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特表2023-524397糖尿病性皮膚多発ニューロパシーの管理における神経性組織ナノトランスフェクション
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-12
(54)【発明の名称】糖尿病性皮膚多発ニューロパシーの管理における神経性組織ナノトランスフェクション
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20230605BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230605BHJP
A61B 18/12 20060101ALI20230605BHJP
A61N 1/32 20060101ALI20230605BHJP
A61K 38/16 20060101ALN20230605BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230605BHJP
C12N 15/87 20060101ALN20230605BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20230605BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00 ZNA
A61P25/00
A61B18/12
A61N1/32
A61K38/16
C12N15/12
C12N15/87 Z
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022563392
(86)(22)【出願日】2021-04-29
(85)【翻訳文提出日】2022-10-19
(86)【国際出願番号】 US2021029780
(87)【国際公開番号】W WO2021222491
(87)【国際公開日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】63/018,900
(32)【優先日】2020-05-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520477485
【氏名又は名称】ザ・トラスティーズ・オブ・インディアナ・ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100163784
【弁理士】
【氏名又は名称】武田 健志
(72)【発明者】
【氏名】セーン，チャンダン・ケイ
(72)【発明者】
【氏名】ゴトク，サブハディップ
(72)【発明者】
【氏名】ロイ，サシュワティ
(72)【発明者】
【氏名】カンナ，サヴィタ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C053
4C084
4C160
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA44
4C053JJ02
4C053JJ03
4C053JJ21
4C053JJ40
4C084AA13
4C084BA44
4C084CA62
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA01
4C160KK03
4C160KK70
4C160MM32
(57)【要約】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのＮＧＦ及びＮｔ３の細胞発現の増加などの神経原性特性を示すように、皮膚線維芽細胞を再プログラムするための組成物及び方法が提供される。一実施形態に従って、かかる組成物は、糖尿病患者の組織において、ニューロパシー性疼痛を治療するめに、且つＰＧＰ９．５＋成熟神経繊維の産生を安定化又は刺激するために、標準治療と併せて使用される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者においてニューロパシーを治療する方法であって、該方法は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌをコードする核酸配列を、ヒト皮膚線維芽細胞内に導入することによって、ヒト皮膚線維芽細胞を生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で再プログラムする工程を含み、該再プログラムヒト皮膚線維芽細胞が、以下の特性：
増強されたＮｇｆ発現；
Ｂｄｎｆ、Ｎｔ３、及びＮｔ４／５からなる群から選択される神経栄養性因子遺伝子の増強された発現；及び
真皮における前記再プログラム細胞と関連するＴｕＪ１＋細胞の数の増加；
のうちの少なくともを含む、元の線維芽細胞に対して１つ又は複数の神経原性特性を示し、
該再プログラム細胞が線維芽細胞特異的タンパク質－１（Ｆｓｐ－１）を発現する、
上記方法。
【請求項2】
患者が糖尿病患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
細胞内送達が組織ナノトランスフェクションを介する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのＮＧＦ及びＮｔ３発現の皮膚ストローマ細胞発現を増加する方法であって、組織ナノトランスフェクションにより、患者の皮膚ストローマ細胞に、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌをコードする核酸配列を導入する工程を含む、上記方法。
【請求項5】
糖尿病患者の組織においてＰＧＰ９．５＋成熟神経繊維の産生を安定化又は刺激する方法であって、神経原性となるように皮膚線維芽細胞を生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で再プログラムする工程と、
該患者の皮膚線維芽細胞に、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌをコードする核酸配列を導入して、再プログラム皮膚線維芽細胞を産生する工程と、
を含む、上記方法。
【請求項6】
核酸配列が、組織ナノトランスフェクションを介してヒト皮膚線維芽細胞の細胞質ゾル内に送達される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記方法が、末梢神経の形態機能的修復を誘導する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示内容が本明細書に明確に組み込まれる、２０２０年５月１日出願の米国仮特許出願第６３／０１８，９００号への優先権を主張する。
本出願は、その開示内容が本明細書に明確に組み込まれる、２０２０年５月１日出願の米国仮特許出願第６３／０１８，９００号への優先権を主張する。
【0002】
行政補助の記載
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられたＤＫ１１４７１８、ＧＭ１０８０１４、ＮＲ０１５６７６、ＮＳ０４２６１７、及びＮＳ０８５２７２の下で行政補助を利用して行われた。政府は本発明において特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられたＤＫ１１４７１８、ＧＭ１０８０１４、ＮＲ０１５６７６、ＮＳ０４２６１７、及びＮＳ０８５２７２の下で行政補助を利用して行われた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【0003】
電子提出されたデータの参照による組み込み
本明細書と共に同時に提出され、且つ以下同定されるコンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれる；４キロバイトＡＣＩＩ（テキスト）ファイル名「３３５００２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」；２０２１年４月２１日作成。
本明細書と共に同時に提出され、且つ以下同定されるコンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれる；４キロバイトＡＣＩＩ（テキスト）ファイル名「３３５００２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」；２０２１年４月２１日作成。
【背景技術】
【0004】
糖尿病性ニューロパシーは、糖尿病に罹患している人々の５０％もが影響を受け得る重篤な糖尿病合併症である。高血糖（グルコース）は、全身の神経に損傷を与え得て、個体の脚及び足の神経に損傷を与える場合が最も多い。しかしながら、影響を受ける神経に応じて、糖尿病性ニューロパシー症状は、脚及び足の痛み及び痺れから、消化器系、泌尿器系、血管及び心臓の問題までの範囲にあり得る。
【0005】
糖尿病性末梢ニューロパシー（ＤＰＮ）の患者において神経繊維をサポートする以前のアプローチは、細胞内シグナル伝達経路、神経細胞の生化学及び細胞器官機能を補正する薬理学的治療に頼っていた。しかしながら、かかる介入は、主に有効性の欠如及び／又は有害な副作用のために、過去の第ＩＩ又はＩＩＩ相臨床試験を進めることができなかった。神経成長因子（ＮＧＦ）は、ケラチノサイトによって大量に産生され、ＤＰＮの発症時には枯渇している。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのＮＧＦの退薬によって、遠位性軸索変性が引き起こされる。神経栄養性因子の補充、つまり外因性ＮＧＦ注入が、ＤＰＮにおける予防的措置として臨床的に試験されている。しかしながら、注入部位の痛み、疑わしい有効性、及び同時投与される他の栄養因子の潜在的な必要性などの障壁があるために、外因性ＮＧＦのみの治療的投与は、臨床試験を経て進行していない。
【0006】
糖尿病における健常な血中グルコースレベルを維持しようと試みる方針に加えて、糖尿病性ニューロパシーを予防し、ＤＰＮに伴う症状を軽減し、又はその進行を遅らせるためのより有効な治療方針が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本開示の一実施形態に従って、糖尿病性ニューロパシーを予防又は治療するための、組成物及び方法が提供される。最近、新たな非ウイルス組織ナノトランスフェクション技術（ＴＮＴ）が、皮膚の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）再プログラミングについて報告されている。出願人は、Ａｃｈａｅｔｅ－ＳｃｕｔｅファミリーＢＨＬＨ転写因子１（ＡＳＣＬ１）、Ｍａｓｔｅｒ Ｎｅｕｒａｌ転写因子ＢＲＮ２（ＰＯＵ３Ｆ２によってコードされる）、及びミエリン転写因子１様（ＭＹＴ１Ｌ）をコードする核酸配列のＴＮＴ送達によって、皮膚線維芽細胞の直接的な変換が達成されて、電気生理学的に活性な誘導神経（ｉＮ）細胞が成熟されることを発見した（Ｄ．Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）１２：９７４－９７９）。しかしながら、その発見は、再プログラム細胞に焦点が置かれており、出願人は現時点で、皮膚線維芽細胞のｉｎ ｖｉｖｏ再プログラムを受けて生成された神経栄養性環境が、慢性糖尿病条件下にて変性を受けやすい既存の神経繊維を救い、且つ／又は保護するために利用することができる皮膚の神経栄養性環境を産生することを発見している。
【0008】
本開示の一実施形態に従って、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でＮＧＦ及びＮｔ３発現の皮膚ストローマ細胞発現を増加するための、組成物及び方法が提供される。一実施形態において、その方法は、組織ナノトランスフェクションを介して、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌをコードする核酸配列を前記患者の皮膚ストローマ細胞内に導入する工程を含む。
【0009】
本開示の一実施形態に従って、誘導神経（ｉＮ）細胞となるようにヒト皮膚線維芽細胞を再プログラムするための組成物及び方法が提供され、再プログラムされた皮膚線維芽細胞は、局所的な神経栄養性環境を高め、且つ糖尿病性ニューロパシーに伴う症状を軽減する能力を有する。一実施形態において、再プログラムされるヒト皮膚細胞は、ニューロパシー性疼痛源である組織の局所領域に位置付けられる。一実施形態において、ヒト皮膚細胞は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌから選択される１つ又は複数の遺伝子産物をコードする１つ又は複数の核酸配列をトランスフェクトすることによって再プログラムされる。本明細書に記載のように、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌの併用投与は、本明細書において「ＡＢＭ」投与と呼ばれる。
【0010】
一実施形態において、組織ナノトランスフェクション（ＴＮＴ）を用いてＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌ（ＴＮＴＡＢＭ）を送達し、生体内で電気生理学的に活性な誘導神経細胞（ｉＮ）へと皮膚線維芽細胞を直接変換する。皮膚線維芽細胞の神経原性転換に加えて、ＴＮＴＡＢＭは、皮膚間質の神経栄養強化も引き起こし、皮膚の神経栄養性環境のかかる強化は、慢性糖尿病条件下に存在する、ストレスを受けた既存の神経繊維を救うことができる。局所的皮膚ＴＮＴＡＢＭは、内因性ＮＧＦ、及びＮｔ３などの他の同時制御神経栄養性因子の上昇を引き起こす。
【0011】
一実施形態に従って、患者においてニューロパシーを治療する方法が提供される。その方法は、対象の手及び足と関連する局所組織など、神経損傷からの脱力感、痺れ、及び痛みを有する局所組織においてヒト皮膚線維芽細胞を生体内で再プログラムすることを含む。一実施形態において、局所組織のヒト皮膚線維芽細胞は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌをコードする標的ヒト皮膚線維芽細胞核酸配列を、細胞質ゾル内に導入することによって再プログラムされ、得られた再プログラムヒト皮膚線維芽細胞は、以下の特性：１）増強されたＮｇｆ発現；２）神経栄養性因子遺伝子Ｎｔ３の増強された発現；及び真皮における前記再プログラム細胞と関連するＴｕＪ１＋細胞数の増加；のうちの１つ又は複数など、元の線維芽細胞に対して１つ又は複数の神経原性特性を示す。一実施形態において、再プログラムヒト皮膚線維芽細胞は、線維芽細胞特異的タンパク質－１（Ｆｓｐ－１）を発現し続ける。一実施形態において、この方法を用いて、糖尿病患者において末梢ニューロパシーが治療される。一実施形態において、ヒト皮膚線維芽細胞のトランスフェクションが、生体内組織ナノトランスフェクションを用いて行われる。
【0012】
一実施形態において、糖尿病患者の組織におけるＰＧＰ９．５＋成熟神経繊維を安定化又は刺激する方法が提供される。この方法は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌをコードする核酸配列を、前記患者の皮膚線維芽細胞に導入することによって、生体内で皮膚線維芽細胞を再プログラムして神経原性にし、再プログラム皮膚線維芽細胞を産生する工程を含む。一実施形態において、任意に組織ナノトランスフェクションによって、手及び足などの末梢組織の局所皮膚線維芽細胞に、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌをコードする核酸配列をトランスフェクトし、末梢神経の形態機能的（ｍｏｒｐｈｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）修復を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1-1】図１Ａ－１Ｉ：ナノチャネル電気穿孔法（ＮＥＰＡＢＭ）トランスフェクションによる、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２及びＭｙｔ１ｌ（ＡＢＭ）をコードする遺伝子の送達によって、マウス胚細胞（ＭＥＦ）細胞において神経栄養性因子が誘導された。ナノチャネル電気穿孔法による、ＭＥＦ細胞におけるＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２及びＭｙｔ１ｌの送達が、免疫染色によって確認された。表現型キャラクタリゼーションから、ＮＥＰから２週間後又はＮＥＰから４週間後に誘導ニューロン様細胞が明らかになった。ＮＥＰから１週間後（図１Ａ）及び４週間後（図１Ｂ）でのＮｇｆ発現は４週時点で高いＮｇｆを示す。図１Ｃは、ＮＥＰ後４週での分化ＭＥＦ培地からのＮＧＦ ＥＬＩＳＡの結果の定量化を示す（ｎ＝１０）。ＮＥＰ後１週時点（図１Ｄ、１Ｆ及び１Ｈ；ｎ＝４）及びＮＥＰ後４週時点（図１Ｅ、１Ｇ及び１Ｉ；ｎ＝６）での、脳由来神経栄養性因子（Ｂｄｎｆ；図１Ｄ及び１Ｅ）、ニューロトロフィン－３（Ｎｔ３；図１Ｆ及び１Ｇ）、及びニューロトロフィン－４／５（Ｎｔ４／５；図１Ｈ及び１Ｉ）に関するｍＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ分析からのデータを示す。ニューロトロフィン－３（Ｎｔ３）が、ＮＥＰＡＢＭ後４週時点で発現の有意な増加を示した。データは、平均±ＳＥＭ，＊ｐ＜０．０５として表される。
【図1-2】同上。
【図1-3】同上。
【図1-4】同上。
【図1-5】同上。
【図2-1】図２Ａ－２Ｃ：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの背側皮膚内へのＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌ（ＴＮＴＡＢＭ）の組織ナノトランスフェクション（ＴＮＴ）送達の結果、ストローマ再プログラミングが起こる。共焦点顕微鏡画像は、ＤＡＰＩで対比染色された、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌの３神経叢（ｔｈｒｅｅ－ｐｌｅｘ）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示した。ＴＮＴ後２４時間で皮膚におけるＡＢＭ遺伝子発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析から作成されたデータを表すグラフを示す（図２Ａ；ｎ＝４）。免疫染色は、皮膚におけるＴｕＪ１繊維を示し、表皮長さｍｍ当たりのＴｕＪ１＋繊維長さの定量化を図２Ｂの棒グラフに示す（ｎ＝６）。皮膚の共焦点顕微鏡画像は、ＦＳＰ及びＴｕＪ１の共存（ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示し、視野当たりのＴｕＪ１及びＦＳＰポジティブ細胞の定量化を図２に示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３～４），＊ｐ＜０．０５として表される。
【図2-2】同上。
【図3-1】図３Ａ－３Ｆ：ＴＮＴＡＢＭは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの皮膚において神経栄養性因子を増加した。ＮｇｆのＲＴ－ｑＰＣＲ分析からのデータの棒グラフ（図３Ａ；ｎ＝６）、ＥＬＩＳＡによって定量化されたＮＧＦ発現（図３Ｂ；ｎ＝８）、＊ｐ＜０．０１、及び表皮におけるＮＧＦを示す共焦点顕微鏡画像の定量化（図３Ｃ；ｎ＝４）を表す。皮膚におけるＢｄｎｆ、Ｎｔ３又はＮｔ４／Ｎｔ５発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析からのデータの棒グラフをそれぞれ、図３Ｄ、３Ｅ及び３Ｆに示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６），＊ｐ＜０．０５として表される。
【図3-2】同上。
【図3-3】同上。
【図4-1】図４Ａ－４Ｅ：ＴＮＴＡＢＭは、ｄｂ／ｄｂマウスの皮膚においてＮＧＦ産生及びＰＧＰ９．５＋神経繊維を増加した。皮膚表皮中の免疫染色ＴｕＪ１＋繊維におけるＴｕＪ１＋繊維長さ／ｍｍの定量化を図４Ａ（ｎ＝６）に提供する。ＥＬＩＳＡによって組織ＮＧＦを定量化し、データを図４Ｂに示す（ｎ＝９，１０），＊ｐ＜０．０１。４週時点（図４Ｃ）及び９週時点（図４Ｄ）のＩＨＣ画像の定量化を示す。ＴＮＴＡＢＭ後９週での表皮中のＮＧＦの免疫染色に基づく、表皮長さｍｍ当たりのＰＧＰ９．５＋繊維の数の定量化を示す（図４Ｅ）。免疫染色によって、皮膚におけるＰＧＰ９．５＋繊維数の増加が示された。データは平均±ＳＥ（ｎ＝４），＊ｐ＜０．０１として表される。
【図4-2】同上。
【発明を実施するための形態】
【0014】
定義
本発明の説明及び主張において、以下の専門用語が、以下に記載の定義に従って使用される。
本発明の説明及び主張において、以下の専門用語が、以下に記載の定義に従って使用される。
【0015】
本明細書で使用される、「約」という用語は、記載の値又は値の範囲よりも１０％大きい、又は小さいことを意味するが、いずれの値も、又は値の範囲も、このより広い定義にのみに限定されないことを意図する。「約」という用語が前にある、それぞれの値又は値の範囲は、指定の絶対値又は値の範囲の実施形態を包含することも意図される。
【0016】
本明細書で使用される、「精製された」という用語及び同様な用語は、天然又は自然環境において分子又は化合物を通常伴う汚染物質を実質的に含有しない形態での分子又は化合物の単離に関する。本明細書で使用される、「精製された」という用語は、絶対的純度を必要とするわけではなく；相対的な定義として意図される。「精製ポリペプチド」は、限定されないが、核酸分子、脂質及び炭水化物などの他の化合物から分離されているポリペプチドを説明するために、本明細書で使用される。
【0017】
「単離された」という用語は、言及される物質が、その元の環境（例えば、それが天然である場合には自然環境）から除去されることを必要とする。例えば、生体動物に存在する天然ポリヌクレオチドは単離されないが、自然体系において共在する物質の一部又はすべてから分離される、同じポリヌクレオチドは単離される。
【0018】
組織ナノトランスフェクション（ＴＮＴ）は、ナノスケールで細胞の細胞質ゾル内に核酸配列及びタンパク質を送達することができる電気穿孔法をベースとする技術である。さらに詳しくは、ＴＮＴでは、配列ナノチャネルを通じて非常に強く、集束した電場が使用され、並んだ組織細胞メンバーを優しくナノポレーションし、細胞内にカーゴ（ｃａｒｇｏ）（例えば、核酸又はタンパク質）を電気泳動的に運ぶ。
【0019】
本明細書で使用される、「制御要素」又は「調節配列」は、エンハンサー、プロモーター、５’及び３’非翻訳領域などの機能性遺伝子の非翻訳領域であり、宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写及び翻訳が行われる。かかる要素は、その強さ及び特異性が異なり得る。「真核生物の調節配列」は、エンハンサー、プロモーター、５’及び３’非翻訳領域などの機能性遺伝子の非翻訳領域であり、哺乳動物細胞などの真核細胞において、真核細胞の宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写及び翻訳が行われる。
【0020】
本明細書で使用される「プロモーター」は、遺伝子の転写開始部位に対して相対的に固定された位置にある場合に機能する、１つ又は複数のＤＮＡの配列である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的相互作用に必要とされるコア要素を含有し、上流要素及び応答要素を含有し得る。
【0021】
本明細書で使用される「エンハンサー」は、転写開始部位からの距離に無関係に機能するＤＮＡの配列であり、転写ユニットに対して５’又は３’のいずれかであり得る。さらに、エンハンサーは、イントロン内並びにコード配列自体の中にあり得る。それらは通常、長さ１０～３００ｂｐであり、シス（ｃｉｓ）で機能する。エンハンサーは、近傍のプロモーターからの転写を増加するように機能する。プロモーターなどのエンハンサーは、転写の調節を仲介する応答要素も含有する場合が多い。エンハンサーは、発現の調節を決定することが多い。
【0022】
「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノムにおける所定の遺伝子に天然に連結されるものである。「外因性」又は「異種」エンハンサー／プロモーターは、その遺伝子の転写が、連結されたエンハンサー／プロモーターによって指示されるように、遺伝子操作（つまり、分子生物学技術）を用いて、遺伝子と並んで位置するものである。本明細書で使用される、細胞に関する外因性配列は、細胞に対して外部の源から細胞に導入されている配列である。
【0023】
本明細書で使用される、「非コード化（非標準）アミノ酸」という用語は、以下の２０個のアミノ酸：Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＴｙｒのいずれかのＬ－異性体ではない、いずれかのアミノ酸を包含する。
【0024】
本明細書で使用される、「同一性」という用語は、２つ以上の配列間の類似性に関する。同一性は、残基の総数で同一残基数を割り、それに１００を掛けて、パーセンテージを得ることによって測定される。したがって、正確に同じ配列の２つのコピーは１００％同一性を有し、互いに対してアミノ酸欠失、付加、又は置換を有する配列２つの同一性の程度は低い。ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを利用するプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）など、いくつかのコンピュータープログラムが、配列同一性の決定に利用可能であることは、当業者であれば認識されよう。
【0025】
本明細書で使用される、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブと標的配列との間に少なくとも９５％及び好ましくは少なくとも９７％の配列同一性がある場合に、ハイブリダイゼーションが一般に起こるであろうことを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％デキストラン硫酸塩、及び２０μｇ／ｍｌ変性断片化担体ＤＮＡ、例えばサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション担体を洗浄することである。他のハイブリダイゼーション及び洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、特にチャプター１１に例示されている。
【0026】
本明細書で使用される、「薬剤として許容される担体」という用語は、標準的な薬剤担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、水中油型若しくは油中水型エマルジョンなどのエマルジョン、及び様々なタイプの湿潤剤のいずれかを含む。この用語は、ヒトなどの動物での使用に関して、アメリカ合衆国政府の規制当局によって承認された、又は米国薬局方に記載の薬剤のいずれかも包含する。
【0027】
本明細書で使用される、「リン酸緩衝生理食塩水」又は「ＰＢＳ」という用語は、塩化ナトリウム及びリン酸ナトリウムを含む水溶液を意味する。ＰＢＳの異なる配合は当業者には公知であるが、本発明の目的では、「標準ＰＢＳ」というグレーズは、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、２．７ｍＭ ＫＣｌの最終濃度、及びｐＨ７．２～７．４を有する溶液を意味する。
【0028】
本明細書で使用される、「治療する（すること）」という用語は、特定の疾患若しくは病状に伴う症状の軽減、及び／又は前記症状の予防若しくは解消を含む。
【0029】
本明細書において、薬物の「有効」量又は「治療有効量」は、非毒性であるが、所望の効果を提供するのに十分な薬物の量を意味する。「有効」である量は、個人の年齢及び全身状態、投与形式等に応じて、対象ごとに、又は対象単独でさえ、ある期間にわたって異なる。したがって、正確な「有効量」を特定することは常に可能ではない。しかしながら、個人における適切な「有効」量は、通常の実験を用いて当業者によって決定され得る。
【0030】
本明細書において使用される、アミノ酸「置換」とは、異なるアミノ酸残基によって１つのアミノ酸残基が置換されることを意味する。
【0031】
本明細書において使用される、「保存的アミノ酸置換」という用語は、以下の５つのグループ：
Ｉ．小さな脂肪族、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性、負に荷電した残基及びそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大きな、脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン（ｈＣｙｓ）
Ｖ．大きな、芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）
のうちの１つ内で交換（ｅｘｃｈａｎｇｅ）として定義される。
Ｉ．小さな脂肪族、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性、負に荷電した残基及びそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大きな、脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン（ｈＣｙｓ）
Ｖ．大きな、芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）
のうちの１つ内で交換（ｅｘｃｈａｎｇｅ）として定義される。
【0032】
本明細書において使用される、更なる指定のない「患者」という用語は、医師による管理ありで、又はなしで投薬又は医療処置を受ける、温血脊椎動物の飼いならされた動物（例えば、限定されないが、家畜、ウマ、ネコ、イヌ及び他のペット）又はヒトを包含することが意図される。
【0033】
「担体」という用語は、化合物又は組成物と併せた場合に、化合物若しくは組成物の製造、保存、投与、送達、有効性、選択性、又はその使用目的若しくは用途に関する他のいずれかの特徴を助ける、又は容易にする、化合物、組成物、物質、又は構造を意味する。例えば、担体は、活性成分の分解を最小限に抑え、且つ対象における有害な副作用を最小限にするように選択され得る。
【0034】
「抑制する」という用語は、活性、応答、病状、疾患、又は他の生物学的パラメーターの減少を意味する。これは、限定されないが、活性、応答、病状、又は疾患の完全な消失を含み得る。これは、天然又は対照レベルと比較して、活性、応答、病状、又は疾患の例えば１０％の減少も含み得る。したがって、その減少は、天然又は対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％の減少、又はその間のいずれかの量の減少であり得る。
【0035】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合若しくは修飾ペプチド結合、ペプチドアイソステア等によって互いに連結されるアミノ酸を意味し、２０遺伝子コードアミノ酸以外の修飾アミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによって、又は当技術分野でよく知られている化学修飾技術によって修飾され得る。修飾は、ポリペプチドのどこでも、例えばペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ若しくはカルボキシル末端などで起こり得る。
【0036】
「アミノ酸配列」という用語は、ペプチド結合を介して互いに連結される、一連の２つ以上のアミノ酸を意味し、アミノ酸結合の順序は、アミノ酸残基を表す略語、文字、字、又は言葉のリストによって指定される。本明細書において使用されるアミノ酸略語は、アミノ酸をコードする従来の１つの文字であり、以下のように：Ａ、アラニン；Ｂ、アスパラギン又はアスパラギン酸；Ｃ、システイン；Ｄアスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈヒスチジン；Ｉイソロイシン；Ｋ、リジン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、トレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；Ｙ、チロシン；Ｚ、グルタミン又はグルタミン酸；と表される。
【0037】
本明細書で使用される「核酸」というフレーズは、天然若しくは合成オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味し、ワトソン－クリック型塩基対によって相補核酸にハイブリダイゼーションすることができる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、一本鎖又は二本鎖、センス又はアンチセンスを意味する。核酸は、ヌクレオチド類似体（例えば、ＢｒｄＵ）、及び非リン酸ジエステルヌクレオシド内結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はチオジエステル結合）も含み得る。特に、核酸としては、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ又はそのいずれかの組み合わせが挙げられる。
【0038】
本明細書で使用される「ヌクレオチド」とは、塩基部位、糖部位、及びリン酸部位を含有する分子である。ヌクレオチドは、そのリン酸部位及び糖部位を介して互いに連結され、ヌクレオシド内結合が形成され得る。「オリゴヌクレオチド」という用語は時として、互いに連結された２つ以上のヌクレオチドを含有する分子を意味するために使用される。ヌクレオチドの塩基部位は、アデニン－９－イル（Ａ）、シトシン－１－イル（Ｃ）、グアニン－９－イル（Ｇ）、ウラシル－１－イル（Ｕ）、及びチミン－１－イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部位は、リボース又はデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部位は五価リン酸である。ヌクレオチドの非制限的な例としては、３’－ＡＭＰ（３’－アデノシン一リン酸）又は５’－ＧＭＰ（５’－グアノシン一リン酸）が挙げられる。ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、及び／又はリン酸部位への一部のタイプの修飾を含有するヌクレオチドである。ヌクレオチドへの修飾は、当技術分野でよく知られており、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、及び２－アミノアデニン、並びに糖又はリン酸部位での修飾を含む。
【0039】
ヌクレオチド置換は、ヌクレオチドへの同様な機能特性を有するが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのリン酸部位を含有しない分子である。ヌクレオチド置換は、ワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）又はフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型の核酸を認識するが、リン酸部位以外の部位を介して互いに連結される分子である。ヌクレオチド置換は、適切な標的核酸と相互作用する場合に二重らせん型構造に適合することができる。
【0040】
「ベクター」又は「構築物」という用語は、ベクター配列が連結されている他の核酸を細胞内に輸送することができる核酸配列を示す。「発現ベクター」という用語は、細胞（例えば、転写制御要素に連結された）による発現に適した形態の遺伝子構築物を含有する、いずれかのベクター（例えば、プラスミド、コスミド又はファージ染色体）を包含する。プラスミドはベクターの一般的に使用される形態であるため、「プラスミド」及び「ベクター」は区別なく使用される。さらに、本発明は、等しい機能を果たす他のベクターを包含することが意図される。
【0041】
「作動可能に連結される」という用語は、核酸の、他の核酸配列との機能的関係を意味する。プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳停止部位、及び他のシグナル配列は、他の配列に作動可能に連結し得る核酸配列の例である。例えば、転写制御要素へのＤＮＡの作動可能な連結とは、ＤＮＡを特異的に認識し、ＤＮＡに結合し、ＤＮＡを転写する、ＲＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡの転写がプロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターとの物理的及び機能的関係を意味する。
【0042】
本明細書で使用される「干渉性ＲＮＡ」とは、転写後遺伝子サイレンシングに関与するいずれかのＲＮＡであり、その定義は、限定されないが、センス及びアンチセンス鎖で構成される、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。
【0043】
本明細書で使用される「ロック核酸」（ＬＮＡ）とは、２’酸素及び４’炭素を連結する追加の架橋でリボース部位が修飾される、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。例えば、ロック核酸配列は、構造：
のヌクレオチドを含む。
【化1】
【0044】
本明細書で使用される「ニューロパシー」という用語は、通常、手及び足において神経損傷からの脱力感、しびれ、及び痛みを生じる、１種又は複数種の末梢神経の機能不全を伴う病状又は疾患を定義する。「糖尿病性ニューロパシー」は、糖尿病（Ｉ型又はＩＩ型）を患う対象に生じるニューロパシーとして定義される。
【0045】
本明細書で使用される「皮膚ストローマ細胞」という用語は、細胞分裂を促進する成長因子を放出する、表皮に隣接する真皮層に存在する間葉細胞を包含する。例えば、皮膚ストローマ細胞は線維芽細胞及び周皮細胞を含む。
【0046】
実施形態
神経保護措置の必要がある患者において、ニューロパシーを治療し、ＰＧＰ９．５＋成熟神経繊維の産生を安定化又は刺激するための方法及び組成物が本明細書で開示される。一実施形態において、その患者は、Ｉ又はＩＩ型糖尿病を有する患者である。さらに詳しくは、一実施形態において、本開示は、元の未修飾細胞に対して１つ又は複数の神経原性特性を示すように、皮膚細胞を再プログラムするための組成物及び方法に関する。一実施形態において、ヒト皮膚線維芽細胞は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌをコードするヒト皮膚線維芽細胞核酸配列に導入することによって生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でトランスフェクトされる。本明細書で開示される、皮膚組織細胞のかかる生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）再プログラミングの結果、患者において隣接末梢神経に有益である、関連する組織微小環境の変化が生じ、糖尿病患者における予測可能な経路から既存の神経繊維の救出など、治療的目的に使用することができる。
神経保護措置の必要がある患者において、ニューロパシーを治療し、ＰＧＰ９．５＋成熟神経繊維の産生を安定化又は刺激するための方法及び組成物が本明細書で開示される。一実施形態において、その患者は、Ｉ又はＩＩ型糖尿病を有する患者である。さらに詳しくは、一実施形態において、本開示は、元の未修飾細胞に対して１つ又は複数の神経原性特性を示すように、皮膚細胞を再プログラムするための組成物及び方法に関する。一実施形態において、ヒト皮膚線維芽細胞は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌをコードするヒト皮膚線維芽細胞核酸配列に導入することによって生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でトランスフェクトされる。本明細書で開示される、皮膚組織細胞のかかる生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）再プログラミングの結果、患者において隣接末梢神経に有益である、関連する組織微小環境の変化が生じ、糖尿病患者における予測可能な経路から既存の神経繊維の救出など、治療的目的に使用することができる。
【0047】
一実施形態において、患者においてニューロパシーを治療し、且つ／又は皮膚ＰＧＰ９．５＋成熟神経繊維の損失を低減する方法が提供される。一実施形態において、その方法は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌをコードするヒト皮膚線維芽細胞核酸配列に導入することによって、ヒト皮膚線維芽細胞を生体内で再プログラムする工程を含む。一実施形態において、再プログラムされたヒト皮膚線維芽細胞は、以下の特性：
増強されたＮｇｆ発現；
Ｂｄｎｆ、Ｎｔ３、及びＮｔ４／５からなる群から選択される神経栄養性因子遺伝子の増強された発現；及び
真皮における前記再プログラム細胞と関連するＴｕＪ１＋細胞の数の増加；
のうちの少なくとも１つを含む、元の線維芽細胞に対する１つ又は複数の神経原性特性を示す。一実施形態において、再プログラムされた皮膚線維芽細胞は、線維芽細胞特異的タンパク質－１（Ｆｓｐ－１）を発現し続ける。
増強されたＮｇｆ発現；
Ｂｄｎｆ、Ｎｔ３、及びＮｔ４／５からなる群から選択される神経栄養性因子遺伝子の増強された発現；及び
真皮における前記再プログラム細胞と関連するＴｕＪ１＋細胞の数の増加；
のうちの少なくとも１つを含む、元の線維芽細胞に対する１つ又は複数の神経原性特性を示す。一実施形態において、再プログラムされた皮膚線維芽細胞は、線維芽細胞特異的タンパク質－１（Ｆｓｐ－１）を発現し続ける。
【0048】
一実施形態において、本発明は、皮膚組織に存在する場合に、内因性ＮＧＦ及びＮｔ３などの他の同時制御神経栄養性因の上昇を含む、皮膚間質の神経栄養強化を生じさせる神経原性線維芽細胞を含む組成物、並びにかかる組成物を使用して、神経保護措置の必要がある患者においてニューロパシーを治療し、且つ／或いはＰＧＰ９．５＋成熟神経繊維の産生を安定化又は刺激する方法に関する。本明細書に開示の神経原性線維芽細胞は、より神経原性の環境を促進する能力を有するように操作されている線維芽細胞特異的タンパク質－１（Ｆｓｐ－１）を発現する、確認されたヒト皮膚線維芽細胞（ＨＡＤＦ）に由来する。かかる再プログラム線維芽細胞は、３つの遺伝子産物：Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌで転写され、皮膚線維芽細胞におけるその発現によって、電気生理学的に活性な誘導神経細胞（ｉＮ）へと細胞が変換され、皮膚の神経栄養性環境が強化される。一実施形態において、かかる再プログラム線維芽細胞は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で産生される。
【0049】
一実施形態に従って、元の線維芽細胞に対して１つ又は複数の神経原性特性を示すようにヒト皮膚線維芽細胞を再プログラムする方法であって、前記細胞においてＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌの活性及び／又は発現を強化することを含む方法が提供される。一実施形態において、再プログラム線維芽細胞は、線維芽細胞特異的タンパク質－１（Ｆｓｐ－１）を発現し続け、且つ以下の特性：
１．増強されたＮｇｆ発現；
２．Ｂｄｎｆ、Ｎｔ３、及びＮｔ４／５からなる群から選択される神経栄養性因子遺伝子の増強された発現；及び
３．真皮における前記再プログラム細胞と関連するＴｕＪ１＋細胞の数の増加；
のうちの少なくともを示す。
１．増強されたＮｇｆ発現；
２．Ｂｄｎｆ、Ｎｔ３、及びＮｔ４／５からなる群から選択される神経栄養性因子遺伝子の増強された発現；及び
３．真皮における前記再プログラム細胞と関連するＴｕＪ１＋細胞の数の増加；
のうちの少なくともを示す。
【0050】
一実施形態に従って、元の線維芽細胞に対して１つ又は複数の神経原性特性を示すようにヒト皮膚線維芽細胞を再プログラムする方法であって、Ａｃｈａｅｔｅ－ＳｃｕｔｅファミリーＢＨＬＨ転写因子１（ＡＳＣＬ１）、Ｍａｓｔｅｒ Ｎｅｕｒａｌ転写因子ＢＲＮ２（ＰＯＵ３Ｆ２によってコードされる）、及びミエリン転写因子１様（ＭＹＴ１Ｌ）からなる群から選択される１つ若しくは複数のタンパク質、又はＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、及びＭＹＴ１Ｌタンパク質からなる群から選択される１つ若しくは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、線維芽細胞内に送達すること、或いはＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、及びＭＹＴ１Ｌからなる群から選択される１つ若しくは複数のタンパク質、又はＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、及びＭＹＴ１Ｌタンパク質からなる群から選択される１つ若しくは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、又は発現する細胞から産生される細胞外小胞に線維芽細胞を曝露することと、を含む方法が提供される。
【0051】
一実施形態において、線維芽細胞を再プログラムする方法は、例えば、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、及びＭＹＴ１Ｌをコードする１つ又は複数の核酸配列を細胞にトランスフェクトすることによって、細胞内ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、及びＭＹＴ１Ｌタンパク質濃度を増加することを含む。トランスフェクションは、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で、又は生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行われ得る。一実施形態において、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、及びＭＹＴ１Ｌをコードする核酸配列は、生体内でヒト皮膚線維芽細胞の細胞質ゾル内に送達される。本発明に従って、細胞内へ巨大分子を導入する標準技術のいずれかを用いることができる。既知の送達方法は、２つのタイプに広く分類することができる。第１のタイプでは、機械的、熱的又は電気的手段を伴う膜破壊ベースの方法を使用して、所望の巨大分子の直接的侵入のために、増強された透過処理で細胞膜の連続性を破壊することができる。第２のタイプにおいて、種々のウイルス、エキソソーム、小胞及びナノ粒子カプセルを用いた担体ベースの方法によって、エンドサイトーシスを介した担体の取込み、及び担体ペイロードの送達のための細胞の融合プロセスが可能となる。
【0052】
一実施形態において、細胞内送達は、ウイルスベクターを介するか、又は細胞膜と相互作用して、細胞内にその内容物を送達することができる他の送達ビヒクルを介する。一実施形態において、細胞内送達は、三次元ナノチャネル電気穿孔法、組織ナノトランスフェクションデバイスによる送達、又は深部局所的組織ナノエレクトロ注入デバイスによる送達を介する。一実施形態において、シリコン中空針アレイを使用して組織ナノトランスフェクション（ＴＮＴ）によって、再プログラム組成物が生体内にて線維芽細胞の細胞質ゾル内に送達される。
【0053】
透過処理ベースの破壊送達の方法の中でも、電気穿孔法は既に世界共通のツールとして確立されている。高性能送達は、電場破壊を注意深くコントロールすることによって、最小限の細胞毒性で達成することができる。一実施形態に従って、組織ナノトランスフェクション（ＴＮＴ）の使用によって、体細胞の細胞質ゾルに核酸配列が送達される。組織ナノトランスフェクション（ＴＮＴ）は、生体組織にプラスミド、ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドを送達し、いずれかの実験手順を行う必要なく、免疫監視下で生体内にて組織機能の直接的変換を生じさせる起電性遺伝子導入技術である。生体内組織再プログラミングに一般に使用されるウイルス遺伝子導入とは異なり、ＴＮＴはウイルスベクターの必要性を取り除き、ゲノム統合（ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）又は細胞形質転換のリスクを最小限に抑える。
【0054】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）再プログラミングの現在の方法は、生体外又は生体内にて細胞をトランスフェクトし、続いてインプラントすることを含み得る。本発明の一実施形態は、生体内再プログラミングに続いて、インプランテーションを必要とするが、細胞インプラントは、生着率が低く、組織統合が低い場合が多い。さらに、生体外での細胞のトランスフェクトは、更なる調節的及び実験的ハードルを要する。
【0055】
一実施形態に従って、皮膚線維芽細胞に、本明細書に開示の再プログラミング組成物を生体内にてトランスフェクトする。バルク（ｂｕｌｋ）生体内トランスフェクションの一般的な方法は、ウイルスベクター又は電気穿孔法による送達である。ウイルスベクターは、皮膚線維芽細胞への再プログラミング組成物の送達のために、本開示に従って使用することができるが、ウイルスベクターは、不要な免疫反応を開始するかもしれない欠点を有する。さらに、多くのウイルスベクターは、遺伝子の長期間の発現を生じさせ、それは遺伝子治療の一部の用途には有用であるが、持続性の遺伝子発現が不必要であるか、又は望まれない用途では、一過性トランスフェクションが実行可能な選択肢である。ウイルスベクターはまた、望ましくない副作用を有し得る挿入変異生成及びゲノム統合を含む。しかしながら、一実施形態に従って、リポソーム又はエキソソームなどの特定の非ウイルス担体を使用して、生体内にて体細胞に再プログラミングカクテルを送達することができる。
【0056】
ＴＮＴは、いずれかの実験手順を行う必要なく、免疫監視下で生体内にて組織機能の直接的変換を生じさせる局所遺伝子送達の方法を提供する。プラスミドでのＴＮＴを用いて、遺伝子の過剰発現を一時的及び空間的にコントロールし、又は標的遺伝子の発現を抑制することが可能である。ＴＮＴでの空間的なコントロールによって、他の組織をトランスフェクトすることなく、皮膚組織の一部など、標的領域のトランスフェクションが可能となる。ＴＮＴデバイスに関する詳細は、その開示内容が明確に、参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１９０３２９０１４号明細書及び米国特許出願公開第２０２００１１５４２５号明細書に記載されている。組織ナノトランスフェクションは、配列ナノチャネルを通じて非常に強く、集束した電場を適用し、並んだ組織細胞メンバーが優しくナノポレーションされ、細胞内にカーゴが電気泳動的に運ばれることによって、細胞内へのカーゴ（例えば、再プログラミング因子）の直接的細胞質ゾル送達が可能となる。
【0057】
一実施形態に従って、本明細書に開示の方法のいずれか一つによって産生される神経原性線維芽細胞であって、線維芽細胞特異的タンパク質－１（Ｆｓｐ－１）と、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、及びＭＹＴ１Ｌからなる群から選択される少なくとも１種類のタンパク質とを発現する神経原性線維芽細胞が提供される。一実施形態において、神経原性線維芽細胞は、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、及びＭＹＴ１Ｌのうちの１つ又は複数の高い発現、特にＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、及びＭＹＴ１Ｌのすべての高い発現を特徴とする。
【0058】
本発明に従って、本明細書に開示の神経原性線維芽細胞の生体内での産生を用いて、糖尿病患者の組織など、患者の組織においてＰＧＰ９．５＋成熟神経繊維の産生を安定化又は刺激することができる。一実施形態において、この方法は、神経原性となるように皮膚線維芽細胞を生体内にて再プログラムする、又は神経原性となるように生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）にて再プログラムされた神経原性線維芽細胞を患者内に導入する工程を含む。一実施形態において、皮膚線維芽細胞は、タンパク質ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、及びＭＹＴ１Ｌをコードする核酸配列と前記皮膚線維芽細胞を、前記核酸配列の細胞内取り込みを高める条件下にて接触させることによって再プログラムされている。一実施形態において、再プログラミングは、ＴＮＴを介してヒト皮膚線維芽細胞の細胞質ゾル内に、タンパク質ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、及びＭＹＴ１Ｌをコードする核酸配列を送達することを含む。
【0059】
一実施形態において、糖尿病患者における末梢ニューロパシーの治療方法であって、ニューロパシー性疼痛部位の近位組織において神経原性となるように、神経原性線維芽細胞を導入すること、又は線維芽細胞を再プログラムすることを含む、治療方法が提供される。一実施形態において、この方法は、タンパク質ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、及びＭＹＴ１Ｌをコードする核酸配列を皮膚線維芽細胞にトランスフェクトすることを含む。
【実施例】
【0060】
実施例１
神経原性線維芽細胞状態の導入
材料及び方法
マウス
インディアナ州立大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されたプロトコルに従って、すべての動物研究が実施された。マウスは、標準条件下にて２２±２℃にて１２時間明暗サイクルで、無制限に食餌及び水に無制限にアクセスできるように維持された。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、ジャクソン・ラボトリー社（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入した。レプチン受容体（Ｌｅｐｒｄｂ）の自然突然変異に対してホモ接合性のＬｅｐｒ ｄｂ／ｄｂマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ７ ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ、又はｄｂ／ｄｂ；ストック番号０００６４２）（８～１０週齢）をジャクソン・ラボトリー社（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。
神経原性線維芽細胞状態の導入
材料及び方法
マウス
インディアナ州立大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されたプロトコルに従って、すべての動物研究が実施された。マウスは、標準条件下にて２２±２℃にて１２時間明暗サイクルで、無制限に食餌及び水に無制限にアクセスできるように維持された。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、ジャクソン・ラボトリー社（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入した。レプチン受容体（Ｌｅｐｒｄｂ）の自然突然変異に対してホモ接合性のＬｅｐｒ ｄｂ／ｄｂマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ７ ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ、又はｄｂ／ｄｂ；ストック番号０００６４２）（８～１０週齢）をジャクソン・ラボトリー社（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。
【0061】
細胞培養
一次マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（ＰＭＥＦ－ＨＬＣ）から購入した。１０％ウシ胚性血清、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．２５ｕｇ／ｍｌアンホテリシン及び１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（すべてサーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手）を補充したＤＭＥＭ中でＭＥＦを成長させた。加湿雰囲気で３７℃にて空気９５％及びＣＯ２５％中にて細胞を維持した。
一次マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（ＰＭＥＦ－ＨＬＣ）から購入した。１０％ウシ胚性血清、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．２５ｕｇ／ｍｌアンホテリシン及び１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（すべてサーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手）を補充したＤＭＥＭ中でＭＥＦを成長させた。加湿雰囲気で３７℃にて空気９５％及びＣＯ２５％中にて細胞を維持した。
【0062】
生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）再プログラミングのためのナノチャネル電気穿孔法
ナノチャネル電気穿孔法（ＮＥＰ）について、通常の維持培地（上記のＤＭＥＭ）中の密度約０．１５～０．１８×１０６細胞／ウェルにてＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ）カタログ番号３４６０）の頂膜表面（ａｐｉｃａｌ ｓｕｒｆａｃｅ）上で直接、細胞を増殖させた。ナノチャネル電気穿孔法（ＮＥＰ）トランスフェクション前に、細胞を一晩接着させ、広げさせた。細胞ローディングに続いて、頂端側（ａｐｉｃａｌ）チャンバ内の培地をＰＢＳに取り換え、次いでプラスミド溶液と直接接触する特注の金電極上に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートを取り付けた。次いで、頂端側チャンバのＰＢＳ中に対電極を浸漬し、Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ電源装置を使用して、方形波パルス（２７５Ｖ，３５ｍｓ持続パルス，１～１０パルス）を電極に適用した。直後に、ＰＢＳを新たな培地に取り換え、次いで細胞を３７℃で一晩インキュベートした。Ｄ．Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）１２：９７４－９７９に記載のように、Ａｓｃｌ１プラスミド、Ｂｒｎ２プラスミド、Ｍｙｔ１ｌ（ＡＢＭ）プラスミドをモル比２：１：１にて混合した。
ナノチャネル電気穿孔法（ＮＥＰ）について、通常の維持培地（上記のＤＭＥＭ）中の密度約０．１５～０．１８×１０６細胞／ウェルにてＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ）カタログ番号３４６０）の頂膜表面（ａｐｉｃａｌ ｓｕｒｆａｃｅ）上で直接、細胞を増殖させた。ナノチャネル電気穿孔法（ＮＥＰ）トランスフェクション前に、細胞を一晩接着させ、広げさせた。細胞ローディングに続いて、頂端側（ａｐｉｃａｌ）チャンバ内の培地をＰＢＳに取り換え、次いでプラスミド溶液と直接接触する特注の金電極上に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートを取り付けた。次いで、頂端側チャンバのＰＢＳ中に対電極を浸漬し、Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ電源装置を使用して、方形波パルス（２７５Ｖ，３５ｍｓ持続パルス，１～１０パルス）を電極に適用した。直後に、ＰＢＳを新たな培地に取り換え、次いで細胞を３７℃で一晩インキュベートした。Ｄ．Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）１２：９７４－９７９に記載のように、Ａｓｃｌ１プラスミド、Ｂｒｎ２プラスミド、Ｍｙｔ１ｌ（ＡＢＭ）プラスミドをモル比２：１：１にて混合した。
【0063】
誘導神経細胞プロトコル
ＮＥＰ後、通常の維持培地においてポリ－Ｄ－リジン臭化水素酸塩：（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，米国）被覆ガラスカバーガラス又はプレート上で２４時間、ＭＥＦを培養した。２４時間後、培地をニューロン誘導培地と置き換えた。ニューロン誘導培地は、１×Ｎ２サプリメント、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．２５ｕｇ／ｍｌアンホテリシン、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、及び１０ｎｇ／ｍｌヒトｂＦＧＦでＤＭＥＭ塩基培地を補うことによって調製した。ＡＢＭ ｃＤＮＡ発現プラスミドをトランスフェクトしたＭＥＦ細胞を１，２又は４週間分化させた。
ＮＥＰ後、通常の維持培地においてポリ－Ｄ－リジン臭化水素酸塩：（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，米国）被覆ガラスカバーガラス又はプレート上で２４時間、ＭＥＦを培養した。２４時間後、培地をニューロン誘導培地と置き換えた。ニューロン誘導培地は、１×Ｎ２サプリメント、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．２５ｕｇ／ｍｌアンホテリシン、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、及び１０ｎｇ／ｍｌヒトｂＦＧＦでＤＭＥＭ塩基培地を補うことによって調製した。ＡＢＭ ｃＤＮＡ発現プラスミドをトランスフェクトしたＭＥＦ細胞を１，２又は４週間分化させた。
【0064】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）再プログラミングのための組織ナノトランスフェクション
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）再プログラミングのために、組織ナノトランスフェクション（ＴＮＴ）にＣ５７Ｂｌ／６マウス（８～１０週齢）又はｄｂ／ｄｂマウス（２７週齢）を使用して、Ａｓｃｌ１をコードする核酸配列、Ｂｒｎ２をコードする核酸配列、及びＭｙｔ１ｌ（ＡＢＭ）をコードする核酸配列を送達した（ＴＮＴを示すＴＮＴＡＢＭによって、ＡＢＭでの細胞のトランスフェクションが行われた）。ＴＮＴデバイスを上述のように使用した（Ｄ．Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）；１２：９７４－９７９）。端的に言えば、ＴＮＴの２４時間前に、トランスフェクションに使用される皮膚の背側領域を脱毛した。次いで、皮膚を剥離して、死んだ／ケラチン細胞層を除去して、表皮における有核細胞を露出させた。ＡＢＭプラスミドカクテル（モル比２：１：１）を、濃度０．０５～０．１ｕｇ／ｕｌにてリザーバー中にローディングした。金被覆電極（陰極）をプラスミド溶液に浸漬し、２５Ｇ針対電極（陽極）を、ＴＮＴプラットフォーム面に並置される真皮内に挿入した。次いで、パルス電気刺激（１０パルス，振幅で２５０Ｖ，持続時間１０ｍｓ／パルス）を電極にかけて、露出細胞膜をナノポレーションし、ナノチャネルを介して細胞内にプラスミドカーゴを運んだ。別段の指定がない限り、対照試験片は、モック（ｍｏｃｋ）プラスミド溶液でのＴＮＴ処理を含んだ。ＴＮＴＡＢＭの２４時間後、マウス皮膚試料（１２ｍｍパンチ生検）をＯＣＴで収集した。皮膚の組織学及びその場での（ｉｎ ｓｉｔｕ）ｍＲＮＡ発現を厚さ１０μｍ切片上で実施した。
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）再プログラミングのために、組織ナノトランスフェクション（ＴＮＴ）にＣ５７Ｂｌ／６マウス（８～１０週齢）又はｄｂ／ｄｂマウス（２７週齢）を使用して、Ａｓｃｌ１をコードする核酸配列、Ｂｒｎ２をコードする核酸配列、及びＭｙｔ１ｌ（ＡＢＭ）をコードする核酸配列を送達した（ＴＮＴを示すＴＮＴＡＢＭによって、ＡＢＭでの細胞のトランスフェクションが行われた）。ＴＮＴデバイスを上述のように使用した（Ｄ．Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）；１２：９７４－９７９）。端的に言えば、ＴＮＴの２４時間前に、トランスフェクションに使用される皮膚の背側領域を脱毛した。次いで、皮膚を剥離して、死んだ／ケラチン細胞層を除去して、表皮における有核細胞を露出させた。ＡＢＭプラスミドカクテル（モル比２：１：１）を、濃度０．０５～０．１ｕｇ／ｕｌにてリザーバー中にローディングした。金被覆電極（陰極）をプラスミド溶液に浸漬し、２５Ｇ針対電極（陽極）を、ＴＮＴプラットフォーム面に並置される真皮内に挿入した。次いで、パルス電気刺激（１０パルス，振幅で２５０Ｖ，持続時間１０ｍｓ／パルス）を電極にかけて、露出細胞膜をナノポレーションし、ナノチャネルを介して細胞内にプラスミドカーゴを運んだ。別段の指定がない限り、対照試験片は、モック（ｍｏｃｋ）プラスミド溶液でのＴＮＴ処理を含んだ。ＴＮＴＡＢＭの２４時間後、マウス皮膚試料（１２ｍｍパンチ生検）をＯＣＴで収集した。皮膚の組織学及びその場での（ｉｎ ｓｉｔｕ）ｍＲＮＡ発現を厚さ１０μｍ切片上で実施した。
【0065】
ＤＮＡプラスミドの調製
プラスミドＤＮＡ精製キット（ＺｙｍｏＰＵＲＥ ＩＩ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ，カタログ番号Ｄ４２０１）を使用して、モック（空のベクター）、Ａｓｃｌ１プラスミド、Ｂｒｎ２プラスミド、及びＭｙｔ１ｌプラスミドを調製した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃ分光光度計（サーモサイエンティフィック社）からＤＮＡ濃度を得た。上述（Ｄ．Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）１２：９７４－９７９）のように、アプライドバイオロジカルマテリアルズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．），Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）による、ＧＦＰ（Ａｓｃｌ１）、ＲＦＰ（Ｂｒｎ２）、又はＣＦＰ（Ｍｙｔ１ｌ）で、Ａｓｃｌ１プラスミド、Ｂｒｎ２プラスミド、及びＭｙｔ１ｌプラスミド（バックボーン，ｐＣＡＧＧｓ）を作製した。ｐＣＡＧＥＮ（空の）は、Ｃｏｎｎｉｅ Ｃｅｐｋｏからの贈与物であった（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１１１６０）。
プラスミドＤＮＡ精製キット（ＺｙｍｏＰＵＲＥ ＩＩ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ，カタログ番号Ｄ４２０１）を使用して、モック（空のベクター）、Ａｓｃｌ１プラスミド、Ｂｒｎ２プラスミド、及びＭｙｔ１ｌプラスミドを調製した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃ分光光度計（サーモサイエンティフィック社）からＤＮＡ濃度を得た。上述（Ｄ．Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）１２：９７４－９７９）のように、アプライドバイオロジカルマテリアルズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．），Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）による、ＧＦＰ（Ａｓｃｌ１）、ＲＦＰ（Ｂｒｎ２）、又はＣＦＰ（Ｍｙｔ１ｌ）で、Ａｓｃｌ１プラスミド、Ｂｒｎ２プラスミド、及びＭｙｔ１ｌプラスミド（バックボーン，ｐＣＡＧＧｓ）を作製した。ｐＣＡＧＥＮ（空の）は、Ｃｏｎｎｉｅ Ｃｅｐｋｏからの贈与物であった（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１１１６０）。
【0066】
ＲＮＡ単離及びｍＲＮＡのためのリアルタイム定量的ＰＣＲ
製造元のプロトコル（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ，Ｔｈｏｒｏｌｄ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）に従って、全ＲＮＡ抽出及び精製単離キット（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して、全ＲＮＡを抽出した。遺伝子発現の研究のために、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（サーモサイエンティフィック社）を使用して、全ｃＤＮＡ合成が達成された。Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｎｇｆ、Ｂｄｎｆ、Ｎｔ３、Ｎｔ４／５についてのｍＲＮＡの存在量は、リアルタイムＰＣＲによって、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ－Ｉを使用して定量化された。Ｇａｐｄｈは、ハウスキーピング対照としての役割を果たす。以下のプライマーのセットを使用した：
ｍ＿Ｇａｐｄｈ Ｆ５’－ＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣＴ－３’（配列番号１）
ｍ＿Ｇａｐｄｈ Ｒ５’－ＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴ－３’（配列番号２）
ｍ＿Ａｓｃｌ１ Ｆ：５’－ＣＧＡＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号３）
ｍ＿Ａｓｃｌ１ Ｒ：５’－ＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣＧＡＡＣ－３’（配列番号４）
ｍ＿Ｂｒｎ２＿Ｆ： ５’－ＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡＴＣＴＡＣ－３’（配列番号５）
ｍ＿Ｂｒｎ２＿Ｒ：５’－ＴＧＧＣＧＴＣＣＡＣＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧ－３’（配列番号６）
ｍ＿Ｍｙｔ１Ｌ＿Ｆ：５’－ＡＴＡＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＴＣ－３’（配列番号７）
ｍ＿Ｍｙｔ１Ｌ＿Ｒ：５’－ＧＴＣＧＴＧＣＡＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＴＧ－３’（配列番号８）
ｍ＿ＮｇｆＦ：５’－ＡＣＣＡＡＴＡＧＣＴＧＣＣＣＧＡＧＴＧＡＣＡ－３’（配列番号９）
ｍ＿ＮｇｆＲ：５’－ＧＡＧＡＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＣＴ－３’（配列番号１０）
ｍ＿ＢｄｎｆＦ：５’－ＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＧＴＧＴＧ－３’（配列番号１１）
ｍ＿ＢｄｎｆＲ：５’－ＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧ－３’（配列番号１２）
ｍ＿Ｎｔ３Ｆ：５’－ＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡ－３’（配列番号１３）
ｍ＿Ｎｔ３Ｒ：５’－ＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＧＧＴＴＧＣＣＣＡＣ－３’（配列番号１４）
ｍ＿Ｎｔ４／５Ｆ：５’－ＡＧＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＣＧＣＣＣＧＣ－３’（配列番号１５）
ｍ＿Ｎｔ４／５Ｒ：５’－ＴＧＣＧＡＣＧＣＡＧＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧ－３’（配列番号１６）
製造元のプロトコル（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ，Ｔｈｏｒｏｌｄ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）に従って、全ＲＮＡ抽出及び精製単離キット（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して、全ＲＮＡを抽出した。遺伝子発現の研究のために、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（サーモサイエンティフィック社）を使用して、全ｃＤＮＡ合成が達成された。Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｎｇｆ、Ｂｄｎｆ、Ｎｔ３、Ｎｔ４／５についてのｍＲＮＡの存在量は、リアルタイムＰＣＲによって、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ－Ｉを使用して定量化された。Ｇａｐｄｈは、ハウスキーピング対照としての役割を果たす。以下のプライマーのセットを使用した：
ｍ＿Ｇａｐｄｈ Ｆ５’－ＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣＴ－３’（配列番号１）
ｍ＿Ｇａｐｄｈ Ｒ５’－ＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴ－３’（配列番号２）
ｍ＿Ａｓｃｌ１ Ｆ：５’－ＣＧＡＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号３）
ｍ＿Ａｓｃｌ１ Ｒ：５’－ＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣＧＡＡＣ－３’（配列番号４）
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ｍ＿Ｂｒｎ２＿Ｒ：５’－ＴＧＧＣＧＴＣＣＡＣＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧ－３’（配列番号６）
ｍ＿Ｍｙｔ１Ｌ＿Ｆ：５’－ＡＴＡＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＴＣ－３’（配列番号７）
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ｍ＿ＢｄｎｆＲ：５’－ＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧ－３’（配列番号１２）
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ｍ＿Ｎｔ３Ｒ：５’－ＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＧＧＴＴＧＣＣＣＡＣ－３’（配列番号１４）
ｍ＿Ｎｔ４／５Ｆ：５’－ＡＧＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＣＧＣＣＣＧＣ－３’（配列番号１５）
ｍ＿Ｎｔ４／５Ｒ：５’－ＴＧＣＧＡＣＧＣＡＧＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧ－３’（配列番号１６）
【0067】
免疫細胞化学（ＩＣＣ）
ニューロン変換因子ＡＢＭ、又はモックプラスミドをナノトランスフェクトされたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）にてＩＣＣを行った。簡単に言えば、室温にて４％ホルムアルデヒドで細胞を１５分間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１５分間透過処理し、続いて１０％正常ヤギ血清中で室温にて１時間ブロッキングした。ブロッキング後、一次抗体処理を実施し、続いてＰＢＳの３回の洗浄段階が行われた。
ニューロン変換因子ＡＢＭ、又はモックプラスミドをナノトランスフェクトされたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）にてＩＣＣを行った。簡単に言えば、室温にて４％ホルムアルデヒドで細胞を１５分間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１５分間透過処理し、続いて１０％正常ヤギ血清中で室温にて１時間ブロッキングした。ブロッキング後、一次抗体処理を実施し、続いてＰＢＳの３回の洗浄段階が行われた。
【0068】
二次抗体を適用して、ＭＡＰ２（Ａｂｃａｍ，ａｂ５３９２；１５９ １：１０００）、βＩＩＩチューブリン（ＴｕＪ１）（Ａｂｃａｍ，ａｂ５２６２３；１：２００，ＧｅｎｅＴｅｘ ＧＴＸ８５４６９；１：５００）及び１６０ニューロフィラメント２００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ Ｎ４１４２；１：２００）タンパク質の発現パターンを可視化した。適切な蛍光タグ付き二次抗体（Ａｌｅｘａ ４８８タグ付きα－ウサギ，１：２００；Ａｌｅｘａ ５６８タグ付きα－ニワトリ，１：２００）と共に続いてインキュベートすることによって、シグナルを可視化した。ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０００スペクトル共焦点顕微鏡及びレーザースキャン共焦点顕微鏡（ＬＳＭ８８０，Ｚｅｉｓｓ）を使用して、蛍光画像が獲得された。
【0069】
免疫組織化学及び顕微鏡検査法
１２ｍｍパンチバイオプシー試料の厚さ１０ｕｍパラフィン又は凍結切片上で組織免疫染色を行った。βＩＩＩチューブリン（ＴｕＪ１）（Ａｂｃａｍ，ａｂ５２６２３；１：１００；ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｉｎｃ．ＧＴＸ８５４６９，１：５００）、Ｓ１００Ａ４（Ａｂｃａｍ，ａｂ４１５３２；１：２００）、神経成長因子－β（ＮＦＧ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，ＡＢ１５２６；１：２００）、及びタンパク質遺伝子産物９．５（ＰＧＰ９．５）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，ＡＢ１７６１；１：２００）の免疫染色を、指定の特異的抗体を使用して皮膚試料のパラフィン及び凍結切片で実施した。簡単に言えば、ＯＣＴ又はパラフィン包埋組織を厚さ１０ｕｍで凍結切片にし、冷たいアセトンで固定し、１０％正常ヤギ血清でブロックし、特異的抗体と共にインキュベートした。続いて、適切な蛍光タグ付き二次抗体（Ａｌｅｘａ ４８８タグ付きα－ウサギ，１：２００；Ａｌｅｘａ ４８８タグ付きα－ニワトリ，１：２００；Ａｌｅｘａ ５６８タグ付きα－ウサギ，１：２００）と共にインキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色することによって、シグナルを可視化した。Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１スライドスキャナー（Ｚｅｉｓｓ顕微鏡検査）又はレーザースキャン共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、画像を収集した。画像分析ソフトウェアＺｅｎ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、蛍光強度を定量した。さらに、Ｚｅｎ（Ｚｅｉｓｓ）における細胞カウントモジュールを用いて、実視野（ＦＯＶ）における蛍光ポジティブ細胞の手作業での細胞カウント。各画像に関して、３～６ＦＯＶをカウントし、ポジティブパーセントとしてデータを表した。Ｚｅｎ ｂｌａｃｋソフトウェアを使用して、共局在化を実施した。
１２ｍｍパンチバイオプシー試料の厚さ１０ｕｍパラフィン又は凍結切片上で組織免疫染色を行った。βＩＩＩチューブリン（ＴｕＪ１）（Ａｂｃａｍ，ａｂ５２６２３；１：１００；ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｉｎｃ．ＧＴＸ８５４６９，１：５００）、Ｓ１００Ａ４（Ａｂｃａｍ，ａｂ４１５３２；１：２００）、神経成長因子－β（ＮＦＧ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，ＡＢ１５２６；１：２００）、及びタンパク質遺伝子産物９．５（ＰＧＰ９．５）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，ＡＢ１７６１；１：２００）の免疫染色を、指定の特異的抗体を使用して皮膚試料のパラフィン及び凍結切片で実施した。簡単に言えば、ＯＣＴ又はパラフィン包埋組織を厚さ１０ｕｍで凍結切片にし、冷たいアセトンで固定し、１０％正常ヤギ血清でブロックし、特異的抗体と共にインキュベートした。続いて、適切な蛍光タグ付き二次抗体（Ａｌｅｘａ ４８８タグ付きα－ウサギ，１：２００；Ａｌｅｘａ ４８８タグ付きα－ニワトリ，１：２００；Ａｌｅｘａ ５６８タグ付きα－ウサギ，１：２００）と共にインキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色することによって、シグナルを可視化した。Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１スライドスキャナー（Ｚｅｉｓｓ顕微鏡検査）又はレーザースキャン共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、画像を収集した。画像分析ソフトウェアＺｅｎ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、蛍光強度を定量した。さらに、Ｚｅｎ（Ｚｅｉｓｓ）における細胞カウントモジュールを用いて、実視野（ＦＯＶ）における蛍光ポジティブ細胞の手作業での細胞カウント。各画像に関して、３～６ＦＯＶをカウントし、ポジティブパーセントとしてデータを表した。Ｚｅｎ ｂｌａｃｋソフトウェアを使用して、共局在化を実施した。
【0070】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
細胞培養実験では、ＮＧＦ産生を培養培地で測定し、細胞溶解物から測定された総タンパク質濃度に正規化した。皮膚組織試料については、厚さ１００μＭの切片２０個からタンパク質を単離した。組織切片をＨＢＳＳ中に収集し、ＨＢＳＳで３回洗浄して、ＯＣＴを除去し、均質化バッファー［５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５～８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，０．５％デオキシコール酸ナトリウム，プロテアーゼ阻害剤カクテル１０ｕｌ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ），Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びＰＭＳＦ１０ｕｌ（１００ｍＭ）］中に再懸濁した。Ｐｅｌｌｅｔ Ｐｅｓｔｌｅ Ｍｏｔｏｒ（Ｋｉｍｂｌｅ Ｃｈａｓｅ，ＮＪ）での５～１０秒の破断を用いて、組織を氷上でそれぞれ３回３０秒間ホモジナイズし、続いて１０秒の破断を用いて、氷上でそれぞれ３回１０秒間音波処理した。４℃で２１，０００ｇにて５分間ホモジネートを遠心分離した。上清を回収し、ＥＬＩＳＡが実施されるまで－８０℃で保管した。製造元の説明書に従って、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を実施し、タンパク質ミリグラム当たりのＮＧＦ値を標準化した。ＮＧＦ Ｒａｐｉｄ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｅｎｓｉｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）を使用して、ＮＧＦタンパク質レベルを決定した。
細胞培養実験では、ＮＧＦ産生を培養培地で測定し、細胞溶解物から測定された総タンパク質濃度に正規化した。皮膚組織試料については、厚さ１００μＭの切片２０個からタンパク質を単離した。組織切片をＨＢＳＳ中に収集し、ＨＢＳＳで３回洗浄して、ＯＣＴを除去し、均質化バッファー［５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５～８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，０．５％デオキシコール酸ナトリウム，プロテアーゼ阻害剤カクテル１０ｕｌ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ），Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びＰＭＳＦ１０ｕｌ（１００ｍＭ）］中に再懸濁した。Ｐｅｌｌｅｔ Ｐｅｓｔｌｅ Ｍｏｔｏｒ（Ｋｉｍｂｌｅ Ｃｈａｓｅ，ＮＪ）での５～１０秒の破断を用いて、組織を氷上でそれぞれ３回３０秒間ホモジナイズし、続いて１０秒の破断を用いて、氷上でそれぞれ３回１０秒間音波処理した。４℃で２１，０００ｇにて５分間ホモジネートを遠心分離した。上清を回収し、ＥＬＩＳＡが実施されるまで－８０℃で保管した。製造元の説明書に従って、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を実施し、タンパク質ミリグラム当たりのＮＧＦ値を標準化した。ＮＧＦ Ｒａｐｉｄ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｅｎｓｉｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）を使用して、ＮＧＦタンパク質レベルを決定した。
【0071】
ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（蛍光マルチプレックスＲＮＡｓｃｏｐｅ）
クリオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、皮膚切片（１０ｕｍ）を切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ Ｇｏｌｄガラススライド（フィッシャーサイエンティフィック社，番号２２－０３５－８１３）に載せた。続いてスライドを－８０℃で保存した。カスタムソフトウェアを使用して、対ダブル（ｐａｉｒｅｄ ｄｏｕｂｌｅ）－Ｚオリゴヌクレオチドプローブを標的ＲＮＡに対してデザインした。Ａｓｃｌ１ ｍＲＮＡ（３１３２９１－Ｃ２）、Ｂｒｎ２（４６０５６１－Ｃ３）及びＭｙｔ１ｌ（４８３４０１）に対するプローブ、並びにｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びＤＡＰＩ標識のための他の試薬をＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＡＣＤ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）から購入した。製造元の説明書に従って、ＲＮＡｓｃｏｐｅマルチプレックス蛍光試薬ｖ２キットを使用して手作業で、組織前処理、ハイブリダイゼーション、増幅、及び検出を実施した。ＲＮＡｓｃｏｐｅハイブリダイゼーションの間、ポジティブプローブ（カタログ番号３２１８１１）、ネガティブプローブ（カタログ番号３２１８３１）、及びＡＢＭプローブを同時に処理した。ＦＶ３０００オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）顕微鏡を使用して、蛍光画像を獲得した。
クリオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、皮膚切片（１０ｕｍ）を切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ Ｇｏｌｄガラススライド（フィッシャーサイエンティフィック社，番号２２－０３５－８１３）に載せた。続いてスライドを－８０℃で保存した。カスタムソフトウェアを使用して、対ダブル（ｐａｉｒｅｄ ｄｏｕｂｌｅ）－Ｚオリゴヌクレオチドプローブを標的ＲＮＡに対してデザインした。Ａｓｃｌ１ ｍＲＮＡ（３１３２９１－Ｃ２）、Ｂｒｎ２（４６０５６１－Ｃ３）及びＭｙｔ１ｌ（４８３４０１）に対するプローブ、並びにｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びＤＡＰＩ標識のための他の試薬をＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＡＣＤ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）から購入した。製造元の説明書に従って、ＲＮＡｓｃｏｐｅマルチプレックス蛍光試薬ｖ２キットを使用して手作業で、組織前処理、ハイブリダイゼーション、増幅、及び検出を実施した。ＲＮＡｓｃｏｐｅハイブリダイゼーションの間、ポジティブプローブ（カタログ番号３２１８１１）、ネガティブプローブ（カタログ番号３２１８３１）、及びＡＢＭプローブを同時に処理した。ＦＶ３０００オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）顕微鏡を使用して、蛍光画像を獲得した。
【0072】
結果
ナノチャネル電気穿孔法（ＮＥＰＡＢＭ）によるＡＢＭの送達によって、トランスフェクションから２週間後及び４週間後にＭＥＦの変換が起こる。ニューロフィラメント２００＋染色によって示される、誘導神経（ｉＮ）細胞は、４週目に有意に高いＮｇｆ発現を示した（図１Ｂ）。ＮＧＦタンパク質の産生は、図１Ｃに示すＮＥＰＡＢＭ後４週目にＭＥＦ培養培地中に誘導された。ＮＥＰＡＢＭ後１週目（図１Ｄ）及び４週目（図１Ｅ）での脳由来神経栄養性因子（Ｂｄｎｆ）の定量分析、ＮＥＰＡＢＭ後１週目（図１Ｆ）及び４週目（図１Ｇ）でのニューロトロフィン－３（Ｎｔ３）の定量分析、ＮＥＰＡＢＭ後１週目（図１Ｈ）及び４週目（図１Ｈ）でのニューロトロフィン－４／５（Ｎｔ４／５）の定量分析は、ＮＥＰＡＢＭ後４週目にてＮｔ３発現の有意な増加を示した（図１Ｇ）。
ナノチャネル電気穿孔法（ＮＥＰＡＢＭ）によるＡＢＭの送達によって、トランスフェクションから２週間後及び４週間後にＭＥＦの変換が起こる。ニューロフィラメント２００＋染色によって示される、誘導神経（ｉＮ）細胞は、４週目に有意に高いＮｇｆ発現を示した（図１Ｂ）。ＮＧＦタンパク質の産生は、図１Ｃに示すＮＥＰＡＢＭ後４週目にＭＥＦ培養培地中に誘導された。ＮＥＰＡＢＭ後１週目（図１Ｄ）及び４週目（図１Ｅ）での脳由来神経栄養性因子（Ｂｄｎｆ）の定量分析、ＮＥＰＡＢＭ後１週目（図１Ｆ）及び４週目（図１Ｇ）でのニューロトロフィン－３（Ｎｔ３）の定量分析、ＮＥＰＡＢＭ後１週目（図１Ｈ）及び４週目（図１Ｈ）でのニューロトロフィン－４／５（Ｎｔ４／５）の定量分析は、ＮＥＰＡＢＭ後４週目にてＮｔ３発現の有意な増加を示した（図１Ｇ）。
【0073】
背側マウス皮膚へのＴＮＴＡＢＭによるＡＢＭの局所的送達の成功は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌ（図２Ａ）の検出された発現で、その場（ｉｎｓｉｔｕ）で確認された。ＴｕＪ１＋として早期に可視化されたｉＮ細胞は、ＴＮＴＡＢＭ後４週目（図２Ｂ）で真皮に有意に豊富であった。ＴｕＪ１＋ｉＮ細胞は、線維芽細胞－特異的タンパク質（ＦＳＰ）を同時発現し、これらのｉＮ細胞が線維芽細胞由来であることが示された（図２Ｃ）。
【0074】
ＴＮＴＡＢＭは、ＴＮＴＡＢＭ後１週にてマウス皮膚においてＮｇｆ発現を増強し（図３Ａ参照）、続いてＴＮＴＡＢＭ後４週でＮＧＦタンパク質産生を増強した（図３Ｂ）。免疫染色をベースとする表皮において高いＮＧＦ発現が局在化された（図３Ｃ）。ｇＢｄｎｆ（図３Ｄ）、Ｎｔ３（図３Ｅ）、及びＮｔ４／５（図３Ｆ）を含む神経栄養性因子遺伝子発現の定量分析から、ＴＮＴＡＢＭ後１週目に有意なＮｔ３発現を示した（図３Ｅ）。
【0075】
ｄｂ／ｄｂマウスの背側皮膚上の局所的ＴＮＴＡＢＭは、４週目に真皮においてＴｕＪ１＋細胞の増加を示した（図４Ａ）。トランスフェクトされた組織におけるＮＧＦの存在量は、ＥＬＩＳＡによって定量化され（データを図４Ｂに示す（ｎ＝９，１０），＊ｐ＜０．０１）、４週目（図４Ｃ）及び９週目での（図４Ｄ）ＩＨＣ画像の定量化は、ＴＮＴＡＢＭ後４週目でのＮＧＦの有意な増加を示した。表皮によるＮＧＦの高い産生は、マウスにけるＴＮＴＡＢＭ後９週までの間持続された。ニューロパシーの発症が十分に実証された際に、その時点でこれらのｄｂ／ｄｂマウスは３６週齢であった。ＰＧＰ９．５＋染色によって測定された成熟神経細胞の数は、ＴＮＴｍｏｃｋと比較して有意に高かった（図４Ｅ）。
【0076】
考察
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）再プログラミングは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で再プログラムされた限られた数の細胞のインプランテーションに依存している場合が多い。かかるアプローチは、宿主免疫システムと矛盾することが多い。局所的ＴＮＴにより仲介される生体内再プログラミングによって、免疫監視下にて生体内で細胞が変換されるという利点を提供する。生体内での細胞変換の成功は、かかる再プログラミングが、局所免疫システムでの交渉が成功した後にのみ起こったことを意味する。したがって、生体内細胞のかかるプロセスは、翻訳の有意性を有する持続可能な結果を生じる可能性が高い。
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）再プログラミングは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で再プログラムされた限られた数の細胞のインプランテーションに依存している場合が多い。かかるアプローチは、宿主免疫システムと矛盾することが多い。局所的ＴＮＴにより仲介される生体内再プログラミングによって、免疫監視下にて生体内で細胞が変換されるという利点を提供する。生体内での細胞変換の成功は、かかる再プログラミングが、局所免疫システムでの交渉が成功した後にのみ起こったことを意味する。したがって、生体内細胞のかかるプロセスは、翻訳の有意性を有する持続可能な結果を生じる可能性が高い。
【0077】
生体内での細胞の再プログラミングは、パラクリンメカニズムによって同じ微小環境内の非再プログラム細胞に影響を及ぼすと予測される因子の放出を誘導する。生体内再プログラミングの産物は、変換が成功した細胞、並びに変換細胞及び周囲の神経性細胞の生存及び機能性を支える修飾組織微小環境である。成人皮膚におけるＴＮＴＡＢＭにより産生されたｉＮ細胞は、長期間生き残り続け、電気生理学的活性を獲得する。
【0078】
本明細書に開示される、ＴｕＪ１＋神経細胞は、ＴＮＴＡＢＭに応答して産生し、ＦＳＰ＋細胞と共存し、以前に確立されたようにｉＮの線維芽細胞由来を意味する。この研究の興味深い知見は、皮膚間質がＮＧＦ及びＮｔ３発現を豊富にすることである。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）条件下でのＮＧＦ及びＮｔ３の誘導の相違するタイムラインは、間質の複雑性及び血液由来因子など、実験条件の違いによって説明され得る。
【0079】
ＮＧＦ及びＮＴ３発現の誘導の遅れが、老齢糖尿病性マウスにおいて確認され、糖尿病の条件下にて神経原性再プログラミングの成功に対する障害を意味する。ＤＰＮの臨床的評価は、タンパク質遺伝子産物９．５（ＰＧＰ９．５）免疫染色による、皮膚生検における官能検査、神経伝導速度試験、又は神経繊維の計数を含む。ＰＧＰ９．５＋ペプチド作動性及び非ペプチド作動性表皮内神経繊維（ＩＥＮＦ）の計数は、ＤＰＮにおける小神経の減少を定量的に評価するための「ゴールドスタンダード」として益々認識されている。これらの初期構造変化がｄｂ／ｄｂマウスにおいて確立された。この研究において、ｄｂ／ｄｂマウスにおける局所的皮膚ＴＮＴＡＢＭによって、９週間まで高いＮＧＦ産生が誘導された。かかる高い皮膚ＮＧＦは、ＰＧＰ９．５＋成熟神経繊維のより高い存在量と関連した。ｄｂ／ｄｂにおいて、この年齢にて皮膚ＰＧＰ９．５＋成熟神経繊維が顕著に減少したことはよく知られている。したがって、局所的皮膚ＴＮＴＡＢＭに応答した、内因性ＮＧＦ及び他の同時制御神経栄養性因子の上昇は、糖尿病における皮膚ＰＧＰ９．５＋成熟神経繊維の喪失を減らすのに有効である。まとめると、これは、生体内再プログラミングの条件下にて、糖尿病の条件下にてその損失の予測可能な経路から既存の神経線維を救出することなど、治療目的に、組織微小環境の変化を利用することができることを実証する最初の研究である。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4-1】
【図4-2】
【配列表】
【国際調査報告】