特表 2023-524238 治療用ＳＩＲＰα抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-09

(54)【発明の名称】治療用ＳＩＲＰα抗体

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20230602BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230602BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230602BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230602BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230602BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230602BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230602BHJP

   C07K 16/24 20060101ALN20230602BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 N ZNA

A61K39/395 T

A61P35/00

A61P43/00 121

A61P35/02

A61K45/00

C07K16/28

C12N15/13

C07K16/24

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022566033

(86)(22)【出願日】2021-04-30

(85)【翻訳文提出日】2022-12-28

(86)【国際出願番号】 US2021030163

(87)【国際公開番号】W WO2021222746

(87)【国際公開日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】63/018,177

(32)【優先日】2020-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/071,732

(32)【優先日】2020-08-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/107,200

(32)【優先日】2020-10-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521202743

【氏名又は名称】アーチ オンコロジー，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】プーロ，ロビン

(72)【発明者】

【氏名】ヒービッシュ，ロナルド

(72)【発明者】

【氏名】カポッシア，ベンジャミン

(72)【発明者】

【氏名】アンドレジェバ，ガブリエラ

(72)【発明者】

【氏名】ペレイラ，ダニエル スーザ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB27

4C084ZC75

4C085AA14

4C085EE01

4C085EE03

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

特徴的な機能プロファイルを有する、多重特異性ＳＩＲＰα抗体を含む抗ＳＩＲＰαモノクローナル抗体（抗SIRPα mAb）、ならびに関連する組成物、ならびに固形がんおよび血液がんの予防および治療のための治療薬として抗ＳＩＲＰα ｍＡｂを使用する方法が提供される。例示的な抗ＳＩＲＰαモノクローナル抗体のアミノ酸配列も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を、がんを治療するのに有効な量で対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてがんを治療する方法であって、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、正常な末梢血単核細胞（PBMC）に対する食作用を誘導することなくがん細胞に対する食作用を誘導し、モノクローナル抗体または抗原結合性断片が、
ｉ． 配列番号１、配列番号２、配列番号３、
ｉｉ． 配列番号４、配列番号５、配列番号６、
ｉｉｉ． 配列番号７、配列番号８、配列番号９、
ｉｖ． 配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、
ｖ． 配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、
ｖｉ． 配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、
ｖｉｉ． 配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、
ｖｉｉｉ． 配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、
ｉｘ． 配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、
ｘ． 配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、
ｘｉ． 配列番号１０、配列番号３１、配列番号１２、
ｘｉｉ． 配列番号１０、配列番号３１、配列番号３２、および
ｘｉｉｉ． 配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、
から選択される３つの軽鎖相補性決定領域（LCDR1、LCDR2、LCDR3）と、
ｘｉｖ． 配列番号３３、配列番号３４、および配列番号３５、
ｘｖ． 配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８、
ｘｖｉ． 配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１、
ｘｖｉｉ． 配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４、
ｘｖｉｉｉ． 配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７、
ｘｉｘ． 配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０、
ｘｘ． 配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３、
ｘｘｉ． 配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５６、
ｘｘｉｉ． 配列番号５７、配列番号５８、および配列番号５９、
ｘｘｉｉｉ． 配列番号６０、配列番号６１、および配列番号６２、ならびに
ｘｘｉｖ． 配列番号５７、配列番号５８、および配列番号６３
から選択される３つの重鎖相補性決定領域（HCDR1、HCDR2、HCDR3）とを含む、方法。

【請求項2】

ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、
ｉ． 配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号６４を含む軽鎖可変ドメイン、
ｉｉ． 配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号６５を含む軽鎖可変ドメイン、
ｉｉｉ． 配列番号８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号６６を含む軽鎖可変ドメイン、
ｉｖ． 配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号６７を含む軽鎖可変ドメイン、
ｖ． 配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号６８を含む軽鎖可変ドメイン、
ｖｉ． 配列番号８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号６９を含む軽鎖可変ドメイン、
ｖｉｉ． 配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７０を含む軽鎖可変ドメイン、
ｖｉｉｉ． 配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７１を含む軽鎖可変ドメイン、
ｉｘ． 配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７２を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘ． 配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７３を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｉ． 配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７４を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｉｉ． 配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７５を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｉｉｉ． 配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７６を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｉｖ． 配列番号９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７４を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｖ． 配列番号９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７５を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｖｉ． 配列番号９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７６を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｖｉｉ． 配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７４を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｖｉｉｉ． 配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７５を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｉｘ． 配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７６を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘ． 配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７４を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｉ． 配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７５を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｉｉ． 配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７６を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｉｉｉ． 配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７７を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｉｖ． 配列番号９５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７８を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｖ． 配列番号９５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７９を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｖｉ． 配列番号９５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号８０を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｖｉｉ． 配列番号９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７８を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｖｉｉｉ． 配列番号９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７９を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｉｘ． 配列番号９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号８０を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｘ． 配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７８を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｘｉ． 配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７９を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｘｉｉ． 配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号８０を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに
ｘｘｘｉｉｉ． 配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７２を含む軽鎖可変ドメイン
から選択される、重鎖可変ドメイン（V_H）および軽鎖可変ドメイン（V_L）を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項3】

ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、
ｉ． 配列番号１０９のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号９８を含む軽鎖、
ｉｉ． 配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号９９を含む軽鎖、
ｉｉｉ． 配列番号１１１のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１００を含む軽鎖、
ｉｖ． 配列番号１１２のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０１を含む軽鎖、
ｖ． 配列番号１１２のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０２を含む軽鎖、
ｖｉ． 配列番号１１２のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０３を含む軽鎖、
ｖｉｉ． 配列番号１１３のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０１を含む軽鎖、
ｖｉｉｉ． 配列番号１１３のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０２を含む軽鎖、
ｉｘ． 配列番号１１３のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０３を含む軽鎖、
ｘ． 配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０１を含む軽鎖、
ｘｉ． 配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０２を含む軽鎖、
ｘｉｉ． 配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０３を含む軽鎖、
ｘｉｉｉ． 配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０１を含む軽鎖、
ｘｉｖ． 配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０２を含む軽鎖、
ｘｖ． 配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０３を含む軽鎖、
ｘｖｉ． 配列番号１１６のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０４を含む軽鎖、
ｘｖｉｉ． 配列番号１１７のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０５を含む軽鎖、
ｘｖｉｉｉ． 配列番号１１７のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０６を含む軽鎖、
ｘｉｘ． 配列番号１１７のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０７を含む軽鎖、
ｘｘ． 配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０５を含む軽鎖、
ｘｘｉ． 配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０６を含む軽鎖、
ｘｘｉｉ． 配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０７を含む軽鎖、
ｘｘｉｉｉ． 配列番号１１９のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０５を含む軽鎖、
ｘｘｉｖ． 配列番号１１９のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０６を含む軽鎖、
ｘｘｖ． 配列番号１１９のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０７を含む軽鎖、ならびに
ｘｘｖｉ． 配列番号１２０のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０８を含む軽鎖
から選択される、１本の重鎖および１本の軽鎖を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項4】

モノクローナル抗体またはその抗原結合性断が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ｑ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４ ＰＥ、およびこれらのバリアントから選択されるＩｇＧアイソタイプを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、ヒトＳＩＲＰαおよびヒトＳＩＲＰγに結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

食作用の誘導がＦｃ依存的である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

食作用の誘導がＦｃγＲに依存する、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ（CD64）、ＦｃγＲＩＩＡ（CD32）、ＦｃγＲＩＩＢ（CD32）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（CD16a）、およびＦｃγＲＩＩＩＢ（CD16b）から選ばれる、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、化学療法剤または治療用抗体と組み合わせて投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

治療用抗体が、ＣＤ４７（表面抗原分類47）、ＣＤ７０（表面抗原分類70）、ＣＤ２００（OX-2膜糖タンパク質、表面抗原分類200）、ＣＤ１５４（表面抗原分類154、CD40L、CD40リガンド、表面抗原分類40リガンド）、ＣＤ２２３（リンパ球活性化遺伝子3、LAG3、表面抗原分類223）、ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）、ＧＩＴＲ（TNFRSF18、グルココルチコイド誘導性TNFR関連タンパク質、活性化誘導性TNFRファミリー受容体、AITR、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー18）、ＣＤ２０（表面抗原分類）、ＣＤ２８（表面抗原分類28）、ＣＤ４０（表面抗原分類40、Bp50、CDW40、TNFRSF5、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー5、p50）、ＣＤ８６（B7-2、表面抗原分類86）、ＣＤ１６０（表面抗原分類160、BY55、NK1、NK28）、ＣＤ２５８（LIGHT、表面抗原分類258、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー14、TNFSF14、ヘルペスウイルス侵入メディエーターリガンド（HVEM-L））、ＣＤ２７０（HVEM、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー14、ヘルペスウイルス侵入メディエーター、表面抗原分類270、LIGHTR、HVEA）、ＣＤ２７５（ICOSL、ICOSリガンド、誘導性T細胞共刺激分子リガンド、表面抗原分類275）、ＣＤ２７６（B7-H3、B7ホモログ3、表面抗原分類276）、ＯＸ４０Ｌ（OX40リガンド）、Ｂ７－Ｈ４（B7ホモログ4、VTCN1、V-setドメイン含有T細胞活性化阻害物質1）、ＧＩＴＲＬ（グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体-リガンド、グルココルチコイド誘導性TNFR-リガンド）、４－１ＢＢＬ（4-1BBリガンド）、ＣＤ３（表面抗原分類3、T3D）、ＣＤ２５（IL2Rα、表面抗原分類25、インターロイキン-2 受容体α鎖、IL-2受容体α鎖）、ＣＤ４８（表面抗原分類48、Bリンパ球活性化マーカー、BLAST-1、シグナル伝達リンパ球活性化分子2、SLAMF2）、ＣＤ６６a（Ceacam-1、癌胎児抗原関連細胞接着分子1、胆汁糖タンパク質、BGP、BGP1、BGPI、表面抗原分類66a）、ＣＤ８０（B7-1、表面抗原分類80）、ＣＤ９４（表面抗原分類94）、ＮＫＧ２Ａ（ナチュラルキラーグループ2A、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーDメンバー1、KLRD1）、ＣＤ９６（表面抗原分類96、TActILE、T細胞活性化後期発現増加）、ＣＤ１１２（PVRL2、ネクチン、ポリオウイルス受容体関連2、ヘルペスウイルス侵入メディエーターB、HVEB、ネクチン-2、表面抗原分類112）、ＣＤ１１５（CSF1R、コロニー刺激因子1受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体、M-CSFR、表面抗原分類115）、ＣＤ２０５（DEC-205、LY75、リンパ球抗原75、表面抗原分類205）、ＣＤ２２６（DNAM1、表面抗原分類226、DNAXアクセサリー分子-1、PTA1、血小板およびT細胞活性化抗原1）、ＣＤ２４４（表面抗原分類244、ナチュラルキラー細胞受容体2B4）、ＣＤ２６２（DR5、TrailR2、TRAIL-R2、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー10b、TNFRSF10B、表面抗原分類262、KILLER、TRICK2、TRICKB、ZTNFR9、TRICK2A、TRICK2B）、ＣＤ２８４（Toll様受容体-4、TLR4、表面抗原分類284）、ＣＤ２８８（Toll様受容体-8、TLR8、表面抗原分類288）、白血病抑制因子（LIF）、TNFSF15（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー15、血管内皮細胞増殖阻害物質、VEGI、TL1A）、ＴＤＯ２（トリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼ、TPH2、TRPO）、ＩＧＦ－１Ｒ（1型インスリン様増殖因子）、ＧＤ２（ジシアロガングリオシド2）、ＴＭＩＧＤ２（膜貫通免疫グロブリンドメイン含有タンパク質2）、ＲＧＭＢ（RGMドメインファミリー、メンバーB）、ＶＩＳＴＡ（T細胞活性化のVドメイン免疫グロブリン含有サプレッサー、B7-H5、B7ホモログ5）、ＢＴＮＬ２（ブチロフィリン様タンパク質2）、Ｂｔｎ（ブチロフィリンファミリー）、ＴＩＧＩＴ（IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体、Vstm3、WUCAM）、シグレック（シアル酸結合Ig様レクチン）、すなわち、ＳＩＧＬＥＣ－１５、ニューロフィリン、ＶＥＧＦＲ（血管内皮増殖因子受容体）、ＩＬＴファミリー（LIR、免疫グロブリン様転写物ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体）、ＮＫＧファミリー（ナチュラルキラーグループファミリー、C型レクチン膜貫通受容体）、ＭＩＣＡ（MHCクラスIポリペプチド関連配列A）、ＴＧＦβ（形質転換増殖因子β）、ＳＴＩＮＧ経路（インターフェロン遺伝子経路の刺激物質）、アルギナーゼ（アルギニンアミジナーゼ、カナバナーゼ、L-アルギナーゼ、アルギニントランスアミジナーゼ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮増殖因子受容体バリアントIII）、およびＨＨＬＡ２（B7-H7、B7y、HERV-H LTR関連タンパク質2、B7ホモログ7）、ＰＤ－１の阻害物質（プログラム細胞死タンパク質 1、PD-1、CD279、表面抗原分類279）、ＰＤ－Ｌ１（B7-H1、B7ホモログ1、プログラム死リガンド1、CD274、表面抗原分類274）、ＰＤ－Ｌ２（B7-DC、プログラム細胞死1リガンド2、PDCD1LG2、CD273、表面抗原分類273）、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4、CD152、表面抗原分類152）、ＢＴＬＡ（Bおよび Tリンパ球アテニュエーター、CD272、表面抗原分類272）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（IDO、IDO1）、ＴＩＭ３（HAVCR2、A型肝炎ウイルス細胞受容体 2、T細胞免疫グロブリンムチン-3、KIM-3、腎臓損傷分子3、TIMD-3、T細胞免疫グロブリンムチン-ドメイン3）、Ａ２Ａアデノシン受容体（ADO受容体）、ＣＤ３９（エクトヌクレオチド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ-1、表面抗原分類39、ENTPD1）、およびＣＤ７３（エクト-5'-ヌクレオチダーゼ、5'-ヌクレオチダーゼ、5'-NT、表面抗原分類73）、ＣＤ２７（表面抗原分類27）、ＩＣＯＳ（CD278、表面抗原分類278、誘導性T細胞共刺激分子）、ＣＤ１３７（4-1BB、表面抗原分類137、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9、TNFRSF9）、ＯＸ４０（CD134、表面抗原分類134）、ＴＮＦＳＦ２５（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー25）、ＩＬ－１０（インターロイキン-10、ヒトサイトカイン合成阻害因子、CSIF）、ＰＶＲＩＧ（ポリオウイルス受容体関連免疫グロブリンドメイン含有タンパク質）、およびガレクチンから選択される細胞標的を対象とする、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、腫瘍細胞上の抗原を標的とするオプソニン化抗体と組み合わせて投与される、請求項１から３、７、８、および１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

オプソニン化抗体が、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＲＡＮＫＬ、抗ＳＬＡＭＦ７、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ１９／ＣＤ３、および抗ＧＤ２抗体のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

オプソニン化抗体が、リツキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、デノスマブ、ペルツズマブ、パニツムマブ、エロツズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ネシツムマブ、ダラツムマブ、オビヌツズマブ、ブリナツモマブ、およびジヌツキシマブのうちの１つまたは複数から選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

オプソニン化抗体が、抗ＣＤ２０、抗ＥＧＦＲ、抗ＰＤ－１、および抗ＰＤ－Ｌ１抗体のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記がんが、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、乳がん、子宮内膜がん、結腸がん（結腸直腸がん）、直腸がん、膀胱がん、尿路上皮がん、肺がん（非小細胞肺がん、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌）、気管支がん、骨がん、前立腺がん、膵がん、胃がん、肝細胞癌、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、腎細胞癌、甲状腺がん、頭頸部の扁平上皮癌（頭頸部がん）、精巣がん、内分泌腺のがん、副腎のがん、下垂体のがん、皮膚のがん、軟部組織のがん、血管のがん、脳のがん、神経のがん、目のがん、髄膜のがん、中咽頭のがん、下咽頭のがん、子宮頸のがん、および子宮のがん、神経膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、ガストリノーマ、神経芽腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、および肉腫から選択される、請求項１から３、７、８、１０、および１２から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記白血病が、全身性肥満細胞症、急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病（ALL）、Ｔ細胞ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、骨髄増殖性疾患／新生物、骨髄異形成症候群、単核球細胞白血病、および形質細胞白血病から選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記リンパ腫が、組織球性リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫、ならびに、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（NHL）、細胞リンパ腫（FCC）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、びまん性大細胞型リンパ腫（DLCL）、小リンパ球性（SL）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度 びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、およびワルデンストローム・マクログロブリン血症を含む、Ｂ細胞リンパ腫から選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記肉腫が、骨肉腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、滑膜肉腫、胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、および軟骨肉腫から選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項19】

モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が汎対立遺伝子的である、請求項１から３、７、８、１０、１２から１４、および１６から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、ＳＩＲＰαの二量体化、クラスター形成、およびアーキテクチャのうちの１つまたは複数に影響を与える、請求項１から３、７、８、１０、１２から１４、および１６から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、細胞表面ＳＩＲＰαの減少を引き起こす、請求項１から３、７、８、１０、１２から１４、および１６から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

細胞表面ＳＩＲＰαが内在化される、請求項２１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[0001] 本開示は免疫療法の分野に関する。本開示は、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の間の相互作用を妨害し、腫瘍細胞に対する食作用を増強し、免疫応答の免疫調節を引き起こす、抗ＳＩＲＰα抗体（抗SIRPα）、抗ＳＩＲＰα抗体を作製する方法、ならびに、血液がんおよび固形がんの予防および治療のための治療剤として抗ＳＩＲＰα抗体を使用する方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

[0002] Ｔ細胞チェックポイントＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＣＴＬＡ－４を含む獲得免疫を標的とし、Ｔ細胞免疫応答の細胞障害活性を増強する治療用抗体により、転移性疾患を有する患者の長期的寛解の見込み、または治癒の見込みさえもが高まった（Hodi 2010、McDermott 2015）。前向きな結果にもかかわらず、これらのチェックポイント阻害剤に対する応答ができない（原発性の抵抗性）大きな患者集団、または、応答はするが、最終的に疾患進行が発生する（後天的な抵抗性）人々が存在する（Pitt 2016、Restifo 2016、Sharma 2017）。近年の研究により、抵抗性のメカニズムは、特有の腫瘍抗原タンパク質を欠くことまたは腫瘍抗原の提示の阻害など、腫瘍細胞内因的であり、なおかつ、腫瘍微小環境における浸潤性Ｔ細胞の不在、冗長な阻害チェックポイント、および／または免疫抑制細胞の存在を伴い、腫瘍細胞外因的である可能性があることが示唆されている（Sharma 2017）。チェックポイント阻害剤に感受性があると考えられる腫瘍においてでさえ、あるいは抗ＣＴＬＡ－４および抗ＰＤ－１／ＰＤＬ－１剤を組み合わせた場合であっても、患者のおよそ５０％が腫瘍縮小を経験せず、治療を受けたすべての患者の治療期間または無増悪生存期間中央値は２～５カ月付近と、比較的短いままである（Kazandjian、 2016）。さらに、最もありふれた固形腫瘍のいくつかと血液悪性腫瘍の大部分において、これらのチェックポイント阻害剤では残念な結果となっている。特に、ホルモン受容体陽性乳がん、結腸直腸がん（非マイクロサテライト不安定性）、および前立腺がんはこの種の免疫操作に対して感受性ではないように思われ、違った免疫療法のアプローチから恩恵を受ける可能性がある（Le 2015、Dirix 2015、Topalian 2012、Graff 2016）。これらの知見は、さらなるチェックポイントを標的とすることで、獲得免疫応答に加えて自然免疫応答を活性化させて臨床成績をさらに改善する、代替的または相乗的なアプローチの必要性を強調している。いくつかの自然免疫応答のチェックポイントは、腫瘍細胞上および骨髄細胞（マクロファージ、樹状細胞、単球由来サプレッサー細胞、顆粒球）上に存在し、骨髄細胞は、腫瘍の進行、転移、および全体的な成績に影響を与える、腫瘍微小環境の重要な細胞構成要素である（Barclayおよびvan den Berg 2014、Yanagita 2017）。

【0003】

[0003] シグナル制御タンパク質（SIRP）－α、またはＳＩＲＰαは、ＣＤ１７２ａ、ＢＩＴ、またはＳＨＰＳ－１としても知られ、密接に関連したＳＩＲＰタンパク質からなるＳＩＲＰペア型受容体ファミリーのメンバーである。ＳＩＲＰαは、マクロファージ、樹状細胞、および顆粒球を含む造血細胞によって主に発現され、とりわけ脳内のニューロン、グリア、平滑筋細胞、ならびに内皮および一部の腫瘍細胞上でも発現される（Barclayおよびvan den Berg 2014）。ＳＩＰＲαは、３つのＩｇ様ドメインを含む細胞外ドメインと、免疫受容体チロシン型阻害性モチーフ（ITIM）を含む細胞質領域とを有する、膜貫通タンパク質である。

【0004】

[0004] ヒトＳＩＲＰαをコードする遺伝子は多形性であり、最大で１０種類のＳＩＲＰαハプロタイプが報告されている［Takenaka K.ら, 2007およびBrooke G.ら, 2004）。３つの対立遺伝子群（ホモ接合性v1/v1、ヘテロ接合性v1/v2、およびホモ接合性v2/v2）は、遺伝子型を同定された実質的にすべての民族を構成する（Treffers LWら, 2018およびSim J.ら 2020）。ヘテロ接合体では、ＳＩＲＰαの両方の対立遺伝子を遮断することがマクロファージ媒介性食作用を増強するために必要であるため、ＳＩＲＰαに対する対立遺伝子汎特異的抗体は、多様な集団においてＳＩＲＰα／ＣＤ４７チェックポイントを最も広く標的化／遮断すると考えられる（Sim J.ら 2020およびZhao XWら, 2011）。本開示の抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、ヒト単核球細胞株Ｕ９３７（SIRPα v1／v1）およびＴＨＰ－１（SIRPα v2／v2）のいずれにも結合し（Tsaiら, 2010）、Ｕ９３７（SIRPα v1／v1）のみに結合するｍＡｂ １８Ｄ５とは異なる（細胞ベースの結合アッセイによる）（Tsaiら, 2010およびvan Eenennaamら, 2018）。

【0005】

[0005] ＳＩＲＰαは骨髄細胞により発現され、ＣＤ４７は多くの腫瘍細胞上や一部の正常細胞上で発現または過剰発現されるが、ＳＩＲＰαのＣＤ４７との相互作用は、接着、移動、活性化、および阻害活性を含む骨髄機能を制御する自然応答の、重要な免疫チェックポイントである。ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用は、阻害性の「私を食べるなシグナル」を貪食細胞に送る標的細胞に対する、マクロファージおよび樹状細胞の食作用を制御する。ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合により阻害シグナル伝達カスケードが開始されることで、その細胞質ＩＴＩＭのリン酸化（Oldenborg 2000、Oldenborg 2001、Okazawa 2005）、ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２、ならびにＳｒｃ相同領域含有タンパク質チロシンホスファターゼの動員および結合（Veillette 1998、Oldenborg 2001）、ならびに非筋肉ミオシンＩＩＡの阻害、そして最終的に貪食機能の阻害（TsaiおよびDischer 2008、Barclayおよびvan den Berg 2014、Murata 2014、VeilletteおよびChen 2018、Matazaki 2009）が起こり、その後食作用が阻害される。ＣＤ４７の「私を食べるな」シグナルとしての作用に付随して重要なのは、その「自己のマーカー」としての役割である。これにより自己に対する食作用が著しく妨げられ、その後の自己免疫反応が遮断される（Oldenborg, 2002、Oldenborg 2004）。がん細胞はＣＤ４７を用いて自らを「自己」の中に隠し、この結果、自然免疫系と獲得免疫系の両方から巧みに逃れる。マクロファージおよび樹状細胞などの自然免疫細胞上におけるＳＩＲＰαと、腫瘍細胞上におけるＣＤ４７との相互作用の遮断は、がん療法における有望な標的として登場した。前臨床データより、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７相互作用を遮断する抗ＳＩＲＰα抗体は、抗ＣＤ４７抗体と同様に、マウス腫瘍モデルにおいて、単剤療法で、または他の薬剤との組合せにおいて抗腫瘍力を呈することが示されている（Gauttier, 2017；Ring, 2017；Yanigita, 2017；Poirier, 2018；およびGuattier, 2018）。重要なことは、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７相互作用の妨害後の自然免疫応答に加えて獲得免疫応答が生じることが、頑強な抗腫瘍応答を得る際に不可欠と考えられる点である（Tseng 2013、Li 2015、Xu 2017）。

【0006】

[0006] ＤＣ細胞上におけるＳＩＲＰαの発現、およびＴ細胞上でのＣＤ４７とのその相互作用は、獲得免疫応答を誘導する際に重要であると考えられる。ＳＩＲＰα／ＣＤ４７相互作用の遮断が、ＤＣによる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激する能力に影響を与えることが報告されており、これは腫瘍ＤＮＡに対するＤＣ媒介性応答の増強と相関していた（Liu 2015、Xu 2017）。

【0007】

[0007] ペア型受容体からなるＳＩＲＰファミリーのもう１つのメンバーである、ＳＩＲＰ－γは、ヒトＴ細胞の表面上に選択的に発現され（ただし齧歯類ではそうではない）、４つのアミノ酸からなる短い細胞質領域を有する。ＳＩＲＰ－γもＣＤ４７に結合し、Ｔ細胞とＡＰＣの間の接着の媒介、ならびに増殖および活性化を含む、Ｔ細胞の機能にとって重要であると考えられる（Barclayおよびvan den Berg 2014；およびPiccio, 2005）。よって、ＳＩＲＰ－γとＣＤ４７の間ではなくＳＩＲＰαとＣＤ４７の間の相互作用を遮断することで、Ｔ細胞の機能を保護する利点が得られる可能性がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

[0008] 本開示は、特徴的な機能プロファイルを有する抗ＳＩＲＰα ｍＡｂを記載する。本開示の抗体は、ヒトにおけるＳＩＲＰαと関連する疾患および状態を治療するための様々な治療方法において有用であり、これらには、固形がんおよび血液がんの予防および治療のための治療薬としての、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂの使用が含まれる。本開示の抗体は、組織試料における抗ＳＩＲＰα発現量を決定するための診断薬としても有用である。本開示の実施形態は、単離された抗体およびその免疫学的に活性なその結合性断片；抗ＳＩＲＰαモノクローナル抗体、好ましくは、これらの抗体のキメラまたはヒト化形態のうちの１つまたは複数を含む、医薬組成物；ならびにこのような抗ＳＩＲＰαモノクローナル抗体の治療的使用方法を含む。

【0009】

[0009] 本開示の実施形態はｍＡｂまたはその抗原結合性断片を含み、これらは、特定の構造的特徴、すなわち、ＣＤＲ、または重鎖および軽鎖可変ドメインの全体、または重鎖および軽鎖の全体の、規定されたアミノ酸配列を参照することによって定義される。本明細書で開示されるこれらの抗体のすべてが、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰ－γ、またはＳＩＲＰαとＳＩＲＰ－γとに結合する。

【0010】

[0010] モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書で提示される少なくとも１つ、通常は少なくとも３つのＣＤＲ配列を、通常はヒト可変領域に由来するフレームワーク配列と組み合わせて、または単離されたＣＤＲペプチドとして含んでいてもよい。一部の実施形態において、抗体は、限定されるものではないが、マウスまたはヒト可変領域フレームワークであってもよい可変領域フレームワークに位置する、本明細書で提示される３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む少なくとも１本の軽鎖と、限定されるものではないが、マウスまたはヒト可変領域フレームワークであってもよい可変領域フレームワークに位置する、本明細書で提示される３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む少なくとも１本の重鎖とを含む。モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片には、単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディラクダ科ＶＨＨ、またはサメ単一ドメイン抗体もしくはその抗原結合性断片）および多重特異性（例えば、二重特異性）抗体またはその抗原結合性断片も含まれる。

【0011】

[0011] 一部の実施形態において、６つのＣＤＲの組合せとしては、以下から選択される可変重鎖ＣＤＲ１（HCDR1）、可変重鎖ＣＤＲ２（HCDR2）、可変重鎖ＣＤＲ３（HCDR3）、可変軽鎖ＣＤＲ１（LCDR1）、可変軽鎖ＣＤＲ２（LCDR2）、および可変軽鎖ＣＤＲ３（LCDR3）の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。

【0012】

[0012] 配列番号３３を含むＨＣＤＲ１、配列番号３４を含むＨＣＤＲ２、配列番号３５を含むＨＣＤＲ３、配列番号１を含むＬＣＤＲ１、配列番号２を含むＬＣＤＲ２、配列番号３を含むＬＣＤＲ３、

【0013】

[0013] 配列番号３６を含むＨＣＤＲ１、配列番号３７を含むＨＣＤＲ２、配列番号３８を含むＨＣＤＲ３、配列番号４を含むＬＣＤＲ１、配列番号５を含むＬＣＤＲ２、配列番号６を含むＬＣＤＲ３、

【0014】

[0014] 配列番号３９を含むＨＣＤＲ１、配列番号４０を含むＨＣＤＲ２、配列番号４１を含むＨＣＤＲ３、配列番号７を含むＬＣＤＲ１、配列番号８を含むＬＣＤＲ２、配列番号９を含むＬＣＤＲ３、

【0015】

[0015] 配列番号４２を含むＨＣＤＲ１、配列番号４３を含むＨＣＤＲ２、配列番号４４を含むＨＣＤＲ３、配列番号１０を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１を含むＬＣＤＲ２、配列番号１２を含むＬＣＤＲ３、

【0016】

[0016] 配列番号４５を含むＨＣＤＲ１、配列番号４６を含むＨＣＤＲ２、配列番号４７を含むＨＣＤＲ３、配列番号１３を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４を含むＬＣＤＲ２、配列番号１５を含むＬＣＤＲ３、

【0017】

[0017] 配列番号４８を含むＨＣＤＲ１、配列番号４９を含むＨＣＤＲ２、配列番号５０を含むＨＣＤＲ３、配列番号１６を含むＬＣＤＲ１、配列番号１７を含むＬＣＤＲ２、配列番号１８を含むＬＣＤＲ３、

【0018】

[0018] 配列番号５１を含むＨＣＤＲ１、配列番号５２を含むＨＣＤＲ２、配列番号５３を含むＨＣＤＲ３、配列番号１９を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０を含むＬＣＤＲ２、配列番号２１を含むＬＣＤＲ３。

【0019】

[0019] 配列番号５４を含むＨＣＤＲ１、配列番号５５を含むＨＣＤＲ２、配列番号５６を含むＨＣＤＲ３、配列番号２２を含むＬＣＤＲ１、配列番号２３を含むＬＣＤＲ２、配列番号２４を含むＬＣＤＲ３。

【0020】

[0020] 配列番号５７を含むＨＣＤＲ１、配列番号５８を含むＨＣＤＲ２、配列番号５９を含むＨＣＤＲ３、配列番号２５を含むＬＣＤＲ１、配列番号２６を含むＬＣＤＲ２、配列番号２７を含むＬＣＤＲ３。

【0021】

[0021] 配列番号６０を含むＨＣＤＲ１、配列番号６１を含むＨＣＤＲ２、配列番号６２を含むＨＣＤＲ３、配列番号２８を含むＬＣＤＲ１、配列番号２９を含むＬＣＤＲ２、配列番号３０を含むＬＣＤＲ３。

【0022】

[0022] 配列番号４２を含むＨＣＤＲ１、配列番号４３を含むＨＣＤＲ２、配列番号４４を含むＨＣＤＲ３、配列番号１０を含むＬＣＤＲ１、配列番号３１を含むＬＣＤＲ２、配列番号１２を含むＬＣＤＲ３。

【0023】

[0023] 配列番号４２を含むＨＣＤＲ１、配列番号４３を含むＨＣＤＲ２、配列番号４４を含むＨＣＤＲ３、配列番号１０を含むＬＣＤＲ１、配列番号３１を含むＬＣＤＲ２、配列番号３２を含むＬＣＤＲ３。

【0024】

[0024] 配列番号５７を含むＨＣＤＲ１、配列番号５８を含むＨＣＤＲ２、配列番号６３を含むＨＣＤＲ３、配列番号２５を含むＬＣＤＲ１、配列番号２６を含むＬＣＤＲ２、配列番号２７を含むＬＣＤＲ３。

【0025】

[0025] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα抗体には、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、および配列番号９７のアミノ酸配列、ならびに記載されたアミノ酸配列の１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（V_H）を含む、抗体またはその抗原結合性断片が含まれる。あるいは、またはさらに、抗体またはその抗原結合性断片を含む抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、および配列番号８０のアミノ酸配列、ならびに記載されたアミノ酸配列の１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（V_L）を含んでいてもよい。

【0026】

[0026] 上記で列挙したＶ_ＨドメインおよびＶＬドメインの配列群から選択されるＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとのすべての可能な対が許容されるが、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインのある特定の組合せが開示される。したがって、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、
ｉ． 配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号６４を含む軽鎖可変ドメイン、
ｉｉ． 配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号６５を含む軽鎖可変ドメイン、
ｉｉｉ． 配列番号８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号６６を含む軽鎖可変ドメイン、
ｉｖ． 配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号６７を含む軽鎖可変ドメイン、
ｖ． 配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号６８を含む軽鎖可変ドメイン、
ｖｉ． 配列番号８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号６９を含む軽鎖可変ドメイン、
ｖｉｉ． 配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７０を含む軽鎖可変ドメイン、
ｖｉｉｉ． 配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７１を含む軽鎖可変ドメイン、
ｉｘ． 配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７２を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘ． 配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７３を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｉ． 配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７４を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｉｉ． 配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７５を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｉｉｉ． 配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７６を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｉｖ． 配列番号９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７４を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｖ． 配列番号９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７５を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｖｉ． 配列番号９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７６を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｖｉｉ． 配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７４を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｖｉｉｉ． 配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７５を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｉｘ． 配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７６を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘ． 配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７４を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｉ． 配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７５を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｉｉ． 配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７６を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｉｉｉ． 配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７７を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｉｖ． 配列番号９５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７８を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｖ． 配列番号９５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７９を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｖｉ． 配列番号９５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号８０を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｖｉｉ． 配列番号９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７８を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｖｉｉｉ． 配列番号９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７９を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｉｘ． 配列番号９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号８０を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｘ． 配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７８を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｘｉ． 配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７９を含む軽鎖可変ドメイン、
ｘｘｘｉｉ． 配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号８０を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに
ｘｘｘｉｉｉ． 配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号７２を含む軽鎖可変ドメイン
から選択される、重鎖可変ドメイン（V_H）と軽鎖可変ドメイン（V_L）との組合せを含む、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片である。

【0027】

[0027] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片はまた、重鎖可変ドメインが、上記で（ｉ）～（ｘｘｘｉｉｉ）に示した重鎖アミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＶ_Ｈ配列を含む、および／または、軽鎖可変ドメインが、上記で（ｉ）～（ｘｘｘｉｉｉ）に示した軽鎖アミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＶ_Ｌ配列を含む、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの組合せを含んでいてもよい。項目（ｉ）～（ｘｘｘｉｉｉ）における特定のＶ_ＨとＶ_Ｌとの対または組合せが、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメイン配列を有する抗ＳＩＲＰα抗体について、これらの参照配列に対して特定の百分率の配列同一性で保存されていてもよい。

【0028】

[0028] すべての実施形態について、抗体または抗原結合性断片の重鎖および／または軽鎖可変ドメインは、参照配列に対する特定の百分率の配列同一性によって定義され、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌドメインは、フレームワーク領域内のみに差異が存在するように、参照配列中に存在するＣＤＲ配列と同一のＣＤＲ配列を保持していてもよい。

【0029】

[0029] 別の実施形態において、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、
ｉ． 配列番号１０９のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号９８を含む軽鎖、
ｉｉ． 配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号９９を含む軽鎖、
ｉｉｉ． 配列番号１１１のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１００を含む軽鎖、
ｉｖ． 配列番号１１２のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０１を含む軽鎖、
ｖ． 配列番号１１２のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０２を含む軽鎖、
ｖｉ． 配列番号１１２のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０３を含む軽鎖、
ｖｉｉ． 配列番号１１３のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０１を含む軽鎖、
ｖｉｉｉ． 配列番号１１３のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０２を含む軽鎖、
ｉｘ． 配列番号１１３のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０３を含む軽鎖、
ｘ． 配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０１を含む軽鎖、
ｘｉ． 配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０２を含む軽鎖、
ｘｉｉ． 配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０３を含む軽鎖、
ｘｉｉｉ． 配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０１を含む軽鎖、
ｘｉｖ． 配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０２を含む軽鎖、
ｘｖ． 配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０３を含む軽鎖、
ｘｖｉ． 配列番号１１６のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０４を含む軽鎖、
ｘｖｉｉ． 配列番号１１７のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０５を含む軽鎖、
ｘｖｉｉｉ． 配列番号１１７のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０６を含む軽鎖、
ｘｉｘ． 配列番号１１７のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０７を含む軽鎖、
ｘｘ． 配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０５を含む軽鎖、
ｘｘｉ． 配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０６を含む軽鎖、
ｘｘｉｉ． 配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０７を含む軽鎖、
ｘｘｉｉｉ． 配列番号１１９のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０５を含む軽鎖、
ｘｘｉｖ． 配列番号１１９のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０６を含む軽鎖、
ｘｘｖ． 配列番号１１９のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０７を含む軽鎖、ならびに
ｘｘｖｉ． 配列番号１２０のアミノ酸配列を含む重鎖およびアミノ酸配列配列番号１０８を含む軽鎖
から選択される重鎖（HC）と軽鎖（LC）との組合せを含む、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片である。

【0030】

[0030] 様々な形態の抗ＳＩＲＰα ｍＡｂが開示される。例えば、抗ＣＤ４７ ｍＡｂは、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、より具体的には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のヒトフレームワークおよび定常領域を有し、一部の場合において、Ｆｃ受容体の機能を変えるかまたはＦａｂアーム交換を防止する様々な変異を有する、全長ヒト化抗体、または抗体断片、例えば、本明細書で開示される、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ）断片、一本鎖Ｆｖ断片（scFv）等であり得る。

【0031】

[0031] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ｑ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４ ＰＥ、およびこれらのバリアントから選択されるＩｇＧアイソタイプを含む。

【0032】

[0032] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、ヒトＳＩＲＰαに加えてヒトＳＩＲＰγに結合する。

【0033】

[0033] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、ヒトＳＩＲＰαに選択的に結合する。

【0034】

[0034] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、ヒト腫瘍細胞に対する食作用を増加させる。

【0035】

[0035] 一部の実施形態において、本明細書で開示される抗ＳＩＲＰα ｍＡｂは、ＳＩＲＰαと、ＣＤ４７発現細胞のマーカーである少なくとも１つの第２の抗原とに特異的に結合する、多重特異性抗体である。

【0036】

[0036] 一部の実施形態において、多重特異性抗体の第２の抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ１１７、Ｃ－Ｍｅｔ、ＰＴＨＲ２、ＥＧＦＲ、ＲＡＮＫＬ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３８、ＣＤ１９／ＣＤ３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）、およびＧＤ２から選択される。

【0037】

[0037] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、ヒト腫瘍細胞に対する食作用を増加させる。

【0038】

[0038] 一部の実施形態において、ヒト腫瘍細胞に対する食作用の増加は、Ｆｃ非依存的である。

【0039】

[0039] 一部の実施形態において、ヒト腫瘍細胞に対する食作用の増加は、Ｆｃ依存的である。

【0040】

[0040] 一部の実施形態において、ヒト腫瘍細胞食作用の食作用の増加は、ＦｃγＲに依存する。

【0041】

[0041] 一部の実施形態において、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ（CD64）、ＦｃγＲＩＩＡ（CD32）、ＦｃγＲＩＩＢ（CD32）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（CD16a)、およびＦｃγＲＩＩＩＢ（CD16b）から選ばれる。

【0042】

[0042] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、ヒト腫瘍細胞に対する食作用を増加させ、腫瘍細胞上の抗原を標的とするオプソニン化モノクローナル抗体と組み合わせて投与される。

【0043】

[0043] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、ヒト腫瘍細胞に対する食作用を増加させ、腫瘍細胞上の抗原を標的とするオプソニン化モノクローナル抗体と組み合わせて投与され、オプソニン化モノクローナル抗体は、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＲＡＮＫＬ、抗ＳＬＡＭＦ７、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ１９／ＣＤ３、および抗ＧＤ２抗体のうちの１つまたは複数から選択される。一部の実施形態において、オプソニン化モノクローナル抗体は、リツキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、デノスマブ、ペルツズマブ、パニツムマブ、エロツズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ネシツムマブ、ダラツムマブ、オビヌツズマブ、ブリナツモマブ、およびジヌツキシマブのうちの１つまたは複数から選択される。

【0044】

[0044] 一部の実施形態において、オプソニン化モノクローナル抗体は、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、およびＰＤ－Ｌ１を標的とする。

【0045】

[0045] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、抗腫瘍活性を呈する。

【0046】

[0046] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、参照により全体が本明細書に援用される米国特許第１０，２３９，９４５号に記載される、抗ＣＤ４７抗体と組み合わせて投与される。

【0047】

[0047] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、抗ＥＧＦＲ抗体と組み合わせて投与される。

【0048】

[0048] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与される。

【0049】

[0049] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、抗ＣＴＬＡ－４抗体と組み合わせて投与される。

【0050】

[0050] 一部の実施形態において、本開示は、任意選択によりキメラまたはヒト化形態である、本明細書で開示される抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたは抗原結合性断片のうちの１つまたは複数と、薬学的または生理学的に許容される担体、賦形剤、または添加剤とを含む、医薬組成物を提供する。

【0051】

[0051] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、ヒト用の療法において使用するためのものである。

【0052】

[0052] 一部の実施形態において、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂまたはその抗原結合性断片は、ヒト患者におけるがんを予防または治療する際に使用するためのものである。

【0053】

[0053] 本開示に先立って、本明細書に記載される機能プロファイルを有する抗ＳＩＲＰα ｍＡｂを特定する必要があった。本開示の抗ＳＩＲＰα ｍＡｂは、該ｍＡｂを、ヒト用の療法、特に、固形がんおよび血液がんの予防および／または治療において使用することに関して特に有利とする特性の組合せを呈する。

【0054】

[0054] 一部の実施形態において、がんは、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、乳がん、子宮内膜がん、結腸がん（結腸直腸がん）、直腸がん、膀胱がん、尿路上皮がん、肺がん（非小細胞肺がん、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌）、気管支がん、骨がん、前立腺がん、膵がん、胃がん、肝細胞癌、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、腎細胞癌、甲状腺がん、頭頸部の扁平上皮癌（頭頸部がん）、精巣がん、内分泌腺のがん、副腎のがん、下垂体のがん、皮膚のがん、軟部組織のがん、血管のがん、脳のがん、神経のがん、目のがん、髄膜のがん、中咽頭のがん、下咽頭のがん、子宮頸のがん、および子宮のがん、神経膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、ガストリノーマ、神経芽腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、および肉腫から選択される。

【0055】

[0055] 一部の実施形態において、白血病は、全身性肥満細胞症、急性リンパ性（リンパ芽球性） 白血病（ALL）、Ｔ細胞ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（AML）、骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、骨髄増殖性疾患／新生物、骨髄異形成症候群、単核球細胞白血病、および形質細胞白血病からなる群から選択され、前記リンパ腫は、組織球性リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫、ならびに、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（NHL）、細胞リンパ腫（FCC）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、びまん性大細胞型リンパ腫（DLCL）、小リンパ球性（SL）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、およびワルデンストローム・マクログロブリン血症を含む、Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択され、前記肉腫は、骨肉腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、滑膜肉腫、胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、および軟骨肉腫からなる群から選択される。

【0056】

[0056] 一部の実施形態において、配列番号１２１の配列内のエピトープに特異的に結合する抗ＳＩＲＰαモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を使用して、腫瘍および／または免疫細胞におけるＳＩＲＰα発現をアッセイする方法が開示される。

【0057】

[0057] 一部の実施形態において、本方法は、患者試料を得ることと、患者試料を、配列番号１２１の配列内のエピトープに特異的に結合する抗ＳＩＲＰαモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片と接触させることと、患者試料に対する抗体の結合についてアッセイすることとを含み、患者試料に対する抗体の結合は、患者試料におけるＳＩＲＰα発現を示す。

【0058】

[0058] 一部の実施形態において、配列番号１２２の配列内のエピトープに特異的に結合する抗ＳＩＲＰαモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を使用して、腫瘍および／または免疫細胞におけるＳＩＲＰγ発現をアッセイする方法が開示される。

【0059】

[0059] 一部の実施形態において、本方法は、患者試料を得ることと、患者試料を、配列番号１２２の配列内のエピトープに特異的に結合する抗ＳＩＲＰγモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片と接触させることと、患者試料に対する抗体の結合についてアッセイすることとを含み、患者試料に対する抗体の結合は、患者試料におけるＳＩＲＰγ発現を示す。

【0060】

[0060] 一部の実施形態において、腫瘍は主に、がん腫瘍または転移性がん腫瘍である。

【0061】

[0061] 一部の実施形態において、患者試料に対する抗ＳＩＲＰαモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片の結合についてのアッセイは、組織試料の免疫組織化学的標識、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、またはフローサイトメトリーを利用する。

【0062】

[0062] 一部の実施形態において、本方法は腫瘍細胞を含み、アッセイは、患者試料中の腫瘍細胞に対する抗ＳＩＲＰαモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片の結合についてアッセイすることを含む。

【0063】

[0063] 本開示の利用可能性のさらなる範囲は、以下に提示される詳細な説明から明らかになるはずである。しかし、本開示の主旨および範囲から逸脱しない様々な変更および改変が、この詳細な説明から当業者に明らかになるはずであり、よって詳細な説明および具体的な例は、本開示の実施形態を示しているものの、例示のためだけに与えられている点については理解しなければならない。

【0064】

[0064] 本開示の上記およびその他の態様、特徴、および利点は、添付の図面と組み合わせてなされる以下の詳細な説明からよりよく理解されることになるが、これらのすべては例示のためだけに与えられ、本開示において限定されるものではない。

【図面の簡単な説明】

【0065】

【図1A-1V】[0065]抗ＳＩＲＰ抗体のヒトＳＩＲＰαへの結合。抗ＳＩＲＰ抗体の組換えヒトＳＩＲＰαへの結合を、固相ＥＬＩＳＡによって決定した。高結合ＥＬＩＳＡプレートを組換えヒトＳＩＲＰαで被覆し、漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ抗体を１時間添加した。ウェルを洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識二次抗体を用いて１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。抗ＳＩＲＰα抗体１～２３についての結果を示す。

【0066】

【図2】[0066]ハイブリドーマ由来ｍＡｂ（SIRP1、SIRP2、およびSIRP3）のＳＩＲＰαを発現するＴＨＰ１細胞への結合。ＳＩＲＰ１、ＳＩＲＰ２、およびＳＩＲＰ３のＴＨＰ－１単核球細胞株への結合を決定した。細胞を、漸増する濃度の抗体を用いて１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、次いで、Ａｌｅｘａｆｌｏｕｒ６４７標識二次抗体を用いて１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを使用して抗体結合を測定した。

【0067】

【図3A-3V】[0067]抗ＳＩＲＰ抗体のヒトＳＩＲＰガンマへの結合。抗ＳＩＲＰ抗体の組換えヒトＳＩＲＰガンマ（SIRPγ）への結合を、固相ＥＬＩＳＡによって決定した。高結合ＥＬＩＳＡプレートを組換えヒトＳＩＲＰガンマで被覆し、漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ抗体を１時間添加した。ウェルを洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識二次抗体を用いて１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。抗ＳＩＲＰα抗体１～２３についての結果を示す。

【0068】

【図4A-4B】[0068]ＳＩＲＰ ｍＡｂのＳＩＲＰγを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞への結合。ＳＩＲＰ１、ＳＩＲＰ２、ＳＩＲＰ３、ＳＩＲＰ４、およびＳＩＲＰ９のＪｕｒｋａｔ Ｔ－ＡＬＬ細胞への結合を決定した。細胞を、漸増する濃度の抗体（図４Ａ）、または１０μｇ／ｍｌの抗ＳＩＲＰ抗体（図４Ｂ）を用いて１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａｆｌｏｕｒ６４７標識二次抗体を用いて１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを使用して抗体結合を測定した。

【0069】

【図5A-5G】[0069]抗ＳＩＲＰ抗体による、ヒトＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合の遮断。ＣＤ４７と組換えヒトＳＩＲαの間の相互作用を遮断する抗ＳＩＲＰ抗体の能力を、固相ＥＬＩＳＡによって決定した。高結合ＥＬＩＳＡプレートを組換えヒトＳＩＲＰαで被覆し、漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ抗体を１時間添加した。ウェルを洗浄し、次いで、Ｆｃタグ付きヒトＣＤ４７を用いて１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識二次抗体を用いて１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

【0070】

【図6A-6H】[0070]抗ＳＩＲＰ抗体による、ヒトＣＤ４７／ＳＩＲＰγ結合の遮断。ＣＤ４７と組換えヒトＳＩＲＰγの間の相互作用を遮断する抗ＳＩＲＰ抗体の能力を、固相ＥＬＩＳＡによって決定した。高結合ＥＬＩＳＡプレートを組換えヒトＳＩＲＰγで被覆し、漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ抗体を１時間添加した。ウェルを洗浄し、次いで、Ｆｃタグ付きヒトＣＤ４７を用いて１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識二次抗体を用いて１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

【0071】

【図7A-7B】[0071]抗ＳＩＲＰ抗体は食作用を増強する。ヒトマクロファージを、９６ウェルプレート中に１ウェル当たり３×１０^４細胞の濃度で播種し、２４時間接着させた。８×１０^４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と、漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ抗体（図７Ａ）、または１０μｇ／ｍｌの抗ＳＩＲＰ抗体（図７Ｂ）とをマクロファージ培養物に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。食作用を受けていないＪｕｒｋａｔ細胞を除去し、マクロファージ培養物を洗浄した。マクロファージをトリプシン処理し、ＣＤ１４について染色した。フローサイトメトリーを使用して、全ＣＤ１４^＋集団中のＣＤ１４^＋／ＣＦＳＥ^＋細胞の百分率を求めた。

【0072】

【図8A-8J】[0072]抗ＳＩＲＰ抗体は、抗ＣＤ４７抗体との組合せにおいて食作用を増強する。ヒトマクロファージを、９６ウェルプレート中に１ウェル当たり３×１０^４細胞の濃度で播種し、２４時間接着させた。８×１０^４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と、漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ抗体単独、抗ＣＤ４７抗体単独、または抗ＳＩＲＰ抗体と抗ＣＤ４７抗体との組合せとをマクロファージ培養物に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。食作用を受けていないＪｕｒｋａｔ細胞を除去し、マクロファージ培養物を洗浄した。マクロファージをトリプシン処理し、ＣＤ１４について染色した。フローサイトメトリーを使用して、全ＣＤ１４^＋集団中のＣＤ１４^＋／ＣＦＳＥ^＋細胞の百分率を求めた。

【0073】

【図9A-9D】[0073]抗ＳＩＲＰ抗体は、抗ＣＤ２０抗体との組合せにおいて食作用を増強する。ヒトマクロファージを、９６ウェルプレート中に１ウェル当たり３×１０^４細胞の濃度で播種し、２４時間接着させた。８×１０^４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識ヒトＲＡＪＩリンパ腫細胞と、漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ抗体単独、抗ＣＤ２０抗体であるＲｉｔｕｘａｎ単独、または抗ＳＩＲＰ抗体とＲｉｔｕｘａｎとの組合せとをマクロファージ培養物に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。食作用を受けていないＲＡＪＩ細胞を除去し、マクロファージ培養物を洗浄した。マクロファージをトリプシン処理し、ＣＤ１４について染色した。フローサイトメトリーを使用して、全ＣＤ１４^＋集団中のＣＤ１４^＋／ＣＦＳＥ^＋細胞の百分率を求めた。

【0074】

【図10A-10B】[0074]抗ＳＩＲＰ抗体は、抗ＥＧＦＲおよび抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組合せにおいて食作用を増強する。ヒトマクロファージを、９６ウェルプレート中に１ウェル当たり３×１０^４細胞の濃度で播種し、２４時間接着させた。８×１０^４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識ヒトＦａＤｕ ＨＮＳＣＣと、漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ抗体単独、抗ＥＧＦＲ抗体であるＥｒｂｉｔｕｘ単独、または抗ＳＩＲＰ抗体とＥｒｂｉｔｕｘもしくはアベルマブとの組合せとをマクロファージ培養物に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。食作用を受けていないＦａＤｕ細胞を除去し、マクロファージ培養物を洗浄した。マクロファージをトリプシン処理し、ＣＤ１４について染色した。フローサイトメトリーを使用して、全ＣＤ１４^＋集団中のＣＤ１４^＋／ＣＦＳＥ^＋細胞の百分率を求めた。

【0075】

【図11】[0075]抗ＳＩＲＰ抗体はマクロファージおよび樹状細胞上のＳＩＲＰαに結合する。抗ＳＩＲＰ抗体のヒトマクロファージまたは樹状細胞への結合を決定した。ヒト単球由来マクロファージを、漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ抗体を用いて１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、次いで、ＡＦ６４７標識二次抗体を用いて４５分間インキュベートし、洗浄し、フローサイトメトリーを使用して抗体結合を測定した。

【0076】

【図12A-12C】[0076]抗ＳＩＲＰ抗体は、ナイーブおよび活性化Ｔ細胞上のＳＩＲＰγに結合する。抗ＣＤ３被覆プレート上での３日間の活性化後における、抗ＳＩＲＰ抗体のナイーブＴ細胞（図１２Ａおよび図１２Ｂ）または活性化Ｔ細胞（図１２Ｃ）への結合を、フローサイトメトリーによって決定した。Ｔ細胞を漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ抗体を用いて１時間インキュベートし、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗マウス二次抗体を１時間添加した。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを使用して抗体結合を測定した。

【0077】

【図13】[0077]マクロファージ上の抗ＳＩＲＰ抗体によるヒトＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合の遮断。組換えヒトＣＤ４７とマクロファージ発現ＳＩＲＰαの間の相互作用を遮断する抗ＳＩＲＰ抗体の能力を、フローサイトメトリーによって決定した。インキュベーションに先立ち、１０μｇ／ｍｌの抗ＳＩＲＰ抗体を用いてマクロファージ上のＦｃ受容体を遮断した。ＡＦ６４７タグ付き抗ヒト二次抗体を使用して、可溶性Ｆｃタグ付きヒトＣＤ４７（２０μｇ／ｍｌ）の結合を測定した。

【0078】

【図14A-14B】[0078]抗ＳＩＲＰ抗体は、同種樹状細胞刺激時にＴ細胞増殖を阻害しない。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ標識ヒトＣＤ３ Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍｌ抗ＳＩＲＰ抗体の存在下、同種ヒト単球由来樹状細胞により１：５のＴ細胞：ＤＣ比で活性化することによって、Ｔ細胞の増殖に対する抗ＳＩＲＰ抗体の効果を決定した。フローサイトメトリーを使用して、６～７日間の共培養後における増殖したＣＤ３ Ｔ細胞の百分率を求めた。点線は、ｈＩｇＧ４Ｐ対照の増殖を表す。

【0079】

【図15】[0079]抗ＳＩＲＰ抗体は、抗原リコール応答を阻害しない。ヒトサイトメガロウイルス血清陽性ドナーから得たＰＢＭＣを使用して、Ｔ細胞抗原リコール応答に対する抗ＳＩＲＰ抗体の効果を評価した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素標識ＰＢＭＣを、漸増する濃度のＣＭＶ抗原の存在下、１０μｇ／ｍｌの抗ＳＩＲＰ抗体を用いて５日間インキュベートした。フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団中におけるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素の希釈により、Ｔ細胞増殖率を決定した。

【0080】

【図16】[0080]抗ＳＩＲＰ抗体は、ＳＩＲＰα高次構造および／またはアーキテクチャをもたらす。フローサイトメトリー（FCET）を使用して、フィコエリトリン（PE）と、アロフィコシアニン（APC）とコンジュゲートした非競合性抗ＳＩＲＰ抗体の間の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）効率を測定することにより、ＳＩＲＰαの二量体化／クラスター形成／アーキテクチャに対する抗ＳＩＲＰ抗体の効果を評価した。ヒトＣＤ１４＋単球を、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦを補足したＡＩＭ－Ｖ培地中で６日間培養して、これらをマクロファージへと分化させた。１０μｇ／ｍｌの抗ＳＩＲＰ抗体で３時間処理した後、ＰＥまたはＡＰＣで標識した非競合性ＳＩＲＰα抗体（クローンSE5A5）でマクロファージを染色した。フローサイトメトリーを使用してＰＥ／ＡＰＣ対間のＦＲＥＴ効率をアッセイし、３波長補正モデルを使用した。

【0081】

【図17】[0081]抗ＳＩＲＰ抗体は、ＳＩＲＰα抗体の内在化を誘導する。ヒトマクロファージおよびｐＨｒｏｄｏ ｇｒｅｅｎ標識抗ＳＩＲＰ抗体を使用して、ＳＩＲＰα抗体複合体の内在化に対する抗ＳＩＲＰ抗体の効果を評価した。マクロファージへの分化のために、末梢血単核細胞から単離したヒトＣＤ１４＋単球を、インビトロで７日間、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦを補足したＡＩＭ－Ｖ培地中で培養した。マクロファージを１０μｇ／ｍｌの抗ＳＩＲＰ抗体を用いて３７℃で最長１時間インキュベートし、フローサイトメトリーによって内在化を測定した。ｐＨｒｏｄｏ Ｇｒｅｅｎマイクロスケールタンパク質標識キットを使用して、ＳＩＲＰ抗体を標識した。

【0082】

【図18】[0082]抗ＳＩＲＰモノクローナル抗体は、細胞表面ＳＩＲＰαレベルを低下させる。ヒトマクロファージを使用して、細胞表面上におけるＳＩＲＰαの発現量に対する抗ＳＩＲＰ抗体の効果を、フローサイトメトリーによって評価した。末梢血単核細胞から単離したヒトＣＤ１４＋単球を、インビトロで７日間、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦを補足したＡＩＭ－Ｖ培地中で分化させて、ヒトマクロファージを作製した。Ｖ底９６ウェルプレートにおいて、ヒトマクロファージをＡＩＭ－Ｖ培地中で２時間インキュベートした。次いで、細胞を、１０μｇ／ｍｌのｍＩｇＧ１対照、ＳＩＰＲ４、ＳＩＲＰ９、１８Ｄ５、またはＫＷＡＲ２３を用いて、５％ＣＯ_２にて、４℃で２時間、または３７℃で２時間、４時間、６時間、もしくは２４時間インキュベートした。続いて、非競合性蛍光標識抗ＳＩＲＰα抗体を使用して、細胞表面ＳＩＲＰαレベルをフローサイトメトリーによって測定した。

【0083】

【図19A-19B】[0083]抗ＳＩＲＰ抗体は、ＳＩＲＰアルファ対立遺伝子バリアントとは無関係に、腫瘍細胞に対する食作用を誘導する。異なるＳＩＲＰα対立遺伝子バリアントを保有するマクロファージによる腫瘍細胞に対する食作用に対する抗ＳＩＲＰα抗体の効果を、フローサイトメトリーを使用したインビトロアッセイによって評価した。ＣＤ１４＋単球から、異なるＳＩＲＰα対立遺伝子群ドナー（v1/v1、v1/v2、およびv2/v2）に由来するヒト単球由来マクロファージを分化させ、補足物のないＡＩＭ－Ｖ培地中で２時間培養した。ヒトがん細胞を１μＭ ５（６）－カルボキシフルオレセイン二酢酸Ｎ－スクシンイミジルエステルで標識し、８×１０^４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレート中のマクロファージ培養物に添加した。標的およびエフェクター細胞を混合してすぐに、抗ＳＩＲＰ抗体を添加した。図１９Ａは、様々な濃度で添加した抗ＳＩＲＰまたはｍＩｇＧ１対照抗体を示し、図１９Ｂは、１０μｇ／ｍｌの濃度の場合を示す。３７℃で４時間のインキュベーションの後、食作用を受けていないすべての細胞を除去し、残りの細胞をＰＢＳで３回洗浄した。Ａｃｃｕｔａｓｅを使用してマクロファージを剥離し、アロフィコシアニン（APC）標識ＣＤ１４抗体１００ｎｇで３０分間染色し、フローサイトメトリーによって分析した。食作用を、ＣＤ１４＋細胞集団内でのＣＦＳＥ＋細胞の百分率として決定した。

【0084】

【図20】[0084]抗ＳＩＲＰモノクローナル抗体は、ＳＩＲＰα結合について互いに競合しない。Ｈｉｓタグ付きヒトＳＩＲＰαタンパク質およびビオチン化ＳＩＲＰα抗体を使用したＥＬＩＳＡにより、ヒトＳＩＲＰαへの結合における抗ＳＩＲＰ抗体間の競合を評価した。

【0085】

【図21A-21B】[0085]抗ＳＩＲＰ抗体のヒトがん細胞株への結合は、それらによるＳＩＲＰαおよびＳＩＲＰγの発現と相関する。食作用アッセイで使用したヒトがん細胞株（Jurkat T-ALL、RAJI B細胞リンパ腫、DLD-1結腸直腸腺癌、RL95-2子宮内膜癌、およびES-2卵巣癌）における抗ＳＩＲＰ ｍＡｂの結合、ならびにＳＩＲＰα／β、ＳＩＲＰγ、およびＣＤ４７の表面発現を、フローサイトメトリーによって評価した。図２１Ａは、食作用アッセイで使用されたがん細胞株上での、市販の抗ＣＤ４７クローンＢ６Ｈ１２によって測定したＣＤ４７の発現、ＳＩＲＰα／βの発現（市販のクローンSE5A5で測定）、およびＳＩＲＰγの発現（市販のクローンLSB2.20で測定）を示す。図２１Ｂは、ＳＩＲＰ４およびＳＩＲＰ９の結合が、市販の抗ＳＩＲＰ抗体によって確認されるＳＩＲＰα／βまたはＳＩＲＰγ発現とよく相関していることを示す。^＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。

【0086】

【図22A-22D】[0086]抗ＳＩＲＰ抗体誘導性食作用はＦｃ受容体を関与させる。ヒト単球由来マクロファージを、９６ウェルプレート中に１ウェル当たり３×１０^４細胞の濃度で播種し、２４時間接着させた。次いで、ヒトＦｃ受容体ＣＤ１６、ＣＤ３２、およびＣＤ６４に対する１０μｇ／ｍｌの抗体（+Fc遮断）または３０μｇ／ｍｌのｍＩｇＧ１アイソタイプ対照（-Fc遮断）を添加した。その直後に、８×１０^４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ－ＡＬＬ細胞（図２２Ａ～図２２Ｂ）またはＤＬＤ－１細胞（図２２Ｃ～図２２Ｄ）と、漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ抗体ＳＩＲＰ４（図２２Ａ～図２２Ｃ）またはＳＩＲＰ９（図２２Ｂ～図２２Ｄ）とをマクロファージ培養物に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。食作用を受けていないがん細胞を除去し、マクロファージ培養物を洗浄した。マクロファージをトリプシン処理し、ＣＤ１４について染色した。フローサイトメトリーを使用して、全ＣＤ１４^＋集団中のＣＤ１４^＋／ＣＦＳＥ^＋細胞の百分率を求めた。

【0087】

【図23A-23B】[0087]抗ＳＩＲＰ抗体誘導性食作用は、ＦｃγＲＩＩに依存する。ヒト単球由来マクロファージを、９６ウェルプレート中に１ウェル当たり３×１０^４細胞の濃度で播種し、２４時間接着させた。次いで、１０μｇ／ｍｌの、ヒトＦｃ受容体ＣＤ１６、ＣＤ３２、およびＣＤ６４に対する抗体またはｍＩｇＧ１アイソタイプ対照を個別に添加した。その直後に、８×１０^４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ－ＡＬＬ細胞と、漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ抗体ＳＩＲＰ４（図２３Ａ）またはＳＩＲＰ９（図２３Ｂ）とをマクロファージ培養物に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。食作用を受けていないがん細胞を除去し、マクロファージ培養物を洗浄した。マクロファージをトリプシン処理し、ＣＤ１４について染色した。フローサイトメトリーを使用して、全ＣＤ１４^＋集団におけるＣＤ１４^＋／ＣＦＳＥ^＋細胞の百分率を求めた。

【0088】

【図24A-24B】[0088]抗ＳＩＲＰ抗体は、正常な自己ヒト末梢血単核細胞（PBMC）に対する食作用を誘導しない。ヒト単球由来マクロファージを、９６ウェルプレート中に１ウェル当たり３×１０^４細胞の濃度で播種し、２４時間接着させた。８×１０^４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識自己正常ＰＢＭＣ（図２４Ａ）またはヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ－ＡＬＬ細胞（図２４Ｂ）と、漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ抗体ＳＩＲＰ４またはＳＩＲＰ９とをマクロファージ培養物に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。食作用を受けていない細胞を除去し、マクロファージ培養物を洗浄した。マクロファージをトリプシン処理し、ＣＤ１４について染色した。フローサイトメトリーを使用して、全ＣＤ１４^＋集団中のＣＤ１４^＋／ＣＦＳＥ^＋細胞の百分率を求めた。

【発明を実施するための形態】

【0089】

[0089] 定義
別段の定義がなされない限り、本開示との関連で使用される科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、タンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学、ならびにハイブリダイゼーションとの関連で利用される命名法、およびそれらの技法は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されているものである。

【0090】

[0090] 本明細書で使用される場合、「ＳＩＲＰα」および「Ｓｒｃホモロジー２（SH2）ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ基質１（SHPS-1）」という用語は同義であり、交換可能に使用することができる。

【0091】

[0091] 「抗ＳＩＲＰα抗体」という用語は、治療剤または診断剤としての使用が意図され、ＳＩＲＰα、特にヒトＳＩＲＰαに特異的に結合する、本開示の抗体を指す。

【0092】

[0092] 「抗ＳＩＲＰ」という用語は、治療剤または診断剤としての使用が意図され、ＳＩＲＰα、特にヒトＳＩＲＰα、特定されている２つの一般的なバリアントであるＳＩＲＰαＶ１およびＳＩＲＰαＶ２の一方もしくは両方、ならびに／またはＳＩＲＰγおよびその抗体バリアントに特異的に結合する、本開示の抗体を指す。

【0093】

[0093] 本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン（Ig）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応を行う）抗原結合部位を含む分子を指す。～と、または～に対して、「特異的に結合する」または「免疫反応を行う」は、抗体が、所望の抗原の１つまたは複数の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応しないか、またははるかに低い親和性（K_d > 10^-6 M）で結合することを意味する。抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、一本鎖Ｆｖ断片、および片腕抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0094】

[0094] 本明細書で使用される場合、本抗ＳＩＲＰα化合物に対して適用される「モノクローナル抗体（mAb）」と言う用語は、単一コピー、または、例えば、任意の真核生物、原核生物、もしくはファージクローンなどのクローンに由来する抗体を指し、それが作製される方法ではない。本開示のモノクローナル抗体は、好ましくは、均一または実質的に均一な集団中に存在する。完全なｍＡｂは、２本の重鎖と２本の軽鎖とを含む。

【0095】

[0095] 「抗体断片」とは、インタクトな抗体の、該インタクトな抗体が結合する抗原に結合する一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、scFv）、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0096】

[0096] 本明細書で開示される場合、「抗体化合物」とは、ｍＡｂおよびその抗原結合性断片を指す。本開示に従う類似の機能特性を呈するさらなる抗体化合物を、常法によって作製することができる。例えば、マウスをヒトＳＩＲＰαまたはその断片によって免疫化することができ、得られた抗体を回収および精製することができ、これらが本明細書で開示される抗体化合物と類似または同一の結合および機能特性を有しているか決定することを、実施例に開示される方法によって評価することができる。常法によって抗原結合性断片を調製することもできる。抗体および抗原結合性断片を作製および精製するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， 第５～８および１５章に見出すことができる。

【0097】

[0097] 本明細書で開示される場合、「多重特異性抗体」は、例えば、二重特異性、三重特異性、または四重特異性抗体である。一部の実施形態において、多重特異性抗体は、ＳＩＲＰαおよび／またはＳＩＲＰγと、１つの分子中における少なくとも１つの他の抗原結合特異性とを標的とする。一部の実施形態において、多重特異性抗体は、ＳＩＲＰαおよび／またはＳＩＲＰγと、少なくとも第２の抗原（二重特異性）、または少なくとも第２および第３の抗原（三重特異性）、または少なくとも第２、第３、および第４の抗原（四重特異性）とを同時に標的としてもよく、この場合、第２の抗原、第３の抗原、および第４の抗原は、本明細書で開示される腫瘍細胞上に存在する。

【0098】

[0098] 二重特異性抗体は、１つの分子中に２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。同様に、三重特異性抗体は、１つの分子中に３つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。四重特異性抗体は、１つの分子中に４つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。一実施形態において、本明細書で開示される抗ＳＩＲＰα抗体は、ＳＩＲＰαおよび／またはＳＩＲＰγと、本明細書で開示される腫瘍細胞上の第２の抗原とを標的とする、二重特異性抗体である。

【0099】

[0099] 一部の実施形態において、二重特異性抗体は、対称または非対称アーキテクチャを有する分子形式を含んでいてもよい。

【0100】

[0100] 非対称二重特異性抗体としては、二重特異性抗体コンジュゲート、ハイブリッド二重特異性ＩｇＧ、ハイブリッド二重特異性ＩｇＭ、「可変ドメイン単独」二重特異性抗体分子、Ｃ_Ｈ１／Ｃ_Ｌ融合タンパク質、Ｆａｂ融合タンパク質、非免疫グロブリン融合タンパク質、Ｆｃ改変ＩｇＧ、Ｆｃ改変ＩｇＭ、付加Ｆｃ改変ＩｇＧ、付加Ｆｃ改変ＩｇＧＭ、および改変Ｆｃ／Ｃ_Ｈ３融合タンパク質を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0101】

[0101] 対称二重特異性抗体としては、付加ＩｇＧ－ＨＣ融合物、付加ＩｇＧ－ＬＣ融合物、付加ＩｇＧ－ＨＣ／ＬＣ融合物、Ｆｃ融合物、Ｃ_Ｈ３融合物、ＩｇＥ、ＩｇＭ／Ｃ_Ｈ２融合物、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｃ_Ｈ１／ＣＬ融合タンパク質、改変ＩｇＧ、および非免疫グロブリン融合物を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0102】

[0102] モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が、マウス抗体、特に、マウスＣＤＲにおける対応する配列と同一または相同であり、一方で、該鎖の残りがヒト抗体における対応する配列と同一または相同である抗体を包含する。本開示の他の実施形態は、これらのモノクローナル抗体と類似または同一の結合および生物学的特性を呈する、該モノクローナル抗体の抗原結合性断片を含む。本開示の抗体は、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域と、ＩｇＧサブクラスＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の定常領域などの、重鎖ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ定常領域とを含むことができ、一部の場合、Ｆｃ受容体機能を変える様々な変異を有する。

【0103】

[0103] ここで開示されるマウスＣＤＲを含むモノクローナル抗体を、組換えＤＮＡ方法を含む、当業者に公知の様々な方法のいずれかによって調製することができる。

【0104】

[0104] 抗体を操作および改良するための現行の方法に関する総説は、例えば、Ｐ． Ｃｈａｍｅｓ編， （２０１２） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， 第２版（Methods in Molecular Biology, Book 907）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ－１０：１６１７７９９７３４；Ｃ． Ｒ． Ｗｏｏｄ編， （２０１１） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Molecular Medicine and Medicinal Chemistry, Book 4）， Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｒｅｓｓ；Ｒ． ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＳ． Ｄｕｂｅｌ編， （２０１０） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ第１および２巻（Springer Protocols）， 第２版；およびＷ． ＳｔｒｏｈｌおよびＬ． Ｓｔｒｏｈｌ（２０１２） Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ａｄｖａｎｃｅｓ ｄｒｉｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｒｅａ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｙ， Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに見出すことができる。

【0105】

[0105] 抗体および抗原結合性断片を作製および精製するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， 第５～８および１５章に見出すことができる。

【0106】

[0106] 天然に存在する完全長抗体は、４本のポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合で相互接続された、２本の同一の重鎖（H）と２本の同一の軽鎖（L）とを含む、「Ｙ」型の免疫グロブリン（Ig）分子である。各鎖のアミノ末端部分は抗原結合性フラグメント領域（FAB）と称され、約１００～１１０個以上のアミノ酸からなる可変領域を含み、可変領域は、そこに含まれる相補性決定領域（CDR）を介する抗原認識に主に関与する。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域（「FC」領域）を定める。

【0107】

[0107] ＣＤＲ間には、より保存された、フレームワーク（「FR」）と称される領域が挟まっている。多くのＦＲのアミノ酸配列が当技術分野において周知である。各々の軽鎖可変領域（LCVR）および重鎖可変領域（HCVR）は、３つのＣＤＲと４つのＦＲとで構成されており、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲｌ、ＣＤＲｌ、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で並んでいる。軽鎖の３つのＣＤＲは「ＬＣＤＲｌ、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と呼ばれ、重鎖の３つのＣＤＲは「ＨＣＤＲｌ、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と呼ばれる。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大半を含む。ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲアミノ酸残基に対する付番および位置付けは、周知のＫａｂａｔによる付番の慣習である、Ｋａｂａｔら（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， ＮＩＨ出版番号９１－３２４２に従う。

【0108】

[0108] 本明細書に記載される、「抗原結合部位」は、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」としても定義することができ、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917, 1987）によって定義される、抗体可変ドメインの構造的超可変領域を指し得る。６つのＨＶＲ、すなわち、ＶＨ中に３つ（H1、H2、H3）、ＶＬ中に３つ（L1、L2、L3）のＨＶＲが存在する。本明細書では、Ｈ１を含むように延長されるＨ－ＣＤＲ１を除き、Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲを使用した。

【0109】

[0109] ５種類の哺乳動物免疫グロブリン（Ig）重鎖が存在し、これらはギリシャ文字のα（アルファ）、δ（デルタ）、ε（イプシロン）、γ（ガンマ）、およびμ（ミュー）で表され、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ，またはＩｇＭとして、抗体のクラスまたはアイソタイプを定義する。ＩｇＧ抗体は、例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のサブクラスにさらに分けることができる。

【0110】

[0110] 各々の重鎖型は、当技術分野において周知の配列を有する特定の定常領域によって特徴付けられる。定常領域は同じアイソタイプの全抗体間で同一だが、異なるアイソタイプの抗体間で異なる。重鎖γ、α、およびδは、３つのタンデム免疫グロブリン（Ig）ドメインと、可撓性の付加に関わるヒンジ領域とから構成される、定常領域を有する。重鎖μおよびεは、４つのＩｇドメインから構成される定常領域を有する。

【0111】

[0111] ヒンジ領域は、抗体のＦｃ部分とＦａｂ部分とを連結する、可撓性のあるアミノ酸区間である。この領域はジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を含み、２本の重鎖を一体に接続している。

【0112】

[0112] 重鎖の可変領域は、異なるＢ細胞によって産生された抗体間で異なるが、単一のＢ細胞またはＢ細胞クローンによって再生された全抗体で同一である。各重鎖の可変領域はおよそ１１０個のアミノ酸長であり、単一のＩｇドメインから構成される。

【0113】

[0113] 哺乳動物において、軽鎖はカッパ（κ）またはラムダ（λ）に分類され、当技術分野で知られている特定の定常領域によって特徴付けられる。軽鎖は、２つの連続するドメイン、すなわち、アミノ末端における１つの可変ドメインと、カルボキシ末端における１つの定常ドメインとを有する。各々の抗体は常に同一である２本の軽鎖を含み、哺乳動物においては、１つの抗体にκまたはλの一方のみの種類の軽鎖が存在する。

【0114】

[0114] Ｆｃ領域は、抗体のクラスに応じて３つまたは４つの定常ドメインを与える２本の重鎖から構成され、免疫細胞活性を調節する役割を果たしている。Ｆｃ領域は、特定のタンパク質に結合することにより、各々の抗体が所与の抗原に対して適当な免疫応答を生じることができるようにする。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体などの様々な細胞受容体や、補体タンパク質などの他の免疫分子にも結合する。こうすることにより、Ｆｃ受容体は、オプソニン化、細胞溶解、ならびに肥満細胞、好塩基球、および好酸球の脱顆粒を含む、種々の生理学的効果を媒介する。

【0115】

[0115] 本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体または抗体断片が結合するペプチドまたはタンパク質上に位置するアミノ酸の、特異的な配列を指す。エピトープは、多くの場合、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面の化学的に活性な一群からなり、特異的な電荷特性に加え、特異的な三次元構造特性を有する。エピトープは、線状、すなわち、アミノ酸の単一の配列への結合を伴うものでも、立体構造的、すなわち、必ずしも直線配列中で連続になっていなくてもよい、抗原の様々な領域中のアミノ酸の２つ以上の配列への結合を伴うものでもあり得る。

【0116】

[0116] 本明細書で使用される場合、本抗体化合物に適用される「特異的に結合する」、「特異的に結合を行う」、「特異的な結合」等の用語は、特異的な結合剤（抗体など）による、特異的な結合剤および標的分子種と共に混合される他の分子種への結合よりも優先的に標的分子種に結合する能力を指す。特異的な結合剤は、それが標的分子種に特異的に結合できる場合に、その標的を特異的に認識すると言われる。

【0117】

[0117] 本明細書で使用される場合、「結合親和性」という用語は、ある分子のある部位における、別の分子への結合の強さを指す。特定の分子が別の特定の分子に結合する、または特異的に会合するならば、これらの２つの分子は、互いに対する結合親和性を呈すると言われる。結合親和性は、分子の対についての結合定数および解離定数と関連しているが、これらの定数が測定または決定されることは、本明細書の方法にとって決定的に重要というわけではない。逆に、記載される方法の分子同士の相互作用を説明するために本明細書で使用される場合、親和性は、一般に、実験的研究において観察される見かけの親和性（別段の規定がなされない限り）であり、１つの分子（例えば、抗体または他の特異的な結合パートナー）が２つの他の分子（例えば、ペプチドの２つのバージョンまたはバリアント）と結合する相対的な強さを比較するために使用することができる。結合親和性、結合定数、および解離定数という概念は周知である。

【0118】

[0118] 本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つ以上の配列を最大の配列合致となるように、すなわち、ギャップおよび挿入を考慮してアラインメントした際の、該配列中の対応する位置において同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の百分率を意味する。同一性は公知の方法によって容易に計算することができ、これらとしては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ、Ａ． Ｍ．編， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， 第Ｉ部， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．編， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ， Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８： １０７３（１９８８）に記載される方法が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、同一性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラム中に体系化されている。

【0119】

[0119] 比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、相同性アラインメントアルゴリズム、類似性探索法、もしくはこれらのアルゴリズムのコンピュータによる実装（GCG Wisconsin Package中のGAP、BESTFIT、PASTA、およびTFASTA、Accelrys, Inc., San Diego, California, United States of Americaから入手可能）、または目視よって実施することができる。概要は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．ら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３～４１０（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９～３４０２（１９９７）を参照されたい。

【0120】

[0120] パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適したアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら， ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３～４１０（１９９０）に記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから公的に入手可能である。このアルゴリズムでは、まず、問合せ配列中において、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントしたときに一致するか、またはある正の値の閾値スコアＴを満たす、長さＷの短いワードを特定し、これにより、高スコア配列ペア（HSP）を特定する。Ｔは、近接ワードスコア閾値と呼ばれる。

【0121】

[0121] これらの最初における近接ワードヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見つける探索を開始するための種値として働く。次いで、これらのワードヒットは、積算アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列の両方向に延長される。積算スコアは、塩基配列の場合、パラメータＭ（一致する残基のペアに対するリワードスコア、常時、０）およびＮ（一致しない残基のペアに対するペナルティスコア、常時、０）を使用して計算する。アミノ酸配列の場合、スコアリング行列を使用して積算スコアを計算する。各方向へのワードヒットの延長は、積算アラインメントスコアが最大到達値から量Ｘだけ下がったとき、１つまたは複数の負のスコアとなる残基アラインメントの蓄積によって積算スコアがゼロ以下になったとき、またはいずれかの配列の末端に到達したときに、停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感受性および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（塩基配列用）では、デフォルトとして、ワード長（W）１１、期待値（E）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝ー４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、デフォルトとして、ワード長（W）３、期待値（E）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する。

【0122】

[0122] ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、パーセント配列同一性の計算に加えて、２つの配列間の類似性の統計解析も行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の１つの尺度は最小合計確率（P（N））であり、これは、２つの塩基またはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を与える。例えば、試験核酸配列を参照核酸配列と比較した際の最小合計確率が、一実施形態において約０．１未満であり、別の実施形態において約０．０１未満であり、さらに別の実施形態において約０．００１未満であった場合、試験核酸配列は参照核酸配列と類似しているとみなされる。

【0123】

[0123] 本明細書で使用される場合、「ヒト化された」、「ヒト化」等の用語は、本明細書で開示されるマウスモノクローナル抗体ＣＤＲをヒトＦＲおよび定常領域に移植することを指す。これらの用語は、以下で解説するように、様々な抗体特性を改善するための、マウスＣＤＲおよびヒトＦＲに対する可能なさらなる改変を包含し、これらは、例えば、それぞれＫａｓｈｍｉｒｉら（２００５） Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（１）：２５～３４およびＨｏｕら（２００８） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４４（１）：１１５～１２０で開示される方法によって行われる。

【0124】

[0124] 本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、本明細書で開示されるものと類似した本開示による結合および機能特性を有し、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを取り囲む、実質的にヒト型または完全にヒト型のＦＲおよび定常領域を有する、ｍＡｂおよびその抗原結合性断片を指し、本明細書で開示される抗体化合物を含む。

【0125】

[0125] 本明細書で使用される場合、「ＦＲ」または「フレームワーク配列」という用語は、ＦＲ１～４のいずれか１つを指す。本開示によって包含されるヒト化抗体および抗原結合性断片は、ＦＲ１～４のうちのいずれか１つまたは複数が実質的または完全にヒト型である、すなわち、個々の実質的または完全なヒトＦＲ１～４の可能な組合せのいずれかが存在する分子を含む。例えば、これは、ＦＲ１およびＦＲ２、ＦＲ１およびＦＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３などが実質的または完全にヒト型である分子を含む。実質的にヒト型であるフレームワークは、既知のヒト生殖系列フレームワーク配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するフレームワークである。好ましくは、実質的にヒト型であるフレームワークは、本明細書で開示されるフレームワーク配列または既知のヒト生殖系列フレームワーク配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、 少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0126】

[0126] 完全にヒト型であるフレームワークは、既知のヒト生殖系列フレームワーク配列と同一なフレームワークである。ヒトＦＲ生殖系列配列を、国際免疫遺伝学（IMGT）データベースや、内容の全体が参照により本明細書に援用される、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ、Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ ＬｅｆｒａｎｃおよびＧｅｒａｒｄ Ｌｅｆｒａｎｃ著， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２００１から取得することができる。

【0127】

[0127] Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋは、ヒト抗体レパートリーを創出するために使用されるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子の大要であり、２０３種の遺伝子と４５９種の対立遺伝子についての収録項目を含み、全部で８３７個の配列が示されている。それぞれの収録項目によって、ヒト免疫グロブリン定常遺伝子、ならびに、少なくとも１つの機能的またはオープンリーディングフレーム対立遺伝子を有し、３つの主要な遺伝子座に位置する、生殖系列可変、多様性、およびジョイニング遺伝子のすべてを構成する。例えば、生殖系列軽鎖ＦＲを、ＩＧＫＶ３Ｄ－２０、ＩＧＫＶ２－３０、ＩＧＫＶ２－２９、ＩＧＫＶ２－２８、ＩＧＫＶ１－２７、ＩＧＫＶ３－２０、ＩＧＫＶ１－１７、ＩＧＫＶ１－１６、１－６、ＩＧＫＶ１－５、ＩＧＫＶ１－１２、ＩＧＫＶ１Ｄ－１６、ＩＧＫＶ２Ｄ－２８、ＩＧＫＶ２Ｄ－２９、ＩＧＫＶ３－１１、ＩＧＫＶ１－９、ＩＧＫＶ１－３９、ＩＧＫＶ１Ｄ－３９、およびＩＧＫＶ１Ｄ－３３、ならびにＩＧＫＪ１－５からなる群から選択することができ、生殖系列重鎖ＦＲを、ＩＧＨＶ１－２、ＩＧＨＶ１－１８、ＩＧＨＶ１－４６、ＩＧＨＶ１－６９、ＩＧＨＶ２－５、ＩＧＨＶ２－２６、ＩＧＨＶ２－７０、ＩＧＨＶ１－３、ＩＧＨＶ１－８、ＩＧＨＶ３－９、ＩＧＨＶ３－１１、ＩＧＨＶ３－１５、ＩＧＨＶ３－２０、ＩＧＨＶ３－６６、ＩＧＨＶ３－７２、ＩＧＨＶ３－７４、ＩＧＨＶ４－３１、ＩＧＨＶ３－２１、ＩＧＨＶ３－２３、ＩＧＨＶ３－３０、ＩＧＨＶ３－４８、ＩＧＨＶ４－３９、ＩＧＨＶ４－５９、およびＩＧＨＶ５－５１、ならびにＩＧＨＪ１－６からなる群から選択することができる。

【0128】

[0128] 実質的にヒト型であるＦＲは、既知のヒト生殖系列ＦＲ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＦＲである。好ましくは、実質的にヒト型であるフレームワークは、本明細書で開示されるフレームワーク配列または既知のヒト生殖系列フレームワーク配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0129】

[0129] 本開示によって包含されるＣＤＲは、本明細書で具体的に開示されるＣＤＲだけでなく、本明細書で開示されるＣＤＲ配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列も含む。あるいは、本開示によって包含されるＣＤＲは、本明細書で具体的に開示されるＣＤＲだけでなく、本明細書で開示されるＣＤＲ配列と比較して、対応する位置において１、２、３、４、または５個のアミノ酸変化を有するＣＤＲ配列も含む。このような配列上同一であるか、またはアミノ酸が改変されたＣＤＲは、好ましくは、インタクトな抗体によって認識される抗原に結合する。

【0130】

[0130] 本明細書で開示されるものに加え、本開示による類似の機能特性を呈するヒト化抗体は、いくつかの異なる方法、すなわち、Ａｌｍａｇｒｏら， Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．（２００８） Ｊａｎ １； １３：１６１９～３３を使用して作製することができる。１つのアプローチでは、親抗体化合物ＣＤＲを、親抗体化合物フレームワークと高い配列同一性を有するヒトフレームワーク中に移植する。新しいフレームワークの配列同一性は、一般に、親抗体化合物中の対応するフレームワークの配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性となる。１００個未満のアミノ酸残基を有するフレームワークの場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が変化し得る。この移植により、親抗体と比較して結合親和性が低下する可能性がある。これが起こる場合、Ｑｕｅｅｎら（１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：２８６９によって開示された具体的な判断基準に基づいて、フレームワークをある特定の位置で親フレームワークに逆変異させることができる。相同性および逆変異に基づいてヒト化バリアントを作製するのに有用な方法を記載するさらなる参考文献としては、Ｏｌｉｍｐｉｅｒｉら， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１５ ２月１日；３１（３）：４３４～４３５、ならびに米国特許第４，８１６，３９７、５，２２５，５３９、および５，６９３，７６１号に記載されているもの、ならびにＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Jonesら（1986） Nature 321:522-525、Riechmannら（1988） Nature 332:323-327、およびVerhoeyenら（1988） Science 239:1534-1536）が挙げられる。

【0131】

[0131] ヒト化は、１９８０年代前半に開発された方法である、キメラ化（Morrison, S. L., M. J. Johnson、L. A. Herzenberg & V. T. Oi: Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 6851-5（1984））によって開始され、これは、マウス抗体の可変（V）ドメインをヒト定常（C）ドメインと組み合わせて約７０％のヒト型含有率を有する分子を作製することからなる。

【0132】

[0132] 本明細書に記載されるヒト化抗体を作製するために、いくつかの異なる方法を使用することができる。１つのアプローチでは、親抗体化合物ＣＤＲを、親抗体化合物フレームワークと高い配列同一性を有するヒトＦＲ中に移植する。新しいＦＲの配列同一性は、一般に、親抗体化合物中の対応するＦＲの配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性となる。１００個未満のアミノ酸残基を有するＦＲの場合、１、２、３、４、５個、またはそれより多くのアミノ酸残基が変化し得る。この移植により、親抗体と比較して結合親和性が低下する可能性がある。これが起こる場合、Ｑｕｅｅｎら（１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：２８６９によって開示された具体的な判断基準に基づいて、ＦＲをある特定の位置で親フレームワークに逆変異させることができる。相同性および逆変異に基づいてヒト化バリアントを作製するのに有用な方法を記載するさらなる参考文献としては、Ｏｌｉｍｐｉｅｒｉら， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１５ ２月１日；３１（３）：４３４～４３５、ならびに米国特許第４，８１６，３９７、５，２２５，５３９、および５，６９３，７６１号に記載されているもの、ならびにＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Jonesら（1986） Nature 321:522-525、Riechmannら（1988） Nature 332:323-327、およびVerhoeyenら（1988） Science 239:1534-1536）が挙げられる。

【0133】

[0133] 逆変異のために考慮すべき残基の特定は、以下で記載されるように実施することができる。あるアミノ酸が以下のカテゴリーに当てはまる場合、使用されているヒト生殖系列配列のフレームワークアミノ酸（「アクセプターFR」）は、親抗体化合物のフレームワークに由来するフレームワークアミノ酸（「ドナーFR」）で置き換えられている。

【0134】

[0134] （ａ）アクセプターフレームワークのヒトＦＲ中のアミノ酸が、その位置におけるヒトフレームワークにとって普通ではないものの、ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸が、その位置におけるヒトフレームワークにとって典型的である；

【0135】

[0135] （ｂ）アミノ酸の位置がＣＤＲのうちの１つとすぐ隣である；または

【0136】

[0136] （ｃ）三次元免疫グロブリンモデルにおいて、フレームワークアミノ酸の任意の側鎖原子が、ＣＤＲアミノ酸の任意の原子から約５～６オングストローム（中心間）以内である。

【0137】

[0137] アクセプターフレームワークのヒトＦＲにおけるアミノ酸の各々およびドナーフレームワークにおける対応するアミノ酸が、その位置においてヒトフレームワークにとって全体として普通でない場合、そのようなアミノ酸は、その位置においてヒトフレームワークにとって典型的なアミノ酸と置き換えることができる。この逆変異判断基準により、親抗体化合物の活性を回復させることができる。

【0138】

[0138] 本明細書で開示される抗体化合物と類似する機能特性を呈するヒト化抗体を作製することに対するもう１つのアプローチでは、移植されたＣＤＲ内のアミノ酸を、フレームワークを変化させることなくランダムに変異させ、得られた分子を、親抗体化合物と同程度またはそれより良好な結合親和性およびその他の機能特性についてスクリーニングする。各ＣＤＲ内の各アミノ酸位置に単一の変異を導入し、その後、結合親和性およびその他の機能特性に対するかかる変異の影響を評価することもできる。改善された特性を生む単一の変異を組み合わせることで、互いの組合せにおけるその効果を評価することができる。

【0139】

[0139] さらに、上記アプローチの両方の組合せが可能である。ＣＤＲ移植の後、ＣＤＲ中にアミノ酸変化を導入することに加え、特定のＦＲを逆変異させることができる。この方法論は、Ｗｕら（１９９９） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９４： １５１～１６２に記載されている。

【0140】

[0140] 本開示の教示を適用することで、当業者は、一般的な技法、例えば、部位特異的変異誘発を使用して、本開示によるＣＤＲおよびＦＲ配列内のアミノ酸を置換し、これにより本配列に由来するさらなる可変領域アミノ酸配列を作製することができる。最大ですべての天然に存在するアミノ酸を、特定の置換部位に導入することができる。次いで、指定されたインビボ機能を有する配列を特定するために、本明細書で開示される方法を使用して、これらのさらなる可変領域アミノ酸配列をスクリーニングすることができる。このように、本開示に従ってヒト化抗体およびそれらの抗原結合部分を調製するのに適する、さらなる配列を特定することができる。好ましくは、フレームワーク内のアミノ酸置換は、本明細書で開示される４つの軽鎖および／または重鎖ＦＲのうちの任意の１つまたは複数の中における、１、２、３、４、または５箇所に限定される。好ましくは、ＣＤＲ内のアミノ酸置換は、３つの軽鎖および／または重鎖ＣＤＲのうちの任意の１つまたは複数の中における、１、２、３、４、または５箇所に限定される。これらＦＲおよびＣＤＲ内における上述の様々な変化の組合せもまた、可能である。

【0141】

[0141] 上記で解説したアミノ酸改変を導入することによって作製された抗体化合物の機能特性が本明細書で開示される特定の分子が呈する機能特性に従うことは、本明細書で開示される実施例における方法によって確認することができる。

【0142】

[0142] 上述のように、患者におけるヒト抗マウス抗体（HAMA）応答の誘発という問題を回避するために、マウス抗体を、抗原結合部位の完全性にとって必須と思われるそのマウスフレームワーク残基を維持しつつ、その相補性決定領域（CDR）をヒト免疫グロブリン分子の可変軽鎖（V_L）および可変重鎖（V_H）フレームワーク上に移植することによって遺伝子操作することで、そのマウス型の内容をヒトの対応物中に存在するアミノ酸残基と徐々に置き換えておく。しかし、ヒト化抗体の異種ＣＤＲは、患者において抗イディオタイプ（抗Id）応答を惹起する可能性がある。

【0143】

[0143] 抗Ｉｄ応答を最小化するために、抗体－リガンド相互作用において最も重要なＣＤＲ残基のみをヒトフレームワーク上に移植することによる、「ＳＤＲ移植」と呼ばれる異種抗体をヒト化する手順が開発されており、この手順では、ＣＤＲの重要な特異性決定残基（SDR）のみをヒトフレームワーク上に移植する。Ｋａｓｈｍｉｒｉら（２００５） Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（１）：２５～３４に記載されているこの手順では、既知の構造を有する抗原－抗体複合体の三次元構造のデータベースの助けを借りて、または抗体結合部位の変異分析により、ＳＤＲを特定することが行われる。より多くのＣＤＲ残基を保持することを伴うヒト化の別なアプローチは、すべてのＳＤＲを含むＣＤＲ残基の区間である、「省略された」ＣＤＲの移植に基づく。Ｋａｓｈｍｉｒｉらは、マウス抗体を投与された患者から得られた血清に対するヒト化抗体の反応性を評価する手順も開示している。

【0144】

[0144] 免疫原性特性が改善されたヒト抗体バリアントを構築するためのもう１つの戦略が、Ｈｏｕら（２００８） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４４（１）：１１５～１２０に開示されている。これらの著者は、マウス抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体である４Ｃ８から、コンピュータ補助相同性モデリングによって構築された４Ｃ８の分子モデルを使用したＣＤＲ移植により、ヒト化抗体を開発した。この著者らは、この分子モデルを使用して、抗原結合において潜在的に重要なＦＲ残基を特定した。これら鍵となるマウスＦＲ残基を、マウスＣＤＲ残基と共に、マウス抗体ＦＲに対する相同性に基づいて選択されたヒト抗体フレームワーク上に導入することにより、４Ｃ８のヒト化バージョンが作製された。得られたヒト化抗体は、元のマウス抗体と類似した抗原結合親和性および特異性を有することが示されたが、このことは、得られたヒト化抗体が、臨床において日常的に使用されているマウス抗ＣＤ３４抗体の代替になり得ることを示唆している。

【0145】

[0145] 本開示の実施形態は、ヒト免疫系による認識を回避するように創出され、想定されているｍＡｂが本明細書で開示される単一のマウスｍＡｂから得られるＣＤＲの組を含み得るような、任意の組合せの形態における本明細書で開示されるＣＤＲ、または開示されるマウスｍＡｂのうちの２つもしくは３つに由来する各々のＣＤＲを含むＣＤＲの組を含む軽鎖および重鎖を含む、抗体を包含する。このようなｍＡｂを分子生物学の標準的な技法によって創出することができ、本明細書に記載されるアッセイを使用して、所望の活性についてスクリーニングすることができる。このように、本開示は、開示されるマウスｍＡｂから得られるＣＤＲの混合物を含む新規ｍＡｂを創出して、新しい、または改善された治療活性を達成するための、「ミックス・アンド・マッチ」アプローチを提供する。

【0146】

[0146] 本明細書で開示される分子と「競合」する、本開示に包含されるモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、本分子が結合する部位と同一であるかまたはこれと重なり合う部位においてヒトＳＩＲＰαに結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、抗体競合アッセイにより特定することができる。例えば、精製または部分的に精製されたヒトＳＩＲＰα細胞外ドメインの試料を、固体支持体に結合させることができる。次いで、本開示の抗体化合物またはその抗原結合性断片と、かかる開示抗体化合物と競合することが可能であると疑われるモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片とを添加する。２つの分子のうちの一方を標識する。標識された化合物と標識されていない化合物がＳＩＲＰα上の別々の離れた部位に結合する場合、疑われる競合する化合物が存在するか否かにかかわらず、標識された化合物は同レベルで結合する。しかし、相互作用の部位が同一であるかまたは重なり合う場合、標識されていない化合物は競合し、抗原に結合する標識された化合物の量は減少する。標識されていない化合物が過剰に存在する場合、標識された化合物は、結合したとしても極めて少量である。本開示の目的に対し、競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、本抗体化合物のＳＩＲＰαへの結合を、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、 約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％減少させる、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。このような競合アッセイを実施するための手順の詳細は当技術分野において周知であり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙに見出すことができる。精製された抗体を使用することにより、このようなアッセイを定量的にすることができる。１つの抗体をそれ自身に対して滴定することにより、すなわち、標識と競合物質の両方に対して同じ抗体を使用し、標準曲線を確立する。標識されていない競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片による、標識された分子のプレートへの結合を阻害する能力を滴定する。結果をプロットし、所望の結合阻害度を達成するのに必要な濃度を比較する。

【0147】

[0147] そのような競合アッセイにおいて、本開示の抗体化合物と競合するｍＡｂまたはその抗原結合性断片が本抗体化合物と同一または類似の機能特性を有するかは、これらの方法と下記実施例２～７で記載される方法を組み合わせることで決定することができる。様々な実施形態において、本明細書で包含される治療方法において使用するための競合する抗体は、本明細書で開示される抗体化合物の本明細書に記載される生物活性と比較して、約５０％から約１００％または約１２５％以上までの範囲の本明細書に記載される生物活性を有する。一部の実施形態において、競合する抗体は、下記で提示される実施例において開示される方法によって決定した場合、本明細書で開示される抗体化合物の生物活性と比較して、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または同一の生物活性を有する。

【0148】

[0148] 前記組成物および方法において有用な、ｍＡｂもしくはその抗原結合性断片または競合する抗体は、本明細書に記載されるアイソタイプのいずれでもあり得る。さらに、これらのアイソタイプのいずれもが、以下のさらなるアミノ酸改変を含むことができる。

【0149】

[0149] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、または競合する抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプとすることができる。

【0150】

[0150] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ１定常領域は、抗体半減期を変えるように改変することができる。抗体半減期は、大部分が新生児Ｆｃ受容体とのＦｃ依存性相互作用によって制御されている（RoopenianおよびAlikesh, 2007）。モノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ１定常領域は、半減期を延長させるように改変することができ、例としては、アミノ酸改変Ｎ４３４Ａ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ（Petkovaら, 2006、Yeungら, 2009）；Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（Dall'Acquaら、2006）；Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（Hintonら, 2006）；およびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（Zalevskyら, 2010）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0151】

[0151] 半減期を延長させることとは反対に、例えば、高い抗体依存性細胞傷害（ADCC）および補体依存性細胞傷害（CDC）と関連する有害事象の可能性を低減するために、半減期の短縮が望ましい状況がいくつか存在する（Presta 2008）。本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ１定常領域は、半減期を短縮させる、および／または内因性ＩｇＧを減少させるように改変することができ、例としては、アミノ酸改変Ｉ２５３Ａ（Petkovaら, 2006）；Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ（Datta-Mannanら, 2007）；およびＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ（Vaccaroら, 2005）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0152】

[0152] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ１定常領域は、抗体エフェクター機能を増加または減少させるように改変することができる。これらの抗体エフェクター機能としては、抗体依存性細胞傷害（ADCC）、補体依存性細胞傷害（CDC）、抗体依存性細胞食作用（ADCP）、Ｃ１ｑ結合、およびＦｃ受容体への結合の変容が挙げられるが、これらに限定されない。

【0153】

[0153] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ１定常領域は、抗体エフェクター機能を増加させるように改変することができ、例としては、アミノ酸改変
Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４（Shieldsら, 2001）；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ（Lazarら, 2006）；Ｆ２３４Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２３４Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９３Ｌ、およびＦ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ（Stevenhagenら, 2007）；Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、およびＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ（Richardsら, 2008）；Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ｓ、およびＫ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ（Idusogieら, 2001）；Ｓ２６７ＥおよびＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（Smithら, 2012）； Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２３４Ｔ、およびＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ（Mooreら, 2010）；Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ（Sazinskyら, 2008）；Ｅ３８２Ｖ／Ｍ４２８Ｉ（Jungら, 2010）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0154】

[0154] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ１定常領域は、抗体エフェクター機能を減少させるように改変することができ、例としては、アミノ酸改変Ｎ２９７ＡおよびＮ２９７Ｑ（Boltら, 1993、Walkerら, 1989）； Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（Xuら, 2000）；Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３５６Ｅ／Ｌ３５８Ｍ（Ghevaertら, 2008）；Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ（McEarchernら, 2007）；Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（Chuら, 2008）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0155】

[0155] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ１定常領域は、抗体エフェクター機能を減少させるように改変することができ、例としては、アミノ酸改変Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ（Coleら, 1999）；Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｐ２３８Ｄ、Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｒ、Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ａ３３０Ｓ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｄ／Ａ３３０Ｓ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ａ３３０Ｒ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｄ／Ａ３３０Ｒ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ（Anら, 2009、Mimoto, 2013）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0156】

[0156] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片または競合する抗体は、ヒトＩｇＧ２アイソタイプとすることができる。

【0157】

[0157] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ２定常領域は、抗体エフェクター機能を増加または減少させるように改変することができる。これらの抗体エフェクター機能としては、抗体依存性細胞傷害（ADCC）、補体依存性細胞傷害（CDC）、抗体依存性細胞食作用（ADCP）、Ｃ１ｑ結合、およびＦｃ受容体への結合の変容が挙げられるが、これらに限定されない。

【0158】

[0158] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ２定常領域は、抗体エフェクター機能を増加させるように改変することができ、例としては、アミノ酸改変Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ｓ（Idusogieら, 2001）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0159】

[0159] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ２定常領域は、抗体エフェクター機能を減少させるように改変することができ、例としては、アミノ酸改変Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ（Coleら, 1999）；Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｐ２３８Ｄ、Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｒ、Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ａ３３０Ｓ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｄ／Ａ３３０Ｓ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ａ３３０Ｒ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｄ／Ａ３３０Ｒ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ（Anら, 2009、Mimoto, 2013）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0160】

[0160] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ２のＦｃ領域は、アイソフォームおよび／またはアゴニスト活性を変えるように改変することができ、例としては、アミノ酸改変Ｃ１２７Ｓ（C_H1ドメイン）、Ｃ２３２Ｓ、Ｃ２３３Ｓ、Ｃ２３２Ｓ／Ｃ２３３Ｓ、Ｃ２３６Ｓ、およびＣ２３９Ｓ（Whiteら, 2015、Lightleら, 2010）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0161】

[0161] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ２のＦｃ領域は、ＦｃγＲ結合能力の低下を示すが保存されたＦｃＲｎ結合を有するように改変することができる。これらのＩｇＧ Ｆｃ変異体は、免疫エフェクター機能および補体媒介性細胞傷害のＦｃに関連する関与を最小化しつつ、可溶性または細胞表面抗原の治療的標的化を可能にする。一実施形態において、ＩｇＧ２ Ｆｃ変異体は、ＥＵ付番方式に従い、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓを含む。別の実施形態において、ＩｇＧ２ Ｆｃ変異体は、ＥＵ付番方式に従い、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｈ２６８Ｑ、またはＨ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓを含む。特定の態様において、ＩｇＧ２ Ｆｃ変異体は、ＥＵ付番方式に従い、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、任意選択により、Ｐ２３３Ｓとを含む。

【0162】

[0162] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体は、ヒトＩｇＧ３アイソタイプとすることができる。

【0163】

[0163] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片のヒトＩｇＧ３定常領域は、抗体半減期、抗体依存性細胞傷害（ADCC）、補体依存性細胞傷害（CDC）、またはアポトーシス活性を延長／増加させるように、１つまたは複数のアミノ酸において改変することができる。

【0164】

[0164] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片のヒトＩｇＧ３定常領域は、抗体半減期を延長させるように、アミノ酸Ｒ４３５Ｈにおいて改変することができる。

【0165】

[0165] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、または競合する抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプとすることができる。

【0166】

[0166] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ４定常領域は、抗体エフェクター機能を減少させるように改変することができる。これらの抗体エフェクター機能としては、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および抗体依存性細胞食作用（ADCP）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0167】

[0167] 本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、または競合する抗体のヒトＩｇＧ４定常領域は、Ｆａｂアーム交換を防止する、および／または抗体エフェクター機能を減少させるように改変することができ、例としては、アミノ酸改変Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（Alegreら, 1994）；Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、およびＳ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ（Reddyら, 2000）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0168】

[0168] 本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、悪性であれ良性であれ、すべての新生物細胞の成長および増殖、ならびにすべての前がん性またはがん性の細胞および組織を指す。

【0169】

[0169] 「がん」、「がん性」、および「腫瘍」という用語は、本明細書で使用される場合、互いに排他的ではない。「がん」および「がん性」という用語は、典型的には異常な細胞成長／増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはこれを記述する。がんの例としては、癌、リンパ腫（すなわち、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、芽腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このようながんのより具体的な例としては、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜のがん、肝細胞がん、消化管がん、膵がん、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎がん、肝がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、白血病およびその他のリンパ増殖性障害、ならびに様々な種類の頭頸部がんが挙げられる。

【0170】

[0170] 「感受性がん」という用語は、本明細書で使用される場合、がんであって、その細胞が、ＣＤ４７、ＩＲＰα、またはＣＤ４７およびＳＩＲＰαを発現し、ＣＤ４７とＳＩＲＰαの間の相互作用を防止する、本開示から得られる抗体もしくはその抗原結合性断片または競合する抗体もしくはその抗原結合性断片を用いた治療に対して反応性である、がんを指す。

【0171】

[0171] 「自己免疫疾患」という用語は、本明細書で使用される場合、身体の免疫系が自らに反抗し、誤って健康な細胞を攻撃する場合を指す。

【0172】

[0172] 「炎症性疾患」という用語は、本明細書で使用される場合、炎症を特徴とする疾患を指し、炎症とは、物理的、化学的、または生物学的要因によって引き起こされる傷害または異常刺激に応答して罹患した血管および隣接する組織に生じる、組織学的に明確な細胞学的変化、細胞浸潤、およびメディエーター放出の動的な複合的現象からなり、局所的反応およびそれに起因する形態変化、傷害性物質の破壊または除去、ならびに修復および治癒に繋がる応答を含む、基本的な病理過程である。

【0173】

[0173] 「自己炎症性疾患」という用語は、本明細書で使用される場合、自然免疫系が未知の理由で炎症を引き起こす際に生じる疾患を指す。

【0174】

[0174] 本明細書で使用される場合、「治療すること」または「治療する」または「治療」という用語は、徴候、症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度を、遅らせること、妨害すること、停止させること、抑制すること、止めること、低減すること、または逆転させることを意味するが、疾患に関連するすべての徴候、症状、状態、または障害を完全に除去することを必ずしも伴わない。「治療すること」という用語等は、疾患または病態の徴候または症状が発症してしまった後でこれを寛解させる、治療的介入を指す。

【0175】

[0175] 本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、患者または器官に単回または複数回投与を行った際に所望の治療または予防をもたらす、本開示の抗体化合物の量または用量を指す。

【0176】

[0176] いずれの特定の対象についても、精確な有効量は、対象の大きさおよび健康、対象の状態の性質および程度、ならびに投与のために選択された治療薬または治療薬の組合せに依存する。ある患者についての有効量は定期的な実験によって決定され、臨床医による判断の範囲内にある。本抗体化合物の治療有効量は、採取された器官または患者に投与される単回用量当たり、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内の量を含み得る。この点について、公知の抗体系医薬品が指標となる。例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）は、２１ｍｇ／ｍｌ溶液の静脈内注入によって投与され、初回負荷用量が４ｍｇ／ｋｇ体重で、週間維持用量が２ｍｇ／ｋｇ体重であり、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）は、例えば、毎週３７５ｍｇ／ｍ^２で投与される。

【0177】

[0177] 個々のいずれの患者についても、腫瘍退縮、循環する腫瘍細胞、腫瘍幹細胞、または抗腫瘍応答に対する抗体化合物の効果をモニタリングすることによって、医療提供者が治療有効量を決定することができる。これらの方法によって得られたデータを解析することにより、本開示の抗体化合物が単独で用いられたか、互いに組み合わせて用いられたか、あるいは別の治療剤と組み合わせて用いられたか、それとも両方の組合せで用いられたかにかかわらず、本開示の抗体化合物の最適な量が投与されるように、そして、治療の継続期間も同様に決定できるように、療法中の治療計画を修正することが可能となる。このように、単独または組合せで使用された抗体化合物の、良好な有効性を示す最低量が投与されるように、そして、かかる化合物の投与が、患者を首尾よく治療するのに必要である限りにおいてのみ継続されるように、投与／治療計画を療法の過程全体にわたって修正することができる。投与の頻度、例えば、医薬品を、例えば、毎日、毎週、それとも毎月与えるべきかに関して、公知の抗体系医薬品が指標となる。頻度および投薬量は、症状の重症度にも依存し得る。

【0178】

[0178] 一部の実施形態において、本開示の抗体化合物を、ヒトおよび動物の医療における医薬として使用し、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹膜内、髄腔内、脳室内、経皮（transdermal）、経皮（transcutaneous）、局所、皮下、腫瘍内、鼻腔内、経腸、舌下、膣内、小胞内、または直腸経路を含むがこれらに限定されない、様々な経路によって投与することができる。組成物を、腫瘍などの病変中に直接投与することもできる。投薬治療は、単回投与スケジュールであっても複数回投与スケジュールであってもよい。また、ハイポスプレーを使用して医薬組成物を投与してもよい。一般に、治療用組成物を、液体の溶液または懸濁液のいずれかである注射剤として調製することができる。注射前に液体ビヒクル中に溶解または懸濁するのに適した、固体形態を調製することもできる。獣医学用途としては、ネコおよびイヌなどの伴侶／ペット動物、盲導犬または介助犬およびウマなどの使役動物、ウマおよびイヌなどの競技用動物、霊長類、ライオンおよびトラなどのネコ科動物、クマなどの、動物園の動物、ならびに監禁下にあるその他の有価値な動物の治療が挙げられる。

【0179】

[0179] このような医薬組成物は、当技術分野において周知の方法によって調製することができ（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^stEdition（2005）, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PAを参照）、本明細書で開示される１つまたは複数の抗体化合物と、薬学的に許容される、例えば、生理学的に許容される、担体、賦形剤、または添加剤とを含む。

【0180】

[0180] がん適応症
感受性の血液がんおよび固形腫瘍を有する患者に、好ましくは非経口的に投与することができるがん治療薬として有効な、抗ＳＩＲＰα ｍＡｂおよびその抗原結合性断片がここで開示され、感受性の血液がんおよび固形腫瘍としては、全身性肥満細胞症、急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病（ALL）、Ｔ細胞ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（AML）、骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、骨髄増殖性疾患／新生物、単核球細胞白血病、および形質細胞白血病を含む、白血病；多発性骨髄腫（MM）；ワルデンストローム・マクログロブリン血症；組織球性リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫、ならびに、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（NHL）、細胞リンパ腫（FCC）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、びまん性大細胞型リンパ腫（DLCL）、小リンパ球性（SL）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬを含む、リンパ腫；卵巣がん、乳がん、子宮内膜がん、結腸がん（結腸直腸がん）、直腸がん、膀胱がん、尿路上皮がん、肺がん（非小細胞肺がん、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌）、気管支がん、骨がん、前立腺がん、膵がん、胃がん、肝細胞癌（肝がん、ヘパトーマ）、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、腎細胞癌、甲状腺がん、頭頸部の扁平上皮癌（頭頸部がん）、精巣がん、内分泌腺のがん、副腎のがん、下垂体のがん、皮膚のがん、軟部組織のがん、血管のがん、脳のがん、神経のがん、目のがん、髄膜のがん、中咽頭のがん、下咽頭のがん、子宮頸のがん、および子宮のがん、神経膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、ガストリノーマ、神経芽腫、骨髄異形成症候群、ならびに、骨肉腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、滑膜肉腫、胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、および軟骨肉腫を含むがこれらに限定されない、肉腫を含む、固形腫瘍；ならびに黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0181】

[0181] がんの治療
当業者に周知の通り、単剤による療法または手順は疾患または状態を治療または治癒するのに十分ではない可能性があるため、多くの場合、がん治療において併用療法が採用される。従来のがん治療は、多くの場合、手術、放射線治療、相加的もしくは相乗的効果を達成するための細胞傷害性薬物の組合せ、またはこれらのアプローチのうちのいずれかもしくはすべての組合せを伴う。とりわけ有用な化学療法および生物学的療法の組合せは、異なる作用機序を介して作用する薬物を用い、がん細胞の抑制または殺傷を増大し、免疫系によるがん細胞の増殖を抑制する能力を増加させ、療法中の薬物耐性の可能性を低減し、個々の薬物を低減された用量で使用することを許容することによって、起こり得る重複毒性を最小化する。

【0182】

[0182] 本方法に包含される併用療法において有用な従来の抗腫瘍および抗新生物剤のクラスは、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， 第１２版（２０１０） Ｌ．Ｌ． Ｂｒｕｎｔｏｎ， Ｂ．Ａ． ＣｈａｂｎｅｒおよびＢ． Ｃ． Ｋｎｏｌｌｍａｎｎ編， 第ＶＩＩＩ節， 「Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ」， 第６０～６３章， １６６５～１７７０頁， ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ， ＮＹに開示されており、これらとしては、アントラサイクリン類、白金類、タキゾール、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍性抗生物質、有糸分裂阻害剤、およびアルキル化剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0183】

[0183] 上記に加え、本開示の方法はがん適応症の治療に関し、手術、放射線、および／または、腫瘍性の状態を治療するための慣用もしくは現在開発中であるペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸治療薬を含むがこれらに限定されない、有効量の化学的低分子もしくは生物学的薬物を、それを必要とする患者に投与することを介して患者を治療することを、さらに含む。これは、本明細書で開示されるもの以外の抗体および抗原結合性断片、サイトカイン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ならびにｍｉＲＮＡを含む。

【0184】

[0184] 本明細書で開示および特許請求される治療方法は、本明細書で開示される抗体を、単独で、および／または互いの組合せで、および／またはＳＩＲＰαに結合する、本開示のその抗原結合性断片と共に、および／または適当な生物／治療活性を呈する、競合する抗体と共に、ならびに、例えば、最大の治療有効性を達成する、これらの抗体化合物のあらゆる可能な組合せで使用することを含む。

【0185】

[0185] さらに、本治療方法はまた、これらの抗体、その抗原結合性断片、競合する抗体、およびこれらの組合せを、（１）手術、放射線、抗腫瘍剤、および抗新生物剤、もしくはこれらのいずれかの組合せから選択される、１つもしくは複数の抗腫瘍治療的処置、または（２）抗腫瘍性生物学的薬剤のうちの１つもしくは複数、または（３）特定の適応症に対する所望の治療的処置効果を達成する適当な組合せである、当業者には明白と思われる上記（１）または（２）のいずれかの等価物と、さらに組み合わせて使用することも包含する。

【0186】

[0186] 腫瘍抗原に対するＴ細胞応答に影響を与える同時刺激性または阻害性相互作用を調節することによってがんに対する免疫応答を増加させる、免疫チェックポイントの阻害剤および同時刺激性分子のモジュレーターなどの抗体および低分子薬物もまた、本明細書に包含される併用治療方法の文脈で特に対象となっており、これらとしては、その他の抗ＳＩＲＰα抗体が挙げられるが、これに限定されない。ＳＩＲＰαタンパク質に結合する治療剤、例えば、ＳＩＲＰαに結合し、ＣＤ４７とＳＩＲＰαの間の相互作用を防止する抗体または低分子の投与が患者に対して行われ、食作用を介してがん細胞のクリアランスを引き起こす。ＳＩＲＰαタンパク質に結合する治療剤は、ＣＤ４７（表面抗原分類47）、ＣＤ７０（表面抗原分類70）、ＣＤ２００（OX-2膜糖タンパク質、表面抗原分類200）、ＣＤ１５４（表面抗原分類154、CD40L、CD40リガンド、表面抗原分類40リガンド）、ＣＤ２２３（リンパ球活性化遺伝子3、LAG3、表面抗原分類223）、ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）、ＧＩＴＲ（TNFRSF18、グルココルチコイド誘導性TNFR関連タンパク質、活性化誘導性TNFRファミリー受容体、AITR、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー18）、ＣＤ２０（表面抗原分類20）、ＣＤ２８（表面抗原分類28）、ＣＤ４０（表面抗原分類40、Bp50、CDW40、TNFRSF5、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー5、p50）、ＣＤ８６（B7-2、表面抗原分類86）、ＣＤ１６０（表面抗原分類160、BY55、NK1、NK28）、ＣＤ２５８（LIGHT、表面抗原分類258、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー14、TNFSF14、ヘルペスウイルス侵入メディエーターリガンド（HVEM-L））、ＣＤ２７０（HVEM、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー14、ヘルペスウイルス侵入メディエーター、表面抗原分類270、LIGHTR、HVEA）、ＣＤ２７５（ICOSL、ICOSリガンド、誘導性T細胞共刺激分子リガンド、表面抗原分類275）、ＣＤ２７６（B7-H3、B7ホモログ3、表面抗原分類276）、ＯＸ４０Ｌ（OX40リガンド）、Ｂ７－Ｈ４（B7ホモログ4、VTCN1、V-setドメイン含有T細胞活性化阻害物質1）、ＧＩＴＲＬ（グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体-リガンド、グルココルチコイド誘導性TNFR-リガンド）、４－１ＢＢＬ（4-1BBリガンド）、ＣＤ３（表面抗原分類3、T3D）、ＣＤ２５（IL2Rα、表面抗原分類25、インターロイキン-2 受容体α鎖、IL-2受容体α鎖）、ＣＤ４８（表面抗原分類48、Bリンパ球活性化マーカー、BLAST-1、シグナル伝達リンパ球活性化分子2、SLAMF2）、ＣＤ６６a（Ceacam-1、癌胎児抗原関連細胞接着分子1、胆汁糖タンパク質、BGP、BGP1、BGPI、表面抗原分類66a）、ＣＤ８０（B7-1、表面抗原分類80）、ＣＤ９４（表面抗原分類94）、ＮＫＧ２Ａ（ナチュラルキラーグループ2A、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーDメンバー1、KLRD1）、ＣＤ９６（表面抗原分類96、TActILE、T細胞活性化後期発現増加）、ＣＤ１１２（PVRL2、ネクチン、ポリオウイルス受容体関連2、ヘルペスウイルス侵入メディエーターB、HVEB、ネクチン-2、表面抗原分類112）、ＣＤ１１５（CSF1R、コロニー刺激因子1受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体、M-CSFR、表面抗原分類115）、ＣＤ２０５（DEC-205、LY75、リンパ球抗原75、表面抗原分類205）、ＣＤ２２６（DNAM1、表面抗原分類226、DNAXアクセサリー分子-1、PTA1、血小板およびT細胞活性化抗原1）、ＣＤ２４４（表面抗原分類244、ナチュラルキラー細胞受容体2B4）、ＣＤ２６２（DR5、TrailR2、TRAIL-R2、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー10b、TNFRSF10B、表面抗原分類262、KILLER、TRICK2、TRICKB、ZTNFR9、TRICK2A、TRICK2B）、ＣＤ２８４（Toll様受容体-4、TLR4、表面抗原分類284）、ＣＤ２８８（Toll様受容体-8、TLR8、表面抗原分類288）、白血病抑制因子（LIF）、TNFSF15（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー15、血管内皮細胞増殖阻害物質、VEGI、TL1A）、ＴＤＯ２（トリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼ、TPH2、TRPO）、ＩＧＦ－１Ｒ（1型インスリン様増殖因子）、ＧＤ２（ジシアロガングリオシド2）、ＴＭＩＧＤ２（膜貫通免疫グロブリンドメイン含有タンパク質2）、ＲＧＭＢ（RGMドメインファミリー、メンバーB）、ＶＩＳＴＡ（T細胞活性化のVドメイン免疫グロブリン含有サプレッサー、B7-H5、B7ホモログ5）、ＢＴＮＬ２（ブチロフィリン様タンパク質2）、Ｂｔｎ（ブチロフィリンファミリー）、ＴＩＧＩＴ（IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体、Vstm3、WUCAM）、シグレック（シアル酸結合Ig様レクチン）、すなわち、ＳＩＧＬＥＣ－１５、ニューロフィリン、ＶＥＧＦＲ（血管内皮増殖因子受容体）、ＩＬＴファミリー（LIR、免疫グロブリン様転写物ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体）、ＮＫＧファミリー（ナチュラルキラーグループファミリー、C型レクチン膜貫通受容体）、ＭＩＣＡ（MHCクラスIポリペプチド関連配列A）、ＴＧＦβ（形質転換増殖因子β）、ＳＴＩＮＧ経路（インターフェロン遺伝子経路の刺激物質）、アルギナーゼ（アルギニンアミジナーゼ、カナバナーゼ、L-アルギナーゼ、アルギニントランスアミジナーゼ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮増殖因子受容体バリアントIII）、およびＨＨＬＡ２（B7-H7、B7y、HERV-H LTR関連タンパク質2、B7ホモログ7）、ＰＤ－１の阻害物質（プログラム細胞死タンパク質 1、PD-1、CD279、表面抗原分類279）、ＰＤ－Ｌ１（B7-H1、B7ホモログ1、プログラム死リガンド1、CD274、表面抗原分類274）、ＰＤ－Ｌ２（B7-DC、プログラム細胞死1リガンド2、PDCD1LG2、CD273、表面抗原分類273）、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4、CD152、表面抗原分類152）、ＢＴＬＡ（Bおよび Tリンパ球アテニュエーター、CD272、表面抗原分類272）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（IDO、IDO1）、ＴＩＭ３（HAVCR2、A型肝炎ウイルス細胞受容体 2、T細胞免疫グロブリンムチン-3、KIM-3、腎臓損傷分子3、TIMD-3、T細胞免疫グロブリンムチン-ドメイン3）、Ａ２Ａアデノシン受容体（ADO受容体）、ＣＤ３９（エクトヌクレオチド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ-1、表面抗原分類39、ENTPD1）、およびＣＤ７３（エクト-5'-ヌクレオチダーゼ、5'-ヌクレオチダーゼ、5'-NT、表面抗原分類73）、ＣＤ２７（表面抗原分類27）、ＩＣＯＳ（CD278、表面抗原分類278、誘導性T細胞共刺激分子）、ＣＤ１３７（4-1BB、表面抗原分類137、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9、TNFRSF9）、ＯＸ４０（CD134、表面抗原分類134）、ＴＮＦＳＦ２５（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー25）、ＩＬ－１０（インターロイキン-10、ヒトサイトカイン合成阻害因子、CSIF）、およびガレクチンから選択される、１つまたは複数のさらなる細胞標的を対象とする、抗体、化学的低分子または生物学的薬物などの、治療剤と組み合わせられる。

【0187】

[0187] ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ、Bristol-Meyers Squibb）は、ヒト上皮増殖因子受容体（EGFR）の細胞外ドメインに特異的に結合する、認可された組換えヒト／マウスキメラモノクローナル抗体の一例である。

【0188】

[0188] ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ、Biogen IDEC/Genentech）は、認可された抗ＣＤ２０抗体の一例である。

【0189】

[0189] ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）（イピリムマブ、Bristol-Meyers Squibb）は、認可された抗ＣＴＬＡ－４抗体の一例である。

【0190】

[0190] ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ、Merck）およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ、Bristol-Meyers Squibb Company）は、認可された抗ＰＤ－１抗体の例である。

【0191】

[0191] ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（商標）（アテゾリズマブ、Roche）は、認可された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の一例である。

【0192】

[0192] ＢＡＶＥＮＣＩＯ（商標）（アベルマブ、Merck KGaAおよびPfizer and Eli Lilly and Company）は、認可された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の一例である。

【0193】

[0193] ＩＭＦＩＮＺＩ（商標）（デュルバルマブ、Medimmune/AstraZeneca）は、認可された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の一例である。

【0194】

[0194] 実施例は本開示の様々な実施形態を例示するが、実施例を、本開示のこれら具体的に開示された実施形態のみへの限定と解釈してはならない。

【実施例】

【0195】

実施例１
アミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ

【0196】

【表1】

重鎖ＣＤＲ

【0197】

【表2】

マウス軽鎖（V_L）可変ドメイン配列およびヒト軽鎖（V_L）可変ドメイン配列

【0198】

【表3-1】

【0199】

【表3-2】

マウス重鎖（V_H）可変ドメイン配列およびヒト重鎖（V_H）可変ドメイン配列

【0200】

【表4-1】

【0201】

【表4-2】

マウス軽鎖（LC）配列およびヒト軽鎖（LC）配列

【0202】

【表5-1】

【0203】

【表5-2】

【0204】

【表5-3】

マウス重鎖（HC）配列およびヒト重鎖（HC）配列

【0205】

【表6-1】

【0206】

【表6-2】

【0207】

【表6-3】

【0208】

【表6-4】

ＳＩＲＰαおよびＳＩＲＰγ配列

【0209】

【表7-1】

【0210】

【表7-2】

【0211】

【表7-3】

【0212】

【表7-4】

【0213】

[0195] 実施例２
ＳＩＲＰモノクローナル抗体のＳＩＲＰαへの結合
本開示の抗ＳＩＲＰモノクローナル抗体（mAb）のＳＩＲＰアルファ（SIRPα）への結合を、Ｆｃタグ付きヒトＳＩＲＰアルファを使用した固相ＥＬＩＳＡによって決定した。可溶性抗ＳＩＲＰ抗体による結合をインビトロで測定した。

【0214】

[0196] Ｆｃタグ付きヒトＳＩＲＰα（ACRO #SIG-H5251、遺伝子バリアント1）を、リン酸緩衝食塩水（PBS）中に希釈した１μｇ／ｍｌの濃度にて、４℃で終夜、高結合マイクロタイタープレートに吸着させる。コーティング溶液を除去し、ウェルを洗浄し、次いで、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（PBST）中の７５％カゼインにより、振盪しながら室温で６０分間ブロッキングする。ブロッキング溶液を除去し、ウェルを洗浄し、ＰＢＳＴ中に開始濃度３０μｇ／ｍｌで希釈したマウスまたはヒト抗ＳＩＲＰ ｍＡｂを用い、濃度を３倍連続希釈で低減して、振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳＴ中に１：１０，０００で希釈したＨＲＰ標識ロバ抗マウスまたは抗ヒト二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用い、振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。ウェルを洗浄し、次いで、ペルオキシダーゼ基質を用いてインキュベートし、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。非線形フィットモデル（GraphPad Prism）を使用して、見かけの親和性を計算した。

【0215】

[0197] 表１に示されるように、すべての可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂは、ピコモルからナノモルの範囲の見かけの親和性でヒトＳＩＲＰαに結合した。図１Ａ～図１Ｖは、本開示の抗体についての代表的な結合曲線を示す。

【0216】

【表8】

【0217】

[0198] 実施例３
マウス抗ＳＩＲＰ ｍＡｂのＳＩＲＰαを発現するＴＨＰ－１細胞への結合
ハイブリドーマ由来マウスＳＩＲＰ抗体ＳＩＲＰ１、ＳＩＲＰ２、およびＳＩＲＰ３の、ＳＩＲＰαを発現するがＳＩＲＰγを発現しないＴＨＰ－１細胞への結合活性を、フローサイトメトリーによって決定した。

【0218】

[0199] ｐＨ７．２のＰＢＳ中に希釈した漸増する濃度のｍＡｂを用い、ＴＨＰ－１細胞を３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７標識ロバ抗マウス抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用いてさらに１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、Ｃ６ Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（Becton Dickinson）を使用して結合を分析した。

【0219】

[0200] 図２に示されるように、すべての抗体がＳＩＲＰα発現ＴＨＰ－１細胞に濃度依存的に結合した。

【0220】

[0201] 実施例４
ＳＩＲＰ ｍＡｂのＳＩＲＰγへの結合
本開示の抗ＳＩＲＰ抗体のＳＩＲＰガンマ（SIRPγ）への結合を、Ｆｃタグ付きヒトＳＩＲＰγを使用したＥＬＩＳＡによって決定した。可溶性抗ＳＩＲＰ抗体の結合をインビトロで測定した。

【0221】

[0202] Ｆｃタグ付きヒトＳＩＲＰγ（ACRO #SIG-H5253）を、リン酸緩衝食塩水（PBS）中で１μｇ／ｍｌの濃度にて、４℃で終夜、高結合マイクロタイタープレートに吸着させる。コーティング溶液を除去し、ウェルを洗浄し、次いで、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（PBST）中の７５％カゼインにより、振盪しながら室温で６０分間ブロッキングする。ブロッキング溶液を除去し、ウェルを洗浄し、ＰＢＳＴ中に開始濃度３０μｇ／ｍｌで希釈した抗ＳＩＲＰ ｍＡｂを用い、濃度を３倍連続希釈で低減して、振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳＴ中に１：１０，０００で希釈したＨＲＰ標識ロバ抗マウスまたは抗ヒト二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用い、振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。ウェルを洗浄し、次いで、ペルオキシダーゼ基質を用いてインキュベートし、４５０ｎｍにおける吸光度を決定する。非線形フィットモデル（GraphPad Prism）を使用して、見かけの親和性を計算した。

【0222】

[0203] 表２に示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ２、ＳＩＲＰ３、ＳＩＲＰ４、ＳＩＲＰ５、ＳＩＲＰ６、ＳＩＲＰ７、ＳＩＲＰ９、ＳＩＲＰ１０、ＳＩＲＰ１１、ＳＩＲＰ１２、ＳＩＲＰ１６、ＳＩＲＰ１７、ＳＩＲＰ１８、ＳＩＲＰ２０、ＳＩＲＰ２１、およびＳＩＲＰ２３は、ピコモルからナノモルの範囲の見かけの親和性でヒトＳＩＲＰガンマに結合した。さらに、抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ１、ＳＩＲＰ８、ＳＩＲＰ１３、ＳＩＲＰ１４、ＳＩＲＰ１５、ＳＩＲＰ１９、およびＳＩＲＰ２２は、３０μｇ／ｍｌまでのｍＡｂ濃度ではヒトＳＩＲＰガンマに認識可能な結合をしなかった。図３Ａ～図３Ｖは、本開示の抗体から得られた代表的な結合曲線を示す。

【0223】

【表9】

【0224】

[0204] 実施例５
マウスｍＡｂのＳＩＲＰγを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞への結合
マウスハイブリドーマ由来ＳＩＲＰ ｍＡｂの、ＳＩＲＰγを発現するがＳＩＲＰαを発現しないＪｕｒｋａｔ細胞への結合活性を、フローサイトメトリーによって決定した。

【0225】

[0205] ｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水（PBS）中に希釈した漸増する濃度の抗ＳＩＲＰ ｍＡｂを用い、Ｊｕｒｋａｔ細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で６０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７標識ロバ抗マウス抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用いてさらに１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、Ｃ６ Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（Becton Dickinson）を使用して結合を分析した。あるいは、ＰＢＳ（Corning）中に１ｍＭ ＥＤＴＡ（Sigma Aldrich）、１％ ＦＢＳ（Biowest）を含有する結合バッファ中の飽和濃度１０μｇ／ｍｌのＳＩＲＰ ｍＡｂを用いて、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、同じ条件下でロバ抗マウスＩｇＧフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用いて、４５分間染色した。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）によって分析した。

【0226】

[0206] 図４Ａに示されるように、ＳＩＲＰ３はＳＩＲＰγ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合したが、ＳＩＲＰ２もＳＩＲＰ１も結合を示さなかった。さらに、図４Ｂに示されるように、ＳＩＲＰ９は１０μｇ／ｍｌの濃度でＪｕｒｋａｔ細胞に結合し、これはこれまでにＳＩＲＰγに結合することが示されているＫＷＡＲ－２３に匹敵していたが、ＳＩＲＰ４はＪｕｒｋａｔ細胞上のＳＩＲＰγに結合を示さなかった。

【0227】

[0207] 実施例６
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂはＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合を遮断する
ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合を遮断する本開示の抗ＳＩＲＰ抗体の能力をインビトロで評価するため、ヒスチジン（HIS)タグ付きヒトＳＩＲＰαで被覆されたＥＬＩＳＡプレートを使用した以下の方法を採用した。

【0228】

[0208] ＨＩＳタグ付きヒトＳＩＲＰα（ACRO #SIG-H5225）を、ＰＢＳ中に希釈した１μｇ／ｍｌの濃度にて、４℃で終夜、高結合マイクロタイタープレートに吸着させる。コーティング溶液を除去し、ウェルを洗浄し、次いで、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（PBST）中の７５％カゼインにより、振盪しながら室温で６０分間ブロッキングする。ブロッキング溶液を除去し、ウェルを洗浄し、ＰＢＳＴ中に開始濃度３０μｇ／ｍｌで希釈した抗ＳＩＲＰ ｍＡｂを用い、濃度を３倍連続希釈で低減して、振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳＴ中２５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＣタグ付きヒトＣＤ４７（ACRO #CD7-H5256）を用い、振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳＴ中に１：２０，０００で希釈したＨＲＰ標識ロバ抗マウスまたは抗ヒト二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用い、振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。ウェルを洗浄し、次いで、ペルオキシダーゼ基質を用いてインキュベートし、４５０ｎｍにおける吸光度を決定する。非線形フィットモデル（GraphPad Prism）を使用して、ＩＣ_５０を計算した。

【0229】

[0209] 表３に示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ２、ＳＩＲＰ３、ＳＩＲＰ４、およびＳＩＲＰ７は、ナノモル範囲のＩＣ_５０値でヒトＳＩＲＰαのヒトＣＤ４７への結合を遮断する。さらに、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ１、ＳＩＲＰ５、ＳＩＲＰ６、ＳＩＲＰ８、およびＳＩＲＰ１０は、３０μｇ／ｍｌまでのｍＡｂ 濃度ではヒトＳＩＲＰαのヒトＣＤ４７への結合を遮断することができなかった。図５Ａ～図５Ｇは、本開示の抗体から得られた代表的な阻害曲線を示す。

【0230】

【表10】

【0231】

[0210] 実施例７
抗ＳＩＲＰモノクローナル抗体はＣＤ４７／ＳＩＲＰγ結合を遮断する
ＣＤ４７のＳＩＲＰγへの結合に対する本開示の抗ＳＩＲＰ ｍＡｂの効果をインビトロで評価するため、ＨＩＳタグ付きヒトＣＤ４７で被覆されたＥＬＩＳＡプレートを使用した以下の方法を採用した。

【0232】

[0211] ＨＩＳタグ付きヒトＣＤ４７（ACRO #CD7-H5227）を、ＰＢＳ中に希釈した２μｇ／ｍｌの濃度にて、４℃で終夜、高結合マイクロタイタープレートに吸着させる。コーティング溶液を除去し、ウェルを洗浄し、次いで、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（PBST）中の７５％カゼインにより、振盪しながら室温で６０分間ブロッキングする。ブロッキング溶液を除去し、ウェルを洗浄し、ＰＢＳＴ中に開始濃度３０μｇ／ｍｌで希釈した抗ＳＩＲＰ ｍＡｂを用い、濃度を３倍連続希釈で低減して、また、０．５μｇ／ｍｌのヒトＳＩＲＰγ（ACRO# SIG-H5253）を用い、振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳＴ中に１：２０，０００で希釈したＨＲＰ標識ロバ抗マウスまたは抗ヒト二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用い、振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。ウェルを洗浄し、次いで、ペルオキシダーゼ基質を用いてインキュベートし、４５０ｎｍにおける吸光度を決定する。非線形フィットモデル（GraphPad Prism）を使用して、ＩＣ_５０を計算した。

【0233】

[0212] 表４に示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ２、ＳＩＲＰ３、ＳＩＲＰ４、ＳＩＲＰ５、ＳＩＲＰ６、およびＳＩＲＰ７は、ナノモル範囲のＩＣ_５０値でヒトＳＩＲＰγのヒトＣＤ４７への結合を遮断する。さらに、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ１、ＳＩＲＰ８、ＳＩＲＰ９、およびＳＩＲＰ１０は、３０μｇ／ｍｌまでのｍＡｂ 濃度ではヒトＳＩＲＰγのヒトＣＤ４７への結合を遮断することができなかった。図６Ａ～図６Ｈは、本開示の抗体から得られた代表的な阻害曲線を示す。

【0234】

【表11】

【0235】

[0213] 実施例８
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂは食作用を誘導する
マクロファージによる腫瘍細胞に対する食作用に対する抗ＳＩＲＰ ｍＡｂの効果をインビトロで評価するため、フローサイトメトリーを使用した以下の方法を採用した。

【0236】

[0214] ヒト単球由来マクロファージを、健康なヒト末梢血の白血球除去によって取得し、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（Biolegend）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中で７日間インキュベートした。インビトロ食作用アッセイのために、９６ウェルプレート中、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦを補足したＡＩＭ－Ｖ培地１００μｌ中にマクロファージを１ウェル当たり３×１０^４細胞の濃度で再播種し、２４時間接着させた。エフェクターマクロファージが培養皿に接着したら、標的となるヒトがん細胞（Jurkat）を１μＭ ５（６）－カルボキシフルオレセイン二酢酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（CFSE; Sigma Aldrich）で標識し、補足物のないＡＩＭ－Ｖ培地１００μｌ中８×１０^４細胞の濃度でマクロファージ培養物に添加した。標的およびエフェクター細胞を混合してすぐに、抗ＳＩＲＰ ｍＡｂを様々な濃度（図７Ａ）または１０μｇ／ｍｌ（図７Ｂ）の抗体で添加し、３７℃で３時間インキュベートした。３時間後、食作用を受けていないすべての細胞を除去し、残りの細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Stemcell Technologies）中でインキュベートしてマクロファージを剥離し、微量遠心管中に回収し、アロフィコシアニン（APC）標識ＣＤ１４抗体（BD biosciences）１００ｎｇ中で３０分間インキュベートし、１回洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）により、完全な食作用の指標となるＣＦＳＥ^＋でもあるＣＤ１４^＋細胞の百分率について分析した。

【0237】

[0215] 図７Ａおよび図７Ｂに示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ４、ＳＩＲＰ９、ＳＩＲＰ１１、ＳＩＲＰ１２、ＳＩＲＰ１３、ＳＩＲＰ１４、ＳＩＲＰ１５、ＳＩＲＰ１６、ＳＩＲＰ１７、ＳＩＲＰ１８、ＳＩＲＰ１９、ＳＩＲＰ２０、ＳＩＲＰ２１、ＳＩＲＰ２２、およびＳＩＲＰ２３は、マウスＩｇＧ１対照抗体（Biolegend）と比較して、ヒトマクロファージによるＪｕｒｋａｔ細胞に対する食作用を誘導した。一方、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ１、ＳＩＲＰ２、ＳＩＲＰ３、ＳＩＲＰ７、ＳＩＲＰ８、およびＳＩＲＰ１０は、ヒトマクロファージによるＪｕｒｋａｔ細胞に対する食作用を誘導しなかった。

【0238】

[0216] 実施例９
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂは抗ＣＤ４７抗体と組み合わせた場合に食作用を誘導する
マクロファージによる腫瘍細胞に対する食作用の誘導に対する抗ＳＩＲＰ ｍＡｂと抗ＣＤ４７ ｍＡｂとの組合せの効果をインビトロで評価するため、フローサイトメトリーを使用した以下の方法を採用した。

【0239】

[0217] ヒト単球由来マクロファージを、健康なヒト末梢血の白血球除去によって取得し、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（Biolegend）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中で７日間インキュベートした。インビトロ食作用アッセイのために、９６ウェルプレート中、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦを補足したＡＩＭ－Ｖ培地１００μｌ中にマクロファージを１ウェル当たり３×１０^４細胞の濃度で再播種し、２４時間接着させた。エフェクターマクロファージが培養皿に接着したら、標的となるヒトがん細胞（Jurkat）を１μＭ ５（６）－カルボキシフルオレセイン二酢酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（CFSE; Sigma Aldrich）で標識し、補足物のないＡＩＭ－Ｖ培地１００μｌ中８×１０^４細胞の濃度でマクロファージ培養物に添加した。標的およびエフェクター細胞を混合してすぐに、抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ単独、抗ＣＤ４７ ｍＡｂ（食作用を誘導することが知られている）単独、または抗ＳＩＲＰ ｍＡｂと抗ＣＤ４７ ｍＡｂとを、様々な濃度で添加し、３７℃で３時間インキュベートした。３時間後、食作用を受けていないすべての細胞を除去し、残りの細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Stemcell Technologies）中でインキュベートしてマクロファージを剥離し、微量遠心管中に回収し、アロフィコシアニン（APC）標識ＣＤ１４抗体（BD biosciences）１００ｎｇ中で３０分間インキュベートし、１回洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）により、完全な食作用の指標となるＣＦＳＥ^＋でもあるＣＤ１４^＋細胞の百分率について分析した。

【0240】

[0218] 図８Ａ～図８Ｊに示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ１、ＳＩＲＰ２、ＳＩＲＰ３、ＳＩＲＰ４、ＳＩＲＰ５、ＳＩＲＰ７、ＳＩＲＰ１２、ＳＩＲＰ２０、ＳＩＲＰ２１、およびＳＩＲＰ２２のすべてが、単独の薬剤と比較して、抗ＣＤ４７ ｍＡｂと組み合わせた場合に、より大きな程度でヒトマクロファージによるＪｕｒｋａｔ細胞に対する食作用を増加させる。

【0241】

[0219] 実施例１０
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂはＲｉｔｕｘａｎとの組合せにおいて食作用を誘導する
マクロファージによる腫瘍細胞に対する食作用の誘導に対する抗ＳＩＲＰ ｍＡｂと抗ＣＤ２０ ｍＡｂとの組合せの効果をインビトロで評価するため、フローサイトメトリーを使用した以下の方法を採用した。

【0242】

[0220] ヒト単球由来マクロファージを、健康なヒト末梢血の白血球除去によって取得し、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（Biolegend）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中で７日間インキュベートした。インビトロ食作用アッセイのために、９６ウェルプレート中、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦを補足したＡＩＭ－Ｖ培地１００μｌ中にマクロファージを１ウェル当たり３×１０^４細胞の濃度で再播種し、２４時間接着させた。エフェクターマクロファージが培養皿に接着したら、標的となるヒトがん細胞（RAJI）を１μＭ ５（６）－カルボキシフルオレセイン二酢酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（CFSE; Sigma Aldrich）で標識し、補足物のないＡＩＭ－Ｖ培地１００μｌ中８×１０^４細胞の濃度でマクロファージ培養物に添加した。標的およびエフェクター細胞を混合してすぐに、抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ単独、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（Rituxan、Roche）単独、または抗ＳＩＲＰ ｍＡｂと抗ＣＤ２０ ｍＡｂとを、様々な濃度で添加し、３７℃で３時間インキュベートした。３時間後、食作用を受けていないすべての細胞を除去し、残りの細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Stemcell Technologies）中でインキュベートしてマクロファージを剥離し、微量遠心管中に回収し、アロフィコシアニン（APC）標識ＣＤ１４抗体（BD biosciences）１００ｎｇ中で３０分間インキュベートし、１回洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）により、完全な食作用の指標となるＣＦＳＥ^＋でもあるＣＤ１４^＋細胞の百分率について分析した。

【0243】

[0221] 図９Ａ～図９Ｄに示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ１、ＳＩＲＰ２、ＳＩＲＰ３、およびＳＩＲＰ７のすべてが、単独の薬剤と比較して、抗ＣＤ２０ ｍＡｂと組み合わせた場合に、より大きな程度でヒトマクロファージによるＲＡＪＩ細胞に対する食作用を増加させた。

【0244】

[0222] 実施例１１
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂはＥｒｂｉｔｕｘおよびアベルマブとの組合せにおいて食作用を誘導する
マクロファージによる腫瘍細胞に対する食作用の誘導に対する抗ＳＩＲＰ ｍＡｂと抗ＥＧＦＲ ｍＡｂまたは抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂとの組合せの効果をインビトロで評価するため、フローサイトメトリーを使用した以下の方法を採用した。

【0245】

[0223] ヒト単球由来マクロファージを、健康なヒト末梢血の白血球除去によって取得し、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（Biolegend）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中で７日間インキュベートした。インビトロ食作用アッセイのために、９６ウェルプレート中、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦを補足したＡＩＭ－Ｖ培地１００μｌ中にマクロファージを１ウェル当たり３×１０^４細胞の濃度で再播種し、２４時間接着させた。エフェクターマクロファージが培養皿に接着したら、標的となるヒトがん細胞（FaDuまたはES-2）を１μＭ ５（６）－カルボキシフルオレセイン二酢酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（CFSE; Sigma Aldrich）で標識し、補足物のないＡＩＭ－Ｖ培地１００μｌ中８×１０^４細胞の濃度でマクロファージ培養物に添加した。標的およびエフェクター細胞を混合してすぐに、抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ単独、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ（Erbitux、Bristol-Myers Squibb）単独、抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ（アベルマブ、Pfizer）、または抗ＳＩＲＰ ｍＡｂと抗ＥＧＦＲ ｍＡｂとを、様々な濃度で添加し、３７℃で３時間インキュベートした。３時間後、食作用を受けていないすべての細胞を除去し、残りの細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Stemcell Technologies）中でインキュベートしてマクロファージを剥離し、微量遠心管中に回収し、アロフィコシアニン（APC）標識ＣＤ１４抗体（BD biosciences）１００ｎｇ中で３０分間インキュベートし、１回洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）により、完全な食作用の指標となるＣＦＳＥ^＋でもあるＣＤ１４^＋細胞の百分率について分析した。

【0246】

[0224] 図１０Ａに示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ４は、単独の薬剤と比較して、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂと組み合わせた場合に、より大きな程度でヒトマクロファージによるＦａＤｕ細胞に対する食作用を増加させた。図１０Ｂに示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ４は、単独の薬剤と比較して、抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂと組み合わせた場合に、より大きな程度でヒトマクロファージによるＥＳ－２細胞に対する食作用を増加させた。

【0247】

[0225] 実施例１２
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂはヒトマクロファージおよび樹状細胞に結合する
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂのヒトマクロファージおよび樹状細胞などのＳＩＲＰαを発現する細胞への結合を評価するため、フローサイトメトリーを使用した以下の方法を採用した。

【0248】

[0226] 末梢血単核細胞から単離されたヒトＣＤ１４^＋単球（Astarte Biologics）を、インビトロで７日間、マクロファージまたは樹状細胞にへと分化させた。マクロファージ分化については、単球を、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（Biolegend）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中で７日間インキュベートした。樹状細胞分化については、単球を、ＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中、１０％ヒトＡＢ血清（Valley Biomedical）、２００ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ（Biolegend）、および５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４（Biolegend）の存在下でインキュベートした。ＰＢＳ（Corning）中に１ｍＭ ＥＤＴＡ（Sigma Aldrich）および１％ ＦＢＳ（Biowest）を含有する結合バッファ中のＳＩＲＰ ｍＡｂの連続希釈を用いて、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、同じ条件下でロバ抗マウスＩｇＧフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用いて、４５分間染色した。その後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７フルオロフォアとコンジュゲートした抗ＣＤ１４または抗ＣＤ１１ｃ（それぞれ、Life TechnologiesおよびBiolegend）を用いて、細胞を氷上で３０分間染色し、洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）によって分析した。結合を、二次抗体のみで染色した細胞から差し引いた、ＣＤ１４^＋またはＣＤ１１ｃ^＋細胞のＦＩＴＣ蛍光強度中央値として評価した。

【0249】

[0227] 表５に示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ３、ＳＩＲＰ４、ＳＩＲＰ５、およびＳＩＲＰ９は、ＯＳＥ－１８Ｄ５およびＫＷＡＲ－２３と同様に、ピコモル範囲の見かけの親和性で樹状細胞および／またはマクロファージ上の細胞発現ＳＩＲＰαに結合した。図１１は、本開示の抗体から得られた代表的な結合曲線を示す。

【0250】

【表12】

【0251】

[0228] 実施例１３
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂはヒトＣＤ３^＋ Ｔ細胞への可変的な結合を示す
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂのヒトＣＤ３ Ｔ細胞に対する結合を評価するため、フローサイトメトリーを使用した以下の方法を採用した。

【0252】

[0229] ＰＢＳ（Corning）中に１ｍＭ ＥＤＴＡ（Sigma Aldrich）、１％ ＦＢＳ（Biowest）を含有する結合バッファ中のＳＩＲＰ ｍＡｂの連続希釈を用いて、末梢血単核細胞から単離されたヒトＣＤ３ Ｔ細胞（Astarte Biologics）を、９６ウェルＶ底プレート中、２．５×１０５細胞／ウェルにて、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、同じ条件下でロバ抗マウスＩｇＧフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用いて、４５分間染色した。その後、３－カルボキシ－６，８－ジフルオロ－７－ヒドロキシクマリン（パシフィックブルー）フルオロフォアとコンジュゲートした抗ＣＤ３（BioLegend）を用いて、細胞を氷上で３０分間染色し、洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）によって分析した。結合を、二次抗体のみで染色したＣＤ３^＋細胞から差し引いた、ＣＤ３^＋細胞のＦＩＴＣ蛍光強度中央値として評価した。ＬＳＢ２．２０（BioLegend）を除き、すべてのＳＩＲＰ抗体を自社で作製した。活性化されたＴ細胞については、ＣＤ３ Ｔ細胞を、結合アッセイの前に、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（クローンUCHT1; BioLegend）で被覆された９６ウェル平底プレート中、１×１０^５細胞／ウェルにて、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（クローンCD28.2; BioLegend）の存在下で７２時間活性化させた。

【0253】

[0230] 表６に示されるように、可溶性ＳＩＲＰ３、ＳＩＲＰ７、ＳＩＲＰ９、ＫＷＡＲ－２３、およびＳＩＲＰγ特異的抗体ＬＳＢ２．２０は、ピコモル範囲の親和性でＴ細胞に結合する。抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ４、ＳＩＲＰ５、およびＯＳＥ－１８Ｄ５の親和性ははるかに低く、ナノモル範囲である。図１２Ａ、図１２Ｂ、および図１２Ｃは、本開示の抗体から得られた代表的な結合曲線を示す。

【0254】

【表13】

【0255】

[0231] 実施例１４
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂは可溶性ＣＤ４７／細胞ＳＩＲＰγ結合を遮断しない
可溶性ＣＤ４７のＳＩＲＰγを発現する細胞への結合の遮断に対する本開示の抗ＳＩＲＰ抗体の効果を評価するため、可溶性ヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグ付きヒトＣＤ４７を使用した以下の方法を採用した。

【0256】

[0232] ＰＢＳ（Corning）中に１ｍＭ ＥＤＴＡ（Sigma Aldrich）、１％ ＦＢＳ（Biowest）を含有する結合バッファ中の１０μｇ／ｍｌのＳＩＲＰ ｍＡｂを用いて、ヒトＴ－ＡＬＬ細胞（Jurkat）を、２．５×１０^５細胞／ウェルにて、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。この後、可溶性ヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグ付きヒトＣＤ４７（ACRO #CD7-H5256）を最終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、細胞を前と同様にもう１時間インキュベートした。次いで、細胞をくまなく洗浄し、同じ条件下でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Jackson ImmunoResearch）にコンジュゲートしたロバ抗ヒト抗体を用いて、４５分間染色した。試料をフローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）によって分析した。分析のために、可溶性Ｆｃタグ付きＣＤ４７の非存在下におけるバックグラウンドヒトＩｇＧ１ Ｆｃ染色を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７蛍光強度中央値から差し引いた。遮断を、マウスＩｇＧ１（Biolegend、MOPC-21）対照と比較したときの、ＳＩＲＰ ｍＡｂの存在下におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７のバックグラウンド補正済み蛍光強度中央値の減少として評価した。

【0257】

[0233] 表７に示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ４、ＳＩＲＰ９、およびＯＳＥ １８Ｄ５は、細胞発現ＳＩＲＰγの可溶性ヒトＣＤ４７への結合を遮断しない。ＫＷＡＲ－２３は、Ｊｕｒｋａｔ細胞発現ＳＩＲＰγの可溶性ヒトＣＤ４７への結合を遮断する。

【0258】

【表14】

【0259】

[0234] 実施例１５
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂは可溶性ＣＤ４７／細胞ＳＩＲＰα結合を遮断する
可溶性ＣＤ４７のＳＩＲＰαを発現する細胞への結合に対する本開示の抗ＳＩＲＰ抗体の効果を評価するため、ヒトマクロファージおよび可溶性ヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグ付きヒトＣＤ４７を使用した以下の方法を採用した。

【0260】

[0235] 末梢血単核細胞から単離されたヒトＣＤ１４^＋単球（Astarte Biologics）を、インビトロで７日間、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（Biolegend）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中で分化させた。次いで、ヒトＦｃ受容体ブロッキング溶液（Biolegend）を用いて、マクロファージＦｃ受容体を室温で２０分間ブロッキングした。次いで、細胞を洗浄し、ＰＢＳ（Corning）中に１ｍＭ ＥＤＴＡ（Sigma Aldrich）、１％ ＦＢＳ（Biowest）を含有する結合バッファ中の１０μｇ／ｍｌの抗ＳＩＲＰ ｍＡｂを用いて、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。この後、可溶性ヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグ付きヒトＣＤ４７（ACRO #CD7-H5256）を最終濃度が２０μｇ／ｍｌとなるように添加し、細胞を前と同様にもう１時間インキュベートした。次いで、細胞をくまなく洗浄し、同じ条件下でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Jackson ImmunoResearch）にコンジュゲートしたロバ抗ヒト抗体を用いて、４５分間染色した。試料をフローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）によって分析した。分析のために、可溶性Ｆｃタグ付きＣＤ４７の非存在下におけるバックグラウンドヒトＩｇＧ１ Ｆｃ染色を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７蛍光強度中央値から差し引いた。遮断を、マウスＩｇＧ１（Biolegend、MOPC-21）対照と比較したときの、ＳＩＲＰ ｍＡｂの存在下におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７のバックグラウンド補正済み蛍光強度中央値の減少として評価した。これらのアッセイでは、被験抗体当たり３種のドナーを最小として、４種の異なる単球ドナーを使用した。

【0261】

[0236] 図１３に示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ４およびＳＩＲＰ９は、マクロファージ上の細胞発現ＳＩＲＰαの可溶性ヒトＣＤ４７への結合を遮断する。ＯＳＥ １８Ｄ５ ｍＡｂは、細胞発現ＳＩＲＰαの可溶性ヒトＣＤ４７への結合を遮断しない。

【0262】

[0237] 実施例１６
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂはＴ細胞増殖を阻害しない
同種樹状細胞誘導性Ｔ細胞増殖に対する抗ＳＩＲＰ ｍＡｂの効果をインビトロで評価するため、フローサイトメトリーを使用した以下の方法を採用した。

【0263】

[0238] １０％ヒトＡＢ血清（Valley Biomedical）、２００ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ（Biolegend）、および５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４（Biolegend）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中で、２日目に新しいサイトカイン再播種培地を添加しつつ６日間ＣＤ１４^＋単球（Astarte Biologics）をインキュベートすることにより、ヒト単球由来樹状細胞を作製した。同種樹状細胞・Ｔ細胞共培養アッセイのために、未成熟の樹状細胞を、９６ウェルプレート上に１ウェル当たり１×１０^５細胞の濃度で再播種した。４種の異なるドナー（Astarte Biologics）から得られ、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ（Life Technologies）蛍光細胞増殖色素で標識した、同種健康ドナー由来ＣＤ３^＋ Ｔ細胞を、１：５のＤＣ：Ｔ細胞比で培養物に添加した。抗ＳＩＲＰ ｍＡｂを１０μｇ／ｍｌの飽和濃度で即座に添加し、細胞を総体積２００μｌにて３７℃、５％ＣＯ_２で６～７日間インキュベートした。次いで、ピペットの先端でウェルを擦ることによって細胞を剥離し、蛍光活性化細胞用ソーティングバッファ（１％FBS、Biowest、PBS中）中で洗浄した。次いで、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５蛍光色素標識ＣＤ３抗体（Biolegend）を用いて、細胞を氷上で３０分間インキュベートし、１回洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）によって分析した。ＣＤ３^＋細胞集団内でのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素の希釈により、Ｔ細胞増殖を測定した。

【0264】

[0239] 図１４Ａおよび図１４Ｂに示されるように、抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ３、ＳＩＲＰ４、ＳＩＲＰ５、ＳＩＲＰ９、ＳＩＲＰ１１、ＳＩＲＰ１２、ＳＩＲＰ１３、ＳＩＲＰ１４、ＳＩＲＰ１５、ＳＩＲＰ１７、ＳＩＲＰ１８、ＳＩＲＰ２０、ＳＩＲＰ２１、ＳＩＲＰ２３、およびＯＳＥ－１８Ｄ５は、対照抗体（Biolegend）と比較して、Ｔ細胞増殖に対する有意な効果を有していなかった。一方、ＣＤ４７へのＳＩＲＰαおよびＳＩＲＰγ結合のいずれも遮断するＫＷＡＲ－２３は、Ｔ細胞増殖を阻害した。

【0265】

[0240] 実施例１７
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂは抗原特異的Ｔ細胞リコール応答を阻害しない
Ｔ細胞における抗原リコール応答に対する抗ＳＩＲＰ ｍＡｂの効果をインビトロで評価するため、フローサイトメトリーを使用した以下の方法を採用した。

【0266】

[0241] サイトメガロウイルス血清陽性ドナー（Astarte Biologics）から得られたヒト末梢血単核細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ（Life Technologies）蛍光細胞増殖色素で標識し、９６ウェルプレート中に２００，０００細胞／ウェルで播種した。次いで、異なる濃度のサイトメガロウイルス抗原（Astarte Biologics）を用いて、Ｔ細胞増殖に対する抗原依存性刺激を誘導する１０％ヒトＡＢ血清（Valley Biomedical）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中で、細胞をインキュベートした。抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ、あるいは抗ＣＤ４７ ｍＡｂであるクローンＢ６Ｈ１２（Biolegend）を１０μｇ／ｍｌの飽和濃度で即座に添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で５日間インキュベートした。ＣＤ４^＋細胞集団内でのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素の希釈により、Ｔ細胞増殖を測定した。

【0267】

[0242] 図１５に示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ４、ＳＩＲＰ５、およびＳＩＲＰ９は、ＣＭＶ抗原リコール応答を誘発するＴ細胞の能力を阻害しなかった。一方、Ｔ細胞応答を阻害することが知られている抗ＣＤ４７抗体クローンＢ６Ｈ１２は、マウスＩｇＧ１対照抗体（Biolegend）と比較してＴ細胞増殖を低減させた。

【0268】

実施例１８
ＳＩＲＰα抗体配列

【0269】

【表15-1】

【0270】

【表15-2】

【0271】

【表15-3】

【0272】

[0243] 実施例１９
ＳＩＲＰαアーキテクチャに対する抗ＳＩＲＰモノクローナル抗体の効果
ＳＩＲＰαのアーキテクチャ、すなわち、二量体、多量体、またはクラスター中でのその組織に対する本開示の抗ＳＩＲＰ抗体の効果を評価するため、ヒトマクロファージおよびフィコエリトリン（PE）またはアロフィコシアニン（APC）で標識した非競合性ＳＩＲＰα抗体を使用し、フローサイトメトリー（FCET）法によって定量された、以下の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を採用する。

【0273】

[0244] 末梢血単核細胞から単離したヒトＣＤ１４^＋単球（Astarte Biologics）を、インビトロで７日間、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（BioLegend）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中で分化させた。ＦＲＥＴアッセイのために、ＰＥおよびＡＰＣで標識したＳＩＲＰαに対する抗体を、これまでに記載されているＦＣＥＴ法（Batardら, 2002）に従って使用した。抗体－ＰＥとコンジュゲートしたドナーと抗体－ＡＰＣとコンジュゲートしたアクセプターの間のＦＲＥＴは、これら２つの分子が近接していることを示す。Ａｃｃｕｔａｓｅを使用してヒトマクロファージをプレートから剥離し、洗浄し、Ｖ底９６ウェルプレートにおいてＡＩＭ－Ｖ培地中で２時間インキュベートした。次いで、細胞を、１０μｇ／ｍｌのＳＩＰＲ４、ＳＩＲＰ９、またはｍＩｇＧ１対照を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、等モル濃度のＳＩＲＰ抗体クローンＳＥ５Ａ５－ＰＥおよびＳＥ５Ａ５－ＡＰＣ（いずれもBioLegendから）を組み合わせ（最終的に１０μｇ／ｍｌとなるように）、細胞懸濁液に添加した。また、単一フルオロフォア染色のために、等モル量の非標識ＳＥ５Ａ５（BioLegend）の存在下で、細胞をＳＥ５Ａ５－ＰＥまたはＳＥ５Ａ５－ＡＰＣで標識した。細胞を氷上で３０分間染色し、洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）によって分析した。ＳＥ５Ａ５－ＡＰＣおよびＳＥ５Ａ５－ＰＥのいずれについても１：１のタンパク質対色素比であると仮定し（BioLegendによって提供された情報を使用）、３波長補正法（Batardら, 2002）を使用してＦＲＥＴ効率を計算した。

【0274】

[0245] 図１６に示されるように、抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ９は、ＳＥ５Ａ５－ＰＥドナーとＳＥ５Ａ５－ＡＰＣアクセプターの間のＦＲＥＴ効率を低下させる。抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ４は、ＳＥ５Ａ５－ＰＥドナーとＳＥ５Ａ５－ＡＰＣアクセプターの間のＦＲＥＴ効率を低下させない。

【0275】

[0246] 実施例２０
マクロファージによる抗ＳＩＲＰモノクローナル抗体の内在化
ＳＩＲＰα－抗体複合体の内在化に対する本開示の抗ＳＩＲＰ抗体の効果を評価するため、ヒトマクロファージおよびｐＨｒｏｄｏ ｇｒｅｅｎ標識抗ＳＩＲＰ抗体を使用した以下の方法を採用した。ｐＨｒｏｄｏ ｇｒｅｅｎ色素は、酸性の内在化したコンパートメントにおいて１度だけ蛍光を発する。

【0276】

[0247] 末梢血単核細胞から単離したヒトＣＤ１４^＋単球（Astarte Biologics）を、インビトロで７日間、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（BioLegend）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中で分化させた。ｐＨｒｏｄｏ Ｇｒｅｅｎマイクロスケールタンパク質標識キット（Invitrogen）を使用して、製造業者による説明書に従ってＳＩＲＰ抗体を標識した。標識効率はすべての抗体間で同等であった。抗体をマクロファージ成長培地中に希釈し、３７℃に加温した。指定された時点で、マクロファージから培地を取り除き、１０μｇ／ｍｌの標識抗体を含有する培地と置き換え、３７℃で最長１時間、インキュベーションを継続した。インキュベーション後、培地を取り除き、Ａｃｃｕｔａｓｅ（STEMCELL Technologies）を使用して細胞をプレートから剥離した。細胞を４００ｇでペレット化し、氷冷ＰＢＳ（Corning）で洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）によって分析した。内在化を、ｐＨｒｏｄｏ ｇｒｅｅｎ^＋単一生細胞の百分率として定量化した。

【0277】

[0248] 図１７に示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ４は、ＳＩＲＰα－抗体複合体の内在化を誘導する。可溶性抗ＳＩＲＰ９ ｍＡｂは、ＳＩＲＰアルファ－抗体複合体の内在化をより低い程度で誘導する。

【0278】

[0249] 実施例２１
抗ＳＩＲＰモノクローナル抗体は細胞表面ＳＩＲＰアルファレベルを低下させる
細胞表面上におけるＳＩＲＰアルファの発現量に対する本開示の抗ＳＩＲＰ抗体の効果を評価するため、ヒトマクロファージを利用した、フローサイトメトリーに基づく以下の方法を使用した。

【0279】

[0250] 末梢血単核細胞から単離したヒトＣＤ１４^＋単球（Astarte Biologics）を、インビトロで７日間、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（BioLegend）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中で分化させた。Ａｃｃｕｔａｓｅ（STEMCELL Technologies）を使用してヒトマクロファージをプレートから剥離し、洗浄し、Ｖ底９６ウェルプレートにおいて、ＡＩＭ－Ｖ培地中で２時間インキュベートした。次いで、１０μｇ／ｍｌ のｍＩｇＧ１対照、ＳＩＰＲ４、ＳＩＲＰ９、１８Ｄ５、またはＫＷＡＲ２３を用いて、５％ＣＯ_２にて、４℃で２時間、または３７℃で２時間、４時間、６時間、もしくは２４時間インキュベートした。その後、細胞をフローサイトメトリー（FC）バッファ（PBS中２％FBS）中で洗浄し、非競合性の蛍光標識した抗ＳＩＲＰアルファ抗体を使用して、細胞表面ＳＩＲＰアルファレベルを測定した。ＳＩＲＰ４、１８Ｄ５、およびＫＷＡＲ２３については、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で標識した抗ＳＩＲＰ抗体ＳＩＲＰ９を使用した。ＳＩＲＰ９－ＡＦ６４７は、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗体標識キットを使用して作製した。ＳＩＲＰ４については、フィコエリトリンで標識した抗ＳＩＲＰ抗体ＳＥ５Ａ５を使用した（BioLegend）。蛍光抗体標識のために、細胞を氷上で３０分間染色し、洗浄し、フローサイトメーター（Attune、Life Technologies）上で分析した。蛍光レベルを、ｍＩｇＧ１対照で処理し、それぞれの蛍光ＳＩＲＰ抗体を用いて氷上で染色したマクロファージの蛍光強度中央値に対して正規化した。

【0280】

[0251] 図１８に示されるように、抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ４は、ＳＩＲＰαの表面レベルの低下を示す。抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ９、１８Ｄ５、およびＫＷＡＲ２３は、いずれもＳＩＲＰアルファの表面レベルの低下を示さない。

【0281】

[0252] 実施例２２
抗ＳＩＲＰモノクローナル抗体は、ＳＩＲＰα対立遺伝子バリアントによらずマクロファージによる腫瘍細胞に対する食作用を増加させる
異なるＳＩＲＰアルファ対立遺伝子バリアントを保有するマクロファージによる腫瘍細胞に対する食作用に対する抗ＳＩＲＰアルファ抗体の効果を評価するため、フローサイトメトリーを使用した以下のインビトロの方法を採用した。

【0282】

[0253] ＣＤ１４^＋単球から、異なるＳＩＲＰα対立遺伝子群（V1/V1、V1/V2、およびV2/V2）に由来するヒト単球由来マクロファージ（MDM/MQ）を分化させた。ＣＤ１４^＋単球はＡｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから購入したか、または汎単球単離キット（Miltenyi Biotec）を使用して末梢血単核細胞（PBMC、AllCellsおよびHemacare）から富化した。単球を９６ウェル平底プレート上に５×１０^４細胞／ウェルで播種し、インビトロで７日間、１０％ ＦＢＳ（Biowest）および５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（BioLegend）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中でＭＤＭに分化させた。

【0283】

[0254] インビトロ食作用アッセイを開始する前に、ヒトＭＤＭを補足物のないＡＩＭ－Ｖ培地中で２時間培養した。ヒトがん細胞を１μＭ ５（６）－カルボキシフルオレセイン二酢酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（CFSE; Sigma Aldrich）で標識し、８×１０^４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレート中のマクロファージ培養物に添加した。標的およびエフェクター細胞を混合してすぐに、抗ＳＩＲＰまたはｍＩｇＧ１対照抗体を様々な濃度で（図１９Ａ）、または１０μｇ／ｍｌの濃度（図１９Ｂ）で添加し、３７℃で４時間インキュベートした。４時間後、食作用を受けていないすべての細胞を除去し、残りの細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Innovative Cell Technologies）中でインキュベートしてマクロファージを剥離し、９６ウェルＶ底プレート中に回収し、アロフィコシアニン（APC）標識ＣＤ１４抗体（BD biosciences）１００ｎｇを用いて３０分間インキュベートし、１回洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）によって分析した。食作用を、ＣＤ１４^＋細胞集団内でのＣＦＳＥ^＋細胞の百分率として決定した。

【0284】

[0255] 図１９Ａ～１９Ｂで示されるように、抗ＳＩＲＰ抗体ＳＩＲＰ４およびＳＩＲＰ９は、ＳＩＲＰアルファ対立遺伝子バリアントとは無関係に腫瘍に対する食作用を誘導する。

【0285】

[0256] 実施例２３
抗ＳＩＲＰモノクローナル抗体はＳＩＲＰα結合について互いに競合しない
ヒトＳＩＲＰαへの結合における本開示の抗ＳＩＲＰ抗体同士の競合を評価するため、Ｈｉｓタグ付きヒトＳＩＲＰαタンパク質およびビオチン化ＳＩＲＰα抗体を使用した以下のＥＬＩＳＡ法を採用する。

【0286】

[0257] ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）スルホ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン化キット（Thermo Scientific）を使用して、製造業者による説明書に従ってＳＩＲＰアルファに対する抗体をビオチン化し、固相ＥＬＩＳＡを使用してそれらのヒトＳＩＲＰαへの結合を確認した。競合ＥＬＩＳＡのために、１．２５μｇ／ｍｌのビオチン化ＳＩＲＰ抗体の存在下で連続希釈された非ビオチンＳＩＲＰ抗体を用いる対の様式により、プレートに吸着させたヒトＳＩＲＰα（Ｈｉｓタグ付き、ACRObiosystems）を室温で１時間インキュベートした。検出のために、ＨＲＰストレプトアビジン（BioLegend）およびペルオキシダーゼ基質３，３’ ，５，５’－テトラメチルベンジジン（TMB、Thermo Scientific）を１：５０００で使用し、１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４の添加により反応を停止させた。Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１プレートリーダー（BioTek）を使用して、４５０ｎｍにおける吸光度を決定した。

【0287】

[0258] 図２０に示されるように、抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ９は、ＳＩＲＰα結合についてＳＩＲＰ４、ＯＳＥ（18D5）、およびＫＷＡＲ２３と競合しない。抗ヒトＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ４は、ＳＩＲＰα結合についてＯＳＥ（18D5）と競合するが、ＳＩＲＰ９ともＫＷＡＲ２３とも競合しない。

【0288】

[0259] 実施例２４
抗ＳＩＲＰモノクローナル抗体はヒトがん細胞株に対し様々な結合パターンを示す
食作用アッセイにおいて使用されたヒトがん細胞株への抗ＳＩＲＰ ｍＡｂの結合、ならびにこれらの細胞株によるＳＩＲＰα／β、ＳＩＲＰγ、およびＣＤ４７の発現を評価するため、フローサイトメトリーを使用した以下の方法を採用する。

【0289】

[0260] ヒトがん細胞株（Jurkat T-ALL、RAJI B細胞リンパ腫、DLD-1結腸直腸腺癌、RL95-2子宮内膜癌、およびES-2卵巣癌）をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ATCC）から購入し、ベンダーによって推奨されるように培養した。これらの細胞株上におけるＳＩＲＰα、ＳＩＲＰγ、およびＣＤ４７のレベルを評価するため、それらの成長培地中で非接着細胞株を回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Stemcell Technologies）を使用して接着細胞株をそれらの培養プレートから剥離した。次いで、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、９６ウェルＶ底プレート中に１×１０^５細胞／ウェルで配置し、いずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した、ヒトＳＩＲＰα／β（クローンSE5A5）、ＳＩＲＰγ（クローンLSB2.20）、またはＣＤ４７（クローンB6H12）を認識する市販のフィコエリトリン（PE）標識抗体を用いて、フローサイトメトリーバッファ（PBS中１％FBS）中、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）によって分析した。ＳＩＲＰ４およびＳＩＲＰ９ ｍＡｂのがん細胞株への結合を測定するため、上記のように、ＰＢＳ（Corning）中に１ｍＭ ＥＤＴＡ（Sigma Aldrich）、１％ ＦＢＳ（Biowest）を含有する結合バッファ中の１０μｇ／ｍｌのＳＩＲＰ ｍＡｂまたはマウスＩｇＧ１対照（BioLegend）を用いて、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で１時間、９６ウェルＶ底プレート中に置いた。次いで、細胞を洗浄し、同じ条件下でロバ抗マウスＩｇＧフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用いて、４５分間染色し、次いで洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）によって分析した。

【0290】

[0261] 図２１Ａに示されるように、既知の特異性を有するＳＩＲＰ ｍＡｂを使用すると、Ｊｕｒｋａｔ細胞はＳＩＲＰγを発現し、ＥＳ－２細胞はＳＩＲＰα／βを発現するが、残りの細胞株はＳＩＲＰα／βもＳＩＲＰγも発現しない。すべての被験細胞株がＣＤ４７を発現する。図２１Ｂに示されるように、ＳＩＲＰ９はＪｕｒｋａｔ（SIRPγ）およびＥＳ－２（SIRPα/β）細胞株に結合し、ＳＩＲＰ４はＥＳ－２（SIRPα/β）細胞株のみに結合し、Ｊｕｒｋａｔ（SIRPγ）には結合しない。

【0291】

[0262] 実施例２５
抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ誘導性食作用はＦｃγＲ会合に依存する
マクロファージによる腫瘍細胞に対する抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ誘導性食作用に対するヒトＦｃ受容体の遮断の効果をインビトロで評価するため、フローサイトメトリーを使用した以下の方法を採用した。

【0292】

[0263] ヒト単球由来マクロファージを、健康なヒト末梢血の白血球除去によって取得し、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（Biolegend）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中で７日間インキュベートした。インビトロ食作用アッセイのために、９６ウェルプレート中、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦを補足したＡＩＭ－Ｖ培地１００μｌ中にマクロファージを１ウェル当たり３×１０^４細胞の濃度で再播種し、２４時間接着させた。エフェクターマクロファージが培養皿に接着したら、各々が１０μｇ／ｍｌ（+Fc遮断）の最終濃度である、ヒトＣＤ１６（クローン3G8、Invitrogen）、ＣＤ３２（クローンAT10、Invitrogen）、およびＣＤ６４（クローン10.1、Invitrogen）に対する機能遮断抗体からなるヒトＦｃ抗体の反応混液を添加した。３０μｇ／ｍｌのｍＩｇＧ１（Biolegend）をアイソタイプ対照（-Fc遮断）として使用した。その後すぐに、標的となるヒトがん細胞Ｊｕｒｋａｔ（図２２Ａおよび図２２Ｂ）またはＤＬＤ－１（図２２Ｃおよび図２２Ｄ）を１μＭ ５（６）－カルボキシフルオレセイン二酢酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（CFSE; Sigma Aldrich）で標識し、補足物のないＡＩＭ－Ｖ培地１００μｌ中８×１０^４細胞の濃度でマクロファージ培養物に添加した。標的およびエフェクター細胞を混合してすぐに、抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ４（図２２Ａおよび図２２Ｃ）またはＳＩＲＰ９（図２２Ｂおよび図２２Ｄ）を様々な濃度で添加し、３７℃で３時間インキュベートした。３時間後、食作用を受けていないすべての細胞を除去し、残りの細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Stemcell Technologies）中でインキュベートしてマクロファージを剥離し、微量遠心管中に回収し、アロフィコシアニン（APC）標識ＣＤ１４抗体（BD biosciences）１００ｎｇ中で３０分間インキュベートし、１回洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）により、完全な食作用の指標となるＣＦＳＥ^＋でもあるＣＤ１４^＋細胞の百分率について分析した。

【0293】

[0264] 個々のＦｃ受容体の効果を詳細に分析するため、上記のように食作用を行ったが、Ｆｃ遮断抗体を個別に１０μｇ／ｍｌで添加し、１０μｇ／ｍｌの対照ｍＩｇＧ１と比較した。

【0294】

[0265] 図２２Ａおよび図２２Ｂに示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ４およびＳＩＲＰ９はヒトマクロファージによるＪｕｒｋａｔ細胞に対する食作用を誘導したが、食作用活性はＦｃ遮断抗体反応混液の添加によって抑制された。ＤＬＤ－１細胞を標的細胞として使用したとき、ＳＩＲＰ４（図２２Ｃ）およびＳＩＲＰ９（図２２Ｄ）を用いると同じ効果が観察された。図２３に示されるように、ＣＤ１６でもＣＤ６４でもなく、ＣＤ３２（FcγRII）の機能遮断により、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ－ＡＬＬ細胞に対するＳＩＲＰ４誘導性（図２３Ａ）およびＳＩＲＰ９（図２３Ｂ）誘導性のいずれの食作用も阻害された。これは、Ｆｃ受容体との既知のアイソタイプ相互作用と一致する。

【0295】

[0266] 実施例２６
抗ＳＩＲＰ抗体は正常な自己ヒト末梢血単核細胞に対する食作用を誘導しない
正常な非がん性細胞に対する食作用に対する本開示の抗ＳＩＲＰ抗体の効果をインビトロで評価するため、フローサイトメトリーを使用した以下の方法を採用した。

【0296】

[0267] ヒト単球由来マクロファージを、健康なヒト末梢血の白血球除去によって取得した。マクロファージを作製するため、ＣＤ１４^＋単球を、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（Biolegend）を補足したＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technologies）中で７日間インキュベートした。インビトロ食作用アッセイのために、９６ウェルプレート中、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦを補足したＡＩＭ－Ｖ培地１００μｌ中にマクロファージを１ウェル当たり３×１０^４細胞の濃度で再播種し、２４時間接着させた。エフェクターマクロファージが培養皿に接着したら、正常な自己ヒト末梢血単核細胞（図２４Ａ）またはＪｕｒｋａｔ Ｔ－ＡＬＬ細胞（図２４Ｂ）を１μＭ ５（６）－カルボキシフルオレセイン二酢酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（CFSE; Sigma Aldrich）で標識し、補足物のないＡＩＭ－Ｖ培地１００μｌ中８×１０^４細胞の濃度でマクロファージ培養物に添加した。標的およびエフェクター細胞を混合してすぐに、抗ＳＩＲＰ抗体ＳＩＲＰ４またはＳＩＲＰ９を様々な濃度で添加し、３７℃で３時間インキュベートした。３時間後、食作用を受けていないすべての細胞を除去し、残りの細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Stemcell Technologies）中でインキュベートしてマクロファージを剥離し、微量遠心管中に回収し、アロフィコシアニン（APC）標識ＣＤ１４抗体（BD biosciences）１００ｎｇ中で３０分間インキュベートし、１回洗浄し、フローサイトメトリー（Attune、Life Technologies）により、完全な食作用の指標となるＣＦＳＥ^＋でもあるＣＤ１４^＋細胞の百分率について分析した。

【0297】

[0268] 図２４Ａに示されるように、可溶性抗ＳＩＲＰ抗体 ＳＩＲＰ４およびＳＩＲＰ９は、ヒトマクロファージによるＰＢＭＣに対する食作用を誘導しなかった。一方、図２４Ｂに示されるように、ＳＩＲＰ４およびＳＩＲＰ９は、マクロファージによるＪｕｒｋａｔ Ｔ－ＡＬＬ細胞に対する食作用を用量依存的に誘導した。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図1J】

【図1K】

【図1L】

【図1M】

【図1N】

【図1O】

【図1P】

【図1Q】

【図1R】

【図1S】

【図1T】

【図1U】

【図1V】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図3J】

【図3K】

【図3L】

【図3M】

【図3N】

【図3O】

【図3P】

【図3Q】

【図3R】

【図3S】

【図3T】

【図3U】

【図3V】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【図8J】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図23A】

【図23B】

【図24A】

【図24B】

【配列表】

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【国際調査報告】