特表 2023-524437 ＣＤＫＬ５欠損症（ＣＤＤ）の治療において有用な組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-12

(54)【発明の名称】ＣＤＫＬ５欠損症（ＣＤＤ）の治療において有用な組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20230605BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230605BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230605BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20230605BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230605BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230605BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230605BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230605BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20230605BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230605BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230605BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20230605BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 Z

C12N7/01 ZNA

C12N15/867 Z

C12N15/861 Z

C12N5/10

A61P25/00

A61K35/76

A61K48/00

A61K9/10

A61P43/00 105

C12N15/12

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022565789

(86)(22)【出願日】2021-04-26

(85)【翻訳文提出日】2022-12-12

(86)【国際出願番号】 US2021029185

(87)【国際公開番号】W WO2021222118

(87)【国際公開日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】63/109,608

(32)【優先日】2020-11-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/091,032

(32)【優先日】2020-10-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/016,036

(32)【優先日】2020-04-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＬＡＢＲＡＳＯＬ

(71)【出願人】

【識別番号】502409813

【氏名又は名称】ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア

(74)【代理人】

【識別番号】110000741

【氏名又は名称】弁理士法人小田島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウイルソン，ジェームス・エム

(72)【発明者】

【氏名】シュミッド，ラルフ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA22

4C076BB13

4C076BB21

4C076BB40

4C076CC01

4C076FF70

4C084AA13

4C084MA23

4C084MA56

4C084MA66

4C084MA70

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZC01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087CA20

4C087MA23

4C087MA56

4C087MA66

4C087MA70

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZC01

(57)【要約】

ＡＡＶカプシドと、機能的ＣＤＫＬ５（ｈＣＤＫＬＫ５）をコードする核酸配列を含むベクターゲノムと、を有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。また、ｒＡＡＶを産生するために有用な産生系、ｒＡＡＶを含む薬学的組成物、及びＣＤＤを有する対象を治療する方法、又はＣＤＤの症状を改善する方法、又は有効量のｒＡＡＶを、それを必要とする対象に投与することを介して、ＣＤＤの進行を遅延させる方法も提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤＫＬ５欠損症（ＣＤＤ）を治療するために有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、
（ａ）ＡＡＶカプシドと、
（ｂ）（ａ）のＡＡＶカプシド中にパッケージされるベクターゲノムと、を含み、前記ベクターゲノムが、逆位末端反復（ＩＴＲ）、及び中枢神経系細胞におけるヒトＣＤＫＬ５（ｈＣＤＫＬ５）発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ｈＣＤＫＬ５をコードする核酸配列である、ｈＣＤＫＬ５コード配列を含み、前記ｈＣＤＫＬ５コード配列が、配列番号３（配列番号２２）のｎｔ６９９～３５８１、又は配列番号３（配列番号２２）のｎｔ６９９～３５８１と少なくとも約９５％同一である配列である、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項2】

前記ｈＣＤＬＫ５コード配列が、ｈＣＤＫＬ５転写バリアント１～３（ＮＭ＿００１０３７３４３．１（配列番号１６）、ＮＭ＿ＮＭ＿００１３２３２８９．２（配列番号１７）及びＮＭ＿００３１５９．２（配列番号１８））のうちのいずれか１つと８０％未満同一である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項3】

前記機能的ｈＣＤＫＬ５が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項4】

ＣＤＫＬ５欠損症（ＣＤＤ）を治療するために有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、
（ａ）ＡＡＶカプシドと、
（ｂ）のＡＡＶカプシド中にパッケージされるベクターゲノムと、を含み、前記ベクターゲノムが、逆位末端反復（ＩＴＲ）、及びヒトＣＤＫＬ５（ｈＣＤＫＬ５）発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ｈＣＤＫＬ５をコードする核酸配列である、ｈＣＤＫＬ５コード配列を含み、前記機能的ｈＣＤＫＬ５が、機能的ｈＣＤＫＬ５アイソフォーム２（ｈＣＤＫＬ５－２ＧＳ）、機能的ｈＣＤＫＬ５アイソフォーム３（ｈＣＤＫＬ５－３ＧＳ）又は機能的ｈＣＤＫＬ５アイソフォーム４（ｈＣＤＫＬ５－４ＧＳ）である、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項5】

前記ベクターゲノムが、配列番号６のアミノ酸配列を有する前記機能的ｈＣＤＫＬ５－２ＧＳをコードする核酸配列を含む、請求項４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項6】

前記ｈＣＤＫＬ５コード配列が、配列番号２４、又は配列番号６をコードする配列と少なくとも９５％同一の配列である、請求項４又は５に記載のｒＡＡＶ。

【請求項7】

前記ベクターゲノムが、配列番号８のアミノ酸配列を有する前記機能的ｈＣＤＫＬ５－３ＧＳをコードする核酸配列を含む、請求項４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項8】

前記ｈＣＤＫＬ５コード配列が、配列番号２５、又は配列番号８をコードする配列と少なくとも９５％同一の配列である、請求項４又は７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項9】

前記ベクターゲノムが、配列番号１０のアミノ酸配列を有する前記機能的ｈＣＤＫＬ５－４ＧＳをコードする核酸配列を含む、請求項４に記載のｒＡＡＶ系。

【請求項10】

前記ｈＣＤＫＬ５コード配列が、配列番号２６、又は配列番号１０をコードする配列と少なくとも９５％同一の配列である、請求項４又は９に記載のｒＡＡＶ。

【請求項11】

前記調節配列が、ニューロン特異的プロモーターを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項12】

前記調節配列が、ヒトシナプシンプロモーターを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項13】

前記調節配列が、構成的プロモーターを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項14】

前記調節配列が、ＣＢ７プロモーターを含む、請求項１～１０又は請求項１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項15】

前記調節配列が、ＵｂＣプロモーターを含む、請求項１～１０又は請求項１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項16】

調節エレメントが、Ｋｏｚａｋ配列、イントロン、エンハンサー、ＴＡＴＡシグナル、及びポリＡ配列のうちの１つ以上を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項17】

前記調節エレメントが、ＷＰＲＥエレメントを更に含む、請求項１～６又は１６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項18】

前記ベクターゲノムが、前記ｈＣＤＫＬ５の３’非翻訳領域に、少なくとも２つの背根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列のタンデムリピートを更に含み、前記少なくとも２つのタンデムリピートが、少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列、及び同じ又は異なり得る少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、ｍｉＲ１８３又はｍｉＲ１８２を標的とする、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項19】

前記発現カセットｍＲＮＡ又はＤＮＡプラス鎖の前記少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列及び／又は前記少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列が、（ｉ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（ｍｉＲ１８３、配列番号１１）、及び（ｉｉ）ＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号１２）である、請求項１～１６又は１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項20】

前記ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、スペーサーによって分離されており、各スペーサーが、独立して、（Ａ）ＧＧＡＴ、（Ｂ）ＣＡＣＧＴＧ、又は（Ｃ）ＧＣＡＴＧＣのうちの１つ以上から選択される、請求項１８又は１９に記載のｒＡＡＶ。

【請求項21】

前記ｍｉＲＮＡ標的配列間に位置する前記スペーサーが、前記第１のｍｉＲＮＡ標的配列の３’及び／又は最後のｍｉＲＮＡ標的配列の５’に位置し得る、請求項２０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項22】

前記ｍｉＲＮＡ標的配列間の前記スペーサーが、同じである、請求項２０又は２１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項23】

前記カプシドが、ＡＡＶｈｕ６８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、又はＡＡＶｒｈ９１カプシドである、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項24】

請求項１～２３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶのストックと、水性懸濁媒体と、を含む、組成物。

【請求項25】

前記懸濁液が、静脈内投与、髄腔内投与、大槽内投与、又は脳室内投与用に製剤化される、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

発現カセットを含むベクターであって、前記発現カセットが、ヒトｈＣＤＫＬ５（ｈＣＤＫＬ５）発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ヒトＣＤＫＬ５をコードする核酸配列である、ｈＣＤＫＬ５コード配列を含み、前記ｈＣＤＫＬ５コード配列が、配列番号２２、又は配列番号２２と少なくとも約９５％同一の配列である、ベクター。

【請求項27】

前記ベクターが、
組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、若しくは組換えアデノウイルスから選択されるウイルスベクター；又は
裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、若しくはキトサンベースの組成から選択される非ウイルスベクターである、請求項２６に記載のベクター。

【請求項28】

ＣＤＤを治療する方法であって、有効量の、請求項１～２３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、又は請求項２６若しくは２７に記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。

【請求項29】

請求項１～２３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを産生するために有用なｒＡＡＶ産生系であって、前記産生系が、
（ａ）クレードＦカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、
（ｂ）ベクターゲノムと、
（ｃ）前記ベクターゲノムを前記クレードＦカプシドにパッケージングするのを許可する十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能及びヘルパー機能と、を含む細胞培養物を含む、ｒＡＡＶ産生系。

【請求項30】

前記ベクターゲノムが、配列番号１である、請求項２９に記載のｒＡＡＶ産生系。

【請求項31】

前記ベクターゲノムが、配列番号２９である、請求項２９に記載のｒＡＡＶ産生系。

【請求項32】

前記ベクターゲノムが、配列番号３１である、請求項２９に記載のｒＡＡＶ産生系。

【請求項33】

前記細胞培養物が、ヒト胚性腎臓２９３細胞培養物である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ産生系。

【請求項34】

前記ＡＡＶ ｒｅｐが、異なるＡＡＶに由来する、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の系。

【請求項35】

前記ベクターゲノムが、配列番号３である、請求項２９に記載のｒＡＡＶ産生系。

【請求項36】

前記ベクターゲノムが、配列番号５である、請求項２９に記載のｒＡＡＶ産生系。

【請求項37】

前記ベクターゲノムが、配列番号７である、請求項２９に記載のｒＡＡＶ産生系。

【請求項38】

前記ベクターゲノムが、配列番号９である、請求項２９に記載のｒＡＡＶ産生系。

【請求項39】

発現カセットを含むベクターであって、前記発現カセットが、ヒトＣＤＫＬ５アイソフォーム２（ｈＣＤＫＬ５－２ＧＳ）発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ｈＣＤＫ
Ｌ５－２ＧＳをコードする核酸配列である、ｈＣＤＫＬ５－２ＧＳコード配列を含み、前記ｈＣＤＫＬ５－２ＧＳコード配列が、配列番号２４、又は配列番号２４と少なくとも約９５％同一の配列である、ベクター。

【請求項40】

発現カセットを含むベクターであって、前記発現カセットが、ヒトＣＤＫＬ５アイソフォーム３（ｈＣＤＫＬ５－３ＧＳ）発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ｈＣＤＫＬ５－３ＧＳをコードする核酸配列である、ｈＣＤＫＬ５－３ＧＳコード配列を含み、前記ｈＣＤＫＬ５－３ＧＳコード配列が、配列番号２５、又は配列番号２５と少なくとも約９５％同一の配列である、ベクター。

【請求項41】

発現カセットを含むベクターであって、前記発現カセットが、ヒトＣＤＫＬ５アイソフォーム４（ｈＣＤＫＬ５－４ＧＳ）発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ｈＣＤＫＬ５－４ＧＳをコードする核酸配列である、ｈＣＤＫＬ５－４ＧＳコード配列を含み、前記ｈＣＤＫＬ５－４ＧＳコード配列が、配列番号２６、又は配列番号２６と少なくとも約９５％同一の配列である、ベクター。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

ＣＤＫＬ５欠損症（ＣＤＤ）は、幼児に影響を及ぼす重篤な神経発達障害である。根本的な原因は、Ｘ連鎖サイクリン依存性キナーゼ様５遺伝子、ＣＤＫＬ５（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ，ＭＩＭ：３００２０３、以前はＳＴＫ９として知られていた）における変異によるＣＤＫＬ５タンパク質発現の欠如であり、初期の乳児てんかん性脳症の形態であるＥＩＥＥ２（ＭＩＭ：３００６７２）［Ｂａｈｉ－Ｂｕｉｓｓｏｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｋｅｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｇｉｒｌｓ ｗｉｔｈ ＣＤＫＬ５ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｂｒａｉｎ １３１，２６４７－２６６１，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｒａｉｎ／ａｗｎ１９７（２００８）］、及び点頭てんかん［Ｆｅｈｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２１，２６６－２７３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｅｊｈｇ．２０１２．１５６（２０１３）、Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７２，１４０１－１４１１，ｄｏｉ：１０．１０８６／３７５５３８（２００３）、Ｔａｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７５，１１４９－１１５４，ｄｏｉ：１０．１０８６／４２６４６０（２００４）．Ｗｅａｖｉｎｇ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７５，１０７９－１０９３，ｄｏｉ：１０．１０８６／４２６４６２（２００４）］を含む一連の表現型をもたらす。特徴的な早期発症の発作に加えて、表現型は、定型的な手の動き、重度の精神運動遅滞及び一般的な低張などのいくつかの他の特徴も含み得る。症状の産後早期発症は、ＣＤＫＬ５が脳発達に重要な役割を果たすことを示す。ＣＤＫＬ５は、成熟成人神経系内でも発現される。ＣＤＫＬ５は、核、並びに細胞体の細胞質及び樹状突起を含む、細胞全体で発現される。

【0002】

ＣＤＫＬ５遺伝子変異は、ＣＤＤのほとんどの症例の原因であり、進行性神経発達障害であり、女性の認知障害の最も一般的な原因の１つである。ＣＤＤを引き起こす遺伝子変異を有する男性は、壊滅的な影響を受ける。彼らのほとんどは出生前又は乳児期初期に死亡する。例えば、ｎｉｎｄｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ／Ｐａｔｉｅｎｔ－Ｃａｒｅｇｉｖｅｒ－Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／Ｆａｃｔ－Ｓｈｅｅｔｓ／Ｒｅｔｔ－Ｓｙｎｄｒｏｍｅ－Ｆａｃｔ－Ｓｈｅｅｔ ａｎｄ ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／３１２７５０を参照されたい。

【0003】

現在、ＣＤＤの治療法は存在せず、疾患症状の緩和に重点を置いた治療が行われている。多くの場合、発作は制御が不十分であるため、新規の治療的アプローチを見出すための緊急の医学的必要性がある。

【発明の概要】

【0004】

本明細書では、ＣＤＫＬ５欠損症（ＣＤＤ）の治療を必要とする対象におけるＣＤＤを治療するために有用である、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡＶは、逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むベクターゲノムと、標的細胞においてｈＣＤＫＬ５発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ヒトＣＤＫＬ５タンパク質をコードする新規の核酸配列とを有する。

【0005】

特定の実施形態では、ＣＤＤを治療するために有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡＶは、（ａ）ＡＡＶカプシドと、（ｂ）（ａ）のＡＡＶカプシドにパッケージされるベクターゲノムとを含み、このベクターゲノムは、逆位末端反復（ＩＴＲ）、及び中枢神経系細胞においてヒトＣＤＫＬ５（ｈＣＤＫＬＫ５）発現を指示
する調節配列の制御下で、機能的ｈＣＤＫＬ５をコードする核酸配列を含み、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号３（若しくは配列番号２２）のｎｔ６９９～３５８１又は配列番号３（若しくは配列番号２２）のｎｔ６９９～３５８１と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、機能的ｈＣＤＫＬ５は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、調節配列は、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、調節配列は、ＷＰＲＥエレメントを含む。

【0006】

特定の実施形態では、機能的ヒトＣＤＫＬ５（ｈＣＤＫＬＫ５）がｈＣＤＫＬ５アイソフォーム２である、ＣＤＤを治療するために有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。特定の実施形態では、機能的ヒトＣＤＫＬ５（ｈＣＤＫＬＫ５）がｈＣＤＫＬ５アイソフォーム３である、ＣＤＤを治療するために有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。特定の実施形態では、機能的ヒトＣＤＫＬ５（ｈＣＤＫＬＫ５）がｈＣＤＫＬ５アイソフォーム４である、ＣＤＤを治療するために有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。

【0007】

特定の実施形態では、ＣＤＤを治療するために有用なｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＤを治療するために有用なｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを含む。他の実施形態では、ＣＤＤを治療するために有用なｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを含む。

【0008】

特定の実施形態では、ＣＤＫＬ５－２ＧＳコード配列は、配列番号２４、又は配列番号６をコードする配列と少なくとも９５％同一の配列である。特定の実施形態では、ＣＤＫＬ５－３ＧＳコード配列は、配列番号２５、又は配列番号８をコードする配列と少なくとも９５％同一の配列である。特定の実施形態では、ＣＤＫＬ５－４ＧＳコード配列は、配列番号２６、又は配列番号１０をコードする配列と少なくとも９５％同一の配列である。

【0009】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｈＣＤＫＬ５の３’未翻訳領域に後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの少なくとも２つのタンデムリピートを含み、少なくとも２つのタンデムリピートは、少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列、及び同じ又は異なり得、ｍｉＲ１８３又はｍｉＲ１８２を標的とする少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。

【0010】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ以外のベクターは、本明細書に記載される発現カセットの送達に使用される。ベクターは、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、若しくは組換えアデノウイルス；又は裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、若しくはキトサンベースの製剤から選択される非ウイルスベクターであり得る。

【0011】

特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶ又は他のウイルスベクターのストック及び水性懸濁媒体を含む組成物が提供される。

【0012】

特定の実施形態では、有効量の本明細書に記載されるｒＡＡＶ又は他のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、ＣＤＤを治療する方法が提供される。

【0013】

特定の実施形態では、本明細書に記載されるベクターを産生するために有用なｒＡＡＶ産生系が提供される。

【0014】

特定の実施形態では、発現カセットを含むベクターが提供され、この発現カセットは、ヒトＣＤＫＬ５－ｃｏ１（ｈＣＤＫＬ５）発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ｈＣＤＫＬ５をコードする核酸配列を含み、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２２、又
は配列番号２２と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、発現カセットを含むベクターが提供され、この発現カセットは、ヒトＣＤＫＬ５－２ＧＳ（ｈＣＤＫＬ５－２ＧＳ）発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ｈＣＤＫＬ５－２ＧＳをコードする核酸配列を含み、ｈＣＤＫＬ５－２ＧＳコード配列は、配列番号２４、又は配列番号２４と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、発現カセットを含むベクターが提供され、この発現カセットは、ヒトＣＤＫＬ５－３ＧＳ（ｈＣＤＫＬ５－３ＧＳ）発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ｈＣＤＫＬ５－３ＧＳをコードする核酸配列を含み、ｈＣＤＫＬ５－３ＧＳコード配列は、配列番号２５、又は配列番号２５と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、発現カセットを含むベクターであって、この発現カセットは、ヒトＣＤＫＬ５－４ＧＳ（ｈＣＤＫＬ５－４ＧＳ）発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ｈＣＤＫＬ５－４ＧＳをコードする核酸配列を含み、ｈＣＤＫＬ５－４ＧＳコード配列は、配列番号２６、又は配列番号２６と少なくとも約９５％同一の配列である。

【0015】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの少なくとも２つのタンデムリピートを更に含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ又はｒＡＡＶを含む組成物は、ＣＤＤの症状を改善する、及び／又はＣＤＤの進行を遅延させるために、それを必要とする対象に投与可能である。

【0016】

更なる一態様では、本明細書に記載されるｒＡＡＶ又はベクター及び水性懸濁媒体を含む組成物が本明細書で提供される。

【0017】

別の態様では、ＣＤＤを有する対象を治療するか、又はＣＤＤの症状を緩和するか、又はＣＤＤの進行を遅延させる方法が提供される。本方法は、有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶ又はベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む。特定の実施形態では、ベクター又はｒＡＡＶは、大槽内注射（ＩＣＭ）を介して患者に投与可能である。

【0018】

本発明のこれらの態様及び他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、ニューロンプロモーター、操作されたヒトＣＤＫＬ５ ＤＮＡコード配列、エンハンサー、及びポリＡ、並びにＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む発現カセットを含む、ＡＡＶ ＣＤＫＬ５ベクターゲノムのＡＡＶベクター設計を示す。

【図1B】５’ＡＡＶ ＩＴＲ、並びにユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、操作されたヒトＣＤＫＬ５ ＤＮＡコード配列、ｄｒｇ脱標的化ｍｉＲＮＡ、ポリＡ、及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む発現カセットを含む、ＡＡＶ ＣＤＫＬ５ベクターゲノムのＡＡＶベクター設計を示す。

【図1C】５’ＡＡＶ ＩＴＲ、並びにニワトリβアクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢｈ）、操作されたヒトＣＤＫＬ５ ＤＮＡコード配列、ｄｒｇ標的化ｍｉＲＮＡ、ポリＡ、及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む発現カセットを含む、ＡＡＶ ＣＤＫＬ５ベクターゲノムのＡＡＶベクター設計を示す。

【図2A-2B】抗ＣＤＫＬ５抗体（Ｓ９５７Ｄ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｎｄｅｅ，ＵＫ）で評価したマウス海馬の分析を示す。マウスを、新生児脳室内注射によって５×１０^１０ＧＣ ＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ＷＰＲＥで処置した。図２Ａは、ＰＢＳ注射した野生型マウス、ＰＢＳ注射したＫＯマウス、及び処置されたＫＯマウスにおけるＣＤＫＬ５／チューブリンレベルをチャート化する、ウエスタンブロッティングによるＣＤＫＬ５発現を示す。図２Ｂは、ＰＢＳ注射した野生型マウス、ＰＢＳ注射したＫＯマウス、及び処置されたＫＯマウスにおけるｐＳ２２２ＥＢ２（Ｂａｌｔｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１８）レベルを使用して判定した場合のＣＤＫＬ５活性を示す。

【図3】ＣＤＤマウスモデルにおけるＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ｈＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ＷＰＲＥの注射後のマウス成熟及び生存のグラフを提供する。注射した全てのマウスは、処置後に生存し、体重を増加させた。マウスは、有害転帰の明らかな徴候を示さなかった。

【図4】ＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ＷＰＲＥを受容するＣＤＤマウスにおける行動評価からの結果を提供する。この図は、リスクテイキング、好奇心、及び不安のバランスを評価する上昇したゼロ迷路（Ｅｌｅｖａｔｅｄ Ｚｅｒｏ Ｍａｚｅ）の結果を示す。第１のバーは、ＰＢＳを受容するｗｔマウスを表す。Ｗｔマウスは、好奇心が強いが慎重であり、限られた時間をオープンで過ごす。中央のバーは、ＰＢＳのみを受容するＣｄｋｌ５－ｋｏマウスを示し、これは、不安の低下、及びオープンでより多くの時間を過ごすことを示し、これらのマウスはより頻繁にオープンゾーンに入った。ＡＡＶ－ＣＤＫＬ５処置後、Ｃｄｋｌ５－ｋｏマウスの行動は、ｗｔの行動に戻る（オープンゾーン内での時間、及び閉鎖されたゾーンからオープンゾーンへの進入について）。

【図5A-5B】ＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ＷＰＲＥを受容するＣＤＤマウスにおける行動評価からの結果を提供する。図５Ａは、ビームブレイク／ビン対時間（分）としてプロットされたオープンフィールドアリーナにおけるマウスの探索活動を示す。点線は、好奇心が強いが、１０分以内にアリーナを探索し、落ち着いているｗｔマウスを示す。長い破線による線は、Ｃｄｋｌ５－ｋｏが探索に長い時間を費やすが、最終的に落ち着くことを示す。破線及び点による線は、ＡＡＶ－ＣＤＫＬ５処置後、Ｃｄｋｌ５－ｋｏマウスの活動が低減し、それらの全体的な活動レベルがｗｔマウスに類似することを示す。図５Ｂは、マウスによって取得された総ビームブレイクの累積活動データを示し、これは、図５Ａにおける結果を確認する。

【図6】連続３日間にわたるマウスにおける運動活動及び機敏性評価（ロータロッド）における、測定された落下までの時間（秒）のグラフを示す。野生型マウスは、経時的に学習しながらパフォーマンスを高めることが観察される。Ｃｄｋｌ５－ｋｏマウスは、ｗｔマウスと比較して、以前に観察された初期多動性に起因する可能性が高い、パフォーマンスの向上を示す。ＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ＷＰＲＥ．処置後、Ｃｄｋｌ５－ｋｏマウスの行動はｗｔの行動に戻らない。

【図7A-7B】海馬の学習及び記憶（Ｙ迷路）の結果を示す。図７Ａは、試験群及び２つの対照群の自発的変化のパーセンテージを示す。図７Ｂは、試験群及び２つの対照群の移動距離（ｍ）を示す。ｗｔマウスは、最近訪れていない迷路アームを探索する強い傾向を示す（自発的変化行動）。

【図8A-8D】発現アイソフォーム１、アイソフォーム２、アイソフォーム３、又はアイソフォーム４について、ＡＡＶ．ＣＤＬＫ５ベクター構築物のＣＤＫＬ５発現レベル又は活性レベルを示す。図８Ａは、ビヒクルを注射した野生型マウス及びビヒクルを注射したノックアウトマウスと比較した、ＡＡＶベクター（５×１０^１０ＧＣ、新生児ＩＣＶ）を注射したノックアウトマウスにおけるＣＤＫＬ５アイソフォーム１、２、３、及び４の定量化された発現レベルを示す。図８Ｂは、処置された野生型マウス（ビヒクル（ＰＢＳ）を注射した）、ノックアウトマウス（ビヒクルを注射した、又はＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ）からの組織のウエスタンブロット分析からのｐＳ２２２ＥＢ２の定量化されたシグナルから決定される、ＣＤＫＬ５活性を示す。図８Ｃは、処置された野生型マウス（ビヒクル（ＰＢＳ）を注射した）、ノックアウトマウス（ビヒクルを注射した、又はＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１、２、３、若しくは４（図８Ａから））由来の組織のウエスタンブロット分析からのｐＳ２２２ＥＢ２の定量化されたシグナルから決定される、ＣＤＫＬ５活性を示す。図８Ｄは、ＫＯマウスにおけるアイソフォーム１の定量化されたＣＤＫＬ５発現レベルを示す（図８Ｂから）。

【図9A-9F】ノックアウトマウス及び野生型マウスにおける異なるベクター用量（５×１０^１０ＧＣ、２．５×１０^１０ＧＣ、１×１０^１０ＧＣ、及び６×１０^９ＧＣ）を比較したマウス研究におけるＡＡＶ．ＣＤＫＬ５遺伝子療法の治療有効性を示す。図９Ａは、５×１０^１０ＧＣ又はＰＢＳの用量でＡＡＶ．ＣＤＫＬ５で処置されたマウスの１０週間にわたる体重増加（ｇ）を示す。図９Ｂは、２．５×１０^１０ＧＣ又はＰＢＳの用量でＡＡＶ．ＣＤＫＬ５で処置されたマウスの１０週間にわたる体重増加（ｇ）を示す。図９Ｃは、未処置のＣｄｋｌ５－ｋｏマウスと比較した、５×１０^１０ＧＣの用量でのＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置群の後肢クラスピング試験の用量依存性結果を示す。図９Ｄは、未処置のＣｄｋｌ５－ｋｏマウスと比較した、２．５×１０^１０ＧＣの用量の用量でのＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置群の後肢クラスピング試験の用量依存性結果を示す。図９Ｅは、未処置のＣｄｋｌ５－ｋｏマウスと比較した、１×１０^１０ＧＣの用量でのＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置群の後肢クラスピング試験の用量依存性結果を示す。図９Ｆは、未処置のＣｄｋｌ５－ｋｏマウスと比較した、６×１０^９ＧＣの用量でのＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置群の後肢クラスピング試験の用量依存性結果を示す。ＷＴマウスはクラスピングを示さず、ＫＯマウスは顕著なクラスピングを示した。処置後、ＫＯマウスは、クラスピングの中で著しく低減したを示した。注射したＷＴマウスは影響を受けなかった。

【図10A-10E】ＣＤＤ ｋｏマウス研究におけるＡＡＶ．ＣＤＬ５遺伝子療法の治療有効性を示す。図１０Ａは、未処置のＣｄｋｌ５－ｋｏマウスと比較した、５×１０^１０ＧＣの用量でのＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置群の巣構築（巣の質／スコア）における結果を示す。図１０Ｂは、ＷＴ及びＣｄｋｌ５－ｋｏマウスと比較して、５×１０^１０ＧＣの用量で、ＡＡＶ．ＣＤＬＫ５処置群において正常化の傾向を有するガラス球覆い隠しタスクからの結果を示す。図１０Ｃは、未処置のＣｄｋｌ５－ｋｏマウスと比較した、２．５×１０^１０ＧＣの用量でのＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置群の巣構築（巣の質／スコア）における結果を示す。図１０Ｄは、ＷＴ及びＣｄｋｌ５－ｋｏマウスと比較した、２．５×１０^１０ＧＣの用量でのＡＡＶ．ＣＤＬＫ５処置群において正常化の傾向を有するガラス球覆い隠しタスクからの結果を示す。図１０Ｅは、未処置のＣｄｋｌ５－ｋｏマウスと比較した、１×１０^１０ＧＣの用量でのＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置群の巣構築（巣の質／スコア）における結果を示す。

【図11A-11F】オープンフィールド活動試験で評価したように、ＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置を受けたｋｏマウスにおける多動性の補正を示す。図１１Ａは、５×１０^１０ＧＣの用量でのＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置ｋｏマウスにおける歩行活動／ビン対時間（５分間隔で３０分間）を示す。図１１Ｂは、５×１０^１０ＧＣの用量でのＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置ｋｏマウスにおける総活動を示す。図１１Ｃは、２．５×１０^１０ＧＣの用量でのＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置ｋｏマウスにおける歩行活動／ビン対時間（５分間隔で３０分間）を示す。図１１Ｄは、２．５×１０^１０ＧＣの用量でのＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置ｋｏマウスにおける総活性を示す。図１１Ｅは、６×１０^９ＧＣの用量でのＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置ｋｏマウスにおける歩行活動／ビン対時間（５分間隔で３０分間）を示す。図１１Ｆは、６×１０^９ＧＣの用量でのＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置ｋｏマウスにおける総活動を示す。ＡＡＶ．ＣＤＫＬ５処置ｋｏマウスにおいて、リスクテイキングの増加の正常化は、上昇したゼロ迷路において観察され、海馬学習欠損の正常化は、Ｙ迷路において見られる。

【図12】ＣＤＫＬ５アイソフォーム２～４の発現が、ｋｏマウスにおける５×１０^１０ＧＣの用量で評価した場合に、後肢クラスピング表現型の著しい補正を提供することを示す。

【図13A-13D】ＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１で処置したＫＯマウスにおける補正の強い傾向を示す。図１３Ａは、５×１０^１０ＧＣの用量でＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１で処置されたＫＯマウスにおける上昇した活動を示す。図１３Ｂは、２．５×１０^１０ＧＣの用量でＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１で処置されたＫＯマウスにおける上昇した活動を示す。図１３Ｃは、５×１０^１０ＧＣの用量でＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１で処置されたＫＯマウスにおけるＹ迷路での活動を示す。図１３Ｄは、２．５×１０^１０ＧＣの用量でＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１で処置されたＫＯマウスにおけるＹ迷路での活動を示す。

【図14A-14C】ＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１によるノックアウトマウスの処置後の後肢クラスピングにおける性別特異的な結果を示す。図１４Ａは、ＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１による雄ノックアウトマウスの処置後の後肢クラスピングを示す。図１４Ｂは、ＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１による雌ノックアウトマウスの処置後の後肢クラスピングを示す。Ｃｄｋｌ５－ｋｏマウスにおいて、半接合雄及びヘテロ接合雌の両方が後肢クラスピングを示し、これは処置後に著しく低減した。ＷＴ群のいずれも、クラスピングを示さなかった。図１４Ｃは、雌のヘテロ接合マウスにおける著しく改善を伴う、高用量（５×１０^１０ＧＣ、新生児ＩＣＶ）での歩行活動を示す。

【図15A-15B】オープンフィールド評価におけるオープンフィールド－歩行活動の性別特異的な結果を示す。図１５Ａは、経時的なＸ、Ｙ軸ビームブレイクとしてプロットされた、ＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１で処置された雄（ＫＯ）マウスにおけるオープンフィールド評価における歩行活動の結果を示す。図１５Ｂは、経時的なＸ、Ｙ軸ビームブレイクとしてプロットされた、ＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１で処置された雌（ｈｔ）マウスにおけるオープンフィールド評価における歩行活動の結果を示す。野生型への完全補正は、ＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１で処置された雄（ＫＯ）及び雌（ｈｔ）両方のマウスにおいて、複数の時点で観察される。

【図16A-16B】ＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１ベクターで処置されたｋｏマウスにおける性別差を示す。図１６Ａは、オープンゾーン内で過ごした時間（秒）としてプロットされた、ＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１で処置された雄（ＫＯ）マウスにおける、上昇したゼロ迷路評価におけるオープンフィールド－歩行活動の結果を示す。図１６Ｂは、オープンゾーン内で過ごした時間（秒）としてプロットされた、ＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－アイソフォーム１で処置された雌（ｈｔ）マウスにおける、上昇したゼロ迷路評価におけるオープンフィールド－歩行活動の結果を示す。リスクを伴いやすい行動が補正され、雄ではより顕著なサイズ効果を伴う。

【図17】ＮＨＰ研究からの様々な組織試料中のベクター分布を提供する（１×１０^１４ＧＣ用量の代表）。このグラフは、様々な非神経組織、脊髄トラック、及び脳組織のｇｃ／二倍体ゲノムにおけるｒＡＡＶ．ＣＤＫＬ５を提供する。後根神経節（ＤＲＧ）の強力な形質導入が観察される。脳組織の中～低程度の形質導入が観察され、非神経組織へのいくらかの漏出を伴う。

【図18】小脳、前頭皮質、後頭皮質、頭頂皮質、及び側頭皮質に示されるＮＨＰ研究におけるｈＣＤＫＬ５発現（ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定）を定量化した結果を提供する。

【図19A-19B】ＷＴマウスへのＣＤＫＬ５遺伝子療法投与後の行動変化を測定する用量漸増研究の結果を示す。図１９Ａは、ＰＢＳで処置した対照マウスと比較して、７．５×１０^１０ＧＣ及び１×１０^１１ＧＣのＡＡＶを注射したＷＴマウスにおける後肢クラスプ重症度スコアの著しい変化を示さない。図１９Ｂは、ＰＢＳで処置した対照マウスと比較して、７．５×１０^１０ＧＣ及び１×１０^１１ＧＣのＡＡＶを注射したＷＴマウスにおける著しい歩行活動変化を示さない。

【発明を実施するための形態】

【0020】

ＣＤＤを治療するための組成物及び方法が、本明細書で提供される。ＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶｈｕ６８又はＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ）を有し、機能的ヒトサイクリン依存性キナーゼ様５（ｈＣＤＫＬ５）をコードするベクターゲノムがその中にパッケージされる、有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、それを必要とする対象に送達される。

【0021】

Ｉ．ヒトＣＤＫＬ５
サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５、ＣＦＡＰ２４７としても知られる、セリン／スレオニンキナーゼ９、ＳＴＫ９；Ｕｎｉｐｒｏｔ＃０７６０３９）遺伝子は、Ｘ染色体の２２．１３位の短い（ｐ）アーム上に天然に位置する。ＣＤＬＫ５タンパク質のＮ末端は、他のタンパク質の活性を変化させる酵素であるキナーゼとして作用する。いくつかのＣＤＫＬ５の直接基質が同定されている（Ｂａｌｔｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１８、Ｍｕｎｏｚ ｅｔ ａｌ，２０１８）。ＣＤＫＬ５のＣ末端は機能不明である。

【0022】

本明細書で使用される場合、機能的ｈＣＤＫＬ５タンパク質は、ＣＤＤと関連付けられていないＣＫＤＬ５タンパク質のアイソフォーム、天然バリアント、バリアント、多形体、若しくは切断を指し、かつ／あるいはその送達若しくは発現は、動物モデル若しくは患者におけるＣＤＤの症状を緩和するか、又は進行を遅延させる可能性がある。ＯＭＩＭ＃３００２０３を参照されたく、各ウェブページは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、機能的ｈＣＤＫＬ５は、配列番号２のアミノ酸配列（アイソフォーム１）、又はそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．９％）同一のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＣＤＫＬ５タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列（アイソフォーム２）、又はそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．９％）同一のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＣＤＫＬ５タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列（アイソフォーム３）、又はそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．９％）同一のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＣＤＫＬ５タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列（アイソフォーム４）、又はそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．９％）同一のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＣＤＫＬ５は、配列を有するメチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）及びＮＣｏＲ／ＳＭＲＴ相互作用ドメイン（ＮＩＤ）を含む、切断されたｈＣＤＫＬ５である。ＷＯ２０１８／１７２７９５Ａ１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0023】

特定の実施形態では、機能的ｈＣＤＫＬ５タンパク質は、動物モデルにおけるＣＤＤの症状を改善するか、又は進行を遅延させる。例示される１つの動物モデルは、ＣＤＫＬ５－ｋｏマウスである。他の好適なモデルは、本明細書に記載されている。

【0024】

ＣＤＤの症状又は進行は、生存プロット（例えば、カプラン・マイヤー生存プロット）、体重のモニタリング、及び行動変化の観察（例えば、後肢クラスピング、オープンフィールドアッセイ（運動機能）、上昇したゾーン迷路（不安／リスク対探索）、Ｙ迷路（学習及び記憶／海馬）、ガラス球覆い隠しアッセイ（先天的行動及び運動）、巣作り（先天的社会行動）、並びにロータロッドアッセイ（運動機能、整合）を含むがこれらに限定されない、種々のアッセイ／方法を使用して評価され得る。特定の実施形態では、動物モデルにおける機能的ｈＣＤＫＬ５タンパク質の投与又は発現は、対応する野生型動物で得られたものの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、又は１００％超であるアッセイ結果によって示されるＣＤＤ症状の改善、又はＣＤＤ進行の遅延につながる。特定の実施形態では、ＣＤＤ動物モデルにおける機能的ｈＣＤＫＬ５タンパク質の投与又は発現は、対応する非処置ＣＤＤ動物から得られたものの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、又は１００％超である向上したアッセイ結果によって示されるＣＤＤ症状の改善、又はＣＤＤ進行の遅延につながる。

【0025】

本明細書では、ｈＣＤＫＬ５コード配列又はＣＤＫＬ５コード配列と称される、機能的ｈＣＤＫＬ５タンパク質をコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号３、又は配列番号３と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２（ＣＤＫＬ５若しくはＣＤＫＬ５ｃｏ又はＣＤＫＬ５－１若しくはＣＤＫＬ５－１ｃｏと称される）、あるいはアミノ酸配列ＮＰ＿００１０３２４２０．１（配列番号１９）をコードするＮＣＢＩ参
照配列ＮＭ＿００１０３７３４３．１（ＣＤＫＬ５若しくはＣＤＫＬ５ｅ１と称される、配列番号１６）、アミノ酸配列ＮＰ＿００１３１０２１８．１（配列番号２０）をコードするＮＭ＿００１３２３２８９．２（配列番号１７）、及びアミノ酸配列ＮＰ＿００３１５０．１（配列番号２１）をコードするＮＭ＿００３１５９．２（配列番号１８）、又はそれらと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．９％）同一である核酸配列から選択される。ＮＣＢＩ参照配列の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、修飾又は操作された（ｈＣＤＫＬ５若しくはｈＣＤＫＬ５ｃｏ又はＣＤＫＬ５－１若しくはＣＤＫＬ５－１ｃｏ）である。修飾又は操作されたは、ＮＣＢＩ参照配列に対して約７０％（例えば、約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．９％）未満の同一性を共有する。

【0026】

特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２２、又はそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは少なくとも約９９．９％）同一の核酸配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２４、又はそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは少なくとも約９９．９％）同一の核酸配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２５、又はそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは少なくとも約９９．９％）同一の核酸配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２６、又はそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは少なくとも約９９．９％）同一の核酸配列である。

【0027】

特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号３７の操作配列、又は配列番号３７と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号３８の操作配列、又は配列番号３８と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号３９の操作配列、又は配列番号３９と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号４０の操作配列、又は配列番号４０と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号４１の操作配列、又は配列番号４１と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号４２の操作配列、又は配列番号４２と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号４３の操作配列、又は配列番号４３と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号４４の操作配列、又は配列番号４４と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号４５の操作配列、又は配列番号４５と少なくとも約９５％同一の配列である。特
定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号４６の操作配列、又は配列番号４６と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号４７の操作配列、又は配列番号４７と少なくとも約９５％同一の配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号４８の操作配列、又は配列番号４８と少なくとも約９５％同一の配列である。

【0028】

本明細書に記載される「核酸」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はその修飾であってもよく、一本鎖又は二本鎖であってもよく、例えば、対象となるタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、偽相補性ＰＮＡ（ｐｃ－ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）等を含む群から選択されてもよい。そのような核酸配列には、例えば、転写抑制因子、アンチセンス分子、リボザイム、低阻害性核酸配列、例えば、限定されないが、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド等として作用する、例えば、タンパク質をコードする核酸配列が含まれるが、これに限定されない。

【0029】

核酸配列の文脈で「パーセント（％）同一性」、「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、又は「パーセント同一」という用語は、対応するように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、又は少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたってもよく、これが望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。

【0030】

パーセント同一性は、タンパク質、ポリペプチド、約３２個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸、若しくはそのペプチド断片の全長にわたるアミノ酸配列、又は配列をコードする対応する核酸配列について容易に決定することができる。好適なアミノ酸断片は、長さが少なくとも約８個のアミノ酸であり得、最大で約７００個であり得る。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、又は「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、又は「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「整列された」配列又は「整列」とは、複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損又は追加の塩基又はアミノ酸についての補正を含む。

【0031】

整列は、公共の又は市販のいずれかの様々な多重配列整列プログラムを用いて行われる。配列整列プログラムは、アミノ酸配列に対して利用可能であり、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムが挙げられる。一般的に、これらのプログラムのうちのいずれかをデフォルト設定で使用するが、当業者は、これらの設定を必要に応じて変更することができる。あるいは、当業者は、別のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを利用することができ、参照のアルゴリズム及びプログラムによって提供されるように、少なくとも同一性のレベル又は整列が提供される。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

【0032】

多重配列整列プログラムもまた、核酸配列に対して利用可能である。かかるプログラムの例としては、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が挙げられ、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能である。かかるプ
ログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及び検索配列（ｓｅａｒｃｈ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の間の最良の重複領域の整列及びパーセント配列同一性を提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＧＣＧバージョン６．１（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、Ｆａｓｔａ（商標）をそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）とともに使用して決定することができる。

【0033】

ＩＩ．発現カセット
本明細書では、発現カセットとも称される標的細胞におけるｈＣＤＫＬ５発現を指示する調節配列の制御下で、ｈＣＤＫＬ５コード配列を含む核酸配列が提供される。本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、コード配列（例えば、ＣＤＫＬ５コード配列）、及びそれに作動可能に連結された調節配列を含む、核酸分子を指す。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、２つ以上の発現カセットを含む。「導入遺伝子」という用語は、標的細胞に挿入される外因性供給源からのＤＮＡ配列を指し、典型的には、導入遺伝子は、産物（例えば、ＣＤＫＬ５）をコードする。典型的に、ウイルスベクターにパッケージされるかかる発現カセッは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載される遺伝子産物のコード配列、及び本明細書に記載されるものなどの他の発現制御配列を含む。必要な調節配列は、標的細胞中でその転写、翻訳及び／又は発現を許可する様式で、ｈＣＤＫＬ５コード配列と作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列には、ｈＣＤＫＬ５コード配列と連続する転写、翻訳、及び／又は発現を調節する配列、並びにｈＣＤＫＬ５コード配列を制御するためにトランスで又は離れて作用する調節配列が含まれる。発現カセットは、他のエレメントの中で、遺伝子配列の上流（５’～）の調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン等のうちの１つ以上、及びエンハンサー、又は遺伝子配列の下流（３’～）の調節配列、例えば、ポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含有してよい。かかる調節配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、及びＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、ＣＮＳ特異的又はニューロン特異的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトシナプシンプロモーター（配列番号２３）である。特定の実施形態では、追加的又は代替的なニューロン特異的プロモーター配列は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３ １５）、神経フィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１ ５）、ニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３ ８４）、及び／又は他から選択されてもよい。

【0034】

特定の実施形態では、ヒトシナプシンプロモーターは、配列番号１、３、５、７、９又は配列番号２３（本明細書ではｈＳｙｎ又はＳｙｎとも称される）の配列（例えば、ｎｔ２１３～ｎｔ６７８）を有する。

【0035】

他の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、例えば、サイトメガロウイルスエンハンサー（ＣＢ７）プロモーターを有するニワトリβアクチンプロモーター、ヒト伸長開始因子１αプロモーター（ＥＦ１ａ）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ
）プロモーターである。特定の実施形態では、調節配列は、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞におけるｈＣＤＫＬ５の発現を指示する。

【0036】

特定の実施形態では、標的細胞は、中枢神経系細胞であり得る。特定の実施形態では、標的細胞は、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、グリア細胞、皮質細胞、前頭皮質細胞、大脳皮質細胞、脊髄細胞のうちの１つ以上である。特定の実施形態では、標的細胞は、末梢神経系（ＰＮＳ）細胞、例えば、網膜細胞である。また、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、リンパ節細胞、扁桃細胞、骨髄間葉細胞、幹細胞、骨髄幹細胞、心臓細胞、上皮細胞、食道細胞、胃細胞、胎児切断細胞、結腸細胞、直腸細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、肺細胞、唾液腺細胞、甲状腺細胞、副腎細胞、乳房細胞、膵臓細胞、ランゲルハンス島細胞、胆嚢細胞、前立腺細胞、膀胱細胞、皮膚細胞、子宮細胞、子宮頸細胞、精巣細胞、又はＣＤＤを有しない対象における機能的ＣＤＫＬ５タンパク質を発現する任意の他の細胞などの、神経系由来の細胞以外の細胞も標的細胞として選択され得る。

【0037】

特定の実施形態では、発現制御配列（調節配列）の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置する追加的又は代替的なプロモーター配列が含まれ得る。構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、組織特異的プロモーター、又は生理学的ヒントに応答するプロモーターが、本明細書に記載されるベクターに利用され得る。プロモーターは、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０最初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモマウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）又は神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、及びニワトリβアクチンプロモーターから選択され得る。

【0038】

プロモーターに加えて、ベクターは、１つ以上の他の適切な転写開始配列、転写終結配列、エンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列（例えば、ＷＰＲＥ）；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；及び必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なエンハンサーの一例は、ＣＭＶエンハンサーである。他の適切なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、調節配列は、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、調節配列は、２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ前初期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。あるいは、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列により分離される。更に別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリβ－アクチンイントロンを更に含有する。特定の実施形態では、イントロンは、ヒトβ－グロビンスプライスドナー及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スプライスアクセプター要素からなるハイブリッドイントロンである、キメライントロン（ＣＩ）である。他の好適なイントロンには、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８号などに記載されている。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ウサギグロビンポリＡ、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、及び合成ポリＡが含まれる。任意選択的に、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流及びコード配列の下流で操作され得る（例えば、ＭＡ Ｚａ
ｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照されたい）。特定の実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、存在しない。

【0039】

特定の実施形態では、発現カセットは、ｈＣＤＫＬ５のアミノ酸配列（アイソフォーム１、配列番号２）をコードする、配列番号１のｎｔ２１３～４４３９の配列を有する核酸分子を指す。特定の実施形態では、発現カセットは、ｈＣＤＫＬ５のアミノ酸配列（アイソフォーム２又は２ＧＳ、配列番号６）をコードする配列番号５のｎｔ２１３～４５６２の配列を有する核酸分子を指す。特定の実施形態では、発現カセットは、ｈＣＤＫＬ５のアミノ酸配列（アイソフォーム３又は３ＧＳ、配列番号８）をコードする配列番号７のｎｔ２１３～４３８８の配列を有する核酸分子を指す。特定の実施形態では、発現カセットは、ｈＣＤＫＬ５のアミノ酸配列（アイソフォーム４又は４ＧＳ、配列番号１０）をコードする配列番号９のｎｔ２１３～４５１１の配列を有する核酸分子を指す。特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、又は４８から選択され、ｈＣＤＫＬ５のアミノ酸配列（アイソフォーム１、配列番号２）をコードする操作された核酸配列を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、ｈＣＤＫＬ５のアミノ酸配列（アイソフォーム１、配列番号４）をコードし、ｍｉＲＮＡ１８３（配列番号１１）で構成される、配列番号３のｎｔ２１３～４５５５の配列を有する核酸分子を指す。特定の実施形態では、これらの発現カセットは、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上のｄｒｇ脱標的化配列（すなわち、ｍｉＲＮＡ）を更に含む。例えば、２０１９年１２月２０日に出願され、現在ＷＯ２０２０／１３２４５５として公表されているＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２を参照されたい。

【0040】

ＩＩＩ．ｒＡＡＶ
本明細書では、ＣＤＤを治療するために有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡＶは、（ａ）ＡＡＶカプシド、及び（ｂ）（ａ）のＡＡＶカプシドにパッケージされるベクターゲノムを含む。好適には、選択されたＡＡＶカプシドは、治療される細胞を標的とする。特定の実施形態では、カプシドは、クレードＦ由来である。しかしながら、特定の実施形態では、別のＡＡＶカプシド供給源が選択され得る。ベクターゲノムは、逆位末端反復（ＩＴＲ）、及びｈＣＤＫＬ５発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ヒトサイクリン依存性キナーゼ様５（ｈＣＤＫＬ５）をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤＫＬ５は、ＣＤＫＬ５又はｈＣＤＫＬ５、ＣＤＫＬ５－２ＧＳ又はｈＣＤＫＬ５－２ＧＳ、ＣＤＫＬ５－３ＧＳ又はｈＣＤＫＬ５－３ＧＳ、及びＣＤＫＬ５－４ＧＳ又はｈＣＤＫＬ５－４ＧＳを指し得る。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２２（ＣＤＫＬ５－１又はｈＣＤＫＬ５－１のアミノ酸配列をコードする、配列番号２）と少なくとも約９５％同一である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２４（ＣＤＫＬ５－２ＧＳ又はｈＣＤＫＬ５－２ＧＳのアミノ酸配列をコードする、配列番号６）と少なくとも約９５％同一である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２５（ＣＤＫＬ５－３ＧＳ又はｈＣＤＫＬ５－３ＧＳのアミノ酸配列をコードする、配列番号８）と少なくとも約９５％同一である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２６（ＣＤＫＬ５－４ＧＳ又はｈＣＤＫＬ５－４ＧＳのアミノ酸配列をコードする、配列番号１０）と少なくとも約９５％同一である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、ｈＣＤＫＬ５転写バリアント１～３のうちのいずれか１つと８０％未満同一である（配列番号１６を有するＮＭ＿００１０３７３４３．１であり、配列番号１９を有するアミノ酸配列ＮＰ＿００１０３２４２０．１をコードする；配列番号１７を有するＮＭ＿００１３２３２８９．２であり、配列番号２０を有するアミノ酸配列ＮＰ＿００１３１０２１８．１をコードする；配列番号１８を有するＮＭ＿００３１５９．２であり、配列番号２１を有するアミノ酸配列ＮＰ＿００３１５０．１をコードする）。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、及び４７であるか、又はそれと少なくとも約９５％同一である（ＣＤＫＬ５－１又はｈ
ＣＤＫＬ５－１のアミノ酸配列をコードする、配列番号２）。特定の実施形態では、機能的ｈＣＤＫＬ５は、配列番号２のアミノ酸配列（ＣＤＫＬ５－１又はｈＣＤＫＬ５－１）を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＣＤＫＬ５は、配列番号６のアミノ酸配列（ＣＤＫＬ５－２ＧＳ又はｈＣＤＫＬ５－２ＧＳ）を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＣＤＫＬ５は、配列番号８のアミノ酸配列（ＣＤＫＬ５－３ＧＳ又はｈＣＤＫＬ５－３ＧＳ）を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＣＤＫＬ５は、配列番号１０のアミノ酸配列（ＣＤＫＬ５－４ＧＳ又はｈＣＤＫＬ５－４ＧＳ）を有する。特定の実施形態では、調節配列は、中枢神経系細胞におけるｈＣＤＫＬ５発現を指示する。特定の実施形態では、調節配列は、ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ）又はＣＢ７プロモーターを含む。特定の実施形態では、調節エレメントは、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、イントロン、エンハンサー、及びＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも２つのタンデムリピートを更に含み、少なくとも２つのタンデムリピートは、少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列と、同じ又は異なり得る少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ４６３４、又は配列番号３のｎｔ１～ｎｔ４７５０、又は配列番号５のｎｔ１～ｎｔ４７５７、又は配列番号７のｎｔ１～ｎｔ４５８３、又は配列番号９のｎｔ１～ｎｔ４７０６、又はそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．９％）同一の核酸配列である。

【0041】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｈＣＤＫＬ５のアミノ酸配列（アイソフォーム１、配列番号２）をコードする配列番号１を含む、核酸分子を指す。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｈＣＤＫＬ５のアミノ酸配列（アイソフォーム２又は２ＧＳ、配列番号６）をコードする配列番号５を含む、核酸分子を指す。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｈＣＤＫＬ５のアミノ酸配列（アイソフォーム３又は３ＧＳ、配列番号８）をコードする配列番号７を含む、核酸分子を指す。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｈＣＤＫＬ５のアミノ酸配列（アイソフォーム４又は４ＧＳ、配列番号１０）をコードする配列番号９を含む、核酸分子を指す。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３を含み、ｈＣＤＫＬ５（アイソフォーム１、配列番号４）のアミノ酸配列をコードし、ｍｉＲＮＡ１８３（配列番号１１）を含む、核酸分子を指す。

【0042】

特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列に加えて、別の非ＡＡＶコード配列、例えば、目的のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、機能的ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、又は他の遺伝子産物が含まれてもよい。有用な遺伝子産物としては、ｍｉＲＮＡも含まれる。ｍｉＲＮＡ及び他の低分子干渉核酸は、標的ＲＮＡ転写産物の切断／分解又は標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制を介して遺伝子発現を制御する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を通してそれらの活性を示す。これらの内因性の発現ｍｉＲＮＡは、ヘアピン前駆体を形成し、これがその後、ｍｉＲＮＡ二本鎖へと処理され、更に「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子へと処理される。この成熟ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡとの相補性に基づいて、例えば、３′ＵＴＲ領域内の標的ｍＲＮＡの標的部位を特定する、多タンパク質複合体ｍｉＲＩＳＣを誘導する。

【0043】

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ標的配列」は、ＤＮＡプラス鎖上に位置する配列（５’から３’）であり、ｍｉＲＮＡシード配列を含むｍｉＲＮＡ配列に少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡ標的配列は、コードされた導入遺伝子産物の非翻訳領域に対して外因性であり、導入遺伝子発現の抑制が所望される細胞で、ｍｉＲＮＡによって特異的に標的化されるように設計される。「ｍｉＲ１８３クラスター標的配列」という
用語は、ｍｉＲ－１８３、－９６、及び－１８２（参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｍｂａｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４３：７１７３－７１８８，２０１５によって記載されている）を含む、ｍｉＲ１８３クラスター（あるいは、ファミリーと称される）のうちの１つ以上のメンバーに応答する標的配列を指す。

【0044】

典型的には、ｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド長、約１２～約２８ヌクレオチド長、約２０～約２６ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、又は約２６ヌクレオチドであり、ｍｉＲＮＡシード配列に相補的である少なくとも１つの連続領域（例えば、７又は８ヌクレオチド）を含有する。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と正確な相補性（１００％）を有する配列、又はｍｉＲＮＡシード配列といくつかのミスマッチを含む部分的な相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である少なくとも７～８個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である配列からなる。特定の実施形態では、標的配列は、シード配列と１００％相補的である配列を複数コピー（例えば、２又は３コピー）含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、標的配列の残部は、ｍｉＲＮＡに対して少なくとも約８０％～約９９％の相補性を有する。特定の実施形態では、ＤＮＡプラス鎖を含む発現カセットにおいて、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡの逆相補である。

【0045】

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ標的配列」は、ＤＮＡプラス鎖上に位置する配列（５’から３’）であり、ｍｉＲＮＡシード配列を含むｍｉＲＮＡ配列に少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡ標的配列は、コードされた導入遺伝子産物の非翻訳領域に対して外因性であり、導入遺伝子発現の抑制が所望される細胞で、ｍｉＲＮＡによって特異的に標的化されるように設計される。「ｍｉＲ１８３クラスター標的配列」という用語は、ｍｉＲ－１８３、－９６及び－１８２（参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｍｂａｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４３：７１７３－７１８８，２０１５によって記載されている）を含む、ｍｉＲ１８３クラスター（あるいはファミリーと称される）のうちの１つ以上のメンバーに応答する標的配列を指す。理論に束縛されることを意図するものではないが、導入遺伝子（遺伝子産物をコードする）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ｍｉＲＮＡを含有する発現カセットが送達される細胞型に存在し、その結果、３’ＵＴＲ ｍｉＲＮＡの標的配列に対するｍｉＲＮＡの特異的結合が、ｍＲＮＡのサイレンシング及び切断をもたらし、それによって、ｍｉＲＮＡを発現する細胞においてのみ、導入遺伝子の発現が低減又は排除される。

【0046】

典型的には、ｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド長、約１２～約２８ヌクレオチド長、約２０～約２６ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、又は約２６ヌクレオチドであり、ｍｉＲＮＡシード配列に相補的である少なくとも１つの連続領域（例えば、７又は８ヌクレオチド）を含有する。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と正確な相補性（１００％）を有する配列、又はｍｉＲＮＡシード配列といくつかのミスマッチを含む部分的な相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である少なくとも７～８個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である配列からなる。特定の実施形態では、標的配列は、シード配列と１００％相補的である配列を複数コピー（例えば、２又は３コピー）含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、標的配列の残
部は、ｍｉＲＮＡに対して少なくとも約８０％～約９９％の相補性を有する。特定の実施形態では、ＤＮＡプラス鎖を含む発現カセットにおいて、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡの逆相補である。

【0047】

特定の実施形態では、発現カセットｍＲＮＡ又はＤＮＡプラス鎖の少なくとも第１の及び／又は少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列のｍｉＲＮＡ標的配列は、（ｉ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（ｍｉＲ１８３、配列番号１１）、（ｉｉ）ＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡ（ｍｉＲ－９６、配列番号１２）、（ｉｉｉ）ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（ｍｉＲ１８２、配列番号１３）から選択される。他の実施形態では、ＡＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＣ（配列番号１４）が選択される。

【0048】

特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（配列番号１１）を含むｍｉＲ－１８３標的配列を含み、ｍｉＲ－１８３シード配列に相補的な配列は、ＧＴＧＣＣＡＴである）。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３シード配列に１００％相補的な配列を、２コピー以上（例えば、２又は３コピー）含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８３シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１１に部分的に相補的な配列を含み、したがって、配列番号１１に整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１１と整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８３標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８３シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８３と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、切断された配列番号１１（すなわち、配列番号１の５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む、ｍｉＲ－１８３標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子及び１つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。更に他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、又は４つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。（ｉ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（ｍｉＲ１８３、配列番号１１）、（ｉｉ）ＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡ（ｍｉＲ－９６、配列番号１２）。

【0049】

特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号１３）を含む、ｍｉＲ－１８２標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２シード配列に１００％相補的な配列を、１コピーより多く（例えば、２又は３コピー）含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８２シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、配列番号１３に部分的に相補的な配列を含み、したがって、配列番号１３と整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１３と整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、
７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、１００％相補性の領域を含み、これはまた、ｍｉＲ－１８２標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８２シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８２と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、切断された配列番号１３（すなわち、配列番号１３の５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む、ｍｉＲ－１８２標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８２標的配列とを含む。更に他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、又は４つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。

【0050】

「タンデムリピート」という用語は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の存在を指すように本明細書で使用される。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であってもよい。すなわち、ある配列の３’末端が、介在配列なしで、次の配列の５’末端のすぐ上流にあるように、又はその逆でもよく、次々と直に位置している。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、短いスペーサー配列によって分離されている。

【0051】

本明細書で使用される場合、「スペーサー」としては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長の任意の選択された核酸配列であり、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置する。特定の実施形態では、スペーサーは、１～８ヌクレオチド長、２～７ヌクレオチド長、３～６ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、４～９ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、又はより長い値である。好適には、スペーサーは、非コード配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、４つの（４）ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＡＴである。特定の実施形態では、スペーサーは、６つの（６）ヌクレオチドである。特定の実施形態では、スペーサーは、ＣＡＣＧＴＧ又はＧＣＡＴＧＣである。

【0052】

特定の実施形態では、タンデムリピートは、２つ、３つ、４つ以上の同じｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、タンデムリピートは、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、又は少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列などを含む。特定の実施形態では、タンデムリピートは、２つ又は３つの同じｍｉＲＮＡ標的配列、及び異なる第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。

【0053】

特定の実施形態では、発現カセットには、少なくとも２つの異なるセットのタンデムリピートが存在し得る。例えば、３’ＵＴＲは、導入遺伝子、ＵＴＲ配列のすぐ下流にタンデムリピート、及びＵＴＲの３’末端の近くに２つ以上のタンデムリピートを含み得る。別の例では、５’ＵＴＲは、１つ、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。別の例では、３’は、タンデムリピートを含んでもよく、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。

【0054】

特定の実施形態では、発現カセットは、２つ、３つ、４つ以上のタンデムリピートを含み、導入遺伝子の終止コドンの約０～２０ヌクレオチド以内に開始する。他の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンから少なくとも１００～約４０００ヌクレオチドのｍｉＲＮＡタンデムリピートを含む。

【0055】

特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列間のスペーサーは同じである。本明細書で使用される場合、ＣＤＫＬ５又はｈＣＤＫＬ５は、別途指定されない限り、アイソフォーム
１を指す。アイソフォーム２～４は、ＣＤＫＬ５－２ＧＳ又はｈＣＤＫＬ５－２ＧＳ、ＣＤＫＬ５－３ＧＳ又はｈＣＤＫＬ５－３ＧＳ、及びＣＤＫＬ５－４ＧＳ又はｈＣＤＫＬ５－４ＧＳとして指定することができる。これらのアイソフォームを有する発現カセット及びベクターゲノムは、アイソフォーム１について記載されるように構築され得る。

【0056】

参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１２月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２（現ＷＯ２０２０／１３２４５５）及び２０２０年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０２３，５９３号、２０２０年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０３８，４８８号、２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，５６２号、及び２０２０年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／０７９，２９９号、２０１１年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／１５２，０４２号を参照されたい（これらは参照により本明細書に組み込まれる）。

【0057】

特定の実施形態では、クレードＦ ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶｈｕ３１カプシド、ＡＡＶｈｕ３２カプシド、又はこれらのカプシドのうちの１つの操作されたバリアント（例えば、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ）から選択される。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、ベクターゲノムを有するＡＡＶ．ｈＣＤＫＬ５組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の産生のために以下の実施例で利用される。ＡＡＶｈｕ６８又はＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂに関連する追加の詳細は、ＷＯ２０１８／１６０５８２及びＵＳ２０１５／００７９０３８に提供され、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるクレードＦベクターは、ｈＣＤＫＬ５コード配列を含むベクターゲノムを、脳、海馬、運動皮質、小脳、及び運動ニューロンを含む中枢神経系内の細胞に送達するのに非常に好適である。これらのベクターは、中枢神経系（ＣＮＳ）内の他の細胞、並びにＣＮＳ外の特定の他の組織及び細胞を標的にするために使用され得る。

【0058】

特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法のためのＡＡＶカプシドは、標的細胞に基づいて選択される。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＣＮＳ細胞及び／又はＰＮＳ細胞を形質導入する。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ｃｙ０２カプシド、ｒｈ４３カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ｒｈ０１カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ｒｈ８カプシド、ｒｈ１０カプシド、ｂｂ０１カプシド、ｈｕ３７カプシド、ｒｈ０２カプシド、ｒｈ２０カプシド、ｒｈ３９カプシド、ｒｈ６４カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ１カプシド、ｈｕ４４カプシド、ｈｕ４８カプシド、ｃｙ０５カプシド、ｈｕ１１カプシド、ｈｕ３２カプシド、ｐｉ２カプシド、又はそれらのバリエーションから選択される。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶｈｕ６８カプシド、ｈｕ３１カプシド、ｈｕ３２カプシド、又はそれらのバリエーションなどのクレードＦカプシドである。例えば、２０１５年４月１４日に公開されたＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２０１８／１６０５８２、及びＵＳ２０１５／００７９０３８を参照されたい（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、非クレードＦカプシド、例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＥカプシドである。特定の実施形態では、非クレードＦカプシドは、ＡＡＶ１又はそのバリエーションである。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、神経系細胞以外の標的細胞を形質導入する。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、クレードＡカプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶｒｈ９１）、クレードＢカプシド（例えば、ＡＡＶ２）、クレードＣカプシド（例えば、ｈｕ５３）、クレードＤカプシド（例えば、ＡＡＶ７）、又はクレードＥカプシド（例えば、ｒｈ１０）である。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ９１カプシド（配列番号３３及び３５の核酸配列）などのクレードＡカプシドである。２０２０年４月２９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／０３０２６６、現在公表されているＷＯ２０２０／２２３２３１（参照により本明細書に組み込まれる）、及び２０１９年４月２９日に出願された米国仮特許米国特許出願第６３／０６５，
６１６号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。また、２０２０年８月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／０６５，６１６号、及び２０２０年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１０９，７３４号（参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。にもかかわらず、他のＡＡＶカプシドが選択されてもよい。

【0059】

本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「系統群（ｃｌａｄｅ）」という用語は、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指し、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列の整列に基づいて、少なくとも７５％のブートストラップ値（少なくとも１０００反復のうち）及び０．０５以下のポアソン補正距離測定値による隣接結合アルゴリズム（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して決定される。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。コンピュータプログラムが利用可能であり、それを使用して、このアルゴリズムを実装することができる。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、修正Ｎｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術及びコンピュータプログラム、並びにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定される１つの系統群（ｃｌａｄｅ）に含まれるか、別の系統群に含まれるか、又はこれらの系統群の外にあるかを容易に決定することができる。例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦを同定し、新規ＡＡＶの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９）を提供する、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００４ Ｊｕｎ；７８（１０）：６３８１－６３８８を参照されたい。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。

【0060】

ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド及びベクターゲノムからなる。ＡＡＶカプシドは、ｖｐ１の異種集団、ｖｐ２の異種集団、及びｖｐ３タンパク質の異種集団の集合体である。本明細書で使用される、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語又はその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。

【0061】

本明細書で使用される、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語又はその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種集団」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、予測されたアミノ酸残基からの修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低限、特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対における少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸変化及び他の任意選択的な修飾をもたらす。

【0062】

特定の実施形態では、複数の高度に脱アミド化された「ＮＧ」位置を含むＡＡＶカプシドアイソフォーム（すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の異種集団を有するＡＡＶカプシドが提供される。特定の実施形態では、高度に脱アミド化された位置は、予測される完全長のＶＰ１アミノ酸配列を参照して、以下に示す位置にある。他の実施形態では、カプシド遺伝子は、参照される「ＮＧ」が除去されるように修飾され、変異「ＮＧ」は、別の位置に操作される。

【0063】

本明細書で使用される場合、「標的細胞」及び「標的組織」という用語は、対象となるＡＡＶベクターによって形質導入されることが意図される任意の細胞又は組織を指し得る。この用語は、筋肉、肝臓、肺、気道上皮、中枢神経系、ニューロン、眼（視覚細胞）、又は心臓のうちのいずれか１つ以上を指し得る。

【0064】

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」という用語は、ウイルスカプシド、例えば、ＡＡＶカプシドにパッケージされ、宿主細胞又は患者の細胞に送達され得る核酸分子を指す。特定の実施形態では、ベクターゲノムは発現カセットであり、ベクターゲノムをＡＡＶカプシドにパッケージングするのに必要な逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を５’及び３’最末端に有し、それらの間に、発現を指示する配列と作動可能に連結された本明細書に記載されるＣＤＬＫ５遺伝子を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、少なくとも５’から３’へ、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、コード配列、及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含み得る。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来（カプシドとは異なるＡＡＶ供給源）であるか、又はそれ以外の完全長ＩＴＲが選択され得る。特定の実施形態では、ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能又はトランス相補性ＡＡＶを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。更に、他のＩＴＲが使用され得る。ベクターゲノムは、本明細書では「ミニ遺伝子」と称されることがある。

【0065】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ｒＡＡＶがプラスミドから産生されるパッケージング細胞株を指し得る。代替的に、「宿主細胞」という用語は、導入遺伝子の発現が所望される標的細胞を指し得る。

【0066】

上に示されるように、所望の細胞を標的とするＡＡＶカプシド、並びに少なくとも、ベクターゲノムをカプシドにパッケージするのに必要なＡＡＶ ＩＴＲ、ｈＣＤＫＬ５コード配列、及びそのための発現を指示する調節配列を含むベクターゲノムを有するｒＡＡＶが提供される。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、一本鎖ＡＡＶベクターゲノムである。特定の実施形態では、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクターが本発明に利用され得る。

【0067】

ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５’及び３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５塩基対（ｂｐ）の長さである。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする全体配列が分子内で使用されるが、これらの配列のある程度の軽微な修飾が許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当該技術分野の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい）。本発明で利用されるかかる分子の一例は、選択された導入遺伝子配列及び関連する調節エレメントが５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する、導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドである。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。Ｄ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、外部Ａエレメントが欠失している、１３０塩基対の短縮ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。短縮されたＩＴＲは、内部Ａエレメントをテンプレートとして使用して、ベクターＤＮＡ増幅中に１４５塩基対の野生型長に戻される。しかしながら、他のＡＡＶ起源由来のＩＴＲが選択され
得る。ＩＴＲの起源がＡＡＶ２からであり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ起源からのものである場合、得られたベクターは、シュードタイプであると称され得る。しかし、これらのエレメントの他の構成も好適であり得る。

【0068】

特定の実施形態では、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－プロモーター－任意選択的なエンハンサー－任意選択的なイントロン－ｈＣＤＫＬ５コード配列－ポリＡ－３’ＩＴＲを含む、ベクターゲノムが構築される。特定の実施形態では、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－プロモーター－任意選択的なエンハンサー－任意選択的なイントロン－ｈＣＤＫＬ５コード配列－任意選択的に反復するｍｉＲ脱標的化配列－ポリＡ－３’ＩＴＲを含む、ベクターゲノムが構築される。特定の実施形態では、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－プロモーター－任意選択的なイントロン－ｈＣＤＫＬ５コード配列－任意選択的なエンハンサー－ポリＡ－３’ＩＴＲを含む、ベクターゲノムが構築される。特定の実施形態では、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－プロモーター－任意選択的なエンハンサー－任意選択的なイントロン－ｈＣＤＫＬ５コード配列－任意選択的なエンハンサー－任意選択的に反復するｍｉＲ脱標的化配列－ポリＡ－３’ＩＴＲを含む、ベクターゲノムが構築される。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来ではない。特定の実施形態では、１つより多くのプロモーターが存在する。特定の実施形態では、エンハンサーは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、１つより多くのエンハンサーが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、エンハンサー及びイントロンが存在する。特定の実施形態では、ポリＡは、ＳＶ４０ポリＡ（すなわち、サルウイルス４０（ＳＶ４０）後期遺伝子に由来するポリアデニル化（ＰｏｌｙＡ）シグナル）である。特定の実施形態では、ポリＡは、ウサギβグロビン（ＲＢＧ）ポリＡである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、少なくとも、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ｈＳｙｎプロモーター－ｈＣＤＫＬ５コード配列－ポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＣＢ７プロモーター－ｈＣＤＫＬ５コード配列－ＲＢＧポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ｄｒｇ脱標的化配列は、本明細書に記載される１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上のｍｉＲ１８３配列であり、発現カセットに含まれる。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、ＣＤＫＬ５のためのものである。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、ＣＤＫＬ５－２ＧＳのためのものである。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、ＣＤＫＬ５－３ＧＳのためのものである。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、ＣＤＫＬ５－４ＧＳのためのものである。任意選択的に、これらのベクターゲノムのうちの１つ以上は、ＷＰＲＥエレメントを含む。

【0069】

本明細書で使用される場合、ベクターゲノム又はベクターゲノムを含むｒＡＡＶは、本明細書では、ＡＡＶ．プロモーター（任意選択的）．Ｋｏｚａｋ（任意選択的）．イントロン（任意選択的）．ＣＤＫＬ５コード配列（例えば、ｈＣＤＫＬ５、ｈＣＤＫＬ５ｃｏ、ＣＤＫＬ５、ＣＤＫＬ５ｃｏ）．ｍｉＲＮＡ（任意選択的）．ポリＡ（任意選択的）．Ｓｔｕｆｆｅｒ（任意選択的）として例示される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、本明細書では、ＡＡＶカプシド．プロモーター（任意選択的）．Ｋｏｚａｋ（任意選択的）イントロン（任意選択的）．ＣＤＫＬ５コード配列．ｍｉＲＮＡ（任意選択的）．ポリＡ（任意選択的）．Ｓｔｕｆｆｅｒ（任意選択的）として例示される。任意選択的に、これらのベクターゲノムのうちの１つ以上は、ＷＰＲＥエレメントを含む。

【0070】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、少なくとも、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ユビキチンＣプロモーター－ｈＣＤＫＬ５コード配列－１、２、３、４、又はそれ以上のｍｉＲ１８３配列－ＲＢＧポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、少なくとも、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ニワトリβアクチンハイブリッドプロモーター－ｈＣＤＫＬ５コード配列－１、２、３、４、又はそれ以上のｍｉＲ１８３配列－ＲＢＧポリＡ－３’ＩＴＲを含む。任意選択的に、これらのベクターゲノムのうちの１つ以上は、ＷＰＲＥエレメントを含む。

【0071】

更に、本明細書では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを産生するために有用なｒＡＡＶ産生系が提供される。産生系は、（ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、（ｂ）ベクターゲノムと、（ｃ）ベクターゲノムをＡＡＶカプシドにパッケージングするのを許可する十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能及びヘルパー機能とを含む、細胞培養物を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１、３、５、７、９、２９、又は３１である。特定の実施形態では、細胞培養物は、ヒト胚性腎臓２９３細胞培養物である。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐは、異なるＡＡＶ由来である。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐは、ＡＡＶ２由来である。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列及びｃａｐ遺伝子は、同じ核酸分子上にあり、任意選択的に、ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーが存在する。特定の実施形態では、スペーサーは、ａｔｇａｃｔｔａａａｃｃａｇｇｔ（配列番号１５）である。

【0072】

ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、ベクターゲノムは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミドに担持され得る。本発明において有用なプラスミドは、とりわけ、原核細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞におけるインビトロでの複製及びパッケージングに適しているように操作され得る。好適なトランスフェクション技術及びパッケージ宿主細胞は、既知であり、かつ／又は当業者によって容易に設計することができる。

【0073】

ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成及び単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ ＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、及び以下に引用される参考文献を参照されたい（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書で使用される場合、遺伝子療法ベクターは、本明細書に記載されるｒＡＡＶを指し、患者を治療する際の使用に好適である。遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、遺伝子を含む核酸分子と同じ構築物においてシスで必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。

【0074】

一実施形態では、選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージ細胞に送達され得る。安定したＡＡＶパッケージ細胞も作製することができる。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

【0075】

用語「ＡＡＶ中間体」又は「ＡＡＶベクター中間体」は、それにパッケージされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらは、「空の」カプシドと称され得る。そのようなカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列をまったく含まないか、又は遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージされたゲノム配列のみを含み得る。これらの空のカプシドは、宿主細胞に目的の遺伝子
を導入するために非機能的である。

【0076】

本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技法を使用して産生されてもよい。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、最低限でもＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び導入遺伝子からなる発現カセット、並びに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを許可する十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。カプシドを産生する方法、そのためのコード配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターを産生するための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

【0077】

一実施形態では、組換えＡＡＶｈｕ６８又はＡＡＶｒｈ９１を産生するために有用な産生細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物は、宿主細胞中でＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を発現する核酸、ＡＡＶｈｕ６８カプシドにパッケージングするのに好適な核酸分子（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノム）、及び宿主細胞において遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された遺伝子をコードする非ＡＡＶ核酸配列、並びにベクターゲノムを組換えＡＡＶｈｕ６８又はＡＡＶｒｈ９１カプシドにパッケージングするのを許可する十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能及びアデノウイルスヘルパー機能を含む。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞（例えば、とりわけヒト胚性腎臓２９３細胞）又は昆虫細胞（例えば、ヨトウガＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞）で構成される。特定の実施形態では、バキュロウイルスは、組換えＡＡＶｈｕ６８又はＡＡＶｒｈ９１カプシドにベクターゲノムをパッケージングするのに必要なヘルパー機能を提供する。

【0078】

任意選択的に、ｒｅｐ機能は、ｈｕ６８以外のＡＡＶ又はＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂによって提供される。特定の実施形態では、ｒｅｐ機能の少なくとも一部は、ＡＡＶｈｕ６８又はＡＡＶｒｈ９１由来である。別の実施形態では、ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶｈｕ６８ｒｅｐ以外の異種ｒｅｐタンパク質であり、例えば、限定されないが、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ３ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ４ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ５ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ６ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ７ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ８ ｒｅｐタンパク質、又はｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ６８／７８、及びｒｅｐ４０／５２、又はそれらの断片、あるいは別の供給源であり得る。これらのＡＡＶｈｕ６８又は変異体ＡＡＶカプシド配列のうちのいずれかは、宿主細胞中でそれらの発現を指示する外因性調節制御配列の制御下にあり得る。

【0079】

一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養物（例えば、ＨＥＫ２９３又はＳｆ９）又は懸濁液で製造される。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法は、当該技術分野においてよく知られている方法、例えば、遺伝子療法ベクターの産生のために使用されるプラスミドＤＮＡの産生、ベクターの産生、及びベクターの精製を含む。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクターであり、産生されたプラスミドは、ＡＡＶベクターゲノム及び目的の遺伝子をコードするＡＡＶシス－プラスミド、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶトランス－プラスミド、及びアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、並びにベクター含有細胞及び培養培地の回収などの方法ステップを含み得る。回収されたベクター含有細胞及び培養培地は、本明細書では粗細胞回収物と称される。更に別の系では、遺伝子療法ベクターは、バキュロウイルスベースベ
クターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生系に関するレビューについては、概して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたく、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これら及び他のＡＡＶ産生系を作製及び使用する方法は、以下の米国特許にも記載されており、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：米国特許第５，１３９，９４１号、同第５，７４１，６８３号、同第６，０５７，１５２号、同第６，２０４，０５９号、同第６，２６８，２１３号、同第６，４９１，９０７号、同第６，６６０，５１４号、同第６，９５１，７５３号、同第７，０９４，６０４号、同第７，１７２，８９３号、同第７，２０１，８９８号、同第７，２２９，８２３号、及び同第７，４３９，０６５号。

【0080】

粗細胞回収物は、その後、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物のダイアフィルトレーション、ベクター回収物の微小流動化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、微小流動化された中間体の濾過、クロマトグラフィによる粗精製、超遠心分離による粗精製、タンジェンシャルフロー濾過による緩衝液交換、並びに／又はバルクベクターを調製するための製剤化及び濾過などの、方法ステップに供され得る。

【0081】

２工程の高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィ精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィを用いて、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願されたＷＯ２０１７／１６０３６０号及びその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０７１号、及び２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」という題名の同第６２／２２６，３５７号により詳細に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、ベクター薬品製品の精製（例えば、ＡＡＶｒｈ９１）は、２０１６年１２月９日に出願されたＷＯ２０１７／１００６７４及びその優先権書類、２０１５年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／２６６，３５１号、及び２０１６年４月１３日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ１」という題名の同第６２／３２２，０８３号（参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されるものを含む。

【0082】

空の及び完全粒子含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配－精製された調製物、ここで（ＧＣ）＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド容量が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物品ピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。次いで、ロードした２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割って、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ～ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割って、次いで１００を掛けることよって、空粒子のパーセンテージを得る。

【0083】

一般に、空のカプシド及びパッケージされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性したカプシドについて試験するために、本方法は、３つのカプシドタンパク質を分離することができる任意のゲル（例えば、緩衝液中に３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含む勾配ゲル）からなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理済みＡＡＶスト
ックを供し、次いで、試料材料が分離するまでゲルを泳動し、ナイロン又はニトロセルロースの膜（好ましくは、ナイロン）にゲルをブロットすることを含む。抗ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質に結合する一次抗体、好ましくは、抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗－ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗－マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法が使用され、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、又は比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションからの試料を取って、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って使用して、銀染色を実施してもよく、又は他の好適な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー若しくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（又は別の適切なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料は更に希釈され、プライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを利用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定した。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用されることができる。

【0084】

一態様では、広域スペクトル血清プロテアーゼ、例えば、プロテイナーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテイナーゼＫで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテイナーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的には、プロテイナーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間実施されるが、より低い温度で（例えば、約３７℃～約５０℃）より長い時間にわたって（例えば、約２０分間～約３０分間）、又はより高い温度で（例えば、最高約６０℃）より短い時間にわたって（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。

【0085】

追加的に、又は代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補的なＡＡＶベクターゲノム力価を測定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ
．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

【0086】

簡潔に言うと、パッケージされたゲノム配列を有するｒＡＡＶｈｕ６８（又はＡＡＶｒｈ９１）粒子をゲノム欠損ＡＡＶｈｕ６８（又はＡＡＶｒｈ９１）中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶｈｕ６８（又はｒｈ９１）ウイルス粒子及びＡＡＶｈｕ６８（又はＡＡＶｒｈ９１）カプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィに供することを含み、ＡＡＶｈｕ６８（又はＡＡＶｒｈ９１）ウイルス粒子及びＡＡＶｈｕ６８中間体は、約１０．２（又はＡＡＶｒｈ９１の場合、約９．８）のｐＨで平衡化された強力なアニオン交換樹脂に結合され、約２６０ナノメートル（ｎｍ）及び約２８０ｎｍで紫外吸光度について溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。ｒＡＡＶｈｕ６８及びＡＡＶｒｈ９１にはあまり最適ではないが、ｐＨは、約１０～１０．４の範囲であり得る。この方法では、ＡＡＶ完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に到達すると溶出される画分から回収される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィステップのために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶｈｕ６８又はＡＡＶｒｈ９１血清型を効率的に捕捉するアフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン性条件下、残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質の著しいパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕捉される。

【0087】

ｒＡＡＶ．ｈＣＤＫＬ５は、好適な生理学的に適合性の組成物（例えば、緩衝生理食塩水）中に懸濁される。この組成物は、保管のために凍結され、後に解凍され、任意選択的に、好適な希釈剤で希釈され得る。あるいは、ベクターは、凍結及び解凍ステップを進めることなく患者への送達に好適な組成物として調製され得る。

【0088】

本明細書で使用される場合、「ＮＡｂ力価」という用語は、その標的化されたエピトープ（例えば、ＡＡＶ）の生理学的効果を中和する中和抗体（例えば、抗ＡＡＶ Ｎａｂ）がどれだけ産生されるかの測定値である。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９．１９９（３）：ｐ．３８１－３９０に記載されているように測定され得、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0089】

略称「ｓｃ」は、自己相補性（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）を指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって担持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染の際、第２の鎖の細胞介在性の合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、即時の複製及び転写が可能な１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ１２４８－１２５４．を参照されたい。自己相補的なＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0090】

「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」は、合成又は人工ウイルス粒子を指し、ここで、目的の遺伝子を含有する発現カセットは、ウイルスカプシド又はエンベロープ中にパッケージされ、ウイルスカプシド又はエンベロープ内にパッケージされた任意のウ
イルスゲノム配列は、複製欠損である、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的の遺伝子のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。

【0091】

多くの場合、ｒＡＡＶ粒子は、ＤＮａｓｅ耐性として参照される。しかし、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）に加えて、他のエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼが、汚染核酸を除去するために本明細書に記載の精製工程において使用され得る。かかるヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡ及び／又は二本鎖ＤＮＡ、及びＲＮＡを分解するために選択され得る。かかる工程は、単一のヌクレアーゼ、又は異なる標的に指向性のヌクレアーゼの混合物を含み得、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼであり得る。

【0092】

「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、ＡＡＶカプシドが、宿主細胞に遺伝子を送達するように設計された発現カセットの周りで完全に構築されていることを示し、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するように設計されたヌクレアーゼインキュベーション工程の間の分解（消化）から、これらのパッケージされたゲノム配列を保護する。

【0093】

ＩＶ．他のベクター
本明細書では、本明細書に記載される発現カセットを含むベクターが提供される。特定の実施形態では、発現カセットは、ｈＣＤＫＬ５発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ヒトサイクリン依存性キナーゼ様５（ｈＣＤＫＬ５）をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、［ＭＫＩＰＮＩＧＮＶＭＮＫＦＥＩＬＧＶＶＧＥＧＡＹＧＶＶＬＫＣＲＨＫＥＴＨＥＩＶＡＩＫＫＦＫＤＳＥＥＮＥＥＶＫＥＴＴＬＲＥＬＫＭＬＲＴＬＫＱＥＮＩＶＥＬＫＥＡＦＲＲＲＧＫＬＹＬＶＦＥＹＶＥＫＮＭＬＥＬＬＥＥＭＰＮＧＶＰＰＥＫＶＫＳＹＩＹＱＬＩＫＡＩＨＷＣＨＫＮＤＩＶＨＲＤＩＫＰＥＮＬＬＩＳＨＮＤＶＬＫＬＣＤＦＧＦＡＲＮＬＳＥＧＮＮＡＮＹＴＥＹＶＡＴＲＷＹＲＳＰＥＬＬＬＧＡＰＹＧＫＳＶＤＭＷＳＶＧＣＩＬＧＥＬＳＤＧＱＰＬＦＰＧＥＳＥＩＤＱＬＦＴＩＱＫＶＬＧＰＬＰＳＥＱＭＫＬＦＹＳＮＰＲＦＨＧＬＲＦＰＡＶＮＨＰＱＳＬＥＲＲＹＬＧＩＬＮＳＶＬＬＤＬＭＫＮＬＬＫＬＤＰＡＤＲＹＬＴＥＱＣＬＮＨＰＴＦＱＴＱＲＬＬＤＲＳＰＳＲＳＡＫＲＫＰＹＨＶＥＳＳＴＬＳＮＲＮＱＡＧＫＳＴＡＬＱＳＨＨＲＳＮＳＫＤＩＱＮＬＳＶＧＬＰＲＡＤＥＧＬＰＡＮＥＳＦＬＮＧＮＬＡＧＡＳＬＳＰＬＨＴＫＴＹＱＡＳＳＱＰＧＳＴＳＫＤＬＴＮＮＮＩＰＨＬＬＳＰＫＥＡＫＳＫＴＥＦＤＦＮＩＤＰＫＰＳＥＧＰＧＴＫＹＬＫＳＮＳＲＳＱＱＮＲＨＳＦＭＥＳＳＱＳＫＡＧＴＬＱＰＮＥＫＱＳＲＨＳＹＩＤＴＩＰＱＳＳＲＳＰＳＹＲＴＫＡＫＳＨＧＡＬＳＤＳＫＳＶＳＮＬＳＥＡＲＡＱＩＡＥＰＳＴＳＲＹＦＰＳＳＣＬＤＬＮＳＰＴＳＰＴＰＴＲＨＳＤＴＲＴＬＬＳＰＳＧＲＮＮＲＮＥＧＴＬＤＳＲＲＴＴＴＲＨＳＫＴＭＥＥＬＫＬＰＥＨＭＤＳＳＨＳＨＳＬＳＡＰＨＥＳＦＳＹＧＬＧＹＴＳＰＦＳＳＱＱＲＰＨＲＨＳＭＹＶＴＲＤＫＶＲＡＫＧＬＤＧＳＬＳＩＧＱＧＭＡＡＲＡＮＳＬＱＬＬＳＰＱＰＧＥＱＬＰＰＥＭＴＶＡＲＳＳＶＫＥＴＳＲＥＧＴＳＳＦＨＴＲＱＫＳＥＧＧＶＹＨＤＰＨＳＤＤＧＴＡＰＫＥＮＲＨＬＹＮＤＰＶＰＲＲＶＧＳＦＹＲＶＰＳＰＲＰＤＮＳＦＨＥＮＮＶＳＴＲＶＳＳＬＰＳＥＳＳＳＧＴＮＨＳＫＲＱＰＡＦＤＰＷＫＳＰＥＮＩＳＨＳＥＱＬＫＥＫＥＫＱＧＦＦＲＳＭＫＫＫＫＫＫＳＱＴＶＰＮＳＤＳＰＤＬＬＴＬＱＫＳＩＨＳＡＳＴＰＳＳＲＰＫＥＷＲＰＥＫＩＳＤＬＱＴＱＳＱＰＬＫＳＬＲＫＬＬＨＬＳＳＡＳＮＨＰＡＳＳＤＰＲＦＱＰＬＴＡＱＱＴＫＮＳＦＳＥＩＲＩＨＰＬＳＱＡＳＧＧＳＳＮＩＲＱＥＰＡＰＫＧＲＰＡＬＱＬＰＧＱＭＤＰＧＷＨＶＳＳＶＴＲＳＡＴＥＧＰＳＹＳＥＱＬＧＡＫＳＧＰＮＧＨＰＹＮＲＴＮＲＳＲＭＰＮＬＮＤＬＫＥＴＡＬ］（配列番号２）のアミノ酸配列を
含むｈＣＤＫＬ５タンパク質をコードし、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２２の核酸配列、又は配列番号２２と少なくとも約９５％同一であり、配列番号２のタンパク質をコードする核酸配列である。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、［ＭＫＩＰＮＩＧＮＶＭＮＫＦＥＩＬＧＶＶＧＥＧＡＹＧＶＶＬＫＣＲＨＫＥＴＨＥＩＶＡＩＫＫＦＫＤＳＥＥＮＥＥＶＫＥＴＴＬＲＥＬＫＭＬＲＴＬＫＱＥＮＩＶＥＬＫＥＡＦＲＲＲＧＫＬＹＬＶＦＥＹＶＥＫＮＭＬＥＬＬＥＥＭＰＮＧＶＰＰＥＫＶＫＳＹＩＹＱＬＩＫＡＩＨＷＣＨＫＮＤＩＶＨＲＤＩＫＰＥＮＬＬＩＳＨＮＤＶＬＫＬＣＤＦＧＦＡＲＮＬＳＥＧＮＮＡＮＹＴＥＹＶＡＴＲＷＹＲＳＰＥＬＬＬＧＡＰＹＧＫＳＶＤＭＷＳＶＧＣＩＬＧＥＬＳＤＧＱＰＬＦＰＧＥＳＥＩＤＱＬＦＴＩＱＫＶＬＧＰＬＰＳＥＱＭＫＬＦＹＳＮＰＲＦＨＧＬＲＦＰＡＶＮＨＰＱＳＬＥＲＲＹＬＧＩＬＮＳＶＬＬＤＬＭＫＮＬＬＫＬＤＰＡＤＲＹＬＴＥＱＣＬＮＨＰＴＦＱＴＱＲＬＬＤＲＳＰＳＲＳＡＫＲＫＰＹＨＶＥＳＳＴＬＳＮＲＮＱＡＧＫＳＴＡＬＱＳＨＨＲＳＮＳＫＤＩＱＮＬＳＶＧＬＰＲＡＤＥＧＬＰＡＮＥＳＦＬＮＧＮＬＡＧＡＳＬＳＰＬＨＴＫＴＹＱＡＳＳＱＰＧＳＴＳＫＤＬＴＮＮＮＩＰＨＬＬＳＰＫＥＡＫＳＫＴＥＦＤＦＮＩＤＰＫＰＳＥＧＰＧＴＫＹＬＫＳＮＳＲＳＱＱＮＲＨＳＦＭＥＳＳＱＳＫＡＧＴＬＱＰＮＥＫＱＳＲＨＳＹＩＤＴＩＰＱＳＳＲＳＰＳＹＲＴＫＡＫＳＨＧＡＬＳＤＳＫＳＶＳＮＬＳＥＡＲＡＱＩＡＥＰＳＴＳＲＹＦＰＳＳＣＬＤＬＮＳＰＴＳＰＴＰＴＲＨＳＤＴＲＴＬＬＳＰＳＧＲＮＮＲＮＥＧＴＬＤＳＲＲＴＴＴＲＨＳＫＴＭＥＥＬＫＬＰＥＨＭＤＳＳＨＳＨＳＬＳＡＰＨＥＳＦＳＹＧＬＧＹＴＳＰＦＳＳＱＱＲＰＨＲＨＳＭＹＶＴＲＤＫＶＲＡＫＧＬＤＧＳＬＳＩＧＱＧＭＡＡＲＡＮＳＬＱＬＬＳＰＱＰＧＥＱＬＰＰＥＭＴＶＡＲＳＳＶＫＥＴＳＲＥＧＴＳＳＦＨＴＲＱＫＳＥＧＧＶＹＨＤＰＨＳＤＤＧＴＡＰＫＥＮＲＨＬＹＮＤＰＶＰＲＲＶＧＳＦＹＲＶＰＳＰＲＰＤＮＳＦＨＥＮＮＶＳＴＲＶＳＳＬＰＳＥＳＳＳＧＴＮＨＳＫＲＱＰＡＦＤＰＷＫＳＰＥＮＩＳＨＳＥＱＬＫＥＫＥＫＱＧＦＦＲＳＭＫＫＫＫＫＫＳＱＴＴＤＳＴＮＧＥＮＰＳＩＫＫＳＬＦＰＬＦＮＳＫＮＨＬＫＨＳＳＳＬＫＫＬＰＶＶＴＰＰＭＶＰＮＳＤＳＰＤＬＬＴＬＱＫＳＩＨＳＡＳＴＰＳＳＲＰＫＥＷＲＰＥＫＩＳＤＬＱＴＱＳＱＰＬＫＳＬＲＫＬＬＨＬＳＳＡＳＮＨＰＡＳＳＤＰＲＦＱＰＬＴＡＱＱＴＫＮＳＦＳＥＩＲＩＨＰＬＳＱＡＳＧＧＳＳＮＩＲＱＥＰＡＰＫＧＲＰＡＬＱＬＰＧＱＭＤＰＧＷＨＶＳＳＶＴＲＳＡＴＥＧＰＳＹＳＥＱＬＧＡＫＳＧＰＮＧＨＰＹＮＲＴＮＲＳＲＭＰＮＬＮＤＬＫＥＴＡＬ］（配列番号６）のアミノ酸配列を含むｈＣＤＫＬ５－２ＧＳタンパク質をコードし、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２４の核酸配列、又は配列番号２４と少なくとも約９５％同一であり、配列番号６のタンパク質をコードする配列を含む。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、［ＭＫＩＰＮＩＧＮＶＭＮＫＦＥＩＬＧＶＶＧＥＧＡＹＧＶＶＬＫＣＲＨＫＥＴＨＥＩＶＡＩＫＫＦＫＤＳＥＥＮＥＥＶＫＥＴＴＬＲＥＬＫＭＬＲＴＬＫＱＥＮＩＶＥＬＫＥＡＦＲＲＲＧＫＬＹＬＶＦＥＹＶＥＫＮＭＬＥＬＬＥＥＭＰＮＧＶＰＰＥＫＶＫＳＹＩＹＱＬＩＫＡＩＨＷＣＨＫＮＤＩＶＨＲＤＩＫＰＥＮＬＬＩＳＨＮＤＶＬＫＬＣＤＦＧＦＡＲＮＬＳＥＧＮＮＡＮＹＴＥＹＶＡＴＲＷＹＲＳＰＥＬＬＬＧＡＰＹＧＫＳＶＤＭＷＳＶＧＣＩＬＧＥＬＳＤＧＱＰＬＦＰＧＥＳＥＩＤＱＬＦＴＩＱＫＶＬＧＰＬＰＳＥＱＭＫＬＦＹＳＮＰＲＦＨＧＬＲＦＰＡＶＮＨＰＱＳＬＥＲＲＹＬＧＩＬＮＳＶＬＬＤＬＭＫＮＬＬＫＬＤＰＡＤＲＹＬＴＥＱＣＬＮＨＰＴＦＱＴＱＲＬＬＤＲＳＰＳＲＮＱＡＧＫＳＴＡＬＱＳＨＨＲＳＮＳＫＤＩＱＮＬＳＶＧＬＰＲＡＤＥＧＬＰＡＮＥＳＦＬＮＧＮＬＡＧＡＳＬＳＰＬＨＴＫＴＹＱＡＳＳＱＰＧＳＴＳＫＤＬＴＮＮＮＩＰＨＬＬＳＰＫＥＡＫＳＫＴＥＦＤＦＮＩＤＰＫＰＳＥＧＰＧＴＫＹＬＫＳＮＳＲＳＱＱＮＲＨＳＦＭＥＳＳＱＳＫＡＧＴＬＱＰＮＥＫＱＳＲＨＳＹＩＤＴＩＰＱＳＳＲＳＰＳＹＲＴＫＡＫＳＨＧＡＬＳＤＳＫＳＶＳＮＬＳＥＡＲＡＱＩＡＥＰＳＴＳＲＹＦＰＳＳＣＬＤＬＮＳＰＴＳＰＴＰＴＲＨＳＤＴＲＴＬＬＳＰＳＧＲＮＮＲＮＥＧＴＬＤＳＲＲＴＴＴＲＨＳＫＴＭＥＥＬＫＬＰＥＨＭＤＳＳＨＳＨＳＬＳＡＰＨＥＳＦＳＹＧＬＧＹＴＳＰＦＳＳＱＱＲＰＨＲＨＳＭＹＶＴＲＤＫＶＲＡＫＧＬＤＧＳＬＳＩＧＱＧＭＡＡＲＡＮＳＬＱＬＬＳＰＱＰＧＥＱＬＰＰＥＭＴＶＡＲＳＳＶＫＥＴＳＲＥＧＴＳＳＦＨＴＲＱＫＳＥＧＧＶＹＨＤＰＨＳＤＤＧＴＡＰＫＥＮＲＨＬＹＮＤＰＶＰＲＲＶＧＳＦＹＲＶＰＳＰＲＰＤＮＳＦＨＥＮＮＶＳＴＲＶＳＳＬＰＳＥＳＳＳＧＴＮＨＳＫＲＱＰＡＦＤＰＷＫＳＰＥＮ
ＩＳＨＳＥＱＬＫＥＫＥＫＱＧＦＦＲＳＭＫＫＫＫＫＫＳＱＴＶＰＮＳＤＳＰＤＬＬＴＬＱＫＳＩＨＳＡＳＴＰＳＳＲＰＫＥＷＲＰＥＫＩＳＤＬＱＴＱＳＱＰＬＫＳＬＲＫＬＬＨＬＳＳＡＳＮＨＰＡＳＳＤＰＲＦＱＰＬＴＡＱＱＴＫＮＳＦＳＥＩＲＩＨＰＬＳＱＡＳＧＧＳＳＮＩＲＱＥＰＡＰＫＧＲＰＡＬＱＬＰＧＱＭＤＰＧＷＨＶＳＳＶＴＲＳＡＴＥＧＰＳＹＳＥＱＬＧＡＫＳＧＰＮＧＨＰＹＮＲＴＮＲＳＲＭＰＮＬＮＤＬＫＥＴＡＬ］（配列番号８）のアミノ酸配列を含むｈＣＤＫＬ５－３ＧＳタンパク質をコードし、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２５の核酸配列、又は配列番号２５と少なくとも約９５％同一であり、配列番号８のタンパク質をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、［ＭＫＩＰＮＩＧＮＶＭＮＫＦＥＩＬＧＶＶＧＥＧＡＹＧＶＶＬＫＣＲＨＫＥＴＨＥＩＶＡＩＫＫＦＫＤＳＥＥＮＥＥＶＫＥＴＴＬＲＥＬＫＭＬＲＴＬＫＱＥＮＩＶＥＬＫＥＡＦＲＲＲＧＫＬＹＬＶＦＥＹＶＥＫＮＭＬＥＬＬＥＥＭＰＮＧＶＰＰＥＫＶＫＳＹＩＹＱＬＩＫＡＩＨＷＣＨＫＮＤＩＶＨＲＤＩＫＰＥＮＬＬＩＳＨＮＤＶＬＫＬＣＤＦＧＦＡＲＮＬＳＥＧＮＮＡＮＹＴＥＹＶＡＴＲＷＹＲＳＰＥＬＬＬＧＡＰＹＧＫＳＶＤＭＷＳＶＧＣＩＬＧＥＬＳＤＧＱＰＬＦＰＧＥＳＥＩＤＱＬＦＴＩＱＫＶＬＧＰＬＰＳＥＱＭＫＬＦＹＳＮＰＲＦＨＧＬＲＦＰＡＶＮＨＰＱＳＬＥＲＲＹＬＧＩＬＮＳＶＬＬＤＬＭＫＮＬＬＫＬＤＰＡＤＲＹＬＴＥＱＣＬＮＨＰＴＦＱＴＱＲＬＬＤＲＳＰＳＲＮＱＡＧＫＳＴＡＬＱＳＨＨＲＳＮＳＫＤＩＱＮＬＳＶＧＬＰＲＡＤＥＧＬＰＡＮＥＳＦＬＮＧＮＬＡＧＡＳＬＳＰＬＨＴＫＴＹＱＡＳＳＱＰＧＳＴＳＫＤＬＴＮＮＮＩＰＨＬＬＳＰＫＥＡＫＳＫＴＥＦＤＦＮＩＤＰＫＰＳＥＧＰＧＴＫＹＬＫＳＮＳＲＳＱＱＮＲＨＳＦＭＥＳＳＱＳＫＡＧＴＬＱＰＮＥＫＱＳＲＨＳＹＩＤＴＩＰＱＳＳＲＳＰＳＹＲＴＫＡＫＳＨＧＡＬＳＤＳＫＳＶＳＮＬＳＥＡＲＡＱＩＡＥＰＳＴＳＲＹＦＰＳＳＣＬＤＬＮＳＰＴＳＰＴＰＴＲＨＳＤＴＲＴＬＬＳＰＳＧＲＮＮＲＮＥＧＴＬＤＳＲＲＴＴＴＲＨＳＫＴＭＥＥＬＫＬＰＥＨＭＤＳＳＨＳＨＳＬＳＡＰＨＥＳＦＳＹＧＬＧＹＴＳＰＦＳＳＱＱＲＰＨＲＨＳＭＹＶＴＲＤＫＶＲＡＫＧＬＤＧＳＬＳＩＧＱＧＭＡＡＲＡＮＳＬＱＬＬＳＰＱＰＧＥＱＬＰＰＥＭＴＶＡＲＳＳＶＫＥＴＳＲＥＧＴＳＳＦＨＴＲＱＫＳＥＧＧＶＹＨＤＰＨＳＤＤＧＴＡＰＫＥＮＲＨＬＹＮＤＰＶＰＲＲＶＧＳＦＹＲＶＰＳＰＲＰＤＮＳＦＨＥＮＮＶＳＴＲＶＳＳＬＰＳＥＳＳＳＧＴＮＨＳＫＲＱＰＡＦＤＰＷＫＳＰＥＮＩＳＨＳＥＱＬＫＥＫＥＫＱＧＦＦＲＳＭＫＫＫＫＫＫＳＱＴＴＤＳＴＮＧＥＮＰＳＩＫＫＳＬＦＰＬＦＮＳＫＮＨＬＫＨＳＳＳＬＫＫＬＰＶＶＴＰＰＭＶＰＮＳＤＳＰＤＬＬＴＬＱＫＳＩＨＳＡＳＴＰＳＳＲＰＫＥＷＲＰＥＫＩＳＤＬＱＴＱＳＱＰＬＫＳＬＲＫＬＬＨＬＳＳＡＳＮＨＰＡＳＳＤＰＲＦＱＰＬＴＡＱＱＴＫＮＳＦＳＥＩＲＩＨＰＬＳＱＡＳＧＧＳＳＮＩＲＱＥＰＡＰＫＧＲＰＡＬＱＬＰＧＱＭＤＰＧＷＨＶＳＳＶＴＲＳＡＴＥＧＰＳＹＳＥＱＬＧＡＫＳＧＰＮＧＨＰＹＮＲＴＮＲＳＲＭＰＮＬＮＤＬＫＥＴＡＬ］（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むｈＣＤＫＬ５－４ＧＳタンパク質をコードし、ｈＣＤＫＬ５コード配列は、配列番号２６の核酸配列、又は配列番号２６と少なくとも約９５％同一であり、配列番号１０のタンパク質をコードする核酸配列を含む。

【0094】

特定の実施形態では、ベクターは、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、若しくは組換えアデノウイルスから選択されるウイルスベクター；又は裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、若しくはキトサンベースの製剤から選択される非ウイルスベクターである。選択されるベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技法、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む、任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。

【0095】

「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」は、合成又は人工ウイルス粒子を指し
、ここで、目的の遺伝子を含有する発現カセットは、ウイルスカプシド又はエンベロープ中にパッケージされ、ウイルスカプシド又はエンベロープ内にパッケージされた任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損である、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含む「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作することができる）、これらの遺伝子は、産生の間に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。そのような複製欠損ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス（組み込み又は非組み込み）、又は別の適切なウイルス源であってもよい。

【0096】

Ｖ．組成物
本明細書に記載されるｒＡＡＶ又はベクター及び水性懸濁媒体を含む組成物が本明細書で提供される。特定の実施形態では、懸濁液は、静脈内送達、髄腔内投与、又は脳室内投与のために製剤化される。

【0097】

本明細書では、少なくとも１つのｒＡＡＶストック、並びに任意選択的な担体、賦形剤及び／又は防腐剤を含む組成物が提供される。本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶの「ストック」は、ｒＡＡＶの集団を指す。脱アミド化に起因するカプシドタンパク質の不均一性にもかかわらず、ストック内のｒＡＡＶは、同一のベクターゲノムを共有することが予想される。ストックは、例えば、選択されたＡＡＶカプシドタンパク質及び選択された産生系に特徴的な不均一な脱アミド化パターンを有するカプシドを有するｒＡＡＶを含み得る。ストックは、単一の産生系から産生されてもよく、又は産生系の複数の実行からプールされてもよい。本明細書に記載されるものを含むが、これらに限定されない、様々な産生系を選択することができる。

【0098】

本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足有効成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギー又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。特に、ｒＡＡＶベクター送達ベクターゲノムは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、又はナノ粒子などのいずれかに封入された送達ために製剤化され得る。

【0099】

一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨ及び塩濃度に緩衝される水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、投与時に凍結乾燥され、再構成され得る。

【0100】

好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、一級ヒドロキシル基末端の二機能的ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチ
レン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ１５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）の後に３桁の数字で命名され、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与え、最後の１桁×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与える。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。一実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％（ｗ／ｗ％、重量比に基づく）の量で存在し得る。別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％（ｖ／ｖ％、体積比に基づく）の量で存在し得る。更に別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し、ここで、ｎ％は、懸濁液１００ｍＬ当たりのｎグラムを示す。

【0101】

別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤及び／又はアジュバントを含む。好適な担体は、導入ウイルスが向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）とともに製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに付着するのを防ぐが、インビボでｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含むべきである。好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８（商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８としても知られている）などの、末端が一級ヒドロキシル基の二機能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ－オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）の後に３桁の数字で命名され、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与え、最後の１桁×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与える。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高約０．０００５％～約０．００１％の量で存在してもよい。

【0102】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＣＤＫＬ５を含有する組成物は、６．８～８、又は７．２～７．８、又は７．５～８の範囲のｐＨで送達される。髄腔内送達の場合、ｐＨが、７．５超、例えば、７．５～８、又は７．８が望ましい可能性がある。

【0103】

特定の実施形態では、製剤は、重炭酸ナトリウムを含まない緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。かかる製剤は、ハーバード緩衝液などの緩衝生理食塩水溶液を含有してもよく、水中に、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、及びそれらの混合物のうちの１つ以上を含む。水溶液は、ポロキサマーである
Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８を更に含んでもよく、これは、ＢＡＳＦから市販され、以前、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８という商品名で販売されていた。水溶液は、７．２のｐＨを有し得る。

【0104】

別の実施形態では、製剤は、１ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ_３ＰＯ_４）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、０．８ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、及び０．００１％のポロキサマー（例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標））１８８、ｐＨ７．２を含む、緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。例えば、ｈａｒｖａｒｄａｐｐａｒａｔｕｓ．ｃｏｍ／ｈａｒｖａｒｄ－ａｐｐａｒａｔｕｓ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－ｆｌｕｉｄ．ｈｔｍｌを参照されたい。特定の実施形態では、ハーバード緩衝液は、ハーバード緩衝液でより良好なｐＨ安定性が観察されるため、好ましい。

【0105】

特定の実施形態では、製剤緩衝液は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含む人工ＣＳＦである。他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。好適な透過促進剤の例としては、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、又はＥＤＴＡを含んでもよい。

【0106】

任意選択的に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び担体に加えて、防腐剤又は化学的安定剤などの他の従来の医薬成分を含み得る。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。

【0107】

本発明による組成物は、上記に定義されるような薬学的に許容される担体を含み得る。好適には、本明細書に記載される組成物は、有効量の薬学的に好適な担体に懸濁された、及び／又は注入、浸透ポンプ、髄腔内カテーテルを介して対象に送達するために、又は別のデバイス若しくは経路による送達のために設計された好適な賦形剤と混合された１つ以上のＡＡＶを含む。一実施例では、組成物は、髄腔内送達用に製剤化される。一実施例では、組成物は、静脈内（ｉｖ）送達用に製剤化される。

【0108】

ＶＩ．使用
本明細書では、ＣＤＤを治療する方法であって、有効量の本明細書に記載されるｒＡＡＶ又はベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法が提供される。

【0109】

特定の実施形態では、本明細書における「有効量」は、ＣＤＤの症状の改善及び／又はＣＤＤの進行の遅延を達成する量である。

【0110】

ベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入及び発現を提供して、過度の悪影響なしに、又は医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは当業者によって決定され得る。従来の及び薬学的に許容される投与経路には、限定されないが、所望の臓器（例えば、脳、ＣＳＦ，肝臓（任意選択的に、肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、髄腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、実質内、髄腔内、ＩＣＭ、腰椎穿刺、及び他の非経口の投与経路が含まれる。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。

【0111】

ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）の投薬量は、主に、治療されている状態、患者
の年齢、体重及び健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療上有効なヒト投薬量は、概して、約１×１０^９～１×１０^１６ベクターゲノムコピーの濃度を含有する約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの溶液の範囲である。特定の実施形態では、約１ｍＬ～約１５ｍＬ、又は約２．５ｍＬ～約１０ｍＬ、又は約５ｍＬの体積の懸濁液が送達される。特定の実施形態では、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、又は約１５ｍＬの懸濁液の体積が送達される。特定の実施形態では、合計約８．９×１０^１２～２．７×１０^１４ＧＣの用量が、この体積で投与される。特定の実施形態では、約１．１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量が、この体積で投与される。特定の実施形態では、脳質量１グラム当たり約３．０×１０^９、約４．０×１０^９、約５．０×１０^９、約６．０×１０^９、約７．０×１０^９、約８．０×１０^９、約９．０×１０^９、約１．０×１０^１０、約１．１×１０^１０、約１．５×１０^１０、約２．０×１０^１０、約２．５×１０^１０、約３．０×１０^１０、約３．３×１０^１０、約３．５×１０^１０、約４．０×１０^１０、約４．５×１０^１０、約５．０×１０^１０、約５．５×１０^１０、約６．０×１０^１０、約６．５×１０^１０、約７．０×１０^１０、約７．５×１０^１０、約８．０×１０^１０、約８．５×１０^１０、約９．０×１０^１０、約９．５×１０^１０、約１．０×１０^１１、約１．１×１０^１１、約１．５×１０^１１、約２．０×１０^１１、約２．５×１０^１１、約３．０×１０^１１、約３．３×１０^１１、約３．５×１０^１１、約４．０×１０^１１、約４．５×１０^１１、約５．０×１０^１１、約５．５×１０^１１、約６．０×１０^１１、約６．５×１０^１１、約７．０×１０^１１、約７．５×１０^１１、約８．０×１０^１１、約８．５×１０^１１、約９．０×１０^１１ＧＣの用量が、この体積で投与される。

【0112】

任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるために、かかる投薬量を調整してもよく、かかる投薬量は、組換えベクターが利用される治療用途に応じて変化し得る。導入遺伝子の発現レベルをモニタリングして、ウイルスベクター（好ましくは、ミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクター）をもたらす投薬頻度を決定することができる。任意選択的に、治療目的で記載されているものと同様の投薬レジメンは、本発明の組成物を使用した免疫に利用され得る。

【0113】

複製欠陥ウイルス組成物は、投薬量単位で製剤化され、ヒト患者にとって、（対象を治療するために）約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１６ＧＣの範囲にある量の複製欠陥ウイルスを含み、その範囲内の全ての整数又は小数量、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣを含むことができる。一実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、又は９×１０^９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、又は９×１０^１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、又は９×１０^１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、又は９×１０^１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、又は９×１０^１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４
、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、又は９×１０^１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、又は９×１０^１５ＧＣを含むように製剤化される。

【0114】

一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、体重１ｋｇ当たり１×１０^１０～約１×１０^１５ＧＣの範囲であり得る。一実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は少数を含む、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、又は９×１０^９ＧＣである。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、体重１ｋｇ当たり約１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、又は９×１０^１０ＧＣである。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、体重１ｋｇ当たり約１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、又は９×１０^１１ＧＣである。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、体重１ｋｇ当たり約１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、又は９×１０^１２ＧＣである。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、体重１ｋｇ当たり約１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、又は９×１０^１３ＧＣである。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、体重１ｋｇ当たり約１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、又は９×１０^１４ＧＣである。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、体重１ｋｇ当たり約１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、又は９×１０^１５ＧＣである。

【0115】

一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は少数を含む、脳質量１グラム（ｇ）当たり１×１０^１０～約１×１０^１５ＧＣの範囲であり得る。一実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は少数を含む、脳質量１グラム（ｇ）当たり約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、又は９×１０^９ＧＣである。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、脳質量１グラム（ｇ）当たり約１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、又は９×１０^１０ＧＣである。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、脳質量１グラム（ｇ）当たり約１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、又は９×１０^１１ＧＣである。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、脳質量１グラム（ｇ）当たり約１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、又は９×１０^１２ＧＣである。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、脳質量１グラム（ｇ）当たり約１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、又は９×１０^１３ＧＣである。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、脳質量１グラム（ｇ）当たり約１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、又は９×１０^１４ＧＣである。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、脳質量１グラム（ｇ）当たり約１×１
０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、又は９×１０^１５ＧＣである。

【0116】

これらの上記用量は、治療される領域の大きさ、使用されるウイルス力価、投与経路、及び方法の所望の効果に応じて、約２５～約１０００マイクロリットルの範囲の様々な容量の担体、賦形剤、若しくは緩衝液製剤、又はその範囲内の全ての数を含むより高い容量で投与され得る。一実施形態では、担体、賦形剤、又は緩衝液の容量は、少なくとも約２５μＬである。一実施形態では、容量は、約５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１７５μＬである。更に別の実施形態では、容量は、約２００μＬである。別の実施形態では、容量は、約２２５μＬである。更に別の実施形態では、容量は、約２５０μＬである。更に別の実施形態では、容量は、約２７５μＬである。更に別の実施形態では、容量は、約３００μＬである。更に別の実施形態では、容量は、約３２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約３５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約３７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約４００μＬである。別の実施形態では、容量は、約４５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約５００μＬである。別の実施形態では、容量は、約５５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約６００μＬである。別の実施形態では、容量は、約６５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００～１０００μＬである。

【0117】

特定の実施形態では、用量は、約１ｘ１０^９ＧＣ／ｇ脳質量～約１ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約２．５×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約５×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。

【0118】

一実施形態では、ウイルス構築物は、少なくとも約最小１×１０^９ＧＣ～約１×１０^１５、又は約１×１０^１１～５×１０^１３ＧＣの用量で送達され得る。これらの用量及び濃度の送達のために好適な容量は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人用に選択されてもよい。典型的に、新生児用に好適な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児用に、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択される。幼児のためには、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量が選択されてもよい。小児用に、最大約３０ｍＬの容量が選択されてもよい。プレティーン及びティーンには、最大約５０ｍＬの容量が選択されてもよい。更に他の実施形態では、患者は、選択された約５ｍＬ～約１５ｍＬ、又は約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量で髄腔内投与を受けることができる。他の好適な容量及び投薬量が決定されてもよい。任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。

【0119】

上述の組換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞に送達され得る。好ましくは生理学的に適合性のある担体に懸濁されたｒＡＡＶは、ヒト又は非ヒト哺乳動物患者に投与され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ｒＡＡＶは、食塩水、界面活性剤、及び生理学的に適合性のある塩、又は塩の混合物を含有する水性溶液中に好適に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、又はｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、又はｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるので、髄腔内送達のためには、この範囲内のｐＨが望ましく、静脈内送達のためには、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかしながら、最も広範囲内の他のｐＨ、及びこれらの下位範囲が、他
の送達経路のために選択され得る。

【0120】

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」又は「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への注入による、より詳細には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注入による、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰椎穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、及び／又はＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽内であり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶ、ベクター、又は組成物は、髄腔内投与を介して必要な対象に投与される。特定の実施形態では、髄腔内投与は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１１月２９日に公表された米国特許公開第２０１８／０３３９０６５Ａ１号に記載されるように実施される。

【0121】

本明細書で使用される場合、「大槽内送達」又は「大槽内投与」という用語は、小脳延髄大槽の脳脊髄液への直接的な薬物の投与経路、より具体的には、後頭下穿刺による、若しくは大槽内への直接注射による、又は永続的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。

【0122】

特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物の治療は、感覚神経毒性及び無症状性感覚ニューロン病変に関して良好な耐容される、動物及び／又はヒト患者におけるＤＲＧ感覚ニューロンの最小～軽度の無症状変性を有する。

【0123】

ＶＩＩ．脳脊髄液中への医薬組成物の送達のための装置及び方法
一態様では、本明細書に提供されるベクターは、この節で提供され、かつＷＯ２０１８／１６０５８２（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法及び／又はデバイスを介して髄腔内投与され得る。代替的に、他のデバイス及び方法が選択され得る。特定の実施形態では、本方法は、脊椎ニードルを介する、患者の大槽内へのＣＴガイド下の後頭下注射のステップを含む。本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、軸に沿って作成された一連の平面断面画像から、コンピュータによって身体構造の三次元画像が構築される放射線撮影を指す。特定の実施形態では、装置は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１１月２９日に公開された米国特許公開第２０１８／０３３９０６５Ａ１号に記載されている。

【0124】

ＶＩＩＩ．ＣＤＤ
本明細書で使用される場合、「患者」又は「対象」は、雄又は雌の哺乳動物を意味し、ヒト、獣医学用動物又は農業用動物、家庭用動物又は愛玩動物、及び通常臨床研究に使用される動物が含まれる。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、ヒト患者である。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、男性又は女性のヒトである。特定の実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、ＣＤＤ及び／又はＣＤＤの症状と診断される。

【0125】

方法及び組成物は、ＣＤＤの病期のうちのいずれかの治療のために使用され得る。特定の実施形態では、患者は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ヶ月齢であるか、又は約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８歳である。特定の実施形態では、患者は、幼児、例えば、１８ヶ月齢～３歳である。特定の実施形態では、患者は、３歳～６歳、３歳～１２歳、３歳～１８歳、３歳～３０歳である。特定の実施形態では、患者は、１８歳を超えている。

【0126】

ＣＤＤの症状には、通常、生後３ヶ月以内に始まる発作が含まれ、出生後１週間に早く
も現れる可能性がある。発作の種類は年齢とともに変化し、予測可能なパターンに従うことがある。最も一般的なタイプは、意識喪失、筋剛性、及び痙攣を伴う全般性強直間代発作；異常な筋収縮を特徴とする強直発作；及び筋肉ジャークの短いエピソードを伴うてんかん性痙攣である。発作は、ＣＤＫＬ５欠損症のほとんどの人々で毎日起こるが、発作のない期間を有し得る。ＣＤＫＬ５欠損症における発作は、典型的には、治療に耐性である。

【0127】

ＣＤＫＬ５欠損症を有する小児では発達障害がみられる。ほとんどは重度の知的障害があり、発話はほとんど又はまったくない。座る、立つ、及び歩くなどの全身運動能力の発達が遅れているか、達成されていない。罹患者の約３分の１は、独立して歩くことができる。指で小さな物を拾うなどの細かい運動スキルも損なわれ、罹患者の約半数は、意図的に手を使用している。この状態の人々のほとんどは、視力障害（皮質視覚障害）を有している。

【0128】

ＣＤＫＬ５欠損症の他の一般的な特徴には、拍手、手舐め、及び手吸いなどの反復的な手の動き（ステレオタイプ）、歯ぎしり（ブラキシズム）、睡眠障害、摂食困難、並びに便秘及び食道への酸性胃内容物の逆流（胃食道逆流）を含む胃腸障害が含まれる。罹患者の中には、不規則な呼吸のエピソードがある人もいる。ＣＤＫＬ５欠損症を有する一部の人々における特徴的な顔の特徴は、高く広い額、大きくくぼんだ目、鼻と上唇との間の明確な空間（フィルトラム）、ふっくらした唇、広い間隔の歯、及び高い口の頂部（口蓋）を含む。他の物理的な違い、例えば、異常に小さい頭部サイズ（小頭症）、脊椎の側面から側面への湾曲（脊柱側弯症）、及び先細りの指なども生じ得る。

【0129】

上に記載したとおり、「増加」「減少」「低減」「改善」「向上」「遅延」若しくはそれらの任意の文法的変形、又は任意の類似の用語は、別途指定されない限り、対応する参照（例えば、未治療の対照又はＣＤＤを有しない健常状態の対象）と比較して、約５倍、約２倍、約１倍、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％の変動を意味する。

【0130】

特定の実施形態では、患者は、発作、筋肉硬直、又は呼吸、睡眠、消化管若しくは心臓の問題など、ＣＤＤと関連付けられたいくつかの徴候及び症状を制御する薬剤を受容する。

【0131】

特定の実施形態では、利尿剤は、それを必要とする対象における併用療法で使用されてもよい。使用される利尿剤は、アセタゾラミン（Ｄｉａｍｏｘ）又は他の好適な利尿剤であり得る。いくつかの実施形態では、利尿剤は、遺伝子療法投与時に投与される。いくつかの実施形態では、利尿剤は、遺伝子療法投与の前に投与される。いくつかの実施形態では、利尿剤は、注射量が３ｍＬである場合に投与される。

【0132】

特定の実施形態では、Ｃｄｋｌ５－アイソフォーム１、アイソフォーム２、アイソフォーム３、及び／若しくはアイソフォーム４発現ベクター、又はそれらの様々な二方向若しくは三方向の組み合わせの同時投与を含む、併用療法が利用されてもよい。任意選択で、併用療法は、別の活性剤の投与を更に含み得る。特定の実施形態では、併用療法は、酵素補充療法を含み得る。

【0133】

任意選択的に、必要とする対象において、免疫抑制性併用療法を使用してもよい。かかる併用療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、抗代謝剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシン又はラパログ）、及び細胞分裂阻害剤（アルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、又はイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む）が挙げられる。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマ
スタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体又はＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、又はＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の０、１、２、３、４、５、６、７日前若しくは後、又はそれ以前若しくはそれ以後に開始されてもよい。かかる免疫抑制療法は、１つ、２つ、又はそれ以上の薬物（例えば、グルココルチコイド、プレネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／又はシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の投与を伴い得る。かかる免疫抑制薬は、同じ用量又は調整用量で、１回、２回、又はそれ以上、必要とする対象に投与され得る。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬物（例えば、プレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／又はシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の同時投与を伴い得る。これらの薬物のうちの１つ以上が、同じ用量又は調整された用量で、遺伝子療法投与後に継続されてもよい。かかる療法は、必要に応じて、約１週間（７日間）、約６０日間、又はそれ以上であり得る。特定の実施形態では、タクロリムスを含まないレジメンが選択される。

【0134】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という語句、及びその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、他の状況では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を用いて解釈及び記載されるべきことも意図される。

【0135】

「発現」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、ＲＮＡ又はＲＮＡ及びタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」又は「翻訳」という用語は、特に、ペプチド又はタンパク質の産生に関する。発現は、一過性又は安定であり得る。

【0136】

「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「エンハンサー（ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は、１つ以上のエンハンサーを表すと理解されることに留意されたい。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0137】

本明細書全体を通して、指数は、「ｅ」という用語に続いて数値（ｎ）を使用して参照される。これは、「×１０^ｎ）」を指すことが理解されるであろう。例えば、「３ｅ９」は、３×１０^９と同じであり、「１ｅ１３」は、１×１０^１３と同じである。

【0138】

上述のように、「約」という用語は、別段の指定がない限り、数値を修正するために使用される場合、±１０％の変動を意味する。

【0139】

本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって、及び本明細書で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

【実施例】

【0140】

ＩＸ．実施例
以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。

【0141】

ＣＤＤのためのいくつかのモデルが開発されており、治療効果を評価する際に使用するために選択され得る。これらの以下のモデルは、ＣＤＫＬ５発現についてヌルである：例えば、エクソン６（Δエクソン６）に欠失を有するＣｄｋｌ５－ｋｏマウス（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｅｃ ２０１２，１０９（５２）２１５１６－２１５２１；ＤＯＩ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１６９８８１１０）；エクソン４（Δエクソン４）に欠失を有するＣｄｋｌ５－ｋｏマウス（Ａｍｅｎｄｏｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ａ
Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＣＤＫＬ５ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（５）：ｅ９１６１３．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９１６１３（２０１４）を参照されたい）；Ｃｄｋｌ５（Ｒ５９Ｘノックイン）モデル（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１９），Ｔａｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｌｔｅｒｅｄ ＮＭＤＡＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ ａｕｔｉｓｔｉｃ－ｌｉｋｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ＣＤＫＬ５ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１９；１０（１）：２６５５．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１９ Ｊｕｎ １４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１９－１０６８９－ｗを参照されたい）、及びＣｄｋｌ５（Ｄ４７１ｆｓ）モデル（Ｒｏｄｎｅｙ Ｓａｍａｃｏ，Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）。

【0142】

本研究では、３つのＣＤＤマウスモデル（Ｃｄｋｌ５－ｋｏ（エクソン６）、Ｃｄｋｌ５（Ｒ５９Ｘ）、Ｃｄｋｌ５（Ｄ４７１ｆｓ））のＣＮＳにおけるＣＤＫＬ５発現を復元することは、疾患症状を著しく改善することが示されている。我々は、ＡＡＶｈｕ６８カプシドで構成されるＡＡＶ遺伝子療法ベクター、及びヒトシナプシンプロモーターを有する発現カセット、及び操作されたヒトＣＤＫＬ５導入遺伝子を開発した。ＡＡＶ－ＣＤＫＬ５ベクターが、新生児の側脳室への注射を介してＣｄｋｌ５ノックアウトマウスに投与されたとき、我々は、脳全体の最大５０％のニューロンにおける堅牢な発現を検出した。ＡＡＶ投与及びヒトＣＤＫＬ５発現は、良好に忍容された。ヒトＣＤＫＬ５は、ほとんど細胞質に局在しており、タンパク質発現及びキナーゼ活性は、４ヶ月以上持続していた。我々は、処置されたＣｄｋｌ５－ｋｏマウスのコホートを一連の神経行動試験に供し、野生型マウスで観察された行動転帰に対して、未処置のＣｄｋｌ５－ｋｏ表現型から著しい改善を見出した。次いで、遺伝子ノックアウトの代わりに患者由来のフレームシフト変異（Ｃｄｋｌ５（Ｒ５９Ｘ）及びＣＤＫＬ５（Ｄ４７１ｆｓ）モデル）を有する２つの異なるＣＤＤマウスモデルにおいて同じ研究を繰り返した。我々は非常に類似した結果を得たため、我々のＣＤＫＬ５遺伝子療法ベクターの治癒的利益を再確認した。

【0143】

ＣＤＫＬ５は、ヒト脳における少なくとも４つの異なるアイソフォームとして発現される。我々は、３つの交互にスプライシングされたアイソフォームについて同様のＡＡＶ遺伝子療法ベクターを生成し、これらは全て、形質導入されたマウス脳においてキナーゼ活性を発現し、それを示すことが見出された。

【0144】

より大きな動物における我々のＡＡＶ－ＣＤＫＬ５遺伝子療法ベクターの発現を試験するために、我々は、アカゲザルを用いた研究を行った。大槽を介した脳脊髄液への注入を通じて、我々は、二倍体ゲノム当たり０．１～１ベクターコピーで、脳全体にわたるベクター分布を達成することができた。後根神経節（ＤＲＧ）において、はるかに高いベクター形質導入が観察された。したがって、ヒトＣＤＫＬ５配列に特異的なプローブによるインサイチュハイブリダイゼーションは、ＤＲＧニューロンにおける豊富な発現を示したが
、皮質灰白質ニューロンでははるかにまばらな発現を示した。ＣＤＫＬ５の投与及び発現は、概して、６０日間にわたって全６匹のアカゲザルにおいて良好に忍容性があったが、我々は、白質脊髄路の軽度の軸索障害に気付いた。

【0145】

要約すると、我々は、ＣＤＫＬ５遺伝子療法がモデルマウスに持続的な治癒的利益をもたらし、非ヒト霊長類において良好に忍容性があるという有望な証拠を示す。このアプローチの更なる最適化は、最終的に、ＣＤＤに罹患している小児における臨床介入のための選択肢を提供する可能性がある。

【0146】

実施例１．材料及び方法。
プラスミド。ヒト脳^１において発現する４つのＣＤＫＬ５（サイクリン依存性キナーゼ様５、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ７６０３９）のアミノ酸配列をＤＮＡ配列に逆翻訳した。コード配列は、例えば、ヒトゲノム、暗号ＲＮＡスプライス部位、及び代替リーディングフレームに見出されるコドン頻度を考慮することによって、更に操作された。操作された配列を、ヒトシナプシンプロモーター^２の制御下で、ＡＡＶ発現プラスミドにクローニングした。コード配列は、Ｋｏｚａｋ配列、続いてＷＰＲＥエンハンサーカセット（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）、ＳＶ４０ポリＡ配列に続き、ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）によってフレーム化される。後根神経節（ＤＲＧ）における発現を抑制するために、いくつかの実験では、上記のプラスミドは、ＣＤＫＬ５コード配列の直後及びＷＰＲＥ配列の直前に、ｍｉＲ１８３結合部位（ａｇｔｇａａｔｔｃｔａｃｃａｇｔｇｃｃａｔａ）（配列番号１１）の４回の反復を含有するように修飾された。ＡＡＶ
ＣＤＫＬ５ベクターは、マウス研究のためのカプシドＰＨＰ．Ｂ^３又はマウス及び非ヒト霊長類研究のためのＡＡＶ９ｈｕ６８^４又はＡＡＶｒｈ９１のいずれかとして使用して、ペンシルベニア大学Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅで産生された。

【0147】

マウス研究。マウスを伴う全ての研究は、ペンシルベニア大学ＩＡＣＵＣによって承認された。我々は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからＣｄｋｌ５－ｋｏマウス（Ｂ６．１２９（ＦＶＢ）－Ｃｄｋｌ５ｔｍ１．１Ｊｏｅｚ／Ｊ、株番号０２１９６７）を得て、ヘテロ接合雌ｋｏマウスをｗｔＣ５７Ｂｌ６雄と交配させ、以下の遺伝子型の同腹子を得た：雄の半接合Ｃｄｋｌ５－ｋｏ（ＫＯマウス又はマウスとしても参照される）、雄のｗｔ、雌のヘテロ接合Ｃｄｋｌ５－ｋｏ、及び雌のｗｔ。マウスは、１８～２１日齢で、後眼窩注射によって総容量１００μｌで、ＡＡＶ Ｃｄｋｌ５ベクター（用量範囲１×１０^１１ＧＣ～５×１０^１１ＧＣ）又はビヒクル対照（滅菌リン緩衝生理食塩水）を受容した。あるいは、マウスは、出生日に、１×１０^１０ＧＣ～５×１０^１０ＧＣの用量を総容量２μｌで脳室内に注射された。遺伝子型及び注射産物に関して混合したマウスを収容し、体重を測定し、週に少なくとも２回観察し、行動試験に供した場合、雄は１１週、雌は１４週まで加齢させた。治療関連の病的状態は観察されなかった。

【0148】

ウエスタンブロッティング及び組織染色。安楽死後、一方の皮質半球を急速冷凍し、続いてＲＩＰＡ緩衝液を使用して、タンパク質溶解物を生成した。ヒトＣｄｋｌ５（Ｓ９５７Ｄ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｎｄｅｅ、ＵＫ）、ＥＢ２（ａｂ４５７６７、Ａｂｃａｍ）又はＥＢ２ ｐｈｏｓｐｏ２２２（ｐａｂ０１０３２－Ｐ、Ｃｏｖａｌａｂ、ＵＫ）に対する抗体を用いて、ウエスタンブロッティングを実行した。もう一方の脳半分をホルマリン中で一晩固定し、パラフィン包埋し、薄い切片を、同じＣＤＫＬ５抗体を用いて免疫蛍光染色のために処理した。

【0149】

行動試験。マウスは、１日当たり１回の試験を行った。試験の日時、操作者、及び環境を同じに保った（６０ｄＢのホワイトノイズバックグラウンド、及び１０００ルーメンの白熱間接照明）。各試験の前に、マウスをホームケージ内で３０分間慣らした。オープンフィールドアッセイのために、最小量の床敷を有する新しいケージを、赤外線ビームアレ
イ（ＭｅｄＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）中に配置した。ケージの中央に一匹のマウスを追加し、次の３０分間にわたって、ビームブレーキの数を自動的に記録し、地面に近いビームブレーキ（一般的な活動）と地面から３インチ上のビームブレーキ（飼育活動）に分離した。高架式ゼロ迷路（ＥＺＭ、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．）については、２つの対向する閉じたアームと２つの開放されたアームを有する高架式円形プラットフォームを使用して、途切れない探索を可能にした。一匹のマウスを開放されたアームの中央に配置し、その動きを１５分間ビデオ記録した。Ｙ迷路（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．）については、Ｙ形状の３つの同一のアームを含む密閉プラットフォームを使用した。操作者に最も近いアームに一匹のマウスを配置し、その動きを５分間ビデオ記録した。ガラス玉覆い隠しアッセイのために、新しいケージを３インチのＡｌｐｈａＤｒｉ床敷（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐａｐｅｒｓ）で満たし、穏やかに押して圧縮した。１２個の固形の青いガラス玉を床敷の上に等間隔で配置し、一匹のマウスをケージの中央に配置した。少なくとも半分が床敷で覆われたガラス玉の数を、３０分後に記録した。

【0150】

データ分析。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍｓソフトウェアを使用してグラフ化し、分析した。ビデオファイルを２０ｆｐｓでｍｐ４形式で記録し、ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ ＸＴソフトウェア（バージョン１４、Ｎｏｌｄｕｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して分析した。巣構築アッセイのために、マウスは、新しいケージ内に単独で一晩収容され、標準化された２×２インチ平方ネストレット（綿ベース）を供給された。２４時間後、巣の質を１～５の尺度でスコア化し、残りの触れられていないネストレット材料を計量した。

【0151】

非ヒト霊長類実験。非ヒト霊長類を伴う全ての研究は、ペンシルベニア大学ＩＡＣＵＣによって承認され、ＵＳＤＡ規則に従って実行された。Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）種の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）は、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃから入手した。隔離及び動物の飼育は、遺伝子療法プログラムＳＯＰに従って実施した。ＡＡＶベクター投与の前月に研究を通じて、体重、体温、呼吸数及び心拍数を定期的に監視し、血液及びＣＳＦ試料を得た。全血を細胞数及び鑑別に使用し、臨床血液化学パネルを使用した。ＣＳＦ試料は、血液細胞数及び鑑別、並びに全タンパク質定量に使用された。大槽穿刺によるＣＳＦへのＡＡＶベクター送達のために、麻酔されたサルを、側臥位で処置台上に配置し、頭部を前方に屈曲させた。無菌技法を使用して、２１～２７ゲージ、１～１．５インチのＱｕｉｎｃｋｅ脊椎ニードル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、ＣＳＦの流れが観察されるまで、後頭下空間へと前進させた。ニードルは、血液の汚染及び潜在的な脳幹損傷を回避するために、より広範囲の大槽の上部空隙へ指向される。ニードル穿刺の正確な配置は、透視装置を使用する脊髄造影法によって確認される。１ｍＬのＣＳＦを、投与前に、ベースライン分析のために収集した。ＣＳＦ収集の後、ルアーアクセス延長カテーテルは、脊椎ニードルに連結されて、１ｍｌのイオヘキサール（商標名：Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０ｍｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）コントラスト培地を促進する。ニードル配置を確認した後、試験品目を含有するシリンジ（１ｍＬに等価な容量並びにシリンジ及びリンカーのデッドスペース容量）は、可撓性リンカーに連結されて、３０±５秒間にわたって注射された。ニードルを除去し、直圧を穿刺部位に適用した。ＡＡＶｈｕ６８．ｈＳｙｎ．Ｃｄｋｌ５－１ｃｏ及びＡＡＶｈｕ６８．ｈＳｙｎ．Ｃｄｋｌ５－１ｃｏベクターは、最大３×１０^１３ＧＣ／ＮＨＰの用量で注射されている。研究０日目、１４日目、１８日目、４１日目、及び最終試験日に、神経学的機能の詳細な評価のために、全てのアカゲザルで神経学的評価を行った。簡潔に述べると、評価には、姿勢及び歩行評価、脳神経評価、固有受容性評価、並びに脊髄／神経反射が含まれた。５６日目の試験で、アカゲザルを安楽死させ、大規模解剖検査及び剖検を行った。瞬間凍結又はホルマリン固定のいずれかのために、２５個の主要な組織を各アカゲザルから二重で回収した。ＤＮＡ又はＲＮＡを瞬間凍結した組織から精製し、それぞれ、ベクター生体内分布又は導入遺伝子発現分析の
ために使用した。ベクター生体内分布については、導入遺伝子カセットのポリＡ領域を再び指向するプローブを用いたＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイ及び内部標準を使用して、総ＤＮＡ重量当たりのゲノムコピー（ＧＣ）を決定した。導入遺伝子発現を定量化するために、総ＲＮＡを使用して、ポリＴオリゴヌクレオチドによる第１の鎖合成を介してｃＤＮＡを生成し、続いて、内因性アカゲザルＣＤＫＬ５配列と交差反応しない導入遺伝子に特異的なプローブを有するＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを生成した。組織病理学的分析のために、マカク組織をパラフィン包埋し、これらの切片を、それぞれＨ＆Ｅ溶液又はＣＤＫＬ５抗体で染色した。同じ脊髄切片をＬｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅとともにインキュベートし、ミエリンを染色した。全ての染色組織切片は、委員会認定の獣医病理学者によって審査され、異常所見は査読によって検証された。
参考文献：
１．Ｈｅｃｔｏｒ，Ｒ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＫＬ５ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ １１，ｅ０１５７７５８，（２０１６）．
２．Ｔｈｉｅｌ，Ｇ．，Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ，Ｐ．＆ Ｓｕｄｈｏｆ，Ｔ．Ｃ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ Ｉ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８８，３４３１－３４３５，（１９９１）．
３．Ｄｅｖｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄｓ ＡＡＶ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｂｒａｉｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，２０４－２０９，（２０１６）．
４．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｖｅｒｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｌｅｔｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｈｉｇｈ－Ｄｏｓｅ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ
Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＳＭＮ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２９，２８５－２９８，（２０１８）．

【0152】

実施例２：遺伝子療法ＡＡＶベクター
ＩＴＲ間の発現構築物は、ヒトシナプシンプロモーター（配列番号２３）、ヒトＣＤＫＬ５の操作されたコード配列、アイソフォーム１（配列番号２２）、ＷＰＲＥ発現エンハンサー（配列番号２７）、及びＳＶ４０ポリＡ配列（配列番号２８）で構成される（図１Ａ）。同様に、代替発現構築物は、アイソフォーム１の代わりに、それぞれヒトＣＤＫＬ５、アイソフォーム２（ＣＤＫＬ５－２ＧＳ若しくはｈＣＤＫＬ５－２ＧＳ、配列番号２４）、３（ＣＤＫＬ５－３ＧＳ若しくはｈＣＤＫＬ５－３ＧＳ、配列番号２５）、又は４（ＣＤＫＬ５－４ＧＳ若しくはｈＣＤＫＬ５－４ＧＳ、配列番号２６）の操作されたコード配列を含有する。全ての試験されたプラスミドは、マウスの脳で良好に発現し、ＥＢ２をリン酸化する能力（ＣＤＫＬ５キナーゼ活性の測定）にわずかな違いを示す。我々は、野生型マウスＣｄｋｌ５発現に類似するマウス脳におけるヒトＣＤＫＬ５発現レベルを得るために、ＷＰＲＥエンハンサーが必要であることを見出した（図２）。ＣＤＫＬ５は、その内因性標的ＥＢ２タンパク質をリン酸化する能力によって決定されるように、完全に活性であった（図２）。ＣＤＫＬ５の発現及び局在を、ＩＨＣを介して確認した。また、ヒトシナプシンを、ヒトユビキチンＣプロモーター（Ｕｂｃ）（図１Ｂ）又はニワトリβアクチンハイブリッドプロモーター（図１Ｃ）と交換することによって、代替発現構築物を生成した。ＡＡＶｒｈ９１カプシド中のＡＡＶベクターＡＡＶｒｈ９１．ＵｂＣ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３及びＡＡＶｒｈ９１．ＣＢｈ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３を、Ｃｄｋｌ５－ｋｏマウスの新生児ＩＣＶを介して３×１０^１０ＧＣの用量で投与し、剖検をＰ１４で実施した。マウス脳組織のウエスタンブロット分析は、ＵｂＣ又
はＣＢｈプロモーターを含むＡＡＶベクターゲノムによる形質導入後のＣＤＫＬ５の発現を確認した。我々は、ＡＡＶｒｈ９１．ＵｂＣ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３及びＡＡＶｒｈ９１．ＣＢｈ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３での形質導入後のマウス脳におけるＣＤＫＬ５導入遺伝子の発現を観察した。ＡＡＶｒｈ９１．ＵｂＣ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３での形質導入後、細胞当たりのより高いＣＤＫＬ５発現が、マウス脳の海馬において観察された。一方、ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢｈ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３での形質導入後、ここで、細胞当たりのより低いＣＤＫＬ５の発現が、マウス脳の海馬において観察された。ＡＡＶｒｈ９１．ＵｂＣ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３での形質導入後、細胞当たりのより高いＣＤＫＬ５の発現が、マウス脳の皮質において観察された。ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢｈ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３での形質導入後、細胞当たりのより低いＣＤＫＬ５の発現が、マウス脳の皮質において観察された。更に、ＡＡＶｒｈ９１．ＵｂＣ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３（３×１０^１０ＧＣ、新生児ＩＣＶ）及びＡＡＶｈｕ６８．ｈＳｙｎ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３（２．５×１０^１０ＧＣ）の投与後のＣｄｋｌ５－ｋｏマウス脳におけるＣＤＫＬ５発現を比較した。指定されているように、ＡＡＶの投与後に、非常に類似した発現パターンがマウス脳で観察された。ＡＡＶｒｈ９１．ＵｂＣ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３（ＡＡＶｒｈ９１カプシド、ユビキチンＣプロモーター）又はＡＡＶｈｕ６８．ｈＳｙｎ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３（ＡＡＶｈｕ６８カプシド、シナプシンプロモーター）のいずれかでの形質導入後のマウス脳において、ＣＤＫＬ５発現が観察された。更に、１×１０^１０ＧＣ、３×１０^１０ＧＣ、及び６×１０^１０ＧＣでの様々な用量のＡＡＶｒｈ９１．ＵｂＣ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３及びＡＡＶｒｈ９１．ＣＢｈ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３を、Ｃｄｋｌ５－ｋｏマウスにおいて行動効果について調べる。

【0153】

ＡＡＶ．ＵｂＣ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３ベクターは、ｈＳｙｎによってＣＤＫＬ５発現が駆動されたときと同様に、マウスにおいて治療有用性を示した。操作された核酸配列を含むＡＡＶベクターゲノムとともに使用した場合のＡＡＶｒｈ９１カプシドは、ＡＡＶｈｕ６８と同様のＣＤＫＬ５発現を達成した。マウス脳におけるＣＤＫＬ５タンパク質レベルは、ｈＳｙｎプロモーターと比較して、Ｕｂｃプロモーターでより高かった。

【0154】

実施例３：ＣＤＤマウスモデルにおけるＣＤＫＬ５遺伝子療法の臨床前治療効果
Ｃｄｋｌ５欠損マウスに対するＣＤＫＬ５遺伝子療法の治療効果の試験のために、我々は、若年性Ｃｄｋｌ５－ｋｏ（ＫＯマウス又はマウスとしても参照される）及び野生型（ｗｔ）同腹子のコホートを、逆軌道ＩＶ注射によって、５×１０^１１ＧＣ（５ｅ１１ｇｃ）のＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎ－ｈＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ＷＰＲＥベクターで処理した。全ての処置群は、同じ速度で成長し続け、処置関連死は観察されなかった。生後１０週で、マウスを一連の行動試験に供した。上昇したゼロ迷路及びオープンフィールド活動試験では、処置群について堅牢かつ統計学的に有意な正規化が観察された。ロータロッド試験及びＹ迷路試験では、同じ群でわずかな改善が認められたが、熱感度に改善は認められなかった。

【0155】

Ｃｄｋｌ５が神経発達に重要であることを考慮して、遺伝子療法の早期投与はマウスにおける治療転帰を改善する可能性があるかどうかを考えた。次に、我々は、脳室内（ＩＣＶ）注射によって、マウス１匹当たり６×１０^９ＧＣ～５×１０^１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８－ｈＳｙｎ－ｈＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ＷＰＲＥベクターの用量範囲で、新生児Ｃｄｋｌ５－ｋｏ又はｗｔ同腹子のコホートを処置した。生後１０週間又は１１～１４週間（指示されている場合）に記載された行動試験。全ての群にわたる全体的な観察は、処置が良好に忍容され、処置関連死は存在せず、正常な体重増加（図９Ａ及び９Ｂ）並びに全体的な発達が観察された。５×１０^１０ＧＣの用量、２．５×１０^１０ＧＣの用量、及び１×１
０^１０ＧＣの用量で、Ｃｄｋｌ５－ｋｏマウス脳におけるＣＤＫＬ５導入遺伝子の用量依存的発現が観察された。１０週齢で、ＫＯマウスは、特徴的な後肢クラスピング表現型を示し、これは、処置されたｋｏマウスにおいて実質的に改善された。ＣＤＫＬ５遺伝子療法の治療有効性は、後肢クラスピング試験によって測定された。用量依存的改善は、処置されたＣＤＫＬ５－ｋｏマウスの重症度スコアにおいて観察された（図９Ｃ～９Ｆ）。同様に、ｋｏマウスに見られる持続的な多動性及び飼育表現型を、野生型活性に対して正規化した。海馬の学習及び記憶は、Ｙ迷路試験（自発的変化指数）において、処置されたｋｏマウスで高度に改善された。ＣＤＫＬ５遺伝子療法の治療有効性は、ＫＯ及びＡＡＶ処置マウスにおける多動性の補正を測定する、オープンフィールド活動試験によって更に測定した。処置されたＣｄｋｌ５－ｋｏマウスにおいて、多動性の用量依存的解決が観察された（図１１Ａ～１１Ｆ）。ＫＯマウスは、新鮮なケージに単独で一晩収容されたときには貧弱な巣構築であり、全ての巣材を引き裂かない。処置したＫＯマウスは、用量依存的に、巣構築能力を大幅に向上させた（図１０Ａ、１０Ｃ、１０Ｅ）。追加の２つの他の神経行動アッセイ（ガラス玉覆い隠し及びＹ迷路）は、処置したＣｄｋｌ５－ｋｏマウスにおける表現型の改善の強い傾向を示した（図１０Ｂ及び１０Ｄ）。ＥＥＧ表現型は、予備的な共同研究で救出され、翻訳バイオマーカーとして有用になり得る。主要なアッセイ（後肢クラスピング、歩行活動）の転帰の検証は、独立した実験コホートを用いて追加的に行われる。より大きなコホートサイズ（Ｎ＝１８／群）は、より堅牢な統計学的有意性をもたらした。代替のＣＤＤマウスモデル（Ｒ５９Ｘ、Ｄ４７１ｆｓ）を用いた主要アッセイ（後肢クラスピング、歩行活動）の転帰の検証も実施される。要約すると、ＣＤＫＬ５遺伝子療法は、機能的ＣＤＫＬ５タンパク質をマウス脳に送達し、ＣＤＤ雄マウスモデルにおけるいくつかの神経行動転帰に対して用量依存的な治療効果を有する。

【0156】

行動試験を終えた後、マウスが約３ヶ月齢であったときに脳を採取した。ウエスタンブロッティングは、ＡＡＶ投与の３ヶ月後であっても、Ｃｄｋｌ５－ｋｏ脳におけるヒトＣＤＫＬ５の堅牢な発現を明らかにした。最後に、ヒトＣＤＫＬ５は、リン酸化ＥＢ２タンパク質についてブロットするときに堅牢なキナーゼ活性を示した。

【0157】

また、代替ＣＤＤマウスモデルを用いたＣＤＫＬ５遺伝子療法の転帰を調べた。Ｃｄｋｌ５（Ｄ４７１ｆｓ）は、早期終止コドンにつながる患者点変異を有する。患者と同様に、これらのマウスの脳において、ＣＤＫＬ５タンパク質は見出されず、非常に低減したＥＢリン酸化レベルが見出された。したがって、Ｃｄｋｌ５（Ｄ４７１ｆｓ）は、以前に使用されたＣｄｋｌ５－ｋｏマウスとＣｄｋｌ５タンパク質の非存在を共有するが、マウスモデルの生成方法により、遺伝的背景が若干異なる。新生児には、以前と同じ濃度（５×１０^１０ＧＣ、ｎｅｏＩＣＶ）で注射し、３ヶ月後には堅牢なｈＣＤＫＬ５タンパク質発現及びＥＢ２リン酸化を示した。小さなパイロットコホートを行動試験に供した。ＡＡＶ処置は良好に忍容され、病的状態は観察されなかった。後肢クラスピングは、処置された変異体マウスにおいて著しい補正され、同様に、上昇したゼロ迷路試験における変異体表現型は、処置された変異体マウスにおいて野生型行動に補正された（オープンゾーン内、オープンゾーン進入。変異体マウスは、相互作用及び新しいケージ内のグリッドに配置されたガラス玉での覆い隠し行動が不良であることを示すが、野生型マウスは、典型的にほとんど全てを覆い隠す。処置された変異体マウスは、野生型マウスに対するそれらの行動の強力な補正を示す。処置群のＣｄｋｌ５－ｋｏマウスにおいて、５×１０^１０ＧＣ／マウスのより高い用量で著しい改善が観察された。

【0158】

また、代替ＣＤＤマウスモデルを用いたＣＤＫＬ５遺伝子療法の転帰を調べた。Ｃｄｋｌ５（Ｒ５９Ｘ）は、未成熟終止コドンを導入する患者点変異を有する。患者と同様に、これらのマウスの脳において、ＣＤＫＬ５タンパク質は見出されず、非常に低減したＥＢリン酸化レベルが見出された。したがって、Ｃｄｋｌ５（Ｒ５９Ｘ）は、以前に使用されたＣｄｋｌ５－ｋｏマウスとＣｄｋｌ５タンパク質の非存在を共有するが、マウスモデル
の生成方法により、遺伝的背景が若干異なる。新生児には、以前と同じ濃度（５×１０^１０ＧＣ、ｎｅｏＩＣＶ）で注射し、３ヶ月後には堅牢なｈＣＤＫＬ５タンパク質発現及びＥＢ２リン酸化を示した。小さなパイロットコホートを行動試験に供した。ＡＡＶ処置は良好に忍容され、病的状態は観察されなかった。後肢クラスピングは、処置された変異体マウスにおいて著しく補正された。

【0159】

我々はまた、ヘテロ接合雌Ｃｄｋｌ５－ｋｏマウスにおける代替ＣＤＤマウスモデルを用いたＣＤＫＬ５遺伝子療法の転帰を調べた。このようなモデルは、ほとんどのＣＤＤ患者（ＣＤＤ雌）を反映する。全体的な評価は、ヘテロ接合雌Ｃｄｋｌ５－ｋｏマウス神経行動表現型がはるかに穏やかであり、後に発症するため、治療転帰の堅牢な評価をより困難にすることを示した。しかしながら、高用量（５×１０^１０ＧＣ、新生児ＩＣＶ）における後肢クラスピング及び歩行活動の代表的なデータは、著しい改善を示す（図１４Ｂ及び１４Ｃ）。

【0160】

加えて、我々は、ＷＴマウスにおけるＣＤＫＬ５遺伝子療法の用量漸増を調べた。ＷＴ（Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ）マウスに、新生児ＩＣＶを介して、７．５×１０^１０ＧＣ及び１×１０^１１ＧＣ（すなわち、以前に使用された最高用量の１．５倍又は２倍）で注射した。体重、発達、及び生存に明らかな影響は観察されなかった。マウスは正常に見え、後肢クラスピング又は活動変化を示さなかった。ＣＮＳ組織の病理学的レビューにおいて、効果は観察されなかった（図１９Ａ及び１９Ｂ）。

【0161】

実施例４：実用的なヒトＣＤＫＬ５アイソフォーム２～４
ヒト及びマウスの脳には少なくとも４つの検出可能なＣｄｋｌ５ ｍＲＮＡスプライスバリアントが存在することが示されているが、アイソフォーム２～４が安定なタンパク質として存在することは確立されていない。アイソフォーム１は、脳ＣＤＫＬ５の８５％超を占める。

【0162】

我々は、ヒトＣＤＫＬ４アイソフォーム２～４のコード配列をコドン操作し、以前と同じＡＡＶベクターにコード配列をクローニングした。アイソフォーム１～４のＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂベクターコーディングを、ウエスタンブロット分析のために２週間後に採取した成体Ｃｄｋｌ５－ｋｏマウス及び脳に尾部ＩＶ注射した。我々は、期待されるゲル移行パターンを堅牢に発現し、表示する４つのアイソフォーム全てを見出した。フォローアップのために、アイソフォーム１の発現量によく似たアイソフォーム２～４の発現をもたらした操作配列を選択した。アイソフォーム２によって生成されたＥＢ２リン酸化レベルは、アイソフォーム１と比較してわずかに高く、アイソフォーム３又は４によるものはわずかに低かった。

【0163】

３つの代替ＣＤＫＬ５アイソフォームが、新生児Ｃｄｋｌ５－ｋｏマウスに注射され、潜在的な治療効果がアイソフォーム１とどのように比較されるかを試験した。図１２は、代替ＣＤＫＬ５アイソフォーム（２、３、及び４）による処置を用いたクラスピング表現型の著しい補正を示す。図８Ａ～８Ｄは、発現アイソフォーム１、アイソフォーム２、アイソフォーム３、又はアイソフォーム４のためのＡＡＶ．ＣＤＬＫ５ベクター構築物のＣＤＫＬ５発現レベル又は活性を提供する。図８Ａは、ビヒクルを注射した野生型マウス及びビヒクルを注射したノックアウトマウスと比較した、これらのアイソフォームの各々を発現するＡＡＶベクター（５×１０^１０ＧＣ、新生児ＩＣＶ）を注射したノックアウトマウスにおける発現レベルを示す。図８Ｂは、ビヒクル（ＰＢＳ）を注射した野生型マウス、ビヒクルを注射したノックアウトマウス、又はＡＡＶ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏにおいてｐＳ２２２ＥＢ２を使用して決定されたＣＤＫＬ５活性を示す。図８Ｃは、図８Ａの群について、ｐＳ２２２ＥＢ２を使用して決定されたＣＤＫＬ５活性を示す。図８Ｄは、図８Ｂの群のＣＤＫＬ５発現レベルを示す。

【0164】

要約すると、全てのアイソフォームは、タンパク質として発現し、同等の触媒活性を有する。ＣＤＤマウスモデルにおけるアイソフォーム２、３、又は４を有する治療転帰は、頭から頭への試験を行った場合のアイソフォーム１と同等である（５×１０^１０ＧＣ、新生児ＩＣＶ）。全体として、ＣＤＫＬ５アイソフォーム１によるＣＤＫＬ５遺伝子療法は、著しい治療効果を有する雄ＣＤＤモデルマウスにおける有望かつ安全なアプローチである。

【0165】

実施例５：ｈＣＤＫＬ５遺伝子療法の毒性及び安全性試験のためのＮＨＰパイロット試験
我々は、ＮＨＰにおけるＡＡＶｈｕ６８カプシドにパッケージングされたＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ＷＰＲＥ構築物の発現パターン及び安全性プロファイルを調査することを望んだ。本明細書に記載されるベクターゲノム及び以前に記載されている産生方法を使用して、ベクターを生成した。例えば、ＷＯ２０１８／１６０５８２を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。６匹のアカゲザル（４～６歳）の群を、大槽（ＩＣＭ）を介して注射した。異なる条件を試験し、
Ａ．用量１×１０^１４ＧＣ、１ｍｌの緩衝液中で注射
Ｂ．用量１×１０^１４ＧＣ、３ｍｌ又は５ｍｌの緩衝液中で注射
Ｃ．用量３×１０^１４ＧＣ、３ｍｌの緩衝液中で注射
Ｄ．用量１×１０^１４ＧＣ、１ｍｌの緩衝液中で注射、２日間の利尿剤アセタゾラミン（Ｄｉａｍｏｘ（登録商標））による前処置後、ＣＳＦ産生を低減した。

【0166】

簡単に述べると、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究のために、ｈＣＤＫＬ５遺伝子療法の毒性及び安全性試験を、ＡＡＶｈｕ６８－ｈＳｙｎ－Ｃｄｋｌ５－１ｃｏ－ＷＰＲＥベクターを使用して実施した。予備研究では、３つの異なる用量、３×１０^１２ＧＣ／動物、１×１０^１３ＧＣ／動物、及び３×１０^１３ＧＣ／動物を評価した。パイロット研究のために、１×１０^１４ＧＣ／動物の用量を選択し、２つの異なる体積（３ｍＬ及び５ｍＬ）を、ＡＡＶベクターの、大槽を介した脳脊髄液（ＣＳＦ）への送達について評価した。他の研究群は、利尿薬（例えば、Ｄｉａｍｏｘブランドのアセタゾラミド）とともに１×１０^１４ＧＣ／動物又は３×１０^１４ＧＣ／動物（対象）を使用した。

【0167】

更に、２×１０^１２、１×１０^１３、及び３×１０^１３ＧＣ／対象の用量を試験した。ＣＤＫＬ５ベクターによる処置は、良好に忍容され、臨床血液化学の変化の徴候は観察されなかった。ケージ側の神経学的検査からの観察では、ベースラインからの変化は見出されなかった。

【0168】

剖検は、注射の２８日後に実行され、続いて、分子分析、組織学、及び病理学の検討が行われた。全体的に、ＣＮＳ以外の主要な臓器では、大きな形質導入の違いは見出されなかった（例えば、肝臓の形質導入は、既に最大値に達している可能性が高い）。脊髄及びＤＲＧにおける主要な形質導入の違い（非常に高い形質導入速度に留まる）は観察されなかったが、注射パラメータに応じて脳組織の著しい変化が明らかになった。形質導入の最も高い形質導入増加は、皮質において見られた。Ｄｉａｍｏｘは、脳を介した導入効率のわずかな増加につながる。

【0169】

図１７は、非神経組織、脊髄路組織、及び脳組織にわたる各ＮＨＰのベクター生体分布を示す。図１８では、脳のベクター生体分布データのみが示されている。結果は、後根神経節（ＤＲＧ）の強力な形質導入、脳組織の中～低程度の形質導入、及び神経組織への形質導入漏出が観察されることを示す。病理学的結果は、背側白質路における軽度の軸索障害を示した。ｈＣＤＫＬ５ ｍＲＮＡレベルのわずかな差が観察された。３ｍｌの注射量を使用した場合、ｍＲＮＡの発現が高くなる傾向がある。また、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によるｈＣＤＫＬ５ ｍＲＮＡの分布も視覚化した。後根神経節
（ＤＲＧ）は、６つ全てのＮＨＰにわたって非常に強力なｍＲＮＡ発現を示した。運動皮質では、少数の形質導入ニューロンが観察された（＜１０％）。時折、形質導入ニューロンの小さなクラスターが見出された。この研究では、ＮＨＰ間の運動皮質におけるｈＣＤＫＬ５ ｍＲＮＡ陽性ニューロンに著しい差はなかった。

【0170】

病理学的レビューでは、組織及びＮＨＰにわたる大規模な病変は見つからなかった。最高用量を受容したＮＨＰは、肝臓における炎症性細胞浸潤の軽度の徴候を示した。更に、全てのＮＨＰにおいて、軽度～中程度の脊髄軸索障害及びＤＲＧサテリトーシス。

【0171】

更に、我々は、ＡＡＶｒｈ９１．ＵｂＣ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３及びＡＡＶｒｈ９１．ＣＢｈ．ＣＤＫＬ５－１ｃｏ．ｍｉＲ１８３ベクターのＮＨＰにおけるベクター発現及び安全性試験を調べる。ベクターは、ＩＣＭ経路を介して３×０１^１０ＧＣでＣ．マカクに投与される。ＡＡＶベクター投与後のＣＤＫＬ５発現の効果を評価するために、病理学的分析及び神経検査を実施する。

【0172】

結論として、我々の研究で調べたＡＡＶ－ＣＤＫＬ５ベクター（配列番号１）を使用して、ニューロンにおける安定したＣＤＫＬ５タンパク質発現を達成することができる。ＡＡＶ－ＣＤＫＬ５遺伝子療法は、ＣＤＤマウスモデルの表現型を著しく改善した。更に、ＡＡＶ－ＣＤＫＬ５ベクターは、大槽を介して非ヒト霊長類に効率的に送達され、ＣＮＳ全体を通して発現され得る。
参考文献
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８．Ｍｕｎｏｚ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．“Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤＫＬ５ ｋｉｎａｓｅ．”ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．

【0173】

本明細書に引用される全ての文書は、２０２０年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０１６，０３６号、及び２０２０年１０月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／０９１，０３２号、２０２０年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１０９，６０８号と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。「２０－９１９６ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前で本明細書とともに提出された配列表、並びにその中の配列及びテキストは、参照により組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18】

【図19A】

【配列表】

2023524437000001.app

【国際調査報告】