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特表2023-524414ＴＤＰ－４３プロテイノパチーの処置のための組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-12
(54)【発明の名称】ＴＤＰ－４３プロテイノパチーの処置のための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230605BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230605BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20230605BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20230605BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230605BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230605BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230605BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230605BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230605BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20230605BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230605BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230605BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20230605BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230605BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230605BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20230605BHJP
A61K 35/763 20150101ALI20230605BHJP
A61K 35/765 20150101ALI20230605BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230605BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230605BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C12N15/864 100Z
C12N15/86 Z
C12N7/01
C12N5/10
A61P43/00 111
A61P25/00
A61P21/00
A61P25/14
A61P25/16
A61P25/28
A61K38/17
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/761
A61K35/763
A61K35/765
A61K35/12
A61K47/64
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022565544
(86)(22)【出願日】2021-04-27
(85)【翻訳文提出日】2022-12-14
(86)【国際出願番号】 US2021029289
(87)【国際公開番号】W WO2021222168
(87)【国際公開日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】63/016,707
(32)【優先日】2020-04-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/035,437
(32)【優先日】2020-06-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516127178
【氏名又は名称】ソラ・バイオサイエンシズ・エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100196243
【弁理士】
【氏名又は名称】運 敬太
(72)【発明者】
【氏名】菱谷 彰徳
(72)【発明者】
【氏名】コヤ，ケイゾウ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD25
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC01
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA06
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA20
4C084BA21
4C084BA23
4C084BA41
4C084CA18
4C084CA53
4C084DC50
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZA161
4C084ZA162
4C084ZA221
4C084ZA222
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZC411
4C084ZC412
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA04
4C087CA09
4C087CA12
4C087NA05
4C087NA13
4C087ZA02
4C087ZA15
4C087ZA16
4C087ZA22
4C087ZA94
4C087ZC41
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
ＴＤＰ－４３媒介性タンパク質凝集および関連したプロテオパチーを特異的に低下させるために、細胞の生得的なシャペロン機構、具体的にはＨｓｐ７０媒介性システムを動員する新規なクラスの融合タンパク質が開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｊタンパク質のＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む単離された融合タンパク質。
【請求項2】
Ｊタンパク質のＪドメインが真核生物起源である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
Ｊタンパク質のＪドメインがヒト起源である、請求項１または請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
Ｊタンパク質のＪドメインが細胞質に局在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
Ｊタンパク質のＪドメインが、配列番号１～５０からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
Ｊドメインが、配列番号１、５、６、１０、１６、２４、２５、３１、および４９からなる群から選択される配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
Ｊドメインが配列番号５の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
Ｊドメインが配列番号１０の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
Ｊドメインが配列番号１６の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
Ｊドメインが配列番号２５の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
Ｊドメインが配列番号３１の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
ＴＤＰ－４３結合性ドメインが、例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定された場合、１μＭ以下、例えば、３００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下の、ＴＤＰ－４３（例えば、ＴＤＰ－４３のＣ末端の２０７アミノ酸を含むレポーター構築物を用いる）に対するＫＤを有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
ＴＤＰ－４３結合性ドメインが、配列番号５１～５５からなる群から選択される配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
ＴＤＰ－４３結合性ドメインが、配列番号５１～５３の配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
ＴＤＰ－４３結合性ドメインが配列番号５１の配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項16】
ＴＤＰ－４３結合性ドメインが配列番号５３の配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項17】
複数のＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項18】
２つのＴＤＰ－４３結合性ドメインからなる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項19】
３つのＴＤＰ－４３結合性ドメインからなる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項20】
以下の構築物：ａ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｂ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｃ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｄ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｅ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｆ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｇ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｈ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｉ． ＴＤＮＡＪ－Ｘ－ＴＴＴＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｊ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－ＴＴ、
ｋ． ＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＴＴＴＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｌ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｍ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｎ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｏ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｐ． ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｑ． Ｔ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、
ｒ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、および
ｓ． Ｔ－Ｘ－ＴＤｎａＪ－Ｘ－ＴＤｎａＪ－Ｘ－ＴＴＴＴ
のうちの１つを含み、
ここで、
ＴはＴＤＰ－４３結合性ドメインであり、
ＤＮＡＪはＪタンパク質のＪドメインであり、
Ｘは任意選択のリンカーである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項21】
配列番号５のＪドメイン配列および配列番号５１のＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項22】
配列番号５のＪドメイン配列、および配列番号５３のＴＤＰ－４３結合性ドメインの２個のコピーを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項23】
配列番号８０～８５および８９～９７からなる群から選択される配列を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項24】
配列番号８０、８２～８５、８９～９０、および９２～９７からなる群から選択される配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項25】
配列番号８０の配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項26】
配列番号９０の配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項27】
配列番号９２の配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項28】
配列番号９４の配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項29】
配列番号９５の配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項30】
配列番号９６の配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項31】
標的化試薬をさらに含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項32】
エピトープをさらに含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項33】
エピトープが、配列番号６７～７３からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項34】
細胞透過剤をさらに含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項35】
細胞透過剤が、配列番号７４～７７からなる群から選択される、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項36】
シグナル配列をさらに含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項37】
シグナル配列が、配列番号９８～１００からなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項38】
細胞においてＴＤＰ－４３タンパク質の凝集を低下させる能力がある、請求項１～３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項39】
ＴＤＰ－４３媒介性細胞毒性を低下させる能力がある、請求項１～３８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項40】
請求項１～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項41】
前記核酸がＤＮＡである、請求項４０に記載の核酸配列。
【請求項42】
前記核酸がＲＮＡである、請求項４０に記載の核酸配列。
【請求項43】
前記核酸が少なくとも１個の修飾核酸を含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の核酸配列。
【請求項44】
プロモーター領域、５’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）シグナルなどの３’ＵＴＲをさらに含む、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の核酸配列。
【請求項45】
プロモーター領域が、ＣＭＶエンハンサー配列、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＮＳＥプロモーター、シナプシンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、およびＧＦＡＰプロモーターからなる群から選択される配列を含む、請求項４４に記載の核酸配列。
【請求項46】
請求項４０～４５のいずれか一項に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項47】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアまたは粘液腫）、パラミクソウイルス（麻疹、ＲＳＶ、またはニューキャッスル病ウイルス）、バキュロウイルス、レオウイルス、アルファウイルス、およびフラビウイルスからなる群から選択される、請求項４６に記載のベクター。
【請求項48】
ＡＡＶである、請求項４６または請求項４７に記載のベクター。
【請求項49】
カプシドおよび請求項４６～４８のいずれか一項に記載のベクターを含むウイルス粒子。
【請求項50】
カプシドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、偽型ＡＡＶ、アカゲザル由来ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、およびＡＡＶ－ＤＪａｎ ＡＡＶカプシド変異体、ＡＡＶハイブリッドセロタイプ、臓器向性ＡＡＶ、心臓向性ＡＡＶ、および心臓向性ＡＡＶＭ４１変異体からなる群から選択される、請求項４９に記載のウイルス粒子。
【請求項51】
カプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択される、請求項４９または請求項５０に記載のウイルス粒子。
【請求項52】
カプシドがＡＡＶ２である、請求項４９～５１のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項53】
カプシドがＡＡＶ５である、請求項４９～５１のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項54】
カプシドがＡＡＶ８である、請求項４９～５１のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項55】
カプシドがＡＡＶ９である、請求項４９～５１のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項56】
カプシドがＡＡＶ ｒｈ１０である、請求項４９～５１のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項57】
請求項１～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する細胞、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の核酸、請求項４６～４８のいずれか一項に記載のベクター、請求項４９～５６のいずれか一項に記載のウイルス粒子からなる群から選択される作用物質、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項58】
細胞においてＴＤＰ－４３タンパク質の毒性を低下させる方法であって、請求項１～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する細胞、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の核酸、請求項４６～４８のいずれか一項に記載のベクター、請求項４９～５６のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および請求項５７に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量と前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
【請求項59】
細胞が対象内にある、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
対象がヒトである、請求項５８または請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
細胞が中枢神経系の細胞である、請求項５８～６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
対象が、ＴＤＰ－４３疾患を有すると同定されている、請求項５８～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
ＴＤＰ－４３疾患が、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
ＴＤＰ－４３疾患がＡＬＳである、請求項６２または請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
対照細胞と比較した場合、細胞において凝集ＴＤＰ－４３タンパク質の量の低下がある、請求項５８～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
ＴＤＰ－４３疾患の処置、防止、またはその進行の遅延を必要とする対象においてＴＤＰ－４３疾患を処置する、防止する、またはその進行を遅延させる方法であって、請求項１～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する細胞、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の核酸、請求項４６～４８のいずれか一項に記載のベクター、請求項４９～５６のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および請求項５７に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量を投与するステップを含む、方法。
【請求項67】
ＴＤＰ－４３疾患が、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
ＴＤＰ－４３疾患がＡＬＳである、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
対象におけるＴＤＰ－４３疾患の防止またはその進行の遅延に有用な医薬の調製における、請求項１～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する細胞、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の核酸、請求項４６～４８のいずれか一項に記載のベクター、請求項４９～５６のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および請求項５７に記載の薬学的組成物の１つまたは複数の使用。
【請求項70】
ＴＤＰ－４３疾患が、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される、請求項６９に記載の使用。
【請求項71】
ＴＤＰ－４３疾患がＡＬＳである、請求項６９または請求項７０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
この出願は、２０２０年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／０１６，７０７号、およびまた２０２０年６月５日に出願された米国仮特許出願第６３／０３５，４３７号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による優先権を主張する。前述の出願の全内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
この出願は、２０２０年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／０１６，７０７号、およびまた２０２０年６月５日に出願された米国仮特許出願第６３／０３５，４３７号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による優先権を主張する。前述の出願の全内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【背景技術】
【0002】
細胞内で発現した全てのタンパク質は、適切に機能するためにそれらの意図された構造へ正しくフォールドされる必要がある。増え続ける疾患および障害が、タンパク質の不適切なフォールディングならびに／またはタンパク質およびリポタンパク質、加えて感染性タンパク質性物質の不適切な沈着および凝集と関連づけられることが示されている。コンフォメーション病またはプロテオパチーとしても知られている、ミスフォールディングにより引き起こされる疾患の例には、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）が挙げられる。変異タンパク質は、細胞において凝集し、典型的な細胞毒性細胞封入体をもたらす。
【0003】
様々な神経変性疾患は、アミロイド線維で構成される細胞内または細胞外のタンパク質凝集物の蓄積により病理学的に特徴づけられる（Ｆｏｒｍａｎら、（２００４）Ｎａｔ Ｍｅｄ．１０：１０５５～１０６３）。例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）の病態は、βアミロイドおよび微小管結合タンパク質タウ、それぞれで構成される老人斑および神経原線維濃縮体により定義され、αシヌクレインで構成されるレビー小体は、パーキンソン病の、疾患を定義する病変である。最近まで、ＦＴＬＤ症候群に関連した最もよく見られる表現型である、ユビキチン封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－Ｕ）（Ｋｕｍａｒ－Ｓｉｎｇｈ ＆ Ｖａｎ （２００７）Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．、１７：１０４～１１４）、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（Ｘｉａｏら、（２００６）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１７６２：１００１～１０１２）の両方の神経病理学は、非アミロイド形成的ユビキチン化封入体（ＵＢＩ）によって定義された。
【0004】
初老期認知症の２番目に多い型である、ＦＴＬＤは、共通して行動および／または言語の機能障害を有する、神経変性障害の不均一な群を指す（Ｋｕｍａｒ－Ｓｉｎｇｈ ＆ Ｖａｎ、前記）。いく人かの罹患した個体は、パーキンソニズムまたは運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）などの運動障害を現す。ＦＴＬＤという名称は、顕著な前頭葉および側頭葉の変性を反映しているが、多数の神経病理学的異常がこれらの患者において同定されている（Ｃａｉｒｎｓら、（２００７）Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．、１１４５：５～２２）。ＦＴＬＤの以下の２つの広い病理学的下位区分が認識されている：タウ陽性封入体を有する脳（すなわち、タウオパチー）、ならびにタウ、αシヌクレイン、およびβアミロイドに対する抗体で検出されないＵＢＩを有する脳（すなわち、ＦＴＬＤ-Ｕ）。ＦＴＬＤの最高で４０％は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）およびバロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）における変異、加えて染色体９ｐ上の新規な遺伝子座との連鎖を含むＦＴＬＤ－Ｕ病態に関連した３つの異なる遺伝的異常を有する家族性遺伝様式を示す。
【0005】
運動ニューロン疾患またはルー・ゲーリック病としても知られた、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、進行性筋消耗および筋力低下をもたらす、脳幹および脊髄における上位と下位の両方の運動ニューロンの進行性変性により特徴づけられる神経変性疾患である（Ａｌ－Ｃｈａｌａｂｉら、（２０１６）Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．、１５（１１）：１１８２～１１９４；Ｒｏｂｂｅｒｅｃｈｔ ＆ Ｐｈｉｌｉｐｓ、（２０１３）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１４（４）：２４８～２６４；Ｔａｌｂｏｔら、（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３７（８）：ｅ６４）。ＡＬＳは、５４～６７歳での発症年齢中央値について１００，０００人あたり約５．４症例の罹患率中央値を有し、男性のリスクが、女性と比較して、わずかに高い（Ｃｈｉｏら、（２００９）Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒ．、１０（５－６）：３１０～３２３；Ｃｈｉｏら、（２０１３）Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ、４１（２）：１１８～１３０；ＭｃＣｏｍｂｅ ＆ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、（２０１０）Ｇｅｎｄ Ｍｅｄ．、７（６）：５５７～５７０）。ＡＬＳは、いかなる有効な処置もない、壊滅的な神経変性疾患であり、患者は、通常、疾患発症から２～４年以内に、主に呼吸不全および嚥下問題によって、死亡する（Ｃｈｉｏら、（２００９）Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒ．、１０（５－６）：３１０～３２３；ｄｅｌ Ａｇｕｉｌａら、（２００３）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６０（５）：８１３～８１９；Ｔａｂａｔａら、（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、７（８）：ｅ６４）。
【0006】
ＡＬＳ症例の大部分は、原因不明の孤発性（ｓＡＬＳ）であり、約１０％の症例のみが、家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）として知られた家族性遺伝子変異のメンデル遺伝様式を含む（Ｒｅｎｔｏｎら、（２０１４）Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１７（１）：１７～２３；Ｔａｙｌｏｒら、（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ、５３９（７６２８）：１９７～２０６；Ｔｕｒｎｅｒら、（２０１７）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、８８（１２）：１０４２～１０４４）。今まで、最高３０個の遺伝子が、ＡＬＳの一遺伝子的原因として記載されており、最も頻度の高いのは、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＳＯＤ１、ＦＵＳ、およびＴＡＲＤＢＰ／ＴＤＰ４３である（Ｃｈｉａら、（２０１８）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．、１７（１）：９４～１０２；Ｎｉｃｏｌａｓら、（２０１８）Ｎｅｕｒｏｎ、９７（６）：１２６８～１２８３；Ｖｏｌｋら、（２０１８）Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．、３０（２）：２５２～２５８）。
【0007】
ＡＬＳにおける浸透率の変動性、加えて多数の遺伝子における遺伝子変異の同定は、多重遺伝子コンポーネントおよび環境因子などの多数の因子が疾患感受性の根底にあり得ることを示唆している。実際、タンパク質ミスフォールディング／凝集（Ｒｏｓｓ ＆ Ｐｏｉｒｉｅｒ、（２００４）Ｎａｔ Ｍｅｄ．、１０ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１０～１７）、グルタミン酸媒介性興奮毒性（Ｂｌａｓｃｏら、（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．、２１（３１）：３５５１～３５７５）、ミトコンドリア動態異常（Ｃａｐｐｅｌｌｏ ＆ Ｆｒａｎｃｏｌｉｎｉ、（２０１７）Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．、１８（１０）；Ｄｅｌｉｃら、（２０１８） Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．、９６（８）：１３５３～１３６６；Ｏｎｅｓｔｏら、（２０１６）Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｃｏｍｍｕｎ．、４（１）：４７）、および酸化ストレスへの寄与因子（Ａｎａｎｄら、（２０１３）Ｏｘｉｄ Ｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｏｎｇｅｖ．、２０１３：６３５８３１；Ｓｈａｒｍａら、（２０１６）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ．、４１（５）：９６５～９８４）などの細胞経路の組合せがＡＬＳにおいて神経毒性結果をもたらし得ると示唆されている。
【0008】
４３ＫＤａの分子量を有するトランザクティブ応答（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＴＡＲ）－ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ－４３）は、ＦＴＬＤ－ＵおよびＡＬＳのＵＢＩにおいて主要な疾患タンパク質として同定された（Ｎｅｕｍａｎｎら、（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４：１３０～１３３）。これらの障害の両方におけるＴＤＰ－４３病理の同定は、以下についての機構的リンクを提供した：１）ＡＬＳ患者の大部分が、ＦＴＬＤの範囲に位置する一連の行動および認知の変化を現す（Ｍｕｒｐｈｙら、（２００７）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．、６４：３３０～３３４）；２）ＭＮＤが、ＦＴＬＤ－Ｕ患者に共通して観察される（ＭｃＫｈａｎｎら、（２００１）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．、５８：１８０３～１８０９）；３）ＡＬＳおよびＦＴＬＤ－Ｕに観察されるユビキチン病理に有意な重複がある（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ ＆ Ｆｅｌｄｍａｎ （２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．６４：７３０～７３９）；ならびに４）ＡＬＳとＦＴＬＤの両方の同時分離を有する家族における遺伝子座および特定の遺伝子内の変異の同定（Ｔａｌｂｏｔ ＆ Ａｎｓｏｒｇｅ （２００６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１５：Ｒ１８３～Ｒ１８７）。ＴＤＰ－４３はまた、複数の他の神経変性疾患の組織病理学的マーカーであることが示されており、その疾患には、アルツハイマー病（Ａｍａｄｏｒ－Ｏｒｔｉｚら、（２００７）、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．、６１：４３５～４５）、パーキンソン病（ＬｉｎおよびＤｉｃｋｓｏｎ、（２００８）Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．、１１６：２０５～１３）、およびハンチントン病（Ｓｃｈｗａｂら、（２００８）、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．、６７：１１５９～６５）、海馬硬化症（Ａｍａｄｏｒ－Ｏｒｔｉｚら、（２００７）、前記）、およびレビー小体型認知症（ＬｉｎおよびＤｉｃｋｓｏｎ、（２００８）、前記）が挙げられる；（Ｌａｇｉｅｒ－Ｔｏｕｒｅｎｎｅら、（２０１０）、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９：Ｒ４６～Ｒ６４）に概説されている。
したがって、特に、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に基づいた病態を有する疾患、ならびに異種性凝集物の場合における疾患に対して、特異的な抗原、タンパク質、糖タンパク質、またはリポタンパク質を標的化するように最適化された新しい治療モダリティーの開発の必要性が存在する。
したがって、特に、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に基づいた病態を有する疾患、ならびに異種性凝集物の場合における疾患に対して、特異的な抗原、タンパク質、糖タンパク質、またはリポタンパク質を標的化するように最適化された新しい治療モダリティーの開発の必要性が存在する。
【0009】
熱ショック７０ｋＤａタンパク質（本明細書では「Ｈｓｐ７０ｓ」と呼ぶ）は、様々な種の細胞においてシャペロンタンパク質の遍在性クラスを構成する（Ｔａｖａｒｉａら、（１９９６） Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ １、２３～２８）。Ｈｓｐ７０は、機能するために、Ｊドメインタンパク質およびヌクレオチド交換因子（ＮＥＦ）などのコシャペロンタンパク質と呼ばれるアシスタントタンパク質を必要とする（Ｈａｒｔｌら、（２００９）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １６、５７４～５８１）。タンパク質をフォールドするためのＨｓｐ７０シャペロン機構の最新モデルにおいて、Ｈｓｐ７０は、ＡＴＰ結合状態とＡＤＰ結合状態との間を循環し、Ｊドメインタンパク質は、フォールディングまたはリフォールディングを必要とする別のタンパク質（「クライアントタンパク質」と呼ばれる）と結合して、Ｈｓｐ７０のＡＴＰ結合型（Ｈｓｐ７０－ＡＴＰ）と相互作用する（Ｙｏｕｎｇ（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８８、２９１～３００；Ｍａｙｅｒ、（２０１０）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ３９、３２１～３３１）。Ｊドメインタンパク質－クライアントタンパク質複合体のＨｓｐ７０－ＡＴＰとの結合は、ＡＴＰ加水分解を刺激し、それは、Ｈｓｐ７０タンパク質において立体構造変化を引き起こし、ヘリックスの蓋を閉じ、それにより、クライアントタンパク質とＨｓｐ７０－ＡＤＰとの間の相互作用を安定化し、加えて、Ｊドメインタンパク質の放出を誘発し、その後、そのＪドメインタンパク質は、別のクライアントタンパク質と自由に結合できる。
【0010】
したがって、このモデルにより、Ｊドメインタンパク質は、架橋として働き、かつ様々なクライアントタンパク質の捕獲およびそのＨｓｐ７０機構への提出を促進して、適切な立体構造へのフォールディングまたはリフォールディングを促すことにより、Ｈｓｐ７０機構内で重要な部分を果たす（Ｋａｍｐｉｎｇａ ＆ Ｃｒａｉｇ（２０１０）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１、５７９～５９２）。Ｊドメインファミリーは、原核生物（ＤｎａＪタンパク質）から真核生物（Ｈｓｐ４０タンパク質ファミリー）にわたる種において広く保存されている。Ｊドメイン（約６０～８０ａａ）は、４つのヘリックス：Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶで構成されている。ヘリックスＩＩおよびＩＩＩは、「ＨＰＤモチーフ」を含有する可動性ループを介して接続されており、そのＨＰＤモチーフは、Ｊドメインにわたって高度に保存されており、活性にとって重要な意味をもつと考えられる（Ｔｓａｉ ＆ Ｄｏｕｇｌａｓ、（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１、９３４７～９３５４）。ＨＰＤ配列内の変異は、Ｊドメイン機能を消失させることが見出されている。
【0011】
ＡＬＳなどのプロテオパチーについて上記で提供された背景を考えると、ミスフォールドされたタンパク質のレベルを低下させることが、これらの壊滅的な障害の症状を処置する、防止する、または別様に改善するための手段として役に立ち得ること、およびタンパク質ミスフォールディングを修復する細胞の生得的な能力の動員が、追求するべき当然の選択であろうことは明らかなように思われる。
【発明の概要】
【0012】
本発明者らは、ＴＤＰ－４３媒介性タンパク質凝集を特異的に低下させるために、細胞の生得的なシャペロン機構、具体的にはＨｓｐ７０媒介性システムを動員する新規なクラスの融合タンパク質を開発している。タンパク質分泌および発現を増強するために、Ｈｓｐ７０と相互作用するコシャペロンである、Ｈｓｐ４０タンパク質（Ｊタンパク質とも呼ばれる）の断片を含む融合タンパク質を用いる、本発明者らによる以前の研究においてとは違って、本研究は、変異ＴＤＰ－４３タンパク質の凝集により引き起こされる、タンパク質凝集および細胞毒性を低下させることを目的として、Ｊドメイン含有融合タンパク質を用いる。この関連において、本発明者らは、機能に必要とされるＪドメインのエレメントが、タンパク質発現および分泌を増強することにおけるＪドメインの使用とは全く異なるという驚くべき発見をし、本融合タンパク質の作用様式について別個の機構を実証した。本明細書に記載された融合タンパク質は、Ｊドメイン、およびＴＤＰ－４３に対する親和性を有するドメインを含む。融合タンパク質内のＴＤＰ－４３結合性タンパク質の存在は、結果として、変異ＴＤＰ－４３タンパク質の凝集の特異的な低下を生じる。
【0013】
Ｅ１． したがって、第１の態様において、Ｊタンパク質のＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む単離された融合タンパク質が本明細書で開示される。
Ｅ２． Ｊタンパク質のＪドメインが真核生物起源である、Ｅ１に記載の融合タンパク質。
Ｅ３． Ｊタンパク質のＪドメインがヒト起源である、Ｅ１～Ｅ２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ４． Ｊタンパク質のＪドメインが細胞質に局在する、Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ５． Ｊタンパク質のＪドメインが、配列番号１～５０からなる群から選択される、Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ６． Ｊドメインが、配列番号１、５、６、１０、１６、２４、２５、３１、および４９からなる群から選択される配列を含む、Ｅ１～Ｅ５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ７． Ｊドメインが配列番号５の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ８． Ｊドメインが配列番号１０の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ９． Ｊドメインが配列番号１６の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１０． Ｊドメインが配列番号２５の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１１． Ｊドメインが配列番号３１の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１２． ＴＤＰ－４３結合性ドメインが、例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定された場合、１μＭ以下、例えば、３００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下の、ＴＤＰ－４３（例えば、ＴＤＰ－４３のＣ末端の２０７アミノ酸を含むレポーター構築物を用いる）に対するＫＤを有する、Ｅ１～Ｅ１１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１３． ＴＤＰ－４３結合性ドメインが、配列番号５１～５５からなる群から選択される配列を含む、Ｅ１～Ｅ１２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１４． ＴＤＰ－４３結合性ドメインが、配列番号５１～５３の配列を含む、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１５． ＴＤＰ－４３結合性ドメインが配列番号５１の配列を含む、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１６． ＴＤＰ－４３結合性ドメインが配列番号５３の配列を含む、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１７． 複数のＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む、Ｅ１～Ｅ１６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１８． ２つのＴＤＰ－４３結合性ドメインからなる、Ｅ１～Ｅ１７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１９． ３つのＴＤＰ－４３結合性ドメインからなる、Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２０． 以下の構築物：
ａ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｂ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｃ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｄ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｅ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｆ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｇ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｈ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｉ． ＴＤＮＡＪ－Ｘ－ＴＴＴＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｊ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－ＴＴ、
ｋ． ＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＴＴＴＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｌ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｍ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｎ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｏ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｐ． ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｑ． Ｔ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、
ｒ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、および
ｓ． Ｔ－Ｘ－ＴＤｎａＪ－Ｘ－ＴＤｎａＪ－Ｘ－ＴＴＴＴ
のうちの１つを含み、
ここで、
ＴはＴＤＰ－４３結合性ドメインであり、
ＤＮＡＪはＪタンパク質のＪドメインであり、
Ｘは任意選択のリンカーである、Ｅ１～Ｅ１９のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２１． 配列番号５のＪドメイン配列および配列番号５１のＴＤＰ－４３結合性ドメイン配列を含む、Ｅ１～Ｅ２０のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２２． 配列番号５のＪドメイン配列、および配列番号５３のＴＤＰ－４３結合性ドメイン配列の２個のコピーを含む、Ｅ１～Ｅ２１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２３． 配列番号８０～８５、および８９～９７からなる群から選択される配列を含む、Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２４． 配列番号８０、８２～８５、８９～９０、および９２～９７からなる群から選択される配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２５． 配列番号８０の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２６． 配列番号９０の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２７． 配列番号９２の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２８． 配列番号９４の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２９． 配列番号９５の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３０． 配列番号９６の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３１． 標的化試薬をさらに含む、Ｅ１～Ｅ３０のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３２． エピトープをさらに含む、Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３３． エピトープが、配列番号６７～７３からなる群から選択されるポリペプチドである、Ｅ３２に記載の融合タンパク質。
Ｅ３４． 細胞透過剤をさらに含む、Ｅ１～Ｅ３３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３５． 細胞透過剤が、配列番号７４～７７からなる群から選択される、Ｅ３４に記載の融合タンパク質。
Ｅ３６． シグナル配列をさらに含む、Ｅ１～Ｅ３５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３７． シグナル配列が、配列番号９８～１００からなる群から選択されるペプチド配列を含む、Ｅ３６に記載の融合タンパク質。
Ｅ３８． 細胞においてＴＤＰ－４３タンパク質の凝集を低下させる能力がある、Ｅ１～Ｅ３７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３９． ＴＤＰ－４３媒介性細胞毒性を低下させる能力がある、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ４０． Ｅ１～Ｅ３９のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
Ｅ４１． 前記核酸がＤＮＡである、Ｅ４０に記載の核酸配列。
Ｅ４２． 前記核酸がＲＮＡである、Ｅ４０に記載の核酸配列。
Ｅ４３． 前記核酸が、少なくとも１個の修飾核酸を含む、Ｅ４０～Ｅ４２のいずれか１つに記載の核酸配列。
Ｅ４４． プロモーター領域、５’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）シグナルなどの３’ＵＴＲをさらに含む、Ｅ４０～Ｅ４３のいずれか１つに記載の核酸配列。
Ｅ４５． プロモーター領域が、ＣＭＶエンハンサー配列、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＮＳＥプロモーター、シナプシンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、およびＧＦＡＰプロモーターからなる群から選択される配列を含む、Ｅ４４に記載の核酸配列。
Ｅ４６． Ｅ４０～Ｅ４５のいずれか１つに記載の核酸配列を含むベクター。
Ｅ４７． アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアまたは粘液腫）、パラミクソウイルス（麻疹、ＲＳＶ、またはニューキャッスル病ウイルス）、バキュロウイルス、レオウイルス、アルファウイルス、およびフラビウイルスからなる群から選択される、Ｅ４６に記載のベクター。
Ｅ４８． ＡＡＶである、Ｅ４６またはＥ４７に記載のベクター。
Ｅ４９． カプシドおよびＥ４６～Ｅ４８のいずれか１つに記載のベクターを含む、ウイルス粒子。
Ｅ５０． カプシドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、偽型ＡＡＶ、アカゲザル由来ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、およびＡＡＶ－ＤＪａｎ ＡＡＶカプシド変異体、ＡＡＶハイブリッドセロタイプ、臓器向性ＡＡＶ、心臓向性ＡＡＶ、および心臓向性ＡＡＶＭ４１変異体からなる群から選択される、Ｅ４９に記載のウイルス粒子。
Ｅ５１． カプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択される、Ｅ４９またはＥ５０に記載のウイルス粒子。
Ｅ５２． カプシドがＡＡＶ２である、Ｅ４９～Ｅ５１のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５３． カプシドがＡＡＶ５である、Ｅ４９～Ｅ５１のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５４． カプシドがＡＡＶ８である、Ｅ４９～Ｅ５１のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５５． カプシドがＡＡＶ９である、Ｅ４９～Ｅ５１のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５６． カプシドがＡＡＶｒｈ１０である、Ｅ４９～Ｅ５１のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５７． Ｅ１～Ｅ３９のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３９に記載の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ４０～Ｅ４５のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４６～Ｅ４８のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４９～Ｅ５６のいずれか１つに記載のウイルス粒子からなる群から選択される作用物質、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物。
Ｅ５８． 細胞においてＴＤＰ－４３タンパク質の毒性を低下させる方法であって、Ｅ１～Ｅ３９のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３９の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ４０～Ｅ４５のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４６～Ｅ４８のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４９～Ｅ５６のいずれか１つに記載のウイルス粒子、およびＥ５７に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量と前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
Ｅ５９． 細胞が対象内にある、Ｅ５８に記載の方法。
Ｅ６０． 対象がヒトである、Ｅ５８～Ｅ５９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６１． 細胞が中枢神経系および末梢神経系の細胞である、Ｅ５８～Ｅ６０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６２． 対象が、ＴＤＰ－４３疾患を有すると同定されている、Ｅ５８～Ｅ６１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６３． ＴＤＰ－４３疾患が、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、レビー小体型認知症、および辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症からなる群から選択される、Ｅ６２に記載の方法。
Ｅ６４． ＴＤＰ－４３疾患がＡＬＳである、Ｅ６２またはＥ６３に記載の方法。
Ｅ６５． 対照細胞と比較した場合、細胞において凝集ＴＤＰ－４３タンパク質の量の低下がある、Ｅ５８～Ｅ６４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６６． ＴＤＰ－４３疾患の処置、防止、またはその進行の遅延を必要とする対象において、ＴＤＰ－４３疾患を処置する、防止する、またはその進行を遅延させる方法であって、Ｅ１～Ｅ３９のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３９の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ４０～Ｅ４５のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４６～Ｅ４８のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４９～Ｅ５６のいずれか１つに記載のウイルス粒子、およびＥ５７に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量を投与するステップを含む、方法。
Ｅ６７． ＴＤＰ－４３疾患が、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、レビー小体型認知症、および辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症からなる群から選択される、Ｅ６６に記載の方法。
Ｅ６８． ＴＤＰ－４３疾患がＡＬＳである、Ｅ６７に記載の方法。
Ｅ６９． 対象におけるＴＤＰ－４３疾患の防止またはその進行の遅延に有用な医薬の調製における、Ｅ１～Ｅ３９のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３９に記載の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ４０～Ｅ４５のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４６～Ｅ４８のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４９～Ｅ５６のいずれか１つに記載のウイルス粒子、およびＥ５７に記載の薬学的組成物の１つまたは複数の使用。
Ｅ７０． ＴＤＰ－４３疾患が、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、レビー小体型認知症、および辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症からなる群から選択される、Ｅ６９に記載の使用。
Ｅ７１． ＴＤＰ－４３疾患がＡＬＳである、Ｅ６９またはＥ７０に記載の使用。
Ｅ２． Ｊタンパク質のＪドメインが真核生物起源である、Ｅ１に記載の融合タンパク質。
Ｅ３． Ｊタンパク質のＪドメインがヒト起源である、Ｅ１～Ｅ２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ４． Ｊタンパク質のＪドメインが細胞質に局在する、Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ５． Ｊタンパク質のＪドメインが、配列番号１～５０からなる群から選択される、Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ６． Ｊドメインが、配列番号１、５、６、１０、１６、２４、２５、３１、および４９からなる群から選択される配列を含む、Ｅ１～Ｅ５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ７． Ｊドメインが配列番号５の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ８． Ｊドメインが配列番号１０の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ９． Ｊドメインが配列番号１６の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１０． Ｊドメインが配列番号２５の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１１． Ｊドメインが配列番号３１の配列を含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１２． ＴＤＰ－４３結合性ドメインが、例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定された場合、１μＭ以下、例えば、３００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下の、ＴＤＰ－４３（例えば、ＴＤＰ－４３のＣ末端の２０７アミノ酸を含むレポーター構築物を用いる）に対するＫＤを有する、Ｅ１～Ｅ１１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１３． ＴＤＰ－４３結合性ドメインが、配列番号５１～５５からなる群から選択される配列を含む、Ｅ１～Ｅ１２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１４． ＴＤＰ－４３結合性ドメインが、配列番号５１～５３の配列を含む、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１５． ＴＤＰ－４３結合性ドメインが配列番号５１の配列を含む、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１６． ＴＤＰ－４３結合性ドメインが配列番号５３の配列を含む、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１７． 複数のＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む、Ｅ１～Ｅ１６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１８． ２つのＴＤＰ－４３結合性ドメインからなる、Ｅ１～Ｅ１７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ１９． ３つのＴＤＰ－４３結合性ドメインからなる、Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２０． 以下の構築物：
ａ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｂ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｃ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｄ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｅ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｆ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｇ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｈ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｉ． ＴＤＮＡＪ－Ｘ－ＴＴＴＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｊ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－ＴＴ、
ｋ． ＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＴＴＴＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｌ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｍ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｎ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｏ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｐ． ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｑ． Ｔ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、
ｒ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、および
ｓ． Ｔ－Ｘ－ＴＤｎａＪ－Ｘ－ＴＤｎａＪ－Ｘ－ＴＴＴＴ
のうちの１つを含み、
ここで、
ＴはＴＤＰ－４３結合性ドメインであり、
ＤＮＡＪはＪタンパク質のＪドメインであり、
Ｘは任意選択のリンカーである、Ｅ１～Ｅ１９のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２１． 配列番号５のＪドメイン配列および配列番号５１のＴＤＰ－４３結合性ドメイン配列を含む、Ｅ１～Ｅ２０のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２２． 配列番号５のＪドメイン配列、および配列番号５３のＴＤＰ－４３結合性ドメイン配列の２個のコピーを含む、Ｅ１～Ｅ２１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２３． 配列番号８０～８５、および８９～９７からなる群から選択される配列を含む、Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２４． 配列番号８０、８２～８５、８９～９０、および９２～９７からなる群から選択される配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２５． 配列番号８０の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２６． 配列番号９０の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２７． 配列番号９２の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２８． 配列番号９４の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ２９． 配列番号９５の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３０． 配列番号９６の配列を含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３１． 標的化試薬をさらに含む、Ｅ１～Ｅ３０のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３２． エピトープをさらに含む、Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３３． エピトープが、配列番号６７～７３からなる群から選択されるポリペプチドである、Ｅ３２に記載の融合タンパク質。
Ｅ３４． 細胞透過剤をさらに含む、Ｅ１～Ｅ３３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３５． 細胞透過剤が、配列番号７４～７７からなる群から選択される、Ｅ３４に記載の融合タンパク質。
Ｅ３６． シグナル配列をさらに含む、Ｅ１～Ｅ３５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３７． シグナル配列が、配列番号９８～１００からなる群から選択されるペプチド配列を含む、Ｅ３６に記載の融合タンパク質。
Ｅ３８． 細胞においてＴＤＰ－４３タンパク質の凝集を低下させる能力がある、Ｅ１～Ｅ３７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ３９． ＴＤＰ－４３媒介性細胞毒性を低下させる能力がある、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
Ｅ４０． Ｅ１～Ｅ３９のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
Ｅ４１． 前記核酸がＤＮＡである、Ｅ４０に記載の核酸配列。
Ｅ４２． 前記核酸がＲＮＡである、Ｅ４０に記載の核酸配列。
Ｅ４３． 前記核酸が、少なくとも１個の修飾核酸を含む、Ｅ４０～Ｅ４２のいずれか１つに記載の核酸配列。
Ｅ４４． プロモーター領域、５’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）シグナルなどの３’ＵＴＲをさらに含む、Ｅ４０～Ｅ４３のいずれか１つに記載の核酸配列。
Ｅ４５． プロモーター領域が、ＣＭＶエンハンサー配列、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＮＳＥプロモーター、シナプシンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、およびＧＦＡＰプロモーターからなる群から選択される配列を含む、Ｅ４４に記載の核酸配列。
Ｅ４６． Ｅ４０～Ｅ４５のいずれか１つに記載の核酸配列を含むベクター。
Ｅ４７． アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアまたは粘液腫）、パラミクソウイルス（麻疹、ＲＳＶ、またはニューキャッスル病ウイルス）、バキュロウイルス、レオウイルス、アルファウイルス、およびフラビウイルスからなる群から選択される、Ｅ４６に記載のベクター。
Ｅ４８． ＡＡＶである、Ｅ４６またはＥ４７に記載のベクター。
Ｅ４９． カプシドおよびＥ４６～Ｅ４８のいずれか１つに記載のベクターを含む、ウイルス粒子。
Ｅ５０． カプシドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、偽型ＡＡＶ、アカゲザル由来ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、およびＡＡＶ－ＤＪａｎ ＡＡＶカプシド変異体、ＡＡＶハイブリッドセロタイプ、臓器向性ＡＡＶ、心臓向性ＡＡＶ、および心臓向性ＡＡＶＭ４１変異体からなる群から選択される、Ｅ４９に記載のウイルス粒子。
Ｅ５１． カプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択される、Ｅ４９またはＥ５０に記載のウイルス粒子。
Ｅ５２． カプシドがＡＡＶ２である、Ｅ４９～Ｅ５１のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５３． カプシドがＡＡＶ５である、Ｅ４９～Ｅ５１のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５４． カプシドがＡＡＶ８である、Ｅ４９～Ｅ５１のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５５． カプシドがＡＡＶ９である、Ｅ４９～Ｅ５１のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５６． カプシドがＡＡＶｒｈ１０である、Ｅ４９～Ｅ５１のいずれか１つに記載のウイルス粒子。
Ｅ５７． Ｅ１～Ｅ３９のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３９に記載の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ４０～Ｅ４５のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４６～Ｅ４８のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４９～Ｅ５６のいずれか１つに記載のウイルス粒子からなる群から選択される作用物質、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物。
Ｅ５８． 細胞においてＴＤＰ－４３タンパク質の毒性を低下させる方法であって、Ｅ１～Ｅ３９のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３９の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ４０～Ｅ４５のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４６～Ｅ４８のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４９～Ｅ５６のいずれか１つに記載のウイルス粒子、およびＥ５７に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量と前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
Ｅ５９． 細胞が対象内にある、Ｅ５８に記載の方法。
Ｅ６０． 対象がヒトである、Ｅ５８～Ｅ５９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６１． 細胞が中枢神経系および末梢神経系の細胞である、Ｅ５８～Ｅ６０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６２． 対象が、ＴＤＰ－４３疾患を有すると同定されている、Ｅ５８～Ｅ６１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６３． ＴＤＰ－４３疾患が、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、レビー小体型認知症、および辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症からなる群から選択される、Ｅ６２に記載の方法。
Ｅ６４． ＴＤＰ－４３疾患がＡＬＳである、Ｅ６２またはＥ６３に記載の方法。
Ｅ６５． 対照細胞と比較した場合、細胞において凝集ＴＤＰ－４３タンパク質の量の低下がある、Ｅ５８～Ｅ６４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６６． ＴＤＰ－４３疾患の処置、防止、またはその進行の遅延を必要とする対象において、ＴＤＰ－４３疾患を処置する、防止する、またはその進行を遅延させる方法であって、Ｅ１～Ｅ３９のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３９の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ４０～Ｅ４５のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４６～Ｅ４８のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４９～Ｅ５６のいずれか１つに記載のウイルス粒子、およびＥ５７に記載の薬学的組成物からなる群から選択される１つまたは複数の作用物質の有効量を投与するステップを含む、方法。
Ｅ６７． ＴＤＰ－４３疾患が、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、レビー小体型認知症、および辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症からなる群から選択される、Ｅ６６に記載の方法。
Ｅ６８． ＴＤＰ－４３疾患がＡＬＳである、Ｅ６７に記載の方法。
Ｅ６９． 対象におけるＴＤＰ－４３疾患の防止またはその進行の遅延に有用な医薬の調製における、Ｅ１～Ｅ３９のいずれか１つに記載の融合タンパク質、Ｅ１～Ｅ３９に記載の融合タンパク質を発現する細胞、Ｅ４０～Ｅ４５のいずれか１つに記載の核酸、Ｅ４６～Ｅ４８のいずれか１つに記載のベクター、Ｅ４９～Ｅ５６のいずれか１つに記載のウイルス粒子、およびＥ５７に記載の薬学的組成物の１つまたは複数の使用。
Ｅ７０． ＴＤＰ－４３疾患が、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、レビー小体型認知症、および辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症からなる群から選択される、Ｅ６９に記載の使用。
Ｅ７１． ＴＤＰ－４３疾患がＡＬＳである、Ｅ６９またはＥ７０に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1A-1】代表的なヒトＪドメイン配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ配列アラインメントを示す図である。高度に保存されたＨＰＤドメインは、強調表示された四角形内に示されている。
【図1A-2】代表的なヒトＪドメイン配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ配列アラインメントを示す図である。高度に保存されたＨＰＤドメインは、強調表示された四角形内に示されている。
【図1B-1】代表的なヒトＪドメイン配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ配列アラインメントを示す図である。
【図1B-2】代表的なヒトＪドメイン配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ配列アラインメントを示す図である。
【図2-1】ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含むいくつかの実例的な融合タンパク質構築物を示す図である。
【図2-2】ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含むいくつかの実例的な融合タンパク質構築物を示す図である。
【図3】蛍光顕微鏡法により測定された場合の細胞におけるＴＤＰ４３－ＧＦＰ融合構築物の凝集の可視化、および前記凝集を低下させることにおけるＪドメイン融合タンパク質の効果を示す図である。完全長ＴＤＰ－４３（ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬ；パネル１～４）かまたはＴＤＰ－４３のＣ末端断片（ＧＦＰ－ＴＤＰＣＴＦ；パネル５～８）のいずれかを含有するＧＦＰレポーター構築物をトランスフェクトされ、さらに、ｓｃＦｖ対照（パネル２および６）、ＤｎａＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ）融合タンパク質（パネル３および７）、および保存ＨＰＤドメイン内にＰ３３Ｑ変異を含有するＤｎａＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ）融合タンパク質（パネル４および８）を含有する細胞の蛍光顕微鏡観察を、前記レポーター構築物をのみトランスフェクトされた細胞（パネル１および５）と比較した。
【図5】融合タンパク質構築物ありまたはなしでの、ＧＦＰレポーター構築物を発現する細胞の抽出物のイムノブロット分析を示す図である。上方パネルは、大きい方のＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬ（レーン１～４）および小さい方ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦ（レーン５～８）を検出する、抗ＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロット分析である。下方パネルは、ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ）対照（レーン２および６）、融合タンパク質構築物（ＤｎａＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ）、レーン３および７）、および保存ＨＰＤドメイン内にＰ３３Ｑ変異を含有するＤｎａＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ）融合タンパク質（パネル４および８）を検出する、抗ＦＬＡＧエピトープ抗体を用いたウェスタンブロット分析である。
【図6】ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬかまたはＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦのいずれかのレポーター構築物を発現し、かつまた、それ以外何も発現せず（陰性対照）、または構築物２もしくは３を発現する細胞の抽出物由来の可溶性または不溶性画分からのＧＦＰレポーター構築物のイムノブロット検出を示す図である。
【図7】蛍光顕微鏡法により測定された場合の細胞におけるＴＤＰ４３－ＧＦＰ融合構築物の凝集の可視化、および前記凝集を低下させることにおけるＪドメイン融合タンパク質の効果を示す図である。完全長ＴＤＰ－４３（ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬ）かまたはＴＤＰ－４３のＣ末端断片（ＧＦＰ－ＴＤＰＣＴＦ）のいずれかを含有するＧＦＰレポーター構築物をトランスフェクトされ、かつさらに、構築物２、３、５、６、および７を含有する細胞の蛍光顕微鏡観察を、レポーター単独を発現する対照（なし）と比較した。
【図8】蛍光顕微鏡法により測定された場合の細胞におけるＴＤＰ４３－ＧＦＰ融合構築物の凝集の可視化、および前記凝集を低下させることにおけるＪドメイン融合タンパク質の効果を示す図である。完全長ＴＤＰ－４３（ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬ）かまたはＴＤＰ－４３のＣ末端断片（ＧＦＰ－ＴＤＰＣＴＦ）のいずれかを含有する、ＧＦＰレポーター構築物をトランスフェクトされ、かつさらに、構築物１、２、３、４、９、１０、１１、または１４を含有する細胞の蛍光顕微鏡観察を、レポーター単独を発現する対照（なし）と比較した。
【図9A】ＴＤＰ－４３レポーター構築物の定量化および検出を示す図である。図９Ａは、図８に示された実験からの細胞における凝集の定量的差を示す。図９Ｂは、細胞抽出物においてレポーター構築物レベルを定量化する、抗ＧＦＰ抗体を用いた細胞抽出物のイムノブロット分析を示す。
【図9B】ＴＤＰ－４３レポーター構築物の定量化および検出を示す図である。図９Ａは、図８に示された実験からの細胞における凝集の定量的差を示す。図９Ｂは、細胞抽出物においてレポーター構築物レベルを定量化する、抗ＧＦＰ抗体を用いた細胞抽出物のイムノブロット分析を示す。
【図10-1】バフィロマイシンＡ１（ＢＦＡ）（オートファジーの遅延相の強力な阻害剤）またはＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）の、構築物３を同時発現する細胞においてＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦの低下への効果を示す図である。細胞を、レポーター構築物ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬ（レーン２）かまたはＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦ（レーン３～８）のいずれかをトランスフェクトし、かつ構築物３をコードする核酸を同時トランスフェクトした（レーン４～８）。いずれかのＢＦＡ（０．０１μＭにおいて、レーン５、および０．１μＭにおいて、レーン６）での細胞の処理は、イムノブロットにより検出された場合、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦレポーター構築物のより高いレベルを生じた。対照的に、０．１μＭまたは１．０μＭのＭＧ１３２（それぞれ、レーン７および８）での処理は、全くかほとんど効果を生じなかった。
【図10-2】バフィロマイシンＡ１（ＢＦＡ）（オートファジーの遅延相の強力な阻害剤）またはＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）の、構築物３を同時発現する細胞においてＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦの低下への効果を示す図である。細胞を、レポーター構築物ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬ（レーン２）かまたはＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦ（レーン３～８）のいずれかをトランスフェクトし、かつ構築物３をコードする核酸を同時トランスフェクトした（レーン４～８）。いずれかのＢＦＡ（０．０１μＭにおいて、レーン５、および０．１μＭにおいて、レーン６）での細胞の処理は、イムノブロットにより検出された場合、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦレポーター構築物のより高いレベルを生じた。対照的に、０．１μＭまたは１．０μＭのＭＧ１３２（それぞれ、レーン７および８）での処理は、全くかほとんど効果を生じなかった。
【図11A】抗ＴＤＰ４３抗体（図１１Ａ）および抗ホスホＴＤＰ４３抗体（図１１Ｂ）で探索した場合の、細胞抽出物の可溶性（非凝集型）および不溶性（凝集型）画分におけるＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦレポーターのレベルへの、構築物３を同時発現すること（レーン４および８）の効果を示す図である。
【図11B】抗ＴＤＰ４３抗体（図１１Ａ）および抗ホスホＴＤＰ４３抗体（図１１Ｂ）で探索した場合の、細胞抽出物の可溶性（非凝集型）および不溶性（凝集型）画分におけるＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦレポーターのレベルへの、構築物３を同時発現すること（レーン４および８）の効果を示す図である。
【図12】抗ホスホＴＤＰ４３抗体で探索した場合の、細胞抽出物におけるリン酸化ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦレポーターのレベルを低下させることにおける構築物３（レーン３）、構築物７（レーン４）、構築物２（レーン５）、構築物１５（レーン６）、および構築物１６（レーン７）の同時発現の効果を示す図である。
【図13】ＴＤＰ４３ＦＬ（レーン２、３、７、および８）およびＴＤＰ４３ΔＮＬＳ構築物（レーン４、５、９、および１０）のいずれかを発現する細胞において構築物３を同時発現すること（レーン３、５、８、および１０）の、ＴＤＰ－４３（抗ＴＤＰ４３抗体で探索した場合、上端パネル）、リン酸化ＴＤＰ－４３（抗ホスホＴＤＰ－４３抗体で探索した場合、２番目のパネル）、Ｆｌａｇエピトープ（抗ＦＬＡＧ抗体で探索した場合、３番目のパネル）、およびチューブリン（抗チューブリン抗体、下端パネル）のレベルへの効果を示す図である。
【図14】リン酸化ＴＤＰ－４３を低下させる能力について試験された追加の構築物を示す図である。ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬ（レーン１および７）かまたはＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦ（レーン２～６、８～１２）のいずれかを発現する細胞に、構築物３（レーン３および９）、構築物１７（レーン４および１０）、構築物１８（レーン５および１１）、および構築物１９（レーン６および１２）を同時トランスフェクトした。可溶性画分（レーン１～６）および不溶性画分（レーン７～１２）を、抗ホスホＴＤＰ４３抗体で探索した。
【図15A】くも膜下腔内（ＩＴ）かまたは脳室内（ＩＣＶ）かのいずれかの注射により投与される、対照かまたは構築物３をコードするベクターかのいずれかを含有するＡＡＶ ｒｈ１０を注射されたＣ５７マウスの結果の要約を示す図である。図１５Ａは、研究スケジュールを要約する。図１５Ｂは、対照（レーン１および２）または構築物３を含有するベクター（レーン３および４）を含有するＡＡＶ ｒｈ１０のＩＴ投与から３週間後のマウスからの大脳抽出物のイムノブロットを示す。図１５Ｃは、ＩＣＶ注射後のマウスからの大脳抽出物のイムノブロットを示す。レーン１～３は、対照（レーン１および２）または構築物３を含有するベクター（レーン３）を含有するＡＡＶ ｒｈ１０のＩＣＶ投与から３週間後のマウスからの大脳抽出物のイムノブロットを示す。レーン４～８は、対照（レーン４～６）および構築物３（レーン７および８）マウスからの８週間目のマウスのイムノブロットを示す。
【図15B】くも膜下腔内（ＩＴ）かまたは脳室内（ＩＣＶ）かのいずれかの注射により投与される、対照かまたは構築物３をコードするベクターかのいずれかを含有するＡＡＶ ｒｈ１０を注射されたＣ５７マウスの結果の要約を示す図である。図１５Ａは、研究スケジュールを要約する。図１５Ｂは、対照（レーン１および２）または構築物３を含有するベクター（レーン３および４）を含有するＡＡＶ ｒｈ１０のＩＴ投与から３週間後のマウスからの大脳抽出物のイムノブロットを示す。図１５Ｃは、ＩＣＶ注射後のマウスからの大脳抽出物のイムノブロットを示す。レーン１～３は、対照（レーン１および２）または構築物３を含有するベクター（レーン３）を含有するＡＡＶ ｒｈ１０のＩＣＶ投与から３週間後のマウスからの大脳抽出物のイムノブロットを示す。レーン４～８は、対照（レーン４～６）および構築物３（レーン７および８）マウスからの８週間目のマウスのイムノブロットを示す。
【図15C】くも膜下腔内（ＩＴ）かまたは脳室内（ＩＣＶ）かのいずれかの注射により投与される、対照かまたは構築物３をコードするベクターかのいずれかを含有するＡＡＶ ｒｈ１０を注射されたＣ５７マウスの結果の要約を示す図である。図１５Ａは、研究スケジュールを要約する。図１５Ｂは、対照（レーン１および２）または構築物３を含有するベクター（レーン３および４）を含有するＡＡＶ ｒｈ１０のＩＴ投与から３週間後のマウスからの大脳抽出物のイムノブロットを示す。図１５Ｃは、ＩＣＶ注射後のマウスからの大脳抽出物のイムノブロットを示す。レーン１～３は、対照（レーン１および２）または構築物３を含有するベクター（レーン３）を含有するＡＡＶ ｒｈ１０のＩＣＶ投与から３週間後のマウスからの大脳抽出物のイムノブロットを示す。レーン４～８は、対照（レーン４～６）および構築物３（レーン７および８）マウスからの８週間目のマウスのイムノブロットを示す。
【図16A】ＩＣＶ注射により投与される、対照かまたは構築物３をコードするベクターかのいずれかを含有するＡＡＶ ｒｈ１０を注射されたΔＮＬＳ８マウスを用いた結果の要約を示す図である。図１６Ａは、研究スケジュールを示す。図１６Ｂは、各群からの雄の平均体重を示す。図１６Ｃは、異なる群からのマウスの生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
定義
本明細書および特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に指図しない限り、複数の指示物を含む。例えば、用語「１つの細胞」は、その混合物を含む、複数の細胞を含む。
本明細書および特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に指図しない限り、複数の指示物を含む。例えば、用語「１つの細胞」は、その混合物を含む、複数の細胞を含む。
【0016】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すのに本明細書で交換可能に用いられる。ポリマーは直鎖状または分岐状であり得、それは修飾アミノ酸を含んでもよく、それは非アミノ酸により中断されてもよい。それらの用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識コンポーネントとのコンジュゲーションなどの任意の他の操作により、修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。
【0017】
本明細書で用いられる場合、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然もしくは合成のアミノ酸のいずれかを指し、それには、Ｄ型またはＬ型の両方の光学異性体、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体が挙げられるが、それらに限定されない。標準一文字または三文字コードが、アミノ酸を名付けるために用いられる。
【0018】
「宿主細胞」は、対象ベクターについてのレシピエントであり得、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含む。その子孫は、自然の、偶発的な、または計画的な変異によって、最初の親細胞と必ずしも完全に同一（形態において、または全ＤＮＡ相補体のゲノムにおいて）というわけではない。宿主細胞は、インビボでこの発明のベクターでトランスフェクトされた細胞を含む。
【0019】
本明細書で開示された様々なポリペプチドを記載するために用いられる場合の「単離された」は、その天然の環境のコンポーネントから識別および分離されており、ならびに／または回収されているポリペプチドを意味する。その天然の環境の夾雑コンポーネントは、典型的には、本ポリペプチドについての診断的または治療的使用に干渉する材料であり、それには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられ得る。当業者には明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、その天然に存在する対応物からそれを区別するために「単離」を必要としない。加えて、「濃縮された」、「分離された」、または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、体積あたりの分子の濃度または数が、その天然に存在する対応物のそれより一般的に大きい点で、その天然に存在する対応物から区別可能である。一般的に、組換え手段により生成され、かつ宿主細胞において発現したポリペプチドは、「単離」されていると見なされる。
【0020】
「単離された」ポリヌクレオチド、またはポリペプチドをコードする核酸、または他のポリペプチドをコードする核酸は、それが、そのポリペプチドをコードする核酸の天然源において通常付随している少なくとも１つの夾雑核酸分子から識別および分離されている核酸分子である。単離された、ポリペプチドをコードする核酸分子は、それが天然で見出される形または設定以外をとる。したがって、単離された、ポリペプチドをコードする核酸分子は、それが天然の細胞において存在する場合のその特定のポリペプチドをコードする核酸分子から区別される。しかしながら、単離された、ポリペプチドをコードする核酸分子には、そのポリペプチドを通常発現する細胞に含有される、ポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられ、ここで、例えば、その核酸分子は、天然細胞の位置とは異なる、染色体または染色体外の位置にある。
【0021】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は交換可能に用いられる。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を実施し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、そのポリマーのアセンブリの前または後に、ヌクレオチド構造への修飾が与えられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチドコンポーネントによって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識コンポーネントとのコンジュゲーションなど、ポリマー化後にさらに修飾され得る。
【0022】
本明細書で定義される場合、用語「ＴＤＰ－４３障害」または「ＴＤＰ－４３媒介性疾患」は、細胞内ＴＤＰ－４３凝集物、特に、ＴＤＰ－４３変異タンパク質の凝集物の形成に関連した障害を指す。ＴＤＰ－４３障害の例には、好ましくは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、レビー小体型認知症、および辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症が挙げられるが、それらに限定されない。
【0023】
「ベクター」は、好ましくは適切な宿主において自己複製する、核酸分子であり、それは、挿入された核酸分子を宿主細胞の中へおよび／または宿主細胞間で転移させる。その用語は、主にＤＮＡまたはＲＮＡの細胞への挿入のために機能するベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために機能する複製ベクター、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また、上記の機能の１つより多くを提供するベクターも含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞の中へ導入された場合、転写され、かつポリペプチドへ翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、所望の発現産物を生じるように機能することができる発現ベクターで構成された適切な宿主細胞を含意する。
【0024】
用語「作動可能に連結された」は、記載されたコンポーネントの並置であって、そこで、それらのコンポーネントが、それらの意図された様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、並置を指す。コード配列と「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合した条件下で達成されるように、ライゲーションされている。「作動可能に連結された」配列には、目的の遺伝子と近接する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するようにトランスでまたはある距離を置いて作用する発現制御配列の両方が挙げられ得る。用語「発現制御配列」は、それらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングに作用するのに必要であるポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；スプライシングなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナルおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに、必要に応じて、タンパク質分泌を増強する配列が挙げられる。そのような制御配列の性質は、宿主生物体によって異なる；原核生物において、そのような制御配列には、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が挙げられる；真核生物において、一般的に、そのような制御配列には、プロモーターおよび転写終結配列が挙げられる。用語「制御配列」は、その存在が発現およびプロセシングに必須であるコンポーネントを含むことが意図され、その存在が有利である追加のコンポーネント、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。他に言及がない限り、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を発現ベクターへ挿入することの本明細書での記載または言及は、その挿入される核酸もまた、その挿入される核酸分子を含有する発現ベクターが適合性宿主細胞または生物体の適合性細胞へ導入される場合、コードされた融合タンパク質の発現に必要とされる、機能性プロモーターならびに他の転写および翻訳制御エレメントとベクター内で作動可能に連結されていることを意味する。
【0025】
ポリヌクレオチドに適用される場合の「組換え型の」は、そのポリヌクレオチドが、宿主細胞において潜在的に発現し得る構築物を生じる、インビトロクローニング、制限および／またはライゲーションのステップ、ならびに他の手順の様々な組合せの産物であることを意味する。
【0026】
用語「遺伝子」および「遺伝子断片」は、本明細書で交換可能に用いられる。それらは、転写および翻訳された後、特定のタンパク質をコードする能力がある少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子断片は、そのポリヌクレオチドが少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有する限り、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得、それは、コード領域全体またはそのセグメントを網羅し得る。「融合遺伝子」は、一緒に連結されている少なくとも２つの異種性ポリヌクレオチドで構成される遺伝子である。
【0027】
用語「疾患」および「障害」は、当技術分野において容認可能な医療水準および行為により同定された病的状態を示すように、交換可能に用いられる。
【0028】
本明細書で用いられる場合、用語「有効量」は、疾患またはその１つもしくは複数の症状の重症度および／または期間を低下させまたは改善する；有害なまたは病的な状態の進展を防止する；病的状態の退行を引き起こす；病的状態に関連した１つまたは複数の症状の再発、発達、発生、または進行を防止する；障害を検出する；あるいは、治療（例えば、別の予防または治療剤の投与）の予防的または治療的効果を増強しまたは向上させるのに十分である治療の量を指す。
【0029】
本明細書で用いられる場合、用語「Ｊドメイン」は、Ｈｓｐ７０およびその同族の内因性ＡＴＰアーゼ触媒活性を加速する能力を保持する断片を指す。様々なＪタンパク質のＪドメインが決定されており（例えば、Ｋａｍｐｉｎｇａら （２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．、１１：５７９～５９２；Ｈｅｎｎｅｓｓｙら （２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４：１６９７～１７０９参照（それぞれは、全体として参照により組み入れられている））、以下のいくつかのホールマークによって特徴づけられる：４つのαヘリックス（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）、および通常、ヘリックスＩＩとＩＩＩの間に高度に保存された、ヒスチジン、プロリン、およびアスパラギン酸のトリペプチド配列モチーフ（「ＨＰＤモチーフ」と呼ばれる）を有することにより特徴づけられる。典型的には、Ｊタンパク質のＪドメインは、５０アミノ酸長から７０アミノ酸長の間であり、Ｈｓｐ７０－ＡＴＰシャペロンタンパク質とのＪドメインの相互作用（結合）の部位は、ヘリックスＩＩ内から伸びる領域であると考えられており、ＨＰＤモチーフは、Ｈｓｐ７０ ＡＴＰアーゼ活性の刺激に必要である。本明細書で用いられる場合、用語「Ｊドメイン」は、Ｈｓｐ７０の内因性ＡＴＰアーゼ活性を加速する能力を保持する、天然のＪドメイン配列およびその機能性バリアントを含むことを意図され、その能力は、当技術分野においてよく知られた方法を用いて測定することができる（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、Ｈｏｒｎｅら （２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８５、２１６７９～２１６８８参照）。ヒトＪドメインの非限定的リストは、表１に提供されている。
【0030】
詳細な説明
本発明者らは、Ｊタンパク質のＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む融合タンパク質構築物と、細胞をある程度、接触させることが、変異ＴＤＰ－４３タンパク質の凝集を低下させる予想外の効果を生じることを見出している。変異ＴＤＰ－４３の凝集は、いくつかの壊滅的な疾患を引き起こすと考えられており、その疾患には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、およびアルツハイマー病が挙げられるが、それらに限定されない。したがって、ＴＤＰ－４３障害を処置するための、例えばそれを必要とする対象においての、有用な組成物および方法が本明細書に提供される。
本発明者らは、Ｊタンパク質のＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む融合タンパク質構築物と、細胞をある程度、接触させることが、変異ＴＤＰ－４３タンパク質の凝集を低下させる予想外の効果を生じることを見出している。変異ＴＤＰ－４３の凝集は、いくつかの壊滅的な疾患を引き起こすと考えられており、その疾患には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、およびアルツハイマー病が挙げられるが、それらに限定されない。したがって、ＴＤＰ－４３障害を処置するための、例えばそれを必要とする対象においての、有用な組成物および方法が本明細書に提供される。
【0031】
シャペロンに基づいた治療に関連した問題を克服するために、本発明者らは、高い特異性を有する人工シャペロンタンパク質をデザインすることが可能であるかどうかを調べた。本発明者らは、Ｈｓｐ７０結合／活性化のためのエフェクタードメイン（Ｊドメイン配列）、およびＴＤＰ－４３タンパク質に対する特異性を与えるドメインを含む一連の融合タンパク質構築物をデザインした。生じた融合タンパク質は、Ｈｓｐ７０およびその同族の内因性ＡＴＰアーゼ触媒活性を加速するように作用し、その結果として、タンパク質フォールディングの増加、凝集の低下、および／またはクリアランスの加速を生じる。
【0032】
Ｉ． 融合タンパク質構築物
ａ． 本発明における有用なＪドメイン
様々なＪタンパク質のＪドメインが決定されている。例えば、Ｋａｍｐｉｎｇａら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．、１１：５７９～５９２（２０１０）；Ｈｅｎｎｅｓｓｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４：１６９７～１７０９（２００５）参照。本発明の融合タンパク質を調製することにおいて有用なＪドメインは、主にＨｓｐ７０ ＡＴＰアーゼ活性を加速するＪドメインの特徴を定義する鍵を握る。したがって、本発明において有用な単離されたＪドメインは、４つのαヘリックス（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）、および通常、ヘリックスＩＩとＩＩＩの間に高度に保存された、ヒスチジン、プロリン、およびアスパラギン酸のトリペプチド配列（「ＨＰＤモチーフ」と呼ばれる）を有することにより特徴づけられる、ポリペプチドドメインを含む。典型的には、Ｊタンパク質のＪドメインは、５０アミノ酸長から７０アミノ酸長の間であり、Ｈｓｐ７０－ＡＴＰシャペロンタンパク質とのＪドメインの相互作用（結合）の部位は、ヘリックスＩＩ内から伸びる領域であると考えられており、ＨＰＤモチーフは、原始的な活性の基礎をなす。代表的なＪドメインには、ＤｎａＪＢ１、ＤｎａＪＢ２、ＤｎａＪＢ６、ＤｎａＪＣ６のＪドメイン、ＳＶ４０のラージＴ抗原のＪドメイン、および哺乳動物のシステインストリングタンパク質（ＣＳＰ－α）のＪドメインが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の融合タンパク質に用いられ得るこれらを始めとするＪドメインについてのアミノ酸配列は、表１に提供されている。保存ＨＰＤモチーフは、太字で強調されている。一実施形態において、本明細書に開示された融合タンパク質は、配列番号１～５０からなる群から選択されるＪドメインを含む。下記の実施例セクションに示されているように、本発明者らは、保存「ＨＰＤ」モチーフを欠損するＪドメインの使用が、タンパク質凝集を低下させる能力がないことを発見している。したがって、別の実施形態において、本明細書に開示された融合タンパク質は、コンセンサスＨＰＤモチーフを含むＪドメインを含む。一つの特定の実施形態において、配列番号１～１５、１７～５０からなる群から選択される。
ａ． 本発明における有用なＪドメイン
様々なＪタンパク質のＪドメインが決定されている。例えば、Ｋａｍｐｉｎｇａら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．、１１：５７９～５９２（２０１０）；Ｈｅｎｎｅｓｓｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４：１６９７～１７０９（２００５）参照。本発明の融合タンパク質を調製することにおいて有用なＪドメインは、主にＨｓｐ７０ ＡＴＰアーゼ活性を加速するＪドメインの特徴を定義する鍵を握る。したがって、本発明において有用な単離されたＪドメインは、４つのαヘリックス（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）、および通常、ヘリックスＩＩとＩＩＩの間に高度に保存された、ヒスチジン、プロリン、およびアスパラギン酸のトリペプチド配列（「ＨＰＤモチーフ」と呼ばれる）を有することにより特徴づけられる、ポリペプチドドメインを含む。典型的には、Ｊタンパク質のＪドメインは、５０アミノ酸長から７０アミノ酸長の間であり、Ｈｓｐ７０－ＡＴＰシャペロンタンパク質とのＪドメインの相互作用（結合）の部位は、ヘリックスＩＩ内から伸びる領域であると考えられており、ＨＰＤモチーフは、原始的な活性の基礎をなす。代表的なＪドメインには、ＤｎａＪＢ１、ＤｎａＪＢ２、ＤｎａＪＢ６、ＤｎａＪＣ６のＪドメイン、ＳＶ４０のラージＴ抗原のＪドメイン、および哺乳動物のシステインストリングタンパク質（ＣＳＰ－α）のＪドメインが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の融合タンパク質に用いられ得るこれらを始めとするＪドメインについてのアミノ酸配列は、表１に提供されている。保存ＨＰＤモチーフは、太字で強調されている。一実施形態において、本明細書に開示された融合タンパク質は、配列番号１～５０からなる群から選択されるＪドメインを含む。下記の実施例セクションに示されているように、本発明者らは、保存「ＨＰＤ」モチーフを欠損するＪドメインの使用が、タンパク質凝集を低下させる能力がないことを発見している。したがって、別の実施形態において、本明細書に開示された融合タンパク質は、コンセンサスＨＰＤモチーフを含むＪドメインを含む。一つの特定の実施形態において、配列番号１～１５、１７～５０からなる群から選択される。
【0033】
特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１、５、６、１０、１６、２４、２５、３１、および４９からなる群から選択されるＪドメインを含む。
【0034】
【表1-1】
【0035】
【表1-2】
【0036】
【表1-3】
【0037】
ｂ. ＴＤＰ－４３結合性ドメイン
融合タンパク質はまた、少なくとも１つのＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む。ＴＤＰ－４３結合性ドメインは、融合タンパク質を形成するようにＪドメインと連結された一本鎖ポリペプチドまたは多量体ポリペプチドであり得る。
融合タンパク質はまた、少なくとも１つのＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む。ＴＤＰ－４３結合性ドメインは、融合タンパク質を形成するようにＪドメインと連結された一本鎖ポリペプチドまたは多量体ポリペプチドであり得る。
【0038】
ＴＤＰ－４３結合性ドメインが、細胞内において病的レベルで存在する時のＴＤＰ－４３タンパク質を結合することができるような十分な親和性を有することは理想である。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、９６ウェルマイクロタイタープレート上でのＥＬＩＳＡにより試験された場合、例えば、２μＭ以下、１μＭ以下、５００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、３０ｎＭ以下の、ＴＤＰ－４３レポーター構築物（例えば、完全長ＴＤＰ－４３（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢＰ２－２２８５０、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ、ＣＯ））に対するＫＤを有するＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む。
【0039】
ＴＤＰ－４３結合性ドメインは、以前に同定され、かつ特徴づけられている（例えば、米国特許第１０，２５９，８６６号、ＷＯ２０１６／５３６１０、ＷＯ２０１８／２１８２５２、ＷＯ２０１９／１３４９８１、ＷＯ２０１９／１７７１３８（それぞれ、参照により本明細書に組み入れられている）参照）。したがって、別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５１～５５からなる群から選択されるＴＤＰ－４３結合性ドメイン（例えば、表２参照）を含む。一つの特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５１のＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５３のＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む。なお別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５２のＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む。
【0040】
別の実施形態において、融合タンパク質はまた、Ｊドメインと化学的にコンジュゲートされているＴＤＰ－４３結合性ドメインの使用を企図する。ＴＤＰ－４３結合性ドメインは、Ｊドメインと直接的にコンジュゲートされ得る。あるいは、それは、リンカーによりＪドメインとコンジュゲートされ得る。例えば、当業者に知られて、かつＴＤＰ－４３結合性ドメインをＪドメインと、または標的化ドメインを、ＴＤＰ－４３結合性ドメインおよびＪドメインを含む融合タンパク質と架橋するのに有用である多数の化学的架橋剤がある。例えば、架橋剤は、分子を段階的な様式で連結するために用いることができるヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤は、タンパク質をコンジュゲートするためのより特異的なカップリング方法をデザインする能力を提供し、それにより、ホモタンパク質ポリマーなどの望ましくない副反応の発生を低下させる。様々なヘテロ二官能性架橋剤が当技術分野において知られており、それには、スクシンイジミル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）；４－スクシンイミジルオキシカルボニル－ａ－メチル－ａ－（２－ピリジルジチオ）－トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ－ＳＰＤＰ）が挙げられる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド部分を有する架橋剤は、一般的により高い水溶性を有するＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ることができる。加えて、連結鎖内にジスルフィド架橋を有する架橋剤は、インビボでのリンカー切断の量を低下させるためにアルキル誘導体として、代わりに合成することができる。ヘテロ二官能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性架橋剤および光反応性架橋剤を含む、いくつかの他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、およびジメチルピメリミデート・２ＨＣｌは、この開示に用いられる有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、ビス－［Ｂ－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）およびＮ－スクシンイミジル－６（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、有用な光反応性架橋剤の例である。タンパク質カップリング技術の最近の概説について、参照により本明細書に組み入れられた、Ｍｅａｎｓら、（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１：２～１２を参照されたい。
【0041】
【表2】
【0042】
ｃ． 任意選択のリンカー
本明細書に記載された融合タンパク質は、任意選択で、１つまたは複数のリンカーを含有することができる。リンカーは、ペプチド性または非ペプチド性であり得る。リンカーの目的は、とりわけ、タンパク質内の機能性ドメインの間（例えば、ＪドメインとＴＤＰ－４３結合性ドメインの間、ＴＤＰ－４３結合性ドメインのタンデム配置の間、ＪドメインとＴＤＰ－４３結合性ドメインと任意選択の標的化試薬のいずれかの間、またはＪドメインとＴＤＰ－４３結合性ドメインと任意選択の検出ドメインまたはエピトープのいずれかの間）に、そのドメインのそれぞれの最適な機能のために、適切な距離を与えることである。明らかに、リンカーは、好ましくは、本発明の融合タンパク質のＪドメイン、標的タンパク質結合性ドメインのそれぞれの機能に干渉しない。リンカーは、本発明の融合タンパク質に存在する場合には、標的タンパク質（ＴＤＰ－４３タンパク質）によって引き起こされる細胞毒性を減弱するように選択され、直接的付着が所望の効果を達成するならば、それは省略され得る。本発明の融合タンパク質に存在するリンカーは、本明細書に記載されているようなタンパク質ドメインまたは融合タンパク質全体をコードする核酸セグメントをインフレームで挿入されている発現ベクターのクローニング部位あたりの核酸のセグメント上に存在するヌクレオチド配列によってコードされる１個または複数のアミノ酸を含み得る。一実施形態において、ペプチドリンカーは、１アミノ酸長から２０アミノ酸長の間である。別の実施形態において、ペプチドリンカーは、２アミノ酸長から１５アミノ酸長の間である。なお別の実施形態において、ペプチドリンカーは、２アミノ酸長から１０アミノ酸長の間である。
本明細書に記載された融合タンパク質は、任意選択で、１つまたは複数のリンカーを含有することができる。リンカーは、ペプチド性または非ペプチド性であり得る。リンカーの目的は、とりわけ、タンパク質内の機能性ドメインの間（例えば、ＪドメインとＴＤＰ－４３結合性ドメインの間、ＴＤＰ－４３結合性ドメインのタンデム配置の間、ＪドメインとＴＤＰ－４３結合性ドメインと任意選択の標的化試薬のいずれかの間、またはＪドメインとＴＤＰ－４３結合性ドメインと任意選択の検出ドメインまたはエピトープのいずれかの間）に、そのドメインのそれぞれの最適な機能のために、適切な距離を与えることである。明らかに、リンカーは、好ましくは、本発明の融合タンパク質のＪドメイン、標的タンパク質結合性ドメインのそれぞれの機能に干渉しない。リンカーは、本発明の融合タンパク質に存在する場合には、標的タンパク質（ＴＤＰ－４３タンパク質）によって引き起こされる細胞毒性を減弱するように選択され、直接的付着が所望の効果を達成するならば、それは省略され得る。本発明の融合タンパク質に存在するリンカーは、本明細書に記載されているようなタンパク質ドメインまたは融合タンパク質全体をコードする核酸セグメントをインフレームで挿入されている発現ベクターのクローニング部位あたりの核酸のセグメント上に存在するヌクレオチド配列によってコードされる１個または複数のアミノ酸を含み得る。一実施形態において、ペプチドリンカーは、１アミノ酸長から２０アミノ酸長の間である。別の実施形態において、ペプチドリンカーは、２アミノ酸長から１５アミノ酸長の間である。なお別の実施形態において、ペプチドリンカーは、２アミノ酸長から１０アミノ酸長の間である。
【0043】
本発明による融合タンパク質を作製するために１つまたは複数のポリペプチドリンカーを選択することは、当業者の知識と技能の範囲内である。例えば、Ａｒａｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１４（８）：５２９～５３２（２００１）；Ｃｒａｓｔｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１３（５）：３０９～３１４（２０００）；Ｇｅｏｒｇｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１５（１１）：８７１～８７９（２００３）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：５９２９～５９３４（１９９８）参照（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）。本発明による融合タンパク質を調製することにおいて用いられ得る２個以上のアミノ酸のリンカーの例には、下記の表３に提供されたものが挙げられるが、それらに限定されない。
【0044】
【表3】
【0045】
ｄ． 標的化試薬
本明細書に開示された融合タンパク質はさらに、標的化部分を含み得る。本明細書で用いられる場合、用語「標的化部分」および「標的化試薬」は、交換可能に用いられ、細胞においてまたは対象の身体において、融合タンパク質の結合、輸送、蓄積、滞留時間、生物学的利用率を増強し、またはその生物活性もしくは治療効果を改変する、融合タンパク質に会合した物質を指す。標的化部分は、組織、細胞、および／または細胞内のレベルで機能性を有し得る。標的化部分は、例えば融合タンパク質の対象への投与により、融合タンパク質の特定の細胞、組織、もしくは器官への局在、または細胞内分布を方向づけることができる。一実施形態において、標的化部分は、融合タンパク質のＮ末端に位置する。別の実施形態において、標的化部分は、融合タンパク質のＣ末端に位置する。なお別の実施形態において、標的化部分は内部に位置する。別の実施形態において、標的化部分は、化学的コンジュゲーションを介して融合タンパク質と付着する。
本明細書に開示された融合タンパク質はさらに、標的化部分を含み得る。本明細書で用いられる場合、用語「標的化部分」および「標的化試薬」は、交換可能に用いられ、細胞においてまたは対象の身体において、融合タンパク質の結合、輸送、蓄積、滞留時間、生物学的利用率を増強し、またはその生物活性もしくは治療効果を改変する、融合タンパク質に会合した物質を指す。標的化部分は、組織、細胞、および／または細胞内のレベルで機能性を有し得る。標的化部分は、例えば融合タンパク質の対象への投与により、融合タンパク質の特定の細胞、組織、もしくは器官への局在、または細胞内分布を方向づけることができる。一実施形態において、標的化部分は、融合タンパク質のＮ末端に位置する。別の実施形態において、標的化部分は、融合タンパク質のＣ末端に位置する。なお別の実施形態において、標的化部分は内部に位置する。別の実施形態において、標的化部分は、化学的コンジュゲーションを介して融合タンパク質と付着する。
【0046】
標的化部分には、とりわけ、有機もしくは無機分子、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、抗体もしくはその断片、成長因子、酵素、レクチン、抗原もしくは免疫原、ウイルスもしくはそのコンポーネント、ウイルスベクター、受容体、受容体リガンド、毒素、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドもしくはアプタマー、ヌクレオチド、炭水化物、糖、脂質、糖脂質、核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ステロイド、ホルモン、成長因子、化学誘引物質、サイトカイン、ケモカイン、薬物、または小分子が挙げられ得るが、それらに限定されない。
【0047】
本発明の例示的実施形態において、標的化部分は、標的細胞または組織、例えば、神経細胞、中枢神経系、および／または末梢神経系において、プラットフォーム、またはその関連したリガンドおよび／もしくは活性物質の結合、輸送、蓄積、滞留時間、生物学的利用率を増強し、またはその生物活性もしくは治療効果を改変する。したがって、標的化部分は、中枢神経系に関連した細胞受容体に対する特異性を有し得、または血液脳関門（ＢＢＢ）を経由してのＣＮＳへの送達の増強に別様に関連する。結果的に、上記のようなリガンドは、リガンドと標的化部分の両方であり得る。
【0048】
いくつかの実施形態において、標的化部分は、例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、米国特許第１０，１１１，９６５号に記載されているような、細胞透過性ペプチドであり得る。別の実施形態において、標的化部分は、例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、米国特許出願第１６／１３１，５９１号に記載されているような、抗体またはその抗原結合性断片もしくは一本鎖誘導体であり得る。さらなる実施形態において、標的化部分は、核移行シグナルまたは核外移行シグナルについてのアミノ酸配列であり得る。
【0049】
標的化部分は、標的化された細胞送達のためのプラットフォームに、そのコアと直接的または間接的に結合することにより、連結され得る。例えば、コアがナノ粒子を含む実施形態において、標的化部分のナノ粒子とのコンジュゲーションは、ナノ粒子にＰＥＧを繋ぎ止めるために用いられる類似した官能基を利用することができる。したがって、標的化部分は、標的化部分の官能化を通してナノ粒子と直接的に結合することができる。あるいは、標的化部分は、上記で論じられているように、標的化部分の官能化ＰＥＧとのコンジュゲーションを通して、ナノ粒子と間接的に結合することができる。標的化部分は、共有結合性、非共有結合性、または静電気性相互作用によってコアと接着することができる。一実施形態において、標的化部分はペプチドである。特定の実施形態において、標的化部分は、融合タンパク質のＮ末端と共有結合性に付着するペプチドである。
【0050】
ｅ． エピトープ
ある特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質に追加の性質を与えることができる任意選択のエピトープまたはタグを含有する。本明細書で用いられる場合、用語「エピトープ」および「タグ」は、典型的には融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端と付着する、典型的には３００アミノ酸長以下の、アミノ酸配列を指すのに交換可能に用いられる。一実施形態において、本発明の融合タンパク質はさらに、精製を促進するために用いられるエピトープを含む。下記の表４に提供された、精製に有用なそのようなエピトープの例には、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（配列番号６７）、ＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号６８）、Ｈｉｓ６エピトープ（配列番号６９）、ｃ－ｍｙｃ（配列番号７０）、ＨＡ（配列番号７１）、Ｖ５エピトープ（配列番号７２）、またはグルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼ（配列番号７３）が挙げられる。別の実施形態において、本発明の融合タンパク質はさらに、対象、例えばヒトへ投与された時、融合タンパク質の半減期を増加させるために用いられるエピトープを含む。半減期を増加させるために有用なそのようなエピトープの例には、ヒトＦｃ配列が挙げられる。したがって、一つの特定の実施形態において、融合タンパク質は、ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインに加えて、ヒトＦｃエピトープを含む。エピトープは、融合タンパク質のＣ末端に位置する。
ある特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質に追加の性質を与えることができる任意選択のエピトープまたはタグを含有する。本明細書で用いられる場合、用語「エピトープ」および「タグ」は、典型的には融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端と付着する、典型的には３００アミノ酸長以下の、アミノ酸配列を指すのに交換可能に用いられる。一実施形態において、本発明の融合タンパク質はさらに、精製を促進するために用いられるエピトープを含む。下記の表４に提供された、精製に有用なそのようなエピトープの例には、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（配列番号６７）、ＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号６８）、Ｈｉｓ６エピトープ（配列番号６９）、ｃ－ｍｙｃ（配列番号７０）、ＨＡ（配列番号７１）、Ｖ５エピトープ（配列番号７２）、またはグルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼ（配列番号７３）が挙げられる。別の実施形態において、本発明の融合タンパク質はさらに、対象、例えばヒトへ投与された時、融合タンパク質の半減期を増加させるために用いられるエピトープを含む。半減期を増加させるために有用なそのようなエピトープの例には、ヒトＦｃ配列が挙げられる。したがって、一つの特定の実施形態において、融合タンパク質は、ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインに加えて、ヒトＦｃエピトープを含む。エピトープは、融合タンパク質のＣ末端に位置する。
【0051】
【表4】
【0052】
ｆ．細胞透過性ペプチド
なお他の実施形態において、本明細書に記載された融合タンパク質はさらに、細胞透過性ペプチドを含み得る。細胞透過性ペプチドは、コンジュゲートされたカーゴを、それが小分子であろうと、ペプチドであろうと、タンパク質であろうと、核酸であろうと、細胞へ運ぶことが知られている。本発明の融合タンパク質における細胞透過性ペプチドの非限定的例には、ポリカチオン性ペプチド、例えば、ＨＩＶ ＴＡＴペプチド４９－５７、ポリアルギニン、およびペネトラチンｐＡｎｔａｎ（４３－５８）、両親媒性ペプチド、例えば、ｐｅｐ－１、疎水性ペプチド、例えば、Ｃ４０５Ｙ、およびその他同種類のものが挙げられる。下記の表５参照。
なお他の実施形態において、本明細書に記載された融合タンパク質はさらに、細胞透過性ペプチドを含み得る。細胞透過性ペプチドは、コンジュゲートされたカーゴを、それが小分子であろうと、ペプチドであろうと、タンパク質であろうと、核酸であろうと、細胞へ運ぶことが知られている。本発明の融合タンパク質における細胞透過性ペプチドの非限定的例には、ポリカチオン性ペプチド、例えば、ＨＩＶ ＴＡＴペプチド４９－５７、ポリアルギニン、およびペネトラチンｐＡｎｔａｎ（４３－５８）、両親媒性ペプチド、例えば、ｐｅｐ－１、疎水性ペプチド、例えば、Ｃ４０５Ｙ、およびその他同種類のものが挙げられる。下記の表５参照。
【0053】
【表5】
【0054】
したがって、一実施形態において、本融合タンパク質は、細胞透過性ペプチドおよび融合タンパク質を含み、前記細胞透過性ペプチドが、配列番号７４～７７からなる群から選択され、前記融合タンパク質がＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む。一実施形態において、前記融合タンパク質は、配列番号８０～８５および８９～９６からなる群から選択される。別の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号７４のシグナル配列、ならびに配列番号８０～８５、８９～９０、および９２～９６からなる群から選択される融合タンパク質を含む。別の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号７５の細胞透過性ペプチド、ならびに配列番号８０～８５、８９～９０、および９２～９６からなる群から選択される融合タンパク質を含む。なお別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号７６の細胞透過性ペプチド、ならびに配列番号８０～８５、８９～９０、および９２～９６からなる群から選択される融合タンパク質を含む。さらに別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号７７の細胞透過性ペプチド、ならびに配列番号８０～８５、８９～９０、および９２～９６からなる群から選択される融合タンパク質を含む。細胞透過性ペプチドを含む本融合タンパク質構築物を発現する細胞は、対象、例えばヒト対象（例えば、ＴＤＰ－４３障害を有し、または患うリスクがある患者）へ投与され得る。本融合タンパク質は、細胞から分泌され、ＴＤＰ－４３含有タンパク質凝集および／または関連した細胞毒性を低下させるのを助ける。
【0055】
ｇ． ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインの配置
本明細書に記載された融合タンパク質は、多数の様式で配置され得る。一実施形態において、ＴＤＰ－４３結合性ドメインは、ＪドメインのＣ末端側へ付着している。別の実施形態において、ＴＤＰ－４３結合性ドメインは、ＪドメインのＮ末端側へ付着している。ＴＤＰ－４３結合性ドメインおよびＪドメインは、いずれの立体配置においても、任意で、上記のようなリンカーを介して、分離され得る。
本明細書に記載された融合タンパク質は、多数の様式で配置され得る。一実施形態において、ＴＤＰ－４３結合性ドメインは、ＪドメインのＣ末端側へ付着している。別の実施形態において、ＴＤＰ－４３結合性ドメインは、ＪドメインのＮ末端側へ付着している。ＴＤＰ－４３結合性ドメインおよびＪドメインは、いずれの立体配置においても、任意で、上記のようなリンカーを介して、分離され得る。
【0056】
いくつかの実施形態において、Ｊドメインは、複数のＴＤＰ－４３結合性ドメイン、例えば、２つのＴＤＰ－４３結合性ドメイン、３つのＴＤＰ－４３結合性ドメイン、４つのＴＤＰ－４３結合性ドメイン、またはそれ以上と付着し得る。ＴＤＰ－４３結合性ドメインは、ＪドメインのＮ末端側へ付着し得る。あるいは、ＴＤＰ－４３結合性ドメインは、ＪドメインのＣ末端側へ付着し得る。なお別の実施形態において、ＴＤＰ－４３結合性ドメインは、ＪドメインのＮ末端側およびＣ末端側に付着し得る。複数のＴＤＰ－４３結合性ドメインのそれぞれは、同じＴＤＰ－４３結合性ドメインであり得る。別の実施形態において、融合タンパク質における複数のＴＤＰ－４３結合性ドメインのそれぞれは、異なるＴＤＰ－４３結合性ドメイン（すなわち、異なる配列）であり得る。
【0057】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、以下の群：
ａ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｂ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｃ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｄ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｅ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｆ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｇ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｈ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｉ． ＴＤＮＡＪ－Ｘ－ＴＴＴＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｊ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－ＴＴ、
ｋ． ＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＴＴＴＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｌ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｍ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｎ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｏ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｐ． ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｑ． Ｔ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、
ｒ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、および
ｓ． Ｔ－Ｘ－ＴＤｎａＪ－Ｘ－ＴＤｎａＪ－Ｘ－ＴＴＴＴ
から選択される構造を含み得、
ここで、
ＴはＴＤＰ－４３結合性ドメインであり、
ＤＮＡＪはＪタンパク質のＪドメインであり、
Ｘは任意選択のリンカーである。
ａ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｂ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｃ． ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｄ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｅ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｆ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ、
ｇ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｈ． Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｉ． ＴＤＮＡＪ－Ｘ－ＴＴＴＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｊ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－ＴＴ、
ｋ． ＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＴＴＴＴＴＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｌ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｍ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ、
ｎ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｏ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤＮＡＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｐ． ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－Ｔ、
ｑ． Ｔ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、
ｒ． Ｔ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＤｎａＪ－Ｘ－ＤｎａＪ、および
ｓ． Ｔ－Ｘ－ＴＤｎａＪ－Ｘ－ＴＤｎａＪ－Ｘ－ＴＴＴＴ
から選択される構造を含み得、
ここで、
ＴはＴＤＰ－４３結合性ドメインであり、
ＤＮＡＪはＪタンパク質のＪドメインであり、
Ｘは任意選択のリンカーである。
【0058】
一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５、６、１０、２４、および３１からなる群から選択されるＪドメインを含む。一つの特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５のＪドメインを含む。
【0059】
別の実施形態において、ＴＤＰ－４３結合性ドメインは、配列番号５１～５５からなる群から選択される。一つの特定の実施形態において、ＴＤＰ－４３結合性ドメインは、配列番号５１～５３からなる群から選択される。
【0060】
なお別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５のＪドメインおよび配列番号５１のＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５のＪドメイン、および配列番号５３のＴＤＰ－４３結合性ドメインの少なくとも２個のコピーを含む。
【0061】
ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む融合タンパク質構築物の非限定的例は、図２に模式的に描かれ、下記の表６にも示されている。別の実施形態において、特定の融合タンパク質構築物は、配列番号８０～８５、および８９～９６からなる群から選択される。
【0062】
【表6-1】
【0063】
【表6-2】
【0064】
【表6-3】
【0065】
ＩＩ． 融合タンパク質構築物をコードする核酸
本発明の別の態様によれば、（ａ）前述の実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸が提供される。本発明は、ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする、単離された核酸、ならびに融合タンパク質をコードするそのような核酸分子と相補的な配列、加えて、その相同バリアントを提供する。別の態様において、本発明は、本明細書に開示された融合タンパク質をコードする核酸、融合タンパク質をコードする核酸と相補的な配列、加えて、その相同バリアントを作製するための方法を包含する。本発明のこの態様による核酸は、プレメッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡであり得る。
本発明の別の態様によれば、（ａ）前述の実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸が提供される。本発明は、ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする、単離された核酸、ならびに融合タンパク質をコードするそのような核酸分子と相補的な配列、加えて、その相同バリアントを提供する。別の態様において、本発明は、本明細書に開示された融合タンパク質をコードする核酸、融合タンパク質をコードする核酸と相補的な配列、加えて、その相同バリアントを作製するための方法を包含する。本発明のこの態様による核酸は、プレメッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡであり得る。
【0066】
さらに別の態様において、（ａ）融合タンパク質をコードするヌクレオチドを合成しおよび／またはアセンブルするステップ、（ｂ）コード遺伝子を、宿主細胞に適切な発現ベクターへ組み入れるステップ、（ｃ）適切な宿主細胞を発現ベクターで形質転換するステップ、ならびに（ｄ）融合タンパク質が形質転換宿主細胞において発現することを引き起こしまたは可能にする条件下で宿主細胞を培養し、それにより、生物活性融合タンパク質を産生し、産生された生物活性融合タンパク質が、当技術分野において知られた標準タンパク質精製方法によって、単離された融合タンパク質として回収される、ステップを含む、融合タンパク質を産生する方法が開示される。分子生物学における標準組換え技術が、本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製するために用いられる。
【0067】
本発明によれば、本明細書に開示された融合タンパク質をコードする核酸配列（またはその相補体）は、適切な宿主細胞において融合タンパク質の発現を指示する組換えＤＮＡ分子を作製するために用いられる。いくつかのクローニングストラテジーは、本発明を実施するのに適しており、その多くは、本発明の融合タンパク質またはその相補体をコードする遺伝子を含む構築物を作製するために用いられる。いくつかの実施形態において、クローニングストラテジーは、本発明の融合タンパク質またはその相補体をコードする遺伝子を産生するために用いられる。
【0068】
ある特定の実施形態において、１つまたは複数の融合タンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡ分子であり、プレメッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡであり得る。
【0069】
様々な実施形態において、核酸は、所望のポリペプチドを一過性に発現するために細胞へ導入されるｍＲＮＡである。本明細書で用いられる場合、「一過性の」は、数時間、数日間、または数週間の期間の間の、組み込まれていない導入遺伝子の発現を指し、発現の期間は、ゲノムへ組み込まれ、または細胞における安定なプラスミドレプリコン内に含有される場合のポリヌクレオチドの発現についての期間より短い。
【0070】
特定の実施形態において、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、インビトロで転写されたｍＲＮＡである。本明細書で用いられる場合、「インビトロで転写されたＲＮＡ」とは、インビトロで合成されているＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。一般的に、インビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから生成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロで転写されたＲＮＡを生成するために用いられる鋳型を含む。
特定の実施形態において、ｍＲＮＡはさらに、５’キャップもしくは修飾５’キャップおよび／またはポリ（Ａ）配列を含み得る。本明細書で用いられる場合、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７－メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも呼ばれる）は、転写の開始後すぐに真核生物メッセンジャーＲＮＡの「最前部（ｆｒｏｎｔ）」または５’末端に付加されている修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに連結され、かつリボソームによって認識され、かつＲｎアーゼから保護される末端基を含む。キャッピング部分は、ｍＲＮＡの機能性、例えば、その安定性または翻訳の効率を調節するために修飾され得る。特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、約５０個から約５０００個の間のアデニンのポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは、約１００塩基から約１０００塩基の間、約２００塩基から約５００塩基の間、または約３００塩基から約４００塩基の間のポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは、約６５塩基、約１００塩基、約２００塩基、約３００塩基、約４００塩基、約５００塩基、約６００塩基、約７００塩基、約８００塩基、約９００塩基、または約１０００塩基もしくはそれ以上のポリ（Ａ）配列を含む。ポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡの機能性、例えば、局在化、安定性、または翻訳の効率を調節するために化学的または酵素的に修飾され得る。
特定の実施形態において、ｍＲＮＡはさらに、５’キャップもしくは修飾５’キャップおよび／またはポリ（Ａ）配列を含み得る。本明細書で用いられる場合、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７－メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも呼ばれる）は、転写の開始後すぐに真核生物メッセンジャーＲＮＡの「最前部（ｆｒｏｎｔ）」または５’末端に付加されている修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに連結され、かつリボソームによって認識され、かつＲｎアーゼから保護される末端基を含む。キャッピング部分は、ｍＲＮＡの機能性、例えば、その安定性または翻訳の効率を調節するために修飾され得る。特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、約５０個から約５０００個の間のアデニンのポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは、約１００塩基から約１０００塩基の間、約２００塩基から約５００塩基の間、または約３００塩基から約４００塩基の間のポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは、約６５塩基、約１００塩基、約２００塩基、約３００塩基、約４００塩基、約５００塩基、約６００塩基、約７００塩基、約８００塩基、約９００塩基、または約１０００塩基もしくはそれ以上のポリ（Ａ）配列を含む。ポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡの機能性、例えば、局在化、安定性、または翻訳の効率を調節するために化学的または酵素的に修飾され得る。
【0071】
本明細書で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」およびその他同種類のものは、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または以下で定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して、１個または複数のヌクレオチドが、付加し、または欠失し、または異なるヌクレオチドに置き換えられているポリヌクレオチドを含む。この点において、変異、付加、欠失、および置換を含むある特定の変更を、参照ポリヌクレオチドに行うことができ、それにより変更されたポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することは、当技術分野においてよく理解されている。
【0072】
ある特定の実施形態において、核酸配列は、目的の遺伝子（例えば、Ｊドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む融合タンパク質）をコードするヌクレオチド配列を核酸カセット内に含む。本明細書で用いられる場合、用語「核酸カセット」または「発現カセット」は、ＲＮＡおよびその後、ポリペプチドを発現することができるベクター内の遺伝的配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、目的の遺伝子、例えば、目的のポリヌクレオチドを含有する。別の実施形態において、核酸カセットは、１つまたは複数の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および目的の遺伝子、例えば目的のポリヌクレオチドを含有する。ベクターは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個、またはそれ以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡへ転写され、必要に応じて、タンパク質もしくはポリペプチドへ翻訳され、形質転換細胞における活性に必要とされる適切な翻訳後修飾を起こし、適切な細胞内コンパートメントへと標的化することまたは細胞外のコンパートメントへの分泌により、生物活性のために適切なコンパートメントへと転位することができるように、ベクター内に位置的にかつ順序的に方向づけられる。好ましくは、カセットは、ベクターへの即時挿入に適応した３’および５’末端を有し、例えば、それは、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。カセットは、単一ユニットとして、プラスミドまたはウイルスベクターへ除去および挿入され得る。
【0073】
特定の実施形態における使用に適した実例的な遍在性発現制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルスのサルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、およびＰｌ ｌプロモーター、伸長因子１－アルファ（ＥＦｌａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物の翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（ｂ－ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５、１４７７～１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター（Ｏｋａｂｅら （１９９７）ＦＥＢＳ ｌｅｔ．４０７：３１３～９）、ｂ－アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負制御領域が欠失し、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位に置換された（ＭＮＤ）Ｕ３プロモーター（Ｈａａｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００３；７７（ｌ７）：９４３９～９４５０）が挙げられるが、それらに限定されない。
【0074】
一実施形態において、プロモーターなどの導入遺伝子標的特異性および発現を増強するための少なくとも１つのエレメント（例えば、Ｐｏｗｅｌｌら （２０１５）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９（１０２）：４９～５７（その内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている）参照）が、本明細書に記載されたポリヌクレオチドと共に用いられ得る。たいていの組織において発現を促進するプロモーターには、ヒト伸長因子ｌａ－サブユニット（ＥＦｌａ）、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）およびその誘導体ＣＡＧ、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、またはユビキチンＣ（ＵＢＣ）が挙げられるが、それらに限定されない。組織特異的発現エレメントは、ある特定の細胞型へ発現を制限するために用いられ、それには、例えば、ニューロン、アストロサイト、またはオリゴデンドロサイトへ発現を制限するために用いられ得る神経系プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。ニューロンについての組織特異的発現エレメントの非限定的例には、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来成長因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ－β）、シナプシン（Ｓｙｎ）、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、ＣａＭＫＩＩ、ｍＧｌｕＲ２、ＮＦＬ、ＮＦＨ、ηβ２、ＰＰＥ、Ｅｎｋ、およびＥＡＡＴ２のプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。アストロサイトについての組織特異的発現エレメントの非限定的例には、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびＥＡＡＴ２のプロモーターが挙げられる。オリゴデンドロサイトについての組織特異的発現エレメントの非限定的例には、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターが挙げられる。Ｙｕら（全体として参照により組み入れられた（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｉｎ、７：６３）は、ラットＤＲＧ細胞および一次ＤＲＧ細胞におけるＣＡＧ、ＥＦＩａ、ＰＧＫ、およびＵＢＣプロモーター下でのｅＧＦＰの発現を、レンチウイルスベクターを用いて評価し、ＵＢＣが、他の３つのプロモーターより弱い発現を示し、全てのプロモーターについてたった１０～１２％だけのグリア発現があることを見出した。Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍら（全体として参照により組み入れられた、Ｅ．Ｎｅｕｒｏ ２０１５）は、ＣＭＶおよびＵＢＣプロモーターを有するＡＡＶ８ならびにＣＭＶプロモーターを有するＡＡＶ２におけるｅＧＦＰの発現を、運動皮質内の注射後、評価した。ＵＢＣまたはＥＦＩａプロモーターを含有するプラスミドの鼻腔内投与は、ＣＭＶプロモーターでの発現より高い持続性気道発現を示した（例えば、全体として参照により組み入れられた、Ｇｉｌｌら、（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、８巻、１５３９～１５４６参照）。Ｈｕｓａｉｎら（全体として参照により組み入れられた（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）は、ｈＧＵＳＢプロモーター、ＨＳＶ－１ＬＡＴプロモーター、およびＮＳＥプロモーターを有するΗβΗ構築物を評価し、ΗβΗ構築物が、マウス脳においてＮＳＥより弱い発現を示すことを見出した。ＰａｓｓｉｎｉおよびＷｏｌｆｅ（全体として参照により組み入れられた、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００１、１２３８２～１２３９２）は、新生仔マウスにおける脳室内注射後のΗβΗベクターの長期効果を評価し、少なくとも１年間の持続性発現があることを見出した。Ｘｕら（全体として参照により組み入れられた、（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、８、１３２３～１３３２）により、ＣＭＶ－ｌａｃＺ、ＣＭＶ－ｌｕｃ、ＥＦ、ＧＦＡＰ、ｈＥＮＫ、ｎＡＣｈＲ、ＰＰＥ、ＰＰＥ＋ｗｐｒｅ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）、およびＮＳＥ（１．８ｋｂ＋ｗｐｒｅ）との比較として、ＮＦ－ＬおよびＮＦ－Ｈプロモーターが用いられた場合、全ての脳領域における低発現が見出された。Ｘｕらは、プロモーター活性が、降順で、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）、ＥＦ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＧＦＡＰ、ＣＭＶ、ｈＥＮＫ、ＰＰＥ、ＮＦＬ、およびＮＦＨであることを見出した。ＮＦＬは６５０ヌクレオチドのプロモーターであり、ＮＦＨは、９２０ヌクレオチドのプロモーターであり、両方とも肝臓に存在しないが、ＮＦＨが、自己受容感覚ニューロン、脳、および脊髄において豊富であり、ＮＦＨは心臓に存在する。Ｓｃｎ８ａは、４７０ヌクレオチドのプロモーターであり、ＤＲＧ、脊髄、および脳中に発現し、特に、海馬ニューロンおよび小脳プルキンエ細胞、皮質、視床および視床下部に特に高い発現が見られる。（例えば、全体として参照により組み入れられた、Ｄｒｅｗｓら ２００７およびＲａｙｍｏｎｄら ２００４参照）。
【0075】
ＩＩＩ． 融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター
本発明による核酸を含むベクターもまた提供される。そのようなベクターは、好ましくは、ホスファターゼをコードする核酸配列の転写／翻訳に必要なエレメント（例えば、プロモーターおよび／またはターミネーター配列）などの追加の核酸配列を含む。前記ベクターはまた、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を選択または維持するために選択マーカー（例えば、抗生物質）をコードする核酸配列を含み得る。用語「ベクター」は、別の核酸分子を移入させまたは輸送する能力がある核酸分子を指す。移入した核酸は、一般的に、ベクター核酸分子と連結され、例えば、その中へ挿入される。ベクターは、細胞において自己複製を指示する配列を含み得、または宿主細胞ＤＮＡへの組込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書で企図された１つまたは複数のポリヌクレオチドを罹患細胞（例えば、神経細胞）へ送達するために用いられる。一実施形態において、ベクターは、ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする、インビトロで合成されまたは合成的に調製されたｍＲＮＡである。非ウイルスベクターの実例には、ｍＲＮＡ、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が挙げられるが、それらに限定されない。
本発明による核酸を含むベクターもまた提供される。そのようなベクターは、好ましくは、ホスファターゼをコードする核酸配列の転写／翻訳に必要なエレメント（例えば、プロモーターおよび／またはターミネーター配列）などの追加の核酸配列を含む。前記ベクターはまた、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を選択または維持するために選択マーカー（例えば、抗生物質）をコードする核酸配列を含み得る。用語「ベクター」は、別の核酸分子を移入させまたは輸送する能力がある核酸分子を指す。移入した核酸は、一般的に、ベクター核酸分子と連結され、例えば、その中へ挿入される。ベクターは、細胞において自己複製を指示する配列を含み得、または宿主細胞ＤＮＡへの組込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書で企図された１つまたは複数のポリヌクレオチドを罹患細胞（例えば、神経細胞）へ送達するために用いられる。一実施形態において、ベクターは、ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする、インビトロで合成されまたは合成的に調製されたｍＲＮＡである。非ウイルスベクターの実例には、ｍＲＮＡ、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が挙げられるが、それらに限定されない。
【0076】
ベクターの実例には、プラスミド、自己複製配列、および転位因子、例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｍｏｓｌ、Ｔｃｌ／ｍａｒｉｎｅｒ、Ｔｏｌ２、ｍｉｎｉ－Ｔｏｌ２、Ｔｃ３、ＭｕＡ、Ｈｉｍａｒ Ｉ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、およびそれらの誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。ベクターの追加の実例には、非限定的に、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰｌ由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして有用なウイルスの実例には、非限定的に、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（vims））、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。発現ベクターの実例には、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介性遺伝子移入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ ５－ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されたポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のためにそのような発現ベクターへライゲーションされ得る。
【0077】
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外に維持されるベクターである。本明細書で用いられる場合、用語「エピソームの」は、宿主の染色体ＤＮＡへの組込みなしに、かつ分裂する宿主細胞から徐々に失われることなしに複製することができる、つまり、前記ベクターが染色体外にまたはエピソーム的に複製する、ベクターを指す。
【0078】
ベクターは、様々な部位特異的リコンビナーゼのいずれかについての１つまたは複数の組換え部位を含み得る。部位特異的リコンビナーゼについての標的部位が、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組込みに必要とされる任意の部位に加えてであることは、理解されるべきである。本明細書で用いられる場合、用語「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」は、リコンビナーゼが認識しかつ結合する特定の核酸配列を指す。
【0079】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼについての１つの組換え部位は、８塩基対コア配列に隣接する２つの１３塩基対逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として働く）を含む３４塩基対配列である、ｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１～５２７（１９９４）の図１参照）。ＦＬＰリコンビナーゼについての適切な認識部位には、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６）、ＦＩ、Ｆ２、Ｆ３（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４）、ＦｙＦｓ（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８）が挙げられるが、それらに限定されない。
【0080】
認識配列の他の例は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列であり、それらは、リコンビナーゼ酵素ｌインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ－ｃ３ｌによって認識される。（ｐＣ３ｌ ＳＳＲは、ヘテロタイプな部位、ａｔｔＢ（３４ｂｐ長）とａｔｔＰ（３９ｂｐ長）の間のみの組換えを媒介する（Ｇｒｏｔｈら、２０００）。細菌ゲノムおよびファージゲノム、それぞれにおけるファージインテグラーゼについての付着部位に関して名付けられたａｔｔＢおよびａｔｔＰはどちらも、おそらくφ０３１ホモダイマーにより結合される、不完全な逆方向反復を含有する（Ｇｒｏｔｈら、２０００）。生成部位、ａｔｔＬおよびａｔｔＲは、事実上、さらなるｔｐＱＡ １媒介性組換えに対して不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３）、反応を不可逆性にさせている。挿入を触媒することについて、ａｔｔＢ保有ＤＮＡは、ａｔｔＰ部位がゲノムａｔｔＢ部位へ挿入するより容易に、ゲノムａｔｔＰ部位へ挿入することが見出されている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、２００１；Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３）。したがって、典型的なストラテジーは、相同組換えにより、ａｔｔＰ保有「ドッキング部位」を、限定された遺伝子座へ位置づけ、その後、そのａｔｔＰ保有「ドッキング部位」が、挿入としてのａｔｔＢ保有の入ってくる配列とパートナーを組まされる。
【0081】
本明細書で用いられる場合、「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、シストロン（タンパク質コード領域）のＡＴＧなどの開始コドンへの直接的な配列内リボソーム進入を促進し、それにより、遺伝子のキャップ非依存性翻訳をもたらすエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９０ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７～８３、ならびにＪａｃｋｓｏｎおよびＫａｍｉｎｓｋｉ １９９５ ＲＮＡ １（１０）：９８５～１０００参照。特定の実施形態において、ベクターは、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の目的のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、１つもしくは複数のＩＲＥＳ配列、または自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離され得る。一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドに用いられるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳである。
【0082】
本明細書で用いられる場合、用語「コザック配列」は、リボソームの小サブユニットとのｍＲＮＡの最初の結合を大いに促進し、翻訳を増加させる、短いヌクレオチド配列を指す（Ｋｏｚａｋ、１９８６、Ｃｅｌｌ ４４（２）：２８３～９２、およびＫｏｚａｋ、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５－４８）。特定の実施形態において、ベクターは、コンセンサスコザック配列を有するポリヌクレオチド、ならびにＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。異種性核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を方向づけるエレメントは、異種性遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは、一般的に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるべきポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’側にポリアデニル化配列を含む。
【0083】
本明細書で企図された特定の実施形態における使用に適したウイルスベクター系の実例には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスのベクターが挙げられるが、それらに限定されない。
【0084】
様々な実施形態において、Ｊドメインおよびポリグルタミン結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、細胞、例えば、神経細胞へ、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を細胞に形質導入することにより、導入される。ＡＡＶは、小さい（約２６ｎｍ）複製欠損の、主にエピソーム性の、無エンベロープのウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムへ組み入れ得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、典型的には、最小限で、導入遺伝子、ならびにその制御配列、ならびに５’および３’ ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）で構成される。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐ長である。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、ＵＳ６９６２８１５Ｂ２に記載された）、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、ＵＳ７４７９５５４Ｂ２に記載された）、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、ＵＳ７２８２１９９Ｂ２に記載された）、ＡＡＶ９（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、ＵＳ９７３７６１８Ｂ２に記載された）、ＡＡＶ ｒｈ１０（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、ＵＳ９７９０４７２Ｂ２に記載された）、またはＡＡＶ１０から単離されたＩＴＲおよびカプシド配列を含む。一実施形態において、本発明のベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ ｒｈ１０からなる群から選択されるカプシド内へ被包される。一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ２内に被包される。一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ５内に被包される。一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ８内に被包される。一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ９内に被包される。なお一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ ｒｈ１０内に被包される。
【0085】
いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列が１つのＡＡＶ血清型から単離され、かつカプシド配列が異なるＡＡＶ血清型から単離されているキメラｒＡＡＶが用いられる。例えば、ＡＡＶ２に由来したＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来したカプシド配列を有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と呼ばれる。特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２に由来したＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のいずれか１つに由来したカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来したＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来したカプシド配列を含む。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来したＩＴＲ配列およびＡＡＶ２に由来したカプシド配列を含む。
【0086】
いくつかの実施形態において、操作および選択方法は、目的の細胞を形質導入する可能性をより高くするために、ＡＡＶカプシドへ適用することができる。
【0087】
ｒＡＡＶベクターの構築、その産生および精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号；第９，１６９，４９２号；第９，０１２，２２４号；第８，８８９，６４１号；第８，８０９，０５８号；および第８，７８４，７９９号に開示されており、それらの特許のそれぞれは、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【0088】
ＩＶ． 送達
特定の実施形態において、ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、非ウイルスまたはウイルスのベクターにより細胞へ導入される。特定の実施形態において企図されたポリヌクレオチドの非ウイルス性送達の実例的方法には、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられるが、それらに限定されない。
特定の実施形態において、ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む融合タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、非ウイルスまたはウイルスのベクターにより細胞へ導入される。特定の実施形態において企図されたポリヌクレオチドの非ウイルス性送達の実例的方法には、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられるが、それらに限定されない。
【0089】
特定の実施形態において企図された特定の実施形態における使用に適したポリヌクレオチド送達系の実例には、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．により提供される送達系が挙げられるが、それらに限定されない。リポフェクション試薬は、商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適しているカチオン性および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１８０～１８７；およびＢａｌａｚｓら、（２０Ｗ）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ２０１１：１～１２参照。抗体により標的化された、細菌由来の、非生存のナノセルに基づいた送達もまた、特定の実施形態において企図される。
【0090】
特定の実施形態において企図されたポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、インビボで、個々の患者への投与により、典型的には、下に記載されているように、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内の注入）により、くも膜下腔内注射、脳室内注射、または局所適用により、送達され得る。あるいは、ベクターは、個々の患者（例えば、動員末梢血、リンパ球、骨髄液、組織生検など）から外植された細胞または万能ドナーの造血幹細胞などのエクスビボでの細胞へ送達され、その後、その細胞を患者へ再植え込みされ得る。
【0091】
一実施形態において、本明細書に開示された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、インビボでの細胞の形質導入のために生物体へ直接的に投与される。
【0092】
適切にパッケージングされかつ製剤化されたウイルスベクターは、中枢神経系（ＣＮＳ）へくも膜下腔内送達を介して送達され得る。例えば、アデノ随伴ウイルスベクターは、全体として参照により本明細書に組み入れられている、米国特許出願第１５／７７１，４８１号に記載された方法を用いて送達され得る。
【0093】
あるいは、裸のＤＮＡが投与され得る。投与は、分子を血液または組織細胞との最終的な接触へ導入するために通常用いられる経路のいずれかによってであり、その経路には、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、それらに限定されない。そのような核酸を投与する適切な方法が利用でき、当業者によく知られており、特定の組成物を投与するために１つより多い経路を用いることができるが、特定の経路が、別の経路より速効性が高くかつより効果的な反応を提供することができる。
【0094】
様々な実施形態において、本明細書に開示された融合タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、細胞、例えば、神経細胞または神経幹細胞へ、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むレトロウイルス、例えばレンチウイルスを細胞に形質導入することにより、導入される。本明細書で用いられる場合、用語「レトロウイルス」は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状二本鎖ＤＮＡコピーへ転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムへ共有結合性に組み込む、ＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態における使用に適した実例的なレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ならびにレンチウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。本明細書で用いられる場合、用語「レンチウイルス」は、複雑なレンチウイルスの一群（または一属）を指す。実例的なレンチウイルスには、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ １型およびＨＩＶ ２型を含む）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態において、ＨＩＶに基づいたベクターバックボーン（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。
【0095】
レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲを改変することの結果としてのいくつかの安全性の増強を含有する。「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、複製欠損ベクター、例えば、Ｕ３領域として知られた、右側（３’）のＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域が、ウイルス複製の最初のラウンドを超えてのウイルス転写を防止するように（例えば、欠失または置換により）改変されている、ベクターを指す。追加の安全性増強は、５’ ＬＴＲのＵ３領域を、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を駆動させる異種性プロモーターと置き換えることにより提供される。用いられ得る異種性プロモーターの例には、例えば、ウイルスのサルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（vims）（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）のプロモーターが挙げられる。ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、公知の方法に従って作製される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０ Ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２－６７５０－９－１０；Ｋｕｔｎｅｒら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５～５０５ Ｄｏｉ：ｌ０．ｌ０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２参照。
【0096】
本明細書で企図されたある特定の実施形態によれば、ウイルスベクターバックボーン配列の大部分または全部は、レンチウイルス、例えばＨＩＶ－１に由来している。しかしながら、レトロウイルスおよび／もしくはレンチウイルス配列の多くの異なる源が用いられ得、またはレンチウイルス配列のある部分における組み合わせられた多数の置換および変更が、トランスファーベクターが本明細書に記載された機能を実施する能力を損なうことなく、受け入れられ得ることは理解されるべきである。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当技術分野において知られており、Ｎａｌｄｉｎｉら（ｌ９９６ａ、ｌ９９６ｂ、および１９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、（１９９７）；Ｄｕｌｌら、１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号；および第５，９９４，１３６号を参照されたい（それらの多くは、本明細書で企図されたウイルスベクターまたはトランスファープラスミドを作製するように適応し得る）。
【0097】
様々な実施形態において、本明細書に開示された融合タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、標的細胞へ、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスを細胞へ形質導入することにより導入される。アデノウイルスに基づいたベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率の能力があり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高い力価および高いレベルの発現が得られている。このベクターは、相対的に単純な系において大量に産生され得る。たいていのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅｌａ、Ｅｌｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作され、その後、その複製欠損ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞において増殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉内で見出される細胞などの非分裂性の分化細胞を含む複数の型の組織をインビボで形質導入することができる。通常のＡｄベクターは、大きな運搬能を有する。
【0098】
複製欠損である、現在のアデノウイルスベクターの生成および伝播は、２９３と名付けられた固有のヘルパー細胞株を利用し得、その細胞株は、ヒト胚性腎臓細胞からＡｄ５ ＤＮＡ断片により形質転換され、Ｅｌタンパク質を構成的に発現する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムからなくても済むため（Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｓｈｅｎｋ、１９７８）、２９３細胞の助けを借りる現在のアデノウイルスベクターは、Ｅｌ、Ｅ３、または両方のいずれかの領域において外来ＤＮＡを有する（Ｇｒａｈａｍ ＆ Ｐｒｅｖｅｃ、１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ－Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ、１９９２；Ｇｒａｈａｍ ＆ Ｐｒｅｖｅｃ、１９９２）に用いられている。異なる組織へ組換えアデノウイルスを投与することにおける研究には、気管滴下（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚ ＆ Ｇｅｒａｒｄ、１９９３）、および脳への定位接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅら、１９９３）が挙げられる。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３～９（１９９８））。
【0099】
様々な実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、対象の標的細胞へ、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペスウイルス、例えば、ＨＳＶ－ｌ、ＨＳＶ－２を細胞に形質導入することにより導入される。
【0100】
成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを含む、エンベロープ型正二十面体カプシドからなる。一実施形態において、ＨＳＶに基づいたウイルスベクターは、１つまたは複数の必須または非必須のＨＳＶ遺伝子が欠損している。一実施形態において、ＨＳＶに基づいたウイルスベクターは、複製欠損である。たいていの複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を防止するために１つまたは複数の最初期、初期、または後期ＨＳＶ遺伝子を除去する欠失を含有する。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびそれらの組合せからなる群から選択される最初期遺伝子が欠損し得る。ＨＳＶベクターの利点は、結果として長期ＤＮＡ発現を生じ得る、潜伏期を進入できるその能力、および最大２５ｋｂまでの外因性ＤＮＡ挿入断片を収容できるその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶに基づいたベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、第５，８４６，７８２号、および第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願ＷＯ９１／０２７８８、ＷＯ９６／０４３９４、ＷＯ９８／１５６３７、およびＷＯ９９／０６５８３に記載されている（それらのそれぞれは、全体として参照により本明細書に組み入れられている）。
【0101】
Ｖ． 融合タンパク質を発現する細胞
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載された融合タンパク質を発現する細胞を提供する。細胞は、上記で記載されているような融合タンパク質をコードするベクターをトランスフェクトされ得る。一実施形態において、細胞は原核細胞である。別の実施形態において、細胞は真核細胞である。なお別の実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、細胞はヒト細胞である。別の実施形態において、細胞は、ＴＤＰ－４３媒介性障害を患っておりまたは患うリスクがある患者に由来するヒト細胞であり、そのＴＤＰ－４３媒介性障害には、ＡＬＳ、ＦＴＤ、およびアルツハイマー病が挙げられるが、それらに限定されない。細胞は神経細胞または筋肉細胞であり得る。
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載された融合タンパク質を発現する細胞を提供する。細胞は、上記で記載されているような融合タンパク質をコードするベクターをトランスフェクトされ得る。一実施形態において、細胞は原核細胞である。別の実施形態において、細胞は真核細胞である。なお別の実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、細胞はヒト細胞である。別の実施形態において、細胞は、ＴＤＰ－４３媒介性障害を患っておりまたは患うリスクがある患者に由来するヒト細胞であり、そのＴＤＰ－４３媒介性障害には、ＡＬＳ、ＦＴＤ、およびアルツハイマー病が挙げられるが、それらに限定されない。細胞は神経細胞または筋肉細胞であり得る。
【0102】
融合タンパク質を発現する細胞は、融合タンパク質を産生することにおいて有用であり得る。この実施形態において、細胞は、融合タンパク質を過剰発現するベクターをトランスフェクトされる。融合タンパク質は、任意選択で、エピトープ、例えば、（それぞれ、プロテインＡカラムまたは抗ＦＬＡＧ抗体カラムを用いる）精製を促進する、本明細書に記載されているようなヒトＦｃドメインまたはＦＬＡＧエピトープを含有し得る。エピトープは、融合タンパク質の残りの部分と、リンカー、または精製中もしくは後にエピトープが融合タンパク質から除去され得るようにプロテアーゼ基質配列を介して、接続され得る。
【0103】
融合タンパク質を発現する細胞はまた、治療関連において有用であり得る。一実施形態において、細胞は、治療を必要とする患者（例えば、ＴＤＰ－４３媒介性障害を患っておりまたは患うリスクがある患者）から収集される。一実施形態において、細胞は神経細胞である。その後、収集された細胞は、融合タンパク質を発現するベクターをトランスフェクトされる。その後、トランスフェクト細胞は、トランスフェクト細胞について濃縮または選択するように処理され得る。トランスフェクト細胞はまた、細胞の異なる型、例えば、神経細胞へ分化するように処置され得る。処理後、トランスフェクト細胞は、患者へ投与され得る。一実施形態において、細胞は、くも膜下腔内注射、頭蓋内注射、または脳室内注射による中枢神経系への定方向的注射（directed injection）により、投与される。
【0104】
代替の実施形態において、融合タンパク質の分泌型を発現する細胞が用いられ得る。例えば、融合タンパク質構築物は、Ｎ末端にシグナル配列を有するようにデザインされ得る。代表的なシグナル配列は下記の表７に示されている。
【0105】
【表7】
【0106】
したがって、一実施形態において、本融合タンパク質は、シグナル配列および融合タンパク質を含み、前記シグナル配列が配列番号９８～１００からなる群から選択され、前記融合タンパク質がＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む。一実施形態において、シグナル配列は、配列番号９８～１００からなる群から選択され、融合タンパク質は、配列番号８０～８５、８９～９０、および９２～９６からなる群から選択される。別の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号９８のシグナル配列、ならびに配列番号８０～８５、８９～９０、および９２～９６からなる群から選択される融合タンパク質を含む。別の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号９９のシグナル配列、ならびに配列番号８０～８５、８９～９０、および９２～９６からなる群から選択される融合タンパク質を含む。別の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号１００のシグナル配列、ならびに配列番号８０～８５、８９～９０、および９２～９６からなる群から選択される融合タンパク質を含む。シグナル配列を含む融合タンパク質構築物を発現する細胞は、対象、例えばヒト対象（例えば、ＴＤＰ－４３障害を有し、または患うリスクがある患者）へ投与され得る。本融合タンパク質は、細胞から分泌され、ＴＤＰ－４３タンパク質凝集および／または関連細胞毒性を低下させるのを助ける。
【0107】
上記で記載されているように、ある特定の実施形態において、本融合タンパク質はさらに、細胞透過性ペプチドを含み得る。シグナル配列および細胞透過性ペプチドを含む融合タンパク質を発現する細胞は、シグナル配列を欠く融合タンパク質を分泌する能力がある。細胞透過性ペプチドも含む分泌性融合タンパク質は、その後、すぐ近くの細胞に進入する能力があり、それらの細胞において、ＴＤＰ－４３タンパク質により媒介される凝集および／または細胞毒性を低下させる潜在能力を有する。
【0108】
ＶＩ． 使用の方法
別の態様において、本発明は、障害において、および／またはＴＤＰ－４３凝集により媒介されるＴＤＰ－４３障害、障害、もしくは状態において、有益な効果を達成するための方法を提供する。ＴＤＰ－４３障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、レビー小体型認知症、および辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症からなる群から選択される。
別の態様において、本発明は、障害において、および／またはＴＤＰ－４３凝集により媒介されるＴＤＰ－４３障害、障害、もしくは状態において、有益な効果を達成するための方法を提供する。ＴＤＰ－４３障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、海馬硬化症、レビー小体型認知症、および辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症からなる群から選択される。
【0109】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＴＤＰ－４３疾患、障害、または状態を有する、ヒトなどの対象を処置するための方法であって、治療的または予防的有効量の融合タンパク質、そのような融合タンパク質をコードする核酸、または本明細書に記載されたそのような融合タンパク質をコードするウイルスベクターを対象へ投与するステップを含み、前記投与が、結果として、ＴＤＰ－４３疾患、障害、または状態に関連した１つまたは複数の生化学的もしくは生理学的パラメータまたは臨床エンドポイントの向上を生じる、方法を提供する。
【0110】
他の実施形態において、本発明は、細胞におけるＴＤＰ－４３の凝集を低下させる方法を提供する。細胞は、培養細胞または単離された細胞であり得る。細胞はまた、対象、例えば、ヒト対象の由来であり得る。一実施形態において、細胞は、ヒト対象の中枢神経系内にある。別の実施形態において、ヒト対象は、ＴＤＰ－４３障害を患っておりまたは患うリスクがあり、そのＴＤＰ－４３障害には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、およびアルツハイマー病が挙げられるが、それらに限定されない。一つの特定の実施形態において、ＴＤＰ－４３障害は筋萎縮性側索硬化症である。
【0111】
ＴＤＰ－４３タンパク質の凝集は、いくつかの方法で検出され得る。一例において、凝集したＴＤＰ－４３タンパク質は、遊離（すなわち、可溶性）ＴＤＰ－４３含有タンパク質から、溶解性に基づいて、例えば、細胞可溶化物の選択的フィルターを通しての通過により不溶性凝集物をトラップすることにより、区別され得る。凝集していないタンパク質は、これらのフィルターを通過し、一方、凝集物は、フィルター上に保持され、それは、様々な試薬を用いて検出され得、その試薬には、ＴＤＰ－４３タンパク質に対して方向づけられた抗体が挙げられる。本明細書に記載されているような、融合タンパク質、融合タンパク質を発現する細胞、または融合タンパク質をコードする核酸、ベクター、もしくはウイルス粒子で処理された細胞試料の可溶化液における、トラップされた凝集タンパク質の量は、未処理のまたは対照処理された細胞からの可溶化液と比較することができ、その場合、対照試料と比較しての、処理された試料における凝集ＴＤＰ－４３タンパク質の量の低下は、前記融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸、ベクター、もしくはウイルス粒子の有効性を示している（例えば、Ｋｉｍら、（２０１４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３４：６４３～６５２、および実施例１参照）。対照と比較した場合の、凝集ＴＤＰ－４３タンパク質におけるより大きい低下は、より高い効力を示す。ＴＤＰ－４３タンパク質の凝集の低下はまた、細胞において、例えば、ＴＤＰ－４３タンパク質を検出する標識試薬での免疫蛍光顕微鏡法を用いて、直接的に検出することができる（例えば、Ｄｉｎｇら、（２０１５）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、６：２４１７８～２４１９１；Ｃｈｏｕら、（２０１５）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２４：５１５４～５１７３、および実施例１を参照）。ある特定の実施形態において、対照と比較した場合のＴＤＰ－４３ポリペプチドレベルのより大きい低下は、より高い効力を示す。
【0112】
したがって、一実施形態において、方法は、未処理または対照細胞と比較して、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、ＴＤＰ－４３タンパク質の凝集を低下させるのに有効な融合タンパク質または前記融合タンパク質をコードする核酸、ベクター、もしくはウイルス粒子の量と、細胞を接触させるステップを含む。
【0113】
下記の実施例１に示されているように、ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む融合タンパク質の発現が、ＴＤＰ－４３含有レポーター構築物の全体的なレベルを低下させることが見出されている。したがって、別の実施形態において、方法は、未処理または対照細胞と比較して、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、ＴＤＰ－４３タンパク質のレベルを低下させるのに有効な、融合タンパク質、前記融合タンパク質を発現する細胞、または前記融合タンパク質をコードする核酸、ベクター、もしくはウイルス粒子の量と、細胞を接触させるステップを含む。
【0114】
ＶＩＩ． 薬学的組成物
本明細書で企図された組成物は、本明細書で企図されているような、ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む１つまたは複数の融合タンパク質、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、それを含むベクター、遺伝子修飾された細胞などを含み得る。組成物は、薬学的組成物が挙げられるが、それに限定されない。「薬学的組成物」は、単独かまたは１つもしくは複数の他の治療モダリティーと組み合わせての細胞または動物への投与のための薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液として製剤化された組成物を指す。必要に応じて、組成物は、なお他の作用物質、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の様々な薬学的活性物質も組み合わせて、投与され得ることも理解されるであろう。追加の作用物質が、意図された治療を送達する本組成物の能力に悪影響を及ぼさないならば、本組成物にまた含まれ得る他のコンポーネントに、事実上、制限はない。
本明細書で企図された組成物は、本明細書で企図されているような、ＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む１つまたは複数の融合タンパク質、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、それを含むベクター、遺伝子修飾された細胞などを含み得る。組成物は、薬学的組成物が挙げられるが、それに限定されない。「薬学的組成物」は、単独かまたは１つもしくは複数の他の治療モダリティーと組み合わせての細胞または動物への投与のための薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液として製剤化された組成物を指す。必要に応じて、組成物は、なお他の作用物質、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の様々な薬学的活性物質も組み合わせて、投与され得ることも理解されるであろう。追加の作用物質が、意図された治療を送達する本組成物の能力に悪影響を及ぼさないならば、本組成物にまた含まれ得る他のコンポーネントに、事実上、制限はない。
【0115】
句「薬学的に許容される」は、合理的な利益／リスク比に釣り合って、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して用いるのに、健全な医学的判断の範囲内において、適している、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すように、本明細書で用いられる。
【0116】
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される担体」、「希釈剤」、または「賦形剤」には、ヒトまたは家畜における使用について容認できるとして、米国食品医薬品局によって認可されている、非限定的に、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味料、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶剤、界面活性剤、または乳化剤が挙げられる。例示的な薬学的に許容される担体には、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；コーン（com）スターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター、ワックス、動物および植物脂肪、パラフィン、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン（com）油、およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリーの水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；ならびに薬学的製剤中に用いられる任意の他の適合性物質が挙げられるが、それらに限定されない。
【0117】
ＶＩＩＩ． 投薬量
本明細書に記載された組成物（例えば、融合タンパク質構築物、核酸、または遺伝子治療ウイルス粒子を含む組成物）の投薬量は、本化合物の薬力学的性質；投与の様式；レシピエントの年齢、健康、および体重；症状の性質および程度；処置の頻度、およびもしあれば、同時処置の型；ならびに処置されることになっている動物における本化合物のクリアランス速度などの多くの因子に依存して変動し得る。本明細書に記載された組成物は、臨床応答に依存して、必要に応じて調整され得る、適切な投薬量で、最初、投与され得る。いくつかの態様において、組成物の投薬量は、予防的または治療的有効量である。
本明細書に記載された組成物（例えば、融合タンパク質構築物、核酸、または遺伝子治療ウイルス粒子を含む組成物）の投薬量は、本化合物の薬力学的性質；投与の様式；レシピエントの年齢、健康、および体重；症状の性質および程度；処置の頻度、およびもしあれば、同時処置の型；ならびに処置されることになっている動物における本化合物のクリアランス速度などの多くの因子に依存して変動し得る。本明細書に記載された組成物は、臨床応答に依存して、必要に応じて調整され得る、適切な投薬量で、最初、投与され得る。いくつかの態様において、組成物の投薬量は、予防的または治療的有効量である。
【0118】
ＩＸ． キット
（ａ）本明細書に記載された、細胞または対象においてＴＤＰ－４３タンパク質の凝集を低下させる、融合タンパク質構築物、そのような融合タンパク質をコードする核酸、またはそのような核酸を包含するウイルス粒子を含む薬学的組成物、および（ｂ）本明細書に記載された方法のいずれかを実施するための使用説明書を含む添付文書を含むキットが企図される。いくつかの態様において、キットは、（ａ）本明細書に記載された細胞または対象においてＴＤＰ－４３タンパク質の凝集を低下させる、本明細書に記載された組成物を含む薬学的組成物、（ｂ）追加の治療剤、および（ｃ）本明細書に記載された方法のいずれかを実施するための使用説明書を含む添付文書を含む。
（ａ）本明細書に記載された、細胞または対象においてＴＤＰ－４３タンパク質の凝集を低下させる、融合タンパク質構築物、そのような融合タンパク質をコードする核酸、またはそのような核酸を包含するウイルス粒子を含む薬学的組成物、および（ｂ）本明細書に記載された方法のいずれかを実施するための使用説明書を含む添付文書を含むキットが企図される。いくつかの態様において、キットは、（ａ）本明細書に記載された細胞または対象においてＴＤＰ－４３タンパク質の凝集を低下させる、本明細書に記載された組成物を含む薬学的組成物、（ｂ）追加の治療剤、および（ｃ）本明細書に記載された方法のいずれかを実施するための使用説明書を含む添付文書を含む。
【実施例】
【0119】
Ｊドメインが、凝集タンパク質の適切なフォールディングを促進するように特定的に操作され得るかどうかを試験するために、本発明者らは、ＴＤＰ－４３タンパク質を標的化するようにデザインされたいくつかの融合タンパク質構築物をデザインし、試験した。
【0120】
実施例１：融合タンパク質デザイン
Ａ． 方法
一般的な技術および材料
本発明の実施は、他に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの通常の技術を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１；「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７；シリーズ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；「ＰＣＲ ２：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ、およびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」 Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８；「Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第１１版、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、２００５；ならびにＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ、２０００（それらの内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている）参照。ＨＥＫ－２９３細胞（ヒト胚性腎臓細胞）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入された。抗ＦＬＡＧ抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入された。ウサギ抗ＧＦＰ抗体は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入された。精製および特徴づけを容易にするために、この実施例１に用いられる融合タンパク質構築物のいくつかは、配列番号８０～８５および８９～９６に提供された配列に加えて、配列番号６８のＦＬＡＧエピトープを、そのタンパク質のＣ末端かまたはＮ末端のいずれかに、短いリンカー配列に加えて、含有する。
Ａ． 方法
一般的な技術および材料
本発明の実施は、他に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの通常の技術を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１；「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７；シリーズ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；「ＰＣＲ ２：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ、およびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」 Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８；「Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第１１版、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、２００５；ならびにＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ、２０００（それらの内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている）参照。ＨＥＫ－２９３細胞（ヒト胚性腎臓細胞）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入された。抗ＦＬＡＧ抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入された。ウサギ抗ＧＦＰ抗体は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入された。精製および特徴づけを容易にするために、この実施例１に用いられる融合タンパク質構築物のいくつかは、配列番号８０～８５および８９～９６に提供された配列に加えて、配列番号６８のＦＬＡＧエピトープを、そのタンパク質のＣ末端かまたはＮ末端のいずれかに、短いリンカー配列に加えて、含有する。
【0121】
ＨＥＫ２９３細胞におけるタンパク質の発現および検出
様々なタンパク質構築物をコードする発現ベクタープラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞へ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、トランスフェクトした。細胞可溶化物を、発現したタンパク質について、イムノブロットアッセイを用いて分析した。培地の試料を、分析前に、遠心分離して、デブリを除去した。細胞を、２ｍＭ ＰＭＳＦおよびプロテアーゼカクテル（完全プロテアーゼ阻害剤カクテル；Ｓｉｇｍａ）を含有する溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ）中に溶解した。短時間の超音波処理後、試料を、発現したタンパク質について、イムノブロットアッセイを用いて分析した。イムノブロット分析について、試料を、ＳＤＳ試料バッファー中で煮沸し、ポリアクリルアミド電気泳動に流した。その後、分離されたタンパク質バンドを、ＰＶＤＦ膜へ転写した。
様々なタンパク質構築物をコードする発現ベクタープラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞へ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、トランスフェクトした。細胞可溶化物を、発現したタンパク質について、イムノブロットアッセイを用いて分析した。培地の試料を、分析前に、遠心分離して、デブリを除去した。細胞を、２ｍＭ ＰＭＳＦおよびプロテアーゼカクテル（完全プロテアーゼ阻害剤カクテル；Ｓｉｇｍａ）を含有する溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ）中に溶解した。短時間の超音波処理後、試料を、発現したタンパク質について、イムノブロットアッセイを用いて分析した。イムノブロット分析について、試料を、ＳＤＳ試料バッファー中で煮沸し、ポリアクリルアミド電気泳動に流した。その後、分離されたタンパク質バンドを、ＰＶＤＦ膜へ転写した。
【0122】
発現したタンパク質を、化学発光シグナルを用いて検出した。簡単に述べれば、ブロットを、特定のエピトープ（例えば、ＧＦＰ）を結合する能力がある一次抗体と反応させた。反応していない一次抗体を洗い流した後、酵素連結型二次抗体（例えば、ＨＲＰ連結型抗ＩｇＧ抗体）を、ブロットと結合した一次抗体分子と反応させた。すすいだ後、化学発光試薬を加え、ブロットにおいて結果として生じた化学発光シグナルを、Ｘ線フィルム上に捕獲した。
【0123】
蛍光顕微鏡法
場合によっては、ＴＤＰ－４３（Ｃ末端断片の完全長）ＧＦＰレポーター構築物（下記）の凝集を、インビボで蛍光顕微鏡法を用いて、検出した。レポーター構築物、加えてＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む融合タンパク質を発現する培養細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドを用いて５分間固定した。ＰＢＳでの３回の５分間洗浄後、核ＤＮＡをＤＡＰＩで染色した。トランスフェクト細胞におけるＴＤＰ－４３（ＧＦＰ病巣）を含有する細胞のパーセンテージをカウントした。
場合によっては、ＴＤＰ－４３（Ｃ末端断片の完全長）ＧＦＰレポーター構築物（下記）の凝集を、インビボで蛍光顕微鏡法を用いて、検出した。レポーター構築物、加えてＪドメインおよびＴＤＰ－４３結合性ドメインを含む融合タンパク質を発現する培養細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドを用いて５分間固定した。ＰＢＳでの３回の５分間洗浄後、核ＤＮＡをＤＡＰＩで染色した。トランスフェクト細胞におけるＴＤＰ－４３（ＧＦＰ病巣）を含有する細胞のパーセンテージをカウントした。
【0124】
分画アッセイ
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル、２ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＮａＦ、および２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４を追加したＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）においてホモジナイズする。短時間の超音波処理後、タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）により測定する。等しいタンパク質量を、１６，０００ｘｇ、４℃、３０分間の遠心分離により遠沈して、可溶性画分（上清）および不溶性画分（ペレット）へ分画する。不溶性画分をさらに、ＳＤＳ溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％ＳＤＳ）中に可溶化する。可溶性画分および不溶性画分の両方を、還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥへアプライし、その後、抗ＧＦＰ抗体でのイムノブロッティングアッセイに供した。
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル、２ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＮａＦ、および２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４を追加したＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）においてホモジナイズする。短時間の超音波処理後、タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）により測定する。等しいタンパク質量を、１６，０００ｘｇ、４℃、３０分間の遠心分離により遠沈して、可溶性画分（上清）および不溶性画分（ペレット）へ分画する。不溶性画分をさらに、ＳＤＳ溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％ＳＤＳ）中に可溶化する。可溶性画分および不溶性画分の両方を、還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥへアプライし、その後、抗ＧＦＰ抗体でのイムノブロッティングアッセイに供した。
【0125】
Ｂ． レポーター構築物
本発明者らはまず、ＴＤＰ－４３を標的化する本発明の融合分子が、培養細胞においてその凝集を改善するかどうかを調べた。この目的を達成するために、本発明者らは、ＧＦＰが完全長ヒトＴＤＰ－４３タンパク質かまたはＣ末端断片ＴＤＰ－４３（細胞質内凝集および細胞毒性を形成することが知られている）かのいずれかのＣ末端に融合している、ＧＦＰに基づいたレポーター構築物ＧＦＰ－ＴＤＰ４３およびＧＦＰ－ＴＤＰ４３を作製した（下記の表８参照）。ＨＥＫ２９３細胞を、培養し、ＧＦＰ融合体［ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬ（配列番号１０１）またはＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦ（配列番号１０２）］として完全長ＴＤＰ４３、またはＣ末端２０７アミノ酸ＴＤＰ－４３（ヒトＴＤＰ－４３のアミノ酸２０８～４１４）を含有するＴＤＰ４３のＣ末端断片をコードするプラスミドを、トランスフェクトした。本発明者らは、以前に報告されているように（Ｚｈａｎｇら、（２００９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、１０６（１８）：７６０７～１２）、発現したＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬの大部分が細胞の核に局在し（図３、パネル１）、一方、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦが細胞質内封入体を生成した（図３、パネル５）ことを見出した。
本発明者らはまず、ＴＤＰ－４３を標的化する本発明の融合分子が、培養細胞においてその凝集を改善するかどうかを調べた。この目的を達成するために、本発明者らは、ＧＦＰが完全長ヒトＴＤＰ－４３タンパク質かまたはＣ末端断片ＴＤＰ－４３（細胞質内凝集および細胞毒性を形成することが知られている）かのいずれかのＣ末端に融合している、ＧＦＰに基づいたレポーター構築物ＧＦＰ－ＴＤＰ４３およびＧＦＰ－ＴＤＰ４３を作製した（下記の表８参照）。ＨＥＫ２９３細胞を、培養し、ＧＦＰ融合体［ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬ（配列番号１０１）またはＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦ（配列番号１０２）］として完全長ＴＤＰ４３、またはＣ末端２０７アミノ酸ＴＤＰ－４３（ヒトＴＤＰ－４３のアミノ酸２０８～４１４）を含有するＴＤＰ４３のＣ末端断片をコードするプラスミドを、トランスフェクトした。本発明者らは、以前に報告されているように（Ｚｈａｎｇら、（２００９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、１０６（１８）：７６０７～１２）、発現したＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬの大部分が細胞の核に局在し（図３、パネル１）、一方、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦが細胞質内封入体を生成した（図３、パネル５）ことを見出した。
【0126】
【表8】
【0127】
Ｃ． 融合タンパク質構築物
本発明の融合タンパク質がＴＤＰ－４３凝集を低下させるために用いることができるかどうかを決定するために、最初の実験をまず、ＧＦＰを認識する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）とコンジュゲートされた、ヒトＨｓｐ４０ Ｊドメインタンパク質に由来したＪドメイン配列を含む融合タンパク質の同時発現により行った（データ未呈示）。驚くべきことに、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦがこの構築物と共に発現した場合、凝集のほとんどが消失したが、ＧＦＰ ｓｃＦｖ（Ｊドメイン配列なし）がＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦと共に発現した場合、有意な効果は観察されなかった。これは、ＴＤＰ－４３凝集が、Ｈｓｐ７０媒介性経路を用いて解決され得ることを示唆した（未呈示）。
本発明の融合タンパク質がＴＤＰ－４３凝集を低下させるために用いることができるかどうかを決定するために、最初の実験をまず、ＧＦＰを認識する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）とコンジュゲートされた、ヒトＨｓｐ４０ Ｊドメインタンパク質に由来したＪドメイン配列を含む融合タンパク質の同時発現により行った（データ未呈示）。驚くべきことに、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦがこの構築物と共に発現した場合、凝集のほとんどが消失したが、ＧＦＰ ｓｃＦｖ（Ｊドメイン配列なし）がＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦと共に発現した場合、有意な効果は観察されなかった。これは、ＴＤＰ－４３凝集が、Ｈｓｐ７０媒介性経路を用いて解決され得ることを示唆した（未呈示）。
【0128】
その後、本発明者らは、表９に描かれているような一連の融合タンパク質構築物をデザインした。
【0129】
【表9】
【0130】
最初の実験を、ＴＤＰ－４３凝集を低下させることにおける融合タンパク質構築物の能力を試験するために行った。構築物３（ＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ））、ならびにコンパニオン対照の構築物２（ＴＤＰ－４３結合性ドメインのみ）および構築物４（Ｊドメインの保存ＨＰＤモチーフ内に変異Ｐ３３Ｑを含有することを除いて、構築物３と同じ）を、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬレポーター構築物かまたはＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦレポーター構築物のいずれかを発現する細胞へトランスフェクトした。図３は、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦレポーター構築物を発現する細胞におけるＧＦＰ構築物の凝集が、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬを発現する細胞においてより多いことを示している。構築物３を発現する細胞は、凝集の実質的な低下を示したが、対照（構築物２および構築物４）の発現は、凝集を低下させなかった（図４；下記の表１０も参照）。Ｐ３３Ｑを含有する構築物４における活性の欠如は、凝集を低下させる能力が、Ｈｓｐ７０経路を通して作用するＪドメインにより駆動されることを強く示唆している。
【0131】
【表10】
【0132】
これらの細胞の細胞抽出物を、ＧＦＰ含有レポーター構築物またはＦＬＡＧエピトープ含有融合タンパク質構築物、それぞれのレベルを決定するために抗ＧＦＰ抗体かまたは抗ＦＬＡＧ抗体のいずれかを用いるイムノブロットを用いて、分析した（図５）。ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬを発現する細胞抽出物は、抗ＧＦＰ抗体で探索した場合、顕著な約７０ｋＤａバンドの存在を示すが、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦを発現する細胞は約５０ｋＤａバンドの存在を示す。興味深いことに、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦレポーターを有し、かつまた構築物３（ＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ））も発現する細胞は、陰性対照の、ｓｃＦｖ対照（構築物２）またはＰ３３Ｑ変異体（構築物４）と比較した場合、レポータータンパク質の量の著しい低下を示す。完全長レポーター構築物（ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬ）のレベルにおける差は見られなかった。
【0133】
ＴＤＰ－４３レベルの低下が、タンパク質凝集に依存するかどうかを調べるために、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬかまたはＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦのいずれかを発現し、かつまた構築物２または３を発現する細胞の抽出物を、可溶性（非凝集型）および不溶性（凝集型）画分へ分画し、抗ＧＦＰ抗体で探索することによりレポーターの存在について検出した。図６に示されているように、完全長レポーター（ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬ）を発現する細胞において、可溶性画分と不溶性画分の両方におけるレポーターのレベルの有意な変化はない。対照的に、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦレポーターを発現する細胞において、構築物３（ＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ））を発現する細胞の可溶性画分にレポーターの中程度の減少が見られたが、構築物２（ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ））を発現する細胞では見られなかった。対照的に、不溶性画分（おそらく、凝集型）において、レポーターのほとんど完全な消失である、レポーターのレベルの有意な低下がある。
【0134】
総合すれば、これらのデータは、融合タンパク質が、細胞においてＴＤＰ－４３のレベルを低下させることができ、凝集ＴＤＰ４３タンパク質のクリアランスを優先的に加速するように働き得ることを強く示唆している。
【0135】
上記の結果に基づいて、Ｊドメインに対するＴＤＰ－４３結合性ドメインの異なる立体配置を含有するいくつかの追加の構築物（構築物５～７）を、作製した。これらの構築物を、凝集を低下させるそれらの能力について試験した。これらの新しい構築物を、構築物３（ＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ））、加えて、何も発現しない細胞（陰性対照）またはｓｃＦｖ単独（構築物２）を発現する細胞と比較した。図７は、それらの実験の結果を示す（下記の表１１にも要約されている）。
【0136】
【表11】
【0137】
図７で見られるように、構築物３（ＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ））、構築物５（ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ）－ＪＢ１）、構築物６（ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ）－ＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ））、および構築物７（ＪＢ６－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ））は、陰性対照、および構築物２（ｓｃＦｖ単独）を発現する細胞と比較して、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬレポーター構築物を発現する細胞において凝集レベルの中程度の低下を示している。対照的に、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦ構築物を発現する細胞において、以前の観察と一致して、陰性対照、および構築物２を発現する細胞においてタンパク質凝集のより高い全体的なレベルがある。さらに、構築物３、構築物５、構築物６、および構築物７もまた発現する細胞は全て、タンパク質凝集の劇的に低下したレベルを有し、融合タンパク質の以下の立体配置が有効であることを実証している：ＤＮＡＪ－Ｔ、Ｔ－ＤＮＡＪ、Ｔ－ＤＮＡＪ－Ｔ（ここで、ＤＮＡＪはＪドメインであり、ＴはＴＤＰ－４３結合性ドメインである）。さらに、複数のＪドメイン（例えば、ＤｎａＪＢ１およびＤｎａＪＢ６由来）は、融合タンパク質において活性があることが見出された。その後、図８および９（下記の表１２も参照）に示されているように、追加の構築物を作製し、試験した。興味深いことに、ＴＤＰ－４３結合性ドメインなしでの完全長ＤｎａＪＢ１の発現は、ＴＤＰ－４３凝集を、構築物３（ＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ））による＞９０％低下と比較して、約４３％、低下させることができた。加えて、ＱＢＰ１ペプチドの２つのタンデムコピーを含有する構築物１４の発現もまた、凝集の実質的低下（約７１％低下）を示した。ＱＢＰ１は、以前、ＴＤＰ－４３と相互作用することが示された（例えば、Ｍｏｍｐｅａｎら、（２０１９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．６７５：１０８１１３参照）。したがって、複数のＴＤＰ－４３結合性ドメイン（ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ）およびＱＢＰ１）は、融合タンパク質に配置された場合、活性があることが見出された。さらに、細胞抽出物を、レポーター構築物のレベルを定量化するために抗ＧＦＰ抗体を用いるイムノブロッティングにより分析した場合（図９Ｂ）、構築物３（ＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ））、構築物９（完全長ＤｎａＪＢ１）、および構築物１４（ＪＢ１－２ＸＱＢＰ１）を発現する細胞は、レポーター構築物のより低いレベルを有することが見出された。
【0138】
【表12】
【0139】
下記の表１３および１４に示されているように、追加の構築物を試験した。
【0140】
【表13】
【0141】
【表14】
【0142】
上記で示されているように、代替Ｊドメイン（例えば、ＪＢ６およびＪＣ７ドメイン参照）を用いたものを含む多数の構築物は、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦ凝集を低下させることにおいて有効であった。他の融合タンパク質構築物は、ＤＮＡＪＣ６由来のＪドメインおよびＳＶ４０由来のＪドメインまたは細菌Ｊドメインタンパク質（ＤｎａＪ）もまた、他のレポーター構築物の凝集を低下させることにおいて有効であることが見出された（データ未呈示）。しかしながら、コンセンサスＨＰＤ配列を含まないＪドメインを含む構築物１６（表１参照、配列番号１６）は、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦレポーター構築物の凝集を低下させることができなかった。
【0143】
下記の表１５に示されているように、追加の構築物を試験した。ＤＮＡＪＢ１のＪドメインと融合した、ＴＤＰ－４３と結合するｓｃＦｖ ３Ｆ１０を用いる、構築物１３（ＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｆ１０）、配列番号９０）。ヒトＤｎａＪＡ１由来の二量体形成ドメインを含有する、構築物２０（ＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ）－ＤＤ）、配列番号９７。下記に示されているように、構築物１３は、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦの凝集を低下させる中程度の能力を示した。二量体形成ドメインを含有する構築物３である、構築物２０の発現は、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦ凝集の強力な低下を示した。二量体形成ドメインによる効果のさらなる増強は、いくつかの天然のＪドメインタンパク質に見出されたドメイン立体配置と一致して、おそらく二量体化構築物３とＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦの間の相互作用の増強による（Ｓｈａ （２０００）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ８（８）、７９９～８０７）。
【0144】
【表15】
【0145】
本発明者らは次に、凝集を低下させることにおける融合タンパク質の機構を調べた。ＨＥＫ２９３細胞に、ＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＦＬまたはＧＦＰ－ＴＤＰ４３ＣＴＦレポーター構築物を単独かまたは構築物３（ＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ））と共のいずれかで、トランスフェクトし、ＢＦＡ（バフィロマイシンＡ１、オートファジーの遅延相の阻害剤）またはＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）も加えた。図１０に示されているように、細胞の１０ｎＭまたは１００ｎＭ ＢＦＡでの処理は、用量依存的様式で、病原性ＴＤＰ４３の再出現を生じた。対照的に、０．１μＭまたは１．０μＭのＭＧ１３２での処理は、病原性ＴＤＰ４３形の蓄積に全くかほとんど効果を生じなかった。総合すれば、これらの結果は、融合タンパク質構築物が、シャペロン媒介性オートファジーを介してそれらの効果を発揮することを示唆している。
【0146】
実施例２
融合タンパク質構築物をコードするＡＡＶベクター
例示的な遺伝子治療ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ－アクチンプロモーターを含有するＣＡＧプロモーターの制御下での、表６の融合タンパク質構築物、具体的には構築物２、４、６、７、１７、および２０～３１、加えて対照構築物１（ＤｎａＪＢ１ Ｊドメインのみ）、ＧＦＰ（陰性対照）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを有するＡＡＶ９ベクターにより構築される。構築物をコードするｃＤＮＡは、コザック配列の下流に位置し、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨｐＡ）シグナルによってポリアデニル化される。カセット全体は、ＡＡＶ－２の２つの非コード末端逆位配列によって隣接されている。
融合タンパク質構築物をコードするＡＡＶベクター
例示的な遺伝子治療ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ－アクチンプロモーターを含有するＣＡＧプロモーターの制御下での、表６の融合タンパク質構築物、具体的には構築物２、４、６、７、１７、および２０～３１、加えて対照構築物１（ＤｎａＪＢ１ Ｊドメインのみ）、ＧＦＰ（陰性対照）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを有するＡＡＶ９ベクターにより構築される。構築物をコードするｃＤＮＡは、コザック配列の下流に位置し、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨｐＡ）シグナルによってポリアデニル化される。カセット全体は、ＡＡＶ－２の２つの非コード末端逆位配列によって隣接されている。
【0147】
組換えＡＡＶベクターは、上記のものと類似したバキュロウイルス発現系を用いて調製される（Ｕｒａｂｅら、２００２；Ｕｎｚｕら、２０１１（Ｋｏｔｉｎ、２０１１に概説されている））。簡単に述べれば、複製およびパッケージングのためのＲＥＰをコードする１つ、ＡＡＶ９のカプシドについてのＣＡＰ－５をコードする１つ、および発現カセットを有する１つである、３つの組換えバキュロウイルスが、ＳＦ９昆虫細胞に感染するために用いられる。精製は、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速アフィニティ媒体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて実施される。ベクターは、導入遺伝子についてのプライマー－プローブの組合せでのＱＰＣＲを用いて滴定され、力価は、１ｍｌあたりのゲノムコピー数（ＧＣ／ｍｌ）として表される。ベクターの力価は、およそ８×１０１３～２×１０１４ＧＣ／ｍｌの間である。
【0148】
実施例３
ＡＬＳのマウスモデルにおける発現および効力の試験
まず、構築物３の発現を確認するために、および発現が動物に有害効果を生じるかどうかを確かめるために、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて実験を行った。上記に記載されているような対照かまたは構築物３のいずれかを含有する６×１０１０ｖｇ ＡＡＶｒｈ１０カプシドを、下記の表１６に示されているように、くも膜下腔内注射かまたは脳室内注射のいずれかにより注射した。
ＡＬＳのマウスモデルにおける発現および効力の試験
まず、構築物３の発現を確認するために、および発現が動物に有害効果を生じるかどうかを確かめるために、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて実験を行った。上記に記載されているような対照かまたは構築物３のいずれかを含有する６×１０１０ｖｇ ＡＡＶｒｈ１０カプシドを、下記の表１６に示されているように、くも膜下腔内注射かまたは脳室内注射のいずれかにより注射した。
【0149】
【表16】
【0150】
マウスを、運動失調、後肢虚弱、または足の引きずりについて観察した。ＡＡＶ注射から１週間後、体重測定および臨床観察を毎週、行った。３週間目、マウス（ｎ＝３）を、ＣＯ２により人道的に安楽死させて、ＡＡＶ発現を確認した。ＩＣＶまたはＩＴ注射後の３週間の間、体重の差は見出されなかった（データ未呈示）。図１５に示されているように、くも膜下腔内（図１５Ｂ）またはＩＣＶ（図１５Ｃ）注射により注射されたマウスは、大脳抽出物のイムノブロットを用いて検出された場合、構築物３の発現を生じたが、対照マウスにおいては検出されなかった。さらに、発現が、ＩＣＶ注射後の８週間目において、３週間目より有意に高いことが見出された。
【0151】
上記で調製されたベクターを、新規なＡＡＶ ＮＥＦＨ－ｔＴＡ × ｈＴＤＰ－４３ΔＮＬＳの２遺伝子組換えマウス（ｒＮＬＳマウス）のＴＤＰ－４３関連病態に関して試験した。このモデルは、病原性ＴＤＰ－４３（ヒトＴＤＰ－４３ΔＮＬＳ）を発現する、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）抑制性構築物を有する。ＤＯＸの除去により、ＴＤＰ－４３ΔＮＬＳ発現は、動物の急速かつ進行性の悪化を引き起こして、重度の体重減少、および一般的には６～８週間以内に、死をもたらす。ＴＤＰ－４３ΔＮＬＳ媒介性病態の進行を遅くすることにおける構築物３（ＪＢ１－ｓｃＦｖ（３Ｂ１２Ａ）、配列番号８０）の効力を試験した。対照または構築物３を含有するＡＡＶ ｒｈ１０を、下記の表１７に示されているように、異なる群において、Ｐ１／Ｐ２に、２ｕｌ（最大４ｕｌ）の体積で一側性にＩＣＶ投与した。対照群１を除いて、ＤＯＸ除去は、５週間目に起こった。群における対照マウス
【0152】
【表17】
【0153】
体重を、離乳後毎週２回、測定した。試験の完了後、試料を、全ての生存するマウスから収集した。全脳を収集し、２つの半球へ分割した。１つの半球を重量測定し、ドライアイス上で凍結させた。２つ目の半球を、組織学評価のために４％ＰＦＡ中に固定した。
【0154】
図１６Ｂに示されているように、群２の対照マウスは、ＤＯＸ除去により、次の数週間にわたって有意に体重を減少し始め、結果として、群１とは統計的有意な体重相違を生じた。驚くべきことに、構築物３を発現する群３もまた、群２と比較した場合、統計的有意な体重増加を示した（群１が雄のみを含有することにより、群２および３についての結果は、性別差を考慮するために、雄の体重のみを示す）。
【0155】
生存率を調べた場合、本発明者らは、対照群２（ＤＯＸオフ）における動物が、急速に健康を損ない、１０週間目においてマウスのたった３７．５％（雄の０％）の生存率をもたらしたことを見出した。しかしながら、構築物３を発現するマウスは、１０週間目において１００％生存率を示し、群１（ＤＯＸオン）対照と区別できなかった。
【0156】
他の態様
この明細書で言及された全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個々に示されて、全体として参照により組み入れられているかのように同じ程度で、全体として参照により本明細書に組み入れられている。本出願における用語が、参照により本明細書に組み入れられた文書においてと異なって定義されていることが見出された場合、本明細書に提供された定義がその用語についての定義としての役割を果たすものとする。
この明細書で言及された全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個々に示されて、全体として参照により組み入れられているかのように同じ程度で、全体として参照により本明細書に組み入れられている。本出願における用語が、参照により本明細書に組み入れられた文書においてと異なって定義されていることが見出された場合、本明細書に提供された定義がその用語についての定義としての役割を果たすものとする。
【0157】
本発明は、その特定の態様に関連して記載されているが、本発明はさらに改変することができ、一般的に本発明の原理に従い、かつ当技術分野内での公知または慣習的な実施範囲内に入り、上記で示された本質的な特徴に適用することができような、本開示からの逸脱を含む、本発明の任意のバリエーション、使用、または適応を網羅することを、この出願は意図され、主張された範囲内に従うことは理解されるであろう。
【図1A-1】
【図1A-2】
【図1B-1】
【図1B-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10-1】
【図10-2】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【配列表】
【国際調査報告】