特表2023-524197エンジニアリング組織の生成及び評価のための装置及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-09
(54)【発明の名称】エンジニアリング組織の生成及び評価のための装置及び方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20230602BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20230602BHJP
C12M 1/42 20060101ALI20230602BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 D
C12M3/00 Z
C12M1/42
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022551564
(86)(22)【出願日】2021-02-25
(85)【翻訳文提出日】2022-10-21
(86)【国際出願番号】 US2021019748
(87)【国際公開番号】W WO2021173887
(87)【国際公開日】2021-09-02
(31)【優先権主張番号】62/981,446
(32)【優先日】2020-02-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522337576
【氏名又は名称】キュリ バイオ，アイエヌシー．
(74)【代理人】
【識別番号】100128347
【弁理士】
【氏名又は名称】西内 盛二
(72)【発明者】
【氏名】グレイ，ケビン
(72)【発明者】
【氏名】カルーフェ，サミール
(72)【発明者】
【氏名】フィッシャー，エリオット
(72)【発明者】
【氏名】シルバー，ジェイソン
(72)【発明者】
【氏名】ガイセ，ニコラス
【テーマコード（参考）】
4B029
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029BB11
4B029GA03
4B029GB04
(57)【要約】
【課題】本発明は、三次元（３Ｄ）エンジニアリング組織（ＥＴ）を生成するための方法及びシステム、並びにＥＴを電気刺激するための方法及びシステムに関する。
【解決手段】ＥＴ蓋を含むＥＴアセンブリであって、当該ＥＴ蓋には、剛性ポストアセンブリ及び可撓性ポストアセンブリが連結されているＥＴアセンブリを提供する。ＥＴアセンブリ及び鋳造プレートを含む鋳造アセンブリを提供する。組織構築物を刺激するための刺激方法及びシステムを提供する。
【選択図】図３Ｅ
【解決手段】ＥＴ蓋を含むＥＴアセンブリであって、当該ＥＴ蓋には、剛性ポストアセンブリ及び可撓性ポストアセンブリが連結されているＥＴアセンブリを提供する。ＥＴアセンブリ及び鋳造プレートを含む鋳造アセンブリを提供する。組織構築物を刺激するための刺激方法及びシステムを提供する。
【選択図】図３Ｅ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エンジニアリング組織（ＥＴ）アセンブリであって、第１側、第２側及び複数の貫通孔を含むプレートを含むＥＴ取付蓋と、
複数の第１ポストを含む第１本体を含む第１ポストアセンブリと、
複数の第２ポストを含む第２本体を含む第２ポストアセンブリと、を含み、
さらに、前記複数の第１ポストと前記複数の第２ポストは、ポスト対をなして設けられ、各対は、第１ポスト及び第２ポストを含み、前記ポスト対は、前記ＥＴ取付蓋の前記貫通孔の対応する側に位置する、ことを特徴とするエンジニアリング組織（ＥＴ）アセンブリ。
【請求項2】
前記貫通孔は、行及び列のアレイに配置される、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴアセンブリ。
【請求項3】
前記ポスト対は、前記第１ポストが前記貫通孔の第１側に配置されるとともに前記第２ポストが前記貫通孔の第２側に配置されるように、前記ＥＴ取付蓋の対応する貫通孔内に収容されること、を特徴とする請求項１に記載のＥＴアセンブリ。
【請求項4】
複数のピンを含み、前記剛性ポストアセンブリ及び前記可撓性ポストアセンブリは、前記プレートの前記第１側に連結され、前記複数のピンの遠位端は、前記可撓性ポスト及び前記剛性ポストの遠位端よりも前記プレートの前記第２側からより遠く延在する、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴアセンブリ。
【請求項5】
前記剛性ポストアセンブリは、第１機械的連結又は接着連結により前記ＥＴ取付蓋に連結され、前記可撓性ポストアセンブリは、第２機械的連結又は接着連結により前記ＥＴ取付蓋に連結される、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴアセンブリ。
【請求項6】
前記第１ポストアセンブリは、複数の剛性ポストを含む剛性ポストアセンブリであり、前記第２ポストアセンブリは、複数の可撓性ポストを含む可撓性ポストアセンブリである、ことを特徴とする請求項５に記載のＥＴアセンブリ。
【請求項7】
前記剛性ポストアセンブリと前記ＥＴ取付蓋は、単一の一体部品で製造される、ことを特徴とする請求項６に記載のＥＴアセンブリ。
【請求項8】
前記第１ポストアセンブリは、複数の第１可撓性ポストを含む第１可撓性ポストアセンブリであり、前記第２ポストアセンブリは、複数の第２可撓性ポストを含む第２可撓性ポストアセンブリである、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴアセンブリ。
【請求項9】
前記複数の第１ポスト及び前記複数の第２ポストのうちの少なくとも一つのポストは、少なくとも一層の導電材料によって少なくとも部分的に被覆される、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴアセンブリ。
【請求項10】
前記少なくとも一層の導電材料は、電気絶縁体によって部分的に被覆される、ことを特徴とする請求項８に記載のＥＴアセンブリ。
【請求項11】
前記ＥＴ取付蓋の周辺は、前記ＥＴ取付蓋の前記第２面を超えるように延在するスカート部を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＥＴアセンブリ。
【請求項12】
鋳造アセンブリであって、複数の鋳造穴を含む鋳造プレートと、エンジニアリング組織（ＥＴ）アセンブリとを含み、前記ＥＴアセンブリは、
第１側、第２側及び複数の貫通孔を含むプレートを含むＥＴ取付蓋と、
複数の第１ポストを含む第１本体を含む第１ポストアセンブリと、
複数の第２ポストを含む第２本体を含む第２ポストアセンブリと、を含み、
前記複数の第１ポストと前記複数の第２ポストは、ポスト対をなして設けられ、各対は、第１ポスト及び第２ポストを含み、前記ポスト対は、前記ＥＴ取付蓋の対応する貫通孔、及び前記鋳造プレートの前記複数の鋳造穴のうちの対応する鋳造穴内に収容される、ことを特徴とする鋳造アセンブリ。
【請求項13】
前記複数の鋳造穴のうちの各鋳造穴は、凹穴の上方に配置された無底穴を含み、かつ前記ポスト対の端部は、対応する凹穴に収容される、ことを特徴とする請求項１２に記載の鋳造アセンブリ。
【請求項14】
前記無底穴のそれぞれのサイズは、前記凹穴のそれぞれのサイズよりも大きい、ことを特徴とする請求項１３に記載の鋳造アセンブリ。
【請求項15】
前記凹穴は、組織溶液のための容器である、ことを特徴とする請求項１３に記載の鋳造アセンブリ。
【請求項16】
前記凹穴を形成する壁は傾斜し、かつ前記凹穴の前記壁及び底面に形成されたコーナーは面取り又は湾曲する、ことを特徴とする請求項１３に記載の鋳造アセンブリ。
【請求項17】
前記第１ポストアセンブリは、複数の剛性ポストを含む剛性ポストアセンブリであり、前記第２ポストアセンブリは、複数の可撓性ポストを含む可撓性ポストアセンブリである、ことを特徴とする請求項１２に記載の鋳造アセンブリ。
【請求項18】
前記第１ポストアセンブリは、複数の第１可撓性ポストを含む第１可撓性ポストアセンブリであり、前記第２ポストアセンブリは、複数の第２可撓性ポストを含む第２可撓性ポストアセンブリである、ことを特徴とする請求項１２に記載の鋳造アセンブリ。
【請求項19】
組織構築物を刺激するための刺激プレートであって、本体とバックプレートと含み、前記本体は、上面及び下面を有する無底穴を複数含み、前記本体の前記無底穴は、前記上面に前記組織構築物を収容するように構成され、
前記バックプレートは、前記本体の前記下面に連結され、前記バックプレートは、電極対を含み、各電極対は、複数の前記無底穴のうちの一つに対応し、かつ対応する前記無底穴に収容された前記組織構築物と電気的に連通するように構成される、ことを特徴とする刺激プレート。
【請求項20】
前記バックプレートはＰＣＢであり、かつ前記電極対は、前記ＰＣＢの表面に形成された導電パッド電極である、ことを特徴とする請求項１９に記載の刺激プレート。
【請求項21】
請求項１に記載のＥＴアセンブリは、前記ポスト対が対応する無底穴内に延在するように、前記刺激プレートに連結され、各ポスト対は、その間に組織構築物を有し、かつ、前記電極対は、対応する前記無底穴内に収容された前記組織構築物と電気的に連通するように構成される、ことを特徴とする請求項１９に記載の刺激プレート。
【請求項22】
前記電極対は、少なくとも部分的に１層又は複数層の導電性又は絶縁性材料によって塗布される、ことを特徴とする請求項１７に記載の刺激プレート。
【請求項23】
刺激蓋であって、第１基板と、第２基板と、複数の電極ロッドとを含み、前記第１基板は、対をなして配置された複数の孔を含み、
前記第２基板は、前記第１基板に連結され、前記第２基板は、複数のソケットを含み、各ソケットは、２つのポゴピンを含み、
前記複数の電極ロッドは、対をなして配置され、前記複数のロッドのうちの各ロッドは、前記第１基板の前記複数の孔のうちの対応する孔を貫通するように延在し、前記ロッド対は、各ソケットの前記２つのポゴピンに取り外し可能に連結される、ことを特徴とする刺激蓋。
【請求項24】
前記刺激蓋は、前記電極ロッド対がマイクロプレートの穴内に延入するように、前記マイクロプレートの表面に連結される、ことを特徴とする請求項２３に記載の刺激蓋。
【請求項25】
電極ロッドは、グラファイトを含む、ことを特徴とする請求項２３に記載の刺激蓋。
【請求項26】
ＥＴアセンブリであって、鋳造プレートと、エンジニアリング組織（ＥＴ）アセンブリとを含み、前記鋳造プレートは、複数の鋳造穴を含み、
前記エンジニアリング組織アセンブリは、ＥＴ取付蓋を含み、前記ＥＴ取付蓋は、複数の貫通孔を有するプレートと、前記プレートに連結される少なくとも第１ポストアセンブリ及び第２ポストアセンブリとを含み、
前記プレートは、その周辺に前記鋳造プレートの周辺を囲むリップを含み、
前記第１ポストアセンブリ及び前記第２ポストアセンブリは、前記第１ポストアセンブリの前記第１ポストが所定の距離で前記第２ポストアセンブリの対応する前記第２ポストと位置合わせするように、前記プレートに連結され、
前記第１ポストと前記第２ポストは、対をなして配置されることにより、各対は、前記鋳造プレートの対応する鋳造穴の中心領域まで延在する、ことを特徴とするＥＴアセンブリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、三次元（３Ｄ）エンジニアリング組織（ＥＴ）を生成するための方法及びシステム、並びにＥＴの収縮性及び各種生理特性を電気刺激及び測定するための方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【0002】
競合生理モデルに比べて、３次元エンジニアリング組織（ここでＥＴと呼ばれる）又は人工プロセスにより製造されるか又は増強された単細胞層より厚い組織は、そのコスト、利用可能性、及び人間の生理組織をシミュレーションする顕著な能力により、生物医学研究において非常に大きな興味を引き起こす。これらのＥＴを製造、メンテナンス及び特徴づける手段は、多くの学術的興味を蓄積した。特に人気のあるＥＴシステムは２ポストシステムと呼ばれ、ここで、組織は２つのポストの間に鋳造され、そのうちの少なくとも一つのポストは、その接着された組織が収縮するときに湾曲するように、十分な可撓性を有するものである。ポストの湾曲は、組織により生成された力に関連することができ、これは、組織の健康及び機能に関する有意義な情報を提供することができる。このような装置を商業化する試みが存在するものの、これらの方法は、学術実験室の原生物であり、効率的で、業界を中心とするツールではない。
【0003】
Ｓｎｉａｄｅｃｋｉらの米国公開番号２０１９／００２９５４９は、このような２ポストＥＴシステムを開示した。Ｓｎｉａｄｅｃｋｉの２ポストＥＴシステムの一つのポストに埋め込まれた磁石は、マルチウェルプレートに内蔵するＥＴの収縮力の磁気センサに基づく検出を提供する。当該非光学収縮測定システムでは、磁石が埋め込まれた可撓性ポストと剛性ポストとの間に吊り下げられた３ＤＥＴにより印加された力を測定することを可能にするとともに、磁力計を用いてＥＴが収縮動作を行うときに可撓性ポストの偏向による磁場変化を検出する。他の市販の２ポストシステムは、例えば、Ｈｅｎｓｅｎらに説明されたように、ＥＴ負荷下でのポスト湾曲の光学的な読み取りを提供する。Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｈｅａｒｔ Ｔｉｓｓｕｅ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１０年７月９日を開示し、ｈｔｔｐ：／／ｃｉｒｃｒｅｓ．ａｈａｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇからダウンロードすることができる。
【0004】
しかしながら、先に開示されたＥＴシステムは、製造生産量、使いやすさ及び人間工学の面で限界がある。システムの非生物部品の製造は、数日間の複雑な成形及び離型プロセスを必要とする。このような製造プロセスは、常に圧縮又は射出成形のような工業標準的な製造技術と互換性がなく、又は前記技術に非一般的な修正を行って拡張可能性を実現する必要がある。
【0005】
３Ｄ組織自体を生成するためのプロセスは、顕著な制限要因である。多くの２ポストシステムにおいて、ＥＴは、細胞及び細胞外マトリックスの懸濁液で鋳造されてなり、当該細胞外マトリックスは、金型に堆積した後にポストの周囲にゲル化する。オペレータは、組織培養プレートの穴内の組織自体の金型をゼラチン又はアガロースのような温度に敏感なゲル材料から鋳造する必要があり、これは、３Ｄ組織構築物の再現性及び生産量に悪影響を与える。シリコーン樹脂のような他の材料を使用することができるが、金型が組織に付着しないように手間のかかる表面処理を必要とする。その上に組織を保持するこれらのポストが取り付けられたハンドルは、溝内に一貫に配置されることを確保する位置合わせ特徴を有するものではなく、鋳造組織の形態の高可変性をもたらす。また、鋳造すると、これらのゲル金型は、垂直壁付きの溝を有し、当該溝は、組織構築物と金型側面との間の摩擦により、組織構築物の除去が困難となる。
【0006】
新たに形成された組織は脆弱であり、かつ任意の軽微な鋳造基板との接着によって、鋳造された組織の致命的な障害を引き起こす可能性がある。その上に２つのポストが取り付けられた部材は、工業標準培養装置と効率的かつ再現可能なインタフェース接続のための特徴がなく、かつその重い形状のため、自動化処理システムに集積する能力が限られる。これらの部材は、組織を評価するための如何なるセンサと容易かつ有害に位置ずれする可能性がある。マイクロプレート上での装置の僅かな位置ずれは、マイクロプレートの頂面と上のポストが取り付けられた基板との間の組織を押しつぶす可能性がある。部品は、６つより多いグループを一度に容易に取り扱うことができず、かつ人間又はロボット操作者が容易に把持可能な特徴を欠いている。
【0007】
電気刺激により多くの方式でＥＴの性能を向上させることができ、これは非常に関心を抱かせるが、これもチャレンジを提供する。細胞培養のための従来の電気刺激装置は、一般的に電気刺激モジュールに永久的に固定されたグラファイト棒又は白金ワイヤに関し、当該電気刺激モジュールは、マイクロプレートの頂部に取り付けられ、ここで、電極はマイクロプレートにおける各穴の基質浴に突出する。基質浴中の小分子が浸透しかつグラファイト電極に付着しやすいため、一回だけの薬物スクリーニング実験後に、交差汚染を回避するために、グラファイト電極アセンブリを交換する必要がある。しかしながら、使用可能なこのようなグラファイト刺激装置は、使い捨て消耗品として非常に高価であり、又は工業標準組織培養器に組み立てて集積されることが非常に困難であるため、このような装置のハイスループット刺激研究における商用利用性が制限される。白金電極は、グラファイト電極の気孔率がないため、繰り返し使用性の面で優位性があるが、それらは、細胞毒性電解副生成物を生成するより高い傾向を有し、かつ使用後に広範な洗浄を必要とし、これはそれらのハイスループット生物学的研究における効用に悪影響を与える。白金ワイヤも非常に高価であるため、白金ワイヤを採用する装置の商業的拡張可能性が制限される。また、ポスト自体を電極として組織から刺激して記録する手段を組み合わせる２ポストシステムはない。電気生理学は組織機能の別の重要なメトリックであり、かつ収縮挙動と組み合わせて所定のＥＴの状態の高度な情報性ビューを与えることができるため、記録機能の組み合わせは非常に有益である。組織が電極表面の近傍にあるため、ポストを用いて組織を刺激することは、さらに組織を刺激することに必要な電圧を低減することができる。これによって、他のより遠隔的な刺激伝達方法に起因する有毒な副生成物が発生する可能性を低減することができる。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、三次元（３Ｄ）エンジニアリング組織（エンジニアリング心臓組織（ＥＨＴ）、エンジニアリング骨格筋組織（ＥＭＴ）、興奮性細胞又は収縮性細胞などの他の種類のエンジニアリング組織など）を生成する方法及びシステム、並びにＥＴの収縮性及び各種生理特性を電気的に刺激及び測定する方法及びシステムに関する。ＥＴアセンブリであって、複数対のポストアセンブリが連結されるＥＴ蓋を含むＥＴアセンブリを提供している。鋳造アセンブリであって、ＥＴアセンブリ及び鋳造プレートを含む鋳造アセンブリを提供している。刺激蓋及びプレートを提供している。
【0009】
一実施例は、エンジニアリング組織（ＥＴ）アセンブリに関し、当該エンジニアリング組織アセンブリは、ＥＴ取付蓋と、少なくとも一つの可撓性ポストアセンブリと、選択可能な剛性ポストアセンブリとを含む。ＥＴ取付蓋は、プレートを含み、当該プレートは、第１側、第２側及び複数の貫通孔を含む。少なくとも一つの剛性ポストアセンブリは、第１本体を含み、当該第１本体は、複数の剛性ポストを含む。少なくとも一つの可撓性ポストアセンブリは、第２本体を含み、当該第２本体は、複数の可撓性ポストを含む。複数の剛性ポスト及び可撓性ポストは、剛性ポスト及び可撓性ポストのポスト対を含むように配置される。ポスト対は、ＥＴ取付蓋の対応する貫通孔内に収容され、又は貫通孔の側面に位置する。
【0010】
別の実施例において、ＥＴアセンブリは、複数の鋳造穴を含む鋳造プレートに連結されてもよい。ポスト対は、ＥＴ取付蓋の複数の貫通孔のうちの対応する貫通孔及び鋳造プレートの複数の鋳造穴のうちの対応する鋳造穴に収容される。
【0011】
別の実施例において、組織構築物を刺激するための刺激プレートを提供している。刺激プレートは、本体を含み、当該本体は、上面及び下面を有する複数の無底穴を含む。本体の無底穴は、上面に組織構築物を収容するように構成される。刺激プレートは、本体の下面に連結されるバックプレートをさらに備える。バックプレートは、電極対を含み、各電極対は、複数の無底穴のうちの一つの穴に対応し、かつ対応する無底穴内における組織構築物と電気的に連通するように構成される。
【0012】
別の実施例は、刺激蓋に関し、当該刺激蓋は、第１基板及び第２基板を含む。第１基板は、対をなして配置される複数の孔を含む。第２基板は、第１基板に連結され、かつ複数のソケットを含み、各ソケットは、２つのポゴピンを含む。刺激蓋は、対をなして配置される複数の電極ロッドをさらに含む。複数のロッドのそれぞれは、第１基板の複数の孔のうちの対応する孔を貫通するように延在する。ロッド対は、各ソケットの２つのポゴピンに取り外し可能に連結される。第１基板は、鋳造プレートの表面に連結されるように構成され、当該鋳造プレートは、組織構築物を有する複数の穴を含むことにより、電極ロッド対の遠位端は、組織培養マイクロプレートの対応する鋳造穴に延在するように構成される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1A】一実施例に係るエンジニアリング筋肉組織（ＥＴ）取付蓋を示す図である。
【図1B】一実施例に係るエンジニアリング筋肉組織（ＥＴ）取付蓋を示す図である。
【図1C】一実施例に係るエンジニアリング筋肉組織（ＥＴ）取付蓋を示す図である。
【図1D】一実施例に係るエンジニアリング筋肉組織（ＥＴ）取付蓋を示す図である。
【図2A】一実施例に係る剛性ポストアセンブリの上面アイソメトリック図である。
【図2B】一実施例に係る可撓性ポストアセンブリの上面アイソメトリック図である。
【図2C】別の実施例に係る可撓性ポストアセンブリの上面アイソメトリック図である。
【図3A】一実施例に係る部分的に組み立てされたＥＴアセンブリの様子を示す図である。
【図3B】一実施例に係る部分的に組み立てされたＥＴアセンブリの様子を示す図である。
【図3C】一実施例に係る部分的に組み立てされたＥＴアセンブリの様子を示す図である。
【図3D】一実施例に係る部分的に組み立てされたＥＴアセンブリの様子を示す図である。
【図3E】一実施例に係る部分的に組み立てされたＥＴアセンブリの様子を示す図である。
【図3F】完全に組み立てされたＥＴアセンブリの上面アイソメトリック図である。
【図4A】一実施例に係る鋳造プレートを示す図である。
【図4B】一実施例に係る鋳造プレートを示す図である。
【図4C】一実施例に係る鋳造プレートを示す図である。
【図4D】別の実施例に係る鋳造プレートの断面図である。
【図6A】一実施例に係る組織構築物を電気的に刺激するための刺激プレートを示す図である。
【図6B】一実施例に係る組織構築物を電気的に刺激するための刺激プレートを示す図である。
【図6C】一実施例に係る組織構築物を電気的に刺激するための刺激プレートを示す図である。
【図9A】一実施例に係る刺激蓋の分解図である。
【図11】一実施例に係るポストの断面図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
図１Ａは、一実施例に係るＥＴ取付蓋の上面アイソメトリック図である。図１Ｂは、図１ＡのＥＴ取付蓋の底面アイソメトリック図である。図１Ｃは、図１ＡのＥＴ取付蓋の上面図である。図１Ｄは、図１Ｃに示されるＥＴ取付蓋の一部の分解上面図である。ＥＴ取付蓋は、エンジニアリング組織を成長させるための鋳造プレート（またはマイクロプレート）と組み合わせて用いられるように構成される。
【0015】
ＥＴ取付蓋１００は、一つ又は複数の剛性プレート１０２で形成された格子構造を含む。剛性プレート１０２を取り囲むように第２側１０２ｂからスカート部１０３が延在し、それは人間又はロボット操作者がＥＭＴ取付蓋１００を把持するための領域を提供し、さらに、バーコードを配置するか又は特定の装置を識別するために重要な他の情報の領域を提供する。ＥＴ取付蓋１００は、プレート１０２の第１側１０２ａからプレート１０２の第２側１０２ｂまで延在する貫通開口１０４のアレイを有する。図１Ａ～図１Ｃにおける貫通開口１０４のアレイでは、４列６行のアレイを示し、ただし、任意のアレイサイズを用いることができ、かつアレイ以外の配置を用いることができる。
【0016】
各貫通開口１０４のサイズや形状は、ＥＴ取付蓋１００の第１側１０２ａと第２側１０２ｂとで異なってもよい。一実施例において、貫通開口１０４での壁は、第１側１０２ａと第２側１０２ｂとの間に一定の角度で傾斜する。別の実施例において、貫通開口１０４での壁は第１側１０２ａと第２側１０２ｂとの間に垂直に延在する。
【0017】
貫通開口１０４は、図４Ａの鋳造プレートのようなマイクロプレートの穴と重なるように構成され、以下に説明するとおりである。これにより、ＥＴ取付蓋１００の貫通開口１０４の配置は、鋳造プレートの鋳造穴の配置に対応することにより、貫通開口１０４の少なくとも一部は、鋳造プレートの鋳造穴の一部と重なる。ＥＴ取付蓋の貫通開口１０４のサイズ及び形状は、ポストが鋳造プレートの鋳造穴に延在することを可能にする任意の形状又はサイズであってもよく、以下に説明するとおりである。
【0018】
ＥＴ取付蓋１００は、各行の対向する側での連結部材１１２を含む。ＥＴ取付蓋１００の連結部材１１２は、貫通開口１０４の外側に位置する。連結部材１１２は、図２Ａ及び／又は図２Ｂのポストアセンブリの連結素子と接合するように構成され、以下に説明するとおりである。一実施例において、図１Ｃ及び図１Ｄを参照し、連結部材１１２ａは、連結部材１１２ｂと異なるサイズ及び／又は形状を有することができる。例示された実施例において、複数行の連結部材１１２は、例えば、スロット又は開口などの収容部材であり、それは、例えば、ピンなどのポストアセンブリの連結素子を収容するように構成される。別の実施例において、行１１２は、ピンであり、ポストアセンブリは、収容部材を有する。
【0019】
ＥＴ取付蓋１００は、各行の貫通開口１０４の間に延在し、ＥＴ取付蓋１００の対向する端に位置する複数の剛性ストリップ１１０を有している。平坦な剛性ストリップ１１０は、ＥＴ取付蓋１００に剛性を提供し、かつ、ＥＴ取付蓋１００に固定される様々な部品に対して位置合わせ及び固定し、処理による外乱を防止することに寄与する。例示された実施例において、各行は、対応する剛性ストリップ１１０により分けられた４つの貫通開口１０４を含む。剛性ストリップ１１０は、ＥＴ取付蓋１００の第１側１０２ａに位置するが、剛性ストリップ１１０は、第２側１０２ｂに位置してもよい。剛性ストリップ１１０は、単一の剛性プレート１０２に一体的に形成されるが、他の実施例において、剛性ストリップ１１０は、プレート１０２の表面に連結された分離可能な部品であってもよい。
【0020】
図１Ｂを参照し、ＥＴ取付蓋１００の第２側１０２ｂに位置する貫通開口１０４は、突出リング１１３を含み、それは、ＥＴ取付蓋１００の第２側から延出する。突出リング１１３は、ＥＴ取付蓋１００をマルチウェル組織培養プレート（鋳造プレートを含む）に連結するときの位置合わせ特徴を提供し、図５Ａ～図５Ｃを参照しながらより詳細に説明する。
【0021】
ＥＴ取付蓋１００の第２側１０２ｂは、第２側１０２ｂから直交して延在する複数のピン１１４を含む。ピン１１４は、剛性であり、かつ鋳造プレートを有するＥＴ取付蓋１００の収容部分と嵌合することにより、ＥＴ取付蓋を鋳造プレートに取り外し可能に固定するように構成され、以下に図５Ａ～図５Ｃを参照してより詳細に説明する。したがって、ピン１１４のサイズ及び形状は、鋳造プレートの収容部分、隙間に対応する。４つのピン１１４が示されているが、ＥＴ取付蓋１００の第２側には、より多く又はより少ないピンを含むような任意の数のピンを有することができる。
【0022】
ＥＴ取付蓋１００は、一つ又は複数の成形、フライス加工又は３Ｄ印刷の部品で製造されてもよく、ここで、射出成形部品は、好ましいプロセス部品である。成形材料は、剛性熱可塑性プラスチックであってもよく、かついくつかの実施例において、一つ又は複数の部品は、エラストマー熱硬化性プラスチック又は熱可塑性プラスチックで製造されてもよい。
【0023】
【0024】
図２Ａは、剛性ポストアセンブリ２００を示し、図２Ｂ及び図２Ｃは、代替の可撓性ポストアセンブリ２０２、２０４を示す。剛性ポストアセンブリ２００及び可撓性ポストアセンブリ２０２、２０４の両者は、いずれも基部２０８と、基部２０８から延在する複数のポスト２１０ａ、２１０ｂ、２１０ｃと、複数の連結エレメント２１２ａ、２１２ｂとを含み、それは、例示された実施例においてピンである。ＥＴ取付蓋１００の各行はいずれも、当該行における第１剛性ストリップ１１０に近接する第１側に図２Ａの剛性ポストアセンブリ２００を収容し、かつ当該行における他の剛性ストリップ１１０に近接する第２側に図２Ｂ（又は図２Ｃ）の可撓性ポストアセンブリを収容するように構成される。
【0025】
ポスト２１０ａ、２１０ｂ、２１０ｃの近位端は、基部２０８に連結され、かつポスト２１０ａ、２１０ｂ、２１０ｃの遠位端は、基部２０８から離間して延在する。対応する複数のポスト２１０ａ、２１０ｂ、２１０ｃ及び基部２０８は、単一の一体部品を形成し、それは、エラストマー材料で形成されてもよい。基部２０８は、ポスト２１０ａ、２１０ｂ、２１０ｃを支持するための適切な剛性を提供するサイズを有するが、基部２０８は、可撓性であってもよい。ポストの遠位端２１１は、任意の被覆成形材料（例えば組織）をポストに堅固に連結するために、追加のアンカー特徴を結合することができる。
【0026】
一般的には、ポスト２１０ａ、２１０ｂ、２１０ｃは、ポリマー材料で製造された一般的なポストであり、その間に組織が成長することを許容するように構成される。各基部２０８から延在するポスト２１０ａ、２１０ｂ、２１０ｃの数および位置は、ＥＴ取付蓋１００における貫通開口１０４の数および位置に対応する。より具体的には、複数のポスト２１０ａ、２１０ｂ、２１０ｃは、ＥＴ取付蓋１００の貫通開口１０４に対応するように互いに隔てられ、それによりポストアセンブリ２００、２０２、２０４をＥＴ取付蓋１００に取り付けるとき、ポスト２１０ａ、２１０ｂ、２１０ｃは、図３Ｅに最適に示されるように、ＥＴ取付蓋１００の貫通開口１０４内に延在する。
【0027】
ポストアセンブリ２００、２０２、２０４の隣接するポスト２１０ａ、２１０ｂ、２１０ｃの間は、連結エレメントであり、これらの連結エレメントは、基部２０８から延在するピン２１２ａ、２１２ｂである。ピン２１２ａ、２１２ｂは、ポスト部材２００、２０２、２０４をＥＴ取付蓋１００に機械的に連結するように構成される。特に、ピン２１２ａ、２１２ｂは、ＥＴ取付蓋１００の第１側に位置する各行の対応するスロットに挿入されるように配置されかつサイズが定められ、それによりポストアセンブリをＥＴ取付蓋１００に固定する。剛性ポストアセンブリ２００のピン２１２ａは、組立者を補助するために、可撓性ポストアセンブリ２０２、２０４のピン２１２ｂと異なってもよい。したがって、図１Ｄに示されるように、ＥＴ取付蓋１００の連結部材１１２ａは、第１寸法を有することができ、剛性ポストアセンブリ２００を収容するために用いられ、ＥＴ取付蓋１００の連結部材１１２ｂは、異なる第２寸法を有する。
【0028】
ピン２１２ａ、２１２ｂは、例えばリップなどのロック特徴を含むことができ、それは、ＥＴ取付蓋１００の第２側１０２ｂに押し付けられることにより、ポストアセンブリ２００、２０２、２０４をＥＴ取付蓋１００に固定することを補助する。ＥＴ取付蓋１００とポストアセンブリ２００、２０２、２０４との間の上記連結機構は、雄部材及び雌部材である。ＥＴ取付蓋１００が雌部材を有するように示され、かつポストアセンブリ２００、２０２、２０４が雄部材を有するように示されるが、理解されるように、ＥＴ取付蓋１００は、雄部材を有してもよく、かつポストアセンブリ２００、２０２、２０４は、雌部材を有してもよい。また、ＥＴ取付蓋とポストアセンブリとの間の任意の他の機械的接続を用いることができる。
【0029】
可撓性ポストアセンブリ２０２、２０４と剛性ポストアセンブリ２００との間の相違点は、以下のとおりである。すなわち、可撓性ポストアセンブリ２０２、２０４は、組織構築物及びその電気刺激に関連する力に対して可撓性である複数の可撓性ポスト２１０ｂ、２１０ｃを含み、剛性ポストアセンブリ２００は、組織構築物及びその電気刺激に関連する力に対して剛性である複数の剛性ポスト２１０ａを含む。
【0030】
図２Ｂの可撓性ポスト２１０ｂは、その近位端に大きな直径（又はサイズ）を有するが、その大部分の長さに沿って小さな直径を有する。これにより、先端の形状を変化させることなく、所定の用途に対してポスト曲げ剛性を調整することを可能にする。可撓性ポスト２１０ｂは、全ての平面（垂直面を含む）において湾曲するように構成されてもよい。図２Ｃの可撓性ポスト２１０ｃは、近位端からその大部分の長さに沿って平坦な矩形状を有し、かつその遠位端に向かって狭い領域に徐々に小さくなる。図２Ｃの可撓性ポスト２１０ｃは、成長した組織構築物及びその電気刺激に関連する一つ又は複数の力に応答して単一の平面において湾曲しながら、横方向平面において剛性を保持するように構成される。
【0031】
剛性ポスト２１０ａは、この分野で周知されるように、可撓性ポスト２１０ｂ、２１０ｃよりも数桁硬くなる。剛性ポスト２１０ａは、適切な形状及び材料で製造され、それにより、それらは、組織力（例えば組織成長及び試験期間の力）に曝されるときに剛性を保持し、可撓性ポスト２１０ｂ、２１０ｃは、適切な形状及び材料で製造され、それによりそれらは、組織力に曝されるときに少なくとも一つ又は複数の方向に湾曲することになる。例えば、剛性ポスト２１０ａは、剛性熱可塑性プラスチックで製造されてもよく、例えばポリスチレン又はポリカーボネートであるが、これらに限定されない。
【0032】
可撓性ポスト２１０ｂ、２１０ｃは、遠位端２１１での磁石を含むことができる。磁石は、エラストマー材料の内部に埋め込まれ、または外面に連結されてもよい。可撓性ポスト２１０ｂ、２１０ｃは、エラストマー材料で製造されてもよい。剛性ポストと可撓性ポストの両者はいずれも、任意の被覆成形された生物組織をポストに堅固に接続するために、遠位端でのキャップを含むことができる。可撓性ポストは、当該組織により生成された力のトランスデューサとして用いられる。ポストの機械的特性及び組織により載荷されたポストの湾曲を知ることにより、組織が任意の所定の時間に生成した力を推定することができ、これは、組織の健康及び機能に関する有意な情報を生成することができる。
【0033】
Ｓｎｉａｄｅｃｋｉの米国公開番号２０１９／００２９５４９は、剛性ポスト、可撓性ポスト及び組織成長の別の詳細を説明し、その全文はあらゆる目的のためにここに結合される。当該出願はさらに剛性／可撓性ポスト対を用いる装置を開示したが、本明細書に記載の剛性ポストは、高剛性熱可塑性プラスチックで製造されかつ高剛性熱可塑性プラスチックに取り付けられるため、本開示よりも高い剛性を実現することができる。上記開示内容は、別の可撓性ポストに埋め込まれた剛性インサートを用いるが、当該剛性インサートは、可撓性材料の基部から突出することにより、ポストは依然として、それから突出した未支持の弾性体基部の湾曲によってＥＴにより生成された負荷で変位することが可能である。我々の装置における剛性ポストアセンブリ２００は、剛性ＥＴ取付蓋１００に堅固に固定され、それにより、それらは、ＥＴ収縮により変位することはない。
【0034】
一実施例において、当該分野で知られる通常の種々の細胞培養及び組織生成技術を用いて、一つの剛性ポスト及び一つの可撓性ポストを含むポスト対をその間にＥＴ構築物を保持するように構成する。他の実施例において、ポスト対は、２つの可撓性ポストを含み、それは、その間にＥＴ構築物を保持するように構成される。
【0035】
図３Ａは、一実施例に係る部分的に組み立てされたＥＴアセンブリ３００の上面アイソメトリック図であり、当該アセンブリは、図１ＡのＥＴ取付蓋１００と、ポストアセンブリ２００及び２０２とを含む。説明を簡略化及び容易にするために、一対の剛性ポストアセンブリ２００及び可撓性ポストアセンブリ２０２のみがＥＴ取付蓋１００の第１側１０２ａの単一の行に連結される。
【0036】
図３Ｂは、当該一対の剛性ポストアセンブリ２００及び可撓性ポストアセンブリ２０２がＥＴ取付蓋１００に連結されないように、図３Ａの部分的に組み立てされたＥＴアセンブリ３００を分解図で示している。図３Ｃは、図３Ａの部分的に組み立てされたＥＴアセンブリ３００の平面図である。図３Ｃは、図３Ｄ及び図３Ｅに示される断面図の断面線位置を示している。ＥＴ取付蓋の単一の行に単一の剛性ポストアセンブリ及び単一の可撓性ポストアセンブリのみが取り付けられるが、全ての行には対応する剛性及び可撓性ポストアセンブリが取り付けられて、図３Ｆに示されるような完全に組み立てされたＥＴアセンブリが形成される。
【0037】
図３Ｄに最適に示されるように、ＥＴ取付蓋１００の連結部材１１２ａは、ポストアセンブリ２００、２０２のピン２１２ａ、２１２ｂを収容して、プレスフィット構造によりポストアセンブリをＥＴ取付蓋に固定する。図３Ｅに最適に示されるように、一つの剛性ポスト２１０ａ及び一つの可撓性ポスト２１０ｂを含む各ポスト対は、貫通開口の対向側において対応する貫通開口内に延在する。剛性ポストアセンブリ２００と可撓性ポストアセンブリ２０２は、図３Ａに最適に示されるように、ＥＴ取付蓋１００に取り付けられるときに、互いに隙間を隔てる。ポスト対２１０ａ、２１０ｂは、ＥＴ取付蓋１００に取り付けられてＥＴアセンブリを形成するときに、その中心軸に対して互いに特定の距離だけ離れ、いくつかの実施例において、当該特定の距離は、この分野で常用されるように、組織構築物がその間に成長することを可能にするように、４ｍｍ～２０ｍｍの間にあってもよい。
【0038】
図３Ｄ及び図３Ｅに示されるように、ＥＴ取付蓋１００のピン１１４は、剛性及び可撓性ポスト２１０ａ、２１０ｂよりも長い。すなわち、ピン１１４の遠位端は、可撓性及び剛性ポスト２１０ａ、２１０ｂの遠位端よりもＥＴ取付蓋１００の第２側１０２ｂから離れている。各ピン１１４はいずれも、ＥＴアセンブリ３００を鋳造プレートに連結するための位置合わせガイドとして用いられ、以下に図５Ａ～図５Ｃを参照しながら説明するとおりである。特に、ピン１１４は、鋳造プレートの収容部材に収容される。
【0039】
図３Ｆは、組み立てされたＥＴアセンブリ３００を示し、それは、完全に組み立てされることにより、各行は、上記したような剛性ポストアセンブリ２００及び可撓性ポストアセンブリ２０２を含み、それは、鋳造プレート４００に連結するために用意される。
【0040】
なお、別の実施例において、各ポスト対における剛性ポストアセンブリ２００は、可撓性ポストアセンブリ２０２（又は２０４）と交換することができ、この場合、可撓性ポスト対が互いに相対的に位置決めされて組織構築物を成長させるために用いられる。これは、いくつかのシーンにおいて好ましい可能性があり、剛性及び可撓性対を用いて信号強度を向上させることができるが、一つの可撓性ポストは組織収縮の全長だけ偏向するため、２つの可撓性ポストと逆であり、２つの可撓性ポストにおいて、各可撓性ポストは半分の長さだけ偏向する。特に、剛性－可撓性対を用いることは有利であるが（このような設計は磁力計に基づく収縮性測定システム（例えばＳｎｉａｋｄｅｃｋｉらに開示された）と組み合わせて用いるときに測定されるＥＴ収縮性の信号強度を向上させることができ、これは２つの可撓性ポスト（ここで各ポストが半分の長さだけ偏向する）と逆であり、単一の可撓性ポストが組織収縮の全長だけ偏向するためである）、２つの可撓性ポスト構造は、光学イメージングに基づく測定手段又は他のタイプの測定においてより柔軟な体内環境などで好適に行うことができるときに有用である。
【0041】
別の実施例において、ＥＴ取付蓋１００と剛性ポストアセンブリ２００は、一体部品（又は本体）を形成するのと同じ材料で製造され、それにより製造効率を向上させる。そして、剛性ポストアセンブリ２００及び可撓性ポストアセンブリ２０２、２０４を取り付けるための好適な手段は、ピン２１２ａ又は２１２ｂを挿入することによるものであるが、剛性ポストアセンブリ２００及び可撓性ポストアセンブリ２０２、２０４は、接着剤、封止剤、治具、被覆成形の機械的インターロックなど又はそれらの任意の組み合わせを含む任意の手段を用いて、ＥＴ取付蓋１００に固定されてもよい。
【0042】
図４Ａは、一実施例に係る鋳造プレート４００（又はマイクロプレート）の上面アイソメトリック図である。図４Ｂは、図４Ａの鋳造プレート４００の平面図であり、それは、図４Ｃの断面図に用いられる横断面線を示めしている。鋳造プレート４００は、鋳造穴４０２のアレイを含み、それは、組織を鋳造して図３ＦのＥＴアセンブリ３００の一対の剛性と可撓性ポストとの間に接着されたＥＴを生成するために用いられる。鋳造穴４０２のアレイは、ＥＴアセンブリのＥＴ取付蓋の貫通開口のアレイに対応する。
【0043】
鋳造プレート４００は、無底穴４０６のアレイを有する第１部分４０４と、凹穴４１０のアレイを有する第２部分４０８とで形成された鋳造穴を含む。無底穴４０６は、平面図において円形であり、凹穴４１０は、平面図において矩形である。例示された実施例において、第１部分４０４と第２部分４０８は、分離した部材である。しかしながら、別の実施例において、無底穴４０６と凹穴４１０は、図４Ｄに示されるように、単一の部材に形成されてもよい。
【0044】
図４Ｃに最適に示されるように、凹穴４１０における側壁は、一定の角度で傾斜することにより、無底穴４０６に近接する凹穴４１０での開口の面積は、凹穴４１０の基部での面積よりも大きくなる。また、凹穴４１０の底部でのコーナーは、湾曲又は面取りされる。凹穴４１０の傾斜側壁及び／又は湾曲又は面取りされた角部は、それから鋳造された組織を除去すること、及び／又は組織鋳造過程中に気泡を形成することを抑制することを許容することに寄与することができる。いくつかの実施例において、鋳造プレート４００は、ポリプロピレンで製造された射出成形部品であり、それによって組織が穴の壁に付着することがより一層抑制される。凹穴は、この実施例において矩形であるが、それらは、状況に応じて、他の形状、例えば、卵形、ドッグボーン形状又は任意の他の適切な形状とすることができる。
【0045】
図４Ｃは、鋳造プレート４００ａの代替実施例を示す断面図である。鋳造プレート４００ａは、鋳造穴の無底穴４０６及び凹穴４１０が本体４０７全体に形成されること以外、図４Ａ～図４Ｃの鋳造プレート４００と同じである。
【0046】
鋳造プレート４００（又は４００ａ）の上面は、ＥＴ取付アセンブリ３００に当接するか又は取り外し可能に連結されて、図５Ａ～図５Ｃに示されるような鋳造アセンブリ５００を形成するように構成される。図３Ａ～図３Ｅは、本発明の詳細を混同することを回避するために、部分的に形成されたＥＴ取付アセンブリを示す。しかしながら、図３Ｆの完全に組み立てされた取付アセンブリは、一般的に鋳造プレート４００に接続されて鋳造アセンブリ５００を形成することであると理解されるべきである。
【0047】
図５Ａは、図３ＡのＥＴアセンブリ３００を含む鋳造アセンブリ５００の平面図であり、当該ＥＴアセンブリは、図４Ａの鋳造プレート４００に取り外し可能に連結される。図５Ｂは、図５Ａの鋳造アセンブリ５００の図５Ａに示される断面線における断面図である。図５Ｃは、図５Ｂの鋳造アセンブリ５００の一部の拡大図である。
【0048】
図５Ｂに最適に示されるように、ＥＴアセンブリ３００の第２側１０２ｂは、鋳造プレート４００の上面に取り外し可能に連結され、それにより、ＥＴアセンブリ３００の外面部は、鋳造プレート４００の外面部の凹部内に配置される。
【0049】
鋳造プレート４００の鋳造穴（すなわち無底穴４０６及び凹穴４１０）は、ＥＴアセンブリ３００の貫通開口と位置合わせされることにより、対をなす剛性ポスト２１０ａ及び可撓性ポスト２１０ｂは、鋳造穴に収容され、無底穴４０６を貫通して凹穴４１０に入るように延在する。一対の剛性ポスト及び可撓性ポストのみを示すが、理解されように、各鋳造穴は、対応する一対の剛性ポスト及び可撓性ポストを含む。
【0050】
前記のように、ＥＴ取付蓋１００の突出リング１１３は、ＥＴ取付蓋１００を鋳造プレート４００に連結するための位置合わせ特徴を提供している。特に、突出リング１１３は、ＥＴアセンブリのポストが鋳造穴の中心領域に位置合わせするように、ＥＴ取付蓋を鋳造プレートの鋳造穴と位置合わせすることにより、より一貫した位置合わせを行うことができ、自動配置が可能となり、組織から組織までの形態もより一貫性のある形態になる。このように組織の整合性を向上させることにより、より再現性の高い磁気センシング、イメージング及び一貫性のある配置を必要とする他のあらゆるものを提供することができる。これらの突出リング１１３は、鋳造プレート４００上だけではなく、他の組織培養プレート上にも適切な形状係数でより正確かつ一貫してＥＴアセンブリ３００を配置することを可能にするため、それらは、ＥＴアセンブリ３００に固定された組織を、これらの組織を評価するための任意のセンサとより一貫性のあるように位置合わせすることができ、より一貫性があり、且つ再現性の高いデータを得ることができる。
【0051】
図５Ｂ及び図５Ｃの断面図に示されていないが、ピン１１４は、位置合わせ特徴を提供しており、ＥＴアセンブリ３００を鋳造プレート４００に配置するとき、当該位置合わせ特徴は、ＥＴアセンブリ３００の位置合わせを補助する。ピン１１４が剛性ポスト２１０ａ及び可撓性ポスト２１０ｂよりも長いため、剛性ポスト２１０ａ及び可撓性ポスト２１０ｂの端部又はそれらの間に形成された任意の組織を鋳造プレート４００に衝突することから保護することができ、これは、剛性ポスト２１０ａ及び可撓性ポスト２１０ｂの端部が鋳造プレート４００の無底穴４０６内に収容される前に、ピン１１４の端部が鋳造プレート４００における対応する開口内に収容されるためである。
【0052】
操作において、ＥＴアセンブリ３００の貫通開口１０４で組織溶液を提供し、当該貫通開口は凹穴４１０内に収容され、ここで、組織は各鋳物内のポスト対の間に鋳造される。組織溶液が十分にゲル化した後、鋳造プレートからＥＴアセンブリ３００を除去することによりそれを鋳造プレートから除去することができる。その後、ＥＴアセンブリ３００は、その上に固定された組織を長期培養するために、任意の他の適切な組織培養マイクロプレートに配置することができる。組織が凹穴４１０内に長時間ゲル化しなければならない状況がいくつか存在する可能性があり、このような状況で、無底穴４０６は、この長期間内に組織を維持するために、追加の栄養基質のための貯蔵器を提供することができる。
【0053】
鋳造アセンブリ５００の各部材では、筋肉組織、神経組織、又はこれらの組み合わせを含む組織鋳物の製造性を向上させる各部材の自動化処理を含む製造性を向上させることを許容する。
【0054】
電気刺激は、ＥＴのより多くの成熟又は生理的発育を誘導することに用いることができる。鋳造過程で対応する各凹穴４１０内（場合によっては無底穴４０６内）に成長して鋳造プレート４００から除去された後にＥＴアセンブリ３００に付着した細胞及び組織は、電気刺激に暴露することができる。図６Ａ及び図６Ｂは、３Ｄ ＥＴ（例えばエンジニアリング心臓組織（ＥＨＴ））の細胞及び組織に電気刺激を与えるための刺激プレート６００（又は電気プレートアセンブリ）の反対側を示している。図６Ａは、刺激プレート６００の上面アイソメトリック図を示し、図６Ｂは、底面アイソメトリック図を示し、かつ図６Ｃは、刺激プレート６００の断面を示す。
【0055】
刺激プレート６００は、バックプレート６０４と、本体６０５とを含み、当該本体は、複数の無底穴６０６を含み、それは、ＥＴアセンブリ３００の貫通開口に対応する。バックプレート６０４は、剛性バックプレートであり、それは、例えば、任意の適切な粘着又は接着材料により本体６０５に連結される。例示された実施例において、バックプレート６０４は、プリント回路板（ＰＣＢ）を含み、当該プリント回路板は、第１側にコネクタに電気的に接続された金などの導電性電極６１０ａ、６１０ｂ（図７Ｂ）を有する。本体６０５の第１側での導電性電極６１０ａ、６１０ｂは、本体６０５の無底穴６０６に位置合わせされる。ＰＣＢは、観察窓６１２ａと、６１２ｂとを含むことができ、それにより刺激プレート６００の下面から無底穴６０６の内容物を観察することを可能にする。観察窓６１２ａ、６１２ｂ及び導電性電極６１０ａ、６１０ｂは、異なるサイズ及び形状が示されるが、それらは、いずれも同じサイズ及び形状であってもよく、又は示されるサイズ及び形状とは異なる他のサイズ及び形状であってもよい。
【0056】
図６Ｃは、刺激プレート６００の断面を示している。本体６０５の複数の無底穴６０６は、組織構築物を収容するように構成される。細胞又は組織構築物は、導電性電極６１０ａ、６１０ｂと電気的に連通し、例えば、容量的に結合するように配置される。電気刺激は、細胞培養物への電気生理学的応答を誘導し、又はその薬物化合物への応答を特徴づけるために用いられる。
【0057】
導電性電極６１０ａ及び６１０ｂは、例えば、ＰＣＢにおける接触パッドやコネクタ、各種様々なトレース及びビアホール、並びに外部電源による電気信号の提供など、この分野における一般的な方式により、刺激器とインタフェース接続されるように構成される。バックプレート６０４は、さらに透明フィルムを含むことができ、それは、例えば、任意の適切な粘着又は接着材料によりＰＣＢの第１側６０２ａに連結されて、刺激プレートの無底穴を密封する。
【0058】
図７Ａ及び図７Ｂは、図６Ａ及び図６ＢのＰＣＢをより詳細に示す。図７Ｂに示されるように、ＰＣＢの底側には、接地平面及びコネクタを有するが、いくつかの実施例において、コネクタは上側に位置してもよい。コネクタは、刺激器のコネクタと連結するための帯状コネクタであってもよい。他の実施例において、コネクタの代わりに、第２側６Ｂでの露出した接触パッドは、刺激プレートにおける対応する行の穴のうちの各穴を貫通することに十分な電流を提供するために、導電性電極６１０ａ及び６１０ｂを刺激器に連結するために用いられてもよい。
【0059】
図８Ａは、刺激プレート６００のための代替的なバックプレートを示す。図８Ａは、刺激プレートのバックプレート８００の第１面８０２ａの平面図であり、図８Ｂは、バックプレート８００の第２面８０２ｂの平面図である。当該実施例において、刺激プレート８００は、透明プラスチックフィルム８０２を含むが、他の実施例において、当該フィルムは、ポリイミドのような半透明又は不透明フィルムで製造されてもよい。第１面８０２ａは、透明プラスチックフィルム８０２と、対をなして配置される導電性電極８０３とから構成される。第１面８０２ａは、導電性電極８０３が本体６０５の無底穴６０６と位置合わせされるように、任意の適切な粘着又は接着材料により本体６０５に直接接着されるように構成される。
【0060】
バックプレート８００の第２面８０２ｂは、電気接点８０５を含み、それは、この分野で公知のビア及びトレースを介して第１面８０２ａの導電性電極８０３に連結される。透明フィルムは、組織構築物の封止のために用いられ、当該組織構築物は、本体６０５の無底穴６０６内に設けられてもよい。本体６０５の各無底穴６０６は、電気的に絶縁されてもよく、又は複数の穴（例えば一行の穴）は、トレースを介して電気的に接続されてもよい。導電性電極８０３は、例えば、示された半円形パターンのように、所定の応用に最適な幾何学的形状を有してもよく、蛇行形状及びフラクタル幾何学的形状を用いてもよい。導電材は、金属、セラミックス、高分子材料、導電性ペースト、またはこれらの混合物または層であってもよい。これらの材料のいくつかの例は、金、白金、グラファイト、カーボンナノチューブ、ＰＥＤＯＴ、ＰＥＤＯＴ ＰＳＳ、酸化インジウムスズ及びスパッタリング酸化イリジウムを含み、それらは、電極の電荷注入能力を向上させることができる。
【0061】
テストを行うために、ＥＴアセンブリ３００における対をなす剛性ポスト及び可撓性ポストに形成された３Ｄ組織構築物を刺激プレート６００の本体６０５の各無底穴６０６に挿入する。組織培養プレートの底部から組織培養物を刺激することは、従来技術よりも優れた、改良されたテスト方法を提供しており、それらは、工業標準プロセスを用いて効率的に製造することができ、かつ交換しやすいためである。
【0062】
別の実施例は、バックプレートの代わりに用いることができる直接基板ベース刺激プレートを提供する。刺激電極のバックプレートにおけるサイズ及び／又はレイアウトは、任意の形態に構成されてもよく、それは、様々なタイプ、サイズ、形状又は組織部品の電気刺激を最適化するように設計される。さらに別の実施例において、バックプレート上の電極パターンは、ＰＥＤＯＴ：ＰＳＳなどの電気インピーダンスが非常に低い導電性材料で基板の大きな面積を覆う直接基板ベース電気刺激設計を有することができる。
【0063】
従来の電気ＥＴ刺激装置は、刺激蓋であり、それは、組織培養マイクロプレートの頂部から各穴の基質浴に下向きに突出するロッド電極を利用してその中の組織培養物を刺激する。図９Ａ～図９Ｃは、電気刺激蓋９００に対する改良を例示し、当該刺激蓋は、下方へ向けてマイクロプレート内に突出するロッド電極９０４を利用する。刺激蓋９００は、ＥＴ素子３００に固定された細胞および組織構築物に電気刺激を与える。図９Ａは、刺激蓋９００の各部材の等距離分解図を示し、図９Ｃは、完全に組み立てされた刺激蓋９００の底面図を示す。
【0064】
図９Ａを参照すると、刺激蓋９００は、外部電気刺激器のコネクタに連結されるか又はオンボード電気刺激モジュールを結合するように構成されるプリント回路板（ＰＣＢ）９０２を含む。
【0065】
刺激蓋９００は、複数の取り外し可能なロッド電極９０４、例えばグラファイトロッド電極又は任意の他の適切な材料をさらに含み、それは、対をなして配置され、かつＰＣＢ９０２に電気的に接続される。一実施例において、ロッド電極９０４の直径は、３／１６インチである。しかしながら、他の実施例において、より小さいか又はより大きい直径の電極又は非ロッド状電極を用いてもよい。
【0066】
電極９０４の第１端は、ＰＣＢ９０２上のポゴピン９１２に接触して押し付けられることにより、ＰＣＢ９０２に連結される。図９Ｂは、電極９０４を収容するためのＰＣＢ９０２の対応するソケット９１４内に位置する一対のポゴピン９１２の部分拡大図を示す。特に、電極９０４の第１端は、ソケット９１４内に収容されかつバネで付勢されたポゴピン９１２に押し付けられることにより、電気部品への電気的接続を提供し、例えば、この分野で常用のＰＣＢ９０２の接点、パッド、ビア及びトレースなどである。ＰＣＢ９０２に取り付けられたポゴピン９１２は、ソケット９１４に摩擦嵌合することにより、ロッド電極９０４と確実に電気的に接続される。ロッド電極９０４は、ＰＣＢ９０２のソケット９１４内において取り外し可能である。したがって、ロッド電極９０４は、必要に応じて単独で交換することができ、それにより刺激蓋９００のハイスループット電気刺激研究における商用利用性を向上させることができる。
【0067】
対をなすロッド電極の第２端は、組織構築物を刺激するためにマイクロプレートの穴に挿入されるように配置されて構成される。刺激蓋９００は、さらにＰＣＢ９０２に機械的に連結されるアライナ９０６を含む。アライナ９０６は、貫通開口を含み、それは、マイクロプレートの穴に対応するか又は重なるように配置されることにより、各対のロッド電極の第２端が対応するマイクロプレート穴に延在するようにする。操作において、刺激器は、ロッドを充電する信号を提供し、信号は、マイクロプレートの穴内の細胞及び組織培養物を刺激する。
【0068】
ＰＣＢ９０２とアライナ９０６との間には、エラストマー材料からなるガスケット９０８が設けられる。ガスケットは、刺激蓋をマイクロプレートに連結するときにマイクロプレート内及び刺激蓋９００の下方の組織培養物の無菌性を確保するための封止を提供する。ＰＣＢとアライナとの間の隙間は、さらに硬化可能なポリマー材料で封止することができる。
【0069】
図１０Ａは、図９Ｃの刺激蓋９００が部分的に組み立てされたＥＴアセンブリ３００に取り付けられ、当該アセンブリが組織培養に適するマイクロプレート装置の頂部に位置することを示す。アライナ９０６は、周辺にあるリップを含み、当該リップは、マイクロプレート装置の周辺を囲む凹部と嵌合する。図１０Ｂは、ＥＴアセンブリ３００に完全に取り付けられた図９Ｃの刺激蓋９００を示し、ここでアライナ９０６のリップがＥＴアセンブリ３００の凹部に取り付けられる。一つのマイクロプレート穴に示されるように、ロッド電極の第２端は、マイクロプレート穴を貫通して組織構築物に向かって延在する。細胞又は組織構築物は、ロッド電極と電気的に連通し、例えば容量的に結合される。電気刺激は、細胞培養物への電気生理学的応答を誘導し、又はその薬物化合物への応答を特徴づけるために用いられる。
【0070】
図１１は、別の実施例に係るポスト２１０ｄを示す。ポストは、上記ポスト２１０ａと同じであり、しかしながら、ポスト２１０ｄには、一層又は多層の導電性材料２３０が塗布され、例えば、第１層の金及び第２層の導電性ポリマーである。導電層は、外部機器とインタフェース接続するための電気的接触パッドを形成するために基部２０８まで延在することができる。剛性ポストのみを示すが、可撓性ポストには導電性材料層が被覆されてもよい。
【0071】
２３０で塗布されたポスト２１０ａは、組織の挙動を操作・評価するために、組織に電気信号を送信、又は組織からの電気信号を記録するために用いられてもよい。導電性被覆層２３０の部分は、さらに絶縁層２３２に被覆することができ、それにより組織構築物に露出する導電領域を制限する。導電層２３０の追加的なパターニングを行うことにより、複数のドットから独立して電気的活動ＥＴを記録または刺激することができる複数のトレースを形成することができる。
【0072】
ポスト（より具体的には、可撓性ポスト）の一つ以上の導電層又はこのような導電層のトレースは、可撓性電極材料で形成することができる。商業会社のＢＭＳＥＥＤのウェブサイト（ｗｗｗ．ｂｍｓｅｅｄ．ｃｏｍ）にはポストに形成可能なこのような可撓性電極アレイの例が開示され、このウェブサイトは引用によりここに結合される。また、このような導電層又はそのトレースは、ＥＴの電気生理（電気刺激があるか又は刺激がない）を測定するための外部システムと共に動作し、単独で又はＥＴの収縮性の測定と連動するように構成されてもよい。
【0073】
本発明の消耗品装置は、ＥＴ鋳造過程における可変性を低減するように独特に設計される。現在の組織鋳造手段は、本質的に学術的である。これらの手段は、技術的に強く、かつ広範な専門知識を有しても再生可能な方式でこの技術を他のユーザに伝達しにくい。本発明のＥＴアセンブリ及び鋳造アセンブリは、形状がよく一致する組織を製造することを可能にし、これらの組織は、各鋳造穴の中心に位置合わせされる。これは、３Ｄ ＥＴのロバスト形成を可能にし、これらの３Ｄ ＥＴは、それ自体を各ポストの周りに完全に巻き付けかつ組織鋳造過程中の位置ずれに関連する可変性を減少させる。鋳造穴内の溝の独特な設計は、それらのゲル化を可能にする鋳造穴から、それらのそれぞれの成長用基質を含む組織培養プレートに成功的に転移することを可能にする。これは、絶対的に重要なものであり、新たに形成された組織が脆弱であり、かつ任意の軽微な鋳造基板との接着は鋳造されたＥＴの致命的な障害を引き起こす可能性があるからである。また、格子（又はＥＴプレート）から延在するピンの設計は、格子を新しい培養プレートに転移して基質交換、薬物試験又はイメージング目的などに用いられるときに組織を処理することに寄与する。これらのピンが適切な位置にない場合、不慮に脆弱組織に衝突せずかつ潜在的に培養された細胞を破壊せず格子を転移することは困難である。本明細書に提供される開示内容及び図面を閲覧すると、これらの利点は全て明らかである。
【0074】
本発明の各種実施例は、光学イメージングによる収縮性測定及び磁気センサによる収縮性測定の両方において、組織成長をハイスループットで実現する方法及びシステムを提供する。特に、本明細書に記載の互換性のある鋳造プレートと共に用いる場合、本明細書に記載のＥＴアセンブリは、心臓及び他のＥＴ収縮性測定において顕著な利点を有する。また、可撓性磁気ポストを有する２ポストマルチウェルＥＴシステムアセンブリをＳｎｉａｄｅｃｋｉの米国公開番号２０１９／００２９５４９に開示された磁気センサによる収縮力測定システムと互換性を持たせるか又はその一部とすることができる。
【0075】
また、本発明の各種特徴は、ＥＴ構築物を鋳造して生成するための消耗品装置の製造可能性、再現性及び効用を改良し、かつ各種ＥＴ構築物の収縮力の費用対効果を有するハイスループット測定を実現している。同様に、本発明の刺激プレート及び刺激蓋の各種特徴は、ハイスループット方式で各種の細胞又は組織構築物を電気的に刺激する方面で優位性を有し、同時にこのような消耗品刺激装置の製造可能性、再現性及び効用を改良している。
【0076】
また、刺激蓋と互換ＥＴアセンブリの組み合わせは、同時又は非同時電気刺激下で組織構築物の収縮力を監視又は測定するための有利な手段を提供している。
【0077】
上記したように、穴内に成長する例示的な組織構築物は、エンジニアリング心臓組織（ＥＨＴ）であってもよく、それは、２つのポストの間に形成されて吊り下げられる。これらの３Ｄ心臓組織は、本開示の鋳造プレートで鋳造された心筋細胞により生成することができ、かつ本開示の２ポストＥＴアセンブリで構築することができる。
【0078】
本開示の装置を用いて心筋細胞のＷＴＣ１１細胞株から例示的な３Ｄ心臓組織を作製した。以下の画像は、固定された組織を有するＥＴアセンブリを示す図である。
【0079】
［写真１］
【0080】
以下の写真画像は、可撓性及び剛性ポスト２００、２０２又は２０４の２つのポストに固定された組織の拡大画像を示す。
【0081】
［写真２］
【0082】
上述した各種実施例は、組み合わせて他の実施例を提供することができる。本明細書に言及され、及び／又は出願データテーブルに列挙された全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許公開は、いずれも参照によりここに全文結合される。必要であれば、実施例の各態様を修正して様々な特許、出願及び開示の概念を採用して他の実施例を提供することが可能である。
【0083】
以上の詳細な説明に基づいて、実施例に対してこれら及び他の変更を行うことができる。一般的に、添付の請求項において、用いられる用語は、請求項を明細書及び請求項に開示された具体的な実施例に限定するものと解釈されるべきではなく、全ての可能な実施例及びこれらの請求項に許可された同等物の全ての範囲を含むと解釈されるべきである。したがって、請求項は、本開示に限定されないものとする。
【0084】
本願は、２０２０年２月２５日に提出された米国仮出願番号６２／９８１、４４６の優先権の利益を要求し、当該出願は引用によりここに全文結合される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【国際調査報告】