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特表2023-524247アンジェルマン症候群の治療のための組成物及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-09
(54)【発明の名称】アンジェルマン症候群の治療のための組成物及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230602BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20230602BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230602BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230602BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230602BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20230602BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20230602BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20230602BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230602BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230602BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20230602BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20230602BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230602BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20230602BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/09 100
C12N15/55 ZNA
C12N15/11 Z
C12N15/113 Z
C12N15/63 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/861 Z
C12N15/867 Z
A61K48/00
A61K31/7088
A61K35/76
A61K35/761
A61P25/08
A61P25/00
A61P25/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022566154
(86)(22)【出願日】2021-04-27
(85)【翻訳文提出日】2022-12-13
(86)【国際出願番号】 US2021029378
(87)【国際公開番号】W WO2021222232
(87)【国際公開日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】63/016,712
(32)【優先日】2020-04-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/118,299
(32)【優先日】2020-11-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
３．ＬＡＢＲＡＳＯＬ
(71)【出願人】
【識別番号】502409813
【氏名又は名称】ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア
(74)【代理人】
【識別番号】110000741
【氏名又は名称】弁理士法人小田島特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウイルソン，ジェームス・エム
(72)【発明者】
【氏名】シュミッド，ラルフ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA05
4C084ZA02
4C084ZA06
4C084ZA22
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086NA05
4C086ZA02
4C086ZA06
4C086ZA22
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA05
4C087ZA02
4C087ZA06
4C087ZA22
(57)【要約】
アンジェルマン症候群を有する患者のニューロン中の父系対立遺伝子に対してＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳを標的化する遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列を有する発現カセットを含む組成物が提供される。また、ニューロンにおいてＵＢＥ３Ａ発現が欠損している患者においてアンジェルマン症候群（ＡＳ）の１つ以上の症状を治療するための方法であって、本方法が、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳを標的化する遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列を送達して、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳコード配列を修飾し、かつ父系ＵＢＥ３Ａの発現を提供することを含む、方法が提供される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
発現カセットであって、アンジェルマン症候群を有する患者のニューロン中の父系対立遺伝子に対してＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ中の変異を標的化及び導入する遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列と、標的細胞でその発現を指示する調節要素と、を含み、それによって、父系ＵＢＥ３Ａ対立遺伝子を脱サイレンシングし、ＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の発現を可能にする、発現カセット。
【請求項2】
前記遺伝子編集系が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はＴＡＬＥＮである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項3】
前記核酸が、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳに特異的な遺伝子編集ヌクレアーゼ及び／又は標的化配列をコードする、請求項１又は２に記載の発現カセット。
【請求項4】
前記遺伝子編集系が、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼと、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ標的配列に特異的に結合する配列を有するｓｇＲＮＡと、を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項5】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、任意選択的にＳａＣａｓ９である、請求項１～４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項6】
前記発現カセットが、配列番号１～３２のいずれかをコードする配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項7】
前記ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ標的配列が、ＵＢＥ３Ａ ３’ＵＴＲの下流にある、請求項１～６のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項8】
前記標的配列が、ｃｈｒ１５：２５，２７８，４０９～２５，３３３，７２８（ｈｇ３８ゲノムアセンブリ）に、及び／又は１５番染色体上のＵＢＥ３Ａ ３’ＵＴＲとＳＮＯＲＤ１０９Ｂ ＯＲＦとの間の領域に対して相補性のＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの配列中に位置する、請求項１～７のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項9】
前記標的配列が、ＣＮＳの細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項10】
前記調節要素が、ニューロン特異的プロモーターを含み、任意選択的に、前記プロモーターが、シナプシンプロモーターである、請求項１～９のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項11】
前記調節要素が、エンハンサーを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項12】
前記ベクターが、非ウイルスベクター又はウイルスベクターである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【請求項13】
前記非ウイルスベクターが、プラスミドである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項14】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ボカウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、又はレトロウイルスである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項15】
アンジェルマン症候群（ＡＳ）の治療のためのＣＮＳ指向性治療薬として有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＶＶが、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムと、を含み、前記ベクターゲノムが、（ａ）ＡＡＶの５’逆位末端反復（ＩＴＲ）と、
（ｂ）ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳを標的化する遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列と、
（ｃ）前記遺伝子編集系の前記１つ以上の要素の発現を指示する調節要素と、
（ｄ）ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含む、ｒＡＡＶ。
【請求項16】
遺伝子標的化系が、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼと、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ標的配列に特異的に結合するｓｇＲＮＡと、を含む、請求項１５に記載のｒＡＡＶ。
【請求項17】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項１５又は１６に記載のｒＡＡＶ。
【請求項18】
前記調節要素が、ニューロン特異的プロモーターを含み、任意選択的に、前記プロモーターが、シナプシンプロモーターである、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項19】
前記調節要素が、エンハンサーを含む、請求項１５～１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項20】
前記カプシドが、ＡＡＶ９カプシド、若しくはそのバリアント、又はＡＡＶｈｕ６８カプシド、若しくはそのバリアントである、請求項１５～１９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項21】
前記ＡＡＶカプシドが、配列番号５４の核酸配列の発現から生成されたＡＡＶｈｕ６８カプシドである、請求項１５～２０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項22】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項１５～２１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶと、生理学的に適合する担体、緩衝液、アジュバント、及び／又は希釈剤と、を少なくとも含む、薬学的組成物。
【請求項23】
ＡＳの治療を必要とする対象に、請求項１～１１のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のベクター、請求項１５～２１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、又は請求項２２に記載の組成物を投与することによって前記ＡＳを治療する方法であって、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの編集が、ニューロン中の父系対立遺伝子からのＵＢＥ３Ａの発現を増強させる、方法。
【請求項24】
ニューロンにおいてＵＢＥ３Ａ発現が欠損している患者においてアンジェルマン症候群（ＡＳ）の１つ以上の症状を治療するための方法であって、前記方法が、ＵＢＥ３Ａ ３’ＵＴＲの下流のＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ中の配列を標的化する遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列を送達して、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳコード配列を修飾し、それによって、母系対立遺伝子からのＵＢＥ３Ａ発現が欠損している患者の父系対立遺伝子上のＵＢＥ３Ａを脱サイレンシングすることと、前記父系対立遺伝子からのＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の発現を提供することと、を含む、方法。
【請求項25】
前記修飾が、前記ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳコード配列におけるインデル、欠失、挿入、反転、又は他の破壊である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記修飾が、前記ＵＢＥ３Ａ ３’ＵＴＲ及びＳＮＯＲＤ１０９Ｂにわたる領域において、ヒトＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳに導入される、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項27】
前記標的配列が、ｃｈｒ１５：２５，２７８，４０９～２５，３３３，７２８（ｈｇ３８ゲノムアセンブリ）に、及び／又は１５番染色体上のＵＢＥ３Ａ ３’ＵＴＲとＳＮＯＲＤ１０９Ｂ ＯＲＦとの間の領域に対して相補性のＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの配列中に位置する、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記症状が、発育遅延、知的障害、重度の言語障害、運動失調、及び／又はてんかんのうちの１つ以上から選択される、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
アンジェルマン症候群（ＡＳ）を有する患者を治療する際に使用するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のベクター、請求項１５～２１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、又は請求項２２に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
アンジェルマン症候群（ＡＳ）は、稀な重度の神経発達障害である。特徴的な症状としては、発育遅延、知的障害、重度の言語障害、運動及びバランスに関する問題（運動失調）、並びに多くの場合に早期発症性の再発性発作（てんかん）が挙げられる。現時点で、ＡＳには利用可能な根治療法は存在しない。
【0002】
ＡＳの進行は、ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ（Ｅ６ＡＰユビキチンタンパク質リガーゼとしても知られる、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ）タンパク質発現の欠如から生じる。ＵＢＥ３Ａは、ニューロンにおいて、母系遺伝対立遺伝子から単対立遺伝子的に発現するのみであり、一方で、父系遺伝ＵＢＥ３Ａ対立遺伝子は、ニューロンにおいてサイレンシングされる。ＡＳに罹患した個体は、母系遺伝対立遺伝子上に位置するＵＢＥ３Ａ遺伝子内に大きな欠損、又は機能欠損変異を有し、その結果、ニューロンにおいてＵＢＥ３Ａ発現が完全に消失する。
【0003】
当該技術分野では、ＡＳのための新規かつ効果的な治療が、継続的に必要とされている。
【発明の概要】
【0004】
一実施形態では、発現カセットであって、アンジェルマン症候群を有する患者のニューロン中の父系対立遺伝子に対してＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ（ＵＢＥ３Ａアンチセンス転写産物）を標的化する遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列と、標的細胞でその発現を指示する調節要素と、を含む、発現カセットが本明細書で提供される。ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの編集によって、父系ＵＢＥ３Ａ対立遺伝子を脱サイレンシングし、ＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の発現を可能にする。遺伝子編集系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はＴＡＬＥＮであり得る。特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、任意選択的にＣａｓ９（例えば、ＳａＣａｓ９）、及びＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ標的配列に特異的に結合する配列を有するｓｇＲＮＡをコードする。特定の実施形態では、ｇｓＲＮＡは、配列番号１～３２のいずれかを含む。特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ標的配列は、ＵＢＥ３Ａ ３’ＵＴＲの下流である。更なる実施形態では、標的配列は、ｃｈｒ１５：２５，２７８，４０９～２５，３３３，７２８（ｈｇ３８ゲノムアセンブリ）に、及び／又は１５番染色体上のＵＢＥ３Ａ ３’ＵＴＲとＳＮＯＲＤ１０９Ｂ ＯＲＦとの間の領域に対して相補性のＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの配列中に位置する。
【0005】
本明細書に提供される発現カセットは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれ得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ボカウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、又はレトロウイルスである。
【0006】
一実施形態では、アンジェルマン症候群（ＡＳ）の治療のためのＣＮＳ指向性治療薬として有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が本明細書で提供される。ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムと、を含み、ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶの５’逆位末端反復（ＩＴＲ）と、（ｂ）ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳを標的化する遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列と、（ｃ）遺伝子編集系の１つ以上の要素の発現を指示する調節要素と、（ｄ）ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含む。特定の実施形態では、遺伝子標的化系は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼと、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ標的配列に特異的に結合するｓｇＲＮＡと、を含む。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、任意選択的にＳａＣａｓ９であり得る。特定の実施形態では、
カプシドは、ＡＡＶ９カプシド、若しくはそのバリアント、又はＡＡＶｈｕ６８カプシド、若しくはそのバリアントである。
カプシドは、ＡＡＶ９カプシド、若しくはそのバリアント、又はＡＡＶｈｕ６８カプシド、若しくはそのバリアントである。
【0007】
他の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子編集系の送達のための発現カセット、ベクター、又はｒＡＡＶと、生理学的に適合する担体、緩衝液、アジュバント、及び／又は希釈剤と、を少なくとも含む、薬学的組成物が本明細書で提供される。
【0008】
特定の実施形態では、ＡＳを治療する方法であって、それを必要とする対象に、発現カセット、ベクター、又はｒＡＡＶを投与して、遺伝子発現系を送達することによって、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの編集が、ニューロン中の父系対立遺伝子からのＵＢＥ３Ａの発現を増強させる、方法が本明細書で提供される。また、ニューロンにおいてＵＢＥ３Ａ発現が欠損している患者においてアンジェルマン症候群（ＡＳ）の１つ以上の症状を治療するための方法であって、本方法が、ＵＢＥ３Ａ ３’ＵＴＲの下流のＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ中の配列を標的化する遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列を送達して、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳコード配列を修飾することを含む、方法が提供される。ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの編集によって、母系対立遺伝子からのＵＢＥ３Ａ発現が欠損している患者の父系対立遺伝子上のＵＢＥ３Ａ発現を脱サイレンシングし、父系対立遺伝子からのＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の発現を提供する。特定の実施形態では、発育遅延、知的障害、重度の言語障害、運動失調、及び／又はてんかんのうちの１つ以上を含む、アンジェルマン病の症状を改善するための方法を提供する。
【0009】
特定の実施形態では、アンジェルマン症候群（ＡＳ）を有する患者を治療する際に使用するための、発現カセット、ベクター、ｒＡＡＶ、医薬品が本明細書で提供される。
【0010】
これらの方法及び組成物の他の態様及び利点が、以下の詳細な説明において更に説明される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】父系Ｕｂｅ３ａ対立遺伝子を脱サイレンシングするための戦略の概要を示す。Ｕｂｅ３ａは、健常な細胞における二重対立遺伝子を示すが、健常なニューロンにおける単一対立遺伝子発現を示し、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳは、父系ＵＢＥ３Ａ発現を阻害する。ＡＳ対象は、ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ発現を妨げる母系Ｕｂｅ３ａ遺伝子座を欠いている。ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳとの干渉によって、父系ＵＢＥ３Ａ対立遺伝子発現が生じ、したがって、ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａタンパク質発現を回復させる。
【図2A-2I】Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳのインビボ遺伝子編集が、インデル形成、及びＵｂｅ３ａ－ＹＦＰ受容体の発現を引き起こすことを示す。（図２Ａ）マウスＵｂｅ３ａゲノム遺伝子座の概略図［Ｍｅｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５１８（７５３９）：４０９－１２から適合される］。この試験において、ｓｇＲＮＡによって標的とされた領域を示す。ＩＣ：インプリンティングセンター、３’ＵＴＲ：３’非翻訳領域、ｓｎｏＲＮＡ：核小体低分子ＲＮＡ。（図２Ｂ）スクリーニングされたｓｇＲＮＡについてのインビトロインデル頻度。（図２Ｃ）Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐＹＦＰマウスに、示された時点でＡＴＳ－ＧＥベクターを注射した。３週間後、皮質試料を用いたＡｍｐｌｉｃｏｎ－Ｓｅｑは、新生児注射された仔において、インデルを有する細胞が平均１４．７％であることを明らかにし、全ての他の時間点でインデル頻度が２．９％未満であった。非標的化ＣＲＩＳＲＰ／Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９は、０．２％未満のインデル形成をもたらした（テューキーのペアワイズ比較を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ、２～６匹のマウス／群）。（図２Ｄ）インデルは、１×１０１１ｇｃ ＡＴＳ－ＧＥベクターを新生児注射されたＵｂｅ３ａｍ＋／ｐＹＦＰマウスにおいて持続した（テューキーのペアワイズ比較を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ、３～６匹のマウス／群）。（図２Ｅ、図２Ｆ）（図２Ｃ）からの皮質についての代表的なウエスタンブロットは、ＹＦＰ抗体（図２Ｅ）又はＵｂｅ３ａ抗体（図２Ｆ）でプローブしたときに、父系Ｕｂｅ３ａ－ＹＦＰの強固な発現を示す。アクチンに対して正規化された相対的定量化は、各レーンの下に示されており、（図２Ｆ）の緑色の矢印は、定量化されたＵｂｅ３ａ－ＹＦＰバンドを区切っている。ＮＴ：非標的化。（図２Ｇ）（図２Ｃ）からの皮質についての代表的な免疫蛍光染色は、皮質全体のニューロンにおけるＵｂｅ３ａ－ＹＦＰ発現を示す（スケールバー＝１００ｕｍ）。（図２Ｈ）Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ転写産物に特異的なプライマーを用いたｑＰＣＲ遺伝子発現分析。Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐＹＦＰ遺伝子編集された皮質試料について、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ発現が有意に２８％低減することを検出した（３～１５匹のマウス／群、テューキーのペアワイズ比較を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ）。（図２Ｉ）隣接する転写産物に特異的なプライマーを用いたｑＰＣＲ遺伝子発現分析は、発現の差をなんら検出しなかった（３～４匹のマウス／群、テューキーのペアワイズ比較を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＞０．４）。平均は、標準誤差、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１を用いて示される。
【図3A-3G】Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウスモデルにおけるＵｂｅ３ａ－ＡＴＳのインビボ遺伝子編集を示す。（図３Ａ）１×１０１１のｇｃ ＡＴＳ－ＧＥベクターを注射されたＵｂｅ３ａｍ－／ｐ＋マウスの脳を、４ヶ月後に回収した。Ｕｂｅ３ａ抗体を用いたウエスタンブロッティングによって、大脳皮質において持続的な父系Ｕｂｅ３ａ発現を検出した。アクチンに対して正規化されたそれぞれのＵｂｅ３ａバンドの相対的定量化を、各レーンの下に示す。（図３Ｂ）図３Ａからの脳を、Ｕｂｅ３ａ抗体によって免疫組織染色（ＩＨＣ）染色すると、脳全体にわたって父系Ｕｂｅａ３ａ発現を示す。代表的な皮質切片をここに示す（スケールバー：１ｍｍ）。Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐ＋（図３Ｃ）、Ｕｂｅ３ａｍ－／ｐ＋（図３Ｄ）、及び遺伝子編集されたＵｂｅ３ａｍ－／ｐ＋（図３Ｅ）皮質からの拡大皮質ＩＨＣ画像（スケールバー：１０μｍ）。（図３Ｆ）図３Ａに示したのと同じコホートからのＡｍｐｌｉｃｏｎ－Ｓｅｑ分析は、注射された仔において、インデルを有する細胞が平均１９．４％であることを明らかにした。非標的化ＣＲＩＳＲＰ／Ｃａｓ９の注射は、０．２％（５匹のマウス／群）のインデル形成をもたらした。（図３Ｇ）図３Ａに示したのと同じコホートの皮質から抽出されたＲＮＡを使用して、遺伝子編集（Ｅ）によって標的化される部位とインプリンティングセンター（ＩＣ）との間の異なる位置でＵｂｅ３ａ－ＡＴＳ転写産物レベルを定量化した。Ｅからおよそ５ｋｂ離れて開始するＵｂｅ３ａ－ＡＴＳの有意な低減を観察した（テューキーのペアワイズ比較を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ、５匹のマウス／群）。平均は、標準誤差、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１を用いて示される。
【図4A-4E】遺伝子編集後のＡＳマウスモデルにおける表現型改善を示す。Ｕｂｅ３ａｍ－／ｐ＋及びＵｂｅ３ａｍ＋／ｐ＋同腹仔は、１ｘ１０１１のｇｃ ＡＴＳ－ＧＥ又は対照ベクターの新生児注射を受けた。（図４Ａ）マウス体重は、観察期間にわたって増加したが、群効果を示さなかった［Ｆ（１．３１１，６４．２５）＝３８５．３、ｐ＞０．２、１５匹のマウス／群］。（図４Ｂ）８週齢で、ロータロッド装置を用い、３日間連続で運動機能を試験した。２日目及び３日目に、遺伝子編集されたＵｂｅ３ａｍ－／ｐ＋マウスは、対照ベクターを受けたＵｂｅ３ａｍ－／ｐ＋マウスと比較すると、有意な運動改善を示した（テューキーのペアワイズ比較を伴う二元配置ＡＮＯＶＡ、１５～２４匹のマウス／群）。（図４Ｃ）遺伝子編集されたＵｂｅ３ａｍ－／ｐ＋マウスは、対照ベクターを受けたＵｂｅ３ａｍ－／ｐ＋マウスと比較すると、覆い隠し活動の有意な改善を示した（テューキーのペアワイズ比較を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ、１５～２４匹のマウス／群）。（図４Ｄ）遺伝子編集されたＵｂｅ３ａｍ－／ｐ＋マウスは、対照ベクターを受けたＵｂｅ３ａｍ－／ｐ＋マウスと比較すると、営巣スキル及び活動の有意な改善を示した（テューキーのペアワイズ比較を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ、１５～２４匹のマウス／群）。（図４Ｅ）オープンフィールドアリーナにおいて同じマウスコホートを評価し、歩行活動を決定した。遺伝子編集されたＵｂｅ３ａｍ＋／ｐ－マウスの性能は、対照ベクターを受けたＵｂｅ３ａｍ＋／ｐ－マウスと比較すると、全ての時点で改善の傾向を示した（１５～２４匹のマウス／群、二元配置ＡＮＯＶＡ、治療群効果［Ｆ（３，７７）＝１３．４８、ｐ＜０．００１）、テューキーのペアワイズ比較、ｐ＞０．４））。平均は、標準誤差、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１を用いて示される。
【図5A-5D】Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳのインビボ遺伝子編集が、インデル形成及びＵｂｅ３ａ受容体の発現を引き起こすことを示す。（図５Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードするＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクターで治療されたＵｂｅ３ａｍ＋／ｐＹＦＰマウスからの脳においてベクターゲノムを定量化し、出生児（０日目）に側脳室（ＩＣＶ）に注射したか、又は１４、２１、又は２８日齢にＩＶ注射した。大脳皮質における二倍体ゲノム当たりのベクターゲノムコピーは、その後の時点でのＩＶ注射と比較して、ＩＣＶ注射について１２～５９倍高かった（群当たり３匹のマウス、テューキーのペアワイズ比較を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊ｐ＜０．００１）。（図５Ｂ）Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐＹＦＰ（父系Ｕｂｅ３ａ－ＹＦＰ）マウスに、出生時（０日目）にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードするＡＡＶベクターを注射し、２１日後に大脳皮質を採取した。ＡＭＰ－ｓｅｑによって分子分析を行い、塩基対の挿入、欠失、及びＩＴＲ統合の割合を決定し、これらは合計で平均１２．８％に達した。比較すると、非標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物は、同じ実験において全体的な割合が０．４％であった。挿入、欠失及び統合は、各々、ＮＴ対照と比較して、有意に増加した（群当たり３匹のマウス、シダックのペアワイズ比較を伴う二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＞０．００１）。（図５Ｃ）、（図５Ｄ）Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐＹＦＰマウスに、出生時（０日目）にＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９（ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９）をコードするＡＡＶベクターを注射し、２１日後に大脳皮質を採取した。（図５Ｃ）ＵＢＥ３Ａ抗体を用いるウエスタンブロットによって、父系ＵＢＥ３Ａ－ＹＦＰタンパク質はなんら検出されなかった（Ｕｂｅ３ａ－ＹＦＰバンドは、緑色の矢印によって区切られており、各Ｕｂｅ３ａ－ＹＦＰバンドの相対量をアクチンに対して正規化し、各レーンの下にアノテーションが付けられている）。（図５Ｄ）ＧＦＰ抗体を用いる免疫蛍光染色によって、父系Ｕｂｅ３ａ－ＹＦＰタンパク質はなんら検出されなかった（皮質からの代表的な画像、スケールバー：１００μｍ）。
【図6A-6C】Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳのインビボ遺伝子編集が、Ｕｂｅ３ａの発現を引き起こすことを示す。ＡＴＳ－ＧＥベクターを新生児注射したＵｂｅ３ａ－ｋｏマウス、又は未治療の野生型同腹仔から４ヶ月齢で脳を採取し、固定し、Ｕｂｅ３ａ抗体を用いた免疫組織化学のために処理した。（図６Ａ及び図６Ｂ）矢状方向切片の概要図。（図６Ｃ）アノテーション付き脳領域の図６Ｂの拡大図（スケールバー：（図６Ａ）、図６Ｂ）－３ｍｍ、（図６Ｃ）－３００ｕｍ）。
【図7A-7C】ＡＳマウスモデルにおけるＵｂｅ３ａ－ＡＴＳのインビボ遺伝子編集を示す。Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐ－マウスに、出生時（０日目）にＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９（ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９）をコードするＡＡＶベクターを注射し、４ヶ月後に大脳皮質を採取した。（図７Ａ）Ｕｂｅ３ａ抗体を用いるウエスタンブロットによって、有意な父系Ｕｂｅ３ａタンパク質発現をなんら検出しなかった（相対量は、アクチンに対して正規化し、各レーンに対してアノテーションが付けられている）。（図７Ｂ）同様に、Ｕｂｅ３ａ抗体を用いる免疫組織化学染色は、Ｕｂｅ３ａ発現をなんら示さなかった（代表的な画像、スケールバー：５００μｍ）。（図７Ｃ）Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐ－マウスに、出生時（０日目）に標的化又は非標的化（ＮＴ）ｓｇＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードするＡＡＶベクターを注射し、４ヶ月後に大脳皮質を採取した。ＡＭＰ－ｓｅｑを使用して、欠失、挿入又はＩＴＲ統合の頻度を定量化し、編集された群について２２％、対照（ＮＴ）群について０．５％に達した。挿入、欠失及び統合は、各々、有意に増加した（群当たり５匹のマウス、シダックのペアワイズ比較を伴う二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＞０．００１）。
【図8】ＡＡＶベクターゲノムを示し、インビトロでＵｂｅ３ａの下流のＵｂｅ３ａ－ＡＴＳコード領域を標的化する際の効率についてのｓｇＲＮＡのスクリーニングからの結果を示す。
【図9】ヒトＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの領域（上から下に配列番号１～３２）におけるｓｇＲＮＡ配列及びその標的位置のリストを提供する。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書に記載の方法及び組成物は、母系Ｕｂｅ３ａ対立遺伝子中の欠失又は変異、及びニューロン中のＵＢＥ３Ａ発現の欠如から生じる状態であるアンジェルマン症候群（ＡＳ）の治療に有用である。
【0013】
ＡＳ患者におけるＵＢＥ３Ａ発現の消失は、母系遺伝ＵＢＥ３Ａ対立遺伝子における変異、欠損と、父系遺伝ＵＢＥ３Ａ対立遺伝子のサイレンシングとの組み合わせの結果であり、ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ発現が完全に消失する。ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ発現を復元するための１つのアプローチは、完全に機能しているが、発現しない父系ＵＢＥ３Ａ遺伝子を脱サイレンシングすることである。
【0014】
父系ＵＢＥ３Ａサイレンシングは、転写開始部位を過ぎたＵＢＥ３Ａ ｍＲＮＡの伸長を抑制すると考えられるアンチセンス転写産物（ＡＴＳ）の発現によって達成される。本明細書で示されるように、ＵＢＥ３Ａコード領域へのＡＴＳの伸長と干渉することにより、ＵＢＥ３Ａ ｍＲＮＡの全長伸長及びタンパク質発現を可能にする。ＡＳモデルマウスに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集系を提供するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与し、インビボでマウスニューロンの最大２１％においてＡＴＳ配列のインデル形成を達成した。インデル形成により、父系Ｕｂｅ３ａ対立遺伝子の脱サイレンシング、及びその後のタンパク質発現が生じた。母系対立遺伝子からのＵｂｅ３ａの発現は影響を受けなかった。更に、マウスにおけるＵｂｅ３ａ－ＡＴＳ遺伝子編集は、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳによって調節される他の遺伝子（Ｓｎｒｐｎ、Ｓｎｏｒｄ１１５、Ｓｎｏｒｄ１１６を含む）を脱サイレンシングすることなく、全長Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ転写産物の存在量を選択的に減少させた。治療後、ＡＳマウスにおけるＵＢＥ３Ａタンパク質発現は、少なくとも３ヶ月間持続した。治療されたＡＳモデルマウスは、神経行動学的試験のバッテリーにおける性能も改善した。この知見は、限られた数のニューロンにおける遺伝子編集によるＵｂｅ３ａの再活性化が、ＡＳマウスモデルにおける疾患症状を改善するのに十分であることを示す。ＡＳに対する現在の治療は、疾患の発作及び行動的態様のための薬学的治療を含め、対症療法である。定期的な再投与を必要とする他のアプローチと比較して、ＡＳの治療のための遺伝子編集アプローチは、長く続く療法である可能性を有する。
【0015】
一実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、ＡＳの治療のための遺伝子編集系の送達のための発現カセット、ベクター、及び組換えウイルスを伴う。
【0016】
本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、及び「状態」は、対象における異常な状態を示すために互換的に使用される。一実施形態では、疾患は、アンジェルマン症候群（ＡＳ）である。
【0017】
「患者」又は「対象」は、本明細書で互換的に使用される場合、ヒト、獣医学用動物又は農業用動物、家庭用動物又は愛玩動物、並びに通常臨床研究に使用される動物を含む、雄又は雌の哺乳動物を意味する。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、ヒト患者である。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、男性又は女性のヒトである。
【0018】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、及びその変形語は、他の構成要素、要素、整数、ステップ等を含む。逆に、「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語及びその変形は、他の構成要素、要素、整数、ステップなどを除外する。
【0019】
「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「ニューロン（ａ ｎｅｕｒｏｎ）」は、１つ以上のニューロンを表すと理解されることを留意されたい。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【0020】
本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照からプラス又はマイナス１０％の可変性を意味する。
【0021】
本明細書で使用される場合、「ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ」は、ＵＢＥ３Ａアンチセンス転写産物を指す。ヒトでは、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳは、核小体低分子ＲＮＡ宿主遺伝子１４（ＳＮＨＧ１４）、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１０４４７２７１５、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿１４６１７７．１）としても知られる（例えば、Ｒｕｎｔｅ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００１； １０：２６８７－２７００（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【0022】
理論に束縛されることを意図するものではないが、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳは、ニューロン細胞における父系染色体上のＵＢＥ３Ａ遺伝子内に伸長し、ＵＢＥ３Ａの転写と干渉する。非ニューロン細胞では、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの転写は、ＵＢＥ３Ａに伸長せず、ＵＢＥ３Ａは、依然として二対立遺伝子として発現していた（図１を参照されたい）。マウス及びヒトＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳは、異なる染色体上に位置している（それぞれ７及び１５）。しかしながら、転写産物は、マウスとヒトとの間で高度に保存される領域（プラダー・ウィリ症候群（ＰＷＳ）／アンジェルマン症候群（ＡＳ）領域として知られている）に位置している。本明細書に記載される場合、特定の実施形態では、遺伝子編集のための標的配列は、ＵＢＥ３Ａ ３’ＵＴＲの下流の領域中のヒトＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの中にある。特定の実施形態では、ヒトＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳにおける標的配列は、ｃｈｒ１５：２５，２７８，４０９～２５，３３３，７２８（ｈｇ３８ゲノムアセンブリ）に位置する。更に別の実施形態では、ＵＢＥ３Ａの３’ＵＴＲとＳＮＯＲＤ１０９Ｂ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿００１２８９．１）との間の領域のヒトＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ中の標的配列。一態様では、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳによって調節される他の遺伝子の発現を変化させることなく、父系対立遺伝子のＵＢＥ３Ａ発現を増強する方法でＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳを編集するための組成物及び方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、ヒトＵｂｅ３ａ－ＡＴＳの編集は、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの発現を変更しない。
【0023】
本明細書に記載の核酸配列を、日常的な分子生物学技術を使用してクローニングすることができ、又はＤＮＡ合成によってデノボで生成することができ、これは、ＤＮＡ合成及び／又は分子クローニングの分野での事業を有するサービス企業（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）による日常的な手順を使用して行うことができる。本明細書に記載のＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ編集系の態様をコードする核酸配列は、組み立てられ、例えば、非ウイルス送達系（例えば、ＲＮＡベースの系、裸のＤＮＡ等）を生成するために、又はパッケージング宿主細胞中でウイルスベクターを生成するために、及び／又は対象において宿主細胞に送達するために、任意の適切な遺伝要素、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム等に配置され、それらの上に保有される配列を宿主細胞に送達する。一実施形態では、遺伝要素は、ベクターである。一実施形態では、遺伝要素は、プラスミドである。かかる操作された構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
【0024】
発現カセット
本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、遺伝子編集系の１つ以上の要素、例えば、エンドヌクレアーゼ及び標的化配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系発現カセットのｃｒＲＮＡ配列）をコードする核酸分子を指す。発現カセットは、プロモーターも含有し、宿主細胞における遺伝子編集系の発現を制御する追加の調節要素を含有し得る。一実施形態では、発現カセットは、ウイルスベクターのカプシド（例えば、ウイルス粒子）にパッケージングされ得る。一実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターを生成するためのこのような発現カセットは、本明細書に記載されるようなウイルスゲノムのパッケージングシグナル及び他の発現制御配列に隣接する。例えば、ＡＡＶウイルスベクターの場合、パッケージングシグナルは、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＡＡＶ ＩＴＲである。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、遺伝子編集系の１つ以上の要素、例えば、エンドヌクレアーゼ及び標的化配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系発現カセットのｃｒＲＮＡ配列）をコードする核酸分子を指す。発現カセットは、プロモーターも含有し、宿主細胞における遺伝子編集系の発現を制御する追加の調節要素を含有し得る。一実施形態では、発現カセットは、ウイルスベクターのカプシド（例えば、ウイルス粒子）にパッケージングされ得る。一実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターを生成するためのこのような発現カセットは、本明細書に記載されるようなウイルスゲノムのパッケージングシグナル及び他の発現制御配列に隣接する。例えば、ＡＡＶウイルスベクターの場合、パッケージングシグナルは、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＡＡＶ ＩＴＲである。
【0025】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」又は「操作可能に会合された」という用語は、目的の遺伝子に連続している発現制御配列又は調節要素、及びトランスで、又は離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を指す。
【0026】
本明細書に記載される場合、調節要素は、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、転写因子、転写終結因子、スプライシング及びポリアデニル化シグナル（ポリＡ）等の効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節因子（ＷＰＲＥ）、翻訳効率を向上させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）を含む。
【0027】
一実施形態では、発現カセットは、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳを標的化するための、遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする配列の発現を指示する調節要素を含む。一実施形態では、調節要素は、１つ以上のプロモーターを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＭＶプロモーターを含む。特定の実施形態では、プロモーターは、ニューロン特異的プロモーターである。特定の実施形態では、好適なプロモーターとしては、伸長因子１アルファ（ＥＦ１アルファ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ ＤＷ ｅｔ ａｌ，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ．１９９０ Ｊｕｌ １６；９１（２）：２１７－２３を参照されたい）、シナプシン１プロモーター（例えば、Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈｌｙ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ａｒｅａ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｆｅｂ；１０（４）：３３７－４７を参照されたい）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ
ＬＮＣａＰ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００４ Ｆｅｂ；１４５（２）：６１３－９．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｏｃｔ １６を参照されたい）、又はＣＢ６プロモーター（例えば、Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ－９ Ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ
Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊａｎ；５８（１）：３０－６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３３－０１５－９８９
９－５を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適なプロモーターとしては、（Ｃ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素、（Ａ）プロモーター、ニワトリベータアクチン遺伝子の第１のエクソン及び第１のイントロン、並びに（Ｇ）ウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む、ＣＡＧプロモーターが挙げられる。例えば、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，Ａｎｎｉｋａ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ９．１（２００８）：２を参照されたい。望ましさは低いが、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、調節可能なプロモーター等の他のプロモーター（例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい）、又は生理学的キューに応答するプロモーターを使用してもよく、本明細書に記載のベクターに利用してもよい。特定の実施形態では、発現カセットは、Ｕ６プロモーターを含む。別の実施形態では、調節要素は、エンハンサーを含む。更なる実施形態では、エンハンサーは、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４エンハンサー、ＡｐｏＥエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、又はＲＳＶエンハンサーのうちの１つ以上から選択される。なお別の実施形態では、調節要素は、イントロンを含む。更なる実施形態では、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトベータグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、アルファ－グロブリン、ベータ－グロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、又はｐ５３から選択される。一実施形態では、調節要素は、ポリＡを含む。更なる実施形態では、ポリＡは、合成ポリＡ、又はウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、若しくは修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）からのものである。別の実施形態では、調節要素は、ＷＰＲＥ配列を含み得る。更に別の実施形態では、調節要素は、コザック配列を含む。
ＬＮＣａＰ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００４ Ｆｅｂ；１４５（２）：６１３－９．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｏｃｔ １６を参照されたい）、又はＣＢ６プロモーター（例えば、Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ－９ Ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ
Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊａｎ；５８（１）：３０－６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３３－０１５－９８９
９－５を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適なプロモーターとしては、（Ｃ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素、（Ａ）プロモーター、ニワトリベータアクチン遺伝子の第１のエクソン及び第１のイントロン、並びに（Ｇ）ウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む、ＣＡＧプロモーターが挙げられる。例えば、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，Ａｎｎｉｋａ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ９．１（２００８）：２を参照されたい。望ましさは低いが、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、調節可能なプロモーター等の他のプロモーター（例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい）、又は生理学的キューに応答するプロモーターを使用してもよく、本明細書に記載のベクターに利用してもよい。特定の実施形態では、発現カセットは、Ｕ６プロモーターを含む。別の実施形態では、調節要素は、エンハンサーを含む。更なる実施形態では、エンハンサーは、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４エンハンサー、ＡｐｏＥエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、又はＲＳＶエンハンサーのうちの１つ以上から選択される。なお別の実施形態では、調節要素は、イントロンを含む。更なる実施形態では、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトベータグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、アルファ－グロブリン、ベータ－グロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、又はｐ５３から選択される。一実施形態では、調節要素は、ポリＡを含む。更なる実施形態では、ポリＡは、合成ポリＡ、又はウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、若しくは修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）からのものである。別の実施形態では、調節要素は、ＷＰＲＥ配列を含み得る。更に別の実施形態では、調節要素は、コザック配列を含む。
【0028】
特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたＵ６プロモーターを含む発現カセットが提供される。特定の実施形態では、発現カセットは、少なくとも、ｓｇＲＮＡコード配列に作動可能に連結されたＵ６プロモーターと、Ｃａｓ９コード配列に作動可能に連結されたニューロン特異的プロモーター（例えば、ヒトシナプシンプロモーター）と、を含む。例示的なベクターゲノムを図９に示す。
【0029】
「発現」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、ＲＮＡの産生、タンパク質の産生、又はＲＮＡ及びタンパク質の両方の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」又は「翻訳」という用語は、特に、ペプチド又はタンパク質の産生に関する。発現は、一過性のものであってもよく、又は安定したものであってもよい。
【0030】
発現カセットは、任意の好適な送達システムを介して送達することができる。好適な非ウイルス送達系は、当該技術分野において既知であり（例えば、Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊａｎ；９（１）：ＧＥ０１－ＧＥ０６、参照により本明細書に組み込まれる）、当業者によって容易に選択され得、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、デンドリマー、ＰＬＧＡ、ポリメタクリレート、無機粒子、脂質粒子（脂質ナノ粒子若しくはＬＮＰ）又はキトサンベースの製剤を含み得る。
【0031】
一実施形態では、ベクターは、非ウイルスプラスミドであり、その記載される発現カセット（例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）を含み、様々な組成物及びナノ粒子（例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物、及び他のポリマー、脂質及び／又はコレステロール系－核酸コンジュゲート、並びに本明細書に記載されるような他の構築物を含む）と結合される。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７；ウェブ公開：２０１１年３月２１日、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照された
く、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
く、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【0032】
遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列を含む組成物、及びＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳを編集するためのその使用方法が本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、「遺伝子編集系」は、典型的には特定の遺伝子又は核酸配列（例えば、標的配列又はモチーフを含む）に対して特異性を有する、遺伝物質を修飾するための技術又は分子機構を指す。かかる遺伝子編集系は、ゲノム中の標的部位を修飾するか、又は変異を導入するように設計される。本明細書で使用される場合、「変異」又は「修飾」は、別途記載されない限り、小さなヌクレオチド挿入若しくは欠失（インデル）、又はより大きな欠失、挿入、又は反転を含むがこれらに限定されないゲノム配列の任意の変化を指すことができる。特定の実施形態では、変異又は修飾の導入は、「編集」又は「遺伝子編集」と称される。
【0033】
「標的部位」及び「標的配列」等の用語は、別途指定されない限り、遺伝子編集系の１つ以上の要素によって認識される配列を指すために本明細書で使用される。例えば、ｓｇＲＮＡは、ゲノム中の標的部位又は標的配列に結合する（すなわち、それに対して相補的である）配列を含む。
【0034】
特定の実施形態では、遺伝子編集系は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳを修飾するためのクラスター化された規則的な間隔の短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）系である。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓデュアルベクター系が本明細書で提供される（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１７６１９１を参照されたい）。代替的に、特定の実施形態では、好適な遺伝子編集系としては、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が挙げられ、これは、外因性ＤＮＡドナー基質の送達を組み合わせてもよく、又は組み合わせなくてもよい（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＥｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（ｅｐｕｂ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１２）２０：３５－４２を参照されたい）。他の実施形態では、好適な遺伝子編集系としては、メガヌクレアーゼ（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４４５，２５１号、ＵＳ９，３４０，７７７、ＵＳ９，４３４，９３１、ＵＳ９，６８３，２５７、及びＷＯ２０１８／１９５４４９を参照されたい）、又は転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。
【0035】
特定の実施形態では、好適なＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系は、少なくとも、Ｃａｓ９酵素、及びＵｂｅ３ａ－ＡＴＳコード配列中の標的部位に特異的なｓｇＲＮＡを含む。したがって、一実施形態では、遺伝子編集ベクターは、編集酵素としてのＣａｓ９酵素と、少なくとも２０ヌクレオチド長であり、かつＣａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に対して５’のＵｂｅ３ａ－ＡＴＳ中の選択された部位に特異的に結合するｓｇＲＮＡと、を含む。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、ｓｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列と、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸配列と、を含む（例えば、図８を参照されたい）。特定の実施形態では、遺伝子編集系は、ドナー又は修復鋳型も含む。ドナー鋳型を提供する発現カセットは、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードする発現カセットと同じであってもよく、又は異なる発現カセットであってもよい。したがって、特定の実施形態では、遺伝子編集系が、その発現を指示する調節配列の制御下でＣａｓ９遺伝子を含む発現カセットと、ｓｇＲＮＡ及びドナー鋳型を含む第２の発現カセットと、を含む、デュアルベクター系（例えば、ＷＯ２０１６／１７６１９１に記載されるような）が提供される。
【0036】
「Ｃａｓ９」（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）は、２つのシグネチャーヌクレアーゼドメインＲｕｖＣ（非コード鎖を切断する）及びＨＮＨ（コード鎖）によって特徴付けられるＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼのファミリーを指す。Ｃａｓ９の好適な細菌
源としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）、Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＫＭ Ｅｓｔｅｌｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈ，１０：１１１６－２１（２０１３））が挙げられる。野生型コード配列は、本明細書に記載の構築物に利用され得る。代替的に、細菌コドンは、例えば、様々な既知のヒトコドン最適化アルゴリズムのいずれかを使用して、ヒトにおける発現のために最適化される。同様の特性を有する他のエンドヌクレアーゼは、任意選択的に置換されてもよい。例えば、ｃｒｉｓｐｒ．ｕ－ｐｓｕｄ．ｆｒ／ｃｒｉｓｐｒでアクセス可能な公的なＣＲＩＳＰＲデータベース（ｄｂ）を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子標的化は、標的化配列（ｃｒＲＮＡ配列）及びＣａｓ９ヌクレアーゼ動員配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含有する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が必要である。ｃｒＲＮＡ領域は、標的部位に相同であり、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を指示する２０ヌクレオチド配列である。オフターゲット効果も排除しつつ、ゲノム中の好適な標的部位を特定するための戦略は、当業者に既知である（例えば、ＣｈｏｐＣｈｏｐ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｏｎｌｉｎｅ ａｔ ｃｈｏｐｃｈｏｐ．ｃｂｕ．ｕｉｂ．ｎｏ／を参照されたい）。本明細書に記載のヒトＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳを標的化するためのＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系で使用するのに好適なｓｇＲＮＡの設計のための配列が、以下の表に提供される。特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号１～３２のいずれかを含むｓｇＲＮＡをコードする配列を含む。
源としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）、Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＫＭ Ｅｓｔｅｌｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈ，１０：１１１６－２１（２０１３））が挙げられる。野生型コード配列は、本明細書に記載の構築物に利用され得る。代替的に、細菌コドンは、例えば、様々な既知のヒトコドン最適化アルゴリズムのいずれかを使用して、ヒトにおける発現のために最適化される。同様の特性を有する他のエンドヌクレアーゼは、任意選択的に置換されてもよい。例えば、ｃｒｉｓｐｒ．ｕ－ｐｓｕｄ．ｆｒ／ｃｒｉｓｐｒでアクセス可能な公的なＣＲＩＳＰＲデータベース（ｄｂ）を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子標的化は、標的化配列（ｃｒＲＮＡ配列）及びＣａｓ９ヌクレアーゼ動員配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含有する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が必要である。ｃｒＲＮＡ領域は、標的部位に相同であり、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を指示する２０ヌクレオチド配列である。オフターゲット効果も排除しつつ、ゲノム中の好適な標的部位を特定するための戦略は、当業者に既知である（例えば、ＣｈｏｐＣｈｏｐ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｏｎｌｉｎｅ ａｔ ｃｈｏｐｃｈｏｐ．ｃｂｕ．ｕｉｂ．ｎｏ／を参照されたい）。本明細書に記載のヒトＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳを標的化するためのＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系で使用するのに好適なｓｇＲＮＡの設計のための配列が、以下の表に提供される。特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号１～３２のいずれかを含むｓｇＲＮＡをコードする配列を含む。
【表1】
【0037】
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系は、Ｃｐｆｌ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａからのＣＲＩＳＰＲ）であり得る。Ｃｐｆｌの好ましいＰＡＭは、５’－ＴＴＮであり、これは、両方のゲノム位置及びＧＣ含有量においてＳｐＣａｓ９（５’－ＮＧＧ）及びＳａＣａｓ９（５’－ＮＮＧＲＲＴ、Ｎ＝任意のヌクレオチド、Ｒ＝アデニン又はグアニン）のものと対照的である。少なくとも１６種のＣｐｆｌ
ヌクレアーゼが特定されているが、２種のヒト化ヌクレアーゼ（ＡｓＣｐｆｌ及びＬｂＣｐｆｌ）が特に有用である。参照により本明細書に組み込まれる、ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．Ｏｒｇ／６９９８２／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／＃ｄｅｐｏｓｉｔｏｒ－ｆｕｌｌ（ＡｓＣｐｆｌ配列、及びｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．Ｏｒｇ／６９９８８／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／＃ｄｅｐｏｓｉｔｏｒ－ｆｕｌｌ（ＬｂＣｐｆｌ配列）を参照されたい。更に、Ｃｐｆｌは、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、Ｃａｓ９と比較して、より短いガイドＲＮＡ（約４２ヌクレオチド）の使用を可能にする。プラスミドは、公共のプラスミドデータベースであるＡｄｄｇｅｎｅから得られてもよい。
ヌクレアーゼが特定されているが、２種のヒト化ヌクレアーゼ（ＡｓＣｐｆｌ及びＬｂＣｐｆｌ）が特に有用である。参照により本明細書に組み込まれる、ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．Ｏｒｇ／６９９８２／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／＃ｄｅｐｏｓｉｔｏｒ－ｆｕｌｌ（ＡｓＣｐｆｌ配列、及びｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．Ｏｒｇ／６９９８８／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／＃ｄｅｐｏｓｉｔｏｒ－ｆｕｌｌ（ＬｂＣｐｆｌ配列）を参照されたい。更に、Ｃｐｆｌは、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、Ｃａｓ９と比較して、より短いガイドＲＮＡ（約４２ヌクレオチド）の使用を可能にする。プラスミドは、公共のプラスミドデータベースであるＡｄｄｇｅｎｅから得られてもよい。
【0038】
本明細書に記載される通り、遺伝子編集系を利用して、標的細胞において、父系Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ対立遺伝子中に変異を導入する。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（すなわち、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ配列）は、二本鎖切断が生じるように切断される。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖切断が生じるように切断される。特定の実施形態では、変化は、非相同末端結合の結果として、接合部位にランダムな挿入／欠失変異を生じさせ得る、挿入又は欠失（インデル）である。遺伝子のコード領域内で生じるインデル変異は、フレームシフト及び早期終止コドンを生じさせ、転写を破壊し得る。代替的に、プラスミド又は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の形態の修復鋳型を供給して、高忠実度及び正確な編集を可能にする相同組換え修復（ＨＤＲ）経路を活用することができる。
【0039】
特定の実施形態では、ウイルスベクターを使用して、遺伝子編集系の１つ以上の要素を送達する。以下の例は、ＡＡＶベクターの使用を説明し、以下の考察は、ＡＡＶベクターに焦点を当てているが、遺伝子編集ベクター及び／又はベクターを保有する鋳型の代わりに、異なる部分的又は完全に統合されたベクター又はウイルスが系で使用され得ることが理解されるだろう。例えば、Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．；Ｃｈｉｌｙｎｋｓｉ，Ｋ．；Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．，；Ｈａｕｅｒ，Ｍ．，；Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．，；Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．，（Ａｕｇｕｓｔ １７，２０１２）“Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７（６０６９）：８１６－８２１．Ｂｉｂｃｏｄｅ：２０１２ Ｓｃｉ．．３３７．．８１６Ｊ．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２５８２９．ＰＭＩＤ ２２７４５２４９、米国特許第８，６９７，３５９号、ＵＳ ９，９０９，１２２、ＵＳ ２０１７／００５１３１２、ＵＳ ２０１７／０１３７８０１、ＵＳ ２０１７／０１６６８９３、ＵＳ２０１７／０３６００４８、ＵＳ ２０１８／０００２６８２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0040】
特定の実施形態では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のゲノム編集系の１つ以上の構成要素（例えば、ガイドＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼ）を送達する。別の実施形態では、対象に同時投与されたときにＣＲＩＳＰＲ系の構成要素を送達するために、組み合わせ又は二重ＡＡＶベクター系が提供される（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１７６１９１を参照されたい）。ベクターは、一緒に、又は別個に製剤化されてもよく、本質的に同時に、好ましくは同じ経路によって送達されてもよい。
【0041】
特定の実施形態では、１つ以上の変異は、本明細書に記載の遺伝子編集系を使用して標的配列（例えば、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ）に導入され得る。特定の実施形態では、ドナー又は修復鋳型を送達するためのものであり、標的配列に導入されたときに、例えば早期終止を含む、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの転写の破壊が存在するように設計された配列である、ベクターが提供される。
【0042】
様々な従来のベクター要素は、標的細胞における遺伝子編集活性を増強するために使用され得る。例えば、ＡＳを治療するための治療用に設計された系は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ヒトシナプシン１）の制御下で発現されるように設計され得る。
【0043】
任意選択的に、発現カセットは、非翻訳領域にｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子発現が望ましくない、及び／又は導入遺伝子発現のレベルの減少が望ましい細胞に存在するｍｉＲＮＡによって特異的に認識されるように設計される。特定の実施形態では、発現カセットは、後根神経節（ＤＲＧ）におけるヌクレアーゼの発現を特異的に減少させるｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、並びに／又は３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲの両方に位置する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、発現カセットにおいて、調節配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、発現カセットは、ＤＲＧ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも２つのタンデム反復を含み、少なくとも２つのタンデム反復は、少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列と、同じ又は異なり得る少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。特定の実施形態では、タンデムｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であるか、又は１～１０個の核酸のスペーサーによって分離されており、このスペーサーは、ｍｉＲＮＡ標的配列ではない。
【0044】
特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、
（配列番号３３）を含むｍｉＲ－１８３標的配列を含有する（ｍｉＲ－１８３シード配列に相補的な配列には、下線が引かれている）。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３シード配列に１００％相補的である配列を、１コピーより多く（例えば、２又は３コピー）含有する。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８３シード配列に少なくとも１００％相補性である領域を、少なくとも１つ含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号３３に部分的な相補性を有する配列を含有し、したがって、配列番号３３にアラインメントさせた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号３３とアラインメントさせた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、１００％相補性の領域を含み、また、ｍｉＲ－１８３標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８３シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８３と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、切断された配列番号３３を含むｍｉＲ－１８３標的配列（すなわち、配列番号３３の５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８３標的配列とを含む。なお他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、又は４つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。
【0045】
特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番
号３４）を含むｍｉＲ－１８２標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２シード配列に１００％相補的である配列を、１コピーより多く（例えば、２又は３コピー）含有する。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８２シード配列に少なくとも１００％相補性である領域を、少なくとも１つ含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、配列番号３４に部分的な相補性を有する配列を含有し、したがって、配列番号３４にアラインメントさせた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号３４とアラインメントさせた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、１００％相補性の領域を含み、また、ｍｉＲ－１８２標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８２シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８２と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、切断された配列番号３４を含むｍｉＲ－１８２標的配列（すなわち、配列番号３４の５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８２標的配列とを含む。なお他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、又は４つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。
号３４）を含むｍｉＲ－１８２標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２シード配列に１００％相補的である配列を、１コピーより多く（例えば、２又は３コピー）含有する。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８２シード配列に少なくとも１００％相補性である領域を、少なくとも１つ含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、配列番号３４に部分的な相補性を有する配列を含有し、したがって、配列番号３４にアラインメントさせた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号３４とアラインメントさせた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、１００％相補性の領域を含み、また、ｍｉＲ－１８２標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８２シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８２と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、切断された配列番号３４を含むｍｉＲ－１８２標的配列（すなわち、配列番号３４の５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８２標的配列とを含む。なお他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、又は４つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。
【0046】
「タンデム反復」という用語は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の存在を指すように本明細書で使用される。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であってもよい。すなわち、ある配列の３’末端が、介在配列なしで、次の配列の５’末端の直ぐ上流にあるように、又はその逆でもよく、次々と直に位置している。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、短いスペーサー配列によって分離されている。
【0047】
本明細書で使用される場合、「スペーサー」としては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長の任意の選択された核酸配列であり、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置する。特定の実施形態では、スペーサーは、１～８ヌクレオチド長、２～７ヌクレオチド長、３～６ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、４～９ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、又はより長い値である。好適には、スペーサーは、非コード配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、４つの（４）ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＡＴである。特定の実施形態では、スペーサーは、６つの（６）ヌクレオチドである。特定の実施形態では、スペーサーは、ＣＡＣＧＴＧ又はＧＣＡＴＧＣである。
【0048】
特定の実施形態では、タンデム反復は、２つ、３つ、４つ以上の同じｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。特定の実施形態では、タンデム反復は、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、又は少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列等を含有する。特定の実施形態では、タンデム反復は、２つ又は３つの同じｍｉＲＮＡ標的配列、及び異なる第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。
【0049】
特定の実施形態では、発現カセットには、少なくとも２つの異なるセットのタンデム反復が存在し得る。例えば、３’ＵＴＲは、導入遺伝子のすぐ下流のタンデム反復と、ＵＴＲ配列と、ＵＴＲの３’末端に近接する２つ以上のタンデム反復と、を含有し得る。別の例では、５’ＵＴＲは、１つ、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。別の例では、３’は、タンデム反復を含有してもよく、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有してもよい。
【0050】
特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンの約０～２０ヌクレオチド以内で開始する、２つ、３つ、４つ以上のタンデム反復を含有する。他の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンから少なくとも１００～約４０００ヌクレオチドでｍｉＲＮＡタンデム反復を含有する。
【0051】
２０１８年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７８３，９５６号（参照により本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する、２０１９年１２月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0052】
本明細書に記載の発現カセットにおける組成物が、本明細書にわたって記載される組成物及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。
【0053】
ベクター
特定の実施形態では、遺伝子編集系の１つ以上の要素は、ベクター又はウイルスベクターによってニューロンに送達される核酸配列によってコードされ、その多くは、当該技術分野で既知であり、利用可能である。一実施形態では、本明細書に記載されるＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ標的化遺伝子編集系を含むベクターが提供される。一実施形態では、本明細書に記載の発現カセットを含むベクターが提供される。一実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。更なる実施形態では、非ウイルスベクターは、プラスミドである。別の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターとしては、ボカウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、又はパルボウイルスを含むが、これらに限定されない、遺伝子療法に好適な任意のウイルスが挙げられる。しかしながら、理解を容易にするために、アデノ随伴ウイルスが、例示的なウイルスベクターとして本明細書で言及される。したがって、一実施形態では、核酸配列と、そのための調節要素に作動可能に連結された遺伝子編集系の１つ以上の要素と、を含む、アデノ随伴ウイルスベクターが提供される。
特定の実施形態では、遺伝子編集系の１つ以上の要素は、ベクター又はウイルスベクターによってニューロンに送達される核酸配列によってコードされ、その多くは、当該技術分野で既知であり、利用可能である。一実施形態では、本明細書に記載されるＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ標的化遺伝子編集系を含むベクターが提供される。一実施形態では、本明細書に記載の発現カセットを含むベクターが提供される。一実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。更なる実施形態では、非ウイルスベクターは、プラスミドである。別の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターとしては、ボカウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、又はパルボウイルスを含むが、これらに限定されない、遺伝子療法に好適な任意のウイルスが挙げられる。しかしながら、理解を容易にするために、アデノ随伴ウイルスが、例示的なウイルスベクターとして本明細書で言及される。したがって、一実施形態では、核酸配列と、そのための調節要素に作動可能に連結された遺伝子編集系の１つ以上の要素と、を含む、アデノ随伴ウイルスベクターが提供される。
【0054】
本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列の複製又は発現のために適切な標的細胞に導入することができる核酸配列を含む、生物学的部分又は化学的部分である。ベクターの例としては、組換えウイルス、プラスミド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）コンジュゲート、磁性粒子、又はナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、機能的な遺伝子産物をコードする外因性又は異種の操作された核酸を有する核酸分子であり、そのため、適切な標的細胞に導入することができる。かかるベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点、及び組換えＤＮＡを挿入することができる１つ以上の部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞を、有さない細胞から選択することができる手段を有しており、例えば、それらは薬剤耐性遺伝子をコードしている。一般的なベクターには、プラスミド、ウイルスゲノム、及び「人工染色体」が含まれる。ベクターの生成、産生、特性評価、又は定量化の従来の方法は、当業者にとって利用可能である。
【0055】
本明細書で使用される場合、組換えウイルスベクターは、所望の細胞を標的化する任意の好適なウイルスベクターである。したがって、本明細書に記載の組換えウイルスベクターは、好ましくは、中枢神経系（例えば、脳）の細胞を含む、アンジェルマン症候群に罹患した細胞及び組織のうちの１つ以上を標的化する。実施例は、例示的な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。しかしながら、他の好適なウイルスベクターとしては、例えば、組換えアデノウイルス、組換えボカウイルス等の組換えパルボウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス、組換え単純ヘルペスウイルス、組換えレトロウイルス、又は組換えレンチウイルスが挙げられ得る。好ましい実施形態では、これらの組換えウイルスは、複製欠陥である。
【0056】
「複製欠損」ウイルス又はウイルスベクターは、合成又は人工ウイルス粒子であって、目的の遺伝子を含有する発現カセットが、ウイルスカプシド又はエンベロープ中にパッケージングされ、ウイルスカプシド又はエンベロープ内にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列が、複製欠損でもある、すなわち、それらが、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができるものを指す。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接して目的の遺伝子のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であり得る）が、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、後代ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。そのような複製欠損ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス（組み込み若しくは非組み込み）、又は別の適切なウイルス源であってもよい。
【0057】
「プラスミド」又は「プラスミドベクター」は、一般に、本明細書では、ベクター名の前及び／又は後に小文字のｐで示される。本発明に従って使用することができるプラスミド、他のクローニング及び発現ベクター、それらの特性、並びにそれらの構築／操作方法は、当業者には容易に明らかである。一実施形態では、本明細書に記載される遺伝子編集系の要素は、ウイルスベクターを生成するため、及び／又は宿主細胞、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム等への送達のために有用であり、その上に保有される配列を転写する好適な遺伝要素（ベクター）内で操作される。選択されるベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。
【0058】
本明細書で互換的に使用される「導入遺伝子」又は「目的の遺伝子」という用語は、本明細書に記載の発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、組換えプラスミド、又は産生プラスミド、ベクター、又は宿主細胞におけるプロモーター及び／又は他の調節要素の制御下にある、外因性及び／又は操作されたタンパク質をコードする核酸配列を意味する。
【0059】
核酸配列又はタンパク質を説明するために使用される場合、「異種」という用語は、核酸又はタンパク質が、それが発現される宿主細胞若しくは対象とは異なる生物又は同じ生物の異なる種に由来したことを意味する。「異種」という用語は、プラスミド、発現カセット、若しくはベクターにおけるタンパク質又は核酸と関連して使用される場合、タンパク質又は核酸が、問題となるタンパク質又は核酸が天然には互いに同じ関係で認められない別の配列若しくはサブ配列で存在することを示す。
【0060】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生プラスミドから産生されるパッケージング細胞株を指し得る。代替的に、「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載の遺伝子編集系の発現が望まれる任意の標的細胞を指し得る。したがって、「宿主細胞」は、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合によって細胞に導入された外因性又は異種ＤＮＡを含有する原核細胞又は真核細胞を指す。本明細書の特定の実施形態では、「宿主細胞」
という用語は、本明細書に記載される組成物のインビトロ評価のための様々な哺乳動物種の細胞の培養物を指す。本明細書の他の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、ウイルスベクター又は組換えウイルスを生成及びパッケージングするために使用される細胞を指す。更に他の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、ＡＳについてインビボで治療される対象の標的細胞を指すことが意図される。更なる実施形態では、「宿主細胞」という用語は、ニューロン、例えば、ＣＮＳのニューロンである。
という用語は、本明細書に記載される組成物のインビトロ評価のための様々な哺乳動物種の細胞の培養物を指す。本明細書の他の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、ウイルスベクター又は組換えウイルスを生成及びパッケージングするために使用される細胞を指す。更に他の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、ＡＳについてインビボで治療される対象の標的細胞を指すことが意図される。更なる実施形態では、「宿主細胞」という用語は、ニューロン、例えば、ＣＮＳのニューロンである。
【0061】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、異種核酸配列又はタンパク質の発現が所望される任意の標的細胞を指す。特定の実施形態では、標的細胞は、ＣＮＳのニューロン、特に、変異若しくは欠損母系ＵＢＥ３Ａ対立遺伝子を有するニューロン、又はＵＢＥ３Ａ発現を欠くニューロンである。
【0062】
本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルスベクター内にパッケージングされる核酸配列を指す。一例では、「ベクターゲノム」は、最低限、５’から３’に向けて、ベクター特異的配列と、遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列（例えば、標的配列における発現を指示する調節制御配列に作動可能に連結されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素及びｓｇＲＮＡ）と、を含有し、ベクター特異的配列は、ベクターゲノムをウイルスベクターカプシド又はエンベロープタンパク質に特異的にパッケージングする末端反復配列であり得る。例えば、ＡＡＶ逆位末端反復は、ＡＡＶ及び特定の他のパルボウイルスカプシドにパッケージングするために利用される。レンチウイルスの長い末端反復は、レンチウイルスベクターへのパッキングが所望される場合に利用され得る。同様に、他の末端反復（例えば、レトロウイルス長末端反復）等が選択され得る。
【0063】
本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス、当業者に、かつ／又は本明細書に記載の組成物及び方法の観点において利用可能であるアデノ随伴ウイルス、並びに人工ＡＡＶを指す。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ）耐性粒子であり、その中にパッケージングされる発現カセットは、標的細胞に送達するためのＡＡＶの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ヌクレアーゼ耐性組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶカプシドが完全に構築されていることを示し、これらのパッケージングされたベクターゲノム配列を、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するために設計される、ヌクレアーゼインキュベーション工程の際の分解（消化）から保護する。多くの場合、本明細書に記載のｒＡＡＶは、ＤＮａｓｅ耐性である。
【0064】
ＡＡＶカプシドの供給源は、数十種の天然に発生し、利用可能なアデノ随伴ウイルス、及び操作されたＡＡＶのうちのいずれかの１つであり得る。ＡＡＶカプシドは、６０カプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニットであるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３で構成され、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比で二十面体対称に配置される。上で特定されるＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として、様々なＡＡＶが選択されてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０－Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８－Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１、及びＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、及びＷＯ２００６／１１０６８９、並びにＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ．１０）も参照されたい。また、これらの文書には、他のＡＡＶも記載されており、ＡＡＶを生成するために選択され得る（参照により組み込まれる）。ヒト又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され、又は操作され、十分に特性評価されたＡＡＶのうち、ヒトＡＡＶ２が、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり、それは、異なる標的組織及び動物モデルにおいて、効率的な遺伝子導入実験に広く使用されている。特に明記しない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシ
ド、ＩＴＲ、及び他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８、及びＡＡＶＡｎｃ８０として一般に特定されているＡＡＶを含む任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシド又はそのバリアントである。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名称で「ＡＡＶ」という用語の後の数値又は数値と文字の組み合わせによって指定される。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、各々「Ｎｏｖｅｌ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｃａｐｓｉｄ Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ
Ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」と題される、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１６９００４及びＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８９６１も参照されたい。
ド、ＩＴＲ、及び他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８、及びＡＡＶＡｎｃ８０として一般に特定されているＡＡＶを含む任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシド又はそのバリアントである。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名称で「ＡＡＶ」という用語の後の数値又は数値と文字の組み合わせによって指定される。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、各々「Ｎｏｖｅｌ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｃａｐｓｉｄ Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ
Ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」と題される、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１６９００４及びＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８９６１も参照されたい。
【0065】
本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶの「ストック」は、ｒＡＡＶの集団を指す。脱アミド化に起因するカプシドタンパク質の不均一性にもかかわらず、ストック内のｒＡＡＶは、同一のベクターゲノムを共有することが予想される。ストックは、例えば、選択されたＡＡＶカプシドタンパク質及び選択された産生系に特徴的な不均一な脱アミド化パターンを有するカプシドを有するｒＡＡＶを含み得る。ストックは、単一の産生系から産生されてもよく、又は産生系の複数の実行からプールされてもよい。本明細書に記載されるものを含むが、これらに限定されない様々な産生系が選択され得る。
【0066】
本明細書で使用される場合、ＡＡＶに関して「バリアント」という用語は、アミノ酸配列又は核酸配列にわたって、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を共有する配列を含む、既知のＡＡＶ配列に由来する任意のＡＡＶ配列を意味する。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、任意の記載又は既知のＡＡＶカプシド配列から最大約１０％の変化を含み得るバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶカプシドは、本明細書に提供され、かつ／又は当該技術分野で既知のＡＡＶカプシドに対して、約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性、又は約９７％～約９８％の同一性を共有する。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶカプシドのパーセント同一性を決定する場合、比較は、可変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３）のうちのいずれかにわたって行われ得る。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８
ｖｐ３と少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態では、自己相補性ＡＡＶが使用される。
ｖｐ３と少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態では、自己相補性ＡＡＶが使用される。
【0067】
ＩＴＲ又は他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用して、ＡＡＶから容易に単離又は操作され得る。かかるＡＡＶは、学術的、商業的、又は公的供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離され、操作されるか、又は入手することができる。代替的に、ＡＡＶ配列は、文献又はデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄ等）で利用可能であるような公開された配列を参照することによって、合成又は他の好適な手段を通して操作され得る。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学的な技術によって操作することができ、これらの粒子を、核酸配列の細胞特異的送達のため、免疫原性を最小限に抑えるため、安定性及び粒子寿命を調整するため、効率的な分解のため、核への正確な送達のため等に最適化することを可能にする。
【0068】
本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ」及び「人工ＡＡＶ」という用語は、互換的に使用され、限定されないが、カプシドタンパク質と、その中にパッケージングされるベクターゲノムとを含むＡＡＶを意味し、ベクターゲノムは、ＡＡＶとは異種の核酸を含む。
一実施形態では、カプシドタンパク質は、天然に存在しないカプシドである。かかる人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を使用して、異種配列（異なる選択されたＡＡＶ、同じＡＡＶの非連続部分、非ＡＡＶウイルス源、又は非ウイルス源から得ることができる）と組み合わせて、任意の好適な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶは、限定されないが、疑似型ＡＡＶカプシド、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、又は「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得る。１つのＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質に置き換えられている擬似型ベクターは、本発明に有用である。一実施形態では、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／８は、例示的な擬似型ベクターである。選択される遺伝要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
一実施形態では、カプシドタンパク質は、天然に存在しないカプシドである。かかる人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を使用して、異種配列（異なる選択されたＡＡＶ、同じＡＡＶの非連続部分、非ＡＡＶウイルス源、又は非ウイルス源から得ることができる）と組み合わせて、任意の好適な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶは、限定されないが、疑似型ＡＡＶカプシド、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、又は「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得る。１つのＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質に置き換えられている擬似型ベクターは、本発明に有用である。一実施形態では、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／８は、例示的な擬似型ベクターである。選択される遺伝要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
【0069】
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、天然及び操作されたクレードＦアデノ随伴ウイルスの中から選択される。以下の実施例では、クレードＦアデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶｈｕ６８である。ＷＯ２０１８／１６０５８２を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、別のＡＡＶカプシドは、異なるクレード、例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、若しくはＥから、又はこれらのクレードのいずれかからも外れたＡＡＶ供給源から選択される。例えば、別の好適なカプシドは、ＡＡＶｒｈ９１である。２０２０年１１月５日に出願されたＷＯ２０２０／２２３２３１、２０２０年８月１４日に出願された米国特許出願第６３／０６５，６１６号、及び２０２０年１１月４日に出願された米国特許出願第６３／１０９，７３４号を参照されたい（これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【0070】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、（ａ）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＳ９９２６４（参照により本明細書に組み込まれる）（ＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質）のアミノ酸配列、及び／又は（ｂ）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＹ５３０５７９．１：（ｎｔ １．．２２１１）のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する、ＡＡＶ９を指す。このコード配列からのいくつかの変化は、本発明に包含され、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＳ９９２６４及びＵＳ７９０６１１１（同様に、ＷＯ２００５／０３３３２１）における参照アミノ酸配列に対して約９９％同一性を有する配列を含み得る（すなわち、参照配列からの約１％未満の変化）。かかるＡＡＶは、例えば、天然単離物（例えば、ｈｕ３１若しくはｈｕ３２）、又はアミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有するＡＡＶ９のバリアントを含み得、例えば、限定されないが、ＡＡＶ９カプシドとアラインメントされた任意の他のＡＡＶカプシドにおける対応する位置から「補充された」代替的な残基から選択されるアミノ酸置換を含み、例えば、ＵＳ９，１０２，９４９、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／３４９９１１、ＷＯ２０１６／０４９２３０Ａ１、ＵＳ９，６２３，１２０、及びＵＳ９，５８５，９７１に記載されているもの等が挙げられる。しかし、他の実施形態では、ＡＡＶ９の他のバリアント、又は上記の参照配列に対して少なくとも約９５％同一性を有するＡＡＶ９カプシドが選択され得る。例えば、ＵＳ２０１５／００７９０３８を参照されたい。カプシド、したがってコード配列を生成する方法、及びｒＡＡＶウイルスベクターの産生のための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
【0071】
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、「Ｎｏｖｅｌ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｃｌａｄｅ Ｆ Ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」と題されるＷＯ２０１８／１６０５８２に記載される通りであり、参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパクは、配列番号５５の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号５４から産生されたｖｐ１タンパク質、若しくは配列番号５５の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号５４に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号５５の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号５４の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、若しくは配列番号５５の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号５４の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、及び／又は配列番号５５の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号５４の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、若しくは配列番号５５の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号５４の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質、を含む。
【0072】
ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、典型的には、配列番号５５の全長ｖｐ１アミノ酸配列（アミノ酸１～７３６）をコードする同じ核酸配列によってコードされる選択的スプライシングバリアントとして発現される。任意選択的に、ｖｐ１コード配列は単独で使用されて、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質を発現する。代替的に、この配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）及び／又はｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号５５のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列若しくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ（配列番号５４の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）、又は配列番号５５のａａ２０３～７３６をコードする配列番号５４に対して少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％）同一の配列、のうちの１つ以上と共発現され得る。追加的に、又は代替的に、ｖｐ１コード配列及び／又はｖｐ２コード配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有しない配列番号５５のＡＡＶｈｕ６８
ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列若しくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ（配列番号５４のｎｔ４１２～２２１１）、又は配列番号５５の約ａａ１３８～７３６をコードする配列番号５４のｎｔ４１２～２２１１に対して少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％）同一の配列と、共発現され得る。
ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列若しくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ（配列番号５４のｎｔ４１２～２２１１）、又は配列番号５５の約ａａ１３８～７３６をコードする配列番号５４のｎｔ４１２～２２１１に対して少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％）同一の配列と、共発現され得る。
【0073】
本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、配列番号５５のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸配列、及び任意選択的に、追加の核酸配列（例えば、ｖｐ１及び／又はｖｐ２固有領域を含まないｖｐ３タンパク質をコードする配列）からカプシドを発現する産生系で産生されるｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生から得られたｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、及びｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。より具体的には、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号５５の予測されたアミノ酸残基からの修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有する。これらの
亜集団は、少なくとも脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、アスパラギン－グリシン対中のアスパラギンは、高度に脱アミド化されている。
亜集団は、少なくとも脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、アスパラギン－グリシン対中のアスパラギンは、高度に脱アミド化されている。
【0074】
一実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１核酸配列は、配列番号５４の配列、又はそれに相補的な鎖、例えば、対応するｍＲＮＡを有する。特定の実施形態では、ｖｐ２及び／又はｖｐ３タンパク質は、追加的に、又は代替的に、例えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比率を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）及び／又はｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号５５のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）若しくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ（配列番号５４の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）をコードする核酸配列も提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有しない配列番号５５のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）又はそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ（配列番号５４のｎｔ４１２～２２１１）をコードする核酸配列も提供される。
【0075】
しかしながら、配列番号５５のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号５４の核酸配列、又は配列番号５４に対して少なくとも７０％～９９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号５５をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号５４の核酸配列、又は配列番号５４の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１に対して少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号５５のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号５４の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１の核酸配列、又は配列番号５４の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１に対して少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号５５のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする。
【0076】
ＤＮＡ（ゲノム若しくはｃＤＮＡ）、又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、このＡＡＶｈｕ６８カプシドをコードする核酸配列を設計することは、当該技術分野の範囲内である。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号５５に提供される。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号５４の核酸配列、又は本明細書に記載の修飾（例えば、脱アミド化アミノ酸）を含む配列番号５５のｖｐ１アミノ酸配列をコードする少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列、又は少なくとも９９％の配列、を使用して産生される。特定の実施形態では、ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号５５に再現される。
【0077】
特定の実施形態では、カプシド脱アミド化が減少しているＡＡＶカプシドが選択され得る。例えば、ともに２０１９年２月２７日に出願され、それらの全体が参照により組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８０４及びＰＣＴ／ＵＳ１８／１９８６１を参照されたい。
【0078】
本明細書で使用される、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語又はその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素から
なる集団を指す。配列番号５５は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、予測されたアミノ酸残基からの修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対中の少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸変化及び他の任意選択的な修飾をもたらす。
なる集団を指す。配列番号５５は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、予測されたアミノ酸残基からの修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対中の少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸変化及び他の任意選択的な修飾をもたらす。
【0079】
本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから参照群の全てのメンバーよりも少ないメンバーまでからなるｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中の少なくとも１つの（１）ｖｐ１タンパク質であり、全てのｖｐ１タンパク質未満である。ｖｐ３タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、１つの（１）ｖｐ３タンパク質から、組み立てられたＡＡＶカプシド中の全てのｖｐ３タンパク質よりも少ないものまでであり得る。例えば、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であってもよく、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別個の亜集団であってもよく、ｖｐ３は更に、組み立てられたＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質の更なる亜集団であってもよい。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有する亜集団を含有し得る。
【0080】
別途指定されない限り、高度脱アミド化は、参照アミノ酸位置での予測されたアミノ酸配列と比較して、参照アミノ酸位置での少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は最大約１００％の脱アミド化を指す（例えば、配列番号５５［ＡＡＶｈｕ６８］の番号付けに基づくアミノ酸５７のアスパラギンの少なくとも８０％が、総ｖｐ１タンパク質に基づいて脱アミド化されてもよく、総ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質に基づいて脱アミド化されてもよい）。かかる割合は、２Ｄゲル、質量分析技術、又は他の好適な技術を使用して決定され得る。
【0081】
したがって、ｒＡＡＶは、少なくとも１つの高度に脱アミド化されたアスパラギンを含む少なくとも１つの亜集団を最低限含む、脱アミド化アミノ酸を有するｖｐ１、ｖｐ２、及び／又はｖｐ３タンパク質のｒＡＡＶカプシド内の亜集団を含む。更に、他の修飾は、特に、選択されたアスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）残基位置での異性化を含み得る。更なる他の実施形態では、修飾は、Ａｓｐ位置でのアミド化を含み得る。
【0082】
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、少なくとも４個～少なくとも約２５個の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３の亜集団を含有し、そのうちの少なくとも１～１０％は、ｖｐタンパク質のコードされたアミノ酸配列と比較して脱アミド化される。これらの大部分はＮ残基であり得る。しかしながら、Ｑ残基は脱アミド化され得る。
【0083】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、２つ、３つ、４つ以上の脱アミド化残基の組み合わせを含む亜集団を有するｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質を有するＡＡＶカプシドを
有する。ｒＡＡＶの脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動、及び／又は質量分析、及び／又はタンパク質モデリング技術を使用して決定され得る。オンラインクロマトグラフィーは、ＮａｎｏＦｌｅｘ ｓｏｕｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦに結合されたＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐカラム及びＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行され得る。Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦにおけるデータ依存のｔｏｐ－２０法を用いてＭＳデータを取得し、調査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から最も豊富な未配列前駆体イオンを動的に選択する。配列決定は、予測自動ゲイン制御によって決定される１ｅ５イオンの標的値を有する、より高エネルギーの衝突解離断片化によって行われ、前駆体の単離は、４ｍ／ｚのウィンドウで行われた。ｍ／ｚ ２００で１２０，０００の解像度で、調査スキャンを取得した。ＨＣＤスペクトルの解像度は、最大イオン注射時間５０ｍｓ及び正規化された衝突エネルギー３０で、ｍ／ｚ２００で３０，０００に設定されてもよい。Ｓ－レンズＲＦレベルを５０に設定して、消化物からのペプチドが占めるｍ／ｚ領域の透過率を最適化できる。断片化選択からの単一の割り当てられていない帯電状態、又は６以上の帯電状態を有する前駆イオンは、除外され得る。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、取得したデータの分析に使用してもよい。ペプチドマッピングのために、固定修飾としてカルバミドメチル化設定された単一エントリのタンパク質ＦＡＳＴＡデータベース、可変修飾として酸化、脱アミド化、及びリン酸化の設定、１０ｐｐｍ質量精度、高プロテアーゼ特異性、並びにＭＳ／ＭＳスペクトルにおける信頼レベル０．８を使用して検索を実施する。好適なプロテアーゼの例としては、例えば、トリプシン又はキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化は、無傷分子の質量＋０．９８４Ｄａ（－ＯＨ及び－ＮＨ２基の質量差）を付加するので、脱アミド化ペプチドの質量分析的同定は比較的簡単である。特定のペプチドの脱アミド化率は、脱アミド化ペプチドの質量面積を、脱アミド化及びネイティブペプチドの面積の合計で除することによって決定される。脱アミド化の可能性がある部位の数を考慮すると、異なる部位で脱アミド化されている同重種は、単一のピークで共移動し得る。その結果、複数の脱アミド化の可能性がある部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、脱アミド化の複数の部位を位置決定又は区別することができる。これらの場合に、観測される同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる脱アミド化ペプチド異性体の相対的な存在率を特異的に決定することができる。この方法は、全ての異性体種についての断片化効率が同じであり、脱アミド化部位に依存しないことを想定する。これらの例示的な方法のいくつかの変形が使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、好適な質量分析器は、例えば、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ若しくはＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０等の四重飛行質量分析器（ＱＴＯＦ）、又はＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ若しくはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）等のオービトラップ装置を含み得る。好適な液体クロマトグラフィーとしては、例えば、Ｗａｔｅｒｓ製のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム、又はＡｇｉｌｅｎｔシステム（１１００若しくは１２００シリーズ）が挙げられる。好適なデータ分析ソフトウェアとしては、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ ａｎｄ Ｐｅｐｆｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｅａｋｓ ＤＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が挙げられ得る。更に他の技術は、例えば、２０１７年６月１６日にオンラインで公開されたＸ．Ｊｉｎ
ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５－２６７に記載され得る。
有する。ｒＡＡＶの脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動、及び／又は質量分析、及び／又はタンパク質モデリング技術を使用して決定され得る。オンラインクロマトグラフィーは、ＮａｎｏＦｌｅｘ ｓｏｕｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦに結合されたＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐカラム及びＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行され得る。Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦにおけるデータ依存のｔｏｐ－２０法を用いてＭＳデータを取得し、調査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から最も豊富な未配列前駆体イオンを動的に選択する。配列決定は、予測自動ゲイン制御によって決定される１ｅ５イオンの標的値を有する、より高エネルギーの衝突解離断片化によって行われ、前駆体の単離は、４ｍ／ｚのウィンドウで行われた。ｍ／ｚ ２００で１２０，０００の解像度で、調査スキャンを取得した。ＨＣＤスペクトルの解像度は、最大イオン注射時間５０ｍｓ及び正規化された衝突エネルギー３０で、ｍ／ｚ２００で３０，０００に設定されてもよい。Ｓ－レンズＲＦレベルを５０に設定して、消化物からのペプチドが占めるｍ／ｚ領域の透過率を最適化できる。断片化選択からの単一の割り当てられていない帯電状態、又は６以上の帯電状態を有する前駆イオンは、除外され得る。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、取得したデータの分析に使用してもよい。ペプチドマッピングのために、固定修飾としてカルバミドメチル化設定された単一エントリのタンパク質ＦＡＳＴＡデータベース、可変修飾として酸化、脱アミド化、及びリン酸化の設定、１０ｐｐｍ質量精度、高プロテアーゼ特異性、並びにＭＳ／ＭＳスペクトルにおける信頼レベル０．８を使用して検索を実施する。好適なプロテアーゼの例としては、例えば、トリプシン又はキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化は、無傷分子の質量＋０．９８４Ｄａ（－ＯＨ及び－ＮＨ２基の質量差）を付加するので、脱アミド化ペプチドの質量分析的同定は比較的簡単である。特定のペプチドの脱アミド化率は、脱アミド化ペプチドの質量面積を、脱アミド化及びネイティブペプチドの面積の合計で除することによって決定される。脱アミド化の可能性がある部位の数を考慮すると、異なる部位で脱アミド化されている同重種は、単一のピークで共移動し得る。その結果、複数の脱アミド化の可能性がある部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、脱アミド化の複数の部位を位置決定又は区別することができる。これらの場合に、観測される同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる脱アミド化ペプチド異性体の相対的な存在率を特異的に決定することができる。この方法は、全ての異性体種についての断片化効率が同じであり、脱アミド化部位に依存しないことを想定する。これらの例示的な方法のいくつかの変形が使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、好適な質量分析器は、例えば、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ若しくはＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０等の四重飛行質量分析器（ＱＴＯＦ）、又はＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ若しくはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）等のオービトラップ装置を含み得る。好適な液体クロマトグラフィーとしては、例えば、Ｗａｔｅｒｓ製のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム、又はＡｇｉｌｅｎｔシステム（１１００若しくは１２００シリーズ）が挙げられる。好適なデータ分析ソフトウェアとしては、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ ａｎｄ Ｐｅｐｆｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｅａｋｓ ＤＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が挙げられ得る。更に他の技術は、例えば、２０１７年６月１６日にオンラインで公開されたＸ．Ｊｉｎ
ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５－２６７に記載され得る。
【0084】
脱アミド化に加えて、１つのアミノ酸が異なるアミノ酸残基に変換されることはない他の修飾が生じてもよい。かかる修飾は、アセチル化残基、異性化、リン酸化、又は酸化を含み得る。
【0085】
脱アミド化の調節：特定の実施形態では、ＡＡＶは、アスパラギン－グリシン対の中のグリシンを変更して、脱アミド化を低減するように修飾される。他の実施形態では、アスパラギンは、異なるアミノ酸、例えば、より遅い速度で脱アミド化するグルタミン、又はアミド基を欠くアミノ酸（例えば、グルタミン及びアスパラギンは、アミド基を含有する）、及び／又はアミン基を欠くアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジンは、アミン基を含有する）に変更される。本明細書で使用される場合、アミド又はアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、若しくはトリプトファン、及び／又はプロリンを指す。記載されるような修飾は、コードされたＡＡＶアミノ酸配列中に見出されるアスパラギン－グリシン対のうちの１つ、２つ、又は３つにあり得る。特定の実施形態では、かかる修飾は、アスパラギン－グリシン対の４つ全てでは行われない。したがって、より低い脱アミド率を有する、ＡＡＶ及び／又は操作されたＡＡＶバリアントの脱アミドを低減するための方法。追加的に、又は代替え的に、１つ以上の他のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変更して、ＡＡＶの脱アミド化を低減し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される変異体ＡＡＶカプシドは、グリシンがアラニン又はセリンに変化するように、アスパラギン－グリシン対の中に変異を含有する。変異体ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に４つのＮＧ対を含む位置に、１つ、２つ、又は３つの変異体を含有し得る。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に５つのＮＧ対を含む位置に、１つ、２つ、３つ、又は４つのかかる変異体を含有し得る。特定の実施形態では、変異体ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対に単一の変異のみを含有する。特定の実施形態では、変異体ＡＡＶカプシドは、２つの異なるＮＧ対に変異を含有する。特定の実施形態では、変異体ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシド中で構造的に離れた位置に位置する２つの異なるＮＧ対に変異を含有する。特定の実施形態では、変異は、ＶＰ１固有領域にはない。特定の実施形態では、変異のうちの１つは、ＶＰ１固有領域にある。任意選択的に、変異体ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対中に修飾を含まないが、ＮＧ対から外れて位置する１つ以上のアスパラギン若しくはグルタミン中の脱アミド化を最小限に抑えるか、又は排除するために変異を含有する。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質において、４個の残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は、様々なロットにわたって７０％を超える脱アミド化レベルを日常的に示し、ほとんどの場合、９０％を超える。更なるアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、及びＱ５９９）も、様々なロットにわたって最大約２０％の脱アミド化レベルを示す。脱アミド化レベルは、最初にトリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。
【0086】
ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号５５の予測されたアミノ酸残基からの修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、配列番号５５のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸の変化及び他の任意選択的な修飾をもたらす。これら及び他の修飾の様々な組み合わせは、本明細書に記載されている。
【0087】
一態様では、ＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、発現カセットと、を含み、発現カセットが、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列と、宿主細胞におけるＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ遺伝子編集の要素の発現を指示する調節要素と、を含む、ＡＡＶベクターが本明細書で提供される。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列も含む。
【0088】
ＩＴＲは、ベクター産生の際のゲノムの複製及びパッケージングに関与する遺伝要素で
あり、ｒＡＡＶを生成するために必要とされる唯一のウイルス性シス要素である。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。好ましい実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、又はその欠失態様（ΔＩＴＲ）が、利便性のため、及び規制当局の承認を加速させるために使用され得る。しかしながら、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶの５’ＩＴＲと、遺伝子産物をコードする核酸配列と、任意の調節配列と、ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含む。しかしながら、これらの要素の他の構成も好適であり得る。一実施形態では、自己相補性ＡＡＶが使用される。Ｄ配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮態様が記載されている。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、１３０塩基対の短縮されたＡＡＶ２ ＩＴＲを含み、ここで、外部「ａ」要素は欠失している。短縮されたＩＴＲは、内部Ａ要素を鋳型として使用して、ベクターＤＮＡ増幅中に１４５塩基対の野生型の長さに戻される。他の実施形態では、全長ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲが使用される。
あり、ｒＡＡＶを生成するために必要とされる唯一のウイルス性シス要素である。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。好ましい実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、又はその欠失態様（ΔＩＴＲ）が、利便性のため、及び規制当局の承認を加速させるために使用され得る。しかしながら、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶの５’ＩＴＲと、遺伝子産物をコードする核酸配列と、任意の調節配列と、ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含む。しかしながら、これらの要素の他の構成も好適であり得る。一実施形態では、自己相補性ＡＡＶが使用される。Ｄ配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮態様が記載されている。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、１３０塩基対の短縮されたＡＡＶ２ ＩＴＲを含み、ここで、外部「ａ」要素は欠失している。短縮されたＩＴＲは、内部Ａ要素を鋳型として使用して、ベクターＤＮＡ増幅中に１４５塩基対の野生型の長さに戻される。他の実施形態では、全長ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲが使用される。
【0089】
一実施形態では、調節配列は、総ｒＡＡＶベクターゲノムが、約２．０～約５．５キロ塩基のサイズであるように選択される。一実施形態では、調節配列は、総ｒＡＡＶベクターゲノムが、約２．９～約５．５キロ塩基のサイズであるように選択される。一実施形態では、調節配列は、総ｒＡＡＶベクターゲノムが約２．９ｋｂのサイズであるように選択される。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、天然ＡＡＶゲノムのサイズに近似することが望ましい。したがって、一実施形態では、調節配列は、総ｒＡＡＶベクターゲノムが約４．７ｋｂのサイズであるように選択される。別の実施形態では、総ｒＡＡＶベクターゲノムは、約５．２ｋｂ未満のサイズである。ベクターゲノムのサイズは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡ等を含む調節配列のサイズに基づいて操作され得る。参照により本明細書に組み込まれるＷｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，Ｊａｎ ２０１０，１８（１）：８０－６を参照されたい。
【0090】
特定の実施形態では、アンジェルマン症候群（ＡＳ）を有する対象の治療のためのＣＮＳ指向性療法として有用なｒＡＡＶであって、ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされるベクターゲノムと、を含み、上述のベクターゲノムが、（ａ）ＡＡＶの５’逆位末端反復（ＩＴＲ）と、（ｂ）宿主細胞（ｈｏｓｔ ｅｌｌ）における発現を指示する調節要素に作動可能に連結される遺伝子編集系の構成要素をコードする配列と、（ｃ）発現を指示する調節要素と、（ｄ）（ｄ）ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含む、ｒＡＡＶが本明細書で提供される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＣＮＳの細胞に対して向性を有し（例えば、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを有するｒＡＡＶ）、及び／又はニューロン特異的発現制御要素（例えば、シナプシンプロモーター）を含有する。一態様では、ウイルスベクターの生成に有用なベクター（例えば、プラスミド）である構築物が提供される。一実施形態では、ＡＡＶ ５’ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、ＡＡＶ ３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、本明細書に記載のＡＡＶカプシドを含む。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを含む。他の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ６８ではないＡＡＶカプシドを含む。
【0091】
本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技術を使用して生成されてもよい。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列と、機能的ｒｅｐ遺伝子と、ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接する本明細書に記載の発現カセットと、発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にするのに十分なヘルパー機能と、を含有する宿主細胞を培養することを伴う。また、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列と、機能
的ｒｅｐ遺伝子と、記載のベクターゲノムと、ベクターゲノムをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にするのに十分なヘルパー機能と、を含有する宿主細胞も本明細書で提供される。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１６０３６０Ａ２に更に詳細に記載されている。
的ｒｅｐ遺伝子と、記載のベクターゲノムと、ベクターゲノムをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にするのに十分なヘルパー機能と、を含有する宿主細胞も本明細書で提供される。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１６０３６０Ａ２に更に詳細に記載されている。
【0092】
当業者に利用可能なｒＡＡＶの他の産生方法も利用することができる。好適な方法としては、バキュロウイルス発現系又は酵母を介した生成が挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ Ｍ．Ｋｏｔｉｎ，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－Ｒ６．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１１ Ａｐｒ ２９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１、Ａｕｃｏｉｎ ＭＧ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒｉｐｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００６ Ｄｅｃ ２０；９５（６）：１０８１－９２；ＳＡＭＩ Ｓ．ＴＨＡＫＵＲ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｔｈｅｓｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ，２０１２、Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ Ｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｅａｄ－ｔｏ－Ｈｅａｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７ Ａｕｇ １０．ｐｉｉ：Ｓ１５２５－００１６（１７）３０３６２－３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０８．００３．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］、Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ，ＯｎｅＢａｃ ２．０：Ｓｆ９ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ
ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ１，ＡＡＶ２，ａｎｄ ＡＡＶ８ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｆｅｂ；２８（１）：１５－２２．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１６．１６４．、Ｌｉ
Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ－ｆｏｒｍ ｇｅｎｏｍｅｓ：ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ａｕｇ １；８（８）：ｅ６９８７９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９．Ｐｒｉｎｔ ２０１３、Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｌａｔｅｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ Ｐａｔｈｏｌ．２０１１ Ｊｕｌ；１０７ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８０－９３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｐ．２０１１．０５．００８、及びＫｏｔｉｎ ＲＭ，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ ２９を参照されたい。
Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７ Ａｕｇ １０．ｐｉｉ：Ｓ１５２５－００１６（１７）３０３６２－３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０８．００３．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］、Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ，ＯｎｅＢａｃ ２．０：Ｓｆ９ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ
ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ１，ＡＡＶ２，ａｎｄ ＡＡＶ８ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｆｅｂ；２８（１）：１５－２２．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１６．１６４．、Ｌｉ
Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ－ｆｏｒｍ ｇｅｎｏｍｅｓ：ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ａｕｇ １；８（８）：ｅ６９８７９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９．Ｐｒｉｎｔ ２０１３、Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｌａｔｅｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ Ｐａｔｈｏｌ．２０１１ Ｊｕｌ；１０７ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８０－９３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｐ．２０１１．０５．００８、及びＫｏｔｉｎ ＲＭ，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ ２９を参照されたい。
【0093】
２ステップの高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交
換樹脂クロマトグラフィーを使用して、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ＡＡＶ９」と題するＷＯ２０１７／１６０３６０に更に詳細に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に説明すると、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ９粒子をゲノム欠損ＡＡＶ９中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶ９ウイルス粒子及びＡＡＶ９カプシド中間体を含む懸濁液を高速液体クロマトグラフィーに供することを含み、このときＡＡＶ９ウイルス粒子及びＡＡＶ９中間体は、１０．２のｐＨで平衡化された強アニオン交換樹脂に結合され、約２６０及び約２８０の紫外吸光度で溶離液をモニタリングしながら塩勾配に供される。ｒＡＡＶ９にとっては、最適には満たないが、ｐＨは約１０．０～１０．４の範囲であり得る。この方法では、ＡＡＶ９完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に到達した場合に溶出するフラクションから回収される。一例では、アフィニティクロマトグラフィーステップのために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン性条件下、有意な割合の残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質が、カラムを通って流れる一方で、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕捉される。
換樹脂クロマトグラフィーを使用して、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ＡＡＶ９」と題するＷＯ２０１７／１６０３６０に更に詳細に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に説明すると、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ９粒子をゲノム欠損ＡＡＶ９中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶ９ウイルス粒子及びＡＡＶ９カプシド中間体を含む懸濁液を高速液体クロマトグラフィーに供することを含み、このときＡＡＶ９ウイルス粒子及びＡＡＶ９中間体は、１０．２のｐＨで平衡化された強アニオン交換樹脂に結合され、約２６０及び約２８０の紫外吸光度で溶離液をモニタリングしながら塩勾配に供される。ｒＡＡＶ９にとっては、最適には満たないが、ｐＨは約１０．０～１０．４の範囲であり得る。この方法では、ＡＡＶ９完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に到達した場合に溶出するフラクションから回収される。一例では、アフィニティクロマトグラフィーステップのために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン性条件下、有意な割合の残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質が、カラムを通って流れる一方で、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕捉される。
【0094】
ｒＡＡＶの特性評価又は定量化のための従来の方法は、当業者に利用可能である。空及び充填粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配で精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド体積が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物品ピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。次いで、ロードした２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割り算し、ゲノムコピーに対する粒子の比率（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ－ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割り、１００を掛け算することによって、空粒子の割合を得る。一般に、空のカプシド及びパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性カプシドについて試験するために、本方法は、処理されたＡＡＶストックを、３つのカプシドタンパク質を分離することが可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、緩衝液中に３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含有する勾配ゲル）に供することと、次いで、試料材料が分離されるまでゲルを試行することと、ナイロン又はニトロセルロース膜、好ましくはナイロンの上でゲルをブロッティングすることと、を含む。抗－ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗－ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗－ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する主要な抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体との結合を検出するための手段を含有する二次抗体、より好ましくは、抗体自体に共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を使用する。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、又は比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラム画分からの試料を採取し、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）で分割された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って銀染色を実施してもよく、又は他の好適な染色方
法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー又はクマシー色素を用いてもよい。一実施形態では、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（又は別の好適なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活性化後、試料は、更に希釈され、プライマー、及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを利用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定した。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用され得る。
Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性カプシドについて試験するために、本方法は、処理されたＡＡＶストックを、３つのカプシドタンパク質を分離することが可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、緩衝液中に３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含有する勾配ゲル）に供することと、次いで、試料材料が分離されるまでゲルを試行することと、ナイロン又はニトロセルロース膜、好ましくはナイロンの上でゲルをブロッティングすることと、を含む。抗－ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗－ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗－ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する主要な抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体との結合を検出するための手段を含有する二次抗体、より好ましくは、抗体自体に共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を使用する。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、又は比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラム画分からの試料を採取し、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）で分割された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って銀染色を実施してもよく、又は他の好適な染色方
法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー又はクマシー色素を用いてもよい。一実施形態では、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（又は別の好適なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活性化後、試料は、更に希釈され、プライマー、及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを利用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定した。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用され得る。
【0095】
一態様では、広域スペクトルのセリンプロテアーゼ、例えば、プロテイナーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より特定的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、標準アッセイと同様であるが、但し、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテイナーゼＫで処理した後、熱不活性化させる。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮され得る。典型的には、プロテアーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間、実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分間～約３０分間）、又はより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱不活性化は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。
【0096】
追加的に、又は代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用され得る。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価を決定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。
【0097】
カプシドタンパク質のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３間の比率を決定する方法も利用可能である。例えば、Ｖａｍｓｅｅｄｈａｒ Ｒａｙａｐｒｏｌｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ；８７（２４）：１３１５０－１３１６０、Ｂｕｌｌｅｒ ＲＭ，Ｒｏｓｅ ＪＡ．１９７８．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ＫＢ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２５：３３１－３３８、及びＲｏｓｅ ＪＡ，Ｍａｉｚｅｌ ＪＶ，Ｉｎｍａｎ ＪＫ，Ｓｈａｔｋｉｎ ＡＪ．１９７１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８：７６６－７７０を参照されたい。
ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８：７６６－７７０を参照されたい。
【0098】
本明細書に記載のベクターにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。
【0099】
組成物
ＡＳを治療することを必要とする対象においてＡＳを治療するための投与に適した水性懸濁物であって、この懸濁物が、水性懸濁液と、本明細書に記載のそのための調節要素に作動可能に連結された遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列を含むベクターと、を含む、水性懸濁液が提供される。一実施形態では、治療有効量の上述のベクターが、懸濁液に含まれる。
ＡＳを治療することを必要とする対象においてＡＳを治療するための投与に適した水性懸濁物であって、この懸濁物が、水性懸濁液と、本明細書に記載のそのための調節要素に作動可能に連結された遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列を含むベクターと、を含む、水性懸濁液が提供される。一実施形態では、治療有効量の上述のベクターが、懸濁液に含まれる。
【0100】
核酸
特定の実施形態では、薬学的組成物は、遺伝子編集系の構成要素と、非ウイルス送達系と、を含む、発現カセットを含む。これには、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質又は脂質様粒子、キトサンベースの製剤、及び当該技術分野で既知であり、例えば、上記で引用されるＲａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒによって記載されている他のものが含まれ得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、ウイルスベクター系に遺伝子編集系を含む発現カセットを含む懸濁液である。特定の実施形態では、薬学的組成物は、非複製ウイルスベクターを含む。好適なウイルスベクターには、例えば、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えボカウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又は別の組換えパルボウイルス等の任意の好適な送達ベクターが含まれ得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳを標的化するための遺伝子編集系を、それを必要とする患者に送達するための組換えＡＡＶである。
特定の実施形態では、薬学的組成物は、遺伝子編集系の構成要素と、非ウイルス送達系と、を含む、発現カセットを含む。これには、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質又は脂質様粒子、キトサンベースの製剤、及び当該技術分野で既知であり、例えば、上記で引用されるＲａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒによって記載されている他のものが含まれ得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、ウイルスベクター系に遺伝子編集系を含む発現カセットを含む懸濁液である。特定の実施形態では、薬学的組成物は、非複製ウイルスベクターを含む。好適なウイルスベクターには、例えば、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えボカウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又は別の組換えパルボウイルス等の任意の好適な送達ベクターが含まれ得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳを標的化するための遺伝子編集系を、それを必要とする患者に送達するための組換えＡＡＶである。
【0101】
一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤を含み、例えば、生理学的に適合するｐＨ及び塩濃度に緩衝される水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥され、投与時に再構築されてもよい。
【0102】
一実施形態では、懸濁液は、水性懸濁液中に溶解される界面活性剤、防腐剤、賦形剤、及び／又は緩衝剤を更に含む。一実施形態では、緩衝液は、ＰＢＳである。様々な好適な溶液が既知であり、緩衝化生理食塩水、界面活性剤、約１００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭの塩化ナトリウムに相当するイオン強度に調整された生理学的に適合する塩若しくは塩の混合物、又は同等のイオン濃度に調整された生理学的に適合する塩のうちの１つ以上を含むものが含まれる。好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、ポロキサマーの中から、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖で構成される非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールから選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。ｐＨは、６．５～８．５、又は７～８．５、又は７．５～８の範囲であり得る。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるので、髄腔内送達のためには、この範囲内のｐＨが望ましい可能性があるが、静脈内送達のためには、６．８～約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかしながら、最も広い範囲にある他のｐＨ、及びこれらの部分範囲が、他の送達経路のために選択され得る。
【0103】
更に、薬学的組成物であって、薬学的に許容される担体と、本明細書に記載のそのための調節要素に作動可能に連結された遺伝子編集系の１つ以上の構成要素をコードする核酸配列を含むベクターと、を含む、薬学的組成物が提供される。本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗
菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補助活性成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギー又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、ミクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞等の送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又は他の遺伝子編集系の１つ以上の構成要素の送達のためのｒＡＡＶベクター送達導入遺伝子又はｒＡＡＶベクターは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、又はナノ粒子等のいずれかに封入された送達のために製剤化され得る。一実施形態では、治療有効量の上述のベクターが、薬学的組成物に含まれる。好適な担体は、ベクターが向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）とともに製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。担体の選択は、本発明を限定しない。防腐剤又は化学安定化剤等の他の従来の薬学的に許容される担体。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学安定化剤としては、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。
菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補助活性成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギー又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、ミクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞等の送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又は他の遺伝子編集系の１つ以上の構成要素の送達のためのｒＡＡＶベクター送達導入遺伝子又はｒＡＡＶベクターは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、又はナノ粒子等のいずれかに封入された送達のために製剤化され得る。一実施形態では、治療有効量の上述のベクターが、薬学的組成物に含まれる。好適な担体は、ベクターが向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）とともに製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。担体の選択は、本発明を限定しない。防腐剤又は化学安定化剤等の他の従来の薬学的に許容される担体。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学安定化剤としては、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。
【0104】
「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギー又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。
【0105】
本明細書で使用される場合、「投薬量」又は「量」という用語は、対象に治療の過程で送達される総投薬量若しくは総量、あるいは単一単位（又は複数単位若しくは分割投薬量）投与で送達される投薬量若しくは量を指し得る。
【0106】
本明細書に記載の水性懸濁液又は薬学的組成物は、任意の好適な経路又は異なる経路の組み合わせによって、それを必要とする対象に送達されるように設計される。一実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載の発現カセット又はベクターと、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、又は静脈内（ＩＶ）の投与経路を介した送達に好適な製剤緩衝液とを含む。代替的に、他の投与経路（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、筋肉内、及び他の非経口経路）を選択してもよい。
【0107】
本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」又は「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への注射を介する、より具体的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間への注射による、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内、後頭下／大槽内、及び／又はＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰椎穿刺の手段によって、クモ膜下腔全体に拡散させるために導入され得る。別の例では、大槽内への注射であってもよい。大槽内送達は、ベクター拡散を増加させ、及び／又は投与によって引き起こされる毒性及び炎症を低減し得る。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ
ａｌ，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１４；１：１４０５１．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１４ Ｄｅｃ １０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１４．５１を参照されたい。
ａｌ，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１４；１：１４０５１．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１４ Ｄｅｃ １０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１４．５１を参照されたい。
【0108】
本明細書で使用される場合、「大槽内送達（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」又は「大槽内投与（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａ
ｔｉｏｎ）」という用語は、脳室の脳脊髄液への、又は小脳延髄槽内への直接的な薬物の投与経路、より詳細には、後頭下穿刺による、又は大槽内への直接注射による、又は永続的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。
ｔｉｏｎ）」という用語は、脳室の脳脊髄液への、又は小脳延髄槽内への直接的な薬物の投与経路、より詳細には、後頭下穿刺による、又は大槽内への直接注射による、又は永続的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。
【0109】
一態様では、本明細書に記載されるベクターを製剤緩衝液中に含む薬学的組成物が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、複製欠損ウイルス組成物は、ヒト患者にとって、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、約１．０×１０９ＧＣ～約１．０×１０１６ＧＣ（体重７０ｋｇの平均対象を治療するため）、好ましくは１．０×１０１２ＧＣ～１．０×１０１４ＧＣの範囲にある一定量の複製欠損ウイルスを含有するように投薬量単位で製剤化され得る。一実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数を含む、用量当たり少なくとも１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、又は９×１０９ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、又は９×１０１０ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、又は９×１０１１ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、又は９×１０１２ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、又は９×１０１３ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、又は９×１０１４ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、又は９×１０１５ＧＣを含有するように製剤化される。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり１×１０１０～約１×１０１２ＧＣの範囲であり得る。
【0110】
一実施形態では、製剤緩衝液中に本明細書に記載されるｒＡＡＶを含む薬学的組成物が提供される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ～約１×１０１４ＧＣ／ｍＬで製剤化される。更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約３×１０９ＧＣ／ｍＬ～約３×１０１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。なお更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０９ＧＣ／ｍＬ～約１×１０１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、少なくとも約１×１０１１ＧＣ／ｍＬで製剤化される。
【0111】
これらの用量及び濃度の送達のために好適な体積は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの体積が選択されてもよいが、より大きな体積が、成人用に選択されてもよい。典型的には、新生児のために、好適な体積は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児のために、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児のために、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの体積が選択され得る。小児のために、最大約３０ｍＬの体積が選択され得る。プレティーン及び１０代のために、最大約５０ｍＬの体積が選択され得る。更に他の実施形態では、患者は、約５ｍＬ～約１５ｍＬの体積での髄腔内投与を受けてもよく、これが選択されるか、又は約７．５ｍＬ～約１０ｍＬを受けてもよい。他の適切な体積及び投薬量が決定され得る。任意の副作用に対する治療的利益のバランスを
とるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。
とるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。
【0112】
ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量化は、水性懸濁液又は薬学的組成物中に含まれる用量の尺度として使用され得る。当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定することができる。ＡＡＶのＧＣ数滴定を行うための１つの方法は、以下の通りである。精製されたＡＡＶベクター試料は、まずＤＮａｓｅで処理され、非カプシド化ＡＡＶゲノムＤＮＡ又は産生プロセスからの汚染プラスミドＤＮＡを排除する。次いで、ＤＮａｓｅ耐性粒子を熱処理して、カプシドからゲノムを放出させる。次いで、ウイルスゲノムの特定の領域（通常はポリＡシグナル）を標的化するプライマー／プローブセットを使用して、放出されたゲノムをリアルタイムＰＣＲ又は定量的ＰＣＲによって定量化する。複製欠損ウイルス組成物は、ヒト患者にとって、約１．０×１０９ＧＣ～約１．０×１０１５ＧＣの範囲、好ましくは１．０×１０１２ＧＣ～１．０×１０１４ＧＣの範囲にある量の複製欠損ウイルスを含有する投与量単位で製剤化することができる。好ましくは、製剤中の複製欠損ウイルス組成物の濃度は、約１．０×１０９ＧＣ、約５．０×１０９ＧＣ、約１．０×１０１０ＧＣ、約５．０×１０１０ＧＣ、約１．０×１０１１ＧＣ、約５．０×１０１１ＧＣ、約１．０×１０１２ＧＣ、約５．０×１０１２ＧＣ、約１．０×１０１３ＧＣ、約５．０×１０１３ＧＣ、約１．０×１０１４ＧＣ、約５．０×１０１４ＧＣ、又は約１．０×１０１５ＧＣである。ＡＡＶ ＧＣ数滴定を行うための代替的な方法又は追加の方法は、例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるようなｏｑＰＣＲ又はデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）による方法である。
【0113】
本明細書に記載の薬学的組成物における組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるよう意図されることを理解されたい
【0114】
方法
特定の実施形態では、発現カセット、核酸、又はウイルス若しくは非ウイルスベクターが、医薬品の調製に使用される。特定の実施形態では、アンジェルマン症候群の治療を必要とする対象において、アンジェルマン症候群を治療するためのその使用が提供される。
特定の実施形態では、発現カセット、核酸、又はウイルス若しくは非ウイルスベクターが、医薬品の調製に使用される。特定の実施形態では、アンジェルマン症候群の治療を必要とする対象において、アンジェルマン症候群を治療するためのその使用が提供される。
【0115】
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」という用語は、ＵＢＥ３Ａ欠損又はアンジェルマン症候群（ＡＳ）の１つ以上の症状を軽減する目的で、本明細書に記載される１つ以上の化合物又は組成物を対象に投与することを包含すると定義される。したがって、「治療」は、所与の対象において、ＡＳの発生若しくは進行を低減すること、疾患を予防すること、疾患の症状の重症度を低減すること、その進行を遅延させること、疾患の症状を除去すること、疾患の進行を遅らせること、又は療法の有効性を増加させること、のうちの１つ以上を含み得る。
【0116】
本明細書に記載される療法の目標は、所望の結果、すなわち、アンジェルマン症候群（ＡＳ）又はその１つ以上の症状の治療を達成するために、ＵＢＥ３Ａ発現を増強することである。そのような症状としては、限定されないが、知的障害、言語障害、運動失調、てんかん、発作障害、小頭症、精神運動遅延、及び反射亢進を伴う筋緊張低下が挙げられ得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＫ．Ｂｕｉｔｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，（２０１６）を参照されたい）。本明細書に記載されるように、所望の結果は、発育遅延、知的障害、重度の言語障害、運動
及びバランスに関する問題を含む神経物理学的合併症を減少させるか、又は排除することを含み得る。
及びバランスに関する問題を含む神経物理学的合併症を減少させるか、又は排除することを含み得る。
【0117】
本明細書に提供される組成物の「治療有効量」は、所望の結果を達成するか、又は治療目標に到達するために、対象に送達される。一実施形態では、ＡＳを治療するための治療目標は、ニューロン中、又はニューロンの集団中のＵＢＥ３Ａ発現を、正常範囲内であるか、又は非ＡＳレベルである患者の機能レベルに復元することである。別の実施形態では、ＡＳの治療のための治療目標は、ＵＢＥ３Ａ発現を、正常値若しくは非ＡＳレベルに対して、又は治療前のＵＢＥ３Ａ発現レベルと比較して、少なくとも約９９％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約２％、約１％に増加させることである。ＵＢＥ３Ａ機能を１００％未満の活性レベルに送達することによってレスキューされた患者は、任意選択的に、更なる治療を受けてもよい。別の実施形態では、ＡＳの治療のための治療目標は、選択された集団におけるニューロンの約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約２％、又は約１％を含む、標的ニューロンの割合でＵＢＥ３Ａ発現を増加させることである。
【0118】
特定の実施形態では、ＡＳを治療する方法であって、それを必要とする対象に、遺伝子編集系の編集の１つ以上の要素を提供する発現カセット、ベクター、又はｒＡＡＶを投与することによって、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの編集が、ニューロン中の父系対立遺伝子からのＵＢＥ３Ａの発現を増強させる、方法が本明細書で提供される。
【0119】
特定の実施形態では、本方法は、ＵＢＥ３Ａ ３’ＵＴＲの下流のＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ中の配列に結合するヌクレアーゼを発現する核酸配列を送達することを含む。理論に束縛されることを意図するものではないが、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳコード配列の編集によって、母系対立遺伝子からのＵＢＥ３Ａ発現が欠損している患者の父系対立遺伝子上のＵＢＥ３Ａ発現を脱サイレンシングし、父系対立遺伝子からのＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の発現を提供した。特定の実施形態では、遺伝子編集系は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳコード配列の転写と干渉する、インデル、欠失、挿入、反転、又は他の破壊である変異又は修飾を導入する。特定の実施形態では、本方法は、ＵＢＥ３Ａ ３’ＵＴＲ及びＳＮＯＲＤ１０９Ｂにわたる領域において、ヒトＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ中に変異を導入することを含む。特定の実施形態では、変異は、ｃｈｒ１５：２５，２７８，４０９～２５，３３３，７２８（ｈｇ３８ゲノムアセンブリ）に、及び／又は１５番染色体上のＵＢＥ３Ａ ３’ＵＴＲとＳＮＯＲＤ１０９Ｂ ＯＲＦとの間の領域に対して相補性のＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの配列中に位置する標的配列中に導入される。
【0120】
本明細書に記載される遺伝子療法は、ウイルス性であるか、又は非ウイルス性であるかにかかわらず、他の治療（二次療法）、すなわち、対象の（患者の）診断及び状態のための標準的なケアと併せて使用され得る。本明細書で使用される場合、「二次療法」という用語は、ＡＳの治療のために本明細書に記載される遺伝子療法と組み合わせることができる療法を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子療法は、ＡＳの治療のための１つ以上の二次療法、例えば、抗けいれん剤又は食事制限（例えば、ケトジェニック及び低血糖）の投与と組み合わせて投与される。二次療法は、ＡＳのこれらの症状を予防し、停止し、又は緩和するのに役立つ任意の療法であり得る。二次療法は、上に記載の組成物の投与の前、投与と同時、又は投与の後に投与することができる。対象は、彼らの担当医の裁量によって、遺伝子療法治療の前に、及びそれと同時に、彼らの標準的なケア治療を継続することを許可されてもよい。代替として、医師は、遺伝子療法治療を投与する前に標準的なケア療法を停止し、任意選択的に、遺伝子療法の投与後に併用療法として
標準的なケア療法を再開することを選び得る。別の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子療法を、当該技術分野で日常的である遺伝子型分析又は遺伝子スクリーニングと組み合わせることができ、ＵＢＥ３Ａ遺伝子の核酸配列における１つ以上の変異を特定するためのＰＣＲの使用を含み得る。上述のように、人生の初期（例えば、１～３ヶ月）にＡＳの症状を示す対象、及び人生の後期にＡＳを有すると診断された対象は、本明細書に記載の組成物及び方法の意図されるレシピエントである。
標準的なケア療法を再開することを選び得る。別の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子療法を、当該技術分野で日常的である遺伝子型分析又は遺伝子スクリーニングと組み合わせることができ、ＵＢＥ３Ａ遺伝子の核酸配列における１つ以上の変異を特定するためのＰＣＲの使用を含み得る。上述のように、人生の初期（例えば、１～３ヶ月）にＡＳの症状を示す対象、及び人生の後期にＡＳを有すると診断された対象は、本明細書に記載の組成物及び方法の意図されるレシピエントである。
【0121】
「投与すること」又は「投与経路」とは、薬学的担体又は賦形剤の有無にかかわらず、本明細書に記載の組成物を対象に送達することである。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。いくつかの実施形態では、投与は、周期的に繰り返される。連続的な投与は、数日間、数週間、数ヶ月間、又は数年の間隔からの複数の投与の時間ギャップを意味し得る。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、それを必要とする対象に１回以上投与される。一実施形態では、複数回の投与は、数日間、数週間、数ヶ月又は数年間離れている。一実施形態では、１回、２回、３回、又はそれ以上再投与することが許される。かかる再投与は、同じ種類のベクター、又は異なるベクターによるものであってもよい。更なる実施形態では、本明細書に記載のベクターは、単独で、又は患者の診断及び状態のための標準的なケアと組み合わせて使用され得る。本明細書に記載の核酸分子及び／又はベクターは、単一の組成物又は複数の組成物で送達されてもよい。任意選択的に、２つ以上の異なるＡＡＶ、又は複数のウイルスが送達され得る［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４９３を参照されたい］。
【0122】
一実施形態では、遺伝子療法のための本明細書に記載の発現カセット、ベクター、又は他の組成物は、患者当たり単回用量として送達される。一実施形態では、対象は、治療有効量の本明細書に記載の組成物を送達される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、発現カセット若しくはベクター、又はそれらの組み合わせの量を指す。
【0123】
一実施形態では、発現カセットは、ベクターゲノム中、その範囲及びエンドポイント内の全ての整数又は分数量を含む、脳質量１グラム当たり約１×１０９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）の量で送達される。別の実施形態では、投薬量は、脳質量１グラム当たり１×１０１０ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０１３ＧＣである。特定の実施形態では、患者に投与されるベクターの用量は、少なくとも約１．０×１０９ＧＣ／ｇ、約１．５×１０９ＧＣ／ｇ、約２．０×１０９ＧＣ／ｇ、約２．５×１０９ＧＣ／ｇ、約３．０×１０９ＧＣ／ｇ、約３．５×１０９ＧＣ／ｇ、約４．０×１０９ＧＣ／ｇ、約４．５×１０９ＧＣ／ｇ、約５．０×１０９ＧＣ／ｇ、約５．５×１０９ＧＣ／ｇ、約６．０×１０９ＧＣ／ｇ、約６．５×１０９ＧＣ／ｇ、約７．０×１０９ＧＣ／ｇ、約７．５×１０９ＧＣ／ｇ、約８．０×１０９ＧＣ／ｇ、約８．５×１０９ＧＣ／ｇ、約９．０×１０９ＧＣ／ｇ、約９．５×１０９ＧＣ／ｇ、約１．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約１．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約２．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約２．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約３．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約３．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約４．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約４．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約５．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約５．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約６．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約６．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約７．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約７．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約８．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約８．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約９．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約９．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約１．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約１．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約２．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約２．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約３．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約３．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約４．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約４．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約５．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約５．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約６．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約６．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約７．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約７．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約８．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約８．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約９．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約９．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約１．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約１．５×１０１２Ｇ
Ｃ／ｇ、約２．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約２．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約３．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約３．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約４．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約４．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約５．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約５．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約６．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約６．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約７．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約７．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約８．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約８．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約９．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約９．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約１．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約１．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約２．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約２．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約３．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約３．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約４．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約４．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約５．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約５．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約６．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約６．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約７．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約７．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約８．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約８．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約９．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約９．５×１０１３ＧＣ／ｇ、又は約１．０×１０１４ＧＣ／ｇ脳質量である。
Ｃ／ｇ、約２．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約２．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約３．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約３．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約４．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約４．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約５．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約５．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約６．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約６．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約７．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約７．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約８．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約８．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約９．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約９．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約１．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約１．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約２．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約２．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約３．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約３．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約４．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約４．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約５．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約５．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約６．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約６．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約７．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約７．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約８．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約８．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約９．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約９．５×１０１３ＧＣ／ｇ、又は約１．０×１０１４ＧＣ／ｇ脳質量である。
【0124】
特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳに変異（例えば、インデル）を導入するための本明細書に記載の組成物によるＡＳを有する対象の治療は、再投与を必要としない場合がある。代替的に、本明細書に提供される遺伝子編集系を含む組成物を含む第２の治療又はその後の追加の治療が追求され得る。そのような後の治療は、初期の治療に利用されたものとは異なるカプシドを有するベクターを利用してもよい。当業者によって、更に他のＡＡＶカプシドの組み合わせが選択され得る。
【0125】
ウイルス又は他の送達ビヒクルの最低有効濃度を利用して、毒性等の望ましくない効果の危険性を低減することが望ましい。これらの範囲のなお他の投薬量は、治療される対象、好ましくはヒトの身体状態、対象の年齢、進行性である場合、障害が発症した程度を考慮して、主治医によって選択され得る。
【0126】
一般に、本方法は、それを必要とする哺乳動物対象に、調節配列の制御下にあるＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ遺伝子編集系の１つ以上の要素をコードする核酸配列を保有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む薬学的に有効な量の組成物と、薬学的に許容される担体と、を投与することを含む。一実施形態では、かかる方法は、哺乳動物対象においてＡＳを治療し、遅延させ、又はその進行を停止するために設計される。
【0127】
一実施形態では、本明細書に記載されるベクター、ｒＡＡＶ、水性懸濁液、又は薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することによる、ＡＳを治療する方法が提供される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０１０～約１×１０１５ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ体重で送達される。特定の実施形態では、対象はヒトである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、１回より多く投与される。更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、数日間、数週間、数ヶ月又は数年間に分けて投与される。
【実施例】
【0128】
ここで、以下の実施例を参照しながら、本発明が説明される。これらの実施例は例示のみを目的として提供され、本発明がこれらの実施例に限定されるものとして決して解釈されるべきではなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形例を包含すると解釈されるべきである。
【0129】
実施例１－材料及び方法
プラスミド構築
前述のｐＡＡＶ．Ｕ６．ｓｇＲＮＡ．ＴＢＧ．ＳａＣａｓ９ベクター中のＴＢＧプロモーター（Ｙａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６；３４（３）：３３４－８）を、ヒトシナプシンＩプロモーター（Ｔｈｉｅｌ Ｇ，ｅｔ ａｌ．
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９１；８８（８）：３４３１－５）と置き換え、ｐＡＡＶ．Ｕ６．ｓｇＲＮＡ．ｈＳｙｎ．ＳａＣａｓ９ベクターを得た。Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ遺伝子編集のために、５’ＮＮＧＲＴＴ ＰＡＭ配列の前に１２種類の２０ｂｐ標的配列を選択し、それらをｓｇＲＮＡクローニング部位にサブクローニングした（詳細は表１を参照されたい）。標的配列は、Ｕｂｅ３ａ ３’ＵＴＲの下流の１２ｋｂｐ領域（ｃｈｒ７：５９，３４１，０００～５９，３５３，０００、ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０ゲノムアセンブリ）をサンプリングした。非標的化配列は、スクランブル２０ｂｐ配列（５’－ＧＡＧＡＣＧＧＴＣＴＴＣＧＡＣＧＴＣＴＣ－３’、配列番号５６）からなっていた。ヌクレアーゼ欠損ｄＣａｓ９変異体を、点変異誘発（Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ）によって生成した。製造元の指示に従って、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１（ＭｉｒｕｓＢｉｏ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いたプラスミドトランスフェクションを使用して、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を用いてインビトロで標的配列をスクリーニングした。ｇＤＮＡ（ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット、Ｑｉａｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を単離した後、ＰＣＲによってそれぞれの標的配列を増幅させ、Ａｍｐｌｉｃｏｎ－Ｓｅｑによってインデル頻度を定量化した。インビボ試験のために、以下の標的配列を選択した（ｓｇＲＮＡ ＃７）：
５’－ＴＴＧＣＣＣＡＡＣＣＴＣＴＣＡＡＡＣＧＴ－３’（配列番号３５）。
プラスミド構築
前述のｐＡＡＶ．Ｕ６．ｓｇＲＮＡ．ＴＢＧ．ＳａＣａｓ９ベクター中のＴＢＧプロモーター（Ｙａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６；３４（３）：３３４－８）を、ヒトシナプシンＩプロモーター（Ｔｈｉｅｌ Ｇ，ｅｔ ａｌ．
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９１；８８（８）：３４３１－５）と置き換え、ｐＡＡＶ．Ｕ６．ｓｇＲＮＡ．ｈＳｙｎ．ＳａＣａｓ９ベクターを得た。Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ遺伝子編集のために、５’ＮＮＧＲＴＴ ＰＡＭ配列の前に１２種類の２０ｂｐ標的配列を選択し、それらをｓｇＲＮＡクローニング部位にサブクローニングした（詳細は表１を参照されたい）。標的配列は、Ｕｂｅ３ａ ３’ＵＴＲの下流の１２ｋｂｐ領域（ｃｈｒ７：５９，３４１，０００～５９，３５３，０００、ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０ゲノムアセンブリ）をサンプリングした。非標的化配列は、スクランブル２０ｂｐ配列（５’－ＧＡＧＡＣＧＧＴＣＴＴＣＧＡＣＧＴＣＴＣ－３’、配列番号５６）からなっていた。ヌクレアーゼ欠損ｄＣａｓ９変異体を、点変異誘発（Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ）によって生成した。製造元の指示に従って、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１（ＭｉｒｕｓＢｉｏ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いたプラスミドトランスフェクションを使用して、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を用いてインビトロで標的配列をスクリーニングした。ｇＤＮＡ（ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット、Ｑｉａｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を単離した後、ＰＣＲによってそれぞれの標的配列を増幅させ、Ａｍｐｌｉｃｏｎ－Ｓｅｑによってインデル頻度を定量化した。インビボ試験のために、以下の標的配列を選択した（ｓｇＲＮＡ ＃７）：
５’－ＴＴＧＣＣＣＡＡＣＣＴＣＴＣＡＡＡＣＧＴ－３’（配列番号３５）。
【0130】
配列決定分析
Ａｍｐｌｉｃｏｎ－Ｓｅｑ：製造元の指示に従って、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、順方向プライマー及び逆方向プライマーの対（表１）を用い、目的の領域を増幅させた。ＮＧＳライブラリーを、１９１ｂｐ産物を用いて生成し、既に記載されているように（Ｗａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１８；３６（８）：７１７－２５）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｖ２キット（１５０ｂｐペアエンド、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して配列決定した。ＮｏｖｏＡｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ、Ｓｅｌａｎｇｏｒ，Ｍａｌａｙｓｉａ）を使用して、マウス参照ゲノムに対してリードペアをマッピングした。更なる分析のために標的領域に対するリードマッピングを保持した。カスタムスクリプトを使用して、４０ｂｐの標的領域（ｃｈｒ７：５９３４６１１０－５９３４６１５０、マウスゲノムアセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ６）におけるインデルを含有するリードの数を決定し、標的領域に対するリードマッピングの合計数の割合（インデル％）として、その数を報告した。
Ａｍｐｌｉｃｏｎ－Ｓｅｑ：製造元の指示に従って、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、順方向プライマー及び逆方向プライマーの対（表１）を用い、目的の領域を増幅させた。ＮＧＳライブラリーを、１９１ｂｐ産物を用いて生成し、既に記載されているように（Ｗａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１８；３６（８）：７１７－２５）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｖ２キット（１５０ｂｐペアエンド、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して配列決定した。ＮｏｖｏＡｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ、Ｓｅｌａｎｇｏｒ，Ｍａｌａｙｓｉａ）を使用して、マウス参照ゲノムに対してリードペアをマッピングした。更なる分析のために標的領域に対するリードマッピングを保持した。カスタムスクリプトを使用して、４０ｂｐの標的領域（ｃｈｒ７：５９３４６１１０－５９３４６１５０、マウスゲノムアセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ６）におけるインデルを含有するリードの数を決定し、標的領域に対するリードマッピングの合計数の割合（インデル％）として、その数を報告した。
【0131】
表１：高齢マウスについての選択されたｓｇＲＮＡを用いた遺伝子編集についてのインビボオフターゲット分析。
Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐ－（母系Ｕｂｅ３ａ－ｋｏ）マウスに、出生時（０日目）にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードするＡＡＶベクターを注射し、４ヶ月後に大脳皮質を採取した。ＩＴＲ－ｓｅｑを行い、オフターゲット遺伝子編集を検出した（群当たり５匹のマウス）。オフターゲット位置での遺伝子又は予測遺伝子を、ＵＳＣＤゲノムブラウザ（ｍｍ１０ゲノムアセンブリ）を使用して特定した。イントロン及びエクソンの両方をクエリした。
Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐ－（母系Ｕｂｅ３ａ－ｋｏ）マウスに、出生時（０日目）にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードするＡＡＶベクターを注射し、４ヶ月後に大脳皮質を採取した。ＩＴＲ－ｓｅｑを行い、オフターゲット遺伝子編集を検出した（群当たり５匹のマウス）。オフターゲット位置での遺伝子又は予測遺伝子を、ＵＳＣＤゲノムブラウザ（ｍｍ１０ゲノムアセンブリ）を使用して特定した。イントロン及びエクソンの両方をクエリした。
【表2】
【0132】
ＡＭＰ－Ｓｅｑ：アンカーマルチプレックスＰＣＲ配列決定（ＡＭＰ－Ｓｅｑ）分析を以下のように実施した。５００ｎｇのゲノムＤＮＡの試料を、以前に報告されているように、Ｃｏｖａｒｉｓ ＭＥ２２０機器を使用して剪断し、ＤＮＡを末端修復し、Ａ－テール化し、アダプターにライゲーションした（Ｗａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１８；３６（８）：７１７－２５、Ｚｈｅｎｇ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１４；２０（１２）：１４７９－８４）。それぞれ、第１及び第２のネステッドＰＣＲ反応において、ＧＳＰ１プライマー及びＧＳＰ２プライマーを使用して、目的の領域を増幅させた。９５℃－５分、［９５℃－３０秒、７０℃（－１℃／サイクル）－２分、７２℃－３０秒］の１５サイクル、［９５℃－３０秒、５５℃－１分、７２℃－３０秒］の１０サイクル、７２℃－５分。
【0133】
プライマー：
ＡＮＧ３Ｍ＿ＧＳＰ１＿Ｐ
５’－ＡＧＣＴＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＴＡＴＡＧＡＣＡＴＧＡＣ－３’（配列番号３８）、
ＡＮＧ３Ｍ＿ＧＳＰ２＿Ｐ
５’－ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＡＡＡＡＴＣＴＣＣＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧ－３’
（配列番号３９）、
ＡＮＧ３Ｍ＿ＧＳＰ１＿Ｎ
５’－ＡＴＴＴＴＴＡＣＧＴＴＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣ－３’（配列番号４０）、
ＡＮＧ３Ｍ＿ＧＳＰ２＿Ｎ
５’－ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＡＣＣＴＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＴＴＧＡＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＧＣ－３’
（配列番号４１）。
ＡＮＧ３Ｍ＿ＧＳＰ１＿Ｐ
５’－ＡＧＣＴＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＴＡＴＡＧＡＣＡＴＧＡＣ－３’（配列番号３８）、
ＡＮＧ３Ｍ＿ＧＳＰ２＿Ｐ
５’－ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＡＡＡＡＴＣＴＣＣＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧ－３’
（配列番号３９）、
ＡＮＧ３Ｍ＿ＧＳＰ１＿Ｎ
５’－ＡＴＴＴＴＴＡＣＧＴＴＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣ－３’（配列番号４０）、
ＡＮＧ３Ｍ＿ＧＳＰ２＿Ｎ
５’－ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＡＣＣＴＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＴＴＧＡＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＧＣ－３’
（配列番号４１）。
【0134】
ライブラリーを構築し、前述のようにＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。本願発明者等の独自のカスタムスクリプトを使用して、ＡＡＶベクターに対応する挿入、欠失、転座、及び挿入を含有するリードを定量化した（Ｗａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１８；３６（８）：７１７－２５）。
【0135】
ＩＴＲ－Ｓｅｑ：ｓｇＲＮＡ＋ＳａＣａｓ９複合体によって媒介されるオフターゲット編集は、逆位末端反復配列決定（ＩＴＲ－Ｓｅｑ）によって決定された（Ｂｒｅｔｏｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０２０；２１（１）：２３９）。簡潔に述べると、ＤＮＡを剪断し、末端修復し、Ａ－テール化し、固有の分子バーコードを含有するアダプターにライゲーションした。次いで、ＤＮＡを、ＡＡＶ－ＩＴＲ特異的プライマー及びアダプター特異的プライマーを使用した２ラウンドのＰＣＲによって増幅させ、ＮＧＳ適合性ライブラリーが得られ、その後に、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。二本鎖切断から得られたＡＡＶ統合部位のゲノム位置（イントロン及びエクソンの位置を含む）を特定するために、カスタムスクリプトを使用した（Ｂｒｅｔｏｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０２０；２１（１）：２３９）。
【0136】
ＡＡＶベクター産生
全てのＡＡＶｈｕ６８（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１８；２９（３）：２８５－９８）及びＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂ（Ｄｅｖｅｒｍａｎ ＢＥ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６；３４（２）：２０４－９）ベクターを、以前に記載されたように産生した（Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；２１（１０）：１２５９－７１）。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、培養上清を回収し、濃縮し、イオジキサノール勾配で精製した。精製したベクターを、以前に記載されているように、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を標的化するプライマーを使用して、ドロップレットデジタルＰＣＲを用いて滴定した（Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４；２５（２）：１１５－２５）。
全てのＡＡＶｈｕ６８（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１８；２９（３）：２８５－９８）及びＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂ（Ｄｅｖｅｒｍａｎ ＢＥ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６；３４（２）：２０４－９）ベクターを、以前に記載されたように産生した（Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；２１（１０）：１２５９－７１）。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、培養上清を回収し、濃縮し、イオジキサノール勾配で精製した。精製したベクターを、以前に記載されているように、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を標的化するプライマーを使用して、ドロップレットデジタルＰＣＲを用いて滴定した（Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４；２５（２）：１１５－２５）。
【0137】
動物
Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙからＣ５６ＢＬ／６Ｊ（ストック番号０００６６４）、Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｕｂｅ３ａｔｍ１Ａｌｂ／Ｊ（０１６５９０）、及びＢ６．１２９Ｓ７－Ｕｂｅ３ａｔｍ２Ａｌｂ／Ｊ（０１７７６５）マウスを購入し、動物をペンシルバニア大学で維持した。雌Ｃ５６ＢＬ／６Ｊマウスを雄Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｕｂｅ３ａｔｍ２Ａｌｂ／Ｊマウスと交配させることによって、又は雄Ｃ５６ＢＬ／６Ｊマウスを雌Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｕｂｅ３ａｔｍ１Ａｌｂ／Ｊマウスと交配させることによって、実験コホートを生成した。遺伝子編集実験のために、同腹仔を無作為に分け、麻酔された新生児マウスにおいて、各側脳室に、１μｌのＡＡＶｈｕ６８ベクターを合計１×１０１１ｇｃ注射した。麻酔した幼若マウス（出生後１４、２１、又は２８日）に、右眼に、５０μｌのＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂベクターを合計１×１０１２ｇｃ、眼窩後の静脈内（ＩＶ）注射した。ＡＡＶベクターを、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で希釈して、適切な用量を達成した。動物を、１ケージ当たり２～５匹の動物で、標準的なケージに収容した。バリア施設のケージ、給水瓶、及び床敷は、オートクレーブ処理し、ケージは、週に１回交換した。自動制御された１２時間の明／暗サイクルが維持され、各々の黒期間は、午後６時に開始された。オートクレーブ処理された実験用げっ歯類の餌及び塩素化された水は、自由摂食で提供された。離乳年齢では、固有の４桁の数字を有する耳タグを適用し、マウスを、ほぼ等しい群サイズのケージ内に無作為に分布させた。組織試料を、遺伝子型決定のために処理した。マウスの観察、試料の処理、及びデータの分析に関与する全ての研究者は、遺伝子型及び治療群に対して盲検であった。統計学的検査を適用するために、初期分析後にデータをグループ分けした。
Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙからＣ５６ＢＬ／６Ｊ（ストック番号０００６６４）、Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｕｂｅ３ａｔｍ１Ａｌｂ／Ｊ（０１６５９０）、及びＢ６．１２９Ｓ７－Ｕｂｅ３ａｔｍ２Ａｌｂ／Ｊ（０１７７６５）マウスを購入し、動物をペンシルバニア大学で維持した。雌Ｃ５６ＢＬ／６Ｊマウスを雄Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｕｂｅ３ａｔｍ２Ａｌｂ／Ｊマウスと交配させることによって、又は雄Ｃ５６ＢＬ／６Ｊマウスを雌Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｕｂｅ３ａｔｍ１Ａｌｂ／Ｊマウスと交配させることによって、実験コホートを生成した。遺伝子編集実験のために、同腹仔を無作為に分け、麻酔された新生児マウスにおいて、各側脳室に、１μｌのＡＡＶｈｕ６８ベクターを合計１×１０１１ｇｃ注射した。麻酔した幼若マウス（出生後１４、２１、又は２８日）に、右眼に、５０μｌのＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂベクターを合計１×１０１２ｇｃ、眼窩後の静脈内（ＩＶ）注射した。ＡＡＶベクターを、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で希釈して、適切な用量を達成した。動物を、１ケージ当たり２～５匹の動物で、標準的なケージに収容した。バリア施設のケージ、給水瓶、及び床敷は、オートクレーブ処理し、ケージは、週に１回交換した。自動制御された１２時間の明／暗サイクルが維持され、各々の黒期間は、午後６時に開始された。オートクレーブ処理された実験用げっ歯類の餌及び塩素化された水は、自由摂食で提供された。離乳年齢では、固有の４桁の数字を有する耳タグを適用し、マウスを、ほぼ等しい群サイズのケージ内に無作為に分布させた。組織試料を、遺伝子型決定のために処理した。マウスの観察、試料の処理、及びデータの分析に関与する全ての研究者は、遺伝子型及び治療群に対して盲検であった。統計学的検査を適用するために、初期分析後にデータをグループ分けした。
【0138】
ベクター生体分布
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を用いて組織ＤＮＡを抽出し、ＴａｑＭａｎ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、プライマー、及びベクターのウシ成長ホルモン配列を標的化するプローブを使用したリアルタイムＰＣＲによって、ベクターゲノ
ムを定量化した。
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を用いて組織ＤＮＡを抽出し、ＴａｑＭａｎ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、プライマー、及びベクターのウシ成長ホルモン配列を標的化するプローブを使用したリアルタイムＰＣＲによって、ベクターゲノ
ムを定量化した。
【0139】
ウエスタンブロッティング
ＲＩＰＡ緩衝液中の凍結した大脳皮質を溶解させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、総タンパク質４５μｇを分離した。導入の後、ＴＰＢＳ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ）中の１％ＢＳＡでＰＶＤＦ膜をブロッキングし、以下の抗体の１つを用いて一晩インキュベートした。抗Ｕｂｅ３ａ ｍＡｂ（６１１４１６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、抗ＧＦＰ ｐＡｂ（ＧＦＰ－１０１０、Ａｖｅｓ Ｌａｂｓ、Ｄａｖｉｓ，ＣＡ）、又は抗ベータアクチンｍＡｂ（ＭＡ５－１５７３９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。ＨＲＰにコンジュゲートされた二次抗体を用いてインキュベーションした後、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステムで、Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット（１７０－５０６０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ウエスタンブロットを可視化した。それぞれの個々のウエスタンブロッティング実験を、独立して少なくとも３回実施した。
ＲＩＰＡ緩衝液中の凍結した大脳皮質を溶解させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、総タンパク質４５μｇを分離した。導入の後、ＴＰＢＳ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ）中の１％ＢＳＡでＰＶＤＦ膜をブロッキングし、以下の抗体の１つを用いて一晩インキュベートした。抗Ｕｂｅ３ａ ｍＡｂ（６１１４１６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、抗ＧＦＰ ｐＡｂ（ＧＦＰ－１０１０、Ａｖｅｓ Ｌａｂｓ、Ｄａｖｉｓ，ＣＡ）、又は抗ベータアクチンｍＡｂ（ＭＡ５－１５７３９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。ＨＲＰにコンジュゲートされた二次抗体を用いてインキュベーションした後、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステムで、Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット（１７０－５０６０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ウエスタンブロットを可視化した。それぞれの個々のウエスタンブロッティング実験を、独立して少なくとも３回実施した。
【0140】
組織学
マウスを麻酔し、ＤＰＢＳで末端灌流し、全脳を速やかに回収した。矢状方向に切開した脳の半分を、１０％の中性緩衝化ホルマリンでおよそ２４時間、浸漬固定し、ＰＢＳで短時間洗浄し、７０％エタノールで平衡化した後、パラフィンに包埋し、１０μｍ厚さの切片に切断した。生化学分析のために、脳のもう半分をドライアイスで急速凍結させた。ホルマリン固定パラフィン包埋脳試料に対して、ＹＦＰの免疫蛍光及びＵＢＥ３Ａの免疫組織化学を行った。免疫蛍光染色のために、切片を脱パラフィン化し、抗原賦活化のために１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間煮沸し、ＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ中の１％ロバ血清で１５分間ブロッキングし、次いで、抗ＧＦＰ抗体（Ａ－１１１２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及び抗ＮｅｕＮ抗体（ＡＢＮ９０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）とともに１：５００希釈で１時間インキュベートした。洗浄した後、試料を、蛍光標識した二次抗体（抗ウサギＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８及び抗モルモットＩｇＧ－Ｃｙ５コンジュゲート［Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ］）とともに１：２００希釈で４５分間インキュベートした。免疫組織化学的染色のために、切片を脱パラフィン化し、抗原賦活化のために１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間煮沸し、２％Ｈ２Ｏ２（１０分間）、アビジン及びビオチンブロッキング試薬（各１５分、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、並びにブロッキング緩衝液（０．２％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳ中の１％ロバ血清で１０分間）で順次処理した。次いで、切片を、抗ＵＢＥ３Ａマウス抗体（６１１４１６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とともに１：５００で１時間インキュベートし、次いでブロッキング緩衝液で希釈したビオチン化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）とともに４５分間インキュベートした。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造元の指示に従って、３，３’－ジアミノベンジジンを基質として使用して、結合した抗体を褐色沈殿物として染色した。画像をＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｅ顕微鏡で取得し、Ａｐｅｒｉｏ
Ｖｅｒｓａスライドスキャナを用い、全脳切片をスキャンした。
マウスを麻酔し、ＤＰＢＳで末端灌流し、全脳を速やかに回収した。矢状方向に切開した脳の半分を、１０％の中性緩衝化ホルマリンでおよそ２４時間、浸漬固定し、ＰＢＳで短時間洗浄し、７０％エタノールで平衡化した後、パラフィンに包埋し、１０μｍ厚さの切片に切断した。生化学分析のために、脳のもう半分をドライアイスで急速凍結させた。ホルマリン固定パラフィン包埋脳試料に対して、ＹＦＰの免疫蛍光及びＵＢＥ３Ａの免疫組織化学を行った。免疫蛍光染色のために、切片を脱パラフィン化し、抗原賦活化のために１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間煮沸し、ＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ中の１％ロバ血清で１５分間ブロッキングし、次いで、抗ＧＦＰ抗体（Ａ－１１１２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及び抗ＮｅｕＮ抗体（ＡＢＮ９０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）とともに１：５００希釈で１時間インキュベートした。洗浄した後、試料を、蛍光標識した二次抗体（抗ウサギＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８及び抗モルモットＩｇＧ－Ｃｙ５コンジュゲート［Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ］）とともに１：２００希釈で４５分間インキュベートした。免疫組織化学的染色のために、切片を脱パラフィン化し、抗原賦活化のために１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間煮沸し、２％Ｈ２Ｏ２（１０分間）、アビジン及びビオチンブロッキング試薬（各１５分、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、並びにブロッキング緩衝液（０．２％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳ中の１％ロバ血清で１０分間）で順次処理した。次いで、切片を、抗ＵＢＥ３Ａマウス抗体（６１１４１６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とともに１：５００で１時間インキュベートし、次いでブロッキング緩衝液で希釈したビオチン化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）とともに４５分間インキュベートした。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造元の指示に従って、３，３’－ジアミノベンジジンを基質として使用して、結合した抗体を褐色沈殿物として染色した。画像をＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｅ顕微鏡で取得し、Ａｐｅｒｉｏ
Ｖｅｒｓａスライドスキャナを用い、全脳切片をスキャンした。
【0141】
遺伝子発現分析
ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ及びＤＮＡｓｅＩキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）、その後、ｃＤＮＡ合成（Ｍａｘｉｍａ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、急速凍結した大脳皮質から抽出した。ＳＹＢＲ緑色ｑＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍ
ｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、以前に公開されたプライマー（Ｍｅｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５１８（７５３９）：４０９－１２）、又は表１に列挙されているプライマーを用いて、ＡＢＩ７５００サーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）について製造元の指示に従って、各試料について３回ずつ実施した。
ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ及びＤＮＡｓｅＩキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）、その後、ｃＤＮＡ合成（Ｍａｘｉｍａ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、急速凍結した大脳皮質から抽出した。ＳＹＢＲ緑色ｑＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍ
ｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、以前に公開されたプライマー（Ｍｅｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５１８（７５３９）：４０９－１２）、又は表１に列挙されているプライマーを用いて、ＡＢＩ７５００サーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）について製造元の指示に従って、各試料について３回ずつ実施した。
【0142】
行動評価
母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウスの行動表現型は、十分に特性評価されており（１２～１６）、母系Ｕｂｅ３ａ発現を遺伝的に回復させることによって改善することができる（Ｓｏｎｚｏｇｎｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｕｔｉｓｍ．２０１８；９：４７）。マウスは、離乳後に群ごとに収容され、遺伝子型及び治療によって混合された。行動分析を開始する数日前に、各動物の体重を決定した。各試験の前に、マウスを、そのホームケージ中の試験室に３０分間適応させた。全ての行動実験は、明／暗サイクルの午後の明期間中に実施された。実験のために、８～１０週齢の雄マウス及び雌マウスの両方を使用した。試験後、マウスは、速やかに保持室へ戻された。収容ケージは、透明なポリカーボネートプラスチック（７．７５×１２×５インチ）で構成されていた。提示されたデータは、３つの独立した実験コホートからの累積結果に基づく。同じセットのブリーダーを使用して、それらの実験コホートを生成した。
母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウスの行動表現型は、十分に特性評価されており（１２～１６）、母系Ｕｂｅ３ａ発現を遺伝的に回復させることによって改善することができる（Ｓｏｎｚｏｇｎｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｕｔｉｓｍ．２０１８；９：４７）。マウスは、離乳後に群ごとに収容され、遺伝子型及び治療によって混合された。行動分析を開始する数日前に、各動物の体重を決定した。各試験の前に、マウスを、そのホームケージ中の試験室に３０分間適応させた。全ての行動実験は、明／暗サイクルの午後の明期間中に実施された。実験のために、８～１０週齢の雄マウス及び雌マウスの両方を使用した。試験後、マウスは、速やかに保持室へ戻された。収容ケージは、透明なポリカーボネートプラスチック（７．７５×１２×５インチ）で構成されていた。提示されたデータは、３つの独立した実験コホートからの累積結果に基づく。同じセットのブリーダーを使用して、それらの実験コホートを生成した。
【0143】
加速ロータロッド：加速回転ロータロッドを使用して、運動機能を試験した（４～４０ｒｐｍで５分間、モデル７６５０、Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｖａｒｅｓｅ，Ｉｔａｌｙ）。マウスに対し、連続した３日間にわたって（各日同じ時間）、１５分間の試験間隔で、１日当たり３回の試行を行った。各日について、マウスがロータロッド上で落下するまでに費やした平均時間（秒単位での潜時）を計算した。マウスが、ロータロッド上で３回の連続したラッピング／受動回転を達成したときに、３回目の回転が終わった時間を潜時として記録し、マウスを除去した。
【0144】
オープンフィールド活動試験：ロコモ度活動（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を試験するために、最小限の量の床敷で底部を覆った新しい収容ケージに個々にマウスを入れた。このケージを、赤外線クロスビームのアレイ（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆａｘ，ＶＴ）に置いた。マウスを３０分間自由に探索させ、ビームを遮った数を活動の尺度として自動的に記録した。ビームを遮った数を、分析のための持続時間５分で、瓶において合計した。
【0145】
ガラス玉覆い隠し試験：収容ケージに、５ｃｍの床敷材料（Ａｌｐｈａ－Ｄｒｉ，Ｌａｂ Ｓｕｐｐｌｙ，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）を充填した。床敷材料の上に、等距離の３×４のグリッドに並べた１２個の青色ガラス玉を並べた。動物に、３０分間、ガラス玉へのアクセスを許可した。試験の後、マウスをケージから除去し、床敷によって５０％より多く覆われていたガラス玉を、覆い隠されたものとしてスコア付けした。この試験で測定した結果は、覆い隠されたガラス玉の数であった。
【0146】
営巣試験：営巣能力を測定するために、マウスを新しいケージに単独で収容し、事前に計量された正方形のネストレット（２×２×０．２５インチ）を提供した。２４時間後、マウスは、元々のホームケージに戻され、巣の品質は、既に記載されているように、１～５のスケールでスコア付けされた（Ｄｅａｃｏｎ ＲＭ．Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２００６；１（３）：１１１７－９）。残った引き裂かれていないネストレットを計量し、元の重量に対する残りのネストレットの分数を算出した。
【0147】
統計
Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を統計
分析のために使用した。一元配置又は二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ検定、その後、アルファ値０．０５を用いた事後テューキー又はシダックのペアワイズ比較を適用することによって、複数の群を比較した。群平均は、平均＋／－ＳＥＭとして提示される。群当たり１０個未満のデータ点が存在する場合、個々のデータ点もグラフに示される。得られた全てのデータ点を、統計分析に使用した。
Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を統計
分析のために使用した。一元配置又は二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ検定、その後、アルファ値０．０５を用いた事後テューキー又はシダックのペアワイズ比較を適用することによって、複数の群を比較した。群平均は、平均＋／－ＳＥＭとして提示される。群当たり１０個未満のデータ点が存在する場合、個々のデータ点もグラフに示される。得られた全てのデータ点を、統計分析に使用した。
【0148】
実施例２－ＵＢＥ３Ａアンチセンス転写産物の編集後の父系ＵＢＥ３Ａの発現の回復。
遺伝子編集によるゲノム配列の操作は、遺伝子変異を修正するための強力なツールであるが、ニューロン等の有糸分裂後の細胞におけるインビボでの使用には、大部分が利用することができなかった。しかしながら、遺伝子編集は、インデル形成と呼ばれる、塩基対の欠失及び挿入によって遺伝子コードを破壊するための細胞型の独立したツールとして使用することもできる。ここでは、Ｕｂｅ３ａ遺伝子の遺伝子座の下流にあるＵｂｅ３ａ－ＡＴＳ配列内のインデル形成が、Ｕｂｅ３遺伝子の遺伝子座にわたってマウスＵｂｅ３ａ－ＡＴＳの伸長を防止し、父系Ｕｂｅ３ａ発現を引き起こし、母系Ｕｂｅ３ａ欠損マウスにおけるアンジェルマン表現型を改善することができることを示す。
遺伝子編集によるゲノム配列の操作は、遺伝子変異を修正するための強力なツールであるが、ニューロン等の有糸分裂後の細胞におけるインビボでの使用には、大部分が利用することができなかった。しかしながら、遺伝子編集は、インデル形成と呼ばれる、塩基対の欠失及び挿入によって遺伝子コードを破壊するための細胞型の独立したツールとして使用することもできる。ここでは、Ｕｂｅ３ａ遺伝子の遺伝子座の下流にあるＵｂｅ３ａ－ＡＴＳ配列内のインデル形成が、Ｕｂｅ３遺伝子の遺伝子座にわたってマウスＵｂｅ３ａ－ＡＴＳの伸長を防止し、父系Ｕｂｅ３ａ発現を引き起こし、母系Ｕｂｅ３ａ欠損マウスにおけるアンジェルマン表現型を改善することができることを示す。
【0149】
Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳにインデルを導入するために、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳコード配列の１２ｋｂセグメント内の異なる部位を標的化する１２個の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を最初にスクリーニングした（図２Ａ、表２）。既知の発現された遺伝子の遺伝子座以外の標的を選択することを目的とした。それぞれの標的部位でのＣａｓ９によって誘導されるインデルを、Ａｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑによって評価した（図２Ｂ）。次いで、ｓｇＲＮＡ ＃７（図２Ｂ）及びＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９コード配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドを構築した。ヒトシナプシンプロモーター（１３、１４）を使用して、マウス脳のニューロンにおいてＣａｓ９発現を選択的に駆動した。脳室内（ＩＣＶ）注射によるＡＡＶ遺伝子編集ベクター（本願発明者らはＡＴＳ－ＧＥと称する）の新生物マウス脳への送達は、全ての脳細胞の１４．７％（８．６～２１．７％）においてゲノムインデルを形成した（図２Ｃ）。非標的化（ＮＴ）ｓｇＲＮＡ又はヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のいずれかを発現したとき、インデル形成は、バックグラウンド頻度に留まっていた（それぞれ０．１７％又は０．０４％、図２Ｃ）。インデル形成は、新生物ＩＣＶベクター送達後に最も高かった。ＰＨＰ．Ｂカプシドは、任意の年齢で静脈内（ＩＶ）送達によってマウス脳の非常に効率的な形質導入を促進する（１５）。しかしながら、ＡＴＳ－ＧＥが１４～２８日齢で送達されたとき、はるかに低いインデル頻度が観察され（０．６～２．９％、図２Ｃ）、このことは、新生時マウス脳へのＩＣＶ注射が、このプロジェクトのための効率的な遺伝子編集にとって最も適していることを示唆している。この考え方の裏付けとして、新生児脳へのＩＣＶ注射後の脳組織に存在するベクターゲノムの量は、出生から１４、２１、又は２８日後のＩＶ注射後の形質導入（二倍体ゲノム当たり０．０４～０．１９ＧＣ、図５Ａ）と比較して、はるかに多かった［二倍体ゲノム当たり平均２．３ゲノムコピー（ＧＣ）］。アンカーマルチプレックスＰＣＲ配列決定（ＡＭＰ－Ｓｅｑ）を使用した標的部位の追加の分析は、新生児ＩＣＶ送達後のほとんどの編集事象が、１５ｂｐ未満の実際に短いインデルであり、編集部位でのみ、ベクター編集部分の統合が、２．８％の頻度で観察されたことを示した（図５Ｂ）。計算分析は、マウスゲノム全体にわたって、本願発明者等が選択したｓｇＲＮＡについて追加の直接のマッチは予測されず、少なくとも４個のミスマッチを含む最も近い類似性を有していた。したがって、逆位末端反復配列決定（ＩＴＲ－Ｓｅｑ）は、ＡＴＳ－ＧＥを有する標的化された編集のための小さなゲノム全体のオフターゲット率（１．３％）のみを明らかにした（表３）。新生児ＡＴＳ－ＧＥベクター送達から３、８、又は１４週後の皮質細胞について分子分析を行うと、インデルが同様の頻度で存在することがわかった（図２Ｄ）。この結果は、編集されたＵｂｅ３ａ－ＡＴＳ配列を有するニューロンが、成体マウス脳に存在することを示唆している。
【表3】
【0150】
表３：選択されたｓｇＲＮＡを用いた遺伝子編集についてのインビボオフターゲット分析。
Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐＹＦＰ（父系Ｕｂｅ３ａ－ＹＦＰ）マウスに、出生時（０日目）にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードするＡＡＶベクターを注射し、２１日後に大脳皮質を採取した。オフターゲット遺伝子編集を検出するためにＩＴＲ－ｓｅｑを行った（群当たり３匹のマウス）。
Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐＹＦＰ（父系Ｕｂｅ３ａ－ＹＦＰ）マウスに、出生時（０日目）にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードするＡＡＶベクターを注射し、２１日後に大脳皮質を採取した。オフターゲット遺伝子編集を検出するためにＩＴＲ－ｓｅｑを行った（群当たり３匹のマウス）。
【表4】
【0151】
Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳは、父系対立遺伝子上のＵｂｅ３ａ転写産物の伸長と干渉し、父系対立遺伝子からのＵｂｅ３ａ発現をブロックする。ＡＳのための有望な治療アプローチは、父系対立遺伝子上のＵｂｅ３ａ遺伝子の遺伝子座にわたるＵｂｅ３ａ－ＡＴＳの伸長を阻止し、全長Ｕｂｅ３ａ転写産物形成を可能にし、したがって、タンパク質発現を可能に
することに依存する。したがって、次に、本願発明者らの試験で観察されたインデル形成が、Ｕｂｅ３ａ父系対立遺伝子にわたるＵｂｅ３ａ－ＡＴＳの伸長を抑制することができるかどうかを評価した。父系対立遺伝子からのＵｂｅ３ａ発現を明確に検出するために、野生型雌マウスとｓｎ融合遺伝子を有する雄マウスとを交配させた（１６）。ＡＴＳ－ＧＥベクターをＩＣＶ注射された新生仔は、２１日後にＵｂｅ３ａ－ＹＦＰ融合タンパク質の発現を示した（図２Ｅ、図２Ｆ）。免疫蛍光染色は、ニューロンの４８．１％において、遺伝子編集後の皮質全体にわたってＵｂｅ３ａ－ＹＦＰの発現を明らかにした（図２Ｇ、及び１３，０００個のＮｅｕＮ＋細胞の定量化、ＳＥＭ＝８．６％）。ＡＴＳ－ＧＥベクター中の標的化ｓｇＲＮＡを、非標的化ｓｇＲＮＡと置き換えたとき、又はＣａｓ９をｄＣａｓ９と置き換えたとき、Ｕｂｅ３ａ－ＹＦＰ発現は観察されなかった（図５Ｄ及び図５Ｄ）。分子分析から、父系対立遺伝子からのＵｂｅ３ａ－ＡＴＳ発現が、Ｕｂｅ３ａ遺伝子の遺伝子座内で減少したことが明らかになった（図２Ｈ）。対照的に、遺伝子編集位置とインプリンティングセンター（ＩＣ）との間に位置する遺伝子の発現は、影響を受けなかった（Ｓｎｒｐｎ、Ｓｎｏｒｄ１１５、又はＳｎｏｒｄ１１６、図２Ｉ）。したがって、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ内の選択的かつ効率的な遺伝子編集は、以前にサイレンシングされた父系Ｕｂｅ３ａ対立遺伝子からのＵｂｅ３ａタンパク質発現をもたらす。
することに依存する。したがって、次に、本願発明者らの試験で観察されたインデル形成が、Ｕｂｅ３ａ父系対立遺伝子にわたるＵｂｅ３ａ－ＡＴＳの伸長を抑制することができるかどうかを評価した。父系対立遺伝子からのＵｂｅ３ａ発現を明確に検出するために、野生型雌マウスとｓｎ融合遺伝子を有する雄マウスとを交配させた（１６）。ＡＴＳ－ＧＥベクターをＩＣＶ注射された新生仔は、２１日後にＵｂｅ３ａ－ＹＦＰ融合タンパク質の発現を示した（図２Ｅ、図２Ｆ）。免疫蛍光染色は、ニューロンの４８．１％において、遺伝子編集後の皮質全体にわたってＵｂｅ３ａ－ＹＦＰの発現を明らかにした（図２Ｇ、及び１３，０００個のＮｅｕＮ＋細胞の定量化、ＳＥＭ＝８．６％）。ＡＴＳ－ＧＥベクター中の標的化ｓｇＲＮＡを、非標的化ｓｇＲＮＡと置き換えたとき、又はＣａｓ９をｄＣａｓ９と置き換えたとき、Ｕｂｅ３ａ－ＹＦＰ発現は観察されなかった（図５Ｄ及び図５Ｄ）。分子分析から、父系対立遺伝子からのＵｂｅ３ａ－ＡＴＳ発現が、Ｕｂｅ３ａ遺伝子の遺伝子座内で減少したことが明らかになった（図２Ｈ）。対照的に、遺伝子編集位置とインプリンティングセンター（ＩＣ）との間に位置する遺伝子の発現は、影響を受けなかった（Ｓｎｒｐｎ、Ｓｎｏｒｄ１１５、又はＳｎｏｒｄ１１６、図２Ｉ）。したがって、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ内の選択的かつ効率的な遺伝子編集は、以前にサイレンシングされた父系Ｕｂｅ３ａ対立遺伝子からのＵｂｅ３ａタンパク質発現をもたらす。
【0152】
次に、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ遺伝子編集が、父系対立遺伝子からのＵｂｅ３ａの発現を駆動し、母系Ｕｂｅ３ａ－ノックアウト（ＫＯ）マウスのニューロンにおけるＵｂｅ３ａ発現を回復し、マウスＡＳ表現型を改善するかどうかを調査した。ＡＴＳ－ＧＥベクターを新生児母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯ仔及び野生型同腹仔にＩＣＶ注射によって投与した。次いで、４ヶ月のインキュベーションの後に、脳全体にわたってＵｂｅ３ａタンパク質の発現を観察した（図３Ａ）。脳全体のニューロンにおけるＵｂｅ３ａの発現を検出した（図３Ｂ及び図６Ａ）。脳全体にわたってＵｂｅ３ａ陽性ニューロンを観察し（図６Ｂ、図６Ｃ）、基底前脳領域において、発現がより豊富であるように思われた。発現効率が、脳領域と機能的下位構造との間で変化するかどうかを調査するためには、より大きな、より包括的な試験が必要となるが、これは、現在の調査の範囲を超えていた。
【0153】
対照ＡＡＶベクター（非標的化Ｃａｓ９又は標的化ｄＣａｓ９配列を有する）を受けたマウスは、父系対立遺伝子からのＵｂｅ３ａ発現を示さなかった（図７Ａ及び図７Ｂ）。Ａｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑによる分子分析から、インデル頻度が平均１９．４％で生じたことが明らかになり（図３Ｆ）、これは、以前の短期間試験からの観察結果に匹敵するものである（図２Ｃ）。遺伝子編集部位でのベクター統合は、以前に観察されたように（図５Ａ）、低かった（ＡＭＰ－ｓｅｑ、２．１％、図７Ｃ）。ＩＴＲ－ｓｅｑによるオフターゲット分析は、以前の短期間試験（表３）と比較して、オフターゲット効果の割合の増加を示さなかった（表１）。唯一の特定された２つのオフターゲット部位は、イントロン又はアノテーションされていないゲノム領域に位置していた。ＡＴＳ－Ｕｂｅ３ａ転写産物レベルは、遺伝子編集後のＵｂｅ３ａ－ＫＯマウス脳において有意に減少した（図３Ｇ）。転写産物レベルは、遺伝子編集部位からインプリンティングセンターに向かって約４ｋｂ正規化されていることがわかった。
【0154】
母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウスの行動表現型は、十分に特性評価されており、母系Ｕｂｅ３ａ発現を遺伝的に回復させることによって改善することができる。ＡＳＯによる治療は、Ｕｂｅ３ａ遺伝子座にわたってＵｂｅ３ａ－ＡＴＳの伸長を一時的に抑制し、脳全体にわたってニューロンにおける父系Ｕｂｅ３ａ発現をもたらし、その後に行動表現型の改善をもたらす。このアプローチは、マウス脳全体にわたってはるかに多い数のニューロンにおいてＵｂｅ３ａ発現を回復するため、限られた数のニューロンにおいてＵｂｅ３ａ－ＡＴＳの遺伝子編集が母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯ表現型を改善することができるかどうかを考えた。新生児マウスにＡＴＳ－ＧＥベクターをＩＣＶ注射し、４ヶ月齢までそれらをモニタリングした。Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ遺伝子編集は、治療関連の死亡事象を伴わずに、良好に
忍容性であった。予想されるように、体重増加は、ＡＳマウスにおいて有意に高く、観察期間中のＡＴＳ－ＧＥ治療後に減少する傾向を示した（図４Ａ）。２ヶ月齢で、マウスに対し、このマウスモデルで広く使用されてきた一連の行動試験を行った（１７）。母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウスは、ロータロッドを用いて試験された場合、その野生型同腹仔と比較して、運動機能において予測された有意な欠損を示した（図４Ｂ）。遺伝子編集された母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウスは、試験の２日目及び３日目に運動機能の有意な改善を示した（図４Ｂ）。同様に、母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウスでは、ガラス玉覆い隠し及び営巣行動が低下したが、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ遺伝子編集後に有意に改善した（図４Ｃ、図４Ｄ）。オープンフィールド試験における歩行活動は、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ遺伝子編集後の母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウスにおいて、活動低下の改善に向けてあまり大きくないが一貫した傾向を示した（図４Ｅ）。要約すると、ニューロンのサブセットにおいてＵｂｅ３ａ－ＡＴＳを抑制することによってＵｂｅ３ａ発現を回復させることで、母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯ表現型の複数の行動的態様を有意に改善した。Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ遺伝子編集が、脳波変化等の他の母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウス表現型を改善するかどうかは、まだ調査されていない。
忍容性であった。予想されるように、体重増加は、ＡＳマウスにおいて有意に高く、観察期間中のＡＴＳ－ＧＥ治療後に減少する傾向を示した（図４Ａ）。２ヶ月齢で、マウスに対し、このマウスモデルで広く使用されてきた一連の行動試験を行った（１７）。母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウスは、ロータロッドを用いて試験された場合、その野生型同腹仔と比較して、運動機能において予測された有意な欠損を示した（図４Ｂ）。遺伝子編集された母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウスは、試験の２日目及び３日目に運動機能の有意な改善を示した（図４Ｂ）。同様に、母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウスでは、ガラス玉覆い隠し及び営巣行動が低下したが、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ遺伝子編集後に有意に改善した（図４Ｃ、図４Ｄ）。オープンフィールド試験における歩行活動は、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ遺伝子編集後の母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウスにおいて、活動低下の改善に向けてあまり大きくないが一貫した傾向を示した（図４Ｅ）。要約すると、ニューロンのサブセットにおいてＵｂｅ３ａ－ＡＴＳを抑制することによってＵｂｅ３ａ発現を回復させることで、母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯ表現型の複数の行動的態様を有意に改善した。Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ遺伝子編集が、脳波変化等の他の母系Ｕｂｅ３ａ－ＫＯマウス表現型を改善するかどうかは、まだ調査されていない。
【0155】
この試験は、以下の２つの重要な所見を示した。（ｉ）効率的な遺伝子編集は、新生児脳室内ＡＡＶ送達によって、マウス脳において達成することができ、（ｉｉ）ニューロンのサブセットにおけるＵｂｅ３ａの発現は（配列決定データに基づいて最大２０％）、ＡＳマウスモデルにおける治療的利益を提供する。不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）の発現が、Ｕｂｅ３ａタンパク質発現を引き起こさなかったため、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性は、Ｕｂｅ３ａタンパク質発現を達成するために必要であった。
【0156】
特に病的な対立遺伝子の破壊が遺伝性障害の根治治療のための有望性を保持しているため、ＣＮＳは、治療的ゲノム編集のための有望な標的として認識されている（１８～２０）。治療的ＣＮＳ遺伝子編集についての最近の試験は、例えば、ハンチントン病マウスモデルの線条体への（２１）、筋萎縮性側索硬化症マウスモデルの脊髄への（２２）、又は家族製アルツハイマー病のマウスモデルの海馬への（２３）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体の局所送達を介して、有望な結果を達成している。しかしながら、異なる脳領域にわたって編集が達成される必要がある場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、ヒト患者において治療的利益を達成するのに十分な数のニューロンを首尾良く編集することができるかどうかは、示されないままである。本願発明者らの試験は、これがマウス脳において可能であり、疾患表現型の有意な改善をもたらすことができることを示す。ＡＳについては、多くの他の遺伝性ＣＮＳ障害と同様に、治療的利益を引き起こすための疾患遺伝子再発源の必要な効率についてはほとんど知られていない。本願発明者らの試験は、Ｕｂｅ３ａの再発現が全てのニューロンにおいて必要ではないことを示唆している。Ｕｂｅ３ａ又はＡＳＯ媒介性Ｕｂｅ３ａ発現の遺伝子復元を使用した以前の試験は、Ｕｂｅ３ａを発現するニューロンの数がはるかに多いことに起因して、より大きな行動改善の効果サイズを示した（８、１１、１２）。本願発明者らの試験は、ＵＢＥ３Ａの非効率的な発現が、患者における治療効果に変換されるのに既に十分である可能性があるため、更なる翻訳及び臨床ＡＳ研究を奨励している。また、ＡＡＶベクター挿入を有するＵｂｅ３ａ－ＡＴＳ内のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性の２４５ｋｂ切片の置き換えによる最近の試験は、ＡＳマウスモデルにおける限られた神経行動の改善が報告された（２４）。
【0157】
本願発明者らの試験は、インデル形成が、長く続く父系Ｕｂｅ３ａ発現を選択的に可能にする短縮されたＵｂｅ３ａ－ＡＴＳをもたらすかどうかについての可能性がある機構には直接的に対処していない。Ｕｂｅ３ａ遺伝子座の二次元又は三次元ゲノム構造が、Ｕｂｅ３ａ及びＵｂｅ３ａ－ＡＴＳの拮抗性遺伝子発現調節において役割を果たし得ると推測することしかできない。代替的に、又は追加的に、極めて長い父系Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ転写産物が、父系センスＵｂｅ３ａ転写産物の存在下で早期終止する傾向がある可能性があ
ると推測する。遺伝子編集は、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ転写産物の初期の転写停止を引き起こす場合があり、Ｕｂｅ３ａセンス転写産物の形成を可能にし、この状況は、二本鎖修復が完了した後でさえ持続する。別の可能な作用機序としては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９がＲＮＡ転写産物を切断する能力が挙げられ（２５）、このことはＵｂｅ３ａ発現を維持するためにＣａｓ９の構成的発現を必要とする可能性が高いが、全てのＵｂｅ３ａを発現するＡＳマウス脳において、持続的なＣａｓ９発現を観察しなかった（データは示さず）。最後に、最近の試験（２４）において観察されたように、ＡＡＶベクター配列の統合は、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳの早期終止をもたらすことができる。全ての検出された統合が、４ヶ月にわたって依然として２～３％のままであったことを考慮すると、この機構は、検出されたＵｂｅ３ａ発現に寄与し得るが、全てが単独で寄与する可能性は低い。
ると推測する。遺伝子編集は、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ転写産物の初期の転写停止を引き起こす場合があり、Ｕｂｅ３ａセンス転写産物の形成を可能にし、この状況は、二本鎖修復が完了した後でさえ持続する。別の可能な作用機序としては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９がＲＮＡ転写産物を切断する能力が挙げられ（２５）、このことはＵｂｅ３ａ発現を維持するためにＣａｓ９の構成的発現を必要とする可能性が高いが、全てのＵｂｅ３ａを発現するＡＳマウス脳において、持続的なＣａｓ９発現を観察しなかった（データは示さず）。最後に、最近の試験（２４）において観察されたように、ＡＡＶベクター配列の統合は、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳの早期終止をもたらすことができる。全ての検出された統合が、４ヶ月にわたって依然として２～３％のままであったことを考慮すると、この機構は、検出されたＵｂｅ３ａ発現に寄与し得るが、全てが単独で寄与する可能性は低い。
【0158】
Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳのゲノム編成及び調節、並びにインプリンティング制御センターは、マウスとヒトとの間で高度に保存されているが（１１）、ＤＮＡ配列は、これら２つの種では非常に異なっている。ヒトにおける類似のゲノム位置を標的化するマウスｓｇＲＮＡの再設計は、翻訳試験に必要な前提条件であろう。遺伝子編集によるＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳの干渉は、ＡＳ患者のニューロンにおいてＵＢＥ３Ａ発現を同様に回復させることができると予想される。
【0159】
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Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｌｉｆｅｓｐａｎ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｍｏｔｏｒ Ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ａ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１９；１７：８２９－３９．
２２．Ｇａｊ Ｔ，Ｏｊａｌａ ＤＳ，Ｅｋｍａｎ ＦＫ，Ｂｙｒｎｅ ＬＣ，Ｌｉｍｓｉｒｉｃｈａｉ Ｐ，ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＤＶ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ
ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｄｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＡＬＳ．Ｓｃｉ Ａｄｖ．２０１７；３（１２）：ｅａａｒ３９５２．
２３．Ｇｙｏｒｇｙ Ｂ，Ｌｏｏｖ Ｃ，Ｚａｂｏｒｏｗｓｋｉ ＭＰ，Ｔａｋｅｄａ Ｓ，Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ＢＰ，Ｃｏｍｍｉｎｓ Ｃ，ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｗｅｄｉｓｈ ＡＰＰ Ａｌｌｅｌｅ ａｓ ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ
Ｅａｒｌｙ－Ｏｎｓｅｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１８；１１：４２９－４０．
２４．Ｗｏｌｔｅｒ ＪＭ，Ｍａｏ Ｈ，Ｆｒａｇｏｌａ Ｇ，Ｓｉｍｏｎ ＪＭ，Ｋｒａｎｔｚ ＪＬ，Ｂａｚｉｃｋ ＨＯ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｒａｐｓ Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ．２０２０．
２５．Ｓｔｒｕｔｔ ＳＣ，Ｔｏｒｒｅｚ ＲＭ，Ｋａｙａ Ｅ，Ｎｅｇｒｅｔｅ ＯＡ，ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ ＪＡ．ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．ｅＬｉｆｅ．２０１８；７．
１．Ｂｕｉｔｉｎｇ Ｋ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｃ，ａｎｄ Ｈｏｒｓｔｈｅｍｋｅ Ｂ．Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ａ ｒａｒｅ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１６．
２．Ｄａｇｌｉ Ａ，Ｂｕｉｔｉｎｇ Ｋ，ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＣＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ａｎｇｅｌｍａｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｍｏｌ Ｓｙｎｄｒｏｍｏｌ．２０１２；２（３－５）：１００－１２．
３．Ａｌｂｒｅｃｈｔ Ｕ，Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ ＪＳ，Ｃａｔｔａｎａｃｈ ＢＭ，Ｂｅｅｃｈｅｙ ＣＶ，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ Ｄ，Ｅｉｃｈｅｌｅ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｇｅｎｅ，Ｕｂｅ３ａ，ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ａｎｄ
Ｐｕｒｋｉｎｊｅ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９７；１７（１）：７５－８．
４．Ｋｉｓｈｉｎｏ Ｔ，Ｌａｌａｎｄｅ Ｍ，ａｎｄ Ｗａｇｓｔａｆｆ Ｊ．ＵＢＥ３Ａ／Ｅ６－ＡＰ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｃａｕｓｅ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９７；１５（１）：７０－３．
５．Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｔ，Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ ＪＳ，Ｆａｎｇ Ｐ，Ｇａｌｊａａｒｄ ＲＪ，Ｊｉａｎｇ ＹＨ，Ｂｅｎｔｏｎ ＣＳ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅ ｎｏｖｏ ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｅ６－ＡＰ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｇｅｎｅ（ＵＢＥ３Ａ）ｉｎ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９７；１５（１）：７４－７．
６．Ｋｅｕｔｅ Ｍ，Ｍｉｌｌｅｒ ＭＴ，Ｋｒｉｓｈｎａｎ ＭＬ，Ｓａｄｈｗａｎｉ
Ａ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ Ｓ，Ｔｈｉｂｅｒｔ ＲＬ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｍａｎｉｆｅｓｔ ｖａｒｙｉｎｇ ｄｅｇｒｅｅｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ．Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０２０．
７．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ＳＪ，ａｎｄ Ｂｒａｎｎａｎ ＣＩ．Ｔｈｅ Ｐｒａｄｅｒ－Ｗｉｌｌｉ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ ｃｅｎｔｅｒ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ｐａｔｅｒｎａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｍｕｒｉｎｅ Ｕｂｅ３ａ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｂｕｔ ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ｐ
ａｔｅｒｎａｌ Ｕｂｅ３ａ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００１；７３（３）：３１６－２２．
８．Ｍｅｎｇ Ｌ，Ｐｅｒｓｏｎ ＲＥ，Ｈｕａｎｇ Ｗ，Ｚｈｕ ＰＪ，Ｃｏｓｔａ－Ｍａｔｔｉｏｌｉ Ｍ，ａｎｄ Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ．Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ ｕｎｓｉｌｅｎｃｅｓ ｐａｔｅｒｎａｌ Ｕｂｅ３ａ ａｎｄ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．２０１３；９（１２）：ｅ１００４０３９．
９．Ｒｏｕｇｅｕｌｌｅ Ｃ，Ｃａｒｄｏｓｏ Ｃ，Ｆｏｎｔｅｓ Ｍ，Ｃｏｌｌｅａｕｘ Ｌ，ａｎｄ Ｌａｌａｎｄｅ Ｍ．Ａｎ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
ＲＮＡ ｏｖｅｒｌａｐｓ ＵＢＥ３Ａ ａｎｄ ａ ｓｅｃｏｎｄ ｍａｔｅｒｎａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９８；１９（１）：１５－６．
１０．Ｈｕａｎｇ ＨＳ，Ａｌｌｅｎ ＪＡ，Ｍａｂｂ ＡＭ，Ｋｉｎｇ ＩＦ，Ｍｉｒｉｙａｌａ Ｊ，Ｔａｙｌｏｒ－Ｂｌａｋｅ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｕｎｓｉｌｅｎｃｅ ｔｈｅ ｄｏｒｍａｎｔ ａｌｌｅｌｅ ｏｆ Ｕｂｅ３ａ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２；４８１（７３８０）：１８５－９．
１１．Ｍｅｎｇ Ｌ，Ｗａｒｄ ＡＪ，Ｃｈｕｎ Ｓ，Ｂｅｎｎｅｔｔ ＣＦ，Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ，ａｎｄ Ｒｉｇｏ Ｆ．Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５１８（７５３９）：４０９－１２．
１２．Ｓｉｌｖａ－Ｓａｎｔｏｓ Ｓ，ｖａｎ Ｗｏｅｒｄｅｎ ＧＭ，Ｂｒｕｉｎｓｍａ ＣＦ，Ｍｉｅｎｔｊｅｓ Ｅ，Ｊｏｌｆａｅｉ ＭＡ，Ｄｉｓｔｅｌ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｕｂｅ３ａ ｒｅｉｎｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｗｉｎｄｏｗｓ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｍｏｄｅｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（５）：２０６９－７６．
１３．Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ，Ｋｉｌｉｃ Ｅ，ａｎｄ Ｂａｈｒ Ｍ．Ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈｌｙ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ
ａｒｅａ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００３；１０（４）：３３７－４７．
１４．Ｔｈｉｅｌ Ｇ，Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ Ｐ，ａｎｄ Ｓｕｄｈｏｆ ＴＣ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ Ｉ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９１；８８（８）：３４３１－５．
１５．Ｄｅｖｅｒｍａｎ ＢＥ，Ｐｒａｖｄｏ ＰＬ，Ｓｉｍｐｓｏｎ ＢＰ，Ｋｕｍａｒ ＳＲ，Ｃｈａｎ ＫＹ，Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄｓ ＡＡＶ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｂｒａｉｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６；３４（２）：２０４－９．
１６．Ｄｉｎｄｏｔ ＳＶ，Ａｎｔａｌｆｆｙ ＢＡ，Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ ＭＢ，ａｎｄ Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ．Ｔｈｅ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｌｏｃａｌｉｚｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙｎａｐｓｅ
ａｎｄ ｎｕｃｌｅｕｓ，ａｎｄ ｍａｔｅｒｎａｌ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａｂｎｏｒｍａｌ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｓｐｉｎｅ ｍｏｒｐｈｏｌ
ｏｇｙ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００８；１７（１）：１１１－８．
１７．Ｓｏｎｚｏｇｎｉ Ｍ，Ｗａｌｌａａｒｄ Ｉ，Ｓａｎｔｏｓ ＳＳ，Ｋｉｎｇｍａ Ｊ，ｄｕ Ｍｅｅ Ｄ，ｖａｎ Ｗｏｅｒｄｅｎ ＧＭ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｔｅｓｔ ｂａｔｔｅｒｙ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ： ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ Ｕｂｅ３ａ ｍｕｔａｎｔｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｕｔｉｓｍ．２０１８；９：４７．
１８．ｖａｎ Ｈａａｓｔｅｒｅｎ Ｊ，Ｌｉ Ｊ，Ｓｃｈｅｉｄｅｌｅｒ ＯＪ，Ｍｕｒｔｈｙ Ｎ，ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＤＶ．Ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ： ｆｕｌｆｉｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０２０；３８（７）：８４５－５５．
１９．Ｃｏｘ ＤＢ，Ｐｌａｔｔ ＲＪ，ａｎｄ Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ： ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１５；２１（２）：１２１－３１．
２０．Ｎｉｓｈｉｙａｍａ Ｊ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．２０１９；１４１：４－１２．
２１．Ｅｋｍａｎ ＦＫ，Ｏｊａｌａ ＤＳ，Ａｄｉｌ ＭＭ，Ｌｏｐｅｚ ＰＡ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＤＶ，ａｎｄ Ｇａｊ Ｔ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－Ｍｅｄｉａｔｅｄ
Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｌｉｆｅｓｐａｎ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｍｏｔｏｒ Ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ａ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１９；１７：８２９－３９．
２２．Ｇａｊ Ｔ，Ｏｊａｌａ ＤＳ，Ｅｋｍａｎ ＦＫ，Ｂｙｒｎｅ ＬＣ，Ｌｉｍｓｉｒｉｃｈａｉ Ｐ，ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＤＶ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ
ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｄｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＡＬＳ．Ｓｃｉ Ａｄｖ．２０１７；３（１２）：ｅａａｒ３９５２．
２３．Ｇｙｏｒｇｙ Ｂ，Ｌｏｏｖ Ｃ，Ｚａｂｏｒｏｗｓｋｉ ＭＰ，Ｔａｋｅｄａ Ｓ，Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ＢＰ，Ｃｏｍｍｉｎｓ Ｃ，ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｗｅｄｉｓｈ ＡＰＰ Ａｌｌｅｌｅ ａｓ ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ
Ｅａｒｌｙ－Ｏｎｓｅｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１８；１１：４２９－４０．
２４．Ｗｏｌｔｅｒ ＪＭ，Ｍａｏ Ｈ，Ｆｒａｇｏｌａ Ｇ，Ｓｉｍｏｎ ＪＭ，Ｋｒａｎｔｚ ＪＬ，Ｂａｚｉｃｋ ＨＯ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｒａｐｓ Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ．２０２０．
２５．Ｓｔｒｕｔｔ ＳＣ，Ｔｏｒｒｅｚ ＲＭ，Ｋａｙａ Ｅ，Ｎｅｇｒｅｔｅ ＯＡ，ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ ＪＡ．ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．ｅＬｉｆｅ．２０１８；７．
【0160】
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。
【表5】
【0161】
本明細書に引用される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。「２０－９２３１ＰＣＴ＿ＳＴ２５」という名前で本明細書とともに提出された配列表、並びにその中の配列及びテキストは、参照により組み込まれる。２０２０年４月２８日に出願された米国仮出願第６３／０１６，７１２号、及び２０２０年１１月２５日に出願された米国仮出願第６３／１１８，２９９号は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図4A】
【図4B】
【図】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】