(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-08
(54)【発明の名称】ヒアルロナンコンジュゲートの使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/728 20060101AFI20230601BHJP
A61K 31/7016 20060101ALI20230601BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230601BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230601BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230601BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230601BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20230601BHJP
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A61P 33/02 20060101ALI20230601BHJP
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A61P 33/12 20060101ALI20230601BHJP
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A61P 43/00 20060101ALI20230601BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20230601BHJP
【ＦＩ】
A61K31/728
A61K31/7016
A61P11/00
A61P29/00
A61P31/04
A61P31/12
A61P33/00
A61P31/16
A61P31/22
A61P31/14
A61P33/02
A61P33/06
A61P33/12
A61P11/06
A61P43/00 105
A61P31/20
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022566400
(86)(22)【出願日】2021-06-08
(85)【翻訳文提出日】2022-10-31
(86)【国際出願番号】 US2021036438
(87)【国際公開番号】W WO2021252513
(87)【国際公開日】2021-12-16
(31)【優先権主張番号】63/036,231
(32)【優先日】2020-06-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/130,442
(32)【優先日】2020-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521497774
【氏名又は名称】アイホル・コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＡＩＨＯＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】６４８１ ＯＲＡＮＧＥＴＨＯＲＰＥ ＡＶＥＮＵＥ ＳＴＥ ２， ＢＵＥＮＡ ＰＡＲＫ， ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ９０６２０， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】リン，ファ‐ヤン
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA01
4C086EA25
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA59
4C086ZB11
4C086ZB21
4C086ZB33
4C086ZB35
4C086ZB37
4C086ZB38
4C086ZB39
(57)【要約】
急性肺炎症および慢性肺炎症を含む肺炎症を治療するためのヒアルロナンコンジュゲートの使用が、本明細書で開示される。また、ウイルス感染を治療するためのヒアルロナンコンジュゲートの使用も、本明細書で開示される。前記ヒアルロナンコンジュゲートは、ヒアルロン酸（ＨＡ）ニメスリドコンジュゲートである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
治療を必要とする対象の肺炎症の治療に使用するための医薬品の製造におけるヒアルロナンコンジュゲートの使用であって、前記ヒアルロナンコンジュゲートが、以下の構造
【化1】
【請求項2】
前記対象が、ヒトである、請求項１に記載のヒアルロナンコンジュゲートの使用。
【請求項3】
前記肺炎症が、急性肺炎症または慢性肺炎症である、請求項１に記載のヒアルロナンコンジュゲートの使用。
【請求項4】
前記急性肺炎症が、肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、または、急性肺損傷（ＡＬＩ）により引き起こされるか、または、それらに関連する、請求項３に記載のヒアルロナンコンジュゲートの使用。
【請求項5】
前記肺炎が、細菌感染、ウイルス感染、または、寄生虫感染によって引き起こされる、請求項４に記載のヒアルロナンコンジュゲートの使用。
【請求項6】
前記細菌感染が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、または、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）により引き起こされ、前記ウイルス感染が、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、または、コロナウイルスによって引き起こされ、かつ、
前記寄生虫感染が、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、または、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）によって引き起こされる、請求項５に記載のヒアルロナンコンジュゲートの使用。
【請求項7】
前記コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、請求項６に記載のヒアルロナンコンジュゲートの使用。
【請求項8】
前記慢性肺炎症が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、肺線維症、または、特発性肺線維症（ＩＰＦ）によって引き起こされるか、または、それらに関連している、請求項３に記載のヒアルロナンコンジュゲートの使用。
【請求項9】
前記肺炎症が、過敏性肺炎である、請求項１に記載のヒアルロナンコンジュゲートの使用。
【請求項10】
前記ヒアルロナンコンジュゲートが、１０～２０００キロダルトンの平均分子量（ＭＷ）を有する、請求項１に記載のヒアルロナンコンジュゲートの使用。
【請求項11】
前記ヒアルロナンコンジュゲートが、以下の構造【化2】
【請求項12】
前記ヒアルロナンコンジュゲートが、以下の構造【化3】
【請求項13】
前記ヒアルロナンコンジュゲートが、０．５％～３５％の置換度を有する、請求項１に記載のヒアルロナンコンジュゲートの使用。
【請求項14】
治療を必要とする対象の肺炎症の治療に使用するためのヒアルロナンコンジュゲートであって、前記ヒアルロナンコンジュゲートが、以下の構造
【化4】
【請求項15】
治療を必要とする対象における肺炎症を治療するための医薬組成物であって、有効量のヒアルロナンコンジュゲート、および、医薬的に許容される賦形剤を含み、
前記ヒアルロナンコンジュゲートが、以下の構造
【化5】
【請求項16】
治療を必要とする対象における肺炎症を治療するための方法であって、有効量の、以下の構造【化6】
【請求項17】
以下の構造【化7】
【請求項18】
有効量の、請求項１７に記載のヒアルロナンコンジュゲート、および、医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項19】
以下の構造【化8】
【請求項20】
有効量の、請求項１９に記載のヒアルロナンコンジュゲート、および、医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ヒアルロン酸のコンジュゲート（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関し、より詳細には、肺炎症を治療するためのヒアルロン酸のコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【0002】
炎症とは、とりわけ、病原体、刺激物、および傷害などの刺激に対して、我々の身体の免疫システムが応答するプロセスである。炎症には、急性炎症と慢性炎症の２種類がある。急性炎症の主な症状は、痛み、発赤、腫れ、熱感などで、数日続くことがしばしばある。一方、慢性炎症は、数ヶ月から数年にわたって生じる可能性がある。慢性炎症の症状としては、痛みおよび疲労が一般的であるが、それ以外の症状については、アレルギー、関節炎、乾癬、関節リウマチ、糖尿病、心疾患、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの慢性炎症に関連する疾患によって異なることが多い。
【0003】
炎症反応は、刺激部位から生じる事象の非常に複雑なカスケードの結果である。この複雑な反応は、サイトカインによって媒介される。サイトカインは、適応免疫、炎症誘発シグナル伝達経路、および抗炎症シグナル伝達経路に関与する、炎症の重要な調節因子である。サイトカインの例としては、ケモカイン、インターロイキン（ＩＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、例えば、ＴＮＦ－αおよびＴＮＦ－β）、インターフェロン（ＩＦＮ、例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、およびＩＦＮ－γ）、コロニー刺激因子（ＣＦＳ、例えば、顆粒球ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）および顆粒球／マクロファージＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）およびエリスロポエチン）、およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）が挙げられるが、これらに限定されない。ケモカインは、小型サイトカイン（８－１２ｋＤａ）の一種で、主に白血球を刺激部位に遊走させるために、細胞によって産生される。ケモカインは、その最初の２つのＮ末端システイン残基の間隔に応じて、４つのグループ（ＣＣケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン）に分類され得る。
【0004】
ＩＬ－６は、急性期反応、免疫応答、および造血を活性化することにより、感染症および組織損傷などの急性環境刺激に対する宿主防御に関与する多目的サイトカインである。しかし、ＩＬ－６の調節不全の継続的な産生は、様々な自己免疫疾患および慢性炎症性疾患の発症および発現を引き起こす可能性がある。さらに、ＩＬ－６および他のサイトカイン（ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０など）の高発現は、全身性の急性炎症性合併症であるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）すなわちサイトカインストームを、引き起こす可能性がある。現在、ＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックは、多くの国の医療資源と社会経済を圧迫している。ＣＯＶＩＤ－１９は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）により引き起こされる感染症である。ＣＯＶＩＤ－１９の重症例では、程度の差こそあれＣＲＳが認められ、これらの患者ではＩＬ－６レベルの上昇がしばしば認められる。ＣＲＳは重篤な肺損傷を引き起こし、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および死をもたらす可能性があるため、ＩＬ－６を介したカスケードを遮断することで疾患の重症度を軽減できる可能性がある。
【0005】
したがって、ＩＬ－６遮断は、自己免疫疾患、炎症性疾患、およびサイトカインストームの治療戦略として用いられてきた。しかし、免疫応答は非常に複雑かつ動的であるため、ＩＬ－６遮断薬は数種類しか承認されておらず、いくつかの薬剤候補が臨床試験中である。 それにもかかわらず、これらの薬剤は、すべて抗体ベースの生物製剤であり、特に上市当初は非常に高価であることが多い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記の観点から、当該技術分野では、効果的に治療できる低分子ベースの治療薬を提供する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
（概要）
以下では、読み手に基本的な理解を提供するために、本開示の簡略化した概要が示される。この概要は、本開示の広範な概要ではなく、本発明の肝要な／重要な要素を特定するものでも、本発明の範囲を明確にするものでもない。その唯一の目的は、後述するより詳細な説明の前段階として、本明細書に開示されているいくつかの概念を簡略化して提示することである。
以下では、読み手に基本的な理解を提供するために、本開示の簡略化した概要が示される。この概要は、本開示の広範な概要ではなく、本発明の肝要な／重要な要素を特定するものでも、本発明の範囲を明確にするものでもない。その唯一の目的は、後述するより詳細な説明の前段階として、本明細書に開示されているいくつかの概念を簡略化して提示することである。
【0008】
１つの態様では、本開示は、治療を必要とする対象における肺炎症を治療する方法に関する。
【0009】
本開示のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、有効量の、以下の構造
または、その医薬的に許容される塩の構造を有する少なくとも１つの二糖単位を有するヒアルロナンコンジュゲート（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を、前記対象に投与するステップ、を含む。
【化1】
【0010】
様々な実施形態において、前記対象は、ヒトを含む哺乳類である。
【0011】
本開示のいくつかの実施形態によれば、前記肺炎症は、急性肺炎症（例えば、肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、および急性肺損傷（ＡＬＩ））、慢性肺炎症（例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、肺線維症、もしくは特発性肺線維症（ＩＰＦ））、または過敏性肺炎（外因性アレルギー性肺胞炎）である。
【0012】
本開示の様々な実施形態によれば、肺炎は、細菌（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、およびマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ））、ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、およびコロナウイルス）、または寄生虫（例えば、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、および住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ））により引き起こされる。ヒトに肺炎を引き起こす可能性のあるコロナウイルスの例としては、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、および中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0013】
いくつかの実施形態では、前記ヒアルロナンコンジュゲートは、静脈内注射で投与される。
【0014】
本開示の特定の実施形態によれば、前記ヒアルロナンコンジュゲートは、１０～２０００キロダルトン（ｋＤａ）、好ましくは、５０～２５０ｋＤａ、より好ましくは、１００～２００ｋＤａの平均分子量（ＭＷ）を有している。
【0015】
本開示のいくつかの実施形態によれば、前記ヒアルロナンコンジュゲートは、約０．５％～３５％の置換度（ＤＳ）を有する。すなわち、１０００個の二糖単位ごとに、約５～１００個の水素化ニメスリド分子がそこに結合している。いくつかの好ましい実施形態では、本ヒアルロナンコンジュゲートの置換度は、約０．７５～９％、好ましくは約１％～８％、好ましくは約１．２５％～７％、好ましくは１．５％～６％、好ましくは約１．７５％～５．５％、好ましくは約２％～５％、好ましくは約２．２５％～４．５％である。
【0016】
本開示の特定の実施形態によれば、前記ヒアルロナンコンジュゲートは、１つの二糖単位のみを含み、以下の構造
または、その医薬的に許容される塩の構造を有している。
【化2】
【0017】
本開示の特定の実施形態によれば、前記ヒアルロナンコンジュゲートは、２つの二糖単位のみを含み、以下の構造
若しくは、それらの医薬的に許容される塩の構造を有している。
【化3】
【0018】
さらに別の態様において、本開示は、肺炎症を治療するための医薬組成物に関する。
【0019】
いくつかの実施形態によれば、前記医薬組成物は、有効量の上記のヒアルロン酸のコンジュゲートと、医薬的に許容される賦形剤とを含む。
【0020】
本開示の他の態様にも含まれる主題には、肺炎症の治療に使用するための医薬品の製造におけるヒアルロン酸のコンジュゲートの使用、および肺炎症の治療に使用するためのヒアルロン酸のコンジュゲート、を含む。
【0021】
本開示の特徴および利点の多くは、添付の図面に関連して考慮される以下の詳細な説明を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
【0022】
本明細書は、添付の図面に照らして示される以下の詳細な説明から、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】本開示の１つの実施例による、様々な実験群におけるマウスのＰＧＩ２レベルを示すヒストグラムである。
【図2】本開示の１つの実施例による、様々な実験群におけるマウスの平均サイトカイン濃度を示すヒストグラムである。
【図3】本開示の１つの実施例による、ＬＰＳ誘導Ａ５４９細胞におけるＩＬ－６レベルに対するＮＩＭ－ＨＡの効果を示すヒストグラムである。
【図4】本開示の１つの実施例による、ＬＰＳ誘導Ａ５４９細胞におけるＩＬ－６レベルに対するＮＩＭ－ＨＡ二糖の効果を示すヒストグラムである。
【図5】本開示の１つの実施例による、ＬＰＳ誘導ＡＬＩマウスモデルにおける肺重量の湿潤／乾燥比に対するＮＩＭ－ＨＡの効果を示すヒストグラムである。
【図6A】本開示の１つの実施例による、ＬＰＳ誘導ＡＬＩマウスモデルのＢＡＬＦにおける総タンパク質、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、およびＩＬ－６のレベルに対するＮＩＭ－ＨＡの効果をそれぞれ示すヒストグラムである。
【図6B】本開示の１つの実施例による、ＬＰＳ誘導ＡＬＩマウスモデルのＢＡＬＦにおける総タンパク質、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、およびＩＬ－６のレベルに対するＮＩＭ－ＨＡの効果をそれぞれ示すヒストグラムである。
【図6C】本開示の１つの実施例による、ＬＰＳ誘導ＡＬＩマウスモデルのＢＡＬＦにおける総タンパク質、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、およびＩＬ－６のレベルに対するＮＩＭ－ＨＡの効果をそれぞれ示すヒストグラムである。
【図6D】本開示の１つの実施例による、ＬＰＳ誘導ＡＬＩマウスモデルのＢＡＬＦにおける総タンパク質、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、およびＩＬ－６のレベルに対するＮＩＭ－ＨＡの効果をそれぞれ示すヒストグラムである。
【図7A】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス侵入に対するＮＩＭ－ＨＡおよびＮＩＭ－ＨＡ４コンジュゲートの効果を示すヒストグラムおよび折れ線グラフを示す（侵入遮断:６時間）。
【図7B】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス侵入に対するＮＩＭ－ＨＡおよびＮＩＭ－ＨＡ４コンジュゲートの効果を示すヒストグラムおよび折れ線グラフを示す（侵入遮断:６時間）。
【図8A】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス侵入に対するＮＩＭ－ＨＡおよびＮＩＭ－ＨＡ４コンジュゲートの効果を示すヒストグラムおよび折れ線グラフを示す（侵入遮断:１６時間）。
【図8B】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス侵入に対するＮＩＭ－ＨＡおよびＮＩＭ－ＨＡ４コンジュゲートの効果を示すヒストグラムおよび折れ線グラフを示す（侵入遮断:１６時間）。
【図9A】細胞生存率に対するＮＩＭ－ＨＡ４コンジュゲートの効果を示すヒストグラムおよび折れ線グラフを示す。
【図9B】細胞生存率に対するＮＩＭ－ＨＡ４コンジュゲートの効果を示すヒストグラムおよび折れ線グラフを示す。
【図10A】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルスに感染したマウスに対するＮＩＭ－ＨＡのｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す分布図である。
【図10B】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルスに感染したマウスに対するＮＩＭ－ＨＡのｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す分布図である。
【図11】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するＮｉｍ－テトラ（ＮＩＭ－ＨＡ４）コンジュゲートの阻害効果を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【0024】
（説明）
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明を意図したものであり、本実施例が構築または利用され得る唯一の形態を表すことを意図したものではない。本説明では、本実施例の役割と、本実施例を構築して実行させるためのステップの順序とを示している。しかし、同じまたは同等の役割および順序が、異なる実施例によって達成され得る。
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明を意図したものであり、本実施例が構築または利用され得る唯一の形態を表すことを意図したものではない。本説明では、本実施例の役割と、本実施例を構築して実行させるためのステップの順序とを示している。しかし、同じまたは同等の役割および順序が、異なる実施例によって達成され得る。
【0025】
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で採用されている特定の用語がここに集められている。本明細書で特に定義されていない限り、本開示で採用されている科学的および技術的な用語は、当業者が一般的に理解し、使用する意味を有するものとする。
【0026】
文脈上特に要求されない限り、単数形には同じものの複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれることが理解される。また、本明細書および特許請求の範囲で使用されている「少なくとも１つ」および「１つ以上」という用語は、同じ意味を有し、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上を含む。さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲を通して使用される、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つ」、および「Ａ、Ｂおよび／またはＣのうちの少なくとも１つ」という表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢを一緒に、ＢとＣを一緒に、ＡとＣを一緒に、ならびにＡ、Ｂ、およびＣを一緒にカバーすることを意図している。
【0027】
本発明の広範な範囲を示す数値範囲やパラメータは近似値であるにもかかわらず、具体的な実施例に記載された数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、いずれかの数値にも、それぞれの試験測定で見出される標準偏差に起因する一定の誤差が含まれている。また、本明細書では、「約」という用語は、一般に、所定の値または範囲の１０％、５％、１％、または０．５％以内を意味する。また、「約」という用語は、当業者が考える場合の平均値の許容可能な標準誤差の範囲内を意味する。実行／実施例以外では、または別途明示して示されない限り、本明細書で開示されている材料の量、時間の長さ、温度、作動条件、量の割合などのためのすべての数値範囲、量、値、およびパーセントは、すべての例で「約」という用語によって変更されていると理解されるものとする。したがって、特にそれとは反対の指示がない限り、本開示および添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、所望に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、各数値パラメータは、少なくとも、報告される有効桁数の数を踏まえて、および通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるものとする。範囲は、１つの終点からもう１つの終点までまたは２つの終点間として本明細書で示され得る。本明細書で開示される全ての範囲は、別途指定しない限り終点を含む。
【0028】
本明細書で使用される「治療」および「治療する」という用語は、予防に寄与する（例えば、予防的）、治癒的または緩和的な措置を指してもよい。特に、本明細書で使用される「治療する」という用語は、本ヒアルロナンコンジュゲートまたはこれを含む医薬組成物を、病状、病状に関連する症状、病状に続発する疾患または障害、または、病状に対する素因、を有する対象に適用または投与することを指し、その目的は、前記特定の疾患、障害および／または状態の１つ以上の症状または特徴を部分的にまたは全体的に緩和する、改善する、軽減する、発症を遅延させる、進行を阻害する、重症度を低減する、および／または、発病率を低減することである。治療を、疾患、障害および／または状態の兆候を示さない対象、および／または、疾患、障害および／または状態の早期の兆候のみを示す対象に施してもよく、その目的は、疾患、障害および／または状態に関連する病変を発症するリスクを減少することである。
【0029】
用語「対象」および「患者」は、本明細書では互いに互換可能に使用され、本明細書に記載されたヒアルロナンコンジュゲート、これを含有する医薬組成物、および／または本発明の方法により治療可能なヒト種を含む動物を意味することを意図する。用語「対象」または「患者」は、本開示から恩恵を受ける可能性のある任意の哺乳類を含む。本明細書で使用される「哺乳類」は、ヒト、霊長類、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシなどの家畜および農場動物、ならびに動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物、ならびにマウス、およびラットなどのげっ歯類を含む哺乳綱の全てのメンバーを指す。用語「非ヒト動物」は、ヒトを除く哺乳綱の全てのメンバーを指す。１つの例示的な実施形態において、患者はヒトである。用語「対象」または「患者」は、１つの性別を具体的に示さない限り、男性および女性の両方を指すことを意図する。
【0030】
用語「適用」および「投与」は、本明細書では互いに互換可能に使用され、本発明のヒアルロナンコンジュゲートまたは医薬組成物を、治療を必要とする対象に適用することを意味する。
【0031】
本明細書で使用される用語「有効量」は、所望の治療効果を生じるのに十分な本発明のヒアルロナンコンジュゲートの量を指す。治療目的のために、有効量の薬物は、疾患または状態を治癒する（ｃｕｒｅ）のには要求されないが、疾患もしくは状態の発症を遅延させる、妨げる、もしくは予防する、または疾患もしくは状態の症状を改善するなど、疾患または状態のための治療を提供する。有効量を、指定された期間を通して１回、２回、またはそれ以上の回数で、投与するのに適した形態で１回量、２回量またはそれ以上の用量に分割してもよい。具体的な有効量または十分量は、治療する特定の状態、患者の身体状態（例えば、患者の体重、年齢もしくは性別）、治療する哺乳類または動物の種類、治療の期間、併用療法（もしあれば）の特性、ならびに、使用する特定の剤形および化合物またはその誘導体の構造などの要因によって異なる。有効量は、例えば、ヒアルロナンコンジュゲートの総質量またはヒアルロナンコンジュゲートにおける４－アミノニメスリド（ａｍｉｎｏｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）の等価質量（例えば、グラム、ミリグラムもしくはマイクログラム単位）、またはヒアルロナンコンジュゲートの質量またはヒアルロナンコンジュゲートにおける４－アミノニメスリドの等価質量の、体重に対する比、例えば、ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）として表示してもよい。
【0032】
例えば、本開示のいくつかの実施例によれば、ＩＬ－６、ＫＣ－ＧＲＯ、およびＭＣＰ－１レベルを低下させることによりマウス（約２０グラム）における炎症を治療するための前記ヒアルロナンコンジュゲートの有効量は、約２５～１５０ｍｇ／ｋｇ体重／用量である。したがって、マウスを治療するためのヒアルロナンコンジュゲートの有効量は、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、または１５０ｍｇ／ｋｇ体重／投与である。体重約６０ｋｇの成人ヒトの場合、マウスに対する上記用量から得られるヒト等価用量（ＨＥＤ）は、約２～１２０ｍｇ／ｋｇ体重／用量である。
【0033】
理解され得るように、上記の用量の範囲は、提供された医薬組成物を成人に投与するための指針として提供される。例えば、子供または青年に投与する量は、医師または当業者によって決定され得、成人に投与する量よりも低いまたは同じであり得る。患者の年齢、体重、健康状態などを考慮すると、ヒトに対する有効量は、約１～２００ｍｇ／ｋｇ体重／用量であってもよい。
【0034】
具体的には、ヒト対象に対するヒアルロナンコンジュゲートの有効量は、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９または２００ｍｇ／ｋｇ体重／用量であってもよい。
【0035】
また、マウス（約２０ｇ）を治療するための有効量は、ヒアルロナンコンジュゲート中の４－アミノニメスリドの当量質量に換算して、約５０ｎｇ／ｋｇ体重～６μｇ／ｋｇであり、例えば、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、1７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、もしくは９９０ｎｇ／ｋｇの体重／用量、または１、１．５、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、もしくは６μｇ／ｋｇ体重／用量である。
【0036】
同様に、体重約６０ｋｇの成人ヒトにおいて、マウスに対する上記の用量から得られるヒアルロナンコンジュゲート中の４－アミノニメスリドの等価質量のＨＥＤ（換算係数：０．０８）は、約４～４８０ｎｇ／ｋｇ体重／用量である。つまり、本発明のヒアルロナンコンジュゲートのＨＥＤは、約８０ｎｇ／ｋｇ体重～４００μg／ｋｇ体重／用量である。患者の年齢、体重、健康状態を考慮すると、ヒト対象に対する有効量は、約２０～８４０ｎｇ／ｋｇ体重／用量であり得る。
【0037】
具体的には、ヒト対象に対する有効量は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０または８４０ｎｇ／ｋｇ体重／用量である。
【0038】
本開示のいくつかの例によれば、前記ヒアルロナンコンジュゲートは、週３回で２週間投与される。理解され得るように、有効量は、投与の間隔および期間に応じて適宜調整することができる。特定の実施形態では、複数回の投与が対象に行われる場合、対象への複数回の投与の頻度は、1日３回、1日２回、１日１回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、４日ごとに１回、５日ごとに１回、６日ごとに１回、毎週１回、隔週１回、毎月１回または隔月で１回である。特定の実施形態では、対象に複数回の投与を行う頻度は、１日１用量である。特定の実施形態では、対象へ複数回の投与を行う頻度は、１日２用量である。特定の実施形態では、複数の用量が対象に投与される場合、複数回の投与の最初の投与と最後の投与との間の期間は、１日、２日、４日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、７年間、１０年間、１５年間、２０年間、または対象の生存期間である。特定の実施形態では、複数回投与のうちの最初の投与から最後の投与までの期間は、３ヶ月、６ヶ月、または１年である。特定の実施形態では、複数回の投与のうち最初の投与と最後の投与との間の期間は、対象の生存期間である。特定の実施形態では、複数回の投与を対象に行う頻度は、1週間に３用量である。
【0039】
また、以下に提供される実施例によれば、前記ヒアルロナンコンジュゲートは静脈内注射によって投与されるが、これは本発明がどのように実施され得るかについての例示に過ぎず、本開示はこれに限定されない。
【0040】
例えば、前記ヒアルロナンコンジュゲートは、医薬的に許容される賦形剤と共に、所望の投与様式に適した医薬組成物に処方され得る。ここに開示され、特許請求されている発明の概念に従って調製された特定の医薬組成物は、患者への経口、粘膜（例えば、鼻腔内、舌下、膣内、口腔内、または直腸）、非経口（例えば、皮下、静脈内、ボーラス注射、筋肉内、または動脈内）、硝子体内、または経皮投与に適した単一単位剤形である。剤形の例としては、錠剤；カプレット；軟ゼラチンカプセルのようなカプセル；カシェ剤；トローチ；ロゼンジ；分散剤；坐剤；軟膏；パップ剤（湿布）；ペースト；粉末；ドレッシング；クリーム；プラスター；溶液；パッチ；エアロゾル（例：鼻腔スプレーまたは吸入器）；ゲル；懸濁液（例：水性または非水性液体懸濁液、水中油型エマルジョン、または油中水型液体エマルジョン）、溶液、エリキシル剤などの患者への経口投与または粘膜投与に適した液体剤形；および患者への非経口投与に適した液体剤形を提供するために再構成することができる無菌固体（例えば、結晶性または非晶質固体）が挙げられるが、これらに限定されない。理解され得るように、これらの医薬組成物も本開示の範囲内である。
【0041】
本明細書で使用される「医薬的に許容可能な賦形剤」という用語は、１つの臓器または身体の一部から別の臓器または身体の一部へなどの、対象薬剤の運搬または輸送に関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、担体、溶媒、カプセル化材料などの医薬的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各賦形剤は、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容可能」でなければならない。医薬製剤は、本発明の化合物を、１つ以上の医薬的に許容される成分と組み合わせて含む。前記賦形剤は、固体、半固体または液体の希釈剤、クリームまたはカプセルの形態であり得る。これらの医薬製剤は、本発明のさらなる目的である。通常、活性化合物の量は、調製物の０．１～９５重量％、非経口用調製物ではこのましくは０．２～２０重量％、経口投与用調製物では好ましくは１～５０重量％である。本発明の方法の臨床使用のために、本発明の医薬組成物は、意図された投与経路に適した製剤に処方される。
【0042】
本明細書で使用されるＨＡコンジュゲートの「置換度（ＤＳ）」という用語は、前記ＨＡの二糖単位あたりに結合した置換基（すなわち、水素化ニメスリド）の平均比率である。本開示の様々な実施形態によれば、ヒアルロナンコンジュゲートは、０．５～３５％の置換度を有する。例えば、置換度は、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２.６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３.７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５. ７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６.８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８. ８、８.９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３５％である。
【0043】
本開示の特定の実施形態によれば、ヒアルロナンコンジュゲートは１０～３００キロダルトン（ｋＤａ）の平均分子量（ＭＷ）を有する。例えば、ＭＷは、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００ｋＤａである。平均分子は粘度計を用いて得られ、本開示の様々な実施形態によれば、前記ヒアルロナンコンジュゲートの粘度は、約０．１～１ｍ３／ｋｇ；例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１ｍ３／ｋｇである。本開示のいくつかの実施形態によれば、前記ヒアルロナンコンジュゲートは、２つの糖単位（すなわち、１つのヒアルロナンモノマー）または４つの糖単位（すなわち、２つのヒアルロナンモノマー）を含む。
【0044】
本明細書で使用する「ヒアルロン酸」（ＨＡ）（ヒアルロネートまたはヒアルロナンとも称される）という用語は、少なくとも１つの二糖単位、具体的にはＤ－グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからなるアニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンである（－４ＧｌｃＵＡβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－）。本開示のいくつかの実施形態では、前記ＨＡは、単一の二糖単位（すなわち、ＨＡ二糖）を含む。本開示のいくつかの実施形態では、前記ＨＡは、２つの二糖単位（すなわち、ＨＡ四糖）を含む。前記ＨＡの分子量は３７９ダルトン（Ｄａ）（単一の二糖単位）から数百万ダルトンの範囲に及ぶ可能性がある。ＨＡは、細胞表面のヒアルロナン媒介運動性のための受容体（ＲＨＡＭＭ）およびＣＤ４４との相互作用により、細胞の運動性や免疫細胞の接着に関与している。「ＨＡ誘導体」という用語は、ＨＡの１つ以上の二糖単位のヒドロキシル基、カルボキシル基、アミド基、またはアセチルアミノ基に任意の修飾を有するＨＡを指す。本開示の特定の実施形態によれば、前記ＨＡコンジュゲートは、金属塩、好ましくはアルカリ金属塩、より好ましくはナトリウム塩またはカリウム塩の形態である。
【0045】
本開示は、少なくとも部分的には、ＩＬ－６過剰発現マウスにおいて、前記ヒアルロナンコンジュゲートはＩＬ－６の発現レベル、ならびに下流メディエーターＣＣＬ２（または単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１））およびＣＸＣＬ１／２（またはケラチノサイト走化性ケモカイン、ヒト成長制御癌遺伝子（ＧＲＯ）のマウスホモログ）の発現を低下させることができるとの知見に基づくものである。したがって、本発明のヒアルロナンコンジュゲートはＩＬ－６の下流のシグナル伝達カスケードを遮断するために使用され得る。ＩＬ－６の遮断は、実験動物モデルと炎症に関連したヒトの病気の両方で有益であることが示されているので、本発明のヒアルロナンコンジュゲートを用いたＩＬ－６シグナリングの阻害は、通常は炎症に関連した合併症を予防または回復させることができる。
【0046】
本開示は、さらに、本発明のヒアルロナンコンジュゲートが、少なくともウイルス侵入を遮断することによって、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染を阻害するために使用され得るとの知見に基づく。本開示の様々な実施形態によれば、本発明のヒアルロナンコンジュゲートは、（１）ＩＬ－６依存性シグナル伝達カスケードを遮断することと（２）ウイルスの侵入を遮断することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染（コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を含む）の治療のために二重様式で作用し得る。
【0047】
上記に鑑みて、本開示は、本明細書に示されるヒアルロナンコンジュゲートを用いて炎症、特に肺炎症を治療するための方法を提案する。本開示のいくつかの実施形態は、前記ヒアルロナンコンジュゲートを用いて、肺炎症に関連する、または肺炎症に続発する症状もしくは状態を治療するための方法を対象とする。また、本明細書では、肺炎症の治療における前記ヒアルロナンコンジュゲートの使用、および前記治療目的のための医薬品の製造におけるその使用も提供される。医薬品（すなわち、前記ヒアルロナンコンジュゲートを含む医薬組成物）は、もちろん、本出願の範囲に含まれる主題である。
【0048】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を説明するため、および本発明を実施する当業者に役立つように提供される。これらの実施例は、いかなる方法であっても本発明の範囲を限定するとは決して見なされない。更なる詳細無しで、当業者は、本明細書の記載に基づき最大限に本発明を利用できるとされる。
【実施例】
【0049】
実施例１
【0050】
ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートの合成および特性評価
【0051】
（１）水素化ニメスリド（Ｈ－ＮＩＭ）の調製
市販のニメスリド（Ｎ－（４－ニトロ－２－フェノキシフェニル）メタンスルホンアミド）から水素化ニメスリド（Ｎ－（４－アミノ－２－フェノキシフェニル）メタンスルホンアミド、または４－アミノニメスリド）を合成した。簡単に説明すると、ニメスリド５００ｍｇを酢酸エチル２０ｍｌに完全に溶解させ、その溶液に触媒として５％Ｐｄ／Ｃ（パラジウム炭素）を２００ｍｇ添加した。攪拌を続けながら瓶から空気を抜き、１気圧までの水素ガスで空気を置換し、次いで２４時間攪拌して水素化ニメスリド（Ｈ－ＮＩＭ）を得た。
市販のニメスリド（Ｎ－（４－ニトロ－２－フェノキシフェニル）メタンスルホンアミド）から水素化ニメスリド（Ｎ－（４－アミノ－２－フェノキシフェニル）メタンスルホンアミド、または４－アミノニメスリド）を合成した。簡単に説明すると、ニメスリド５００ｍｇを酢酸エチル２０ｍｌに完全に溶解させ、その溶液に触媒として５％Ｐｄ／Ｃ（パラジウム炭素）を２００ｍｇ添加した。攪拌を続けながら瓶から空気を抜き、１気圧までの水素ガスで空気を置換し、次いで２４時間攪拌して水素化ニメスリド（Ｈ－ＮＩＭ）を得た。
【0052】
Ｈ－ＮＩＭの純度は、シリカゲル６０ Ｆ２５４でプレコートしたＴＬＣプレート上で２５４ｎｍの紫外線照射下、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて測定した。移動相：ヘキサン：酢酸エチル＝２：１であった。
【0053】
Ｐｄ／Ｃ触媒を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮し、残留溶媒を除去した。次いで、この水素化生成物をヘキサン－酢酸エチル（１：１）溶液に溶解し、シリカゲルカラムでさらに精製した。このカラムを溶出液（ヘキサン－酢酸エチル＝１：１）で溶出した。発色した画分を回収し、凍結乾燥した。 得られた生成物の濃度および構造は、それぞれＵＶおよびＮＭＲを使用して確認された。
【0054】
（２）ＮＩＭおよびＨＡのコンジュゲーション
ヒアルロン酸（平均分子量（ＭＷ）約９０～２００ｋＤａ）５０ｍｇを、２５ｍｌのｄ．ｄ．水に溶解させた。１－エチル－３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）２５．１ｍｇとＮ－ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）１５．１ｍｇを、１ｍｌのｄ．ｄ．水に混合し室温で５分攪拌した。Ｈ－ＮＩＭ３．６５ｍｇを、１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に溶解し、この溶液を、３分以内にシリンジを用いてＨＡ／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液にゆっくり滴下した。反応混合物を暗所にて室温で１２時間攪拌した後、ダイアライザーバッグ（ｄｉａｌｙｚｅｒ ｂａｇ）を用いて過剰のｄ．ｄ．水に対して２～３日間透析した（ＭＷＣＯ：３，５００Ｄａ）。次いで、保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を凍結乾燥し、ＮＩＭ－ＨＡ（ＣＡ１０２Ｎ）粉末を得た。
ヒアルロン酸（平均分子量（ＭＷ）約９０～２００ｋＤａ）５０ｍｇを、２５ｍｌのｄ．ｄ．水に溶解させた。１－エチル－３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）２５．１ｍｇとＮ－ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）１５．１ｍｇを、１ｍｌのｄ．ｄ．水に混合し室温で５分攪拌した。Ｈ－ＮＩＭ３．６５ｍｇを、１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に溶解し、この溶液を、３分以内にシリンジを用いてＨＡ／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液にゆっくり滴下した。反応混合物を暗所にて室温で１２時間攪拌した後、ダイアライザーバッグ（ｄｉａｌｙｚｅｒ ｂａｇ）を用いて過剰のｄ．ｄ．水に対して２～３日間透析した（ＭＷＣＯ：３，５００Ｄａ）。次いで、保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を凍結乾燥し、ＮＩＭ－ＨＡ（ＣＡ１０２Ｎ）粉末を得た。
【0055】
（３）ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートの特性評価
コンジュゲートの固有粘度（約０．２～０．６ｍ３／ｋｇ）は、欧州薬局方（ＨＡモノグラフＮ°１４７２）に規定された手順に従って測定され、固有粘度から計算されるコンジュゲートのＭＷは、約５３～２３１ｋＤａであった。サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱法（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）を用いて測定すると、分子量多分散指数は約２．５であった。
コンジュゲートの固有粘度（約０．２～０．６ｍ３／ｋｇ）は、欧州薬局方（ＨＡモノグラフＮ°１４７２）に規定された手順に従って測定され、固有粘度から計算されるコンジュゲートのＭＷは、約５３～２３１ｋＤａであった。サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱法（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）を用いて測定すると、分子量多分散指数は約２．５であった。
【0056】
コンジュゲート中のヒアルロン酸ナトリウムおよびニメスリドの含有量は、それぞれＰｈａｒｍｐｕｒ法ＰＰＣＡ０２５およびＰｈａｒｍｐｕｒ法ＰＰＣＡ０１７ ＳＥＣ／ＵＶのプロトコルを用いて分析し、その結果、乾燥ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート１gあたり少なくとも８００ｍｇのＨＡ含有量および少なくとも１５ｍｇのＮＩＭ含有量が存在することが示された。次に、ＨＡの二糖単位とＨ－ＮＩＭとの間のモル比に基づいて、コンジュゲートの置換度（ＤＳ）を測定した。ＤＳは約２．５％から５％であり、これは１，０００個の二糖単位に対して２５から５０個のＨ－ＮＩＭ分子が結合していることを意味する。
【0057】
（４）ＮＩＭ－ＨＡ二糖コンジュゲートの合成
Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンとの二糖単位（ＨＡ二糖）を、４－アミノニメスリドと反応させ、以下の構造を有するＮＩＭ－ＨＡ二糖コンジュゲートを得た。
Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンとの二糖単位（ＨＡ二糖）を、４－アミノニメスリドと反応させ、以下の構造を有するＮＩＭ－ＨＡ二糖コンジュゲートを得た。
【0058】
【化4】
【0059】
（５）ＮＩＭ－ＨＡ四糖コンジュゲートの合成
Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンとの２つの二糖単位（ＨＡ四糖）を、４－アミノニメスリドと反応させて、ＮＩＭ-ＨＡ４糖コンジュゲート（ＮＩＭ－テトラ）を得た。まず、５０ｍｇのＨＡ四糖（ＨＡ４）（０．０６４３７ｍｍｏｌ）を３ｍＬのＤＤＷに溶解させ、次いで、５ｍＬのＤＭＳＯをＨＡ４溶液に添加した。９．１ｍｇのＯｘｙｍａ（０．０６４３７ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、６分間攪拌しながらＨＡ４溶液に添加した。次に１７．９ｍｇのニメスリド－ＢＯＣ（０．０７０８１ｍｍｏｌ）を脱保護した後、０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解させ、ＨＡ４溶液に添加した。１４μＬのＤＩＣ（０．０９６５６ｍｍｏｌ）を、０．５ｍＬのＤＭＳＯに１分間攪拌下で溶解し、ＨＡ４溶液に添加した。最終反応混合物を室温で４８時間撹拌し、得られた溶液を３日間凍結乾燥した後、ＲＰ－ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ，１.０５５５９．０００１）で精製した。こうして合成されたＮＩＭ－テトラは以下の構造を有している。
Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンとの２つの二糖単位（ＨＡ四糖）を、４－アミノニメスリドと反応させて、ＮＩＭ-ＨＡ４糖コンジュゲート（ＮＩＭ－テトラ）を得た。まず、５０ｍｇのＨＡ四糖（ＨＡ４）（０．０６４３７ｍｍｏｌ）を３ｍＬのＤＤＷに溶解させ、次いで、５ｍＬのＤＭＳＯをＨＡ４溶液に添加した。９．１ｍｇのＯｘｙｍａ（０．０６４３７ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、６分間攪拌しながらＨＡ４溶液に添加した。次に１７．９ｍｇのニメスリド－ＢＯＣ（０．０７０８１ｍｍｏｌ）を脱保護した後、０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解させ、ＨＡ４溶液に添加した。１４μＬのＤＩＣ（０．０９６５６ｍｍｏｌ）を、０．５ｍＬのＤＭＳＯに１分間攪拌下で溶解し、ＨＡ４溶液に添加した。最終反応混合物を室温で４８時間撹拌し、得られた溶液を３日間凍結乾燥した後、ＲＰ－ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ，１.０５５５９．０００１）で精製した。こうして合成されたＮＩＭ－テトラは以下の構造を有している。
【0060】
【化5】
【0061】
実施例２
【0062】
担癌マウスのＰＧＩ２発現に対するＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートの効果
【0063】
ＣＴ２６腫瘍を担持するマウスを従来のプロトコルに従って作製し、腫瘍体積が２５～５０ｍｍ３に達した時点で、腫瘍を担持するマウスを無作為に４つの群：ビヒクル対照、５０ｍｇ／ｋｇ（当量１．３ｍｇ／ｋｇ Ｎｉｍ）ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート、１００ｍｇ／ｋｇ（当量２．６ｍｇ／ｋｇ Ｎｉｍ）ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートおよび２００ｍｇ／ｋｇ（当量５．２ｍｇ／ｋｇ Ｎｉｍ）ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートに分けた。ビヒクルまたは試験試料を、週３回、２週間にわたって静脈内注射した。
【0064】
体重および腫瘍体積を、週３回測定した。２週間の処置後、マウスを屠殺した。心臓穿刺により血液を採取し、血清を分離して－８０℃の冷蔵庫で保存した。腫瘍組織を、急速凍結によって収集した。血清組織を、その後の相関解析に利用した。
【0065】
マウス血清中のプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）レベルを、従来のプロトコルに従って測定した。図１に要約するように、結果は、５０、１００、または２００ｍｇ／ｋｇ（当量１．３、２．６および５．２ｍｇ／ｋｇ Ｎｉｍ）ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートの投与が、ビヒクル対照と比較して、統計的に有意にＰＧＩ２レベルを低下させることができることを示している。
【0066】
実施例３
【0067】
担癌マウスのＩＬ－６およびＩＬ－６下流ケモカイン発現に対するＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートの効果
【0068】
マウスは、上記実施例２に記載されたように取り扱った。腫瘍体積が２５～５０ｍｍ３に達したとき、腫瘍を担持するマウスを、６群：ビヒクル対照、５０ｍｇ／ｋｇ（当量１．３ｍｇ／ｋｇ Ｎｉｍ）ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート、１００ｍｇ／ｋｇ（当量２．６ｍｇ／ｋｇ Ｎｉｍ）ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート、２００ｍｇ／ｋｇ（当量５．２ｍｇ／ｋｇ Ｎｉｍ）ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート、１．５ｍｇ／ｋｇニメスリド、および５．３ｍｇ／ｋｇニメスリドに、無作為に割り付けた。ビヒクルまたは試験サンプルを、週２回、２週間にわたって静脈内注射した。
【0069】
ＩＬ－６および２つのＩＬ－６下流ケモカイン（ＫＣ／ＧＲＯおよびＭＣＰ－１）の血清レベルを、従来のプロトコルに従って測定した。図２に要約したように、結果は、５０ｍｇ／ｋｇ（当量１．３ｍｇ／ｋｇ Ｎｉｍ）ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートの投与が、ビヒクル対照と比較して、ＩＬ－６、ＫＣ／ＧＲＯおよびＭＣＰ－１の血清レベルを統計的に有意に低下させ得ることを示している。また、１００ｍｇ／ｋｇ（当量２．６ｍｇ／ｋｇ Ｎｉｍ）ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートの投与は、ビヒクル対照と比較して、ＩＬ－６およびＭＣＰ－１の血清レベルを有意に低下させることが可能である。一方、高濃度のＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート（２００ｍｇ／ｋｇ（当量５．２ｍｇ／ｋｇ Ｎｉｍ））の投与は、ＩＬ－６およびその下流のケモカインの血清レベルを低下させることができない。さらに、ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートの用量とＩＬ－６遮断効果との間に、用量依存性が認められた。さらに、ニメスリド単独の投与では、ＩＬ－６遮断に対する効果を引き出すことはできない。
【0070】
実施例４
【0071】
ＬＰＳ誘導Ａ５４９細胞におけるＩＬ－６レベルに対するＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートの効果
【0072】
本実施例では、Ａ５４９細胞（ヒト肺胞底部上皮細胞）を用いて、ＩＬ－６レベルに対する本発明のＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート（ＣＡ１０２Ｎ）の効果を評価した。
【0073】
６００μＬのＦ－１２Ｋ培地中のＡ５４９細胞を、２４ウェルあたり５×１０４の密度で播種し、一晩インキュベートした。翌日、培地を廃棄し、１μｇ／ｍＬ ＬＰＳに０、０．１、０．２、０．４、および０．８ｍｇ／ｍＬ ＣＡ１０２Ｎ（当量０、５．９、１１．８、２３．６および ４７．２μＭ）コンジュゲートまたは５μｇ／ｍＬ（１２．７μＭ）デキサメタゾンを含む新しい培地に置き換え、これを４８時間インキュベートした。その後、上清を３００μＬ採取し、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡｋｉｔ（カタログ番号８８－７０６６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＩＬ－６レベルを測定した。ＬＰＳで処置されていない細胞を陰性対照として使用し、ＬＰＳで処置されているがＣＡ１０２Ｎで処置されていない細胞を陽性対照として使用した。結果を図３に要約し、データを、平均値±標準偏差（ＳＤ）で表した。
【0074】
図３に要約されたデータは、ＬＰＳ誘導が、ＬＰＳ誘導のない陰性対照と比較して、ＩＬ－６レベルの有意な増加をもたらしたことを示す（＃、p＜０．０５）。また、本発明のＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート（ＣＡ１０２Ｎ）による処置は、細胞がＬＰＳ単独で処置された陽性対照群と比較して、ＬＰＳ処置された細胞におけるＩＬ－６レベルを実質的に減少させることもできる（＊、ｐ＜０．０５）。
【0075】
６００μＬのF－１２Ｋ培地中のＡ５４９細胞を２４ウェルあたり２×１０４の密度で播種し、一晩インキュベートした。翌日、培地を廃棄し、０．５μｇ／ｍＬ ＬＰＳに、０、４．９４、１４．８１、４４．４、１３３．３、４００μＭ ＮＩＭ－ＨＡ二糖コンジュゲートまたは１０μＭデキサメタゾンを含む新しい培地に交換し、４８時間インキュベートさせた。その後、上清３００μＬを回収し、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡｋｉｔ（カタログ番号８８－７０６６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＩＬ－６レベルを測定した。ＬＰＳで処置されていない細胞を陰性対照とし、ＬＰＳで処置されているがＮＩＭ－ＨＡ二糖コンジュゲートでは処置されていない細胞を陽性対照とした。結果を図４に要約し、データを、平均値±標準偏差（ＳＤ）で表した。
【0076】
図４に要約したデータは、ＬＰＳ誘導を行わない陰性対照と比較して、ＬＰＳ誘導がＩＬ－６レベルにおける有意な増加をもたらしたことを示している（＃、ｐ＜０．０５）。また、本発明のＮＩＭ－ＨＡ二糖コンジュゲートによる処置は、細胞をＬＰＳのみで処置した陽性対照群と比較して、ＬＰＳ処置細胞におけるＩＬ－６レベルを用量依存的に大幅に減少させることができる（＊、ｐ＜０．０５）
【0077】
実施例５
【0078】
ＬＰＳ誘発急性肺損傷マウスに対するＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートの効果
【0079】
この実施例では、ＬＰＳを使用してＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＮａｒｌマウスに急性肺損傷（ＡＬＩ）を誘発した。ＡＬＩに対する本発明のヒアルロナンコンジュゲートの効果を調べるために、肺損傷に関する様々な指標を調べた。
【0080】
簡単に説明すると、５～６週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＮａｒｌマウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（台湾、台北）から購入し、安定化のためにＣｈｕｎｇ ＳｈａｎＭｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＣＳＭＵ）Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（台湾、台中）で１週間飼育した。マウスはＬＰＳ処置の１２時間前に絶食させたが、水は自由に与えた。動物を、以下の５群：（１）ＷＴ群、ビヒクル対照（５０μＬ水のみ）；（２）ＬＰＳ群、偽対照（５０μＬ ＬＰＳのみ）；（３）ＬＰＳ＋Ｃ群、陽性対照（２ｍｇ／ｋｇメチルプレドニゾロン前処置／５０μＬ ＬＰＳ／２ｍｇ／ｋｇ メチルプレドニゾロン）；（４）ＬＰＳ＋Ｌ群、低用量のＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート（ＣＡ１０２Ｎ）処置（５０μＬ ＬＰＳ／２５ｍｇ／ｋｇ ＣＡ１０２Ｎ（当量０．５８ｍｇ／ｋｇニメスリド））、および（５）ＬＰＳ＋Ｍ群、中用量のＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート（ＣＡ１０２Ｎ）処置（５０μＬ ＬＰＳ／５０ｍｇ／ｋｇ ＣＡ１０２Ｎ（当量１．１６ｍｇ／ｋｇニメスリド））に、無作為に割り当てた（各群ｎ＝７）。
【0081】
群（１）については、マウスに５０μＬの水を気管内注射した。群（２）については、マウスに５０μＬのＬＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）を気管内注射した。群（３）については、マウスに２ｍｇ／ｋｇのメチルプレドニゾロンを摂取させ、１時間後に５０μＬのＬＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）をマウスに気管内注射して急性肺損傷を誘発し、ＬＰＳ注射の１時間後に２ｍｇ／ｋｇのメチルプレドニゾロンをマウスに経口摂取させた。（４）および（５）群については、５０μＬのＬＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）をマウスに気管内注射し；ＬＰＳ注射の１時間後に、各群のマウスに２５ｍｇ／ｋｇ ＣＡ１０２Ｎまたは５０ｍｇ／ｋｇ ＣＡ１０２Ｎを尾静脈ｉ．Ｖ．注射で与えた。
【0082】
ＬＰＳ注射の１８時間後に、マウスを頸椎脱臼により屠殺した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を１．５ｍｌのＰＢＳ洗浄液を用いて採取し、５００×ｇで４℃、５分間遠心分離してＢＡＬＦ上清を採取した。上清を、その後の分析のために－７０℃で保存した。
【0083】
屠殺後、肺を摘出し、直ちに湿重量を測定した。その後、肺を６５℃で４８時間乾燥させ、乾燥重量を測定した。肺浮腫の評価には、肺湿潤／乾燥比を算出した。サイトカイン分析には、ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＢＡＬＦ中のＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、およびＩＬ－６などの複数のサイトカインレベルを測定した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して測定した。
【0084】
図５に要約したデータは、ＬＰＳ処置が肺水腫に関連していることを示している。一方、免疫系を抑制し、炎症を減少させるために一般的に使用される副腎皮質ホルモン剤であるメチルプレドニゾロン、および低用量および中用量のＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート（ＣＡ１０２Ｎ）の処置は、ＬＰＳ群と比較して、肺水腫の範囲を効果的に減少させ（ｐ＜０．０５）、後者の２つの群は、より大きい効果を示している。
【0085】
図６Ａは、ＢＡＬＦにおける総タンパク質濃度を示し、一方、図６Ｂ～図６Ｄは、ＢＡＬＦにおけるＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、およびＩＬ－６のレベルをそれぞれ示している。図６Ａに見られるように、ＬＰＳ処置マウスでは、ＷＴビークル対照群と比較して、総タンパク質濃度が有意に増加する。メチルプレドニゾロン、低用量、または中用量のＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート（ＣＡ１０２Ｎ）の投与は、ＬＰＳ群の結果と比較して、統計的に有意な程度に総タンパク質濃度を減少させた（ｐ＜０．０５）。なお、ＬＰＳ＋Ｍ群（中用量のＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート（ＣＡ１０２Ｎ）で処置したマウス）の総タンパク質濃度は、ＬＰＣ＋Ｃ群（メチルプレドニゾロンで処置したマウス）の総タンパク質濃度よりもわずかに低い値であった。
【0086】
ＬＰＳ誘導により、ＢＡＬＦにおけるＴＮＦ－α（図６Ｂ）、ＩＬ－１β（図６Ｃ）、ＩＬ－６（図６Ｄ）のレベルが上昇するが、対照薬（メチルプレドニゾロン）および低用量または中用量のＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート（ＣＡ１０２Ｎ）の投与はＬＰＳ群と比較してＢＡＬＦにおけるこれらのサイトカインの発現レベルを低下させ、いくつかの群は統計的有意性を示している（ｐ＜０．０５）。低用量ＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート（ＣＡ１０２Ｎ）での処置は、メチルプレドニゾロンの効果と比較して、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１β発現に対してより優れた阻害を示すことが注目される。
【0087】
要約すると、本開示の実施例１～５で提供される結果は、本発明のＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート（ＣＡ１０２Ｎ）が、ＩＬ－６依存性シグナル伝達カスケードを効果的に遮断し得ることを示す。さらに、本開示は、そのような効果を引き出すのに十分な用量を提案した。
【0088】
実施例６
【0089】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス侵入に対するＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートおよびＮＩＭ－テトラコンジュゲートの効果
【0090】
ヒトＡＣＥ２遺伝子を安定に発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補充）において様々な濃度の試験化合物（ニメスリド、ＮＩＭ－テトラ、ＣＡ１０２Ｎ、ＨＡ、およびＨＡ四糖（テトラ））で前処置し、３７℃で１時間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似型レンチウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス）と共培養した。次いで、感染後６時間または１６時間で培養液を新鮮なＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補充）に交換した。その上、ＣＡ１０２Ｎ（プレインキュベーション）群では、まず１０００ＴＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型レンチウイルスをＤＭＥＭ中で様々な濃度のＣＡ１０２Ｎで３７℃、１時間前処置し、その後、６時間または１６時間、ＨＥＫ－２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞とコインキュベートした。擬似型レンチウイルスに感染しておらず、被験物質に曝されていないＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を陰性対照（ＮＣ）とし、擬似型レンチウイルスに感染しているが被験物質に曝されていないＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、陽性対照（ＰＣ）として使用した。さらに４８時間連続培養した後、ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｒｉｇｈｔ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を行い、化合物なしの対照に対する試験化合物存在下のルシフェラーゼリードアウト（ＲＬＵ）の損失率として、以下の式で表すことができる阻害率を算出した。
阻害％＝[（ＲＬＵ対照－ＲＬＵ血清）／ＲＬＵ対照]×１００％。
図７Ａおよび７Ｂ（侵入遮断：６時間）および図８Ａおよび８Ｂ（侵入遮断：１６時間）は、ＲＬＵおよび阻害％の両方の結果を示している。
阻害％＝[（ＲＬＵ対照－ＲＬＵ血清）／ＲＬＵ対照]×１００％。
図７Ａおよび７Ｂ（侵入遮断：６時間）および図８Ａおよび８Ｂ（侵入遮断：１６時間）は、ＲＬＵおよび阻害％の両方の結果を示している。
【0091】
図７Ａおよび７Ｂに要約された実験データは、ニメスリド単独では、ウイルスの侵入を阻止することによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス感染を阻害できないことを示している。対照的に、ＮＩＭ－テトラ、ＣＡ１０２Ｎ、ＨＡ、およびＨＡ四糖は、感染後最初の６時間において、いくつかの試験した濃度で、少なくとも５０％の阻害を達成する。特に、ＮＩＭ－テトラは、用量依存的に所望のウイルス抑制効果を示す。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルスをＣＡ１０２Ｎと６時間プレインキュベートした場合、約４０～６０％のウイルス侵入を阻害することができる。
【0092】
図８Ａおよび８Ｂに要約した実験データは、ニメスリド単独では、ウイルスの侵入を遮断することによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス感染を阻害できないことを示している。その上、ＨＡ四糖は、感染後最初の１６時間において、全ての試験した濃度でわずかな阻害（５０％未満の阻害）しか示さない。また、ＣＡ１０２ＮとＨＡは共に、最高試験用量で５０％を超える阻害を達成した。一方、ＮＩＭ－テトラは、用量依存的に所望のウイルス阻害を発現する。同様に、SＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルスを最高試験用量のＣＡ１０２Ｎと１６時間プレインキュベートした場合、５０％の阻害が達成される。
【0093】
実施例７
【0094】
細胞生存率に対するＮＩＭ－テトラコンジュゲートの効果
【0095】
ヒトＡＣＥ２遺伝子を安定に発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補充）中で様々な濃度の試験化合物（ＮＩＭ－テトラおよびＨＡ四糖）で３７℃にて前処置した。６時間または１６時間後、培養液を新しいＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補充）に交換し、さらに４８時間連続培養した後に細胞生存率測定（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ商標 ａｌａｍａｒＢｌｕｅ商標試薬）を実施した。その後、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬を添加し、５６０ｎｍの励起光と５９０ｎｍの発光でレゾルフィンの蛍光を測定した。データは、ビヒクル処置したウェルから得られたシグナルが１００％の生細胞に相当すると仮定して正規化し、細胞生存率は、以下の式で表すことができる。
細胞生存率％＝[（実験ＲＦＵ－ブランクＲＦＵ）／（対照ＲＦＵ－ブランクＲＦＵ）]×１００％。
９Ａおよび９Ｂは、ＮＩＭ－テトラまたはＨＡ四糖で６時間または１６時間処置した後の細胞生存率を示している。
細胞生存率％＝[（実験ＲＦＵ－ブランクＲＦＵ）／（対照ＲＦＵ－ブランクＲＦＵ）]×１００％。
９Ａおよび９Ｂは、ＮＩＭ－テトラまたはＨＡ四糖で６時間または１６時間処置した後の細胞生存率を示している。
【0096】
【0097】
実施例８
【0098】
ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス感染に対するＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートの効果
【0099】
８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＢｉｏＬＡＳＣＯ ＴａｉｗａｎＣｏ．，Ｌｔｄから購入）を１～２週間、実験室ハウジングに順応させた。順応後、マウスに２００μｌの試験試料（ＣＡ１０２Ｎ ２：２ｍｇ／ｋｇ相当のニメスリド、ＣＡ１０２Ｎ ４：４ｍｇ／ｋｇ相当のニメスリド、またはニメスリド４：４ｍｇ／ｋｇのニメスリド）を1時間かけて静脈内注射し、続いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス（１０＾１０ＰＦＵ／マウス）を気管内注入した。感染２４時間後にルシフェリン１００μlをマウスに腹腔内投与により与え、肺でのルミネセンス・シグナルをＩＶＩＳ登録商標 ＳｐｅｃｔｒｕｍＩｎ ＶＩＶＯＩｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ.）で検出および分析した。露光時間は１分であった。偽型レンチウイルスに感染しておらず、被験物質に曝されていないマウスを、陰性対照（ＨＣ群）とした。一方、陽性対照（ウイルス群）として、偽型レンチウイルスに感染しているが被験物質に曝されていないマウスを用いた。
【0100】
図１０Ａおよび１０Ｂに要約されたデータは、ニメスリド、ＣＡ１０２Ｎ ２およびＣＡ１０２Ｎ ４群において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルス感染が、陽性対照と比較して有意に阻害されることを示している（クラスカル・ウォリス検定およびポアソン回帰分析；p＜０．０５）。さらに分析したところ、ＣＡ１０２Ｎ ２またはＣＡ１０２Ｎ ４とニメスリド４との間に統計的な差は見られなかった。一方、ＨＡ群と陽性対照との間には有意な差はない。
【0101】
実施例９
【0102】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス減少に対するＮＩＭ－テトラコンジュゲートの効果
【0103】
Ｖｅｒｏ Ｂ６細胞を、ウェル当たり１０５細胞数の密度で、４８ウェルプレートに播種した。薬剤（３．１３μＭおよび１２．５μＮｉｍ－テトラおよび２．５μＭレムデシビル；ｎ＝４）を、１００μｌのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルス含有培地（ＭＯＩ＝０．０３）と共に１時間プレインキュベートし、次いで、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞の培地を除去してから各ウェル中に添加した。対照群は、（１）バックグラウンド対照（細胞なし）、（２）正規化のための模擬（ｍｏｃｋ）感染対照（細胞は培地のみで処置）、（３）ウイルス対照（細胞はウイルスのみで処置）であった。細胞を１時間インキュベートした。次いで、培地（薬剤およびウイルスと共に）を除去し、各ウェルの細胞を、３７℃に予熱したＰＢＳで３回洗浄した。各ウェル（対照以外）を２００μlの薬剤希釈液で２４時間インキュベートし、各ウェルの上清を採取してウイルスｑＲＴ－ＰＣＲを行い、ウイルスＣｔ値を測定した。ウイルスＣｔ値は、Ｃｔ対ウイルスコピーの既知の標準曲線（ｓｔａｎｄ ｃｕｒｖｅ）を用いて、１ｍｌあたりのウイルスコピー数で表した。
【0104】
その結果、図１１に要約したように、Ｎｉｍ－テトラ（Ｎｉｍ－ＨＡ４）は３．１３および１２．５Ｍでウイルスコピーを減少させ、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞における１２．５μＭ Ｎｉｍ－テトラの処置は、ウイルス対照群と比較して、統計的に有意なレベルまでウイルスコピーを有効に減少させることが示された。また、１２．５μＭ Ｎｉｍ－テトラの処置が２．５Ｍレムデシビルと同等（やや良好）のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルス感染抑制効果を示すことが、わかった。
【0105】
要約すると、本開示の実施例６～９で提供される結果は、本発明のＮＩＭ－ＨＡコンジュゲート（ＣＡ１０２ＮまたはＮｉｍ－テトラのいずれか）が、少なくともウイルスの侵入を遮断することによって、ウイルス感染を有効に阻害し得ることを示している。さらに、本開示は、そのような効果を引き出すのに十分な用量を提案した。
【0106】
本開示は、本ＮＩＭ-ＨＡコンジュゲートが、（１）ＩＬ－６依存性シグナル伝達カスケードを遮断し、（２）ウイルス侵入を遮断することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染（コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を含む）を処置するための二重様式で機能し得ることを立証している。先行研究では、ニメスリドが肝毒性と有意に関連していることが示された。本明細書に示された実験データは、本発明のＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートが、実質的に同様のｉｎ ｖｉｖｏ効果を達成しながら、ニメスリドの用量の半分の用量で与えられ得ることを示す。また、本発明のＮＩＭ－ＨＡコンジュゲートは、従来のニメスリドと比較して、血清半減期が長く、治療効果をさらに高めることができるという利点もある。
【0107】
上記した実施形態の記載は例示としてのみ行われ、様々な改変が当業者により行われ得ることが理解されるであろう。上記した明細書、実施例およびデータは、本発明の例示的実施形態の構造および使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態を、ある程度の特殊性によりまたは１つ以上の個別の実施形態に関して記載したが、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、当業者は、開示された実施形態に対して多数の変更を行うことができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【手続補正書】
【提出日】2022-10-31
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
治療を必要とする対象の肺炎症を治療するための医薬組成物であって、有効量のヒアルロナンコンジュゲート、および、医薬的に許容される賦形剤を含み、
前記ヒアルロナンコンジュゲートが、以下の構造
【化1】
【請求項2】
前記対象が、ヒトである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記肺炎症が、急性肺炎症または慢性肺炎症である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記急性肺炎症が、肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、または、急性肺損傷（ＡＬＩ）により引き起こされるか、または、それらに関連する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記肺炎が、細菌感染、ウイルス感染、または、寄生虫感染によって引き起こされる、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記細菌感染が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、または、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）により引き起こされ、前記ウイルス感染が、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、または、コロナウイルスによって引き起こされ、かつ、
前記寄生虫感染が、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、または、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）によって引き起こされる、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記慢性肺炎症が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、肺線維症、または、特発性肺線維症（ＩＰＦ）によって引き起こされるか、または、それらに関連している、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記肺炎症が、過敏性肺炎である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記ヒアルロナンコンジュゲートが、１０～２０００キロダルトンの平均分子量（ＭＷ）を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記ヒアルロナンコンジュゲートが、以下の構造【化2】
【請求項12】
前記ヒアルロナンコンジュゲートが、以下の構造【化3】
【請求項13】
前記ヒアルロナンコンジュゲートが、０．５％～３５％の置換度を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項14】
以下の構造【化4】
【請求項15】
有効量の、請求項１４に記載のヒアルロナンコンジュゲート、および医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項16】
以下の構造【化5】
【請求項17】
有効量の、請求項１６に記載のヒアルロナンコンジュゲート、および医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【国際調査報告】