特表 2023-524200 コロナウイルス中和抗体の検出アッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-09

(54)【発明の名称】コロナウイルス中和抗体の検出アッセイ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/47 20060101AFI20230602BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20230602BHJP

   C12Q 1/34 20060101ALI20230602BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230602BHJP

   C12Q 1/6897 20180101ALI20230602BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230602BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20230602BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20230602BHJP

【ＦＩ】

C12N15/47

C12Q1/04 ZNA

C12Q1/34

C12N7/01

C12Q1/6897 Z

G01N33/53 V

G01N33/569 L

G01N33/536 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022562981

(86)(22)【出願日】2021-04-19

(85)【翻訳文提出日】2022-12-12

(86)【国際出願番号】 US2021027909

(87)【国際公開番号】W WO2021212096

(87)【国際公開日】2021-10-21

(31)【優先権主張番号】63/012,074

(32)【優先日】2020-04-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/012,066

(32)【優先日】2020-04-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/020,445

(32)【優先日】2020-05-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/029,267

(32)【優先日】2020-05-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/078,214

(32)【優先日】2020-09-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/151,623

(32)【優先日】2021-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(71)【出願人】

【識別番号】522403893

【氏名又は名称】ヴィリアド インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＶＹＲＩＡＤ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100139723

【弁理士】

【氏名又は名称】樋口 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100116540

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 香

(72)【発明者】

【氏名】ラッセル，スティーヴン ジェイ

(72)【発明者】

【氏名】パン，カー ホワイエ

(72)【発明者】

【氏名】レッヒ，パトリツィア

(72)【発明者】

【氏名】ファンデルガスト，リアーナ

(72)【発明者】

【氏名】キャリー，ティモシー

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ03

4B063QQ10

4B063QR16

4B063QR48

4B063QS28

4B063QS36

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

(57)【要約】

本開示は、試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するための方法、並びに関連する組成物及びキットを提供する。本開示の方法は組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子を使用し、ここでＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）は、コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体に置き換えられている。ある具体的実施形態では、上記Ｓ糖タンパク質は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来し、上記方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の存在を決定するために使用される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するための方法であって、前記方法は：
ａ）前記試料を組換えラブドウイルス粒子と接触させるステップであって、ここでラブドウイルス糖タンパク質（Ｇ）はコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられ、前記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、第１の標的細胞及び第２の標的細胞の感染を仲介できる、ステップ；
ｂ）ステップ（ａ）の後で、前記組換えラブドウイルス粒子を、レポータータンパク質の第１の部分を発現する前記第１の標的細胞、及び前記レポータータンパク質の第２の部分を発現する前記第２の標的細胞と接触させて、前記レポータータンパク質の前記第１の部分及び前記第２の部分両方を含みかつ検出可能なレポーターシグナルを生成する合胞体を形成するステップであって、ここで前記第１の標的細胞及び前記第２の標的細胞は、前記組換えラブドウイルス粒子との接触時に互いに融合できる、ステップ；
ｃ）ステップ（ｂ）の後で、前記細胞内の前記レポーターシグナルを測定するステップ、並びに
ｄ）ステップ（ｃ）で測定された前記レポーターシグナルを対照と比較するステップ
を含む、方法。

【請求項2】

前記第１の標的細胞及び／又は前記第２の標的細胞の両方は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１の標的細胞はＶｅｒｏ－ＤＳＰ１（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－１－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７３）であり、前記第２の標的細胞はＶｅｒｏ－ＤＳＰ２（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－２－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７４）である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記レポータータンパク質の前記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１～２２９を含み、前記レポータータンパク質の前記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸２３０～３１１を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記レポータータンパク質の前記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１～１５５を含み、前記レポータータンパク質の前記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１５６～３１１を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記レポータータンパク質の前記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ変異体ＲＬｕｃ８のアミノ酸１～１５５を含み、前記レポータータンパク質の前記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ変異体ＲＬｕｃ８のアミノ酸１５６～３１１を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記レポータータンパク質の前記第１の部分は、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）又はその変異体のアミノ酸１～１５６を含み、前記レポータータンパク質の前記第２の部分は、ＧＦＰ又はその変異体のアミノ酸１５７～２３１を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記レポータータンパク質の前記第１の部分は、スーパーフォルダーＧＦＰのアミノ酸１～２１３を含み、前記レポータータンパク質の前記第２の部分は、スーパーフォルダーＧＦＰのアミノ酸２１４～２３０を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記レポータータンパク質の前記第１の部分は、スーパーフォルダー黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のアミノ酸１～１５４を含み、前記レポータータンパク質の前記第２の部分は、スーパーフォルダーＹＦＰのアミノ酸１５５～２６２を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するための方法であって、前記方法は：
ａ）前記試料を組換えラブドウイルス粒子と接触させるステップであって、ここで（ｉ）ラブドウイルス糖タンパク質（Ｇ）はコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられ、前記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、標的細胞の感染を仲介でき、（ｉｉ）前記ラブドウイルス粒子は、レポータータンパク質、及び／又は前記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、ステップ；
ｂ）ステップ（ａ）の後で、前記組換えラブドウイルス粒子を前記標的細胞と接触させるステップ；
ｃ）ステップ（ｂ）の後で、前記細胞内の前記レポーターシグナルを測定するステップ、並びに
ｄ）ステップ（ｃ）で測定された前記レポーターシグナルを対照と比較するステップ
を含む、方法。

【請求項11】

前記組換えラブドウイルス粒子は、前記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記レポータータンパク質をコードする核酸配列は、前記コロナウイルスＳ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体をコードする核酸配列と、ラブドウイルス巨大（Ｌ）タンパク質をコードする核酸配列との間に挿入される、請求項１１記載の方法。

【請求項13】

前記標的細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞、Ｖｅｒｏ－ＴＲＭＰＳＳ２細胞、又はＶｅｒｏ－Ｅ６細胞である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記標的細胞はアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、機能性ラブドウイルスＧ遺伝子を欠いており、前記コロナウイルスＳ糖タンパク質、その断片又は誘導体をコードする、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、ラブドウイルスＧ遺伝子を欠いており、前記コロナウイルスＳ糖タンパク質、その断片又は誘導体をコードする、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記組換えラブドウイルス粒子は組換えベシクロウイルス粒子である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記組換えベシクロウイルス粒子は組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記レポータータンパク質はルシフェラーゼを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記ルシフェラーゼは、ウミシイタケルシフェラーゼ、ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼ、（ｄＣｐＧ）ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃレポーター、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）、ＭｅｔＬｕｃ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉルマジンタンパク質、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉルミナーゼ（ｌｕｍｉｎａｚｅ）タンパク質、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼＹＹ５変異体、ホタルルシフェラーゼＬＧＲ変異体、ホタルルシフェラーゼ変異体Ｅ、及びこれらの断片又は誘導体から選択される、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記レポータータンパク質は蛍光タンパク質を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰ様蛍光タンパク質、（ＧＦＰ－ｌｉｋｅ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化型青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、強化型青緑色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）；赤色蛍光タンパク質、スーパーフォルダーＧＦＰ、スーパーフォルダーＹＦＰ、橙色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、小型超赤色蛍光タンパク質、ＦＭＮ結合蛍光タンパク質、ｄｓＲｅｄ、ｑＦＰ６１１、Ｄｒｏｎｐａ、ＴａｇＲＦＰ、ＫＦＰ、ＥｏｓＦＰ、ＩｒｉｓＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ、Ｋａｅｄｅ、ＫｉｋＧｒ１、鮮緑色蛍光タンパク質、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びこれらの断片又は誘導体から選択される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記レポーターシグナルを得るために、レポータータンパク質基質を添加するステップを含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記レポータータンパク質はルシフェラーゼを含み、前記レポータータンパク質基質は、ルシフェリン、セレンテラジン、又はＥｎｄｕＲｅｎルシフェラーゼ基質を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記組換えラブドウイルス粒子は、複製可能なラブドウイルス粒子である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質、その断片又は誘導体は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質は、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片は、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片である、請求項２６に記載の方法。

【請求項31】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７７％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項２６に記載の方法。

【請求項34】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＳ１サブユニットに対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項２６に記載の方法。

【請求項35】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４～６８４に対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項２６に記載の方法。

【請求項36】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＲＢＤドメインに対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項２６に記載の方法。

【請求項37】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸３１９～５４１に対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項２６に記載の方法。

【請求項38】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、ラブドウイルスゲノムの同じ位置に挿入された全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質を発現するラブドウイルスゲノムを含む同等の組換えラブドウイルス粒子と比較して、より融合誘導性が高い組換えラブドウイルス粒子をもたらす、請求項２６に記載の方法。

【請求項39】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、表８及び９に列挙された１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／又は置換を含み、前記挿入、欠失、及び／又は置換の位置は、配列番号１に関連して特定される、請求項２６に記載の方法。

【請求項40】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項41】

ステップ（ａ）は、前記試料を２つ以上の異なる組換えラブドウイルス粒子と接触させるステップを含み、ここで前記２つ以上の異なる組換えラブドウイルス粒子は、異なるコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質、その断片又は誘導体を含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記２つ以上の異なるコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質、その断片又は誘導体のうちの少なくとも１つは、配列番号１、配列番号３、及び配列番号４４から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は表８及び９に列挙された１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／若しくは置換を含み、ここで前記挿入、欠失、及び／又は置換の位置は、配列番号１に関連して特定される、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）中和抗体の存在を決定するための方法であって、前記方法は：
ａ）前記試料を、複製可能な組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子と接触させるステップであって、前記組換えＶＳＶ粒子のゲノムは、機能性ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）遺伝子を欠いており、また、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片をコードする、ステップ；
ｂ）ステップ（ａ）の後で、前記組換えＶＳＶ粒子を、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１細胞とＶｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞との混合物と接触させるステップ；
ｃ）ステップ（ｂ）の後で、前記細胞のルシフェラーゼシグナル及び／又はＧＦＰシグナルを測定するステップ、並びに
ｄ）ステップ（ｃ）で測定された前記シグナルを対照と比較するステップ
を含む、方法。

【請求項44】

試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）中和抗体の存在を決定するための方法であって、前記方法は：
ａ）前記試料を、複製可能な組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子と接触させるステップであって、（ｉ）前記組換えＶＳＶ粒子のゲノムは、機能性ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）遺伝子を欠いており、また、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片をコードし、（ｉｉ）前記組換えＶＳＶ粒子の前記ゲノムは更に、ルシフェラーゼタンパク質をコードする、ステップ；
ｂ）ステップ（ａ）の後で、前記組換えＶＳＶ粒子を、Ｖｅｒｏ細胞、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞、及びＶｅｒｏ－Ｅ６細胞から選択される細胞と接触させるステップ；
ｃ）ステップ（ｂ）の後で、前記細胞のルシフェラーゼシグナルを測定するステップ、並びに
ｄ）ステップ（ｃ）で測定された前記シグナルを対照と比較するステップ
を含む、方法。

【請求項45】

前記全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項４３又は４４に記載の方法。

【請求項46】

１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項４３又は４４に記載の方法。

【請求項47】

１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた前記全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、表８及び９に列挙された１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／又は置換を含み、前記挿入、欠失、及び／又は置換の位置は、配列番号１に関連して特定される、請求項４３又は４４に記載の方法。

【請求項48】

１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号４４のアミノ酸配列からなる、請求項４３又は４４に記載の方法。

【請求項49】

ステップ（ａ）は、前記試料を２つ以上の異なる組換えＶＳＶ粒子と接触させるステップを含み、ここで前記２つ以上の異なる組換えＶＳＶ粒子は、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた異なる全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質又はその断片を含む、請求項４３～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた前記２つ以上の異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質又はその断片のうちの少なくとも１つは、配列番号１、配列番号３、及び配列番号４４から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は表８及び９に列挙された１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／若しくは置換を含み、ここで前記挿入、欠失、及び／又は置換の位置は、配列番号１に関連して特定される、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

ステップ（ｂ）の後及びステップ（ｃ）の前に、細胞はトリプシンに曝露される、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

前記組換えラブドウイルス粒子は、変異型ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質を含む、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

前記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、変異型ラブドウイルスＭタンパク質をコードする、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記組換えラブドウイルス粒子は、メチオニン５１における変異を含む変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質を含む、組換えＶＳＶ粒子である、請求項５２又は５３に記載の方法。

【請求項55】

メチオニン５１における前記変異は、メチオニン（Ｍ）からアルギニン（Ｒ）へのものである、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列からなる、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記組換えラブドウイルス粒子は、野生型ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質を含む、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、野生型ラブドウイルスＭタンパク質をコードする、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記組換えラブドウイルス粒子は、配列番号９のアミノ酸配列を含む野生型ＶＳＶ Ｍタンパク質を含む、組換えＶＳＶ粒子である、請求項５８又は５９に記載の方法。

【請求項61】

前記野生型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列からなる、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記試料は血清又は血漿である、請求項１～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記試料は唾液である、請求項１～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項64】

前記試料は乾燥血斑である、請求項１～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項65】

前記方法は更に、前記試料を約１：１０～約１：３２０に希釈するステップを含む、請求項６２～６４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項66】

前記方法は更に、前記試料を約１：１００に希釈するステップを含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記方法は更に、前記試料を約１：２０に希釈するステップを含む、請求項６４又は６５に記載の方法。

【請求項68】

前記方法は更に、前記組換えラブドウイルス粒子を約２００～８００ｐｆｕ／ウェルに希釈するステップを含む、請求項１～６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項69】

前記試料は熱不活化されている、請求項６２～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

前記試料は熱不活化されていない、請求項６２～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

前記方法は更に、細菌汚染を防止するために、前記試料を抗生物質で処理する、及び／又は前記試料をろ過するステップを含む、請求項６２～７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

前記対照は、コロナウイルス中和抗体を含まない対照試料を用いて得られたレポーターシグナルであり、前記方法は、ステップ（ｃ）で得られた前記レポーターシグナルが前記対照に比べて低減されている場合に、試験された前記試料がコロナウイルス中和抗体を含むと結論づけるステップを含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項73】

前記方法は、ステップ（ｃ）で得られた前記レポーターシグナルが前記対照に比べて５０％を超えて低減されている場合に、試験された前記試料がコロナウイルス中和抗体を含むと結論づけるステップを含む、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

ステップ（ｃ）で得られた前記レポーターシグナルを：コロナウイルス中和抗体；又はコロナウイルスＳ糖タンパク質と、前記コロナウイルスＳ糖タンパク質が前記標的細胞上で相互作用するタンパク質との間の相互作用を遮断する分子；又はこれらのいずれの組み合わせ、を含む対照試料を用いて得られたレポーターシグナルと、比較するステップを更に含む、請求項７２又は７３に記載の方法。

【請求項75】

前記方法は、前記レポーターシグナルを、コロナウイルス中和抗体、又はコロナウイルスＳ糖タンパク質と、前記コロナウイルスＳ糖タンパク質が前記標的細胞上で相互作用するタンパク質との間の相互作用を遮断する分子、又はこれらのいずれの組み合わせ、を含む対照試料の連続希釈物から決定された検量線と、比較することによって、試験された前記試料中のコロナウイルス中和抗体の濃度を決定するステップを含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記レポーターシグナルを補正することによって、前記組換えラブドウイルス粒子と接触していない対照試料から測定されるバックグラウンドシグナルを除去する、請求項１～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

前記レポーターシグナルは、ステップ（ｂ）の約１８～３０時間後に測定される、請求項１～７６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項78】

前記レポーターシグナルは、ステップ（ｂ）の約２４～３０時間後に測定される、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

ステップ（ａ）において、前記試料は前記組換えラブドウイルス粒子と、室温で約３０分間接触させられる、請求項１～７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

前記方法は高スループットフォーマットで実施される、請求項１～７９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項81】

前記方法は９６ウェルプレートで実施される、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記第１の標的細胞及び前記第２の標的細胞の密度は約６×１０^４細胞／ウェルである、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

組換えラブドウイルス粒子であって、ここでラブドウイルス糖タンパク質（Ｇ）はコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられ、前記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、標的細胞の感染を仲介できる、組換えラブドウイルス粒子。

【請求項84】

前記ラブドウイルス粒子は更に、レポータータンパク質、及び／又は前記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、請求項８３に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項85】

前記ラブドウイルス粒子は、前記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、請求項８４に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項86】

前記レポータータンパク質をコードする核酸配列は、前記コロナウイルスＳ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体をコードする核酸配列と、ラブドウイルス巨大（Ｌ）タンパク質をコードする核酸配列との間に挿入される、請求項８５に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項87】

前記組換えラブドウイルス粒子は、複製可能なラブドウイルス粒子である、請求項８３～８６のいずれか１項に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項88】

前記組換えラブドウイルス粒子は組換えベシクロウイルス粒子である、請求項８３～８７のいずれか１項に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項89】

前記組換えベシクロウイルス粒子は組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子である、請求項８８に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項90】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質、その断片又は誘導体は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来する、請求項８３～８９のいずれか１項に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項91】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質は、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質である、請求項９０に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項92】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項93】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項９２に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項94】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片は、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片である、請求項９０に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項95】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項９４に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項96】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項９５に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項97】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７７％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項９０に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項98】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＳ１サブユニットに対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項９０に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項99】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４～６８４に対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項９０に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項100】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＲＢＤドメインに対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項９０に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項101】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸３１９～５４１に対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項９０に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項102】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、ラブドウイルスゲノムの同じ位置に挿入された全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質を発現するラブドウイルスゲノムを含む同等の組換えラブドウイルス粒子と比較して、より融合誘導性が高い組換えラブドウイルス粒子をもたらす、請求項９０に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項103】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、表８及び９に列挙された１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／又は置換を含み、前記挿入、欠失、及び／又は置換の位置は、配列番号１に関連して特定される、請求項９０に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項104】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項９０に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項105】

前記組換えラブドウイルス粒子は、変異型ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質を含む、請求項８３～１０４のいずれか１項に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項106】

前記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質をコードする、請求項１０５に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項107】

前記組換えラブドウイルス粒子は、メチオニン５１における変異を含む変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質を含む、組換えＶＳＶ粒子である、請求項１０５又は１０６に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項108】

メチオニン５１における前記変異は、メチオニン（Ｍ）からアルギニン（Ｒ）へのものである、請求項１０７に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項109】

前記変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１０８に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項110】

前記変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列からなる、請求項１００に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項111】

前記組換えラブドウイルス粒子は、野生型ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質を含む、請求項８３～１０４のいずれか１項に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項112】

前記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、野生型ラブドウイルスＭタンパク質をコードする、請求項１１１に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項113】

前記組換えラブドウイルス粒子は、配列番号９のアミノ酸配列を含む野生型ＶＳＶ Ｍタンパク質を含む、組換えＶＳＶ粒子である、請求項１１１又は１１２に記載の組換えラブドウイルス粒子。

【請求項114】

前記野生型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列からなる、請求項１１３に記載の組換えＶＳＶ粒子。

【請求項115】

組換えラブドウイルス粒子のウイルスエンベロープでの発現のために、ラブドウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラブドウイルスリンタンパク質（Ｐ）、及びラブドウイルス巨大タンパク質（Ｌ）、又はこれらの機能性断片若しくは誘導体をコードし、更に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイク（Ｓ）糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項116】

前記ポリヌクレオチドは更に、レポータータンパク質をコードする、請求項１１５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項117】

前記レポータータンパク質をコードする核酸配列は、前記コロナウイルスＳ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体をコードする核酸配列と、ラブドウイルス巨大（Ｌ）タンパク質をコードする核酸配列との間に挿入される、請求項１１６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項118】

前記組換えラブドウイルス粒子は複製可能なラブドウイルス粒子である、請求項１１５～１１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項119】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質、その断片又は誘導体は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来する、請求項１１５～１１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項120】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質は、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質である、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項121】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１２０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項122】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１２１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項123】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１２１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項124】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片は、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片である、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項125】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１２４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項126】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項１２５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項127】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項128】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７７％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項129】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＳ１サブユニットに対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項130】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４～６８４に対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項131】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＲＢＤドメインに対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項132】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸３１９～５４１に対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項133】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、ラブドウイルスゲノムの同じ位置に挿入された全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質を発現するラブドウイルスゲノムを含む同等の組換えラブドウイルス粒子と比較して、より融合誘導性が高い組換えラブドウイルス粒子をもたらす、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項134】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、表８及び９に列挙された１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／又は置換を含み、ここで前記挿入、欠失、及び／又は置換の位置は、配列番号１に関連して特定される、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項135】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項136】

前記組換えラブドウイルス粒子は組換えベシクロウイルス粒子である、請求項１１５～１３５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項137】

前記組換えベシクロウイルス粒子は組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子である、請求項１３６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項138】

試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するためのキットであって、前記キットは：
ａ）組換えラブドウイルス粒子であって、ここでラブドウイルス糖タンパク質（Ｇ）はコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられ、前記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、第１の標的細胞及び第２の標的細胞の感染を仲介できる、組換えラブドウイルス粒子；
ｂ）（ｉ）レポータータンパク質の第１の部分を発現する前記第１の標的細胞、及び（ｉｉ）前記レポータータンパク質の第２の部分を発現する前記第２の細胞であって、前記第１の標的細胞及び前記第２の標的細胞は、前記組換えラブドウイルス粒子と接触したときに互いに融合でき、前記融合は、検出可能なレポーターシグナルの生成をもたらす、前記第１の標的細胞及び前記第２の細胞；
ｃ）任意に、コロナウイルス中和抗体を含まない対照試料；
ｄ）任意に、コロナウイルス中和抗体；又はコロナウイルスＳ糖タンパク質と、前記コロナウイルスＳ糖タンパク質が標的細胞上で相互作用するタンパク質との間の相互作用を遮断する分子；又は標的細胞の融合を遮断する分子；又はこれらのいずれの組み合わせ、を含む、対照試料；
ｅ）任意に、前記レポータータンパク質のための基質、並びに
ｆ）任意に、使用説明書
を含む、キット。

【請求項139】

試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するためのキットであって、前記キットは：
ａ）組換えラブドウイルス粒子のウイルスエンベロープでの発現のために、ラブドウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラブドウイルスリンタンパク質（Ｐ）、及びラブドウイルス巨大タンパク質（Ｌ）、又はこれらの機能性断片若しくは誘導体をコードし、更に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイク（Ｓ）糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体をコードする、ポリヌクレオチドであって、前記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、第１の標的細胞及び第２の標的細胞の感染を仲介できる、ポリヌクレオチド；
ｂ）（ｉ）レポータータンパク質の第１の部分を発現する前記第１の標的細胞、及び（ｉｉ）前記レポータータンパク質の第２の部分を発現する前記第２の細胞であって、前記第１の標的細胞及び前記第２の標的細胞は、前記組換えラブドウイルス粒子と接触した場合に互いに融合でき、前記融合は、検出可能なレポーターシグナルの生成をもたらす、前記第１の標的細胞及び前記第２の細胞；
ｃ）任意に、コロナウイルス中和抗体を含まない対照試料；
ｄ）任意に、コロナウイルス中和抗体；又はコロナウイルスＳ糖タンパク質と、前記コロナウイルスＳ糖タンパク質が標的細胞上で相互作用するタンパク質との間の相互作用を遮断する分子；又は標的細胞の融合を遮断する分子；又はこれらのいずれの組み合わせ、を含む、対照試料；
ｅ）任意に、前記レポータータンパク質のための基質、並びに
ｆ）任意に、使用説明書
を含む、キット。

【請求項140】

前記第１の標的細胞及び／又は前記第２の標的細胞の両方は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を含む、請求項１３８又は１３９に記載のキット。

【請求項141】

前記第１の標的細胞はＶｅｒｏ－ＤＳＰ１（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－１－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７３）であり、前記第２の標的細胞はＶｅｒｏ－ＤＳＰ２（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－２－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７４）である、請求項１３８又は１３９に記載のキット。

【請求項142】

前記レポータータンパク質の前記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１～２２９を含み、前記レポータータンパク質の前記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸２３０～３１１を含む、請求項１３８～１４１のいずれか１項に記載のキット。

【請求項143】

前記レポータータンパク質の前記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１～１５５を含み、前記レポータータンパク質の前記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１５６～３１１を含む、請求項１３８～１４１のいずれか１項に記載のキット。

【請求項144】

前記レポータータンパク質の前記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ変異体ＲＬｕｃ８のアミノ酸１～１５５を含み、前記レポータータンパク質の前記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ変異体ＲＬｕｃ８のアミノ酸１５６～３１１を含む、請求項１４３に記載のキット。

【請求項145】

前記レポータータンパク質の前記第１の部分は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体のアミノ酸１～１５６を含み、前記レポータータンパク質の前記第２の部分は、ＧＦＰ又はその変異体のアミノ酸１５７～２３１を含む、請求項１３８～１４１のいずれか１項に記載のキット。

【請求項146】

前記レポータータンパク質の前記第１の部分は、スーパーフォルダーＧＦＰのアミノ酸１～２１３を含み、前記レポータータンパク質の前記第２の部分は、スーパーフォルダーＧＦＰのアミノ酸２１４～２３０を含む、請求項１３８～１４１のいずれか１項に記載のキット。

【請求項147】

前記レポータータンパク質の前記第１の部分は、スーパーフォルダー黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のアミノ酸１～１５４を含み、前記レポータータンパク質の前記第２の部分は、スーパーフォルダーＹＦＰのアミノ酸１５５～２６２を含む、請求項１３８～１４１のいずれか１項に記載のキット。

【請求項148】

試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するためのキットであって、前記キットは：
ａ）組換えラブドウイルス粒子であって、ここで（ｉ）ラブドウイルス糖タンパク質（Ｇ）はコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられ、前記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、標的細胞の感染を仲介でき、（ｉｉ）前記組換えラブドウイルス粒子は、レポータータンパク質、及び／又は前記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、組換えラブドウイルス；
ｂ）前記標的細胞；
ｃ）任意に、コロナウイルス中和抗体を含まない対照試料；
ｄ）任意に、コロナウイルス中和抗体；又はコロナウイルスＳ糖タンパク質と、前記コロナウイルスＳ糖タンパク質が標的細胞上で相互作用するタンパク質との間の相互作用を遮断する分子；又はこれらのいずれの組み合わせ、を含む、対照試料；
ｅ）任意に、前記レポータータンパク質のための基質、並びに
ｆ）任意に、使用説明書
を含む、キット。

【請求項149】

前記組換えラブドウイルス粒子は、前記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、請求項１４８に記載のキット。

【請求項150】

試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するためのキットであって、前記キットは：
ａ）組換えラブドウイルス粒子のウイルスエンベロープでの発現のために、ラブドウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラブドウイルスリンタンパク質（Ｐ）、及びラブドウイルス巨大タンパク質（Ｌ）、又はこれらの機能性断片若しくは誘導体をコードし、更にレポータータンパク質及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイク（Ｓ）糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体をコードする、ポリヌクレオチドであって、前記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、標的細胞の感染を仲介できる、ポリヌクレオチド；
ｂ）前記標的細胞；
ｃ）任意に、コロナウイルス中和抗体を含まない対照試料；
ｄ）任意に、コロナウイルス中和抗体；又はコロナウイルスＳ糖タンパク質と、前記コロナウイルスＳ糖タンパク質が標的細胞上で相互作用するタンパク質との間の相互作用を遮断する分子；又はこれらのいずれの組み合わせ、を含む、対照試料；
ｅ）任意に、前記レポータータンパク質のための基質、並びに
ｆ）任意に、使用説明書
を含む、キット。

【請求項151】

前記レポータータンパク質をコードする核酸配列は、前記コロナウイルスＳ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体をコードする核酸配列と、ラブドウイルス巨大（Ｌ）タンパク質をコードする核酸配列との間に挿入される、請求項１４８～１５０のいずれか１項に記載のキット。

【請求項152】

前記標的細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞、Ｖｅｒｏ－ＴＲＭＰＳＳ２細胞、又はＶｅｒｏ－Ｅ６細胞である、請求項１４８～１５１のいずれか１項に記載のキット。

【請求項153】

前記標的細胞はアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を含む、請求項１４８～１５１のいずれか１項に記載のキット。

【請求項154】

前記組換えラブドウイルス粒子は、複製可能なラブドウイルス粒子である、請求項１３８、１４０～１４９、及び１５１～１５３のいずれか１項に記載のキット。

【請求項155】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質、その断片又は誘導体は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来する、請求項１３８～１５４のいずれか１項に記載のキット。

【請求項156】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質は、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質である、請求項１５５に記載のキット。

【請求項157】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１５６に記載のキット。

【請求項158】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１５７に記載のキット。

【請求項159】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１５７に記載のキット。

【請求項160】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片は、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片である、請求項１５５に記載のキット。

【請求項161】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１６０に記載のキット。

【請求項162】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項１６１に記載のキット。

【請求項163】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１６１に記載のキット。

【請求項164】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７７％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１５５に記載のキット。

【請求項165】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＳ１サブユニットに対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１５５に記載のキット。

【請求項166】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４～６８４に対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１５５に記載のキット。

【請求項167】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＲＢＤドメインに対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１５５に記載のキット。

【請求項168】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸３１９～５４１に対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１５５に記載のキット。

【請求項169】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、ラブドウイルスゲノムの同じ位置に挿入された全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質を発現するラブドウイルスゲノムを含む同等の組換えラブドウイルス粒子と比較して、より融合誘導性が高い組換えラブドウイルス粒子をもたらす、請求項１５５に記載のキット。

【請求項170】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、表８及び９に列挙された１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／又は置換を含み、前記挿入、欠失、及び／又は置換の位置は、配列番号１に関連して特定される、請求項１５５に記載のキット。

【請求項171】

前記コロナウイルスＳ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項１５５に記載のキット。

【請求項172】

前記組換えラブドウイルス粒子は組換えベシクロウイルス粒子である、請求項１３８～１７１のいずれか１項に記載のキット。

【請求項173】

前記組換えベシクロウイルス粒子は組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子である、請求項１７２に記載のキット。

【請求項174】

前記組換えラブドウイルス粒子は、変異型ＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質を含む、請求項１３８、１４０～１４９、及び１５１～１７３のいずれか１項に記載のキット。

【請求項175】

前記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質をコードする、請求項１７４に記載のキット。

【請求項176】

前記組換えラブドウイルス粒子は、メチオニン５１における変異を含む変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質を含む、組換えＶＳＶ粒子である、請求項１７４又は１７５に記載のキット。

【請求項177】

メチオニン５１における前記変異は、メチオニン（Ｍ）からアルギニン（Ｒ）へのものである、請求項１７６に記載のキット。

【請求項178】

前記変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１７７に記載のキット。

【請求項179】

前記変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列からなる、請求項１７７に記載のキット。

【請求項180】

前記組換えラブドウイルス粒子は、野生型ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質を含む、請求項１３８、１４０～１４９、及び１５１～１７３のいずれか１項に記載のキット。

【請求項181】

前記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、野生型ラブドウイルスＭタンパク質をコードする、請求項１８０に記載のキット。

【請求項182】

前記組換えラブドウイルス粒子は、配列番号９のアミノ酸配列を含む野生型ＶＳＶ Ｍタンパク質を含む、組換えＶＳＶ粒子である、請求項１８０又は１８１に記載のキット。

【請求項183】

前記野生型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列からなる、請求項１８２に記載のキット。

【請求項184】

前記レポータータンパク質はルシフェラーゼを含む、請求項１３８～１８３のいずれか１項に記載のキット。

【請求項185】

前記ルシフェラーゼは、ウミシイタケルシフェラーゼ、ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼ、（ｄＣｐＧ）ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃレポーター、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）、ＭｅｔＬｕｃ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉルマジンタンパク質、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉルミナーゼ（ｌｕｍｉｎａｚｅ）タンパク質、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼＹＹ５変異体、ホタルルシフェラーゼＬＧＲ変異体、ホタルルシフェラーゼ変異体Ｅ、及びこれらの断片又は誘導体から選択される、請求項１８４に記載のキット。

【請求項186】

前記レポータータンパク質は蛍光タンパク質を含む、請求項１３８～１８５のいずれか１項に記載のキット。

【請求項187】

前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰ様蛍光タンパク質、（ＧＦＰ－ｌｉｋｅ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化型青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、強化型青緑色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）；赤色蛍光タンパク質、スーパーフォルダーＧＦＰ、スーパーフォルダーＹＦＰ、橙色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、小型超赤色蛍光タンパク質、ＦＭＮ結合蛍光タンパク質、ｄｓＲｅｄ、ｑＦＰ６１１、Ｄｒｏｎｐａ、ＴａｇＲＦＰ、ＫＦＰ、ＥｏｓＦＰ、ＩｒｉｓＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ、Ｋａｅｄｅ、ＫｉｋＧｒ１、鮮緑色蛍光タンパク質、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びこれらの断片又は誘導体から選択される、請求項１８６に記載のキット。

【請求項188】

前記レポータータンパク質はルシフェラーゼを含み、前記レポータータンパク質のための前記基質は、ルシフェリン、セレンテラジン、又はＥｎｄｕＲｅｎルシフェラーゼ基質を含む、請求項１３８～１８５のいずれか１項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

本特許出願は、２０２１年２月１９日出願の米国仮特許出願第６３／１５１，６２３号、２０２０年９月１４日出願の米国仮特許出願第６３／０７８，２１４号、２０２０年５月２２日出願の米国仮特許出願第６３／０２９，２６７号、２０２０年５月５日出願の米国仮特許出願第６３／０２０，４４５号、２０２０年４月１７日出願の米国仮特許出願第６３／０１２，０６６号、及び２０２０年４月１７日出願の米国仮特許出願第６３／０１２，０７４号に対する優先権を主張するものであり、以上の仮特許出願それぞれの開示は、その全体が参照により本出願に援用される。

【0002】

本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された、その全体が参照により本出願に援用される配列表を含む。２０２１年４月１５日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、名称が２５０２９８＿０００２１３＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが１４７，５６８バイトである。

【技術分野】

【0003】

本明細書に記載されるのは、試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するための方法、並びに関連する組成物及びキットである。本開示の方法は、組換え水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）粒子を使用し、上記ＶＳＶ粒子では、ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）がコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられる。ある具体的実施形態では、上記Ｓ糖タンパク質は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来し、上記方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の存在を決定するために使用される。

【背景技術】

【0004】

以下の３つのコロナウイルスが、ヒトにおいて重篤な肺炎を引き起こすことが知られている：重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ：ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１は中華人民共和国で２００２年に出現し、５大陸に拡散して８，０００人以上が感染し、７７４人が死亡した。ＭＥＲＳ－ＣｏＶはアラビア半島で２０１２年に出現し、２７か国で約２，５００人以上が感染し、８５８人が死亡した。２０１９年１２月、新たなコロナウイルスが中華人民共和国の武漢で出現し、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）として知られる急性呼吸器症候群を引き起こした（非特許文献１、２０２０年２月３日にオンライン公開、doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7にて入手可能；非特許文献２）。ＣＯＶＩＤ－１９の症状としては、発熱、咳、息切れ、肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＲＤＳ）、急性肺症候群、嗅覚の喪失、味覚の喪失、喉の痛み、鼻汁、胃腸症状（例えば下痢）、臓器不全（例えば腎不全及び腎機能障害）、敗血症性ショック、そして重症例では死亡が挙げられる。ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と関連することが特定され、従ってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と命名された（ｎＣｏｖ－２０１９、武漢コロナウイルス、又はＳＡＲＳ ｎＣｏＶ１９と呼ばれることもある）。無症状の個体、又はごく軽症の個体もいるものの、多くは重症であり、入院が必要である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は世界中に急速に広がり、２０２０年３月１１日には世界保健機関によって世界的なパンデミックと宣言された。２０２０年５月２０日の時点でこのウイルスは世界中で約５００万人に感染し、３２８，０００人を超える死者を発生させた。ＣＯＶＩＤ－１９を発症する患者の多くは軽度の上気道症状を示すが、一部（特に高齢者、及び慢性肺疾患、喘息、心臓病、糖尿病、免疫不全患者等といった基礎疾患を有する人）は、非定型肺炎及びこれに関連する合併症を発症する（非特許文献３、２０２０年４月１日にオンライン公開、doi.org/10.1038/s41586-020-2196-xにて入手可能）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は伝染性が極めて高く、無症候性キャリアによって拡散される可能性がある。

【0005】

アクティブなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を検出するＰＣＲアッセイが、疾患の広がりを追跡する上で重要な役割を果たしており、その一方で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を検出する血清学的試験が、過去の感染の検出及び測定、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫を有する可能性がある個体の特定、並びにワクチン及び治療法の有効性の評価に使用されている。利用可能な血清学的試験が抗体介在性免疫をどの程度正確に反映しているかは、依然としてよく分かっていない。

【0006】

ウイルス中和抗体の生成は、後続のウイルス感染を遮断するために重要であり、中和抗体の存在は、ワクチン接種後の防御免疫と相関している（非特許文献４）。しかしながら典型的には、ウイルス特異性抗体のわずかなサブセットしか中和していない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関して、合計抗体レベルが中和抗体レベルとどのように関連しているかは現在のところ分かっておらず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の応答の試験の改良が緊急に必要とされている。回復期の血漿療法試験からの早期データは有望な結果を示した（非特許文献５）ものの、受け入れ基準が抗ＳＡＲＳ２－ＣｏＶ－２抗体の合計レベルに基づくものであり、中和抗体レベルに特に基づくものではない場合、血漿ドナーのスクリーニングは不十分である。同様に、新規のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの有効性の研究は、総抗体応答だけでなく中和抗体の応答も考慮する必要がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Zhou et al., Nature（https://doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7）

【非特許文献2】Zhu et al., New Engl J Med, 2020, 382:727-733

【非特許文献3】Woelfel et al., Nature（https://doi.org/10.1038/s41586-020-2196-x）

【非特許文献4】Koff WC et al., Science. 2013;340(6136)

【非特許文献5】Casadevall A et al., 379 J Clin Invest 2020 Mar 13

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び他のコロナウイルスに関する強力かつ効率的なセロポジティビティ（ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ）アッセイ、特にウイルス中和抗体を評価するアッセイに対して、当該技術分野において高い需要が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上の「背景技術」のセクションで明記したように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び他のコロナウイルスに関する効果的なセロポジティビティアッセイ、特にウイルス中和抗体を評価するアッセイの開発に対して、高い需要が存在する。本開示は、これらの需要、及びその他の需要に対処する。本開示は、試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するためのアッセイ、並びに関連する組成物及びキットを提供する。本開示のセロポジティビティアッセイは、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子を使用し、上記ＶＳＶ粒子では、ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）がコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられている。ある具体的実施形態では、上記Ｓ糖タンパク質は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来し、上記方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の存在を決定するために使用される。

【0010】

ある態様では、試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するための方法が提供され、上記方法は：
ａ）上記試料を組換えラブドウイルス粒子と接触させるステップであって、ここでラブドウイルス糖タンパク質（Ｇ）はコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられ、上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、第１の標的細胞及び第２の標的細胞の感染を仲介できる、ステップ；
ｂ）ステップ（ａ）の後で、上記組換えラブドウイルス粒子を、レポータータンパク質の第１の部分を発現する上記第１の標的細胞、及び上記レポータータンパク質の第２の部分を発現する上記第２の標的細胞と接触させて、上記レポータータンパク質の上記第１の部分及び上記第２の部分両方を含みかつ検出可能なレポーターシグナルを生成する合胞体を形成するステップであって、ここで上記第１の標的細胞及び上記第２の標的細胞は、上記組換えラブドウイルス粒子との接触時に互いに融合できる、ステップ；
ｃ）ステップ（ｂ）の後で、上記細胞内の上記レポーターシグナルを測定するステップ、並びに
ｄ）ステップ（ｃ）で測定された上記レポーターシグナルを対照と比較するステップ
を含む。

【0011】

一実施形態では、上記第１の標的細胞及び／又は上記第２の標的細胞の両方は、アンジオテンシン変換酵素２（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ２：ＡＣＥ２）を含む。

【0012】

一実施形態では、上記第１の標的細胞はＶｅｒｏ－ＤＳＰ１（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－１－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７３）であり、上記第２の標的細胞はＶｅｒｏ－ＤＳＰ２（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－２－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７４）である。

【0013】

一実施形態では、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１～２２９を含み、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸２３０～３１１を含む。別の実施形態では、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１～１５５を含み、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１５６～３１１を含む。ある具体的実施形態では、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ変異体ＲＬｕｃ８のアミノ酸１～１５５を含み、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ変異体ＲＬｕｃ８のアミノ酸１５６～３１１を含む。

【0014】

一実施形態では、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）又はその変異体のアミノ酸１～１５６を含み、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、ＧＦＰ又はその変異体のアミノ酸１５７～２３１を含む。別の実施形態では、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、スーパーフォルダーＧＦＰのアミノ酸１～２１３を含み、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、スーパーフォルダーＧＦＰのアミノ酸２１４～２３０を含む。更に別の実施形態では、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、スーパーフォルダー黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＹＦＰ）のアミノ酸１～１５４を含み、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、スーパーフォルダーＹＦＰのアミノ酸１５５～２６２を含む。

【0015】

別の態様では、試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するための方法が提供され、上記方法は：
ａ）上記試料を組換えラブドウイルス粒子と接触させるステップであって、ここで（ｉ）ラブドウイルス糖タンパク質（Ｇ）はコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられ、上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、標的細胞の感染を仲介でき、（ｉｉ）上記ラブドウイルス粒子は、レポータータンパク質、及び／又は上記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、ステップ；
ｂ）ステップ（ａ）の後で、上記組換えラブドウイルス粒子を上記標的細胞と接触させるステップ；
ｃ）ステップ（ｂ）の後で、上記細胞内の上記レポーターシグナルを測定するステップ、並びに
ｄ）ステップ（ｃ）で測定された上記レポーターシグナルを対照と比較するステップ
を含む。

【0016】

一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、上記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む。ある具体的実施形態では、上記レポータータンパク質をコードする核酸配列は、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体をコードする核酸配列と、ラブドウイルス巨大（Ｌ）タンパク質をコードする核酸配列との間に挿入される。一実施形態では、上記標的細胞は、Ｖｅｒｏ細胞（Ｖｅｒｏ－αＨｉｓ細胞を含む）、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞、Ｖｅｒｏ－ＴＲＭＰＳＳ２細胞、又はＶｅｒｏ－Ｅ６細胞である。一実施形態では、上記標的細胞はアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を含む。一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、機能性ラブドウイルスＧ遺伝子を欠いており、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質、その断片又は誘導体をコードする。一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、ラブドウイルスＧ遺伝子を欠いており、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質、その断片又は誘導体をコードする。

【0017】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は組換えベシクロウイルス粒子である。上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記組換えベシクロウイルス粒子は組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子である。

【0018】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記レポータータンパク質はルシフェラーゼを含む。使用可能なルシフェラーゼの非限定的な例としては、例えばウミシイタケルシフェラーゼ、ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼ、（ｄＣｐＧ）ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃレポーター、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）、ＭｅｔＬｕｃ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉルマジンタンパク質、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉルミナーゼ（ｌｕｍｉｎａｚｅ）タンパク質、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼＹＹ５変異体、ホタルルシフェラーゼＬＧＲ変異体、ホタルルシフェラーゼ変異体Ｅ、及びこれらの断片又は誘導体が挙げられる。

【0019】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記レポータータンパク質は蛍光タンパク質を含む。使用可能な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰ様蛍光タンパク質、（ＧＦＰ－ｌｉｋｅ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＦＰ）、強化型青色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＢＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＦＰ）、強化型青緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＣＦＰ）；赤色蛍光タンパク質、スーパーフォルダーＧＦＰ、スーパーフォルダーＹＦＰ、橙色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、小型超赤色蛍光タンパク質、ＦＭＮ結合蛍光タンパク質、ｄｓＲｅｄ、ｑＦＰ６１１、Ｄｒｏｎｐａ、ＴａｇＲＦＰ、ＫＦＰ、ＥｏｓＦＰ、ＩｒｉｓＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ、Ｋａｅｄｅ、ＫｉｋＧｒ１、鮮緑色（ｅｍｅｒａｌｄ）蛍光タンパク質、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びこれらの断片又は誘導体が挙げられる。

【0020】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記方法は、上記レポーターシグナルを得るために、レポータータンパク質基質を添加するステップを含む。ルシフェラーゼに対して使用可能なレポータータンパク質基質の非限定的な例としては、例えばルシフェリン（例えばｄ－ルシフェリン）、ＥｎｄｕＲｅｎ、及びセレンテラジンルシフェラーゼ基質が挙げられる。

【0021】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、複製可能なラブドウイルス粒子である。

【0022】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質、その断片又は誘導体は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質は、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質である。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片は、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片である。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７７％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＳ１サブユニットに対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４～６８４に対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＲＢＤドメインに対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸３１９～５４１に対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、ラブドウイルスゲノムの同じ位置に挿入された全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質を発現するラブドウイルスゲノムを含む同等の組換えラブドウイルスと比較して、より融合誘導性が高い組換えラブドウイルス粒子をもたらす。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個の残基の挿入、欠失、及び／又は置換を含んでよく、あるいは上記挿入、欠失、及び／又は置換からなってよい。発生し得る欠失のためのアミノ酸の非限定的な例としては、例えば１４５位のチロシン、６７９位のアスパラギン、６８０位のセリン、６８１位のプロリン、６８２位のアルギニン、６８３位のアルギニン、６８４位のアラニン、及び／又は６８５位のアルギニン（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基が挙げられる。発生し得る置換のためのアミノ酸の非限定的な例としては、例えば５位においてフェニルアラニンへと変化するロイシン、２８位においてアスパラギンへと変化するチロシン、２９位においてイソロイシンへと変化するスレオニン、４９位においてチロシンへと変化するヒスチジン、５４位においてフェニルアラニンへと変化するロイシン、７４位においてリシンへと変化するアスパラギン、９６位においてアスパラギン酸へと変化するグルタミン酸、１１１位においてアスパラギンへと変化するアスパラギン酸、１５７位においてロイシンへと変化するフェニルアラニン、１８１位においてバリンへと変化するグリシン、２２１位においてトリプトファンへと変化するセリン、２４７位においてアルギニンへと変化するセリン、３４８位においてスレオニンへと変化するアラニン、４０８位においてイソロイシンへと変化するアルギニン、４７６位においてセリンへと変化するグリシン、４８３位においてアラニンへと変化するバリン、５１９位においてグルタミンへと変化するヒスチジン、５２０位においてセリンへと変化するアラニン、６１４位においてアスパラギンへと変化するアスパラギン酸、６１４位においてグリシンへと変化するアスパラギン酸、６７９位においてイソロイシンへと変化するアスパラギン、６８０位においてロイシンへと変化するセリン、６８２位においてグリシンへと変化するアルギニン、６８３位においてセリンへと変化するアルギニン、６８５位においてグルタミンへと変化するアルギニン、６８５位においてセリンへと変化するアルギニン、７９７位においてシステインへと変化するフェニルアラニン、９３０位においてバリンへと変化するアラニン、９３６位においてチロシンへと変化するアスパラギン酸、１０７８位においてバリンへと変化するアラニン、１１６８位においてヒスチジンへと変化するアスパラギン酸、及び／又は１２５９位においてヒスチジンへと変化するアスパラギン酸（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基が挙げられる。Becerra-Flores and Cardozo, “SARS-CoV-2 viral spike G614 mutation exhibits higher case fatality rate,” The International Journal of Clinical Practice, published online May 6, 2020; Eaaswarkhanth et al., “Could the D614G substitution in the SARS-CoV-2 spike (S) protein be associated with higher COVID-19 mortality?” International Journal of Infectious Diseases, 96: July 2020, Pages 459-460; Tang et al., “The SARS-CoV-2 Spike Protein D614G Mutation Shows Increasing Dominance and May Confer a Structural Advantage to the Furin Cleavage Domain,” Preprints 2020, 2020050407 (doi: 10.20944/preprints202005.0407.v1); Hansen et. al., “Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail” Science, published online June 15, 2020; Lokman et al., “Exploring the genomic and proteomic variations of SARS-CoV-2 spike glycoprotein: A computational biology approach”, Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases, 2020 Jun;84:104389. DOI: 10.1016/j.meegid.2020.104389を参照。これらの文献はそれぞれ、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される。挿入、欠失、及び／又は置換のためのアミノ酸残基の更なる非限定的な例としては、表８及び９に列挙されているものが挙げられる（アミノ酸残基の位置は配列番号１を参照配列として用いて示されており、これは、（上記と同じ）いずれのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基の特定のための参照として使用できる；表８中の参考文献は、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される）。表８に列挙された残基の修飾はそれぞれ、単独で、又は他のものと組み合わせて個別に使用することによって、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子のバリアントを生成できる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び／又は６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基を変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、溶解性がより高い表現型をもたらす。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４２のアミノ酸配列、又は配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一の配列を含んでよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、コドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされてよい。様々な実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４３のポリヌクレオチド配列、又は配列番号４３に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％のポリヌクレオチド配列同一性を有する配列によってコードされてよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４４のアミノ酸配列、又は配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一の配列を含んでよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び／若しくは４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び／若しくは６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、並びに／又は残基
６９～７０の欠失（配列番号１に示されている位置）によって、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基の変化又は欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへとへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへとへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、上記スパイクタンパク質内のフリン切断部位を不活化することによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、配列番号１に示されているＱ^６７７ＴＮＳＰＲＲＡＲＳＶ^６８７（配列番号６５）、又は変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基を、ＱＴＩＬＲＳＶ（配列番号６６）又はＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶ（配列番号６７）へと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、Ｓ１／Ｓ２境界の一塩基フリン切断部位（ＱＴＩＬＲＳＶ（配列番号６６））、又はフリン切断部位（ＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶ（配列番号６７））表現型の欠失をもたらす。特定の実施形態では、フリン切断部位に対する変更は、スパイク安定化擬似粒子をもたらすことができる。Hansen et. al.,“Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail” Science（２０２０年６月１５日オンライン公開）を参照。上記文献は、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される。

【0023】

上述の方法のうちのいずれかの特定の実施形態では、ステップ（ａ）は、上記試料を２つ以上の異なる組換えラブドウイルス粒子と（例えば同時に又は順次）接触させるステップを含み、ここで上記２つ以上の異なる組換えラブドウイルス粒子は、異なるコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質、その断片又は誘導体を含む。特定の実施形態では、上記２つ以上の異なるコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質、その断片又は誘導体のうちの少なくとも１つは、配列番号１、配列番号３、及び配列番号４４から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は表８及び９に列挙された１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／若しくは置換を含み、ここで上記挿入、欠失、及び／又は置換の位置は、配列番号１に関連して特定される。上記ラブドウイルス粒子がレポータータンパク質及び／又は上記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、上記方法の特定の実施形態では、上記２つ以上の異なる組換えラブドウイルス粒子は、異なるレポータータンパク質、及び／又は上記異なるレポータータンパク質をコードする異なる核酸分子を含む。上記ラブドウイルス粒子がレポータータンパク質及び／又は上記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、上記方法の特定の実施形態では、上記２つ以上の異なる組換えラブドウイルス粒子は、同一のレポータータンパク質、及び／又は上記レポータータンパク質をコードする同一の核酸分子を含む。

【0024】

一実施形態では、試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）中和抗体の存在を決定するための方法が提供され、上記方法は：
ａ）上記試料を、複製可能な組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子と接触させるステップであって、上記組換えＶＳＶ粒子のゲノムは、機能性ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）遺伝子を欠いており、また、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片をコードする、ステップ；
ｂ）ステップ（ａ）の後で、上記組換えＶＳＶ粒子を、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１細胞とＶｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞との混合物と接触させるステップ；
ｃ）ステップ（ｂ）の後で、上記細胞のルシフェラーゼシグナル及び／又はＧＦＰシグナルを測定するステップ、並びに
ｄ）ステップ（ｃ）で測定された上記シグナルを対照と比較するステップ
を含む。

【0025】

別の実施形態では、試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）中和抗体の存在を決定するための方法が提供され、上記方法は：
ａ）上記試料を、複製可能な組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子と接触させるステップであって、（ｉ）上記組換えＶＳＶ粒子のゲノムは、機能性ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）遺伝子を欠いており、また、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片をコードし、（ｉｉ）上記組換えＶＳＶ粒子の上記ゲノムは更に、ルシフェラーゼタンパク質をコードする、ステップ；
ｂ）ステップ（ａ）の後で、上記組換えＶＳＶ粒子を、Ｖｅｒｏ細胞、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞、及びＶｅｒｏ－Ｅ６細胞から選択される細胞と接触させるステップ；
ｃ）ステップ（ｂ）の後で、上記細胞のルシフェラーゼシグナルを測定するステップ、並びに
ｄ）ステップ（ｃ）で測定された上記シグナルを対照と比較するステップ
を含む。

【0026】

上述の２つの方法の一実施形態では、上記全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。上述の２つの方法の一実施形態では、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列からなる。

【0027】

上述の２つの方法の特定の実施形態では、ステップ（ａ）は、上記試料を２つ以上の異なる組換えＶＳＶ粒子と（例えば同時に又は順次）接触させるステップを含み、ここで上記２つ以上の異なる組換えＶＳＶ粒子は、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた異なる全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質又はその断片を含む。特定の実施形態では、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた上記２つ以上の異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質又はその断片のうちの少なくとも１つは、配列番号１、配列番号３、及び配列番号４４から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は表８及び９に列挙された１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／若しくは置換を含み、ここで上記挿入、欠失、及び／又は置換の位置は、配列番号１に関連して特定される。上記ＶＳＶ粒子がレポータータンパク質及び／又は上記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、上記方法の特定の実施形態では、上記２つ以上の異なる組換えＶＳＶ粒子は、異なるレポータータンパク質、及び／又は上記異なるレポータータンパク質をコードする異なる核酸分子を含む。上記ＶＳＶ粒子がレポータータンパク質及び／又は上記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、上記方法の特定の実施形態では、上記２つ以上の異なる組換えＶＳＶ粒子は、同一のレポータータンパク質、及び／又は上記レポータータンパク質をコードする同一の核酸分子を含む。

【0028】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、ステップ（ｂ）の後及びステップ（ｃ）の前に、細胞はトリプシンに曝露される。

【0029】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、変異型ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質を含む。一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、変異型ラブドウイルスＭタンパク質をコードする。一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、メチオニン５１における変異を含む変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質を含む、組換えＶＳＶ粒子である。ある具体的実施形態では、メチオニン５１における上記変異は、メチオニン（Ｍ）からアルギニン（Ｒ）へのものである。ある具体的実施形態では、上記変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある具体的実施形態では、上記変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列からなる。

【0030】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、野生型ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質を含む。一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、野生型ラブドウイルスＭタンパク質をコードする。一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、配列番号９のアミノ酸配列を含む野生型ＶＳＶ Ｍタンパク質を含む、組換えＶＳＶ粒子である。ある具体的実施形態では、上記野生型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列からなる。

【0031】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記試料は血清又は血漿である。上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記試料は唾液である。上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記試料は乾燥血斑である。一実施形態では、上記方法は更に、上記試料を約１：１０～約１：３２０に希釈するステップを含む。例えば上記試料を、約１：１０、約１：１６、約１：２０、約１：３２、約１：６４、約１：８０、約１：１００、約１：１２８、又は約１：１６０に希釈してよい。一実施形態では、上記方法は更に、上記試料を約１：１００に希釈するステップを含む。一実施形態では、上記方法は更に、上記試料を約１：２０に希釈するステップを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は更に、上記組換えラブドウイルス粒子を約２００～８００ｐｆｕ／ウェルに希釈するステップを含む。例えば上記組換えラブドウイルス粒子を、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約７２０、又は約８００ｐｆｕ／ウェルに希釈してよい。一実施形態では、上記試料は熱不活化されている。別の実施形態では、上記試料は熱不活化されていない。一実施形態では、上記方法は更に、細菌汚染を防止するために、上記試料を抗生物質で処理する、及び／又は上記試料をろ過するステップを含む。

【0032】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記対照は、コロナウイルス中和抗体を含まない対照試料を用いて得られたレポーターシグナルであり、上記方法は、ステップ（ｃ）で得られた上記レポーターシグナルが上記対照に比べて低減されている場合に、試験された上記試料がコロナウイルス中和抗体を含むと結論づけるステップを含む。一実施形態では、上記方法は、ステップ（ｃ）で得られた上記レポーターシグナルが上記対照に比べて５０％を超えて低減されている場合に、試験された上記試料がコロナウイルス中和抗体を含むと結論づけるステップを含む。一実施形態では、上記方法は更に、ステップ（ｃ）で得られた上記レポーターシグナルを：コロナウイルス中和抗体；又はコロナウイルスＳ糖タンパク質と、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質が上記標的細胞上で相互作用するタンパク質との間の相互作用を遮断する分子；又は上記標的細胞の融合を遮断する分子；又はこれらのいずれの組み合わせ、を含む対照試料を用いて得られたレポーターシグナルと、比較するステップを含む。一実施形態では、上記方法は、上記レポーターシグナルを、コロナウイルス中和抗体、又はコロナウイルスＳ糖タンパク質と、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質が上記標的細胞上で相互作用するタンパク質との間の相互作用を遮断する分子、又はこれらのいずれの組み合わせ、を含む対照試料の連続希釈物から決定された検量線と、比較することによって、試験された上記試料中のコロナウイルス中和抗体の濃度を決定するステップを含む。ある具体的実施形態では、上記対照試料はｍＡｂ１０９１４を含む。ある具体的実施形態では、上記対照試料の上記連続希釈物は、約０．０１μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４を含む。ある具体的実施形態では、上記対照試料はｍＡｂ１０９２２を含む。ある具体的実施形態では、上記対照試料の上記連続希釈物は、約０．０１μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９２２を含む。

【0033】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記レポーターシグナルを補正することによって、上記組換えラブドウイルス粒子と接触していない対照試料から測定されるバックグラウンドシグナルを除去する。

【0034】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記レポーターシグナルは、ステップ（ｂ）の約１８～３０時間後に測定される。上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記レポーターシグナルは、ステップ（ｂ）の約２４～３０時間後に測定される。

【0035】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、ステップ（ａ）において、上記試料は上記組換えラブドウイルス粒子と、室温で約３０分間接触させられる。

【0036】

上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、上記方法は高スループットフォーマットで実施される。ある具体的実施形態では、上記方法は９６ウェルプレートで実施される。ある具体的実施形態では、上記方法を９６ウェルプレートで実施する場合、上記第１の標的細胞及び上記第２の標的細胞の密度は約６×１０^４細胞／ウェルである。

【0037】

別の態様では、組換えラブドウイルス粒子が提供され、ここでラブドウイルス糖タンパク質（Ｇ）はコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられ、上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、標的細胞の感染を仲介できる。

【0038】

一実施形態では、上記ラブドウイルス粒子は更に、レポータータンパク質、及び／又は上記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む。一実施形態では、上記ラブドウイルス粒子は、上記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む。ある具体的実施形態では、上記レポータータンパク質をコードする核酸配列は、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体をコードする核酸配列と、ラブドウイルス巨大（Ｌ）タンパク質をコードする核酸配列との間に挿入される。

【0039】

一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、複製可能なラブドウイルス粒子である。

【0040】

一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は組換えベシクロウイルス粒子である。一実施形態では、上記組換えベシクロウイルス粒子は組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子である。

【0041】

一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質、その断片又は誘導体は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質は、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質である。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片は、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片である。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７７％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＳ１サブユニットに対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４～６８４に対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＲＢＤドメインに対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸３１９～５４１に対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、ラブドウイルスゲノムの同じ位置に挿入された全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質を発現するラブドウイルスゲノムを含む同等の組換えラブドウイルスと比較して、より融合誘導性が高い組換えラブドウイルス粒子をもたらす。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個の残基の挿入、欠失、及び／又は置換を含んでよく、あるいは上記挿入、欠失、及び／又は置換からなってよい。発生し得る欠失のためのアミノ酸の非限定的な例としては、例えば１４５位のチロシン、６７９位のアスパラギン、６８０位のセリン、６８１位のプロリン、６８２位のアルギニン、６８３位のアルギニン、６８４位のアラニン、及び／又は６８５位のアルギニン（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基が挙げられる。発生し得る置換のためのアミノ酸の非限定的な例としては、例えば５位においてフェニルアラニンへと変化するロイシン、２８位においてアスパラギンへと変化するチロシン、２９位においてイソロイシンへと変化するスレオニン、４９位においてチロシンへと変化するヒスチジン、５４位においてフェニルアラニンへと変化するロイシン、７４位においてリシンへと変化するアスパラギン、９６位においてアスパラギン酸へと変化するグルタミン酸、１１１位においてアスパラギンへと変化するアスパラギン酸、１５７位においてロイシンへと変化するフェニルアラニン、１８１位においてバリンへと変化するグリシン、２２１位においてトリプトファンへと変化するセリン、２４７位においてアルギニンへと変化するセリン、３４８位においてスレオニンへと変化するアラニン、４０８位においてイソロイシンへと変化するアルギニン、４７６位においてセリンへと変化するグリシン、４８３位においてアラニンへと変化するバリン、５１９位においてグルタミンへと変化するヒスチジン、５２０位においてセリンへと変化するアラニン、６１４位においてアスパラギンへと変化するアスパラギン酸、６１４位においてグリシンへと変化するアスパラギン酸、６７９位においてイソロイシンへと変化するアスパラギン、６８０位においてロイシンへと変化するセリン、６８２位においてグリシンへと変化するアルギニン、６８３位においてセリンへと変化するアルギニン、６８５位においてグルタミンへと変化するアルギニン、６８５位においてセリンへと変化するアルギニン、７９７位においてシステインへと変化するフェニルアラニン、９３０位においてバリンへと変化するアラニン、９３６位においてチロシンへと変化するアスパラギン酸、１０７８位においてバリンへと変化するアラニン、１１６８位においてヒスチジンへと変化するアスパラギン酸、及び／又は１２５９位においてヒスチジンへと変化するアスパラギン酸（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基が挙げられる。Becerra-Flores and Cardozo, “SARS-CoV-2 viral spike G614 mutation exhibits higher case fatality rate,” The International Journal of Clinical Practice, published online May 6, 2020; Eaaswarkhanth et al., “Could the D614G substitution in the SARS-CoV-2 spike (S) protein be associated with higher COVID-19 mortality?” International Journal of Infectious Diseases, 96: July 2020, Pages 459-460; Tang et al., “The SARS-CoV-2 Spike Protein D614G Mutation Shows Increasing Dominance and May Confer a Structural Advantage to the Furin Cleavage Domain,” Preprints 2020, 2020050407 (doi: 10.20944/preprints202005.0407.v1); Hansen et. al., “Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail” Science, published online June 15, 2020; Lokman et al., “Exploring the genomic and proteomic variations of SARS-CoV-2 spike glycoprotein: A computational biology approach”, Infection, Genetics and Evolution : Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases, 2020 Jun;84:104389. DOI: 10.1016/j.meegid.2020.104389を参照。これらの文献はそれぞれ、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される。挿入、欠失、及び／又は置換のためのアミノ酸残基の更なる非限定的な例としては、表８及び９に列挙されているものが挙げられる（アミノ酸残基の位置は配列番号１を参照配列として用いて示されており、これは、（上記と同じ）いずれのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基の特定のための参照として使用できる；表８中の参考文献は、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される）。表８に列挙された残基の修飾はそれぞれ、単独で、又は他のものと組み合わせて個別に使用することによって、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子のバリアントを生成できる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び／又は６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基を変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、溶解性がより高い表現型をもたらす。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４２のアミノ酸配列、又は配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一の配列を含んでよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、コドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされてよい。様々な実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４３のポリヌクレオチド配列、又は配列番号４３に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％のポリヌクレオチド配列同一性を有する配列によってコードされてよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４４のアミノ酸配列、又は配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一の配列を含んでよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び／若しくは４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び／若しくは６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、並びに／又は残基６９～７０の欠失（配列番号
１に示されている位置）によって、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基の変化又は欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへとへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへとへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、上記スパイクタンパク質内のフリン切断部位を不活化することによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、配列番号１に示されているＱ^６７７ＴＮＳＰＲＲＡＲＳＶ^６８７（配列番号６５）、又は変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基を、ＱＴＩＬＲＳＶ（配列番号６６）又はＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶ（配列番号６７）へと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、Ｓ１／Ｓ２境界の一塩基フリン切断部位（ＱＴＩＬＲＳＶ（配列番号６６））、又はフリン切断部位（ＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶ（配列番号６７））表現型の欠失をもたらす。特定の実施形態では、フリン切断部位に対する変更は、スパイク安定化擬似粒子をもたらすことができる。Hansen et. al.,“Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail” Science（２０２０年６月１５日オンライン公開）を参照。上記文献は、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される。

【0042】

一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、変異型ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質を含む。一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質をコードする。ある具体的実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、メチオニン５１における変異を含む変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質を含む、組換えＶＳＶ粒子である。ある具体的実施形態では、メチオニン５１における上記変異は、メチオニン（Ｍ）からアルギニン（Ｒ）へのものである。ある具体的実施形態では、上記変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある具体的実施形態では、上記変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列からなる。

【0043】

一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、野生型ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質を含む。一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、野生型ラブドウイルスＭタンパク質をコードする。ある具体的実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、配列番号９のアミノ酸配列を含む野生型ＶＳＶ Ｍタンパク質を含む、組換えＶＳＶ粒子である。ある具体的実施形態では、上記野生型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列からなる。

【0044】

別の態様では、組換えラブドウイルス粒子のウイルスエンベロープでの発現のために、ラブドウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラブドウイルスリンタンパク質（Ｐ）、及びラブドウイルス巨大タンパク質（Ｌ）、又はこれらの機能性断片若しくは誘導体をコードし、更に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイク（Ｓ）糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体をコードする、ポリヌクレオチドが提供される。

【0045】

一実施形態では、上記ポリヌクレオチドは更に、レポータータンパク質をコードする。ある具体的実施形態では、上記レポータータンパク質をコードする核酸配列は、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体をコードする核酸配列と、ラブドウイルス巨大（Ｌ）タンパク質をコードする核酸配列との間に挿入される。

【0046】

一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は複製可能なラブドウイルス粒子である。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質、その断片又は誘導体は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質は、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質である。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片は、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片である。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質をコードする上記ヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７７％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＳ１サブユニットに対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４～６８４に対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＲＢＤドメインに対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸３１９～５４１に対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、ラブドウイルスゲノムの同じ位置に挿入された全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質を発現するラブドウイルスゲノムを含む同等の組換えラブドウイルスと比較して、より融合誘導性が高い組換えラブドウイルス粒子をもたらす。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、ラブドウイルスゲノムの同じ位置に挿入された全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質を発現するラブドウイルスゲノムを含む同等の組換えラブドウイルス粒子と比較して、より融合誘導性が高い組換えラブドウイルス粒子をもたらす。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、表８及び９に列挙された１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／又は置換を含み、ここで上記挿入、欠失、及び／又は置換の位置は、配列番号１に関連して特定される。一実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。上述の方法のうちのいずれかの一実施形態では、ステップ（ａ）は、上記試料を２つ以上の異なる組換えラブドウイルス粒子と接触させるステップを含み、ここで上記２つ以上の異なる組換えラブドウイルス粒子は、異なるコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質、断片、又はその誘導体を含む。上記２つ以上の異なるコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質、断片、又はその誘導体のうちの少なくとも１つは、配列番号１、配列番号３、及び配列番号４４から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は表８及び９に列挙された１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／若しくは置換を含み、ここで上記挿入、欠失、及び／又は置換の位置は、配列番号１に関連して特定される。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個の残基の挿入、欠失、及び／又は置換を含んでよく、あるいは上記挿入、欠失、及び／又は置換からなってよい。発生し得る欠失のためのアミノ酸の非限定的な例としては、例えば１４５位のチロシン、６７９位のアスパラギン、６８０位のセリン、６８１位のプロリン、６８２位のアルギニン、６８３位のアルギニン、６８４位のアラニン、及び／又は６８５位のアルギニン（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基が挙げられる。発生し得る置換のためのアミノ酸の非限定的な例としては、例えば５位においてフェニルアラニンへと変化するロイシン、２８位においてアスパラギンへと変化するチロシン、２９位においてイソロイシンへと変化するスレオニン、４９位においてチロシンへと変化するヒスチジン、５４位においてフェニルアラニンへと変化するロイシン、７４位においてリシンへと変化するアスパラギン、９６位においてアスパラギン酸へと変化するグルタミン酸、１１１位においてアスパラギンへと変化するアスパラギン酸、１５７位においてロイシンへと変化するフェニルアラニン、１８１位においてバリンへと変化するグリシン、２２１位においてトリプトファンへと変化するセリン、２４７位においてアルギニンへと変化するセリン、３４８位においてスレオニンへと変化するアラニン、４０８位においてイソロイシンへと変化するアルギニン、４７６位においてセリンへと変化するグリシン、４８３位においてアラニンへと変化するバリン、５１９位においてグルタミンへと変化するヒスチジン、５２０位においてセリンへと変化するアラニン、６１４位においてアスパラギンへと変化するアスパラギン酸、６１４位においてグリシンへと変化するアスパラギン酸、６７９位においてイソロイシンへと変化するアスパラギン、６８０位においてロイシンへと変化するセリン、６８２位においてグリシンへと変化するアルギニン、６８３位においてセリンへと変化するアルギニン、６８５位においてグルタミンへと変化するアルギニン、６８５位においてセリンへと変化するアルギニン、７９７位においてシステインへと変化するフェニルアラニン、９３０位においてバリンへと変化するアラニン、９３６位においてチロシンへと変化するアスパラギン酸、１０７８位においてバリンへと変化するアラニン、１１６８位においてヒスチジンへと変化するアスパラギン酸、及び／又は１２５９位においてヒスチジンへと変化するアスパラギン酸（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基が挙げられる。Becerra-Flores and Cardozo, “SARS-CoV-2 viral spike G614 mutation exhibits higher case fatality rate,” The International Journal of Clinical Practice, published online May 6, 2020; Eaaswarkhanth et al., “Could the D614G substitution in the SARS-CoV-2 spike (S) protein be associated with higher COVID-19 mortality?” International Journal of Infectious Diseases, 96: July 2020, Pages 459-460; Tang et al., “The SARS-CoV-2 Spike Protein D614G Mutation Shows Increasing Dominance and May Confer a Structural Advantage to the Furin Cleavage Domain,” Preprints 2020, 2020050407 (doi: 10.20944/preprints202005.0407.v1); Hansen et. al., “Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail” Science, published online June 15, 2020; Lokman et al., “Exploring the genomic and proteomic variations of SARS-CoV-2 spike glycoprotein: A computational biology approach”, Infection, Genetics and Evolution : Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases, 2020 Jun;84:104389. DOI: 10.1016/j.meegid.2020.104389を参照。これらの文献はそれぞれ、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される。挿入、欠失、及び／又は置換のためのアミノ酸残基の更なる非限定的な例としては、表８及び９に列挙されているものが挙げられる（アミノ酸残基の位置は配列番号１を参照配列として用いて示されており、これは、（上記と同じ）いずれのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基の特定のための参照として使用できる；表８中の参考文献は、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される）。表８に列挙された残基の修飾はそれぞれ、単独で、又は他のものと組み合わせて個別に使用することによって、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子のバリアントを生成できる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び／又は６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基を変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、溶解性がより高い表現型をもたらす。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４２のアミノ酸配列、又は配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一の配列を含んでよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、コドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされてよい。様々な実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４３のポリヌクレオチド配列、又は配列番号４３に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％のポリヌクレオチド配列同一性を有する配列によってコードされてよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４４のアミノ酸配列、又は配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一の配列を含んでよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び／若しくは４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び／若しくは６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、並びに／又は残基６９～７０の欠失（配列番号１に示されている位置）によって、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基の変化又は欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへとへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへとへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、上記スパイクタンパク質内のフリン切断部位を不活化することによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、配列番号１に示されているＱ^６７７ＴＮＳＰＲＲＡＲＳＶ^６８７（配列番号６５）、又は変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基を、ＱＴＩＬＲＳＶ（配列番号６６）又はＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶ（配列番号６７）へと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、Ｓ１／Ｓ２境界の一塩基フリン切断部位（ＱＴＩＬＲＳＶ（配列番号６６））、又はフリン切断部位（ＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶ（配列番号６７））表現型の欠失をもたらす。特定の実施形態では、フリン切断部位に対する変更は、スパイク安定化擬似粒子をもたらすことができる。Hansen et. al.,“Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail” Science（２０２０年６月１５日オンライン公開）を参照。上記文献は、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される。

【0047】

一実施形態では、上記ポリヌクレオチドは更に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体をコードする配列の３’側にコザック配列を含む。一実施形態では、上記コザック配列は野生型コザック配列である。ある具体的実施形態では、上記野生型コザック配列は、配列番号１１又はその誘導体を含む。一実施形態では、上記コザック配列は最適化コザック配列である。ある具体的実施形態では、上記最適化コザック配列は、配列番号１２又はその誘導体を含む。

【0048】

一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は組換えベシクロウイルス粒子である。一実施形態では、上記組換えベシクロウイルス粒子は組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子である。

【0049】

更なる態様では、試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するためのキットが提供され、上記キットは：
ａ）組換えラブドウイルス粒子であって、ここでラブドウイルス糖タンパク質（Ｇ）はコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられ、上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、第１の標的細胞及び第２の標的細胞の感染を仲介できる、組換えラブドウイルス粒子；
ｂ）（ｉ）レポータータンパク質の第１の部分を発現する上記第１の標的細胞、及び（ｉｉ）上記レポータータンパク質の第２の部分を発現する上記第２の細胞であって、上記第１の標的細胞及び上記第２の標的細胞は、上記組換えラブドウイルス粒子と接触したときに互いに融合でき、上記融合は、検出可能なレポーターシグナルの生成をもたらす、上記第１の標的細胞及び上記第２の細胞；
ｃ）任意に、コロナウイルス中和抗体を含まない対照試料；
ｄ）任意に、コロナウイルス中和抗体；又はコロナウイルスＳ糖タンパク質と、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質が標的細胞上で相互作用するタンパク質との間の相互作用を遮断する分子；又は標的細胞の融合を遮断する分子；又はこれらのいずれの組み合わせ、を含む、対照試料；
ｅ）任意に、上記レポータータンパク質のための基質、並びに
ｆ）任意に、使用説明書
を含む。

【0050】

更に別の態様では、試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するためのキットが提供され、上記キットは：
ａ）組換えラブドウイルス粒子のウイルスエンベロープでの発現のために、ラブドウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラブドウイルスリンタンパク質（Ｐ）、及びラブドウイルス巨大タンパク質（Ｌ）、又はこれらの機能性断片若しくは誘導体をコードし、更に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイク（Ｓ）糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体をコードする、ポリヌクレオチドであって、上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、第１の標的細胞及び第２の標的細胞の感染を仲介できる、ポリヌクレオチド；
ｂ）（ｉ）レポータータンパク質の第１の部分を発現する上記第１の標的細胞、及び（ｉｉ）上記レポータータンパク質の第２の部分を発現する上記第２の細胞であって、上記第１の標的細胞及び上記第２の標的細胞は、上記組換えラブドウイルス粒子と接触した場合に互いに融合でき、上記融合は、検出可能なレポーターシグナルの生成をもたらす、上記第１の標的細胞及び上記第２の細胞；
ｃ）任意に、コロナウイルス中和抗体を含まない対照試料；
ｄ）任意に、コロナウイルス中和抗体；又はコロナウイルスＳ糖タンパク質と、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質が標的細胞上で相互作用するタンパク質との間の相互作用を遮断する分子；又は標的細胞の融合を遮断する分子；又はこれらのいずれの組み合わせ、を含む、対照試料；
ｅ）任意に、上記レポータータンパク質のための基質、並びに
ｆ）任意に、使用説明書
を含む。

【0051】

一実施形態では、上記第１の標的細胞及び／又は上記第２の標的細胞の両方は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を含む。一実施形態では、上記第１の標的細胞はＶｅｒｏ－ＤＳＰ１（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－１－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７３）であり、上記第２の標的細胞はＶｅｒｏ－ＤＳＰ２（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－２－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７４）である。

【0052】

一実施形態では、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１～２２９を含み、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸２３０～３１１を含む。別の実施形態では、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１～１５５を含み、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１５６～３１１を含む。ある具体的実施形態では、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ変異体ＲＬｕｃ８のアミノ酸１～１５５を含み、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ変異体ＲＬｕｃ８のアミノ酸１５６～３１１を含む。

【0053】

一実施形態では、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体のアミノ酸１～１５６を含み、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、ＧＦＰ又はその変異体のアミノ酸１５７～２３１を含む。別の実施形態では、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、スーパーフォルダーＧＦＰのアミノ酸１～２１３を含み、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、スーパーフォルダーＧＦＰのアミノ酸２１４～２３０を含む。更に別の実施形態では、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、スーパーフォルダー黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のアミノ酸１～１５４を含み、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、スーパーフォルダーＹＦＰのアミノ酸１５５～２６２を含む。

【0054】

別の態様では、試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するためのキットが提供され、上記キットは：
ａ）組換えラブドウイルス粒子であって、ここで（ｉ）ラブドウイルス糖タンパク質（Ｇ）はコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられ、上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、標的細胞の感染を仲介でき、（ｉｉ）上記組換えラブドウイルス粒子は、レポータータンパク質、及び／又は上記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、組換えラブドウイルス；
ｂ）上記標的細胞；
ｃ）任意に、コロナウイルス中和抗体を含まない対照試料；
ｄ）任意に、コロナウイルス中和抗体；又はコロナウイルスＳ糖タンパク質と、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質が標的細胞上で相互作用するタンパク質との間の相互作用を遮断する分子；又はこれらのいずれの組み合わせ、を含む、対照試料；
ｅ）任意に、上記レポータータンパク質のための基質、並びに
ｆ）任意に、使用説明書
を含む。

【0055】

一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、上記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む。

【0056】

更なる態様では、試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するためのキットが提供され、上記キットは：
ａ）組換えラブドウイルス粒子のウイルスエンベロープでの発現のために、ラブドウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラブドウイルスリンタンパク質（Ｐ）、及びラブドウイルス巨大タンパク質（Ｌ）、又はこれらの機能性断片若しくは誘導体をコードし、更にレポータータンパク質及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイク（Ｓ）糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体をコードする、ポリヌクレオチドであって、上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、標的細胞の感染を仲介できる、ポリヌクレオチド；
ｂ）上記標的細胞；
ｃ）任意に、コロナウイルス中和抗体を含まない対照試料；
ｄ）任意に、コロナウイルス中和抗体；又はコロナウイルスＳ糖タンパク質と、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質が標的細胞上で相互作用するタンパク質との間の相互作用を遮断する分子；又はこれらのいずれの組み合わせ、を含む、対照試料；
ｅ）任意に、上記レポータータンパク質のための基質、並びに
ｆ）任意に、使用説明書
を含む。

【0057】

一実施形態では、上記レポータータンパク質をコードする核酸配列は、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体をコードする核酸配列と、ラブドウイルス巨大（Ｌ）タンパク質をコードする核酸配列との間に挿入される。

【0058】

一実施形態では、上記標的細胞は、Ｖｅｒｏ細胞（Ｖｅｒｏ－αＨｉｓ細胞を含む）、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞、Ｖｅｒｏ－ＴＲＭＰＳＳ２細胞、又はＶｅｒｏ－Ｅ６細胞である。一実施形態では、上記標的細胞はアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を含む。

【0059】

組換えラブドウイルス粒子を含む上述のキットのうちのいずれかの一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、複製可能なラブドウイルス粒子である。

【0060】

上述のキットのうちのいずれかの一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質、その断片又は誘導体は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質は、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質である。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片は、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片である。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。ある具体的実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、配列番号３のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質をコードする上記ヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７７％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＳ１サブユニットに対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４～６８４に対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＲＢＤドメインに対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸３１９～５４１に対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、ラブドウイルスゲノムの同じ位置に挿入された全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質を発現するラブドウイルスゲノムを含む同等の組換えラブドウイルスと比較して、より融合誘導性が高い組換えラブドウイルス粒子をもたらす。一実施形態では、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質断片又は誘導体は、ラブドウイルスゲノムの同じ位置に挿入された全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質を発現するラブドウイルスゲノムを含む同等の組換えラブドウイルス粒子と比較して、より融合誘導性が高い組換えラブドウイルス粒子をもたらす。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個の残基の挿入、欠失、及び／又は置換を含んでよく、あるいは上記挿入、欠失、及び／又は置換からなってよい。発生し得る欠失のためのアミノ酸の非限定的な例としては、例えば１４５位のチロシン、６７９位のアスパラギン、６８０位のセリン、６８１位のプロリン、６８２位のアルギニン、６８３位のアルギニン、６８４位のアラニン、及び／又は６８５位のアルギニン（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基が挙げられる。発生し得る置換のためのアミノ酸の非限定的な例としては、例えば５位においてフェニルアラニンへと変化するロイシン、２８位においてアスパラギンへと変化するチロシン、２９位においてイソロイシンへと変化するスレオニン、４９位においてチロシンへと変化するヒスチジン、５４位においてフェニルアラニンへと変化するロイシン、７４位においてリシンへと変化するアスパラギン、９６位においてアスパラギン酸へと変化するグルタミン酸、１１１位においてアスパラギンへと変化するアスパラギン酸、１５７位においてロイシンへと変化するフェニルアラニン、１８１位においてバリンへと変化するグリシン、２２１位においてトリプトファンへと変化するセリン、２４７位においてアルギニンへと変化するセリン、３４８位においてスレオニンへと変化するアラニン、４０８位においてイソロイシンへと変化するアルギニン、４７６位においてセリンへと変化するグリシン、４８３位においてアラニンへと変化するバリン、５１９位においてグルタミンへと変化するヒスチジン、５２０位においてセリンへと変化するアラニン、６１４位においてアスパラギンへと変化するアスパラギン酸、６１４位においてグリシンへと変化するアスパラギン酸、６７９位においてイソロイシンへと変化するアスパラギン、６８０位においてロイシンへと変化するセリン、６８２位においてグリシンへと変化するアルギニン、６８３位においてセリンへと変化するアルギニン、６８５位においてグルタミンへと変化するアルギニン、６８５位においてセリンへと変化するアルギニン、７９７位においてシステインへと変化するフェニルアラニン、９３０位においてバリンへと変化するアラニン、９３６位においてチロシンへと変化するアスパラギン酸、１０７８位においてバリンへと変化するアラニン、１１６８位においてヒスチジンへと変化するアスパラギン酸、及び／又は１２５９位においてヒスチジンへと変化するアスパラギン酸（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基が挙げられる。Becerra-Flores and Cardozo, “SARS-CoV-2 viral spike G614 mutation exhibits higher case fatality rate,” The International Journal of Clinical Practice, published online May 6, 2020; Eaaswarkhanth et al., “Could the D614G substitution in the SARS-CoV-2 spike (S) protein be associated with higher COVID-19 mortality?” International Journal of Infectious Diseases, 96: July 2020, Pages 459-460; Tang et al., “The SARS-CoV-2 Spike Protein D614G Mutation Shows Increasing Dominance and May Confer a Structural Advantage to the Furin Cleavage Domain,” Preprints 2020, 2020050407 (doi: 10.20944/preprints202005.0407.v1); Hansen et. al., “Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail” Science, published online June 15, 2020; Lokman et al., “Exploring the genomic and proteomic variations of SARS-CoV-2 spike glycoprotein: A computational biology approach”, Infection, Genetics and Evolution : Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases, 2020 Jun;84:104389. DOI: 10.1016/j.meegid.2020.104389を参照。これらの文献はそれぞれ、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される。挿入、欠失、及び／又は置換のためのアミノ酸残基の更なる非限定的な例としては、表８及び９に列挙されているものが挙げられる（アミノ酸残基の位置は配列番号１を参照配列として用いて示されており、これは、（上記と同じ）いずれのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基の特定のための参照として使用できる；表８中の参考文献は、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される）。表８に列挙された残基の修飾はそれぞれ、単独で、又は他のものと組み合わせて個別に使用することによって、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子のバリアントを生成できる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び／又は６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基を変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、溶解性がより高い表現型をもたらす。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４２のアミノ酸配列、又は配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一の配列を含んでよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、コドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされてよい。様々な実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４３のポリヌクレオチド配列、又は配列番号４３に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％のポリヌクレオチド配列同一性を有する配列によってコードされてよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４４のアミノ酸配列
、又は配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一の配列を含んでよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び／若しくは４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び／若しくは６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、並びに／又は残基６９～７０の欠失（配列番号１に示されている位置）によって、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基の変化又は欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへとへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへとへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、上記スパイクタンパク質内のフリン切断部位を不活化することによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、配列番号１に示されているＱ^６７７ＴＮＳＰＲＲＡＲＳＶ^６８７（配列番号６５）、又は変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基を、ＱＴＩＬＲＳＶ（配列番号６６）又はＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶ（配列番号６７）へと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、Ｓ１／Ｓ２境界の一塩基フリン切断部位（ＱＴＩＬＲＳＶ（配列番号６６））、又はフリン切断部位（ＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶ（配列番号６７））表現型の欠失をもたらす。特定の実施形態では、フリン切断部位に対する変更は、スパイク安定化擬似粒子をもたらすことができる。Hansen et. al.,“Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS－CoV－2 antibody cocktail” Science（２０２０年６月１５日オンライン公開）を参照。上記文献は、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される。

【0061】

上述のキットのうちのいずれかの一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は組換えベシクロウイルス粒子である。一実施形態では、上記組換えベシクロウイルス粒子は組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子である。

【0062】

組換えラブドウイルス粒子を含む上述のキットのうちのいずれかの一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、変異型ＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質を含む。一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質をコードする。ある具体的実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、メチオニン５１における変異を含む変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質を含む、組換えＶＳＶ粒子である。ある具体的実施形態では、メチオニン５１における上記変異は、メチオニン（Ｍ）からアルギニン（Ｒ）へのものである。ある具体的実施形態では、上記変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある具体的実施形態では、上記変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列からなる。

【0063】

組換えラブドウイルス粒子を含む上述のキットのうちのいずれかの一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、野生型ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質を含む。一実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子のゲノムは、野生型ラブドウイルスＭタンパク質をコードする。ある具体的実施形態では、上記組換えラブドウイルス粒子は、配列番号９のアミノ酸配列を含む野生型ＶＳＶ Ｍタンパク質を含む、組換えＶＳＶ粒子である。ある具体的実施形態では、上記野生型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列からなる。

【0064】

上述のキットのうちのいずれかの一実施形態では、上記レポータータンパク質はルシフェラーゼを含む。使用可能なルシフェラーゼの非限定的な例としては、例えばウミシイタケルシフェラーゼ、ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼ、（ｄＣｐＧ）ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃレポーター、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）、ＭｅｔＬｕｃ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉルマジンタンパク質、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉルミナーゼ（ｌｕｍｉｎａｚｅ）タンパク質、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼＹＹ５変異体、ホタルルシフェラーゼＬＧＲ変異体、ホタルルシフェラーゼ変異体Ｅ、及びこれらの誘導体が挙げられる。

【0065】

上述のキットのうちのいずれかの一実施形態では、上記レポータータンパク質は蛍光タンパク質を含む。使用可能な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰ様蛍光タンパク質、（ＧＦＰ－ｌｉｋｅ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化型青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、強化型青緑色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）；赤色蛍光タンパク質、スーパーフォルダーＧＦＰ、スーパーフォルダーＹＦＰ、橙色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、小型超赤色蛍光タンパク質、ＦＭＮ結合蛍光タンパク質、ｄｓＲｅｄ、ｑＦＰ６１１、Ｄｒｏｎｐａ、ＴａｇＲＦＰ、ＫＦＰ、ＥｏｓＦＰ、ＩｒｉｓＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ、Ｋａｅｄｅ、ＫｉｋＧｒ１、鮮緑色蛍光タンパク質、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びこれらの誘導体が挙げられる。

【0066】

上述のキットのうちのいずれかのある具体的実施形態では、上記レポータータンパク質はルシフェラーゼを含み、上記レポータータンパク質のための上記基質は、ルシフェリン（例えばｄ－ルシフェリン）、セレンテラジン、又はＥｎｄｕＲｅｎルシフェラーゼ基質を含む。

【0067】

上述のキットのうちのいずれかのある具体的実施形態では、コロナウイルス中和抗体を含む上記対照試料は、ｍＡｂ１０９１４を含む対照試料である。上述のキットのうちのいずれかのある具体的実施形態では、コロナウイルス中和抗体を含む上記対照試料は、ｍＡｂ１０９２２を含む対照試料である。

【0068】

本明細書に記載のこれらの態様及び他の態様は、以下の説明、特許請求の範囲、及び図面において、当業者には明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0069】

【図1】図１は、実施例において試験されるＶＳＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（バリアント１～４）を示す。これらの構築物では、ＶＳＶ Ｇ糖タンパク質が：（１）全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質配列（バリアント１；ＶＳＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｄＧ＝ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ；配列番号１のアミノ酸配列；配列番号２のコドン最適化ヌクレオチド配列）、（２）細胞質尾部の１９個のアミノ酸ＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴ（配列番号２０）が欠失したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列（バリアント２；ＶＳＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Δ１９ＣＴ ｄＧ＝ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ；配列番号３のアミノ酸配列；配列番号４のコドン最適化ヌクレオチド配列）、（３）Ｓ細胞質尾部がＶＳＶ Ｇ糖タンパク質細胞質尾部配列ＫＬＫＨＴＫＫＲＱＩＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ（配列番号２１）に置き換えられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列（バリアント３；ＶＳＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ－Ｇ ＣＴ ｄＧ；配列番号５のアミノ酸配列；配列番号６のコドン最適化ヌクレオチド配列）、又は（４）全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列ではあるものの、他の３つの構築物で使用されている最適化コザック配列（ｃａｃｃＡＴＧ；配列番号１２）の代わりに野生型ＶＳＶコザック配列（ｃＡｃｔＡＴＧ；配列番号１１）が使用された、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列（バリアント４；ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ；配列番号１のアミノ酸配列；配列番号２のコドン最適化ヌクレオチド配列）によって、置換された。野生型Ｍタンパク質（配列番号９のアミノ酸配列；配列番号１０のヌクレオチド配列）をコードする、バリアント１～４の構築物の１つ目のセットを調製した。ウイルスの弱毒化をもたらす置換Ｍ５１Ｒを有するＭタンパク質（配列番号７のアミノ酸配列；配列番号８のヌクレオチド配列）をコードする、バリアント１～４の構築物の第２のセットを調製した。

【図2】図２は、本発明のＤＳＰ Ｖｅｒｏルシフェラーゼアッセイの概要を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクを発現するＶＳＶ（例えばＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ又はＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ）を、試験用血清試料と共にインキュベートする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の不在下（上側）では、ウイルスは感染性を保持し、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層に感染する。試験用試料がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を含有する場合（下側）、抗体はスパイクタンパク質に結合し、細胞侵入を遮断することによってウイルスの中和を引き起こす。ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴは、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層での合胞体形成を誘導し、これによって、完全に機能するルシフェラーゼレポーターが再構成され、これは、ウイルス誘導型合胞体形成を定量化するために使用される。高いルシフェラーゼシグナルは、試験用試料がウイルスを中和しなかったことを示し、ルシフェラーゼの減少は、試験用試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－中和抗体が存在することを示す。

【図3】（Ａ）本アッセイで使用されたＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴゲノムの概略図。ＶＳＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、及びＬ遺伝子の位置が示されている。ＶＳＶ－Ｇは、１９個のアミノ酸Ｃ末端（ＣＴ）の欠失（Δ１９ＣＴ）を伴うコドン最適化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク遺伝子に置き換えられている。ＴＭは膜貫通ドメインであり、ＣＴはＣ末端ドメインである。描画の縮尺は正確ではない。（Ｂ）ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴは、Ｖｅｒｏ細胞単層での合胞体の形成を誘導する。Ｖｅｒｏ単層を、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴに感染、又は偽感染させた。４時間後、接種材料を除去し、新鮮な培地±０．４μｇ／ｍＬのトリプシンと交換した。感染の２０時間後に１００倍の倍率で画像を撮影した。（Ｃ）免疫ブロット分析。ＶＳＶ－ＧＦＰ（ＶＳＶ－Ｇをコードする）若しくはＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴに感染した、若しくは偽感染したＶｅｒｏ細胞から調製したウイルス上清を、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク抗体（左）及びウサギ抗ＶＳＶ抗血清（右）を用いた免疫ブロット分析に供した。矢印は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の全長Ｓ１／Ｓ２バリアント及びタンパク質分解的に切断されたＳ２バリアント、並びにＶＳＶ－Ｇ、ＶＳＶ－Ｎ、及びＶＳＶ－Ｍタンパク質を示す。（Ｄ及びＥ）フローサイトメトリー。Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１細胞の単層をＶｅｒｓｅｎｅで除去し、（ＴＭＰＲＳＳ２染色のみについて）透過処理し、アイソタイプ対照（灰色）、抗ＡＣＥ２（Ｄ、黒色）、又は抗ＴＭＰＲＳＳ２（Ｅ、黒色）抗体で染色し、固定し、フローサイトメトリー分析に供した。（Ｆ）ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴはルシフェラーゼ活性を誘導した。Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２、又は混合Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞の単層を、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴに感染（１０，０００ ＴＣＩＤ_５０単位／ウェル）、又は偽感染させた。ルシフェラーゼ活性を、感染の２４時間後の細胞融合のマーカーとして測定した。値は、二重に測定されたウェルからの平均ＲＬＵ±標準偏差を表す。

【図4】図４Ａ～Ｂは、アッセイのルシフェラーゼシグナルの最適化を示す。（Ａ）ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ誘導型ルシフェラーゼ活性の動態。ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ（２３６０ ＴＣＩＤ_５０単位／ウェル）又はＯｐｔｉＭＥＭのみ（モック）を、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞の単層上に重ねた。ルシフェラーゼ基質ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）をウェルに加え、その後、指示された時点（単位：時間）で、ルシフェラーゼ活性を測定した。値は、二重に測定されたウェルからの平均ＲＬＵ±標準偏差を表す。（Ｂ）Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞の密度の最適化。指示された個数のＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞を９６ウェルプレートに播種した。翌日、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴを指示された希釈率となるまでＯｐｔｉＭＥＭ中で希釈し、細胞単層上に重ねた。ルシフェラーゼ基質ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）をウェルに加え、感染の２８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。値は、二重に実施した２つの別個の実験からの平均ＲＬＵ±標準偏差を表す。

【図5】図５Ａ～Ｂは、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ誘導型ルシフェラーゼ活性の中和を示す。（Ａ）精製された分子による阻害。ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴを、培地のみ、又は指示された濃度のポリクローナル抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク抗体、モノクローナル抗ＡＣＥ２抗体、若しくは組換えＡＣＥ２と共に、インキュベートした。３７℃で１時間後、ウイルス混合物をＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層上に重ねた。対照ウェルは培地のみ（ウイルスなし）を受け入れた。ルシフェラーゼ基質ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）をウェルに加え、感染の２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。値は、二重に測定されたウェルからの平均ＲＬＵ±標準偏差を表す。（Ｂ）ＣＯＶＩＤ－１９回復期血漿による阻害。ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴをＣＯＶＩＤ－１９回復期の個体からの血漿（ＮＬ１）、又は３人のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ（ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ）と推定される個体からのプールされた血漿の、指示された希釈物と共に、インキュベートした。血漿希釈率は、ウイルス添加後の最終的な希釈率を表す。３７℃で１時間後、ウイルス混合物をＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層上に重ねた。ルシフェラーゼ基質ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）をウェルに加え、感染の２８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。値は、二重に測定されたウェルからの平均ＲＬＵ±標準偏差を表す。

【図6】図６Ａ～Ｅは、アッセイの中和条件の最適化を示す。（Ａ）ウイルスのインキュベーションによって、合胞体の形成が減少する。ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴを解凍し、指示されたＴＣＩＤ_５０単位／１００μＬまで、ＯｐｔｉＭＥＭ中で希釈した。試料は二重に調製され、一方のセットはＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層にすぐに重ねられ、もう一方は３７℃で１時間インキュベートした後でＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層に重ねられた。ルシフェラーゼ基質ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）をウェルに加え、感染の２７時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。値は、二重に測定されたウェルからの平均ＲＬＵ±標準偏差を表す。（Ｂ）異なる複数の条件下でのＮＬ１の阻害。ＮＬ１回復期血漿の希釈物を調製し、指示された時間にわたって、指示された温度で、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴと共にインキュベートした後、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層上に重ねた。希釈率は、最終的なウイルス／血漿混合物中のＮＬ１希釈率を表す。ルシフェラーゼ基質ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）をウェルに加え、感染の２５時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。値は、二重に測定されたウェルからの平均ＲＬＵ±標準偏差を表す。（Ｃ及びＤ）陰性血清に対する熱不活化の影響。陰性と推定される血清試料Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及び市販のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブのプールされた血清（プール）を、二重のアリコートとして調製した。一方のアリコートは氷上で保管され、もう一方は５６℃で３０分間インキュベートされた。次に各アリコートをＯｐｔｉＭＥＭ中で希釈し、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴと混合して、最終希釈率を１：１００（Ｃ）又は指示された希釈率（Ｄ）とした。室温で３０分間のインキュベーションの後、ウイルス／血清混合物をＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層上に重ねた。ルシフェラーゼ基質ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）をウェルに加え、感染の２３時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。値は、二重に測定されたウェルからの平均ＲＬＵ±標準偏差を表す。（Ｅ）ＣＯＩＶＤ－１９回復期血清に対する熱不活化の影響。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロポジティブと推定される試料を解凍し、パネルＤに記載されているようにアッセイに供した。

【図7】図７Ａ～Ｄは、人工（ｃｏｎｔｒｉｖｅｄ）陽性対照の開発を示す。（Ａ）推奨される最低希釈率。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブと推定される個体からの３９個の血清を連続希釈し、１つずつＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴと混合した。希釈率は、ウイルス／血清混合物中の血清希釈率を表す。室温で３０分後、ウイルス／血清混合物をＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層に重ねた。ルシフェラーゼ基質ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）をウェルに加え、感染の２２時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。値は、非線形回帰曲線に当てはめた平均ＲＬＵ±標準偏差を表す。（Ｂ及びＣ）ｍＡｂ１０９１４によるＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴの中和。ｍＡｂ１０９１４又はアイソタイプ対照抗体を、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｂ）、又はプールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清（Ｃ）中で希釈し、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴと共にインキュベートした。濃度は、ウイルス／抗体混合物中での濃度を表し、血清濃度は１：１００であった。室温で３０分後、ウイルスをＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層上に重ねた。ルシフェラーゼ基質ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）をウェルに加え、感染の２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。値は、二重に測定されたウェルからの平均ＲＬＵ±標準偏差を表す。（Ｄ）人工陽性対照の値の確立。ｍＡｂ１０９１４を、パネルＣに記載されているように、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清中で希釈し、３人の異なる操作者が三重に実施した、パネルＣと同様のアッセイに供した。プールされていた陰性血清を希釈したものを、対照として用いた（０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４）。対照に対する％シグナルを各試料について決定した。値は、非線形回帰曲線に当てはめた、二重に実施された３つの独立した実験からの平均％シグナル±標準偏差を表す。％ルシフェラーゼシグナル：陰性対照（プールされていた陰性血清）のルシフェラーゼシグナルに対する試験用試料からのルシフェラーゼシグナル：５０％超＝陰性試料；５０％未満＝陽性又はボーダーライン。ウイルス中和単位（ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｕｎｉｔ：ＶＮＵ）：同等の％ルシフェラーゼシグナルをもたらすｍＡｂ１０９１４の濃度の１００倍に等しい任意単位。陽性であるためには、試料は３０のＶＮＵを有する必要がある。

【図8-1】図８Ａ～Ｄは、ウイルス中和単位の、ＰＲＮＴ_ＥＣ５０及びＶＮＴ_ＥＣ５０に対する相関を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロポジティブ血清試料をＯｐｔｉＭＥＭ中で連続希釈し、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴと混合した。室温で３０分後、ウイルス／血清混合物をＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層に重ねた。ルシフェラーゼ基質ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）をウェルに加え、感染の２３時間後及び２７時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。各アッセイプレートは検量線も含んでおり、この検量線では、ｍＡｂ１０９１４を、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清中にスパイクしてウイルスと混合した。検量線のためのウイルス混合物中のｍＡｂ１０９１４の濃度は、３、１、０．３３、０．１１、及び０．０３７μｇ／ｍＬであった。各試験試料及び検量線のポイントに関する％シグナルを決定した。続いて、各試料について、検量線に対するその％シグナルに基づいてウイルス中和単位（ＶＮＵ）を決定した。ここでＶＮＵは、与えられた％シグナルに対するｍＡｂ１０９１４の濃度を１００倍したものに等しい。陽性であるためには、試料は３０のＶＮＵを有する必要がある。（Ａ）ＰＲＮＴ_ＥＣ５０との比較。試験された陽性試料のうち１５個の血清試料を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の臨床単離株を用いたプラーク減少中和試験（ｐｌａｑｕｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ 試験：ＰＲＮＴ）に供した。試料の２倍連続希釈物を、ＰＲＮＴ５０アッセイで１：２０から１：４０９６０まで試験した。各試料について、各希釈率におけるプラークの数をプロットし、これを用いて、各試料についてのＰＲＮＴ_ＥＣ５０値を決定した。ＰＲＮＴ_ＥＣ５０に対するＶＮＵの統計的比較を実施した。データは非正規分布（ｐ＜０．０００１）であるため変換された。（Ｂ）ＶＮＴ_ＥＣ５０との比較。各試料希釈物に関する％シグナルをプロットし、これを用いてＶＮＴ_ＥＣ５０を決定した。ＶＮＴ_ＥＣ５０に対するＶＮＵの統計的比較を実施した。データは非正規分布（ｐ＜０．０００１）であるため変換された。

【図8-2】図８－１の続き。（Ｃ）ＰＣＲ陽性コホートにおけるＶＮＵの代表的な分布。（Ｄ）臨床症状が自己報告された３１個の陽性試料における、ＶＮＵ値と症状の重篤度との間の相関。

【図9】図９は、ＤＳＰ Ｖｅｒｏルシフェラーゼアッセイのためのアッセイプレートのレイアウトの例を示す。例示的なアッセイプレートのレイアウト。全ての対照及び試料は二重にアッセイに供された。合計４１個の試料（Ｓ１～Ｓ４１）を、各試料について単一の希釈物を用いて、単一のプレート上で分析できる。ＢＣ（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ：バックグラウンド対照）は、ウイルスを含まない、１：１００のプールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清からなる。ＮＣ（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ：陰性対照）は、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴを含む、１：１００のプールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清からなる。ＮＣは、アッセイにおける１００％のルシフェラーゼシグナルを決定するために使用される。Ｓｔ１～Ｓｔ５は、検量線のための標準である。全ての標準は、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ及びｍＡｂ１０９１４を含む、１：１００のプールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清であり、上記ｍＡｂ１０９１４は、各標準に異なる濃度でスパイクされている：Ｓｔｄ１は３μｇ／ｍＬであり、Ｓｔｄ２は１μｇ／ｍＬであり、Ｓｔｄ３は０．３３μｇ／ｍＬであり、Ｓｔｄ４は０．１１μｇ／ｍＬであり、Ｓｔｄ５は０．０３７μｇ／ｍＬである。

【図10】図１０は、ＤＳＰ Ｖｅｒｏルシフェラーゼアッセイのワークフローの概略図である。

【図11-1】図１１Ａ～Ｃは、異なる希釈率の３人の対象の血漿及び血清におけるルシフェラーゼ活性を示す。３人のＣＯＶＩＤ－１９回復期の個体からの血漿及び血清を、５６℃で３０分間熱不活化した。続いて連続希釈物を調製し、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴと共に室温で３０分間インキュベートした後、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１／ＤＰＳ２単層上に重ねた。およそ２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。

【図11-2】図１１－１の続き。図１１Ｄは、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ｖ１．０（ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ）ウイルスと混合された段階的な濃度の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗体ｍＡｂ１０９１４を含有する、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血漿における、ルシフェラーゼ活性を示す。室温で３０分のインキュベーションの後、血漿／ウイルス混合物をＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／ＤＳＰ２単層上に重ねた。およそ２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。図１１Ｅは、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ｖ．１．０（ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ）ウイルスと混合された、ＣＯＶＩＤ－１９回復期の個体（ＮＬ１）からの、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血漿又は血漿の希釈物における、ルシフェラーゼ活性を示す。３７℃で１時間のインキュベーションの後、血漿／ウイルス混合物をＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／ＤＳＰ２細胞単層上に重ねた。およそ２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。図１１Ｆは、血漿試料に対する熱不活化の影響を示す。一方のアリコートは氷上で保管され、もう一方は５６℃で３０分間インキュベートされた。次に各アリコートをＯｐｔｉＭＥＭ中で希釈し、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴと混合して、グラフ中に示されている最終希釈率とした。室温で３０分間のインキュベーションの後、ウイルス／血漿混合物をＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層上に重ねた。およそ２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。

【図12】図１２は、１：１００の希釈率のＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ｖ．１．０（ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ）ウイルスと混合された段階的な濃度（２μｇ／ｍＬ（ＱＣ－Ｈｉｇｈ）、０．６μｇ／ｍＬ（ＱＣ－Ｍｉｄ）、及び０．４μｇ／ｍＬ（ＱＣ－Ｌｏｗ））のｍＡｂ１０９１４がスパイクされた、ＣＯＶＩＤパンデミック前の個体から調製された、プールされていた唾液における、ルシフェラーゼ活性を示す。室温で３０分のインキュベーションの後、唾液／ウイルス混合物をＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層に重ねた。およそ２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。スパイクなし、ＱＣ－Ｌｏｗ、ＱＣ－Ｍｉｄ、ＱＣ－Ｈｉｇｈを用いて生成されたデータに対応するバーを、試験された各希釈率について上述の順（左から右）に示す。

【図13】図１３Ａは、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｆｌｕｃ及びＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－ｇＬｕｃの概略図である。ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｆｌｕｃは、ホタルルシフェラーゼの変異型Ｌｕｃ２バリアント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ７３８２２２）をコードする。ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－ｇＬｕｃは、分泌型ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）をコードする。図１３Ｂは、ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶアッセイのバージョン２のワークフローを示す。

【図14】図１４Ａは、ホタルルシフェラーゼの変異型Ｌｕｃ２バリアントをコードするＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－Ｆｌｕｃを、プールされていた陰性血清（希釈率１：８０）、ＣＯＶＩＤ－１９回復期血清（希釈率１：８０）、又はプールされていた陰性血清（希釈率１：８０）を、１０、２、若しくは０．２μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４と混合したものと共にインキュベートした場合の、ルシフェラーゼ活性を示す。室温で４５分間のインキュベーションの後、ウイルス／血清混合物をＶｅｒｏ細胞単層上に重ねた。更に１８時間後、ｄ－ルシフェリン基質をウェルに加え、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）を測定した。図１４Ｂは、分泌型ガウシアルシフェラーゼをコードするＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－ｇＬｕｃ（ウイルスストックの１：４８希釈物）を、単独の、又は０．２若しくは２μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４がスパイクされた、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清（希釈率１：８０）と共にインキュベートした場合の、ルシフェラーゼ活性を示す。室温で３０分間のインキュベーションの後、ウイルス／血清混合物をＶｅｒｏ－Ａｃｅ－２単層上に重ねた。更に２４時間後、セレンテラジン（５μＭのストック、２０μＬ）を加え、ルシフェラーゼ活性を測定した。

【図15】図１５Ａ～Ｂは、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞がＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶアッセイｖ．２において特に有効であることを実証している。図１５Ａは、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－Ｆｌｕｃ又は培地のみ（ウイルスなしの対照）を、２又は０．２μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４と混合された、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清（希釈率１：８０）と共にインキュベートした場合の、ルシフェラーゼ活性を示す。室温で３０分間のインキュベーションの後、ウイルス／血清混合物を細胞（Ｖｅｒｏ－αＨｉｓ、Ｖｅｒｏ－Ｅ６、又はＶｅｒｏ－Ａｃｅ－２）の単層上に重ねた。更に２６時間後、ｄ－ルシフェリン基質をウェルに加え、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）を測定した。図１５Ｂは、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清（希釈率１：８０）を、単独の、又は０．２μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４がスパイクされた、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－ｇＬｕｃ（４８００ ＴＣＩＤ_５０／ウェル）と共にインキュベートした場合の、ルシフェラーゼ活性を示す。室温で３０分間のインキュベーションの後、ウイルス／血清混合物を、前日に黒色透明底９６ウェルプレートに１ｅ４細胞／ウェルで播種されたＶｅｒｏ－αＨｉｓ、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２、又はＶｅｒｏ－Ａｃｅ－２／ＴＭＰＲＳＳ２細胞単層上に重ねた。更に２４時間後、ｄ－ルシフェリンを加えてから、ウェル内のルシフェラーゼ活性を測定した。

【図16】図１６Ａ～Ｂは、細胞をウイルスと同時にプレーティングした場合に、ルシフェラーゼシグナルが（細胞を事前にプレーティングした場合に比べて）大幅に低くなるものの、４時間の回復時間を与えると大幅に回復することを示している。（Ａ）ウイルスを、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清（１：８０）と共に室温で３０分間インキュベートした後、Ｖｅｒｏ細胞単層上に重ねるか、又は同等の密度でＶｅｒｏ細胞と混合した。細胞に重ねてから指定された時間だけ後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。（Ｂ）ウイルスを、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清（１：８０）と共に室温で３０分間インキュベートした後、４時間又は２４時間前にプレーティングされたＶｅｒｏ細胞単層上に重ねた。更に２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。

【図17】図１７Ａ～Ｂは、ルシフェラーゼ活性が、細胞密度（Ａ）及びウイルス量／ウェル（Ｂ）の上昇と共に上昇することを示している。ウイルスをＯｐｔｉＭＥＭ中で希釈して、１ウェルあたり指定されたＴＣＩＤ_５０とし、前日に指定された細胞／ウェルでプレーティングされたＶｅｒｏ細胞単層上に重ねた。更に１６、２０、及び２４時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。パネルＡのデータは２４時間からのものである。パネルＡでは、７０００細胞／ウェル、１００００細胞／ウェル、１５０００細胞／ウェル、及び２００００細胞／ウェルを用いて生成されたデータに対応するバーを、試験されたウイルスＴＣＩＤ_５０条件それぞれについて、上述の順（左から右）に示す。パネルＢでは、２４００Ｐｆｕ／ウェル、１６００ＰＦＵ／ウェル、８００ＰＦＵ／ウェル、及び４００ＰＦＵ／ウェルを用いて生成されたデータに対応するバーを、試験された各時点について、上述の順（左から右）に示す。

【図18】図１８は、ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶアッセイｖ．２が高感度であり、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－Ｆｌｕｃの用量依存性阻害を示すことを示している。ウイルスを、段階的な濃度のｍＡｂ１０９１４を含有するプールされていた陰性血清と共に、室温で３０分間インキュベートした。続いてウイルス／血清混合物をＶｅｒｏ細胞単層上に重ねた。更に２４時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。

【図19】図１９は、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－Ｆｌｕｃに感染したＶｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞の、ｄ－ルシフェリン添加後のＦｌｕｃ活性の動態曲線を示す。Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞単層（感染の前日に１ｅ４細胞／ウェルで播種）に、４８００ ＴＣＩＤ_５０単位のＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－Ｆｌｕｃを感染させた。２４時間後に、インジェクターを取り付けたＴＥＣＡＮ機器（発光プレートリーダー）にプレートを装入した。インジェクターを、所望量の基質（ｄ－ルシフェリンの３．７５ｍｇ／ｍＬ溶液、２０μＬ）を各ウェルに注入するようにプログラムし、０．５秒後に発光を読み取った（１０００ｍｓの積分時間）。更なるルシフェラーゼの読み取りを５秒ごとに３分間にわたって実施して、ルシフェラーゼ活性の動態曲線を生成した（２回の読み取りを実施、９秒（矢印）にｄ－ルシフェリンを添加（ウェル中での最終濃度０．４４ｍｇ／ｍＬ）、更なる読み取りは３分間実施された）。

【図20】図２０は、例示的な乾燥血斑（ＤＢＳ）収集カードの記載を示す。血液の滴を、５つの円が印刷されたろ紙に落とす。

【図21】図２１は、様々な試料希釈率にわたるＯｐｔｉＭＥＭを用いて血斑を抽出することによって生成された、％相対ルシフェラーゼ応答データの概要のグラフを示す。ＯｐｔｉＭＥＭ Ａ及びＢは、ＯｐｔｉＭＥＭの独立した試料である。

【図22】図２２Ａ～Ｂは、血斑マトリックスの例示的な顕微鏡写真を示す。（Ａ）Ｂ７ Ｏｐｔｉ－２０ｘ陽性マトリックスＡ、及び（Ｂ）Ａ７ Ｏｐｔｉ－２０ｘ陰性マトリックスＡ。血斑マトリックスは、マトリックスの１：２０での希釈において、適合性を有していた。試験された血斑試料では、細胞の健康状態又はウイルス感染性について問題は見られなかった。

【図23】図２３は、９６ウェルのＵウェル（又はＵ底）プレートに関する例示的なレイアウトマップを示す。

【図24】図２４は、９６ウェルアッセイプレートに関する例示的なレイアウトマップを示す。

【発明を実施するための形態】

【0070】

定義
本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、それ以外の定義がなされていない限り、本開示が属する分野の当業者が共通して理解する意味と同じ意味を有する。

【0071】

単数形「ある（ａ、ａｎ）」及び「上記（ｔｈｅ）」は、文脈によってそうでないことが規定されている場合を除いて、複数の指示対象を含む。従って例えば、「ある方法（ａ ｍｅｔｈｏｄ）」に関する言及は、本明細書に記載されているタイプの、及び／又は本開示を読めば当業者には明らかになる、１つ以上の方法及び／又はステップを含む。

【0072】

用語「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、ある値の、統計的に有意な範囲内にあることを含む。このような範囲は、所与の値又は範囲の１桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、更に好ましくは１０％以内、また更に好ましくは５％以内とすることができる。用語「約」又は「およそ」が包含する許容可能なばらつきは、研究中の特定の系に依存し、これは当業者には容易に理解され得る。

【0073】

用語「…を備える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「…を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「…を有する（ｈａｖｉｎｇ、ｈａｓ）」、及び「…を含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」は、追加の行為又は構造の可能性を排除することのない、非制限的な意味の移行句、用語、又は単語であることが意図されている。

【0074】

本明細書中で使用される場合、用語「アッセイ（ａｓｓａｙ）」又は「試験（ｔｅｓｔ）」は、用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」と交換可能なものとして使用され得る。

【0075】

本明細書中で使用される場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を包含し、クラスＩｇＡ（例えばＩｇＡ１若しくはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）、若しくはＩｇＭの免疫グロブリン分子、又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二重官能性抗体、ヒト化抗体、及びこれらの様々な誘導体を含むがこれらに限定されないその断片若しくは誘導体を指す。

【0076】

本開示の文脈において、用語「中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、病原体（例えばウイルス）に結合して、上記病原体の、細胞に感染する能力に干渉する、抗体を指す。中和抗体の非限定的な例としては、ウイルス粒子に結合して、良好な形質導入、例えば結合、侵入、核への輸送、及びウイルスゲノムの転写から選択される１つ以上のステップを阻害する、抗体が挙げられる。一部の中和抗体は、侵入後のステップにおいてウイルスを遮断できる。

【0077】

用語「免疫応答（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」は、免疫系の細胞（例えばＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、又は多形核球）の、抗原（例えばウイルス抗原）等の刺激に対する応答を指す。能動免疫応答は、免疫担当細胞の分化及び増殖を伴うことができ、これは抗体の合成、又は細胞仲介型反応性の発現、又はこれら両方につながる。能動免疫応答は、（例えば感染又はワクチン接種による）抗原への曝露後に宿主によって開始され得る。能動免疫応答は受動免疫と対比でき、受動免疫は、例えば抗体、伝達因子、胸腺移植片、及び／又はサイトカイン等の物質の、能動免疫された宿主から非免疫宿主への伝達によって獲得できる。

【0078】

本明細書中でウイルス感染及びワクチン接種に関連して使用される場合、用語「防御免疫応答（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」又は「防御免疫（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」は、感染を予防若しくは軽減する、又は感染に関連する疾患の発症を予防若しくは軽減するという点で、対象に何らかの利益をもたらす免疫応答を指す。理論によって束縛されることを望むものではないが、対象の体内にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体が存在することは、この対象の体内に防御免疫応答が存在することを示す可能性がある。

【0079】

用語「免疫原性組成物（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」、「ワクチン組成物（ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」、又は「ワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）」は、交換可能なものとして使用され、対象の体内で免疫応答（例えば体液性及び／又は細胞性応答）を誘導する少なくとも１つの免疫原性及び／又は抗原成分を含む組成物を指す。特定の実施形態では、上記免疫応答は防御免疫応答である。ワクチンは、感染症等の疾患の予防又は治療のために投与できる。ワクチン組成物としては、例えば生きた又は死滅した感染性病原体、組換え感染性病原体（例えば、免疫原性及び／又は抗原性成分を発現する、組換えウイルス粒子、ウイルス様粒子、ナノ粒子、リポソーム、又は細胞）、抗原性タンパク質又はペプチド、核酸等が挙げられる。免疫応答を増強するために、ワクチンをアジュバントと共に投与することもできる。

【0080】

用語「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、機能的関係での複数の核酸エレメントの連結を含む。核酸配列は、別の核酸配列と機能的な関係となるように配置されると、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター若しくはエンハンサー、又はプロモーター若しくはエンハンサーを含有する５’調節領域は、コード配列の転写に影響を与える場合、このコード配列に対して作動可能に連結される。

【0081】

本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は、一般にある遺伝子のシス側にあり、かつ上流に位置し、該遺伝子の転写を促進する、遺伝子配列を意味する。プロモーターは、（発生的、組織特異的、若しくは（化学的、温度）誘導的に）調節できるか、又は構成的に活性を有するものとすることができる。特定の実施形態では、プロモーターは、ユビキチンＣプロモーター（Schorpp et al., Nucl. Acids Res. 24(9): 1787-1788, 1996;Byun et al., Biochem. Biophys. Res. Comm 332(2): 518-523, 2005を参照）、又はＣＭＶ－ＩＥプロモーター（Addison et al., J. Gen. Virol. 78(7): 1653-1661, 1997;Hunninghake et al., J. Virol. 63(7): 3026-3033, 1989を参照）、又はｈＣＭＶ－ＩＥプロモーター（ヒトサイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター）（Stinski & Roehr, J. Virol. 55(2): 431-441, 1985; Hunninghake et al., J. Virol. 63(7): 3026-3033, 1989を参照）といった、構成的哺乳類プロモーターである。プロモーターは、発現を更に強化する、並びに／又はその空間的発現及び／若しくは時間的発現を変化させるための、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことができる。プロモーターはまた、遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含むことができ、これは転写の開始部位から数千個もの塩基対の位置に存在できる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含むソースに由来するものであり得る。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織、若しくは器官に対して、又は発現が起こる発生段階に対して、又は生理学的ストレス、病原体、金属イオン、若しくは誘導剤といった外部刺激に応答して、遺伝子成分の発現を構成的又は差次的に調節できる。プロモーターの非限定的な代表例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター又はＳＶ４０後期プロモーター、及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。

【0082】

「シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）」及び「リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、本明細書では交換可能なものとして使用され、ポリペプチドの局在化を指示できるアミノ酸配列を指す。シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞の分泌経路に向かわせることができる。シグナルペプチドは多くの場合、ポリペプチドのＮ末端に位置し、また多くの場合、細胞からの分泌時にポリペプチドの残りの部分（「成熟タンパク質（ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）」と呼ばれることが多い）から切断される。

【0083】

用語「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」及び「バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）」は、本明細書では交換可能なものとして使用され、参照実体との相当な構造的同一性を有するものの、参照実体と比較した場合の１つ以上の化学的部分の存在又はレベルにおいて、参照実体とは構造的に異なる、実体を指す。多くの実施形態では、誘導体はその参照実体とは機能的にも異なる。一般に、ある特定の実体が参照実体の「誘導体」であると適切にみなされるかどうかは、この特定の実体の、参照実体との構造的同一性の程度に基づく。当業者には理解されるように、いかなる生物学的又は化学的参照実体も、特定の特徴的な構造的要素を有する。誘導体はその定義上、１つ以上のこのような特徴的な構造的要素を共有する別個の実体である。ほんの数例を挙げると、ある小分子は、特徴的なコア構造要素（例えば大環状分子コア）及び／又は１つ以上の特徴的なペンダント部分を有することができ、従ってこの小分子の誘導体は、上記コア構造要素及び上記特徴的なペンダント部分を共有するものの、他のペンダント部分、及び／又はコア内に存在する結合のタイプ（単結合か二重結合か、ＥかＺか等）が異なるものとなる。核酸及びポリペプチド／タンパク質である誘導体は、変異体を包含する。誘導体核酸は、直線又は３次元空間において互いに対して指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基で構成された、特徴的な配列要素を有することができる。いくつかの実施形態では、誘導体の核酸配列は、参照配列又はその断片の全長にわたって、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は更に高いパーセンテージで、同一であってよい。誘導体ペプチド又はポリペプチドは、直線若しくは３次元空間において互いに対して指定された位置を有する複数のアミノ酸で構成された、及び／又はある特定の生物学的機能に寄与する、特徴的な配列要素を有することができる。誘導体ペプチド及びポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって参照ペプチド又はポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるものの、上記参照ペプチド又はポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性（例えばウイルスによる細胞感染を仲介する能力、膜融合を仲介する能力、特異的抗体によって結合される又は免疫応答を促進する能力等）を保持する、ペプチド及びポリペプチドを含む。いくつかの非限定的な実施形態では、誘導体ペプチド又はポリペプチドは、全長にわたって、参照ペプチド又はポリペプチド（又はその断片）との少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は更に高いパーセンテージの同一性を示す。あるいは、又は更に、誘導体ペプチド又はポリペプチドは、（例えばグリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、酸化、ホルミル化、アミド化、ポリグルタミル化、ＡＤＰ－リボシル化、ペグ化、ビオチン化等において）ポリペプチド主鎖に付着した１つ以上の化学部分、及び／又は１つ以上の化学部分の１つ以上の差異の結果として、参照ペプチド又はポリペプチドとは異なるものとなり得る。いくつかの実施形態では、誘導体ペプチド又はポリペプチドは、参照ポリペプチドの生物学的活性のうちの１つ以上を欠いているか、又は参照ポリペプチドと比較して１つ以上の生物学的活性のレベルが低下若しくは上昇している。ある特定のペプチド又はポリペプチドの複数の誘導体が、天然のものとして見られる場合があり、又は合成若しくは組換えによって産生され得る。本明細書中で使用される場合、用語「誘導体」又は「バリアント」は、様々なキメラ、融合タンパク質、及びコンジュゲートも包含し、これは、検出タグ（例えばＨＡタグ、ヒスチジンタグ、ビオチン、蛍光又は発光ドメインとの融合等）、二量体化／多量体化配列、Ｆｃ、シグナル伝達配列等との融合物又はコンジュゲートを含む。

【0084】

本明細書中で使用される場合、用語「コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）」は、ニドウイルス目内のコロナウイルス科内のコロナウイルス亜科を指す。系統的関係及びゲノム構造に基づくと、この亜科は４つの属：αコロナウイルス、βコロナウイルス、γコロナウイルス、及びδコロナウイルスからなる。αコロナウイルス及びβコロナウイルスは、哺乳類にしか感染しない。γコロナウイルス及びδコロナウイルスは鳥類に感染するが、一部は哺乳類にも感染する。αコロナウイルス及びβコロナウイルスは通常、ヒトの呼吸器系疾患及び動物の胃腸炎を引き起こす。３つの高病原性ウイルス、即ちＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶは、ヒトの重症呼吸器症候群を引き起こす。他の４つのヒトコロナウイルス、即ちＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、及びＨＫＵ１は、免疫能を有する宿主の体内で軽度の上気道疾患しか誘発しないものの、一部は乳児、幼児、及び高齢の個体の体内で重篤な感染を引き起こす場合がある。商業的に重要なコロナウイルスの更なる非限定的な例としては、伝染性胃腸炎コロナウイルス（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ：ＴＧＥＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス、イヌコロナウイルス、ネコ腸コロナウイルス、ネコ伝染性腹膜炎コロナウイルス、ウサギコロナウイルス、マウス肝炎ウイルス、唾液腺炎ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ウシコロナウイルス、鳥類伝染性気管支炎ウイルス、及びシチメンチョウコロナウイルスが挙げられる。Cui et al., Nature Reviews Microbiology, 2019, 17:181-192;Fung et al., Annu. Rev. Microbiol., 2019, 73:529-557で報告されている。

【0085】

コロナウイルスは、直径８０～１６０ｎｍの、エンベロープを有する球状粒子を形成する。上記粒子は、サイズが２７～３２ｋｂの、ポジティブセンスの、セグメント化されていない一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ゲノムを含有する。このゲノムの５’末端の２／３は、ポリタンパク質ｐｐ１ａ及びｐｐ１ａｂをコードする。３’末端は、エンベロープ糖タンパク質スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、及びヌクレオカプシド（Ｎ）を含む構造タンパク質をコードする。ゲノムＲＮＡは５’がキャップされ、３’がポリアデニル化され、複数のオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）を含有する。不変の遺伝子順序は、５’－レプリカーゼ－Ｓ－Ｅ－Ｍ－Ｎ－３’であり、（アクセサリータンパク質をコードする）多数の小さなＯＲＦが構造遺伝子の間に散乱している。コロナウイルスのレプリカーゼは、ゲノムの約２／３を占める２つの大きな重複するＯＲＦ（ＯＲＦ１ａ及びＯＲＦ１ｂ）によってコードされ、ゲノムＲＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ：ｇＲＮＡ）から直接翻訳される。しかしながら、構造遺伝子及びアクセサリー遺伝子は、ゲノムの転写／複製中に生成されるサブゲノムＲＮＡ（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ：ｓｇＲＮＡ）から翻訳される。感染は、コロナウイルスが同種の細胞受容体に付着することで開始され、これはエンドサイトーシスを誘導する。膜融合が典型的にはエンドソームで発生し、ウイルスのヌクレオカプシドを細胞質に放出する。ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ポリタンパク質ｐｐ１ａ及びｐｐ１ａｂの翻訳のテンプレートとして機能し、上記ポリタンパク質は切断されて、非構造タンパク質（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｎｓｐ）を形成する。ｎｓｐは、細胞膜の再編成を誘導して、二重膜小胞（ｄｏｕｂｌｅ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ：ＤＭＶ）を形成し、そこにウイルスの複製転写複合体（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＴＣ）が固定される。全長ｇＲＮＡは、ネガティブセンス中間体を介して複製され、ネスト化されたサブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）種のセットが、不連続転写によって合成される。これらのｓｇＲＮＡは、ウイルスの構造タンパク質及びアクセサリータンパク質をコードする。粒子の集合は、ＥＲ－ゴルジ中間体複合体（ＥＲ－Ｇｏｌｇｉ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＥＲＧＩＣ）で発生し、成熟したビリオンが分泌経路を介して、滑らかな壁面の小胞に放出される。

【0086】

宿主細胞へのコロナウイルスの侵入は、膜貫通スパイク（Ｓ）糖タンパク質（これと交換可能なものとして、「スパイク糖タンパク質」、「Ｓ糖タンパク質」、「Ｓタンパク質」、又は「スパイクタンパク質」とも呼ばれる）によって仲介され、これは抗ウイルス中和抗体の主要な標的であり、治療及びワクチン設計の焦点である。Ｓ糖タンパク質は、ウイルスの表面から突出したホモ三量体を形成する。Ｓ糖タンパク質は２つの機能性サブユニットを含み、これらは、宿主細胞受容体への結合（Ｓ１サブユニット）、及びウイルス膜と細胞膜との融合（Ｓ２サブユニット）に関与する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む多くのコロナウイルスに関して、Ｓ糖タンパク質はＳ１サブユニットとＳ２サブユニットとの境界で切断され、これらは融合前のコンフォメーションで非共有結合状態のままである。遠位のＳ１サブユニットは、１つ以上の受容体結合ドメイン（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ：ＲＢＤ）を含み、融合機構を含有する膜固定Ｓ２サブユニットの融合前状態の安定化に寄与する。Ｓは更に、融合ペプチドのすぐ上流に位置するＳ２’部位において、宿主プロテアーゼによって切断される。この切断は、コンフォメーションの変更によって膜融合のためにタンパク質を活性化することが提案されている。Walls et al., Cell（２０２０年３月９日オンライン公開、doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.058にて入手可能）。

【0087】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と直接相互作用して標的細胞に侵入し、細胞セリンプロテアーゼ、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ， ｓｅｒｉｎｅ ２：ＴＭＰＲＳＳ２）をＳタンパク質のプライミングに使用できる（Hoffmann et al., Cell, 2020, 181:1-10;doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.052にて入手可能）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｓ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓは、７６％のアミノ酸同一性を共有する。Ｓ糖タンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、ＡＣＥ２受容体への結合に関与する。６個のＲＢＤアミノ酸が、ＡＣＥ２受容体への結合、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－ｌｉｋｅウイルスの宿主範囲の決定にとって重要であることが示されている。これらは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶにおいてはＹ４４２、Ｌ４７２、Ｎ４７９、Ｄ４８０、Ｔ４８７、及びＹ４９１１であり、これらはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５５、Ｆ４８６、Ｑ４９３、Ｓ４９４、Ｎ５０１、及びＹ５０５に対応する（Andersen et al., Nature Medicine, 2020;doi.org/10.1038/s41591-020-0820-9にて入手可能）。

【0088】

本明細書中で使用される場合、用語「ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）」は、脊椎動物、無脊椎動物、及び植物の１５０を超えるウイルスを包含する、モノネガウイルス目ラブドウイルス科のウイルスを指す。ラブドウイルスの例としては、リッサウイルス属の狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ：ＲＡＢＶ）、ベシクロウイルス属のベシクロウイルス、ノビラブドウイルス属のウイルス性出血性敗血症ウイルス（ｖｉｒａｌ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ：ＶＨＳＶ）及び伝染性造血器壊死症ウイルスが挙げられる。ラブドウイルスは、長さ１１～１５ｋｂのネガティブセンスの一本鎖ＲＮＡゲノムを有する、弾丸型のエンベロープウイルスである。ラブドウイルスのゲノムは最大１０個の遺伝子を含み、そのうち５個だけが、科の全てのメンバーに共通している。これらの遺伝子は、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、及び巨大タンパク質（Ｌ）をコードする。ゲノムはＮ、Ｌ及びＰと会合してヌクレオカプシドを形成し、これはＭタンパク質によって、密なコイル状のらせん構造へと凝縮される。この凝縮されたヌクレオカプシドは、ウイルスの表面から突出するスパイクを構成するウイルス糖タンパク質Ｇを含有する脂質二重層によって、取り囲まれている。ラブドウイルスは、エンドサイトーシス経路を介して細胞に侵入した後、エンドソームの酸性環境内において細胞膜と融合する。受容体認識、及び膜融合はいずれも、単一の膜貫通型ウイルス糖タンパク質（Ｇ）によって仲介される。ウイルスのエンベロープとエンドソーム膜との間の融合は、（エンドソーム内の）低ｐＨによって誘導されるＧの構造的再編成によって誘発され、ウイルスゲノム及び関連タンパク質の、標的細胞の細胞質中への放出をもたらす。

【0089】

本明細書中で使用される場合、用語「ベシクロウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）」は、ベシクロウイルス属のいずれのウイルスを指す。ベシクロウイルスの非限定的な例としては、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（例えばＶＳＶ－Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＶＳＶ－Ｉｎｄｉａｎａ）、Ａｌａｇｏａｓベシクロウイルス、Ｃｏｃａｌベシクロウイルス、Ｊｕｒｏｎａベシクロウイルス、Ｃａｒａｊａｓベシクロウイルス、Ｍａｒａｂａベシクロウイルス、Ｐｉｒｙベシクロウイルス、Ｃａｌｃｈａｑｕｉベシクロウイルス、Ｙｕｇ Ｂｏｇｄａｎｏｖａｃベシクロウイルス、Ｉｓｆａｈａｎベシクロウイルス、Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａベシクロウイルス、Ｐｅｒｉｎｃｔベシクロウイルス、Ｐｏｒｔｏｎ－Ｓベシクロウイルスが挙げられる。ベシクロウイルス属の水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、プロトタイプのラブドウイルスである。本開示では一例としてＶＳＶを使用するが、本開示は他のベシクロウイルス及び他のラブドウイルスにも使用できる。ＶＳＶにはＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ型及びＩｎｄｉａｎａ型の２つの主要な血清型があり、これらはいずれも昆虫及び哺乳類に感染し、ウシ、ウマ、及びブタにおいて経済的に重要な病気を引き起こす。ＶＳＶゲノムは、１１～１２ｋＢの一本鎖のネガティブセンスＲＮＡで構成され、これは５つのウイルスタンパク質：核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、及び巨大タンパク質（Ｌ）をコードする。複数のＧモノマーが会合して、ウイルス膜に固定される三量体スパイクを形成する。例えばSun et al., Future Virol., 2010, 5(1):85-96、及びAurelie et al., Viruses 2012, 4:117-139で報告されている。

【0090】

本明細書中で使用される場合、句「組換えＶＳＶゲノムの非必須部分（ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｐｏｒｔｉｏｎ（ｓ） ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＳＶ ｇｅｎｏｍｅ）」は、インビトロ及び／又はインビボでのウイルスの発達及び／又は成長に影響を及ぼすことなく、また免疫原性組成物又はワクチンとして機能するために必要なウイルスの機能に影響を及ぼすことなく修飾できる、ＶＳＶゲノムの領域を指す。

【0091】

様々な組換えエンベロープウイルス粒子に関連して本明細書中で使用される場合、用語「シュードタイプ化された（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）」は、ウイルス粒子であって、その脂質エンベロープ分子中に、例えば、上記粒子が由来するウイルス（即ち「参照ウイルス（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖｉｒｕｓ）」）の表面に典型的に見られる分子に比べて変異しており、及び／又は異種であり、かつ参照ウイルスに比べて上記ウイルス粒子の向性に影響を及ぼす、向性に寄与する、向性の方向を決定する、向性を方向転換する、及び／又は向性を完全に変化させることができる、タンパク質、糖タンパク質等を含む、ウイルス粒子を指す。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、参照ウイルスとは異なる標的（リガンド又は細胞）を認識する、これに結合する、及び／又はこれに感染するように、シュードタイプ化される。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、参照ウイルスとは異なる標的（リガンド又は細胞）を認識しない、これに結合しない、及び／又はこれに感染しないように、シュードタイプ化される。

【0092】

用語「フソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ）」又は「融合誘導性の分子（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、本明細書中で使用される場合、ウイルス粒子の表面上に存在する場合に膜融合を引き起こすことができるいずれの分子を指す。フソゲンは例えば、タンパク質（例えばウイルス糖タンパク質）、又はその断片若しくは誘導体であり得る。

【0093】

用語「複製可能な（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」は、感受性細胞内で感染及び増殖できるウイルス（野生型及び組換えウイルス粒子を含む）を指す。

【0094】

用語「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」は、ウイルス粒子での発現のためにポリヌクレオチドの（＋）又は（－）センス鎖のいずれかからコードすることを指すことができる。

【0095】

用語「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」、「特異的に付着する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｄｈｅｒｅｓ）」、「特異的に標的化する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｓ）」、「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｉｎｄｓ）」、又は「選択特異性（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」は、スパイク（Ｓ）糖タンパク質、組換えウイルス粒子、ワクチン、中和抗体、又は本明細書に記載の他の分子の、標的に結合する能力を指す。特定の実施形態では、特異的結合は、非標的に対する親和性より少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、又は１０００倍の親和性での標的への結合を指す。特定の実施形態では、この親和性は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。特定の実施形態では、親和性はＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって決定される。特定の実施形態では、親和性は速度論的方法によって決定される。特定の実施形態では、親和性は平衡／溶液法によって決定される。

【0096】

本明細書中で使用される場合、用語「レポータータンパク質（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、細胞内に存在するときに検出可能な定量化可能なシグナルを生成する、いずれのタンパク質を指す。本開示のアッセイで使用可能なレポータータンパク質の非限定的な例としては、例えばルシフェラーぜ（限定するものではないが、ウミシイタケルシフェラーゼ、変異型ウミシイタケルシフェラーゼＲＬｕｃ８、（ｄＣｐＧ）ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃレポーター、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）、ＭｅｔＬｕｃ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉルマジンタンパク質、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉルミナーゼ（ｌｕｍｉｎａｚｅ）タンパク質、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼＹＹ５変異体、ホタルルシフェラーゼＬＧＲ変異体、ホタルルシフェラーゼ変異体Ｅ、及びこれらの誘導体を含む）、並びに蛍光タンパク質（限定するものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）［例えばＡｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ ＧＦＰ］、ＧＦＰ様蛍光タンパク質、（ＧＦＰ－ｌｉｋｅ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）［例えばＴｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ］、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）［例えばＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＧＦＰ２、ＧＦＰ１０、及びｍＴａｇＢＦＰ］、強化型青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）［例えばｍＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ－Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＣＦＰｍｍ、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）］、強化型青緑色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、スーパーフォルダーＧＦＰ、スーパーフォルダーＹＦＰ、橙色蛍光タンパク質［例えばＫｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ－Ｔａｎｄｅｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ］、赤色蛍光タンパク質［例えばｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｄＫｅｉｍａ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＡＱ１４３］、小型超赤色蛍光タンパク質、ＦＭＮ結合蛍光タンパク質、ｄｓＲｅｄ、ｑＦＰ６１１、Ｄｒｏｎｐａ、ＴａｇＲＦＰ、ＫＦＰ、ＥｏｓＦＰ、ＩｒｉｓＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ、Ｋａｅｄｅ、ＫｉｋＧｒ１、鮮緑色蛍光タンパク質、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びこれらの断片又は誘導体を含む）、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、β－ｇｅｏ等が挙げられる。

【0097】

用量又は量に適用される用語「有効な（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」は、それを必要とする対象に投与した場合に所望の活性をもたらすために十分な、化合物（例えば組換えウイルス）又は組成物（例えば医薬品、ワクチン、若しくは免疫原性組成物）の量を指す。なお、複数の有効成分の組み合わせを投与する場合、上記組み合わせの有効量は、個別に投与した場合に有効であった各成分の量が含まれる場合と含まれない場合があることに留意されたい。必要である正確な量は、対象の種、年齢、及び全身状態、治療される状態の重篤度、採用される１つ以上の特定の薬物、投与の様式等に応じて、対象ごとに変化することになる。

【0098】

本開示の文脈において、本明細書で列挙される病状のいずれかに関連する限り、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」等は、上記病状に関連する少なくとも１つの症状を緩和若しくは軽減すること、又は上記病状の進行を遅延若しくは反転させることを意味する。本開示の意味の範囲内において、用語「治療する」は、疾患を阻止すること、疾患の発病（即ち疾患の臨床所見前の期間）を遅延させること、及び／又は疾患の進展若しくは悪化のリスクを低減することも指す。状態、障害、又は病状に関する用語「治療する」、「治療」等は、（１）該状態、障害、若しくは病状に罹患している若しくはその素因を有する可能性があるものの、該状態、障害、若しくは病状の臨床的若しくは潜在的症状を依然として経験していない若しくは呈していない対象において発生している該状態、障害、若しくは病状の少なくとも１つの臨床的若しくは潜在的症状の出現の、予防若しくは遅延；又は（２）該状態、障害、若しくは病状の阻害、即ち疾患、若しくはその再発（維持療法の場合）、若しくはその少なくとも１つの臨床的若しくは潜在的症状の、発生の阻止、低減、若しくは遅延；又は（３）疾患の緩和、即ち該状態、障害、若しくは病状、又はその臨床的若しくは潜在的症状のうちの少なくとも一方の退行を引き起こすことを含む場合もある。ＣＯＶＩＤ－１９疾患の症状の非限定的な例としては、限定するものではないが、発熱、咳、息切れ、肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺症候群、嗅覚の喪失、味覚の喪失、喉の痛み、鼻汁、胃腸症状（例えば下痢）、臓器不全（例えば腎不全及び腎機能障害）、敗血症性ショック、及び死亡が挙げられる。ウイルス感染（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）によって引き起こされる疾患に関連して使用される場合、用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、又は「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、ウイルスに曝露された対象の感染の拡大の防止、例えば対象の細胞へのウイルスの侵入の防止を指す。

【0099】

用語「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」、又は「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」若しくは「動物（ａｎｉｍａｌ）」は、ヒト、家畜類（例えばネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ等）、家禽種、及び疾患の実験動物モデル（例えばマウス、ラット、フェレット、サル等）を指す。ある好ましい実施形態では、対象はヒトである。

【0100】

用語「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」、「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」、及び「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、交換可能なものとして使用され、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含み、上記ＤＮＡ及びＲＮＡは、特段の指定がない限り、プラス鎖及びマイナス鎖、一本鎖及び二本鎖を含む。

【0101】

本明細書に記載の組成物に関連して使用される場合、句「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、生理学的に忍容性があり、対象（例えばヒト）に投与したときに有害な反応を典型的には生成しない、このような組成物の分子実体及び他の成分を指す。好ましくは、用語「薬学的に許容可能な」は、哺乳類、より詳細にはヒトでの使用に関して、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認められている薬局方に記載されていることを意味する。

【0102】

本開示の実施は、特段の指示がない限り、統計分析、分子生物学（組換え技法を含む）、ウイルス学、微生物学、細胞生物学、化学、及び生化学の従来の技法を採用し、これらは当該技術分野の技能の範囲内である。このようなツール及び技法は、例えばSambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989（本明細書では「Sambrook et al., 1989」）；DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]；Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]；Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]；Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；Ausubel, F.M. et al. (eds.). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., 1994に詳細に記載されている。これらの技法は、Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985)、米国特許第５，０７１，７４３号、Fukuoka et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 263: 357-360 (1999)；Kim and Maas, BioTech. 28: 196-198 (2000)；Parikh and Guengerich, BioTech. 24: 4 28-431 (1998)；Ray and Nickoloff, BioTech. 13: 342-346 (1992)；Wang et al., BioTech. 19: 556-559 (1995)；Wang and Malcolm, BioTech. 26: 680-682 (1999)；Xu and Gong, BioTech. 26: 639-641 (1999)、米国特許第５，７８９，１６６号及び５，９３２，４１９号、Hogrefe, Strategies l4. 3: 74-75 (2001)、米国特許第５，７０２，９３１号、５，７８０，２７０号及び６，２４２，２２２号、Angag and Schutz, Biotech. 30: 486-488 (2001)、Wang and Wilkinson, Biotech. 29: 976-978 (2000)、Kang et al., Biotech. 20: 44-46 (1996)、Ogel and McPherson, Protein Engineer. 5: 467-468 (1992)、Kirsch and Joly, Nucl. Acids. Res. 26: 1848-1850 (1998)、Rhem and Hancock, J. Bacteriol. 178: 3346-3349 (1996)、Boles and Miogsa, Curr. Genet. 28: 197-198 (1995)、Barrenttino et al., Nuc. Acids. Res. 22: 541-542 (1993)、Tessier and Thomas, Meths. Molec. Biol. 57: 229-237、及びPons et al., Meth. Molec. Biol. 67: 209-218に記載されているような部位特異的変異誘発が含まれる。

【0103】

ウイルス粒子
本開示の一態様は、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子を提供する。ＶＳＶは、高力価で生産でき、またヒトの体内で深刻な病状を引き起こさないため、組換えウイルス粒子の生産に関して魅力的なウイルスである。特定の実施形態では、本開示の組換えＶＳＶ粒子では、ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）がコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体に置き換えられている。

【0104】

本開示の組換えＶＳＶ粒子は、当該技術分野で公知の方法を用いて、例えば適切な宿主細胞に：（ａ）（ＶＳＶゲノムに対して相補的な）ＶＳＶアンチゲノム（＋）ＲＮＡをコードするように転写できるＤＮＡ、（ｂ）ＶＳＶ核タンパク質（Ｎ）の組換えソース、（ｃ）ＶＳＶリンタンパク質（Ｐ）の組換えソース、（ｄ）ＶＳＶ巨大タンパク質（Ｌ）の組換えソース、及び（ｅ）外来ＤＮＡを、上記ＤＮＡが転写されてアンチゲノムＲＮＡが生成されるような条件下で提供することによって、生成でき、これにより、生成されたアンチゲノムＲＮＡに対して相補的なゲノムＲＮＡと、上記ＤＮＡ由来の、天然ではＶＳＶゲノムの一部ではない外来ＲＮＡとを含有する、ＶＳＶが生成される。組換えＶＳＶの粒子の生成に使用できる方法及び組成物は、例えば米国特許第７，１５３，５１０号、９，８６１，６６８号、８，０１２，４８９号、９，６３０，９９６号、８，２８７，８７８号、９，２４８，１７８号、米国特許出願公開第２０１４／０２７１５６４号、２０１２／０１２１６５０号、Fukishi et al., J. Gen. Virol.l 2005, 86:2269-2274で確認でき、これらの文献は全て、その全体が参照により本出願に援用される。

【0105】

特定の実施形態では、組換えＶＳＶ粒子のゲノムに含有される外来ＲＮＡは、適切な宿主細胞内での発現時に、１つ以上の外来タンパク質を産生する。特定の実施形態では、ある外来タンパク質は、以下で更に詳細に説明されるように、コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＳ糖タンパク質）又はその断片若しくは誘導体である。

【0106】

特定の実施形態では、コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＳ糖タンパク質）はその断片若しくは誘導体をコードすることに加えて、上記組換えＶＳＶのゲノムはレポータータンパク質をコードする。レポータータンパク質の非限定的な例としては、例えばルシフェラーぜ（限定するものではないが、ウミシイタケルシフェラーゼ、ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼ、（ｄＣｐＧ）ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃレポーター、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）、ＭｅｔＬｕｃ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉルマジンタンパク質、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉルミナーゼ（ｌｕｍｉｎａｚｅ）タンパク質、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼＹＹ５変異体、ホタルルシフェラーゼＬＧＲ変異体、ホタルルシフェラーゼ変異体Ｅ、及びこれらの誘導体を含む）、並びに蛍光タンパク質（限定するものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）［例えばＡｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ ＧＦＰ］、ＧＦＰ様蛍光タンパク質、（ＧＦＰ－ｌｉｋｅ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）［例えばＴｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ］、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）［例えばＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＧＦＰ２、ＧＦＰ１０、及びｍＴａｇＢＦＰ］、強化型青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）［例えばｍＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ－Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＣＦＰｍｍ、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）］、強化型青緑色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、スーパーフォルダーＧＦＰ、スーパーフォルダーＹＦＰ、橙色蛍光タンパク質［例えばＫｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ－Ｔａｎｄｅｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ］、赤色蛍光タンパク質［例えばｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｄＫｅｉｍａ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＡＱ１４３］、小型超赤色蛍光タンパク質、ＦＭＮ結合蛍光タンパク質、ｄｓＲｅｄ、ｑＦＰ６１１、Ｄｒｏｎｐａ、ＴａｇＲＦＰ、ＫＦＰ、ＥｏｓＦＰ、ＩｒｉｓＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ、Ｋａｅｄｅ、ＫｉｋＧｒ１、鮮緑色蛍光タンパク質、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びこれらの断片又は誘導体を含む）、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、β－ｇｅｏ等が挙げられる。

【0107】

特定の代替実施形態では、上記１つ以上の外来タンパク質（例えばコロナウイルスＳ糖タンパク質及び／又はレポータータンパク質）は、組換えＶＳＶ粒子のゲノムによってコードされず、組換えウイルス粒子の生成時にタンパク質としてＶＳＶ粒子に組み込まれる。

【0108】

特定の実施形態では、組換えＶＳＶ粒子は複製可能なウイルス粒子である。特定の実施形態では、組換えＶＳＶ粒子は複製欠損性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）ウイルス粒子である。

【0109】

特定の実施形態では、本開示の組換えＶＳＶ粒子は、対象由来の試料中のコロナウイルス中和抗体（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体）の存在を決定するための、セロポジティビティアッセイに使用される。このようなセロポジティビティアッセイは例えば、対象が上記コロナウイルスに過去に感染したかどうか、及び上記対象を防御する中和抗体が感染によって産生されたかどうか（従って上記対象を回復させることができるかどうか）を決定するために使用できる。本開示のセロポジティビティアッセイは例えば、ワクチンの有効性を決定するため、治療用抗体の開発のため、回復期血漿療法のための最良のドナーを選択するため、患者の接触の追跡のため、ウイルスを保持した宿主を特定するため、疾患の負荷を決定するため、無症候性感染率を決定するため、家庭、地域社会及び特定の環境でのウイルスの拡散の程度を特定するため等にも使用できる。

【0110】

特定の実施形態では、本開示のセロポジティビティアッセイは、２タイプ以上の組換えＶＳＶ粒子を使用してよい。特定の実施形態では、上記アッセイは、異なる複数のコロナウイルスＳ糖タンパク質（例えば異なる株、バリアント、又は変異体に由来するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質）をコードする２つ以上の組換えＶＳＶ粒子の混合物を使用する。

【0111】

特定の態様では、本開示は、本開示の組換えＶＳＶ粒子の生成のための細胞を提供する。例示的な細胞としては、限定するものではないが、中でＶＳＶが成長するいずれの細胞、例えば哺乳類細胞及び一部の昆虫（例えばショウジョウバエ）細胞が挙げられる。当該技術分野で一般的に知られている多数の初代細胞及び細胞株を宿主細胞として使用できる。例えば、使用可能な細胞株としては、限定するものではないが、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ：ベビーハムスター腎臓）細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ：チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＨｅＬＡ（ヒト）細胞、マウスＬ細胞、Ｖｅｒｏ（サル）細胞（Ｖｅｒｏ－αＨｉｓ細胞を含む）、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞、Ｖｅｒｏ－ＴＲＭＰＳＳ２細胞、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞、ＥＳＫ－４、ＰＫ－１５、ＥＭＳＫ細胞、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ：Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ イヌ腎臓）細胞、ＭＤＢＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ ｂｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ：Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙウシ腎臓）細胞、２９３（ヒト）細胞、Ｈｅｐ－２細胞、初代ニワトリ胚繊維芽細胞、初代ニワトリ胚繊維芽細胞、準初代連続細胞株（例えばＡＧＭＫ：アフリカミドリザル腎臓細胞（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ））、ヒト二倍体初代細胞株（例えばＷＩ－３８及びＭＲＣ５細胞）、並びにサル二倍体細胞株（例えばＦＲｈＬ：胎児アカゲザル肺細胞（Ｆｅｔａｌ Ｒｈｅｓｕｓ Ｌｕｎｇ ｃｅｌｌ））が挙げられる。

【0112】

ＶＳＶアンチゲノム（＋）ＲＮＡを生成するための転写用ＶＳＶ ＤＮＡ
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、ビリオンポリメラーゼによって、５つの構造タンパク質をコードする５つのｍＲＮＡに転写される、単一の（非分節）マイナス鎖ゲノムＲＮＡを含む、ラブドウイルスである。上記５つの構造タンパク質は、糖タンパク質（Ｇ）、巨大タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、及び核タンパク質（Ｎ）を含む。ヌクレオカプシドタンパク質は、ＲＮＡゲノムをカプシド化する。ポリメラーゼ複合体を形成する２つのタンパク質は、ヌクレオカプシドに結合する。マトリックス（Ｍ）タンパク質はヌクレオカプシド及び膜と会合する。単一の（膜貫通）エンベロープスパイク糖タンパク質（Ｇ）が、ウイルスエンベロープから延在する。Ｇタンパク質は、ウイルスを細胞受容体に結合させ、ウイルス膜と細胞膜との融合を触媒して、感染サイクルを開始させるように機能する。ＶＳＶゲノムのサイズは約１１キロベースである。

【0113】

ＶＳＶは様々な哺乳類宿主、一般にウシ、ウマ、ブタ、及びげっ歯類に伝染し得る。ヒトのＶＳＶ感染は稀であり、一般には無症状であるか、又は合併症を伴うことなく３～８日で回復する軽度のインフルエンザ様症状を特徴とする。ＶＳＶはヒトの病原体とはみなされず、ＶＳＶに対する既存の免疫はヒト集団では稀であり、従ってＶＳＶはワクチン及び治療用途にとって魅力的なウイルスベクターとなっている。ＶＳＶの他の有益な特徴としては、限定するものではないが、（ｉ）細胞培養で確実に複製できる点、（ｉｉ）宿主細胞ＤＮＡへの組み込み又は遺伝子組換えができない点、（ｉｉｉ）複数の血清型によってプライムブースト免疫戦略が可能となる点、及び（ｉｖ）関心対象の外来遺伝子をＶＳＶゲノムに挿入して、ウイルス転写酵素によって豊富に発現させることができる点が挙げられる。

【0114】

ラブドウイルス（例えばＶＳＶ）の、細胞への融合及びそれに続く取り込みについては、Belot, L. et al., “Structural and cellular biology of rhabdovirus entry”, Adv. Virus Res., 2019, 104:147-183（その全体が参照により本出願に援用される）、及びAlbertini, A.A.V. et al., “Molecular and Cellular Aspects of Rhabdovirus Entry” Viruses, 2012, 4:117-139（その全体が参照により本出願に援用される）に記載されている。ＶＳＶのエンドサイトーシスに関する更なる説明は、Sun, X. et al., “Internalization and fusion mechanism of vesicular stomatitis virus and related rhabdoviruses” Future Virol., 2010, 5(1):85-96（その全体が参照により本出願に援用される）に見られる。ウイルス－細胞間融合に関する一般的な情報については、Igonet, S. et al., “SnapShot: Viral and Eukaryotic Protein Fusogens” Cell, 2012, 151:1634e1（その全体が参照により本出願に援用される）を参照。

【0115】

ＨＩＶウイルスといった他のウイルスによって仲介される細胞間融合は、Kondo, N. et al., “Conformational changes of the HIV-1 envelope protein during membrane fusion are inhibited by the replacement of its membrane-spanning domain” Journ. Biol. Chem., 2010, 285(19):14681-88（その全体が参照により本出願に援用される）に記載されている。

【0116】

当該技術分野において多数のベシクロウイルスが知られており、本明細書で開示される方法に従って組換えを実施できる。このようなベシクロウイルスの非限定的な例を以下に列挙する：

【0117】

【0118】

特定の実施形態では、ＶＳＶは、本開示の組換えウイルスの作製に使用されるベシクロウイルスである。特定の実施形態では、上記組換えＶＳＶは、組換えＶＳＶ－Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ又はＶＳＶ－Ｉｎｄｉａｎａである。特定の実施形態では、上記組換えＶＳＶは組換えＶＳＶ－Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙである。以下の開示では一例としてＶＳＶが使用されており、本開示は他のベシクロウイルスにも使用できる。

【0119】

（ＶＳＶゲノムに対して相補的な）ＶＳＶアンチゲノム（＋）ＲＮＡを生成するように転写できるいずれのＤＮＡが、本開示の組換えＶＳＶ粒子の生成に使用するための、異種（外来）タンパク質又はペプチドをコードする外来ＤＮＡを含有する組換えＤＮＡの構築に使用できる。特定の実施形態では、ＶＳＶアンチゲノム（＋）ＲＮＡをコードするように転写できるＤＮＡは、少なくともＶＳＶ核タンパク質（Ｎ）、ＶＳＶリンタンパク質（Ｐ）、及びＶＳＶ巨大タンパク質（Ｌ）の遺伝子を含む。

【0120】

ＶＳＶベクターは、ゲノムに１つ以上の変異又は「変異クラス（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｌａｓｓ）」を含むように、遺伝子修飾できる。「変異クラス（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｌａｓｓ、ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｌａｓｓｅｓ）」又は「変異のクラス（ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」は交換可能なものとして使用され、単独で使用した場合にＶＳＶを弱毒化することが当該技術分野で知られている変異を指す。例示的な変異クラスとしては、限定するものではないが、ＶＳＶ温度感受性Ｎ遺伝子変異（これ以降では「Ｎ（ｔｓ）」）、温度感受性Ｌ遺伝子変異（これ以降では「Ｌ（ｔｓ）：」）、点変異、Ｇステム変異（これ以降では「Ｇ（ｓｔｅｍ）」）、非細胞変性性Ｍ遺伝子変異（これ以降では「Ｍ（ｎｃｐ）」）、遺伝子シャッフリング又は再配列変異、不完全な（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ｇ遺伝子変異（これ以降では「Ｇ（ｃｔ）」）、アンビセンスＲＮＡ変異、Ｇ遺伝子挿入変異、遺伝子欠失変異等が挙げられる。変異は、挿入、欠失、置換、遺伝子再配列、又はシャッフリングによる修飾とすることができる。

【0121】

本明細書で開示される方法の特定の実施形態では、組換えＶＳＶ粒子は複製可能である。他の特定の実施形態では、組換えＶＳＶ粒子は複製欠損性である。

【0122】

本明細書で開示される方法及び組成物の特定の実施形態では、組換えＶＳＶ粒子中において、ＶＳＶ Ｇ糖タンパク質は、コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体に置き換えられ、ここで上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、標的細胞の感染を仲介できる。特定の実施形態では、組換えＶＳＶ粒子のゲノムは、機能性ＶＳＶ Ｇ遺伝子を欠いており、コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体をコードする。また、ＶＳＶ粒子であって、（ｉ）ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）は、コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体に置き換えられ、ここで上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は標的細胞の感染を仲介でき、また（ｉｉ）上記ＶＳＶ粒子は、レポータータンパク質及び／又は上記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、ＶＳＶ粒子も提供される。上記レポータータンパク質をコードする上記核酸配列は、Ｓ糖タンパク質をコードする核酸配列と、ＶＳＶ巨大（Ｌ）タンパク質をコードする核酸配列との間に装入されていてよい。

【0123】

上記変異は、ＶＳＶの感染性、病毒性、又は病原性効果を弱めることができる。この弱毒化は、相加的である場合も相乗的である場合もある。相乗的弱毒化では、ＶＳＶの弱毒化のレベルは、相加的なものの場合よりも大きい。ＶＳＶの相乗的弱毒化は、同一のＶＳＶゲノム内で少なくとも２つの変異のクラスを組み合わせることによって発生させることができ、これにより、各ＶＳＶ変異クラス単独で観察される相加的な弱毒化レベルをはるかに超える、ＶＳＶ病原性の低減がもたらされる。ＶＳＶの相乗的弱毒化は、少なくとも、各ＶＳＶ変異クラス単独で観察される相加的な弱毒化レベル（即ち２つの変異クラスの合計）よりも高いＬＤ５０を提供でき、ここで弱毒化レベル（即ちＬＤ５０）は、小動物神経毒性モデルで決定される。

【0124】

ＶＳＶ Ｍ遺伝子は、ウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質と、２つのより小さなフレーム内ポリペプチド（Ｍ２及びＭ３）とをコードする。Ｍ２及びＭ３ポリペプチドは、Ｍタンパク質と同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から翻訳でき、またそれぞれ最初の３３個及び５１個のアミノ酸を欠いている。非細胞変性性Ｍ遺伝子変異を含む組換えＶＳＶベクター（即ちＭ２及びＭ３タンパク質を発現することもないＶＳＶベクター）を生成でき、これは更に１つ以上の更なる変異を含むことができ、これにより、細胞培養物及び動物において大幅に弱毒化されたＶＳＶベクターが得られる。

【0125】

特定の実施形態では、本開示の組換えＶＳＶ粒子は、Ｍ遺伝子の非細胞変性性変異を含む。ＶＳＶ（Ｉｎｄｉａｎａ血清型）Ｍ遺伝子は、２２９個のアミノ酸Ｍ（マトリックス）タンパク質をコードし、これらのうち、ＮＨ２末端の最初の３０個のアミノ酸は、プロリンに富むＰＰＰＹ（ＰＹ）モチーフ（配列番号６８）を含む。ＶＳＶ Ｍタンパク質のＰＹモチーフは、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０４４５２）及びＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１４５５３）血清型の両方の、アミノ酸位置２４～２７に位置する。ＶＳＶは、ＰＹモチーフの変異（例えばＡＰＰＹ（配列番号６９）、ＡＡＰＹ（配列番号７０）、ＰＰＡＹ（配列番号７１）、ＡＰＰＡ（配列番号７２）、ＡＡＰＡ（配列番号７３）、及びＰＰＰＡ（配列番号７４））を含んでよい。ＶＳＶは、Ｍタンパク質ＰＳＡＰ（ＰＳ）モチーフ（配列番号７５）への様々なアミノ酸変異（例えば欠失、置換、挿入等）のうちのいずれを含むことができる。ＰＹモチーフのこれらの変異及び他の変異は、ウイルス出芽の後期段階を遮断することによってウイルス収量を低減するために、有効であり得る。

【0126】

本開示の組換えＶＳＶ粒子は、１つ以上のＭ遺伝子の変異を含んでよい。Ｍタンパク質の変異の非限定的な例としては、例えば２１位においてグルタミン酸へと変化するグリシン、１１１位においてフェニルアラニンへと変化するロイシン、５１位においてアルギニンへと変化するメチオニン、２２位においてグルタミン酸へと変化するグリシン、４８位においてアルギニンへと変化するメチオニン、１１０位においてフェニルアラニンへと変化するロイシン、５１位においてアラニンへと変化するメチオニン、及び３３位においてアラニンへと変化するメチオニンが挙げられる。例えば米国特許第９，６３０，９９６号を参照。本明細書に記載の方法の様々な実施形態において、組換えＶＳＶのゲノムは、Ｍ５１Ｒ変異を含む変異型ＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質をコードする。変異Ｍ５１Ｒは、Ｍタンパク質の、細胞の核－細胞質輸送を遮断する能力を排除し、これにより、ＶＳＶ感染性を大幅に弱毒化させる。

【0127】

特定の実施形態では、ＶＳＶアンチゲノム（＋）ＲＮＡをコードするように転写できるＤＮＡは、ＶＳＶ Ｍタンパク質をコードする遺伝子を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列、又は配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは更に高いパーセンテージで同一である配列を含んでよい。特定の実施形態では、本明細書に記載のワクチン又は方法で使用されるＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列、又は配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは更に高いパーセンテージで同一である配列からなっていてよい。特定の実施形態では、本明細書に記載のワクチン又は方法で使用される、変異したＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列、又は配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは更に高いパーセンテージで同一である配列を含んでよい。特定の実施形態では、本明細書に記載のワクチン又は方法で使用される変異型ＶＳＶ Ｍタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列、又は配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは更に高いパーセンテージで同一である配列からなっていてよい。

【0128】

ＶＳＶの（例えば）アンチゲノム（＋）ＲＮＡを生成するように転写できるＤＮＡ（このようなＤＮＡは、本明細書では「ＶＳＶ（－）ＤＮＡ」と呼ばれる）は、当該技術分野において入手可能であり、及び／又は標準的な方法によって得ることができる。当該技術分野で公知のいずれの血清型又は株、例えばＶＳＶのＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ 又はＩｎｄｉａｎａ血清型のためのＶＳＶ（－）ＤＮＡを使用できる。ＶＳＶゲノムの完全なヌクレオチド及び推定タンパク質配列は公知であり、Ｇｅｎｂａｎｋ ＶＳＶＣＧ、受託番号Ｊ０２４２８；ＮＣＢＩ Ｓｅｑ ＩＤ ３３５８７３として入手可能であり、またRose and Schubert, 1987, in The Viruses: The Rhabdoviruses, Plenum Press, NY, pp. 129-166で公開されている。プラスミドｐＶＳＶＦＬ（＋）に含有されるＶＳＶ（－）ＤＮＡの完全な配列の例は、例えば米国特許第７，１５３，５１０に示されており、上記文献は、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される。他のベシクロウイルスゲノムの配列も公開されており、当該技術分野で入手可能である。

【0129】

ＶＳＶ（－）ＤＮＡがまだ入手できない場合、これを以下のような標準的な方法で調製できる：ＶＳＶゲノムＲＮＡをウイルス調製物から精製して、ｖ（－）ＤＮＡの生成に使用される長距離ポリメラーゼ連鎖反応を用いて逆転写できる。あるいはゲノムＲＮＡの精製後、ＶＳＶ ｍＲＮＡをインビトロで合成でき、ｃＤＮＡを標準的な方法で調製した後、クローニングベクターに挿入できる（例えばRose and Gallione, 1981, J. Virol. 39(2):519-528を参照）。ＶＳＶ ＲＮＡの個々のｃＤＮＡクローンを、逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）（Mullis and Faloona, 1987, Meth. Enzymol. 155:335-350）の使用によってＶＳＶゲノムＲＮＡから生成される、遺伝子接合部をカバーする小さなＤＮＡ断片を用いて接合できる（後述のセクション６を参照）。ＶＳＶ及び他のベシクロウイルスは、当該技術分野で入手可能である。

【0130】

特定の実施形態では、（例えばポリリンカー中の）１つ以上の、通常は固有の制限部位を、ＶＳＶ（－）ＤＮＡ、遺伝子間領域、又はＶＳＶゲノムの３’末端に対して相補的な配列の５’、若しくはＶＳＶゲノムの５’末端に対して相補的な配列の３’に導入することによって、外来ＤＮＡの挿入を容易にする。

【0131】

特定の実施形態では、ＶＳＶ（－）ＤＮＡは、それに作動可能に連結されたプロモーターを有するように構築される。上記プロモーターは、組換えＶＳＶの生成が望まれる動物又は昆虫の細胞内で（－）ＤＮＡの転写を開始させることができる必要がある。使用可能なプロモーターとしては、限定するものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復に含有されるプロモーター（Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42）；熱ショックプロモーター（例えばショウジョウバエＳ２細胞で使用するためのｈｓｐ７０）；ＡＤＣ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｌ ｋｉｎａｓｅ：ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、並びに組織特異性を示し、かつトランスジェニック動物で利用されている、以下の動物転写制御領域が挙げられる：膵腺房細胞において活性を有するエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515）；膵臓β細胞において活性を有するインスリン遺伝子制御領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122）；リンパ系細胞において活性を有する免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444）；精巣、乳房、リンパ球、及び肥満細胞において活性を有するマウス乳癌ウイルス制御領域（Leder et al., 1986, Cell 45:485-495）；肝臓において活性を有するアルブミン遺伝子制御領域（Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276）；肝臓において活性を有するα-フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58）、肝臓において活性を有するα1アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171）；骨髄細胞において活性を有するβグロビン遺伝子制御領域（Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94）、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性を有するミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712）；並びに骨格筋において活性を有するミオシン軽鎖－２遺伝子制御領域（Sani, 1985, Nature 314:283-286）。好ましくは、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼプロモーター、好ましくはバクテリオファージ又はウイルス若しくは昆虫ＲＮＡポリメラーゼプロモーターであり、限定するものではないが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、及びＴ３ ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターが含まれる。組換えＶＳＶの生成が望まれる宿主細胞によってＲＮＡポリメラーゼが内因的に産生されないＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用する場合、ＲＮＡの組換えソースもまた、宿主細胞に提供しなければならない。

【0132】

ＶＳＶ（－）ＤＮＡは、外来ＤＮＡの挿入の前又は後に、プロモーターに作動可能に連結できる。特定の実施形態では、転写ターミネーターはＶＳＶ（－）ＤＮＡの下流に位置する。

【0133】

別の実施形態では、リボザイム配列を生成するために転写できるＤＮＡ配列が、転写終結シグナルの前のＶＳＶ（－）ＤＮＡのすぐ３’側の末端に位置し、これにより、転写時に自己切断性のリボザイム配列がアンチゲノムＲＮＡの３’末端に生成され、このリボザイム配列はこの融合転写物を（Ｕの後ろで）自己消化的に切断して、ＶＳＶアンチゲノム（＋）ＲＮＡの正確な３’末端を放出する。正確な配列が認識されて切断される限り、当該技術分野で公知のいずれのリボザイム配列を使用してよい。ある好ましい態様では、デルタ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ ｖｉｒｕｓ：ＨＤＶ）リボザイムが使用される（Perrotta and Been, 1991, Nature 350:434-436；Pattnaik et al., 1992, Cell 69:1011-1020）。

【0134】

従って、外来ＤＮＡの挿入に使用するためのＶＳＶ（－）ＤＮＡの例としては、作動可能に連結される以下の成分が挙げられる：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＶＳＶ（－）ＤＮＡ、ＨＤＶリボザイム配列を生成するために転写されるＤＮＡ配列（ＶＳＶ（－）ＤＮＡのすぐ下流）、及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写終結部位。

【0135】

使用できるプラスミドの例は、ｐＶＳＶＦＬ（＋）又はｐＶＳＶＳＳ１である。

【0136】

特定の実施形態では、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質は、組換えＶＳＶ粒子内の内因性ＶＳＶ Ｇタンパク質を置き換えることができ、又は内因性ＶＳＶ Ｇタンパク質との融合物として発現させるでき、又は内因性ＶＳＶ Ｇタンパク質に加えて、融合タンパク質若しくは非融合タンパク質として発現させることができる。例えば、プラスミドｐＶＳＶＦＬ（＋）のＶＳＶ（－）ＤＮＡ中のＶＳＶのＧ遺伝子を、Ｇ遺伝子に隣接するＮｈｅＩ及びＭｌｕＩ部位の切断、並びに所望の配列の挿入によって、切除及び置換できる。他の実施形態では、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質は、ＶＳＶ Ｇタンパク質の細胞質ドメイン（及び任意に膜貫通領域）を含む融合タンパク質として発現される。特定の実施形態では、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質は、ＶＳＶエンベロープの一部を形成し、従ってＶＳＶ粒子において表面提示される。

【0137】

特定の実施形態では、外来ＤＮＡは、遺伝子間領域に、又はＶＳＶ（－）ＤＮＡの、ウイルスｍＲＮＡの非コード領域を形成するために転写される一部分に、挿入される。特定の実施形態では、外来ＤＮＡは、ウイルスの発生、成長、及び／又はワクチンとして作用するために必要な機能にとって必須ではないＶＳＶゲノムのコード領域に挿入される。特定の実施形態では、ＶＳＶ Ｇ遺伝子は破壊される。特定の実施形態では、外来ＤＮＡ挿入は、Ｇ遺伝子又はＧタンパク質の機能を破壊しない。

【0138】

コロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質
宿主細胞へのコロナウイルスの侵入は、膜貫通スパイク（Ｓ）糖タンパク質（これと交換可能なものとして、「スパイク糖タンパク質」、「Ｓ糖タンパク質」、「Ｓタンパク質」、又は「スパイクタンパク質」とも呼ばれる）によって仲介され、これは抗ウイルス中和抗体の主要な標的であり、治療及びワクチン設計の焦点である。Ｓ糖タンパク質は、ウイルスの表面から突出したホモ三量体を形成する。Ｓ糖タンパク質は２つの機能性サブユニットを含み、これらは、宿主細胞受容体への結合（Ｓ１サブユニット）、及びウイルス膜と細胞膜との融合（Ｓ２サブユニット）に関与する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む多くのコロナウイルスに関して、Ｓ糖タンパク質はＳ１サブユニットとＳ２サブユニットとの境界で切断され、これらは融合前のコンフォメーションで非共有結合状態のままである。遠位のＳ１サブユニットは、１つ以上の受容体結合ドメイン（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ：ＲＢＤ）を含み、融合機構を含有する膜固定Ｓ２サブユニットの融合前状態の安定化に寄与する。Ｓは更に、融合ペプチドのすぐ上流に位置するＳ２’部位において、宿主プロテアーゼによって切断される。この切断は、コンフォメーションの変更によって膜融合のためにタンパク質を活性化することが提案されている。Walls et al., Cell（２０２０年３月９日オンライン公開、doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.058にて入手可能）。

【0139】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と直接相互作用して標的細胞に侵入でき、また、細胞セリンプロテアーゼ、膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）をＳタンパク質のプライミングに使用できる（Hoffmann et al., Cell, 2020, 181:1-10；doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.052にて入手可能）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｓ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓは、約７６％のアミノ酸同一性を共有する。Ｓ糖タンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、コロナウイルスゲノムの最も変化しやすい部分である。６個のＲＢＤアミノ酸が、ＡＣＥ２受容体への結合、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－ｌｉｋｅウイルスの宿主範囲の決定にとって重要であることが示されている。これらは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶにおいてはＹ４４２、Ｌ４７２、Ｎ４７９、Ｄ４８０、Ｔ４８７、及びＹ４９１１であり、これらはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬ４５５、Ｆ４８６、Ｑ４９３、Ｓ４９４、Ｎ５０１、及びＹ５０５に対応する（Andersen et al., Nature Medicine, 2020；doi.org/10.1038/s41591-020-0820-9にて入手可能）。

【0140】

本開示の特定の実施形態では、ＶＳＶ粒子は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体を含み、ここで上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、標的細胞の感染を仲介できる。様々な実施形態において、上記Ｓ糖タンパク質は、（配列番号１を含むか又はこれからなる）全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質、又は配列番号１に対して少なくとも７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は更に高いパーセンテージのアミノ酸配列同一性を有するその断片若しくは誘導体であってよい。

【0141】

野生型コロナウイルスＳ糖タンパク質は、細胞表面タンパク質へのコロナウイルスの結合を促進するＳ１サブユニットを含む。理論によって束縛されることを望むものではないが、野生型Ｓ糖タンパク質のＳ１サブユニットは、どの細胞がコロナウイルスに感染するかを制御する。野生型Ｓ糖タンパク質はＳ２サブユニットも含み、これは、ウイルス膜と細胞膜との融合を促進する膜貫通サブユニットである。本明細書に記載の様々な態様及び実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の断片又は誘導体は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質のＳ１サブユニット、又は上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質のＳ１サブユニットに対して少なくとも６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は更に高いパーセンテージのアミノ酸配列同一性を有するその断片若しくは誘導体を含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸１４～１６８に対して少なくとも６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は更に高いパーセンテージのアミノ酸配列同一性を有する配列を含むことができる。本明細書に記載の様々な態様及び実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の断片又は誘導体は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質のＳ２サブユニット、又は上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質のＳ２サブユニットに対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は更に高いパーセンテージのアミノ酸配列同一性を有するその断片若しくは誘導体を含むことができる。

【0142】

野生型コロナウイルスＳ糖タンパク質は、宿主細胞上の受容体に対するコロナウイルスの結合を促進する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質のＲＢＤは、例えばAnderson et al., Nature Medicine, 2020（doi.org/10.1038/s41591-020-0820-9において入手可能）に記載されている。本明細書に記載の様々な態様及び実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の断片又は誘導体は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質のＲＢＤ、又は上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質のＲＢＤに対して少なくとも７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は更に高いパーセンテージのアミノ酸配列同一性を有するその断片若しくは誘導体を含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の断片又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸３１９～５４１に対して少なくとも７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は更に高いパーセンテージのアミノ酸配列同一性を有する配列を含むことができる。

【0143】

特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個の残基の挿入、欠失、及び／又は置換を含んでよく、あるいは上記挿入、欠失、及び／又は置換からなってよい。発生し得る欠失のためのアミノ酸の非限定的な例としては、例えば１４５位のチロシン、６７９位のアスパラギン、６８０位のセリン、６８１位のプロリン、６８２位のアルギニン、６８３位のアルギニン、６８４位のアラニン、及び／又は６８５位のアルギニン（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基が挙げられる。発生し得る置換のためのアミノ酸の非限定的な例としては、例えば５位においてフェニルアラニンへと変化するロイシン、２８位においてアスパラギンへと変化するチロシン、２９位においてイソロイシンへと変化するスレオニン、４９位においてチロシンへと変化するヒスチジン、５４位においてフェニルアラニンへと変化するロイシン、７４位においてリシンへと変化するアスパラギン、９６位においてアスパラギン酸へと変化するグルタミン酸、１１１位においてアスパラギンへと変化するアスパラギン酸、１５７位においてロイシンへと変化するフェニルアラニン、１８１位においてバリンへと変化するグリシン、２２１位においてトリプトファンへと変化するセリン、２４７位においてアルギニンへと変化するセリン、３４８位においてスレオニンへと変化するアラニン、４０８位においてイソロイシンへと変化するアルギニン、４７６位においてセリンへと変化するグリシン、４８３位においてアラニンへと変化するバリン、５１９位においてグルタミンへと変化するヒスチジン、５２０位においてセリンへと変化するアラニン、６１４位においてアスパラギンへと変化するアスパラギン酸、６１４位においてグリシンへと変化するアスパラギン酸、６７９位においてイソロイシンへと変化するアスパラギン、６８０位においてロイシンへと変化するセリン、６８２位においてグリシンへと変化するアルギニン、６８３位においてセリンへと変化するアルギニン、６８５位においてグルタミンへと変化するアルギニン、６８５位においてセリンへと変化するアルギニン、７９７位においてシステインへと変化するフェニルアラニン、９３０位においてバリンへと変化するアラニン、９３６位においてチロシンへと変化するアスパラギン酸、１０７８位においてバリンへと変化するアラニン、１１６８位においてヒスチジンへと変化するアスパラギン酸、及び／又は１２５９位においてヒスチジンへと変化するアスパラギン酸（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基が挙げられる。Becerra-Flores and Cardozo, “SARS-CoV-2 viral spike G614 mutation exhibits higher case fatality rate,” The International Journal of Clinical Practice, published online May 6, 2020; Eaaswarkhanth et al., “Could the D614G substitution in the SARS-CoV-2 spike (S) protein be associated with higher COVID-19 mortality?” International Journal of Infectious Diseases, 96: July 2020, Pages 459-460; Tang et al., “The SARS-CoV-2 Spike Protein D614G Mutation Shows Increasing Dominance and May Confer a Structural Advantage to the Furin Cleavage Domain,” Preprints 2020, 2020050407 (doi: 10.20944/preprints202005.0407.v1); Hansen et. al., “Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail” Science, published online June 15, 2020; Lokman et al., “Exploring the genomic and proteomic variations of SARS-CoV-2 spike glycoprotein: A computational biology approach”, Infection, Genetics and Evolution : Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases, 2020 Jun;84:104389. DOI: 10.1016/j.meegid.2020.104389を参照。これらの文献はそれぞれ、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される。挿入、欠失、及び／又は置換のためのアミノ酸残基の更なる非限定的な例としては、表８及び９に列挙されているものが挙げられる（アミノ酸残基の位置は配列番号１を参照配列として用いて示されており、これは、（上記と同じ）いずれのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基の特定のための参照として使用できる；表８中の参考文献は、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される）。表８に列挙された残基の修飾はそれぞれ、単独で、又は他のものと組み合わせて個別に使用することによって、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子のバリアントを生成できる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び／又は６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって（配列番号１に示されている位置）、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基を変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、２４７位においてセリンをアルギニンへと、６１４位においてアスパラギン酸をアスパラギンへと、及び６８５位においてアルギニンをグルタミンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、溶解性がより高い表現型をもたらす。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４２のアミノ酸配列、又は配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一の配列を含んでよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、コドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされてよい。様々な実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４３のポリヌクレオチド配列、又は配列番号４３に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％のポリヌクレオチド配列同一性を有する配列によってコードされてよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号４４のアミノ酸配列、又は配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一の配列を含んでよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び／若しくは４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び／若しくは６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、並びに／又は残基６９～７０の欠失（配列番号１に示されている位置）によって、あるいは変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基の変化又は欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパ
ク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへとへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへとへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと、及び６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、５０１位においてアスパラギンをチロシンへと変化させ、４８４位においてグルタミン酸をリシンへと変化させ、６１４位においてアスパラギン酸をグリシンへと変化させること、及び残基６９～７０の欠失によって、参照ペプチド又はポリペプチドとアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、上記スパイクタンパク質内のフリン切断部位を不活化することによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、配列番号１に示されているＱ^６７７ＴＮＳＰＲＲＡＲＳＶ^６８７（配列番号６５）、又は変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列中の同等のアミノ酸残基を、ＱＴＩＬＲＳＶ（配列番号６６）又はＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶ（配列番号６７）へと変化させることによって、参照ペプチド又はポリペプチド（例えば野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）とアミノ酸配列が異なるものとなる。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体、又はその断片は、Ｓ１／Ｓ２境界の一塩基フリン切断部位（ＱＴＩＬＲＳＶ（配列番号６６））、又はフリン切断部位（ＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶ（配列番号６７））表現型の欠失をもたらす。特定の実施形態では、フリン切断部位に対する変更は、スパイク安定化擬似粒子をもたらすことができる。Hansen et. al.,“Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail” Science（２０２０年６月１５日オンライン公開）を参照。上記文献は、意図されているあらゆる目的のために、その全体が参照により本出願に援用される。

【0144】

特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の１つ以上のＣ末端残基を欠いている。例えば上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質のＣ末端残基のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個を欠いていてよい。特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の１９個のＣ末端残基を欠いている。上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質断片又は誘導体は、配列番号３のアミノ酸配列、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは更に高いパーセンテージで同一である配列からなってよい。

【0145】

特定の実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質誘導体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のウイルス由来のフソゲン配列を含む、キメラ又は融合分子である。特定の実施形態では、このようなキメラは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質のＳ１又はＲＢＤ配列を含む。特定の実施形態では、上記融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体の細胞外膜貫通配列と、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２フソゲン又はその断片若しくは誘導体の細胞質ドメインとの融合物である。特定の実施形態では、上記融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の細胞外配列、又はその断片若しくは誘導体と、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２フソゲン又はその断片若しくは誘導体の膜貫通及び細胞質ドメインとの融合物である。上述のキメラ及び融合分子で使用できる非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２フソゲンの非限定的な例としては、例えばコロナウイルスフソゲン（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＭＥＲＳ－ＣｏＶ由来）；ＶＳＶ又は他のベシクロウイルス、又はラブドウイルス科の他のウイルス、レトロウイルス科のウイルス（例えばヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）、マウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ：ＭＬＶ）、鳥類肉腫白血病ウイルス（Ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ ｌｅｕｋｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＡＳＬＶ）、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（Ｊａａｇｓｉｅｋｔｅ ｓｈｅｅｐ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ：ＪＳＲＶ））、パラミクソウイルス科のウイルス（例えばパラインフルエンザウイルス５（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５：ＰＩＶ５））、ヘルペスウイルス科のウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ：ＨＳＶ））、トガウイルス科のウイルス（例えばセムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ：ＳＦＶ）、風疹ウイルス）、フラビウイルス科のウイルス（例えばダニ媒介性脳炎（ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＴＢＥ）、デングウイルス）、オルトミクソウイルス科のウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、アレナウイルス科のウイルス（例えばリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＬＣＭＶ）、ラッサ熱ウイルス（Ｌａｓｓａ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ：ＬＡＳＶ））、ブニヤウイルス科のウイルス（例えばウークニエミウイルス（Ｕｕｋｕｎｉｅｍｉ ｖｉｒｕｓ：ＵＵＫＶ））、フィロウイルス科のウイルス（例えばエボラウイルス（Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ：ＥＢＯＶ））、ポックスウイルス科のウイルス（例えばワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ：ＶＶ））、アスファウイルス科のウイルス（例えばアフリカブタ熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ：ＡＳＦＶ））、アルテリウイルス科のウイルス（例えばブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ：ＰＲＲＳＶ））、ボルナウイルス科のウイルス（例えばボルナ病ウイルス（Ｂｏｒｎａ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ：ＢＤＶ））、ヘパドナウイルス科のウイルス（例えばＢ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ））、及びハンタウイルス科のウイルス（例えばアンデスウイルス）に由来するフソゲンが挙げられる。

【0146】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体と、ＶＳＶ糖タンパク質Ｇタンパク質、又はその断片若しくは誘導体との融合物である。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体と、ＶＳＶ Ｇ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体の細胞質部分との融合物である。ある具体的実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。

【0147】

本開示のアッセイの特定の実施形態では、より広範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を確実に検出するために、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２つ以上の異なる株、変異体又はバリアントに由来するコンセンサス配列を含むことができる。他の実施形態では、より広範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を確実に検出するために、本開示の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２つ以上の異なる株、変異体又はバリアントに由来するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（又はその断片若しくは誘導体）の混合物を使用する。

【0148】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチド分子は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体の発現を改善するための、コンセンサス配列及び／又は１つ以上の修飾を含むことができる。修飾は、コドン最適化、翻訳開始の増加のためのコザック配列若しくは修飾（例えば最適化）コザック配列の追加、及び／又はシグナルペプチド／リーダー配列（例えば、例えばＩｇＥ若しくはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド）の追加を含むことができる。特定の実施形態では、コザック配列又は修飾（例えば最適化）コザック配列は、外来遺伝子の３’側である。特定の実施形態では、コザック配列又は修飾（例えば最適化）コザック配列は、外来遺伝子のすぐ３’側である。特定の実施形態では、コザック配列又は修飾（例えば最適化）コザック配列は、外来遺伝子の５’側である。特定の実施形態では、コザック配列又は修飾（例えば最適化）コザック配列は、外来遺伝子のすぐ５’側である。

【0149】

いくつかの実施形態では、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体は、検出タグ（例えばＨＡタグ、ヒスチジンタグ、ビオチン）、レポータータンパク質又はその断片、二量体化／多量体化配列、Ｆｃ、シグナル伝達配列等との融合物又はコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本開示の組換えＶＳＶ粒子は、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体に加えて、レポータータンパク質又はその断片を含み、ここで上記レポータータンパク質又はその断片は、ＶＳＶ粒子ゲノムによってコードされるか、又はタンパク質としてＶＳＶ粒子ゲノムに含まれる。レポータータンパク質の非限定的な例としては、例えばルシフェラーぜ（限定するものではないが、ウミシイタケルシフェラーゼ、ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼ、（ｄＣｐＧ）ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃレポーター、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）、ＭｅｔＬｕｃ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉルマジンタンパク質、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉルミナーゼ（ｌｕｍｉｎａｚｅ）タンパク質、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼＹＹ５変異体、ホタルルシフェラーゼＬＧＲ変異体、ホタルルシフェラーゼ変異体Ｅ、及びこれらの誘導体を含む）、並びに蛍光タンパク質（限定するものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）［例えばＡｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ ＧＦＰ］、ＧＦＰ様蛍光タンパク質、（ＧＦＰ－ｌｉｋｅ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）［例えばＴｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ］、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）［例えばＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＧＦＰ２、ＧＦＰ１０、及びｍＴａｇＢＦＰ］、強化型青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）［例えばｍＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ－Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＣＦＰｍｍ、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）］、強化型青緑色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、スーパーフォルダーＧＦＰ、スーパーフォルダーＹＦＰ、橙色蛍光タンパク質［例えばＫｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ－Ｔａｎｄｅｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ］、赤色蛍光タンパク質［例えばｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｄＫｅｉｍａ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＡＱ１４３］、小型超赤色蛍光タンパク質、ＦＭＮ結合蛍光タンパク質、ｄｓＲｅｄ、ｑＦＰ６１１、Ｄｒｏｎｐａ、ＴａｇＲＦＰ、ＫＦＰ、ＥｏｓＦＰ、ＩｒｉｓＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ、Ｋａｅｄｅ、ＫｉｋＧｒ１、鮮緑色蛍光タンパク質、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びこれらの断片又は誘導体を含む）、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、β－ｇｅｏ、並びにこれらの断片が挙げられる。

【0150】

組換えＶＳＶ粒子の生成
以下の開示では組換えＶＳＶ粒子を一例として使用するが、本開示は他のベシクロウイルスに対しても使用可能である。

【0151】

本開示の組換えＶＳＶ粒子は、適切な宿主細胞：ＶＳＶ（－）ＤＮＡであって、複製に必須ではない領域が、コロナウイルスＳ糖タンパク質若しくはその断片若しくは誘導体をコードする配列と、任意に上述の他の配列とを含む外来ＤＮＡに挿入されているか、又は上記外来ＤＮＡによって置き換えられている、ＶＳＶ（－）ＤＮＡ、並びにＶＳＶ Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｌタンパク質、並びに更なるいずれの所望のＶＳＶタンパク質（例えばＭタンパク質及び／又はＧ糖タンパク質）の組換えソースを提供することによって、生成される。特定の実施形態では、上記生成は好ましくはインビトロ（例えば細胞培養において）である。

【0152】

組換えＶＳＶの生成に使用される宿主細胞は、中でＶＳＶが成長するいずれの細胞とすることができる。宿主細胞の非限定的なソースとしては、原核細胞若しくは真核細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞及び一部の昆虫（例えばショウジョウバエ）細胞、初代細胞（例えば初代ニワトリ胚線維芽細胞）、又は細胞株（例えばＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＨｅＬＡ（ヒト）細胞、マウスＬ細胞、Ｖｅｒｏ（サル）細胞（Ｖｅｒｏ－αＨｉｓ細胞を含む）、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞、Ｖｅｒｏ－ＴＲＭＰＳＳ２細胞、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞、ＥＳＫ－４、ＰＫ－１５、ＥＭＳＫ細胞、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ イヌ腎臓）細胞、ＭＤＢＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙウシ腎臓）細胞、２９３（ヒト）細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ヒト二倍体初代細胞株（例えばＷＩ－３８及びＭＲＣ５細胞）、サル二倍体細胞株（例えばＦＲｈＬ：胎児アカゲザル肺細胞）、並びに準初代連続細胞株（例えばＡＧＭＫ：アフリカミドリザル腎臓細胞）等）が挙げられる。

【0153】

Ｎ、Ｐ、及びＬタンパク質、並びに更なるいずれの所望のＶＳＶタンパク質（例えばＭタンパク質及び／又はＧ糖タンパク質）のソースは、組換えＶＳＶの生成が望まれている宿主細胞内でこれらのタンパク質をコードし、また発現させることができる、同一の組換え核酸又は異なる複数の組換え核酸とすることができる。Ｎ、Ｐ、及びＬタンパク質、並びに更なるいずれの所望のＶＳＶタンパク質（例えばＭタンパク質及び／又はＧ糖タンパク質）をコードする核酸は、当該技術分野において利用可能ないずれの手段によって得ることができる。ＶＳＶ Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｍ、及びＧコード核酸配列は、既に開示されており、使用可能である。例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｊ０２４２８；Rose and Schubert, 1987, in The Viruses: The Rhabdoviruses, Plenum Press, NY, pp. 129-166を参照。Ｎ、Ｐ、及びＬ遺伝子をコードする配列もまた、例えばＡＴＣＣに寄託されて受託番号９７１３４が割り当てられたプラスミドｐＶＳＶＦＬ（＋）から、例えば所望の遺伝子のＰＣＲ増幅によって得ることができる（米国特許第４，６８３，２０２号、４，６８３，１９５号、及び４，８８９，８１８号；Gyllenstein et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7652-7656;Ochman et al., 1988, Genetics 120:621-623; Loh et al., 1989, Science 243:217-220も参照）。Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｍ又はＧ遺伝子のいずれの核酸クローンもまだ入手できない場合、このクローンを標準的な組換えＤＮＡ法を用いて得ることができる。例えば上記ＤＮＡは、ＶＳＶビリオンからのＲＮＡの精製と、それに続く逆転写及びＰＣＲによるもの（Mullis and Faloona, 1987, Meth. Enzymol. 155:335-350）等の、当該技術分野で公知の標準的な手順によって、得ることができる。代替例としては、限定するものではないが、遺伝子配列自体の化学的合成が挙げられる。他の方法も可能であり、本開示の範囲内である。

【0154】

ＶＳＶ Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｍ、及び／又はＧ遺伝子の断片及び誘導体、並びにＶＳＶ（－）ＤＮＡの断片及び誘導体をコードする核酸も、このような断片及び誘導体が必要な機能（例えば本開示の１つ以上の方法で使用できる複製可能な又は複製可能でないＶＳＶ粒子を生成する能力）を保持する限りにおいて、本開示で使用できる。特に、誘導体は、置換、付加、又は欠失によって配列を変更することで作成できる。更に、遺伝暗号の固有の縮重により、略同一の、又は機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、本開示の方法の実施において使用してよい。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。

【0155】

所望のＮ／Ｐ／Ｌ／Ｍ／Ｇコード核酸を、適切な発現ベクター、即ち組換えＶＳＶ粒子の生成が望まれる宿主細胞内での、挿入されたタンパク質コード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入することによって、ＶＳＶタンパク質の合成を指示する機能を有するベクターを作成でき、このベクターは後に、（例えば、例えばＶＳＶ（－）ＤＮＡの転写によって生成されたアンチゲノムＶＳＶ（＋）ＲＮＡから、宿主細胞内で生成される）ＶＳＶゲノムＲＮＡとアセンブルされる。

【0156】

そのベクターが宿主細胞内で機能し、また存在する他のいずれのベクターと適合する限りにおいて、様々なベクター系を、Ｎ、Ｐ、及びＬＶＳＶタンパク質、並びに更なるいずれの所望のＶＳＶタンパク質（例えばＭ及び／又はＧ）を発現させるため、並びに（例えば外来ＤＮＡを含む）ＶＳＶ（－）ＤＮＡを転写するために、利用できる。ベクターの発現要素は、その強度及び特異性が様々である。宿主細胞内で機能する限りにおいて、多数の好適な転写及び翻訳要素のいずれを使用してよい。

【0157】

標準的な組換えＤＮＡ法を用いて、ＶＳＶタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクター、及び適切な転写／翻訳制御シグナルを含む外来ＤＮＡを含有するＶＳＶ（－）ＤＮＡを構築できる（例えば前出のSambrook et al., 1989、及び上述の方法を参照）。発現は、当該技術分野で公知のいずれのプロモーター／エンハンサーによって制御できる。発現の制御に使用できるプロモーターは、構成的プロモーター又は誘導的プロモーターとすることができる。ある具体的実施形態では、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。

【0158】

（遺伝子の下流の）転写終結シグナル、及び選択マーカーも、好ましくは発現ベクターに含まれる。プロモーター配列に加えて、Ｎ、Ｐ、Ｌ、及び更なるいずれの所望のＶＳＶタンパク質、並びにいずれのコロナウイルスタンパク質のための発現ベクターは、挿入された配列、例えばリボソーム結合部位の効率的な翻訳のための、特定の開始シグナルを含んでよい。

【0159】

タンパク質コード配列の効率的な翻訳に、特定の開始シグナルが必要となる場合がある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列を含む。それ自体の開始コドン及び隣接する配列を含む、Ｎ、Ｐ、Ｌ、又は他の（例えばＭ及び／若しくはＧ）ＶＳＶ遺伝子の全体を、適切なベクターに挿入する場合、更なる翻訳制御シグナルは必要ない場合がある。しかしながら、遺伝子配列の一部分のみを挿入する場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の制御シグナルを提供する必要がある。開始コドンは更に、挿入物全体を確実に翻訳するために、タンパク質コード配列のリーディングフレームと一致する必要がある。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成両方の様々な起源のものであり得る。

【0160】

ある具体的実施形態では、Ｎ、Ｐ、Ｌ、並びに／又は他の（例えばＭ及び／又はＧ）タンパク質、あるいはその機能性誘導体をコードする、本明細書中で提供される組換え発現ベクターは、以下の作動可能に結合された成分を含む：タンパク質（例えばＮ、Ｐ、Ｌ、並びに／又は他のＶＳＶタンパク質（例えばＭ及び／若しくはＧ）、コロナウイルスタンパク質（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質等のスパイク糖タンパク質）あるいはその断片若しくは誘導体の発現を制御するプロモーター、翻訳開始シグナル、ＶＳＶタンパク質又はその機能性断片若しくは誘導体をコードするＤＮＡ配列、並びに転写終結シグナル。実施形態では、以上の成分は、上で挙げたような５’から３’への順序で存在する。特定の実施形態では、Ｍタンパク質、Ｇタンパク質及び／若しくはコロナウイルスＳ糖タンパク質、又はその断片若しくは誘導体をコードする遺伝子は、Ｎ、Ｐ、及び／又はＬタンパク質の間に散在している。特定の実施形態では、Ｍタンパク質、Ｇタンパク質、及び／又はコロナウイルスＳ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体に関する遺伝子は、Ｐタンパク質に関する遺伝子とＬタンパク質に関する遺伝子との間に存在する（図１を参照）。特定の実施形態では、Ｎ、Ｐ、及びＬタンパク質、又はその機能性断片又は誘導体は、上で挙げたような５’から３’への順序で存在しない。特定の実施形態では、順序は（例えば組換えＶＳＶを弱毒化するように）変化する。

【0161】

特定の実施形態では、Ｎ、Ｐ、Ｌ、並びに他の（例えばＭ及び／又はＧ）ＶＳＶタンパク質をコードする遺伝子は、Ａと共に－３位に位置する、ファージＴ７遺伝子１０由来のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流に挿入される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼターミネーター及びレプリコンも、発現ベクターに含めることができる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを提供することにより、ＶＳＶタンパク質配列を転写できる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、染色体に組み込まれた配列又はエピソームベクターから生成できる。特定の実施形態では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換えワクシニアウイルスベクターからの細胞内発現によって提供できる。特定の実施形態では、Ｎ、Ｐ、Ｌ、並びに／又は他の（例えばＭ及び／若しくはＧ）ＶＳＶタンパク質はそれぞれ、コードされたタンパク質の転写及び翻訳のために必要な調節シグナルを含む、発現プラスミド内のプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ配列によって、コードされる。このような発現プラスミドは好ましくは、プロモーター、コード配列、及び転写終結／ポリアデニル化シグナル、並びに任意に選択マーカー（例えばβ－ガラクトシダーゼ）を含む。

【0162】

特定の実施形態では、Ｎ、Ｐ、Ｌ、並びに／又は他の（例えばＭ及び／又はＧ）タンパク質は、同一のプラスミド、又は異なるプラスミド、又はこれらの組み合わせによってコードできる。他の実施形態では、Ｎ、Ｐ、Ｌ、並びに／又は他の（例えばＭ及び／又はＧ）ＶＳＶタンパク質のうちの１つ以上は、染色体内で発現させることができる。

【0163】

外来ＤＮＡを含有するＶＳＶ（－）ＤＮＡを含むクローン配列、並びにＶＳＶ及び外来タンパク質をコードする配列を含むクローン配列を、当該技術分野で公知のいずれの方法、例えばトランスフェクション、電気穿孔法、（配列がウイルスベクターに含有される場合には）感染、、マイクロインジェクション等によって、所望の宿主細胞に導入できる。特定の実施形態では、トランスフェクション促進用試薬を加えることによって、細胞によるＤＮＡ取り込みを増大させる。これらの試薬の多くは当該技術分野において公知である（例えばその非限定的な例は、リン酸カルシウム；ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＣＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州ゲイザースバーグ）、及びＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）である）。

【0164】

特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター）に作動可能に連結される、コロナウイルスＳ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体をコードする外来ＤＮＡを含有するＶＳＶ（－）ＤＮＡを含むＤＮＡ；同じＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結される、ＮをコードするＤＮＡ；同じポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結される、ＰをコードするＤＮＡ；及び同じポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結される、ＬをコードするＤＮＡを、全て同じ宿主細胞に（例えばトランスフェクションによって）導入し、この宿主細胞内では、ＲＮＡポリメラーゼが細胞質に提供されている。特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、同じ宿主細胞に（例えば感染によって）導入された、細胞質中で複製されてＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えウイルスベクター、最も好ましくはワクシニアウイルスベクターからの発現によって、細胞質に提供される。細胞質でのＲＮＡポリメラーゼの提供は、これが：外来ＤＮＡを含むＶＳＶ（－）ＤＮＡの、そしてＮ、Ｐ、Ｌ、並びに他の（例えばＭ及び／又はＧ）ＶＳＶタンパク質の、細胞質転写及び処理；細胞核内のスプライシング機構の回避；これによる、Ｎ、Ｐ、Ｌ、並びに他の（例えばＭ及び／又はＧ）ＶＳＶタンパク質の適切な処理及び生成の最大化；並びにその結果としての組換えＶＳＶのアセンブリをもたらすため、使用できる。ワクシニアウイルスベクターは、ｍＲＮＡの処理（キャッピング及びポリアデニル化）のための酵素も細胞質に提供し、適切な翻訳を促進する。最も好ましい態様では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを採用し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの細胞質ソースを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換えワクシニアウイルスベクターも宿主細胞に導入することによって、提供する。このようなワクシニアウイルスベクターは、公知の方法で得ることができる。特定の実施形態では、ｖＴＦ７－３（Fuerst et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:8122-8126）等の組換えワクシニアウイルスベクターを使用できる。

【0165】

他の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）は、（例えば相同組換えによって染色体に元々挿入されていた）染色体に組み込まれた配列から、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを、場合によっては構成的に発現させる、又はプラスミドからＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをエピソームに発現させる、宿主細胞の使用によって、提供できる。

【0166】

他の実施形態では、プロモーターに作動可能に連結されたコロナウイルスＳ糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体をコードするＶＳＶ（－）ＤＮＡを、Ｎ、Ｐ、Ｌ、並びに他のいずれの（例えばＭ及び／又はＧ）ＶＳＶタンパク質を、染色体に組み込まれた配列から、安定して組換え発現させる宿主細胞に、トランスフェクトできる。

【0167】

細胞を培養し、組換えＶＳＶ粒子を、例えば標準的な方法を用いて回収できる。限定するものではないが例えば、およそ２４時間後に細胞及び培地を回収し、冷凍し、融解させ。溶解物を清澄化してウイルス調製物を得ることができる。あるいは、細胞及び培地を回収し、低速栄進分離によって単純に細胞及びデブリを除去できる。

【0168】

適切な外来配列が組換えＶＳＶのゲノム中に存在し、感染した細胞での１つ以上の所望のタンパク質の生成を指示することの、確認を実施できる。この目的のために、当該技術分野で公知の標準的な手順を使用できる。限定するものではないが例えば、ゲノムＲＮＡを、ウイルス調製物からのＳＤＳフェノール抽出によって、ＶＳＶから得ることができ、これを逆転写（及び／又はＰＣＲ）に供した後、それに続いて例えばシーケンシング、外来ＤＮＡに対して特異的なプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は制限酵素マッピング等に供することができる。ウイルスを用いて宿主細胞に感染させることができ、その後、タンパク質に対する抗体を使用する標準的なイムノアッセイ技法（例えばウエスタンブロッティング）によって、又はタンパク質の機能活性に基づくアッセイによって、所望のタンパク質の発現に関するアッセイを実施できる。他の技法も当該技術分野において公知であり、使用可能である。

【0169】

組換えウイルスの大規模成長及び精製
以下の開示ではＶＳＶを一例として使用するが、本開示は他のベシクロウイルスに対しても使用可能である。

【0170】

プラーク精製後の組換えＶＳＶウイルスの大規模生産の非限定的な例を以下に示す。単一のプラーク（約１０^５ｐｆｕ）からウイルスを回収し、これを用いて約１０^７細胞（例えばＢＨＫ細胞）を感染させることにより、通常１０^９～１０^１０ｐｆｕ／ｍｌの力価で１０ｍｌ、合計およそ１０^１１ｐｆｕが得られる。次に（例えば０．１の感染多重度で）約１０^１２細胞の感染を行い、細胞を、当該技術分野で公知の標準的な方法によって、懸濁培養、大型ディッシュ、又はローラーボトルで成長させることができる。

【0171】

次に細胞上清から、ワクチンの調製のためのウイルスを回収でき、この上清は清澄化されて細胞デブリが除去されている。必要に応じて、ウイルスの単離及び濃縮に採用できる１つの方法は、タンジェンシャルフロー膜に上清を通すことによる濃縮である。グリセロールクッションによるペレット化、及びショ糖段階勾配での濃縮によって、得られたものの体積を更に削減できる。別の濃縮方法は、アフィニティカラム精製である（Daniel et al., 1988, Int. J. Cancer 41:601-608）。しかしながら、精製のための他の方法も使用でき（例えばArthur et al., 1986, J. Cell. Biochem. Suppl. 10A:226を参照）、以上の手順の、可能ないずれの修正形態は、当業者には容易に認識されるだろう。ウイルス粒子の完全性を維持するために、精製は可能な限り穏やかなものでなければならない。

【0172】

アッセイ
ある態様では、本開示は、試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するための方法を提供する。一実施形態では、試料を組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子と接触させるか、又はこれと共にインキュベートし、上記粒子では、ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）がコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられており、また上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、感受性標的細胞の感染を仲介できる。これと同時に、又はその後で、組換えＶＳＶ粒子を、レポータータンパク質の第１の部分を発現する第１の標的細胞、及び上記レポータータンパク質の第２の部分を発現する第２の標的細胞と接触させて、合胞体を形成し、この合胞体は、上記レポータータンパク質の上記第１の部分及び上記第２の部分の両方を含み、検出可能なレポーターシグナルを生成する。上記第１の標的細胞及び上記第２の標的細胞は、組換えＶＳＶ粒子と接触すると、互いに融合できるものである必要がある。上記レポーターシグナルを上記合胞体内で測定し、対照と比較する。

【0173】

特定の実施形態では、上記第１の細胞はＶｅｒｏ－ＤＳＰ１（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－１－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７３）であり、上記第２の細胞はＶｅｒｏ－ＤＳＰ２（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－２－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７４）である。Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１及びＶｅｒｏ－ＤＳＰ２は、Ｖｅｒｏ細胞のレンチウイルス形質導入によって生成される。Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１細胞はＲｌｕｃ８ １５５－１５６ ＤＳＰ １－７ルシフェラーゼ－ＧＦＰ融合タンパク質（配列番号１４）を発現し、これは、変異型ウミシイタケルシフェラーゼＲＬｕｃ８の断片のアミノ酸１～１５５と、改変ＧＦＰの断片のアミノ酸１～１５６とを含む。Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞は、Ｒｌｕｃ８ １５５－１５６ ＤＳＰ ８－１１ルシフェラーゼ－ＧＦＰ融合タンパク質（配列番号１６）を発現し、これは、変異型ウミシイタケルシフェラーゼＲＬｕｃ８の断片のアミノ酸１５６～３１１と、改変ＧＦＰの断片のアミノ酸１５７～２３１とを含む。ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼは、変異Ａ５５Ｔ、Ｃ１２４Ａ、Ｓ１３０Ａ、Ｋ１３６Ｒ、Ａ１４３Ｍ、Ｍ１８５Ｖ、Ｍ２５３Ｌ、及びＳ２８７Ｌを含む（配列番号１９を参照）。改変ＧＦＰの配列は配列番号１８で提供されている。

【0174】

本開示の上述の方法のいずれかで使用される上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１～２２９を含んでよく、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸２３０～３１１を含んでよい。あるいは、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１～１５５を含んでよく、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、ウミシイタケルシフェラーゼ又はその変異体のアミノ酸１５６～３１１を含んでよい。あるいは、又は更に、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体のアミノ酸１～１５６を含んでよく、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、ＧＦＰ又はその変異体のアミノ酸１５７～２３１を含んでよい。あるいは、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、スーパーフォルダーＧＦＰのアミノ酸１～２１３を含んでよく、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、スーパーフォルダーＧＦＰのアミノ酸２１４～２３０を含んでよい。あるいは、上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、スーパーフォルダー黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のアミノ酸１～１５４を含んでよく、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、スーパーフォルダーＹＦＰのアミノ酸１５５～２６２を含んでよい。

【0175】

別の態様では、本開示は、試料中のコロナウイルス中和抗体の存在を決定するための方法を提供し、試料を組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子と接触させるか、又はこれと共にインキュベートし、上記粒子では、ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）がコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられており、また上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、標的細胞の感染を仲介でき、上記ＶＳＶ粒子は、レポータータンパク質、又は上記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む。続いて上記組換えＶＳＶ粒子を上記標的細胞と接触させる。そしてレポーターシグナルを測定し、対照と比較する。特定の実施形態では、上記レポータータンパク質は、上記組換えＶＳＶ粒子のゲノムによってコードされる。特定の実施形態では、上記レポータータンパク質は、上記ウイルス粒子のゲノムでコードされることなく、上記組換えＶＳＶ粒子に組み込まれる。上記レポータータンパク質をコードする核酸配列は、上記Ｓ糖タンパク質をコードする核酸配列と、ＶＳＶ Ｌタンパク質をコードする核酸配列との間に挿入されていてよい。上記標的細胞は、Ｖｅｒｏ細胞（Ｖｅｒｏ－αＨｉｓ細胞を含む）、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞、Ｖｅｒｏ－ＴＲＭＰＳＳ２細胞、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞、又はアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を含む他のいずれの細胞であってよい。

【0176】

本開示の上述の方法では、上記組換えＶＳＶ粒子は、ＶＳＶウイルスゲノム中のコロナウイルスＳ糖タンパク質をコードできる。あるいは上記ＶＳＶ粒子は、コロナウイルスＳ糖タンパク質を、ゲノム内でコードされないまま、（例えばパッケージング細胞内の別個のプラスミドを使用することによって）シュードタイプ化できる。

【0177】

本開示の上述の方法で使用される試料は、例えば血清又は血漿（例えば熱不活化された血清又は血漿）であってよい。

【0178】

上記試料を上記組換えＶＳＶ粒子と接触させる第１のステップは、約３７℃で１時間にわたって実施できる。上記組換えＶＳＶ粒子を上記標的細胞と接触させる第２のステップは、約３７℃で１～１２、１～３、２～４、３～５、４～６、５～７、６～８、７～９、又は８～１０時間にわたって実施できる。

【0179】

本開示の上述の方法の様々な実施形態において上記方法は、上記レポーターシグナルを得るために、レポータータンパク質基質を添加するステップを含む。上記レポータータンパク質はルシフェラーゼであってよく、上記レポータータンパク質基質は、ルシフェリン（例えばｄ－ルシフェリン）、セレンテラジン、又はＥｎｄｕＲｅｎルシフェラーゼ基質であってよい。

【0180】

いくつかの実施形態では、上記コロナウイルスＳタンパク質、その断片又は誘導体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する。特定の実施形態では、上記コロナウイルスＳタンパク質は、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質（例えば配列番号１のアミノ酸配列を含む、又はこれからなるタンパク質）である。特定の実施形態では、上記コロナウイルスＳタンパク質は、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質（例えば配列番号３のアミノ酸配列を含む、又はこれからなるタンパク質）である。特定の実施形態では、上記コロナウイルスＳタンパク質、断片、又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７７％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態では、上記コロナウイルスＳタンパク質、断片、又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＳ１サブユニットに対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態では、上記コロナウイルスＳタンパク質、断片、又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１４～６８４に対して少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態では、上記コロナウイルスＳタンパク質、断片、又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のＲＢＤドメインに対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態では、上記コロナウイルスＳタンパク質、断片、又は誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸３１９～５４１に対して少なくとも７４％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態では、上記組換えＶＳＶ粒子は、変異型ＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質を含む。特定の実施形態では、上記組換えＶＳＶのゲノムは、変異型ＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質をコードする。特定の実施形態では、上記変異型マトリックス（Ｍ）タンパク質は、メチオニン（Ｍ）５１における変異（例えばメチオニン（Ｍ）からアルギニン（Ｒ）への変化）を含む。特定の実施形態では、上記変異型ＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる。

【0181】

本開示の上述の方法の特定の実施形態では、上記対照は、コロナウイルス中和抗体を含まない対照試料を用いて得られたレポーターシグナルであり、上記方法は、上記試料で得られるレポーターシグナルが対照に比べて低下している場合に、試験された上記試料がコロナウイルス中和抗体を含むと結論づけるステップを含む。特定の実施形態では、上記対照試料は、コロナウイルスＳ糖タンパク質を含まないＶＳＶ粒子、又は標的細胞の感染を仲介しない変異型Ｓ糖タンパク質を含むＶＳＶ粒子を含む。本開示の上述の方法の特定の実施形態では、上記方法は更に、上記試料で得られるレポーターシグナルを、コロナウイルス中和抗体、又は上記コロナウイルスＳ糖タンパク質と、上記コロナウイルスＳ糖タンパク質が上記標的細胞上で相互作用するタンパク質との間の相互作用を遮断する分子とを含む、対照試料を用いて得られたレポーターシグナルとを、比較するステップを含む。

【0182】

本開示の上述の方法の特定の実施形態では、上記方法は高スループットフォーマットで実施される。

【0183】

ある具体的実施形態では、試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）中和抗体の存在を決定するための方法が提供される。上記方法は：
ａ）上記試料を、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子と接触させるステップであって、ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）が、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片によって置き換えられている、ステップ；
ｂ）ステップ（ａ）の後で、上記組換えＶＳＶ粒子を、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－１－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７３細胞とＶｅｒｏ－ＤＳＰ２（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－２－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７４）細胞との混合物と接触させるステップ；
ｃ）ステップ（ｂ）の後で、上記細胞のルシフェラーゼシグナル及び／又はＧＦＰシグナルを測定するステップ、並びに
ｄ）ステップ（ｃ）で測定された上記シグナルを対照と比較するステップ
を含む。

【0184】

別の具体的実施形態では、試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）中和抗体の存在を決定するための方法が提供され、上記方法は：
ａ）上記試料を、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子と接触させるステップであって、（ｉ）ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）遺伝子が、１９個のＣ末端アミノ酸を欠いた全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片によって置き換えられており、（ｉｉ）上記ＶＳＶ粒子は更に、ルシフェラーゼタンパク質及び／又は上記ルシフェラーゼタンパク質をコードする核酸分子を含む、ステップ；
ｂ）ステップ（ａ）の後で、上記組換えＶＳＶ粒子を、Ｖｅｒｏ細胞、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞、及びＶｅｒｏ－Ｅ６細胞から選択される細胞と接触させるステップ；
ｃ）ステップ（ｂ）の後で、上記細胞のルシフェラーゼシグナルを測定するステップ、並びに
ｄ）ステップ（ｃ）で測定された上記シグナルを対照と比較するステップ
を含む。

【0185】

本明細書で開示される方法のいずれかで使用される細胞は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を含んでよい。ＡＣＥ２は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する機能性受容体である。本明細書で開示される方法のいずれかで使用される細胞は、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）を更に含んでよい。本開示の方法で使用できる感受性標的細胞の非限定的な例としては、例えばＶｅｒｏミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ－αＨｉｓ細胞を含む）、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞、Ｖｅｒｏ－ＴＲＭＰＳＳ２細胞、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞、鳥類赤血球、及びＭａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓上皮細胞が挙げられる。

【0186】

いくつかの実施形態では、ウイルス－細胞混合物へのトリプシンの添加を用いて、ウイルス仲介性細胞融合を増大させることができる。トリプシンは、細胞内でレポーターシグナルを測定する前に添加してよい。トリプシンは、ウイルス－細胞混合物をインキュベートした後、例えばインキュベーションの開始から２～６時間後、インキュベーションの開始から３～５時間後、インキュベーションの開始から約４時間後、又はインキュベーションの開始から４時間後に、添加してよい。トリプシンを添加後にウイルス－細胞混合物から除去する必要はない。以下のデータで示されているように、トリプシンの添加によって細胞融合を促進できる。使用されるトリプシンの濃度は、培地（例えばＯｐｔｉＭＥＭ）１ｍＬあたりトリプシン０．１～４．０μＬ、又は培地１ｍＬあたりトリプシン０．１～０．６μＬ、培地１ｍＬあたりトリプシン０．２～０．７μＬ、培地１ｍＬあたりトリプシン０．３～１．２μＬ、培地１ｍＬあたりトリプシン０．５～２．０μＬ、培地１ｍＬあたりトリプシン１．０～２．５μＬ、培地１ｍＬあたりトリプシン１．５～３．０μＬ、又は培地１ｍＬあたりトリプシン２．０～４．０μＬとすることができる。融合アッセイ中に培地にトリプシンを添加することにより、アッセイの感度を高めることができる。追加のトリプシンにより、細胞融合をより短時間で発生させることができる。追加のトリプシンにより、アッセイの読み取り（例えばルシフェラーゼ活性）を、トリプシンが少ない又はトリプシンを用いない場合に比べて迅速に行うことができる。

【0187】

いくつかの実施形態では、トリプシンをアッセイに使用しない。トリプシンを排除する場合、血清/ウイルス混合物、又は血漿/ウイルス混合物を除去して新鮮な血清培地、又は血漿に好適な培地に置き換える場合であっても、追加の洗浄ステップを不要とすることができる。

【0188】

レポータータンパク質
様々なスプリットレポータータンパク質を、本明細書に記載の態様及び実施形態のいずれにおいて使用できる。例えば、検出可能な産物への基質の変換を触媒する酵素。スプリットポリペプチドの再アセンブルのための複数のこのような系は、限定するものではないが、β－ガラクトシダーゼ（Rossi et al., PNAS, 1997, 94:8405-8410）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＦＲ）（Pelletier et al, PNAS, 1998, 95:12141-12146）、ＴＥＭ－１ β－ラクタマーゼ（ｌａｃｔａｍａｓｅ：ＬＡＣ）（Galarneau at al., Nat. Biotech. 2002; 20: 619-622）、並びにホタルルシフェラーゼ（Ray et al., PNAS, 2002, 99: 3105-3110及びPaulmurugan et al, 2002; PNAS, 99: 15608-15613）を含む。例えばスプリットβ－ラクタマーゼは、二本鎖ＤＮＡの検出に使用されている（Ooi et al., Biochemistry, 2006, 45:3620-3525を参照）。スプリットポリペプチド断片は、リアルタイムシグナル検出に使用でき、ここで上記断片は、補完時に迅速なシグナル検出を可能とする、完全に折り畳まれて成熟したコンフォメーションである。

【0189】

スプリットポリペプチド断片は、互いに近接させたときに会合してタンパク質を生成する、いずれのポリペプチドとすることができ、上記タンパク質は、集合したポリペプチド断片を認識できるが個々のポリペプチド断片を認識しないいずれの手段によって検出できる。本開示の一実施形態では、上記方法は、再構成直後に活性を有するようなスプリットポリペプチド断片の設計を包含する。

【0190】

スプリットポリペプチド断片は、近接させたときに会合して活性タンパク質を生成する、いずれのポリペプチドとすることができ、上記タンパク質は、集合した活性タンパク質を認識できるが個々の断片を認識しないいずれの手段によって検出できる。例えば、２つのポリペプチドが再会合して、酵素活性を有するタンパク質を生成でき、ルシフェラーゼ活性、発色活性若しくは蛍光発生活性を有するタンパク質を生成でき、又は抗体によって認識されるタンパク質を作成する。更にこれらは、活性状態であり、かつ活性タンパク質の再構成のためにプライミングされている（即ち準備ができた状態となっている）ように設計され、これにより、インビトロ及びインビボでのタンパク質の補完で従来観察されていたようなラグタイムが最小限に抑えられる。

【0191】

スプリットポリペプチド断片は、蛍光タンパク質又はポリペプチドとすることができる。このような実施形態では、活性化されたスプリット蛍光タンパク質断片のうちの１つは、成熟した、１つ以上の同族の活性化されたスプリット蛍光断片での補完時に、即座に蛍光を発するようにプライミングされ、準備ができた状態となっている、予備形成された成熟した発色団を含有する。例えば、このようなスプリット蛍光断片を含有する包有体を使用することは、完全に折り畳まれた蛍光タンパク質の約半分が、単独では蛍光を発しないものの、同族のペアとの会合時に蛍光を発するようにプライミングされた、正しく折り畳まれた成熟した発色団を伴うようにすることを含む。

【0192】

本明細書に記載の方法では、レポータータンパク質はルシフェラーゼであってよい。当業者に公知の様々なルシフェラーゼ酵素を使用でき、例示的なルシフェラーゼとしては、限定するものではないが、例えばウミシイタケルシフェラーゼ、ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼ、（ｄＣｐＧ）ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃレポーター、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）、ＭｅｔＬｕｃ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉルマジンタンパク質、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉルミナーゼ（ｌｕｍｉｎａｚｅ）タンパク質、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼＹＹ５変異体、ホタルルシフェラーゼＬＧＲ変異体、ホタルルシフェラーゼ変異体Ｅ、及びこれらの誘導体が挙げられる。

【0193】

組換えＶＳＶ粒子が、レポータータンパク質の第１の部分を発現する第１の細胞、及びレポータータンパク質の第２の部分を発現する第２の細胞と接触して合胞体を形成する、本明細書に記載の方法では、レポータータンパク質はルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼの第１の部分及び第２の部分は、スプリットポリペプチドルシフェラーゼ断片であってよい。両方のスプリットポリペプチドルシフェラーゼ断片をアッセイ系に導入すると、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが互いに結合し、その結果としてルシフェラーゼが再構成されてルシフェラーゼ活性が回復するため、このルシフェラーゼは、適切な発光条件下で光を発することができる。このルシフェラーゼ活性は、アッセイ系が細胞である場合には、ルシフェリンを細胞培養物に加え、細胞抽出物を調製してルシフェラーゼ活性を測定することによって、測定できる。この場合、上記活性は、市販のＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃルシフェラーゼアッセイ試薬／細胞溶解剤（東洋紡株式会社）等を用いて、容易に測定できる。

【0194】

ルシフェラーゼ断片を含む融合タンパク質を検出できる。例えば、検出対象の標的タンパク質をルシフェラーゼ断片と融合させることによって作成された第１の融合タンパク質がアッセイ系内に存在する場合、上記標的タンパク質に結合する結合タンパク質をルシフェラーゼ断片と融合させることによって作成された第２の融合タンパク質を、プローブとして調製して、アッセイ系に導入する。その後、上記第２の融合タンパク質中の上記結合タンパク質は、上記第１の融合タンパク質中の上記標的タンパク質に結合することになり、これにより、上記ルシフェラーゼ断片が相互作用してルシフェラーゼ活性を獲得する。このルシフェラーゼ活性を検出することにより、ルシフェラーゼ断片を有する標的融合タンパク質を検出できる。具体的には、上記第１の融合タンパク質を発現する発現ベクターを調製して、細胞に導入できる。次に、上記第２の融合タンパク質を発現する発現ベクターを調製して、上記第１の融合タンパク質を発現する上記細胞に導入できる。そして、上述のようにしてルシフェラーゼ活性を測定することにより、ルシフェラーゼ断片を有する融合タンパク質を検出できる。

【0195】

スプリットルシフェラーゼアッセイは、例えばSaw, W.T. et al., “Using a split luciferase assay (SLA) to measure the kinetics of cell-cell fusion mediated by herpes simplex virus glycoproteins” Methods, 2015, 90:68-75（その全体が参照により本出願に援用される）において更に説明されている。本明細書に記載の方法は、ルシフェラーゼ及び蛍光タンパク質の両方がレポータータンパク質として一体に融合される場合に、実施できる。

【0196】

上記スプリットポリペプチド断片は、酵素活性アッセイを用いて検出できる活性酵素の断片を含むことができる。このような実施形態では、上記酵素活性は、発色又は蛍光発生反応によって検出される。一実施形態では、上記酵素は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ又はβ－ラクタマーゼである。

【0197】

上記酵素は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）とすることができる。例えばMichnick et al.は、単独ではいずれの酵素活性も欠いているものの、近接させると機能性酵素を形成する、ＤＨＦＲのＮ末端断片及びＣ末端断片からなる、「タンパク質補完アッセイ」を開発している。例えば米国特許第６，４２８，９５１号、第６，２９４，３３０号、及び第６，２７０，９６４号（その全体が参照により本出願に援用される）を参照。発色及び蛍光発生法を含む、ＤＨＦＲ活性を検出する方法は、当該技術分野で公知である。

【0198】

本明細書に記載の方法及び組成物のうちのいずれにおいて、様々な蛍光タンパク質を使用してよい。本明細書で開示される方法では、レポータータンパク質は蛍光タンパク質を含んでよい。

【0199】

上記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰ様蛍光タンパク質（ＧＦＰ－ｌｉｋｅ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）であってよい。代替実施形態では、上記蛍光タンパク質は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化型青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、強化型青緑色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）、スーパーフォルダーＧＦＰ、スーパーフォルダーＹＦＰ、橙色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、小型超赤色蛍光タンパク質、ＦＭＮ結合蛍光タンパク質、ｄｓＲｅｄ、ｑＦＰ６１１、Ｄｒｏｎｐａ、ＴａｇＲＦＰ、ＫＦＰ、ＥｏｓＦＰ、ＩｒｉｓＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ、Ｋａｅｄｅ、ＫｉｋＧｒ１、及びこれらの誘導体、又は他のいずれの天然タンパク質、若しくは以上の蛍光タンパク質を遺伝子改変した他のいずれの蛍光タンパク質である。また更なる実施形態では、再構成された蛍光タンパク質は、以上の蛍光タンパク質のうちのいずれか、又はその組み合わせからの断片の混合物で構成されていてよい。

【0200】

緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の、長さが２３８アミノ酸のタンパク質である。本開示のスプリット構築物で使用される改変ＧＦＰは、長さが２３１アミノ酸であり、配列番号１８からなる。蛍光タンパク質は、腔腸動物の他のメンバーからも単離されており、例えばＤｉｓｃｏｓｏｍａ種由来の赤色蛍光タンパク質（Matz, M. V. et al. 1999, Nature Biotechnology 17: 969-973）、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ Ｍｕｅｌｌｅｒｉ由来のＧＦＰ、又は他の動物、真菌、若しくは植物由来の蛍光タンパク質がある。ＧＦＰには様々な修飾形態が存在する。ＧＦＰの青色蛍光バリアント（ＢＦＰ）は、Heim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:26, 1994, pp 12501-12504によって記述されており、これは野生型ＧＦＰのＹ６６Ｈバリアントである。ＧＦＰの黄色蛍光バリアント（ＹＦＰ）は、Ｓ６５Ｇ、Ｓ７２Ａ、及びＴ２０３Ｙ変異を含み、これは国際公開特許第９８／０６７３７号で開示されている。ＧＦＰの青緑色蛍光バリアント（ＣＦＰ）は、Ｙ６６Ｗ色変異、及び任意にＦ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ、Ｎ１４６１、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ折り畳み／可溶性変異を含む。ＣＦＰはHeim, R., Tsien, R. Y., Curr. Biol. 6, 1996, 178-182に記載されている。ＥＧＦＰバリアントは、ＧＦＰのＦ６４Ｌ及びＳ６５Ｔ変異、並びに最初のメチオニンの後への１つのバリン残基の挿入を含む。ＥＧＦＰは、国際公開特許第９７／１１０９４号及び９６／２３８１０号に記載されている。Ｆ６４Ｌ変異は、発色団の１つ上流の位置のアミノ酸である。この折り畳み変異を含有するＧＦＰ又はＧＦＰバリアントは、上記ＧＦＰ又はＧＦＰバリアントが約３０℃を超える温度で細胞内で発現されたときに、蛍光強度の増大を提供する（国際公開特許第９７／１１０９４号）。

【0201】

ＧＦＰの非限定的な例としては：Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ ＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、スーパーフォルダーＧＦＰ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅが挙げられる。

【0202】

ＢＦＰの非限定的な例としては：ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＧＦＰ２、ＧＦＰ１０、及びｍＴａｇＢＦＰが挙げられる。

【0203】

ＣＦＰの非限定的な例としては：ｍＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ－Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＣＦＰｍｍ、及びｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）が挙げられる。

【0204】

ＹＦＰの非限定的な例としては：Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、及びｍＢａｎａｎａが挙げられる。

【0205】

橙色蛍光タンパク質の非限定的な例としては：Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ－Ｔａｎｄｅｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、及びｍＴａｎｇｅｒｉｎｅが挙げられる。

【0206】

赤色蛍光タンパク質の非限定的な例としては：ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｄＫｅｉｍａ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、及びＡＱ１４３が挙げられる。

【0207】

また、上述のレポータータンパク質の断片及び誘導体も包含される。

【0208】

上記蛍光タンパク質は、活性化させることができる２つ以上のポリペプチド又はタンパク質断片に分割できる。これらの活性化されたスプリット蛍光タンパク質断片のうちの１つ以上は、成熟した、１つ以上の同族の活性化されたスプリット蛍光断片での補完時に、即座に蛍光を発するようにプライミングされ、準備ができた状態となっている、予備形成された成熟した発色団を含んでよい。例えば、このようなスプリット蛍光断片を含有する包有体を使用することは、完全に折り畳まれた蛍光タンパク質の約半分が、単独では蛍光を発しないものの、同族のペアとの会合時に蛍光を発するようにプライミングされた、正しく折り畳まれた成熟した発色団を伴うようにすることを含む。

【0209】

上記活性化されたスプリット蛍光タンパク質断片のうちの１つ以上は、活性を有するものの非蛍光状態である、予備形成された成熟した発色団を含んでよい。成熟しているが依然として不活性の状態での発色団の単離により、対応する断片での補完時に即座に蛍光を検出できる。

【0210】

上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のアミノ酸１～１５７を含んでよく、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、ＧＦＰのアミノ酸１５８～２３１を含んでよい。ＧＦＰが不完全である場合、これに伴ってアミノ酸の番号を調整しなければならない。Ｃ末端システインを上記第１の部分に加えることによって、発現前の様々な核酸結合モチーフのコンジュゲートを支援できる。Ｎ末端システインを上記第２の部分に加えることによって、発現前の様々な核酸結合モチーフのコンジュゲートを支援できる。上記第１の部分は、成熟した発色団を含有するα断片を含み、これは単独では蛍光を発しないものの、β断片を含む上記第２の部分とペアリングされると蛍光を発するようにプライミングされる。理論によって束縛されることを望むものではないが、発色団が予備形成されていることにより、これは即座に蛍光を発することができる。上記α断片及び上記β断片は、会合が促進されない限り、再会合できず、又は蛍光を発することができない。

【0211】

上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、スーパーフォルダーＧＦＰのアミノ酸１～２１３を含んでよく、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、スーパーフォルダーＧＦＰのアミノ酸２１４～２３０を含んでよい。スーパーフォルダーＧＦＰが不完全である場合、これに伴ってアミノ酸の番号を調整しなければならない。Ｃ末端システインを上記第１の部分に加えることによって、発現前の様々な核酸結合モチーフのコンジュゲートを支援できる。Ｎ末端システインを上記第２の部分に加えることによって、発現前の様々な核酸結合モチーフのコンジュゲートを支援できる。上記第１の部分は、成熟した発色団を含有するα断片を含み、これは単独では蛍光を発しないものの、β断片を含む上記第２の部分とペアリングされると蛍光を発するようにプライミングされる。

【0212】

上記レポータータンパク質の上記第１の部分は、スーパーフォルダー黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のアミノ酸１～１５４を含んでよく、上記レポータータンパク質の上記第２の部分は、スーパーフォルダーＹＦＰのアミノ酸１５５～２６２を含んでよい。スーパーフォルダーＹＦＰが不完全である場合、これに伴ってアミノ酸の番号を調整しなければならない。Ｃ末端システインを上記第１の部分に加えることによって、発現前の様々な核酸結合モチーフのコンジュゲートを支援できる。Ｎ末端システインを上記第２の部分に加えることによって、発現前の様々な核酸結合モチーフのコンジュゲートを支援できる。上記第１の部分は、成熟した発色団を含有するα断片を含み、これは単独では蛍光を発しないものの、β断片を含む上記第２の部分とペアリングされると蛍光を発するようにプライミングされる。

【0213】

蛍光タンパク質は、フローサイトメトリー、蛍光プレートリーダー、蛍光光度計、顕微鏡法、蛍光共鳴エネルギ転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）、肉眼、又は当業者に公知の他の方法のうちの１つ以上によって、検出できる。フローサイトメトリーを使用する場合、蛍光活性化セルソーター（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ：ＦＡＣＳ）又はタイムラプス顕微鏡を使用して蛍光を検出できる。

【0214】

本開示の別の実施形態では、活性化されたスプリットポリペプチド断片の会合により、不連続なエピトープを含有する集合タンパク質を形成でき、上記不連続なエピトープは、上記集合タンパク質上の上記不連続なエピトープを特異的に認識するものの、個々のポリペプチド上に存在していた部分的なエピトープは認識しない抗体によって、検出できる。これらの誘導体、及びこのような他の誘導体は、当業者が公知の方法に基づいて容易に作成でき、また、いずれのタンパク質断片自体によっても上記集合タンパク質を認識しない抗体に関してスクリーニングできる。

【0215】

スプリットポリペプチドは、スプリット蛍光分子であってよい。上記分子は、ＧＦＰ、ＧＦＰ様蛍光タンパク質、蛍光タンパク質、及びこれらのバリアントからなる群から選択される、少なくとも２つの活性化されたスプリット蛍光断片を含むことができる。上記スプリット蛍光断片のうちの１つは、予備形成された成熟した発色団を含むことができ、これは、解離した状態の断片において、非蛍光状態で活性を有する。活性化された蛍光断片は、互いに会合したときに、蛍光に必要なβ鎖の完全な補完を含むことができるが、それ自体では蛍光を発しない。上記分子の活性化されたスプリット蛍光断片はそれぞれ、核酸結合モチーフを更に含む。標的核酸に対する核酸結合モチーフの結合は、少なくとも２つの活性を有するスプリット蛍光断片の会合と、活性を有する蛍光タンパク質及び蛍光表現型のリアルタイムでの再構築とを促進できる。

【0216】

スプリット蛍光タンパク質アッセイはまた、２０１０年６月１７日公開の国際公開特許第２０１０／０６６１１３号（その全体が参照により本出願に援用される）、及び米国特許出願公開第２００９／０２２０９４２号（その全体が参照により本出願に援用される）に記載されている。

【0217】

併用スプリットルシフェラーゼ－スプリット蛍光タンパク質アッセイが、Nakane, S. et al., “Dual Split Protein (DSP) Assay to Monitor Cell-Cell Membrane Fusion”, Methods Mol. Biol., 2015, 1313:229-36（その全体が参照により本出願に援用される）に更に記載されている。

【0218】

様々な実施形態において、蛍光は、フローサイトメーター又はビーズアレイリーダーを用いて測定できる。例えば、ＢｉｏＰｌｅｘ－１００、ＢｉｏＰｌｅｘ－２００、Ｌｕｍｉｎｅｘ－１００、又はＬｕｍｉｎｅｘ－２００ビーズアレイリーダーを使用してよい。

【0219】

いくつかの実施形態では、ＶＳＶ粒子を細胞に加える前に、プレーティング用培地を除去して、血清培地（例えば５０μＬ／ウェルのＯｐｔｉＭＥＭ）で置き換える。他の実施形態では、ウイルス／血清混合物を細胞に加える前、プレーティング用培地を変更しない。

【0220】

ＶＳＶ粒子は血清中に、ウイルス／血清混合物として存在してよい。他の実施形態では、ウイルス／血清混合物を細胞に加える前、プレーティング用培地を変更しない。ＶＳＶ粒子は血漿中に、ウイルス／血漿混合物として存在してよい。他の実施形態では、ウイルス／血漿混合物を細胞に加える前、プレーティング用培地を変更しない。

【0221】

細胞内のレポーターシグナルを測定して、対照と比較する。

【0222】

組換えＶＳＶ粒子をウイルス／血清混合物又はウイルス／血漿混合物と共にインキュベートする期間は、例えば約３０分～３日、又は約３０分～７５分、４５分～９０分、６０分～２時間、又は９０分～３時間等の、このようなインキュベーションに適した期間として設定してよい。例示的な期間は、約１時間であってよい。

【0223】

いくつかの実施形態では、（例えば血清又は血漿との混合物中の）組換えＶＳＶ粒子を標的細胞に加えた後、ウイルスを伴う上記細胞を、更に２～６時間、約４時間、又は４時間にわたってインキュベートする。インキュベーション後に血清又は血漿が存在する場合、細胞の融合又はルシフェラーゼ活性を強化するために、この血清又は血漿を除去できる。

【0224】

試料（例えば血清又は血漿）は、対照から、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に曝露された、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン若しくは別の免疫原性組成物でワクチン接種されたヒトから、得ることができる。試料は、ある程度のレベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を含有する場合も、含有しない場合もある。ＣＯＶＩＤ－１９患者の体内での抗体応答は、例えばOkba, N.M.A. et al., “SARS-CoV-2 specific antibody responses in COVID-19 patients” Emerg. Infect. Dis., 2020, 26(7)（doi.org/10.3201/eid2607.200841にて入手可能）に記載されている。患者試料中での中和抗体のレベルを迅速に決定することが求められており、本明細書に記載の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の存在及び／又はレベルの迅速な評価を可能にするものである。

【0225】

Montefiori, D.C., “Evaluating neutralizing antibodies against HIV, SIV, and SHIV in luciferase reporter gene assays.” Curr. Protoc. Immunol., 2005, Chapter 12, Unit 12.11（その全体が参照により本出願に援用される）に記載の方法も、本明細書に記載の方法の一部として使用される場合がある。

【0226】

キット
本開示はまた、本明細書で開示される様々な方法に関連するキットも提供する。特定の実施形態では、上記キットは、１つ以上のコンテナ（例えば別個のコンテナ）内に：（ａ）外来ＲＮＡ配列が挿入されたＶＳＶアンチゲノム（＋）ＲＮＡを生成するために、好適な宿主細胞内で転写できる、第１の組換えＤＮＡ；（ｂ）ＶＳＶ Ｎタンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体をコードする配列を含む、第２の組換えＤＮＡ；（ｃ）ＶＳＶ Ｌタンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体をコードする配列を含む、第３の組換えＤＮＡ；及び（ｄ）ＶＳＶ Ｐタンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体をコードする配列を含む、第４の組換えＤＮＡ；及び任意に（ｅ）ＶＳＶ Ｍタンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体をコードする配列を含む、第５の組換えＤＮＡ；及び任意に（ｆ）ＶＳＶ Ｇタンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体をコードする配列を含む、第６の組換えＤＮＡを含む。第２、第３、第４、並びに任意に第５及び／又は第６の組換えＤＮＡは、同一のＤＮＡ分子の一部であっても、異なるＤＮＡ分子の一部であってもよい。ある好ましい実施形態では、Ｎ、Ｌ、Ｐ、及び他のタンパク質をコードする上記配列はそれぞれ、好適な宿主細胞内でのＮ、Ｌ、Ｐ、及び他のタンパク質の発現を制御するプロモーターに、作動可能に連結される。様々な実施形態において、上記キットは、組換えＶＳＶ粒子の生成における使用に関して上述されている、様々な核酸、例えばプラスミド発現ベクターを含有できる。

【0227】

別の実施形態では、本開示のキットは、（ａ）ＲＮＡの一部分が外来ＲＮＡ配列に挿入された、又は外来ＲＮＡ配列によって置き換えられた、ＶＳＶアンチゲノムＤＮＡを生成するために、好適な宿主細胞内で転写できる、第１の組換えＤＮＡ；並びに（ｂ）ＶＳＶ Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質、並びに任意にＭ及び／又はＧタンパク質を組換え発現する、宿主細胞を含む。特定の実施形態では、上記外来ＲＮＡ配列は、組換えＶＳＶゲノムの非必須部分に挿入される。特定の実施形態では、上記外来ＲＮＡ配列は、ＶＳＶのＧタンパク質を置き換える。

【0228】

特定の実施形態では、本開示のキットは、別個のコンテナ内に：
（ａ）以下の作動可能に連結された成分：（ｉ）バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、（ｉｉ）ＶＳＶアンチゲノムＲＮＡを含むＲＮＡ分子を生成するために、好適な宿主細胞内で転写できる配列を含むＤＮＡであって、上記ＶＳＶアンチゲノムＲＮＡ内では、ＶＳＶのＲＮＡの一部分が外来ＲＮＡ配列に挿入された、又は外来ＲＮＡ配列によって置き換えられ、かつアンチゲノムＲＮＡの３’末端がアンチゲノムＲＮＡの３’末端を切断するリボザイム配列のすぐ隣にある、ＤＮＡ、及び（ｉｉｉ）バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのための転写終結シグナル、を含む、第１のプラスミド；
（ｂ）以下の作動可能に連結された成分：（ｉ）上記バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、（ｉｉ）ＶＳＶ Ｎタンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体をコードする配列を含む、ＤＮＡ、及び（ｉｉｉ）バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのための転写終結シグナル、を含む、第２のプラスミド；
（ｃ）以下の作動可能に連結された成分：（ｉ）上記バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、（ｉｉ）ＶＳＶ Ｐタンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体をコードする配列を含む、ＤＮＡ、及び（ｉｉｉ）バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのための転写終結シグナル、を含む、第３のプラスミド；
（ｄ）以下の作動可能に連結された成分：（ｉ）上記バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、（ｉｉ）ＶＳＶ Ｌタンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体をコードする配列を含む、ＤＮＡ、及び（ｉｉｉ）バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのための転写終結シグナル、を含む、第４のプラスミド；
任意に（ｅ）以下の作動可能に連結された成分：（ｉ）上記バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、（ｉｉ）ＶＳＶ Ｍタンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体をコードする配列を含む、ＤＮＡ、及び（ｉｉｉ）バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのための転写終結シグナル、を含む、第５のプラスミド；並びに
任意に（ｆ）以下の作動可能に連結された成分：（ｉ）上記バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、（ｉｉ）ＶＳＶ Ｇタンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体をコードする配列を含む、ＤＮＡ、及び（ｉｉｉ）バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのための転写終結シグナル、を含む、第６のプラスミド
を含む。特定の実施形態では、上記外来ＲＮＡ配列は、組換えＶＳＶゲノムの非必須部分に挿入される。特定の実施形態では、上記外来ＲＮＡ配列は、ＶＳＶのＧタンパク質を置き換える。

【0229】

別の実施形態では、本開示のキットは、別個のコンテナ内に、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼをコードし、またバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを発現させることができる、組換えワクシニアウイルスを更に含む。

【0230】

特定の実施形態では、コンテナ内の成分は精製された形態である。

【0231】

本開示は更に、試料中のコロナウイルス中和抗体（例えば上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質を標的とする中和抗体）を検出するためのキットを提供する。上記キットは：
ａ）組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子であって、ここでＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）はコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられ、上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、標的細胞の感染を仲介できる、組換えラブドウイルス粒子；
ｂ）レポータータンパク質の第１の部分を発現する第１の細胞、及び上記レポータータンパク質の第２の部分を発現する第２の細胞であって、上記第１の細胞及び上記第２の細胞は、上記組換えＶＳＶ粒子と接触したときに互いに融合でき、上記融合は、検出可能なレポーターシグナルの生成をもたらす、第１の細胞及び第２の細胞；
ｃ）任意に、陽性対照及び／又は陰性対照；
ｄ）任意に、上記レポータータンパク質のための基質、並びに
ｅ）任意に、使用説明書
を含んでよい。

【0232】

上記レポータータンパク質は、本明細書に記載の酵素（例えばルシフェラーゼ）又は蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）のうちのいずれであってよい。様々な実施形態において、上記レポータータンパク質は、ＶＳＶ粒子中のゲノムによってコードされることなく、ＶＳＶ粒子に組み込むことができる。様々な実施形態において、上記レポータータンパク質は、ＶＳＶ粒子のゲノムによってコードされる。

【0233】

いくつかの実施形態では、上記陽性対照は、中和抗体（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質に対する抗体）を含んでよい。上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質に対する中和抗体の非限定的な例は、ｍＡｂ１０９１４又はｍＡｂ１０９２２である（ｍＡｂ１０９１４及びｍＡｂ１０９２２のアミノ酸及びヌクレオチド配列は、以下の配列のセクションで提供されている）。既知の量の中和抗体を、上記中和抗体を含まない血清又は血漿に加えることにより、陽性対照を生成できる。いくつかの実施形態では、上記陽性対照は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質と、これが細胞表面上で相互作用するタンパク質、例えばＡＣＥ２又はＴＭＰＲＳＳ２との間の相互作用を遮断する分子を含んでよい。このような分子の非限定的な例としては、例えば抗ＡＣＥ２抗体（例えばＣＬ４０１３、ＡＣ１８Ｆ、８８１ＣＴ１６．４．４、ＭＡ５－３１３９５、及びＯＴＩ１Ｄ２抗体）、（例えばその全体が参照により本出願に援用されるFukuski et al., Journal of General Virology, 2005, 86:2269-74で開示されているような）可溶性ＡＣＥ２タンパク質、及び抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体（例えば、その全体が参照により本出願に援用される国際公開特許出願第２０１９／１４７８３１号に記載されている、Ｈ１Ｈ７０１７Ｎ抗体）が挙げられる。いくつかの実施形態では、上記陽性対照は、細胞間融合を遮断する分子（例えば抗体）を含んでよい。このような分子の非限定的な例としては、例えばSaw, W.T. et al., Methods, 2015, 90:68-75（その全体が参照により本出願に援用される）に記載されているＭＣ５及びＤＬ１１抗体が挙げられる。

【0234】

上記陰性対照は、上記中和抗体を含まない血清又は血漿を含むことができる。上記陰性対照は、上記中和抗体を含まないものの、ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）を特異的に標的とする抗体、ＶＳＶマトリックスタンパク質（Ｍ）を特異的に標的とする抗体、本方法で試験されるものとは異なる別のコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質を特異的に標的とする抗体（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイク（Ｓ）糖タンパク質を特異的に標的とするものの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質には結合しない抗体）、又はＨＩＶ抗原に対して特異的なモノクローナル抗体（例えば、その全体が参照により本出願に援用されるMontefiori, D.C., Current Protocols in Immunology, 2004, Chapter 12: Unit 12.11.1に記載されているような、ＩｇＧ１ｂ１２、２Ｇ１２、Ｘ５、２Ｆ５、４Ｅ１０）、又はいずれのアイソタイプ対照抗体といった他の抗体を含む、血清又は血漿を含むことができる。

【0235】

更に別の実施形態では、上記キットは：
ａ）組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子であって、ここで（ｉ）ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）はコロナウイルススパイク（Ｓ）糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体によって置き換えられ、上記Ｓ糖タンパク質、断片、又は誘導体は、標的細胞の感染を仲介でき、（ｉｉ）ＶＳＶ粒子は、レポータータンパク質及び／又は上記レポータータンパク質をコードする核酸分子を含む、組換えラブドウイルス粒子；
ｂ）コロナウイルスＳ糖タンパク質によって仲介される感染に対して感受性を有する細胞；
ｃ）任意に、陽性対照及び／又は陰性対照；
ｄ）任意に、上記レポータータンパク質のための基質、並びに
ｅ）任意に、使用説明書
を含んでよい。

【0236】

上記キットのうちのいずれに、細胞成長培地及び／又は固定剤を任意に含めてもよい。

【実施例】

【0237】

本開示を、以下の実施例によっても説明及び実証する。しかしながら、この実施例及び本明細書中のいずれの箇所の他の実施例の使用は、単なる例示であり、本開示の又は例示されているいずれの用語の範囲及び意味を一切限定しない。同様に、本開示は、本明細書に記載のいずれの特定の好ましい実施形態に限定されない。実際には、本開示の多数の修正形態及び変形形態は、本明細書を読めば当業者には明らかになり得るものであり、これらの変形例は、本開示の精神又は範囲から逸脱することなく実施できる。従って本開示は、添付の請求項の用語と、これらの請求項が権利を有する均等物の全範囲とによってのみ限定されるものとする。

【0238】

実施例１：スパイク（Ｓ）糖タンパク質構築物を発現するＶＳＶの調製
Ｉｎｄｉａｎａ株のＶＳＶの感染性クローンを用いて、４つの組換えＶＳＶ構築物を生成した。上記４つの組換えＶＳＶ構築物では、ＶＳＶ（Ｇ）糖タンパク質が欠失して、コドン最適化配列によって置き換えられ、上記コドン最適化配列は、ヒト細胞内での発現に好適であり、また：（１）全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０４５５１２．２；タンパク質＿ＩＤ：ＹＰ＿００９７２４３９０．１）（バリアント１；ＶＳＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｄＧ＝ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ；配列番号１のアミノ酸配列；配列番号２の、コドン最適化されたコーディングヌクレオチド配列）、（２）Ｃ末端の１９個のアミノ酸ＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴ（配列番号２０）が欠失したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列（バリアント２；ＶＳＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Δ１９ＣＴ ｄＧ＝ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ；配列番号３のアミノ酸配列；配列番号４の、コドン最適化されたコーディングヌクレオチド配列）、（３）Ｓ糖タンパク質細胞質尾部が、ＶＳＶ Ｇ細胞質尾部ＫＬＫＨＴＫＫＲＱＩＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ（配列番号２１）に置き換えられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列（バリアント３；ＶＳＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ－Ｇ ＣＴ ｄＧ；配列番号５のアミノ酸配列；配列番号６の、コドン最適化されたコーディングヌクレオチド配列）、又は（４）他の３つの構築物で使用されている最適化コザック配列（ｃａｃｃＡＴＧ；配列番号１２）の代わりに野生型ＶＳＶコザック配列（ｃＡｃｔＡＴＧ；配列番号１１）を伴う、バリアント４－全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列（ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ；配列番号１のアミノ酸配列；配列番号２の、コドン最適化されたコーディングヌクレオチド配列）、をコードする。野生型ＶＳＶ Ｍタンパク質（配列番号９のアミノ酸配列；配列番号１０のヌクレオチド配列）をコードする、バリアント１～４の構築物の１つ目のセット（構築物１～４）を調製した。ウイルスの弱毒化をもたらす置換Ｍ５１Ｒを有するＭタンパク質（配列番号７のアミノ酸配列；配列番号８のヌクレオチド配列）をコードする、バリアント１～４の構築物の第２のセット（構築物５～８）を調製した。図１を参照。

【0239】

バリアント１～４組換えウイルス粒子を、（Ｔ７ポリメラーゼを発現する）ワクシニア－Ｔ７ウイルスによるトランスフェクション、並びに（Ｔ７プロモーターの制御下にある各遺伝子を有する）Ｎ、Ｐ及びＬ発現プラスミドと、ウイルスゲノムプラスミドとによる同時トランスフェクションを用いる、公開されている標準的なプロトコルを使用して、生成した。レスキューを促進するために、ＶＳＶ Ｇを発現するプラスミドも細胞にトランスフェクトした。ウイルスをＶｅｒｏ細胞内で増幅及び増殖させた。増幅された組換えウイルスはＶＳＶ（Ｇ）糖タンパク質を有さず、侵入及び感染をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質に依存する。

【0240】

ＶＳＶ Ｇ、Ｎ及びＭタンパク質、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の、組換えバリアント２ ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ構築物６（ＶＳＶ－Ｍ５１Ｒ－ｎＣｏＶ１９－Ｓ Δ１９ＣＴ）ビリオンへの正確な組み込みを、ウエスタンブロッティングで分析した。結果を図３Ｃに示す。ＶＳＶ－ＧＦＰ（ＶＳＶ－Ｇをコードする）若しくはＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴに感染した、若しくは偽感染したＶｅｒｏ細胞から調製したウイルス上清を、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク抗体（左）及びウサギ抗ＶＳＶ抗血清（右）を用いた免疫ブロット分析に供した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ Ｓ糖タンパク質は、全長Ｓ１／Ｓ２バリアント（１８０ｋＤａ）、及びタンパク質分解で切断されたＳ２バリアント（７５ｋＤａ）糖タンパク質に対応する、２つの帯域を生成した。ウエスタンブロットは、ＶＳＶ－ＧＦＰウイルス中のＶＳＶ Ｎ、Ｍ、及びＧタンパク質の存在、並びにバリアント２ ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴウイルス中のＶＳＶ Ｎ及びＭタンパク質（ただしＶＳＶ Ｇ糖タンパク質ではない）の存在を示す。バリアント２ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴウイルスのウエスタンブロットはまた、ＶＳＶ Ｇ糖タンパク質に代わるＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ Ｓ糖タンパク質の効率的な組み込みも示す。

【0241】

実施例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する抗体を検出するための高スループットＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ ｖ．１アッセイの開発
導入
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を検出するための実験室アッセイを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の臨床単離株、シュードタイプ化されたレンチウイルスベクター、及びシュードタイプ化された水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いて開発した。ここで説明されるのは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質をＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質の代わりに発現するよう改変された組換えＶＳＶを用いた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－中和抗体の検出及び定量化のための、高スループットでスケーラブルな臨床アッセイである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質は、細胞表面上のアンジオテンシン変換酵素－２（ＡＣＥ２）に結合して、細胞へのウイルスの侵入を開始させる（Hoffman 2020、Walls 2020、Wan 2020）。主要な表面露出ウイルスタンパク質として、コロナウイルススパイクは、宿主免疫系の主要な標的である（Corman 2016、Liu 2006、Nie 2004、Zhao 2017）。ＡＣＥ２とのスパイクの相互作用を遮断することにより、ウイルスの侵入を防止し、スパイクを中和抗体の主要な標的にする（Walls 2020、Wu 2020）。従って本発明者らは、スパイク（Ｓ）糖タンパク質を発現するＶＳＶを中和できる抗体の検出は、試料中に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体のレベルを直接反映するはずであると仮説を立てた。重要なことには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の代わりにスパイク発現性ＶＳＶを用いることにより、アッセイの安全性及びスケーラビリティが大幅に向上する。

【0242】

本発明のアッセイ（ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ ｖ．１）は、デュアルスプリットタンパク質（ｄｕａｌ ｓｐｌｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＤＳＰ）ルシフェラーゼレポーター系を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質発現性ＶＳＶの融合表現型を利用し、ウイルス誘導型細胞融合、及びこれに伴ってウイルス中和のレベルを定量化する（図２）。本実施形態のＤＳＰ系は、キメラスプリット改変緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びスプリットウミシイタケルシフェラーゼ変異体Ｒｌｕｃ８を使用する。相補的なスプリットレポーターを発現する２つの細胞株の間の融合は、完全に機能するＧＦＰとＲｌｕｃ８ルシフェラーゼとの再会合を促進する。従って、ルシフェラーゼ活性を用いて、高スループット９６ウェルプレートフォーマットにおいて、ウイルス誘導型細胞融合を測定できる。ここで説明されるのは、アッセイ条件の最適化及び最終的な臨床アッセイの検証を含む、アッセイの開発である。このアッセイの結果と、臨床症状と、他の血清学的試験からの結果との間には、優れた相関が観察された。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体レベルの定量化は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の臨床単離株を用いたアッセイからの、プラーク減少中和ＩＣ５０値と密接に相関していた。従って本発明のアッセイはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を正確に定量化するため、血漿療法、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンに対する免疫応答を評価するための、貴重なツールとなる。

【0243】

このＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ ｖ．１アッセイは、検証試験において１００％の特異性を示し、全ての試験にわたって偽陽性は検出されなかった。盲検分析では、アッセイの結果は、利用可能な臨床データ、及びｑＲＴ－ＰＣＲ又は他の血清学的試験（市販のＥＬＩＳＡ）の結果との、略完璧な相関（１９６／１９７）を示した。抗ウイルス応答の強度を定量化するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清又は血漿マトリックスにスパイクされた、異なる複数の濃度の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクモノクローナル抗体からなる、検量線を作成した。この検量線を用いて、最小推奨希釈率であると決定された単一の１：１００血清試験用希釈物から、上記アッセイで中和抗体レベルを定量化した。高レベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－中和抗体を含む試料に関して、第２の希釈物は、より正確な定量化を促進した。このキャリブレーター法を用いて計算されたウイルス中和単位（ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ：ＶＮＵ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の臨床単離株に対するプラーク減少中和試験によって決定されたプラーク減少中和力価ＥＣ５０（ＰＲＮＴ_ＥＣ５０）値と密接に相関していた（ｐ＜０．０００１）。これらの結果を合わせると、本ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ ｖ．１アッセイが、試料（例えば血清又は血漿）中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を、バイオセーフティーレベル２（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ ２：ＢＳＬ２）の高スループットフォーマットで正確に定量化し、例えば回復期血漿療法プログラムへのドナーの適格性、及び様々な臨床試験への参加者の適格性の評価、並びに候補ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンに対する免疫応答の評価のための、重要な情報を提供できることが実証される。

【0244】

結果
ルシフェラーゼアッセイによるＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ融合の測定
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を利用した中和アッセイを安全に実施するためには、バイオセーフティーレベル３（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ ３：ＢＳＬ３）の汚染物質及び実践が必要であるため、これらのアッセイを用いた患者試料の広範な試験は非現実的である。従って本発明者らは、血液試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を検出するために使用できる、より安全でスケーラブルなアッセイを開発しようとした。本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質発現性ＶＳＶによる感染によって誘導される、Ｖｅｒｏ細胞内での合胞体形成を、デュアルスプリットタンパク質（ＤＳＰ）ルシフェラーゼレポーターを用いて検出するアッセイを設計した（図２）。逆遺伝学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて、ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質に置き換えられた組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を生成した（図１及び３Ａ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質のＣ末端（細胞質）ドメインの最後の１９個のアミノ酸の欠失によって、ウイルスのレスキュー及び増幅が改善された。得られたウイルス（バリアント２ ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ）は、Ｖｅｒｏ細胞単層での合胞体形成を誘導し、これは０．４μｇ／ｍＬのトリプシンの存在下で強化された（図３Ｂ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Δ１９ＣＴスパイク糖タンパク質のビリオンへの組み込みは、ウイルス上清において、免疫ブロット分析によって確認された（図３Ｃ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Δ１９ＣＴスパイク糖タンパク質が検出されたものの、ＶＳＶ－Ｇは検出されず、組換えウイルス中でＶＳＶ－ＧがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴによって効率的に置き換えられていることが確認された。

【0245】

Ｖｅｒｏ細胞はＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴに感染しており、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の両方を発現する（図３Ｄ及びＥ）ため、Ｖｅｒｏ細胞がこのアッセイのためのレポーター細胞株として選択された。親Ｖｅｒｏ細胞に、脾臓病巣形成ウイルス（ｓｐｌｅｅｎ ｆｏｃｕｓ ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｉｒｕｓ：ＳＦＦＶ）プロモーターの制御下で、Ｒｌｕｃ８ １５５－１５６ＤＳＰ１－７及びＲｌｕｃ８ １５５－１５６ＤＳＰ８－１１をそれぞれ発現する自己不活化レンチウイルスベクターＳＦＦＶ－ＤＳＰ_１－７－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏ又はＳＦＦＶ－ＤＳＰ_８－１１－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏを形質導入し、Ｐ２Ａ切断ペプチドを介してピュロマイシン耐性遺伝子に連結した。Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１細胞はＲｌｕｃ８ １５５－１５６ ＤＳＰ １－７ルシフェラーゼ－ＧＦＰ融合タンパク質（配列番号１４）を発現し、これは、ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼの断片のアミノ酸１～１５５と、改変ＧＦＰの断片のアミノ酸１～１５６とを含む。Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞は、Ｒｌｕｃ８ １５５－１５６ ＤＳＰ ８－１１ルシフェラーゼ－ＧＦＰ融合タンパク質（配列番号１６）を発現し、これは、ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼの断片のアミノ酸１５７～３１１と、改変ＧＦＰの断片のアミノ酸１５７～２３１とを含む。ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼは、変異Ａ５５Ｔ、Ｃ１２４Ａ、Ｓ１３０Ａ、Ｋ１３６Ｒ、Ａ１４３Ｍ、Ｍ１８５Ｖ、Ｍ２５３Ｌ、及びＳ２８７Ｌを含む（配列番号１９を参照）。改変ＧＦＰの配列は配列番号１８で提供されている。

【0246】

１：１の比率で播種されたＶｅｒｏ－ＤＳＰ１細胞及びＶｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞の混合された単層を、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴに感染させると、合胞体の形成が観察され、感染の２４時間後にルシフェラーゼ活性が容易に検出された（図３Ｆ）。対照的に、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１のみ若しくはＶｅｒｏ－ＤＳＰ２のみの感染した単層、又は偽感染したＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層では、ルシフェラーゼ活性は検出されなかった。よって、ルシフェラーゼ活性は、混合Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層のウイルス誘導型細胞融合に特異的なものであった。

【0247】

ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ融合の最適化
合胞体の形成は、本発明のアッセイで機能的なルシフェラーゼを生成するために必要である。しかしながら、合胞体形成に続く細胞単層の完全な破壊は、細胞生存率の喪失によってルシフェラーゼ活性を低下させる。従って本発明者らは、ルシフェラーゼを測定するための、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ感染後の最適な時点を決定した。ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）生細胞基質（ＥｎｄｕＲｅｎ（商標））は、改変された「前基質（ｐｒｏ－ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」であり、ルシフェラーゼ基質であるセレンテラジンを生成するためには、これを細胞エステラーゼで切断しなければならない。この前基質は極めて安定しているため、ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）を細胞に添加してから２時間後～２４時間後のいずれの時点において、ルシフェラーゼ活性を繰り返し測定できる。感染の１５時間後までは、感染したＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層のルシフェラーゼ活性は、偽感染した細胞のバックグラウンドシグナルから容易に区別された（図４Ａ）。ルシフェラーゼ活性は上昇を続け、感染の約２６時間後にピークレベルに達した。よって、このアッセイでの最適なルシフェラーゼの読み取りは、感染の２４時間後～３０時間後であった。

【0248】

細胞融合及びルシフェラーゼ活性を強化し、これによってアッセイの感度を向上させるために、最適な細胞密度及びウイルス濃度も決定した。Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞を、細胞密度を増大させて播種し、２４時間後に単層を、濃度を上昇させたＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴに感染させた。全てのウイルス希釈物において、細胞密度の増大はルシフェラーゼシグナルを改善した（図４Ｂ）。予想された通り、合胞体の形成、及びルシフェラーゼ活性は、単層の接種により多くのウイルスを使用した場合にも向上した。このアッセイには６×１０^４細胞／ウェルを使用するべきであると結論づけられた。また、最良の結果のためには、「コンフルエントに達していない（ｕｎｄｅｒ－ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）」フラスコから細胞を播種するべきであること、及び回復のために２日が与えられている場合、細胞を冷凍保存ストックから直接播種できることも指摘された。

【0249】

当然のことながら、多数の実験にわたる更なる研究によって、異なるロットのＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴが、融合の誘導に関して異なる効能を示すことが示された。従って、アッセイに適したウイルスの濃度は、一連の人工対照（以下を参照）に対するパフォーマンスに基づいて、ウイルスの各ロットについて決定された。

【0250】

Ｖｅｒｏ－ＤＳＰレポーターアッセイを用いたＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴの中和の検出
本発明のアッセイを用いてウイルスの中和を検出できることを実証するために、まず、いくつかの精製されたタンパク質の、ウイルス誘導型融合を阻害する能力を試験した。アフィニティ精製されたポリクローナル抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－スパイク抗体、及び可溶性組換えＡｃｅ２タンパク質は、ウイルス表面上のスパイクに結合して、細胞への侵入を遮断する。同様に、モノクローナル抗Ａｃｅ２抗体は、細胞受容体を遮断してウイルスの侵入を制限する。３つの阻害剤全てが、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ誘導型の融合を用量依存的に良好に遮断した（図５Ａ）。これは、本発明のアッセイがＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ感染の阻害を検出できることを実証している。重要なことには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２回復期の個体から得られた血漿（ＮＬ１）によるＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴの中和も検出された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブと推定された３人の個体からの、プールされていた血漿と比較して、熱不活化されたＮＬ１血漿は、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴを用量依存的に中和した（図５Ｂ）。従って本発明のアッセイは、回復期血漿中のＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－中和抗体を検出できた。

【0251】

ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ中和時間の最適化
初期の実験では、いずれの中和血清又は阻害剤の不在下であっても、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴを３７℃で１時間インキュベートすることによって、ルシフェラーゼ活性の喪失がもたらされることが観察された（図６Ａ）。この活性の喪失は、ウイルスの濃度が比較的高い場合には部分的に無効化される。それにもかかわらず本発明者らは、室温でのより短いインキュベーション時間によって、効率的なウイルスの中和を促進できるかどうかを調査した。中和ＮＬ１血漿の２倍連続希釈物を調製し、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴと共に３７℃で６０分、又は室温で１５、３０、若しくは６０分にわたってインキュベートした。他の条件に対して、ルシフェラーゼ活性は、室温で１５分間インキュベートされた試料の１：１６０希釈物において、わずかに高く（図６Ｂ）これは、この条件が完全な中和に十分なものではない可能性があることを示唆している。しかしながらＮＬ１は、室温で３０又は６０分間インキュベートされた場合も、３７℃で１時間の場合に比べて効率的ではないものの、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴを中和した。室温で３０分間のインキュベーションは、ウイルスの中和に十分なものであると結論づけられた。

【0252】

熱不活化は、アッセイの適合性ためには必要ではない
アッセイのワークフローを更に合理化するために、信頼できる結果の達成には試料の熱不活化が必要なのかどうかを決定した。血清試料は血漿試料に比べて入手しやすいため、これを試験に使用した。本発明者らはまず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブと推定された３つの試料と、（２０１９年秋までに生成された）市販の血清プールとを、１：１００の希釈率で試験した。上記血清プール、及び上記３つの陰性血清のうちの２つでは、熱不活化により、ルシフェラーゼ活性が若干低下している（図６Ｃ）が、これは恐らく、補体によるウイルスの不活化のレベルが低いためである。それでも全体としては、熱不活化は、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ誘導型細胞融合及びルシフェラーゼ活性にほとんど影響を及ぼさなかった。陰性と推定される３つの更なる血清を複数の希釈率で試験した場合でも、熱不活化された試料と熱不活化されていない試料との間には、ルシフェラーゼ活性の違いはほとんど存在しなかった（図６Ｄ）。対照的に、熱不活化は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２回復期血清の、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴを中和する能力を低下させた（図６Ｅ）。従って、熱不活化されていない試料を使用すると、アッセイのワークフローが合理化され、またアッセイの感度が向上するため好ましいと結論づけられた。

【0253】

最小推奨希釈率の決定
試料の干渉は、高い試料濃度での血清学的アッセイでは一般的である。従って本発明者らは、試料の干渉による偽陽性が略排除される、アッセイの試料に関する最小推奨希釈率を画定した。この目的のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブであると推定される３９個の試料を、１：１０～１：３２０の２倍連続希釈率でのアッセイに供した。予想された通り、ウイルスの融合及びルシフェラーゼ活性との干渉は、比較的高い血清濃度において観察された（図７Ａ）ものの、試料を更に希釈すると消失した。統計的分析により、最小推奨希釈率はおよそ１：１００であることが示された。この希釈率では、陰性血清試料からのルシフェラーゼシグナルが５０％以上となることの信頼度が、９５％を超える。従ってこれ以降の全ての研究では、試験用の血清試料、及びプールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清対照の両方に関する希釈率として、１：１００を使用した。

【0254】

人工陽性対照の開発
大量の適格なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロポジティブ血清の入手可能性は限られているため、本発明者らは、アッセイのための人工陽性対照の開発を試みた。この目的のために、様々な濃度のｍＡｂ１０９１４（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質に結合するモノクローナル抗体）を、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清、又は培地のみにスパイクした。対照として、アイソタイプ抗体も使用した。予想された通り、ｍＡｂ１０９１４は、培地、及びプールされていた陰性血清の両方において、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴの用量依存性の中和を引き起こした（図７Ｂ及びＣ）。対照的に、アイソタイプ対照抗体は、ウイルス誘導型ルシフェラーゼ活性を有意には変化させず、これは、ｍＡｂ１０９１４による中和がスパイク結合に特異的であることを示している。検証研究において人工対照のために使用するべき適切な濃度を確立するために、合計９個のｍＡｂ１０９１４の３倍連続希釈物（１０μｇ／ｍＬ～０．００１５μｇ／ｍＬ）を、３人の別個の分析者によって実施された３つの別個の試験で、二重に試験した。生ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ：相対光単位）のプレートごとのばらつきのため、結果を、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清を含有する対照ウェルにおけるルシフェラーゼシグナルに対する％ルシフェラーゼシグナルとして、正規化した。各濃度での平均％ルシフェラーゼシグナルをプロットし、非線形回帰曲線を生成した（図７Ｄ）。アッセイの直線範囲は、シグナルのおよそ１０％から８０％まで、又はｍＡｂ１０９１４の０．０１μｇ／ｍＬから０．６μｇ／ｍＬまでであった。２μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４を、シグナルを２０％未満に一貫して減少させる、人工陽性対照：高（ＣＰＣ Ｈｉｇｈ）として選択した。応答曲線の９５％信頼度に基づいて、５０％未満のシグナルを誘発するはずのｍＡｂ１０９１４の濃度は０．１８μｇ／ｍＬと計算され、従ってこれはアッセイの検出のおおよその限界を表す。

【0255】

アッセイの特異性及び感度の検査
ＣＰＣ Ｈｉｇｈ値を用いて、アッセイの特異性及び感度を画定した。特異性の測定のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブであると推定される３０個の試料を、単独で、又は２μｇ／ｍＬ（ＣＰＣ Ｈｉｇｈ）のｍＡｂ１０９１４でスパイクして、試験した。この評価を実施することにより、最適化された１：１００の血清希釈率において、偽陽性が観察されないこと、及び全ての人工陽性対照がウイルスの中和を示すことを検証した。異なる分析者が実施した２つの別個の分析において、偽陽性又は偽陰性は観察されなかった（表１）。１つの陰性試料は、１つの複製が５０％未満のシグナルを有していたため、第１のアッセイにおいて不確定として認定された。しかしながら第２のアッセイでは、この試料は陰性として正確に識別された。従ってこの検証では、ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ ｖ．１アッセイの感度及び特異性は１００％であった。検出限界付近でのアッセイの特異性を測定するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブであると推定される３０個の試料（１：１００の血清希釈率）を単独で試験し、上記試料のうちの１９個を、０．３５μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４でスパイクした後にも測定した。上記試験のうち１１個は、検出限界付近ではない２μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４でスパイクした。この実験により、検出限界付近において６８％の感度が実証された（表２）。

【0256】

アッセイの感度を評価するために、上記と同じ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブであると推定される３０個の試料を用いて、同様の単盲検分析を実施した。二重に準備した試料を、１：１００でアッセイに供し、ここで一方の複製試料を、２μｇ／ｍＬ（ＣＰＣ Ｈｉｇｈ）又は０．３５μｇ／ｍＬ（阻害のボーダーライン）のｍＡｂ１０９１４でスパイクし、その後、盲検化されたＩＤを割り当てた。３０個の陰性試料のうち、２６個は陰性として識別され、４個は不確定として識別された（表２）。１１個のＣＰＣ Ｈｉｇｈ試料のうち１０個が検出され、識別されなかった１つの陽性のものについては、試料の調製エラーが疑われた。１９個のボーダーラインの試料からは、１３個が陽性、４個が陰性、２個が不確定として識別され、これは低レベルの中和抗体のみを含有する試料と一致し、０．３５μｇ／ｍＬは、以前に推定されたアッセイの検出限界に近いものであった。

【0257】

アッセイの特異性を更に評価するために、２０１９年１２月以前の４つの一般的なコロナウイルス（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、及びＨＫＵ１）による感染が記録されてそこから回復した患者からの試料を、試験した。これらの一般的なコロナウイルスによる交差反応性は観察されなかった。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ ｖ．１アッセイの強い特異性を実証している。

【0258】

臨床的一致の実証
本発明のアッセイが人工対照で良好に機能したことを考慮して、本発明者らは盲検研究を進め、結果が臨床症状と良好に相関するかどうかを決定した。血清試料を、陰性ドナー（無症状、ＰＣＲでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について陰性、又はＥＬＩＳＡでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ）、陽性ドナー（ＰＣＲでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について陽性、又はＥＬＩＳＡでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロポジティブ）、及び接触陽性ドナー（試験されていないものの、ＰＣＲでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について陽性である者と直接接触している）から取得した。合計２３０個の試料が得られ、これらは、アッセイ分析者に対しては試験完了後まで盲検化された。得られた１２５個の陰性試料のうち、１２５個全てがアッセイにおいて陰性と分析され（表３）、これは、アッセイの優れた特異性の更なるエビデンスを提供した。既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロポジティブ試料のうち、ここでも３８個全てが、アッセイにおいて陽性と分析された。ＰＣＲでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関して過去に陽性と分析されたドナーから得られた３４個の試料からは、３１個の試料で中和抗体が識別された。より詳細な検査では、１つの試料が、陽性ＰＣＲ試験のわずか８日後（これは強力な抗体応答が発生するには十分な時間ではない）に採取されたため、陰性と予測された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性者と接触したドナーからは、３３個の試料のうち１３個（３９．４％）が、中和抗体について陽性として識別された。以上を合わせると、本データは、アッセイが優れた臨床的一致を有することを示している。

【0259】

ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴの中和とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和との間の相関
このアッセイに関して観察された優れた臨床的一致は、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴの中和がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和を正確に反映しているという本発明者らの前提を支持するものであった。この相関を直接実証するために、上述の血清試料のうち２０個を、ＢＳＬ－３プラーク減少中和試験（ｐｌａｑｕｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ：ＰＲＮＴ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の臨床単離株についても試験した（ＰＲＮＴは例えば、Wang et al., Nat Commun 11, 2251 (2020) doi.org/10.1038/s41467-020-16256-y；Okba et al., Emerg Infect Dis. 2020 Jul. doi.org/10.3201/eid2607.200841；Ranawaka et al., Euro Surveill. 2020;25(16):pii=2000421. doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.16.2000421で説明されている）。本発明のアッセイで陰性と判定された５個の試料はそれぞれ、ＰＲＮＴアッセイの検出の限界未満でもあった（表４）。同様に、本発明のアッセイで陽性と判定された１５個の試料は、ＰＲＮＴアッセイでも陽性であった。更に、本発明のアッセイで決定された定量的なウイルス中和単位（ＶＮＵ）は、ＰＲＮＴ５０％及びＰＲＮＴ_ＥＣ５０の値と密接に相関していた（表４～５、及び図８Ａ）。ＶＮＵを計算するために、各アッセイプレートに対する、１：１００のプールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清中のｍＡｂ１０９１４の５点希釈系列からなる検量線を含めた。％ルシフェラーゼシグナルに基づいて、各試料に関して同等のｍＡｂ１０９１４濃度を決定し、これを１００倍して、当該試料のＶＮＵを得た。ＶＮＵとＰＲＮＴ_ＥＣ５０値との間には強い相関（ピアソンρ＝０．８９０２、ｐ＜０．０００１）が観察された。ＶＮＵとウイルス中和力価（ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｔｅｒ：ＶＮＴ）ＥＣ５０値との間の関係も検査した。４４個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性試料の、５つの２倍連続希釈物を調製して、アッセイで試験した。各希釈物に関する％ルシフェラーゼシグナルをプロットし、得られた曲線を用いてＶＮＴ_ＥＣ５０値を決定した。ＶＮＵとＶＮＴ_ＥＣ５０との統計的比較により、これら２つの値の間に優れた相関（スピアマンρ＝０．８３２７、ｐ＜０．０００１）が示され（図８Ｂ）、これはＶＮＵ値の正確性の更なる実証を提供した。ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴの中和は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和を厳密に複製し、またＶＮＵは、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体応答の強度を定量化するための正確な方法を提供する、と結論づけられた。図８Ｃは、ＰＣＲ陽性試料からの代表的なＶＮＵを示し、これは、回復期の試料が様々なＶＮＵを呈することを示す。

【0260】

ＶＮＵ値と重症度との間の相関を、臨床症状が自己報告された３１個の陽性試料について調査した（図８Ｄ）。３人の患者が、無症候性であると報告し：２人は最低のＶＮＵ象限にあり、１人は２番目に低いＶＮＵ象限にあった。悪寒しか経験しなかった１人の患者は、１０００ＶＮＵを超える中和抗体を生成した。従って、重篤な疾患を有する個体が強力な中和抗体応答を発する可能性が高いものの、強力な中和抗体応答には重篤な疾患が必要とされるわけではない。

【0261】

アッセイのための９６ウェルプレートのレイアウトの例
アッセイのための９６ウェルプレートのレイアウトの非限定的な例を図９に示す。各試料及び対照を、Ｕウェルプレート又はチューブ内で１つずつ調製して、黒色透明底９６ウェルプレート内の、二重に作成したＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／ＤＳＰ２混合細胞のウェルに移す。試料Ｓ１～Ｓ４１が示されている。各試料を、ＯｐｔｉＭＥＭ中において１：１００でアッセイに供する。試料及び対照のプレートの位置は変更できる。重要なのは、全ての対照を各プレート上に確実に含めることである。対照は、ＢＣ、ＮＣ、及び標準（Ｓｔａｎｄａｒｄ：Ｓｔ）１～５を含む。
・ＢＣは、１：１００の希釈率のプールされていた陰性（マトリックス）血清であり、ウイルスを含まない
・ＮＣは、１：１００の希釈率のプールされていた陰性（マトリックス）血清＋ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴである
・各標準は、以下の３つの成分を含有する：
１：１００の希釈率のプールされていた陰性（マトリックス）血清
ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ
指定された濃度の陽性対照（例えばｍＡｂ１０９１４）抗体
各標準のｍＡｂ１０９１４の最終濃度は現在：Ｓｔ１＝３μｇ／ｍＬ、Ｓｔ２＝１μｇ／ｍＬ、Ｓｔ３＝０．３３３３μｇ／ｍＬ、Ｓｔ４＝０．１１１１μｇ／ｍＬ、Ｓｔ５＝０．０３７０μｇ／ｍＬである（代替的な標準曲線は６個の標準を含むことができ、その範囲は：Ｓｔ１＝２μｇ／ｍＬ、Ｓｔ２＝１μｇ／ｍＬ、Ｓｔ３＝０．５μｇ／ｍＬ、Ｓｔ４＝０．２５μｇ／ｍＬ、Ｓｔ５＝０．１２５μｇ／ｍＬ、Ｓｔ６＝０．０６２５μｇ／ｍＬとなる）

【0262】

結果を決定するために、以下のステップを実施する：
１．ルシフェラーゼ活性を測定し（１ウェルあたりの積分時間２０００ｍｓ、ウェル間の整定時間２００ｍｓ）、出力の単位は相対光単位（ＲＬＵ）である。
２．ＢＣウェルからの平均ＲＬＵを決定し、互いに差し引きして、バックグラウンド補正済みＲＬＵ値を得る。
３．ＮＣウェルからの平均補正済みＲＬＵを決定する。
４．明らかな外れ値について対照を検査し、外れ値を平均値から除去する。
５．各試料及び標準について％ルシフェラーゼシグナルを決定する（複製ウェルそれぞれについて個別に計算）。％ルシフェラーゼシグナルは：

【数1】

である。
６．定性的な結果を決定するために、各試料複製の％シグナルを検査し、以下のように結果を出す：
・陰性：両方の試料複製の％ルシフェラーゼシグナルが５０％以上である
・陽性：両方の試料複製の％ルシフェラーゼシグナルが５０％未満である
・不確定：一方の試料複製の％ルシフェラーゼシグナルが５０％以上であり、他方が５０％未満である。
７．陽性試料に関する定量的なウイルス中和単位（ＶＮＵ）を計算するために、ルシフェラーゼシグナルの読み取りに続いて、Ｍａｇｅｌｌａｎソフトウェア内で以下のステップが自動的に実施される：
ａ．標準を、その値を１００倍することによって任意のＶＮＵに変換する（例えば３μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４は３００ＶＮＵとなり、０．３３μｇ／ｍＬは３３ＶＮＵとなる）。
ｂ．ＶＮＵを、バックグラウンド補正済みＲＬＵ値に対してプロットし、標準からの４パラメータの当てはめ曲線を生成する。
ｃ．上記標準曲線を用いて、各試料複製、及び二重の試料の平均に関するＶＮＵ値を決定する。
ｄ．３００を超えるＶＮＵは、定量化の限界を超えている。これらは３００超のＶＮＵとして報告でき、又は試料をより高い希釈率で再びアッセイに供することにより、試料を標準曲線の直線範囲内に収めることができる。アッセイの後、ＶＮＵに、上昇させた希釈率を乗算する（例えば、１：１０００の希釈率でアッセイに供された試料が１８０ＶＮＵとして読み取られると、１：１０００の希釈率が１：１００の希釈率よりも１０倍希釈されているため、１０倍することによって１８００ＶＮＵとなる）。非公式の並列処理試験を実施し、アッセイでの使用のために希釈を１：３２００まで実施した（希釈係数３２）。

【0263】

議論
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の検出のための血清学的試験に対する高い需要は、過去の感染率を理解し、ワクチン及び血漿療法の有効性を評価する必要性によって刺激されている。多数のＥＬＩＳＡ及び迅速な診断試験が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の検出のために開発され、いくつかは様々な国で診断試験のために承認されている。しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和できる抗体の検出のための、容易に拡張可能な血清学的アッセイは、はっきりしないままである。本明細書で説明されるのは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の検出のためのＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ ｖ．１アッセイであり、これは高スループットであり、比較的低いバイオセーフティー（ＢＳＬ２）条件下で実施され、スケーラブルであり、また定量的である。このアッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２血漿療法試験のための、ドナーからの試料のスクリーニング、候補ワクチンに対する免疫応答の評価、及び抗体応答がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫にどのように関係するかの更なる理解に役立つ。

【0264】

本発明のアッセイは、組換えＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ（又はＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ等の、他の類似の構築物）の融合表現型を利用して、定量的なルシフェラーゼシグナルを９６ウェルプレートフォーマットで生成する（図２、３、９、及び１０）。そして、試験される血清試料によるウイルスの中和を、ルシフェラーゼ活性の低下として検出する。重要なことには、本発明のアッセイからの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の臨床単離株を用いて決定されるウイルス中和力価と密接に相関している（ρ＝０．８９８７）（図８）。興味深いことに、陽性対照抗体ｍＡｂ１０９１４をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プラーク減少中和試験で試験すると、そのＰＲＮＴ５０％力価は４０９６０であった。これは０．０２６μｇ／ｍＬの濃度に対応する。本発明のアッセイでは、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴの５０％超を阻害できるｍＡｂ１０９１４の最低濃度は、およそ０．１８μｇ／ｍＬであることが決定された（図８）。このデータは、発明のアッセイが異なるウイルス（ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ）を使用していても、上記アッセイが抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を正確に測定し、またＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害できない陽性を検出する可能性は低いことを示している。本発明のアッセイはまた、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮアッセイとの完璧な相関関係も実証した。

【0265】

試験中、ＰＣＲ試験でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について陽性だったドナーから採取された３つの試料は、本発明のアッセイを用いると陰性であった（表４）。これらの試料のうちの１つは、強力な免疫応答が期待されるよりも早い、陽性ＰＣＲ試験のわずか８日後に得られたものであるため、真陰性であると思われ、また上記試料はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＰＲＮＴ５０アッセイでも陰性と判定された。他の２つの試料が偽陰性であるか真陰性であるかは、まだ決定されていない。恐らくこれらの試料は実際には有意なレベルの中和抗体を欠いており、これは、陽性のＰＣＲ試験結果だけでは防御抗体応答が保証されないという仮説を裏付けている。あるいは、上記試料は、本発明のアッセイでは見逃された、低いレベルの中和抗体しか有していない可能性がある。プールされていた陰性血清に低いレベルでスパイクされた人工対照を用いて実施された研究は、検出アッセイの感度の限界付近が６８％であることを示唆した（表２）。しかしながら、人工対照をより高い濃度（２μｇ／ｍＬ）でスパイクすると、感度は９０．９％であった。試験された臨床試料の半分超が、少なくとも２μｇ／ｍＬの中和抗体に相当するウイルス中和単位（ＶＮＵ）を呈した。従って、盲検試験に基づいて感度を計算した場合に、はるかに高い程度の感度（９７．２％）が観察されることは、驚くべきことではない。５０％未満のシグナルはカットオフされる。ばらつきは許容範囲内であった。

【0266】

スパイクのＲＢＤが中和抗体の主要な標的である可能性が高いものの、ＲＢＤ－ＡＣＥ２結合の破壊のみを測定するアッセイが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の合計を正確に定量化するかどうかを決定するために、更なる研究が必要である。特に、コロナウイルスのＲＢＤドメインは、立ち上がった（ｓｔａｎｄｉｎｇ－ｕｐ）位置と横になった（ｌｙｉｎｇ－ｄｏｗｎ）位置とを常に切り替えており（Yuan 2017 and Gui 2017）、これは、一部の中和抗体の標的化が状況に依存している可能性があることを示唆している。スパイクのタンパク質分解活性化も、膜融合及び細胞へのウイルスの侵入に必要であるため、Ｓ１／Ｓ２切断境界も中和抗体の標的となり得る。近年開発されたいくつかのアッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質で偽型化されたウイルスベクターを使用する。しかしながら、偽型ウイルスのスケーラビリティは、（本発明のアッセイで使用されるような）生きた複製ウイルスよりも困難であり、本発明のアッセイは幅広い診断試験に利点を提供する。

【0267】

本発明のアッセイの別の利点は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体のレベルが、試験用試料の希釈系列全体を必要とすることなく定量化される点である。上記アッセイについて、最小推奨希釈率は１：１００であることが決定された。この希釈率では、試料の約１６．９％が検量線の直線範囲を超えた。高いレベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を含有する試料については、第２の希釈率（例えば１：１０００）によって、抗体レベルのより正確な定量化を促進できる。

【0268】

更なる試験により、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１及びＶｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞株を、アッセイのパフォーマンスに影響を及ぼすことなく、少なくとも３週間継代できること、並びにこのアッセイを用いて検出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体は、最長１周間の冷蔵や複数回の冷凍－解凍サイクルを含む多数の他の条件下で安定していることが示された。ＮＬ１、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブであると推定される血漿の小さなプールを用いた実験（図５Ｂ及び６Ｂ）は、上記アッセイが血清試料とも適合性を有することを示唆している。

【0269】

ＭＥＲＳ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶを用いた研究により、インビトロでの感染の抗体依存的な強化が実証されている（Ｙｉｐ、Ｗａｎｇ、Ｗａｎ、及びＪａｕｍｅ）。ＮＨＰの研究では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶに対する抗体レベルの上昇に伴う疾患の増強の可能性が示唆されている（Liu et al. 2019）。いくつかのエビデンスにより、ＳＡＲＳの臨床例における抗体依存的な強化が裏付けられている（Ho 2005, Peiris 2003）。ＣＯＶＩＤ－１９の重症例を治療するための、ＣＯＶＩＤ－１９回復期血漿を用いたまだ初期の研究は、大きな期待を示している。研究者は、回復期血漿療法を更に改良し、モノクローナル抗体療法を開発し、強力な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫応答を生成する効果的なワクチンを設計することに取り組んでいるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と免疫系との間の相互作用に関して解明すべきことは明らかに多い。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体レベル全体が中和抗体レベルとどのように関係しているかが、このパズルの重要なピースであり、これは、その答えを提供するために本発明のアッセイが役立つことができるピースである。

【0270】

材料及び方法
細胞。アフリカミドリザルＶｅｒｏ細胞、Ｖｅｒｏ－αＨｉｓ、及びベビーハムスター腎臓ＢＨＫ－２１細胞を、３７℃／５％ＣＯ_２で、５％ウシ胎児血清及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンが補充された高グルコースＤＭＥＭ（完全培地）中に維持した。

【0271】

Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－１－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７３）及びＶｅｒｏ－ＤＳＰ２（Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ－２－Ｐｕｒｏ；ＣＬＲ－７４）細胞は、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル由来の腎臓上皮細胞）に、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーターの制御下で、Ｒｌｕｃ８ １５５－１５６ＤＳＰ１－７及びＲｌｕｃ８ １５５－１５６ＤＳＰ８－１１をそれぞれ発現する自己不活化レンチウイルスベクターＳＦＦＶ－ＤＳＰ_１－７－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏ又はＳＦＦＶ－ＤＳＰ_８－１１－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏを形質導入し、Ｐ２Ａ切断ペプチドを介してピュロマイシン耐性遺伝子に連結することによって生成された。形質導入された細胞を、１０μｇ／ｍＬのピュロマイシンを用いて選択した。選択後、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ細胞を、５μｇ／ｍＬのピュロマイシンが補充された完全培地中に保持した。ピュロマイシンは、細胞をアッセイのために播種する際に除去された。

【0272】

Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１細胞はＲｌｕｃ８ １５５－１５６ ＤＳＰ １－７ルシフェラーゼ－ＧＦＰ融合タンパク質（配列番号１４）を発現し、これは、ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼの断片のアミノ酸１～１５５と、改変ＧＦＰの断片のアミノ酸１～１５６とを含む。Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞は、Ｒｌｕｃ８ １５５－１５６ ＤＳＰ ８－１１ルシフェラーゼ－ＧＦＰ融合タンパク質（配列番号１６）を発現し、これは、ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼの断片のアミノ酸１５７～３１１と、改変ＧＦＰの断片のアミノ酸１５７～２３１とを含む。ＲＬｕｃ８変異型ウミシイタケルシフェラーゼは、変異Ａ５５Ｔ、Ｃ１２４Ａ、Ｓ１３０Ａ、Ｋ１３６Ｒ、Ａ１４３Ｍ、Ｍ１８５Ｖ、Ｍ２５３Ｌ、及びＳ２８７Ｌを含む（配列番号１９を参照）。改変ＧＦＰの配列は配列番号１８で提供されている。

【0273】

ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴの生成。上の実施例１に記載されているように、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０４５５１２．２；タンパク質＿ＩＤ：ＹＰ＿００９７２４３９０．１）（バリアント１；ＶＳＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｄＧ＝ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ；配列番号１のアミノ酸配列；配列番号２の、コドン最適化されたコーディングヌクレオチド配列）、（２）Ｃ末端の１９個のアミノ酸ＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴ（配列番号２０）が欠失したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列（バリアント２；ＶＳＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Δ１９ＣＴ ｄＧ＝ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ；配列番号３のアミノ酸配列；配列番号４の、コドン最適化されたコーディングヌクレオチド配列）。全長ヒトコドン最適化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質（ＮＣ＿０４５５１２．２）を、ｐＵＣ５７にクローニングした。このプラスミドをＰＣＲテンプレートとして用いて、Ｃ末端の１９個のアミノ酸をコードするヌクレオチドの欠失（Ｓ－Δ１９ＣＴ）、並びに５’ＭｌｕＩ及び３’ＮｈｅＩ制限部位を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳをコードするｃＤＮＡを生成した。ウイルスゲノムを生成するために、Ｓ－Δ１９ＣＴを含有する増幅された上記ＰＣＲ産物を、ＭｌｕＩ及びＮｈｅＩ制限部位を用いて、ＶＳＶ－Ｇの代わりにｐＶＳＶ－Ｍ５１Ｒにクローニングした（図１及び３Ａ）。プラスミドを上述のように配列検証し、ＢＨＫ－２１細胞での感染性ウイルスのレスキューに使用した。ＶＳＶ－Ｇは、レスキューを促進するためにＢＨＫ－２１細胞に同時にトランスフェクトされたが、ウイルスの後続の継代には存在しなかった。１０ｃｍプレートの８０％コンフルエントな単層に１ｍＬのウイルスを接種することによって、ウイルスをＶｅｒｏ－αＨｉｓ細胞内で増殖させた。接種の４８時間後にウイルスを採取し、アリコート化し、使用するまで－８０℃で保管した。アリコートは、Ｖｅｒｏ－αＨｉｓ細胞での組織培養細胞感染率５０（ｔｉｓｓｕｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ ５０：ＴＣＩＤ_５０）アッセイのために使用された。

【0274】

感染。６ウェルプレートのＶｅｒｏ単層に、ＯｐｔｉＭＥＭ中の継代３ ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ、又はＯｐｔｉＭＥＭのみ（モック）を、２ｍＬ接種した。３７℃／５％ＣＯ_２で４時間後、接種材料を除去し、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで１回すすいだ。新鮮なＯｐｔｉＭＥＭのみ、又は４μｇ／ｍＬのトリプシンを含有するＯｐｔｉＭＥＭをウェルに加えた。感染後２０時間まで、細胞を３７℃／５％ＣＯ_２のインキュベーターに戻し、この時に、倒立顕微鏡を用いて１００倍の倍率で写真を撮影した。

【0275】

試薬。ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）生細胞基質を、製造元の指示に従って調製した（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｅ６４８２）。阻害研究のために、マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ ＃ＧＴＸ６３２６０４）、アフィニティ精製済みポリクローナル抗ヒトＡＣＥ２抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＡＦ９３３）、及び組換えヒトＡＣＥ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃９３３－ＺＮ－０１０）を、ＯｐｔｉＭＥＭ中で所望の濃度まで希釈した。

【0276】

ルシフェラーゼアッセイ。アッセイを、黒色透明底９６ウェルプレートで実施した。ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）基質を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ又はＴｅｃａｎ Ｍ Ｐｌｅｘ機器（積分時間２０００ｍｓ、整定時間２００ｍｓ）でバイオルミネッセンスを読み取る少なくとも２時間前の、感染後の様々な時点で、ウェルに加えた（最終濃度７．５μＭ）。動態実験のために、バイオルミネッセンスを繰り返し読み取ったが、最初のＥｎｄｕＲｅｎ（商標）の添加から２４時間後まではそれ以上のＥｎｄｕＲｅｎ（商標）を加えず、更に後の時点において、バイオルミネッセンスを読み取る少なくとも２時間前に更なるＥｎｄｕＲｅｎ（商標）をウェルに加えた。

【0277】

血漿及び血清試料の回収。アッセイの検証のために血液試料を回収するための臨床プロトコルは、Ｗｅｓｔｅｒｎ ＩＲＢによって審査及び認可された（研究ＩＤ：ＶＹＲ－ＣＯＶ－００１）。血清及び血漿試料を、ＰＣＲ試験でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染について陽性であると過去に判定された患者、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した個体への曝露及びＣＯＶＩＤ－１９の症状が分かっていた患者、並びに抗体に対して陰性であると推定される患者、即ちＣＯＶＩＤ－１９疾患の症状が全くなく、曝露もされていない可能性が高い個体のコホートから、回収した。合計１５０人の成人が、ニュージャージー州ニューアークを拠点とするＢｉｏＴｒｉａｌ、及びミネソタ州ロチェスターのＯｌｍｓｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒに登録された。ＥＵＲＯＩＭＭＵＮアッセイを用いて試験された試料からの、８０個の追加の血清アリコート。

【0278】

盲検試料試験。アッセイ試験のために分析者に渡される前に、血清試料にランダムＩＤを割り当てた。試料を複数のバッチでアッセイに供し、ここで各バッチで予想される陽性試料及び陰性試料の個数は不明であった。各試料を１：１００の希釈率でアッセイに供し、全ての陽性試料及び一部の陰性試料を、１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、及び１：１６００を含む希釈系列で更にアッセイに供した。

【0279】

ＰＲＮＴアッセイ。血清を５６℃で３０分にわたって熱不活化し、Ｘで連続希釈した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を８００ＰＦＵ／ｍＬまで希釈し、同体積の希釈された血清と混合した（ウイルスを含む血清の最終希釈率１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０、１：３２０、１：６４０、１：１２８０、１：２５６０、１：５１２０、１：１０２４０、１：２０４８０、１：４０９６０）。同体積の培地のみと混合されたウイルスを、対照として使用した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、２５０μＬのウイルス／血清混合物又はウイルス／培地混合物を用いて、６ウェルプレートのＶｅｒｏ－Ｅ６単層に接種した。接種を３７℃で１時間、時折揺り動かしながら進行させた後、単層に、２％ウシ胎児血清及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを補充された最小必須培地（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ）中の、３ｍＬの０．４％低融点アガロースを重ねた。プラークが出現するまでプレートを３７℃でインキュベートし、その後、１０％のホルムアルデヒドで固定し、０．２５％のクリスタルバイオレットで染色した。プラークを計数し、各希釈率でのプラークの個数をプロットし、これを用いて、非線形回帰モデルによって、各試料についてのＰＲＮＴ_ＥＣ５０値を決定した。３０個を超えるプラークの個数は多すぎて数えられず、ウイルス／培地対照と同等とみなされた。ＰＲＮＴ５０％力価を、ウイルス／培地対照のウェルと比較してプラークを５０％阻害した血清の最高希釈率（逆数として表される）として、決定した。

【0280】

フローサイトメトリー。Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１細胞を、Ｖｅｒｓｅｎｅを用いて除去し、計数し、微量遠心分離チューブに移した（５×１０^５細胞／チューブをＡＣＥ２染色に使用し、１．５×１０^６細胞／チューブをＴＭＰＲＳＳ２染色に使用した）。ＡＣＥ２染色のために、細胞をペレット化して、０．２μｇヤギ抗ヒトＡＣＥ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＡＦ９３３）を含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ中の２％のＦＢＳ）中に再懸濁した。氷上で３０分置いた後、細胞を１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液ですすぎ、５μＬのロバ抗ヤギＩｇＧ－ＰＥ２次抗体を含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。氷上で３０分置いた後、細胞を１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液ですすぎ、氷上で１５分間にわたって１％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＣＹＴＯＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。ＴＭＰＲＳＳ２染色のために、細胞をＤＰＢＳ中の１ｍＬの氷冷７０％エタノール中に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、４μｇのウサギ抗ＴＭＰＲＳＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃ＰＡ５－１４２６４）を含有する１００μＬの０．５％サポニン溶液中に再懸濁した。氷上で３０分置いた後、試料を１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、２μＬのヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＡＦ６４７２次抗体を含有する１００μＬの０．５％サポニン溶液中に再懸濁した。氷上で３０分置いた後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、氷上で１５分間にわたって１％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＣＹＴＯＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。ＡＣＥ２染色及びＴＭＰＲＳＳ２染色の両方について、２次抗体のみの対照をアイソタイプに使用した。

【0281】

免疫ブロット。ＶＳＶ－ＧＦＰ若しくはＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴに感染した、又は偽感染のＶｅｒｏ細胞の、全細胞及び培養上清を、感染の４８時間後に回収した。凍結－解凍によってウイルスを細胞から放出させ、細胞デブリを遠心分離で除去した。試料を、製造元の指示に従ってＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｂ０００７）及び還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｂ０００９）で２つずつ希釈し、７０℃で１０分間インキュベートし、４０μＬの各試料を、プレシジョンＰｌｕｓプロテインデュアルカラースタンダード（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＃１６１－０３７４）を加えた４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ１５ウェルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃ＮＷ０４１２５Ｂｏｘ）で、二重に処理した。Ｐｏｗｅｒ Ｂｌｏｔｔｅｒ ＸＬを用いて、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。膜を、ＴＢＳＴ中の５％の脱脂粉乳中でブロックし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、１次抗体であるマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（１：１０００、ＧｅｎｅＴｅｘ ＃ＧＴＸ６３２６０４）、又はウサギポリクローナル抗ＶＳＶ（１：５０００、Ｉｍａｎｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃ＲＥＡ００５）と共に、室温で１時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、１：２０，０００の２次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＃２０－３０４）又はヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＃２０－３０３）と共に、室温で１時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、ＰｒｏＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｄｕｒａ ＥＣＬ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＃２０－３０１）を用いて、タンパク質バンドを室温で２分間展開させた。タンパク質バンドを、ＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて画像化した。

【0282】

％応答及びウイルス中和単位の決定。各ウェルの生の相対光単位（ＲＬＵ）値を、１：１００のプールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清を含むもののウイルスは含まないバックグラウンドウェルからの平均ＲＬＵ値を用いて、ブランク補正した。％応答を各試料ウェルについて、補正済みＲＬＵ値を、ウイルスと１：１００のプールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブの血清とを含む陰性対照ウェルからの平均補正済みＲＬＵ値で除算し、これに１００％を乗算したものとして決定した。両方の試料複製で％応答が５０％未満である試料を、陽性として分類した。両方の試料複製で％応答が５０％以上である試料を、陰性として分類した。一方の複製が陽性応答を呈し、他方が陰性応答を呈した場合、試料を不確定として分類し、アッセイを繰り返した。陽性試料について、ウイルス中和抗体価（Virus neutralizing titers）（ＶＮＵ）を検量線に基づいて決定した。検量線は各プレートに対して作成され、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清に３、１、０．３３、０．１１、及び０．０３７μｇ／ｍＬでスパイクされたｍＡｂ１０９１４で構成されていた。検量線から、所与の％応答に対する中和抗体の当量濃度を決定した。ＶＮＵに変換するために、抗体の当量濃度を１００倍した。

【0283】

統計的分析。記述統計、比較、及び回帰分析を、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ、ｖ８．４．０（カリフォルニア州サンディエゴ）で実施した。分散の正規性に関する検定が実施され、可能な場合は常にパラメトリック比較を使用した。非正規データセットについては、非パラメトリックアプローチを使用した。アッセイ内のウイルス中和単位の検量線には、４パラメータの非線形回帰を使用した。相関分析のために、スピアマンの順位相関分析を実施した。

【0284】

【表1】

【0285】

【表2】

【0286】

【表3】

【0287】

【表4】

【0288】

【表5】

【0289】

コアの検証
コアの特異性を以下のように試験する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブと推定される個体からの少なくとも３０個の血清試料を、アッセイでこれらのＭＲＤで二重に分析する。更に、分析された各血清試料について、対応するＣＰＣＨ試料を、最適化された試料希釈率に関する上述のセクションで決定された濃度で各試料にスパイクすることによって調製し、二重に分析する。この評価は、２人の別個の分析者による少なくとも２回のアッセイで完了する必要がある。各複製希釈率の平均応答及び％ＣＶを報告する。

【0290】

偽陽性率を、５０％未満の応答を生成する対照マトリックス試料のパーセンテージによって決定する。偽陽性率の許容基準は５％未満である。

【0291】

偽陰性率を、５０％を超える応答を生成するＣＰＣＨ試料のパーセンテージによって決定する。偽陰性率は、最終的なアッセイの検証の概要で報告されるが、許容基準はない。

【0292】

臨床的一致を以下のように決定する。分子診断試験若しくは別の血清学的方法によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について陽性であると過去に判定された、又は症状の発症を理由として医療専門家に推定陽性と宣言された、回復期患者からの、少なくとも３個の血清試料を、アッセイで試験する。推定陽性患者からの情報は自己報告である。この評価は、１人の分析者が実施する少なくとも１つのアッセイで、希釈された試料を二重にプレーティングすることによって、完了される。可能であれば、入手可能な試料の体積を理由として、この分析は少なくとも２人の分析者による３回のアッセイで完了される。試料の提出は、推定陽性試料と推定陰性試料とを混合して、１人以上の分析者に対して単盲検で実施される。推定陽性試料は、精度評価を可能にするための別の血清学的方法で分析される。

【0293】

各複製希釈率について平均応答及び％ＣＶを報告する。臨床的一致は、試験された全ての推定陽性試料について、ＭＲＤで５０％未満の応答が観察された場合に報告される。最初のスクリーンに続いて、試料をＭＲＤで始まる希釈系列で分析し、希釈力価の結果を決定できる。希釈力価の結果の取得は任意であり、アッセイの検証に必須ではない。代替の血清学的方法によって得られた結果と比較して、試料の陽性対陰性の決定には９０％の一致がなければならない。

【0294】

アッセイ内での精度を以下のように決定する。操作者内及び－アッセイ内での精度を、ＣＰＣＨ、ＣＰＣＬ、及び品質管理（ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ：ＱＣ）試料として使用される未処理の血清マトリックスプールを調製することによって、試験する。各ＱＣ試料の２０個の複製を単一のアッセイ内で１人の操作者によって試験する。１回のアッセイは、試料の容量を理由として、複数の試料プレートからなる場合がある。各ＱＣ試料の２０個の複製全てを同一のアッセイプレートで分析してよいが、これは必須ではない。

【0295】

平均応答、ＳＤ、及び％ＣＶを報告する。各ＱＣ試料について、許容は％ＣＶに基づくものであり、許容レベルは２０％である。各ＣＰＣＨ試料については、３０％ＣＶ、又は平均応答±３ＳＤの参照範囲内という許容基準が、許容される。この尺度は、高い％ＣＶが低い応答出力で予想されるため、選択される。最高１０％のエラー率が許容される。

【0296】

アッセイ間での精度及び分析者間での精度を、以下のように決定する。ＣＰＣＨ、ＣＰＣＬ、及び未処理の血清マトリックスプールを調製し、複数日にまたがる、少なくとも２人の分析者による少なくとも３回のアッセイについて、二重に分析する。

【0297】

平均応答、ＳＤ、及び％ＣＶを報告する。各ＱＣ試料について、許容は％ＣＶに基づくものであり、許容レベルは２０％である。各ＣＰＣＨ試料については、３０％ＣＶ、又は平均応答±３ＳＤの参照範囲内という許容基準が、許容される。この尺度は、高い％ＣＶが低い応答出力で予想されるため、選択された。最高１０％のエラー率が許容される。

【0298】

実験室間での精度を、以下のように決定する。ＣＰＣＨ、ＣＰＣＬ、及び未処理の血清マトリックスプールを、試験施設で調製する。試料レベルは単盲検化されて、別の試験場所でのアッセイを完了するために、試薬と共に送られる。少なくとも１つのアッセイを、試料を二重に分析して完了する必要がある。上記別の試験場所、及びこの別の試験場所の責任者は、最終的なアッセイ検証レポートで特定される。

【0299】

平均応答、ＳＤ、及び％ＣＶを報告する。各ＱＣ試料について、許容は％ＣＶに基づくものであり、許容レベルは５２０％である。各ＣＰＣＨ試料については、５３０％ＣＶ、又は平均応答±３ＳＤの参照範囲内という許容基準が、許容される。この尺度は、高い％ＣＶが低い応答出力で予想されるため、選択された。最高１０％のエラー率が許容される。

【0300】

第１の細胞株の安定性のロバスト性を、以下のように決定する。Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１及びＶｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞株でのＡＣＥ－２発現の分析を、フローサイトメトリーによって決定する。予想される細胞の使用に基づいて、各細胞株を複数の間隔で試験して、予想される細胞の使用全体にわたって一貫した受容体発現を決定する。細胞をまず、最初の継代の冷凍ストックを解凍してプレーティングした後４８時間以内に試験する。反復分析を、最低６回の継代まで、又は解凍から最短で３週間までの、複数の継代で実施する。試験された特定の間隔、及び許容可能な安定性について決定された間隔を、最終的なアッセイ検証レポートで報告する。抗ＡＣＥ－２染色済み試料及び適切なフローサイトメトリー陰性対照試料からなる単一の分析を、試験された各間隔において得る。

【0301】

蛍光強度中央値（ｍｅｄｉａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）、及び半ピーク％ＣＶを、ＡＣＥ－２染色済み細胞、及びネガティブ染色対照の両方について報告する。染色指数を各間隔に計算し、最終的なアッセイ検証レポートで報告する。フローサイトメトリーの評価の許容基準は以下の通りである。

【0302】

蛍光強度中央値（ＭＦＩ）、及びハーフピーク％ＣＶを、ＡＣＥ－２染色済み細胞、及びネガティブ染色対照の両方について報告する。許容範囲は、細胞の解凍から４８時間以内の最初の細胞継代において収集されたデータから計算される。許容可能なＭＦＩ範囲は、以下のように計算される：

【数2】

【0303】

ここで％ＣＶ_ｈｐは、フローサイトメーター機器からの半ピーク％ＣＶとして定義される。他の間隔で実施された全ての分析が、ＡＣＥ－２染色済み細胞、及びネガティブ染色対照の両方について、この計算から確立されるＭＦＩ範囲内に収まる必要がある。

【0304】

第２の細胞株の安定性のロバスト性を、以下のように決定する。Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１及びＶｅｒｏ－ＤＳＰ２細胞株での機能性ＤＳＰの分析を、ＣＰＣＨ、ＣＰＣＬ、及びＣＭの存在下で生成される発光のレベルによって決定する。クライオバイアルのアリコートから解凍され、２日間増殖させた後、アッセイでの使用のために継代した細胞に対して、アッセイを実行する。細胞の解凍からアッセイプレートの読み取りまでの時間は、合計４日である。上記アッセイは、二重に調製及び分析されるＣＰＣＨ、ＣＰＣＬ、及び未処理のマトリックスプールを含む必要がある。細胞の連続的な分割ごとにアッセイプレートを調製し、二重に調製及び分析されるＣＰＣＨ、ＣＰＣＬ、及び未処理のマトリックスプールを含むアッセイを完了する。継代及びアッセイの具体的な数は不明であるが、細胞は、細胞が最初に解凍されたときから少なくとも３週間保持され、各分割において、アッセイを実行するためにアッセイプレートをプレーティングし、翌日にセットアップし、プレーティングの２日後に読み取る。

【0305】

平均応答、ＳＤ、及び％ＣＶを報告する。各レベルでのパフォーマンスを、細胞に対する最初のアッセイから得られた平均応答と比較する（細胞の解凍の４日後に読み取る）。細胞に対する最初のアッセイからの％相対誤差（Ｐｅｒｃｅｎｔ Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｅｒｒｏｒ：％ＲＥ）を計算する。許容基準は、ＣＰＣＬ試料から得られた±３０％ＲＥとして定義される。ＣＰＣＬ試料は、ＣＰＣＬ応答がアッセイの直線範囲内にあると疑われる場合の安定性を評価するために選択された。

【0306】

ウイルスストックの安定性のロバスト性を、以下のように決定する。ウイルスストックのチューブをアッセイで使用するために解凍した後、湿った氷上又は冷蔵条件（２～８℃）で、最長で２４時間にわたって保管する。少なくとも３回のアッセイを、この単一のチューブから複数の間隔で準備する。各アッセイは、二重にプレーティングされたＣＰＣＨ、ＣＰＣＬ、及び未処理のマトリックスプールを含む。試験される特定の、時間が設定された間隔としては、解凍の１時間以内に調製されるアッセイプレート（「新鮮なウイルス（ｆｒｅｓｈ ｖｉｒｕｓ）」）、解凍後２２～２４時間で調製されるアッセイプレート、及び少なくとも１つの中間の時間間隔（即ち解凍後１２時間以内）が挙げられる。

【0307】

平均応答、ＳＤ、及び％ＣＶを報告する。各レベルでのパフォーマンスを、１時間未満の間隔から得られた平均応答と比較する）。１時間未満の間隔からの％相対誤差（％ＲＥ）を計算する。許容基準は、ＣＰＣＬ試料から得られた±３０％ＲＥとして定義される。ＣＰＣＬ試料は、ＣＰＣＬ応答がアッセイの直線範囲内にあると疑われる際の安定性を評価するために選択された。

【0308】

試料マトリックスの安定性のロバスト性を、以下のように決定する。上で得られた最小で３個の試料から、回収後可能な限り迅速に分析を実施する。回収から分析までの期間を報告する。分析手順中に、安定性評価に使用するための追加のマトリックスアリコートを調製する。安定性は、－２０℃の温度を維持するように設定された冷凍庫内、及び記載されている他の条件で保管された試料について実施される。

【0309】

時間／温度：試料の体積にばらつきがあるため、調製可能なアリコートの具体的な個数は不明であるが、これを検証アッセイレポートで報告する。最小安定性評価は、以下の表６に示されているような間隔で準備される。

【0310】

【表6】

【0311】

冷凍－解凍（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ：ＦＴ）サイクルは、冷凍された試料を完全に解凍し（冷凍庫からの１５分以上の取り出し、及び試料の外見が完全に液体状態であることを目視で判断）、続いて試料を冷凍庫に６時間戻し、その後再び解凍して分析を実施することとして定義される。３回のＦＴサイクルを実施する。

【0312】

試料を、上述の間隔それぞれにおいて二重に分析する。平均応答、ＳＤ、及び％ＣＶを報告する。各レベルでのパフォーマンスを、最初の分析の結果から得られた平均応答と比較する。最初の分析からの％相対誤差（％ＲＥ）を計算する。許容基準は±３０％ＲＥとして定義される。

【0313】

統計的分析
負の閾値の決定を以下のように実施する。生物学的外れ値を、Ｔｕｋｅｙの箱ひげ図１を用いて特定する。第１四分位、第３四分位、四分位範囲又はＩＱＲ（第３四分位－第１四分位）、上部フェンス（第３四分位＋ｋ＊ＩＱＲ）、及び下部フェンス（第１四分位－ｋ＊ＩＱＲ）を計算する。定数ｋは３に等しいものとして定義される。生物学的外れ値を、負の閾値の決定の更なる計算から除外する。

【0314】

全ての結果からの、排除されなかったデータをプールする。正規性の分散を、Ｓｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ試験又はＡｎｄｅｒｓｏｎ－Ｄａｒｌｉｎｇ試験といった適切な統計検定を用いて分析する。John W. Tukey, Journal of Computational and Graphical Statistics, 1993, 2:1-33 and Shapiro, S.S. and Wilk, M.B., Biometrika, 1965, 52(3-4): 591-611を参照、Anderson, T.W. and Darling, D.A., A Test of Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association, 1954, 49(268):765-769を参照。

【0315】

データ分布が正規分布である場合、α＝０．０５のパラメトリックアプローチを使用する：
負の閾値の決定＝平均正規化応答＋１．６４６×ＳＤ

【0316】

データ分布が非正規分布である場合、ノンパラメトリックアプローチを使用する：
負の閾値の決定＝データの９５パーセンタイル

【0317】

フローサイトメトリー細胞分析の許容基準は、以下の通りである。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）、及びハーフピーク％ＣＶを、ＡＣＥ－２染色済み細胞、及びネガティブ染色対照の両方について報告する。許容範囲は、細胞の解凍から４８時間以内の最初の細胞継代において収集されたデータから計算される。許容可能なＭＦＩ範囲は、以下のように計算される：

【数3】

【0318】

ここで％ＣＶ_ｈｐは、フローサイトメーター機器からの半ピーク％ＣＶとして定義される。他の間隔で実施された全ての分析が、ＡＣＥ－２染色済み細胞、及びネガティブ染色対照の両方について、この計算から確立されるＭＦＩ範囲内に収まる必要がある。

【0319】

実施例３：血漿中のＳＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を検出するための、ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ ｖ．１アッセイの使用
この実施例は、血漿と本発明のＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ ｖ．１アッセイとの適合性を実証する。

【0320】

図１１Ａ～Ｃは、異なる希釈率の３人の対象の血漿及び血清におけるルシフェラーゼ活性を示す。３人のＣＯＶＩＤ－１９回復期の個体からの血漿及び血清を、５６℃で３０分間熱不活化した。続いて連続希釈物を調製し、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴと共に室温で３０分間インキュベートした後、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ１／ＤＰＳ２単層上に重ねた。およそ２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。これらの図は、血漿と血清との間でウイルス中和力価が同等であることを示す。

【0321】

段階的な濃度の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗体ｍＡｂ１０９１４を含有する、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血漿（熱不活化されていない）を、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ｖ１．０（ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ）と混合した。室温で３０分のインキュベーションの後、血漿／ウイルス混合物をＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／ＤＳＰ２単層上に重ねた。およそ２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。図１１Ｄに示されているように、段階的濃度の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗体ｍＡｂ１０９１４の、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血漿への添加は、このアッセイで使用されるＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ｖ．１．０ウイルス（ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ）をブロックする、用量依存的な能力を示した。

【0322】

別の実験では、ＣＯＶＩＤ－１９回復期の個体（ＮＬ１）からの、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血漿又は血漿の希釈物を、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ｖ．１．０ウイルス（ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ）と混合した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、血漿／ウイルス混合物をＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／ＤＳＰ２細胞単層上に重ねた。およそ２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。図１１Ｅに示されているように、ＣＯＶＩＤ－１９回復期血漿は、このアッセイにおいてウイルス及びルシフェラーゼ活性をブロックできた。熱不活化（５６℃、３０分）された血漿試料、及び－熱不活化されていない血漿試料の両方を試験し、これらはアッセイへの適合性を示したものの、熱不活化されていない試料はより高いバックグラウンドを示した。

【0323】

血漿試料に対する熱不活化の影響も調査した。一方のアリコートは氷上で保管され、もう一方は５６℃で３０分間インキュベートされた。血漿は熱凝集するため、試料をアッセイで使用する前に遠心分離によって清澄化した。次に各アリコートをＯｐｔｉＭＥＭ中で希釈し、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴと混合して、最終希釈率を１：８０、１：１６０、１：３２０、１：６４０、１：１２８０、及び１：２５６０とした。室温で３０分間のインキュベーションの後、ウイルス／血漿混合物をＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層上に重ねた。およそ２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図１１Ｆに示す。熱不活化が血漿試料の中和能力に及ぼす影響は、血清試料に比べて少ないようである。一部の血漿試料では、熱不活化は、ボーダーライン試料の感度の低下につながる。

【0324】

実施例４：唾液中のＳＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を検出するための、ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ ｖ．１アッセイの使用
プールされていたヒト唾液に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗体ｍＡｂ１０９１４をスパイクすることによって、唾液とＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ ｖ．１アッセイとの適合性を実証した。具体的には、ＣＯＶＩＤパンデミックの前の個体から調製された、プールされていた唾液に、段階的濃度（ＱＣ－Ｈｉｇｈ、Ｍｉｄ、及びＬｏｗ）のｍＡｂ１０９１４をスパイクした。唾液の使用に関連する細菌汚染を防止するために、全ての唾液試料に、抗生物質／抗真菌剤（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ：Ａｂ／Ａｍ）混合物をスパイクし、ＯｐｔｉＭＥＭ中で最終濃度１：６．２５まで希釈し、Ａｂ／Ａｍを含有するＯｐｔｉＭＥＭで事前に湿潤させた０．２２μｍフィルタを通してろ過した。唾液中のＡｂ／Ａｍ成分の最終濃度は、以下の通りであった：アンピシリン ０．２ｍｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン硫酸塩 ０．１ｍｇ／ｍＬ、アムホテリシンＢ ４μｇ／ｍＬ。ろ過によって阻害性抗体が唾液試料から除去されないことを保証するために、Ａｂ／Ａｍの添加又はろ過の前にｍＡｂ１０９１４を加えることによって、様々な濃度のｍＡｂ１０９１４を伴う人工陽性対照試料を調製した。

【0325】

ろ過された試料をＯｐｔｉＭＥＭ中で更に連続希釈した後、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ｖ．１．０ウイルス（ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ）と混合した。室温で３０分のインキュベーションの後、唾液／ウイルス混合物をＶｅｒｏ－ＤＳＰ１／Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ２単層上に重ねた。およそ２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ここで示された、希釈率１：１００のウイルスとの混合後の試料中のｍＡｂ１０９１４の濃度は：２μｇ／ｍＬ（ＱＣ－Ｈｉｇｈ）、０．６μｇ／ｍＬ（ＱＣ－Ｍｉｄ）、及び０．４μｇ／ｍＬ（ＱＣ－Ｌｏｗ）であった。高い唾液濃度では、試料の干渉が観察された。

【0326】

図１２で実証されているように、ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ ｖ．１アッセイは、唾液試料を用いた場合に良好に機能する。

【0327】

実施例５：ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶアッセイｖ．２の開発
図１３Ａに示されているように、ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶアッセイのバージョン２（ｖ．２）は、ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質の代わりにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質をコードする組換えＶＳＶ（例えばＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ、又はＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ）を、レポーター遺伝子（例えばホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２／Ｆｌｕｃ）遺伝子又はガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）遺伝子）に加えて使用する。ウイルス自体がレポーターをコードするため、Ｖｅｒｏ－ＤＳＰ細胞はこのアッセイではもはや使用されない。このアッセイの原理は、以下の通りである：組換えウイルス（ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－ｌｕｃ又はＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ｌｕｃ）はＶｅｒｏ細胞に感染し、ルシフェラーゼ遺伝子を送達し、これが細胞にルシフェラーゼタンパク質を作成させる。ルシフェラーゼの存在は、例えばＦｌｕｃのためのｄ－ルシフェリン（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗｗｗ．ｇｏｌｄｂｉｏ．ｃｏｍで入手可能）又はｇＬｕｃのためのセレンテラジン（Ｃａｔ．＃３０３１、ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ｎａｎｏｌｉｇｈｔ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ－ｉｎ－ｖｉｖｏ／）といった基質を用いて検出できる。ガウシアルシフェラーゼは、ＡＴＰ非依存性反応の基質としてセレンテラジンを使用する、分泌型のルシフェラーゼである。

【0328】

ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶアッセイｖ．２では、血清又は血漿試料をウイルス（例えばＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－ｌｕｃ又はＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ｌｕｃ）と共にインキュベートし、次にこの混合物を、Ｖｅｒｏ細胞（若しくは他の感受性細胞）と組み合わせるか、又はその上に重ねる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－中和抗体の不在下では、ウイルスは細胞に感染し、レポーター（例えばルシフェラーゼ）活性が検出される。試験用試料がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－中和抗体を含有する場合、ウイルス感染は阻害され、レポーター（例えばルシフェラーゼ）活性が低下する。プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清／血漿、又は単独の血清／血漿、又は段階的濃度の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクモノクローナル抗体ｍＡｂ１０９１４と混合された血清／血漿といった対照を用いて、中和応答のレベルを定量化する。ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶアッセイｖ．２のワークフローを図１３Ｂに示す。

【0329】

図１４Ａに示されている実験は、ホタルルシフェラーゼの変異型Ｌｕｃ２バリアント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ７３８２２２）をコードするＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－Ｆｌｕｃを、プールされていた陰性血清（希釈率１：８０）、ＣＯＶＩＤ－１９回復期血清（希釈率１：８０）、又はプールされていた陰性血清（希釈率１：８０）を、１０、２、若しくは０．２μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４と混合したものと共にインキュベートした。室温で４５分間のインキュベーションの後、ウイルス／血清混合物をＶｅｒｏ細胞単層上に重ねた（別のインキュベーション時間は３０分であってもよい）。更に１８時間（より強いシグナルについては２４時間以上であってもよい）後、ｄ－ルシフェリン基質をウェルに加え、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）を測定した。図１４Ａに示されているように、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－Ｆｌｕｃウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞でルシフェラーゼの発現及び活性を誘導し、これはＣＯＶＩＤ－１９回復期血清及びｍＡｂ１０９１４によって用量依存的にブロックできる。

【0330】

図１４Ｂに示されている実験では、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清（希釈率１：８０）を、培地のみ（ウイルスなし）、又は単独の若しくは０．２若しくは２μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４がスパイクされたＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－ｇＬｕｃ（ウイルスストックの１：４８希釈物）と共に、インキュベートした。室温で３０分置いた後、ウイルス／血清混合物を、前日に黒色透明底９６ウェルプレート内に１ｅ４細胞／ウェルで播種したＶｅｒｏ－Ａｃｅ－２単層（Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞の生成については以下を参照）上に重ねた。更に２４時間後、ウェル内のルシフェラーゼ活性を測定した。ＴＥＣＡＮ（発光プレートリーダー）のインジェクターを用いて、セレンテラジン（５μＭストックを２０μＬ）を各ウェルに加え、ＴＥＣＡＮ（発光プレートリーダー）は基質を添加して、迅速に発光の測定へと進んだ。図１４Ｂに示されている結果は、プールされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清の存在下で（２４時間前に）ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－ｇＬｕｃに感染したＶｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞で、ルシフェラーゼ活性を検出できることを示している。ルシフェラーゼ活性は、プールされていた血清にｍＡｂ１０９１４を加えることによって低減できる。ｍＡｂ１０９１４はルシフェラーゼ活性を阻害できたが、阻害のレベルは、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－Ｆｌｕｃを用いて観察されたものよりもわずかに低かった。しかしながら、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－ｇＬｕｃの主な利点は、ｇＬｕｃ遺伝子がＦｌｕｃ遺伝子よりも大幅に小さいため、ｇＬｕｃ含有ウイルスの安定性及び製造性の向上をもたらすことができる点である。

【0331】

更なる実験は、ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶアッセイｖ．２の条件を最適化することを目的としたものであり、これは、Ｖｅｒｏ－αＨｉｓ、Ｖｅｒｏ－Ｅ６、又はＡｃｅ－２及び／若しくはＴＲＭＰＳＳ２を過剰発現する改変Ｖｅｒｏ細胞のいずれがアッセイで最も良好に機能するかを決定するステップを含んでいた。

【0332】

Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２及びＶｅｒｏ－ＴＲＭＰＳＳ２細胞の生成のために、Ａｃｅ－２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０３９９０２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０５１８３９）を含むプラスミドをＡＢＭから購入した（Ｃａｔ．＃１１１６７０１；ａｂｍｇｏｏｄ．ｃｏｍ／ＡＣＥ２－ＯＲＦ－Ｖｅｃｔｏｒ－１１１６７０１．ｈｔｍｌ＃Ａｃｅ２、及びＣａｔ．＃４７１４８０１１００００；ａｂｍｇｏｏｄ．ｃｏｍ／ＴＭＰＲＳＳ２－ＯＲＦ－Ｖｅｃｔｏｒ－４７１４８０１．ｈｔｍｌ＃４７１４８０１１００００）。Ａｃｅ－２及びＴＭＰＲＳＳ２を、レンチウイルスベクターにサブクローニングした。続いてＶｅｒｏ細胞に１つ以上のレンチウイルスベクターを形質導入し、Ｖｅｒｏ細胞を適切な選択用抗生物質で選択した。

【0333】

図１５Ａ～Ｂは、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞がＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶアッセイｖ．２において特に有効であることを実証している。図１５Ａに示されている実験では、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－Ｆｌｕｃ又は培地のみ（ウイルスなしの対照）を、２又は０．２μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４と混合された、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブの血清（希釈率１：８０）と共にインキュベートした。室温で３０分間のインキュベーションの後、ウイルス／血清混合物を細胞（Ｖｅｒｏ－αＨｉｓ、Ｖｅｒｏ－Ｅ６、又はＶｅｒｏ－Ａｃｅ－２）の単層上に重ねた。更に２６時間後、ｄ－ルシフェリン基質をウェルに加え、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）を測定した。図１５Ａに示されているように、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２及びＶｅｒｏ－αＨｉｓはいずれもアッセイで良好に機能し、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－中和抗体の不在下において、より高いルシフェラーゼシグナルを生成した。

【0334】

図１５Ｂに示されている実験では、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清（希釈率１：８０）を、単独の、又は０．２μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４がスパイクされた、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－ｇＬｕｃ（４８００ ＴＣＩＤ_５０／ウェル）と共にインキュベートした。室温で３０分間のインキュベーションの後、ウイルス／血清混合物を、前日に黒色透明底９６ウェルプレートに１ｅ４細胞／ウェルで播種されたＶｅｒｏ－αＨｉｓ、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２、又はＶｅｒｏ－Ａｃｅ－２／ＴＭＰＲＳＳ２細胞単層上に重ねた。更に２４時間後、ｄ－ルシフェリンを加えてから、ウェル内のルシフェラーゼ活性を測定した。Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞及びＶｅｒｏ－Ａｃｅ２／ＴＭＰＲＳＳ２細胞はいずれも、同様に高いレベルのルシフェラーゼ活性を示したが、ルシフェラーゼシグナル、従ってウイルスは、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ２細胞株のみにおいてｍＡｂ１０９１４によって効果的に阻害された。

【0335】

図１６Ａ～Ｂに示されているように、細胞をウイルスと同時にプレーティングした場合、ルシフェラーゼシグナルは（細胞を事前にプレーティングした場合に比べて）大幅に低くなるものの、４時間の回復時間を与えると大幅に回復する。図１６Ａでは、ウイルスを、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清（１：８０）と共に室温で３０分間インキュベートした後、Ｖｅｒｏ細胞単層上に重ねるか、又は同等の密度でＶｅｒｏ細胞と混合した。細胞に重ねてから指定された時間だけ後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。図１６Ｂでは、ウイルスを、プールされていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２セロネガティブ血清（１：８０）と共に室温で３０分間インキュベートした後、４時間又は２４時間前にプレーティングされたＶｅｒｏ細胞単層上に重ねた。更に２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。

【0336】

図１７Ａ～Ｂに示されている実験は、ルシフェラーゼ活性に対する細胞密度及びウイルスＴＣＩＤ_５０の影響を試験した。ウイルスをＯｐｔｉＭＥＭ中で希釈して、１ウェルあたり指定されたＴＣＩＤ_５０とし、前日に指定された細胞／ウェルでプレーティングされたＶｅｒｏ細胞単層上に重ねた。更に１６、２０、及び２４時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。図１７Ａのデータは、２４時間からのものである。図１７Ａは、ルシフェラーゼ活性が細胞密度の上昇と共に上昇することを示している。図１７Ｂは、ルシフェラーゼ活性がウイルス量／ウェルの増大と共に上昇することを示している。

【0337】

図１８に示されているように、ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶアッセイｖ．２は高感度であるため、弱い中和抗体応答の検出が可能であり、またＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－Ｆｌｕｃの用量依存性阻害を示す。ウイルスを、段階的な濃度のｍＡｂ１０９１４を含有するプールされていた陰性血清と共に、室温で３０分間インキュベートした。続いてウイルス／血清混合物をＶｅｒｏ細胞単層上に重ねた。更に２４時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。

【0338】

【表7】

【0339】

図１９は、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－Ｆｌｕｃに感染したＶｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞の、ｄ－ルシフェリン添加後のＦｌｕｃ活性の動態曲線を示す。Ｆｌｕｃは瞬間的な動態を示すため、予想ピーク発光シグナルは、ウェルへのｄ－ルシフェリンの添加の０．５秒後であると予想される。これは図１９に示されているように、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－Ｆｌｕｃ感染Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞について、真であると確認された。この実験のために、Ｖｅｒｏ－Ａｃｅ－２細胞単層（感染の前日に１ｅ４細胞／ウェルで播種）に、４８００ ＴＣＩＤ_５０単位のＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Δ１９ＣＴ－Ｆｌｕｃを感染させた。２４時間後に、インジェクターを取り付けたＴＥＣＡＮ機器（発光プレートリーダー）にプレートを装入した。インジェクターを、所望量の基質（ｄ－ルシフェリンの３．７５ｍｇ／ｍＬ溶液、この実験では２０μＬ）を各ウェルに注入するようにプログラムし、０．５秒後に発光を読み取った（１０００ｍｓの積分時間）。更なるルシフェラーゼの読み取りを５秒ごとに３分間にわたって実施して、ルシフェラーゼ活性の動態曲線を生成した（２回の読み取りを実施、９秒（矢印）にｄ－ルシフェリンを添加（ウェル中での最終濃度０．４４ｍｇ／ｍＬ）、更なる読み取りは３分間実施された）。予想されたように、活性はｄ－ルシフェリンの添加後すぐ（０．５秒後）にピークに達した。

【0340】

参考文献
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Zhao J et al Recovery from the Middle East respiratory syndrome is associated with antibody and T-cell responses (2017). Sci Immunol 2:5393.

【0341】

実施例６：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントの生成
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質変異体を、Ｃ末端の１９個のアミノ酸をコードするヌクレオチドの欠失（Ｓ－Δ１９ＣＴ）によって、ヒトコドン最適化及び合成した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のこれらのバリアントを、制限部位ＭｌｕＩ及びＮｈｅＩを用いて、ＶＳＶゲノムをコードするプラスミドにクローニングした。プラスミドを配列検証し、ＢＨＫ－２１細胞での感染性ウイルスのレスキューに使用した。ＶＳＶ－Ｇは、レスキューを促進するためにＢＨＫ－２１細胞に同時にトランスフェクトされたが、ウイルスの後続の継代には存在しなかった。

【0342】

【表8-1】

【表8-2】

【表8-3】

【表8-4】

【0343】

【表9】

【0344】

実施例７：乾燥血斑（ＤＢＳ）サンプリングのための試料収集キット
標準的な乾燥血斑（ＤＢＳ）収集手順の非限定的な例を、以下に記載されているように実施した。ＤＢＳサンプリングのための試料収集キットは、試料の収集を実施するために必要な全ての構成要素を内包している。

【0345】

ＤＢＳ収集手順のために、以下のステップを実施した：
１．血斑収集カードを収集のために準備した：
ａ．血斑収集カードは、Ｗｈａｔｍａｎ ９０３（商標）ろ紙を含んでおり、ペーパーカバーで保護されていた。
ｂ．カードのろ紙部分を露出したまま保持するために、カバーを折り曲げて折り目を付けた。
ｃ．収集を自分で実施する場合、露出したろ紙がテーブルから突き出した状態で、カードをテーブルの縁にテープで留めた。
２．試料収集部位をアルコールプレップパッドで拭き、皮膚を約３０秒間乾燥させた。
ａ．推奨される収集部位は、好ましい指の指先付近の腹であった。
３．接触作動式ランセット（ＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）、Ｒｅｆ＃：３６６５９４）を、推奨されるランセットとして提供した。
ａ．青色接触作動式ランセットは「高流量」とみなされ、１４ゲージの針、又は１．５ｍｍ幅の刃を備え、穿刺深さは２．０ｍｍであった。
ｂ．青色の、ねじって外すタイプのカバーがあり、これを取り外すことでランセットを作動させた。
ｃ．カバーを取り外して、ランセットの作動エリアを収集部位にしっかりと押し付け、小さな穿刺を得た。
４．（キットに含まれている）正方形のガーゼを用いて、血液の最初の１滴を拭き取った。
５．その後、指先の血液の滴を、５つの円が印刷されたろ紙に落とした。印刷された５つの円を含むＤＢＳ収集カードの説明は、図２０で提供される。
６．可能な場合、５つの円全てを試料で完全に満たした。指はカードに直接触れなかったが、大きな血液の滴が自然にカードに落下しなかった場合には、滴が紙に触れた（ただし指で紙に触れることは回避された）。
７．カードの円が満たされた後、ガーゼパッドを用いて収集部位を圧迫して出血を遅延／停止させ、その後、付属のバンドエイドを貼り付けた。
８．収集カードを開いたまま乾燥させた。乾燥後、試料を分析実験室へと出荷した。
ａ．乾燥血斑収集に関するＣＤＣの推奨事項は、出荷前に試料を３時間乾燥させることである。
ｂ．収集カードは、乾燥後、室温（７５°Ｆ以下、２４℃以下）で、又は冷蔵条件（３４～４６°Ｆ、２～８℃）で保管してよい。極端な高温条件又は直射日光下での保管は避けること。
ｃ．試料は収集から３日以内に出荷され、収集日から２週間以内に受領された。

【0346】

実施例８：ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ Ｖ２血斑アッセイ試料分析プロトコル
本実施例は、ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ Ｖ２血斑アッセイのセットアップ及び血斑アッセイのマップを提供し、これらは乾燥血斑アッセイ試料分析のプロトコルを説明するものである。具体的には、この手順は、１：４から始まって１：１２８の希釈率まで連続して２倍に希釈する６個の希釈率を用いた、６つの血斑試料のアッセイを説明する。様々な血斑試料希釈率を示す例示的な血斑アッセイマップを、Ｕウェル（又はＵ底）プレート（図２３）及びアッセイプレート（図２４）について説明する。

【0347】

以下は、本手順の実施に必要であった試薬のリストである：
ＶＳＶ－ＳＡＲＳ２－Ｆｌｕｃ
ＯｐｔｉＭＥＭ
ｍＡｂ１０９１４
ｍＡｂ１０９２２
プールされていた陰性血清
Ｄ－ルシフェリン

【0348】

ＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ Ｖ２血斑アッセイのセットアップのために、以下のステップを実施した：
細胞を、本開示のＩＭＭＵＮＯ－ＣＯＶ Ｖ２細胞準備手順に従って播種した。アッセイに使用する１６～２４時間前に細胞を播種した。
１．乾燥血斑（ＤＢＳ）試料の処理を、アッセイのプレーティングの開始のおよそ１．５時間前に開始した。
２．各ＤＢＳ試料について、１／４インチ（６ｍｍ）孔のパンチを用いて、適切なラベルを付けられた１．７ｍＬ微量遠心分離チューブに１つのパンチ／スポットを打ち込んだ。打ち込む際には、打ち抜き位置が、サンプリングされるろ紙の全領域に毛細血管全血が飽和している場所から取られていることを確実にするために、血斑収集カードを裏から見た。
３．全ての試料のパンチをチューブに入れた後、４００μＬのＯｐｔｉＭＥＭを各試料チューブに加えた。ＤＢＳサンプリングの明確化のために、６ｍｍのスポットそれぞれに対して使用されるアッセイ推奨最小体積である２００μＬを用いて、抽出を実施した。本発明の抽出では４００μＬを使用したため、これは１：２希釈とみなされ、ウイルスとの混合後に１：４の開始時希釈率が得られた。これにより、後のステップでＵ底プレートに２４０μＬの溶離液を移すために十分な体積が提供された。
４．チューブを、４５０ｒｐｍで振盪する設定のプレートシェーカー上で、室温で１時間インキュベートした。
５．１時間のインキュベーションの後、マイクロピペットを用いて上清を新たなチューブに移した。ろ紙パンチをピペット先端で側方に押し、抽出された全血溶離液を簡単に回収した。
６．血斑溶離液をサンプリングする前に短時間の遠心分離ステップ（１０００×ｇ、約３０秒）を実施することにより、アッセイのセットアップ中にＵ底プレートに小さなろ紙の破片が移される頻度を低減した。
７．１２０μＬのＯｐｔｉＭＥＭを、図２３に示されているようなプレートレイアウトマップに従って灰色の網掛けで示されているＵ底懸濁液９６ウェル培養プレートに入れた。
８．１０μＬのｍＡｂ１０９１４ストックを９８μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中で希釈することによって、ｍＡｂ１０９１４抗体のワーキングストックを０．μｇ／μＬで調製した。このワーキングストックをピペッティングによって混合した。
９．ＳＴ１（標準）を、以下のようにして１．６μｇ／ｍＬのｍＡｂ１０９１４（ウイルス添加後に０．８μｇ／ｍＬ）で調製した：
２つのプレートについて：９．６μＬのｍＡｂ１０９１４のワーキングストックを５９０．４μＬのＯｐｔｉＭＥＭと組み合わせた。
１０．５μＬのｍＡｂ１０９２２ストックを２４５μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中で希釈することによって、ｍＡｂ１０９２２抗体のワーキングストックを、０．０１μｇ／μＬで調製した。このワーキングストックをピペッティングによって混合した。
１１．アッセイ対照（ＮＣ、陰性対照；ＰＣ、陽性対照）を以下のように調製し、ピペッティングによって混合した：

【0349】

【0350】

１２．１２０μＬの対照を、プレートレイアウトマップ（図２３）に従ってＵ底プレートに加えた。
１３．２４０μＬのＳＴ１を、プレートレイアウトマップ（図２３）の、ＳＴ１とラベルが付けられたウェルに加えた。
１４．２４０μＬの血斑試料溶離液を、プレートレイアウトマップ（図２３）に従って試料ウェルＡ１、Ｂ１、Ｃ１、及びＡ７、Ｂ７、Ｃ７に加えた。
１５．６点２倍連続希釈を以下のように実施した：
１２０μＬをカラム１ウェルからカラム２ウェルに移し、ピペッティングによって混合した。
１２０μＬをカラム２ウェルからカラム３ウェルに移し、ピペッティングによって混合した。
１２０μＬをカラム３ウェルからカラム４ウェルに移し、ピペッティングによって混合した。
１２０μＬをカラム４ウェルからカラム５ウェルに移し、ピペッティングによって混合した。
１２０μＬをカラム５ウェルからカラム６ウェルに移し、ピペッティングによって混合した。
カラム６ウェルから１２０μＬを廃棄した。
全プロセスを、プレートの右側の試料Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６（カラム７～１２；ＮＣ、ＰＯＳ、又は培地対照は希釈されていなかった）について繰り返した。
１６．ウイルスを解凍した。完全に解凍された後、ウイルスを氷上で保管した。
１７．ウイルスを６０００ｐｆｕ／ｍＬまで希釈した。
希釈に必要な実際のＯｐｔｉＭＥＭの体積は、ウイルスのロット及び力価に基づいて、以下の表を用いて計算できる：

【0351】

【0352】

１８．１２０μＬの調製されたウイルスを、Ｕウェルプレートの全てのウェルに加え、ピペッティングによって混合した。
１９．プレートを室温で３０～４５分間インキュベートした。
２０．１００μＬの試料をＵ底プレートに移し、アッセイプレートレイアウトマップ（図２４）に従って細胞を二重にプレーティングした。細胞を、３７℃／５％ＣＯ_２インキュベーター内に入れた。
２１．試料を細胞に重ねてから２４～２８時間時間後に、ルシフェラーゼ活性を以下のように読み取った：
ａ．１５ｍｇ／ｍＬのｄ－ルシフェリンをＤＰＢＳ中で１：１０に（１．５ｍｇ／ｍＬまで）希釈した。非限定的な例として、１５ｍｇ／ｍＬのｄ－ルシフェリン１ｍＬを９ｍＬのＤＰＢＳと組み合わせた。混合は倒置によって実施した。複数のプレート／アッセイからルシフェラーゼを同時に読み取る場合、希釈された（１．５ｍｇ／ｍＬの）ｄ－ルシフェリンをより多量に調製することが許容されていた。
ｂ．１２チャンネルの電子ピペット又は手動ピペットを用いて、１．５ｍｇ／ｍＬのｄ－ルシフェリンを５０μＬ、アッセイプレートの各ウェルに加えた。ｄ－ルシフェリンは、行の順番（即ちＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）で加えられた。ｄ－ルシフェリンを行に加えるタイミングは、各行の間が４～８秒となるものであった。
ｃ．プレートをＴＥＣＡＮに１枚ずつ入れ、適切なプログラムを用いて読み取った。プレート読み取りの開始は、ｄ－ルシフェリンを細胞プレートの最後の行に加えてから１分以内に発生した。
アッセイを報告し、報告者の詳細及び日付を記録した。

【0353】

非限定的な例として、血斑の抽出は、ＯｐｔｉＭＥＭ又はＰＢＳＴを用いて実施された。ＯｐｔｉＭＥＭ条件の場合、ＯｐｔｉＭＥＭはアッセイにおいて、最初は１：２の希釈率であり（適切な溶出、ウイルスでの希釈時に１：２）、ＰＢＳＴは最初は１：１０の希釈率であった（ウイルス添加後に１：１０）。図２１は、上述の方法に従って様々な試料希釈率にわたってＯｐｔｉＭＥＭを用いて血斑を抽出することで生成された、％相対ルシフェラーゼ応答の例の、概要のグラフを示す。

【0354】

概念実証実験により、血斑マトリックスが、マトリックスの１；２０の希釈率において、完全な適合性を有することが実証された（図２２Ａ～Ｂ）。試験された血斑試料において、細胞の健康状態又はウイルス感染性に関して大きな問題は見られなかった。

【0355】

配列
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全長Ｓ糖タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１；バリアント１及びバリアント４；ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００９７２４３９０．１；Ｓ１サブユニットには下線が付されている；ＲＢＤ部位は太字で示されている）

【0356】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全長Ｓ糖タンパク質のコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号２；バリアント１及びバリアント４）
atgttcgtcttcctggtcctgctgcctctggtctcctcacagtgcgtcaatctgacaactcggactcagctgccacctgcttatactaatagcttcaccagaggcgtgtactatcctgacaaggtgtttagaagctccgtgctgcactctacacaggatctgtttctgccattctttagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgagcggcaccaatggcacaaagcggttcgacaatcccgtgctgccttttaacgatggcgtgtacttcgcctctaccgagaagagcaacatcatcagaggctggatctttggcaccacactggactccaagacacagtctctgctgatcgtgaacaatgccaccaacgtggtcatcaaggtgtgcgagttccagttttgtaatgatcccttcctgggcgtgtactatcacaagaacaataagagctggatggagtccgagtttagagtgtattctagcgccaacaactgcacatttgagtacgtgagccagcctttcctgatggacctggagggcaagcagggcaatttcaagaacctgagggagttcgtgtttaagaatatcgacggctacttcaaaatctactctaagcacacccccatcaacctggtgcgcgacctgcctcagggcttcagcgccctggagcccctggtggatctgcctatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacccggcgactcctctagcggatggaccgccggcgctgccgcctactatgtgggctacctccagccccggaccttcctgctgaagtacaacgagaatggcaccatcacagacgcagtggattgcgccctggaccccctgagcgagacaaagtgtacactgaagtcctttaccgtggagaagggcatctatcagacatccaatttcagggtgcagccaaccgagtctatcgtgcgctttcctaatatcacaaacctgtgcccatttggcgaggtgttcaacgcaacccgcttcgccagcgtgtacgcctggaataggaagcggatcagcaactgcgtggccgactatagcgtgctgtacaactccgcctctttcagcacctttaagtgctatggcgtgtcccccacaaagctgaatgacctgtgctttaccaacgtctacgccgattctttcgtgatcaggggcgacgaggtgcgccagatcgcccccggccagacaggcaagatcgcagactacaattataagctgccagacgatttcaccggctgcgtgatcgcctggaacagcaacaatctggattccaaagtgggcggcaactacaattatctgtaccggctgtttagaaagagcaatctgaagcccttcgagagggacatctctacagaaatctaccaggccggcagcaccccttgcaatggcgtggagggctttaactgttatttcccactccagtcctacggcttccagcccacaaacggcgtgggctatcagccttaccgcgtggtggtgctgagctttgagctgctgcacgccccagcaacagtgtgcggccccaagaagtccaccaatctggtgaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcacaggcgtgctgaccgagtccaacaagaagttcctgccatttcagcagttcggcagggacatcgcagataccacagacgccgtgcgcgacccacagaccctggagatcctggacatcacaccctgctctttcggcggcgtgagcgtgatcacacccggcaccaatacaagcaaccaggtggccgtgctgtatcaggacgtgaattgtaccgaggtgcccgtggctatccacgccgatcagctgaccccaacatggcgggtgtacagcaccggctccaacgtcttccagacaagagccggatgcctgatcggagcagagcacgtgaacaattcctatgagtgcgacatcccaatcggcgccggcatctgtgcctcttaccagacccagacaaactctcccagaagagcccggagcgtggcctcccagtctatcatcgcctataccatgtccctgggcgccgagaacagcgtggcctactctaacaatagcatcgccatcccaaccaacttcacaatctctgtgaccacagagatcctgcccgtgtccatgaccaagacatctgtggactgcacaatgtatatctgtggcgattctaccgagtgcagcaacctgctgctccagtacggcagcttttgtacccagctgaatagagccctgacaggcatcgccgtggagcaggataagaacacacaggaggtgttcgcccaggtgaagcaaatctacaagaccccccctatcaaggactttggcggcttcaatttttcccagatcctgcctgatccatccaagccttctaagcggagctttatcgaggacctgctgttcaacaaggtgaccctggccgatgccggcttcatcaagcagtatggcgattgcctgggcgacatcgcagccagggacctgatctgcgcccagaagtttaatggcctgaccgtgctgccacccctgctgacagatgagatgatcgcacagtacacaagcgccctgctggccggcaccatcacatccggatggaccttcggcgcaggagccgccctccagatcccctttgccatgcagatggcctataggttcaacggcatcggcgtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaatcagtttaactccgccatcggcaagatccaggacagcctgtcctctacagccagcgccctgggcaagctccaggatgtggtgaatcagaacgcccaggccctgaataccctggtgaagcagctgagcagcaacttcggcgccatctctagcgtgctgaatgacatcctgagccggctggacaaggtggaggcagaggtgcagatcgaccggctgatcaccggccggctccagagcctccagacctatgtgacacagcagctgatcagggccgccgagatcagggccagcgccaatctggcagcaaccaagatgtccgagtgcgtgctgggccagtctaagagagtggacttttgtggcaagggctatcacctgatgtccttccctcagtctgccccacacggcgtggtgtttctgcacgtgacctacgtgcccgcccaggagaagaacttcaccacagcccctgccatctgccacgatggcaaggcccactttccaagggagggcgtgttcgtgtccaacggcacccactggtttgtgacacagcgcaatttctacgagccccagatcatcaccacagacaacaccttcgtgagcggcaactgtgacgtggtcatcggcatcgtgaacaataccgtgtatgatccactccagcccgagctggacagctttaaggaggagctggataagtatttcaagaatcacacctcccctgacgtggatctgggcgacatcagcggcatcaatgcctccgtggtgaacatccagaaggagatcgaccgcctgaacgaggtggctaagaatctgaacgagagcctgatcgacctccaggagctgggcaagtatgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgatcgccatcgtgatggtgaccatcatgctgtgctgtatgacatcctgctgttcttgcctgaagggctgctgtagctgtggctcctgctgtaagtttgacgaggatgactctgaacctgtgctgaagggcgtgaagctgcattacacctaa

【0357】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Δ１９ＣＴ Ｓ糖タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３；バリアント２；Ｓ１サブユニットには下線が付されている；ＲＢＤ部位は太字で示されている）

【0358】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Δ１９ＣＴ Ｓ糖タンパク質のコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号４；バリアント２）
atgttcgtcttcctggtcctgctgcctctggtctcctcacagtgcgtcaatctgacaactcggactcagctgccacctgcttatactaatagcttcaccagaggcgtgtactatcctgacaaggtgtttagaagctccgtgctgcactctacacaggatctgtttctgccattctttagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgagcggcaccaatggcacaaagcggttcgacaatcccgtgctgccttttaacgatggcgtgtacttcgcctctaccgagaagagcaacatcatcagaggctggatctttggcaccacactggactccaagacacagtctctgctgatcgtgaacaatgccaccaacgtggtcatcaaggtgtgcgagttccagttttgtaatgatcccttcctgggcgtgtactatcacaagaacaataagagctggatggagtccgagtttagagtgtattctagcgccaacaactgcacatttgagtacgtgagccagcctttcctgatggacctggagggcaagcagggcaatttcaagaacctgagggagttcgtgtttaagaatatcgacggctacttcaaaatctactctaagcacacccccatcaacctggtgcgcgacctgcctcagggcttcagcgccctggagcccctggtggatctgcctatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacccggcgactcctctagcggatggaccgccggcgctgccgcctactatgtgggctacctccagccccggaccttcctgctgaagtacaacgagaatggcaccatcacagacgcagtggattgcgccctggaccccctgagcgagacaaagtgtacactgaagtcctttaccgtggagaagggcatctatcagacatccaatttcagggtgcagccaaccgagtctatcgtgcgctttcctaatatcacaaacctgtgcccatttggcgaggtgttcaacgcaacccgcttcgccagcgtgtacgcctggaataggaagcggatcagcaactgcgtggccgactatagcgtgctgtacaactccgcctctttcagcacctttaagtgctatggcgtgtcccccacaaagctgaatgacctgtgctttaccaacgtctacgccgattctttcgtgatcaggggcgacgaggtgcgccagatcgcccccggccagacaggcaagatcgcagactacaattataagctgccagacgatttcaccggctgcgtgatcgcctggaacagcaacaatctggattccaaagtgggcggcaactacaattatctgtaccggctgtttagaaagagcaatctgaagcccttcgagagggacatctctacagaaatctaccaggccggcagcaccccttgcaatggcgtggagggctttaactgttatttcccactccagtcctacggcttccagcccacaaacggcgtgggctatcagccttaccgcgtggtggtgctgagctttgagctgctgcacgccccagcaacagtgtgcggccccaagaagtccaccaatctggtgaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcacaggcgtgctgaccgagtccaacaagaagttcctgccatttcagcagttcggcagggacatcgcagataccacagacgccgtgcgcgacccacagaccctggagatcctggacatcacaccctgctctttcggcggcgtgagcgtgatcacacccggcaccaatacaagcaaccaggtggccgtgctgtatcaggacgtgaattgtaccgaggtgcccgtggctatccacgccgatcagctgaccccaacatggcgggtgtacagcaccggctccaacgtcttccagacaagagccggatgcctgatcggagcagagcacgtgaacaattcctatgagtgcgacatcccaatcggcgccggcatctgtgcctcttaccagacccagacaaactctcccagaagagcccggagcgtggcctcccagtctatcatcgcctataccatgtccctgggcgccgagaacagcgtggcctactctaacaatagcatcgccatcccaaccaacttcacaatctctgtgaccacagagatcctgcccgtgtccatgaccaagacatctgtggactgcacaatgtatatctgtggcgattctaccgagtgcagcaacctgctgctccagtacggcagcttttgtacccagctgaatagagccctgacaggcatcgccgtggagcaggataagaacacacaggaggtgttcgcccaggtgaagcaaatctacaagaccccccctatcaaggactttggcggcttcaatttttcccagatcctgcctgatccatccaagccttctaagcggagctttatcgaggacctgctgttcaacaaggtgaccctggccgatgccggcttcatcaagcagtatggcgattgcctgggcgacatcgcagccagggacctgatctgcgcccagaagtttaatggcctgaccgtgctgccacccctgctgacagatgagatgatcgcacagtacacaagcgccctgctggccggcaccatcacatccggatggaccttcggcgcaggagccgccctccagatcccctttgccatgcagatggcctataggttcaacggcatcggcgtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaatcagtttaactccgccatcggcaagatccaggacagcctgtcctctacagccagcgccctgggcaagctccaggatgtggtgaatcagaacgcccaggccctgaataccctggtgaagcagctgagcagcaacttcggcgccatctctagcgtgctgaatgacatcctgagccggctggacaaggtggaggcagaggtgcagatcgaccggctgatcaccggccggctccagagcctccagacctatgtgacacagcagctgatcagggccgccgagatcagggccagcgccaatctggcagcaaccaagatgtccgagtgcgtgctgggccagtctaagagagtggacttttgtggcaagggctatcacctgatgtccttccctcagtctgccccacacggcgtggtgtttctgcacgtgacctacgtgcccgcccaggagaagaacttcaccacagcccctgccatctgccacgatggcaaggcccactttccaagggagggcgtgttcgtgtccaacggcacccactggtttgtgacacagcgcaatttctacgagccccagatcatcaccacagacaacaccttcgtgagcggcaactgtgacgtggtcatcggcatcgtgaacaataccgtgtatgatccactccagcccgagctggacagctttaaggaggagctggataagtatttcaagaatcacacctcccctgacgtggatctgggcgacatcagcggcatcaatgcctccgtggtgaacatccagaaggagatcgaccgcctgaacgaggtggctaagaatctgaacgagagcctgatcgacctccaggagctgggcaagtatgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgatcgccatcgtgatggtgaccatcatgctgtgctgtatgacatcctgctgttcttgcctgaagggctgctgtagctgtggctcctgctgttaa

【0359】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ Ｇ ＣＴ糖タンパク質のアミノ酸配列（配列番号５；バリアント３；ＶＳＶ Ｇ細胞質尾部の配列は太字で下線を付して示されている）

【0360】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶ Ｇ ＣＴ糖タンパク質のコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号６；バリアント３；ＶＳＶ Ｇ細胞質尾部をコードする配列は大文字で示されている）
atgttcgtcttcctggtcctgctgcctctggtctcctcacagtgcgtcaatctgacaactcggactcagctgccacctgcttatactaatagcttcaccagaggcgtgtactatcctgacaaggtgtttagaagctccgtgctgcactctacacaggatctgtttctgccattctttagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgagcggcaccaatggcacaaagcggttcgacaatcccgtgctgccttttaacgatggcgtgtacttcgcctctaccgagaagagcaacatcatcagaggctggatctttggcaccacactggactccaagacacagtctctgctgatcgtgaacaatgccaccaacgtggtcatcaaggtgtgcgagttccagttttgtaatgatcccttcctgggcgtgtactatcacaagaacaataagagctggatggagtccgagtttagagtgtattctagcgccaacaactgcacatttgagtacgtgagccagcctttcctgatggacctggagggcaagcagggcaatttcaagaacctgagggagttcgtgtttaagaatatcgacggctacttcaaaatctactctaagcacacccccatcaacctggtgcgcgacctgcctcagggcttcagcgccctggagcccctggtggatctgcctatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacccggcgactcctctagcggatggaccgccggcgctgccgcctactatgtgggctacctccagccccggaccttcctgctgaagtacaacgagaatggcaccatcacagacgcagtggattgcgccctggaccccctgagcgagacaaagtgtacactgaagtcctttaccgtggagaagggcatctatcagacatccaatttcagggtgcagccaaccgagtctatcgtgcgctttcctaatatcacaaacctgtgcccatttggcgaggtgttcaacgcaacccgcttcgccagcgtgtacgcctggaataggaagcggatcagcaactgcgtggccgactatagcgtgctgtacaactccgcctctttcagcacctttaagtgctatggcgtgtcccccacaaagctgaatgacctgtgctttaccaacgtctacgccgattctttcgtgatcaggggcgacgaggtgcgccagatcgcccccggccagacaggcaagatcgcagactacaattataagctgccagacgatttcaccggctgcgtgatcgcctggaacagcaacaatctggattccaaagtgggcggcaactacaattatctgtaccggctgtttagaaagagcaatctgaagcccttcgagagggacatctctacagaaatctaccaggccggcagcaccccttgcaatggcgtggagggctttaactgttatttcccactccagtcctacggcttccagcccacaaacggcgtgggctatcagccttaccgcgtggtggtgctgagctttgagctgctgcacgccccagcaacagtgtgcggccccaagaagtccaccaatctggtgaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcacaggcgtgctgaccgagtccaacaagaagttcctgccatttcagcagttcggcagggacatcgcagataccacagacgccgtgcgcgacccacagaccctggagatcctggacatcacaccctgctctttcggcggcgtgagcgtgatcacacccggcaccaatacaagcaaccaggtggccgtgctgtatcaggacgtgaattgtaccgaggtgcccgtggctatccacgccgatcagctgaccccaacatggcgggtgtacagcaccggctccaacgtcttccagacaagagccggatgcctgatcggagcagagcacgtgaacaattcctatgagtgcgacatcccaatcggcgccggcatctgtgcctcttaccagacccagacaaactctcccagaagagcccggagcgtggcctcccagtctatcatcgcctataccatgtccctgggcgccgagaacagcgtggcctactctaacaatagcatcgccatcccaaccaacttcacaatctctgtgaccacagagatcctgcccgtgtccatgaccaagacatctgtggactgcacaatgtatatctgtggcgattctaccgagtgcagcaacctgctgctccagtacggcagcttttgtacccagctgaatagagccctgacaggcatcgccgtggagcaggataagaacacacaggaggtgttcgcccaggtgaagcaaatctacaagaccccccctatcaaggactttggcggcttcaatttttcccagatcctgcctgatccatccaagccttctaagcggagctttatcgaggacctgctgttcaacaaggtgaccctggccgatgccggcttcatcaagcagtatggcgattgcctgggcgacatcgcagccagggacctgatctgcgcccagaagtttaatggcctgaccgtgctgccacccctgctgacagatgagatgatcgcacagtacacaagcgccctgctggccggcaccatcacatccggatggaccttcggcgcaggagccgccctccagatcccctttgccatgcagatggcctataggttcaacggcatcggcgtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaatcagtttaactccgccatcggcaagatccaggacagcctgtcctctacagccagcgccctgggcaagctccaggatgtggtgaatcagaacgcccaggccctgaataccctggtgaagcagctgagcagcaacttcggcgccatctctagcgtgctgaatgacatcctgagccggctggacaaggtggaggcagaggtgcagatcgaccggctgatcaccggccggctccagagcctccagacctatgtgacacagcagctgatcagggccgccgagatcagggccagcgccaatctggcagcaaccaagatgtccgagtgcgtgctgggccagtctaagagagtggacttttgtggcaagggctatcacctgatgtccttccctcagtctgccccacacggcgtggtgtttctgcacgtgacctacgtgcccgcccaggagaagaacttcaccacagcccctgccatctgccacgatggcaaggcccactttccaagggagggcgtgttcgtgtccaacggcacccactggtttgtgacacagcgcaatttctacgagccccagatcatcaccacagacaacaccttcgtgagcggcaactgtgacgtggtcatcggcatcgtgaacaataccgtgtatgatccactccagcccgagctggacagctttaaggaggagctggataagtatttcaagaatcacacctcccctgacgtggatctgggcgacatcagcggcatcaatgcctccgtggtgaacatccagaaggagatcgaccgcctgaacgaggtggctaagaatctgaacgagagcctgatcgacctccaggagctgggcaagtatgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgatcgccatcgtgatggtgaccatcatgctgtgctgtatgAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGTAA

【0361】

変異型ＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質（Ｍ５１Ｒ）のアミノ酸配列（配列番号７）
MSSLKKILGLKGKGKKSKKLGIAPPPYEEDTSMEYAPSAPIDKSYFGVDERDTHDPNQLRYEKSFFTVKMTVRSNRPFRTYSDVAAAVSHWDHMYIGMAGKRPFYKILAFLGSSNLKATPAVLADQGQPEYHAHCEGRAYLPHRMGKTPPMLNVPEHFRRPFNIGLYKGTIELTMTIYDDESLEAAPMIWDHFNSSKFSDFREKALMFGLIVEEEASGAWVLDSVRHSKWASLASSF

【0362】

変異型ＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質（Ｍ５１Ｒ）のヌクレオチド配列（配列番号８）
ATGAGTTCCTTAAAGAAGATTCTCGGTCTGAAGGGGAAAGGTAAGAAATCTAAGAAATTAGGGATCGCACCACCCCCTTATGAAGAGGACACTAGCATGGAGTATGCTCCGAGCGCTCCAATTGACAAATCCTATTTTGGAGTTGACGAGCGAGACACCTATGATCCGAATCAATTAAGATATGAGAAATTCTTCTTTACAGTGAAAATGACGGTTAGATCTAATCGTCCGTTCAGAACATACTCAGATGTGGCAGCCGCTGTATCCCATTGGGATCACATGTACATCGGAATGGCAGGGAAACGTCCCTTCTACAAAATCTTGGCTTTTTTGGGTTCTTCTAATCTAAAGGCCACTCCAGCGGTATTGGCAGATCAAGGTCAACCAGAGTATCACGCTCACTGCGAAGGCAGGGCTTATTTGCCACATAGGATGGGGAAGACCCCTCCCATGCTCAATGTACCAGAGCACTTCAGAAGACCATTCAATATAGGTCTTTACAAGGGAACGATTGAGCTCACAATGACCATCTACGATGATGAGTCACTGGAAGCAGCTCCTATGATCTGGGATCATTTCAATTCTTCCAAATTTTCTGATTTCAGAGAGAAGGCCTTAATGTTTGGCCTGATTGTCGAGAAAAAGGCATCTGGAGCGTGGGTCCTGGACTCTATCGGCCACTTCAAATGA

【0363】

野生型ＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）
MSSLKKILGLKGKGKKSKKLGIAPPPYEEDTSMEYAPSAPIDKSYFGVDEMDTHDPNQLRYEKSFFTVKMTVRSNRPFRTYSDVAAAVSHWDHMYIGMAGKRPFYKILAFLGSSNLKATPAVLADQGQPEYHAHCEGRAYLPHRMGKTPPMLNVPEHFRRPFNIGLYKGTIELTMTIYDDESLEAAPMIWDHFNSSKFSDFREKALMFGLIVEEEASGAWVLDSVRHSKWASLASSF

【0364】

野生型ＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１０）
ATGAGTTCCTTAAAGAAGATTCTCGGTCTGAAGGGGAAAGGTAAGAAATCTAAGAAATTAGGGATCGCACCACCCCCTTATGAAGAGGACACTAGCATGGAGTATGCTCCGAGCGCTCCAATTGACAAATCCTATTTTGGAGTTGACGAGATGGACACCTATGATCCGAATCAATTAAGATATGAGAAATTCTTCTTTACAGTGAAAATGACGGTTAGATCTAATCGTCCGTTCAGAACATACTCAGATGTGGCAGCCGCTGTATCCCATTGGGATCACATGTACATCGGAATGGCAGGGAAACGTCCCTTCTACAAAATCTTGGCTTTTTTGGGTTCTTCTAATCTAAAGGCCACTCCAGCGGTATTGGCAGATCAAGGTCAACCAGAGTATCACGCTCACTGCGAAGGCAGGGCTTATTTGCCACATAGGATGGGGAAGACCCCTCCCATGCTCAATGTACCAGAGCACTTCAGAAGACCATTCAATATAGGTCTTTACAAGGGAACGATTGAGCTCACAATGACCATCTACGATGATGAGTCACTGGAAGCAGCTCCTATGATCTGGGATCATTTCAATTCTTCCAAATTTTCTGATTTCAGAGAGAAGGCCTTAATGTTTGGCCTGATTGTCGAGAAAAAGGCATCTGGAGCGTGGGTCCTGGACTCTATCGGCCACTTCAAATGA

【0365】

野生型ＶＳＶコザック配列（配列番号１１）
CACTATG

【0366】

最適化コザック配列（配列番号１２）
CACCATG

【0367】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイク（Ｓ）タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ５９５９４．１）
MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCSFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDRNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYVWLGFIAGLIAIVMVTILLCCMTSCCSCLKGACSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

【0368】

【0369】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（配列番号１３）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（配列番号１）からのスパイク（Ｓ）糖タンパク質配列の、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏ（１．２．４）多重配列整列

【0370】

Ｒｌｕｃ８ １５５－１５６ＤＳＰ１－７ルシフェラーゼ－ＧＦＰ融合タンパク質（配列番号１４；ウミシイタケルシフェラーゼ断片ａａ１～１５５には下線が付されている；リンカーは強調されていない；改変ＧＦＰの断片ａａ１～１５６は太字で示されている）

【0371】

Ｒｌｕｃ８１５５－１５６ＤＳＰ１－７構築物のヌクレオチド配列（配列番号１５；コーディングＯＲＦはｎｔ１０６８～２０１８）
agatcttcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatat
tggctattggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctc
atgtccaatatgaccgccatgttggcattgattattgactagttattaatagtaatcaat
tacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaa
tggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgt
tcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggta
aactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgt
caatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcc
tacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggca
gtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccat
tgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaa
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ttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagacca
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tcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaattacag
ctcttaaggctagagtacttaatacgactcactataggctagccaccatggcttccaagg
tgtacgaccccgagcaacgcaaacgcatgatcactgggcctcagtggtgggctcgctgca
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ctcacatcgagcccgtggctagatgcatcatccctgatctgatcggaatgggtaagtccg
gcaagagcgggaatggctcatatcgcctcctggatcactacaagtacctcaccgcttggt
tcgagctgctgaaccttccaaagaaaatcatctttgtgggccacgactggggggctgctc
tggcctttcactacgcctacgagcaccaagacaggatcaaggccatcgtccatatggaga
gtgtcgtggacgtgatcgagtcctgggacgagtccggaggaggcggaatgagcaagggcg
aggagctgttcaccggcgtggtgcccatcctggtggagctggacggcgacgtgaacggcc
acaagttcagcgtgagaggcgagggcgagggcgacgccaccatcggcaagctgaccctga
agttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctggtgaccaccctga
cctacggcgtgcagtgcttcagcagataccccgaccacatgaagagacacgacttcttca
agagcgccatgcccgagggctacgtgcaggagagaaccatcagcttcaaggacgacggca
agtacaagaccagagccgtggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaacagaatcgagc
tgaagggcaccgacttcaaggaggacggcaacatcctgggccacaagctggagtacaact
tcaacagccacaacgtgtacatcaccgccgacaagtgatctagagcggccgcttcgagca
gacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaa
tgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaat
aaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgg
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ggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattca
aatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaagg
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cttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttg
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cgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggta
ttatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaat
gacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaaga
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gggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagtt
atctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagata
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attgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataat
ctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaa
aagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaaca
aaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactcttttt
ccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccg
tagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatc
ctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaaga
cgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagccc
agcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagc
gccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaaca
ggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcggg
tttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagccta
tggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatggctcgac

【0372】

Ｒｌｕｃ８ １５５－１５６ＤＳＰ８－１１ルシフェラーゼ－ＧＦＰ融合タンパク質（配列番号１６；ウミシイタケルシフェラーゼ断片ａａ１５６～３１１には下線が付されている；リンカーは強調されていない；改変ＧＦＰの断片ａａ１５７～２３１は太字で示されている）

【0373】

Ｒｌｕｃ８１５５－１５６ＤＳＰ８－１１構築物のヌクレオチド配列（配列番号１７；コーディングＯＲＦはｎｔ１０６８～１７７８）
agatcttcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatat
tggctattggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctc
atgtccaatatgaccgccatgttggcattgattattgactagttattaatagtaatcaat
tacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaa
tggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgt
tcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggta
aactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgt
caatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcc
tacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggca
gtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccat
tgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaa
taaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataag
cagagctcgtttagtgaaccgtcagatcactagaagctttattgcggtagtttatcacag
ttaaattgctaacgcagtcagtgcttctgacacaacagtctcgaacttaagctgcagaag
ttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagacca
atagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattgg
tcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaattacag
ctcttaaggctagagtacttaatacgactcactataggctagccaccatgcagaagaacg
gcatcaaggccaacttcaccgtgagacacaacgtggaggacggcagcgtgcagctggccg
accactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccact
acctgagcacccagaccgtgctgagcaaggaccccaacgagaagagagaccacatggtgc
tgcacgagtacgtgaacgccgccggcatcaccggcggtggcggatcctggcctgacatcg
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tcttcgtcgagaccgtgctcccaagcaagatcatgcggaaactggagcctgaggagttcg
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atggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgc
tcacatggctcgac

【0374】

改変ＧＦＰ（配列番号１８）
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATIGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGKYKTRAVVKFEGDTLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKMQKNGIKANFTVRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQTVLSKDPNEKRDHMVLHEYVNAAGIT

【0375】

ＲＬｕｃ８（配列番号１９）
MASKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNATSSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGAALAFHYAYEHQDRIKAIVHMESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETVLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKLFIESDPGFFSNAIVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFLQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQ

【0376】

バリアント２で欠失した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質細胞質尾部の１９個のアミノ酸（配列番号２０）
KFDEDDSEPVLKGVKLHYT

【0377】

バリアント３で使用された、ＶＳＶ Ｇ糖タンパク質細胞質尾部配列（配列番号２１）
KLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK

【0378】

【0379】

【0380】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Δ１９ＣＴ ＣＰＥ溶解感染バリアントのアミノ酸配列（配列番号４２；ＣＰＥバリアント）
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRRYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQNVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCC

【0381】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Δ１９ＣＴ ＣＰＥ溶解感染バリアントのコドン最適化ポリヌクレオチド配列（配列番号４３；ＣＰＥバリアント）
atgttcgtcttcctggtcctgctgcctctggtctcctcacagtgcgtcaatctgacaactcggactcagctgccacctgcttatactaatagcttcaccagaggcgtgtactatcctgacaaggtgtttagaagctccgtgctgcactctacacaggatctgtttctgccattctttagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgagcggcaccaatggcacaaagcggttcgacaatcccgtgctgccttttaacgatggcgtgtacttcgcctctaccgagaagagcaacattatcagaggctggatctttggcaccacactggactccaagacacagtctctgctgatcgtgaacaatgccaccaacgtggtcatcaaggtgtgcgagttccagttttgtaatgatcccttcctgggcgtgtactatcacaagaacaataagagctggatggagtccgagtttagagtgtattctagcgccaacaactgcacatttgagtacgtgagccagcctttcctgatggacctggagggcaagcagggcaatttcaagaacctgagggagttcgtgtttaagaatatcgacggctacttcaaaatctactctaagcacacccccatcaacctggtgcgcgacctgcctcagggcttcagcgccctggagcccctggtggatctgcctatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagatacctgacacccggcgactcctctagcggatggaccgccggcgctgccgcctactatgtgggctacctccagccccggaccttcctgctgaagtacaacgagaatggcaccatcacagacgcagtggattgcgccctggaccccctgagcgagacaaagtgtacactgaagtcctttaccgtggagaagggcatctatcagacatccaatttcagggtgcagccaaccgagtctatcgtgcgctttcctaatatcacaaacctgtgcccatttggcgaggtgttcaacgcaacccgcttcgccagcgtgtacgcctggaataggaagcggatcagcaactgcgtggccgactatagcgtgctgtacaactccgcctctttcagcacctttaagtgctatggcgtgtcccccacaaagctgaatgacctgtgctttaccaacgtctacgccgattctttcgtgatcaggggcgacgaggtgcgccagatcgcccccggccagacaggcaagatcgcagactacaattataagctgccagacgatttcaccggctgcgtgatcgcctggaacagcaacaatctggattccaaagtgggcggcaactacaattatctgtaccggctgtttagaaagagcaatctgaagcccttcgagagggacatctctacagaaatctaccaggccggcagcaccccttgcaatggcgtggagggctttaactgttatttcccactccagtcctacggcttccagcccacaaacggcgtgggctatcagccttaccgcgtggtggtgctgagctttgagctgctgcacgccccagcaacagtgtgcggccccaagaagtccaccaatctggtgaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcacaggcgtgctgaccgagtccaacaagaagttcctgccatttcagcagttcggcagggacatcgcagataccacagacgccgtgcgcgacccacagaccctggagatcctggacatcacaccctgctctttcggcggcgtgagcgtgatcacacccggcaccaatacaagcaaccaggtggccgtgctgtatcagaacgtgaattgtaccgaggtgcccgtggctatccacgccgatcagctgaccccaacatggcgggtgtacagcaccggctccaacgtcttccagacaagagccggatgcctgatcggagcagagcacgtgaacaattcctatgagtgcgacatcccaatcggcgccggcatctgtgcctcttaccagacccagacaaactctcccagaagagcccagagcgtggcctcccagtctatcatcgcctataccatgtccctgggcgccgagaacagcgtggcctactctaacaatagcatcgccatcccaaccaacttcacaatctctgtgaccacagagatcctgcccgtgtccatgaccaagacatctgtggactgcacaatgtatatctgtggcgattctaccgagtgcagcaacctgctgctccagtacggcagcttttgtacccagctgaatagagccctgacaggcatcgccgtggagcaggataagaacacacaggaggtgttcgcccaggtgaagcaaatctacaagaccccccctatcaaggactttggcggcttcaatttttcccagatcctgcctgatccatccaagccttctaagcggagctttatcgaggacctgctgttcaacaaggtgaccctggccgatgccggcttcatcaagcagtatggcgattgcctgggcgacatcgcagccagggacctgatctgcgcccagaagtttaatggcctgaccgtgctgccacccctgctgacagatgagatgatcgcacagtacacaagcgccctgctggccggcaccatcacatccggatggaccttcggcgcaggagccgccctccagatcccctttgccatgcagatggcctataggttcaacggcatcggcgtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaatcagtttaactccgccatcggcaagatccaggacagcctgtcctctacagccagcgccctgggcaagctccaggatgtggtgaatcagaacgcccaggccctgaataccctggtgaagcagctgagcagcaacttcggcgccatctctagcgtgctgaatgacatcctgagccggctggacaaggtggaggcagaggtgcagatcgaccggctgatcaccggccggctccagagcctccagacctatgtgacacagcagctgatcagggccgccgagatcagggccagcgccaatctggcagcaaccaagatgtccgagtgcgtgctgggccagtctaagagagtggacttttgtggcaagggctatcacctgatgtccttccctcagtctgccccacacggcgtggtgtttctgcacgtgacctacgtgcccgcccaggagaagaacttcaccacagcccctgccatctgccacgatggcaaggcccactttccaagggagggcgtgttcgtgtccaacggcacccactggtttgtgacacagcgcaatttctacgagccccagatcatcaccacagacaacaccttcgtgagcggcaactgtgacgtggtcatcggcatcgtgaacaataccgtgtatgatccactccagcccgagctggacagctttaaggaggagctggataagtatttcaagaatcacacctcccctgacgtggatctgggcgacatcagcggcatcaatgcctccgtggtgaacatccagaaggagatcgaccgcctgaacgaggtggctaagaatctgaacgagagcctgatcgacctccaggagctgggcaagtatgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgatcgccatcgtgatggtgaccatcatgctgtgctgtatgacatcctgctgttcttgcctgaagggctgctgtagctgtggctcctgctgttaa

【0382】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Δ１９ＣＴバリアントのアミノ酸配列（配列番号４４；バリアント）

【0383】

請求対象の主題は、本明細書に記載の具体的実施形態によってその範囲を制限されないものとする。実際には、本明細書に記載されているものに加えて、請求対象の主題の様々な修正形態が、当業者には以上の説明から明らかになるだろう。このような修正形態は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図されている。

【0384】

本明細書に引用される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、及びその他の資料は、あたかもこれらが本明細書中に物理的に存在しているかのように、その全体が参照により本明細書に援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23】

【図24】

【配列表】

2023524200000001.xml

【国際調査報告】