特表2023-524502洞房結節様ペースメーカー細胞のためのマーカーとしてのＣＤ３４の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-12
(54)【発明の名称】洞房結節様ペースメーカー細胞のためのマーカーとしてのＣＤ３４の使用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/04 20060101AFI20230605BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230605BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20230605BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230605BHJP
A61K 35/34 20150101ALI20230605BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230605BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230605BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20230605BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20230605BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230605BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/04
C12Q1/686 Z
C12N5/077
C12N5/10
A61K35/34
A61P9/00
G01N33/53 Y
C12Q1/06
G01N33/48 M
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022566355
(86)(22)【出願日】2021-04-30
(85)【翻訳文提出日】2022-12-22
(86)【国際出願番号】 IB2021053646
(87)【国際公開番号】W WO2021220248
(87)【国際公開日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】63/018,824
(32)【優先日】2020-05-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507148294
【氏名又は名称】ユニバーシティー ヘルス ネットワーク
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】プロッツェ，ステファニー アイ．
(72)【発明者】
【氏名】ケラー，ゴードン エム．
(72)【発明者】
【氏名】ロービラー，ミシェル
(72)【発明者】
【氏名】リム，アモス チュン－ヒン エイドリアン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
2G045CB01
2G045FA37
2G045FB01
2G045FB03
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ53
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS32
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX01
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BB04
4B065CA44
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB47
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA36
(57)【要約】
本発明は、細胞の集団内の洞房結節様ペースメーカー細胞（ＳＡＮＬＰＣ）を検出するための、およびＳＡＮＬＰＣが高度に濃縮された細胞調製物を作製するための、細胞表面マーカーとしてのＣＤ３４の使用に関する。また本明細書で提供されるのは、心臓細胞療法のためにＳＡＮＬＰＣが濃縮された細胞調製物を使用する方法である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞集団において洞房結節様ペースメーカー心筋細胞（ＳＡＮＬＰＣ）の存在を検出する方法であって、前記細胞集団中で１種または複数の心筋細胞マーカーおよびＣＤ３４を発現する細胞を検出することを含み、前記検出された細胞が、ＳＡＮＬＰＣである、方法。
【請求項2】
前記１種または複数の心筋細胞マーカーが、ｃＴＮＴ、ＳＩＲＰＡ、ＴＢＸ３、ＴＢＸ１８、ＳＨＯＸ２、およびＨＣＮ４から選択され、場合により前記ＳＡＮＬＰＣが、ＣＤ９０－、ＮＫＸ２－５－、および／またはＣＤ３１－であることにより特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＳＡＮＬＰＣによるＣＤ３４の発現が、ＣＤ３４タンパク質またはＣＤ３４ ｍＲＮＡの存在により検出され、場合により前記ＣＤ３４タンパク質が、抗ＣＤ３４抗体もしくはその抗原結合断片により検出されるか、または前記ＣＤ３４ ｍＲＮＡが、ＲＴ－ＰＣＲにより検出される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記細胞集団が、場合により心臓組織から、場合によりヒト心臓組織から得られた、または多能性幹細胞、多分化能幹細胞、もしくは前駆細胞、もしくは分化された体細胞に由来する、心筋細胞集団であり、前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞であり、
前記多分化能幹細胞もしくは前駆細胞が、造血細胞であり、または
前記分化された体細胞が、線維芽細胞である、
請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記細胞集団中のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ３４＋および場合によりＣＤ９０－および／またはＣＤ３１－である細胞の数を決定することをさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
洞房結節様ペースメーカー心筋細胞（ＳＡＮＬＰＣ）について濃縮された心筋細胞集団を作製する方法であって、（ａ）ヒト心筋細胞の出発集団を提供すること；
（ｂ）ＣＤ３４に特異的に結合する薬剤と前記ヒト心筋細胞を接触させること；および
（ｃ）前記薬剤により結合されない細胞から前記薬剤により結合された細胞を単離し、それによりＳＡＮＬＰＣについて濃縮されたＣＤ３４＋心筋細胞集団を得ること、
を含む、方法。
【請求項7】
前記薬剤が、抗ＣＤ３４抗体またはその抗原結合断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記単離ステップが、蛍光活性化セルソーティングまたは磁気活性化セルソーティングにより実施される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項9】
前記ＳＡＮＬＰＣが、ＣＤ３４＋であることならびにさらにｃＴＮＴ＋、ＳＩＲＰＡ＋、ＣＤ９０－、ＮＫＸ２－５－、ＴＢＸ３＋、ＴＢＸ１８＋、ＳＨＯＸ２＋、ＨＣＮ４＋、および／またはＣＤ３１－であることにより特徴づけられる、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
ヒト心筋細胞の前記出発集団が、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を培養することにより得られ、場合により前記ｈＰＳＣが、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）またはヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項６～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
ヒト心筋細胞の前記出発集団が、インビトロで多分化能ヒト細胞または分化されたヒト細胞に由来し、場合により前記多分化能ヒト細胞が、造血幹細胞もしくは前駆細胞であり、または
前記分化されたヒト細胞が、線維芽細胞もしくは白血球である、
請求項６～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
ヒト心筋細胞の前記出発集団が、（ａ）胚様体を作製するために、ＢＭＰ成分、場合によりＢＭＰ４を含み、場合によりさらにＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む胚様体培地中でｈＰＳＣをインキュベートすること；
（ｂ）心臓血管中胚葉細胞を作製するために、
ＢＭＰ成分、場合によりＢＭＰ４と、
アクチビン成分、場合によりアクチビンＡと、
場合によりＦＧＦ成分、場合によりｂＦＧＦ、
を含む中胚葉誘導培地中で前記胚様体をインキュベートすること、
を含む工程により得られる、請求項６～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
ヒト心筋細胞の前記出発集団が、（ａ）心臓血管前駆細胞を作製するために、Ｗｎｔ阻害剤、場合によりＩＷＰ２を含む心臓誘導培地中で中胚葉細胞をインキュベートすることであって、場合により前記中胚葉細胞が、心臓血管中胚葉細胞である、インキュベートすること；
（ｂ）前記Ｗｎｔ阻害剤の非存在下で前記心臓血管前駆細胞を培養すること；および
（ｃ）場合によりＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－により特徴づけられるステップ（ｂ）からの細胞を単離し、それにより心筋細胞の前記出発集団を得ること、
により得られる、請求項６～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記心臓誘導培地が、ＢＭＰ成分、場合によりＢＭＰ４と、
レチノイン酸と、
アクチビン／結節阻害薬、場合によりＳＢ－４３１５４２と、
ＦＧＦ阻害剤、場合によりＰＤ１７３０７４またはＳＵ５４０２、および／またはＶＥＧＦ、
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ヒト心筋細胞の前記出発集団が、ヒト心臓から得られる、請求項６～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
請求項６～１５のいずれか１項に記載の方法により得られたＳＡＮＬＰＣが濃縮された心筋細胞集団。
【請求項17】
請求項１６に記載の心筋細胞集団と医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項18】
細胞成分および担体成分からなる医薬組成物であって、前記細胞成分が、前記細胞の８０％より多くがＳＡＮＬＰＣである細胞集団であり、かつ前記担体成分が、医薬的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項19】
前記ＳＡＮＬＰＣが、ｃＴＮＴ＋、ＳＩＲＰＡ＋、ＣＤ９０－、ＣＤ３１－、ＮＫＸ２－５－、ＴＢＸ３＋、ＴＢＸ１８＋、ＳＨＯＸ２＋、ＨＣＮ４＋、および／またはＣＤ３４＋により特徴づけられる、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項20】
心臓ペースメーカーを必要とする患者を処置する方法であって、前記患者に請求項１６に記載の心筋細胞集団または請求項１７～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含み、場合により前記心筋細胞が、自家または同種他家である、方法。
【請求項21】
心臓ペースメーカーを必要とする患者を処置することにおける使用のための請求項１６に記載の心筋細胞集団または請求項１７～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項22】
心臓ペースメーカーを必要とする患者を処置するための医薬品の製造のための請求項１６に記載の心筋細胞集団または請求項１７～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項23】
前記患者が、徐脈、不整脈、心不全、心筋梗塞、同期不全、心房細動、左もしくは右脚ブロック、洞不全症候群、または先天性ＡＶブロックを有する、請求項２０に記載の方法、請求項２１に記載の使用のための心筋細胞集団もしくは医薬組成物、または請求項２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１日出願の米国特許仮出願第６３／０１８，８２４号の優先権を主張するものである。前述の優先権主張出願の内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０２０年５月１日出願の米国特許仮出願第６３／０１８，８２４号の優先権を主張するものである。前述の優先権主張出願の内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
ヒトの心拍は、２種のペースメーカー組織：洞房結節（ＳＡＮ）および房室結節（ＡＶＮ）、により調節される電気パルスにより惹起される。ＳＡＮは、右心房後壁内に位置し、心拍を開始する一次ペースメーカーとして働く。ＡＶＮは、右心房の底部に位置し、心房から心室にシグナルを送る電気的接続を確立する。ＳＡＮおよびＡＶＮの機能は、加齢、先天性疾患、または心臓手術により影響を受け、疲労～失神にわたる症状を伴う緩徐で不規則な心拍（徐脈性不整脈）を生じる可能性がある。徐脈性不整脈のために現在利用可能な最良の処置は、心拍の電気的活性化を引き継ぐ電子ペースメーカー（ＥＰＭ）の植込みである（Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ （２００８） ５：ｅ１－６２）。
ヒトの心拍は、２種のペースメーカー組織：洞房結節（ＳＡＮ）および房室結節（ＡＶＮ）、により調節される電気パルスにより惹起される。ＳＡＮは、右心房後壁内に位置し、心拍を開始する一次ペースメーカーとして働く。ＡＶＮは、右心房の底部に位置し、心房から心室にシグナルを送る電気的接続を確立する。ＳＡＮおよびＡＶＮの機能は、加齢、先天性疾患、または心臓手術により影響を受け、疲労～失神にわたる症状を伴う緩徐で不規則な心拍（徐脈性不整脈）を生じる可能性がある。徐脈性不整脈のために現在利用可能な最良の処置は、心拍の電気的活性化を引き継ぐ電子ペースメーカー（ＥＰＭ）の植込みである（Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ （２００８） ５：ｅ１－６２）。
【0003】
解剖学的にＳＡＮは、ＳＡＮ頭部、ＳＡＮ尾部、および移行ゾーンに分別され得る（Ｃｈａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ （２００９） １１９：１５６２－７５； Ｇｏｏｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． （２０１９） １２５：３７９－９７； Ｗｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． （２００９） １０４：３８８－９７）。ＳＡＮ頭部は、そこから心拍が開始される、コアペースメーカー細胞を含有する。これらの細胞は、ＴＢＸ１８＋ＮＫＸ２－５－ペースメーカー細胞に発達する静脈洞中のＴＢＸ１８＋前駆体に由来する。ＮＫＸ２－５発現の欠如は、心臓における全ての他の心筋細胞から、ＳＡＮ頭部ペースメーカー細胞を識別し、ＳＡＮ頭部ペースメーカー細胞は、この心臓転写因子を発現することが見出されている（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｌｓ ａｎｄ Ｍｏｏｒｍａｎ， Ｃｉｒｃ Ａｒｒｈｙｔｈｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ． （２００９） ２：１９５－２０７； Ｓｉｚａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃ Ａｒｒｈｙｔｈｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ． （２０１１） ４：５３２－４２）。ＳＡＮ尾部は発達上、同じＴＢＸ１８＋前駆体から発生するが、尾部細胞は、ＮＫＸ２－５を上方制御し、ＴＢＸ１８を下方制御する（Ｗｉｅｓｅ、前掲書）。移行ゾーンは、ＳＡＮと心房作業心筋の間に位置し、ペースメーカー／心房心筋の混合表現型を有する細胞で構成される。
【0004】
およそ２１，０００のカナダ人が、毎年ＥＰＭを受ける。その数は、人口の加齢に伴い徐々に増加する。ＥＰＭ処置は、相対的に高い合併症率（約１６％）と関連し、そのほとんどが胸部外傷、リード合併症、および感染により引き起こされる（Ｃａｎｔｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＪＡＣＣ Ｃｌｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ． （２０１７） ３：１２９６－１３０５； Ｋｉｒｋｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ． （２０１４） ３５：１１８６－９４； Ｕｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ （２０１２） ９：７２８－３５）。ＥＰＭ処置のさらなる欠点は、自律神経応答性の欠如および心臓の不適切な電気的興奮であり、それらは、リモデリングおよび究極的に心不全をもたらし得る（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｙｕ， Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ． （２０１２） ３３：８１６－８； Ｖａｔａｎｋｕｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ． （２００９） １０３：１２８０－４）。ＥＰＭは５～１０年ごとの外科的バッテリー交換、および体の成長に適合する能力を欠くＥＰＭリードの定期的な外科的再装着を必要とするため、小児期および思春期患者の合併症リスクはより高い。
【0005】
これらの短所は、ＳＡＮ部位に直接移植され、無傷のままの心臓伝導システムの成分と一体化し、かつ自律神経系の制御下で機能できる生物学的ペースメーカーを開発するための切実な理由である。加えて、生物学的ペースメーカーは、小児期患者の心臓の成長に適合する可能性がより高い。しかし、生物学的ペースメーカーの開発の進展は、真正のヒトペースメーカー細胞の欠如により妨げられてきた。過去の試験は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から分化された心筋細胞の混合集団が、ブタおよびモルモットの心臓に移植された場合に生物学的ペースメーカーとして機能し得ることを示すが、インプラントの半分のみがペーシング活性を示した（Ｋｅｈａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２００４） ２２：１２８２－９； Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ （２００５） １１１：１１－２０）。この低い成功率は、移植された細胞集団の異種性によるのかもしれない。
【0006】
したがって、罹患した心臓のペースメーカー活性を回復させる有効な細胞療法の開発が、依然として求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
発明の概要
本開示は、細胞集団中で１種または複数の心筋細胞マーカーおよびＣＤ３４を発現する細胞を検出することを含む、細胞集団において洞房結節様ペースメーカー心筋細胞（ＳＡＮＬＰＣ）の存在を検出する方法を提供し、検出される細胞は、ＳＡＮＬＰＣである。１種または複数の心筋細胞マーカーは、例えば、ｃＴＮＴ、ＳＩＲＰＡ、ＴＢＸ３、ＴＢＸ１８、ＳＨＯＸ２、およびＨＣＮ４から選択されてよい。幾つかの実施形態において、ＳＡＮＬＰＣは、ＣＤ９０－、ＮＫＸ２－５－、および／またはＣＤ３１－であることを特徴とする。ＳＡＮＬＰＣによるＣＤ３４の発現は、例えばＣＤ３４タンパク質（例えば、抗ＣＤ３４抗体またはその抗原結合断片により検出される）またはＣＤ３４ ｍＲＮＡ（例えば、ＲＴ ＰＣＲにより検出される）の存在により、検出されてよい。心筋細胞マーカーの発現はまた、タンパク質レベルまたはＲＮＡ転写産物レベルで検出されてよい。
本開示は、細胞集団中で１種または複数の心筋細胞マーカーおよびＣＤ３４を発現する細胞を検出することを含む、細胞集団において洞房結節様ペースメーカー心筋細胞（ＳＡＮＬＰＣ）の存在を検出する方法を提供し、検出される細胞は、ＳＡＮＬＰＣである。１種または複数の心筋細胞マーカーは、例えば、ｃＴＮＴ、ＳＩＲＰＡ、ＴＢＸ３、ＴＢＸ１８、ＳＨＯＸ２、およびＨＣＮ４から選択されてよい。幾つかの実施形態において、ＳＡＮＬＰＣは、ＣＤ９０－、ＮＫＸ２－５－、および／またはＣＤ３１－であることを特徴とする。ＳＡＮＬＰＣによるＣＤ３４の発現は、例えばＣＤ３４タンパク質（例えば、抗ＣＤ３４抗体またはその抗原結合断片により検出される）またはＣＤ３４ ｍＲＮＡ（例えば、ＲＴ ＰＣＲにより検出される）の存在により、検出されてよい。心筋細胞マーカーの発現はまた、タンパク質レベルまたはＲＮＡ転写産物レベルで検出されてよい。
【課題を解決するための手段】
【0008】
幾つかの実施形態において、細胞集団は、心臓組織（例えば、ヒト心臓組織）から得られる、またはＰＳＣ（例えば、ＥＳＣまたはｉＰＳＣ）、多分化能幹細胞もしくは前駆細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞、中胚葉細胞、心臓血管（心臓）前駆細胞）、または例えば、必要ならばリプログラミングおよびインビトロでの分化を通して分化された体細胞（例えば、線維芽細胞または白血球）に由来する、心筋細胞集団（例えば、ヒト心筋細胞集団）である。
【0009】
方法はさらに、細胞集団中のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ３４＋および場合によりＣＤ９０－である細胞の数を決定することを含んでよい。
【0010】
別の態様において、本開示は、ＳＡＮＬＰＣが濃縮された心筋細胞集団を作製する方法を提供する。この方法は、（ａ）ヒト心筋細胞の出発集団を提供すること；（ｂ）ヒト心筋細胞をＣＤ３４に特異的に結合する薬剤（例えば、抗ＣＤ３４抗体またはその抗原結合断片）と接触させること；および（ｃ）薬剤により結合されていない細胞から薬剤により結合された細胞を単離すること、それによりＳＡＮＬＰＣが濃縮されたＣＤ３４＋心筋細胞集団を得ること、を含む。単離ステップは、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）により実施されてよい。
【0011】
ＳＡＮＬＰＣは、例えば、ｃＴＮＴ＋、ＳＩＲＰＡ＋、ＣＤ９０－、ＮＫＸ２－５－、ＴＢＸ３＋、ＴＢＸ１８＋、ＳＨＯＸ２＋、ＨＣＮ４＋、および／またはＣＤ３１－であることを特徴としてよい。幾つかの実施形態において、ＳＡＮＬＰＣは、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－ＣＤ３１－ＣＤ３４＋であることを特徴としてよい。
【0012】
幾つかの実施形態において、ヒト心筋細胞の出発集団は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）もしくはヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を培養することにより得られる、またはヒト心臓（例えば、供与された心臓）から単離される。他の実施形態において、ヒト心筋細胞の出発集団は、多分化能ヒト細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）または分化されたヒト細胞（線維芽細胞または白血球）に由来する。
【0013】
特有の実施形態において、ヒト心筋細胞の出発集団は、（ａ）ＢＭＰ成分、場合によりＢＭＰ４を含み、場合によりさらにＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む胚様体培地中でｈＰＳＣをインキュベートして胚様体を作製すること；（ｂ）ＢＭＰ成分（例えば、ＢＭＰ４）、アクチビン成分（例えば、アクチビンＡ）、および場合によりＦＧＦ成分（例えば、ｂＦＧＦ）を含む中胚葉誘導培地中で胚様体をインキュベートして心臓血管中胚葉細胞を作製すること、を含む工程により得られる。
【0014】
特有の実施形態において、ヒト心筋細胞の出発集団は、（ａ）Ｗｎｔ阻害剤（例えば、ＩＷＰ２）を含む心臓誘導培地中で中胚葉細胞（例えば、心臓血管中胚葉細胞）をインキュベートして、心臓前駆細胞を作製すること；（ｂ）Ｗｎｔ阻害剤の非存在下で心臓前駆細胞を培養すること；および（ｃ）ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－を特徴とするステップ（ｂ）からの細胞を場合により単離し、それにより心筋細胞の出発集団を得ること、により得られる。特定の実施形態において、心臓誘導培地はさらに、ＢＭＰ成分（例えば、ＢＭＰ４）、レチノイン酸（ＲＡ）、アクチビン／結節阻害薬（例えば、ＳＢ－４３１５４２）、ＦＧＦ阻害剤（例えば、ＰＤ１７３０７４またはＳＵ５４０２）、および／またはＶＥＧＦを含む。
【0015】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される方法により得られたＳＡＮＬＰＣ濃縮心筋細胞集団、およびＳＡＮＬＰＣ濃縮心筋細胞集団と医薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供する。
【0016】
別の態様において、本開示は、細胞成分および担体成分からなる医薬組成物を提供し、細胞成分は、細胞の８０％より多くがＳＡＮＬＰＣである細胞集団であり、担体成分は、医薬的に許容できる担体を含む。ＳＡＮＬＰＣは、例えばｃＴＮＴ＋、ＳＩＲＰＡ＋、ＣＤ９０－、ＣＤ３１－、ＮＫＸ２－５－、ＴＢＸ３＋、ＴＢＸ１８＋、ＳＨＯＸ２＋、ＨＣＮ４＋、および／またはＣＤ３４＋により特徴づけられてよい。例えばＳＡＮＬＰＣは、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－ＣＤ３４＋および場合によりＣＤ３１－であることにより特徴づけられる。
【0017】
さらに別の態様において、本開示は、患者に本発明のＳＡＮＬＰＣが濃縮された心筋細胞集団または医薬組成物を投与することを含む、心臓ペースメーカーを必要とする患者を処置する方法を提供し、場合により心筋細胞は、自家または同種他家である。患者は、例えば徐脈、不整脈、心不全、心筋梗塞、同期不全、心房細動、左もしくは右脚ブロック、洞不全症候群、または先天性房室ブロックを有してよい。また提供されるのは、これらの処置方法における使用のためのＳＡＮＬＰＣが濃縮された心筋細胞集団および医薬組成物、ならびに心臓ペースメーカーを必要とする患者を処置するための医薬品の製造のためのＳＡＮＬＰＣが濃縮された心筋細胞集団の使用である。
【0018】
本発明の他の特色、目的、および利点は、以下の詳細な記載において明白である。しかし詳細な記載は、本発明の実施形態および態様を示すが、例示として与えられるに過ぎず、限定ではないことが理解されなければならない。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、詳細な記載から当業者に明白となろう。
【0019】
本発明または出願の書類は、着色された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、必要になれば、そして必要となる料金が支払われれば、米国特許商標庁により提供されよう。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】図１は、ＳＡＮＬＰＣを部分的に濃縮するための陰性選択方策を示す。この図は、分化２０日目のＮＫＸ２－５＋ＣＤ９０－ＳＩＲＰＡ＋心筋細胞、およびＮＫＸ２－５－ＣＤ９０－ＳＩＲＰＡ＋ ＳＡＮＬＰＣの代表的なフローサイトメトリー分析を示す。ソートされた集団の明視野／ＧＦＰチャネルオーバーレイ画像が、右のパネルに示される。スケールバー ２００μｍ。Ｐｒｏｔｚｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０１７） ３５：５６－６８も参照されたい。
【図2A】図２Ａ～Ｅは、非遺伝子修飾ｈＰＳＣ株からのＳＡＮＬＰＣの作製および単離を示す。図２Ａは、３日目の心臓血管中胚葉からのＳＡＮＬＰＣの明細に及ぼすＦＧＦシグナル伝達の影響をテストするために用いられた実験プロトコルのスキームを示す。ＢＭＰ：ＢＭＰ４。ＡＣＴＡ：アクチビンＡ。ＳＢ：ＳＢ－４３１５４２。ＲＡ：レチノイン酸。
【図2B】図２Ａ～Ｅは、非遺伝子修飾ｈＰＳＣ株からのＳＡＮＬＰＣの作製および単離を示す。図２Ｂは、ＢＭＰ４（２．５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＢ（５．４μＭ）およびＲＡ（０．２５μＭ）シグナル伝達（３～６日目）のバックグランドで４～６日目に２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、追加的なＦＧＦなし（内因性）、または低分子ＦＧＦ阻害剤（ＦＧＦｉ）ＰＤ１７３０７４（４８０ｎＭ）のいずれかで特定された中胚葉から作製された２０日目集団中のＮＫＸ２－５＋ｃＴＮＴ＋細胞およびＮＫＸ２－５－ｃＴＮＴ＋ ＳＡＮＬＰＣの割合のフローサイトメトリー分析を示す。棒グラフは、これらの条件で作製されたＮＫＸ２－５＋ｃＴＮＴ＋およびＮＫＸ２－５－ｃＴＮＴ＋細胞の平均割合を示す。ｔ検定：内在性（Ｅ）ＦＧＦレベルでのＮＫＸ２－５－ｃＴＮＴ＋細胞に対して＊＊Ｐ＜０．０１；内在性（Ｅ）ＦＧＦレベルでのＮＫＸ２－５＋ｃＴＮＴ＋細胞に対し＃＃Ｐ＜０．０１（ｎ＝５）。
【図2C】図２Ａ～Ｅは、非遺伝子修飾ｈＰＳＣ株からのＳＡＮＬＰＣの作製および単離を示す。図２Ｃは、ＮＫＸ２－５ｇｆｐ／ｗトランスジェニックレポーターと独立してＳＡＮＬＰＣを濃縮するために分化２０日目のＦＧＦｉ処置集団からのＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－細胞の単離を示す１対のフローサイトメトリーグラフ（左のパネル）、およびＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－集団を単離した後のＮＫＸ２－５：ＧＦＰ－ｃＴＮＴ＋ ＳＡＮＬＰＣの割合のフローサイトメトリー分析（右のパネル）である。
【図2D】図２Ａ～Ｅは、非遺伝子修飾ｈＰＳＣ株からのＳＡＮＬＰＣの作製および単離を示す。図２Ｄおよび２Ｅは、ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株からのＳＡＮＬＰＣの作製を示す。図２Ｄは、ＢＭＰ４（２．５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＢ（５．４μＭ）およびＲＡ（０．２５μＭ）シグナル伝達（３～６日目）のバックグランドで３～６日目に４８０ｎＭ ＦＧＦｉで特定された中胚葉から作製された２０日目ＨＥＳ２－ｈＰＳＣ由来集団中のＮＫＸ２－５＋ｃＴＮＴ＋細胞およびＮＫＸ２－５－ｃＴＮＴ＋ ＳＡＮＬＰＣの割合のフローサイトメトリー分析を示す。棒グラフは、これらの条件で作製されたＮＫＸ２－５＋ｃＴＮＴ＋およびＮＫＸ２－５－ｃＴＮＴ＋細胞の平均割合を示す（ｎ＝５）。図２Ｅは、ＳＡＮＬＰＣが濃縮されたＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－集団を単離するために用いられたセルソーティング方策（左のパネル）およびＳＡＮＬＰＣの付加を確認するＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－集団中のＮＫＸ２－５－ｃＴＮＴ＋細胞の割合のフローサイトメトリー分析を示す。Ｐｒｏｔｚｅ（前掲書）も参照されたい。
【図2E】図２Ａ～Ｅは、非遺伝子修飾ｈＰＳＣ株からのＳＡＮＬＰＣの作製および単離を示す。図２Ｄおよび２Ｅは、ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株からのＳＡＮＬＰＣの作製を示す。図２Ｄは、ＢＭＰ４（２．５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＢ（５．４μＭ）およびＲＡ（０．２５μＭ）シグナル伝達（３～６日目）のバックグランドで３～６日目に４８０ｎＭ ＦＧＦｉで特定された中胚葉から作製された２０日目ＨＥＳ２－ｈＰＳＣ由来集団中のＮＫＸ２－５＋ｃＴＮＴ＋細胞およびＮＫＸ２－５－ｃＴＮＴ＋ ＳＡＮＬＰＣの割合のフローサイトメトリー分析を示す。棒グラフは、これらの条件で作製されたＮＫＸ２－５＋ｃＴＮＴ＋およびＮＫＸ２－５－ｃＴＮＴ＋細胞の平均割合を示す（ｎ＝５）。図２Ｅは、ＳＡＮＬＰＣが濃縮されたＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－集団を単離するために用いられたセルソーティング方策（左のパネル）およびＳＡＮＬＰＣの付加を確認するＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－集団中のＮＫＸ２－５－ｃＴＮＴ＋細胞の割合のフローサイトメトリー分析を示す。Ｐｒｏｔｚｅ（前掲書）も参照されたい。
【図3A】図３Ａ～Ｃは、ｈＰＳＣ由来ＳＡＮＬＰＣ培養物の単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）の結果を示すグラフである。図３Ａは、ＳＡＮＬＰＣ分化の２０日目に同定された１１の細胞クラスターを示す。図３Ｂは、示された遺伝子ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５、ＴＢＸ３、ＴＢＸ１８、ＳＣＮ５Ａ、およびＮＰＰＡの転写産物カウントを示すｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔＳＮＥ）プロットのパネルである。図３Ｃは、ＣＤ３４の転写産物カウントを示すｔＳＮＥプロットである。ＣＭ：心筋細胞。
【図3B】図３Ａ～Ｃは、ｈＰＳＣ由来ＳＡＮＬＰＣ培養物の単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）の結果を示すグラフである。図３Ａは、ＳＡＮＬＰＣ分化の２０日目に同定された１１の細胞クラスターを示す。図３Ｂは、示された遺伝子ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５、ＴＢＸ３、ＴＢＸ１８、ＳＣＮ５Ａ、およびＮＰＰＡの転写産物カウントを示すｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔＳＮＥ）プロットのパネルである。図３Ｃは、ＣＤ３４の転写産物カウントを示すｔＳＮＥプロットである。ＣＭ：心筋細胞。
【図3C】図３Ａ～Ｃは、ｈＰＳＣ由来ＳＡＮＬＰＣ培養物の単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）の結果を示すグラフである。図３Ａは、ＳＡＮＬＰＣ分化の２０日目に同定された１１の細胞クラスターを示す。図３Ｂは、示された遺伝子ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５、ＴＢＸ３、ＴＢＸ１８、ＳＣＮ５Ａ、およびＮＰＰＡの転写産物カウントを示すｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔＳＮＥ）プロットのパネルである。図３Ｃは、ＣＤ３４の転写産物カウントを示すｔＳＮＥプロットである。ＣＭ：心筋細胞。
【図4A】図４Ａ～Ｆは、ＣＤ３４がＳＡＮＬＰＣにより特異的に発現されることを示すグラフである。図４Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｂは、図４Ａに示されたＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋心筋細胞中のＣＤ３４の発現を要約する棒グラフである（ｎ＝５）。図４Ｃは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中に存在する全細胞（左）中、および同じ培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－でゲートされた心筋細胞（右）中のＣＤ３４＋ＣＤ３１＋細胞の割合の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｄおよび４Ｅは、２０日目ＡＬＣＭ（図４Ｄ）およびＶＬＣＭ（図４Ｅ）分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｆは、図４Ａ、４Ｄおよび４Ｅに示されたＳＡＮＬＰＣ、ＡＬＣＭおよびＶＬＣＭ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞集団内のＣＤ３４＋細胞の割合を要約する棒グラフである（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し、＊＊Ｐ＜０．０１。ＡＬＣＭ：心房様心筋細胞。ＶＬＣＭ：心室様心筋細胞。
【図4B】図４Ａ～Ｆは、ＣＤ３４がＳＡＮＬＰＣにより特異的に発現されることを示すグラフである。図４Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｂは、図４Ａに示されたＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋心筋細胞中のＣＤ３４の発現を要約する棒グラフである（ｎ＝５）。図４Ｃは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中に存在する全細胞（左）中、および同じ培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－でゲートされた心筋細胞（右）中のＣＤ３４＋ＣＤ３１＋細胞の割合の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｄおよび４Ｅは、２０日目ＡＬＣＭ（図４Ｄ）およびＶＬＣＭ（図４Ｅ）分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｆは、図４Ａ、４Ｄおよび４Ｅに示されたＳＡＮＬＰＣ、ＡＬＣＭおよびＶＬＣＭ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞集団内のＣＤ３４＋細胞の割合を要約する棒グラフである（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し、＊＊Ｐ＜０．０１。ＡＬＣＭ：心房様心筋細胞。ＶＬＣＭ：心室様心筋細胞。
【図4C】図４Ａ～Ｆは、ＣＤ３４がＳＡＮＬＰＣにより特異的に発現されることを示すグラフである。図４Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｂは、図４Ａに示されたＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋心筋細胞中のＣＤ３４の発現を要約する棒グラフである（ｎ＝５）。図４Ｃは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中に存在する全細胞（左）中、および同じ培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－でゲートされた心筋細胞（右）中のＣＤ３４＋ＣＤ３１＋細胞の割合の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｄおよび４Ｅは、２０日目ＡＬＣＭ（図４Ｄ）およびＶＬＣＭ（図４Ｅ）分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｆは、図４Ａ、４Ｄおよび４Ｅに示されたＳＡＮＬＰＣ、ＡＬＣＭおよびＶＬＣＭ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞集団内のＣＤ３４＋細胞の割合を要約する棒グラフである（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し、＊＊Ｐ＜０．０１。ＡＬＣＭ：心房様心筋細胞。ＶＬＣＭ：心室様心筋細胞。
【図4D】図４Ａ～Ｆは、ＣＤ３４がＳＡＮＬＰＣにより特異的に発現されることを示すグラフである。図４Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｂは、図４Ａに示されたＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋心筋細胞中のＣＤ３４の発現を要約する棒グラフである（ｎ＝５）。図４Ｃは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中に存在する全細胞（左）中、および同じ培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－でゲートされた心筋細胞（右）中のＣＤ３４＋ＣＤ３１＋細胞の割合の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｄおよび４Ｅは、２０日目ＡＬＣＭ（図４Ｄ）およびＶＬＣＭ（図４Ｅ）分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｆは、図４Ａ、４Ｄおよび４Ｅに示されたＳＡＮＬＰＣ、ＡＬＣＭおよびＶＬＣＭ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞集団内のＣＤ３４＋細胞の割合を要約する棒グラフである（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し、＊＊Ｐ＜０．０１。ＡＬＣＭ：心房様心筋細胞。ＶＬＣＭ：心室様心筋細胞。
【図4E】図４Ａ～Ｆは、ＣＤ３４がＳＡＮＬＰＣにより特異的に発現されることを示すグラフである。図４Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｂは、図４Ａに示されたＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋心筋細胞中のＣＤ３４の発現を要約する棒グラフである（ｎ＝５）。図４Ｃは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中に存在する全細胞（左）中、および同じ培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－でゲートされた心筋細胞（右）中のＣＤ３４＋ＣＤ３１＋細胞の割合の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｄおよび４Ｅは、２０日目ＡＬＣＭ（図４Ｄ）およびＶＬＣＭ（図４Ｅ）分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｆは、図４Ａ、４Ｄおよび４Ｅに示されたＳＡＮＬＰＣ、ＡＬＣＭおよびＶＬＣＭ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞集団内のＣＤ３４＋細胞の割合を要約する棒グラフである（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し、＊＊Ｐ＜０．０１。ＡＬＣＭ：心房様心筋細胞。ＶＬＣＭ：心室様心筋細胞。
【図4F】図４Ａ～Ｆは、ＣＤ３４がＳＡＮＬＰＣにより特異的に発現されることを示すグラフである。図４Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｂは、図４Ａに示されたＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋心筋細胞中のＣＤ３４の発現を要約する棒グラフである（ｎ＝５）。図４Ｃは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中に存在する全細胞（左）中、および同じ培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－でゲートされた心筋細胞（右）中のＣＤ３４＋ＣＤ３１＋細胞の割合の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｄおよび４Ｅは、２０日目ＡＬＣＭ（図４Ｄ）およびＶＬＣＭ（図４Ｅ）分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｆは、図４Ａ、４Ｄおよび４Ｅに示されたＳＡＮＬＰＣ、ＡＬＣＭおよびＶＬＣＭ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞集団内のＣＤ３４＋細胞の割合を要約する棒グラフである（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し、＊＊Ｐ＜０．０１。ＡＬＣＭ：心房様心筋細胞。ＶＬＣＭ：心室様心筋細胞。
【図5A】図５Ａ～Ｂは、ＣＤ３４＋心筋細胞が分化の１０日目という早期に検出され得ることを示す。図５Ａは、ＳＡＮＬＰＣ分化過程の間の４日目～２０日目のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中でのＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図５Ｂは、分化の経過中のＣＤ３４＋心筋細胞の割合を要約するバイオリンプロット（ｂｌｏｔ）を示す（ｎ＝６）。
【図5B】図５Ａ～Ｂは、ＣＤ３４＋心筋細胞が分化の１０日目という早期に検出され得ることを示す。図５Ａは、ＳＡＮＬＰＣ分化過程の間の４日目～２０日目のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中でのＣＤ３４およびＮＫＸ２－５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図５Ｂは、分化の経過中のＣＤ３４＋心筋細胞の割合を要約するバイオリンプロット（ｂｌｏｔ）を示す（ｎ＝６）。
【図6A】図６Ａ～Ｃは、ＣＤ３４＋細胞についてのＦＡＣＳソーティングがＳＡＮＬＰＣを濃縮することを示す。図６Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０＋ＣＤ３４＋およびＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－ＣＤ３４－集団の単離のために用いられたセルソーティング方策を示す。試料は、ＣＤ３４およびＮＫＸ２－５の発現についてＦＡＣＳの直後のフローサイトメトリーにより分析された。図６Ｂは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞中のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－筋細胞集団内のＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋細胞の割合を示す（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。図６Ｃは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞（ｎ＝５）中の心筋細胞（ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５）、ＳＡＮ（ＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２、ＨＣＮ４）、作業心筋細胞および移行ゾーンの心筋細胞（ＳＣＮ５Ａ、ＮＰＰＡ）についての示されたマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝５）。値は、ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに相対的な発現レベルを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図6B】図６Ａ～Ｃは、ＣＤ３４＋細胞についてのＦＡＣＳソーティングがＳＡＮＬＰＣを濃縮することを示す。図６Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０＋ＣＤ３４＋およびＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－ＣＤ３４－集団の単離のために用いられたセルソーティング方策を示す。試料は、ＣＤ３４およびＮＫＸ２－５の発現についてＦＡＣＳの直後のフローサイトメトリーにより分析された。図６Ｂは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞中のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－筋細胞集団内のＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋細胞の割合を示す（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。図６Ｃは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞（ｎ＝５）中の心筋細胞（ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５）、ＳＡＮ（ＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２、ＨＣＮ４）、作業心筋細胞および移行ゾーンの心筋細胞（ＳＣＮ５Ａ、ＮＰＰＡ）についての示されたマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝５）。値は、ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに相対的な発現レベルを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図6C】図６Ａ～Ｃは、ＣＤ３４＋細胞についてのＦＡＣＳソーティングがＳＡＮＬＰＣを濃縮することを示す。図６Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０＋ＣＤ３４＋およびＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－ＣＤ３４－集団の単離のために用いられたセルソーティング方策を示す。試料は、ＣＤ３４およびＮＫＸ２－５の発現についてＦＡＣＳの直後のフローサイトメトリーにより分析された。図６Ｂは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞中のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－筋細胞集団内のＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋細胞の割合を示す（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。図６Ｃは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞（ｎ＝５）中の心筋細胞（ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５）、ＳＡＮ（ＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２、ＨＣＮ４）、作業心筋細胞および移行ゾーンの心筋細胞（ＳＣＮ５Ａ、ＮＰＰＡ）についての示されたマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝５）。値は、ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに相対的な発現レベルを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図7A】図７Ａ～Ｃは、ＣＤ３４＋細胞についてのＭＡＣＳソーティングがＳＡＮＬＰＣを濃縮することを示す。図７Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中のＣＤ３４＋およびＣＤ３４－集団のＭＡＣＳに基づく単離のために用いられたセルソーティング方策を示す。注：ＭＡＣＳソーティングは、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－筋細胞についての選択を含まない。試料は、筋細胞量を評定するためのＳＩＲＰＡおよびＣＤ９０、およびペースメーカー含量を評定するためのＣＤ３４およびＮＫＸ２－５の発現についてＭＡＣＳの直後にフローサイトメトリーにより分析された。図７Ｂは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞（ｎ＝５）中のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－筋細胞集団内のＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋細胞の割合を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ｔ検定：＊＊Ｐ＜０．０１。図７Ｃは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞（ｎ＝４）中の心筋細胞（ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５）、ＳＡＮ（ＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２、ＨＣＮ４）、作業心筋細胞および移行ゾーンの心筋細胞（ＮＰＰＡ）についての示されたマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝４）。値は、ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに相対的な発現レベルを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図7B】図７Ａ～Ｃは、ＣＤ３４＋細胞についてのＭＡＣＳソーティングがＳＡＮＬＰＣを濃縮することを示す。図７Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中のＣＤ３４＋およびＣＤ３４－集団のＭＡＣＳに基づく単離のために用いられたセルソーティング方策を示す。注：ＭＡＣＳソーティングは、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－筋細胞についての選択を含まない。試料は、筋細胞量を評定するためのＳＩＲＰＡおよびＣＤ９０、およびペースメーカー含量を評定するためのＣＤ３４およびＮＫＸ２－５の発現についてＭＡＣＳの直後にフローサイトメトリーにより分析された。図７Ｂは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞（ｎ＝５）中のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－筋細胞集団内のＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋細胞の割合を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ｔ検定：＊＊Ｐ＜０．０１。図７Ｃは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞（ｎ＝４）中の心筋細胞（ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５）、ＳＡＮ（ＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２、ＨＣＮ４）、作業心筋細胞および移行ゾーンの心筋細胞（ＮＰＰＡ）についての示されたマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝４）。値は、ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに相対的な発現レベルを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図7C】図７Ａ～Ｃは、ＣＤ３４＋細胞についてのＭＡＣＳソーティングがＳＡＮＬＰＣを濃縮することを示す。図７Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中のＣＤ３４＋およびＣＤ３４－集団のＭＡＣＳに基づく単離のために用いられたセルソーティング方策を示す。注：ＭＡＣＳソーティングは、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－筋細胞についての選択を含まない。試料は、筋細胞量を評定するためのＳＩＲＰＡおよびＣＤ９０、およびペースメーカー含量を評定するためのＣＤ３４およびＮＫＸ２－５の発現についてＭＡＣＳの直後にフローサイトメトリーにより分析された。図７Ｂは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞（ｎ＝５）中のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－筋細胞集団内のＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋細胞の割合を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ｔ検定：＊＊Ｐ＜０．０１。図７Ｃは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞（ｎ＝４）中の心筋細胞（ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５）、ＳＡＮ（ＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２、ＨＣＮ４）、作業心筋細胞および移行ゾーンの心筋細胞（ＮＰＰＡ）についての示されたマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝４）。値は、ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに相対的な発現レベルを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図8A】図８Ａ～Ｄは、ＣＤ３４がＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株から作製されたＳＡＮＬＰＣにより特異的に発現されることを示す。図８Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株はＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーターを運搬しないため、ＧＦＰチャネルは、空である。図８ＢおよびＣは、２０日目ＡＬＣＭ（図８Ｂ）およびＶＬＣＭ（図８Ｃ）分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図８Ｄは、図８Ａ～Ｃに示されたＳＡＮＬＰＣ、ＡＬＣＭおよびＶＬＣＭ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞集団内のＣＤ３４＋細胞の割合を要約する棒グラフである（ｎ＝４）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊＊Ｐ＜０．０１。ＡＬＣＭ：心房様心筋細胞。ＶＬＣＭ：心室様心筋細胞。
【図8B】図８Ａ～Ｄは、ＣＤ３４がＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株から作製されたＳＡＮＬＰＣにより特異的に発現されることを示す。図８Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株はＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーターを運搬しないため、ＧＦＰチャネルは、空である。図８ＢおよびＣは、２０日目ＡＬＣＭ（図８Ｂ）およびＶＬＣＭ（図８Ｃ）分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図８Ｄは、図８Ａ～Ｃに示されたＳＡＮＬＰＣ、ＡＬＣＭおよびＶＬＣＭ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞集団内のＣＤ３４＋細胞の割合を要約する棒グラフである（ｎ＝４）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊＊Ｐ＜０．０１。ＡＬＣＭ：心房様心筋細胞。ＶＬＣＭ：心室様心筋細胞。
【図8C】図８Ａ～Ｄは、ＣＤ３４がＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株から作製されたＳＡＮＬＰＣにより特異的に発現されることを示す。図８Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株はＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーターを運搬しないため、ＧＦＰチャネルは、空である。図８ＢおよびＣは、２０日目ＡＬＣＭ（図８Ｂ）およびＶＬＣＭ（図８Ｃ）分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図８Ｄは、図８Ａ～Ｃに示されたＳＡＮＬＰＣ、ＡＬＣＭおよびＶＬＣＭ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞集団内のＣＤ３４＋細胞の割合を要約する棒グラフである（ｎ＝４）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊＊Ｐ＜０．０１。ＡＬＣＭ：心房様心筋細胞。ＶＬＣＭ：心室様心筋細胞。
【図8D】図８Ａ～Ｄは、ＣＤ３４がＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株から作製されたＳＡＮＬＰＣにより特異的に発現されることを示す。図８Ａは、２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株はＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーターを運搬しないため、ＧＦＰチャネルは、空である。図８ＢおよびＣは、２０日目ＡＬＣＭ（図８Ｂ）およびＶＬＣＭ（図８Ｃ）分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞中のＣＤ３４発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図８Ｄは、図８Ａ～Ｃに示されたＳＡＮＬＰＣ、ＡＬＣＭおよびＶＬＣＭ分化培養物のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞集団内のＣＤ３４＋細胞の割合を要約する棒グラフである（ｎ＝４）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊＊Ｐ＜０．０１。ＡＬＣＭ：心房様心筋細胞。ＶＬＣＭ：心室様心筋細胞。
【図9A】図９Ａ～Ｄは、ＣＤ３４＋細胞についてのＭＡＣＳソーティングがＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株のＳＡＮＬＰＣを濃縮することを示す。図９Ａは、ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株からの２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中のＣＤ３４＋およびＣＤ３４－集団のＭＡＣＳに基づく単離のために用いられたセルソーティング方策を示す。ＭＡＣＳソーティングは、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－筋細胞についての選択を含まない。試料は、筋細胞量を評定するためのＳＩＲＰＡおよびＣＤ９０、およびソーティング効率を評定するためのＣＤ３４の発現についてＭＡＣＳの直後にフローサイトメトリーにより分析された。図９Ｂは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株はＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーターを発現しないため、試料は、ソートの直後に固定され、筋細胞マーカーｃＴＮＴおよびＮＫＸ２－５への細胞内染色が、ペースメーカー含量を評定するために実施された。図９Ｃは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞中のｃＴＮＴ＋筋細胞集団内のＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋細胞の割合を示す（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５。図９Ｄは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞中の心筋細胞（ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５）、ＳＡＮ（ＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２、ＨＣＮ４）、作業心筋細胞および移行ゾーンの心筋細胞（ＮＰＰＡ）についての示されたマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝３）。値は、ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに相対的な発現レベルを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図9B】図９Ａ～Ｄは、ＣＤ３４＋細胞についてのＭＡＣＳソーティングがＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株のＳＡＮＬＰＣを濃縮することを示す。図９Ａは、ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株からの２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中のＣＤ３４＋およびＣＤ３４－集団のＭＡＣＳに基づく単離のために用いられたセルソーティング方策を示す。ＭＡＣＳソーティングは、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－筋細胞についての選択を含まない。試料は、筋細胞量を評定するためのＳＩＲＰＡおよびＣＤ９０、およびソーティング効率を評定するためのＣＤ３４の発現についてＭＡＣＳの直後にフローサイトメトリーにより分析された。図９Ｂは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株はＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーターを発現しないため、試料は、ソートの直後に固定され、筋細胞マーカーｃＴＮＴおよびＮＫＸ２－５への細胞内染色が、ペースメーカー含量を評定するために実施された。図９Ｃは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞中のｃＴＮＴ＋筋細胞集団内のＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋細胞の割合を示す（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５。図９Ｄは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞中の心筋細胞（ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５）、ＳＡＮ（ＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２、ＨＣＮ４）、作業心筋細胞および移行ゾーンの心筋細胞（ＮＰＰＡ）についての示されたマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝３）。値は、ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに相対的な発現レベルを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図9C】図９Ａ～Ｄは、ＣＤ３４＋細胞についてのＭＡＣＳソーティングがＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株のＳＡＮＬＰＣを濃縮することを示す。図９Ａは、ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株からの２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中のＣＤ３４＋およびＣＤ３４－集団のＭＡＣＳに基づく単離のために用いられたセルソーティング方策を示す。ＭＡＣＳソーティングは、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－筋細胞についての選択を含まない。試料は、筋細胞量を評定するためのＳＩＲＰＡおよびＣＤ９０、およびソーティング効率を評定するためのＣＤ３４の発現についてＭＡＣＳの直後にフローサイトメトリーにより分析された。図９Ｂは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株はＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーターを発現しないため、試料は、ソートの直後に固定され、筋細胞マーカーｃＴＮＴおよびＮＫＸ２－５への細胞内染色が、ペースメーカー含量を評定するために実施された。図９Ｃは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞中のｃＴＮＴ＋筋細胞集団内のＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋細胞の割合を示す（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５。図９Ｄは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞中の心筋細胞（ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５）、ＳＡＮ（ＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２、ＨＣＮ４）、作業心筋細胞および移行ゾーンの心筋細胞（ＮＰＰＡ）についての示されたマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝３）。値は、ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに相対的な発現レベルを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図9D】図９Ａ～Ｄは、ＣＤ３４＋細胞についてのＭＡＣＳソーティングがＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株のＳＡＮＬＰＣを濃縮することを示す。図９Ａは、ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株からの２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中のＣＤ３４＋およびＣＤ３４－集団のＭＡＣＳに基づく単離のために用いられたセルソーティング方策を示す。ＭＡＣＳソーティングは、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－筋細胞についての選択を含まない。試料は、筋細胞量を評定するためのＳＩＲＰＡおよびＣＤ９０、およびソーティング効率を評定するためのＣＤ３４の発現についてＭＡＣＳの直後にフローサイトメトリーにより分析された。図９Ｂは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株はＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーターを発現しないため、試料は、ソートの直後に固定され、筋細胞マーカーｃＴＮＴおよびＮＫＸ２－５への細胞内染色が、ペースメーカー含量を評定するために実施された。図９Ｃは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞中のｃＴＮＴ＋筋細胞集団内のＮＫＸ２－５－およびＮＫＸ２－５＋細胞の割合を示す（ｎ＝５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５。図９Ｄは、ソート前、ＣＤ３４＋、およびＣＤ３４－でソートされた細胞中の心筋細胞（ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５）、ＳＡＮ（ＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２、ＨＣＮ４）、作業心筋細胞および移行ゾーンの心筋細胞（ＮＰＰＡ）についての示されたマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝３）。値は、ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに相対的な発現レベルを表す。一元配置分散分析に続いてボンフェローニ事後検定。示された試料に対し＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図10A】ヒトＳＡＮ組織の単一核ＲＮＡシーケンシング（ｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ）結果を示す。図１０Ａは、ヒト胎児ＳＡＮ組織（妊娠２０週目）のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑにより同定された１８の細胞クラスターを示すｔＳＮＥプロットである。１０Ｂは、示された遺伝子（ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５、ＴＢＸ３、ＴＢＸ１８、ＳＣＮ５Ａ、およびＮＰＰＡ）の転写産物カウントを示すｔＳＮＥプロットである。図１０Ｃは、ＣＤ３４の転写産物カウントを示すｔＳＮＥプロットである。青色の矢印は、ＳＡＮクラスター内のＣＤ３４発現細胞を示す。
【図10B】ヒトＳＡＮ組織の単一核ＲＮＡシーケンシング（ｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ）結果を示す。図１０Ａは、ヒト胎児ＳＡＮ組織（妊娠２０週目）のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑにより同定された１８の細胞クラスターを示すｔＳＮＥプロットである。１０Ｂは、示された遺伝子（ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５、ＴＢＸ３、ＴＢＸ１８、ＳＣＮ５Ａ、およびＮＰＰＡ）の転写産物カウントを示すｔＳＮＥプロットである。図１０Ｃは、ＣＤ３４の転写産物カウントを示すｔＳＮＥプロットである。青色の矢印は、ＳＡＮクラスター内のＣＤ３４発現細胞を示す。
【図10C】ヒトＳＡＮ組織の単一核ＲＮＡシーケンシング（ｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ）結果を示す。図１０Ａは、ヒト胎児ＳＡＮ組織（妊娠２０週目）のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑにより同定された１８の細胞クラスターを示すｔＳＮＥプロットである。１０Ｂは、示された遺伝子（ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２－５、ＴＢＸ３、ＴＢＸ１８、ＳＣＮ５Ａ、およびＮＰＰＡ）の転写産物カウントを示すｔＳＮＥプロットである。図１０Ｃは、ＣＤ３４の転写産物カウントを示すｔＳＮＥプロットである。青色の矢印は、ＳＡＮクラスター内のＣＤ３４発現細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
発明の詳細な記載
本開示は、ＳＡＮ様ペースメーカー心筋細胞または細胞（ＳＡＮＬＰＣ）を検出するために、およびＳＡＮＬＰＣが高度に濃縮された心筋細胞集団を作製するために、ＣＤ３４を細胞表面マーカーとして使用する方法を提供する。幾つかの実施形態において、細胞集団中の心筋細胞の５０％より多く（例えば、５５％より多く、６０％より多く、６５％より多く、７０％より多く、７５％より多く、８０％より多く、８５％より多く、９０％より多く、９５％より多く、または９９％より多く）は、ＳＡＮＬＰＣである。本明細書で用いられる用語ＳＡＮＬＰＣは、心臓組織（例えば、ヒト心臓組織）から得られた（例えば、単離された）洞房結節ペースメーカー心筋細胞（ＳＡＮＬＰＣ）、ならびに天然由来のＳＡＮＬＰＣの電気生理学的機能を有しかつ、例えばさらに以下に記載される通り、組織培養物から作製された細胞を包含する。
本開示は、ＳＡＮ様ペースメーカー心筋細胞または細胞（ＳＡＮＬＰＣ）を検出するために、およびＳＡＮＬＰＣが高度に濃縮された心筋細胞集団を作製するために、ＣＤ３４を細胞表面マーカーとして使用する方法を提供する。幾つかの実施形態において、細胞集団中の心筋細胞の５０％より多く（例えば、５５％より多く、６０％より多く、６５％より多く、７０％より多く、７５％より多く、８０％より多く、８５％より多く、９０％より多く、９５％より多く、または９９％より多く）は、ＳＡＮＬＰＣである。本明細書で用いられる用語ＳＡＮＬＰＣは、心臓組織（例えば、ヒト心臓組織）から得られた（例えば、単離された）洞房結節ペースメーカー心筋細胞（ＳＡＮＬＰＣ）、ならびに天然由来のＳＡＮＬＰＣの電気生理学的機能を有しかつ、例えばさらに以下に記載される通り、組織培養物から作製された細胞を包含する。
【0022】
ＳＡＮＬＰＣの濃縮された集団は、それを必要とする患者（例えば、徐脈、不整脈、心不全、左もしくは右脚ブロック、心房細動、心筋梗塞、または洞不全症候群および先天性ＡＶブロックなどの先天性心疾患の特定の型を有する患者）における心腔の正常なペースメーカー活性および同時収縮を回復するために再生医療において有効であると予想される。本発明の濃縮された細胞集団は、例えば罹患した心臓の、左心室に、または直接ＳＡＮ、ＡＶＮ、ヒス束（房室束）に、または左および右脚部位に、植込むことができ、ペースメーカー細胞は、患者の自然な心臓伝導システムの無傷の成分と一体化し、自律神経系の制御下で機能する。これらの植込まれた細胞は、電子ペースメーカー植込み装置の必要性に取って代わり、そのような装置の重大な欠点を克服する。
【0023】
本発明のＳＡＮＬＰＣ濃縮細胞集団の有用性は、生物学的ペースメーカーとしての使用に留まらない。濃縮ＳＡＮＬＰＣへのアクセスは、ヒトのＳＡＮ生理学のインビトロ試験だけでなく、洞不全症候群などのＳＡＮに影響を及ぼす先天性疾患の患者特有の疾患モデリングにも有用である。これらの疾患モデリング試験は、潜在的薬物ターゲットの同定および新規な薬物処置の開発を可能にするであろう。加えて、ｈＰＳＣ由来ＳＡＮＬＰＣはまた、安全性薬理学的スクリーニングにおいてペースメーカー細胞に及ぼす新規薬物の潜在的に危険なオフターゲット効果を評定するために用いられ得る。
【0024】
Ｉ．インビトロでの洞房結節様ペースメーカー細胞の作製
ＳＡＮペースメーカー細胞は、心筋細胞の１つの型である。心筋細胞は、シグナンル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）および１種または複数の心筋トロポニン（例えば、心筋トロポニンＩまたは心筋トロポニンＴ（「ｃＴＮＴ」））の発現により特徴づけられる細胞である。心筋細胞はまた、ＣＤ９０陰性である。発達上、心筋細胞前駆細胞は、心臓中胚葉細胞（心臓血管中胚葉または中胚葉細胞としても知られる）に由来し、ｃＴＮＴ陽性およびＮＫ２ホメオボックス５（ＮＫＸ２－５）陽性であることにより特徴づけられる。前駆細胞は、ＮＫＸ２－５＋である、心房心筋細胞および心室心筋細胞、またはＮＫＸ２－５－である、ペースメーカー細胞に分化する。さらなる実施形態において、心臓ペースメーカー細胞はさらに、ＴＢＸ３＋ＴＢＸ１８＋ＳＨＯＸ２＋ＨＣＮ４＋ＮＫＸ２－５－により特徴づけられる。
ＳＡＮペースメーカー細胞は、心筋細胞の１つの型である。心筋細胞は、シグナンル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）および１種または複数の心筋トロポニン（例えば、心筋トロポニンＩまたは心筋トロポニンＴ（「ｃＴＮＴ」））の発現により特徴づけられる細胞である。心筋細胞はまた、ＣＤ９０陰性である。発達上、心筋細胞前駆細胞は、心臓中胚葉細胞（心臓血管中胚葉または中胚葉細胞としても知られる）に由来し、ｃＴＮＴ陽性およびＮＫ２ホメオボックス５（ＮＫＸ２－５）陽性であることにより特徴づけられる。前駆細胞は、ＮＫＸ２－５＋である、心房心筋細胞および心室心筋細胞、またはＮＫＸ２－５－である、ペースメーカー細胞に分化する。さらなる実施形態において、心臓ペースメーカー細胞はさらに、ＴＢＸ３＋ＴＢＸ１８＋ＳＨＯＸ２＋ＨＣＮ４＋ＮＫＸ２－５－により特徴づけられる。
【0025】
ＳＡＮ細胞中の自発的活動電位生成は、ＨＮＣ４およびＨＣＮ１イオンチャネルによりコードされる、いわゆるファニー電流（ＩＦ）により誘導される（Ｇｏｏｄｙｅｒ、前掲書）。この電流は、活動電位発火閾値に達するまで、拡張期緩徐脱分極を起こす。心室心筋細胞および心房心筋細胞（心室作業心筋細胞および心房作業心筋細胞とも呼ばれる）は、活動電位の自発的脱分極を呈さず、成熟状態では典型的には自発的活動性でない。ペースメーカー細胞および作業心筋細胞はさらに、それらの活動電位の最大立ち上がり速度において異なり、それは、心臓ナトリウムイオンチャネル（ＳＣＮ５Ａ）の低い発現レベルによりペースメーカー細胞ではかなり緩徐である（Ｇｏｏｄｙｅｒ，前掲書； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ． （２０１６） ９６：２５３－７３）。加えて、ペースメーカー細胞は、作業心筋細胞に比較してより短い活動電位持続時間を有する。
【0026】
種々の細胞型が、ＳＡＮＬＰＣなどの心筋細胞のインビトロ（エクスビボを含む）作製のために細胞供給源として用いられてよい。供給源細胞は、例えばヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）であってよい。本明細書で用いられる用語「多能性の」または「多能性」は、自己複製しかつ３種の生殖層：内肺葉、中胚葉、または外肺葉のいずれかの細胞に分化する細胞の能力を指す。「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」は、例えば、胚性幹細胞、体細胞核移植により誘導されるＰＳＣ、および人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）を含む。本明細書で用いられる用語「胚性幹細胞」、「ＥＳ細胞」、または「ＥＳＣ」は、早期胚から得られる多能性幹細胞を指し；幾つかの実施形態において、この用語は、過去に樹立されたＥＳ細胞株から得られたＥＳ細胞を指し、近年のヒト胚の破壊により得られた幹細胞を含まない。
【0027】
ＳＡＮＬＰＣなどの心筋細胞を作製するための細胞の簡便な一供給源は、ｉＰＳＣである。ｉＰＳＣは、１つまたは複数のリプログラミング因子を細胞に導入すること、または細胞と接触させることにより、成体体細胞または部分分化細胞または最終分化細胞（例えば、線維芽細胞、造血系列の細胞、筋細胞、神経細胞、表皮細胞、または同様のもの）などの、非多能性細胞から人工的に作製された多能性幹細胞の１つの型である。ｉＰＳＣを生成する方法は、当該技術分野で知られており、例えば、非限定的に、ＳＯＸ２（遺伝子ＩＤ：６６５７）、ＫＬＦ４（遺伝子ＩＤ：９３１４）、ｃ－ＭＹＣ（遺伝子ＩＤ：４６０９、ＮＡＮＯＧ（遺伝子ＩＤ：７９９２３）、および／またはＬＩＮ２８／ＬＩＮ２８Ａ（遺伝子ＩＤ：７９７２７））と組み合わせた、１種または複数の遺伝子（例えば、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４（遺伝子ＩＤ：５４６０）の発現を誘導することを含む。リプログラミング因子は、様々な手段（例えば、ウイルス、非ウイルス、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質送達）により送達されてよく、あるいは、内因性遺伝子が、例えばＣＲＩＳＰＲおよび他の遺伝子編集ツールを用いることにより、活性化されて、非多能性細胞をＰＳＣにリプログラミングしてもよい。
【0028】
ＥＳＣおよびｉＰＳＣを含む、ＰＳＣを単離および維持する方法は、当該技術分野で周知である。例えばＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９８） ２８２（５３９１）：１１４５－７； Ｈｏｖａｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄ．（２００３） １８（７）：１４０４－０９； Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ （２００６） ３：６３７－４６； Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ （２００７） １０９：２６７９－８７； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ （２０１１） ８：４２４－９；およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．（２０１３） １１（３）：１１０３－１６を参照されたい。
【0029】
様々な系列の細胞へのＰＳＣの分化を誘導するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、数多くの方法が、例えばＫａｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ （２０１１） ８（２）：２２８－４０； Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （２０１４） １１（８）：８５５－６０； Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ ＯＮＥ （２０１１） ６：ｅ１８２９３； Ｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ． （２０１２） １０９：ｅ１８４８－５７； Ｍａ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ． （２０１１） ３０１（５）：Ｈ２００６－Ｈ２０１７； ＷＯ２０１６／１３１１３７号；ＷＯ２０１８／０９８５９７号；および米国特許第９，４５３，２０１号に示される通り、ＰＳＣを心筋細胞に分化するために存在する。
【0030】
ヒト中胚葉細胞および心臓前駆細胞などの多分化能細胞もまた、用いられてよい。本明細書で用いられる「多分化能」細胞は、分化により１種より多くの細胞型を生じることができる細胞を指す。多分化能細胞は、多能性細胞より限定された分化能を有する。
【0031】
幾つかの他の実施形態において、細胞供給源は、心筋細胞にリプログラミングされ得る、分化された体細胞である。例えば、細胞供給源は、線維芽細胞であってよい（例えば、Ｅｎｇｅｌ ａｎｄ Ａｒｄｅｈａｌｉ， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ．（２０１８） ２０１８：１－１０参照）。心臓発達転写因子Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５（ＧＭＴ）を過剰発現することによる心筋細胞様細胞への線維芽細胞の直接的リプログラミングが、報告されている（Ｉｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ．（２０１０） １４２（３）：３７５－８６）。幾つかの実施形態において、ＳＡＮＬＰＣはその後、本明細書に記載される方法を利用して心筋細胞の集団から濃縮されてよい。
【0032】
発達上、心筋細胞前駆細胞または心筋前駆細胞は、心臓中胚葉細胞に由来し、ｃＴＮＴ＋であることにより特徴づけられる。ｈＰＳＣ（例えば、ｈＥＳＣおよびヒトｉＰＳＣ）からヒト心臓前駆体を作製する一方法は、（１）アクチビンシグナル伝達経路の活性化因子（例えば、アクチビン）および骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）受容体の活性化因子を含む培地とＰＳＣを接触させることにより、ｈＰＳＣを中胚葉に分化するように誘導すること；ならびに（ｉｉ）中胚葉細胞をＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させることにより、中胚葉を心臓前駆体に分化するように誘導すること、を含む。
【0033】
アクチビンは、発達全体を通して多くの細胞型により生成されるタンパク質のトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）ファミリーのメンバーである。アクチビンＡは、Ｉ型（Ａｃｔ ＲＩ－ＡおよびＡｃｔ ＲＩ－Ｂ）およびＩＩ型（Ａｃｔ ＲＩＩ－ＡおよびＡｃｔ ＲＩＩ－Ｂ）セリン－トレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体に結合するジスルフィド結合されたホモダイマー（２つのベータＡ鎖）である。アクチビンは主に、活性化アクチビン受容体複合体が受容体関連ＳＭＡＤをリン酸化する際にＳＭＡＤ２／３タンパク質を通してシグナル伝達する。得られたＳＭＡＤ複合体は、細胞増殖および分化を含む、種々の機能を調節する。
【0034】
ＢＭＰは、トランスフォーミング成長因子ベータスーパーファミリーの一部である。ＢＭＰ４は、ＢＭＰＲ１およびＢＭＰＲ２として知られるセリン－トレオニンキナーゼ受容体の２つの異なる型に結合する。これらの受容体を介したシグナル伝達は、ＳＭＡＤおよびＭＡＰキナーゼ経路を介して起こって、ＢＭＰ４の標的遺伝子の転写を実行する。ＢＭＰ４およびＢＭＰ２を含む、様々なＢＭＰが、本明細書に提供された細胞を作製する際の使用に適する。
【0035】
Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストは、Ｗｎｔシグナル伝達経路に拮抗する分子（例えば、化合物；核酸、例えば非コード化ＲＮＡ；ポリペプチド；およびポリペプチドをコードする核酸）であり、したがって減少された経路の出力（すなわち、減少された標的遺伝子発現）をもたらす。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストは、経路の正の調節成分を不安定にすること、その発現を減少させること、もしくはその機能を阻害すること、または経路の負の調節成分を安定化すること、その発現もしくは機能を増強すること、により機能し得る。したがってＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストは、経路の１つまたは複数の負の調節成分をコードする核酸であり得る。Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストは、経路の負の調節成分をｍＲＮＡまたはタンパク質レベルのどちらかで安定化させる低分子または核酸でもあり得る。同様に、対象のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストは、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで成分を阻害する経路の正の調節成分の低分子または核酸阻害剤（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）であり得る。幾つかの実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストは、低分子化合物（例えば、Ｘａｖ－９３９、Ｃ５９、ＩＣＧ－００１、ＩＷＲ１、ＩＷＰ２、ＩＷＰ４、ＩＷＰ－Ｌ６、ピルビニウム、ＰＫＦ１１５－５８４、および同様のもの）である。特有の実施形態において、Ｗｎｔアンタゴニズムは、Ｘａｖ－９３９とＣ５９の併用、またはＸａｖ－９３９とＩＷＰ－Ｌ６の併用により実現されてよい。米国特許出願公開第１８０２５１７３４号も参照されたい。
【0036】
例えば、心臓前駆細胞を作製するために、ＰＳＣは最初に、胚様体（ＥＢ）を形成させるために凝集体に導入されてよい。それを実行するために、ＰＳＣ（例えば、ｈＰＳＣ）は、ＢＭＰ成分を含み、場合によりさらにＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含むＥＢ培地中で一定時間（例えば、８～２４時間）培養されて、胚様体を作製してよい。ＥＢ培地は、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）基礎培地（場合によりＢ２７サプリメントを有する）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）基礎培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）基礎培地、またはＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）－３４と、それに添加されるＢＭＰ成分および／またはＲＯＣＫ阻害剤で作製されてよい。幾つかの実施形態において、ＥＢ培地中のＢＭＰ４の濃度は、約０．１と１０ｎｇ／ｍｌの間（例えば、約０．５～５ｎｇ／ｍｌ、または約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ｎｇ／ｍｌ）である。幾つかの実施形態において、ＥＢ培地中のＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ－Ｔｏｃｒｉｓ ＃１２５４）は、１～２０μＭ（例えば、１０μＭなどの５～１５μＭ）の範囲であってもよい。例えばＥＢ培地は、１ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４および１０μＭＹ－２７６３２を含有してよい。
【0037】
ＥＢはその後、アクチビンＡ、ＢＭＰ４、および場合により塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ－塩基性、ＦＧＦ－β、ＦＧＦ２、ヘパリン結合成長因子、またはヘパリンに結合するＦＧＦファミリーメンバーとしても知られる）を含む第一の分化培地（中胚葉誘導培地）中で培養されてよい。中胚葉誘導培地は、ＲＰＭＩ基礎培地（場合によりＢ２７サプリメントを有する）、ＤＭＥＭ基礎培地、ＩＭＤＭ基礎培地、またはＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）－３４と、それに添加される指示された因子で作製されてよい。アクチビンＡ、ＢＭＰ４、およびｂＦＧＦ濃度の選択は、高割合のＡＬＤＨ＋細胞および低割合のＣＤ２３５ａ＋細胞を含有し、かつ２０日目に高割合のｃＴＮＴ＋細胞を作製する、中胚葉集団の同定に基づいてよい。幾つかの実施形態において、中胚葉誘導培地中のＢＭＰ４の濃度は、約０．１と３０ｎｇ／ｍｌの間（例えば、約５～１０もしくは５～１５ｎｇ／ｍｌ；または約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｎｇ／ｍｌ）である。幾つかの実施形態において、中胚葉誘導培地は、約０．１および３０ｎｇ／ｍｌ（例えば、約５～１０もしくは５～１５ｎｇ／ｍｌ；または約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｎｇ／ｍｌ）の濃度でアクチビンＡを含む。幾つかの実施形態において、中胚葉誘導培地は追加的に、０．１～３０ｎｇ／ｍｌ（例えば、約５～１０もしくは５～１５ｎｇ／ｍｌ；または約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｎｇ／ｍｌ）のｂＦＧＦを含有する。特有の実施形態において、中胚葉誘導培地は、約１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、約６ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、および約５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有する。ｈＰＳＣは、中胚葉誘導培地中で約１～３日間（例えば、１、１．５、２、２．５、または３日間）培養されてよい。
【0038】
この培養ステップの後、細胞はさらに、ＩＷＰ２などのＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストを含み、場合によりＶＥＧＦを含む第二の分化培地（心臓誘導培地）中で少なくとも１～３日間（例えば、１、１．５、２、２．５、または３日間）培養されてよい。心臓誘導培地は、ＲＰＭＩ基礎培地（場合によりＢ２７サプリメントを有する）、ＤＭＥＭ基礎培地、ＩＭＤＭ基礎培地、またはＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）－３４と、それに添加される指示された因子で作製されてよい。幾つかの実施形態において、心臓誘導培地は、ＩＷＰ２を０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０μＭなどの０．１～１０μＭのＩＷＰ２、および場合により０．１～３０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（例えば、５～１０もしくは５～１５ｎｇ／ｍｌ；または０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５，または３０ｎｇ／ｍｌ）のＶＥＧＦを含有してよい。ペースメーカー細胞への分化系列決定を促進するために、心臓誘導培地は、ＢＭＰ４、レチノイン酸（ＲＡ）、アクチビン／結節阻害剤（例えば、ＳＢ－４３１５４２）、ＦＧＦ阻害剤（ＰＤ１７３０７４またはＳＵ５４０２）、および／またはＶＥＧＦの１つまたは複数を含有してよい。幾つかの実施形態において、心臓誘導培地は、０．５～１０ｎｇ／ｍｌ（例えば、１～５ｎｇ／ｍｌまたは２．５ｎｇ／ｍｌ）でＢＭＰ４、０．０５～２μＭ（例えば、０．１～０．５μＭまたは０．１２５μＭ）でＲＡ、０．１～１０μＭ（例えば、１～５μＭまたは３μＭ）でＳＢ－４３１５４２、０．０５～２μＭ（例えば、０．５～１．５μＭまたは１μＭ）でＰＤ１７３０７４を含有する。
【0039】
心臓誘導培地中でのインキュベーションの後、細胞をさらに、心臓基礎培地中でさらに１～３週間（例えば、７～１５日間）培養して、心筋細胞を含む細胞集団を得てよい。心臓基礎培地は、例えばＲＰＭＩ基礎培地（場合によりＢ２７サプリメントを有する）、ＤＭＥＭ基礎培地、ＩＭＤＭ基礎培地、または場合によりＶＥＧＦ（例えば、先に列挙された通り０．１～３０ｎｇ／ｍｌ）を補充されたＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）であってよい。
【0040】
幾つかの実施形態において、ＥＢは、慣例的にＥＢ２０として知られるＥＢ分化培地中で心臓前駆細胞（および究極的に心筋細胞）に分化するように誘導される（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．（２０１２） １１０（１２）：１５５６－６３参照）。心臓前駆体をその後、ＲＰＭＩ基礎培地（場合によりＢ２７サプリメントを有する）、ＤＭＥＭ基礎培地、ＩＭＤＭ基礎培地、またはＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）などの心臓基礎培地中でさらに培養して、ヒト心筋細胞（例えば、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ＋細胞））を含む細胞集団を得てよい。心臓基礎培地は、先に記載された通りＶＥＧＦを含有してよい。
【0041】
ｈＰＳＣ（例えば、ｈＥＳＣおよびヒトｉＰＳＣ）からヒト心臓前駆体を作製するための代わりの方法は、（ｉ）ｈＰＳＣ中でＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達を活性化して、第一の細胞集団を得ること；および（ｉｉ）第一の細胞集団中でＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達を阻害して、心筋細胞前駆体を含む第二の細胞集団を得ること、を含む。幾つかの実施形態において、低分子が、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達を連続的に活性化および阻害するために用いられてよい。ｈＰＳＣ中のＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達の活性化は、ｈＰＳＣをＷｎｔシグナル伝達アゴニストと接触させることにより実現されてよい。幾つかの実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストは、βカテニンを安定化すること、したがってβカテニンの各レベルを上昇させることにより、機能する。βカテニンは、複数の方法で安定化され得る。βカテニンの分解を容易にすることによりＷｎｔシグナル伝達経路の複数の負の調節成分が機能するため、対象のＷｎｔシグナル伝達アゴニストは、成分をｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで阻害する、経路の負の調節成分の低分子または核酸阻害剤（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡほか）であり得る。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストは、グリコーゲン合成キナーゼ３β（ＧＳＫ－３β）の阻害剤である。幾つかのそのような実施形態において、ＧＳＫ－３の阻害剤は、低分子化合物（例えば、ＣＨＩＲ－９９０２１、ＴＷＳ１１９、ＢＩＯ、ＳＢ ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＣＨＩＲ－９８０１４、および同様のもの）である。Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達の阻害は、予めＷｎｔシグナル伝達アゴニストと接触された細胞を、上記のものなどのＷｎｔシグナル伝達アゴニストと接触させることにより実現されてよい。一般に、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達の阻害を終了した後、心臓前駆体をさらに、ＲＰＭＩ基礎培地（場合によりＢ２７サプリメントを有する）、ＤＭＥＭ基礎培地、ＩＭＤＭ基礎培地、またはＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）などの心臓基礎培地中で培養して、ヒト心筋細胞（例えば、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ＋細胞））を含む細胞集団を得てよい。
【0042】
Ｌｉａｎらの前掲書に記載されたプロトコルに基づく例示的な非限定的プロトコルでは、心筋細胞は、以下の通りＣＨＩＲを用いる心臓誘導を介してヒトＰＳＣから作製されてよい。－１日目に、６Ｅ６ ｈＰＳＣは、ビトロネクチンコーティング６ウェルプレートのＥ８培地中に播種および培養され、一晩、プレートに接着されてよい。０日目に、細胞培地が、ＣＨＩＲ－９９０２１（「ＣＨＩＲ」；Ｔｏｃｒｉｓ４４２３／１０）を心筋細胞基礎（ＣＭ）培地（ＲＰＭＩ（Ｌ－グルタミンを有する）／インスリン不含のＢ－２７＋２１３μｇ／ｍｌ Ｌ－アスコルビン酸２リン酸塩（Ｓｉｇｍａ））に添加して、２、４、６、８、１０または１２μＭのＣＨＩＲ濃度に到達することにより調製されてよい。プレート中の古い培地は、ウェルあたり４ｍｌのＣＨＩＲ補充基礎ＣＭ培地と交換されてよい。ＣＨＩＲ濃度の最適化が、望ましいであろう（例えば、２～１２μＭの範囲のＣＨＩＲが、テストされてよい）。１日目に、培地が、吸引により除去されてよい。ウェルを、ＤＭＥＭで１回洗浄して、細胞片を除去してよい。その後、室温のＲＰＭＩ／Ｂ－２７／インスリン不含培地が、ウェルあたり４ｍｌの容量で添加されてよい。プレートは、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされてよい。２～３日目に、培地が、吸引により除去されてよい。ウェルが、ＤＭＥＭで１回洗浄されて、細胞片を除去してよい。その後、ＩＷＲＩが、新鮮なＲＰＭＩ／Ｂ－２７／インスリン不含培地４ｍｌに添加されて、最終的なＩＷＲＩ濃度２．５μＭを達成してよい。５日目に、培地が、ウェルあたり４ｍｌ容量の室温のＲＰＭＩ／Ｂ－２７／インスリン不含培地と交換されてよい。プレートは、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされてよい。５、６、７日目に、細胞培養物は、心臓前駆細胞を含む。７日目以降、培地は、心筋細胞を作製するためにウェルあたり４ｍｌ容量の室温のＲＰＭＩ／Ｂ－２７培地と交換されてよい。プレートは、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされてよい。心筋細胞は、フローサイトメトリー（ｃＴＮＴ／ＮＫＸ２－５）によりカウントされてよい。堅固な自発収縮が、１２日目までに起こるはずである。細胞は、６か月より長期間、この自発鼓動の表現型で維持され得る。このプロトコルは、多量の心臓前駆体および／または心筋細胞を生成するために規模拡大されてよい。例えば、バイオリアクター、大型ローラーボトル、および他の培養装置が、マルチウェル組織培養プレートの代わりに用いられてよい。
【0043】
幾つかの実施形態において、出発集団は、心臓血管中胚葉細胞である。そのような細胞は、表面マーカーＰＤＧＲＦ－アルファ（高）およびＫＤＲ（低）を発現する（米国特許第１０，５６１，６８７号）。加えて、これらの細胞は、表面マーカーＣＤ５６を発現し、Ｑ－ＲＴ－ＰＣＲによりＭＥＳＰ１およびＴ（ブラキウリ）を発現し、ｃＴＮＴ＋心筋細胞を生じ得る。心臓血管中胚葉細胞へのＦＧＦ阻害剤の添加は、培養２０日目に評定される場合、洞房結節様心筋細胞の割合を劇的に上昇させる（同書）。したがって、幾つかの実施形態において、心臓血管中胚葉細胞は、心臓導入相の全てまたは一部の間にＦＧＦ阻害剤でも処置される。
【0044】
特有の実施形態において、培養方法は、ａ）胚様体を作製するための期間、ＢＭＰ成分（例えば、ＢＭＰ４）を含み、場合によりさらにＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む胚様体培地中でｈＰＳＣをインキュベートすること；ｂ）心臓血管中胚葉細胞を作製するための期間、ＢＭＰ成分（例えば、ＢＭＰ４）およびアクチビン成分（例えば、アクチビンＡ）を含み、場合によりＦＧＦ成分（例えば、ｂＦＧＦ）を含む中胚葉誘導培地中で胚様体をインキュベートすること；ｃ）ＴＢＸ１８を発現する心臓血管前駆細胞を作製するための期間、先に選択された量のＢＭＰ成分（例えば、ＢＭＰ４）、およびレチノイン酸（ＲＡ）、および場合によりＦＧＦ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、場合によりＩＷＰ２、ＶＥＧＦおよびアクリビン／結節阻害剤（例えば、ＳＢ－４３１５４２）の１種または複数を含む心臓誘導培地心臓誘導培地中で心臓血管中胚葉細胞をインキュベートすることであって、心臓血管中胚葉細胞が好ましくは、ＦＧＦ阻害剤（例えば、ＰＤ １７３０７４（Ｔｏｃｒｉｓ）、ＳＵ ５４０２（Ｔｏｃｒｉｓ）、および任意の他のＦＧＦ受容体阻害剤またはＦＧＦシグナル伝達阻害剤）とインキュベートされ、ＦＧＦ阻害剤が、心臓誘導相の全てまたは一部の間に提供される、インキュベートすること；ならびに（ｄ）ＳＡＮＬＰＣが濃縮された心筋細胞の集団を作製するための期間、ＶＥＧＦを含む基礎培地中で心臓血管前駆細胞をインキュベートすること、を含む。培養物中の心筋細胞は、ＳＩＲＰＡおよび胸腺細胞分化抗原１（ＴＨＹ－１／ＣＤ９０）などの心筋細胞特異的表面マーカーを用いることにより単離され得、場合により単離された集団は、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－である。図２Ａも参照されたい。
【0045】
先に記載された様々な分化段階で用いられる培地は、非限定的にＲＰＭＩ基礎培地（場合によりＢ２７サプリメントを有する）、ＤＭＥＭ基礎培地、ＩＭＤＭ基礎培地、またはＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）－３４を含む、任意の適切な基礎培地と、基礎培地に添加される示された因子（例えば、サイトカインおよび低分子）で作製され得る。
【0046】
ＩＩ．洞房結節様ペースメーカー細胞のさらなる濃縮
上記の培養方法は、最大で約５０％のＳＡＮＬＰＣを有する心筋細胞集団を
もたらし得る。しかし、生物学的ペースメーカー細胞療法の重要な要件である、約５０％を超える（および約９９％までの）純度を有するさらに濃縮されたＳＡＮＬＰＣ細胞組成物を得ることが、望ましい。本発明者らは予想外に、細胞表面分子ＣＤ３４が、心筋細胞中のＳＡＮＬＰＣに対する明らかなマーカーであることを発見した。ＣＤ３４は、早期リンパ造血幹細胞および前駆細胞、ならびに内皮細胞上で典型的に発現される膜貫通型糖タンパク質である。本発明者らは、ＣＤ３４について心筋細胞の集団を染色することが、他の型の心筋細胞からのＮＫＸ２－５－ＣＤ９０－ＳＩＲＰＡ＋ＳＡＮＬＰＣの分離を可能にすることを見出した（実施例２参照）。したがって、ＮＫＸ２－５－ＣＤ９０－ＳＩＲＰＡ＋ＳＡＮＬＰＣは、細胞表面のＣＤ３４を標的とする薬剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を用いて心筋細胞の集団からさらに濃縮され得る。抗ＣＤ３４抗体は、市販の供給源（例えば、ＣＤ３４ ＢＶ４２１クローン５８１およびＣＤ３４ ＡＰＣクローン８Ｇ１２、両者ともＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、それぞれＣａｔ． Ｎｏ．５６２５７７および３４０４４１）から容易に入手可能である。幾つかの実施形態において、混入した内皮細胞は、抗ＣＤ３１抗体などのＣＤ３１結合剤を用いることにより除去され得る。ＳＡＮＬＰＣは、ＣＤ３１－であり、一方で内皮細胞は、ＣＤ３１＋である。
上記の培養方法は、最大で約５０％のＳＡＮＬＰＣを有する心筋細胞集団を
もたらし得る。しかし、生物学的ペースメーカー細胞療法の重要な要件である、約５０％を超える（および約９９％までの）純度を有するさらに濃縮されたＳＡＮＬＰＣ細胞組成物を得ることが、望ましい。本発明者らは予想外に、細胞表面分子ＣＤ３４が、心筋細胞中のＳＡＮＬＰＣに対する明らかなマーカーであることを発見した。ＣＤ３４は、早期リンパ造血幹細胞および前駆細胞、ならびに内皮細胞上で典型的に発現される膜貫通型糖タンパク質である。本発明者らは、ＣＤ３４について心筋細胞の集団を染色することが、他の型の心筋細胞からのＮＫＸ２－５－ＣＤ９０－ＳＩＲＰＡ＋ＳＡＮＬＰＣの分離を可能にすることを見出した（実施例２参照）。したがって、ＮＫＸ２－５－ＣＤ９０－ＳＩＲＰＡ＋ＳＡＮＬＰＣは、細胞表面のＣＤ３４を標的とする薬剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を用いて心筋細胞の集団からさらに濃縮され得る。抗ＣＤ３４抗体は、市販の供給源（例えば、ＣＤ３４ ＢＶ４２１クローン５８１およびＣＤ３４ ＡＰＣクローン８Ｇ１２、両者ともＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、それぞれＣａｔ． Ｎｏ．５６２５７７および３４０４４１）から容易に入手可能である。幾つかの実施形態において、混入した内皮細胞は、抗ＣＤ３１抗体などのＣＤ３１結合剤を用いることにより除去され得る。ＳＡＮＬＰＣは、ＣＤ３１－であり、一方で内皮細胞は、ＣＤ３１＋である。
【0047】
したがって本開示は、抗ＣＤ３４抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２）、またはＣＤ３４に特異的に結合する任意の他の薬剤（例えば、ＣＤ３４の天然または修飾リガンドを含むＦｃ融合タンパク質）を用いることによりＳＡＮＬＰＣが濃縮された心筋細胞の集団を生成する方法を提供する。結合されたＳＡＮＬＰＣの選択／濃縮は、非限定的に、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）（例えば、免疫磁気セルソーティング）、浮力活性化セルソーティング（ＢＡＣＳ（商標））（例えば、Ｌｉｏ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１５） １０（５）：ｅ０１２５０３６参照）および同様のものを含む、当該技術分野で入手可能なソーティング方法を利用することにより完遂されてよい。セルソーティング方法の組み合わせもまた、必要に応じて、ソート時間を低減し純度および回収率を改善するために利用されてよい。
【0048】
幾つかの実施形態において、ＳＡＮＬＰＣが濃縮された心筋細胞の集団は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のＳＡＮＬＰＣを含む。幾つかの実施形態において、ＳＡＮＬＰＣが濃縮された心筋細胞集団は、ＮＫＸ２－５＋である、心房様心筋細胞（ＡＬＣＭ）および心室様心筋細胞（ＶＬＣＭ）を実質的に含まない。
【0049】
ＳＡＮＬＰＣ細胞培養分解過程の間のＣＤ３４の一過性発現が、細胞培養物からＳＡＮＬＰＣを回収するための最適時間を決定するために用いられ得る。例えば、細胞培養物のアリコートが、ＣＤ３４のレベルを測定して所望のＳＡＮＬＰＣ数が細胞培養物中で実現されたかどうかを評定するために、評定され得る。細胞培養物は、１つ以上の段階で評定され得る。追加的心筋細胞マーカーまたはＳＡＮＬＰＣ特異性マーカーが、例えば、免疫に基づく技術（例えば、フローサイトメトリー）、またはｍＲＮＡに基づく技術（例えば、定量的ＲＴ－ＰＣＲ）を用いることにより、測定され得る。
【0050】
ＣＤ３４発現はまた、ＳＡＮＬＰＣ組成物の純度を評価するための基本原理として、例えばペースメーカー細胞療法製品のための品質制御の一部として用いられ得る。反対に、ＣＤ３４発現は、作業心筋細胞（例えば、心室および／または心房心筋細胞）組成物中に混入したＳＡＮＬＰＣを検出するための基本原理として用いられ得る。
【0051】
ＩＩＩ．医薬組成物および使用
本開示の濃縮されたＳＡＮＬＰＣ細胞調製物は、疲労～失神にわたる症状を伴い緩徐で不規則な心拍（徐脈性不整脈）を生じる、ＳＡＮもしくはＡＶＮ機能の加齢関連の損失、先天性疾患、または心臓手術を有する対象を処置するために生物学的ペースメーカー療法において用いられ得る。幾つかの実施形態において、本発明の細胞療法を必要とする患者は、徐脈、不整脈、左および／もしくは右脚ブロック、心房細動、または洞不全症候群および先天性ＡＶブロックなどの先天性心疾患を有する。幾つかの実施形態において、対象は、１回または複数回の心筋梗塞または心不全に見舞われている。幾つかの実施形態において、心不全の型は、左心不全、右心不全、拡張不全、または収縮不全である。幾つかの実施形態において、心不全は、うっ血性心不全である。幾つかの実施形態において、ペースメーカー処置の適応となる患者としては、左室駆出率の低減（例えば、≦３５％）、左脚ブロック（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．（２０１８） ７２：３１１２－２２）、左および右心室の非同期収縮（心臓同期不全；Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２００５） １５：１５３９－４９）、および／またはＱＲＳ幅延長（Ｂｒｉｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２００４） ２１：２１４０－５０）を有する心不全の患者、ならびに虚血性心筋症（心筋梗塞；Ｂｒｉｓｔｏｗ、前掲書）により引き起こされた心不全の患者が挙げられる。
本開示の濃縮されたＳＡＮＬＰＣ細胞調製物は、疲労～失神にわたる症状を伴い緩徐で不規則な心拍（徐脈性不整脈）を生じる、ＳＡＮもしくはＡＶＮ機能の加齢関連の損失、先天性疾患、または心臓手術を有する対象を処置するために生物学的ペースメーカー療法において用いられ得る。幾つかの実施形態において、本発明の細胞療法を必要とする患者は、徐脈、不整脈、左および／もしくは右脚ブロック、心房細動、または洞不全症候群および先天性ＡＶブロックなどの先天性心疾患を有する。幾つかの実施形態において、対象は、１回または複数回の心筋梗塞または心不全に見舞われている。幾つかの実施形態において、心不全の型は、左心不全、右心不全、拡張不全、または収縮不全である。幾つかの実施形態において、心不全は、うっ血性心不全である。幾つかの実施形態において、ペースメーカー処置の適応となる患者としては、左室駆出率の低減（例えば、≦３５％）、左脚ブロック（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．（２０１８） ７２：３１１２－２２）、左および右心室の非同期収縮（心臓同期不全；Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２００５） １５：１５３９－４９）、および／またはＱＲＳ幅延長（Ｂｒｉｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２００４） ２１：２１４０－５０）を有する心不全の患者、ならびに虚血性心筋症（心筋梗塞；Ｂｒｉｓｔｏｗ、前掲書）により引き起こされた心不全の患者が挙げられる。
【0052】
本開示のＳＡＮＬＰＣ細胞調製物は、それを必要とする対象に、最小侵襲法を介して投与されてよく、および／または局所的に移植されてよい。様々な方法が、患者の心臓（例えば、心房）に細胞を投与するために当該技術分野で知られており、冠動脈内投与、心筋内投与、または経心内膜投与を含むが、これらに限定されない。ＳＡＮＬＰＣは、カテーテルに基づくアプローチを用いることにより心臓に導入され得る。カテーテルは、大腿静脈、鎖骨下静脈、頸静脈もしくは腋窩静脈を介して、または心室、心房もしくはＳＡＮ領域への心内膜移植により、挿入されてよい。細胞はまた、胸部を通して挿入される針を利用して、心外膜アプローチにより心室、心房、またはＳＡＮ領域に移植され得る。フルオロスコピー（Ｘ線に基づく方法）または３Ｄマッピングは、カテーテル／針を意図する注射部位に先導するために用いられ得る。
【0053】
本明細書に記載されたＳＡＮＬＰＣ濃縮細胞調製物は、細胞および医薬的に許容できる担体を含有する医薬組成物中で提供されてよい。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、ＰＳＣ由来（例えば、ｉＰＳＣ由来）ＳＡＮＬＰＣの集団と、医薬的に許容できる担体および／または添加剤とを含む。例えば、安定化された水、生理学的生理食塩水、一般的緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸）、安定化剤、塩、抗酸化剤、界面活性剤、懸濁剤、等張剤、場合により任意の動物由来成分を含有しない細胞培地、および／または防腐剤が、医薬組成物に含まれてよい。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、処置を必要とする対象への投与に適した投与剤形に配合される。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、心筋内投与、経心内膜投与、または冠動脈内投与に適した投与剤形に配合される。貯蔵および運搬のために、細胞は場合により、凍結保存されてよい。使用に先立ち、細胞は、目的の細胞型を支援する滅菌担体中で解凍され希釈されてもよい。
【0054】
治療的に有効な数のＳＡＮＬＰＣが、患者に投与される。本明細書で用いられる用語「治療的に有効な」は、疾患、障害、および／または病気の症状（複数可）の発生または進行を処置、予防、および／または遅延するために疾患、障害および／または病気に罹患した、または罹り易いヒト対象に投与される場合に充分である、細胞の数または医薬組成物の量を指す。治療的に有効な量が、少なくとも１単位用量を含む投与レジメンを介して典型的に投与されることは、当業者に察知されよう。
【0055】
本明細書に他に定義されない限り、本開示に関連して用いられる科学的および技術的用語は、当業者に慣例的に理解される意味を有する。例示的方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載されたものと類似の、または同等の方法および材料もまた、本開示の実践およびテストで用いられ得る。矛盾する場合には、本明細書が、定義を含み、管理する。一般に、心臓病学、医療、医療薬化学、細胞生物学、本明細書に記載された分子に関連して用いられる命名法およびそれらの技術は、当該技術分野で周知であり慣例的に用いられるものである。さらに、文脈によって他に要求されない限り、単一の用語は複数を包含し、複数の用語は単一を包含する。本明細書および実施形態全体を通して、言語「有する」および「含む」、または「有する（ｈａｓ）」、「含んでいる」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる」などの変形例は、述べられた整数または整数群の包含を示唆し、任意の他の整数または整数群の除外を示唆しないことが理解されよう。本明細書で言及された全ての発行物および他の参考資料は、全体として参照により組み入れられる。複数の文書が、本明細書で引用されているが、この引用は、これらの文書のいずれかが当該技術分野で共通する一般的知識の一部を形成することの承認とはならない。
【0056】
本明細書で用いられる、該当する１つまたは複数の値に適用される用語「およそ」または「約」は、述べられた参照値と類似の値を指す。特定の実施形態において、用語は、他に述べられない限り、または他に文脈から明白にならない限り、述べられた参照値のいずれかの方向で（より大きな、またはより小さな）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に含まれる値の範囲を指す。
【0057】
本発明がよりよく理解され得る目的で、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例示目的に過ぎず、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
【0058】
実施例
実施例１：細胞培養物中のＳＡＮＬＰＣ心筋細胞の分化
この実施例は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からＳＡＮＬＰＣを分化するためのプロトコルを記載する。プロトコルはまた、Ｐｒｏｔｚｅの前掲書に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
実施例１：細胞培養物中のＳＡＮＬＰＣ心筋細胞の分化
この実施例は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からＳＡＮＬＰＣを分化するためのプロトコルを記載する。プロトコルはまた、Ｐｒｏｔｚｅの前掲書に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【0059】
第一のプロトコルにおいて、ＳＡＮＬＰＣは、フローサイトメトリーを用いてＮＫＸ２－５－ＣＤ９０－ＳＩＲＰＡ＋心筋細胞として陰性選択により同定され単離された（図１）。ＮＫＸ２－５は、ＳＡＮペースメーカー心筋細胞以外のあらゆる心筋細胞により発現される心臓転写因子である（Ｍｏｍｍｅｒｓｔｅｅｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ． ２０１０） ８７：９２－１０１； Ｓｉｚａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃ Ａｒｒｈｙｔｈｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．（２０１１） ４：５３２－４２）。細胞内タンパク質であり抗体による生存細胞染色を受け易くないＮＫＸ２－５の発現を読み出すことができるように、レポーターヒト胚性幹細胞株（ＨＥＳ３ ＮＫＸ２－５：ＧＦＰ）が用いられ；この細胞株は、ＮＫＸ２－５対立遺伝子の１つの最初のエクソンに挿入されたＧＦＰ蛍光レポーターを有した。
【0060】
上記プロトコルは特異的レポーター細胞株の使用に依存するため、第二のプロトコルが開発され、そこでは分化培養物中の任意のＮＫＸ２－５＋心筋細胞の発達が、分化過程の間にＦＧＦシグナル伝達を阻害することにより遮断され（図２Ａ）。ＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーターを運搬しない細胞株中のＮＫＸ２－５－ＳＡＮペースメーカー心筋細胞の割合を視覚化するために、細胞は、固定され細胞内ＮＫＸ２－５およびｃＴＮＴタンパク質について染色された。２×１０５細胞が、染色ごとに用いられた。手短に述べると、ＥＢが、２型コラゲナーゼおよびＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いて解離された。細胞はその後、洗浄され、ＰＢＳ（Ｃａ２＋Ｍｇ２＋）中の４％パラホルムアルデヒドにより４℃で１０分間固定され、その後、ＰＢＳ（Ｃａ２＋Ｍｇ２＋）および５％ＦＣＳで２回洗浄された。細胞はその後、４℃で１０分間洗浄緩衝液（ＰＢＳ（Ｃａ２＋Ｍｇ２＋）、０．３％ＢＳＡ、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、およびＦＣＳ）中で透過処理された。細胞はその後、３０００ｒｐｍで４分間遠心分離され、懸濁され、染色緩衝液（ＰＢＳ（Ｃａ２＋Ｍｇ２＋）、０．３％ＢＳＡ、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ）＋ｃＴＮＴのマウス抗心臓アイソフォームおよびウサギ抗ヒトＮＫＸ２－５抗体中にて、４℃で一晩インキュベートされた。細胞はその後、洗浄され、遠心分離され、洗浄緩衝液中に２回再懸濁された。細胞はその後、遠心分離され、再懸濁され、ヤギ抗マウスＰＥ＋ｄｋ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７二次抗体を含有する染色緩衝液中にて４℃で３０分間インキュベートされた。細胞はその後、洗浄され、洗浄緩衝液中に２回再懸濁された。細胞は再度、遠心分離され、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（Ｃａ２＋Ｍｇ２＋）＋５％ＦＣＳ）中に再懸濁された。ＮＫＸ－ＧＦＰレポーター株が、陽性対照（ＮＫＸ２－５抗体／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７で対比染色された）として用いられた。
【0061】
第二のプロトコルの下で得られたデータは、生じた培養物が、非心筋細胞と、ＣＤ９０－ＳＩＲＰＡ＋発現に基づき非心筋細胞から単離され得るＮＫＸ２－５－ＳＡＮペースメーカー心筋細胞とを含有したことを示す（図２Ｂおよび２Ｃ）。このアプローチを用いて、ＳＡＮＬＰＣが濃縮された培養物が、複数のｈＰＳＣ株（ＨＥＳ３、ＨＥＳ２、ＭＳＣ－ｉＰＳ１）から単離され得た（図２Ｄおよび２Ｅ）（Ｐｒｏｔｚｅ、前掲書）。
【0062】
実施例２：ＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣ心筋細胞のための細胞表面マーカーの同定
上記のプロトコルは、ＳＡＮＬＰＣへのｈＰＳＣの分化誘導を可能にするが、重要な難題が依然として残されている。生物学的ペースメーカー療法における適用のために、高度に濃縮されたペースメーカー集団が必要とされる。ＳＡＮＬＰＣ分化を高い効率で（即ち、≧５０％）日常的に実現することは、困難である。疾患モデリングにおける適用のために、分化プロトコルは、異なる患者特有のｉＰＳＣに適用される必要がある。細胞株間の内因性シグナル伝達の差は多くの場合、プロトコルの調節を必要とし、それは、主にＮＫＸ２－５－ＳＡＮペースメーカー心筋細胞を含有するがＮＫＸ２－５＋心筋細胞を含有しない細胞培養物を得るために、開発に４か月以上かかり得る（Ｐｒｏｔｚｅ、２０１７、前掲書）。それゆえ、分化培養物からの蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によるＳＡＮＬＰＣの陽性選択を可能にする細胞表面マーカーは、非常に価値がある。この細胞表面マーカーは、ＳＡＮＬＰＣを小さな割合（５％、１０％、２０％、３０％または４０％以下などの、５０％未満）でしか含有しない心筋細胞集団からでさえＳＡＮＬＰＣが高度に濃縮された（例えば、≧８０％ＳＡＮＬＰＣ）集団の単離を可能にするであろう。
上記のプロトコルは、ＳＡＮＬＰＣへのｈＰＳＣの分化誘導を可能にするが、重要な難題が依然として残されている。生物学的ペースメーカー療法における適用のために、高度に濃縮されたペースメーカー集団が必要とされる。ＳＡＮＬＰＣ分化を高い効率で（即ち、≧５０％）日常的に実現することは、困難である。疾患モデリングにおける適用のために、分化プロトコルは、異なる患者特有のｉＰＳＣに適用される必要がある。細胞株間の内因性シグナル伝達の差は多くの場合、プロトコルの調節を必要とし、それは、主にＮＫＸ２－５－ＳＡＮペースメーカー心筋細胞を含有するがＮＫＸ２－５＋心筋細胞を含有しない細胞培養物を得るために、開発に４か月以上かかり得る（Ｐｒｏｔｚｅ、２０１７、前掲書）。それゆえ、分化培養物からの蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によるＳＡＮＬＰＣの陽性選択を可能にする細胞表面マーカーは、非常に価値がある。この細胞表面マーカーは、ＳＡＮＬＰＣを小さな割合（５％、１０％、２０％、３０％または４０％以下などの、５０％未満）でしか含有しない心筋細胞集団からでさえＳＡＮＬＰＣが高度に濃縮された（例えば、≧８０％ＳＡＮＬＰＣ）集団の単離を可能にするであろう。
【0063】
ＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣ心筋細胞により特異的に発現される細胞表面マーカーを同定するために、本発明者らは、実施例１およびＰｒｏｔｚｅの前掲書に記載されたＳＡＮペースメーカープロトコルで分化された、ｈＰＳＣ由来（ＨＥＳ２ ｈＰＳＣ株）２０日目培養物の単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を実施した。１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓからのシーケンシングプラットフォームを、用いた（図３Ａ）。教師なしクラスタリングは、１１の明らかに異なる細胞クラスターを同定し、その大部分が、ＴＮＮＴ２を発現しており、それらが心筋細胞に相当することを示した（図３Ｂ）。クラスター１および２は、ＴＮＮＴ２＋ＮＫＸ２－５－ＴＢＸ３ｈｉｇｈＴＢＸ１８＋を発現する細胞を含有し、それは、ＳＡＮＬＰＣを表した。本発明者らはまた、ＮＫＸ２－５＋心筋細胞の３つのクラスター：ＳＡＮ尾部細胞を表すＴＮＮＴ２＋ＮＫＸ２－５＋ＴＢＸ３＋ＴＢＸ１８－（クラスター３）、移行ゾーン細胞を表すＴＮＮＴ２＋ＮＫＸ２－５＋ＴＢＸ３ｌｏｗＳＣＮ５Ａ＋（クラスター４）、および心房心筋細胞を表すＴＮＮＴ２＋ＮＫＸ２－５＋ＴＢＸ３－ＳＣＮ５Ａ＋ＮＰＰＡ＋（クラスター５）、を同定した。ＮＸＫ２－５－ＳＡＮＬＰＣにより特異的に発現された遺伝子を同定しようと試みて、本発明者らは、差次的遺伝子発現分析を実施した。注目すべきことに、この分析は、細胞表面抗原ＣＤ３４が、クラスター１および２で著しく濃縮されたことを明らかにした（図３Ｃ）。
【0064】
ＣＤ３４の染色がｈＰＳＣ分化細胞中のＮＸＫ２－５－ＳＡＮＬＰＣを標識するかどうかをテストするために、本発明者らは、実施例１およびＰｒｏｔｚｅの前掲書に記載されたＳＡＮ分化プロトコルを用いてＨＥＳ３ ＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーター細胞株を分化した。ＥＢの解離後に、１×１０５～３×１０５細胞が、９６ウェルプレートに移され、２０００ｒｐｍ（５００ｇ）で遠心分離され、ＣＤ３４に対する抗体（ＡＰＣ １：３００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ． Ｎｏ．３４０４４１）、ＳＩＲＰＡ（Ｐｅ－Ｃｙ７ １：１０００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３２３８０７、クローンＳＥ５Ａ５）、およびＣＤ９０（ＢＶ４２１、１：３００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５５９８６９）を含有するＦＡＣＳ緩衝液（Ｃａ２＋またはＭｇ２＋＋５％ＦＣＳ＋０．０２％ ＮａＮ３を有さないＰＢＳ）１００μｌに再懸濁された。細胞は、４℃で３０～４５分間インキュベートされた。その後、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液が、インキュベートされた細胞に添加された。細胞は、２０００ｒｐｍでペレット化され、ＦＡＣＳ緩衝液２００μｌで洗浄され、再度ペレット化され、その後２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁された後、分析された。
【0065】
本発明者らは、ＳＩＲＰＡおよび線維芽細胞マーカーＣＤ９０について２０日目ＳＡＮＬＰＣ分化培養物を染色して、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞を同定した（図４Ａ）。この染色に抗ＣＤ３４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ ＃ ３４０４４１）を含めて、ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中の心筋細胞の３０±３％がＣＤ３４を発現したことを示した。重要なことに、ＣＤ３４＋発現は、これらの培養物に含有されるＮＫＸ２－５＋心筋細胞に比較して、ＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣ中で有意に濃縮された（３７±２％ ｖｓ １３±２％）（図４Ｂ）。これらのデータは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの結果と一致した。
【0066】
ＣＤ３４は内皮細胞のための公知のマーカーであるため、本発明者らは、内皮細胞マーカーＣＤ３１との共染色も実施した（図４Ｃ）。この分析は、培養物がＣＤ３１＋ＣＤ３４＋内皮細胞の小集団を含有したことを示した。重要なことに、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞集団中に見出されたＣＤ３４＋細胞はＣＤ３１を発現せず、それらが内皮細胞でないことを裏付けた。
【0067】
ＣＤ３４の特異性をさらにテストするために、本発明者らは次に、確立されたプロトコル（Ｌｅｅ，２０１７、前掲書）を利用して、ＨＥＳ３ ＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーター株を心房（ＡＬＣＭ）および心室（ＶＬＣＭ）心筋細胞に分化させた。心房心筋細胞または心室心筋細胞はどちらも、ＣＤ３４を発現すると見出されなかった（図４Ｄ～Ｆ）。これらのデータは、ＣＤ３４がＳＡＮＬＰＣを特異的に標識することを示唆する。
【0068】
本発明者らは分化培養物中のＣＤ３４＋ＣＤ３１＋内皮細胞の集団も検出したが、これらの細胞の割合は低かったため（約２％）、本発明者らは、内皮細胞からの混入の問題を想定していない（図４Ｃ）。
【0069】
実施例３：分化の経過時間中のＳＡＮＬＰＣの同定
ＣＤ３４がＳＡＮ分化の間の早期にＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣを同定するために用いられ得るかどうかをテストするために、本発明者らは、ＨＥＳ３ ＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーター細胞株において４～２０日目にフローサイトメトリーによりＣＤ９０、ＳＩＲＰＡ、ＮＫＸ２－５：ＧＦＰおよびＣＤ３４の発現を分析した（図５）。予想通り、分化の４日目では、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞は検出されなかった（図５Ａ）。１０日までに、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞の確実な集団が存在し、２０日目まで増加し続けた。本発明者らは、１０日という早期にこの心筋細胞集団内でＣＤ３４＋細胞を検出できた（１４±７％）。ＣＤ３４＋筋細胞の割合は、２０日まで増加し続けた（５５±８％）（図５Ｂ）。重要なことに、分化全体を通して、ＣＤ３４発現は、ＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣに特異的であった。これらのデータは、ＣＤ３４が、ＳＡＮ分化培養物中のＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣの割合をモニタリングするために１０日という早期に用いられ得ることを示唆する。ＳＡＮＬＰＣ含量を分化の早期に予測できることは、将来の細胞療法適用のための分化の規模拡大に大きく関連する。
ＣＤ３４がＳＡＮ分化の間の早期にＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣを同定するために用いられ得るかどうかをテストするために、本発明者らは、ＨＥＳ３ ＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーター細胞株において４～２０日目にフローサイトメトリーによりＣＤ９０、ＳＩＲＰＡ、ＮＫＸ２－５：ＧＦＰおよびＣＤ３４の発現を分析した（図５）。予想通り、分化の４日目では、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞は検出されなかった（図５Ａ）。１０日までに、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞の確実な集団が存在し、２０日目まで増加し続けた。本発明者らは、１０日という早期にこの心筋細胞集団内でＣＤ３４＋細胞を検出できた（１４±７％）。ＣＤ３４＋筋細胞の割合は、２０日まで増加し続けた（５５±８％）（図５Ｂ）。重要なことに、分化全体を通して、ＣＤ３４発現は、ＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣに特異的であった。これらのデータは、ＣＤ３４が、ＳＡＮ分化培養物中のＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣの割合をモニタリングするために１０日という早期に用いられ得ることを示唆する。ＳＡＮＬＰＣ含量を分化の早期に予測できることは、将来の細胞療法適用のための分化の規模拡大に大きく関連する。
【0070】
実施例４：ＳＡＮ分化培養物からのＳＡＮＬＰＣの濃縮
本発明者らは次に、ＣＤ３４が、ＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣを単離するために、およびそれらをＳＡＮ分化培養物中に含有されるＮＫＸ２－５＋心筋細胞から分離するために用いられ得るかどうかをテストした。この試験のために、本発明者らは、ＦＡＣＳを用いてＨＥＳ３ ＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーター株の２０日目ＳＡＮ分化培養物からＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－ＣＤ３４＋心筋細胞およびＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－ＣＤ３４－心筋細胞株を単離した（図６Ａ）。本発明者らは、ソートの直後にＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣの含量を分析し、ソート前対照（５５±７％）に比較して、ＣＤ３４＋でソートされた細胞中のＳＡＮＬＰＣの最大で７８±６％の有意な濃縮を見出した（図６Ｂ）。したがって、ＮＫＸ２－５＋心筋細胞の割合は、ＣＤ３４＋でソートされた細胞において有意に低減された（４５±７％から２２±６％へ）。
本発明者らは次に、ＣＤ３４が、ＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣを単離するために、およびそれらをＳＡＮ分化培養物中に含有されるＮＫＸ２－５＋心筋細胞から分離するために用いられ得るかどうかをテストした。この試験のために、本発明者らは、ＦＡＣＳを用いてＨＥＳ３ ＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーター株の２０日目ＳＡＮ分化培養物からＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－ＣＤ３４＋心筋細胞およびＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－ＣＤ３４－心筋細胞株を単離した（図６Ａ）。本発明者らは、ソートの直後にＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣの含量を分析し、ソート前対照（５５±７％）に比較して、ＣＤ３４＋でソートされた細胞中のＳＡＮＬＰＣの最大で７８±６％の有意な濃縮を見出した（図６Ｂ）。したがって、ＮＫＸ２－５＋心筋細胞の割合は、ＣＤ３４＋でソートされた細胞において有意に低減された（４５±７％から２２±６％へ）。
【0071】
本発明者らはまた、ＣＤ３４＋でソートされた細胞中のＳＡＮＬＰＣマーカーの濃縮についてテストするために、ＣＤ３４＋およびＣＤ３４－でソートされた心筋細胞のＲＴ－ｑＰＣＲ分析も実施した（図６Ｃ）。ＣＤ３４発現は、ＣＤ３４＋でソートされた細胞において有意に濃縮され、ソーティング方策を検証した。ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－ＣＤ３４＋でソートされた細胞は、ソート前に比較して高レベルの汎筋細胞マーカー（ｐａｎ－ｍｙｏｃｙｔｅ ｍａｒｋｅｒ）ＴＮＮＴ２を発現し、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－細胞を選択することによる心筋細胞の濃縮を確認した。ＮＫＸ２－５の発現は、ＣＤ３４＋集団におけるＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣの濃縮について予想された通り、ＣＤ３４－集団に比較してＣＤ３４＋集団で有意に低減された。
【0072】
一致して、ＳＡＮペースメーカーマーカーＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２およびＨＣＮ４が、ソート前およびＣＤ３４－細胞よりＣＤ３４＋細胞中で高レベルで発現された。作業心筋細胞および移行ゾーン細胞のマーカーである、ナトリウムイオンチャネル遺伝子ＳＣＮ５Ａおよびナトリウム利尿ペプチド遺伝子ＮＰＰＡの発現が、ＣＤ３４－細胞で強化された。総括すると、これらのデータは、ＣＤ３４＋がＮＸＫ２－５－ＳＡＮＬＰＣを特異的に標識すること、およびＣＤ３４＋心筋細胞のソーティングがＳＡＮ分化培養物からのＳＡＮＬＰＣの濃縮を可能にすること、を示唆する。この実施例において、ＳＡＮＬＰＣは、７８±６％の純度に濃縮された。
【0073】
実施例５：ＭＡＣＳを用いるＳＡＮＬＰＣの単離
磁気活性化ソーティング（ＭＡＣＳ）はより多数の細胞のより迅速な単離を可能にするため、本発明者らは、ＳＡＮＬＰＣが市販のＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて単離され得るかどうかもテストした。これらの実験では本発明者らは、先に記載された通りＨＥＳ３ ＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーター株の２０日目ＳＡＮ分化培養物を用いた。ＦＡＣＳに基づくアプローチ（実施例４）と対照的に、このＭＡＣＳに基づくアプローチは、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞の選択を含まず、ＣＤ３４－細胞からＣＤ３４＋細胞を分離するに過ぎない（図７Ａ）。本発明者らは、磁気でソートされたＣＤ３４＋細胞が、ソート前に比較して全体的な心筋細胞含量（ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－細胞）を濃縮されたことを見出し、ＣＤ３４が分化培養物に含有される心筋細胞を標識することを確認した。対照的に、ＣＤ３４－でソートされた細胞は、ソート前に比較して低減された心筋細胞含量を有した。重要なことに、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞集団内のＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣの割合は、ソート前対照（５７±４％）に比較して、ＣＤ３４＋でソートされた細胞において８１±４％まで有意に濃縮された（図７Ｂ）。したがって、ＮＫＸ２－５＋心筋細胞の割合は、ＣＤ３４＋でソートされた細胞で有意に低減された（４２±９％から１９±４％へ）。
磁気活性化ソーティング（ＭＡＣＳ）はより多数の細胞のより迅速な単離を可能にするため、本発明者らは、ＳＡＮＬＰＣが市販のＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて単離され得るかどうかもテストした。これらの実験では本発明者らは、先に記載された通りＨＥＳ３ ＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーター株の２０日目ＳＡＮ分化培養物を用いた。ＦＡＣＳに基づくアプローチ（実施例４）と対照的に、このＭＡＣＳに基づくアプローチは、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞の選択を含まず、ＣＤ３４－細胞からＣＤ３４＋細胞を分離するに過ぎない（図７Ａ）。本発明者らは、磁気でソートされたＣＤ３４＋細胞が、ソート前に比較して全体的な心筋細胞含量（ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－細胞）を濃縮されたことを見出し、ＣＤ３４が分化培養物に含有される心筋細胞を標識することを確認した。対照的に、ＣＤ３４－でソートされた細胞は、ソート前に比較して低減された心筋細胞含量を有した。重要なことに、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞集団内のＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣの割合は、ソート前対照（５７±４％）に比較して、ＣＤ３４＋でソートされた細胞において８１±４％まで有意に濃縮された（図７Ｂ）。したがって、ＮＫＸ２－５＋心筋細胞の割合は、ＣＤ３４＋でソートされた細胞で有意に低減された（４２±９％から１９±４％へ）。
【0074】
ＭＡＣＳでソートされたＣＤ３４＋およびＣＤ３４－細胞のＲＴ－ｑＰＣＲ分析は、ＣＤ３４＋でソートされた細胞中で有意により高いＣＤ３４発現を示し、ソーティング方策を確認した（図７Ｃ）。汎筋細胞マーカーＴＮＮＴ２の発現は、ＣＤ３４－細胞に比較してＣＤ３４＋細胞で有意により高く、これは、フローサイトメトリーの結果と一致し（図７Ａ）、ＣＤ３４＋でソートされた集団中のより高い全体的心筋細胞含量をさらに確認する。ＮＫＸ２－５の発現は、フローサイトメトリーで認められたＮＫＸ２－５＋細胞の割合の低減に基づき予想された通り、ＣＤ３４＋細胞で低減された（図７Ｂ）。ＳＡＮペースメーカーマーカーＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２およびＨＣＮ４は、ソート前またはＣＤ３４－細胞よりＣＤ３４＋細胞で有意により高レベルで発現された。作業心筋細胞および移行ゾーン細胞マーカーＮＰＰＡの発現は、ソート前およびＣＤ３４－細胞に比較してＣＤ３４＋細胞で低減された。要約すると、これらのデータは、ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－ＣＤ３４＋細胞についてのＦＡＣＳソーティングを利用して本発明者らが得た結果と互換性があり、ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏｂｅａｄｓでのＭＡＣＳソーティングがＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣを８１±４％の純度に濃縮するための実行可能な選択肢であることを実証する。このＭＡＣＳに基づくアプローチを利用することは、動物モデルにおける生物学的ペースメーカーの能力を評定するための将来の移植実験で必要とされる、多数のＳＡＮＬＰＣを単離することを可能にするであろう。
【0075】
実施例６：ＣＤ３４を用いる他のｈＰＳＣ細胞株からのＳＡＮＬＰＣの単離
ＣＤ３４が任意のｈＰＳＣ株からＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣを単離するための細胞表面マーカーとして使用され得ることを実証するために、本発明者らはまた、ＨＥＳ２ヒト胚性幹細胞株にもこのアプローチを適用した。本発明者らは、ＨＥＳ２細胞株にＳＡＮ分化プロトコルを適用し、分化の２０日目にＣＤ３４の発現について培養物を分析した。実施例２に記載されたものと同じプロトコルが、フローサイトメトリー分析のため細胞を染色するために用いられた。抗ＣＤ３４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ ＃３４０４４１）を使用することは、ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞の５５±１１％がＣＤ３４を発現することを示した（図８Ａおよび８Ｄ）。
ＣＤ３４が任意のｈＰＳＣ株からＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣを単離するための細胞表面マーカーとして使用され得ることを実証するために、本発明者らはまた、ＨＥＳ２ヒト胚性幹細胞株にもこのアプローチを適用した。本発明者らは、ＨＥＳ２細胞株にＳＡＮ分化プロトコルを適用し、分化の２０日目にＣＤ３４の発現について培養物を分析した。実施例２に記載されたものと同じプロトコルが、フローサイトメトリー分析のため細胞を染色するために用いられた。抗ＣＤ３４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ ＃３４０４４１）を使用することは、ＳＡＮＬＰＣ分化培養物中のＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞の５５±１１％がＣＤ３４を発現することを示した（図８Ａおよび８Ｄ）。
【0076】
重要なことに、本発明者らはまた、確立されたプロトコル（Ｌｅｅ，２０１７、前掲書）を利用して、このＨＥＳ２細胞株を心房（ＡＬＣＭ）および心室（ＶＬＣＭ）心筋細胞に分化させた。ＨＥＳ３ ＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーター株の結果と類似して、心房心筋細胞または心室心筋細胞はどちらも、ＣＤ３４を発現しなかった（図８Ｂ～Ｄ）。これらのデータは、ＣＤ３４がまたＨＥＳ２細胞株に由来するＳＡＮＬＰＣも特異的に標識することを示唆する。
【0077】
ＣＤ３４がＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣを単離するために、およびＨＥＳ２細胞株のＳＡＮ分化培養物中に含有されるＮＫＸ２－５＋心筋細胞からそれらを分離するために用いられ得るかどうかをテストするために、本発明者らは、実施例５に記載された通りＣＤ３４＋およびＣＤ３４－細胞をソートした。ＨＥＳ３ ＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーター株で認められる通り、磁気でソートされたＣＤ３４＋細胞は、全体的な心筋細胞含量（ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－細胞）が濃縮され、一方でＣＤ３４－でソートされた細胞は、ソート前に比較して低減された心筋細胞含量を有した（図９Ａ）。ＨＥＳ２細胞株はＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーターを有しないため、本発明者らは、固定された細胞内の、ＮＫＸ２－５（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｃａｔ． Ｎｏ．８７９２Ｓ、クローンＥ１Ｙ８Ｈ）および筋細胞マーカーｃＴＮＣ（１：２０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＳ－２９５－Ｐ、クローン１３－１１）についての細胞内抗体染色を利用して、ソートされた細胞中のＮＫＸ２－５発現を評定した（図９Ｂ）。この分析は、ｃＴＮＴ＋心筋細胞集団内のＮＸＫ２－５－ＳＡＮＬＰＣの集団が、ソート前対照（４８±１１％）に比較してＣＤ３４＋でソートされた細胞中で最大で７７±４％に有意に濃縮されることを示した（図９Ｃ）。したがって、ＮＸＫ２－５＋心筋細胞の割合は、ＣＤ３４＋でソートされた細胞中で有意に低減された（５２±１１％から２３±４％へ）。
【0078】
ＭＡＣＳでソートされたＣＤ３４＋およびＣＤ３４－細胞のＲＴ－ｑＰＣＲ分析は、ＣＤ３４＋でソートされた細胞中のより高いＣＤ３４発現を示し、ソーティング方策を確認した（図９Ｄ）。汎筋細胞マーカーＴＮＮＴ２の発現は、ソート前細胞に比較してＣＤ３４＋細胞でより高く、これはフローサイトメトリーの結果と一致する（図９Ａおよび９Ｂ）。ＮＫＸ２－５の発現は、フローサイトメトリーにより認められたＮＫＸ２－５＋細胞の割合の低減に基づき予想された通り、ＣＤ３４＋細胞中で低減された（図９Ｂおよび９Ｃ）。ＳＡＮペースメーカーマーカーＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２およびＨＣＮ４は、ソート前およびＣＤ３４－細胞中よりＣＤ３４＋細胞中で有意により高レベルで発現された。作業心筋細胞および移行ゾーン細胞マーカーＮＰＰＡの発現は、ソート前に比較してＣＤ３４＋細胞で有意に低減された。総括すると、このデータは、ＣＤ３４＋細胞についてのＭＡＣＳが、７７±４％の純度にＨＥＳ２細胞株からＮＫＸ２－５－ＳＡＮＬＰＣをうまく濃縮することを実証する。したがって、このアプローチは任意の他のｈＰＳＣ株に拡大され得ることが、予想される。
【0079】
実施例７：ヒトＳＡＮ心筋細胞中のＣＤ３４の発現
ＣＤ３４がｈＰＳＣ培養系を越える真のＳＡＮマーカーであることを検証するために、本発明者らは次に、ＣＤ３４がヒト心臓のＳＡＮ心筋により発現されるかどうかをテストした。本発明者らは、過去に記載されたプロトコルを用いて凍結心臓組織から細胞核を単離し、単一核ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ）を実施した（Ｓｅｌｅｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ （２０２０） １０：１５３５；およびＷｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．（２０１９）３０：２３－３２）。ＳＡＮ組織は、胎児心臓（妊娠１９週目）から解離され、１×１０６個の核が、単離された。核はその後、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｙｓｔｅｍを用いるシーケンシングに供された（図１０Ａ）。
ＣＤ３４がｈＰＳＣ培養系を越える真のＳＡＮマーカーであることを検証するために、本発明者らは次に、ＣＤ３４がヒト心臓のＳＡＮ心筋により発現されるかどうかをテストした。本発明者らは、過去に記載されたプロトコルを用いて凍結心臓組織から細胞核を単離し、単一核ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ）を実施した（Ｓｅｌｅｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ （２０２０） １０：１５３５；およびＷｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．（２０１９）３０：２３－３２）。ＳＡＮ組織は、胎児心臓（妊娠１９週目）から解離され、１×１０６個の核が、単離された。核はその後、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｙｓｔｅｍを用いるシーケンシングに供された（図１０Ａ）。
【0080】
教師なしクラスタリングは、１８の明らかに異なる細胞クラスターを同定した。ＴＮＮＴ２を発現する細胞クラスターは、心筋細胞を表す。ＴＮＮＴ２＋ＮＫＸ２－５－ＴＢＸ３ｈｉｇｈＴＢＸ１８＋細胞クラスターが同定され、本発明者らがＳＡＮ細胞核をうまく同定したことを示した（クラスター１）（図１０Ｂ）。加えて、本発明者らは、本発明者らが先に記載されたインビトロクラスターで同定された心筋細胞クラスターと類似の、ＴＮＮＴ２＋ＮＫＸ２－５＋ＴＢＸ３ｍｉｄＳＣＮ５Ａ＋移行ゾーン細胞クラスター（クラスター２）およびＴＮＮＴ２＋ＮＫＸ２－５＋ＴＢＸ３－ＳＣＮ５Ａ＋ＮＰＰＡ＋心房心筋細胞クラスター（クラスター３および４）を同定した。本発明者らがヒト心臓ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ試料中のＣＤ３４発現を分析した場合、高レベルのＣＤ３４発現が、内皮細胞クラスター（クラスター１２、１３、１４）中で同定された（図１０Ｃ）。ＣＤ３４は、線維芽細胞クラスター（クラスター１６、１７、１８）でも発現された。重要なことに、ＣＤ３４発現は、他の心筋細胞クラスター（心房心筋細胞および移行ゾーン心筋細胞；クラスター２、３、４）への発現と比較した場合、ＳＡＮクラスター（クラスター１、青色の矢印、調整されたＰ値１．９７ｅ－６２）において有意に濃縮された。
【0081】
タンパク質レベルでヒトＳＡＮのペースメーカー心筋細胞内のＣＤ３４発現を確認するために、本発明者らは、ヒト胎児心臓（妊娠１９週目）からＳＡＮ組織を解離し、それをＰＦＡ固定し、それをパラフィンに包埋して、横断切片を作製した。切片を、ＴＢＸ３抗体（１：１０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４２４８００、ポリクローナル)およびＮＫＫ２－５抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．８７９２Ｓ、クローンＥ１Ｙ８Ｈ）で免疫染色して、ＳＡＮのＴＢＸ３＋ＮＫＸ２－５－ペースメーカー心筋細胞を同定した。このアプローチは、ＴＢＸ３－心房組織に隣接したＴＢＸ３＋ ＳＡＮエリア（白色の点線により概説された）を同定できた（図１１Ａ）。重要なことに、このＳＡＮエリアは、ＣＤ３４をポジティブ染色した（１：１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３４０４４１）。ＮＫＫ２－５についての連続切片の染色は、ＮＫＫ２－５＋心房細胞と明らかに異なる同じエリア中のＮＫＸ２－５－ＳＡＮ細胞を同定できた（図１１Ｂ）。これらのＮＫＸ２－５－ＳＡＮ細胞は、ＣＤ３４についてポジティブに染色された。心筋細胞マーカーｃＴＮＴ（１：１００、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１３０－１１９－５７５、クローンＲＥＡ４００）を、対比染色として用いて、ＮＫＸ２－５－ＣＤ３４＋細胞が心筋細胞を表すことを確認した。重要なことに、ＴＮＮＴ２＋ＮＫＸ２－５＋ＴＢＸ３－心房心筋細胞は、 ＣＤ３４について陽性に染まらなかった。心房組織内で見出されたＣＤ３４＋細胞は、ＴＮＮＴ２－であり、血管の内皮細胞を表す可能性が最も高い。
【0082】
総括すると、これらのデータは、ＣＤ３４はＳＡＮペースメーカー心筋細胞により特異的に発現されるが、ヒト心臓内の心房細胞により特異的に発現されないことを示唆する。
【図1】
【図2A-E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【国際調査報告】