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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-09
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の治療のための方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/422 20060101AFI20230602BHJP
A61K 31/353 20060101ALI20230602BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230602BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230602BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/706 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/4706 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/7052 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/4965 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/573 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/55 20060101ALI20230602BHJP
C07D 413/14 20060101ALI20230602BHJP
C07D 311/32 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/403 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/475 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/454 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/407 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/44 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/4741 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/4535 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/5025 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/4375 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/343 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/5415 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/585 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/502 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/472 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/352 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/4245 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/4025 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/4745 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/4709 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/429 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/517 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/7076 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/4439 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/445 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/555 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/137 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/381 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/215 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/439 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/4985 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/551 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/351 20060101ALI20230602BHJP
A61K 31/42 20060101ALI20230602BHJP
A61K 33/04 20060101ALI20230602BHJP
A61K 38/06 20060101ALI20230602BHJP
【ＦＩ】
A61K31/422
A61K31/353
A61P31/00
A61P31/14
A61K45/00
A61K31/706
A61K31/4706
A61K31/7052
A61K31/4965
A61K31/573
A61K31/55
C07D413/14 CSP
C07D311/32
A61K31/403
A61K31/496
A61K31/475
A61K31/454
A61K31/407
A61K31/44
A61K31/4741
A61K31/4535
A61K31/519
A61K31/5025
A61K31/4375
A61K31/343
A61K31/5415
A61K31/585
A61K31/502
A61K31/472
A61K31/352
A61K31/4245
A61K31/5377
A61K31/4025
A61K31/4745
A61K31/4709
A61K31/429
A61K31/517
A61K31/7076
A61K31/4439
A61K31/445
A61K31/555
A61K31/137
A61K31/381
A61K31/215
A61K31/439
A61K31/4985
A61K31/551
A61K31/351
A61K31/42
A61K33/04
A61K38/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022567078
(86)(22)【出願日】2021-04-15
(85)【翻訳文提出日】2022-12-28
(86)【国際出願番号】 US2021027535
(87)【国際公開番号】W WO2021225767
(87)【国際公開日】2021-11-11
(31)【優先権主張番号】62/704,340
(32)【優先日】2020-05-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/705,288
(32)【優先日】2020-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/107,893
(32)【優先日】2020-10-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】501244222
【氏名又は名称】ザ スクリプス リサーチ インスティテュート
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100172683
【弁理士】
【氏名又は名称】綾 聡平
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】バコフスキー，マリナ・エー
(72)【発明者】
【氏名】ベトラー，ネーサン
(72)【発明者】
【氏名】バートン，デニス・レイモンド
(72)【発明者】
【氏名】チャタージー，アーナブ・ケー
(72)【発明者】
【氏名】マクナマラ，ケース・ダブリュー
(72)【発明者】
【氏名】ロジャース，トーマス・エフ
(72)【発明者】
【氏名】シュルツ，ピーター・ジー
(72)【発明者】
【氏名】ウォルフ，カレン
(72)【発明者】
【氏名】リバ，ローラ
【テーマコード（参考）】
4C063
4C084
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C063AA03
4C063BB01
4C063CC52
4C063DD03
4C063EE01
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA15
4C084BA31
4C084NA05
4C084ZB321
4C084ZB322
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZC202
4C084ZC412
4C084ZC752
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA05
4C086BA06
4C086BA07
4C086BA08
4C086BB02
4C086BC10
4C086BC12
4C086BC13
4C086BC17
4C086BC21
4C086BC27
4C086BC30
4C086BC31
4C086BC32
4C086BC39
4C086BC46
4C086BC48
4C086BC50
4C086BC51
4C086BC60
4C086BC67
4C086BC69
4C086BC71
4C086BC82
4C086BC89
4C086CB05
4C086CB06
4C086CB09
4C086CB12
4C086CB22
4C086CB26
4C086CB27
4C086EA11
4C086EA12
4C086EA19
4C086GA02
4C086GA04
4C086GA07
4C086GA08
4C086GA09
4C086GA10
4C086GA12
4C086HA08
4C086HA11
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB32
4C086ZB33
4C086ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206FA02
4C206FA07
4C206MA02
4C206MA04
4C206NA05
4C206ZB32
4C206ZB33
4C206ZC75
(57)【要約】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）等の病原性感染症を有する対象を治療するのに有用な方法が本明細書に開示され、対象が病原体に感染する可能性を低減させ、対象から他の対象への病原体の伝播を減少させるためのものである。方法は、抗感染剤等の追加の薬剤と組み合わされていてもよい、本明細書の表１又は表４に開示される化合物を利用する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
病原体による感染を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の以下の表から選択される少なくとも１つの化合物を前記対象に投与することを含む、病原体による感染を有する対象を治療する方法。【表1】
【請求項2】
病原体による感染を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の以下の表から選択される少なくとも１つの化合物を前記対象に投与することを含む、病原体による感染を有する対象を治療する方法。【表2】
【請求項3】
前記病原体がコロナウイルスである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記病原体が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
抗感染剤を投与することを更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記抗感染剤が抗ウイルス剤を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記抗ウイルス剤が、侵入阻害薬、脱コーティング阻害薬、逆転写酵素阻害薬、アンチセンス薬、リボザイム薬、プロテアーゼ阻害薬、集合阻害薬、及び放出阻害薬からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記抗ウイルス剤が、レムデシビル、ヒドロキシクロロキン、ピロナリジン、アジスロマイシン、及びファビピラビルからなる群から選択される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項9】
前記抗ウイルス剤が、デキサメタゾンと組み合わされていてもよい、アモジアキン、【化1】
【化2】
【請求項10】
式ＲＦＭ－０１１－２００－５による化合物又はその薬学的に許容される塩：【化3】
【請求項11】
式ＲＦＭ－００７－４５４－４による化合物又はその薬学的に許容される塩：【化4】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年５月５日に出願された米国仮特許出願第６２／７０４，３４０号、２０２０年６月１９日に出願された第６２／７０５，２８８号、及び２０２０年１０月３０日に出願された第６３／１０７，８９３号に対する優先権の利益を主張し、これらの出願の開示は、あたかも本明細書に完全に記載されているかのように本開示に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルス感染症は、実質的な罹患率及び死亡をもたらし得る。ワクチン接種は一般にいくつかのウイルス感染に対して有効であり得るが、ワクチンは必ずしも特定のウイルスに対して完全に有効であるとは限らない。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する現在知られているワクチンの長期有効性は、特にワクチンの全体的な影響を減少させ得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の出現を考慮して、まだ決定されていない。したがって、このウイルスの治療及び他者へのその感染の防止は、一部の若年者、高齢者又は免疫無防備状態の集団の間で特に重要になっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
したがって、一実施形態では、本開示は、病原体による感染症を有する対象を治療する方法を提供する。この方法は、アピリモド、レムデシビル、及びヒドロキシクロロキンを除く、治療有効量の本明細書に記載の表１又は表４から選択される少なくとも１つの化合物を対象に投与することを含む。
【0004】
様々な実施形態において、病原体はコロナウイルスである。例えば、一実施形態において、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。
【0005】
いくつかの実施形態では、方法は、対象に抗感染剤を投与することを更に含む。抗感染剤は、様々な態様では、抗ウイルス剤、例えば、侵入阻害薬、脱コーティング阻害薬、逆転写酵素阻害薬、アンチセンス薬、リボザイム薬、プロテアーゼ阻害薬、集合阻害薬及び放出阻害薬からなる群から選択されるものである。いくつかの実施形態では、抗ウイルス剤はレムデシビルを含む。
【0006】
本開示の別の実施形態は、式ＲＦＭ－０１１－２００－５による化合物又はその薬学的に許容される塩である：
【化1】
【0007】
ＲＦＭ－０１１－２００－５。
【0008】
本開示の更に別の実施形態は、式ＲＦＭ－００７－４５４－４による化合物又はその薬学的に許容される塩である：
【化2】
【0009】
ＲＦＭ－００７－４５４－４。
【0010】
更なる実施形態では、本開示は、治療有効量の本明細書に記載の表１又は表４から選択される少なくとも１つの化合物、治療有効量の本明細書に記載の抗感染剤、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1A】初代細胞ベースのＨＣＩアッセイが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対して活性な化合物を同定する図である。Ａ）簡素化されたアッセイワークフローの図である。Ｂ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、レムデシビル又はアピリモド処理ウェルからの代表的な画像である。各処理について、ウェル当たりの画像化領域全体（１０×対物レンズで撮影され、一緒にまとめた４視野）、並びに白色ボックスで画定された８倍の拡大されたセグメントが示されている。ＤＮＡシグナル［４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）］は緑色に着色され、免疫蛍光で可視化されたウイルスはマゼンタに着色されている。感染細胞（矢印）及び非感染細胞（矢じり）が示される。複合画像及び拡大画像には、それぞれ５００μｍ及び５０μｍのスケールバーが示されている。Ｒａｗ及び正規化（Ｎｏｒｍ．）画像から算出した値を示す。Ｃ）独立した生物学的実験から得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイ対照ＥＣ５０の箱ひげプロットで、平均を示し、バー及び全てのデータ点を示した図である。ひげは、最小値及び最大値を示す。Ｄ）１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングプレートからの正規化データのヒートマップ画像である。感染細胞％及び総細胞数の正規化された活性値をスケールバーに従って示し、化合物及び対照ウェルの密度プロットを示す。ＤＭＳＯ処理ウェルはカラム２４にあり、陽性対照処理ウェル（２．５μＭレムデシビル、２．５μＭアピリモド、又は９．６μＭピューロマイシンを含むウェルのブロック）はカラム２３にある。各ウェルタイプに関連する値の頻度を表す密度プロットを右側に示す。Ｅ）化合物ウェル及び対照ウェルについての１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングデータの分布の図である。Ｆ）スクリーンヒット選択閾値の図である。
【図1B】初代細胞ベースのＨＣＩアッセイが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対して活性な化合物を同定する図である。Ａ）簡素化されたアッセイワークフローの図である。Ｂ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、レムデシビル又はアピリモド処理ウェルからの代表的な画像である。各処理について、ウェル当たりの画像化領域全体（１０×対物レンズで撮影され、一緒にまとめた４視野）、並びに白色ボックスで画定された８倍の拡大されたセグメントが示されている。ＤＮＡシグナル［４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）］は緑色に着色され、免疫蛍光で可視化されたウイルスはマゼンタに着色されている。感染細胞（矢印）及び非感染細胞（矢じり）が示される。複合画像及び拡大画像には、それぞれ５００μｍ及び５０μｍのスケールバーが示されている。Ｒａｗ及び正規化（Ｎｏｒｍ．）画像から算出した値を示す。Ｃ）独立した生物学的実験から得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイ対照ＥＣ５０の箱ひげプロットで、平均を示し、バー及び全てのデータ点を示した図である。ひげは、最小値及び最大値を示す。Ｄ）１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングプレートからの正規化データのヒートマップ画像である。感染細胞％及び総細胞数の正規化された活性値をスケールバーに従って示し、化合物及び対照ウェルの密度プロットを示す。ＤＭＳＯ処理ウェルはカラム２４にあり、陽性対照処理ウェル（２．５μＭレムデシビル、２．５μＭアピリモド、又は９．６μＭピューロマイシンを含むウェルのブロック）はカラム２３にある。各ウェルタイプに関連する値の頻度を表す密度プロットを右側に示す。Ｅ）化合物ウェル及び対照ウェルについての１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングデータの分布の図である。Ｆ）スクリーンヒット選択閾値の図である。
【図1C】初代細胞ベースのＨＣＩアッセイが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対して活性な化合物を同定する図である。Ａ）簡素化されたアッセイワークフローの図である。Ｂ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、レムデシビル又はアピリモド処理ウェルからの代表的な画像である。各処理について、ウェル当たりの画像化領域全体（１０×対物レンズで撮影され、一緒にまとめた４視野）、並びに白色ボックスで画定された８倍の拡大されたセグメントが示されている。ＤＮＡシグナル［４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）］は緑色に着色され、免疫蛍光で可視化されたウイルスはマゼンタに着色されている。感染細胞（矢印）及び非感染細胞（矢じり）が示される。複合画像及び拡大画像には、それぞれ５００μｍ及び５０μｍのスケールバーが示されている。Ｒａｗ及び正規化（Ｎｏｒｍ．）画像から算出した値を示す。Ｃ）独立した生物学的実験から得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイ対照ＥＣ５０の箱ひげプロットで、平均を示し、バー及び全てのデータ点を示した図である。ひげは、最小値及び最大値を示す。Ｄ）１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングプレートからの正規化データのヒートマップ画像である。感染細胞％及び総細胞数の正規化された活性値をスケールバーに従って示し、化合物及び対照ウェルの密度プロットを示す。ＤＭＳＯ処理ウェルはカラム２４にあり、陽性対照処理ウェル（２．５μＭレムデシビル、２．５μＭアピリモド、又は９．６μＭピューロマイシンを含むウェルのブロック）はカラム２３にある。各ウェルタイプに関連する値の頻度を表す密度プロットを右側に示す。Ｅ）化合物ウェル及び対照ウェルについての１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングデータの分布の図である。Ｆ）スクリーンヒット選択閾値の図である。
【図1D-1】初代細胞ベースのＨＣＩアッセイが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対して活性な化合物を同定する図である。Ａ）簡素化されたアッセイワークフローの図である。Ｂ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、レムデシビル又はアピリモド処理ウェルからの代表的な画像である。各処理について、ウェル当たりの画像化領域全体（１０×対物レンズで撮影され、一緒にまとめた４視野）、並びに白色ボックスで画定された８倍の拡大されたセグメントが示されている。ＤＮＡシグナル［４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）］は緑色に着色され、免疫蛍光で可視化されたウイルスはマゼンタに着色されている。感染細胞（矢印）及び非感染細胞（矢じり）が示される。複合画像及び拡大画像には、それぞれ５００μｍ及び５０μｍのスケールバーが示されている。Ｒａｗ及び正規化（Ｎｏｒｍ．）画像から算出した値を示す。Ｃ）独立した生物学的実験から得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイ対照ＥＣ５０の箱ひげプロットで、平均を示し、バー及び全てのデータ点を示した図である。ひげは、最小値及び最大値を示す。Ｄ）１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングプレートからの正規化データのヒートマップ画像である。感染細胞％及び総細胞数の正規化された活性値をスケールバーに従って示し、化合物及び対照ウェルの密度プロットを示す。ＤＭＳＯ処理ウェルはカラム２４にあり、陽性対照処理ウェル（２．５μＭレムデシビル、２．５μＭアピリモド、又は９．６μＭピューロマイシンを含むウェルのブロック）はカラム２３にある。各ウェルタイプに関連する値の頻度を表す密度プロットを右側に示す。Ｅ）化合物ウェル及び対照ウェルについての１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングデータの分布の図である。Ｆ）スクリーンヒット選択閾値の図である。
【図1D-2】初代細胞ベースのＨＣＩアッセイが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対して活性な化合物を同定する図である。Ａ）簡素化されたアッセイワークフローの図である。Ｂ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、レムデシビル又はアピリモド処理ウェルからの代表的な画像である。各処理について、ウェル当たりの画像化領域全体（１０×対物レンズで撮影され、一緒にまとめた４視野）、並びに白色ボックスで画定された８倍の拡大されたセグメントが示されている。ＤＮＡシグナル［４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）］は緑色に着色され、免疫蛍光で可視化されたウイルスはマゼンタに着色されている。感染細胞（矢印）及び非感染細胞（矢じり）が示される。複合画像及び拡大画像には、それぞれ５００μｍ及び５０μｍのスケールバーが示されている。Ｒａｗ及び正規化（Ｎｏｒｍ．）画像から算出した値を示す。Ｃ）独立した生物学的実験から得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイ対照ＥＣ５０の箱ひげプロットで、平均を示し、バー及び全てのデータ点を示した図である。ひげは、最小値及び最大値を示す。Ｄ）１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングプレートからの正規化データのヒートマップ画像である。感染細胞％及び総細胞数の正規化された活性値をスケールバーに従って示し、化合物及び対照ウェルの密度プロットを示す。ＤＭＳＯ処理ウェルはカラム２４にあり、陽性対照処理ウェル（２．５μＭレムデシビル、２．５μＭアピリモド、又は９．６μＭピューロマイシンを含むウェルのブロック）はカラム２３にある。各ウェルタイプに関連する値の頻度を表す密度プロットを右側に示す。Ｅ）化合物ウェル及び対照ウェルについての１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングデータの分布の図である。Ｆ）スクリーンヒット選択閾値の図である。
【図1E】初代細胞ベースのＨＣＩアッセイが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対して活性な化合物を同定する図である。Ａ）簡素化されたアッセイワークフローの図である。Ｂ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、レムデシビル又はアピリモド処理ウェルからの代表的な画像である。各処理について、ウェル当たりの画像化領域全体（１０×対物レンズで撮影され、一緒にまとめた４視野）、並びに白色ボックスで画定された８倍の拡大されたセグメントが示されている。ＤＮＡシグナル［４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）］は緑色に着色され、免疫蛍光で可視化されたウイルスはマゼンタに着色されている。感染細胞（矢印）及び非感染細胞（矢じり）が示される。複合画像及び拡大画像には、それぞれ５００μｍ及び５０μｍのスケールバーが示されている。Ｒａｗ及び正規化（Ｎｏｒｍ．）画像から算出した値を示す。Ｃ）独立した生物学的実験から得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイ対照ＥＣ５０の箱ひげプロットで、平均を示し、バー及び全てのデータ点を示した図である。ひげは、最小値及び最大値を示す。Ｄ）１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングプレートからの正規化データのヒートマップ画像である。感染細胞％及び総細胞数の正規化された活性値をスケールバーに従って示し、化合物及び対照ウェルの密度プロットを示す。ＤＭＳＯ処理ウェルはカラム２４にあり、陽性対照処理ウェル（２．５μＭレムデシビル、２．５μＭアピリモド、又は９．６μＭピューロマイシンを含むウェルのブロック）はカラム２３にある。各ウェルタイプに関連する値の頻度を表す密度プロットを右側に示す。Ｅ）化合物ウェル及び対照ウェルについての１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングデータの分布の図である。Ｆ）スクリーンヒット選択閾値の図である。
【図1F】初代細胞ベースのＨＣＩアッセイが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対して活性な化合物を同定する図である。Ａ）簡素化されたアッセイワークフローの図である。Ｂ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、レムデシビル又はアピリモド処理ウェルからの代表的な画像である。各処理について、ウェル当たりの画像化領域全体（１０×対物レンズで撮影され、一緒にまとめた４視野）、並びに白色ボックスで画定された８倍の拡大されたセグメントが示されている。ＤＮＡシグナル［４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）］は緑色に着色され、免疫蛍光で可視化されたウイルスはマゼンタに着色されている。感染細胞（矢印）及び非感染細胞（矢じり）が示される。複合画像及び拡大画像には、それぞれ５００μｍ及び５０μｍのスケールバーが示されている。Ｒａｗ及び正規化（Ｎｏｒｍ．）画像から算出した値を示す。Ｃ）独立した生物学的実験から得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイ対照ＥＣ５０の箱ひげプロットで、平均を示し、バー及び全てのデータ点を示した図である。ひげは、最小値及び最大値を示す。Ｄ）１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングプレートからの正規化データのヒートマップ画像である。感染細胞％及び総細胞数の正規化された活性値をスケールバーに従って示し、化合物及び対照ウェルの密度プロットを示す。ＤＭＳＯ処理ウェルはカラム２４にあり、陽性対照処理ウェル（２．５μＭレムデシビル、２．５μＭアピリモド、又は９．６μＭピューロマイシンを含むウェルのブロック）はカラム２３にある。各ウェルタイプに関連する値の頻度を表す密度プロットを右側に示す。Ｅ）化合物ウェル及び対照ウェルについての１．９μＭのＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングデータの分布の図である。Ｆ）スクリーンヒット選択閾値の図である。
【図2A】抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を有する強力かつ選択的な化合物が、ＲｅＦＲＡＭＥライブラリにおいて同定されている図である。Ａ）発生の臨床段階及び疾患適応症に関するＲｅＦＲＡＭＥ再利用ライブラリの組成の図である。Ｂ）用量応答の再確認結果、各化合物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＣ５０を、非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞において評価したときのその宿主細胞毒性ＣＣ５０に対してプロットした図である。点線は、アッセイ化合物（４０μＭ）及び対照アピリモド及びレムデシビル（１０μＭ）について用量反応試験で試験した最大濃度を表す。対照（黒菱形）及びアッセイ化合物（ピンク菱形）の活性を示す。このヒット再確認の一部としてスクリーニングされたピューロマイシンのＲｅＦＲＡＭＥライブラリコピーの活性も示される（赤い菱形）。Ｃ）レムデシビル、アピリモド及びピューロマイシン対照化合物についてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＥＣ５０（青色）、感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＥＣ５０（オレンジ色）及び非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＣＣ５０用量反応曲線を、ＲｅＦＲＡＭＥヒット再確認の一部として実行した図である。Ｄ）機能的注釈による７５種の強力かつ選択的な化合物及び１３５種の弱活性又は非選択的な化合物の分類の図である。Ｅ）アピリモド＋レムデシビル薬物相乗ランドスケープの相乗作用分析の代表的な出力（単一複製）は、全体的な相乗作用効果を示している図である（－１０＜δ＜１０）。Ｆ）レムデシビルと２つの固定濃度のアピリモド（相乗作用実験中のおよそＥＣ３０及びＥＣ６５）との間の付加反応の図である。技術的な三連の中央値＋／－ｓｅｍを示す。
【図2B】抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を有する強力かつ選択的な化合物が、ＲｅＦＲＡＭＥライブラリにおいて同定されている図である。Ａ）発生の臨床段階及び疾患適応症に関するＲｅＦＲＡＭＥ再利用ライブラリの組成の図である。Ｂ）用量応答の再確認結果、各化合物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＣ５０を、非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞において評価したときのその宿主細胞毒性ＣＣ５０に対してプロットした図である。点線は、アッセイ化合物（４０μＭ）及び対照アピリモド及びレムデシビル（１０μＭ）について用量反応試験で試験した最大濃度を表す。対照（黒菱形）及びアッセイ化合物（ピンク菱形）の活性を示す。このヒット再確認の一部としてスクリーニングされたピューロマイシンのＲｅＦＲＡＭＥライブラリコピーの活性も示される（赤い菱形）。Ｃ）レムデシビル、アピリモド及びピューロマイシン対照化合物についてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＥＣ５０（青色）、感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＥＣ５０（オレンジ色）及び非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＣＣ５０用量反応曲線を、ＲｅＦＲＡＭＥヒット再確認の一部として実行した図である。Ｄ）機能的注釈による７５種の強力かつ選択的な化合物及び１３５種の弱活性又は非選択的な化合物の分類の図である。Ｅ）アピリモド＋レムデシビル薬物相乗ランドスケープの相乗作用分析の代表的な出力（単一複製）は、全体的な相乗作用効果を示している図である（－１０＜δ＜１０）。Ｆ）レムデシビルと２つの固定濃度のアピリモド（相乗作用実験中のおよそＥＣ３０及びＥＣ６５）との間の付加反応の図である。技術的な三連の中央値＋／－ｓｅｍを示す。
【図2C】抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を有する強力かつ選択的な化合物が、ＲｅＦＲＡＭＥライブラリにおいて同定されている図である。Ａ）発生の臨床段階及び疾患適応症に関するＲｅＦＲＡＭＥ再利用ライブラリの組成の図である。Ｂ）用量応答の再確認結果、各化合物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＣ５０を、非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞において評価したときのその宿主細胞毒性ＣＣ５０に対してプロットした図である。点線は、アッセイ化合物（４０μＭ）及び対照アピリモド及びレムデシビル（１０μＭ）について用量反応試験で試験した最大濃度を表す。対照（黒菱形）及びアッセイ化合物（ピンク菱形）の活性を示す。このヒット再確認の一部としてスクリーニングされたピューロマイシンのＲｅＦＲＡＭＥライブラリコピーの活性も示される（赤い菱形）。Ｃ）レムデシビル、アピリモド及びピューロマイシン対照化合物についてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＥＣ５０（青色）、感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＥＣ５０（オレンジ色）及び非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＣＣ５０用量反応曲線を、ＲｅＦＲＡＭＥヒット再確認の一部として実行した図である。Ｄ）機能的注釈による７５種の強力かつ選択的な化合物及び１３５種の弱活性又は非選択的な化合物の分類の図である。Ｅ）アピリモド＋レムデシビル薬物相乗ランドスケープの相乗作用分析の代表的な出力（単一複製）は、全体的な相乗作用効果を示している図である（－１０＜δ＜１０）。Ｆ）レムデシビルと２つの固定濃度のアピリモド（相乗作用実験中のおよそＥＣ３０及びＥＣ６５）との間の付加反応の図である。技術的な三連の中央値＋／－ｓｅｍを示す。
【図2D】抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を有する強力かつ選択的な化合物が、ＲｅＦＲＡＭＥライブラリにおいて同定されている図である。Ａ）発生の臨床段階及び疾患適応症に関するＲｅＦＲＡＭＥ再利用ライブラリの組成の図である。Ｂ）用量応答の再確認結果、各化合物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＣ５０を、非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞において評価したときのその宿主細胞毒性ＣＣ５０に対してプロットした図である。点線は、アッセイ化合物（４０μＭ）及び対照アピリモド及びレムデシビル（１０μＭ）について用量反応試験で試験した最大濃度を表す。対照（黒菱形）及びアッセイ化合物（ピンク菱形）の活性を示す。このヒット再確認の一部としてスクリーニングされたピューロマイシンのＲｅＦＲＡＭＥライブラリコピーの活性も示される（赤い菱形）。Ｃ）レムデシビル、アピリモド及びピューロマイシン対照化合物についてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＥＣ５０（青色）、感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＥＣ５０（オレンジ色）及び非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＣＣ５０用量反応曲線を、ＲｅＦＲＡＭＥヒット再確認の一部として実行した図である。Ｄ）機能的注釈による７５種の強力かつ選択的な化合物及び１３５種の弱活性又は非選択的な化合物の分類の図である。Ｅ）アピリモド＋レムデシビル薬物相乗ランドスケープの相乗作用分析の代表的な出力（単一複製）は、全体的な相乗作用効果を示している図である（－１０＜δ＜１０）。Ｆ）レムデシビルと２つの固定濃度のアピリモド（相乗作用実験中のおよそＥＣ３０及びＥＣ６５）との間の付加反応の図である。技術的な三連の中央値＋／－ｓｅｍを示す。
【図2E】抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を有する強力かつ選択的な化合物が、ＲｅＦＲＡＭＥライブラリにおいて同定されている図である。Ａ）発生の臨床段階及び疾患適応症に関するＲｅＦＲＡＭＥ再利用ライブラリの組成の図である。Ｂ）用量応答の再確認結果、各化合物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＣ５０を、非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞において評価したときのその宿主細胞毒性ＣＣ５０に対してプロットした図である。点線は、アッセイ化合物（４０μＭ）及び対照アピリモド及びレムデシビル（１０μＭ）について用量反応試験で試験した最大濃度を表す。対照（黒菱形）及びアッセイ化合物（ピンク菱形）の活性を示す。このヒット再確認の一部としてスクリーニングされたピューロマイシンのＲｅＦＲＡＭＥライブラリコピーの活性も示される（赤い菱形）。Ｃ）レムデシビル、アピリモド及びピューロマイシン対照化合物についてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＥＣ５０（青色）、感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＥＣ５０（オレンジ色）及び非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＣＣ５０用量反応曲線を、ＲｅＦＲＡＭＥヒット再確認の一部として実行した図である。Ｄ）機能的注釈による７５種の強力かつ選択的な化合物及び１３５種の弱活性又は非選択的な化合物の分類の図である。Ｅ）アピリモド＋レムデシビル薬物相乗ランドスケープの相乗作用分析の代表的な出力（単一複製）は、全体的な相乗作用効果を示している図である（－１０＜δ＜１０）。Ｆ）レムデシビルと２つの固定濃度のアピリモド（相乗作用実験中のおよそＥＣ３０及びＥＣ６５）との間の付加反応の図である。技術的な三連の中央値＋／－ｓｅｍを示す。
【図2F】抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を有する強力かつ選択的な化合物が、ＲｅＦＲＡＭＥライブラリにおいて同定されている図である。Ａ）発生の臨床段階及び疾患適応症に関するＲｅＦＲＡＭＥ再利用ライブラリの組成の図である。Ｂ）用量応答の再確認結果、各化合物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＣ５０を、非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞において評価したときのその宿主細胞毒性ＣＣ５０に対してプロットした図である。点線は、アッセイ化合物（４０μＭ）及び対照アピリモド及びレムデシビル（１０μＭ）について用量反応試験で試験した最大濃度を表す。対照（黒菱形）及びアッセイ化合物（ピンク菱形）の活性を示す。このヒット再確認の一部としてスクリーニングされたピューロマイシンのＲｅＦＲＡＭＥライブラリコピーの活性も示される（赤い菱形）。Ｃ）レムデシビル、アピリモド及びピューロマイシン対照化合物についてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＥＣ５０（青色）、感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＥＣ５０（オレンジ色）及び非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＣＣ５０用量反応曲線を、ＲｅＦＲＡＭＥヒット再確認の一部として実行した図である。Ｄ）機能的注釈による７５種の強力かつ選択的な化合物及び１３５種の弱活性又は非選択的な化合物の分類の図である。Ｅ）アピリモド＋レムデシビル薬物相乗ランドスケープの相乗作用分析の代表的な出力（単一複製）は、全体的な相乗作用効果を示している図である（－１０＜δ＜１０）。Ｆ）レムデシビルと２つの固定濃度のアピリモド（相乗作用実験中のおよそＥＣ３０及びＥＣ６５）との間の付加反応の図である。技術的な三連の中央値＋／－ｓｅｍを示す。
【図3】対照化合物ＥＣ５０に対するＭＯＩの効果の図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＨｅＬａ－ＡＣＥ２アッセイにおけるレムデシビル、アピリモド、及びピューロマイシン対照の活性を、１～２６の範囲のＭＯＩを用いて評価した。示されたＭＯＩにおける各化合物のＥＣ５０を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本開示は、部分的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等の病原性感染症を有する対象を治療する方法に関する。２０１９年１２月上旬に、重度の急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が、ＣＯＶＩＤ－１９と呼ばれる重度の肺炎様症状の数が急速に増加する原因であると特定された（Ｈｕａｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｗｕｈａｎ，Ｃｈｉｎａ．Ｌａｎｃｅｔ ３９５，４９７－５０６，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（２０）３０１８３－５（２０２０））。それ以来、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が世界保健機関（ＷＨＯ）からそのパンデミック状況を正式に与えられている。２０２１年２月１０日現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は世界中に拡散し、２２３の異なる国において、１０６，５５５，２００人を超える確認された感染症を引き起こし、２，３３３，４４０人を超える死亡が報告されている（Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｖｏｌ．２０２０（ｅｄ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，２０２０））。いくつかの有効な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの開発がパンデミックの制御に寄与することは疑いないが、ワクチンの一部をあまり有効でなくするエスケープ突然変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の出現及び全体的に制限されたＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの世界的供給は、治療的介入を特定するための継続的な努力の根拠となる。しかし、研究団体の多大な努力にもかかわらず、ＣＯＶＩＤ－１９の抗ウイルス治療の選択肢は依然として非常に限られている。これらには、重症又は重篤なＣＯＶＩＤ－１９を有する患者の治療に対するデキサメタゾン等のコルチコステロイドが含まれる（Ｇｒｏｕｐ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｉｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｏｖｉｄ－Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ２０２１４３６（２０２０）ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ－ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ（ｄｅ Ｗｉｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ（ＧＳ－５７３４）ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１７，６７７１－６７７６，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１９２２０８３１１７（２０２０）；Ｓｈｅａｈａｎ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ＧＳ－５７３４ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｂｏｔｈ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ａｎｄ ｚｏｏｎｏｔｉｃ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｌ３６５３（２０１７）；Ｌｏ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．ＧＳ－５７３４ ａｎｄ ｉｔｓ ｐａｒｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｆｉｌｏ－，Ｐｎｅｕｍｏ－，ａｎｄ Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，４３３９５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４３３９５（２０１７））。広範な抗ウイルス活性を有するヌクレオチド類似体プロドラッグであるレムデシビル及びＲｄＲｐ阻害剤は、第ＩＩＩ相適応ＣＯＶＩＤ－１９治療試験で陽性臨床エンドポイントを実証した（回復までの時間の中央値は１５から１１日間に短縮され（Ｈｅａｌｔｈ，Ｎ．Ｉ．ｏ．（２０２０））、アメリカ食品医薬品局による入院ＣＯＶＩＤ－１９患者の治療のためのその緊急使用許可を正当化した（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｆ．Ｄ．（ｅｄ Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ＆Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ＆Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，２０２０）。しかしながら、ヒドロキシクロロキン、ロピナビル及びインターフェロンレジメンと一緒になって、大規模な多施設ＷＨＯ ＳＯＬＩＤＡＲＩＴＹ試験で入院ＣＯＶＩＤ－１９患者の死亡率を低下させることが最近できなかった（Ｐａｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｅｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ＣＯＶＩＤ－１９－ｉｎｔｅｒｉｍ ＷＨＯ ＳＯＬＩＤＡＲＩＴＹ ｔｒｉａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ．ｍｅｄＲｘｉｖ，２０２０．２０１０．２０１５．２０２０９８１７，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．１０．１５．２０２０９８１７（２０２０））。本開示はまた、部分的に、２つの異なる細胞ベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染アッセイ及びレムデシビル増強フォーマットにおける大規模な薬物ライブラリ（ＲｅＦＲＡＭＥ）のスクリーニング、並びに二次直交アッセイにおける同定されたヒットのプロファイリングに関する。このスクリーニングカスケード及びその後のヒット優先順位付けは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の強力な阻害剤として有望なヒットＭＫ－４４８２を同定及び検証し、インビトロ所見はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のインビボハムスターモデルに変換された。これらの研究で特定された他のヒットは、コロナウイルス複製経路を解明するための治療及びツールへの再利用に有用である。
【0013】
定義
本明細書で使用される場合、そうではないと特定されない限り、「化合物」という用語は、化合物又はその薬学的に許容される塩、立体異性体、及び／又は互変異性体を包含するという点で包括的である。したがって、例えば、本明細書中に記載の化合物は、その化合物の互変異性体の薬学的に許容され得る塩を含む。
本明細書で使用される場合、そうではないと特定されない限り、「化合物」という用語は、化合物又はその薬学的に許容される塩、立体異性体、及び／又は互変異性体を包含するという点で包括的である。したがって、例えば、本明細書中に記載の化合物は、その化合物の互変異性体の薬学的に許容され得る塩を含む。
【0014】
本開示において、「薬学的に許容される塩」は、本明細書に記載される化合物の薬学的に許容される有機又は無機の酸又は塩基の塩である。代表的な薬学的に許容される塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類塩、アンモニウム塩、水溶性及び水不溶性塩、例えば、アセタート、アムソナート（４，４－ジアミノスチルベン－２，２－ジスルホナート）、ベンゼンスルホナート、ベンゾナート、ビカルボナート、ビスルファート、ビタルトラート、ボラート、臭化物、ブチラート、カルシウム、エデト酸カルシウム、カムシラート、カルボナート、塩化物、シトラート、クラブラリエート、二塩酸塩、エデタート、エジシラート、エストラート、エシラート、フィウナラート、グルセプタート、グルコナート、グルタマート、グリコリルアルサニラート、ヘキサフルオロホスファート、ヘキシルレゾルシナート、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトアート、ヨウ化物、イソチオナート、ラクタート、ラクテトビオナート、ラウラート、マラート、マレアート、マンデラート、メシラート、メチルブロミド、メチルニトラート、メチルスルファート、ムケート、ナプシラート、ニトラート、Ｎ－メチルグルカミンアンモニウム塩、３－ヒドロキシ－２－ナフトエート、オレエート、オキサラート、パルミタート、パモエート（１，１－メチレン－ビス－２－ヒドロキシ－３－ナフトエート、アインボナート）、パントテナート、ホスファート／ジホスファート、ピクラート、ポリガラクツロナート、プロピオナート、ｐ－トルエンスルホナート、サリシラート、ステアラート、スアセタート、スクシナート、スルファート、スルホサリツラート、スラメート、タンナート、タルトラート、テオクラート、トシラート、トリエチヨージド、及びバレラート塩が挙げられる。薬学的に許容される塩は、その構造中に２つ以上の荷電原子を有することができる。この場合、薬学的に許容され得る塩は、複数の対イオンを有し得る。したがって、薬学的に許容される塩は、１つ以上の荷電原子及び／又は１つ以上の対イオンを有することができる。
【0015】
「治療する」、「治療すること」及び「治療」という用語は、疾患又は疾患に関連する症状の改善又は根絶を指す。様々な実施形態では、この用語は、そのような疾患を有する患者への本明細書に記載の１つ又は複数の予防的又は治療的化合物の投与から生じる疾患の広がり又は悪化を最小限に抑えることを指す。
【0016】
「予防する」、「予防すること」、及び「予防」という用語は、本明細書に記載の化合物の投与に起因する患者における疾患の発症、再発、又は伝播の予防を指す。
【0017】
「有効量」という用語は、疾患の治療若しくは予防において治療上若しくは予防上の利益を提供するか、又は疾患に関連する症状を遅延若しくは最小化するのに十分な、本明細書に記載の化合物又は他の活性成分の量を指す。更に、本明細書に記載の化合物に関する治療有効量は、疾患の治療又は予防において治療上の利益を提供する治療剤の量を単独で、又は他の療法と組み合わせて意味する。本明細書に記載の化合物に関連して使用される場合、この用語は、全体的な治療を改善し、疾患の症状若しくは原因を軽減若しくは回避し、又は別の治療剤の治療有効性を増強するか、又は別の治療剤と相乗的である量を包含し得る。
【0018】
「患者」又は「対象」には、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、子羊、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ又はモルモット等の動物が含まれる。いくつかの実施形態によれば、動物は、非霊長類及び霊長類（例えば、サル及びヒト）等の哺乳動物である。一実施形態では、患者はヒト、例えばヒト乳児、小児、青年又は成人である。本開示では、「患者」及び「対象」という用語は互換的に使用される。
【0019】
スクリーニングアッセイ及び方法
ＲｅＦＲＡＭＥ（Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ，Ｆｏｃｕｓｅｄ Ｒｅｓｃｕｅ，ａｎｄ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｍｅｄｃｈｅｍ）薬物コレクションは、ヒトへの直接使用に適していることが示された１２，０００個近くの小分子薬物を含む広範な薬物再利用ライブラリであり（５）、更なる単剤療法として、又はレムデシビルと組み合わせて有効性を更に高め、薬物耐性の可能性を減らすのに有用であり得る新しい治療法を発見する豊富な資源を提供する。ヒト細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入又は複製を阻害し得るこのライブラリ中の化合物を同定するために、本発明者等は、ヒトＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体、アンジオテンシン変換酵素２、又はＡＣＥ２（ＨｅＬａ－ＡＣＥ２）を発現するＨｅＬａ細胞を使用してハイコンテンツイメージング（ＨＣＩ）３８４ウェルフォーマットアッセイを開発した。このアッセイでは、ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞を目的の化合物の存在下でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染させ、２４時間後にウイルス感染を定量する（図１、パネルＡ）。アッセイは、ウイルスに曝露された患者から精製された血清を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の免疫蛍光検出に依存し、これは宿主細胞核染色と一緒になって、各ウェル中の感染細胞パーセントの定量化を可能にする（図１、パネルＢ）。
ＲｅＦＲＡＭＥ（Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ，Ｆｏｃｕｓｅｄ Ｒｅｓｃｕｅ，ａｎｄ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｍｅｄｃｈｅｍ）薬物コレクションは、ヒトへの直接使用に適していることが示された１２，０００個近くの小分子薬物を含む広範な薬物再利用ライブラリであり（５）、更なる単剤療法として、又はレムデシビルと組み合わせて有効性を更に高め、薬物耐性の可能性を減らすのに有用であり得る新しい治療法を発見する豊富な資源を提供する。ヒト細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入又は複製を阻害し得るこのライブラリ中の化合物を同定するために、本発明者等は、ヒトＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体、アンジオテンシン変換酵素２、又はＡＣＥ２（ＨｅＬａ－ＡＣＥ２）を発現するＨｅＬａ細胞を使用してハイコンテンツイメージング（ＨＣＩ）３８４ウェルフォーマットアッセイを開発した。このアッセイでは、ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞を目的の化合物の存在下でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染させ、２４時間後にウイルス感染を定量する（図１、パネルＡ）。アッセイは、ウイルスに曝露された患者から精製された血清を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の免疫蛍光検出に依存し、これは宿主細胞核染色と一緒になって、各ウェル中の感染細胞パーセントの定量化を可能にする（図１、パネルＢ）。
【0020】
エボラに対する活性が報告され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する活性が疑われるか又は以前に検証された化合物：レムデシビル（ＧＳ－５７３４）（６）（ＥＣ５０＝１９４±２０ｎＭ、５回の独立した実験の平均±ｓｅｍ）及びＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤アピリモド（ＥＣ５０＝５０±１１ｎＭ、４回の独立した実験の平均±ｓｅｍ）（図１、パネルＢ）を使用してアッセイを検証した。高濃度のレムデシビルは、感染細胞をほぼ完全に排除することができ（図１、パネルＣ）、本発明者等は、これを陽性対照として２．５μＭの濃度で使用し、データはこれ及び中性ＤＭＳＯ対照ウェルに対して正規化した。アピリモドはレムデシビルよりも強力であったが、レムデシビルと比較してわずかに低い最大有効性を有していた（最高有効濃度で８５～９０％の非感染細胞）。更に、本発明者等は、陽性対照として細胞傷害性タンパク質合成阻害剤ピューロマイシンを用いて、１ウェル当たりの総細胞数を定量することによって感染との関連で化合物毒性を評価した（平均ＥＣ５０＝５４７±２７ｎＭ、５回の独立した実験の平均±ｓｅｍ、ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＣＣ５０＝２．４５±０．２３μＭ、５回の独立した実験の平均±ｓｅｍ）。特に、付随する細胞数の増加は、おそらく感染細胞の増殖の減少に起因する、レムデシビル及びアピリモドの抗ウイルス活性と一致した（図１、パネルＢ～Ｅ）。感染多重度を変更すると、同じ実験で対照化合物の効力に中程度の効果があり、レムデシビルのＥＣ５０はＭＯＩ＝１からＭＯＩ＝２６に２．７倍増加し、アピリモドのＥＣ５０は３．７倍増加したが、ピューロマイシンのＥＣ５０は増加しなかった（図３）。
【0021】
開発されたアッセイを使用して、本発明者等はパイロットスクリーニングを実行して、コロナウイルス感染症に対する治療可能性が疑われる１４８個の小分子の活性を評価した（７）（ＲＺ’＝０．８４）。本発明者等は、ＥＣ５０＜９．６μＭの１９個の化合物を同定し、非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２の２４時間生存／死亡アッセイから得られたデータに基づいて、これらのうち１０個が選択的であった（非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＣＣ５０／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＥＣ５０＞１０又は非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＣＣ５０＞４０μＭ）（表１）。これには、アッセイで「再発見」された多数のアピリモド（ＥＣ５０＝１８４ｎＭ、ＣＣ５０＞４０μＭ）及びレムデシビル（ＥＣ５０＝３００ｎＭ ＣＣ５０＞４０μＭ）のライブラリ／スクリーニングが含まれた。アピリモド及びレムデシビルのより高いＥＣ５０は、新たに調製した対照粉末ストックと比較して、スクリーニングデッキ内の経時的なわずかな分解に起因する可能性が高い。
【表1】
【0022】
本発明者等は、１．９μＭ及び９．６μＭの最終濃度で１２，０００化合物ＲｅＦＲＡＭＥ再利用ライブラリをスクリーニングした。アッセイ品質は、以下の表２に示すように、両方のスクリーニングを通して維持された（それぞれ０．８７及び０．７２のＲＺ’）。
【表2】
【0023】
更に、ＤＭＳＯビヒクル－（中性対照）、レムデシビル－（陽性対照）、アピリモド－及びピューロマイシン－（毒性対照）処理ウェルの活性プロファイルにおいて明確な区別が明らかであった（図１、パネルＤ及びＥ）。ヒット選択は、ウェル当たりの感染細胞数の＞５０％の減少（中性対照マイナス阻害剤に対して正規化された＜－５０％の活性）及びウェル当たりの総細胞数に基づく＜４０％の毒性（１０μＭピューロマイシンを含む、化合物活性に対して正規化された＞－４０％の活性）の実証に基づいており（図１、パネルＥ及びＦ）、１．９μＭでの６１の一次ヒット及び９．６μＭのスクリーニング濃度での２６６の一次ヒット（それぞれ０．５１及び２．２４％のヒット率）を同定し、合計３１１ヒットであった。
【0024】
ＲｅＦＲＡＭＥライブラリの一次スクリーニングのヒット率は高かったが（２．５１％）、この生物活性小分子の集合では予想外ではなく、その多くは承認された薬物であるか、又は開発の臨床段階にあり、広範な適応症に使用されている（図２、パネルＡ）。主要なヒットの効力及び選択性を再確認及び評価するために、本発明者等は、９．６μＭの最高濃度を有する１０点１：３希釈用量応答形式で３２５個の利用可能な化合物を試験した。これらのうち、２３３（７１．７％）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対してＥＣ５０＜９．６μＭで活性を示し、更に４２（１２．９％）が弱い活性を示した（ＥＣ５０＞９．６μＭ）。しかしながら、一次スクリーニングヒットの多くはまた、細胞傷害性であり、非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞で決定されるような許容できないほど低い選択比（非感染ＣＣ５０／ＥＣ５０＜１０）を伴った（表３、図２、パネルＢ）。
【表3】
【0025】
ウイルスは複製のために宿主機構に依存するため、抗ウイルス活性を有する化合物の多くが重要な宿主プロセスにも影響を及ぼすことは予想外ではなかった。興味深いことに、タンパク質合成阻害剤ピューロマイシン及び更にはヒドロキシクロロキンのような化合物によるウイルス感染の減少は、感染の状況では細胞の健康に利益を提供したが非感染細胞では提供しなかったため、この毒性は感染細胞では遮蔽されることがあった（図２、パネルＣ）。
【0026】
小規模パイロットとＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングとの間で、本発明者等は、７６個（２つの異なるロットのＧＷ－８０３４３０として７５個のユニークが同定された）の強力な（ＥＣ５０＜９．６μＭ）及び選択的な（ＣＣ５０／ＥＣ５０＞１０又はＣＣ５０＞３９．８μＭ）化合物と、１３５個の化合物であって、活性が弱い（ＥＣ５０＞９．６μＭ）か、又は強力であるが十分に選択的ではない（ＥＣ５０＜９．６μＭ、ＣＣ５０／ＥＣ５０＜１０）化合物を同定した（図２パネルＢ及びＤ、表１）。上位４つのクラスの強力かつ選択的な化合物は、腫瘍崩壊性化合物、イオンチャネル調節剤、抗精神病剤及び受容体結合化合物であった（図２、パネルＤ）。弱い活性又は非選択的ヒットの場合、上位４つのカテゴリーは、同様に腫瘍崩壊性化合物、イオンチャネル調節剤、抗精神病剤並びにシグナル伝達調節剤を含んでいた。強力かつ選択的なヒットのうちの５番目は腫瘍崩壊薬として分類することができ、急速に増殖する細胞に存在する宿主細胞プロセスへのウイルスの依存を更に反映している。抗精神病、心血管、更には抗寄生虫（顧みられない熱帯病）クラスに属する化合物の同定は、これらの分子のいくつかのカチオン性両親媒性の性質、及び酸性の細胞内区画に蓄積し、それに影響を及ぼすそれらの能力を反映し得る（例えば後期エンドソーム／リソソーム）。結果として生じるリソソーム内経路の調節不全及び脂質ホメオスタシスは、ウイルスの侵入及び／又は複製を損なうことが示唆されており（８）、この作用様式は、両方とも本発明者等のスクリーニングにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する強力かつ選択的なヒットとしてここで特定されたアミオダロン及びヒドロキシクロロキンについて企図されている（表１及び３）。本発明者等はまた、エボラウイルス感染を阻害することが以前に見出された化合物のクラスである２つの選択的エストロゲン受容体調整剤（バゼドキシフェン、ＥＣ５０＝３．４７μＭ及びラロキシフェンＥＣ５０＝４．１３μＭ）を同定した（９）。
【0027】
本明細書に記載の方法又は組成物のいずれかで使用するための更なる実施形態は、ＲｅＦＲＡＭＥスクリーニングからの更なる再確認されたヒットを含む。これらは、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ハイコンテンツスクリーニングアッセイ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／Ｃａｌｕ－３ハイコンテンツスクリーニングアッセイ（実施例を参照）からの対応するデータと共に表４に提示される。
【表4】
【0028】
特定されたヒットの中でも、様々な実施形態によれば、治療薬としての比較的高い曝露又は長い使用履歴のために、ハロファントリンＨＣｌ、アミオダロン、メシル酸ネルフィナビル、シンペレビル、マニジピン、及びオザニモドの経口薬が新たに特定され、承認されており、したがって動物モデルでの更なる有効性判定後にＣＯＶＩＤ－１９治療として迅速に再利用される可能性がある。例えば、ウイルスプロテアーゼ阻害薬であるネルフィナビル及びシメプレビルは、優れた曝露を示す。
【0029】
別の実施形態では、化合物は、選択的スフィンゴシン－１－ホスファート（Ｓ１Ｐ１）受容体調整剤オザニモドである。選択的Ｓ１Ｐ１アゴニストは、感染部位での炎症を減少させる（肺内皮細胞によるサイトカインの放出及び肺へのリンパ球の浸潤を減少させる）ことによってマウスモデルにおいてインフルエンザウイルス感染に対する有意な防御を提供することが示されており（１０）、したがってオザニモドは、直接作用型抗ウイルス薬の優れた組み合わせパートナとして役立ち得る。
【0030】
別の実施形態によれば、本明細書中に記載の方法で投与される化合物は、優れた曝露（Ｃｍａｘ約６８４μＭ）を有する承認された薬物アミオダロン、又は曝露は低いが高血圧患者のＣＯＶＩＤ－１９疾患の転帰を改善し得る承認されたカルシウムチャネル遮断薬マニジピンである。アミオダロンは、インビトロスクリーニングにおいて広域抗ウイルス活性を有すると更に同定されている（１１）。
【0031】
アピリモド（フィロウイルスについて見出される、エンドリソソーム輸送の破壊によるウイルス侵入を阻害し得るアッセイコントロール（１２））、プロテアーゼ阻害薬ＮＣＯ ７００（カテプシンＢ）及びデュタカチブ（カテプシンＫ）等の様々な開発段階の１９種の他の化合物は、ウイルス侵入にも影響を与える可能性があり、全てそれらの効力又は薬物動態学的プロファイルのために有効性を示すことができる（表３）。これらのほとんどは、非常に強力なアピリモドを除いて、レムデシビルの効力を超えない１μＭを超える中程度のＥＣ５０を有していた。
【0032】
本開示はまた、いくつかの実施形態では、病原体感染が対象において生じる可能性を低減するか、又は感染対象から他の対象への病原体の伝染を低減する方法を提供する。この方法は、対象に、本明細書に記載の少なくとも１つの抗感染剤と組み合わされていてもよい、表１又は表４に列挙された少なくとも１つの化合物を投与することを含む。
【0033】
併用療法
様々な実施形態において、本開示の方法は、抗感染剤を投与することを更に含む。抗感染剤は、同じ製剤又は剤形等で、本明細書に記載の少なくとも１つの化合物（表１及び表４）と同時に投与することができる。あるいは、抗感染剤は、化合物の前又は後に投与することができる。
様々な実施形態において、本開示の方法は、抗感染剤を投与することを更に含む。抗感染剤は、同じ製剤又は剤形等で、本明細書に記載の少なくとも１つの化合物（表１及び表４）と同時に投与することができる。あるいは、抗感染剤は、化合物の前又は後に投与することができる。
【0034】
いくつかの実施形態では、抗感染剤は、侵入阻害薬（エンフビルチドを含む）、脱コーティング阻害薬（アマンタジン、リマンタジン、及びプレコナリルを含む）、逆転写酵素阻害薬（アシクロビル、ジドブジン、及びラミブジンを含む）、アンチセンス薬（フォミビルセンを含む）、リボザイム薬、プロテアーゼ阻害薬、集合阻害薬（リファンピシンを含む）、及び放出阻害薬からなる群から選択される。
【0035】
いくつかの実施形態において、更なる薬剤は、デキサメタゾン、アモジアキンである。
【化3】
【化4】
【0036】
いくつかの実施形態では、追加の抗感染剤は抗ウイルス剤である。いくつかの実施形態では、抗ウイルス剤は、アバカビル、アシクロビル（Ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）、アデホビル、アマンタジン、アンプリゲン、アンプレナビル（アゲネラーゼ）、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、バラビル、バロキサビルマルボシル（Ｘｏｆｌｕｚａ）、ビクタルビー、ボセプレビル（ビクトレリス）、シドホビル、コビシスタット（Ｔｙｂｏｓｔ）、コンビビル、ダクラタスビル（ダクルインザ）、ダルナビル、デラビルジン、デスコビ、ジダノシン、ドコサノール、ドルテグラビル、ドラビリン（ピフェルトロ）、エコリバー、エドクスジン、エファビレンツ、エルビテグラビル、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、エトラビリン（Ｉｎｔｅｌｅｎｃｅ）、ファンシクロビル、ファビピラビル（Ｔ－７０５；６－フルオロ－３－ヒドロキシ－２－ピラジンカルボキサミド）、フォミビルセン、フォサプレナビル、フォスカネット、フォスフォネット、融合阻害剤、ガンシクロビル（Ｃｙｔｏｖｅｎｅ）、イバシタビン、イバリズマブ（Ｔｒｏｇａｒｚｏ）、イドクスウリジン、イミキモド、イムノビル、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、インターフェロンＩ型、インターフェロンＩＩ型、インターフェロンＩＩＩ型、インターフェロン、ラミブジン、レテルモビル（Ｐｒｅｖｙｍｉｓ）、ロピナビル、ロビリド、マラビロック、メチサゾン、モロキシジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル、ニタゾキサニド、ノルビル、ヌクレオシド類似体、オセルタミビル（タミフル）、ペグインターフェロンアルファ－２ａ、ペグインターフェロンアルファ－２ｂ、ペンシクロビル、ペラミビル（ラピバブ）、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害薬（薬理学）、ピラミジン、ラルテグラビル、レムデシビル、逆転写酵素阻害剤、リバビリン、リルピビリン（エデュラント）、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、シメプレビル（オリシオ）、ソホスブビル、スタブジン、相乗的エンハンサー（抗レトロウイルス）、テラプレビル、テルビブジン（タイゼカ）、テノホビルアラフェナミド、テノホビルジソプロキシル、テノホビル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、トルバダ、バラシクロビル（バルトレックス）、バルガンシクロビル、ビクリビロク、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル（Ｒｅｌｅｎｚａ）及びジドブジンからなる群から選択される。
【0037】
静脈内投与の必要性及びレムデシビルの潜在的に限られた有効性により、代替療法又は補充療法の更なる調査が促された。したがって、様々な実施形態によれば、本開示は、併用療法におけるレムデシビルとのパートナとして本明細書に開示される化合物を提供する。
【0038】
本明細書に開示される併用療法は、いずれか又は両方の併用パートナの薬物用量を減少させながら治療の有効性を増加させることができ、したがって、より高い用量の投与に関連し得る副作用を予防することができる。薬物の組み合わせはまた、薬物耐性の獲得を遅らせることができる。相加的相互作用の予想を超える併用療法の活性の増加として定義される薬物相乗効果はまれであり、更に相加効果自体が治療レジメンを改善することができる。逆に、拮抗作用、化合物が独立して作用した場合に予想されるものを超える組み合わせ全体の活性の阻害は、望ましくない特性である。
【0039】
したがって、ＦＤＡに承認されたレムデシビルヒットとＲｅＦＲＡＭＥヒットとの間の相乗的、相加的、及び拮抗的相互作用を特定するために、本発明者等はチェッカーボード実験で相乗的相互作用研究を行い、１１ヒットの用量応答に対するレムデシビルの完全用量応答を、１０×１０マトリックスにおける魅力的な安全性及び薬物動態学的プロファイルと比較した（図２、パネルＥ）。本発明者等は、ゼロ相互作用効力モデル（ＺＩＰ）（１４）を使用して試験した化合物間の相互作用を評価するためにＲの相乗作用ファインダーパッケージ（１３）を使用し、δスコア＞１０は相乗作用の可能性を示し、δ＜－１０は拮抗作用を示し、－１０と１０の間のδは相加的な相互作用を示唆する。結果は、いくつかの例示的な組み合わせが相加的であることを示した（図２、パネルＥ及びＦ、表１）。
【0040】
このスクリーニングではまた、ヌクレオシド類似体リボプリン（悪心及び手術部位感染症の治療のための抗新生物剤として以前に研究されたＮ６－イソペンテニルアデノシン、並びに処方された出生前／出生後マルチビタミン／ミネラル錠剤であるＣｉｔｒａＮａｔａｌ ９０ ＤＨＡの成分）及び葉酸拮抗薬１０デアザアミノプテリン（現在開発の第ＩＩ相段階にある抗新生物化合物）が、レムデシビルの活性と相乗作用する活性を有するとして特定された。両化合物の相乗効果は、特定の濃度にわたって観察され、３次元相乗作用スコアランドスケープ内のピークとして示された。
【0041】
リボプリンは試験した濃度範囲にわたって最大（１００％）の有効性を達成したが、レムデシビルのＥＣ２の添加はそのＥＣ５０を１２μＭから３．６μＭにシフトさせ、レムデシビルのＥＣ２４の添加はその効力をＥＣ５０＝１．６μＭまで更に増加させた。１０－デアザアミノプテリンは、試験した濃度範囲にわたってわずか４０％の最大有効性を示したが、レムデシビルのＥＣ２の添加は最大有効性の４０％からほぼ６５％への増加を引き起こし（２％のシフトが予想される）、レムデシビルのＥＣ２４の添加は組み合わせの最大有効性を４０％から＞８０％に増加させた。
【0042】
医薬組成物
本開示は、様々な実施形態において、治療有効量の本明細書に記載の表１又は表４から選択される少なくとも１つの化合物、治療有効量の本明細書に記載の抗感染剤、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的配合の許容される慣例に従って、１つ又は複数の追加の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、アジュバント、安定剤、乳化剤、保存剤、着色剤、緩衝剤、及び香味付与剤を更に含む。
本開示は、様々な実施形態において、治療有効量の本明細書に記載の表１又は表４から選択される少なくとも１つの化合物、治療有効量の本明細書に記載の抗感染剤、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的配合の許容される慣例に従って、１つ又は複数の追加の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、アジュバント、安定剤、乳化剤、保存剤、着色剤、緩衝剤、及び香味付与剤を更に含む。
【0043】
本開示の医薬組成物は、優良医療実務と一致する様式で製剤化され、適量に分けられ、投与される。これに関連して考慮すべき因子には、処置される特定の障害、処置される特定の対象、対象の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に知られている他の因子が含まれる。
【0044】
併用療法の全ての有効成分を含む、投与される化合物の「治療有効量」は、そのような考慮事項によって左右され、抗感染性、例えば抗ウイルス効果を誘発するのに必要な最小量である。そのような量は、正常細胞又は対象全体に対して毒性である量未満であり得る。一般に、投与される本開示の化合物の初期治療有効量は、約０．０１～約２００ｍｇ／ｋｇ又は約０．１～約２０ｍｇ／ｋｇ患者体重／日の範囲であり、典型的な初期範囲は約０．３～約１５ｍｇ／ｋｇ／日である。経口単位剤形、例えば錠剤及びカプセル剤は、約１ｍｇ～約１０００ｍｇの本開示の化合物を含有し得る。別の実施形態では、そのような剤形は、約５０ｍｇ～約５００ｍｇの本開示の化合物を含有する。更に別の実施形態では、そのような剤形は、約２５ｍｇ～約２００ｍｇの本開示の化合物を含有する。更に別の実施形態では、そのような剤形は、約１０ｍｇ～約１００ｍｇの本開示の化合物を含有する。更なる実施形態では、そのような剤形は、約５ｍｇ～約５０ｍｇの本開示の化合物を含有する。
【0045】
組成物は、投与単位製剤で経口、局所、非経口、吸入若しくはスプレー又は直腸投与することができる。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射又は注入技術を含む。
【0046】
本開示による適切な経口組成物には、錠剤、トローチ、薬用ドロップ、水性又は油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒、エマルジョン、硬質又は軟質カプセル、シロップ又はエリキシル剤が含まれるが、これらに限定されない。
【0047】
本開示の化合物又はその薬学的に許容される立体異性体、塩若しくは互変異性体及び薬学的に許容される担体を含む単一単位投与量に適した医薬組成物が本開示の範囲内に含まれる。
【0048】
経口使用に適した組成物は、医薬組成物の製造のための当技術分野で公知の任意の方法に従って調製することができる。例えば、化合物の液体製剤は、アルギナーゼ阻害剤の薬学的に洗練された口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤及び保存剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含有する。
【0049】
錠剤組成物については、非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合した本開示の化合物を錠剤の製造に使用する。そのような賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム等の不活性希釈剤；造粒崩壊剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン又はアカシア；及び潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクが挙げられるがこれらに限定されない。錠剤はコーティングされていなくてもよく、又は胃腸管での崩壊及び吸収を遅延させ、それによって所望の期間にわたって持続的な治療作用を提供するために公知のコーティング技術によってコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の時間遅延材料を使用することができる。
【0050】
経口使用のための製剤はまた、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリンと混合される硬ゼラチンカプセルとして、又は活性成分が水若しくは油性媒体、例えば落花生油、流動パラフィン若しくはオリーブ油と混合される軟ゼラチンカプセルとして提供され得る。
【0051】
水性懸濁液の場合、本開示の化合物は、安定な懸濁液を維持するのに適した賦形剤と混合される。そのような賦形剤の例としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアゴムが挙げられるが、これらに限定されない。
【0052】
経口懸濁液はまた、分散剤又は湿潤剤、例えば天然ホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばポリオキシエチレンステアレート、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートを含有し得る。水性懸濁液はまた、１つ以上の保存剤、例えば、エチル、又はｎ－プロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤、及び１つ以上の甘味剤、例えばスクロース又はサッカリンを含有し得る。
【0053】
油性懸濁液は、本開示の化合物を植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油、又は流動パラフィン等の鉱油に懸濁することによって製剤化することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば蜜蝋、硬質パラフィン又はセチルアルコールを含有してもよい。
【0054】
上記のような甘味剤及び香味剤を添加して、口当たりのよい経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸等の酸化防止剤の添加によって保存され得る。
【0055】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末及び顆粒は、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤及び１つ以上の防腐剤と混合した本開示の化合物を提供する。適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤は、既に上述したものによって例示される。追加の賦形剤、例えば甘味剤、香味剤及び着色剤も存在し得る。
【0056】
本開示の医薬組成物は、水中油型エマルジョンの形態であってもよい。油性相は、植物油、例えばオリーブ油若しくは落花生油、又は鉱油、例えば流動パラフィン若しくはこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然に存在するガム、例えばアラビアガム又はトラガカントガム、天然に存在するホスファチド、例えばダイズ、レシチン、並びに脂肪酸及びヘキシトールに由来するエステル又は部分エステル、無水物、例えばソルビタンモノオレエート、及び当該部分エステルとエチレンオキシドとの縮合ジオン生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。エマルジョンはまた、甘味剤及び香味剤を含有し得る。
【0057】
シロップ及びエリキシルは、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はスクロースと共に製剤化され得る。そのような製剤はまた、粘滑剤、保存剤、並びに香味剤及び着色剤を含有し得る。医薬組成物は、滅菌注射剤、水性懸濁液又は油性懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、上記の適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、公知の技術に従って製剤化することができる。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液であってもよい。使用され得る許容され得るビヒクル及び溶媒の中には、水、リンガー液及び等張塩化ナトリウム溶液がある。更に、滅菌固定油は、溶媒又は懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の無刺激性固定油を使用することができる。更に、オレイン酸等の脂肪酸は、注射剤の調製に使用される。
【0058】
本開示の化合物はまた、化合物の直腸投与のための坐剤の形態で投与され得る。これらの組成物は、薬物を、常温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸内で融解して薬物を放出する、適切な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。そのような材料は、ココアバター及びポリエチレングリコールである。
【0059】
非経口投与のための組成物は、滅菌培地中で投与される。使用されるビヒクル及び製剤中の薬物の濃度に応じて、非経口製剤は、懸濁液又は溶解した薬物を含有する溶液のいずれかであり得る。局所麻酔薬、保存剤及び緩衝剤等のアジュバントを非経口組成物に添加することもできる。
【0060】
［実施例］
以下の実施例は、例示であり、本明細書に記載の組成物、方法、及び製剤の範囲に限定されない。
以下の実施例は、例示であり、本明細書に記載の組成物、方法、及び製剤の範囲に限定されない。
【0061】
ウイルス生成。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８６）を、１０％ＦＢＳ、１×ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｃｏｒｎｉｎｇ２０－００２－ＣＬ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５－００５－ＣＬ）を含有する完全ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ １５－０１３－ＣＶ）を含むＴ２２５フラスコに３７℃、５％ＣＯ２で一晩播種した。フラスコ内の培地を除去し、完全ＤＭＥＭ中の２ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ＮＲ－５２２８１）を０．５のＭＯＩでフラスコに添加し、３４℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、３０ｍＬの完全ＤＭＥＭをフラスコに添加した。次いで、フラスコを３４℃のインキュベータ内に５％ＣＯ２で５日間置いた。感染後５日目に上清を回収し、１，０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を０．２２μＭフィルターで濾過し、－８０℃で保存した。
【0062】
ＲｅＦＲＡＭＥライブラリ：化合物管理、薬物アノテーション及びスクリーンデータアクセス。ＲｅＦＲＡＭＥライブラリコレクションは、高品質ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したほぼ１２，０００個の高純度化合物（＞９５％）からなる。化合物の品質管理は、必要に応じて液体クロマトグラフィー－質量分析及び／又は１Ｈ－ＮＭＲによって行った。低濃度（２～１０μＭ）及び高濃度（１０～５０μＭ）のスクリーニング形式をサポートするために、ライブラリを２ｍＭ及び１０ｍＭの２つの濃度で調製した。エコー認定された３８４ウェル低デッドボリューム＋マイクロプレート（ＬＰ－０２００－ＢＣ；Ｌａｂｃｙｔｅ Ｉｎｃ．）をライブラリソースプレートとして使用して、Ｅｃｈｏ ５５５リキッドハンドラ（Ｌａｂｃｙｔｅ Ｉｎｃ．）による音響伝達をサポートした。ＤＭＳＯに溶解しない化合物を水にプレートした（１２９個の化合物）。ＤＭＳＯへの長期溶解性を欠く化合物を、沈殿を避けるために分注直前に懸濁した（７１個の化合物）。
【0063】
関連する化合物の注釈（表１）は、３つの広く使用されている市販の薬物競争知能データベース：Ｃｌａｒｉｖａｔｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ，ＧＶＫ Ｅｘｃｅｌｒａ ＧｏＳｔａｒ、及びＣｉｔｅｌｉｎｅ Ｐｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓによって支持されている。利用可能な場合、アノテーションデータは、臨床開発の状況及び達成された開発の最高段階、作用機序、１又は複数の薬物適応症、及び投与経路を含み得る。
【0064】
ＨｅＬａ－ＡＣＥ２安定細胞株。ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞を、ヒトＡＣＥ２レンチウイルスの形質導入によって作製した。レンチウイルスは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１６６８０１９）を使用して、ｐＢＯＢ－ｈＡＣＥ２構築物及びレンチウイルスパッケージングプラスミドｐＭＤＬ、ｐＲＥＶ及びｐＶＳＶ－Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションによって作製した。トランスフェクションの４８時間後に上清を回収し、次いで、予め播種したＨｅＬａ細胞を形質導入するために使用した。形質導入の１２時間後、安定な細胞株を回収し、スケールアップし、保存した。細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１０４３８０２６）及び１×ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、１１３６００７０）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、１１９６５－０９２）中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
【0065】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＨｅＬａ－ＡＣＥ２高含有量スクリーニングアッセイ。化合物を３８４ウェルμ透明底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｐａｒｔ．Ｎｏ．７８１０９０－２Ｂ）に音響的に移した。ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞を、ウェル当たり１．０×１０３細胞の密度で、２％ＦＢＳを含む１３μＬのＤＭＥＭに播種した。プレートした細胞をＢＳＬ３施設に輸送し、そこで、粉末再確認のために０．６５に調整した、一次スクリーニングのためのアッセイ感染多重度（ＭＯＩ）＝２．２で、アッセイ培地で希釈した１３μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をウェル当たり添加した。プレートを３４℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートし、次いで、４％ホルムアルデヒドの最終濃度で３４℃、５％ＣＯ２で１時間固定した。プレートを固定とその後の一次及び二次抗体染色との間に１×ＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ５５４７２３）で１：５００に希釈したヒトポリクローナル血漿をプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＰＢＳ）緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ３７５１５）中８μｇ／ｍＬ（１：２５０希釈）のヤギ抗ヒトＨ＋Ｌコンジュゲート化Ａｌｅｘａ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ１１０１３）を８μＭのａｎｔｉｆａｄｅ－４６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄ１３０６）と共にプレートに添加し、暗所で室温で１時間インキュベートした。プレートを、１０×対物レンズを有するＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して画像化し、ウェル当たり４つの視野を画像化した。画像を、宿主細胞核（画像中の細胞の総数）を同定するＤＡＰＩ染色及び感染細胞の同定をもたらすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫蛍光シグナルを用いて、多波長細胞スコアリングアプリケーションモジュール（ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ）を使用して分析した。
【0066】
添加時間（ＴＯＡ）アッセイ。ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞を、アッセイ培地（２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）に懸濁したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に、１．５のＭＯＩで、３４℃、５％ＣＯ２で１時間感染させ、次いで、ＰＢＳで十分に洗浄し、標準的なＨｅＬａ－ＡＣＥ２感染アッセイの場合と同様に、化合物を予めスポットしたアッセイ用３８４ウェルプレートに播種した。時間経過実験のために、細胞を４、５、６、７、８、１０、１１、１２及び２４ｈｐｉの最終濃度の４％ホルムアルデヒドで固定し、標準的な感染アッセイの場合と同様に染色及び画像化して、ＴＯＡアッセイの最適な時点を決定した。細胞を１０ｈｐｉに固定して、ＴＯＡアッセイを同じ様式で行った。
【0067】
Ｃａｌｕ－３ハイコンテンツスクリーニングアッセイ。アッセイは、以下の例外を除いて、ＨｅＬａ－ＡＣＥ２アッセイについて概説したように実施される。Ｃａｌｕ－３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－５５）（ＮＣＡＴＳ／ＮＩＨのＤｒ．及びＳｃｒｉｐｐｓ ＲｅｓｅａｒｃｈのＤｒ．Ｊｕａｎ Ｃａｒｌｏｓ ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅからの善意の贈与）を、アッセイ培地（２％ＦＢＳを含むＭＥＭ）に２０μＬ／ウェルで５，０００細胞の密度で播種し、アッセイ培地で希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、０．７５～１のＭＯＩで添加して、約３０～６０％の感染細胞を達成した。プレートを３４℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートし、次いで、４％ホルムアルデヒドの最終濃度で固定した。固定した細胞を染色し、ＨｅＬａ－ＡＣＥ２アッセイと同様に画像化した。
【0068】
非感染宿主細胞傷害性カウンタースクリーニング。ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞の場合、化合物を１，５３６ウェルμクリアプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｐａｒｔ、Ｎｏ．７８９０９１）に音響的に移した。ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞を感染アッセイについて記載されるように維持し、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中４００細胞／ウェルでアッセイ準備プレートに播種し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。細胞生存率を評価するために、Ｉｍａｇｅ－ｉＴ ＤＥＡＤグリーン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を製造者の説明書に従って使用した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩで対比染色した。１０×対物レンズを有するＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓマイクロ共焦点ハイコンテンツイメージングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して固定細胞を画像化し、Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄアプリケーションモジュール（ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ）を使用して取得した画像においてウェル当たりの全生細胞を定量化した。
【0069】
Ｃａｌｕ－３細胞の場合、アッセイ培地（２％ＦＢＳを含むＭＥＭ）にＣａｌｕ－３細胞をウェル当たり５μＬ当たり６００細胞の密度で播種する前に、化合物を１，５３６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｎｏ．９００６ＢＣ）に音響的に移した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。細胞生存率を評価するために、水に希釈した２μＬの５０％Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏ Ｇ７５７３）を細胞に添加し、ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光を測定した。
【0070】
ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６５）及びＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）哺乳動物細胞株を、加湿組織培養インキュベータにおいて、１０％熱不活性化ＨｙＣｌｏｎｅ ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００ＩＵペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。ヒット化合物の哺乳動物毒性をアッセイするために、７５０個のＨｅｐＧ２及び３７５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞／ウェルを、４０μＭで開始する３倍段階希釈で音響的に転移させた化合物を含有する１５３６ウェル白色組織培養処理固体底板（Ｃｏｒｎｉｎｇ、９００６ＢＣ）中のアッセイ培地（ＤＭＥＭ、２％ＦＢＳ、１００ＩＵペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）にそれぞれ播種した。７２時間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＮｏＧ７５７３）を用いて、Ｃａｌｕ－３細胞の場合と同様に細胞生存率を定量した。
【0071】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２一次ＡＬＩ ＨＢＥＣモデル。正常な初代ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）（Ｌｏｎｚａ）を、１μｍのＰＥＴフィルター（Ｓｉｇｍａ）を備えたＭｉｌｌｉｃｅｌｌ－９６細胞培養インサートプレート内で、気液界面で、ＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ（商標）－ＡＬＩ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて少なくとも４週間培養した。簡単に説明すると、ＨＢＥＣを最初に細胞培養フラスコで増殖させた後、ＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ（商標）－Ｅｘ Ｐｌｕｓ培地に浸してウェル当たり１０，０００個の細胞を播種した。１週間後、細胞をＰｎｅｕｍａ Ｃｕｌｔ（商標）－ＡＬＩ培地に切り替え、培地を頂端面から除去した。気液界面を維持し、培地を２～３日ごとに少なくとも４週間交換して、細胞の分化を可能にした。感染前に、頂端面をＤＰＢＳで１回すすぎ、化合物を基底外側チャンバーに添加した。２０，０００ＰＦＵ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０を５０μＬのＰＢＳ中で頂端面に添加し、２時間インキュベートした。次いで、接種材料を除去し、細胞をＤＰＢＳで１回すすいだ。培地を交換し、新鮮な化合物を感染の２４時間後及び４８時間後に添加した。感染後７２時間で、頂端表面に１００μＬのＤＰＢＳを１５分間添加することによって頂端洗浄液を回収した。ＲＮＡを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｐｒｏ ９６Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して頂端洗浄液から単離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及び２０１９－ｎＣｏＶ Ｎ１ ＣＤＣプライマー及びプローブセット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＲＴ－ｑＰＣＲによってウイルスＲＮＡレベルについて分析した。ストックウイルスの連続希釈物からＲＮＡを単離することによって標準曲線を作成し、各試料のＰＦＵ当量／ｍＬを決定するために使用した。次いで、ウイルス量減少を、中性ＤＭＳＯ対照と比較して各実験化合物処置について決定し、対数スケールでプロットした。細胞傷害性を、細胞傷害性検出キット（ＬＤＨ）（Ｓｉｇｍａ）を製造者の説明書に従って使用して側底培地中のＬＤＨ活性を測定することによって評価した。実験試料について平均値を取り、陽性対照ピューロマイシンのパーセンテージとして示した。抗ウイルス性及び細胞傷害性の読出しの両方について、技術的な三連を行った。
【0072】
ゴールデンシリアンハムスターＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２有効性モデル。８週齢のゴールデンシリアンハムスター（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（群当たり５匹）に、示されるように経口（ＰＯ）で投薬した。最初の投与の４時間後、１００μＬのＤＭＥＭ中の動物当たり１０６個の総ＰＦＵの鼻腔内設置によってハムスターを感染させた。ハムスターに化合物を１日２回（ＢＩＤ）投与し、試験期間中体重を測定した。感染後５日目に、ハムスターを屠殺し、肺組織を分析のために単離した。研究プロトコルは承認され、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＡＣＵＣ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＃２０－０００３に従って実施された。
【0073】
肺ウイルス力価測定。１００μｍ細胞ストレーナー（Ｍｙｒｉａｄ２８２５－８３６７）を使用してＤＭＥＭ２％ＦＣＳ中で器官をホモジナイズすることによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２力価を測定した。均質化された器官を６段階にわたって１：１０で滴定し、Ｖｅｒｏ細胞上に重層した。３７℃で１時間インキュベートした後、ＤＭＥＭオーバーレイ中１％メチルセルロースを添加し、細胞を３７℃で３日間インキュベートした。細胞を４％ＰＦＡで固定し、プラークをクリスタルバイオレット染色によって計数した。
【0074】
薬物動態学的研究。薬物動態研究は、ＩＡＣＵＣガイドライン（ＩＡＣＵＣプロトコル＃０９－０００４－５）に従って、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ Ｃｏｒｅで実施した。８週齢の雄のシリアンハムスター（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（１群当たり３匹）に、各化合物及び製剤について示されるようにＰＯを投与した。各試験物の血漿濃度を４８時間まで監視した。薬物動態試験及び有効性試験の両方のために、ネルフィナビルを１０％ＤＭＳＯ／９０％トウモロコシ油に製剤化し、ＭＫ－４４８２を１０％ＰＥＧ４００／２．５％Ｃｒｅｍａｐｈｏｒ ＲＨ４０に製剤化した。
【0075】
ハムスター肺ＲＮＡ分析。非感染（Ｕ、ｎ＝２）、ビヒクル処理（Ｖ、ｎ＝４）及びＭＫ－４４８２処理（Ｔ、ｎ＝４）試料からのハムスター肺を、ＲＮＡＳｅｑプラットフォームを用いて分析した。パイソンパッケージｓｃｉｐｙ．ｓｔａｔｓ．ｍｅｄｉａｎ＿ａｂｓｏｌｕｔｅ＿ｄｅｖｉａｔｉｏｎを使用して、全ての遺伝子について平均絶対偏差（ＭＡＤ）を計算する。ＳｔｅｐＭｉｎｅｒアルゴリズムＳａｈｏｏ，Ｄ．，Ｄｉｌｌ，Ｄ．Ｌ．，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ｒ．＆Ｐｌｅｖｒｉｔｉｓ，Ｓ．Ｋ．Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｂｉｎａｒｙ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｉｍｅ－ｃｏｕｒｓｅ ｄａｔａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５，３７０５－３７１２，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｍ２８４（２００７）を適用して、２２，２８４個の遺伝子を１４，９３９個までフィルタリングする高いＭＡＤ値を選択した。ＳｔｅｐＭｉｎｅｒアルゴリズムを再度適用して、１４，９３９を８，６１７遺伝子までフィルタリングした。パイソンｓｅａｂｏｒｎクラスターマップライブラリ機能を用いて、これらの８，６１７個の遺伝子に対して階層的凝集クラスタリング分析を行った。差次的発現分析を、ＤＥＳｅｑ２２７（ＭＫ－４４８２処理対ビヒクル処理試料）を使用して行い、調整されたｐ値＜０．１及び倍数変化の｜ｌｏｇ２｜＞１を適用して、アップレギュレーション／ダウンレギュレーションされた遺伝子を同定する。組換え経路分析（Ｆａｂｒｅｇａｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｒｅａｃｔｏｍｅ Ｐａｔｈｗａｙ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４６，Ｄ６４９－Ｄ６５５，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｘ１１３２（２０１８））を実施して、遺伝子セットに濃縮された高レベルの生物学的プロセスを同定した。ｘ軸として－ｌｏｇ１０（ｆｄｒ）を有する棒グラフを使用して、濃縮された生物学的プロセスの有意性を実証する。
【0076】
ＲＮＡＳｅｑ。ＲＮＡ配列決定ライブラリを、２５年以前に正確に記載されたように、ＴｒｕＳｅｑ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘｅｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｇｏｌｄを使用して作製した。簡潔には、ＲＮＡ剪断時間を５分に変更することを除いて、サンプルを製造者の指示に従って処理した。得られたライブラリを多重化し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏのｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＩＧＭ）によりＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００上でサンプル当たり約２５～４０００万リードの深さまで１００塩基対（ｂｐ）の対末端（ＰＥ１００）で配列決定した。ｂｃｌ２ｆａｓｔｑ ｖ２．２０ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて試料を逆多重化した。ＲＮＡｓｅｑデータを、ｋａｌｌｉｓｔｏ（ｖｅｒｓｉｏｎ ０．４５．０），Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ ａｕｒａｔｕｓ ｇｅｎｏｍｅ（ＭｅｓＡｕｒ１．０）を使用して処理した。ｔｘｉｍｐｏｒｔ及びｂｉｏｍａＲｔ Ｒパッケージを使用して、遺伝子レベルＴＰＭ値及び遺伝子注釈を計算した。カスタムパイソンスクリプトを使用してデータを編成し、ＴＰＭ＞１の場合はｌｏｇ２（ＴＰＭ）を使用し、ＴＰＭ＜＝１の場合はＴＰＭ－１を使用してログを削減した。ハムスター試験のために、カリストインデックスをＭｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ＿ａｕｒａｔｕｓ．ＭｅｓＡｕｒ１．０．ｎｃｒｎａ．ｆａ．ｇｚ＋Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ＿ａｕｒａｔｕｓ ＭｅｓＡｕｒ１．０ｃｄｎａ．ａｌｌ．ｆａ．ｇｚで調製した。生データ及び処理されたデータは、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＮＣＢＩ ＧＥＯからの係属中のＧＳＥＩＤ）に寄託される。
【0077】
ハムスター肺の病理組織学／濾液の定量化。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、Ｈ＆Ｅ染色スライド画像を定量化する（倍率２０倍）。画像を最初に８ビットに変換し（画像＞種類＞８ビット）、それらの閾値を調整し（画像＞調整＞閾値）、暗い染色核のみを確実に検出するために７０～８０％の閾値を選択する。閾値化後、画像をマスクに変換し（プロセス＞バイナリ＞マスクに変換）、デフォルト設定で解析し（解析＞粒子を解析）、表示結果を追加してアウトラインを示し、出力をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｖ９．０．０）にエクスポートし、ノンパラメトリック両側マン・ホイットニー統計検定を使用して有意性を計算した。
【0078】
データ分析。ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（バージョン６．５．４．５３２）を用いて、高コンテンツ画像解析を行った。一次インビトロスクリーニング及び宿主細胞傷害性カウンタースクリーニングのデータをＧｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ、バージョン１６．０．３－Ｓｔａｎｄａｒｄにアップロードした。ＨｅＬａ－ＡＣＥ２データを、中性（ＤＭＳＯ）マイナス阻害剤対照（ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞における抗ウイルス効果については２．４μＭレムデシビル及び感染宿主細胞毒性については１０μＭピューロマイシン）に対して正規化した。Ｃａｌｕ－３感染アッセイデータを、中性（ＤＭＳＯ）マイナス阻害剤対照（１０μＭレムデシビル）に対して正規化し、Ｃａｌｕ－３細胞数の読出しについては、全細胞を刺激因子（１０μＭレムデシビル）マイナス中性対照（ＤＭＳＯ）に対して正規化した。非感染宿主細胞傷害性カウンタースクリーニングのために、４０μＭピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）をＨｅＬａ－ＡＣＥ２、ＨｅｐＧ２及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞における陽性（阻害性）対照として使用し、３０μＭピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）をＣａｌｕ－３細胞に対する陽性（阻害性）対照として使用した。用量応答実験のために、化合物を異なるアッセイプレート上で技術的な三連で試験し、用量曲線を４つのパラメータヒル式でフィッティングした。技術的複製データを、中央凝縮を用いて分析した。複数の独立した生物学的実験で得られた化合物活性（ＥＣ５０及びＣＣ５０）について、幾何平均及び幾何標準偏差を報告する。Ｒの相乗ファインダーパッケージ（バージョン３．６．３）を相乗効果分析に使用した（（Ｉａｎｅｖｓｋｉ，Ａ．，Ｈｅ，Ｌ．，Ａｉｔｔｏｋａｌｌｉｏ，Ｔ．＆Ｔａｎｇ，Ｊ．ＳｙｎｅｒｇｙＦｉｎｄｅｒ：ａ ｗｅｂ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍａｔｒｉｘ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３３，２４１３－２４１５，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｘ１６２（２０１７））。幾何平均は、全ての値の対数（底１０）を計算し、これらの対数の平均を計算し、その平均の逆対数をとることによって計算した。幾何標準偏差は、対数変換された個々の値の標準偏差をとり、その標準偏差の逆対数をとることによって計算した。幾何標準偏差は単位なしの比率であり、＋／－．の代わりに×÷として報告される。すなわち、報告された０．１２３μＭ×÷１．２７６について、標準偏差範囲は０．０９６μＭ～０．１５７μＭ（すなわち、０．１２３μＭ÷１．２７６～０．１２３μＭ×１．２７６）である。
【0079】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する高スループットＣａｌｕ－３表現型ＲｅＦＲＡＭＥスクリーニング。比較的迅速な２４時間ＨｅＬａ－ＡＣＥ２アッセイを補完し、ヒットを優先順位付けするために、本発明者等は、同じ抗体検出及び同様のアッセイワークフローに依存するＣａｌｕ－３細胞を使用して、第二のより生理学的に関連する感染アッセイを開発し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（ｈｐｉ）後４８時間で読み出した（上述）。Ｃａｌｕ－３は、ＡＣＥ２受容体と宿主セリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２の両方を内因的に発現するヒト肺上皮細胞であり、これはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のプロセシング及び宿主細胞へのウイルス侵入に必要であり（Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｒｙ Ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ＡＣＥ２ ａｎｄ ＴＭＰＲＳＳ２ ａｎｄ Ｉｓ Ｂｌｏｃｋｅｄ ｂｙ ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｖｅｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｃｅｌｌ １８１，２７１－２８０ ｅ２７８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２０．０２．０５２（２０２０））、一方、ＴＭＰＲＳＳ２発現を欠くＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞における強い感染は、コロナウイルスの一般的に認識されている機構であるエンドソームのカテプシン媒介性ウイルス侵入経路に依存する可能性が高い（Ｙａｎｇ，Ｎ．＆Ｓｈｅｎ，Ｈ．Ｍ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ Ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ Ｐｒｏｃｅｓｓ ａｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ＣＯＶＩＤ－１９．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ １６，１７２４－１７３１，ｄｏｉ：１０．７１５０／ｉｊｂｓ．４５４９８（２０２０））。
【0080】
レムデシビルは、Ｃａｌｕ－３細胞において活性であり（ＥＣ５０＝４４４ｎＭ×÷１．５１４（ｎ＝４））、ＴＭＰＲＳＳ２阻害剤メシル酸ナファモスタットと同様であった（ＥＣ５０＝２４ｎＭ×÷１．５５（ｎ＝３））。ＨｅＬａ－ＡＣＥ２スクリーニングとは対照的に、Ｃａｌｕ－３アッセイでは細胞変性効果がより顕著であった（ＭＯＩがより高く、使用されるインキュベーション時間がより長いためと思われる）。結果として、抗ウイルス化合物はまた、細胞をウイルス誘導性細胞死から保護し、化合物抗ウイルス活性に関連する第２の測定基準を提供した。注目すべきことに、５２回のＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＲｅＦＲＡＭＥヒットの大部分は、Ｃａｌｕ－３細胞ベースのアッセイでは活性でなかった（５８％、３０／５２）か、又は選択的でなかった。
【0081】
ＨｅＬａ－ＡＣＥ２及びＣａｌｕ－３細胞における活性の重複の制限により、Ｃａｌｕ－３細胞を用いたＲｅＦＲＡＭＥライブラリの再スクリーニングが促された。スクリーニングを２．５μＭの最終濃度で実施し、ＲＺ’＝０．７４４であり、感染の＞５０％の阻害、感染の＜８０％の細胞毒性又は＞４０％の阻害、及び細胞数の＞４０％の増加（ウイルス誘導性細胞死からの保護）を示す２３５の主要ヒットが同定された。これらのうち、１４５は、用量応答形式で試験した場合に中程度に活性であったが（ＥＣ５０＜１０μＭ）、しかし、４２のみがまた選択的であった（ＣＣ５０／ＥＣ５０＞１０又はＣＣ５０＞３０μＭ）。８８個の推定ヒット化合物を新鮮な粉末ストック（ＣＣ５０／ＥＣ５０＞５又はＣＣ５０＞３０μＭ、ＣＣ５０／ＥＣ５０＜５であるが、非感染細胞傷害性アッセイで５０％未満の減少があり、ＥＣ５０＜１μＭを有する３つの追加の化合物が感染細胞数読み出しで保護を示す）として試験するために選択し、８７個が強力であると再確認され、４１個がＣａｌｕ－３細胞においても選択的であると再確認された。再確認された４１個のＣａｌｕ－３ＲｅＦＲＡＭＥヒットを同様にＨｅＬａ－ＡＣＥ２感染アッセイで再試験した。これらのうち、６３％（２６／４１）はＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して不活性であったが、３４％（１４／４１）は活性であるが強く細胞傷害性であり、非感染ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞においてＣＣ５０は３μＭ未満であった。エンドソームカテプシン媒介侵入阻害剤の同定。Ｃａｌｕ－３アッセイにおけるＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＲｅＦＲＡＭＥヒットの限定された活性の１つの可能性のある供給源は、各細胞株においてウイルスによって使用される侵入機構であるため、本発明者等は、ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞における添加時間（ＴＯＡ）アッセイを確立し、ＲｅＦＲＡＭＥヒットの中で、ＴＭＰＲＳＳ２侵入の文脈において活性である可能性が低いカテプシン媒介性ウイルス侵入阻害剤を同定した。最初に感染の動態を決定するために、ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に１時間感染させ、その後、吸着していないウイルスを洗い流し、細胞をＤＭＳＯ、ヒドロキシクロロキン、アピリモド又はレムデシビルの存在下、１０μＭの最終濃度で３８４ウェルプレートに蒔いた。ウェル中の細胞を示されるように４ｈｐｉから２４ｈｐｉまで固定し、各時点での感染細胞パーセントを定量した。
【0082】
レムデシビルを除く全ての処置において、ウイルス感染は、６ｈｐｉでの抗体染色によって最初に明らかとなり、１０ｈｐｉから１２ｈｐｉでほぼ最大レベルに達した。１ｈｐｉで治療を開始した場合のアピリモド及びヒドロキシクロロキンの両方の活性の喪失は、これらの化合物がＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞へのウイルス侵入をブロックする一方で、レムデシビル治療は、その直接的な抗ウイルス作用機序と一致して、１ｈｐｉで治療を開始したにもかかわらず、感染を効果的にブロックしたことを示す。
【0083】
これらの結果に基づいて、本発明者等は、用量応答における全てのＨｅＬａ－ＡＣＥ２ ＲｅＦＲＡＭＥヒットの活性を評価したＴＯＡアッセイ（上記）において、複製サイクルを制限するために１０ｈｐｉの時点を使用した。本発明者等は、ＴＯＡアッセイにおけるそれらの活性の低下、すなわち標準的な２４時間とＴＯＡアッセイとの間の＞１０のＥＣ５０比に基づいて、Ｃａｌｕ－３細胞において不活性であった化合物の３３％（１０／３０）がＨｅＬａ－ＡＣＥ２における侵入阻害剤であることを見出した。対照的に、Ｃａｌｕ－３細胞においても活性であった化合物（ＥＣ５０＜１０μＭ）は、その閾値において進入阻害剤として明確に分類することができなかった。オシメルチニブ及びＭＫ－２２０６はそれぞれ＞８の比を有し、これらがＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞におけるウイルス侵入に関与し得ることを示唆したが、Ｃａｌｕ－３細胞におけるそれらの抗ウイルス活性は非特異的であった（ＳＩ＜２）。
【0084】
ＲｅＦＲＡＭＥヒット優先順位付け及び検証。ＲｅＦＲＡＭＥライブラリは、生物活性小分子の集合体であり、その多くは承認された薬物又は開発の臨床段階にあり、多種多様な適応症に使用される。ＨｅＬａ－ＡＣＥ２スクリーニングで粉末として再確認された上位５クラスの強力かつ選択的な化合物は、腫瘍崩壊性化合物（９）、イオンチャネル調節剤（７）、抗炎症剤（５）、抗ウイルス剤（５）及びシグナル伝達調節剤（５）であったが、Ｃａｌｕ－３スクリーニングでは、上位５クラスはシグナル伝達調節剤（１４）、腫瘍崩壊性化合物（１１）、プロテアーゼ阻害薬（７）、抗生物質（３）及びイオンチャネル調節剤（３）であった。両方のスクリーニングにおける強力かつ選択的なヒットのうちの５番目は、急速に増殖する細胞に存在する宿主細胞プロセスへのウイルスの依存を反映して、腫瘍崩壊薬として分類され得る。ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞において排他的に抗精神病及び抗寄生虫（顧みられない熱帯病）クラスに属する化合物の同定は、これらの分子のいくつかのカチオン性の両親媒性の性質、及び酸性の細胞内区画に蓄積し、それに影響を及ぼすそれらの能力を反映し得る（例えば後期エンドソーム／リソソーム）。エンドリソソーム経路の結果として生じる調節不全及び脂質ホメオスタシスは、ウイルスの侵入及び／又は複製を損なうことが示唆されている（Ｓａｌａｔａ，Ｃ．，Ｃａｌｉｓｔｒｉ，Ａ．，Ｐａｒｏｌｉｎ，Ｃ．，Ｂａｒｉｔｕｓｓｉｏ，Ａ．＆Ｐａｌｕ，Ｇ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉ Ｉｎｆｅｃｔ Ｔｈｅｒ １５，４８３－４９２，ｄｏｉ：１０．１０８０／１４７８７２１０．２０１７．１３０５８８８（２０１７））、この作用様式は、いずれもＨｅＬａ－ＡＣＥ２スクリーニングにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する強力かつ選択的なヒットとして特定された、アミオダロン及びヒドロキシクロロキンについて推測されている。しかしながら、ヒドロキシクロロキンのみが本発明者等のアッセイにおいて侵入阻害剤として同定された。
【0085】
本発明者等の一次スクリーニングでヒットとして同定された化合物から、高い関心対象の化合物は、ＨｅＬａ－ＡＣＥ２及びＣａｌｕ－３アッセイの両方で活性及び選択性であり、ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞における侵入阻害剤として分類されなかったレムデシビルのプロファイルのようなプロファイルを有する化合物であった。プロドラッグＭＫ－４４８２の親であるＮ－ヒドロキシシチジンは、ＭＫ－４４８２自体はインビトロで活性ではなかったが、おそらくＭＫ－４４８２をその活性形態に変える代謝の欠如のために、そのプロファイルと一致した。
【0086】
更に、Ｃａｌｕ－３において活性であるが、ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞において活性ではないナファモスタットメシラート、ＴＭＰＲＳＳ２阻害剤等の化合物は、感染の進行モデルにおいて活性である可能性を有していた。逆に、Ｃａｌｕ－３細胞において活性でないＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞における侵入阻害剤（例えば、アピリモド、ヒドロキシクロロキン、アジスロマイシン）の優先順位を下げた。発明者らの優先順位付けに基づいて、発明者らは、感染の直交気液界面初代ヒト気管支上皮細胞（ＡＬＩ－ＨＢＥＣ）モデルにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する代表的なヒットの活性を試験した。これらの分化した気道細胞は、高レベルのＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の両方を発現する。予想通り、レムデシビル及びメシル酸ナファモスタットは、ＡＬＩ－ＨＢＥＣにおいてウイルス複製を阻害したが、アピリモドは阻害しなかった。更に、メシル酸ネルフィナビル、ＭＫ－４４８２及びその親Ｎ－ヒドロキシシチジンは全て、７２ｈｐｉで頂端ウイルス量の１ｌｏｇ超の減少を引き起こした。これらの結果は、ヒット優先順位付けの本発明者等のモデルと一致した。
【0087】
全体として、本発明者等は、承認された経口薬ハロファントリンＨＣｌ、メシル酸ネルフィナビル、シメプレビル、及びマニジピンを、両方のアッセイにおけるそれらの活性、並びに治療薬としてのそれらの比較的高い曝露量又は長い使用歴のために最も関心の高いヒットとして特定し、したがって動物モデルにおける更なる有効性評価後にＣＯＶＩＤ－１９治療として迅速に再利用される可能性を特定した。ウイルスプロテアーゼ阻害薬のネルフィナビル及びシメプレビルは、良好な血漿曝露を報告しており、それらの記載された作用様式に基づいて、それらはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を直接阻害し得る。承認されたカルシウムチャネル遮断薬のマニジピンは、血漿曝露が低いが、患者のＣＯＶＩＤ－１９疾患の転帰を改善する可能性があり得る。様々な開発段階の９つの他の化合物もまた、スクリーニングアッセイにおける効力又は薬物動態プロファイルのために有効性を示す可能性が高い（表を参照のこと）。ＴＯ－１９５及びＲＷＪ－５６４２３は両方ともトリプシン阻害剤であり、アボラルスタットはウイルス侵入を阻止し得るＣａｌｕ－３細胞において活性なカリクレイン阻害剤である。ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害剤、ＬＹ２２２８２０／メシル酸ラリメチニブは、ＨｅＬａ－ＡＣＥ２スクリーニング及びＣａｌｕ－３スクリーニングの両方で活性であり、ｐ３８ ＭＡＰＫ２３の阻害を介して他のコロナウイルスの複製を阻害することが以前に示された。したがって、ｐ３８ＭＡＰＫは、コロナウイルス複製を阻害するための重要な宿主標的であり得る。注目すべきことに、プロドラッグＭＫ－４４８２の親であるＮ－ヒドロキシシチジン（モルヌピラビル、ＥＩＤＤ－２８０１）は、ＨｅＬａ－ＡＣＥ２アッセイ及びＣａｌｕ－３アッセイの両方において強力かつ選択的なヒットであった。ＭＫ－４４８２は、Ｒｉｄｇｅｂａｃｋ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ及びＭｅｒｃｋによってＣＯＶＩＤ－１９患者の治療において現在評価されている経口抗ウイルスヌクレオシド類似体である。
【0088】
ＭＫ－４４８２経口投与は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して完全に防御的である。ＡＬＩ－ＨＢＥＣ初代細胞モデルにおける実証されたインビトロ効力並びにネルフィナビル及びＭＫ－４４８２／Ｎ－ヒドロキシシチジンの十分な曝露（ネルフィナビルの単回５００ｍｇ／ｋｇ ＰＯ用量では約３時間のＣａｌｕ－３ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥＣ５０の時間、ＭＫ－４４８２の単回５００ｍｇ／ｋｇ ＰＯ用量では７時間以上のＨｅＬａ－ＡＣＥ２及びＣａｌｕ－３ＥＣ５０の時間）のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のゴールデンシリアンハムスター動物モデルにおけるネルフィナビル及びＭＫ－４４８２の有効性を調査した。用量依存的保護を評価するために、ネルフィナビルを５００ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ（１日２回）でＰＯ送達し、ＭＫ－４４８２を５００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤでＰＯ送達した。一致したビヒクルのみの懸濁液を対照として使用した。最初の処置の４時間後、動物を鼻腔内投与によって１×１０６ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０）でチャレンジした。疾患進行の尺度として動物の体重を毎日測定し、感染の５日目に肺組織を単離してウイルス力価、肺組織学及び遺伝子発現プロファイルを決定した。ネルフィナビルは、おそらくハムスターにおける不十分な血漿曝露に起因して、体重減少及びウイルス複製から動物を保護することができなかった。しかし、ＭＫ－４４８２は、５００ｍｇ／ｋｇで動物を重度の体重減少から保護し、平均して感染５日目において開始体重の９７％であった。１５０ｍｇ／ｋｇ群及び５０ｍｇ／ｋｇ群は、感染の５日目にビヒクル対照８５％と比較して、それぞれその開始重量の平均８９％及び９０％の減量による部分的な保護を示した。
【0089】
体重減少との相関を分析するために、クリスタルバイオレットに基づくプラークアッセイを使用して、５日目の肺試料から相対的ウイルス力価を決定した。５００ｍｇ／ｋｇ及び１５０ｍｇ／ｋｇの用量は、肺において検出不能な生存ウイルス力価を有し、ウイルス複製からの完全な保護を示した。５０ｍｇ／ｋｇ群は平均４．５×１０３ＰＦＵ／肺であり、平均４．５×１０５ＰＦＵ／肺のビヒクル対照群と比較して中程度に良好な有効性（９９％のウイルス減少）を示した。
【0090】
５００ｍｇ／ｋｇ処置群における体重減少及びウイルス血症からの保護は、ハムスター肺に対するＲＮＡ Ｓｅｑ分析、引き続いて教師なし階層的クラスタリングによって決定されるように、宿主免疫応答からのほぼ完全な保護に関連していた；ＭＫ－４４８２処理（５００ｍｇ／ｋｇ）試料を非感染試料と一緒にクラスター化した。ＤＥＳｅｑ２分析により、感染したビヒクル処理肺が、インターフェロンシグナル伝達及びインターフェロン刺激遺伝子を含む、ＣＯＶＩＤ－１９において上方制御されると報告されている経路に関連する６６個の遺伝子の発現を誘導することが確認された（Ｔｉｎｄｌｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｄｕｌｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｌｕｎｇ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｍｏｄｅｌｓ Ｅｍｕｌａｔｅ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ＣＯＶＩＤ－１９．ｂｉｏＲｘｉｖ，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．１０．１７．３４４００２（２０２０）；Ｓａｈｏｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＡＩ－ｇｕｉｄｅｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｈｏｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｖｉｒａｌ ｐａｎｄｅｍｉｃｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．０９．２１．３０５６９８（２０２０））。最後に、組織学的検査により、ＭＫ－４４８２処置ハムスターの肺が保護され、非感染動物の組織によりよく似ていることが確認された。全く対照的に、ビヒクル処置対照群の肺組織の検査は、肺胞腔の閉塞及び圧倒的な免疫細胞浸潤を明らかにした。
【0091】
本開示において引用される参考文献の番号
１．Ａ．Ｚｕｍｌａ，Ｊ．Ｆ．Ｃｈａｎ，Ｅ．Ｉ．Ａｚｈａｒ，Ｄ．Ｓ．Ｈｕｉ，Ｋ．Ｙ．Ｙｕｅｎ，Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ－ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １５，３２７－３４７（２０１６）．
２．Ｅ．ｄｅ Ｗｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ（ＧＳ－５７３４）ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１７，６７７１－６７７６（２０２０）．
３．Ｔ．Ｐ．Ｓｈｅａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ＧＳ－５７３４ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｂｏｔｈ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ａｎｄ ｚｏｏｎｏｔｉｃ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９，（２０１７）．
４．Ｍ．Ｋ．Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＧＳ－５７３４ ａｎｄ ｉｔｓ ｐａｒｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｆｉｌｏ－，Ｐｎｅｕｍｏ－，ａｎｄ Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，４３３９５（２０１７）．
５．Ｊ．Ｊａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＲｅＦＲＡＭＥ ｌｉｂｒａｒｙ ａｓ ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄｒｕｇ ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１５，１０７５０－１０７５５（２０１８）．
６．Ｍ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｒｅｃｅｎｔｌｙ ｅｍｅｒｇｅｄ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（２０１９－ｎＣｏＶ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３０，２６９－２７１（２０２０）．
７．Ｍ．Ｐｒａｊａｐａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ：Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ．Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５２，５６－６５（２０２０）．
８．Ｃ．Ｓａｌａｔａ，Ａ．Ｃａｌｉｓｔｒｉ，Ｃ．Ｐａｒｏｌｉｎ，Ａ．Ｂａｒｉｔｕｓｓｉｏ，Ｇ．Ｐａｌｕ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉ Ｉｎｆｅｃｔ Ｔｈｅｒ １５，４８３－４９２（２０１７）．
９．Ｌ．Ｍ．Ｊｏｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＤＡ－ａｐｐｒｏｖｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，１９０ｒａ１７９（２０１３）．
１０．Ｍ．Ｂ．Ｏｌｄｓｔｏｎｅ，Ｊ．Ｒ．Ｔｅｉｊａｒｏ，Ｋ．Ｂ．Ｗａｌｓｈ，Ｈ．Ｒｏｓｅｎ，Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｕｎｃｏｖｅｒｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｏｍｂａｔ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４３５，９２－１０１（２０１３）．
１１．Ｍ．Ｍａｚｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒｏａｄ－Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｖｉｒａｌ Ｅｎｔｒｙ．Ｖｉｒｕｓｅｓ １１，（２０１９）．
１２．Ｅ．Ａ．Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５－ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｐｉｌｉｍｏｄ ｂｌｏｃｋｓ ｆｉｌｏｖｉｒａｌ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ Ｄｉｓ １１，ｅ０００５５４０（２０１７）．
１３．Ａ．Ｉａｎｅｖｓｋｉ，Ｌ．Ｈｅ，Ｔ．Ａｉｔｔｏｋａｌｌｉｏ，Ｊ．Ｔａｎｇ，ＳｙｎｅｒｇｙＦｉｎｄｅｒ：ａ ｗｅｂ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍａｔｒｉｘ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３３，２４１３－２４１５（２０１７）．
１４．Ｂ．Ｙａｄａｖ，Ｋ．Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇ，Ｔ．Ａｉｔｔｏｋａｌｌｉｏ，Ｊ．Ｔａｎｇ，Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｓｙｎｅｒｇｙ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｄｏｓｅ－Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ｍｏｄｅｌ．Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ １３，５０４－５１３（２０１５）．
１５．Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｎ ｃｏｍｐａｓｓｉｏｎａｔｅ ｕｓｅ Ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ Ｇｉｌｅａｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｎｏ．ＥＭＥＡ／Ｈ／Ｋ／５６２２／ＣＵ（ＥＭＡ／１７８６３７／２０２０）．
１６．Ｃ．Ｊ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｅ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｌｉｐｉｄ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｄａｔａ ｔｏ ｅｘｐｌａｉｎ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｏｒａｌ ｌｉｐｉｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｏｒｌｙ ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｒｕｇｓ：ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｈａｌｏｆａｎｔｒｉｎｅ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９３，１１１０－１１２１（２００４）．
１７．Ｋ．Ａ．Ｍｉｌｔｏｎ，Ｇ．Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｓ．Ａ．Ｗａｒｄ，Ｍ．Ｌ．Ｏｒｍｅ，Ａ．Ｍ．Ｂｒｅｃｋｅｎｒｉｄｇｅ，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｈａｌｏｆａｎｔｒｉｎｅ ｉｎ ｍａｎ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｏｏｄ ａｎｄ ｄｏｓｅ ｓｉｚｅ．Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２８，７１－７７（１９８９）．
１８．Ｓ．Ｍｏｒｉｔａ，Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｎ．Ｙｏｋｏｔａ，Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔ ３８，２５９－２６７（２０１６）．
１９．Ｊ．Ｅｍａｍｉ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｔａｂｌｅｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｄａｒｕ １８，１９３－１９９（２０１０）．
２０．Ｉ．Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ－ｂａｓｅｄ ｒｅｇｉｍｅｎｓ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ（ＶＩＲＡＰＨＡＲ ｓｔｕｄｙ）．ＡＩＤＳ １６，１３３１－１３４０（２００２）．
２１．Ｊ．Ｓｎｏｅｙｓ，Ｍ．Ｂｅｕｍｏｎｔ，Ｍ．Ｍｏｎｓｈｏｕｗｅｒ，Ｓ．Ｏｕｗｅｒｋｅｒｋ－Ｍａｈａｄｅｖａｎ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｓｕｂｊｅｃｔ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｉｍｅｐｒｅｖｉｒ：Ａ ＰＢＰＫ－ｇｕｉｄｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ９９，２２４－２３４（２０１６）．
２２．Ｈ．Ｗ．Ｒｅｅｓｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ＨＣＶ－ＲＮＡ ｄｅｃｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ｏｎｃｅ ｄａｉｌｙ ＴＭＣ４３５：ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３８，９１３－９２１（２０１０）．
２３．Ａ．Ｓｔｏｃｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍａｎｉｄｉｐｉｎｅ ａｎｄ ｄｅｌａｐｒｉｌ ｆｉｘｅｄ ｏｒａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ａｎｄ ｅｌｄｅｒｌｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ５３，５５４－５６１（２００３）．
２４．Ｊ．Ｑ．Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－Ｈｕｍａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｗｉｔｈ Ｏｚａｎｉｍｏｄ，ａ Ｎｏｖｅｌ，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５７，９８８－９９６（２０１７）．
２５．Ｎ．Ｓｔｒｏｊｎｙ，Ｊ．Ａ．ｄｅ Ｓｉｌｖａ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｃｌｏｆｅｎｓｉｎｅ，ａｎ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ ａｇｅｎｔ，ａｎｄ ｉｔｓ ｍａｊｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ３４１，３１３－３３１（１９８５）．
２６．Ｐ．Ｓａｌｖａ，Ｊ．Ｃｏｓｔａ，Ａ．Ｐｅｒｅｚ－Ｃａｍｐｏｓ，Ａ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｔｏｂｅｄ，Ｒｅｐｅａｔｅｄ ｄｏｓｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｐａｎｃｏｐｒｉｄｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓ １５，６４３－６５１（１９９４）．
２７．Ｄ．Ｃ．Ｓ．Ｈａｒｂ Ｗａｅｌ Ａ，Ｌａｋｈａｎｉ Ｎｅｈａｌ，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ Ｓａｒａｈ Ｃ，Ｓｃｈｒｅｅｄｅｒ Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｔ，Ａｎｓｅｌｌ Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｍ，Ｓｈｅｒ Ｔａｉｍｕｒ，Ａｂｏｕｌａｆｉａ Ｄａｖｉｄ Ｍ，Ｃｏｈｅｎ Ｊｏｎａｔｈｏｎ Ｂ，Ｎｉｘ Ｄａｒｒｅｌｌ，Ｌａｎｄｒｅｔｔｅ Ｓｅａｎ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ Ｋａｔｅ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｌａｎｇｄｏｎ Ｌ，Ｌｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎ Ｈｅｎｒｉ，Ａｂｒａｍｓｏ Ｊｅｒｅｍｙ Ｓ，Ｐｈａｓｅ １ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ（ＰＫ），ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａｐｉｌｉｍｏｄ Ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ（ＬＡＭ－００２Ａ），ａ Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－Ｃｌａｓｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５－Ｋｉｎａｓｅ（ＰＩＫｆｙｖｅ），ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．ＡＳＨ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ２０１７ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ９－１２ Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ，ＵＳＡ．
２８．Ａ．Ｐａｔｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－Ｈｕｍａｎ Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｒａｌ ｐ３８ ＭＡＰＫ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｒａｌｉｍｅｔｉｎｉｂ（ＬＹ２２２８８２０ Ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ），ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２２，１０９５－１１０２（２０１６）．
２９．Ｔ．Ｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｓｅ １ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｐａｎ－ＡＫＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＭＫ－２２０６ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７６，４０９－４１６（２０１５）．
３０．Ｔ．Ｃ．Ｗｎｕｋ－Ｌｉｐｉｎｓｋａ Ｋａｔａｒｚｙｎａ，Ｇａｕｓｄａｌ Ｇｒｏ，Ｓａｎｄａｌ Ｔｏｎｅ，Ｆｒｉｎｋ Ｒｏｂｉｎ，Ｈｉｎｚ Ｓｔｅｆａｎ，Ｈｅｌｌｅｓｏｙ Ｍｏｎｉｃａ，Ａｈｍｅｄ Ｌａｖｉｎａ，Ｈａｕｇｅｎ Ｈａｌｌｖａｒｄ，Ｌｉａｎｇ Ｘｉａｏ，Ｂｌｏ Ｍａｇｎｕｓ，Ｍｉｃｋｌｅｍ Ｄａｖｉｄ，Ｙｕｌｅ Ｍｕｒｒａｙ，Ｍｉｎｎａ Ｊｏｈｎ，Ｚｈｏｕ Ｌｏｎｇｅｎ，Ｂｒｅｋｋｅｎ Ｒｏｌｆ，Ｌｏｒｅｎｓ Ｊａｍｅｓ，ＢＧＢ３２４，ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｘｌ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ＥＭＴ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒａｔｉｏｎａｌｅ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １０５ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１４ Ａｐｒ ５－９，（２０１４）．
３１．Ｎ．Ｓｏｎｇ，Ｓ．Ｚｈａｎｇ，Ｑ．Ｌｉ，Ｃ．Ｌｉｕ，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ ｉｎ ｒａｔ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ ４８，９７４－９７９（２００８）．
３２．Ｒ．Ａ．Ｓｔｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｔｈｉａｚｏｌｅ ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ ｂｅｔａ ３－ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ ａｎｄ ｉｔｓ ａｎａｌｏｇｓ ｉｎ ｒａｔｓ，ｄｏｇｓ，ａｎｄ ｍｏｎｋｅｙｓ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｏｒａｌ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ３０，７７１－７７７（２００２）．
３３．Ｋ．Ｋｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ７９０Ｍ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ １０９，１１７７－１１８４（２０１８）．
３４．Ｈ．Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＮＳＣＬＣ：Ａ Ｐｈａｓｅ １ Ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５８，５０４－５１３（２０１８）．
３５．Ｎ．Ａ．Ｎａｒｙｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．ＳＭＮ２ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５，６８８－６９３（２０１４）．
３６．Ｌ．Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｏｒａｌｌｙ Ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－Ｋｉｎａｓｅ ｄｅｌｔａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５９，９２２８－９２４２（２０１６）．
３７．Ｗ．Ｎ．Ｗａｓｈｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎｂａｓｉｃ ｍｅｌａｎｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ａｓ ａｎ ａｎｔｉｏｂｅｓｉｔｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｄｉｄａｔｅ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５７，７５０９－７５２２（２０１４）．
３８．Ｄ．Ｌ．Ｈｅｒｔｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｏｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＭＣＨ Ｒ１ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １６，４７２３－４７２７（２００６）．
３９．Ｄ．Ｃ．Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｎ１－（６－ｃｈｌｏｒｏｉｍｉｄａｚｏ［２，１－ｂ］［１，３］ｔｈｉａｚｏｌｅ－５－ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ，ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，ａｎｄ ｏｒａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ５－ＨＴ（６）ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５０，５５３５－５５３８（２００７）．
参照による組込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
１．Ａ．Ｚｕｍｌａ，Ｊ．Ｆ．Ｃｈａｎ，Ｅ．Ｉ．Ａｚｈａｒ，Ｄ．Ｓ．Ｈｕｉ，Ｋ．Ｙ．Ｙｕｅｎ，Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ－ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １５，３２７－３４７（２０１６）．
２．Ｅ．ｄｅ Ｗｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ（ＧＳ－５７３４）ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１７，６７７１－６７７６（２０２０）．
３．Ｔ．Ｐ．Ｓｈｅａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ＧＳ－５７３４ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｂｏｔｈ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ａｎｄ ｚｏｏｎｏｔｉｃ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９，（２０１７）．
４．Ｍ．Ｋ．Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＧＳ－５７３４ ａｎｄ ｉｔｓ ｐａｒｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｆｉｌｏ－，Ｐｎｅｕｍｏ－，ａｎｄ Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，４３３９５（２０１７）．
５．Ｊ．Ｊａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＲｅＦＲＡＭＥ ｌｉｂｒａｒｙ ａｓ ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄｒｕｇ ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１５，１０７５０－１０７５５（２０１８）．
６．Ｍ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｒｅｃｅｎｔｌｙ ｅｍｅｒｇｅｄ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（２０１９－ｎＣｏＶ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３０，２６９－２７１（２０２０）．
７．Ｍ．Ｐｒａｊａｐａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ：Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ．Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５２，５６－６５（２０２０）．
８．Ｃ．Ｓａｌａｔａ，Ａ．Ｃａｌｉｓｔｒｉ，Ｃ．Ｐａｒｏｌｉｎ，Ａ．Ｂａｒｉｔｕｓｓｉｏ，Ｇ．Ｐａｌｕ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉ Ｉｎｆｅｃｔ Ｔｈｅｒ １５，４８３－４９２（２０１７）．
９．Ｌ．Ｍ．Ｊｏｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＤＡ－ａｐｐｒｏｖｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，１９０ｒａ１７９（２０１３）．
１０．Ｍ．Ｂ．Ｏｌｄｓｔｏｎｅ，Ｊ．Ｒ．Ｔｅｉｊａｒｏ，Ｋ．Ｂ．Ｗａｌｓｈ，Ｈ．Ｒｏｓｅｎ，Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｕｎｃｏｖｅｒｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｏｍｂａｔ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４３５，９２－１０１（２０１３）．
１１．Ｍ．Ｍａｚｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒｏａｄ－Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｖｉｒａｌ Ｅｎｔｒｙ．Ｖｉｒｕｓｅｓ １１，（２０１９）．
１２．Ｅ．Ａ．Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５－ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｐｉｌｉｍｏｄ ｂｌｏｃｋｓ ｆｉｌｏｖｉｒａｌ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ Ｄｉｓ １１，ｅ０００５５４０（２０１７）．
１３．Ａ．Ｉａｎｅｖｓｋｉ，Ｌ．Ｈｅ，Ｔ．Ａｉｔｔｏｋａｌｌｉｏ，Ｊ．Ｔａｎｇ，ＳｙｎｅｒｇｙＦｉｎｄｅｒ：ａ ｗｅｂ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍａｔｒｉｘ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３３，２４１３－２４１５（２０１７）．
１４．Ｂ．Ｙａｄａｖ，Ｋ．Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇ，Ｔ．Ａｉｔｔｏｋａｌｌｉｏ，Ｊ．Ｔａｎｇ，Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｓｙｎｅｒｇｙ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｄｏｓｅ－Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ｍｏｄｅｌ．Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ １３，５０４－５１３（２０１５）．
１５．Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｎ ｃｏｍｐａｓｓｉｏｎａｔｅ ｕｓｅ Ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ Ｇｉｌｅａｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｎｏ．ＥＭＥＡ／Ｈ／Ｋ／５６２２／ＣＵ（ＥＭＡ／１７８６３７／２０２０）．
１６．Ｃ．Ｊ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｅ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｌｉｐｉｄ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｄａｔａ ｔｏ ｅｘｐｌａｉｎ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｏｒａｌ ｌｉｐｉｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｏｒｌｙ ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｒｕｇｓ：ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｈａｌｏｆａｎｔｒｉｎｅ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９３，１１１０－１１２１（２００４）．
１７．Ｋ．Ａ．Ｍｉｌｔｏｎ，Ｇ．Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｓ．Ａ．Ｗａｒｄ，Ｍ．Ｌ．Ｏｒｍｅ，Ａ．Ｍ．Ｂｒｅｃｋｅｎｒｉｄｇｅ，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｈａｌｏｆａｎｔｒｉｎｅ ｉｎ ｍａｎ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｏｏｄ ａｎｄ ｄｏｓｅ ｓｉｚｅ．Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２８，７１－７７（１９８９）．
１８．Ｓ．Ｍｏｒｉｔａ，Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｎ．Ｙｏｋｏｔａ，Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔ ３８，２５９－２６７（２０１６）．
１９．Ｊ．Ｅｍａｍｉ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｔａｂｌｅｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｄａｒｕ １８，１９３－１９９（２０１０）．
２０．Ｉ．Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ－ｂａｓｅｄ ｒｅｇｉｍｅｎｓ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ（ＶＩＲＡＰＨＡＲ ｓｔｕｄｙ）．ＡＩＤＳ １６，１３３１－１３４０（２００２）．
２１．Ｊ．Ｓｎｏｅｙｓ，Ｍ．Ｂｅｕｍｏｎｔ，Ｍ．Ｍｏｎｓｈｏｕｗｅｒ，Ｓ．Ｏｕｗｅｒｋｅｒｋ－Ｍａｈａｄｅｖａｎ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｓｕｂｊｅｃｔ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｉｍｅｐｒｅｖｉｒ：Ａ ＰＢＰＫ－ｇｕｉｄｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ９９，２２４－２３４（２０１６）．
２２．Ｈ．Ｗ．Ｒｅｅｓｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ＨＣＶ－ＲＮＡ ｄｅｃｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ｏｎｃｅ ｄａｉｌｙ ＴＭＣ４３５：ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３８，９１３－９２１（２０１０）．
２３．Ａ．Ｓｔｏｃｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍａｎｉｄｉｐｉｎｅ ａｎｄ ｄｅｌａｐｒｉｌ ｆｉｘｅｄ ｏｒａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ａｎｄ ｅｌｄｅｒｌｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ５３，５５４－５６１（２００３）．
２４．Ｊ．Ｑ．Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－Ｈｕｍａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｗｉｔｈ Ｏｚａｎｉｍｏｄ，ａ Ｎｏｖｅｌ，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５７，９８８－９９６（２０１７）．
２５．Ｎ．Ｓｔｒｏｊｎｙ，Ｊ．Ａ．ｄｅ Ｓｉｌｖａ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｃｌｏｆｅｎｓｉｎｅ，ａｎ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ ａｇｅｎｔ，ａｎｄ ｉｔｓ ｍａｊｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ３４１，３１３－３３１（１９８５）．
２６．Ｐ．Ｓａｌｖａ，Ｊ．Ｃｏｓｔａ，Ａ．Ｐｅｒｅｚ－Ｃａｍｐｏｓ，Ａ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｔｏｂｅｄ，Ｒｅｐｅａｔｅｄ ｄｏｓｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｐａｎｃｏｐｒｉｄｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓ １５，６４３－６５１（１９９４）．
２７．Ｄ．Ｃ．Ｓ．Ｈａｒｂ Ｗａｅｌ Ａ，Ｌａｋｈａｎｉ Ｎｅｈａｌ，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ Ｓａｒａｈ Ｃ，Ｓｃｈｒｅｅｄｅｒ Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｔ，Ａｎｓｅｌｌ Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｍ，Ｓｈｅｒ Ｔａｉｍｕｒ，Ａｂｏｕｌａｆｉａ Ｄａｖｉｄ Ｍ，Ｃｏｈｅｎ Ｊｏｎａｔｈｏｎ Ｂ，Ｎｉｘ Ｄａｒｒｅｌｌ，Ｌａｎｄｒｅｔｔｅ Ｓｅａｎ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ Ｋａｔｅ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｌａｎｇｄｏｎ Ｌ，Ｌｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎ Ｈｅｎｒｉ，Ａｂｒａｍｓｏ Ｊｅｒｅｍｙ Ｓ，Ｐｈａｓｅ １ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ（ＰＫ），ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａｐｉｌｉｍｏｄ Ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ（ＬＡＭ－００２Ａ），ａ Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－Ｃｌａｓｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５－Ｋｉｎａｓｅ（ＰＩＫｆｙｖｅ），ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．ＡＳＨ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ２０１７ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ９－１２ Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ，ＵＳＡ．
２８．Ａ．Ｐａｔｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－Ｈｕｍａｎ Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｒａｌ ｐ３８ ＭＡＰＫ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｒａｌｉｍｅｔｉｎｉｂ（ＬＹ２２２８８２０ Ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ），ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２２，１０９５－１１０２（２０１６）．
２９．Ｔ．Ｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｓｅ １ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｐａｎ－ＡＫＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＭＫ－２２０６ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７６，４０９－４１６（２０１５）．
３０．Ｔ．Ｃ．Ｗｎｕｋ－Ｌｉｐｉｎｓｋａ Ｋａｔａｒｚｙｎａ，Ｇａｕｓｄａｌ Ｇｒｏ，Ｓａｎｄａｌ Ｔｏｎｅ，Ｆｒｉｎｋ Ｒｏｂｉｎ，Ｈｉｎｚ Ｓｔｅｆａｎ，Ｈｅｌｌｅｓｏｙ Ｍｏｎｉｃａ，Ａｈｍｅｄ Ｌａｖｉｎａ，Ｈａｕｇｅｎ Ｈａｌｌｖａｒｄ，Ｌｉａｎｇ Ｘｉａｏ，Ｂｌｏ Ｍａｇｎｕｓ，Ｍｉｃｋｌｅｍ Ｄａｖｉｄ，Ｙｕｌｅ Ｍｕｒｒａｙ，Ｍｉｎｎａ Ｊｏｈｎ，Ｚｈｏｕ Ｌｏｎｇｅｎ，Ｂｒｅｋｋｅｎ Ｒｏｌｆ，Ｌｏｒｅｎｓ Ｊａｍｅｓ，ＢＧＢ３２４，ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｘｌ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ＥＭＴ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒａｔｉｏｎａｌｅ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １０５ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１４ Ａｐｒ ５－９，（２０１４）．
３１．Ｎ．Ｓｏｎｇ，Ｓ．Ｚｈａｎｇ，Ｑ．Ｌｉ，Ｃ．Ｌｉｕ，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ ｉｎ ｒａｔ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ ４８，９７４－９７９（２００８）．
３２．Ｒ．Ａ．Ｓｔｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｔｈｉａｚｏｌｅ ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ ｂｅｔａ ３－ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ ａｎｄ ｉｔｓ ａｎａｌｏｇｓ ｉｎ ｒａｔｓ，ｄｏｇｓ，ａｎｄ ｍｏｎｋｅｙｓ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｏｒａｌ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ３０，７７１－７７７（２００２）．
３３．Ｋ．Ｋｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ７９０Ｍ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ １０９，１１７７－１１８４（２０１８）．
３４．Ｈ．Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＮＳＣＬＣ：Ａ Ｐｈａｓｅ １ Ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５８，５０４－５１３（２０１８）．
３５．Ｎ．Ａ．Ｎａｒｙｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．ＳＭＮ２ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５，６８８－６９３（２０１４）．
３６．Ｌ．Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｏｒａｌｌｙ Ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－Ｋｉｎａｓｅ ｄｅｌｔａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５９，９２２８－９２４２（２０１６）．
３７．Ｗ．Ｎ．Ｗａｓｈｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎｂａｓｉｃ ｍｅｌａｎｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ａｓ ａｎ ａｎｔｉｏｂｅｓｉｔｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｄｉｄａｔｅ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５７，７５０９－７５２２（２０１４）．
３８．Ｄ．Ｌ．Ｈｅｒｔｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｏｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＭＣＨ Ｒ１ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １６，４７２３－４７２７（２００６）．
３９．Ｄ．Ｃ．Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｎ１－（６－ｃｈｌｏｒｏｉｍｉｄａｚｏ［２，１－ｂ］［１，３］ｔｈｉａｚｏｌｅ－５－ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ，ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，ａｎｄ ｏｒａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ５－ＨＴ（６）ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５０，５５３５－５５３８（２００７）．
参照による組込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D-1】
【図1D-2】
【図1E】
【図1F】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3】
【国際調査報告】