特表 2023-524112 唾液におけるウイルス検査

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-08

(54)【発明の名称】唾液におけるウイルス検査

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20230601BHJP

   C12Q 1/70 20060101ALI20230601BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20230601BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20230601BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20230601BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230601BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230601BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z

C12Q1/70

C12Q1/6851 Z

G01N33/50 P

G01N33/68

G01N33/53 N

G01N33/53 D

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022566675

(86)(22)【出願日】2021-04-29

(85)【翻訳文提出日】2022-12-22

(86)【国際出願番号】 US2021029897

(87)【国際公開番号】W WO2021222569

(87)【国際公開日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】63/017,354

(32)【優先日】2020-04-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522426364

【氏名又は名称】ルー， シ－ロン

(71)【出願人】

【識別番号】522426423

【氏名又は名称】ハリー， ブライアン エル．

(71)【出願人】

【識別番号】522426434

【氏名又は名称】セバージョス， ホセ ピー．

(71)【出願人】

【識別番号】522426467

【氏名又は名称】ブロムクイスト， ロバート イー．

(71)【出願人】

【識別番号】522426478

【氏名又は名称】ヤオ， シン

(71)【出願人】

【識別番号】522426489

【氏名又は名称】チウ， ユエ

(71)【出願人】

【識別番号】522426490

【氏名又は名称】タラカン， マーシャ ティー．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ルー， シ－ロン

(72)【発明者】

【氏名】ハリー， ブライアン エル．

(72)【発明者】

【氏名】セバージョス， ホセ ピー．

(72)【発明者】

【氏名】ブロムクイスト， ロバート イー．

(72)【発明者】

【氏名】ヤオ， シン

(72)【発明者】

【氏名】チウ， ユエ

(72)【発明者】

【氏名】タラカン， マーシャ ティー．

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045CB07

2G045DA13

2G045DA36

4B063QA01

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ10

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR39

4B063QR48

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS33

4B063QX02

(57)【要約】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むウイルスの唾液ベースの検査が提供される。単純な収集法は、自宅での収集を可能にし、従来の試験方法を使用する医療従事者に対するリスクおよび負担を低減する。試験は、ウイルス負荷を評価するためにウイルス核酸を、ならびに疾患進行および潜在的免疫を追跡するためにウイルス特異的抗体を、ともに定量的に分析し得る。本発明の組成物および方法は、ウイルス病原体のための唾液ベースの検査を提供する。本発明の検査は、ウイルス感染および唾液中のウイルス抗体の存在の検出を可能にし、それによって、個人が、医療従事者の助力なしに、自己検査することを可能にする。本発明は、高感度で特異的なウイルス監視を提供すると同時に、職員、装置および時間に関して効率を生じる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ウイルス感染を検出する方法であって、前記方法は、
患者に由来する唾液サンプルを提供する工程；
１またはこれより多くのアッセイを実施して、前記唾液サンプル中でウイルス核酸および／またはウイルス特異的抗体もしくは抗原を検出する工程；ならびに
前記唾液サンプル中で、前記ウイルス核酸、または前記ウイルス特異的抗体もしくは抗原を検出した際に、前記ウイルスに感染したと前記患者を診断する工程、
を包含する、方法。

【請求項2】

前記ウイルスは、呼吸器系ウイルスである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ウイルスは、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、コロナウイルス科、パルボウイルス科、およびエンテロウイルス属からなる群より選択されるメンバーである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ウイルスは、重症急性呼吸器症候群の原因ウイルスである、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記実施する工程は、アッセイを実施して、前記唾液サンプル中のウイルス核酸およびウイルス特異的抗体を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記実施する工程は、前記唾液サンプルに由来する核酸に対して、ウイルス核酸に対して特異的なプライマーを使用してＰＣＲを実施する工程を包含する、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記ウイルス核酸特異的プライマーは、Ｎ遺伝子、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子およびＥ遺伝子のうちの１またはこれより多くを標的化する、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ウイルス核酸を定量化する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記定量化する工程は、Ｑ－ＰＣＲを実施する工程を包含する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ＰＣＲは、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）である、請求項７に記載の方法。

【請求項12】

前記ｄＰＣＲは、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

ウイルス核酸の定量化に基づいて前記感染の重篤度を決定する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

逐次的な時点で前記患者から得られた複数の唾液サンプル中のウイルス核酸量を比較する工程、および前記ウイルス核酸量の経時的な増大または減少に基づいて、疾患進行を決定する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。

【請求項15】

前記ウイルス核酸量に基づいて処置の臨床上の経過を評価する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。

【請求項16】

前記処置の臨床上の経過は、挿管、ＩＣＵ入室、退院、挿管までの時間、退院までの時間、および死亡からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記ウイルス特異的抗体は、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記ウイルス特異的抗体は、ＩｇＡ抗体およびＩｇＧ抗体を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ウイルス特異的抗体を定量化する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。

【請求項20】

前記ウイルス特異的ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体の量に基づいて、処置の臨床上の経過を評価する工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記処置の臨床上の経過は、挿管、ＩＣＵ入室、退院、挿管までの時間、退院までの時間、および死亡のうちの１またはこれより多くから選択される、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記唾液サンプル中の全ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体に対してウイルス特異的ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体の量を正規化する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。

【請求項23】

前記アッセイは、イムノアッセイを包含する、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

前記イムノアッセイは、生体マーカーベースのアッセイである、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記生体マーカーベースのイムノアッセイは、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ビーズベースのアッセイ、発光アッセイ、金属結合イムノソルベントアッセイ、またはポイントオブケアイムノクロマトグラフィーアッセイである、請求項２４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２０年４月２９日出願の米国仮特許出願第６３／０１７，３５４号（その内容は、本明細書に参考として援用される）の利益および優先権を主張する。

【0002】

発明の分野
本発明は、体液中のウイルスを検出するための組成物および方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

背景
早期のかつ信頼性の高いウイルス監視は、ウイルス病原体の市中感染を制御するにあたって極めて重要である。例えば、信頼性の高い検査がないことで、２０１９年の新型コロナウイルスパンデミックへの反応が妨げられた。ＦＤＡ緊急使用許可（ＥＵＡ）に伴って、米国でのＣＯＶＩＤ－１９検査の大部分は、鼻咽頭スワブを利用する。鼻咽頭での収集は侵襲性であり、技術的に困難があり、３０～４０％に迫る高い偽陽性率が報告されている。

【0004】

大部分のウイルス検査は、かなりの技術的ノウハウを必要とし、医療専門家によって施されなければならない。感染していると疑われる何人も、彼らの自宅を離れなければならず、少なくとも、検査を施す医療従事者と接触しなければならない。よって、従来の検査は、ウイルスを拡げるリスクがあり、個人防護具を含む資源の不足を引き起こす。

【0005】

ウイルス検査の普及に付随する資源制約に鑑みれば、拡がってしまったウイルス病原体の拡がりを制限するために、迅速で、便利、安全な、かつ信頼性の高い検査は、当該分野で必要である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

発明の要旨
本発明の組成物および方法は、ウイルス病原体のための唾液ベースの検査を提供する。本発明の検査は、ウイルス感染および唾液中のウイルス抗体の存在の検出を可能にし、それによって、個人が、医療従事者の助力なしに、自己検査することを可能にする。本発明は、高感度で特異的なウイルス監視を提供すると同時に、職員、装置および時間に関して効率を生じる。

【0007】

本発明は、呼吸器ウイルス感染を検出するために特に有用である。上部呼吸・消化器道（ａｅｒｏｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ）のためのレザバとして、唾液は、ウイルスの存在およびウイルス負荷の両方の評価のための良好な代表的サンプリングを提供する。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに関して、近年の研究から、唾液中のウイルス濃度が試験される体液の中で最高のもののうちに入ることが見出された。Ｔｏ ＫＫ， Ｔｓａｎｇ ＯＴ， Ｃｈｉｋ－Ｙａｎ Ｙｉｐ Ｃ，ら， ２０２０， Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ ｓａｌｉｖａ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ： ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ； Ｗａｎｇ Ｗ， Ｘｕ Ｙ， Ｇａｏ Ｒ，ら， ２０２０， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ， ＪＡＭＡを参照のこと；これらの各々の内容は、本明細書に参考として援用される。

【0008】

唾液は、患者が自宅で自己収集できるので、医療従事者との直接的な接触の必要性および疾患伝播の関連するリスクを回避することができる。本発明の組成物および方法は、唾液中でウイルス核酸を検出するために有用である。好ましい実施形態において、本発明の方法は、唾液中のウイルス核酸を増幅および検出するために、ＰＣＲの使用を含む。

【0009】

好ましい実施形態において、デジタルＰＣＲおよび特に液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が、ウイルス核酸（ウイルスのタイプに依存して、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を検出するために、唾液サンプルに対して実施される。デジタルＰＣＲまたは定量的蛍光標識ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のような定量的方法は、感染を診断するためのみならず、ウイルス負荷を定量化し、検査される患者の疾患予後および進行に関する貴重な情報を提供するためにも使用され得る。デジタルＰＣＲは、ｑＰＣＲより高い感度を提供し得るので、好ましい。ＮＰＳサンプルでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関するｄｄＰＣＲ検査の近年の研究は、有望であることが示されており、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分析と比較して、高い感度および正確度と、低減された偽陰性報告とを実現している。Ｔａｏ Ｓ，ら， ２０２０， ｄｄＰＣＲ： ａ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｏｗ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ， ｍｅｄＲｘｉｖ （ｐｒｅｐｒｉｎｔ） ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０２．２９．２００２９４３９； Ｄｏｎｇ， Ｉら， ２０２０， Ｈｉｇｈｌｙ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｂｙ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ． ｍｅｄＲｘｉｖ （ｐｒｅｐｒｉｎｔ） ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０３．１４．２００３６１２９を参照のこと；これらの各々の内容は、本明細書に参考として援用される。

【0010】

ある特定の実施形態において、スクリーニング正確度は、唾液中の抗体検査の追加によって補われ得る。１つの唾液サンプル中で２種の異なる方法（核酸および抗体検出）を使用してウイルスを検出できる能力は、自分で施され得る堅固かつ正確な検査を提供する。具体的には、本発明の組成物および方法は、ウイルス特異的ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体（粘膜分泌物中に存在することが公知）を検出し、粘膜（ＩｇＡ）および全身（ＩｇＧ）の両方の免疫の貴重なメトリック（metric）を提供するために使用され得る。ＰＣＲベースのウイルス検出および「唾液血清学（ｓａｌｉｖａ ｓｅｒｏｌｏｇｙ）」（抗体検出）の本発明の組み合わせは、１つの唾液サンプルから診断情報を最大化し、現在の感染および過去の曝露の両方ならびに免疫を検出するにあたって有用なツールを提供する。よって、本発明の検査は、さらなる伝播のリスクを最小限にしながら、疾患曝露、感染、および潜在的免疫に関する詳細な情報を提供することによって、ソーシャルディスタンスの要件を緩和することにいて貴重な役割を果たし得る。

【0011】

ある特定の実施形態において、ウイルス負荷および／または抗体の定量化は、疾患進行に関する情報を提供し、挿管、ＩＣＵ入室、退院、および死亡の確率のような転帰、ならびに挿管、ＩＣＵ入室、または退院までの時間を推測するために、患者サンプル中で長期的にモニターされる。ベッド、材料、または装置が不足している場合、上記の転帰の確率およびタイミングを推測する能力は、患者の入院および処置の割り当ておよび計画の助けになり得る。

【0012】

本発明の方法は、呼吸器系ウイルスが唾液および唾液腺組織（ｓａｌｉｖａｒｙ ｔｉｓｓｕｅ）中に存在するという事実を利用する。よって、本発明は、任意の呼吸器系ウイルス（パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、コロナウイルス科、パルボウイルス科、およびエンテロウイルス属（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーが挙げられるが、これらに限定されない）の検出に適用可能である。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、唾液における定量的ＲＴ－ＰＣＲによるＨＰＶ定量化を示す。

【図2】図２は、１日間、３日間、および７日間の時間にわたって、種々の温度で貯蔵される唾液中のＤＮＡ安定性を示す。

【図3】図３は、唾液および鼻スワブサンプルに関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ１領域を標的化するプライマー－プローブセットでのｑＰＣＲのＣｔ値を示す。

【図4】図４は、唾液および鼻スワブサンプルに関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ２領域を標的化するプライマー－プローブセットでのｑＰＣＲのＣｔ値を示す。

【図5】図５は、唾液および鼻スワブサンプルに関する内部コントロールである宿主遺伝子リボヌクレアーゼＰ（RNP）のＣｔ値を示す。

【図6】図６は、抽出なしの唾液および抽出した鼻スワブサンプルに関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ１領域を標的化するプライマー－プローブセットでのｑＰＣＲのＣｔ値を示す。

【図7】図７は、抽出なしの唾液および抽出した鼻スワブサンプルに関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ２領域を標的化するプライマー－プローブセットでのｑＰＣＲのＣｔ値を示す。

【図8】図８は、抽出なしの唾液および抽出した鼻スワブサンプルに関する内部コントロールである宿主遺伝子リボヌクレアーゼＰ（RNP）のＣｔ値を示す。

【図9】図９は、Ｎ１標的化プライマーを使用する、低い、中程度の、および高いウイルス負荷に関して決定される場合の、鼻スワブおよび唾液サンプルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコピー／μＬを示す。

【図10】図１０は、Ｎ２標的化プライマーを使用する、低い、中程度の、および高いウイルス負荷に関して決定される場合の、鼻スワブおよび唾液サンプルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコピー／μＬを示す。

【図11】図１１は、Ｎ１領域標的化プライマーを使用して、ｑＰＣＲ検査から得られたＣｔ値と、同じ鼻スワブサンプルに対して実施されたｄｄＰＣＲを使用して得られたコピー／μＬ値とを比較する。

【図12】図１２は、Ｎ２領域標的化プライマーを使用して、ｑＰＣＲ検査から得られたＣｔ値と、同じ鼻スワブサンプルに対して実施されたｄｄＰＣＲを使用して得られたコピー／μＬ値とを比較する。

【図13】図１３は、ＲＰＰ３０標的化プライマーを使用して、ｑＰＣＲ検査から得られたＣｔ値と、同じ鼻スワブサンプルに対して実施されたｄｄＰＣＲを使用して得られたコピー／μＬ値とを比較する。

【図14】図１４は、Ｎ１領域標的化プライマーを使用して、ｑＰＣＲ検査から得られたＣｔ値と、同じ唾液サンプルに対して実施されたｄｄＰＣＲを使用して得られたコピー／μＬ値とを比較する。

【図15】図１５は、Ｎ２領域標的化プライマーを使用して、ｑＰＣＲ検査から得られたＣｔ値と、同じ唾液サンプルに対して実施されたｄｄＰＣＲを使用して得られたコピー／μＬ値とを比較する。

【図16】図１６は、ＲＰＰ３０標的化プライマーを使用して、ｑＰＣＲ検査から得られたＣｔ値と、同じ唾液サンプルに対して実施されたｄｄＰＣＲを使用して得られたコピー／μＬ値とを比較する。

【図17】図１７は、Ｎ１領域標的化プライマーを使用する鼻スワブサンプルの対になったｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲを比較する回帰モデリングを示す。

【図18】図１８は、Ｎ２領域標的化プライマーを使用する鼻スワブサンプルの対になったｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲを比較する回帰モデリングを示す。

【図19】図１９は、ＲＮＰコントロールプライマーを使用する鼻スワブサンプルの対になったｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲを比較する回帰モデリングを示す。

【図20】図２０は、Ｎ１領域標的化プライマーを使用する唾液サンプルの対になったｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲを比較する回帰モデリングを示す。

【図21】図２１は、Ｎ２領域標的化プライマーを使用する唾液サンプルの対になったｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲを比較する回帰モデリングを示す。

【図22】図２２は、ＲＮＰコントロールプライマーを使用する唾液サンプルの対になったｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲを比較する回帰モデリングを示す。

【図23】図２３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者における唾液および鼻スワブサンプルの長期的検査の比較を示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

詳細な説明
本発明の組成物および方法は、唾液中でのウイルス検出に関する。詳細には、過去のまたは現在のＣＯＶＩＤ－１９感染に関する核酸分析（例えば、ｄｄＰＣＲを介して）および抗体検査（例えば、ＩｇＡおよびＩｇＡ検査）のうちの１またはこれより多くのものが企図される。自己収集した唾液サンプルからの核酸プロファイリングおよび「唾液血清学」分析の両方を通じて、堅固な定量化された情報を提供する能力は、医療従事者による施与を必要とする検査と関連する伝播リスクを回避しながら、現在の検査より正確な、従って使えるデータを提供する。

【0015】

本発明の検査は、任意のウイルス感染を検出するために使用され得る。プライマーおよび方法（例えば、ＲＮＡ検出のための逆転写および増幅）は、ＰＣＲ法を使用して唾液中で検出するためのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスの特異的配列を標的化するために選択され得る。検査は、例えば、ＲＳＶ、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＨＰＶ、ＨＩＶ、肝炎、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ライノウイルス、およびアデノウイルスを標的化し得る。種々の実施形態において、複数の異なる抗体アッセイおよびプライマーセットが、多数のウイルスの存在を検出するために、１つの唾液サンプルに対して多重分析において使用され得る。ある特定の実施形態において、本発明の検査は、唾液がウイルス物質の顕著なレザバであり得る呼吸器感染または粘膜感染と関連するウイルスを検出するために使用され得る。本発明の検査は、コロナウイルス核酸およびコロナウイルス特異的抗体を検出するために標的化され得る。ＰＣＲベースの検出のための例示的なコロナウイルスプライマー標的としては、Ｎ遺伝子、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子およびＥ遺伝子の中の配列が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明の検査は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的化し、現在のまたは過去のＣＯＶＩＤ－１９感染を検出し、その処置をモニターするために使用され得る。

【0016】

本発明の顕著な利点は、患者の進行をステージ分類し、追跡する、患者転帰を推測する、および種々の治療的処置に対する応答を判断する（gauge）ために使用され得るウイルス負荷および抗体産生の定量的分析を提供する能力である。ウイルス負荷および抗体レベルは、疾患進行を追跡するために、経時的に収集されたサンプル中で追跡され得る、および／または転帰の推測を補助するために標準的な閾値レベルに対して比較され得る。閾値レベルは、以前の患者のプールから決定され得、共通の人口統計、病歴、および他の測定基準に基づいて、患者に調整され得る。レベルは、種々の実施形態において正規化され得る。例えば、ウイルス特異的抗体に関するＩｇＡおよび／またはＩｇＧ抗体レベルは、唾液サンプル中で検出される全てのＩｇＡおよび／またはＩｇＧ抗体に対して正規化され得る。

【0017】

唾液サンプルは、例えば、提供される滅菌容器へと唾液を吐き出させることによって、患者から収集され得る。簡単な指示とともに、患者は、医療従事者を訪れる必要性なしに、隔離下にありながら必要とされる唾液サンプルを提供し得る。ボックスまたは封筒が滅菌容器および指示とともに提供されてもよい。その結果、患者は、サンプルを提供し、その容器を密封した後に、その容器を検査のための研究室へと移送し得る。次いで、以下で考察される核酸および／または抗体アッセイは、最小限の曝露リスクで制御された検査状況において実施され得る。不足しているＰＰＥ装置および医療職員資源は、よって保護され得る。

【0018】

本発明の検査は、現在の感染、過去の感染、疾患の重篤度およびステージ分類、ならびに転帰推測のための検査を含む複数の適用を有する。さらなる適用としては、妊婦のための垂直伝播リスクを評価する検査、および潜在的血液ドナーのための水平伝播リスクを評価する検査が挙げられ得る。

【0019】

核酸分析
本発明の検査は、患者から収集された唾液サンプル中のウイルス核酸のＰＣＲベースの分析を含み得る。単純なＰＣＲ分析は、ウイルス特異的抗体でＤＮＡを増幅する工程（これは、ウイルスＲＮＡから逆転写され得る）およびゲル電気泳動を使用して推測されるサイズのバンドを検出する工程を包含し得る。しかし、好ましい実施形態において、定量的ＰＣＲ法は、ウイルス核酸の存在のみならず、サンプル中のウイルス核酸の量によって示されるように、ウイルス負荷にも関する情報を提供するために使用される。好ましい定量的ＰＣＲ法は、ｄＰＣＲである。

【0020】

デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡを含む核酸鎖を直接的に定量化しかつクローン的に増幅するために使用され得る従来のポリメラーゼ連鎖反応法の改良である。ｄＰＣＲにおいて、サンプルは、多数の区画へと分離され、反応は、各区画で個々に行われ、それによって、標準的なＰＣＲ技術において見出されるとおりのサンプル全体に関して１つの値とは対照的に、各区画における蛍光分析を介して標的ＤＮＡの高感度定量化を可能にする。

【0021】

液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、前述の区画が、ＰＣＲ反応および蛍光検出が、例えば、液滴フローサイトメトリーを使用して実施され得る、ナノリットルサイズの油中水型エマルジョン（ｗａｔｅｒ－ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）液滴からなるｄＰＣＲの一方法である。ｄｄＰＣＲのための液滴を作製および読み取るための方法は、他の箇所で詳細に記載されている（Ｚｈｏｎｇら， ‘Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｄｅｇｉｔａｌ ＰＣＲ： ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｏｎｅ ｔａｒｇｅｔ ｐｅｒ ｃｏｌｏｒ ｂａｒｒｉｅｒ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ’， Ｌａｂ Ｃｈｉｐ， １１：２１６７－２１７４， ２０１１を参照のこと）が、本質的には、各液滴は、別個の反応ウェルのようなものであり、サーマルサイクリングの後、各個々の液滴の蛍光強度が、ピーク蛍光強度を記録したフローサイトメーターのようなフロースルー機器において読み取られた。

【0022】

本発明の組成物および方法は、任意のウイルスに対して特異的な核酸および／または抗体を検出するために使用され得るが、好ましい実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、検出標的である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のための例示的なプライマーおよびプローブは、中華人民共和国ＣＤＣ（ＮおよびＯＲＦ１ａｂ遺伝子を標的化する）およびＷＨＯ（Ｅ遺伝子を標的化する）によって開示されており、Ｔａｏ Ｓ，ら， ２０２０およびＤｏｎｇ， Ｉら ２０２０において提供される。唾液サンプルのｄｄＰＣＲを使用するＣＯＶＩＤ－１９感染の検出のための本発明の組成物および方法は、その中で考察される同じプライマーおよびプローブを使用することを企図する。

【0023】

ＮＰＳサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｄｄＰＣＲ検出および定量化は、成功裡に示されてきており、このような検査は、例えば、Ｂｉｏｄｅｓｉｘ（Ｂｏｕｌｄｅｒ， Ｃｏｌｏｒａｄｏ）によって現在提供されている。本発明の組成物および方法は、類似のｄｄＰＣＲ技術を適用するが、より容易に得られる唾液サンプルに適用する。

【0024】

上述のように、唾液は、ＣＯＶＩＤ－１９感染に関するウイルス負荷の良好な代表を提供することが見出されている。Ｔｏ ＫＫ，ら， ２０２０； Ｗａｎｇ Ｗ，ら， ２０２０を参照のこと。感染患者におけるウイルス核酸のこの未開拓の供給源を認識すると、組成物および方法は、ｄｄＰＣＲを利用して、それらの核酸を検出および定量化する。唾液におけるＰＣＲベースのＤＮＡ分析の実現性は、上記で考察されるように、腫瘍ＤＮＡに関して示されている。種々のウイルスＤＮＡはまた、唾液中で検出されている（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ＤＮＡが挙げられる）。図１Ａおよび１Ｂは、頭頚部がん患者に由来する唾液サンプルから、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してＨＰＶの成功裡の検出および定量化を示す。図１Ａは、アガロースゲル電気泳動による定性的検出を示し、図１Ｂは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって得られる定量的結果を示す。

【0025】

本発明の定量的方法を使用すると、ウイルス負荷は、疾患進行を評価し、種々の処置の治療効果を決定するために患者に対して長期的にモニターされ得る。例えば、疾患プロセスに沿った比較は、公衆の安全および患者のケアのための有用な情報を提供する。サンプルは、長期的なデータを確立するために、不規則なまたは規則的な間隔で収集され得る。例えば、唾液は、患者から、１日に複数回、少なくとも毎日、少なくとも２日毎に、少なくとも３日毎に、少なくとも４日毎に、少なくとも５日毎に、少なくとも６日毎に、少なくとも毎週、収集され得る。このようなデータは、処置決定をガイドするかまたは臨床転帰を推測するために使用され得る。推測される転帰の例としては、挿管、ＩＣＵ入室、回復、死亡、および上記のうちのいずれかのタイミングが挙げられ得る。

【0026】

ウイルス負荷は、宿主遺伝子内部コントロールのコピーに対するウイルスのコピーとして正規化され得る。患者の人口統計情報（人種および社会経済学的データを含む）、および臨床パラメーター（過去の病歴および医療管理を含む）は、ウイルス負荷と上記のパラメーターとの間の関連を同定するために、ウイルス負荷に関して分析され得る。このような情報はまた、患者を、類似の属性を有する患者のデータベースに対して比較することによって、ウイルス負荷に基づいて転帰推測を合わせるために使用され得る。このような情報はまた、リスクにある集団を同定するために使用され得る。

【0027】

収集から検査およびサンプル貯蔵までの時間は、正確なウイルス負荷データを提供するにあたって重要であり得る。唾液中でのＤＮＡ安定性は、種々の温度（ＲＴ：室温、４℃、および－２０℃）で１日間、３日間、および７日間の期間にわたって調べられており、室温での新鮮な唾液（Ｄ０－ＲＴ）に対して比較され、結果は、図２に示される。β－アクチンの増幅有効性（Ｃｔ平均）を、評価のために使用した。示されるように、ＤＮＡは、室温においてすら、１週間またはこれより長い期間にわたって比較的安定である。よって、単純でかつ安価な自己収集方法（自宅用キットおよび簡単なパッケージングを含む）が、検査のためのサンプルを得、移送し、そして貯蔵するために有効に使用され得る。

【0028】

抗体検査
大部分の現在のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査は、核酸に集中している一方で、血清学的検査は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を調べるために現在登場している。このような検査は、免疫を理解し、曝露を追跡し、ソーシャルディスタンスまたは職場復帰キャンペーン（ｒｅｔｕｍ－ｔｏ－ｗｏｒｋ ｃａｍｐａｉｇｎ）の最終的な緩和をガイドするにあたって有用である。血清学的検査は、大部分は、抗ウイルスＩｇＭおよびＩｇＧ抗体の生成に集中している。本発明の検査は、好ましくは、ＩｇＡ抗体分析を含む。上部呼吸・消化器道は、粘膜で裏打ちされ、主なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染部位である。粘膜分泌物中の主な抗体クラスであるＩｇＡは、呼吸器系ウイルスに対する防御の第一線である。ＩｇＧ（これは、免疫応答において後の方で出現する）は、通常は血清中で測定される全身性免疫のメトリックである。しかし、ＩｇＧはまた、唾液中でも見出され、血液と唾液のＩｇＧ間には高い相関関係が示された。これは、本明細書で記載されるように「唾液血清学」試験の開発という実現可能性を裏付ける。Ｈｅｔｔｅｇｇｅｒ Ｐ， Ｈｕｂｅｒ Ｊ， Ｐａｓｓｅｃｋｅｒ Ｋ，ら， ２０１９， Ｈｉｇｈ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｓａｌｉｖａ ｏｐｅｎｓ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｓａｌｉｖａ ｂａｓｅｄ ｓｅｒｏｌｏｇｙ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， １４（６）（本明細書に参考として援用される）を参照のこと。本明細書で記載される唾液抗体検査は、唾液中に存在する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩｇＡおよびＩｇＧを検出し得、ＣＯＶＩＤ－１９に対する粘膜免疫および全身性免疫の両方のより包括的な評価を提供し得る。

【0029】

核酸と比較すると、タンパク質は、比較的安定性が低く、温度および貯蔵に対する感受性がより高い。さらに、唾液のタンパク質は、血清タンパク質と比較して、分解に対してより感受性である可能性がある。Ｄａｗｅｓ Ｃ， Ｗｏｎｇ ＤＴＷ． ２０１９， Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｓａｌｉｖａ ａｎｄ Ｓａｌｉｖａｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｒａｌ Ｈｅａｌｔｈ， Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ， ９８（２）： １３３－１４１（本明細書に参考として援用される）を参照のこと。よって、抗体分析が使用される検査では、断熱パッケージングおよび迅速な輸送、ならびに検査法を含む指示および材料が、タンパク質安定性を促進するために調整され得る。

【0030】

好ましい実施形態において、ＥＬＩＳＡベースのアッセイが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して特異的な唾液ＩｇＡおよびＩｇＧの検出および定量化のために使用され得る。血中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイは、例えば、Ｅｕｒｏｌｍｍｕｎ ＡＧ（Ｌueｂｅｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能である。唾液中の抗ウイルスＩｇＡおよびＩｇＧにおける動的な変化は、上記の核酸に由来するウイルス負荷に関して考察されるように、感染および免疫の進行ステージ全体を通じてモニターされ得る。よって、長期的な抗体データは、転帰推測ならびに疾患進行および治療有効性のモニタリングのために同様に使用され得る。さらに、抗体レベルは、免疫の推測を補助するために退院後にモニターされ得る。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩｇＡおよびＩｇＧの定量化は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の量を、唾液中の全抗体に対してならびに存在する全ＩｇＡおよびＩｇＧ（それぞれ）に対して正規化することによって実施され得る。ウイルス負荷データと同様に、抗体情報は、基本的な人口統計（例えば、年齢、性別、人種）および臨床情報（例えば、既存の状態、臨床経過、転帰）と相関され得、その中で特定されるパターンが、転帰推測を調整するために使用され得る。任意の生体マーカーベースのイムノアッセイが、ウイルス関連抗体の検出のために本発明において使用され得る（例えば、スティックディップ検査（ｓｔｉｃｋ－ｄｉｐ ｔｅｓｔ）、ニトロセルロースストリップ、または任意のラテラルフローイムノアッセイ）。いくつかの非限定的な好ましい例としては、ビーズベースのアッセイ、発光アッセイ、金属結合イムノソルベントアッセイ、またはポイントオブケアイムノクロマトグラフィーアッセイが挙げられる。

【0031】

ＩｇＡは、１０日間以内に検出可能になると予測され、ＩｇＧは、２８日間以内に検出可能になると予測される。よって、ある特定の実施形態において、ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体の相対的レベルが、感染開始日を決定するために使用され得る。

【0032】

本発明の抗体アッセイは、レセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）またはスパイクタンパク質のＳ１サブユニットに依拠し得る。これらは、他のコロナウイルス抗原と比較して、さらなる特異性を付与すると考えられる。Ｏｋｂａ ＮＭＡ， Ｍｕｌｌｅｒ ＭＡ， Ｌｉ Ｗ，ら， ２０２０， Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ Ｐａｔｉｅｎｔｓ， Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ， ２６（７）（本明細書に参考として援用される）を参照のこと。

【実施例】

【0033】

実施例１ － 唾液および鼻スワブに由来するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｑＰＣＲ比較
唾液および鼻スワブサンプルを、ｑＰＣＲを介して検査し、得られたＣｔ値またはＣｑ値を示した。図３は、唾液および鼻スワブサンプルに関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ１領域を標的化するプライマー－プローブセットでのｑＰＣＲのＣｔ値を示す。図４は、唾液および鼻スワブサンプルに関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ２領域を標的化するプライマー－プローブセットでのｑＰＣＲのＣｔ値を示す。図５は、唾液および鼻スワブサンプルに関する内部コントロールである宿主遺伝子リボヌクレアーゼＰ（ＲＮＰ）のＣｔ値を示す。図３～５の各々に関しては、各データ点は、鼻スワブおよび唾液サンプルの両方が調製された１つの供給源を表す。唾液および鼻スワブサンプルはともに、ｑＰＣＲの前にＲＮＡ抽出に供した。

【0034】

図６～８は、同じであるが、ＲＮＡ抽出に供した鼻スワブ、および迅速ＰＣＲのために調製したＲＮＡ抽出なしの唾液での比較を示す。このようなＲＮＡ抽出なしの方法の例は、例えば、米国仮特許出願第６３／１５８，６８５号（本明細書に参考として援用される）に記載される。図６は、抽出なしの唾液および抽出した鼻スワブサンプルに関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ１領域を標的化するプライマー－プローブセットでのｑＰＣＲのＣｔ値を示す。図７は、抽出なしの唾液および抽出した鼻スワブサンプルに関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ２領域を標的化するプライマー－プローブセットでのｑＰＣＲのＣｔ値を示す。図８は、抽出なしの唾液および抽出した鼻スワブサンプルに関する内部コントロールである宿主遺伝子リボヌクレアーゼＰ（RNP）のＣｔ値を示す。図示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むサンプルにおけるＮ１標的は、標準的な鼻スワブ法と比較した場合に、核酸の抽出ありまたはなしの唾液中で、定性的にかつ定量的に、一貫して測定された。それらの知見は、抽出法ありまたはなしの唾液中の内部コントロールＲＮＰの一貫した測定によって裏付けられる。

【0035】

実施例２ － ｄｄＰＣＲ精度検査
ＢｉｏＲａｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｄｄＰＣＲアッセイを使用するＮ１およびＮ２標的化ｄｄＰＣＲを、種々のウイルス負荷を有する唾液および鼻スワブサンプルに対して実施した。ｄｄＰＣＲは、コピー／μＬ単位で、絶対的ウイルス負荷測定値を与える。図９および１０は、唾液および鼻スワブ検査におけるｄｄＰＣＲ検査の再現性および正確度を示す。図９は、Ｎ１標的化プライマーを使用する、低い、中程度の、および高いウイルス負荷に関して決定される場合の、鼻スワブおよび唾液サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコピー／μＬを示す。図１０は、Ｎ２標的化プライマーを使用する、低い、中程度の、および高いウイルス負荷に関して決定される場合の、鼻スワブおよび唾液サンプルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコピー／μＬを示す。

【0036】

実施例３ － ｑＰＣＲおよびｄｄＰＣＲの比較
鼻スワブおよび唾液サンプルを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ１もしくはＮ２領域またはＲＰＰ３０コントロール遺伝子を標的化するｄｄＰＣＲ法およびｑＰＣＲ法を使用して検査し、その結果を比較した。図１１は、Ｎ１領域標的化プライマーを使用して、ｑＰＣＲ検査から得られたＣｔ値と、同じ鼻スワブサンプルに対して実施されたｄｄＰＣＲを使用して得られたコピー／μＬ値とを比較する。図１２は、Ｎ２領域標的化プライマーを使用して、ｑＰＣＲ検査から得られたＣｔ値と、同じ鼻スワブサンプルに対して実施されたｄｄＰＣＲを使用して得られたコピー／μＬ値とを比較する。図１３は、ＲＰＰ３０標的化プライマーを使用して、ｑＰＣＲ検査から得られたＣｔ値と、同じ鼻スワブサンプルに対して実施されたｄｄＰＣＲを使用して得られたコピー／μＬ値とを比較する。図１４は、Ｎ１領域標的化プライマーを使用して、ｑＰＣＲ検査から得られたＣｔ値と、同じ唾液サンプルに対して実施されたｄｄＰＣＲを使用して得られたコピー／μＬ値とを比較する。図１５は、Ｎ２領域標的化プライマーを使用して、ｑＰＣＲ検査から得られたＣｔ値と、同じ唾液サンプルに対して実施されたｄｄＰＣＲを使用して得られたコピー／μＬ値とを比較する。図１６は、ＲＰＰ３０標的化プライマーを使用して、ｑＰＣＲ検査から得られたＣｔ値と、同じ唾液サンプルに対して実施されたｄｄＰＣＲを使用して得られたコピー／μＬ値とを比較する。唾液および鼻スワブサンプルの両方において、ｑＰＣＲ検査を介して得られたＣｔ値は、ｄｄＰＣＲによって決定される場合のウイルス負荷の良好な代用であることを証明する。

【0037】

スワブおよび唾液サンプルの両方のＮ１、Ｎ２、およびＲＮＰに関するｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲ検査の対になった結果をさらに分析して、それらの間の関連を評価した。対になったデータの大部分に関しては、セグメントまたは区分線形回帰(piece-wised linear regression)を使用して、その関連を評価した。Ｒパッケージ「セグメント化（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）」を分析のために使用した。これを、最良のフィットしたモデルを選択するために、ベイス情報量規準ＢＩＣを使用した。

【0038】

図１７は、Ｎ１領域標的化プライマーを使用する鼻スワブサンプルの対になったｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲを比較する回帰モデリングを示す。図１８は、Ｎ２領域標的化プライマーを使用する鼻スワブサンプルの対になったｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲを比較する回帰モデリングを示す。図１９は、ＲＮＰコントロールプライマーを使用する鼻スワブサンプルの対になったｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲを比較する回帰モデリングを示す。

【0039】

図２０は、Ｎ１領域標的化プライマーを使用する唾液サンプルの対になったｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲを比較する回帰モデリングを示す。図２１は、Ｎ２領域標的化プライマーを使用する唾液サンプルの対になったｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲを比較する回帰モデリングを示す。図２２は、ＲＮＰコントロールプライマーを使用する唾液サンプルの対になったｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲを比較する回帰モデリングを示す。

【0040】

重要なことには、それらの結果は、Ｃｔ値のある特定の範囲（およそ２０～３０）内でＲＴ－ＰＣＲとｄｄＰＣＲとの間に線形の関係性が存在することを示す。

【0041】

実施例３ － 長期的検査
対になった長期的な唾液および鼻スワブサンプルを、症状発症後の種々の日で、ＣＯＶＩＤ－１９患者から得た。それらサンプルを、ウイルス負荷の代用として存在するＣｔ値でのｑＰＣＲ分析を使用して、ウイルス負荷に関して試験した。図２３は、その検査の結果を示し、ここでｙ軸は、Ｃｔ値における差異（唾液－鼻スワブ）を表す。測定されたウイルス負荷は、１９名の患者における診断時の唾液サンプルと比較して、鼻スワブサンプルにおいて最初はより高いが、その差異は、１０日目までに消失する。この結果は、鼻スワブおよび唾液の両方が、患者においてウイルス負荷を経時的にモニターするために有用な供給源であることを示す。

【0042】

援用の表示
参考文献および他の文書（例えば、特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ）の引用は、本開示全体を通じて行われている。全てのこのような文書は、それらの全体において全ての目的のために判明に参考として援用される。

【0043】

均等物
本発明の種々の改変およびその多くのさらなる実施形態が、本明細書で示され、記載されるものに加えて、本明細書で引用される科学文献および特許文献への言及を含めて、この文書の全内容から当業者に明らかになる。本明細書中の主題は、その種々の実施形態およびその均等物において、本発明の実施に適合され得る重要な情報、例示およびガイダンスを含む。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【国際調査報告】