましくは、配列同一性は、このプログラムによって決定されるデフォルトパラメータを使用して決定される。このプログラムもまた、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡからのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージから入手可能である。

【0036】

興味深い別のプログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７－１４９，１９８８に記載されている。パーセント配列同一性は、以下のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢによって計算される。ミスマッチペナルティ：１．００、ギャップペナルティ：１．００、ギャップサイズペナルティ：０．３３、及び結合ペナルティ：３０．０。

【0037】

本明細書で使用される場合、「増加させる」、「改善する」、又は「低減する」という用語は、本明細書に記載される治療の開始前の同じ個体における測定値、又は本明細書に記載される治療の非存在下での対照個体（若しくは複数の対照個体）における測定値等のベースライン測定値に対して相対的である値を示す。いくつかの実施形態では、「対照個体」は、治療される個体と同じ形態の疾患又は傷害に罹患している個体である。

【0038】

本明細書で使用される場合、「逆方向末端反復」、「ＩＴＲ」、「末端反復」、及び「ＴＲ」という用語は、ほぼ相補的で対称的に配置された配列を含む、ＡＡＶゲノムの末端又はその付近の回文末端反復配列を指す。これらのＩＴＲは折り畳まれて、ＤＮＡ複製の開始中にプライマーとして機能するＴ字型ヘアピン構造を形成し得る。これらはまた、宿主ゲノムへのウイルスゲノム組み込み、宿主ゲノムからの奪回、及び成熟ビリオンへのウイルス核酸のカプシド化にも必要である。ＩＴＲは、ベクターゲノム複製及びウイルス粒子へのそのパッケージングのために、ｃｉｓで必要とされる。「５’ＩＴＲ」は、ＡＡＶゲノムの５’末端及び／又は組換え導入遺伝子に対する５’のＩＴＲを指す。「３’ＩＴＲ」は、ＡＡＶゲノムの３’末端及び／又は組換え導入遺伝子に対する３’のＩＴＲを指す。野生型ＩＴＲの長さは、約１４５ｂｐである。修飾又は組換えＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列の断片又は一部を含んでもよい。当業者は、連続したラウンドのＤＮＡ複製ＩＴＲ配列が、５’ＩＴＲが３’ＩＴＲとなるように入れ替わってもよく、逆も同様であることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、ベクターゲノムがカプシドにパッケージングされて、ベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクター（本明細書において「ｒＡＡＶベクター粒子」又は「ｒＡＡＶウイルス粒子」とも称される）を産生することができるように、少なくとも１つのＩＴＲが組換えベクターゲノムの５’及び／又は３’末端に存在する。

【0039】

本明細書で使用される場合、「単離」という用語は、１）人間の手によって設計、製造、調製、及び／若しくは製造された、並びに／又は２）それが最初に生成されたときにそれが関連付けられた成分のうちの少なくとも１つから分離された（自然及び／若しくは実験的な設定において）物質又は組成物を指す。一般に、単離された組成物は、自然界で通常関連する１つ以上の材料、例えば、１つ以上のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、及び／又は細胞膜を実質的に含まない。「単離」という用語は、ベクターゲノム及び医薬製剤をパッケージングする、例えばカプシド化する人工の組み合わせ、例えば組換え核酸、組換えベクターゲノム（例えば、ｒＡＡＶベクターゲノム）、ｒＡＡＶベクター粒子（例えば、限定されないが、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１カプシドを含むｒＡＡＶベクター粒子など）を除外しない。また、「単離」という用語は、ハイブリッド／キメラ、多量体／オリゴマー、修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質付加）、変異体若しくは誘導体化形態、又は人工の宿主細胞で発現される形態などの、組成物の代替の物理的形態も除外しない。

【0040】

単離された物質又は組成物は、それらが最初に関連付けられた他の構成要素の約１０％、約２０％、約３０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。いくつかの実施形態では、当業者に理解されるように、物質は、例えば、１つ以上の担体又は賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）などのある特定の他の成分と組み合わせた後も依然として「単離」又は「純粋」とみなすことができ、そのような実施形態では、物質の単離又は純度のパーセントは、そのような担体又は賦形剤を含まずに計算される。

【0041】

本明細書で使用される場合、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、及び「ポリヌクレオチド」という用語は、ホスホジエステル結合によって連結された単量体ヌクレオチドで構成されるか、又はそれを含む任意の分子を同義的に指す。核酸は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり得る。核酸配列は、本明細書において、５’から３’への方向に提示される。本開示の核酸配列（すなわち、ポリヌクレオチド）は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子又はリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得、核酸の全ての形態、例えば、二本鎖分子、一本鎖分子、低分子又は単鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子又は単鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランススプライシングＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡを指す。ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である場合、その分子は、遺伝子、ｃＤＮＡ、アンチセンス分子又は前述の分子のいずれかの断片であり得る。ヌクレオチドは、本明細書において、単一文字コード：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）、及びウラシル（Ｕ）によって示される。ヌクレオチド配列は、化学修飾又は人工的であり得る。ヌクレオチド配列は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロック核酸（ＬＮＡ）、並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含む。これらの配列の各々は、分子の骨格への変化によって、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡと区別される。また、ホスホロチオエートヌクレオチドが使用されてもよい。他のデオキシヌクレオチド類似体としては、メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’－Ｐ５’－ホスホラミデート、及びオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエート、並びにそれらの２’－０－アリル類似体、及び本開示のヌクレオチド配列に使用され得る２’－０－メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが挙げられる。

【0042】

本明細書で使用される場合、「核酸コンストラクト」という用語は、組換えＤＮＡ技術（例えば、組換え核酸）の使用から生じる非天然の核酸分子を指す。核酸コンストラクトは、一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子であり、自然界には見られない様式で結合及び配置される核酸配列のセグメントを含有するように修飾されている。核酸コンストラクトは、「ベクター」（例えば、プラスミド、ｒＡＡＶベクターゲノム、発現ベクターなど）、すなわち、外因的に形成されたＤＮＡを宿主細胞に送達するように設計された核酸分子であり得る。

【0043】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、機能的関係にある核酸配列（又はポリペプチド）エレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに作動可能に連結される。例えば、プロモーター又は他の転写調節配列（例えば、エンハンサー）は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、作動可能に連結されているとは、連結されている核酸配列が連続していることを意味する。いくつかの実施形態では、作動可能に連結されているとは、核酸配列が連続的に連結されていることを意味せず、むしろ連結されているそれらの核酸配列の間に介在配列が存在する。

【0044】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」及び「生理学的に許容される」という用語は、インビボ送達又は接触の１つ以上の投与経路に好適な、生物学的に許容される製剤、気体、液体若しくは固体、又はそれらの混合物を指す。

【0045】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」又は「核酸配列によってコードされる」（すなわち、ヌクレオチド配列によってコードされるポリヌクレオチド配列によってコードされる）という用語は、天然に存在するタンパク質と同様に、完全長の天然配列、並びに機能的部分配列、修飾形態又は配列変異体を指すが、その部分配列、修飾形態又は変異体が天然の完全長タンパク質のある程度の機能性を保持している限りである。本開示の方法及び使用において、そのようなポリペプチド、タンパク質、及び核酸配列によってコードされるペプチドは、遺伝子療法で治療された対象において、欠陥のある、又はその発現が不十分である若しくは欠損している内因性タンパク質と同一であってもよいが、必須ではない。

【0046】

本明細書で使用される場合、「予防する」又は「予防」という用語は、特定の疾患、障害又は状態（例えば、カナバン病）の１つ以上の兆候又は症状の発症遅延、並びに／又は頻度及び／若しくは重症度の低減を指す。いくつかの実施形態では、疾患、障害又は状態に感受性のある集団において、疾患、障害又は状態の１つ以上の兆候又は症状の発症、頻度及び／又は強度の統計的に有意な減少が観察される場合、薬剤が特定の疾患、障害又は状態を「予防する」とみなされるように、予防が集団ベースで評価される。予防は、疾患、障害、又は状態の発症が所定の期間遅延している場合、完全であるとみなされ得る。

【0047】

本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、クローニング、制限、若しくはライゲーションステップの様々な組み合わせの産物であるベクター、ポリヌクレオチド（例えば、組換え核酸）、ポリペプチド、若しくは細胞、及び／又は天然に見られる産物とは異なるコンストラクトをもたらす他の手順を指す。組換えウイルス又はベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、組換え核酸（例えば、導入遺伝子及び１つ以上の調節エレメント、例えば、ＡＳＰＡ及びＣＢｈプロモーターをコードするコドン最適化核酸を含む核酸）を含むベクターゲノムを含む。この用語は、元のポリヌクレオチドコンストラクトの複製、及び元のウイルスコンストラクトの子孫をそれぞれ含む。

【0048】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、生物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類、霊長類、実験動物、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ネコ、イヌ）を指す。いくつかの実施形態では、対象はｎｕｒ７マウスである。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、成人、青年、又は小児対象である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害又は状態、例えば、本明細書に提供されるように治療され得る疾患、障害又は状態に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、アスパルトアシラーゼ活性の欠損又は機能不全、例えば、カナバン病に関連する疾患、障害又は状態に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、又は状態に感受性である。いくつかの実施形態では、感受性の対象は、疾患、障害又は状態を発症する（参照対象又は集団において観察される平均リスクと比較して）増加したリスクを有しやすい、及び／又はそれを示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害又は状態の１つ以上の症状を呈する。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、又は状態の特定の症状（例えば、疾患の臨床的症状）又は特徴を示さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、又は状態の任意の症状又は特徴を示さない。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト患者である。いくつかの実施形態では、対象は、診断及び／又は療法が施される個体及び／又は施された個体である（例えば、カナバン病の遺伝子療法）。いくつかの実施形態では、対象は、カナバン病を有するヒト患者である。

【0049】

本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、関心のある特徴又は特性の全て又はほぼ全ての度合い又は程度の発現の定性的条件を指す。当業者であれば、生物学的及び化学的現象は、あるとしても、完全に達すること、及び／又は完全に進行すること若しくは絶対的な結果を達成することは稀であることを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び化学的現象に内在する潜在的な完全性の欠如を捉えるために本明細書で使用される。

【0050】

本明細書で使用される場合、「症状が低減される」又は「症状を低減する」という用語は、特定の疾患、障害又は状態の１つ以上の症状の大きさ（例えば、強度、重症度等）及び／又は頻度が低減される場合を指す。明確にするために、特定の症状の発症の遅延は、その症状の頻度を低減する一形態とみなされる。

【0051】

本明細書で使用される場合、「治療用ポリペプチド」という用語は、標的細胞（例えば、単離された細胞）又は生物（例えば、対象）におけるタンパク質の非存在又は欠陥に起因する症状を軽減又は低減し得るペプチド、ポリペプチド又はタンパク質（例えば、酵素、構造タンパク質、膜貫通タンパク質、輸送タンパク質）である。導入遺伝子によってコードされる治療用ポリペプチド又はタンパク質は、例えば、遺伝的欠陥を補正するために、発現又は機能に関連する遺伝子の欠損を補正するために、対象に利益を与えるものである。同様に、「治療用導入遺伝子」は、治療用ポリペプチドをコードする導入遺伝子である。いくつかの実施形態では、宿主細胞において発現される治療用ポリペプチドは、導入遺伝子（すなわち、宿主細胞に導入された外因性核酸）から発現される酵素である。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、大脳皮質細胞（例えば、乏突起膠細胞）に移入された治療用導入遺伝子から発現されるＡＳＰＡタンパク質である。

【0052】

本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、投与の目的となる所望の治療効果を生み出す量を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、疾患、障害又は状態に罹患しているか、又はそれに感受性のある集団に治療的投与計画に従って投与される場合に、疾患、障害又は状態を治療するのに十分な量を指す。いくつかの実施形態では、治療有効量は、疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状の発生率及び／若しくは重症度を低減する、並びに／又は発症を遅延させる量である。当業者は、「治療有効量」という用語が、実際には、特定の個体において治療の成功が達成されることを必要としないことを理解するであろう。むしろ、治療有効量は、そのような治療を必要とする患者に投与された場合、有意な数の対象において特定の所望の薬理学的応答を提供する量であり得る。

【0053】

本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、宿主細胞、標的細胞又は生物（例えば、対象）への送達及び／又は発現のための任意の異種ポリヌクレオチドを意味するために使用される。そのような「導入遺伝子」は、ベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）を使用して宿主細胞、標的細胞又は生物に送達され得る。導入遺伝子は、プロモーター等の対照配列に作動可能に連結され得る。宿主細胞、標的細胞、又は生物において導入遺伝子の発現を促進する能力に基づいて、発現制御配列を選択することができることは、当業者には理解されるであろう。一般に、導入遺伝子は、自然界において導入遺伝子に関連した内因性プロモーターに作動可能に連結され得るが、より典型的には、導入遺伝子は、自然界において導入遺伝子が関連していないプロモーターに作動可能に連結されている。導入遺伝子の例は、治療用ポリペプチド、例えば、ＡＳＰＡポリペプチドをコードする核酸であり、例示的なプロモーターは、自然界においてＡＳＰＡをコードするヌクレオチドに作動可能に連結していないものである。そのような非内因性プロモーターは、当該技術分野で既知である多くのものの中でも、ＣＢｈプロモーターを含み得る。

【0054】

関心のある核酸は、トランスフェクション及び形質導入を含む、当該技術分野で周知である多種多様な技術によって宿主細胞に導入することができる。

【0055】

「トランスフェクション」は、一般に、ウイルスベクターを使用せずに外因性核酸を細胞内に導入するための技術として知られている。本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」という用語は、ウイルスベクターを使用せずに、組換え核酸（例えば、発現プラスミド）を細胞（例えば、宿主細胞）に移入することを指す。組換え核酸が導入された細胞は、「トランスフェクト細胞」と称される。トランスフェクト細胞は、組換えＡＡＶベクターを産生するための発現プラスミド／ベクターを含む宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、Ｐｒｏ１０細胞、ＨＥＫ２９３細胞）であってもよい。いくつかの実施形態では、トランスフェクト細胞（例えば、パッキング細胞）は、導入遺伝子（例えば、ＡＳＰＡ導入遺伝子）を含むプラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、並びにヘルパー遺伝子を含むプラスミドを含み得る。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野で知られており、これには、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性又はアニオン性リポソーム、及び核局在化シグナルと組み合わせたリポソームが含まれるが、これらに限定されない。

【0056】

本明細書で使用される場合、「形質導入」という用語は、ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）による核酸（例えば、ベクターゲノム）の細胞（例えば、乏突起膠細胞を含むがこれらに限定されない標的細胞）への移入を指す。いくつかの実施形態では、カナバン病の遺伝子治療は、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むベクターゲノムを乏突起膠細胞に形質導入することを含む。導入遺伝子がウイルス又はウイルスベクターによって導入された細胞は、「形質導入細胞」と称される。いくつかの実施形態では、形質導入細胞は、単離細胞であり、形質導入はエクスビボで行われる。いくつかの実施形態では、形質導入細胞は、生物（例えば、対象）内の細胞であり、形質導入はインビボで行われる。形質導入細胞は、生物の標的細胞がポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子、例えば、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸）を発現するように、組換えＡＡＶベクターによって形質導入された生物の標的細胞であってもよい。

【0057】

形質導入され得る細胞としては、任意の組織若しくは器官型の細胞、又は任意の起源（例えば、中胚葉、外胚葉若しくは内胚葉）が挙げられる。細胞の非限定的な例としては、肝臓（例えば、肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば、β島細胞、外分泌）、肺、中枢又は末梢神経系、例えば、脳（例えば、神経又は上衣細胞、乏突起膠細胞）又は脊椎、腎臓、眼（例えば、網膜）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、横隔膜、心臓（心臓性）、筋肉若しくは腰部、又は腸（例えば、内分泌）、脂肪組織（白色、褐色又はベージュ）、筋肉（例えば、線維芽細胞、筋細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞、又は造血細胞（例えば、血液又はリンパ球）が挙げられる。追加の例としては、肝臓（例えば、肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば、β島細胞、外分泌細胞）、肺、中枢又は末梢神経系、例えば、脳（例えば、神経又は上衣細胞、乏突起膠細胞）又は脊椎、腎臓、眼（例えば、網膜）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、横隔膜、心臓（心臓性）、筋肉若しくは腰部、又は腸（例えば、内分泌）、脂肪組織（白色、褐色又はベージュ）、筋肉（例えば、線維芽細胞、筋細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞又は造血細胞（例えば、血液又はリンパ球）に発達又は分化する多能性又は多分化能前駆細胞などの幹細胞が挙げられる。

【0058】

いくつかの実施形態では、組織又は器官（例えば、脳）の特定のエリア内に存在する細胞は、組織又は器官に投与されるｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＳＰＡ導入遺伝子を含むｒＡＡＶ）によって形質導入され得る。いくつかの実施形態では、脳細胞が、ＡＳＰＡ導入遺伝子を含むｒＡＡＶで形質導入される。いくつかの実施形態では、脳の皮質の細胞が、ＡＳＰＡ導入遺伝子を含むｒＡＡＶで形質導入される。いくつかの実施形態では、脳の線条体の細胞が、ＡＳＰＡ導入遺伝子を含むｒＡＡＶで形質導入される。いくつかの実施形態では、脳の皮質下白質細胞が、ＡＳＰＡ導入遺伝子を含むｒＡＡＶで形質導入される。いくつかの実施形態では、脳の小脳の細胞が、ＡＳＰＡ導入遺伝子を含むｒＡＡＶで形質導入される。

【0059】

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」又は治療という用語は、特定の疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状、特徴、及び／又は原因を部分的又は完全に軽減する、寛解する、緩和する、阻害する、その発症を遅延させる、その重症度を低減する、及び／又はその発生率を低減する療法の投与を指す。

【0060】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、核酸（例えば、組換え核酸）の挿入又は組み込みによって操作され得るプラスミド、ウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）、コスミド、又は他のビヒクルを指す。ベクターは、例えば、遺伝子操作（例えば、クローニングベクター）を含む様々な目的のために使用して、細胞に核酸を導入／移入し、細胞内の挿入された核酸を転写又は翻訳することができる。いくつかの実施形態では、ベクター核酸配列は、細胞における増殖のための少なくとも複製起点を含有する。いくつかの実施形態では、ベクター核酸は、異種核酸配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性）、ポリアデノシン（ｐｏｌｙＡ）配列、及び／又はＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞に送達されると、核酸配列が伝播される。いくつかの実施形態では、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞に送達される場合、細胞は、異種核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞に送達される場合、核酸配列又は核酸配列の一部がカプシドにパッケージングされる。宿主細胞は、単離された細胞又は宿主生物内の細胞であり得る。ポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列（例えば、導入遺伝子）に加えて、追加の配列（例えば、調節配列）が、同じベクター内（すなわち、遺伝子に対してｃｉｓ）に、及び遺伝子に隣接して存在し得る。いくつかの実施形態では、調節配列は、遺伝子の発現を調節するためにｔｒａｎｓで作用する別個の（例えば、第２の）ベクター上に存在し得る。プラスミドベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称され得る。

【0061】

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」という用語は、ｒＡＡＶベクターを形成するようにパッケージング又はカプシド化される組換え核酸配列を指す。典型的には、ベクターゲノムは、異種ポリヌクレオチド配列、例えば、導入遺伝子、調節エレメント、カプシドに元々存在しないＩＴＲを含む。組換えプラスミドを使用して組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）を構築又は製造する場合、ベクターゲノムは、プラスミド全体を含まず、むしろウイルスベクターによる送達を意図する配列のみを含む。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、典型的には「プラスミド骨格」と称され、これは組換えウイルスベクター産生の伝播に必要とされるプロセスであるプラスミドのクローニング、選択及び増幅に重要であるが、それ自体はｒＡＡＶベクターにパッケージング又はカプシド化されない。

【0062】

本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、概して、核酸送達ビヒクルとして機能し、ウイルス粒子（すなわち、カプシド）内にパッケージングされたベクターゲノム（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐをコードする核酸の代わりに導入遺伝子を含む）を含み、例えば、ＡＡＶ血清型及び変異体（例えば、ｒＡＡＶベクター）を含むレンチウイルス及びパルボウイルスを含むウイルス粒子を指す。組換えウイルスベクターは、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を含むベクターゲノムを含まない。

【0063】

本開示は、遺伝子治療医薬組成物における修飾ＡＳＰＡコード配列を含む修飾核酸、及びその使用を提供する。本明細書で使用される「修飾」とは、１つの実施形態では、修飾された核酸配列が、それ以外の場合は同一の細胞における非修飾、すなわち、天然に存在する（遺伝子の変異形態を含む）核酸配列におけるタンパク質の発現レベルと比較して、細胞におけるタンパク質の発現レベルをより高いレベルに駆動するように、天然に存在するポリペプチドをコードする核酸配列が改変されたことを意味する。本開示はまた、それらの配列の一部として、修飾ＡＳＰＡコード配列を含むベクターゲノムを含む組換え核酸も提供する。更に、本開示は、修飾ＡＳＰＡコード配列を含むｒＡＡＶベクターなどのパッケージングされた遺伝子送達ビヒクルを提供する。本開示はまた、細胞内での送達方法、好ましくは、修飾ＡＳＰＡコード配列の発現を含む。本開示はまた、修飾ＡＳＰＡコード配列が対象に、例えばベクターの構成要素として投与される、及び／又はウイルス遺伝子送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶベクター）の構成要素としてパッケージングされる遺伝子治療方法も提供する。治療は、例えば、対象におけるＡＳＰＡのレベルを増加させ、対象におけるＡＳＰＡ欠乏症を治療するために行われ得る。本開示のこれらの態様のそれぞれは、以下のセクションで更に説明される。

【0064】

ＡＡＶ及びｒＡＡＶベクター
ＡＡＶ
前述のように、「アデノ関連ウイルス」及び／又は「ＡＡＶ」という用語は、直鎖一本鎖ＤＮＡゲノムを有するパルボウイルス及びその変異体を指す。この用語は、別様に必要とされる場合を除いて、全ての亜型、並びに天然に存在する形態及び組換え形態の両方を包含する。ＡＡＶを含むパルボウイルスは、細胞に侵入し、核酸（例えば、導入遺伝子）を核に導入することができるため、遺伝子治療ベクターとして有用である。いくつかの実施形態では、導入された核酸（例えば、ｒＡＡＶベクターゲノム）は、形質導入細胞の核内にエピソームとして持続する環状コンカテマーを形成する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、宿主細胞ゲノム内の特定の部位、例えば、ヒト染色体１９上の部位に挿入される。部位特異的統合は、ランダム統合とは対照的に、予測可能な長期発現プロファイルをもたらす可能性が高いと考えられる。ヒトゲノムへのＡＡＶの挿入部位は、ＡＡＶＳ１と称される。細胞に導入されると、核酸によってコードされるポリペプチドは、細胞によって発現され得る。ＡＡＶは、ヒトにおけるいかなる病原性疾患とも関連しないため、ＡＡＶによって送達される核酸を使用して、ヒト対象における疾患、障害、及び／又は状態の治療のための治療用ポリペプチドを発現することができる。

【0065】

ＡＡＶの複数の血清型が自然界に存在し、少なくとも１５の野生型血清型が、これまでにヒトから同定されている（すなわち、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１５）。天然に存在する及び変異体血清型は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に異なるタンパク質カプシドを有することによって区別される。ＡＡＶタイプ１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶタイプ２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶタイプ３Ａ（ＡＡＶ３Ａ）及びＡＡＶタイプ３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）を含むＡＡＶタイプ３（ＡＡＶ３）、ＡＡＶタイプ４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶタイプ５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶタイプ６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶタイプ７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶタイプ８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶタイプ９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶタイプ１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶタイプ１２（ＡＡＶ１２）、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４（ＷＯ２０１６／２１０１７０を参照）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶ、並びに組換え産生変異体（例えば、挿入、欠失及び置換を伴うカプシド変異体）、例えば、他の多くの変異体の中でもＡＡＶタイプ２ｉ８（ＡＡＶ２ｉ８）、ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＤＪ、ＤＪ／８、ＤＪ／９、ＬＫ３、ＲＨＭ４－１がある。例えば、「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は、非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」は、ウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを指す。血清型独自性は、別のＡＡＶと比較して、あるＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。そのような交差反応性の差は、通常、カプシドタンパク質配列及び抗原決定因子の差に起因する（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列の差に起因する）。しかしながら、一部の天然に存在するＡＡＶ又は人工のＡＡＶ変異（例えば、組換えＡＡＶ）は、現在知られている血清型のいずれとも血清学的差異を示さない場合がある。次いで、これらのウイルスは、対応するタイプのサブグループ、又はより単純に変異体ＡＡＶとみなされ得る。したがって、本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、血清学的に異なるウイルス、例えばＡＡＶ、並びに血清学的には異ならないが、所与の血清型のサブグループ又は変異体内にあり得るウイルス、例えばＡＡＶの両方を指す。

【0066】

既知のＡＡＶ血清型のカプシドのアミノ酸配列の包括的なリスト及び整列は、特に補足図１において、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（１１）：１９００－１９０９によって提供される。

【0067】

様々な血清型のＡＡＶのゲノム配列、並びにネイティブ末端反復（ＩＴＲ）、ｒｅｐタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列が、当該技術分野で既知である。そのような配列は、文献中に、又はＧｅｎＢａｎｋ等の公的データベース中に見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７（ＡＡＶ１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ１）、ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ３）、ＮＣ＿００１８６３（ＡＡＶ３Ｂ）、ＮＣ＿００１８２９（ＡＡＶ４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ５）、ＮＣ＿００１８６２（ＡＡＶ６）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ８）、及びＮＣ＿００６２６１（ＡＡＶ８）を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５； Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５－３８３；国際特許公開ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；ＷＯ２０１３／０６３３７９；ＷＯ２０１４／１９４１３２；ＷＯ２０１５／１２１５０１、及び米国特許第６，１５６，３０３号及び米国特許第７，９０６，１１１号を参照されたい。例示のみを目的として、野生型ＡＡＶ２は、３つのタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３；合計６０個のカプシドタンパク質がＡＡＶカプシドを構成する）で構成されるＡＡＶの小さな（２０～２５ｎｍ）二十面体ウイルスカプシドを、重複する配列とともに含む。タンパク質ＶＰ１（７３５ａａ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７８０）、ＶＰ２（５９８ａａ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７７８）及びＶＰ３（５３３ａａ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７７９）は、カプシド内に１：１：１０の比率で存在する。すなわち、ＡＡＶについて、ＶＰ１は完全長タンパク質であり、ＶＰ２及びＶＰ３は、ＶＰ１に比べてＮ末端の切断が増加したＶＰ１の漸進的に短いバージョンである。

【0068】

組換えＡＡＶ
上述のように、「組換えアデノ関連ウイルス」又は「ｒＡＡＶ」は、内因性ウイルスゲノムの全て又は一部を非天然配列で置き換えることによって、野生型ＡＡＶから区別される。ウイルス内に非天然配列を組み込むことは、ウイルスベクターを「組換え」ベクター、したがって「ｒＡＡＶベクター」として定義する。ｒＡＡＶベクターは、所望のタンパク質又はポリペプチド（例えば、ＡＳＰＡポリペプチド）をコードする異種ポリヌクレオチドを含み得る。組換えベクター配列は、ＡＡＶカプシドにカプシド化又はパッケージングされてもよく、「ｒＡＡＶベクター」、「ｒＡＡＶベクター粒子」、「ｒＡＡＶウイルス粒子」、又は単に「ｒＡＡＶ」と称される。

【0069】

ｒＡＡＶベクターの産生のために、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の望ましい比率は、約１：１：１～約１：１：１００の範囲内、好ましくは約１：１：２～約１：１：５０の範囲内、より好ましくは約１：１：５～約１：１：２０の範囲内である。ＶＰ１：ＶＰ２の望ましい比率は１：１であるが、ＶＰ１：ＶＰ２の比率の範囲は１：５０～５０：１で変動し得る。

【0070】

本開示は、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（例えば、ＡＡＶとは異種のポリヌクレオチド）を含むｒＡＡＶベクターを提供する。異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、場合によっては２つのＡＡＶ末端反復配列（例えば、逆方向末端反復（ＩＴＲ））に隣接し得る。本明細書において「ベクターゲノム」とも称されるＩＴＲに隣接する異種ポリヌクレオチドは、典型的には、治療的処置のための標的（例えば、カナバン病の治療のためのＡＳＰＡをコードする核酸）などの関心のあるポリペプチド又は関心のある遺伝子（「ＧＯＩ」）をコードする。ｒＡＡＶベクターの対象（例えば、患者）への送達又は投与は、コードされたタンパク質及びペプチドを対象に提供する。したがって、ｒＡＡＶベクターを使用して、例えば、様々な疾患、障害及び状態を治療するための発現のための異種ポリヌクレオチドを転写／送達することができる。

【0071】

ｒＡＡＶベクターゲノムは概して、ウイルスｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を置き換えた異種核酸配列に対してｃｉｓに１４５塩基のＩＴＲを保持する。そのようなＩＴＲは、組換えＡＡＶベクターを産生するために必要であるが、修飾ＡＡＶ ＩＴＲ及び部分的又は完全に合成された配列を含む非ＡＡＶ末端反復もまた、この目的に役立つことができる。ＩＴＲは、ヘアピン構造を形成し、例えば、感染後の相補的ＤＮＡ鎖の宿主細胞媒介性合成のためのプライマーとして機能する。ＩＴＲはまた、ウイルスパッケージング、統合等においても役割を果たす。ＩＴＲは、ＡＡＶゲノム複製及びｒＡＡＶベクターへのパッケージングのためにｃｉｓで必要とされる唯一のＡＡＶウイルスエレメントである。ｒＡＡＶベクターゲノムは、任意選択で、異種配列（例えば、関心のある遺伝子をコードする導入遺伝子、又はアンチセンス及びｓｉＲＮＡを含むがこれらに限定されない関心のある核酸配列、並びに多くの他のものの中でもＣＲＩＳＰＲ分子）を含むベクターゲノムの５’及び３’末端に一般的に存在する２つのＩＴＲを含む。５’及び３’ＩＴＲは、両方とも同じ配列を含んでもよく、又はそれぞれが異なる配列を含んでもよい。ＡＡＶ ＩＴＲは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは１１、又は任意の他のＡＡＶを含むがこれらに限定されない、任意のＡＡＶに由来し得る。

【0072】

本開示のｒＡＡＶベクターは、カプシドの血清型（例えば、ＡＡＶ８、Ｏｌｉｇ００１）とは異なるＡＡＶ血清型（例えば、野生型ＡＡＶ２、その断片又は変異体）からのＩＴＲを含み得る。１つの血清型からの少なくとも１つのＩＴＲを含むが、異なる血清型からのカプシドを含むそのようなｒＡＡＶベクターは、ハイブリッドウイルスベクターと称され得る（米国特許第７，１７２，８９３号を参照されたい）。ＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ＩＴＲ配列全体を含んでもよく、又はその変異体、断片、若しくは修飾であってもよいが、機能性を保持する。

【0073】

いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、ベクターゲノムの左端及び右端（すなわち、それぞれ５’及び３’末端）に位置するＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ、ただし任意の野生型ＡＡＶ血清型由来のＩＴＲ、又はその変異体を含み得る）を含む。いくつかの実施形態では、左（例えば、５’）のＩＴＲは、配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９の核酸配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、左（例えば、５’）のＩＴＲは、配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％又は１００％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、右（例えば、３’）のＩＴＲは、配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９の核酸配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、右（例えば、３’）のＩＴＲは、配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％又は１００％同一である核酸配列を含む。各ＩＴＲは、ＡＳＰＡ及び調節エレメントをコードする修飾核酸を含む組換え核酸などの可変長の核酸配列によって、互いに、又はベクターゲノム中の他のエレメントとｃｉｓにあるが、分離していてもよい。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、又はその変異体であり、ＡＳＰＡ導入遺伝子に隣接する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ（例えば、配列番号５、配列番号１２、又は配列番号１９に示される配列を有するＩＴＲ）に隣接するＡＳＰＡ導入遺伝子（例えば、配列番号２の核酸配列を含む）を含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、直鎖の一本鎖であり、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接している。異種遺伝子の転写及び翻訳の前に、自己プライミングＩＴＲのうちの１つの遊離３’－ＯＨを使用して、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、形質導入細胞内のＤＮＡポリメラーゼ）によって、約４７００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡゲノムを二本鎖形態に変換して、第２の鎖合成を開始しなければならない。いくつかの実施形態では、完全長一本鎖ベクターゲノム（すなわち、センス及びアンチセンス）はアニールして、完全長二本鎖ベクターゲノムを生成する。これは、反対の極性（すなわち、センス又はアンチセンス）のゲノムを担持する複数のｒＡＡＶベクターが同時に同じ細胞を形質導入する場合に生じ得る。それらがどのように産生されるかにかかわらず、二本鎖ベクターゲノムが形成されると、細胞は、二本鎖ＤＮＡを転写及び翻訳し、異種遺伝子を発現することができる。

【0075】

ｒＡＡＶベクターからの導入遺伝子発現の効率は、発現前に一本鎖ｒＡＡＶゲノム（ｓｓＡＡＶ）を二本鎖ＤＮＡに変換する必要性によって妨げられ得る。このステップは、ＤＮＡ合成又は複数のベクターゲノム間の塩基対合を必要とせずに、二本鎖ＤＮＡに折り畳むことができる反転反復ゲノムをパッケージングすることができる自己相補的ＡＡＶゲノム（ｓｃＡＡＶ）を使用することによって回避される（ＭｃＣａｒｔｙ，（２００８）Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒａｐｙ １６（１０）：１６４８－１６５６；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１２４８－１２５４；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２１１２－２１１８）。ｓｃＡＡＶベクターの制限は、カプシド中にパッケージングされる固有の導入遺伝子、調節エレメント及びＩＲＴのサイズが、ｓｓＡＡＶベクターゲノム（すなわち、２つのＩＴＲを含めて約４，９００ヌクレオチド）のサイズの約半分（すなわち、約２，５００ヌクレオチド、そのうち２，２００ヌクレオチドは導入遺伝子及び調節エレメントであってもよく、プラス約１４５ヌクレオチドＩＴＲの２つのコピーであってもよい）であることである。

【0076】

ｓｃＡＡＶベクターゲノムは、末端分解部位（ＴＲＳ）を含まない核酸を使用するか、又はベクターゲノムを含むベクター、例えばプラスミドの１つのｒＡＡＶ ＩＴＲからＴＲＳを改変し、それによってその末端からの複製の開始を防止することによって作製される（米国特許第８，７８４，７９９号を参照されたい）。宿主細胞内のＡＡＶ複製は、ｓｃＡＡＶベクターゲノムの野生型ＩＴＲで開始され、末端分解部位を欠くか、又は改変された末端分解部位を含むＩＴＲを通して継続し、次いでゲノムを通して戻り、相補鎖を形成する。したがって、得られる相補的単一核酸分子は、中央に変異（分解されていない）ＩＴＲ、及び両端に野生型ＩＴＲを有するベクターゲノムをもたらす自己相補的核酸分子である。いくつかの実施形態では、ＴＲＳを欠くか、又は改変されたＴＲＳを含む変異ＩＴＲは、ベクターゲノムの５’末端にある。いくつかの実施形態では、ＴＲＳを欠くか、又は分解されていない（切断されていない）改変されたＴＲＳを含む変異ＩＴＲは、ベクターゲノムの３’末端にある。いくつかの実施形態では、変異ＩＴＲは、配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９の核酸を含む。

【0077】

理論に束縛されることを望まないが、ｓｃＡＡＶゲノムの２つの半分は相補的であるものの、多くの塩基が内側カプシドシェルのアミノ酸残基と接触し、リン酸骨格が中心に向かって隔離されるため、カプシド内に実質的な塩基対が存在する可能性は低い（ＭｃＣａｒｔｙ，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１６（１０）：１６４８－１６５６）。コーティングを解除すると、ｓｃＡＡＶゲノムの２つの半分がアニールして、一方の端に共有結合で閉じたＩＴＲを有し、他方に２つの開放型ＩＴＲを有するｄｓＤＮＡヘアピン分子を形成する可能性が高い。ＩＴＲは、とりわけ、導入遺伝子及びそれに対してシスに調節エレメントをコードする二本鎖領域に隣接する。

【0078】

ｒＡＡＶベクターのウイルスカプシドは、野生型ＡＡＶ又は変異体ＡＡＶ、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４（ＷＯ２０１６／２１０１７０を参照されたい）、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＲＨＭ４－１（ＷＯ２０１５／０１３３１３の配列番号５）、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９，４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２，８Ｇ９、ＡＶＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶトリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ及びそれらの変異体に由来してもよい（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４^ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい）。カプシドは、米国特許第７，９０６，１１１号；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１；Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５；ＷＯ２０１３／０６３３７９；ＷＯ２０１４／１９４１３２に開示されているＡＡＶ血清型のいくつかから得られてもよく、またＷＯ２０１５／１２１５０１に開示されている真のタイプＡＡＶ（ＡＡＶ－ＴＴ）変異体、並びにＷＯ２０１５／０１３３１３号に開示されているＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１～ＲＨＭ１５－６、及びその変異体を含む。当業者であれば、同じ又は類似の機能を実行する、まだ特定されていない他のＡＡＶ変異体が存在する可能性が高いことを知っているであろう。ＡＡＶ ｃａｐタンパク質の完全な補体には、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３が含まれる。ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、完全な補体ＡＡＶＣａｐタンパク質未満を含んでもよく、又はＡＡＶｃａｐタンパク質の完全な補体が提供されてもよい。

【0079】

別の実施形態では、本開示は、治療的インビボ遺伝子治療で使用するための祖先ＡＡＶベクターの使用を提供する。具体的には、コンピュータを用いて得られた配列がデノボ合成され、生物学的活性について特徴付けられ得る。祖先配列の予測及び合成は、ｒＡＡＶベクターへの組み立てに加えて、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０５４６５３に記載の方法を使用して達成され得る。特に、祖先ウイルス配列から組み立てられたｒＡＡＶベクターは、同時代のウイルス又はその一部と比較して、ヒト集団において既存の免疫に対する感受性が低減され得る。

【0080】

いくつかの実施形態では、２つ以上のＡＡＶ血清型（例えば、野生型ＡＡＶ血清型、変異体ＡＡＶ血清型）に由来するヌクレオチド配列によってコードされるカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶベクターは、「キメラベクター」又は「キメラカプシド」と称される（その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４９１，９０７号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、キメラカプシドタンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれよりも多くのＡＡＶ血清型に由来する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ２ｉ８、又はそれらの変異体に由来するカプシド配列を含み、前述のＡＡＶ血清型のいずれかからのアミノ酸の組み合わせを含むキメラカプシドタンパク質をもたらす（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（２）：７９１－８０１を参照されたい）。代替的に、キメラカプシドは、１つの血清型由来のＶＰ１、異なる血清型由来のＶＰ２、更に異なる血清型由来のＶＰ３、及びそれらの組み合わせの混合物を含み得る。例えば、キメラウイルスカプシドは、ＡＡＶ１ｃａｐタンパク質又はサブユニット、並びに少なくとも１つのＡＡＶ２ｃａｐタンパク質又はサブユニットを含み得る。キメラカプシドは、例えば、１つ以上のＢ１９ｃａｐサブユニットを有するＡＡＶカプシドを含むことができ、例えば、ＡＡＶ ｃａｐタンパク質又はサブミントは、Ｂ１９キャップタンパク質又はサブユニットによって置き換えられ得る。例えば、一実施形態では、ＡＡＶカプシドのＶＰ３サブユニットは、Ｂ１９のＶＰ２サブユニットによって置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、キメラカプシドは、ＷＯ２０１４０５２７８９に記載されるようなＯｌｉｇ００１カプシドであり、参照により本明細書に組み込まれる。

【0081】

いくつかの実施形態では、キメラベクターは、改変された指向性又は特定の組織若しくは細胞型に対する指向性を示すように操作されている。「指向性」という用語は、ある特定の細胞若しくは組織型へのウイルスの優先的な進入、及び／又はある特定の細胞若しくは組織型への進入を促進する細胞表面との優先的な相互作用を指す。ＡＡＶ指向性は、一般に、異なるウイルスカプシドタンパク質とそれらの同族細胞受容体との間の特異的相互作用によって決定される（Ｌｙｋｋｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｄｅｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．１０：１６）。好ましくは、ウイルス又はウイルスベクターが細胞に入ると、ベクターゲノム（例えば、ｒＡＡＶベクターゲノム）によって担持される配列（例えば、導入遺伝子などの異種配列）が発現する。

【0082】

「指向性プロファイル」は、様々な組織及び／又は器官における１つ以上の標的細胞の形質導入のパターンを指す。例えば、キメラＡＡＶカプシドは、ニューロン、アストロサイト及び他のＣＮＳ細胞の低い形質導入のみを伴う乏突起膠細胞の効率的な形質導入によって特徴付けられる指向性プロファイルを有し得る。参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／０５２７８９を参照されたい。そのようなキメラカプシドは、乏突起膠細胞に対する指向性を示す「乏突起膠細胞に特異的」とみなされ得、ＣＮＳに直接投与されたときにニューロン、アストロサイト、及び他のＣＮＳ細胞型よりも乏突起膠細胞を優先的に形質導入する場合、本明細書において「オリゴ指向性」と称される。いくつかの実施形態では、乏突起膠細胞に特異的なカプシドによって形質導入される細胞の少なくとも約８０％が乏突起膠細胞であり、例えば、形質導入細胞の少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上が乏突起膠細胞である。

【0083】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、「乏突起膠細胞機能障害に関連する障害」を治療又は予防するために有用である。本明細書で使用される場合、「乏突起膠細胞機能障害に関連する」という用語は、それ以外の場合は同一の正常な乏突起膠細胞と比較して、乏突起膠細胞が損傷した、喪失した、又は不適切に機能する疾患、障害又は状態を指す。この用語には、乏突起膠細胞が直接影響を受ける疾患、障害及び状態、並びに乏突起膠細胞が他の細胞への損傷に対して二次的に機能不全になる疾患、障害又は状態が含まれる。いくつかの実施形態では、乏突起膠細胞機能不全に関連する障害は、カナバン病（ＣＤ）である。

【0084】

いくつかの実施形態では、乏突起膠細胞への指向性を有するキメラＡＡＶカプシドは、Ｏｌｉｇ００１（ＢＮＰ６１としても知られている）であり、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９からの配列を含む（ＷＯ２０１４／０５２７８９を参照されたい）。いくつかの実施形態では、Ｏｌｉｇｏ００１カプシドＶＰ１は、配列番号１３の核酸配列を含むか又はそれからなる核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｏｌｉｇ００１カプシドＶＰ１は、配列番号１３の核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の核酸配列によってコードされる。

【0085】

核酸配列は、重複するＡＡＶカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。Ｏｌｉｇ００１カプシドタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１４に示され、ＶＰ１は、配列番号１４のアミノ酸残基１（メチオニン）から始まり、ＶＰ２は、アミノ酸残基１４８（トレオニン）から始まり、ＶＰ３は、アミノ酸残基２０３（メチオニン）から始まる。

【0086】

いくつかの実施形態では、乏突起膠細胞に対する指向性を有するキメラＡＡＶカプシドは、Ｏｌｉｇ００２（ＢＮＰ６２としても知られている）又はＯｌｉｇ００３（ＢＮＰ６３としても知られている）である（ＷＯ２０１４／０５２７８９を参照されたい）。いくつかの実施形態では、オリゴ００２カプシドＶＰ１は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｏｌｉｇ００２カプシドＶＰ１アミノ酸配列は、配列番号１５の配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１５のアミノ酸配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴ００３カプシドは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｏｌｉｇ００３カプシドＶＰ１アミノ酸配列は、配列番号１６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする配列を含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、キメラＡＡＶカプシド（例えば、Ｏｌｉｇ００１）及び治療用導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターを使用して、乏突起膠細胞機能障害に関連する疾患、障害又は状態を治療することができる。そのような疾患、障害又は状態では、乏突起膠細胞は、損傷している、喪失している、又は不適切に機能する。これは、乏突起膠細胞に対する直接的な効果の結果であり得るか、又は乏突起膠細胞が他の細胞に対する損傷に対して二次的に機能不全になる場合に生じ得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１カプシド及び修飾ＡＳＰＡ核酸を含むｒＡＡＶベクターは、カナバン病を治療するために使用される。

【0088】

組換え核酸
本開示の組換え核酸には、修飾核酸、並びに修飾核酸を含むプラスミド及びベクターゲノムが含まれる。組換え核酸、プラスミド又はベクターゲノムは、（例えば、プラスミドの）増殖を調整する、及び／又は修飾核酸（例えば、導入遺伝子）の発現を制御するための調節配列を含み得る。組換え核酸はまた、ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）の構成要素として提供されてもよい。一般に、ウイルスベクターは、カプシドにパッケージングされた組換え核酸を含むベクターゲノムを含む。

【0089】

修飾核酸
遺伝子、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子）の修飾形態又は変異体形態は、参照配列から逸脱する核酸を指す。参照配列は、天然に存在する野生型配列（例えば、遺伝子）であってもよく、天然に存在する変異体（例えば、スプライス変異体、代替的な読み取りフレーム）を含んでもよい。当業者は、参照配列がＧｅｎＢａｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）等の公的に入手可能なデータベースに見出され得ることを認識するであろう。修飾／変異体核酸は、参照配列と比較して、実質的に同じ、より大きい、又はより小さい活性、機能又は発現を有し得る。好ましくは、本明細書において同義的に使用される修飾又は変異体核酸は、タンパク質発現の改善を示し、例えば、それによってコードされるタンパク質は、それ以外の場合は同一の細胞における内因性遺伝子（例えば、野生型遺伝子、変異遺伝子）によって提供されるタンパク質の発現レベルと比較して、細胞において検出可能に高いレベルで発現される。いくつかの実施形態では、本明細書において同義的に使用される修飾核酸又は変異体核酸（例えば、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸）は、改善されたタンパク質発現を示し、例えば、それによってコードされるタンパク質は、それ以外の場合は同一の細胞における変異を含む内因性遺伝子によって提供されるタンパク質の発現レベルと比較して、細胞において検出可能に高いレベルで発現される。

【0090】

核酸に対する修飾としては、参照配列の１つ以上のヌクレオチド置換（例えば、１～３、３～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００又はそれ以上のヌクレオチドの置換）、付加（例えば、１～３、３～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００又はそれ以上のヌクレオチドの挿入）、欠失（例えば、１～３、３～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００又はそれ以上のヌクレオチドの欠失、モチーフ、ドメイン、断片等の欠失）が挙げられる。修飾核酸は、参照配列と約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であり得る。

【0091】

修飾核酸は、参照ポリペプチドに対する約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡ（例えば、配列番号２）をコードする修飾核酸は、参照ポリペプチド（例えば、配列番号４）に対して１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。

【0092】

いくつかの実施形態では、修飾核酸（例えば、導入遺伝子）は、野生型タンパク質をコードする。そのような修飾核酸はコドン最適化され得る。本明細書で同義的に言及される「最適化された」又は「コドン最適化された」は、例えば、希少なコドンの使用を最小限に抑えること、ＣｐＧジヌクレオチドの数を減少させること、潜在的スプライスドナー又はアクセプター部位を除去すること、Ｋｏｚａｋ配列を除去すること、リボソームエントリー部位を除去すること等によって、ポリペプチドの発現を増加させるために、野生型コード配列又は参照配列（例えば、ＡＳＰＡポリペプチドのコード配列）に対して最適化されたコード配列を指す。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列（例えば、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸）からのタンパク質の発現レベルは、それ以外の場合は同一の細胞における野生型遺伝子からのタンパク質の発現レベルと比較して増加する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列（例えば、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸）からのタンパク質の発現レベルは、それ以外の場合は同一の細胞における野生型遺伝子からのタンパク質の発現レベルと比較して増加しない（例えば、発現が実質的に類似している）。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列（例えば、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸）からのタンパク質の発現レベルは、それ以外の場合は同一の細胞における変異遺伝子からのタンパク質の発現レベルと比較して増加する。

【0093】

修飾の例としては、１つ以上のｃｉｓ作用モチーフの排除、及び１つ以上のＫｏｚａｋ配列の導入が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つ以上のｃｉｓ作用モチーフが排除され、１つ以上のＫｏｚａｋ配列が導入される。

【0094】

排除され得るｃｉｓ作用モチーフの例としては、内部ＴＡＴＡボックス；カイ部位；リボソーム進入部位；ＡＲＥ、ＩＮＳ、及び／若しくはＣＲＳ配列要素；反復配列及び／若しくはＲＮＡ二次構造；（潜在的）スプライスドナー及び／若しくはアクセプター部位、分岐点；並びに制限部位が挙げられる。

【0095】

いくつかの実施形態では、修飾核酸は、修飾又は変異体ポリペプチドをコードする。修飾核酸によってコードされる修飾ポリペプチドは、野生型コード配列又は参照配列によってコードされるポリペプチドの機能又は活性の全部又は一部を保持し得る。いくつかの実施形態では、修飾ポリペプチドは、１つ以上の非保存的又は保存的アミノ酸変化を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの機能において限定的な役割を果たす、又は全く役割を果たさないことが示されているある特定のドメインは、修飾ポリペプチドには存在しない（例えば、ある特定の結合ドメイン）（例えば、ＷＯ２０１６／０９７２１９）。ｒＡＡＶベクターに存在する修飾核酸は、ｒＡＡＶカプシド（例えば、短縮されたミニジストロフィン導入遺伝子、ＷＯ２００１／８３６９５を参照されたい；Ｂドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子、ＷＯ２０１７／０７４５２６号を参照されたい）のパッケージング能力に起因して、野生型コード又は参照配列よりも少ないヌクレオチドを含んでもよく、また、切断されるとともにコドン最適化された短縮された導入遺伝子（例えば、ＷＯ２０１７／２２１１４５号に記載のコドン最適化されたミニジストロフィン導入遺伝子）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、修飾核酸によってコードされるポリペプチドは、参照配列によってコードされるポリペプチドの機能又は活性より小さい、それと同じ、又はそれより大きいが、ただし少なくとも一部を有する。

【0096】

修飾核酸は、参照及び／又は野生型配列（例えば、野生型ＡＳＰＡコード配列）に対する、修飾ＧＣ含有量（例えば、核酸配列に存在するＧ及びＣヌクレオチドの数）、修飾（例えば、増加又は減少）ＣｐＧジヌクレオチド含有量、及び／又は修飾（例えば、増加又は減少）コドン適応指数（ＣＡＩ）を有し得る。例えば、ＷＯ２０１７／０７７４５１を参照されたい（最適化のための核酸配列を分析するための公的に入手可能なソフトウェアを含む、関心のある核酸配列のコドン最適化のための当該技術分野で周知の様々な考慮事項を論じている）。本明細書で使用される場合、修飾は、特定の値、量又は効果の減少又は増加を指す。

【0097】

いくつかの実施形態では、本開示の修飾核酸配列のＧＣ含有量は、参照及び／又は野生型遺伝子又はコード配列に比べて増加する。修飾核酸のＧＣ含有量は、野生型コード配列（例えば、配列番号３）のＧＣ含有量より少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１７％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％多い。いくつかの実施形態では、ＧＣ含有量は、配列中のＧ（グアニン）及びＣ（シトシン）ヌクレオチドのパーセンテージとして表される。

【0098】

いくつかの実施形態では、本開示の修飾核酸配列のコドン適応指数は、少なくとも０．７４、少なくとも０．７６、少なくとも０．７７、少なくとも０．８０、少なくとも０．８５、少なくとも０．８６、少なくとも０．８７、少なくとも０．９０、少なくとも０．９５、又は少なくとも０．９８である。

【0099】

いくつかの実施形態では、本開示の修飾核酸配列は、野生型又は参照核酸配列と比較して、約１０％、２０％、３０％、５０％又はそれ以上の低減であるＣｐＧジヌクレオチドの低減レベルを有する。いくつかの実施形態では、修飾核酸は、参照配列（例えば、野生型配列）よりも１～５個少ない、５～１０個少ない、１０～１５個少ない、１５～２０個少ない、２０～２５個少ない、２５～３０個少ない、３０～４０個少ない、４０～４５個少ない、又は４５～５０個少ない、又は更に少ないジヌクレオチドを有する。

【0100】

ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化は、真核生物における遺伝子発現の調節において重要な役割を果たすことが知られている。具体的には、真核生物におけるＣｐＧジヌクレオチドのメチル化は、本質的に、転写機構に干渉することによって遺伝子発現をサイレンシングする役割を果たす。したがって、ＣｐＧモチーフのメチル化によって誘発される遺伝子サイレンシングのために、ＣｐＧジヌクレオチドの数が低減した核酸及びベクターは、高く長く持続する導入遺伝子発現レベルをもたらすであろう。

【0101】

修飾核酸配列は、発現ベクターへのサブクローニングを容易にするための隣接制限部位を含んでもよい。多くのそのような制限部位は、当該技術分野において周知であり、限定するものではないが、図１３に示されるもの、例えば、ＡｖａＩ、ＸｍａＩ及びＸｍａＩが含まれる。

【0102】

本開示は、配列番号１～３に記載の配列のうちのいずれか１つの断片であって、ＡＳＰＡポリペプチドの機能的に活性な断片をコードする断片を含む。「機能的に活性な」又は「機能的なＡＳＰＡポリペプチド」は、断片が完全長のＡＳＰＡポリペプチドと同じ又は類似の生物学的機能及び／又は活性を提供することを示す。すなわち、断片は、ＮＡＡを酢酸塩及びアスパラギン酸塩に変換する能力を含むがこれらに限定されない、同じ活性を提供する。ＡＳＰＡ又はその機能的断片の生物学的活性は、本明細書の他の場所及びｎｕｒ７マウスにおいて実証されるように、カナバン病に関連する神経変性表現型を逆転又は予防することも包含する。

【0103】

本開示は、ＡＳＰＡポリペプチドをコードし、野生型核酸配列と比較して少なくとも１つの修飾を含む修飾ＡＳＰＡ核酸配列（例えば、配列番号３；代替の５’ＵＴＲを有するが、同じＡＳＰＡタンパク質（配列番号４）をコードする、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００４９．４又はＮＭ＿００１１２８０８５．１）を提供する。

【0104】

いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸は、野生型ＡＳＰＡポリペプチド（例えば、配列番号４）をコードするコドン最適化核酸であり、配列番号１又は配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸は、コドン最適化核酸であり、配列番号１又は配列番号２の配列からなる。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸は、コドン最適化核酸であり、配列番号１又は配列番号２と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％同一の配列を含む。

【0105】

いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含む細胞は、増加したタンパク質発現を示し、例えば、それによってコードされるタンパク質は、野生型ＡＳＰＡ核酸を含むそれ以外の場合は同一の細胞、又はＡＳＰＡをコードする変異核酸を含むそれ以外の場合は同一の細胞におけるタンパク質の発現レベルと比較して、細胞において検出可能に高いレベルで発現される。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸（例えば、配列番号２の核酸配列を含む）を含む細胞におけるＡＳＰＡタンパク質発現レベルは、野生型ＡＳＰＡ核酸を含むそれ以外の場合は同一の細胞におけるＡＳＰＡタンパク質発現レベルと比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２０％、約１４０％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、又はそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸（例えば、配列番号２の核酸配列を含む）を含む細胞におけるＡＳＰＡタンパク質発現レベルは、ＡＳＰＡをコードする変異核酸を含むそれ以外の場合は同一の細胞におけるＡＳＰＡタンパク質発現レベルと比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２０％、約１４０％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、又はそれ以上増加する。

【0106】

いくつかの実施形態では、これは「発現最適化」若しくは「発現増強」核酸、又は単に「修飾核酸」と称され得る。

【0107】

当業者は、本開示の修飾核酸及びその変異体によってコードされるポリペプチド（例えば、配列番号１、配列番号２）が、ＡＳＰＡをコードする野生型核酸によってコードされるＡＳＰＡポリペプチド（例えば、配列番号３）と同じ又は類似の生物学的機能及び／又は活性を提供する「機能的ＡＳＰＡポリペプチド」であることを理解するであろう。すなわち、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸によってコードされるＡＳＰＡポリペプチドは、ＮＡＡをアセテート及びアスパルテートに変換する能力を含むがこれらに限定されない同じ活性を提供する。ＡＳＰＡの生物学的活性は、ｎｕｒ７マウスにおいて本明細書の他の場所で実証されるような、カナバン病に関連する神経変性表現型の逆転又は予防を包含し、これには、ロータロッド落下潜時のパフォーマンスの改善、横断するオープンフィールド距離の改善、脳組織のＮＡＡの減少、脳（例えば、視床、小脳白質／橋）内の空胞体積の減少、脳（例えば、視床、皮質）内のＯｌｉｇ２陽性細胞の増加、及び／又は皮質髄鞘形成の増加が含まれるが、これらに限定されない。

【0108】

調節エレメント
本開示は、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸と、様々な調節又は対照エレメントと、を含む組換え核酸を含む。典型的には、調節エレメントは、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現に影響を与える核酸配列である。遺伝子発現に有用な調節エレメントの正確な性質は、適切な異種ポリヌクレオチド転写及び翻訳を容易にすることを意図して、生物によって、及び細胞型によって異なり、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン等を含む細胞型によって異なる。調節制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性等のレベルで影響を受ける可能性がある。典型的には、転写を調整する調節制御エレメントは、転写ポリヌクレオチドの５’末端付近（すなわち、上流）に並置される。調節制御エレメントはまた、転写配列の３’末端（すなわち、下流）に、又は転写物内（例えば、イントロン内）に位置してもよい。調節制御エレメントは、転写配列から離れた距離（例えば、１～１００、１００～５００、５００～１０００、１０００～５０００、５０００～１００００、又はそれ以上のヌクレオチド）に位置することができる。しかしながら、ＡＡＶベクターゲノムの長さに起因して、調節制御エレメントは、典型的にはポリヌクレオチドから１～１０００ヌクレオチド以内である。

【0109】

プロモーター
本明細書で使用される場合、「真核生物プロモーター」などの「プロモーター」という用語は、真核生物細胞（例えば、乏突起膠細胞）における特定の遺伝子、又は１つ以上のコード配列（例えば、ＡＳＰＡコード配列）の転写を開始するヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、他の調節エレメント又は領域と協働して、遺伝子又はコード配列の転写レベルを指示することができる。これらの調節エレメントとしては、例えば、転写結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク質結合部位、並びに、例えばアテニュエーター、エンハンサー及びサイレンサーを含む、プロモーターからの転写の量を調節するために直接的又は間接的に作用することが知られている他のヌクレオチド配列が挙げられる。プロモーターは、多くの場合同じ鎖上に位置し、それが作動可能に連結した遺伝子又はコード配列の転写開始部位、５’の近くに位置する。プロモーターは、一般に、１００～１０００ヌクレオチド長である。プロモーターは、典型的には、プロモーターの非存在下での同じ遺伝子の発現と比べて遺伝子発現を増加させる。

【0110】

本明細書で使用される場合、「コアプロモーター」又は「最小限のプロモーター」は、転写を適切に開始するために必要なプロモーター配列の最小限の部分を指す。これは、転写開始部位、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、及び一般的な転写因子結合部位のいずれかを含んでもよい。プロモーターはまた、他の一次調節エレメント（例えば、エンハンサー、サイレンサー、境界エレメント、インシュレーター）及び遠位プロモーター配列（コアプロモーターの３’）を含有する近位プロモーター配列（コアプロモーターの５’）を含んでもよい。

【0111】

好適なプロモーターの例としては、アデノウイルス主要後期プロモーター等のアデノウイルスプロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター等の異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルスプロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；アルブミンプロモーター；マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター等の誘導性プロモーター；メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；α－１抗トリプシンプロモーター；Ｂ型肝炎表面抗原プロモーター；トランスフェリンプロモーター；アポリポタンパク質Ａ－１プロモーター；ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター；伸長因子１ａプロモーター（ＥＦ１ａ）、ＣＢＡプロモーターのハイブリッド形態（ＣＢｈプロモーター）、及びＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルス早期エンハンサーエレメント及びプロモーター）、並びにトリベータアクチン遺伝子の第１のエクソン及び第１のイントロン、及びウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプター（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＢｉｏＭｅｄ．Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２）；並びにヒトＡＳＰＡ遺伝子プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＢｈプロモーターの断片又は変異体であり、配列番号７の核酸配列を含むか又はそれからなる。

【0112】

本開示のいくつかの実施形態では、真核生物プロモーター配列（例えば、ＣＢｈプロモーター）は、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号７の核酸配列を含むプロモーター（例えば、ＣＢｈプロモーター）は、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号７の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の核酸配列を含むか又はそれからなるプロモーターは、配列番号２の核酸配列を含む核酸に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含むプロモーターは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列に作動可能に連結され、乏突起膠細胞において配列番号２の核酸配列によってコードされるポリペプチドの発現を誘導する。いくつかの実施形態では、配列番号７を含む核酸を含むプロモーターに作動可能に連結された、配列番号２の核酸配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドの発現は、それ以外の場合は同一の細胞において、配列番号７の核酸を含むプロモーターに作動可能に連結されていない、配列番号２の核酸配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドの発現レベルと比較して、細胞において検出可能に高いレベルである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列に作動可能に連結され、乏突起膠細胞において配列番号２の核酸配列によってコードされるポリペプチドの発現を誘導する、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含むプロモーターを含む。

【0113】

プロモーターは、構成的であっても、組織特異的であっても、又は調節されていてもよい。構成的プロモーターは、作動可能に連結された遺伝子を本質的に常に発現させるものである。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、ほとんどの生理学的及び発達的条件下でほとんどの真核生物組織で活性である。

【0114】

調節されたプロモーターは、活性化又は非活性化され得るものである。調節されたプロモーターには、通常「オフ」であるが、「オン」に誘導され得る誘導性プロモーター、及び通常「オン」であるが「オフ」にされ得る「抑制性」プロモーターが含まれる。温度、ホルモン、サイトカイン、重金属、及び調節タンパク質を含む多くの異なる調節因子が知られている。区別は絶対的なものではなく、構成的プロモーターはしばしばある程度調節され得る。いくつかの場合には、例えば、病理学的状態が改善するときに自然に下方調節されるプロモーターを用いて、内因性経路を利用して導入遺伝子発現の調節を提供することができる。

【0115】

組織特異的プロモーターは、特定の種類の組織、細胞、又は器官のみにおいて活性なプロモーターである。典型的には、組織特異的プロモーターは、特定の組織、細胞、及び／又は器官に特異的な転写活性化エレメントによって認識される。例えば、組織特異的プロモーターは、他の組織よりも１つ又は複数の特定の組織（例えば、２つ、３つ又は４つ）においてより活性であり得る。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターによって調整される遺伝子の発現は、プロモーターが特異的である組織において、他の組織よりもはるかに高い。いくつかの実施形態では、プロモーターは、それが特異的である組織以外の任意の組織において、ほとんど、又は実質的に活性がなくてもよい。プロモーターは、肝細胞において活性であるマウスアルブミンプロモーター又はトランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）等の組織特異的プロモーターであってもよい。組織特異的プロモーターの他の例としては、骨格筋における発現を誘導する骨格αアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのプロモーターが挙げられる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４１－２４５）。肝臓特異的発現は、アルブミン遺伝子由来のプロモーター（Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５１２４－５１３２）、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１００２－１００９）及びアルファ－フェトプロテイン（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：１５０３－１５１４）を使用して誘導され得る。

【0116】

エンハンサー
別の態様において、治療用ポリペプチドをコードする修飾核酸は、治療用ポリペプチド（例えば、ＡＳＰＡタンパク質）の発現を増加させるためのエンハンサーを更に含む。典型的には、エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントの上流に位置するが、下流又は別の配列（例えば、導入遺伝子）内に位置してもよい。エンハンサーは、修飾核酸の上流又は下流に１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、又はそれ以上に位置し得る。エンハンサーは、典型的には、プロモーターエレメントのみによって提供される増加した発現を超えて、修飾核酸の発現を増加させる（例えば、治療用ポリペプチドをコードする、例えば、ＡＳＰＡをコードする）。

【0117】

多くのエンハンサーが当該技術分野で既知であり、これにはサイトメガロウイルス主要最初期エンハンサーが含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＭＩＥプロモーターは、３つの領域：モジュレーター、独自領域、及びエンハンサーを含む（Ｉｓｏｍｕｒａ ａｎｄ Ｓｔｉｎｓｋｉ（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（６）：３６０２－３６１４）。ＣＭＶエンハンサー領域は、別のプロモーター、又はその一部と組み合わせて、ハイブリッドプロモーターを形成し、それに作動可能に結合した核酸の発現を更に増加させることができる。例えば、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、又はその一部をＣＭＶプロモーター／エンハンサー、又はその一部と組み合わせて、Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１１，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２：１１４３－１１５３）に記載されるように、ニワトリβアクチンハイブリッドプロモーターを表す「ＣＢｈ」プロモーターと呼ばれるＣＢＡのバージョンを作製することができる。プロモーターと同様に、エンハンサーは、構成的であっても、組織特異的であっても、又は調節されていてもよい。

【0118】

本開示のいくつかの実施形態では、エンハンサー配列（例えば、ＣＭＶエンハンサー）は、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号６又は配列番号１７の核酸配列を含むか又はそれからなるエンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）は、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号６又は配列番号１７の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の核酸配列を含むエンハンサーは、配列番号２の核酸配列を含む核酸に作動可能に連結され、任意選択で、配列番号７の核酸配列を含むプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号６又は配列番号１７の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含むエンハンサーは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列に作動可能に連結され、乏突起膠細胞において配列番号２の核酸配列によってコードされるポリペプチドの発現を誘導する。いくつかの実施形態では、配列番号６又は配列番号１７の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含むエンハンサーは、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列に作動可能に連結され、配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列に作動可能に連結され、配列番号６（又は配列番号１７）及び配列番号７の核酸配列とともに、乏突起膠細胞における配列番号２の核酸配列によってコードされるポリペプチドの発現を誘導する。いくつかの実施形態では、配列番号６（又は配列番号１７）の核酸配列を含むエンハンサーに作動可能に連結された、配列番号２の核酸配列によってコードされるポリペプチドの発現は、それ以外の場合は同一の細胞において、配列番号５の核酸を含むエンハンサーに作動可能に連結されていない、配列番号２によってコードされるポリペプチドの発現レベルと比較して、細胞において検出可能により高いレベルである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、配列番号６又は配列番号１７の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含み、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列に作動可能に連結され、配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列に作動可能に連結され、配列番号６（又は配列番号１７）及び配列番号７の核酸配列とともに、乏突起膠細胞における配列番号２の核酸配列によってコードされるポリペプチドの発現を誘導するエンハンサーを含む。

【0119】

フィラー、スペーサー及びスタッファー
本明細書に開示されるように、ｒＡＡＶベクターでの使用を意図した組換え核酸は、核酸の長さを、ｒＡＡＶベクターへのＡＡＶパッケージングに許容されるウイルスゲノム配列の正常なサイズ（例えば、約４．７～４．９キロ塩基）又はそれに近いサイズに調節するための追加の核酸エレメントを含んでよい（Ｇｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１５）：９９３３－９９４４）。そのような配列は、同義的に、フィラー、スペーサー又はスタッファーと称され得る。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡは、核酸の非翻訳（非タンパク質コード）セグメントである。いくつかの実施形態では、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、約１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０～９０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～３０００、又はそれ以上の長さの配列である。

【0120】

ＡＡＶベクターは、典型的には、核酸のＡＡＶカプシドへの最適包装のために、約４ｋｂ～約５．２ｋｂ又は約４．１～４．９ｋｂの範囲のサイズを有するＤＮＡの挿入物を受け入れる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、約３．０ｋｂ～約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ～約４．０ｋｂ、約４．０ｋｂ～約４．５ｋｂ、約４．５ｋｂ～約５．０ｋｂ、又は約５．０ｋｂ～約５．２ｋｂの間の全長を有するベクターゲノムを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、約４．７ｋｂの全長を有するベクターゲノムを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、自己相補的なベクターゲノムを含む。ｒＡＡＶベクターにおける自己相補的（ｓｃ）ベクターゲノムの全長は、一本鎖（ｓｓ）ベクターゲノムに等しい（すなわち、約４ｋｂ～約５．２ｋｂ）が、ｓｃベクターゲノムをコードする核酸配列（すなわち、導入遺伝子、調節エレメント及びＩＴＲを含む）は、ｓｃベクターがカプシド内にパッケージングされるためには、ｓｓベクターゲノムをコードする核酸配列の半分の長さでなければならない。

【0121】

イントロン及びエクソン
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、例えば、イントロン、エクソン及び／又はその一部を含む。イントロンは、ｒＡＡＶベクターへのベクターゲノムパッケージングのための適切な長さを達成するために、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列として機能し得る。イントロン及び／又はエクソン配列は、イントロン及び／又はエクソンエレメントの非存在下での発現と比較して、ポリペプチド（例えば、導入遺伝子）の発現を増強することもできる（Ｋｕｒａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５７６－５２８１；ＷＯ２０１７／０７４５２６）。更に、フィラー／スタッファーポリヌクレオチド配列（「インシュレーター」とも称される）は、当該技術分野において周知であり、限定されないが、ＷＯ２０１４／１４４４８６及びＷＯ２０１７／０７４５２６に記載されているものが含まれる。

【0122】

イントロンエレメントは、異種ポリヌクレオチドと同じ遺伝子に由来してもよく、又は全く異なる遺伝子若しくは他のＤＮＡ配列（例えば、ニワトリβアクチン遺伝子、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ））に由来してもよい。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、イントロンから選択される少なくとも１つのエレメントと、非同族遺伝子に由来するエクソンと、を含む（すなわち、修飾核酸、例えば、導入遺伝子に由来しない）。いくつかの実施形態では、イントロンは、例えば、配列番号９の核酸配列を含むか又はそれからなる、ニワトリβアクチン遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、イントロンは、配列番号９の核酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、例えば、配列番号１０の核酸配列を含むか又はそれからなるＭＶＭに由来する。いくつかの実施形態では、イントロンは、配列番号１０の核酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、エクソンは、例えば、配列番号８の核酸配列を含むか又はそれからなる、ニワトリβアクチン遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、エクソンは、配列番号８の核酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、エンハンサー配列（例えば、配列番号６又は配列番号１７）、プロモーター配列（例えば、配列番号７）、エクソン（例えば、配列番号８又は配列番号１８）、及びイントロン（例えば、配列番号９、配列番号１０）のうちの少なくとも１つを含み、任意選択で配列番号２の核酸配列によってコードされる異種ポリペプチドの発現を調整する。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列（例えば、配列番号６又は配列番号１７）、プロモーター配列（例えば、配列番号７）、エクソン（例えば、配列番号８又は配列番号１８）、及びイントロン（例えば、配列番号９、配列番号１０）のうちの少なくとも１つを含む調節領域に作動可能に連結された、配列番号２の核酸配列によってコードされるポリペプチドの発現は、それ以外の場合は同一の細胞において、そのような調節エレメントに作動可能に連結されていない、配列番号２の核酸配列によりコードされるポリペプチドの発現レベルと比較して、細胞において検出可能により高いレベルである。

【0123】

いくつかの実施形態では、組換え核酸は、エンハンサー配列（例えば、配列番号６又は配列番号１７）、プロモーター配列（例えば、配列番号７）、エクソン（例えば、配列番号８又は配列番号１８）、及びイントロン（例えば、配列番号９、配列番号１０）のうちの少なくとも１つを含む調節エレメントに作動可能に結合した、配列番号２の修飾核酸を含む。

【0124】

ポリアデニル化シグナル配列（ｐｏｌｙＡ）
さらなる調節エレメントとしては、終止コドン、終結配列、及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル配列、例えばウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡシグナル配列（ＢＨＧ ｐｏｌｙＡ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。ｐｏｌｙＡシグナル配列は、遺伝子転写の終結を誘導する、真核生物ｍＲＮＡの３’末端におけるポリアデノシン「テール」の効率的な付加を駆動する（例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ ａｎｄ Ｒｏｔｔｍａｎ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７（２３）：１６３３０－１６３３４を参照されたい）。ｐｏｌｙＡシグナルは、その３’末端での新たに形成された前駆体ｍＲＮＡのエンドヌクレオチド分解切断、及びアデニン塩基のみからなるＲＮＡストレッチのこの３’末端への付加のためのシグナルとして機能する。ｐｏｌｙＡテールは、ｍＲＮＡの核外輸送、翻訳及び安定性に重要である。いくつかの実施形態では、ｐｏｌｙＡは、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５Ｅ１ｂポリアデニル化シグナル、成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＰＢＧＤポリアデニル化シグナル、又はコンピュータ内設計ポリアデニル化シグナルである。

【0125】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の他の調節エレメントと任意選択で組み合わせて、組換え核酸のｐｏｌｙＡシグナル配列は、ＡＳＰＡ（例えば、配列番号２）をコードする修飾核酸の転写から生じる前駆体ｍＲＮＡの核内分解切断及びポリアデニル化を指示し、達成することができるｐｏｌｙＡシグナルである。いくつかの実施形態では、ｐｏｌｙＡ配列は、配列番号１１の核酸配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ｐｏｌｙＡ配列は、配列番号１１の核酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％又は１００％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、エンハンサー配列（例えば、配列番号６又は配列番号１７）、プロモーター配列（例えば、配列番号７）、エクソン（例えば、配列番号８又は配列番号１８）、イントロン（例えば、配列番号９、配列番号１０）、及びｐｏｌｙＡ（配列番号１１）のうちの少なくとも１つを含み、任意選択で配列番号２の核酸配列によってコードされる異種ポリペプチドの発現を調整する。

【0126】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）は、乏突起膠細胞に対する指向性を有し、ＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲ）並びにＡＳＰＡをコードする修飾（すなわち、コドン最適化）核酸及び以下の調節エレメントのうちの少なくとも１つを含む組換え核酸を含む自己相補的ベクターゲノムを含有する：エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、プロモーター（例えば、ＣＢｈプロモーター）、エクソン（例えば、ＣＢＡエクソン１）、イントロン（例えば、ＣＢＡイントロン、ＭＶＭイントロン）及びｐｏｌｙＡ（例えば、ＢＨＧ ｐｏｌｙＡ）。

【0127】

いくつかの実施形態では、乏突起膠細胞に対する指向性を有するｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）は、ＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、配列番号５、配列番号１２、及び／又は配列番号１９）並びにＡＳＰＡをコードする修飾（すなわち、コドン最適化）核酸（例えば、配列番号２）及び以下の調節エレメントのうちの少なくとも１つを含む組換え核酸を含む自己相補的ゲノムを含有する：エンハンサー（例えば、配列番号６又は配列番号１７）、プロモーター（例えば、配列番号７）、エクソン（例えば、ＣＢＡエクソン配列番号８又は配列番号１８）、イントロン（例えば、配列番号９及び配列番号１０）、及びｐｏｌｙＡ（例えば、配列番号１１）。

【0128】

いくつかの実施形態では、乏突起膠細胞に対する指向性を有するｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）は、配列番号２０を含む自己相補的ゲノムを含有する。

【0129】

本開示のｒＡＡＶベクターの生物学的活性
いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＳＰＡ導入遺伝子を含む）は、標的細胞（例えば、乏突起膠細胞）を形質導入し、生物学的活性を媒介する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）は、標的細胞（例えば、乏突起膠細胞）を形質導入し、以下からなる群から選択される少なくとも１つの検出可能な活性を媒介する。
（ｉ）インビトロでの細胞内のＮＡＡレベルを低下させる、
（ｉｉ）バランス、グリップ強度、及び／又は運動協調を改善、増加、及び／又は向上させる、
（ｉｉｉ）落下潜時（秒）を改善、増加、及び／又は増強する、
（ｉｖ）全身的運動機能を改善、増加及び／又は増強する、
（ｖ）インビボでのＮＡＡレベルの蓄積を低減、阻害、及び／又は中和する、
（ｖｉ）視床内の空胞体積割合を低減、阻害、及び／又は中和する、
（ｖｉｉ）小脳白質／橋の空胞体積割合を低減、阻害、及び／又は中和する、
（ｖｉｉｉ）視床内の乏突起膠細胞の数を改善、増加、及び／又は増強する、
（ｉｘ）皮質内の乏突起膠細胞の数を改善、増加、及び／又は増強する、
（ｘ）視床内のニューロンの数を改善、増加、及び／又は増強する、
（ｘｉ）皮質内のニューロンの数を改善、増加、及び／又は増強する、並びに
（ｘｉｉ）皮質髄鞘形成を改善、増大、及び／又は増大する。

【0130】

いくつかの実施形態では、標的細胞（例えば、乏突起膠細胞）を形質導入し、（ｉ）～（ｘｉｉ）の少なくとも１つの検出可能な活性を媒介するｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇｏ００１－ＡＳＰＡである。

【0131】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）で形質導入された細胞は、ＡＳＰＡをコードする野生型核酸配列（例えば、配列番号３）を含むｒＡＡＶで形質導入されたそれ以外の場合は同一の細胞におけるＮＡＡのレベルと比較して、ＮＡＡのレベルが低下している。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）で形質導入された細胞は、ＡＳＰＡをコードする代替のコドン最適化核酸（例えば、配列番号１）を含むｒＡＡＶで形質導入されたそれ以外の場合は同一の細胞におけるＮＡＡのレベルと比較して、ＮＡＡのレベルが低下している。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）で形質導入された細胞は、形質導入されなかったＡＳＰＡをコードする変異核酸を含む細胞におけるＮＡＡのレベルと比較して、ＮＡＡのレベルが低下している。

【0132】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）でインビボで形質導入された細胞は、ＡＳＰＡをコードする野生型核酸（例えば、配列番号３）を含むｒＡＡＶでインビボで形質導入されたそれ以外の場合は同一の細胞におけるＮＡＡのレベルと比較して、ＮＡＡのレベルが低下している。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）でインビボ形質導入された細胞は、ＡＳＰＡをコードする代替のコドン最適化核酸（例えば、配列番号１）を含むｒＡＡＶでインビボで形質導入されたそれ以外の場合は同一の細胞におけるＮＡＡのレベルと比較して、ＮＡＡのレベルが低下している。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）でインビボで形質導入された細胞は、形質導入されなかった変異ＡＳＰＡ遺伝子を含むそれ以外の場合は同一の細胞におけるＮＡＡのレベルと比較して、ＮＡＡのレベルが低下している。

【0133】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されたＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象におけるバランス、グリップ及び／又は運動協調は、例えばロータロッドパフォーマンスによって測定されるように、ｒＡＡＶベクターが投与されていないＡＳＰＡ遺伝子変異を有するそれ以外の場合は同様の対象のバランス、グリップ強度及び／若しくは運動協調と比較して、又はｒＡＡＶベクターの投与前の同じ対象と比較して、有意に改善される。

【0134】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されたＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象におけるバランス、グリップ強度及び／又は運動協調は、例えばロータロッドパフォーマンスによって測定されるように、ＡＳＰＡ遺伝子変異を有さない、及びｒＡＡＶベクターが投与されていないそれ以外の場合は同様の対象におけるバランス、グリップ強度及び／又は運動協調と区別できない。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）は、脳室内（ＩＣＶ）投与経路を介して投与される。いくつかの実施形態では、ロータロッドパフォーマンスは、秒単位での落下潜時として測定される。

【0135】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されているＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象の全身的運動機能は、例えばオープンフィールド活動性によって測定されるように、ｒＡＡＶベクターが投与されていないＡＳＰＡ遺伝子変異を有するそれ以外の場合は同様の対象の全身的運動機能と比較して、又はｒＡＡＶベクターの投与前の対象における機能と比較して、有意に改善される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）は、脳室内（ＩＣＶ）投与経路を介して投与される。

【0136】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されるＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象における全身的運動機能は、例えばオープンフィールド活動性によって測定されるように、ＡＳＰＡ遺伝子変異を有さない、及びｒＡＡＶが投与されていないそれ以外の場合は同様の対象における全身的運動機能と区別できない。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）は、脳室内（ＩＣＶ）投与経路を介して投与される。

【0137】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されるＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象の脳におけるＮＡＡレベルは、ｒＡＡＶベクターが投与されないＡＳＰＡ遺伝子変異を有するそれ以外の場合は同様の対象の脳におけるＮＡＡレベルと比較して、又はｒＡＡＶベクターの投与前の対象におけるＮＡＡレベルと比較して、有意に低減される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されるＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象の脳におけるＮＡＡレベルは、ＡＳＰＡ遺伝子変異を有さない、及びｒＡＡＶベクターが投与されていないそれ以外の場合は同様の対象の脳におけるＮＡＡレベルと比較して低減されるか、又は区別されない。

【0138】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されるＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象の視床における空胞体積割合は、ｒＡＡＶベクターが投与されないＡＳＰＡ遺伝子変異を有するそれ以外の場合は同様の対象の視床における空胞体積割合と比較して、又はｒＡＡＶベクターの投与前の対象と比較して有意に低減され、空胞体積割合は、例えば偏りのない立体的解析学によって測定される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されるＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象の小脳白質／橋における空胞体積割合は、ｒＡＡＶベクターが投与されないＡＳＰＡ遺伝子変異を有するそれ以外の場合は同様の対象の小脳白質／橋における空胞体積割合と比較して、又はｒＡＡＶベクターの投与前の対象と比較して有意に低減され、空胞体積割合は、例えば偏りのない立体的解析学によって測定される。

【0139】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されるＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象の視床における乏突起膠細胞の数は、ベクターが投与されないＡＳＰＡ遺伝子変異を有するそれ以外の場合は同様の対象の視床における乏突起膠細胞の数と比較して、又はベクターが投与される前の対象と比較して有意に増加し、視床における乏突起膠細胞の数は、例えばＯｌｉｇ２抗体を使用したＩＨＣ及び偏りのない立体的解析学によって測定される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されるＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象の脳皮質における乏突起膠細胞の数は、ｒＡＡＶベクターが投与されないＡＳＰＡ遺伝子変異を有するそれ以外の場合は同様の対象の脳皮質における乏突起膠細胞の数と比較して、又はベクターが投与される前の同じ対象と比較して有意に増加し、脳皮質における乏突起膠細胞の数は、例えばＯｌｉｇ２抗体を使用したＩＨＣ及び偏りのない立体的解析学によって測定される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されるＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象の脳皮質における乏突起膠細胞の数は、ＡＳＰＡ遺伝子変異を有さない、及びｒＡＡＶベクターが投与されないそれ以外の場合は同様の対象の脳皮質における乏突起膠細胞の数と区別できず、脳皮質における乏突起膠細胞の数は、例えばＯｌｉｇ２抗体を使用したＩＨＣ及び偏りのない立体的解析学によって測定される。

【0140】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されるＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象の視床におけるニューロンの数は、ｒＡＡＶベクターが投与されないＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象の視床におけるニューロンの数と比較して、又はベクターの投与前の対象の視床におけるニューロンの数と比較して有意に増加し、視床におけるニューロンの数は、例えばＮｅｕＮ抗体を使用したＩＨＣ及び偏りのない立体的解析学によって測定される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されるＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象の脳皮質におけるニューロンの数は、ｒＡＡＶベクターが投与されないＡＳＰＡ遺伝子変異を有するそれ以外の場合は同様の対象の脳皮質におけるニューロンの数と比較して、又はベクターの投与前の対象の脳皮質におけるニューロンの数と比較して有意に増加し、脳皮質におけるニューロンの数は、例えばＮｅｕＮ抗体を使用したＩＨＣ及び偏りのない立体的解析学によって測定される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ）が投与されるＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象の脳皮質におけるニューロンの数は、ＡＳＰＡ遺伝子変異を有さない、及びｒＡＡＶベクターが投与されないそれ以外の場合は同様の対象の脳皮質におけるニューロンの数と区別できず、脳皮質におけるニューロンの数は、例えばＮｅｕＮ抗体を使用したＩＨＣ及び偏りのない立体的解析学によって測定される。

【0141】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇｏ００１－ＡＳＰＡ）が投与されるＡＳＰＡ遺伝子変異を有する対象の脳における皮質髄鞘形成は、ｒＡＡＶベクターが投与されないＡＳＰＡ遺伝子変異を有するそれ以外の場合は同様の対象の脳における皮質髄鞘形成と比較して、又はベクターの投与前の対象の脳における皮質髄鞘形成と比較して有意に増加し、皮質髄鞘形成は、例えば皮質髄鞘塩基性タンパク質陽性線維長密度（ＭＢＰ－ＬＤ）によって測定される。

【0142】

ウイルスベクターの組み立て
導入遺伝子（例えば、ＡＳＰＡ）を担持するウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、導入遺伝子、好適な調節エレメント、及び細胞形質導入を媒介するウイルスタンパク質の産生に必要なエレメントをコードするポリヌクレオチドから組み立てられる。ウイルスベクターの例として、限定されないが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、特にｒＡＡＶベクター（上記で論じたように）が挙げられる。

【0143】

本開示の方法に従って産生されるｒＡＡＶベクターのベクターゲノム構成要素は、少なくとも１つの導入遺伝子、例えば、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸、及びＡＳＰＡをコードする修飾核酸の発現を制御するための関連する発現制御配列を含む。

【0144】

好ましい実施形態では、ベクターゲノムは、ｒｅｐ及びｃａｐが欠失した、並びに／又は修飾核酸（例えば、導入遺伝子、例えば、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸）及びその関連発現制御配列によって置き換えられたＡＡＶゲノム等のパルボウイルスゲノムの一部を含む。ＡＳＰＡをコードする修飾核酸は、典型的には、１つ又は２つ（すなわち、によって隣接する）のＡＡＶ ＩＴＲ又はウイルス複製に適切なＩＴＲエレメントに隣接して挿入される（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（２）：９４１－９４８）。ＡＳＰＡをコードする修飾核酸の標的細胞（例えば、乏突起膠細胞）における組織特異的発現を促進するために使用するのに好適な他の調節配列もまた含まれ得る。

【0145】

パッケージング細胞
導入遺伝子を含み、ウイルス複製（例えば、ｃａｐ及びｒｅｐ）に必要なウイルスタンパク質を欠くｒＡＡＶベクターは、そのようなタンパク質がウイルス複製及びパッケージングに必要であるため、複製することができないことを当業者は理解するであろう。ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、ベクターゲノムに導入遺伝子を供給するプラスミドとは別個のプラスミドの一部として細胞（例えば、宿主細胞、例えば、パッケージング細胞）に供給されてもよい。

【0146】

「パッケージング細胞」又は「プロデューサー細胞」は、ベクター、プラスミド又はＤＮＡコンストラクトでトランスフェクトされ得る細胞又は細胞株を意味し、ウイルスベクターの完全な複製及びパッケージングに必要な失われている機能をｔｒａｎｓで提供する。ｒＡＡＶベクターの組み立てに必要な遺伝子には、ベクターゲノム（例えば、ＡＳＰＡ、調節エレメント、及びＩＴＲをコードする修飾核酸）、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び他のウイルス（例えば、アデノウイルス）に由来する特定のヘルパー遺伝子が含まれる。当業者は、ＡＡＶ産生に必要な遺伝子が、例えば、１つ以上のプラスミドのトランスフェクションを含む様々な手法でパッケージング細胞に導入され得ることを理解するであろう。しかしながら、いくつかの実施形態では、いくつかの遺伝子（例えば、ｒｅｐ、ｃａｐ、ヘルパー）は、パッケージング細胞中に既に存在してもよく、ゲノム中に組み込まれても、又はエピソーム上に担持されてもよい。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、構成的又は誘導的な様式で、１つ以上の失われているウイルス機能を発現する。

【0147】

当該技術分野で既知の任意の好適なパッケージング細胞が、パッケージングされたウイルスベクターの製造に用いられ得る。哺乳動物細胞又は昆虫細胞が好ましい。本開示の実践において、パッケージング細胞の産生に有用な細胞の例として、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３細胞（構成的プロモーターの制御下で機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｂ－５０、又は任意の他のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、及びＨＴ１０８０細胞株等のヒト細胞株が挙げられる。好適な非ヒト哺乳動物細胞株としては、例えば、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、ＭＤＣＫ、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ又はＣＨＯ細胞が挙げられる。

【0148】

いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、浮遊培養中で成長することができる。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、無血清培地で成長することができる。例えば、ＨＥＫ２９３細胞は、無血清培地中で懸濁状態で成長する。別の実施形態では、パッケージング細胞は、米国特許第９，４４１，２０６号に記載されるようなＨＥＫ２９３細胞であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）番号ＰＴＡ１３２７４として寄託される。ＷＯ２００２／４６３５９に開示されているものを含むがこれらに限定されない多数のｒＡＡＶパッケージング細胞株が、当該技術分野で知られている。

【0149】

パッケージング細胞として使用するための細胞株としては、昆虫細胞株が挙げられる。ＡＡＶの複製を可能にし、培養物中で維持することができる任意の昆虫細胞を、本開示に従って使用することができる。例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、例えばＳｆ９又はＳｆ２１細胞株、ショウジョウバエ属細胞株、又はカ細胞株、例えばＡｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来細胞株が挙げられる。好ましい細胞株は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９細胞株である。以下の参考文献は、異種ポリペプチドの発現のための昆虫細胞の使用、そのような細胞に核酸を導入する方法、及びそのような細胞を培養物中で維持する方法に関するそれらの教示に関して、本明細書に組み込まれる：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９５）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２８；Ｋａｊｉｇａｙａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４６４６－４６５０；Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６９２２－６９３０；Ｋｉｍｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．２１９：３７－４４；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｖｉｒｏｌ．２７２：３８２－３９３；及び米国特許第６，２０４，０５９号。

【0150】

さらなる代替として、本開示のウイルスベクターは、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５－１９４３によって記載されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子及びｒＡＡＶテンプレートを送達するためにバキュロウイルスベクターを使用して、昆虫細胞内で産生され得る。ＡＡＶのためにバキュロウイルス産生を使用する場合、いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは自己相補的である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、任意選択で、バキュロウイルスヘルパー機能をコードする追加の核酸を含み、それによってウイルスカプシドの産生を促進する、バキュロウイルス感染細胞（例えば、昆虫細胞）である。

【0151】

パッケージング細胞は、概して、ヘルパー機能及びウイルスベクターの複製及びパッケージングをもたらすのに十分なパッケージング機能とともに、１つ以上のウイルスベクター機能を含む。これらの様々な機能は、プラスミド又はアンプリコンなどの遺伝子コンストラクトを使用して一緒に、又は別々にパッケージング細胞に供給され得、それらは、細胞株内で染色体外に存在し得るか、又は宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、少なくともｉ）コドン最適化ヒトＡＳＰＡ導入遺伝子（例えば、配列番号２）及びＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、配列番号５及び配列番号１２）を含むベクターゲノムを含むとともに、エンハンサー（例えば、配列番号６）、プロモーター（例えば、配列番号７）、エクソン（例えば、ＣＢＡエクソン配列番号８）、イントロン（例えば、配列番号９及び配列番号１０）及びｐｏｌｙＡ（例えば、配列番号１１）のうちの少なくとも１つを更に含むプラスミド、並びにｉｉ）ｒｅｐ遺伝子（例えば、ＡＡＶ２ ｒｅｐ）及びｃａｐ遺伝子（例えば、Ｏｌｉｇ００１ ｃａｐ）を含むプラスミドでトランスフェクションされる。

【0152】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、例えば、染色体外に組み込まれるか、又は細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれる１つ以上のベクター機能を有する宿主細胞株内に組み込まれる包装機能又はヘルパー機能のうちの１つ以上を供給される。

【0153】

ヘルパー機能
ＡＡＶは、ヘルパーウイルスによる細胞の同時感染がなければ細胞内で複製することができないという点で、デペンドウイルスである。ヘルパー機能は、ウイルスベクターのパッケージングを開始するために必要な、パッケージング細胞の活性感染を確立するために必要なヘルパーウイルス要素を含む。ヘルパーウイルスは、典型的には、アデノウイルス又は単純ヘルペスウイルスを含む。アデノウイルスヘルパー機能は、典型的には、アデノウイルスコンポーネント、アデノウイルス初期領域１Ａ（Ｅ１ａ）、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、及びウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡを含む。ヘルパー機能（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡ）は、様々なヘルパー要素をコードする１つ以上の核酸で細胞をトランスフェクトすることによって、パッケージング細胞に提供することができる。代替的に、宿主細胞（例えば、パッケージング細胞）は、ヘルパータンパク質をコードする核酸を含み得る。例えば、ＨＥＫ２９３細胞は、ヒト細胞をアデノウイルス５ＤＮＡで形質転換することによって生成され、現在、Ｅ１及びＥ３を含むがこれらに限定されないいくつかのアデノウイルス遺伝子を発現する（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９－７２を参照されたい）。したがって、これらのヘルパー機能は、例えば、それらをコードするプラスミドによって細胞にそれらを供給する必要なしに、ＨＥＫ２９３パッケージング細胞によって提供され得る。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、少なくともｉ）コドン最適化ヒトＡＳＰＡ導入遺伝子（例えば、配列番号２）及びＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、配列番号５及び配列番号１２）を含むベクターゲノムを含むとともに、エンハンサー（例えば、配列番号６）、プロモーター（例えば、配列番号７）、エクソン（例えば、ＣＢＡエクソン配列番号８）、イントロン（例えば、配列番号９及び配列番号１０）及びｐｏｌｙＡ（例えば、配列番号１１）のうちの少なくとも１つを更に含むプラスミド、ｉｉ）ｒｅｐ遺伝子（例えば、ＡＡＶ２ ｒｅｐ）及びｃａｐ遺伝子（例えば、Ｏｌｉｇ００１ ｃａｐ）を含むプラスミド、並びにｉｉｉ）ヘルパー機能を含むプラスミドでトランスフェクションされる。

【0154】

複製及びパッケージングのためにヘルパー機能を有するヌクレオチド配列を細胞宿主に導入する任意の方法を用いることができ、これには、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性又はアニオン性リポソーム、及び核局在化シグナルと組み合わせたリポソームが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ヘルパー機能は、ウイルスベクターを使用するトランスフェクションによって、又はヘルパーウイルスを使用する感染によって提供され、ウイルス感染を産生するための標準的な方法が使用され得る。

【0155】

ベクターゲノムは、ＤＮＡ又はＲＮＡコンストラクトなどの任意の好適な組換え核酸であってもよく、一本鎖、二本鎖、又は二重鎖であってもよい（すなわち、ＷＯ２００１／９２５５１に記載されているように自己相補的であってもよい）。

【0156】

パッケージングされたウイルスベクターの生成
ウイルスベクターは、当業者に既知のいくつかの方法によって作製することができる（例えば、ＷＯ２０１３／０６３３７９を参照されたい）。好ましい方法は、Ｇｒｉｅｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４（２）：２８７－２９７に記載されており、その内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞の効率的なトランスフェクションを出発点として使用し、適格な臨床マスター細胞バンクからの接着ＨＥＫ２９３細胞株を使用して、迅速かつ拡張可能なｒＡＡＶ生成を可能にするシェーカーフラスコ及びＷＡＶＥバイオリアクター内での動物成分を含まない懸濁条件で増殖させる。三重トランスフェクション法（例えば、ＷＯ９６／４０２４０）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞株懸濁液は、トランスフェクションの４８時間後に採取した場合、１×１０^５超の粒子含有ベクターゲノム（ｖｇ）／細胞、又は１×１０^１４超のｖｇ／Ｌ（細胞培養物）を生成することができる。より具体的には、三重トランスフェクションは、パッケージング細胞を３つのプラスミドでトランスフェクトする方法を指し、１つのプラスミドは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ（例えば、Ｏｌｉｇ００１ ｃａｐ）遺伝子をコードし、別のプラスミドは、様々なヘルパー機能（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡ等のアデノウイルス又はＨＳＶタンパク質）をコードし、別のプラスミドは、導入遺伝子（例えば、ＡＳＰＡ）及び導入遺伝子の発現を制御する様々なエレメントをコードする。

【0157】

一本鎖ベクターゲノムは、プラス鎖又はマイナス鎖として、ほぼ等しい割合でカプシドにパッケージングされる。ｒＡＡＶベクターのいくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、プラス鎖極性（すなわち、ＤＮＡ鎖のセンス又はコード配列）にある。ｒＡＡＶベクターのいくつかの実施形態では、ベクターは、マイナス鎖極性（すなわち、アンチセンス又はテンプレートＤＮＡ鎖）にある。５’から３’方向のプラス鎖のヌクレオチド配列を考えると、５’から３’方向のマイナス鎖のヌクレオチド配列は、プラス鎖のヌクレオチド配列の逆相補鎖として決定することができる。

【0158】

所望の収率を達成するために、成長及びトランスフェクションの両方を支援する適合性のある無血清懸濁培地の選択、トランスフェクション試薬の選択、トランスフェクション条件及び細胞密度などのいくつかの変数が最適化される。

【0159】

ｒＡＡＶベクターは、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配などの当該技術分野における標準的な方法によって精製され得る。ｒＡＡＶベクターを精製する方法は当該技術分野で既知であり、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０（６）：１０３１－１０３９；Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６９：４２７－４４３；米国特許第６，５６６，１１８号及びＷＯ９８／０９６５７に記載されている方法を含む。

【0160】

イオン交換クロマトグラフィー法に基づく普遍的精製戦略を使用して、ＡＡＶ血清型１～６、８、９及び様々なキメラカプシド（例えば、Ｏｌｉｇ００１）の高純度ベクター調製物を生成することができる。いくつかの実施形態では、このプロセスは、１週間以内に完了することができ、高い全カプシド対空カプシド比（＞９０％全カプシド）をもたらし、臨床用途に適した精製後収率（＞１×１０^１３ｖｇ／Ｌ）及び純度を提供する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、全ての血清型及びキメラカプシドに関して普遍的である。拡張可能な製造技術を利用して、（例えば、カナバン病の治療のために）ＧＭＰ臨床及び商業グレードのｒＡＡＶベクターを製造することができる。

【0161】

本開示のｒＡＡＶベクターが生成及び精製された後、それらは、カナバン病を有するヒト対象などの対象への投与用の組成物を調製するために力価測定することができる（例えば、試料中のｒＡＡＶベクターの量を定量することができる）。ｒＡＡＶベクターの力価測定は、当該技術分野で既知の方法を使用して達成することができる。

【0162】

いくつかの実施形態では、ベクターゲノムを含有する粒子及びベクターゲノムを含有しない「空の」カプシドを含むウイルス粒子の数は、電子顕微鏡法、例えば透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって決定され得る。そのようなＴＥＭベースの方法は、試料中のベクター粒子（又は野生型ＡＡＶの場合はウイルス粒子）の数を提供することができる。

【0163】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターゲノム内の配列、例えばＩＴＲ配列（例えば、配列番号５、配列番号１２又は配列番号１９）、及び／又は導入遺伝子内の配列（例えば、配列番号２）又は調節エレメントに対するプライマーを使用した定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて力価測定することができる。ベクターゲノムの配列を含有するプラスミドなどの既知の濃度の標準物質の希釈物に対してｑＰＣＲを並行して行うことにより、マイクロリットル又はミリリットルなどの単位体積当たりのベクターゲノム（ｖｇ）の数としてｒＡＡＶベクターの濃度を計算することを可能にする標準曲線を生成することができる。例えば、電子顕微鏡法によって測定されるベクター粒子の数を、試料中のベクターゲノムの数と比較することによって、空のカプシドの数を決定することができる。ベクターゲノムは、治療用導入遺伝子を含有するため、ベクター試料のｖｇ／ｋｇ又はｖｇ／ｍｌは、対象が受けるであろうベクター粒子の数よりも治療量を示すことができ、そのいくつかは空であってもよく、ベクターゲノムを含有しない。原液中のｒＡＡＶベクターゲノムの濃度が決定されたら、それは、対象（例えば、カナバン病を有する対象）への投与用の組成物を調製する際に使用するのに好適な緩衝液に希釈され得るか、又は透析され得る。

【0164】

治療方法
本明細書に開示されるような、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸などの修飾核酸は、ＡＳＰＡポリペプチドの欠乏若しくは機能不全に関連する疾患、障害若しくは状態（例えば、カナバン病）、並びにＡＳＰＡ遺伝子の上方調節が、それ以外の場合は健常な個体におけるＡＳＰＡポリペプチドのレベル若しくは機能と比較して、ＡＳＰＡポリペプチドのレベル若しくは機能の低下によって媒介されるか、若しくはそれに関連する、治療上の利益若しくは改善をもたらし得る任意の他の状態及び／又は病気の遺伝子治療処置及び／又は予防のために使用され得る。

【0165】

本明細書に開示されるような、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むベクターゲノム及び／又はｒＡＡＶベクターは、ＡＳＰＡ酵素の欠乏又は機能不全に関連する、又はそれによって引き起こされる疾患、障害又は状態（例えば、カナバン病）、並びにＡＳＰＡ酵素の上方調節が治療上の利益又は改善をもたらし得る任意の他の状態及び／又は疾患の遺伝子治療処置及び／又は予防のために使用され得る。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、対象のカナバン病の治療におけるｒＡＡＶベクター又はその医薬組成物の使用を含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇｏ００１－ＡＳＰＡ）、又はその医薬組成物を使用して、それを必要とする対象においてＡＳＰＡのレベルを増加させることを含む。

【0166】

本開示のＡＳＰＡをコードする修飾核酸、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むベクターゲノム及び／又はＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇｏ００１－ＡＳＰＡ）は、ＡＳＰＡの欠乏又は機能不全（例えば、カナバン病などの機能的ＡＳＰＡ酵素のレベルの低下）に関連する、又はそれよって引き起こされる疾患、障害又は状態、及びＡＳＰＡの上方調節が治療的利益又は改善をもたらし得る任意の他の状態又は疾患の治療及び／又は予防に使用するための医薬の調製に使用され得る。

【0167】

いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡ酵素の欠乏若しくは機能不全に関連する疾患、障害又は状態（例えば、カナバン病）、並びにＡＳＰＡ遺伝子発現の上方調節、及び／又は機能的ＡＳＰＡ酵素の発現の増加が治療的利益又は改善をもたらし得る任意の他の状態及び／又は疾患の遺伝子治療処置及び／又は予防は、治療有効量のＡＳＰＡをコードする修飾核酸、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むベクターゲノム、及び／又はＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇｏ００１－ＡＳＰＡ）の、治療を必要とする対象（例えば、患者）への投与を含む。

【0168】

治療有効量の本開示のＡＳＰＡをコードする修飾核酸、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むベクターゲノム、及び／又は修飾核酸ＡＳＰＡを含むｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇｏ００１－ＡＳＰＡ）による対象（例えば、患者）の治療は、本明細書に記載の治療の開始前の同じ個体における測定、又は本明細書に記載の治療の非存在下における対照個体（又はそれにより比較のためのレベルを確立する複数の対照個体）における測定などのベースライン測定と比較して、カナバン病の１つ以上の症状の重症度を軽減、寛解、治療、予防又は低減することができる。いくつかの実施形態では、「対照個体」は、治療されているが、現在治療されていないが、将来治療を受ける可能性がある個体と同じ形態の疾患又は傷害に罹患している個体である。

【0169】

例えば、治療有効量のＡＳＰＡをコードする修飾核酸、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むベクターゲノム、及び／又はｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇｏ００１－ＡＳＰＡ）による対象の治療は、対照個体におけるＮＡＡ蓄積と比較して、又は治療前の同じ個体におけるＮＡＡ蓄積と比較して、ＮＡＡ蓄積を低減し得る。いくつかの実施形態では、ＮＡＡ蓄積は、対照個体と比較して、又は治療前の同じ個体と比較して、治療される対象において約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約１００％低減され得る。

【0170】

いくつかの実施形態では、治療有効量のＡＳＰＡをコードする修飾核酸、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むベクターゲノム、及び／又はｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇｏ００１－ＡＳＰＡ）による対象の治療は、対照個体におけるアスパルテート及び／若しくはアセテートレベルと比較して、又は治療前の同じ個体におけるアスパルテート及び／若しくはアセテートレベルと比較して、アスパルテート及び／又はアセテートレベルを増加させ得る。いくつかの実施形態では、アスパルテート及び／又はアセテートレベルは、対照個体と比較して、又は治療前の同じ個体と比較して、治療される対象において約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％増加する。

【0171】

いくつかの実施形態では、治療はまた、脳及び脊髄におけるミエリンの変性の重症度、知的障害、以前に獲得した運動能力の喪失、摂食困難、異常な筋肉の緊張、巨頭症、麻痺及び発作、並びに／又は、対照個体若しくは治療前の対象のものと比較した発話及び運動能力の発達の遅延を軽減、寛解、処置、予防、又は低減し得る。いくつかの実施形態では、治療有効量の本開示のＡＳＰＡをコードする修飾核酸、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むベクターゲノム、及び／又はＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むｒＡＡＶベクターによる対象（例えば、患者）の治療は、対照個体における同じものと比較して、又は治療前の同じ対象と比較して、バランス、グリップ、強度、及び／又は運動協調、並びに全身的運動機能を増加、改善、そのさらなる喪失を予防、又は増強し得る。いくつかの実施形態では、治療有効量の本開示のＡＳＰＡをコードする修飾核酸、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むベクターゲノム、及び／又はＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むｒＡＡＶによる対象（例えば、患者）の治療は、対照個体における同じものと比較して、又は治療前の同じ対象と比較して、脳（例えば、視床、小脳白質／橋）内の空胞体積割合を低減し、脳（例えば、視床、皮質）内の乏突起膠細胞の数を増加させ、脳（例えば、視床、皮質）内のニューロンの数を増加させ、及び／又は皮質髄鞘形成を増加させ得る。

【0172】

治療に適した対象としては、機能的遺伝子産物（タンパク質）の産生量が不十分である、若しくは不足するリスクがあるか、又は、疾患をもたらし得る、異常である、部分的に機能的である、若しくは非機能的である遺伝子産物（タンパク質、例えば、酵素）を産生する任意の対象が挙げられる。いくつかの実施形態では、患者は、疾患、障害又は状態（例えば、カナバン病）の任意の症状を呈する前に、本開示のベクター又は医薬組成物で治療される。いくつかの実施形態では、遺伝子解析によって疾患、障害又は状態（例えば、カナバン病）のリスクがあると診断された患者は、症状を呈する前に、本開示のｒＡＡＶベクター又は組成物で治療される。

【0173】

いくつかの実施形態では、治療される対象は、哺乳動物であってもよく、特に、対象は、ヒト患者、例えば、カナバン病の患者である。対象は、ＡＳＰＡ遺伝子のコード配列における１つ以上の変異の結果として、ＡＳＰＡタンパク質が誤ったアミノ酸配列を有し、それによって機能が低下若しくは全く機能を有さない、間違った組織において発現される、間違った時間に発現される、又は全く発現されないため、治療を必要とし得る。本発明のＡＳＰＡをコードする修飾核酸を投与して、機能的なＡＳＰＡ酵素の産生を増強、改善、又は提供してもよく、これは一方で、本明細書の他の場所で議論される他の生物学的機能のうち、ＮＡＡのアスパルテート及びアセテートへの分解を触媒し得る。

【0174】

本発明のｒＡＡＶベクターの標的細胞は、細胞、特に乏突起膠細胞であり、これは、通常、哺乳動物の脳内のものなどのＡＳＰＡ酵素を内因的に発現することが可能である。

【0175】

本明細書に記載の治療方法を参照する実施形態では、そのような実施形態はまた、その治療で使用するための、又は代替的に、その治療で使用するための医薬品の製造のためのさらなる実施形態でもある。

【0176】

医薬組成物
特定の実施形態では、本開示は、ＡＳＰＡの発現及び／又は活性の低下によって媒介される、又はそれに関連する疾患、障害又は状態、例えばカナバン病を予防又は治療するための医薬組成物、又は医薬を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、修飾核酸、組換え核酸、ウイルスベクターゲノム、発現ベクター、宿主細胞又はｒＡＡＶベクター、及び薬学的に許容される担体を含む。

【0177】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、細胞におけるＡＳＰＡの発現レベル及び／又は活性レベルを増加させることができるＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含む、治療有効量のベクター（例えば、ウイルスベクターゲノム、発現ベクター、ｒＡＡＶベクター）又は宿主細胞を含む。

【0178】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含む、治療有効量のベクター（例えば、ウイルスベクターゲノム、発現ベクター、ｒＡＡＶベクター）又は宿主細胞（例えば、エクスビボ遺伝子治療のための）を含み、この組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤、賦形剤、及び／又は他の薬剤を更に含む。薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤、賦形剤又は他の薬剤は、生物学的に又は別様に望ましくないものではなく、例えば、材料は、材料の有利な生物学的効果を上回る望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与され得る。

【0179】

任意の好適な薬学的に許容される担体又は賦形剤は、本発明による医薬組成物の調製に使用され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄｉｔｏｒ）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｐｒｉｌ １９９７を参照されたい）。

【0180】

医薬組成物は、典型的には、製造及び貯蔵条件下で無菌であり、発熱原を含まず、かつ安定である。医薬組成物は、溶液（例えば、水、食塩水、デキストロース溶液、緩衝溶液、又は他の薬学的に滅菌された流体）、マイクロエマルション、リポソーム、又は高い生成物（例えば、ウイルスベクター粒子、微粒子、又はナノ粒子）濃度に適合する他の秩序構造として製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本開示の修飾核酸、修飾核酸を含むベクターゲノム、宿主細胞又はｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物は、水又は緩衝生理食塩水中で製剤化される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合は必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。いくつかの実施形態では、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい場合がある。注射用組成物の持続的吸着は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含めることによってもたらすことができる。いくつかの実施形態では、本開示の核酸、ベクター、及び／又は宿主細胞は、制御放出製剤、例えば、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む、生成物を急速放出から保護する徐放性ポリマー又は他の担体を含む組成物中で投与され得る。

【0181】

いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、皮内、腹腔内、筋肉内、関節内、実質内（ＩＰ）、髄腔内（ＩＴ）、脳室内（ＩＣＶ）及び／又は大槽内（ＩＣＭ）投与に好適な組成物を含む非経口医薬組成物である。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物は、ＩＣＶ注射による投与用に製剤化される。

【0182】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１ ＡＳＰＡ）は、ＰＢＳ中３５０ｍＭのＮａＣｌ及び５％Ｄ－ソルビトール中で製剤化される。

【0183】

投与方法
本開示の導入遺伝子（例えば、ＡＳＰＡ）をコードする修飾核酸、又は修飾核酸を含むベクター（例えば、ベクターゲノム、ｒＡＡＶベクター）は、対象を治療するために対象（例えば、患者）に投与され得る。それを必要とするヒト対象又は動物へのベクターの投与は、ベクターを投与するための当該技術分野で既知の任意の手段によって行うことができる。本開示のベクターの標的細胞は、ＣＮＳの細胞、好ましくは乏突起膠細胞を含む。

【0184】

ベクターは、標準的なケア治療に加えて、及びその補助として投与することができる。すなわち、ベクターは、慣例的な方法を使用して当業者によって決定されるように、同時に、同時期に、又は所定の投薬間隔で、別の薬剤、化合物、薬物、治療又は治療レジメンと同時投与することができる。本明細書に開示される使用は、当該技術分野で知られるカナバン病の標準的治療に加えて、及び／又はそれと同時の投与スケジュールに基づいて、本開示のｒＡＡＶベクターを投与することを含む。

【0185】

いくつかの実施形態では、併用組成物は、１種以上の免疫抑制剤を含む。いくつかの実施形態では、併用組成物は、導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸）と、１種以上の免疫抑制剤と、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、導入遺伝子（例えば、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸）を含むｒＡＡＶベクターを対象に投与又は送達することと、ベクターの投与前に予防的に、又はベクターの投与後に（すなわち、ベクター及び／又はそれによって提供されるタンパク質に対する応答の症状が明らかになる前又は後に）、免疫抑制剤を対象に投与することと、を含む。

【0186】

いくつかの実施形態では、本発明のｒＡＡＶは、修飾核酸（例えば、ＡＳＰＡをコードする）を含むｒＡＡＶベクターと同じ又は異なるカプシドタンパク質を含む空のカプシド（すなわち、核酸分子又はベクターゲノムを含まないウイルスカプシド）と同時投与され得る。当業者は、空のカプシドの同時投与が、本開示のｒＡＡＶに対する免疫応答、例えば中和応答を低下させ得ることを理解するであろう。任意の特定の理論に束縛されることを望むものではないが、空のカプシドは、例えばＷＯ２０１５／０１３３１３に記載されるような中和抗体（Ｎａｂ）免疫応答を回避するために、修飾核酸（例えば、ＡＳＰＡをコードする）を含むｒＡＡＶベクターを可能にする免疫デコイとして機能し得る。

【0187】

一実施形態では、本開示のベクター（例えば、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むｒＡＡＶベクター）は、全身投与される。全身投与の例示的な方法には、静脈内（例えば、門脈）、動脈内（例えば、大腿動脈、肝動脈）、血管内、皮下、皮内、腹腔内、経粘膜、肺内、リンパ内、及び筋肉内投与等、並びに直接的な組織又は器官への注射が含まれるが、これらに限定されない。当業者であれば、全身投与により、全ての組織に修飾核酸（例えば、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸）を送達することができることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、直接的な組織又は器官への投与は、肝臓への投与を含む。いくつかの実施形態では、直接的な組織又は器官への投与は、ＡＳＰＡ欠乏症の直接的な影響を受けるエリア（例えば、脳及び／又は中枢神経系）への投与を含む。いくつかの実施形態では、本開示のベクター及びその医薬組成物は、脳実質に（すなわち、実質内投与によって）、脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように脊柱管若しくはくも膜下腔に（すなわち、髄腔内投与によって）、脳の脳室に（すなわち、脳室内投与によって）、及び／又は脳の大槽に（すなわち、大槽内投与によって）投与される。

【0188】

したがって、いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含む本開示のベクターは、カナバン病の神経変性の態様を治療するために、脳に（例えば、実質、脳室、大槽等に）及び／又はＣＳＦに（例えば、脊柱管又はくも膜下腔に）直接注射することによって投与される。本開示のベクターの標的細胞には、皮質、脳梁の皮質下白質、線条体及び／又は小脳に位置する細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示のベクターの標的細胞は、乏突起膠細胞である。追加の投与経路はまた、直接可視化下でのベクターの局所適用、例えば、表面皮質適用、又は他の非定位適用を含み得る。

【0189】

いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、少なくとも２つの経路によって投与される。例えば、ベクターは全身投与され、脳にも直接投与される。
少なくとも２つの経路を介して投与される場合、ベクターの投与は、同時又は同時期であることができるが、そうである必要はない。代わりに、異なる経路を介した投与は、各投与間にある時間間隔置いて別個に行うことができる。

【0190】

本開示のＡＳＰＡをコードする修飾核酸、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むベクターゲノム、及び／又はＡＳＰＡをコードする修飾核酸を含むｒＡＡＶベクターは、細胞のエクスビボの形質導入のために、又は対象に直接（例えば、カナバン病患者のＣＮＳに直接）投与するために使用され得る。いくつかの実施形態では、形質導入細胞（例えば、宿主細胞）は、疾患、障害、又は状態を治療又は予防するために対象に投与される（例えば、カナバン病の細胞療法）。修飾された治療用核酸（例えば、ＡＳＰＡをコードする）を含むｒＡＡＶベクターは、好ましくは、生物学的に有効な量で細胞に投与される。いくつかの実施形態では、生物学的に有効な量のベクターは、標的細胞においてＡＳＰＡをコードする修飾核酸（すなわち導入遺伝子）の形質導入及び発現をもたらすのに十分な量である。

【0191】

いくつかの実施形態では、本開示は、単独で、又はベクター（プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子、リポソーム、又は細胞に核酸を提供するための任意の既知の方法を含む）中のいずれかにおいて、細胞（インビボ、インビトロ、又はエクスビボ）にＡＳＰＡをコードする修飾核酸を投与することによって、細胞におけるＡＳＰＡのレベル及び／又は活性を増加させる方法を含む。

【0192】

ｒＡＡＶベクターの投薬量は、例えば、投与様式、治療される疾患若しくは状態、疾患の病期及び／若しくは侵襲性、個々の対象の状態（年齢、性別、体重等）、特定のウイルスベクター、発現されるタンパク質の安定性、ベクターに対する宿主免疫応答、並びに／又は送達される遺伝子に依存する。一般に、用量は、治療効果を達成するために、対象の体重（ｋｇ）当たり少なくとも１×１０^８又はそれ以上、例えば、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５又はそれ以上のベクターゲノム（ｖｇ）の範囲である。

【0193】

いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸は、標的細胞（例えば、乏突起膠細胞）における発現に適切な調節エレメント（例えば、プロモーター）を有するＤＮＡ分子（例えば、組換え核酸）の構成要素として投与され得る。ＡＳＰＡをコードする修飾核酸は、プラスミド又はウイルスベクター、例えばｒＡＡＶベクターの構成要素として投与され得る。ｒＡＡＶベクターは、ベクターを直接（例えば、ＣＮＳに直接）送達することによって、治療を必要とする患者（例えば、カナバン患者）にインビボで投与され得る。ｒＡＡＶベクターは、治療を必要とするドナー患者からの細胞へのベクターのインビトロ投与、続いて形質導入された細胞のドナーへの再導入（例えば、細胞治療）によってエクスビボで患者に投与されてもよい。

【0194】

本開示は、修飾核酸（例えば、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸）を投与されないそれ以外の場合は同一の細胞におけるＡＳＰＡ発現（ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質）又はＡＳＰＡ活性のレベルよりも検出可能に高い、ＡＳＰＡをコードするｍＲＮＡのレベル、ＡＳＰＡタンパク質発現のレベル、及び／又はＡＳＰＡ活性のレベルをもたらす投与方法を含む。

【0195】

別の実施形態では、本開示は、修飾核酸（例えば、ＡＳＰＡをコードする修飾核酸）を投与されないそれ以外の場合は同一の細胞に存在する機能的ＡＳＰＡ（ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質）のレベルよりも検出可能に高い、機能的ＡＳＰＡをコードするｍＲＮＡのレベル、及び／又は機能的（例えば、生物学的に活性な）ＡＳＰＡタンパク質発現のレベルをもたらす投与方法を含む。すなわち、本発明は、細胞が正常レベルのＡＳＰＡを産生するが、ＡＳＰＡタンパク質が活性を欠くか、又は正常な野生型ＡＳＰＡと比較して活性の低下を示す細胞における機能的ＡＳＰＡのレベルを増加させる方法を含む。

【0196】

当業者は、細胞がインビトロで培養若しくは成長することができるか、又は生物内に存在することができる（すなわち、インビボ）ことを理解するであろう。更に、細胞は、細胞内のＡＳＰＡのレベルが増加するように内因性ＡＳＰＡを発現してもよく、及び／又は、細胞は、野生型ＡＳＰＡ、例えば、配列番号３の配列を有するＡＳＰＡの変異若しくは変異体である内因性ＡＳＰＡを発現し、特に、ヒトＡＳＰＡには２つ以上の野生型対立遺伝子が存在してもよい。したがって、ＡＳＰＡのレベルは、それ以外の場合は同一であるが、未処理の細胞で発現されるＡＳＰＡのレベルと比較して増加する。

【0197】

キット
本開示は、包装材料及び１つ以上の構成要素を含むキットを提供する。キットは、典型的には、構成要素の説明、又はその中の構成要素のインビトロ、インビボ、若しくはエクスビボでの使用説明を含むラベル又は添付文書を含む。キットは、そのような構成要素、例えば、修飾核酸、組換え核酸、ベクターゲノム、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ、及び任意選択で第２の活性剤、例えば化合物、治療剤、薬物又は組成物の集合体を含有し得る。

【0198】

キットは、キットの１つ以上の構成要素を含有する物理的構造を指す。包装材料は、構成要素を無菌的に維持することができ、そのような目的に一般的に使用される材料（例えば、紙、ガラス、プラスチック、箔、アンプル、バイアル、チューブ等）で作製することができる。

【0199】

ラベル又は添付文書は、その中の１つ以上の構成要素の識別情報、用量、作用機序、薬物動態及び薬力学を含む活性成分の臨床薬理学を含み得る。ラベル又は添付文書は、製造、ロット番号、製造場所及び日付、有効期限を特定する情報を含み得る。ラベル又は添付文書は、キット構成要素が使用され得る疾患（例えば、カナバン病）に関する情報を含み得る。ラベル又は添付文書は、方法、使用、又は治療プロトコル若しくは治療レジメンにおけるキット構成要素のうちの１つ以上を使用するための臨床医又は対象に対する指示を含み得る。指示は、投薬量、持続時間の頻度、及び本明細書に記載される方法、使用、治療プロトコル、又は予防若しくは治療レジメンのいずれかを実践するための指示を含み得る。

【0200】

ラベル又は添付文書は、潜在的な副作用、合併症又は反応に関する情報、例えば、特定の組成物を使用することが適切でない状況に関する対象又は臨床医への警告を含み得る。

【0201】

均等物
前述の書面による明細書は、当業者が本開示を実践することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、本開示のある特定の例示的な実施形態を詳細に説明している。しかしながら、前述の事項が文章にどのように詳細に見えても、本開示は多くの手法で実践され得、本開示は添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることを理解されたい。

【0202】

特許、特許出願、論文、テキストブックなどを含む本明細書に引用される全ての参考文献、及びそれらに引用される参考文献は、それらがまだ導入されていない範囲において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0203】

例示的な実施形態
本発明は、以下の実験例を参照することにより更に詳細に説明される。これらの実施例は、例示の目的のみのために提供され、別段の定めのない限り限定することを意図するものではない。したがって、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。

【実施例】

【0204】

実施例１：ＡＳＰＡをコードするコドン最適化核酸を含むｒＡＡＶベクターを使用したＮＡＡにおける用量応答性低減
ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞を、ＮＡＡシンターゼ（Ｎａｔ８Ｌ）を発現する１．０μｇのプラスミドでトランスフェクトし、野生型ヒトＡＳＰＡ核酸配列（配列番号３）、ＡＳＰＡをコードするコドン最適化核酸（配列番号１の核酸配列を含む。Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．９６：３２３－３３４を参照されたい）又は配列番号２の核酸配列を含むＡＳＰＡをコードするコドン最適化核酸のいずれかを含む０．１、０．２、０．５、又は１．０μｇのプラスミドで共トランスフェクトした。ＮＡＡ濃度をＨＰＬＣ（ｎ＝４／群）により測定した。ＡＳＰＡをコードする野生型核酸又は配列番号１のＡＳＰＡをコードするコドン最適化核酸（図１）のいずれかでトランスフェクトした培養物に比べて、配列番号２のＡＳＰＡをコードするコドン最適化核酸を使用してトランスフェクトした培養物において、ＮＡＡにおける用量応答性低減が観察された。

【0205】

実施例２：オリゴ指向性ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１の生体内分布
この研究は、遺伝性ヒト白血球ジストロフィー、カナバン病のマウスモデルにおける広範なＣＮＳ乏突起膠細胞形質導入を促進する上での、オリゴ指向性ＡＡＶ（ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１；（ＷＯ２０１４／０５２７８９；Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．２３：８０７－８１４））カプシド変異体の最も有効な用量及び投与経路（ＲＯＡ）を定義するために行われた。４つの異なるＲＯＡを介して送達された３回用量のＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１を、成体症候性カナバンマウス（ｎｕｒ７）で試験し、ベクターの拡散及び形質導入を、４つの解剖学的関心領域におけるレポーター緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）陽性細胞の立体学的推定を生成することによって、形質導入から２週間後に定量した。各ＲＯＡを介して送達されたＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１の指向性を、これらの同じ領域におけるＧＦＰでの系統特異的抗原同時標識の発生率をスコアリングしてオリゴ指向性を検証することによって評価した。使用されたＲＯＡは、実質内（ＩＰ）、髄腔内（ＩＴ）、脳室内（ＩＣＶ）、及び大槽内（ＩＣＭ）であった。各経路を介して、１×１０^１０、１×１０^１１、及び５×１０^１１総ベクターゲノム（ＶＧ）の３つの用量のベクターを投与し、全ての処置されたコホートにわたって送達された材料の体積は一定であり、それぞれの直接的な対比較を行って、カナバン病へのＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１適用のための用量及びＲＯＡの最適な組み合わせを定義した。カナバン病の急性症状期を示す６週齢のアスパルトアシラーゼ欠損ｎｕｒ７マウス（Ｔｒａｋａ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２８：１１５３７－１１５４９）を使用した。この研究によって生成された結果は、カナバン病などの現在の難治性白質疾患に対するＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１の臨床応用を支援するための、その後の前臨床有効性試験の基礎を形成した。

【0206】

材料
ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１ベクター
ＧＦＰレポーター遺伝子の構成的発現カセットを含有する２つのロットのＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１ベクターを生成した（ロット番号７６６０及びロット番号ＬＡＶ３８Ａ）。生成された全てのベクターは、自己相補的ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するハイブリッドＣＭＶ／ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢｈ）によって駆動されるＧＦＰレポーター遺伝子を含有していた。ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション、続いてイオジキサノール勾配遠心分離及びイオン交換クロマトグラフィーによってベクターを生成した（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０：４５０－９）。ベクターの濃度を、原調製物中のＤＮＡｓｅ耐性ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のｑＰＣＲ定量によって決定されるウイルスベクターゲノム（ｖｇ）の総数として定義した。

【0207】

動物
この研究で使用された全ての動物は、承認された施設プロトコルに従って、Ｒｏｗａｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｐａｔｈｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの動物施設で維持されたコロニーから得られた。創始動物は、商業的供給源（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に由来した。ｎｕｒ７マウスは、グリア加水分解酵素アスパルトアシラーゼ（ａｓｐａ）をコードする遺伝子に不活性化点変異を有し、タンパク質を非機能的にする、カナバン病の十分に特徴付けられたモデルである（Ｔｒａｋａ ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）２８（４５）１１５３７－１１５４９）。ホモ接合ｎｕｒ７変異動物を、ヘテロ接合担体動物のペアリングから得、社内カスタマイズＳＮＰアッセイ及びリアルタイムＰＣＲを使用して遺伝子型決定した。

【0208】

０．９％生理食塩水中で適切な濃度に希釈したＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰを、６週齢のｎｕｒ７変異マウスに、吸入麻酔下で定位注射することによって送達した（４％誘導及び維持力価を効果的に測定）。それぞれ異なる投与経路（ＲＯＡ）を提供することによって区別される４つの処置コホート、すなわち、髄腔内（ＩＴ）、実質内（ＩＰ）、脳室内（ＩＣＶ）、及び大槽内（ＩＣＭ）を生成した。各ＲＯＡコホート内で、各ＲＯＡにより投与されるベクター用量によって定義される動物のサブグループを確立した（１×１０^１０、１×１０^１１、及び５×１０^１１総ベクターゲノム）。

【0209】

したがって、各ＲＯＡについて、用量によって定義される３つのサブグループが生成され、各ＲＯＡでの各用量についてｎ＝５匹の動物により、研究のために合計６０匹のｎｕｒ７マウスが得られた。ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰを麻酔したマウスに投与し、用量又はＲＯＡにかかわらず、全ての手術について、５μＬの総送達体積は一定であった。ＩＰ ＲＯＡは、５つの定位座標で１μＬのベクターを５回、それぞれの半球で前後の皮質下白質に２回（すなわち、帯に合計４回）、小脳白質に１回（合計５回）、デジタルポンプを使用して０．１μＬ／分の速度で追加注射する必要があった。ＩＴ ＲＯＡ動物は、Ｌ５とＬ６との間の腰椎穿刺を介してアクセスされたくも膜下腔へのベクターの単回５μＬの注射を受けた。ＩＣＶ ＲＯＡ動物は、２つの２．５μＬのベクター注射を受け、各側脳室に０．１μＬ／分の速度で１本ずつ注射した。ＩＣＭ ＲＯＡ動物は、０．１μＬ／分の速度で大槽を介してＣＳＦに直接送達される５μＬのベクターを受けた。全ての動物は、手術の２０分前に０．５ｍＬの２０％マンニトール（ｉｐ）を投与された。全ての動物を、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰ送達後２週間群毎に飼育し、次いで死後分析のために屠殺した。

【0210】

２週間及び８週齢の野生型及びｎｕｒ７マウスの群に、１日２回、２日連続で全身ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）を与え、３日目に屠殺した。ＢｒｄＵを５０ｍｇ／ｋｇの濃度で動物に投与した。市販の抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）を使用して、１ＭのＨＣＬ中でのＤＮＡ加水分解後に、脳組織切片をＢｒｄＵ染色のために処理した。

【0211】

方法
偏りのない立体的解析学によるベクター生体分布の定量化
ベクター手術の２週間後、動物を深く麻酔し、０．９％生理食塩水、続いて調製したばかりの緩衝４％パラホルムアルデヒドによる経心臓灌流によって脳を調製した。灌流した脳を切除し、４℃で一晩４％ＰＦＡで固定した。固定脳を凍結保存し、ドライアイス／イソペンタン浴中でフラッシュ凍結し、免疫組織化学処理の前に－８０℃で保管した。連続４０μｍの矢状切片を各脳に対して形成し（合計１４４切片）、市販の抗体（Ｓｉｇｍａ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＧＦＰのために４つの切片毎に染色した。皮質、皮質下白質、線条体、及び小脳におけるＧＦＰ陽性体細胞を、光学分割器法を使用して偏りのない立体的解析学によってスコアリングした（図２）（Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．（１９９１）２３１：４８２－９７）。電動ステージを備えた直立した明視野顕微鏡に結合された立体的解析学ソフトウェア（Ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｅｒ、Ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）を使用して、４つの異なる関心領域、すなわち大脳皮質、脳梁及び外嚢の皮質下白質、線条体、並びに小脳の内でＧＦＰ陽性のソーマのカウントを生成した。サンプリングファクションのＧＦＰ陽性細胞を、式ΣＱ＊（ｔ／ｈ）＊（１／ａｓｆ）＊（１／ｓｓｆ）を使用して各関心領域にわたる絶対推定値に再変換した。式中、ΣＱ＝粒子数、ｔ＝切片厚さ、ｈ＝カウンティングフレーム高さ、ａｓｆ＝面積サンプリング割合、及びｓｓｆ＝切片サンプリング割合である。このようにして生成された全てのデータセットについて、試料間の真の生物学的分散をマスキングする技術的ノイズを低減するために、総分散（ＣＶ）閾値に対する１５％未満の寄与を満たす誤差係数（ＣＥ）の計算によって、試料内の変動を監視した。Ｎの平均群平均推定値の有意差は、閾値有意差＜ｐ０．０５を有するスチューデントの対応のない両側ｔ検定によって決定された。

【0212】

ベクター指向性の定量化
ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰ形質導入脳におけるベクター指向性を、ＧＦＰ蛍光を用いた系統特異的抗原同時標識についてスコアリングすることによって定量化した。代替切片を、市販の抗体（Ｓｉｇｍａ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＮｅｕＮ（これは、脊椎動物のほとんどのＣＮＳ及びＰＮＳ神経細胞型に存在する）、ＧＦＡＰ（グリア原線維性酸性タンパク質）、又はＯｌｉｇ２（乏突起膠細胞系統転写因子２）免疫組織化学のために処理し、それぞれニューロン、星状細胞、及びオリゴデントロサイトを標識した。走査共焦点顕微鏡法を用いて、各関領域全体にわたって多点画像スタックを生成した。ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、各スタック内の総ＧＦＰ陽性細胞及び各系統特異的抗原（Ｏｌｉｇ２及びＮｅｕＮ）で同時標識するＧＦＰ陽性細胞の数をカウントした。個々の脳ごとに数値を照合した（試料間隔４で各脳から合計８つの連続断面をサンプリングした）。ＧＦＰ免疫蛍光体細胞及びＧＦＰ／Ｏｌｉｇ２又はＮｅｕＮ陽性細胞体の両方についてスコアリングするために、個々の切片におけるＲＯＩをソフトウェア及び２００μｍ２毎に高倍率でサンプリングした個々のポイントによって概説した。Ｏｌｉｇ２又はＮｅｕＮのいずれかによるＧＦＰ陽性体細胞同時標識の総数は、ＧＦＰ陽性体細胞の数を、各連続切片における系統特異的同時標識で割ることによって算出した。各ＲＯＡの平均を計算した（ｎ＝５匹の動物）。

【0213】

結果
実質内（ＩＰ）ＲＯＡ用量応答
ＩＰ ＲＯＡ動物に、半球及び小脳の両方において皮質下白質を標的とする５回の個別の注射を行った。処置された動物をベクター投与後２週間（８週齢）で屠殺し、脳をＧＦＰ免疫組織化学のために処理し、皮質、皮質下白質、線条体、及び小脳のＧＦＰ陽性体細胞を、光学分割器を使用して偏りのない立体的解析学を用いてスコアリングし、各関心領域における形質導入細胞の絶対推定値を得た。投与された３回の用量のＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰは全て、脳全体にわたって細胞の有意なレベルの形質導入をもたらした。（図３）皮質内では、形質導入細胞数の増加は、１×１０^１０ｖｇ用量と１×１０^１１ｖｇ用量との間で有意であった（＋１．６倍、ｐ＝０．００９６）が、最高の５×１０^１１用量でのさらなる増加は明らかではなく（ｐ＝０．６５９）、これは飽和を示唆する（図３）。脳梁及び外嚢の皮質下白質では、高いレベルの形質導入が明らかあり、陽性細胞は４つの注射部位に直接隣接して濃縮された。皮質下白質ＧＦＰ陽性細胞も用量依存的に増加し、１×１０^１０から１×１０^１１用量までの２．２倍の増加は統計的に有意であった（ｐ＝０．０１４４）が、１×１０^１１から５×１０^１１までの１．３倍の増加は統計的有意性に達しなかった（ｐ＝０．２８３）。適度な線条体形質導入が明らかであった。１×１０^１０から１×１０^１１への３．４倍の増加は非常に有意であった（ｐ＝４．３８×１０^－５）が、５×１０^１１用量では形質導入のさらなる増加は明らかではなかった（ｐ＝０．７０６）。小脳内の導入遺伝子発現は、１×１０^１１及び５×１０^１１用量の両方での単一の注射部位のすぐ周囲のエリアに限定され、前の用量からの有意な増加をもたらした（１×１０^１１：１．５倍の増加［ｐ＝０．００１６］、５ｘ１０^１１：１．４倍の増加［ｐ＝０．００１９］）。皮質は、形質導入細胞の数が最も多く（５１３，４７７）、続いて皮質下白質（１７８，３６２）、小脳（８６，８２０）、最後に線条体（６２，７０６）であった。ＧＦＡＰの同時標識は２％未満であった。

【0214】

髄腔内（ＩＴ）ＲＯＡ用量応答
ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰのＩＴ投与は、脳梁及び外嚢の皮質下白質を除いて、脳全体にわたって導入遺伝子発現の優れた分布をもたらした（図４）。皮質形質導入の１×１０^１０から１×１０^１１ｖｇへの極めて有意な増加が明らかであり（６．１倍の増加、ｐ＝０．００００２６）、５×１０^１１ｖｇ用量では有意な増加はなかった（ｐ＝０．２７３）。ＩＴ ＲＯＡ皮質におけるＧＦＰ発現の分布は優れていたが、発現の強度はＩＰ脳と比較してある程度低減した。驚くことではないが、認識され得るＧＦＰ発現が脊髄の腰部領域において観察されたが、これは、脳に向かう途中で脊髄組織によってベクターがいくらか希釈されることを示唆している。ＩＴ ＲＯＡ脳における最も顕著な観察は、脳梁及び外嚢における導入遺伝子発現の乏しさであった。用量を１×１０^１０から１×１０^１１に増加させたときに、ＧＦＰ発現白質路細胞の非常に有意な増加が見られたが（６．３倍の増加、ｐ＝０．０００２１）、ＩＴ ＲＯＡ脳における形質導入白質細胞の絶対数は比較的穏やかであった。脳のこの白質路領域における陽性細胞の平均数は、１×１０^１１用量において、同じ用量でのＩＰ脳の１７８，３６２と比較して６４，９７０であり、であった。皮質ＲＯＡと同様に、ＩＴ ＲＯＡ脳における用量を１×１０^１１から５×１０^１１に更に増加させても、形質導入白質炉細胞の数は有意に増加しなかった（ｐ＝０．２０３）。

【0215】

線条体は、連続した各用量での形質導入細胞における用量応答性増加を示した。用量を１×１０^１０から１×１０^１１に増加させると、線条体におけるＧＦＰ陽性細胞が２．７倍増加した（ｐ＝０．００１）。その後の５×１０^１１用量への増加により、陽性細胞が３．２倍増加し（ｐ＝０．００００３７）、これにより、ＩＰ ＲＯＡ脳線条体形質導入に匹敵する数（５×１０^１１のＩＴで平均７９，４４４、５×１０^１１のＩＰで平均６５，２０３）がもたらされた。

【0216】

ＩＴ ＲＯＡは、強力な小脳導入遺伝子発現をもたらし、１×１０^１０から１×１０^１１用量に移行した場合に有意に１．５倍の増加が観察された（ｐ＝０．００６４）が、５×１０^１１用量ではさらなる増加は見られなかった。小脳形質導入は、ＩＰ ＲＯＡ脳と同等であり、１×１０^１１及び５×１０^１１用量ではわずかに高かったが、有意に高くはなかった。

【0217】

脳室内（ＩＣＶ）ＲＯＡ用量応答
ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰを投与したＩＣＶは、全ての関心領域にわたって顕著な導入遺伝子発現をもたらし、特に皮質下白質の強固な形質導入が顕著であった（図５）。全ての関心領域は、用量が１×１０^１０から１×１０^１１に増加した場合に形質導入細胞の数において用量応答性の増加を示したが、小脳を除いて、５×１０^１１用量では、１×１０^１１用量と比較して、ほとんどの領域においてわずかな有意でない増加があった。皮質導入遺伝子発現は、ＩＰ ＲＯＡ脳と同等であり、用量が１×１０^１０から１×１０^１１に増加した場合に導入遺伝子陽性細胞が２倍増加し（ｐ＝０．０００２９）、５×１０^１１用量の投与後に更に１．２倍増加したが、統計的有意性に達しなかった（ｐ＝０．１２３）。

【0218】

ＩＣＶ脳における皮質下白質形質導入は実質的であり、用量を１×１０^１０から１×１０^１１に増加させた場合、ＧＦＰ陽性白質路細胞で２倍の増加が観察された（ｐ＝０．０００５２）。最も高い５×１０^１１用量では、適度な有意でない増加が観察された（ｐ＝０．３３４）。１×１０^１１用量でのＩＣＶ脳における皮質下白質形質導入は、ＩＰ脳と比較して１．５倍有意に増加し（ｐ＝０．０４１）、ＩＴ ＲＯＡ脳と比較して４．２倍有意に増加した（ｐ＝０．０００１）。

【0219】

導入遺伝子発現の非常に類似したパターンがＩＣＶ用量コホートの線条体で見られ、用量を１×１０^１０から１×１０^１１に増加させた場合にＧＦＰ陽性細胞の有意な２倍の増加が観察された（ｐ＝０．００００４３）が、５×１０^１１用量では有意なさらなる増加は見られなかった（ｐ＝０．５３７）。強固な線条体導入遺伝子発現がＩＣＶ脳において明らかであり、この領域におけるＧＦＰ陽性細胞の増加は、ＩＰ脳よりも２．５倍であった（ｐ＝０．００００４）。

【0220】

小脳ＩＣＶ形質導入は強固であり、ＧＦＰ陽性細胞の用量依存的増加が両方の連続したより高い用量で観察された（１×１０^１１で＋２倍、ｐ＝９．５６×１０^６－６；５×１０^１１で＋１．５倍、ｐ＝０．０００７３）。ＩＰ脳と比較してＧＦＰ陽性細胞が１．７倍増加し（ｐ＝０．０００１）、１ｘ１０^１１用量でＩＴ数より１．４倍増加した（ｐ＝０．００１３）。小脳は、ＩＣＶ ＲＯＡ脳におけるＧＦＰ陽性細胞のさらなる顕著な増加を示す唯一の領域であった。

【0221】

サンプリングプロセス全体を通して明らかであったＩＰとＩＣＶ ＲＯＡ脳との間の顕著な相違点は、ＩＣＶ群におけるベクターのより大きな分布であった。注射部位での導入遺伝子発現は、ＩＰ脳ではより激しかったが、その部位からは急速に希釈されていた。対照的に、ＩＣＶ導入遺伝子発現は、脳のはるかに大きなエリアにわたって比較的均等に分布していた。

【0222】

大槽内（ＩＣＭ）ＲＯＡ用量応答
ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰのＩＣＭ投与は、皮質、線条体及び小脳において、比較的広範囲にわたる導入遺伝子でありながら適度な導入遺伝子発現をもたらした。しかしながら、ＩＴ ＲＯＡ脳と同様に、ＩＣＭ脳の皮質下白質において有意な導入遺伝子発現は存在しなかった（図６）。皮質導入遺伝子発現は、用量応答性であり、各連続的に高い用量が、ＧＦＰ陽性細胞の有意な増加をもたらした（１×１０^１１、２．２倍の増加、ｐ＝０．０１８；５×１０^１１、１．３倍の増加、ｐ＝０．０４３）。線条体及び小脳の両方において、１×１０^１１用量ではＧＦＰ陽性細胞の有意な増加が見られ（線条体及び小脳ではそれぞれｐ＝２．４９×１０^－６及びｐ＝０．００６２）、最も高い５×１０^１１用量は、小脳のみで陽性細胞のさらなる増加をもたらした（ｐ＝０．０６１）。ＩＣＭ ＲＯＡによる皮質下白質路の形質導入は、決定的に控えめであった。投与用量を１×１０^１０から１×１０^１１に増加させた結果、ＧＦＰ陽性細胞が有意に増加したが（ｐ＝０．０００８６）、存在する導入遺伝子陽性細胞の実際の数は比較的無視できるものであった。

【0223】

ＩＣＶ脳に比べて、ＩＣＭ皮質下白質ＧＦＰ陽性細胞は１４．２倍低減し（ＩＣＶ平均２７１，２７４；ＩＣＭ平均１８，９９６、ｐ＝０．００００２）、次の最低皮質下白質形質導入ＲＯＡ群の動物に比べて、ＩＴは３．４倍低減し（ＩＴ平均６４，９７０）、ＩＣＭを白質形質導入における最小有効ＲＯＡとした。他の関心領域にわたる分布は、他のＲＯＡ処置群と同等であり、他の３つ全てのＲＯＡと比較して、皮質形質導入において有意差は明らかでなかった。ＩＣＭを介した線条体形質導入は、ＩＣＶ ＲＯＡと比較してわずかに低減した（ｐ＝０．０４３）。線条体ＩＣＭ ＧＦＰの発現は、１×１０^１１用量でのＩＰ（＋２．０倍、ｐ＝０．００００５）及びＩＴ（＋５．１倍、ｐ＝０．００００００５）の両方よりも有意に大きかった。ＩＣＭ脳は、検査した４つのＲＯＡのいずれかの最も高い数の形質導入小脳細胞を示した。１×１０^１１用量では、小脳ＩＣＭの形質導入は、ＩＣＶよりも１．５倍（ＩＣＭ平均２２８，２８２；ＩＣＶ平均１５７，２０３）、ＩＰよりも２．６倍、及びＩＴよりも２．２倍増加した。

【0224】

比較した投与経路（ＲＯＡ）
本明細書で探求される全てのＲＯＡについて、対象となる全ての領域において、ベクター用量を１×１０^１０から１×１０^１１に増加させると、形質導入細胞数が２～３倍増加し、一方で、５×１０^１１へのさらなる用量漸増は、形質導入細胞全体の無視できる増加をもたらした。各関心領域における１×１０^１１用量における４つ全てのＲＯＡの直接比較は、４つ全てのＲＯＩにおける形質導入細胞の絶対数の明確な差異を明らかにした（図７）。１×１０^１１ベクターゲノムで形質導入された脳皮質における形質導入細胞の数は、各ＲＯＡと有意差はなく、全てが平均４４，０００～５０，０００の陽性細胞体細胞をもたらした。対照的に、皮質下白質におけるＩＣＶ ＲＯＡには明らかな利点があり、形質導入細胞数は、他のどの群よりもＩＣＶ脳において有意に多かった。ＩＣＶ及びＩＰ形質導入脳は、それぞれ最も多い、及び２番目に多い形質導入白質路細胞の数を示した。ＩＣＶ ＲＯＡを介して１×１０^１１ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰベクターゲノムで形質導入された脳の白質路における平均２．７×１０^５個の陽性細胞は、同じ用量にさらされたＩＰ脳に存在する平均１．８×１０^５個の陽性細胞よりも有意に多かった（ｐ＝０．０４１）。

【0225】

ＩＴ及びＩＣＭ ＲＯＡはともに、皮質下白質細胞の形質導入において非効率であり、ＩＣＶ群における平均２．７×１０^５個の陽性細胞（ｐ＝０．００００８３）よりも、ＩＣＭ群における平均１．９×１０^４個の細胞は有意に１４倍少なく、ＩＴ群は４倍少なかった（ｐ＝０．０００１）。これは、ミエリンの欠乏を呈する疾患モデル系において懸念され得る。

【0226】

ＩＣＶ経路はまた、他の全てのＲＯＡよりもＩＣＶ脳内のＧＦＰ陽性細胞の数が多い線条体中の細胞の効率的な形質導入をもたらす（ＩＣＶ対ＩＰ ｐ＝３．６８×１０^－５；ＩＣＶ対ＩＴ ｐ＝１．６１×１０^－５；ＩＣＶ対ＩＣＭ ｐ＝０．０４３）。小脳の形質導入の効率は、ＩＰ、ＩＴ、及びＩＣＶ ＲＯＡの全てにわたって同等であったが、ＩＣＭ脳は、形質導入小脳細胞の数が最も多かった（ＩＣＭ対ＩＣＶ ｐ＝０．０４５）。

【0227】

ＩＰ及びＩＣＶ ＲＯＡ脳は、特定の領域においてＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰによって形質導入された細胞の絶対数が同等であったが、ＩＰ脳の陽性細胞数の大部分は、注射部位に直接隣接する切片の産物であり、ＩＣＶ脳の陽性細胞は比較的均一に分布していた。体系的非ランダム立体学的サンプリングは、個々の脳からサンプリングした切片間の分散（試料内分散）の識別を可能にし、データセット内の誤差係数（ＣＥ）として表され、繰り返し推定の平均値の標準誤差を平均値で割った値によって計算される。ＣＥは、サンプリングされた集団における全分散の半分であり、真の生物学的分散（ＣＶ）、又は個々の脳間の平均の差が、他の半分を構成する。個々のＩＰ脳の平均ＣＥは全分散の約１２％として計算され、一方、ＩＣＶ脳の平均ＣＥは約３％であり、これは、ＧＦＰ陽性細胞が、ＩＣＶ脳でサンプリングされた全ての切片にわたってより均等に分布していることを意味する。ＩＰ脳では、サンプリングされた個々の切片における陽性細胞の実際の数は、サンプリングされた切片が注射部位から更に横方向に減少するほど少なくなり、一方ＩＣＶ脳における陽性細胞の数は、サンプリングされた全ての切片において一貫して試料内平均値に近かった。この差の正味の結果は、ＩＰ脳に比べてＩＣＶ ＲＯＡ脳において、特に皮質及び皮質下白質においてベクターの拡散が大きかった（図７）。

【0228】

結論
４つの異なるＲＯＡを使用して、診断時にカナバン脳を密接にモデル化する、急性症候性動物における全体的なＣＮＳ乏突起膠細胞形質導入を促す用量及びＲＯＡの組み合わせを定義した。ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰベクターの投与は、系統特異的発現エレメントを必要とせずに、小脳を除く全ての関心領域において、７０％を超えるオリゴ指向性をもたらした。導入遺伝子陽性乏突起膠細胞の用量依存的増加は、全てのＲＯＡにおいて明らかであり、脳室内ＲＯＡは、この重要な関心領域において９０％を超えるオリゴ指向性を維持しながら、より多くの数の形質導入白質路細胞を促進した。これらのデータは、オリゴ指向性の主要な決定因子としてのカプシド細胞表面相互作用を強調しており、これは、カナバン病等の乏突起膠細胞に特異的な異常への臨床応用に最も関連している。これらのデータはまた、Ｏｌｉｇ００１カプシドが、カナバン病を含む乏突起膠細胞関連疾患、障害及び／又は状態の治療のための潜在的な治療用カプシドを有することを実証している。

【0229】

実施例３：投与経路（ＲＯＡ）によるベクター指向性
ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１の際立った特徴は、他のＡＡＶカプシド変異体と比較したその明確なオリゴ指向性である（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．２３：８０７－８１４；Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．９６：３２３－３３４）。定義上の白色物質障害であるカナバン病への適用には、異なるＲＯＡによって適用された場合にＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１ベクターがこの指向性を示すことができなければならない。オリゴ指向性は、介入の週齢などの変数に起因して変動し得（Ｇｈｏｌｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１３）２４：２０５－１３；Ｆｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００９）２７：５９－６５）、以前の研究は、新生児ｎｕｒ７マウスにおけるＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１の潜在的オリゴ指向性を文書化しているが（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．（２０１６）９６：３２３－３３４）、この潜在的指向性のより高齢の症候性動物への転換は、以前として試験されていない。これを受けて、実施例２で使用された１×１０^１１用量の４つのＲＯＡ全てを、６週齢の動物におけるベクター指向性への潜在的な影響について評価した。ＧＦＰ陽性細胞の絶対数の生成に使用された皮質、皮質下白質、線条体、及び小脳を、ＧＦＰ導入遺伝子と、系統特異的抗原Ｏｌｉｇ２（すなわち、乏突起膠細胞に対する標的特異的標識）及びＮｅｕＮ（すなわち、ニューロンに対する標的特異的標識）との同時標識について分析した。

【0230】

結果
４つ全てのＲＯＡは同等の結果を生じ、オリゴ指向性は無傷であった。非乏突起膠細胞導入遺伝子発現はニューロンに起因するものであり、４つ全てのＲＯＡコホートにおいてＧＦＰを発現するアストロサイトはほとんど観察されなかった（＜５％）。

【0231】

ＧＦＰによるＯｌｉｇ２の皮質同時標識は、ＩＴ、ＩＣＶ及びＩＣＭ ＲＯＡの間で同等であり、Ｏｌｉｇ２と同時標識する全ＧＦＰ陽性細胞の割合は一貫して約７５％であった。ＩＰ形質導入脳では、ＧＦＰ陽性細胞の約６２．３％がＯｌｉｇ２で同時標識され、小さいが有意な低減であった（図８）。ＮｅｕＮと同時標識するこれらの同じ脳内のＧＦＰ陽性細胞は、残りの形質導入皮質集団（３５．１％）を本質的に占めた。ＩＴ、ＩＣＶ、及びＩＣＭ ＲＯＡの３つは全て、約２０％のＮｅｕＮ同時標識を示した。ＩＴ ＲＯＡ脳では、Ｏｌｉｇ２と同時標識された皮質ＧＦＰ陽性細胞が７５．５％及びＮｅｕＮと同時標識された皮質ＧＦＰ陽性細胞が２０．２％であった。ＩＣＶ ＲＯＡ脳は、皮質に７０．８％のオリゴ指向性及び２３．６％の神経指向性を呈し、ＩＣＭ脳の皮質はＯｌｉｇ２と同時標識された７６％のＧＦＰ、及びＮｅｕＮと同時標識された１７．４％のＧＦＰを発現した。４つの異なるＲＯＡ間のオリゴ指向性の発現の差は小さいが、ＩＰ ＲＯＡは、ＮｅｕＮ同時標識の有意な増加（ｐ＝０．００４３対ＩＴ；ｐ＝０．０１１９対ＩＣＶ；ｐ＝０．０００５９対ＩＣＭ）を示し、これは、他の３つのＲＯＡに比べて、Ｏｌｉｇ２同時標識のわずかではあるが有意な低減（ｐ＝０．０２６対ＩＴ；ｐ＝０．０４８対ＩＣＶ；ｐ＝０．００８５対ＩＣＭ）と一致し、ＩＰ ＲＯＡが、オリゴ指向性を犠牲にして神経指向性のわずかな増加を促進したことを示唆している。ここでも、ＩＰ ＲＯＡは、ＮｅｕＮ同時標識の増加（＋１．５倍、ｐ＝０．０１２）に関して顕著であり、これは、Ｏｌｉｇ２同時標識の低減が、このＲＯＡにおけるニューロン形質導入の増加によって説明されることを示唆している。ＩＰ ＲＯＡ脳内のＧＦＰ－ＮｅｕＮ同時標識のほとんどは、注射部位のすぐ周囲にクラスター化されていたが、これは注射部位に隣接するＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰの飽和した量を示している。

【0232】

Ｏｌｉｇ２のＧＦＰとの皮質下白質同時標識は、４つ全てのＲＯＡにおいて９０％超であった（図９）。ＮｅｕＮのＧＦＰとの同時標識は、４つ全てのＲＯＡにおいて６％未満であった。ＲＯＡ間でいずれかの抗原との同時標識の割合に有意差は観察されず、ＲＯＡに関係なく、白質が豊富な領域での乏突起膠細胞に対する強い好ましさを示した。ＩＣＶ形質導入により、脳梁においてほぼ遍在的なＯｌｉｇ２同時標識が存在し、またＮｅｕＮ同時標識は存在しなかった。

【0233】

Ｏｌｉｇ２のＧＦＰとの線条体同時標識は、全てのＲＯＡの中で、Ｏｌｉｇ２と同時標識する全ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ（＞８０％）と同等であった（図１０）。線条体内の残りのＧＦＰ陽性細胞（＜２０％）は、ＮｅｕＮと同時標識した。

【0234】

小脳の同時標識は、研究した脳の他の領域と比較して、４つ全てのＲＯＡにおいてＯｌｉｇ２及びＮｅｕＮの反対の比率を示した。Ｏｌｉｇ２同時標識のパーセンテージは、４つ全てのＲＯＡにおいて総ＧＦＰ陽性細胞の１０％であった（図１１）。導入遺伝子発現は、ＧＦＰ発現細胞の８０％超を占める小脳内のニューロンによって支配された。小脳内のＲＯＡコホート間で、いずれかの抗原との同時標識パーセントの有意差は観察されなかった。顆粒細胞層中の大きなプルキンエニューロンは、強力にＧＦＰ陽性であり、小脳白質路内で散発的なＯｌｉｇ２／ＧＦＰ同時標識のみを有していた（図２９Ｃ）。これは、皮質下白質で観察されたほぼ１００％のオリゴ指向性（図２９Ｂ）及び皮質及び線条体などの比較的ニューロン密度の高い領域で観察された７０％～８０％のオリゴ指向性（図２９Ｄ）とは対照的であった。１×１０^１１用量で各ＲＯＡについてスコアリングされた総ＧＦＰ陽性細胞を、ｎ＝５で総ＧＦＰ陽性細胞（＋／－ｓｄ）の最高平均から最低平均の順にランク付けした：ＩＣＶ １１０４２５６．４（１０６８１６．９６）；ＩＰ ８４１３６５．６（１２１７２２．７）；ＩＣＭ ８１５４８６．９（１０６９７９．７）；ＩＴ ７４２１４３．１（７９４９６．５）。

【0235】

ＩＣＶ ＲＯＡは、最も多数の総ＧＦＰ陽性細胞（個々の脳における全てのＲＯＡカウントの合計）をもたらし、次のランクのＲＯＡ、ＩＰ（ｐ＝０．００６７）よりも１．３倍多かった。ＩＣＶ脳の総数は、ＩＣＭ（ｐ＝０．００２７）及びＩＴ（ｐ＝０．０００３）を含む全てのＲＯＡにわたって有意に増加した。ＩＰ ＲＯＡ脳内の細胞数は、ＩＣＭ（ｐ＝０．７３０）又はＩＴ数（ｐ＝０．１６５）のいずれよりも有意に増加せず、形質導入された全細胞においてＩＣＶ ＲＯＡが明らかに優れていることをマークした。ＩＣＶコホートとＩＰコホートとの間の全体的なＧＦＰ陽性細胞数の差（約２６２，８９１）の約７５％は、皮質下白質（３５％）及び線条体（３６％）のＲＯＩによって占められ、両方のＲＯＡコホートにおいて８０％超のオリゴ指向性を呈した。これは、ＩＣＶ脳がＩＰ脳よりもその領域のどこかに少なくとも２１０，０００個多い形質導入乏突起膠細胞を含んでいたことを意味する。この分析が皮質下白質内に限定される場合、全てのＲＯＡによる＞９０％のオリゴ指向性を示すＲＯＩ、次いで、ＩＣＶ ＲＯＡを介してＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１を投与する場合、脳当たり少なくとも８３，０００個多い形質導入された乏突起膠細胞が予想される。最悪レベルのＧＦＰ導入遺伝子発現を示すＲＯＡコホートに対して評価した場合、ＩＣＭコホート、ＩＣＶ投与は、脳当たり２００，０００個を超える細胞のＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１形質導入乏突起膠細胞の増加をもたらした。

【0236】

成体哺乳動物ＣＮＳは、白質中に相当数の乏突起膠細胞前駆細胞を有することが知られており（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２４：４７６－４８８）、未成熟乏突起膠細胞のターンオーバーの増加の形態での若年性ｎｕｒ７における再ミエリン化の試みの証拠（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２０１２）３２：１７２５－３６）が以前に示されている。白質は、成体脳においてさえも、再髄鞘形成のための著しい能力を有することを考えると、成体ｎｕｒ７白質における未成熟乏突起膠細胞の常在集団の持続性は、乏突起遺伝子送達ベクターの理想的な標的と考えられなければならない。

【0237】

増殖性乏突起膠細胞前駆体／未成熟乏突起膠細胞の相対数を評価するために、ｎｕｒ７及び野生型マウスの両方に、２日間にわたって１日２回全身ＢｒｄＵを与え、３日目にＢｒｄＵ／Ｏｌｉｇ２共同標識のプロセスのために屠殺した（図２９Ｅ～Ｇ）。ＢｒｄＵ投与は、２週齢及び８週齢のコホートの両方で開始し、若年及び成体の脳における増殖性乏突起膠細胞の可能な持続性を定量化した。各週齢における遺伝子型コホートの脳梁及び外嚢におけるＢｒｄＵ陽性細胞の数は、野生型と比較して２週齢ｎｕｒ７脳におけるＢｒｄＵ陽性細胞の有意な１．８倍の増加（ｐ＝０．０２９）及び８週齢ｎｕｒ７脳における１．６倍の増加（ｐ＝０．０３４）を明らかにした（図２９Ｆ）。両方の週齢のｎｕｒ７白質中のＢｒｄＵ細胞の大部分がＯｌｉｇ２と同時標識され、成体症候性ｎｕｒ７マウスの白質中の増殖する前駆体／未成熟乏突起膠細胞の持続性を示す。３匹の６週齢ｎｕｒ７マウスのサブセットに、１×１０^１１ｖｇのＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰで形質導入する前に２日間全身ＢｒｄＵを与え、これらの動物を、白質路内での増殖細胞の形質導入の証拠のために形質導入の２週間後に屠殺した。多数のＢｒｄＵ／ＧＦＰ同時標識細胞がこれらの動物の白質路内で観察されたが、これはレジデント前駆細胞／未成熟細胞の形質導入に成功したことを示す。

【0238】

ｎｕｒ７ ＲＯＡコホート（すなわち、６週齢）に適合させた健康な野生型動物群を、ＩＣＶ ＲＯＡを介して１ｘ１０^１１ｖｇのＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰで形質導入し、２週間後に皮質及び皮質下白質路内のＧＦＰ陽性細胞の立体学的推定の生成のために屠殺した（図８）。ＧＦＰ陽性細胞の推定値は、ｎｕｒ７脳と比較して、野生型脳の皮質及び皮質下白質の両方で有意に２倍の低減を明らかにした（それぞれのＲＯＩのｐ＝０．０００３２及びｐ＝０．０１１６）。野生型脳における皮質下白質ＧＦＰ導入遺伝子発現は、野生型脳における側脳室のすぐ周囲の領域に非常に制限されていたが、皮質発現は、合理的に拡散しているものの、形質導入細胞の絶対数において非常に適度であった。

【0239】

結論
実施例２及び３は、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１ＧＦＰベクターの脳室内（ＩＣＶ）投与経路が、ベクターの拡散及び乏突起膠細胞トロピシズムの最良の組み合わせを提供したことを示す。重要なことに、このＲＯＡは、カナバン病の病理に影響を受ける組織である皮質下白質の形質導入に十分適しているようである。したがって、数十万の細胞を形質導入し、乏突起膠細胞についてほぼ１００％の指向性を維持する能力は、他のＡＡＶカプシドよりもＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１に有意な利点を付与する。４～６週齢のｎｕｒ７脳梁／外嚢は、約１，５００，０００個のＯｌｉｇ２陽性細胞を有するため、ＩＣＶ ＲＯＡを介した１×１０^１１用量のＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１ベクターの投与は、常在性乏突起膠細胞集団の約２０％を形質導入する可能性がある。ｎｕｒ７マウスの白質路は、再ミエリン化の試みの証拠とともに存在し、相当数の増殖性乏突起膠細胞前駆体を含有することに留意すべきである。単一の乏突起膠細胞が複数の軸索を髄鞘化することができることを考えると、治療用ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１ベクターで白質を形質導入した後の再髄鞘形成の可能性は有意である。

【0240】

他のＣＳＦ標的化ＲＯＡ、すなわちＩＴ及びＩＣＭは、比較的貧弱な白質路の形質導入を示し、治療的ＲＯＡとして考慮するための第１の選択肢ではないであろう。ＩＰ脳は、形質導入された細胞の数に関して同等の形質導入レベルに近づいたが、これらの細胞の大部分は注射部位の周りに集中した。これらの部位における細胞は、任意の他のＲＯＡのより大きなベクターゲノムコピー数／細胞を有していた可能性が高いが、これらの部位から離れたベクター拡散は、ＩＣＶ ＲＯＡと比較して顕著に低かった。ＩＣＶ投与によるＧＦＰ形質導入のより広範な分布は、形質導入細胞の数と、形質導入細胞当たりのベクターのコピーの数との間の適切なバランスが達成され得る点で有利である。

【0241】

実際に、実施例２及び３におけるＩＰ脳における導入遺伝子発現の強い集中は、乏突起膠細胞指向性の小さいが有意な低減及び皮質内の神経指向性の平衡増加と関連していた。これは、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１で領域を飽和させると、乏突起膠細胞特異性の低下がもたらされ得ることを示す。なお、本研究で使用した動物群のｎｕｒ７マウスの皮質乏突起膠細胞は野生型から数が低減し、ストレス及びアポトーシスの証拠を示す（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌ．Ｍｅｔａｂ．３２：１７２５－１７３６）が、これは形質導入効率に影響を及ぼすことが予期され得る。

【0242】

全ての関心領域におけるベクター指向性は、小脳を除いて７５～９０％オリゴ指向性であった。この領域は、全てのＲＯＡ群において８０％超の神経指向性を示した。特に強い導入遺伝子発現は、顆粒層プルキンエニューロンで見られた。この明らかな指向性の逆転の理由は容易には明らかではないが、小脳は明らかに、常在細胞型に関して明確な解剖学的実体である。小脳内のプルキンエ細胞は、低いが認識可能なレベルでＯｌｉｇ２を発現し、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１カプシドが、脳の他の領域における他のニューロンの表面とは著しく異なるプルキンエニューロンとの相互作用を有する可能性がある。

【0243】

現在の実施例は、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１が、小脳を重要な例外として、ｎｕｒ７カナバン疾患マウスの脳全体にわたって強固な乏突起膠細胞導入遺伝子発現を促進することを示す。脳の他の全ての領域において、系統特異的プロモーターを必要とせずに、７０％超のオリゴ指向性が達成された。乏突起膠細胞表面に対するＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１カプシドの固有の親和性は、送達されるベクターの総用量に可能な限り近い量が標的細胞において発現することを確実にするため、他の非オリゴ指向性血清型における選択的プロモーター使用よりも有意な利点である。これらのデータにより、脳内の白質を標的化するための別個のＲＯＡの利点が特定され、ＩＣＶ ＲＯＡは、カナバン疾患の治療のためのモデルとしての、症候性成体ｎｕｒ７マウスにおける前臨床有効性研究への適用性を示している。

【0244】

実施例４：野生型とｎｕｒ７脳との間のＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰ形質導入効率の差。
カナバン病のｎｕｒ７マウスモデルは、２週齢で大動脈機能障害の症状を示す。生後６週間までに、ｎｕｒ７脳は著しい細胞喪失、白質の喪失を有し、広範囲に空胞化される。したがって、６週ｎｕｒ７脳は、健常脳とは著しく異なる微小環境であり、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰの拡散及び形質導入に影響を及ぼす可能性がある。実際、６週齢の野生型マウスのコホートにおいて、ＩＣＶ ＲＯＡを介した１×１０^１１用量の投与は、ｎｕｒ７マウスの脳における形質導入レベルと比較して、皮質及び皮質下白質における形質導入レベルの有意な低減をもたらした（図１２）（各群についてｎ＝５匹の動物、平均＋／－標準誤差が示されており、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１である）。

【0245】

皮質及び皮質下白質中のＧＦＰ陽性細胞の立体学的推定により、野生型脳における導入遺伝子発現の発生率が有意に低減した（少なくとも５０％の低減）ことが示された。強力なＧＦＰ蛍光は、側脳室に直接隣接する領域に制限され、野生型脳において適度な皮質及び皮質下白質のＧＦＰ蛍光シグナルを有する。小脳における導入遺伝子発現は乏しかった。これらのデータは、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１の拡散及び形質導入効率に対する遺伝子型特異的効果を示す。また、ｎｕｒ７脳は、ヒトカナバン脳と同様に、空胞化が激しく、過度に大きな脳室を有し、ＮＡＡが著しく上昇するため、これらの兆候及び症状は、ヒトＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１治療薬のベクターの拡散及び生体内分布に影響を及ぼす可能性がある。

【0246】

実施例５：ｎｕｒ７マウスへのＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡのインビボ投与は、ロータロッドパフォーマンスを改善する
方法
６週齢のｎｕｒ７マウスに、配列番号２のコドン最適化ＡＳＰＡ配列を含むある用量のＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡを投与した。コドン最適化ＡＳＰＡ及び調節エレメントをコードする発現プラスミドを図１３に示す。２．５×１０^１１、７．５×１０^１０又は２．５×１０^１０ｖｇの総用量を、脳室内（ＩＣＶ）投与経路（ＲＯＡ）を介して投与した。全ての用量コホートのベクターを、脳の各半球の側脳室に注射した２．５μｌの合計体積５μｌで送達した。週齢適合したｎｕｒ７動物の対照コホートを、同じＲＯＡを介して等量の生理食塩水を注射することによって生成した。週齢適合したナイーブ野生型動物を、全ての運動機能試験の較正基準として使用した。ベクターの投与の２週間後、動物を加速するロータロッドから落下する潜時について、及びオープンフィールド活動性チャンバを使用した全般的な活動性について、４ヶ月間、月に１回試験した。全ての行動試験は、治療に対して盲検化された個体によって行われた。

【0247】

結果
ロータロッドパフォーマンス
ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡは、投与された最高用量（２．５ｘ１０^１１ｖｇ）において、ｎｕｒ７マウスのロータロッドパフォーマンスによって測定されたように徐々に悪化するバランス、グリップ強度及び／又は運動協調を、週齢適合野生型動物と区別できないレベルまで奪回し、偽ｎｕｒ７対照よりも大幅に改善した。この用量では、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置動物におけるロータロッドパフォーマンスの増加は、反復測定ＡＮＯＶＡ（ｐ＝０．０２８）によって決定されるように、研究期間全体にわたって有意であり、対応のないスチューデントｔ検定によって決定されるように、それぞれの個々の時点で有意により高かった。中間範囲用量（７．５×１０^１０ｖｇ）では、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡはまた、試験した各時点でｎｕｒ７マウスにおけるロータロッドパフォーマンスの有意な改善を促進したが、この改善は、試験期間全体にわたって有意ではなかった（反復測定ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．１９）。投与された最低用量（２．５×１０^１０ｖｇ）では、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡは、試験された最後の２つの時点（１８ヶ月及び２２ヶ月）のみにおいて、ロータロッドパフォーマンスの向上を促進するのに有効であった。表１は、各処置群について秒単位で測定された平均落下潜時を示す（標準偏差を伴う）。各群について、１２匹のマウス（雄６匹及び雌６匹）を試験した。表２は、各週齢におけるＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置マウスと偽ｎｕｒ７マウスとの間の対応のないｔ検定比較のｐ値を示す。２．５×１０^１０を投与したマウスを除く全ての群において、１０週目及び１４週目に偽処置マウスと比較して統計的に有意な改善が観察された。

【表1】

【表2】

【0248】

図１４は、各ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ ｎｕｒ７用量コホート、偽ｎｕｒ７、及びナイーブ野生型対照について、生涯研究期間にわたるプロットされたロータロッド平均潜時を示す。落下潜時は、全ての３用量コホートにおいて増加し、最高用量は、反復測定ＡＮＯＶＡによって研究期間全体にわたり有意であった（^＊）。

【0249】

オープンフィールド活動性
ロータロッドを行った各週齢に対して、オープンフィールド活動チャンバ内の全般的な運動機能についても動物を評価した（図１５）。毎回、動物に単一の２０分間のセッションを与え、セッション毎の総移動距離を記録した。週齢適合野生型動物と比較して、偽ｎｕｒ７マウスは、全ての週齢、特に後の時点で有意に多動性を示した。２２週齢では、偽ｎｕｒ７動物は、野生型よりも活動性（移動距離；ｐ＝０．０２０２）の有意な３倍の増加を示した。対照的に、２．５×１０^１１用量のＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡは、偽対照（ｐ＝０．０３１２）に比べて統計的に有意であり、週齢適合野生型と区別できないｎｕｒ７マウスにおける正常化された活動性レベルをもたらした。ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡのより低い７．５×１０^１０用量は、偽ｎｕｒ７パターンよりも野生型に近い活動性パターンをもたらしたが、２２週齢での偽に対する統計的有意性の閾値をわずかに下回った（ｐ＝０．１１８１）。ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡの最低（２．５×１０^１０）用量は、病理学的過剰活性を有意に正常化するものではなく、野生型参照よりも偽ｎｕｒ７対照によく似ていた。

【0250】

これらの同じ動物におけるオープンフィールド活動性の評価は、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置ｎｕｒ７動物における多動性の用量依存的正常化を示した。データは、群当たりｎ＝６匹の動物での平均＋／－標準誤差として示される。

【0251】

ＮＡＡ蓄積及びベクターゲノム（ｖｇ）コピー数
ロータロッド試験後２２週間でマウスを屠殺し、脳組織を分離した。ＮＡＡのＨＰＬＣ分析のために各脳の１つの半球を処理し、残りの半球を定量ＰＣＲによるベクターゲノム（ｖｇ）コピー数の分析のために処理した。

【0252】

偽生理食塩水処理ｎｕｒ７マウス脳は、ＡＳＰＡ機能の喪失から予想されるように、典型的にはＮＡＡ上昇を含有した（図１６）。ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置コホートでは、病理学的に上昇したＮＡＡにおける用量応答性低減が観察され、最も高い２．５×１０^１１用量は、非常に有意な２．６倍の低減（ｐ＝５．０６×１０^－６）をもたらし、最も中間的な７．５×１０^１０用量は１．６倍の低減（ｐ＝５．１７×１０^－５）をもたらし、最も低い２．５×１０^１０用量は１．４倍の低減（ｐ＝０．００１）をもたらした。最高用量のＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡで処置したｎｕｒ７脳のＮＡＡは、実際には週齢適合野生型脳のＮＡＡよりも有意に低かった（ｐ＝０．００１２）。

【0253】

ＮＡＡについて分析した脳から残った半球を使用して、組換えＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ発現カセットのウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列を標的とするカスタムＴａｑＭａｎプローブ／プライマーセットを用い、定量ＰＣＲによってベクターゲノム（ｖｇ）コピー数を定量化した。半球の総ＤＮＡ内容物を、市販のＤＮＡ精製カラム及びキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、このようにして生成されたＤＮＡの試料を、精製されたプラスミド標準曲線に対して試験し、各試料のｖｇ／湿潤組織重量を生成した。生成された組織値のＶＧ／ｍｇは、ベクター用量に対するＮＡＡの応答と一致して、投与されたＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡの用量を反映していた（図１７）。

【0254】

空胞形成分析
ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡで処置したｎｕｒ７マウスの脳を偏りのない立体構造によって分析し、ベクター用量の関数として視床及び小脳白質／橋の空胞体積割合を定量化した（図１８）。空の空間によって占められた各関心領域内のエリアを空胞として定義し、関心領域全体の体積のパーセンテージとして示した。各用量において、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置は、偽処置マウスと比較して、視床空胞体積割合（２．５×１０^１１、ｐ＝４．６×１０^－８；７．５×１０^１０、ｐ＝６．４×１０^－８；及び２．５×１０^１０、ｐ＝６．２×１０^－８）の極めて有意な低減によって示されるように、視床空胞化の完全な奪回をもたらした（図１９）。小脳白質／橋における空胞形成も、偽処置マウスと比較して、全ての用量で有意に奪回された（２．５×１０^１１、ｐ＝１．３×１０^－５、７．５×１０^１０、ｐ＝２．５×１０^－５、及び２．５×１０^１０、ｐ＝０．０００９）が、奪回の程度は、投与したベクターの用量に比例した。最低の２．５×１０^１０用量コホートは、最高の２．５ｘ１０^１１用量（ｐ＝５．７４×１０^－６）のものよりも有意に増加したが、偽処置対照（ｐ＝０．０００９）の空胞体積割合よりも依然として有意に減少した空胞体積割合を示した（図１９）。

【0255】

乏突起膠細胞の回復
空胞形成について分析した同じ脳を、Ｏｌｉｇ２免疫組織化学について処理して、乏突起膠細胞を同定した。視床及び皮質の両方を、Ｏｌｉｇ２陽性細胞について、偏りのない立体構造によりサンプリングし、それぞれ、空胞形成の影響を受けたエリアと影響を受けなかったエリアの両方で、常在白質産生細胞の有意な差を同定した（図２０）。偽ｎｕｒ７脳は、週齢適合野生型脳に比べて、Ｏｌｉｇ２陽性細胞の４．６倍の大きな損失を示し、通常の野生型含有量の２１％に過ぎなかった（ｐ＝４．９×１０^－７）。ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置ｎｕｒ７マウス及び偽処置ｎｕｒ７マウスの視床におけるＯｌｉｇ２カウント（図２１）は、偽対照（２．５×１０^１１ｖｇ、ｐ＝６．７５×１０^－８；７．７×１０^１０ｖｇ、ｐ＝０．０２６；２．３×１０^１０ｖｇ、ｐ＝３．１８×１０^－５）に比べて、３つ全てのＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置ｎｕｒ７コホートにおける乏突起膠細胞の有意な増加を明らかにした。皮質領域におけるＯｌｉｇ２損失は、劇的ではなかったが有意であった（野生型マウスに対して偽処置ｎｕｒ７マウスにおいて１．７倍の低減、ｐ＝０．００２５）。２．５×１０^１１ｖｇで処置したｎｕｒ７脳の皮質のＯｌｉｇ２含有量（図２１）もまた、偽処置ｎｕｒ７対照マウスに比べて有意に増加した（ｐ＝０．０００２）が、２つのより低い用量コホート脳では増加しなかった。

【0256】

ニューロン回復
Ｏｌｉｇ２染色に使用した同じ２２週齢の脳内のＮｅｕＮ陽性ニューロンについて、視床及び皮質をスコアリングした（図２２）。偽処置ｎｕｒ７動物は、週齢適合野生型動物値（ｐ＝２．８×１０^－５）の約３５％である視床ニューロンの数を示した（図２３）。２．５×１０^１１ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡで処置されたｎｕｒ７マウスは、偽処置対照マウス（ｐ＝０．０００９）よりも２．３倍増加した数の視床ニューロンと、野生型マウスで観察された視床ニューロンの約８４％を含有した。７．５×１０^１０及び２．５×１０^１０という２つのより低い用量では、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡは、偽処置対照マウスよりもそれぞれ１．８倍及び１．６倍増加した視床ＮｅｕＮ陽性細胞の増加を促進した（ｐ＝０．０１２、ｐ＝０．０４２）。皮質（運動及び体性感覚）では、週齢適合野生型マウス脳に比べて、偽処置ｎｕｒ７マウス脳における神経細胞の喪失は、それほど深刻ではなかったが、有意であった。偽処置マウス由来の皮質は、野生型マウスで観察された約８０％のＮｅｕＮ陽性細胞を含有し、１．２倍の低減を示した（ｐ＝０．００５）。２．５×１０^１１ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡで処置されたｎｕｒ７マウスは、野生型マウスで観察された皮質ニューロンの約９８％である皮質ニューロンの数を含有し、偽処置されたｎｕｒ７マウスで観察された皮質ニューロンの数を１．２倍増加させた（ｐ＝０．０１３）。ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡの連続用量は、偽処置に比べて皮質ニューロンの安定した１．２倍の増加をもたらした。７．５×１０^１０用量については、サンプリングデータの高い分散により、この増加は有意ではなかった（ｐ＝０．１１３）。最も低い２．５×１０^１０用量では、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置マウスは、偽処置対照よりも、皮質ニューロンの有意な１．２倍の増加を維持した（ｐ＝０．０５）。

【0257】

改善された髄鞘形成
偏りのない立体構造を使用して、偽処置及びＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置２２週齢のｎｕｒ７脳の皮質全体にわたる皮質髄鞘塩基性タンパク質陽性線維長密度（ＭＢＰ－ＬＤ）を定量化し、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡでの処置後の髄鞘形成の回復度の指標を提供した。運動及び体性感覚皮質を、コンピュータ生成プローブを使用してＭＢＰ陽性線維についてサンプリングして、３次元組織空間における等方性プローブ線維相互作用についてスコアリングし、皮質内のＭＢＰ陽性線維長の合計をサンプリングした組織の体積で除して、最終的なＭＢＰ長密度（ｍｍ^３当たりのμｍ線維）を得た（図２４）。週齢適合野生型脳と比較した場合、偽ｎｕｒ７脳は、皮質ＭＢＰＬＤにおいて非常に有意な２倍の低減を示した（ｐ＝０．０００１）。ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡを３つ全ての用量で処置した場合、皮質ＭＢＰ－ＬＤは偽対照に比べて有意に増加し、改善の程度は用量に比例した（２．５×１０^１１ ｐ＝０．００１４；７．５×１０^１０ ｐ＝０．００３、２．５×１０^１０ ｐ＝０．０１６）。偽処置及びＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置ｎｕｒ７マウス脳を抗髄鞘塩基性タンパク質（ＭＢＰ）で染色した（図２５）。

【0258】

これらのデータは、カナバン病のマウスモデルのＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置が、バランス、グリップ強度及び／又は運動協調、運動機能を改善し、脳内に存在するＮＡＡの量を低減し、脳の空胞形成を低減し、Ｏｌｉｇ２及びＮｅｕＮ陽性細胞の数を増加させ、髄鞘形成を回復することを実証している。

【0259】

実施例６：カナバン遺伝子療法のためのＣＬＡＲＩＴＹ補助成体分布
Ｎｕｒ７マウス脳を示すカナバン疾患表現型における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）導入遺伝子を有する乏突起膠細胞指向性ｒＡＡＶベクター（Ｏｌｉｇ００１）の生体内分布を、３次元（３Ｄ）組織鮮明化及び画像化法を用いて評価した。これにより、代替投与経路（ＲＯＡ）を介して投与されたＮｕｒ７マウス半脳内のベクター生体分布の全体的な描写及び体積測定が可能になった。脳室内（ＩＣＶ）及び実質内（ＩＰ）ＲＯＡを生体内分布有効性について比較し、この方法を使用して、従来の２次元（２Ｄ）組織学的評価から得られた従来の立体データを補足した。

【0260】

この実施例は、３Ｄ法の適用可能性、及びカナバン病マウスモデルの成体マウス半脳におけるＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＧＦＰ生体内分布の評価におけるその意義を実証する。結果は、光シート顕微鏡データの３Ｄ鮮明化脳画像の視覚的定性的及び定量的描写及び生体分布推定の一覧化されたパラメータとして示される。

【0261】

試料調製及び画像化
ＲＯＡ当たり４匹の成体マウス（合計８匹）に、６週齢で５×１０^１１ベクターゲノム（ｖｇ）／動物を与え、投薬の２週間後に屠殺した。ＰＦＡ固定脳を受容し、３Ｄ組織鮮明化及び体積光シート顕微鏡画像化用に調製した。各脳を矢状に二分し、右半球をＣＬＡＲＩＴＹを使用して組織鮮明化に供した（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１３）。各試料を、市販の試薬（Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用し、市販のデバイス（Ｘ－Ｃｌａｒｉｔｙ、Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ヒドロゲル包埋及び重合、続いて電気泳動組織鮮明化により等しく調製した。試料の取り扱い中の主要なステップでの肉眼的顕微鏡写真を取得して、試料の状態を記録した（図２６）。

【0262】

Ｚｅｉｓｓ Ｚ．１光シート顕微鏡を使用して、５倍の倍率の対物レンズ及び各半脳の全体をカバーするタイリングベースの取得を利用して、各鮮明化半脳の完全な３Ｄ顕微鏡画像化を行った。画像化パラメータを調整してＧＦＰ発現を検出し、全ての試料にわたって一定に維持して一貫性を確保し、試料にわたる相対的な比較を可能にした。全ての試料を処理し、組織鮮明化から画像取得及び分析まで、同一の条件下で画像化した。

【0263】

画像処理及び分析
生データセットを前処理し、各半脳の社内カスタム設計アルゴリズムを使用して、完全でシームレスな３Ｄ画像に再構築した。最終的な画像はそれぞれ１つの半脳を含み、全体的な定量的生体分布分析のために、商業的な３Ｄ画像処理及び分析プログラム（Ｉｍａｒｉｓ、Ｂｉｔｐｌａｎｅ）にインポートした。まず、全半脳体積内の全体的な平均及び中央（ＧＦＰ）シグナル値を算出した。更に、２つのＧＦＰ強度閾値を選択して、「低」又は「高」ＧＦＰ発現を指定した（図２７）。次いで、これらの閾値を、一貫性のために全ての試料にわたって一定に維持した。次いで、これらの分類された強度領域の体積を決定し、全半脳体積と比較して、「体積％高／低発現」を生じさせた（表３）。

【0264】

結果
巨視的顕微鏡写真及び各半脳の完全な３Ｄ画像化は、２つのＲＯＡにわたるＧＦＰ発現の可変の生体分布パターンを明らかにした（ＩＰ対ＩＣＶ、図２８及び図３０）。更に、細胞形態の視覚的評価及びそれらの空間的位置を決定することによって、細胞型指向性を評価した。これらの生体分布パターンは、ベクターの拡散の程度に応じて試料間で異なっていたが、小脳内のプルキンエ細胞における高発現などの試料間で、細分化された形質導入パターンにおける類似性は一貫したままであった。次いで、全体的な強度とともに「低」及び「高」ＧＦＰ発現の定量化を計算し、各半脳について一覧化した（表３）。先の実施例の立体学的評価と一致して、鮮明化された半脳は、カナバン病の重要な領域であるＩＣＶ注射後の皮質下白質内で優れたベクター拡散を示した。更に、ＩＰ注射は高ＧＦＰ強度のサブ領域をもたらしたが、これらのサブ領域の大部分は注射部位の周囲に集中しており、立体学的評価から得られた結論を支持していた。

【表3】

【0265】

結論及び意義
無傷で組織が鮮明化されたマウス脳の体積画像化は、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１生体分布のより包括的かつ総合的な評価を提供する。分布の完全な取得及び定量化を可能にするカスタムアルゴリズムは、ステレオロジー法から得られるより高分解能の定量化を支援する。器官レベルの画像化の評価は、３Ｄ空間的な構造的及び地域的接続性を保持しながらこの生体分布の全体的な評価を提供する。最後に、様々なＲＯＡのデジタル編集を使用して、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１ＲＯＡに追加の評価を実行して、最適な形質導入効率及び細胞型特異的指向性を評価する場合に将来の参照に使用されるデジタル「ライブラリ」を生成することができる。

【0266】

実施例７：ＡＡＶ生体内分布及び薬力学的効果のＣＬＡＲＩＴＹベース体積評価
この実施例では、上記実施例６に記載されるＣＬＡＲＩＴＹ組織鮮明化技術を利用して、ｎｕｒ７マウス脳におけるＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡを注射した後の脱髄における逆転の全体的及び局所的な導入遺伝子媒介薬理学的効果を評価及び実証した。

【0267】

簡潔に述べると、ｎｕｒ７マウスを２つの群に分け、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ（「Ｏｌｉｇ１」又は「Ｏｌｉｇ１－ＡＳＰＡ」）又は生理食塩水（「Ｎｕｒ７」）とともに、ＩＣＶ又はＩＰ経路を介して上述の様式で投与した。次いで、２つの群のマウスの脳を分析して、上述の様式で視床及び小脳白質／橋の空胞体積割合を定量化した。対照群として野生型マウス（「ＷＴ」）の脳も分析した。結果を図３１に示す。より具体的には、図３１Ｂの矢印は、ｎｕｒ７マウスの視床領域が、ＷＴには存在せず、Ｏｌｉｇ１－ＡＳＰＡ処置組織においてほぼ完全に奪回された可視空胞形成を示したことを示す。更に、図３１Ｃに示すように、１日の受動的鮮明化後、ｎｕｒ７マウス組織は、ＷＴ及びＯｌｉｇ１－ＡＳＰＡ処置組織の両方よりも高い透明度に達した。これらの結果は、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置が、ｎｕｒ７マウスにおける脳の空胞形成を低減し、髄鞘形成を回復させたことを実証している。

【0268】

同様の解剖学的配向を有する３つの群全てからの３Ｄ画像の抽出２Ｄ単一スライスにおいても、細胞計数分析を行った（図３２Ａ）。図３２Ｂ及び３２Ｃに示すように、平均核密度（セグメンテーション面積によって正規化されたカウント）は皮質領域内で細胞密度の全体的な差はほとんど示さなかったが、Ｎｕｒ７群のマウスは視床領域において全体的な核密度／核面積が有意に低かった。対照的に、Ｏｌｉｇ１－ＡＳＰＡ群及びＷＴ群は、視床領域において類似した全体的な核密度又は核面積を有するようであった。これらの結果は、ｎｕｒ７マウスのＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡ処置が、視床領域における細胞の数を、ＷＴ群に見られるレベルに近いレベルまで維持又は増加させたことを実証している。

【0269】

空胞形成について分析した脳を、上述の様式で乏突起膠細胞を識別するためにＭＢＰの免疫蛍光染色用に処理した。そのために、３Ｄ体積分析を行い、薬力学的処置効果を検討した。２ｍｍ組織スライスの完全３Ｄ体積を決定し、平均蛍光強度を、ＳＹＴＯ（核マーカー）並びにＭＢＰについて計算した。Ｎｕｒ７群のマウスからの組織は、より低い平均ＭＢＰ蛍光値を示すことが見出された。対照的に、Ｏｌｉｇ１－ＡＳＰＡ処置群は、全体的にＭＢＰシグナルの増加を有し、これはほぼＷＴ群のレベルに匹敵した（図３３Ｂ）。

【0270】

追加の３Ｄ体積分析を実行し、ＭＢＰ体積をシグナル閾値により計算した。閾値は、２０００を超える蛍光値で設定した閾値でより制限的に（図３３Ｃ、左パネル）、又は１０００の閾値でより包括的に（図３３Ｃ、右パネル）行われた。いずれの場合も、Ｎｕｒ７群のマウスにおいてＭＢＰ欠乏が観察された（図３３Ｄ）。対照的に、ＭＢＰ体積の増加は、Ｏｌｉｇ１－ＡＳＰＡ群において、特より低い閾値を使用した場合に明確に見られ、全体的なＭＢＰ体積値がＷＴ群のレベルに近づいた（図３３Ｄ）。

【0271】

領域ベースの分析を、視床領域において３Ｄで行った。領域の一部の手動セグメンテーションを図３３Ｅに示した。核（ＳＹＴＯ）及びミエリン（ＭＢＰ）マーカーの両方についてのこの領域内の平均蛍光強度を図３３Ｆに示す。Ｏｌｉｇ１－ＡＳＰＡ群のＳＹＴＯ及びＭＢＰレベルは、ＷＴ群のレベルにほぼ到達したことが分かった。対照的に、Ｎｕｒ７試料は、両方のマーカーにおいてより低い平均蛍光値を示した。また、皮質の一部に対して領域ベースの解析を行った。核（ＳＹＴＯ）及びミエリン（ＭＢＰ）マーカーの両方についてのこの皮質領域内の平均蛍光強度レベルを、図３３Ｇ及び３３Ｈに示した。全体的な傾向は、図３３Ｆに示すものと同様であった。皮質及び視床領域における３Ｄ細胞濃度（１００μｍ^２当たりの核）も得た。図３３Ｉに示すように、Ｎｕｒ７群のマウスの両方の領域における全体的核濃度はより低かった。対照的に、Ｏｌｉｇ１－ＡＳＰＡ群のマウスの視床領域における３Ｄ細胞濃度は、ＷＴ群のレベルに近いレベルを示した。

【0272】

これらの結果は、ＡＡＶ／Ｏｌｉｇ００１－ＡＳＰＡの投与がｎｕｒ７マウス脳における脱髄及び細胞損失を奪回又は逆転させたことを実証している。

【0273】

均等物
前述の書面による明細書は、当業者が本開示を実践することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、本開示のある特定の例示的な実施形態を詳細に説明している。しかしながら、前述の事項が文章にどのように詳細に見えても、本開示は多くの手法で実践され得、本開示は添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることを理解されたい。

【0274】

特許、特許出願、論文、テキストブックなどを含む本明細書に引用される全ての参考文献、及びそれらに引用される参考文献は、それらがまだ導入されていない範囲において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【表4】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図29D】

【図29E】

【図29F】

【図29G】

【図30A-30C】

【図31A-31C】

【図32A-32C】

【図33A-33D】

【図33E-33H】

【図33I】

【配列表】

2023524024000001.app

【国際調査報告】